RS57194B1

RS57194B1 - Antagonistička antitela specifična za peptid koji je u vezi sa genom za kalcitonin za lečenje klaster glavobolje

Info

Publication number: RS57194B1
Application number: RS20180545A
Authority: RS
Inventors: Joerg Zeller; Kristian Todd Poulsen; Yasmina Noubia Abdiche; Jaume Pons; Arnon Rosenthal; Sierra Jones Collier
Original assignee: Teva Pharmaceuticals Int Gmbh
Priority date: 2005-11-14
Filing date: 2006-11-02
Publication date: 2018-07-31
Also published as: US8734802B1; DK1957106T4; SI1957106T2; US20200247878A1; US9365648B1; IL248025A0; US8597649B2; AU2006313434B2; EP3069731A1; CN103421114B; EP1957106B1; CN101309704B; KR20110114705A; US9884908B2; SI2380592T1; SI3045182T1; EP3842458A1; ZA200803484B; US20180162931A1; US20140147438A1

Description

Opis

Oblast pronalaska

[0001] Predmetni pronalazak se odnosi na upotrebu anti-CGRP antagonističkih antitela za prevenciju, ublažavanje, ili lečenje vazomotornih simptoma kao što su, glavobolje koje su u vezi sa CGRP (npr., migrena) i toplotnih valunga.

Stanje tehnike

[0002] CGRP (peptid koji je u vezi sa genom za kalcitonin) je neuropeptid sa 37 aminokiselina, koji pripada familiji peptida koja uključuje kalcitonin, adrenomedulin i amilin. Kod ljudi, postoje dva oblika CGRP (a-CGRP i β-CGRP) i imaju slične aktivnosti. Oni se razlikuju do tri aminokiseline i ispoljavaju različitu distribuciju. Najamnje dva podtipa receptora za CGRP-a mogu takođe da imaju različite aktivnosti. CGRP je neurotransmiter u centralnom nervnom sistemu, i pokazano je da na periferiji deluje kao potentni vazodilatator, gde su neuroni koji sadrže CGRP u bliskoj vezi sa krvnim sudovima. Dilatacija koja je posredovana sa CGRP takođe je u vezi sa neurogenom inflamacijom, kao deo kaskadnih događaja koji dovode do ekstravazacije plazme i vazodilatacije i koja je prisutna u migreni.

[0003] CGRP je poznat po svojoj mogudoj vezi sa vazomotornim simptomima (Wyon et al. Scand. J. Urol. Nephrol.35: 92-96 (2001); Wyon et al. Menopause 7(1):25-30 (2000)). Vazomotorni simptomi (VMS), kao što su valunzi i nodna znojenja, su najuobičajeni simptomi koji su povezani sa menopauzom, koji se pojavljuju u 60% do 80% svih žena nakon prirodne ili hirurški indukovane menopauze. Valunzi su verovatno adaptivni odgovor centralnog nervnog sistema (CNS) na smanjenje koncentracije polnih steroida (Freedman Am. J. Human Biol. 13:453-464 (2001)). Do danas, najefektivnije terapije za valunge su tremani koji se baziraju na hormonima, uključujudi estrogene i/ili neke progestine. Hormonski tretmani mogu da budu efikasni za ublažavanje valunga, ali nisu odgovarajudi za sve žene. Smatra se da su uočeni fiziološki i emotivni simptomi, kao što je nervoza, umor, razdražljivost, insomnija, depresija, gubitak memorije, glavobolja, anksioznost, nervoza ili onemogudena koncentracija prouzrokovani nedostatkom sna, nakon čega slede valunzi i nodna znojenja (Kramer et al., In: Murphy et al., 3.sup.rd Int’l Symposium on Recent Advances in Urological Cancer Diagnosis and Treatment-Proceedings, Paris, France: SCI: 3-7 (1992)).

[0004] Muškarci takođe prolaze kroz valunge nakon povlačenja steroidnog hormona (androgena). Ovo je se dešava u slučajevima opadanja androgena koje je u vezi sa starosnim dobom (Katovich, et al., Proceedings of the Society for Experimental Biology & Medicine, 1990, 193(2): 129-35) kao i u ekstremnim slučajevima hormonske deprivacije koja je u vezi sa tretmanima za kancer prostate (Berendsen, et al., European Journal of Pharmacology, 2001, 419(1): 47-54). Čak jedna tredina tih pacijenata prolazi kroz trajne i česte simptome koji su dovoljno ozbiljni da prouzrokuju značaju nelagodu i neprijatnost.

[0005] CGRP je potentni vazodilatator koji je uključen u patologiju drugih vazomotornih simptoma, kao što su svi oblici vaskularne glavobolje, uključujudi migrene (sa ili bez aure) i klaster glavobolje. Durham, N. Engl. J. Med.350:1073-1075, 2004. Nivoi CGRP-a u serumu i u spoljašnjoj jugularnoj veni su povišeni kod pacijenata tokom glavobolje koja je tipa migrene. Goadsby et al., Ann. Neurol.

28:183-7, 1990. Intravenozno davanje humanog α-CGRP indukuje glavobolju i migrenu kod pacijenata koji pate od migrene bez aure, što ukazuje na to da CGRP ima uzročnu ulogu u migrenama. Lassen et al., Cephalalgia 22:54-61, 2002.

[0006] Mogude uključivanje CGRP-a u migreni je osnova razvoja i ispitivanja brojnih jedinjenja koji inhibiraju otpuštanje CGRP-a (npr., sumatriptan), antagonizuju na nivou receptora za CGRP (npr., dipeptidni derivat BIBN4096BS (Boerhringer Ingelheim); CGRP(8-37)), ili interaguju sa jednim ili više proteina koji se nalaze u vezi sa receptorima, kao što su, membranski protein receptorske aktivnosti (RAMP) ili proteinska komponenta receptora (RCP), oba koja utiču na vezivanje CGRP-a za njegove receptore. Brain, S. et al., Trends in Pharmacological Sciences 23:51-53, 2002. Podtipovi alfa-2 adrenoceptora i adenozin A1 receptora takođe kontrolišu (inhibiraju) oslobađanje CGRP i aktivaciju trigeminusa (Goadsby et al., Brain 125:1392-401, 2002). Pokazano je da agonist adenozin A1 receptora GR79236 (metrafadil), inhibira neurogenu vazodilataciju i trigeminalnu nocicepciju kod ljudi, može takođe da ima anti-migrenoznu aktivnost (Arulmani et al., Cephalalgia 25:1082-1090, 2005; Giffin et al., Cephalalgia 23:287-292, 2003.)

[0007] Zbunjujude u ovoj teoriji jeste opservacija da je lečenje sa jedinjenjima koji isključivo inhibiraju neurogenu inflamaciju (npr., tahikinin antagonisti NK1 receptora) ili trigeminalnu aktivaciju (npr., agonisti 5HT1D receptora) relativno nefikasno kao akutni tretman migrena, što dovodi do toga da neki istraživači razmatraju da li je inhibiranje otpuštanja CGRP-a primarni mehanizam delovanja efikasnih anti-migrenoznih tretmana. Arulmani et al., Eur. J. Pharmacol.500:315-330, 2004.

[0008] Migrena je kompleksno, opšte neurološko stanje koje se karakteriše ozbiljnim, epizodnim napadima glavobolje i povezanih karakteristika, u koje mogu da budu uključeni mučnina, povradanje, osetljivost na svetlost, zvuk ili kretanje. Kod nekih pacijenata, glavobolja prethodi ili je udružena sa aurom. Bol tokom trajanja glavobolje može da bude ozbiljan i takođe kod nekih pacijenata može da bude unilateralan.

[0009] Napadi migrene ometaju svakodnevni život. U SAD-u i zapadnoj Evropi, sveukupna prevalenca ljudi koji pate od migrene je 11% u ukupnoj populaciji (6% muškaraca; 15-18% žena). Dalje, srednja učestalost napada kod individua 1,5/mesecu. Dok su brojni tretmani dostupni za ublažavanje ili smanjenje simptoma, preventivna terapija se preporučuje za one pacijente koji imaju više od 3-4 napada migrene po mesecu. Goadsby et al. New Engl. J. Med.346(4): 257-275, 2002.

[0010] Različite farmakološke intervencije koje se koriste za lečenje migrene i varijabilnost u odgovorima kod pacijenata su dokaz različite prirode ovog poremedaja. Prema tome, takvi relativno ne-selektivni lekovi kao što su ergot alkaloidi (npr., ergotamin, dihidroergotamin, metisergid), koji ispoljavaju serotonergičku, kao i adrenergičku, noradrenergičku i dopminergičku aktivnost, koriste se preko osam godina za lečenje migrene. Drugi tretmani uključuju opijate (npr., oksikodon) i βadrenergičke antagoniste (npr., propranolol). Neki pacijenti, obično oni koji imaju blaže simptome, mogu da kontrolišu svoje simptome sa lekovima koji se ne daju na recept kao što su jedan ili više nesteroidnih antiinflamatornih sredstava (NSAID-i), kao što je kombinacija aspirina, acetaminofena i kofeina (npr., Excedrin® Migraine).

[0011] Nedavno, neki pacijenti koji imaju migrenu su tretirani sa topiramatom, antikonvulzantom koji blokira natrijumove kanale koji su zavisni od napona i određene receptore glutamata (AMPA-kainat), potencira aktivnost GABA-A receptora, i blokira karbonsku anhidrazu. Relativno nedavni uspeh agonista serotonin 5HT-1B/1D i/ili 5HT-1a receptora, kao što je sumatriptan, kod nekih pacijenata je usmerio istraživače da predlože serotonergičku etiologiju poremedaja. Nažalost, dok neki pacijenti dobro reaguju na ovaj tretman, drugi ispoljavaju relativnu otpornost na njegove efekte.

[0012] Pretpostavljeno je da se u osnovi poremedaja nalazi disfunkcija jonskog kanala u aminergičkom jedru mozga, međutim, još uvek nije dovoljno jasna precizna patofiziologija migrene. Pokazano je da je jedan oblik migrene, porodična hemiplagična migrena, u vezi sa mutacijama koje imaju pogrešan smisao (eng. „missense“) u α1 subjednici naponom regulisanog kanala za kalcijum P/Q-tipa, i smatra se da je verovatno da de kod drugih populacija pacijenata biti prisutne druge mutacije. Dok je širenje krvnih sudova u vezi sa migrenom i dovodi do egzarcerbacije simptoma bola kod migrene, sada se smatra da su takvi neurovaskularni događaji rezultati, pre nego sam uzrok, stanja. Sveukupno, smatra se da je disfunkcija moždanih puteva koji vrše modulaciju senzornog ulaza jedinstvena karakteristika migrene. Goadsby, P.J. et al., New Engl. J. Med.346(4): 257-275, 2002.

[0013] US2005/0234054 prikazuje male molekule antagnoiste receptora za CGRP za upotrebu u lečenju različitih bolesti, uključujudi klaster glavobolju. Tan et al. Razmatraju ulogu CGRP-a kao potentnog vazodilatatora. Autori pokazuju da davanje anti-CGRP Fab fragmenta blokira odgovor povedanog protoka krvi u antidromičnoj stimulaciji nerva safenusa kod pacova. Dalje, Tan et al. ukazuje da se blokiranje vazodilatacije ne postiže u istoj meri sa anti-CGRP antitelom pune dužine.

Kratak opis pronalaska

[0014] Pronalazak koji je ovde prikazan se odnosi na postupke upotrebe anti-CGRP antagonističkih antitela za lečenje ili prevenciju klaster glavobolja.

[0015] U skladu sa predmetnim pronalaskom, obezbeđeno je anti-CGRP antagonističko antitelo za upotrebu u prevenciji ili lečenju klaster glavobolje.

[0016] U jednom aspektu, predmetni pronalazak obezbeđuje anti-CGRP antagonističko antitelo za upotrebu u postupku lečenja ili prevencije klaster glavobolje kod individue koji obuhvata davanje individui efikasne količine anti-CGRP antagonističkog antitela.

[0017] U jednom aspektu, predmetni pronalazak obezbeđuje anti-CGRP antagonističko antitelo za upotrebu u postupku lečenja ili prevencije klaster glavobolje kod individue koji obuhvata davanje individui efikasne količine anti-CGRP antagonističkog antitela.

[0018] U drugom aspektu, pronalazak obezbeđuje anti-CGRP antagonističko antitelo za upotrebu u postupku ublažavanja, kontrole, smanjenja pojavljivanja, ili odlaganja razvijanja ili progresije klaster glavobolje kod individue koji obuhvata davanje individui efikasne količine anti-CGRP antagonističkog antitela.

[0019] U daljem izvođenju, pronalazak obezbeđuje an anti-CGRP antagonističko antitelo za upotrebu u postupcima ublažavanja, kontrole, smanjenja pojavljivanja, ili odlaganja razvijanja ili progresije klaster glavobolje kod individue koji obuhvata davanje individui efikasne količine anti-CGRP antagonističkog antitela u kombinaciji sa najmanje jednim dodatnim sredstvom koje je korisno za lečenje glavobolje. Takva dodatna sredstva uključuju agoniste slične 5-HT1 (i agoniste koji deluju na drugim 5-HT1 mestima), i nesteroidne antiinflamatorne lekove (NSAIDs).

[0020] Primeri agonista 5-HT1 koji mogu da se koriste u kombinaciji sa anti-CGRP antitelom uključuju klasu jedinjenja koja je poznata pod imenom triptani, kao što su sumatriptan, zolmitriptan, naratriptan, rizatriptan, eletriptan, almotriptan, and frovatriptan. Ergot alkaloidi i povezana jedinjenja su takođe poznata da imaju aktivnost agonista 5-HT i koriste se za lečenje glavobolje kao što je migrena. U ova jedinjenja su uključeni ergotamin tartrat, ergonovin maleat, i ergoloid mezilati (npr., dihidroergokornin, dihidroergokristin, dihidroergokriptin, i dihidroergotamin mezilat (DHE 45)).

[0021] Primeri NSAID-a koji mogu da se koriste u kombinaciji sa anti-CGRP antitelom uključuju naproksen, flurbiprofen, ketoprofen, oksaprozin, etodolak, indometacin, ketorolak, nabumeton, mefanaminsku kiselinu, i piroksikan. Dodatni NSAID-i uključuju inhibitore ciklooksigenaze-2 (COX-2). Članovi ove grupe uključuju: celekoksib; rofekoksib; meloksikam; JTE-522; L-745,337; NS398; i njihove farmaceutski prihvatljive soli.

[0022] U nekim izvođenjima, anti-CGRP antagonističko antitelo prepoznaje humani CGRP. U nekim izvođenjima, anti-CGRP antagonističko antitelo se vezuje i za humani α-CGRP i β-CGRP. U nekim izvođenjima, anti-CGRP antagonističko antitelo se vezuje za humani i CGRP pacova. U nekim izvođenjima, anti-CGRP antagonističko antitelo se vezuje za C-terminalni fragment koji ima aminokiseline 25-37 od CGRP. U nekim izvođenjima, anti-CGRP antagonističko antitelo se vezuje za C-terminalni epitop koji se nalazi u okviru aminokiselina 25-37 od CGRP.

[0023] U nekim izvođenjima, anti-CGRP antagonističko antitelo je monoklonsko antitelo. U nekim izvođenjima, anti-CGRP antagonističko antitelo je humanizovano. U nekim izvođenjima, antitelo je humano. U nekim izvođenjima, anti-CGRP antagonističko antitelo je G1 antitelo (kao što se ovde opisuje). U nekim izvođenjima, anti-CGRP antagonističko antitelo sadrži jedan ili više CDR(a) (kao što su jedan, dva, tri, četiri, pet, ili, u nekim izvođenjima, svih šest CDR-a) antitela G1 ili varijanti G1 koje su prikazne u Tabeli 6. U još drugim izvođenjima, anti-CGRP antagonističko antitelo sadrži sekvencu aminokiselina varijabilnog regiona teškog lanca koja je prikazana na Slici 5 (SEQ ID NO: 1) i sekvencu amnokiselina varijabilnog regiona lakog lanca koja je prikazana na Slici 5 (SEQ ID NO: 2).

[0024] U nekim izvođenjima, anti-CGRP antagonističko antitelo sadrži modifikovani konstantni region, kao što je konstantni region koji je imunološki inertan (uključujudi delom imunološku inerciju), npr., ne pokrede lizu koja je posredovana delovanjem komplementa, ne stimuliše delijski posredovanu citotoksičnost koja je zavisna od antitela (ADCC), ne aktivira mikrogliju, ili ima smanjenu bilo koju od ovih aktivnosti. U nekim izvođenjima, konstantni region je modifikovan kao što se opisuje u Eur. J. Immunol. (1999) 29:2613-2624; i WO 99/58572. U drugim izvođenjima, anti-CGRP antagonističko antitelo sadrži konstantni region humanog teškog lanca IgG2 koji sadrži sledede mutacije: A330P331 u S330S331 (obeležavanjem aminokiselina u odnosu na divlji tip IgG2 sekvence). Eur. J. Immunol. (1999) 29:2613-2624. U nekim izvođenjima, konstantni region teškog lanca anti-CGRP antagonističkog antitela je teški lanac humanog IgG1 sa bilo kojom od slededih mutacija: 1) A327A330P331 u G327S330S331; 2) E233L234L235G236 u P233V234A235 sa G236 delecijom; 3) E233L234L235 u P233V234A235; 4) E233L234L235G236A327A330P331 u P233V234A235G327S330S331 sa G236 delecijom; 5) E233L234L235A327A330P331 u P233V234A235G327S330S331; i 6) N297 do A297 ili bilo koja druga aminokiselina osim N. U nekim izvođenjima, konstantni region teškog lanca anti-CGRP antagonističkog antitela je humani teški lanac IgG4 sa bilo kojom od slededih mutacija: E233F234L235G236 do P233V234A235 sa G236 delecijom; E233F234L235 do P233V234A235; i S228L235 do P228E235.

[0025] U još drugim izvođenjima, konstantni region je aglikozilovan za N-vezanu glikozilaciju. U nekim izvođenjima, konstantni region je aglikozilovan za N-vezanu glikozilaciju mutacijom ostatka za vezivanje oligosaharida (kao što je Asn297) i/ili ograničavanjem ostataka koji su deo sekvence za prepoznavanje N-glikozilacije u konstantnom regionu. U nekim izvođenjima, konstantni region je aglikozilovan za N-vezanu glikozilaciju. Konstantni region može da bude aglikozilovan za N-vezanu glikozilaciju enzimski ili eksprimiranjem u deliji domadina koji je deficijentan za glikozilaciju.

[0026] Afinitet vezivanja (KD) anti-CGRP antagonističkog antitela za CGRP (kao što je humano α-CGRP kao što se meri površinskom plazmon rezonancijom na odgovarajudoj temperaturi, kao što je 25 ili 37 °C) može da bude oko 0,02 do oko 200 nM. U nekim izvođenjima, afinitet vezivanja je bilo koji od oko 200 nM, oko 100 nM, oko 50 nM, oko 10 nM, oko 1 nM, oko 500 pM, oko 100 pM, oko 60 pM, oko 50 pM, oko 20 pM, oko 15 pM, oko 10 pM, oko 5 pM, ili oko 2 pM. U nekim izvođenjima, afinitet vezivanja je manji od bilo kog oko 250 nM, oko 200 nM, oko 100 nM, oko 50 nM, oko 10 nM, oko 1 nM, oko 500 pM, oko 100 pM, ili oko 50 pM.

[0027] Anti-CGRP antagonističko antitelo može da se daje pre, tokom i/ili nakon glavobolje. U nekim izvođenjima, anti-CGRP antagonističko antitelo se daje pre napada klaster glavobolje. Davanje anti-CGRP antagonističkog antitela može da se izvede bilo kojim načinima koji su poznati iz oblasti tehnike, uključujudi: oralno, intravenozno, subkutano, intraarterijalno, intramuskularno, intrakardijalno, intraspinalno, intratorakalno, intraperitonealno, intraventrikularno, sublingvalno, transdermalno, i/ili inhalacijom. Davanje može da bude sistemsko, npr. intravenozno, ili lokalizovano.

[0028] U nekim izvođenjima, anti-CGRP antagonistika antitela mogu da se daju zajedno sa drugim sredstvima, kao što su druga sredstva za lečenje glavobolje.

[0029] U drugom aspektu, pronalazak obezbeđuje upotrebu anti-CGRP antagonističkog antitela za dobijanje leka za upotrebu u bilo kojim postupcima koji se ovde opisuju, na primer, za lečenje ili prevenciju glavobolje.

[0030] Pronalazak može da koristi anti-CGRP antagonistička antitela koja se dobijaju od antitela G1 ili njegovih varijanti koje su prikazane u Tabeli 6. Antitelo G1 (naizmenično nazvano "G1") se proizvodi ekspresionim vektorima koji imaju ATCC pristupne brojeve PTA- 6866 i PTA-6867. Sekvence aminokiselina varijabilnih regiona teškog lanca i lakog lanca G1 su prikazane na Slici 5. Porcije regiona koji određuje komplementarnost (CDR) antitela G1 (uključujudi Chothia i Kabat CDR-e) su takođe prikazani na Slici 5. Razume se da referenca na bilo koji deo ili ukupan region G1 obuhvata sekvence koje se proizvode ekspresionim vektorima koji imaju ATCC pristupne brojeve PTA-6866 i PTA-6867, i/ili sekvence predstavljene na Slici 5. Takođe mogu da se koriste varijante antitela G1 sa sekvencama aminokiselina koje su predstavljene u Tabeli 6.

[0031] Antitelo koje je korisno u pronalasku može da sadrži VH domen koji je najmanje 85%, najmanje 86%, najmanje 87%, najmanje 88%, najmanje 89%, najmanje 90%, najmanje 91%, najmanje 92%, najmanje 93%, najmanje 94%, najmanje 95%, najmanje 96%, najmanje 97% najmanje 98%, najmanje 99% ili 100% identičan u sekvenci aminokiselina sa SEQ ID NO: 1.

[0032] Antitelo koje je korisno u pronalasku može da sadrži VL domen koji je najmanje 85%, najmanje 86%, najmanje 87%, najmanje 88%, najmanje 89%, najmanje 90%, najmanje 91%, najmanje 92%, najmanje 93%, najmanje 94%, najmanje 95%, najmanje 96%, najmanje 97% najmanje 98%, najmanje 99% ili 100% identičan u sekvenci aminokiselina sa SEQ ID NO: 2.

[0033] Antitelo koje je korisno u pronalasku može da sadrži fragment ili region antitela G1 ili njegovih varijanti koje su prikazane u Tabeli 6. U jednom izvođenju, fragment je laki lanac antitela G1. U drugom izvođenju, fragment je teški lanac antitela G1. U još drugom izvođenju, fragment sadrži jedan ili više varijabilnih regiona iz lakog lanca i/ili teškog lanca antitela G1. U još drugom izvođenju, fragment sadrži jedan ili više varijabilnih regiona iz lakog lanca i/ili teškog lanca koji je prikazan na Slici 5. U još drugom izvođenju, fragment sadrži jedan ili više CDR-a izlakog lanca i/ili teškog lanca antitela G1.

[0034] Pronalazak može da koristi antitelo koje sadrži VH CDR3 kao što je predstavljeno u SEQ ID NO: 5, ili sekvenca koja se razlikuje od SEQ ID NO: 5 za 1, 2, 3, 4, ili 5 supstitucija aminokiselina. U posebnom izvođenju, takve supstitucije aminokiselina su konzervativne supstitucije.

[0035] Pronalazak može da koristi antitelo koje sadrži VL CDR3 kao što je predstavljeno u SEQ ID NO: 8, ili sekvencu koja se razlikuje od SEQ ID NO: 8 za 1, 2, 3, 4, ili 5 supstitucija aminokiselina. U posebnom izvođenju, takve supstitucije aminokiselina su konzervativne supstitucije.

[0036] Pronalazak može da koristi antitelo koje sadrži bilo koje jedno ili više od slededih: a) jedan ili više CDR(a) antitela G1 ili njegovih varijanti koje su prikazane u Tabeli 6; b) CDR H3 iz teškog lanca antitela G1 ili njegovih varijanti koje su prikazane u Tabeli 6; c) CDR L3 iz lakog lanca antitela G1 ili njegovih varijanti koje su prikazane u Tabeli 6; d) tri CDR-a iz lakog lanca antitela G1 ili njegovih varijanti koje su prikazane u Tabeli 6; e) tri CDR-a iz teškog lanca antitela G1 ili njegovih varijanti koje su prikazane u Tabeli 6; f) tri CDR-a iz lakog lanca i tri CDR-a iz teškog lanca antitela G1 ili njegovih varijanti koje su prikazane u Tabeli 6. Pronalazak može da koristi antitelo koje može da koristi bilo koje jedno iil više od slededih: a) jedan ili više (jedan, dva, tri, četiri, pet, ili šest) CDR(a) koji se dobijaju iz antitela G1 ili njegovih varijanti koje su prikazane u Tabeli; b) CDR koji se dobija od CDR H3 od teškog lanca antitela G1; i/ili c) CDR koji se dobija od CDR L3 od lakog lanca antiitela G1. U nekim izvođenjima, CDR je CDR koji je prikazan na Slici 5. U nekim izvođenjima, jedan ii više CDR-a koji se dobijaju iz antitela G1 ili njegovih varijanti koje su prikazane u Tabeli 6 su najmanje oko 85%, najmanje oko 86%, najmanje oko 87%, najmanje oko 88%, najmanje oko 89%, najmanje oko 90%, najmanje oko 91%, najmanje oko 92%, najmanje oko 93%, najmanje oko 94%, najmanje oko 95%, najmanje oko 96%, najmanje oko 97%, najmanje oko 98%, najmanje oko 99% identični sa najmnaje jednim, najmanje dva, najmanje tri, najmanje četiri, najmanje pet, ili najmanje šest CDR-a G1 ili njegovim varijantama.

[0037] U nekim izvođenjima, CDR je Kabat CDR. U drugim izvođenjima, CDR je Chothia CDR. U drugim izvođenjima, CDR je kombinacija Kabat i Chothia CDR (kojise takođe zovu "kombinovani CDR" ili "prošireni CDR"). Drugim rečima, za bilo koje dato izvođenje koje sadrži više od jednog CDR-a, CDR-ovi mogu da budu bilo koji od Kabat, Chothia, i/ili kombiovani.

[0038] U nekim izvođenjima, antitelo sadrži sekvencu aminokiselina KASKXaaVXaaTYVS, gde Xaa na položaju 5 je R, W, G, L, ili N; i gde Xaa na položaju 7 je T, A, D, G, R, S, W, ili V. U nekim izvođenjima, sekvenca aminokiselina KASKXaaVXaaTYVS je CDR1 lakog lanca antitela.

[0039] U nekim izvođenjima, antitelo sadrži sekvencu aminokiselina XaaXaaSNRYXaa, gde Xaa na položaju 1 je G ili A; gde Xaa na položaju 2 je A ili H; i gde Xaa na položaju 7 je L, T, I, ili S. U nekim izvođenjima, sekvenca aminokiselina XaaXaaSNRYXaa je CDR2 lakog lanca antitela.

[0040] U nekim izvođenjima, antitelo sadrži sekvencu aminokiselina EIRSXaaSDXaaXaaATXaaYAXaaAVKG, gde Xaa na položaju 5 je E, R, K, Q, ili N; gde Xaa na položaju 8 je A, G, N, E, H, S, L, R, C, F, Y, V, D, ili P; gde Xaa na položaju 9 je S, G, T, Y, C, E, L, A, P, I, N, R, V, D, ili M; gde Xaa na položaju 12 je H ili F; gde Xaa na položaju 15 je E ili D. U nekim izvođenjima, sekvenca aminokiselina EIRSXaaSDXaaXaaATXaaYAXaaAVKG je CDR2 teškog lanca antitela.

[0041] U nekim izvođenjima, antitelo sadrži sekvencu aminokiselina SEQ ID NO:1, gde ostatak aminokiseline na položaju 99 od SEQ ID NO:1 je L ili je supstituisan sa A, N, S, T, V, ili R; i gde ostaci aminokiselina na položaju 100 od SEQ ID NO:1 su A ili su supstituisani sa L, R, S, V, Y, C, G, T, K, ili P.

[0042] U nekim izvođenjima, antitelo je humano antitelo. U drugim izvođenjima, antitelo je humanizovano antitelo. U nekim izvođenjima, antitelo je monoklonsko. U nekim izvođenjima, antitelo (ili polipeptid) je izolovan. U nekim izvođenjima, antitelo (ili polipeptid) je u osnovi čist.

[0043] Konstantni region teškog lanca antitela može da bude od bilo kojih tipova konstantnog regiona, kao što je IgG, IgM, IgD, IgA, i IgE; i bilo kojih izotipova, kao što su IgG1, IgG2, IgG3, i IgG4.

[0044] U nekim izvođenjima, afinitet sadrži modifikovani kostantni region kao što se ovde opisuje.

[0045] Predmetni pronalazak koristi anti-CGRP antagonistička antitela za lečenje, prevenciju, ublažavanje, kontrolu, ili smanjenje pojavljivanja klaster glavobolje.

Kratak opis nacrta

[0046]

Slika 1 je tabela koja pokazuje afinitete vezivanja 12 mišjih antitela za različite humane α-CGRP fragmente supstituisane alaninom. Afiniteti vezivanja se mere na 25°C upotrebom Biacore protokom Fab-a kroz CGRP-e na čipu. Vrednosti u boksovima predstavljaju gubitak u mutantima u odnosu na roditeljski fragment, 25-37 (italik), osim K35A, koji je izveden od 19-37 roditelja. "<a>" označava afinitete za 19-37 i 25-37 fragmente koji su srednja vrednost 6 standardnih devijacija dva nezavisna merenja na različitim senzor čipovima. "<b>" ukazuje na to da su ove interakcije odstupile od jednostavnog modela bimolekulske interakcije zbog bifazne brzine disocijacije, tako da se njihovi afiniteti određuju upotrebom modela konformacione promene. Greyscale ključ: bela (1,0) ukazuje na roditeljski afinitet; svetlo zelena (manje od 0,5) ukazuje navedi afinitet u odnosu na roditelja; tamno zelena (vede od 2) ukazuje na niži afinitet u odnosu na roditelja; i crna ukazuje na to da nije uočeno vezivanje.

Slike 2A i 2B pokazuju efekat davanja CGRP 8-37 (400 nmol/kg), antitela 4901 (25 mg/kg), i antitela 7D11 (25 mg/kg) na protok krvi u koži koji se meri fluksom krvnih delija nakon stimulacije električnim pulsom u trajanju od 30 sekundi. CGRP 8-37 se daje intravenozno (iv) 3-5 min pre stimulacije električnim pulsom. Antitela se daju intraperitonealno (IP) 72 časova pre stimulacije električnim pulsom. Svaka tačka u graficima predstavlja AUC jednog pacova koji se tretira pod uslovima koji su kao što je navedeno. Svaka linija u graficima predstavlja srednju vrednost AUC pacova koji se tretiraju pod uslovima kao što je navedeno. AUC (površina ispod krive) jednaka je Δfluksa x Δvremena. "Δfluksa" predstavlja promenu u jednicama fluksa posle stimulacije električnim pulsem; i "Δvremena" predstavlja vremenski period koji se uzima za nivo fluksa delija krvi da se vrati na nivo pre stimulacije električnim pulsom.

Slika 3 pokazuje efekat davanja različitih doza antitela 4901 (25 mg/kg, 5 mg/kg, 2,5 mg/kg, ili 1 mg/kg) na protok krvi u koži mereno fluksom delija u koži nakon stimulacije električnim pulsom u trajanju od 30 sekundi. Antitela se daju intravenozno (IV) 24 časova pre stimulacije električnim pulsom. Svak tačka na grafiku predstavlja AUC jednog pacova koji se tretira pod uslovima kao što je navedeno. Linija u grafiku predstavlja srednju AUC pacova koji se tretiraju pod uslovima kao što je navedeno.

Slike 4A i 4B pokazuju efekat davanja antitela 4901 (1 mg/kg ili 10 mg/kg, i.v.), antitela 7E9 (10 mg/kg, i.v.), i antitela 8B6 (10 mg/kg, i.v.) na protok krvi u koži koji kao fluks krvnih delija nakon stimulacije električnim pulsom tokom 30 sekundi. Antitela se daju intravenozno (i.v.) nakon stimulacije elekričnim pulsom tokom 30 min, 60 min, 90 min, i 120 min nakon davanja antitela. Y osa predstavlja procenat AUC u poređenju sa nivoom AUC kada nije dato antitelo (vreme 0). X osa prestavlja vremenski (minuti) period između davanja antitela i stimulacije električnim pulsom. "*" ukazuje na P < 0,05, i "**" ukazuje na P< 0,01, u poređenju sa vremenom 0. Podaci se analiziraju jednosmernim ANOVA sa Dunnetovim testom višestrukog poređenja.

Slika 5 pokazuje sekvencu aminokiselina varijabilnog regiona teškog lanca (SEQ ID NO:1) i varijabilnog regiona lakog lanca (SEQ ID NO:2) antitlea G1. Kabat CDR-e su napisane masnim slovima, i Chothia CDR-e su podvučene. Ostaci aminokiselina za varijabilni region teškog i lakog lanca su sekvencijalno obeleženi.

Slika 6 pokazuje mapiranje epitopa antitela G1 kompeticijom peptida upotrebom Biacore. N-biotinilovani humani α-CGRP se hvata na SA senzor čipu. G1 Fab (50 nM) u odsustvu peptida za kompeticiju ili prethodno inkubiranog 1 h sa 10 µM peptidom za kompeticiju se pušta preko čipa. Mereno je vezivanje G1 Fab-a za humani α-CGRP na čipu. Y osa predstavlja procenat vezivanja koje je blokirano prisustvom peptida kompeticije u poređenju sa vezivanjem u odsustvu peptida za kompeticiju.

Slika 7 pokazuje efekat davanja antitela G1 (1 mg/kg ili 10 mg/kg, i.v.) ili nosača (PBS, 0,01% Tween 20) na krvotok kože mereno fluksom krvnih delija nakon stimulacije električnim pulsom u trajanju od 30 sekundi. Antitelo G1 ili nosač se daju intravenozno (i.v.) nakon čega sledi električna stimulacija nerva na 30 min, 60 min, 90 min, i 120 min nakon davnaja antitela. Y osa predstavlja procenat AUC u poređenju sa nivoom AUC kada nema davanja antitela ili nosača (definisano kao 100%) (vreme 0). X osa predstavlja vremenski (minuti) period između davanja antitela i stimulacije električnimpulsom. "*" ukazuje na P < 0,05, i "**" ukazuje na P < 0,01, u poređenju sa nosačem. Podaci se analiziraju two-way ANOVA i Bonferroni post testom.

Slika 8A pokazuje efekat davanja antitela G1 (1 mg/kg, 3 mg/kg ili 10 mg/kg, i.v.) ili nosača (PBS, 0,01% Tween 20) na krvotok kože mereno fluksom krvnih delija nakon stimulacije električnim pulsom tokom 30 sekundi 24 časova nakon doziranja. Antitelo G1 ili nosač se intravenozno daje (i.v.) 24 časova pre stimulacije nerva električnim pulsom. Y osa predstavlja ukupnu površinu ispod krive (promena u fluksu delija krvi koja je pomnožena sa vremenom od početka stimulacije dok se fluks ne vrati do osnovnog nivoa, AUC). X osa predstavlja varirajude doze antitela G1. "*" ukazuje na P < 0,05, i "**" ukazuje na P < 0,01, u poređenju sa nosačem. Podaci se analiziraju upotrebom jednosmernog ANOVA i Dunovim testom višestrukog poređenja.

Slika 8B pokazuje efekat davanja antitela G1 (0.3 mg/kg, 1 mg/kg, 3 mg/kg ili 10 mg/kg, i.v.) ili nosača (PBS, 0,01% Tween 20) na krvotok kože kao što se meri fluksom krvnih delija nakon stimulacije električnim pulsom 30 sekundi 7 dana nakon doziranja. Antitelo G1 ili nosač se daju intravenozno (i.v.) 7 dana pre nervne stimulacije električnim pulsom. Y osa predstavlja ukupni AUC. X osa prdstavlja varirajude doze G1. "**" ukazuje na P < 0,01, i "***" ukazuje na P < 0,001, u poređenju sa nosačem. Podaci se analizuraju upotrebom jednosmernog ANOVA i Dunovog testa višestrukog poređenja.

Slika 8C je analiza uklapanja podataka u krivu sa slika 8A i 8B. Antitelo G1 ili nosač se daju intravenozno (i.v.) ili 24 časova ili 7 dana pre nervne stimulacije električnim pulsom. Y osa predstavlja ukupni AUC. X osa predstavlja varirajude doze G1 u "mg/kg" na logaritamskoj skali za određivanje EC50.

Slika 9 pokazuje efekat antitela mu7E9 (10 mg/kg), BIBN4096BS ili nosača (PBS, 0,01% Tween 20) na promenu prečnika srednje meningealne arterije nakon stimulacije električnim poljem. Antitelo mu7E9, BIBN4096BS ili nosač se daju intravenozno (i.v.) u vremenskoj tački 0 minuta nakon uspostavljanja osnovnog odgovora na električnu stimulaciju. Y osa predstavlja promenu prečnika srednje meningealne arterije nakon stimulacije električnim poljem. Mirujudi prečnik odgovara 0%. X osa predstavlja vreme (minuti) stimulacije električnim pulsom. "*" ukazuje na P < 0,05, i "**" ukazuje na P < 0,01, u poređenju sa nosačem. Podaci se analizuraju upotrebom jednosmernog ANOVA i Dunetovim testom višestrukog poređenja.

Slika 10 pokazuje efekat varirajudih doza antitela G1 (1 mg/kg, 3 mg/kg ili 10 mg/kg, i.v.) ili nosača (PBS, 0,01% Tween 20) na promenu prečnika srednje meningealne arterije nakon stimulacije

1

električnim poljem. Antitelo G1 ili nosač se daju intravenozno (i.v.) 7 dana pre stimulacije električnim poljem. Y osa predstavlja promenu prečnika srednje meningealne arterije. Mirujudi prečnik odgovara 0%. X osa predstavlja voltažu stimulacije. "*" ukazuje na P < 0,05, "**" ukazuje na P < 0,01, i "***" ukazuje na P < 0,001, u poređenju sa nosačem. Podaci se analiziraju upotrebom dvosmernog ANOVA i Bonferroni posttestova.

Slika 11A pokazuje efekat antitela mu4901 (10mg/kg) ili nosača (PBS, 0.01% Tween 20), koji se daju intravenozno (i.v.) 24 časova pre, na smanjenje temperature u centru koja je indukovana subkutanom injekcijom naloksona (1 mg/kg) kod pacova koji su zavisnici od morfina. Y osa predstavlja razliku temperature u odnosu na osnovni nivo. X osa predstavlja vreme koje se meri od tačke injekcije naloksona.

Slika 11B pokazuje efekat antitela mu4901 (10mg/kg) ili nosač (PBS, 0,01% Tween 20), koji se daju intravenozno (i.v.) 24 časova pre, na povedanje u površinskoj temperaturi repa koja je indukovana subkutanom injekcijom naloksona (1 mg/kg) kod pacova koji su zavisnici od morfina. Y osa predstavlja razliku temperature u odnosu na osnovni nivo. X osa predstavlja vreme koje se meri od tačke injekcije naloksona.

Detaljni opis pronalaska

[0047] Pronalazak koji je ovde prikazan obezbeđuje postupke za lečenje i/ili prevenciju klaster glavobolje kod individue davanjem individui terapeutski efikasne količine anti-CGRP antagonističkog antitela.

[0048] Takođe mogu da se koriste anti-CGRP antagonistička antitela koja se dobijaju iz G1 ili njegovih varijanti koja su prikazana u Tabeli 6.

Opšte tehnike

[0049] Praksa predmetnog pronalaska de koristiti, osim ukoliko nije drugačije naznačeno, konvencionalne postupke molekularne biologije (uključujudi tehnike rekombinacije), mikrobiologije, delijske biologije, biohemije i imunologije, koji su obuhvadeni tom oblasti tehnike. Takve tehnike su u potpunosti objašnjene u literaturi, kao što su, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, second edition (Sambrook et al., 1989)Cold Spring Harbor Press; Oligonucleotide Synthesis (M.J. Gait, ed., 1984); Methods in Molecular Biology, Humana Press; Cell Biology: A Laboratory Notebook (J.E. Cellis, ed., 1998) Academic Press; Animal Cell Culture (R.I. Freshney, ed., 1987); Introduction to Cell and Tissue Culture (J.P. Mather and P.E. Roberts, 1998) Plenum Press; Cell and Tissue Culture: Laboratory Procedures (A. Doyle, J.B. Griffiths, and D.G. Newell, eds., 1993-1998) J. Wiley and Sons; Methods in Enzymology (Academic Press, Inc.); Handbook of Experimental Immunology (D.M. Weir and C.C. Blackwell, eds.); Gene Transfer Vectors for Mammalian Cells (J.M. Miller and M.P. Calos, eds., 1987); Current Protocols in Molecular Biology (F.M. Ausubel et al., eds., 1987); PCR: The Polymerase Chain Reaction, (Mullis et al., eds., 1994); Current Protocols in Immunology (J.E. Coligan et al., eds., 1991); Short Protocols in Molecular Biology (Wiley and Sons, 1999); Immunobiology (C.A. Janeway and P. Travers, 1997); Antibodies (P. Finch, 1997); Antibodies: a practical approach (D. Catty., ed., IRL Press, 1988-1989); Monoclonal antibodies: a practical approach (P. Shepherd and C. Dean, eds., Oxford University Press, 2000); Using antibodies: a laboratory manual (E. Harlow and D. Lane (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1999); The Antibodies (M. Zanetti and J.D. Capra, eds., Harwood Academic Publishers, 1995).

Definicije

[0050] "Antitelo" imunoglobulinski molekul koji može ca se vezuje za cilj na specifičan način, kao što je ugljeni hidrat, polinukleotid, lipid, polipeptid, itd., kroz najmanje mesto za prepoznavanje antigena, koje se nalazi u varijabilom regionu imunoglobilinskog molekula. Kao što se ovde koristi, termin obuhvata ne samo intaktna poliklonska ili monoklonska antitela, ved takođe njihove fragmente (kao što su Fab, Fab’, F(ab’)2, Fv), jednolančani (ScFv), njihove mutirane oblike, kombinovane proteine koji sadrže porciju antitela (kao što je domen antitela), i bilo koju drugu modifikovanu konfiguraciju molekula imunoglobulina koja sadrži mesto za prepoznavanje antigena. Antitelo uključuje antitelo bilo koje klase, kao što su IgG, IgA, ili IgM (ili njihove podklase), i antitelo ne mora da bude iz bilo koje posebne klase. U zavisnosti od aminokiselinske sekvence konstantnog domena teških lanaca antitela, imunoglobulini mogu biti dodeljeni različitim klasama. Postoji pet glavnih klasa imunoglobulina: IgA, IgD, IgE, IgG, i IgM, i njih nekoliko mogu da budu podeljeni u subklase (izotipove), npr., IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1 i IgA2. Konstantni domeni teškog lanca koji odgovaraju različitim klasama imunoglobulina se zovu alfa, delta, epsilon, gama, i mu, redom. Dobro su poznate subjedinične strukture i trodimenzionalne konfiguracije različitih klasa imunoglobulina.

[0051] Kao što se ovde koristi, "monoklonsko antitelo" se odnosi na antitelo koji se dobija iz populacije u osnovi homogenih antitela, tj., individualna antitela koja čine populaciju su identična osim mogudih mutacija koje se prirodno pojavljuju koje mogu u manjim količinama da budu prisutne. Monoklonska antitela su visoko specifična, koja su specifično usmerena prema jednom antigenskom mestu. Dalje, u suprotnosti sa preparatima koji sadrže poliklonska antitela, koji obično uključuju različita antitela koja su specifično usmerena prema različitim determinantama (epitopima), svako monoklonsko antitelo je usmereno prema jednoj determinanti na antigenu. Modifikator "monoklonsko" ukazuje na karakter antitela koje se dobija iz u osnovi homogene populacije antitela, i ne treba tumačiti kao neophodnu proizvodnju antitela bilo kojim posebnim postupkom. Na primer, monoklonska antitela koja se koriste prema predmetnom pronalasku mogu da se dobiju postupkom hibridoma koga su prvo opisali Kohler ai Milstein, 1975, Nature, 256:495, ili mogu da se dobiju postupcima rekombinovane DNK kao što se opisuje u U.S. Pat. No.4,816,567. Monoklonska antitela mogu takođe da se izoluju iz fagnih biblioteka koje se dobijaju upotrebom tehnika koje se opisuju u McCafferty et al., 1990, Nature, 348:552-554, na primer.

[0052] Kao što se ovde koristi, "humanizovana" antitela se odnose na oblike ne-humanih (tj. mišjih) antitela koja su specifični himerni imunoglobulini, lanci imunoglobulina, ili njihovi fragmenti (kao što su Fv, Fab, Fab’, F(ab’)2ili druge podsekvence antitela za vezivanje antigena) koje sadrže minimalnu sekvencu koja je izvedena iz ne-humanog imunoglobulina. U vedini slučajeva, humanizovana antitela su humani imunoglobulini (recipijentno antitelo) u kojima su ostaci od regiona koji određuje komplementarnost (CDR) recipijenta zamenjeni ostacima od CDR ne-humanih vrsta (donorsko antitelo) kao što je miš, pacov, ili zec koji imaju željenu specifičnost, afinitet, i biološku aktivnost. U nekim slučajevima ostaci Fv okvirnog regiona (FR) humanog imunoglobulina su zamenjeni sa odgovarajudim ostacima koji nisu poreklom od čoveka. Dalje, humanizovano antitelo može da sadrži ostatke koji nisu prisutni ni kod recipijentnog antitela niti u uvedenom CDR ili okvirnim sekvencama, ali su uključene kako bi dalje poboljšale i optimizovale performanse antitela. Generalno, humanizovano antitelo u osnovi sadrži najmanje jedan, i obično dva, variabilna domena, u kojima svi ili u osnovi svi CDR regioni odgovaraju onima u ne-humanom imunoglobulinu i svi ili u osnovi svi od FR regiona su oni koji pripadaju konseznusnoj sekvenci humanog imunoglobulina. Humanizovano antitelo takođe sadrži najmanje deo konstantnog regiona imunoglobulina ili domena (Fc), obično od humanog imunoglobilina. Antitela mogu da imaju Fc regione koji su modifikovani kao što se opisuje u WO 99/58572. Drugi oblici humanizovanih antitela imaju jedanili više CDRs (jedan, dva, tri, četiri, pet, šest) koji su izmenjeni u odnosu na originalno antitelo, koji se takođe nazivaju jedan ili više CDR-a "koji je izveden od" jednog ii više CDR-a iz originalnog antitela.

[0053] Kao što se ovde koristi, "humano antitelo" označava antitelo koje ima sekvencu aminokiselina koja odgovara antitelu koje je proizveo čovek i/ili je dobijeno upotrebom postupaka za dobijanje humanih antitela koji su poznati iz oblasti tehnike ili su ovde prikazani. Ova definicija humanog antitela uključuje antitela koja sadrže najmanje jedan polipeptid humanog teškog lanca ili najmanje jedn polipeptid humanog lakog lanca. Jedan takav primer je antitelo koje sadrži polipeptide mišjeg lakog lanca i humanog teškog lanca. Humana antitela mogu da se proizvedu upotrebom različitih postupaka koji su poznati iz oblasti tehnike. U jednom izvođenju, humano antitelo se bira iz fagne biblioteke, gde bibiloteka faga eksprimira humana antitela (Vaughan et al., 1996, Nature Biotechnology, 14:309-314; Sheets et al., 1998, PNAS, (USA) 95:6157-6162; Hoogenboom and Winter, 1991, J. Mol. Biol., 227:381; Marks et al., 1991, J. Mol. Biol., 222:581). Humana antitela takođe mogu da se dobiju uvođenjem lokusa humanog imunoglobulina u transgene životinje, tj., miševe kod koji su endogeni imunoglobulinski geni parcijalno ili kompletno inaktivirani. Ovaj pristup se opisuje u U.S. Patent Nos.5,545,807; 5,545,806; 5,569,825; 5,625,126; 5,633,425; and 5,661,016. Alternativno, humano antitelo može da se dobije imortalizovanjem humanih B limfocita koji proizvode antitelo koje je specifično za ciljani antigen (tako da B limfociti mogu da se dobiju od individue ili mogu da se in vitro imunizuju). Videti, npr., Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, p.77 (1985); Boerner et al., 1991, J. Immunol., 147 (1):86-95; and U.S. Patent No.5,750,373.

[0054] Kao što se ovde koristi, termin "peptid koji je u vezi sa genom za kalcitonin" i"CGRP" odnosi se na bilo koji oblik peptida koji je povezan sa genom za kalcitonin i njegovih varijanti koje najmanje delom zadržavaju aktivnost CGRP. Na primer, CGRP može da bude α-CGRP ili β-CGRP. Kao što se ovde koristi, CGRP uključuje sve nativne sekvence CGRP sisarskih vrsta, npr., čoveka, psa, mačke, konja, i govečeta.

[0055] Kao što se ovde koristi, "anti-CGRP antagonističko antitelo" (naizmenično nazvano "anti-CGRP antitelo") se odnosi na antitelo koje može da se veže za CGRP i da inhibira biološku aktivnost CGRP-a i/ili nishodni put(eve) koji su posredovani signalizacijom CGRP. Anti-CGRP antagonističko antitelo obuvata antitela koja blokiraju, antagonizuju, suprimiraju ili redukuju (uključujudi značajnu) biološku aktivnost CGRP, uključujudi nishodne puteve koji su posredovani signalizacijom CGRP, kao što je vezivanje za receptor i/ili pokretanje delijskog odgovora na CGRP. Za svrhu predmetnog pronalaska, izričito treba razumeti da termin "anti-CGRP antagonističko antitelo" obuvata sve prethodno identifikovane termine, naslove, i funkcionalna stanje i karakterisitke gde CGRP sam, biološka aktivnost CGRP-a (uključujudi, ali bez ograničenja, njegovu sposobnost da posreduje u bilo kom aspektu glavobolje), ili posledicama biološke aktivnosti, su u osnovi poništeni, smanjeni, ili

1

neutralizovani u bilo kom značajnom stepenu. U nekom izvođenju, anti-CGRP antagonističko antitelo se vezuje za CGRP i sprečava vezivanje CGRP-a za receptor za CGRP. U drugim izvođenjima, anti-CGRP antitelo se vezuje za CGRP i sprečava aktivaciju receptora za CGRP. Primeri anti-CGRP antagonističkih antitela su ovde obezbeđeni.

[0056] Kao što se ovde koristi, termini "G1" i "antitelo G1" se koriste naizmenično da označe proizvodnju antitela od strane ekspresionih vektora koji su deponovani pod brojevima ATCC PTA-6867 i ATCC PTA-6866. Sekvence aminokiselina varijabilnih regiona teškog i lakog lanca su prikazan na Slici 5. CDR porcije antitela G1 (uključujudi Chothia i Kabat CDRs) su predstavljene dijagramom na Slici 5. Polinukleotidi koji kodiraju varijabilne regione teškog i lakog lanca su prikazani na SEQ ID NO:9 i SEQ ID NO:10. Karakterizacija G1 je opisana u Primerima.

[0057] Termini "polipeptid", "oligopeptid", "peptid" i "protein" ovde se koriste naizmenično i odnose se na polimere aminokiselina bilo koje dužine. Polimer može da bude linearan ili razgranat, može da sadrži modifikovane aminokiseline, i može da bude prekinut sa ne-aminokiselima. Termini takođe obuhvataju polimer aminokiseline koji je modifikovan prirodno ili pomodu intervencije; na primer, obrazovanjem disulfidne veze, glikozilacijom, lipidacijom, acetilacijom, fosforilacijom, ili bilo kojom drugom manipulacijom ili modifikacijom, kao što je konjugovanje sa komponentom za obeležavanje. U definiciju su takođe uključeni, na primer, polipeptidi koji sadrže jedan ili više analoga aminokiselina (uključujudi, na primer, aminokisleline koje nisu prirodne, itd.), kao i druge modifikacije koje su poznate u oblasti tehnike.

[0058] "Polinukleotid," ili "nukleinska kiselina," kao što se ovde naizmenično koristi, odnosi se na polimere nukleotida bilo koje dužine, i uključuje DNK i RNK. Nukleotidi mogu da budu deoksiribonukleotidi, ribonukleotidi, modifikovani nukleotidi ili baze, i/ili njihovi analozi, ili bilo koji supstrat koji može da bude inkorporiran u polimer delovanjem DNK ili RNK polimeraze. Polinukleotid može da sadrži modifikovane nukleotide, kao što su metilovani nukleotidi i njihovi analozi. Ukoliko je prisutna, modifikacija strukture nukleotida može da se prenese pre ili nakon sklapanja polimera. Sekvenca nukleotida može da bude prekinuta komponentama koje nisu nukleotidi. Polinukleotid može dalje da bude modifikovan nakon polimerizacije, kao što je konjugacija sa komponentom za obeležavanje. Drugi tipovi modifikacija uključuju, na primer, "kape", supstituciju jednog ili više nukleotida koji se pojavljuje u prirodi sa analogom, internukleotidnim modifikacijama kao što su, na primer, oni sa nezaštidenom vezom (npr., metil fosfonati, fosfotriestri, fosfoamidati, karbamati, itd.) i sa zaštidenim vezama (npr., fosforotioati, fosforoditioati, itd.), oni koji sadrže bočne grupe, kao što su, na primer, proteini (npr., nukleaze, toksini, antitela, signalni peptidi, ply-L-lizin, itd.), oni sa interkalirajudim sredstvima (npr., akridin, psoralen, itd.), oni koji sadrže helatore (npr., metali, radioaktivni metali, boron, oksidni metali, itd.), oni koji sadrže sredstva za alkilovanje, oni sa modifikovanim vezama (npr., alfa anomerne nukleinske kiseline, itd.), kao i nemodifikovane oblike polinukleotid(a). Dalje, bilo koja od hidroksil grupa koja se uobičajeno nalazi u šederima može da bude zamenjena, na primer, fosfonatnim grupama, fosfatnim grupama, koje su zaštidene standardnim grupama koje štite, ili koje su aktivirane dodatnim vezama sa dodatnim nukelotidima, ili mogu da budu konjugovane sa čvrstim podlogama.5’ i 3’ terminalna OH može da bude fosforilovana ili supstituisana sa aminima ili organskim grupama za dodavanje kape koje sadrže oko 1 do 20 ugljenikovih atoma. Drugi hidroksili mogu takođe da budu derivatizovani do standardnih grupa koje štite. Polinukleotidi mogu takođe da sadrže analogne oblike šedera riboze ili deoksiriboze koji su generalno poznati u oblasti tehike, uključujudi, na primer, 2’-O-metil-, 2’-O-alil, 2’-fluoro- ili 2’-azidoribozu, karbociklične analoge šedera, h-anomerne šedere, epimerne šedere kao što je arabinoza, ksiloze ili liksoze, piranozne sedere, furanozne šedere, sedoheptuloze, aciklične analoge i abazne nukleotidne analoge kao što je metilribozid. Jedna il više fosfodiestarskih veza može da bude zamenjena sa alternativnim grupama za vezivanje. Ove alternativne grupe za vezivnje uključuju, ali bez ograničenja, izvođenja u kojima se fosfat zamenjuje sa P(O)S("tioatom"), P(S)S ("ditioatom"), (O)NR2("amidatom"), P(O)R, P(O)OR’, CO ili CH2("formacetalom"), gde svaki R ili R’ je nezavisno H ili supstituisani ili nesupstituisani alkil (1-20 C) koji opciono sadrži etarsku (-O-) vezu, aril, alkenil, cikloalkil, cikloalkenil ili araldil. Ne moraju sve veze u polinukleotidu da budu identične. Prethodni opis se odnosi na sve ovde navede polinukleotide, uključujudi RNK i DNK.

[0059] "Varijabilni region" antitela se odnosi na varijabilni region lakog lanca antitela ili varijabilni region teškog lanca antitela, ili zasebno ili u kombinaciji. Varijabilni regioniteškog i lakog lanca se svaki zasebno odnose na četiri okvirna regiona (FR) koja su povezana za tri regiona koja određuju komplementarnost (CDR-i) koji su takođe poznati pod imenom hipervarijabilni regioni. CDR-i u svakom lancu se drže zajedno u neposrednoj blizini pomodu FRs i, sa CDRs iz drugog lanca, doprinose obrazovanju mesta za vezivanje antigena kod antitela. Postoje najmanje dve tehnike za određivanje CDR-a: (1) pristup koji je zasnovan na varijabilnosti sekvenci unakrsnih vrsta (tj., Kabat et al. Sequences of Proteins of Immunological Interest, (5th ed., 1991, National Institutes of Health, Bethesda MD)); i (2) pristup koji je zasnovan na kristalografskim ispitivanjima komleksa antigena i antitela (Al-lazikani et al (1997) J. Molec. Biol. 273:927-948)). Kao što se ovde koristi, CDR mogu da se odnose na CDR-e koji se definišu bilo kojim pristupom ili kombinacijom oba pristupa.

[0060] "Konstantni region" antitela odnosi se na konstantni region lakog lanca antitela ili konstantni region teškog lanca antitela, ili zasebno ili u kombinaciji.

[0061] Epitop koji se "preferencijalno vezuje" ili "specifično vezuje" (ove se koristi naizmenično) za antitelo ili polipeptid je termin koji je dobro poznat iz oblasti tehnike, i postupci za određivanje takvog specfičnog ili preferencijalnog vezivanja su takođe dobro poznai iz oblasti tehnike. Kaze se da molekul ispoljava "specifično vezivanje" ili "preferencijalno vezivanje" ukoliko reaguje ili se povezuje česde, brže, sa vedim trajanjem i/ili sa vedim afiniteom sa određenom delijom ili supstancom nego što radi sa alternativnim delijama ili supstancama. Antitelo se ciljano "specifično vezuje" ili "preferencijalno vezuje" ukoliko se vezuje sa vedim afinitetom, aviditetom, brže, i/ili sa vedim trajanjem u odnosu na to kada se vezuje za druge supstance. Na primer, antitelo koje se specifično ili preferencijalno vezuje za CGRP epitop je antitelo koje se vezuje za ovaj epitop sa vedim afinitetom, aviditetom, brže, i/ili sa vedim trajanjem u odnosu na to kada se vezuje za druge CGRP epitope ili epitope koji nisu CGRP. Čitanjem ove definicije takođe može da se razume da, na primer, antitelo (ili ostatak ili epitop) koje se specifično ili preferencijalno vezuje za prvi cilj može ili ne mora specifično ili preferencijalno da se vezuje za drugi cilj. Kao takvo, "specifično vezivanje" ili "preferencijalno vezivanje" nužno ne zahteva (iako može da uključi) ekskluzivno vezivanje. Generalno, ali ne nužno, referenca za vezivanje označava preferencijalno vezivanje.

[0062] Kao što se ovde koristi, "u osnovi čisto" se odnosi na matrijal koji je najmanje 50% čist (tj., oslobođen od kontaminacije), poželjnije najmanje 90 % čist, poželjnije najmanje 95% čist, poželjnije najmanje 98% čist, poželjnije najmanje 99% čist.

1

[0063] "Delija domadin" uključuje individualnu deliju ili delijsku kulturu koja može da bude ili jeste primalac vektor(a) za uključivanje polinukleotidnih inserata. Delije domadina uključuju potomstvo jedne delije domadina, i potomstvo ne mora u potpunosti da bude identično (u morfologiji ili u komplementu genomske DNK) sa originalnom roditeljskom delijom usled prirodne, slučajne, il namerno indukovane mutacije. Delija domadina uključuje delije u kojima je in vivo izvršena transfekcija sa polinukleotidom(a) ovog pronalaska.

[0064] Termin "Fc region" se koristi za definisanje C-terminalnog regiona teškog lanca imunoglobulina. "Fc region" može da bude nativna sekvenca Fc regiona ili varijanta Fc regiona. Iako granice Fc regiona teškog lanca imunoglobulina mogu da se razlikuju, Fc region teškog lanca humanog IgG se obično definiše tako da se pruža od ostatka aminokiseline na položaju Cys226, ili od Pro230, do njegovog krarboksi kraja. Obeležavanje ostataka u Fc regionu je prema EU indeksu kao u Kabatu. Kabat et al., Sequences of Proteins of Imunological Interest, 5th Ed. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Md., 1991. Fc region imunogloblina generalno sadrži dva konstantna domena, CH2 i CH3.

[0065] Kao što se ovde koristi, "Fc receptor" i "FcR" opisuju receptor koji se vezuje za Fc region antitela. Poželjni FcR je nativna sekvenca humanog FcR. Osim toga, poželjni FcR je onaj koji vezuje IgG antitelo (gama receptor) i uključuje receptore FcγRI, FcγRII, i FcγRIII podklasa, uključujudi varijante alela i alternativno splajsovane oblike ovih receptora. FcγRII receptori uključuju FcγRIIA ("aktivirajudi receptor") i FcγRIIB ("inhibirajudi receptor"), koji imaju slične sekvence aminokiselina koje se prvenstveno razlikuju u njihovim citoplazmatskim domenima. Pregled FcR-a se nalazi u Ravetch and Kinet, 1991, Ann. Rev. Immunol., 9:457-92; Capel et al., 1994, Immunomethods, 4:25-34; and de Haas et al., 1995, J. Lab. Clin. Med., 126:330-41. "FcR" takođe uključuje neonatalni receptor, FcRn, koji je odgovoran za prenošenje majčinih IgG-a u fetus (Guyer et al., 1976, J. Immunol., 117:587; and Kim et al., 1994, J. Immunol., 24:249).

[0066] "Citotoksičnost koja je zavisna od komplementa" i "CDC" se odnose na ciljano liziranje u prisustvu komlementa. Put aktivacije komplementa je iniciran vezivanjem prve komponente sistema komplementa (C1q) za molekul (npr. antitelo) u kompleksu sa sredonim antigenom. Za ispitivanje aktivacije komplementa, može da se izvede CDC test, npr. kao što se opisuje u Gazzano-Santoro et al., J. Immunol. Methods, 202:163 (1996).

[0067] "Funkcionalni Fc region" sadrži najmanje jednu efektorsku funkciju nativne sekvence Fc regiona. Primeri "efektorskih funkcija" uključuju vezivanje C1q ; citotoksičnost koja zavisi od komplementa (CDC); vezivanje Fc receptora; delijski posredovanu citotoksičnost koja zavisi od antitela (ADCC); fagocitozu; nishodnu regulaciju receptora na delijskoj površini (npr. B delijski receptor; BCR), itd. Takve efektorske funkcije generalno zahtevaju kombinovanje Fc regiona sa vezujudim domenom (npr. varijabilnim domenom antitela) i može da se ispita upotrebom različitih testova koji su u oblasti tehnike poznati za evaluaciju takvih efektorskih funkcija antitela.

[0068] "Nativna sekvenca Fc regiona" sadrži sekvencu aminokiselina koja je identična sa sekvencom aminokiselina Fc regiona koja može da se nađe u prirodi. "Varijanta Fc regiona" sadrži sekvencu aminokiselina koja se razlikuju u odnosu na nativnu sekvencu Fc regiona na osnovu najmanje jedne

1

modifikacije aminokiseline, dok zadržava najmanje jednu efektorsku funkciju nativne sekvence Fc regiona. Poželjno, varijanta Fc regiona ima najmanje jednu supstituciju aminokiseline u poređenju sa nativnom sekvencom Fc regiona ili sa Fc regionom roditeljskog polipeptida, npr. od oko jedne do oko deset supstitucija aminokiselina, i poželjno od oko jedne do oko pet supstitucija aminokiselina u nativnoj sekvenci Fc regiona ili u Fc regionu roditeljskog polipeptida. Varijanta Fc regiona ovde poželjno ima najmanje oko 80% sličnosti sekvence sa nativnom sekvencom Fc regiona i/ili sa Fc regionom roditeljskog polipeptida, i najpoželjnije najmanje oko 90% identičnosti sekvence sa njim, poželjnije najmanje oko 95%, najmanje oko 96%, najmanje oko 97%, najmanje oko 98%, najmanje oko 99% identičnosti sekvence sa njim.

[0069] Kao što se ovde koristi "citotoksičnost posredovana delijama koja je zavisna od antitela" i "ADCC" se odnosi na reakciju koja je posredovna delijama u kojoj nespecifične citotksične delije koje eksprimiraju Fc receptore (FcR-e) (npr. prirodne (NK) delije ubice, neutrofili, i makrofagi) prepoznaju antitelo koje je vezano za ciljanu deliju i nakon toga prouzrokuju liziranje ciljane delije. ADCC aktivnost molekula od interesa može da se ispita upotrebom ADCC testa, kao što je onaj koji se opisuje u U.S. Patent No.5,500,362 or 5,821,337. Korisne efektorske delije za takve testove uključuju mononuklearne delije iz periferne krvi (PBMC) i NK delije. Alternativno, ili dodatno, ADCC aktivnost molekula od interesa može da se ispita in vivo, npr., u životinjskom modelu kao što je prikazano u Clynes et al., 1998, PNAS (USA), 95:652-656.

[0070] Kao što se ovde koristi, "tretman" je pristup za dobijanje korisnih ili željenih kliničkih rezultata. Za svrhe ovog pronalaska, korisni ili željeni klinički rezultati uključuju, ali bez ograničenja, jedno ili više od slededih: poboljšanje u bilo kom aspektu glavobolje uključujudi slabljenje simptoma, ublažavanje intenziteta bola, i drugih povezanih simptoma, smanjenje učestalosti ponovnog pojavljivanja, povedanja kvaliteta života onih individua koje boluju od glavobolje, i smanjenja doze drugih lekova koji su neophodni za lečenje glavobolje. Za migrenu, drugi povezani simptomi uključuju, ali bez ograničenja, mučninu, povradanje, i osetljivost na svetlost, zvuk, i/ili kretanje. Za klaster glavobolju, drugi povezani simptomi uključuju, ali bez ograničenja na oticanje ispod ili oko očiju, intenzivno suzenje očiju, crvenilo očiju, Rinoreju ili nazalnu kongenstiju, i crvenilo lica.

[0071] "Smanjenje učestalosti" glavobolje označava bilo koje od smanjenja ozbiljnosti simptoma (koje može da uključuje smanjenje potrebe za i/ili količine za (npr., izlaganja prema) drugim lekovima i/ili terapijama koje se generalno koriste za ovo stanje, uključujudi, na primer, ergotamin, dihidroergotamin, ili triptane za migrenu), trajanje, i/ili učestalost (uključujudi, na primer, odlaganje ili povedavanje vremena do sledede epizode napada kod individue). Kao što je jasno stručnjacima iz oblasti tehnike, pojedinici mogu da se razlikuju u pogledu njihovog odgovora na tretman, i, kao takvo, na primer, "postupak za smanjenje učestalosti glavobolje kod individue" odražava davanje anti-CGRP antagonista antitela koje se zasniva na razumnom očekivanju da takvo davanje može najverovatnije da prouzrokuje takvo smanjenje u učestalosti kod određene individue.

[0072] "Ublažavanje" glavobolje ili jednog ili više simptoma glavobolje označava slabljenje ili poboljšanje jednog ili više simptoma glavobolje u poređenju sa ne davanjem antagonističkog anti-CGRP antitela. "Ublažavanje" takođe uključuje skaradenje ili smanjenje trajanja simptoma.

1

[0073] Kao što se ovde koristi, "kontrolisanje glavobolje" se odnosi na održavanje ili smanjenje ozbiljnosti ili trajanja jednog ili više simptoma glavobolje ili učestalosti napada glavobolje kod individue (u poređenju sa nivoom pre tretmana). Na primer, trajanje ili ozbiljnost simptoma bola u glavi, ili učestalost napada je smanjena za najmanje od bilo kog oko 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, ili 70% kod individue u poređenju sa nivoom pre tretmana.

[0074] Kao što se ovde koristi, "odlaganje" razvijanja glavobolje znači odložiti, sprečiti, usporiti, odložiti, stabilizovati, i/ili odgoditi progresiju bolesti. Ovo odlaganje može da bude u različitim vremenskim trajanjima, u zavisnosti od istorije bolesti i/ili individua koje se leče. Kao što je očigledno stručnjaku iz oblasti tehnike, dovoljna ili značajna količina odlaganja može, u stvari, da obuhvati prevenciju, u kojoj individua ne razvija glavobolju (npr., migrenu). Postupak koji "odlaže" razvijanje simptoma je postupak koji smanjuje verovatnodu razvijanja simptoma u datom vremenskom okviru i/ili smanjuje obim simptoma u datom vremenskom okviru, u poređenju sa tim kada se ovaj postupak ne koristi. Takva poređenja su obično zasnovana na kliničkim ispitivanjima, upotrebom statistički značajnog broja subjekata..

[0075] "Napredovanje" ili "progresija" glavobolje označava početne manifestacije i/ili narednu progresiju poremedaja. Razvijanje glavobolje može da se otkrije i ispita upotrebom standardnih kliničkih postupaka koji su dobro poznati iz oblasti tehnike. Međutim, razvijanje se takođe odnosi na progresiju koja može da prođe neopaženo. Za svrhu ovog pronalaska, razvijanje ili progresija se odnosi na biološki tok simptoma. "Razvijanje" uključuje javljanje, ponovno javljivanje, i početak. Kao što se ovde koristi "početak" ili "javljanje" glavobolje uključuje inicijalni početak i/ili ponovno pojavljivanje.

[0076] Kao što se ovde koristi, "efikasna doza" ili "efikasna količina" leka, jedinjenja, ili farmaceutske kompozicije je količina koja je dovoljna da pokrene korisne ili željene rezultate. Za profilaktičku upotrebu, korisni ili željeni rezultati uključuju rezultate kao što je eliminacija ili smanjenje rizika, smanjenje ozbiljnosti simptoma, ili odlaganje početka razvoja bolesti, uključujudi biohemijske, histološke i/ili bihevioralne simptome bolesti, komplikacije u vezi sa bolesti i intermedijerne patološke fenotipove koji su prisutni u toku razvoja bolesti. Za terapeutsku upotrebu, korisni iil željeni rezultati uključuju kliničke rezultate kao što su smanjenje intenziteta bola, trajanje, ili učestalost napada glavobolje, i smanjenje jednog ili više simptoma koji se razvijaju iz glavobolje (biohemijski, histološki i/ili biohevioralni), uključujudi njegove komplikacije i intermedijerne patološke fenotipove koji su prisutni u toku razvoja bolesti, povedanjem kvaliteta života onih individua koje imaju bolest, smanjenjem doze drugih lekova koi su neophodni za lečenje bolesti, pojačavanjem efekta drugih lekova, i/ili odlaganjem progresije bolesti kod pacijenta. Efikasna doza može da se daje u jednom ili više davanja. Za svrhu ovog pronalaska, efikasna doza leka, jedinjenja, ili farmaceutske kompozicije je dovoljna da se postigne profilaktički ili terapeutski tretman ili direktno ili indirektno. Kao što se razume i kliničkog konteksta, efikana doza leka, jedinjenja, ili farmaceutske kompozicije može ili ne mora da se postigne zajedno sa drugim lekom, jedinjenjem, ili farmaceutskom kompozicijom. Prema tome, "efikasna doza" može da se razmatra u kontekstu davanja jednog ili više terapeutskih sredstava, i smatra se da jedno sredstvo može da se daje u efikasnoj količini ukoliko, zajedno sa jednim ili više drugih sredstava, može da se postigne ili jeste postignut željeni rezultat.

1

[0077] "Individua" ili "subjekat" je sisar, poželjnije čovek. Sisari takođe uključuju, ali bez ograničenja, domade životinje, sportske životinje, ljubimce, primate, konje, pse, mačke, miševe i pacove.

[0078] Kao što se ovde koristi, "vektor" označava konstrukt, pomodu koga mogu da se isporuče, i poželjno ekprimiraju, jedan ili više gen(a) ili sekvennca(i) u deliji domadina. Primeri vektora uključuju, ali bez ograničenja, virusne vektore, čiste DNK ili RNK ekspresione vektore, plazmid, kozmid ili fagne vektore, DNK ili RNK ekspresione vektore koji su povezani sa katjonskim sredstvima za kondenzovanje, DNK ili RNK ekspresione vektore koji su inkapsulirani u lipozomima, i određene eukariotske delije, kao što su delije proizvođači.

[0079] Kao što se ovde koristi, "ekspresiona kontrolna sekvenca" označava sekvencu nukleinske kiseline koja usmerava transkripciju nukleinske kiseline. Ekspresiona kontrolna sekvenca može da bude promoter, kao što je konstitutivni ili inducibilni promoter, ili pojačivač. Ekspresiona kontrolna sekvenca je operativno vezana sa sekvencom nukleinske kiseline koja treba da se transkribuje.

[0080] Kao što se ovde koristi, "farmaceutski prihvatljivi nosač" ili "farmaceutski prihvatljivi ekscipijent" uključuje bilo koji materijal koji, kada se kombinuje sa aktivnim sastojkom, omogudava sastojku da zadrži biološku aktivnost i da ne interaguje sa imunskim sistemom domadina. Primeri uključuju, ali bez ograničenja, bilo koje standardne farmaceutske nosače kao što je rastvor fosfatnog pufera, vodu, emulzije kao što je emulzija ulja u vodi, i različiti tipovi sredstva za vlaženje. Poželjni rastvarači za davanje u obliku aerosoli ili parenteralno davanje su rastvor fosfatnog pufera normalnog (0,9 mas%) rastvora soli. Kompozicije koje sadrže takve nosače su formulisane dobro poznatim konvencionalnim postupcima (videti, na primer, Remington’s Pharmaceutical Sciences, 18th edition, A. Gennaro, ed., Mack Publishing Co., Easton, PA, 1990; and Remington, The Science and Practice of Pharmacy 20th Ed. Mack Publishing, 2000).

[0081] Termin "kasoc", kao što se ovde koristi, je namenjen da se odnosi na konstantu brzine za spajanje antitela sa antigenom.

[0082] Termin "kdis", kao što se ovde koristi, je namenjen da se odnosi na konstantu brzine dioscijacije antitela iz kompleksa antitela/antigena.

[0083] Termin "KD", kao što se ovde koristi, je namenjen da se odnosi na ravnotežnu konstantu disocijacije interakcije antitela i antigena.

[0084] Kao što se ovde koristi, termin "vazomotorni simptom," je namenjen da se odnosi na stanja koja su u vezi sa vazodilatacijom i uključuju klaster glavobolju.

A. Postupci za prevenciju ili lečenje vazomotronih simptoma

[0085] U jednom aspektu, pronalazak obezbeđuje anti-CGRP antagonističko antitelo za upotrebu u postupku lečenja ili prevencije klaster glavobolje kod individue koji obuhvata davanje individui efikasne količine anti- CGRP antagonističkog antitela.

1

[0086] U drugom aspektu, pronalazak obezbeđuje anti-CGRP antagonističko antitelo za upotebu u postupku ublažavanja, kontrole, smanjenja pojavljivanja, ili odlaganja razvoja ili progresije klaster glavobolje kod individue koja obuhvata davanje individui efikasne količine anti-CGRP antagonističkog antitela.

[0087] U drugom aspektu, pronalazak obezbeđuje anti-CGRP antagonističko antitelo za upotrebu u postupcima ublažavanja, kontrolisanja, smanjenja pojavljivanja, ili odlaganja razvoja ili progresije klaster glavobolje kod individue koji obuhvaju davanje individui efikasne količine anti-CGRP antagonističkog antitela u kombinaciji sa najmanje jednim dodatnim sredstvom koje je korisno za lečenje glavobolje.

[0088] Takva dodatna sredstva uključuju, ali bez ograničenja, agoniste 5-HT i NSAID-a. Na primer, antitelo i najmanje jedno dodatno sredstvo može da se daje istovremeno, tj., mogu da se daju u neposrednoj vremenskoj blizini da se omogudi prekapanje njihovih individualnih terapeutskih efekata. Na primer, količina agonista 5-HT ili NSAID koji se daju u kombinaciji sa anti-CGRP antitelom treba da bude dovoljna da smanji učestalnost relapsa glavobolje kod pacijenata ili da proizvede efikasnost koja ima duže trajanje u poređenju sa davanjem bilo kog od ovih sredstava u odsustvu drugog. Ovaj postupak može da se koristi za lečenje glavobolja koje se nalaze u širokom opsegu klasa: migrena sa ili bez aure; hemiplegične migrene; klaster glavobolje; migrenozne neuralgije; hronične glavobolje; tenzione glavobolje; glavobolje koje nastaju kao rezultat drugih medicinskih stanja (kao što je infekcija ili pojačani pritisak u lobanji usled prisustva tumora); hronična paroksizmalna hemikranija; različite glavobolje koje nisu povezane sa strukturnom lezijom; glavobolja koja je povezana sa intrakranijalnim poremedajem koji nije vaskularne prirode; glavobolja koja je povezana sa davanjem supstance ili njenim povlačenjem; glavobolja koja je povezana sa necefaličnom infekcijom; glavobolja koja je povezana sa metaboličkim poremedajem; glavobolja koja je povezana sa poremedajem kranijuma, vrata, očiju, ušima, nosem, sinusima, zubima, ustima ili drugom facijalnom ili kranijalnom stukturom; kranijalne neuralgije; i bol nervnog stabla i bol usled neurološke povrede.

[0089] Stručnjaci iz oblasti tehnike de modi da odrede odgovarajude dozne količine za određena sredstva koja de se koristiti u kombnaciji sa anti-CGRP antitelom. Na primer, sumatriptan može da se daje u doznom obliku od oko 0,01 do oko 300 mg. Kada se ne daje parenteralno, tipična doza sumatriptana je od oko 25 do oko 100 mg sa oko 50 mg koje je generalno poželjno, kada se daje parenteralno, poželjna doza je oko 6 mg. Međutim, ove doze mogu da se razlikuju prema postupcima iz oblasti tehnike tako da se optimizuju za posebnog pacijenta ili za posebnu kombinovanu terapiju. Dalje, na primer, celekoksib može da se daje u količini od između 50 i 500 mg. Referenca na anti-CGRP antagonistička antitela takođe uključuje kompozicije koje sadrže jedno ili više ovih sredstava. Ove kompozicije mogu dalje da sadrže pogodne ekscipijente, kao što su farmaceutski prihvatljivi ekscipijenti uključujudi pufere, koji su dobro poznati u oblasti tehnike. Anti-CGRP antagonistička antitela za upotrebu u predmetnom pronalasku mogu zasebno da se koriste ili u kombinaciji sa drugim konvencionalnim postupcima lečenja.

[0090] Anti-CGRP antagonističko antitelo može da se daje individui upotrebom bilo kog pogodnog načina. Stručnjaku iz oblasti tehnike je jasno da primeri koji se ovde opisuju nisu namenjeni da ograničavaju ved dapredstave dostupne tehnike. Prema tome, u nekim izvođenjima, anti-CGRP

2

antagonističko antitelo se daje individui u skladu sa poznatim postupcima, kao što je intravenozno davanje, npr., kao bolus ili kontinualno infuzijom u vremenskom periodu, intramuskularno, intraperitonealno, intracerebrospinalno, subkutano, intraarticularno, sublingvalno, intrasinovijalno, preko insulacije, intratekalno, oralno, inhalacijom ili topikalnim načinima. Davanje može da bude sistemsko, npr., intravenozno davanje, ili lokalizovano. Za davanje su korisni komercijalno dostupni nebulizatori za tečne formulacije, uključujudi džet nebulizatore i ultrasoničnične nebulizatore. Tečne formulacije mogu da budu direktno nebulizovane i liofilizovani prah može da bude nebulizovan nakon rekonstitucije. Alternativno, anti-CGRP antagonističko antitelo može da bude aerosolizovano korišdenjem fluorokarbonske formulacije i doznog inhalatora sa merenjem, ili inhalirano kao liofilizovani i usitnjeni prah.

[0091] U jednom izvođenju, anti-CGRP antagonističko antitelo se daje pomodu mesto-specifičnih ili postupaka za ciljanu lokalnu isporuku. Primeri mesto specifičnih ili tehnika za cilajnu lokalnu isporuku uključuju različite depot izvore koji mogu da se implantiraju anti-CGRP antagonističkog antitela ili katetere za lokalnu isporuku, kao što su infuzioni kateteri, ugrađeni kateter, ili kateter sa iglom, sintetičke graftove, adventicione omotače, skretnice i stentove ili druge sprave za implantaciju, nosače specifične za mesto, direktno injektiranje, ili direktno nanošenje. Videti, npr., PCT objavu br. WO 00/53211 i U.S. objavu br.5,981,568.

[0092] Različite formulacije anti-CGRP antagonističkog antitela mogu da se koriste za davanje. U nekim izvođenjima, može da se daje čisto anti-CGRP antagonističko antitelo. U nekim izvođenjima, anti-CGRP antagonističko antitelo i farmaceutski prihvatljivi ekscipijent mogu da budu u različitim formulacijama. U oblasti tehnike su poznati farmaceutski prihvatljivi ekscipijenti, koji su relativno inertne supstance koje olakšavaju davanje farmakološki efikasne supstance. Na primer, eksipijent može da daje oblik ili konzistenciju, ili može da deluje kao rastvarač. Pogodni ekscipijenti uključuju, ali bez ograničenja stredstva za stabilizaciju, vlaženje i sredstva za emulgovanje, soli za različitu osmolarnost, sredstva za inkapsulaciju, pufere, i pojačivače za prodirane kroz kožu. Ekscipijenti kao i formulacije parenteralno i neparenteralno davnaje leka su predstavljeni u Remington, The Science and Practice of Pharmacy 20th Ed. Mack Publishing (2000).

[0093] U nekim izvođenjima, ova sredstva su formulisana za davanje injekcijom (npr., intraperitonealno, intravenozno, subkutano, intramukularno, itd.). Prema tome, ova sredstva mogu da se kombinuju sa farmaceutski prihvatljivim nosačem kao što je rastvor soli, Ringerov rastvor, rastvor dektroze, i slično. Za posebni dožnji režim, tj., doza, vreme i ponavljanje, de zavisiti od posebne individue i medicinske istorije individue.

[0094] Anti-CGRP antitelo može da se daje bilo kojim pogodnim postupkom, uključujudi davanje injekcijom (npr., intraperitonealno, intravenozno, subkutano, intramuskularno, itd.). Anti-CGRP antitela mogu takođe da se daju inhalacijom, kao što se ovde opisuje. Generalno, za davanje anti-CGRP antitela, početna kandidat doza može da bude oko 2 mg/kg. Za svrhu predmetnog pronalaska, tipična dnevna doza može da ima opseg od bilo kog od 3µg/kg do 30 µg/kg do 300 µg/kg do 3 mg/kg, do 30 mg/kg do 100 mg/kg ili više, u zavisnost od faktora koji se pominju u tekstu iznad. Na primer, može da se koristi doza oko 1 mg/kg, oko 2.5 mg/kg, oko 5 mg/kg, oko 10 mg/kg, i oko 25 mg/kg. Za davanja koja se ponavljaju tokom nekoliko dana ili duže, u zavisnosti od stanja, lečenje se zadržava dok se željeni simptomi supresije pojave ili dok se ne postignu željeni terapeutski nivoi, na primer, smanjenja bola. Primer doznog režima sadrži davanje početne doze oko 2 mg/kg, nakon čega sledi nedeljna doza za održavanje oko 1 mg/kg anti-CGRP antitela, nakon čega sledi doza za održavanje oko 1 mg/kg svake druge nedelje. Međutim, drugi dozni režimi mogu da budu korisni, u zavisnosti ob obrasca farmakokinetičkog raspada koje lekar želi da postigne. Na primer, u nekim izvođenjima se razmatra, doziranje jednom do četiri puta nedeljno. Napredovanje ove terapije se lako prati upotrebom konvencionalnih postupaka i testova. Dozni režim (uključujudi antagonist(e) CGRP koji se koriste) mogu da variraju tokm vremena.

[0095] Za svrhu predmetnog pronalaska, odgovarajuda doza anti-CGRP antagonističkog antitela de zavisiti od anti-CGRP antagonističkog antitela (ili njegove kompozicije) koja se koristi, tipa i ozbiljnosti simptoma klaster glavobolje koja treba da se leči, gde se sredstvo daje za preventivu ili terapeutske svrhe, prethodna terapija, klinička istorija pacijenta i odgovor na sredstvo, i diskrecionog prava lekara. Obično lekar daje, anti-CGRP antagonističko antitelo, dok se ne postigne doza koja daje željeni rezultat. Doza i/ili učestalost može da varira tokom trajanja tretmana.

[0096] Empirijska razmatranja, kao što su polu-život, generalno doprinose određivanju doze. Na primer, antitela koja su kompatibilna sa humanim imunskim sistemom, kao što su humanizovana antitela ili cela humana antitela, mogu da se koriste za produženje polu-života antitela i za sprečavanje napada na antitelo od strane humanog imunskog sistema. Učestalost davanja može da se odredi i prilagodi tokom trajanja terapije, i generalno je, ali nije neophodno, zasnovano na tretmanu i/ili supresiji i/ili ublažavanju i/ili odlaganju glavobolje (npr., migrene). Alternativno, mogu da budu odgovarajude formulacije anti-CGRP antagonističkih antitela sa odloženim kontinuiranim oslobađanjem. U oblasti tehnike su poznate različite formulacije i sredstva za postizanje odloženog oslobađanja.

[0097] U jednom izvođenju, doze za anti-CGRP antagonističko antitelo mogu empirijski da se odrede kod individua koji su primili jedno ili više davanje(a) an anti-CGRP antagonistikog antitela. Individuama se daju rastude doze anti-CGRP antagonističkog antitela. Za procenjivanje efikasnosti anti-CGRP antagonističkog antitela, može da se prati indikator bolesti.

[0098] Davanje anti-CGRP antagonističkog antitela u skladu sa upotrebom predmetnog pronalaska može da bude u kontinuitetu ili sa prekidima, u zavisnosti od, na primer, fiziološkog stanja pacijenta, bilo da je svrha davanja terapeutska ili profilaktička, i drugih faktora koji su poznati stručnjacima iz oblasti tehnike. Davanje anti-CGRP antagonističkog antitela može da bude u osnovi u kontinuitetu tokom prethodno odabranog vremenskog perioda ili može da bude u serijama odvojenih doza, npr., ili pre, tokom, ili nakon razvoja klaster glavobolje pre; tokom; pre i posle; tokom i posle; pre i tokom; ili pre, tokom, i posle razvoja klaster glavobolje. Davanje može da bude pre, tokom i/ili posle bilo kog događaja koji de verovatno dovesti do klaster glavobolje.

[0099] U nekim izvođenjima, može da bude prisutno više od jednog anti-CGRP antagonističkog antitela. Može da bude prisutno najmanje jedno, najmanje dva, najmanje tri, najmanje četiri, najmanje pet, ili više anti-CGRP antagonističkih antitela. generalno, ona anti-CGRP antagonistička antitela mogu da imaju komplementarne aktivnosti koje ne utiču negativno jedna na drugu. Antagonističko anti-CGRP antitelo može takođe da se koristi zajedno sa drugim antagonistima CGRP-a i antagonistima receptora za CGRP. Na primer, jedna ili više od slededih antagonista CGRP-a može da se koristi: anti-sens molekul specifičan za CGRP (uključujudi anti-sense molekul koji je specifičan za nukleinsku kiselinu koja kodira CGRP), inhibitorno jedinjenje za CGRP, trukturni analog CGRP-a, CGRP receptor sa dominantnom negativnom mutacijom koji vezuje CGRP, i anti-CGRP receptorko antitelo. Anti-CGRP antagonističko antitelo može takođe da se koristi zajedno sa drugim sredstvima koja služe za poboljšanje i/ili dopunjuju efikasnost sredstava.

[0100] Terapeutske formulacije anti-CGRP antagonističkih antitela koja se koriste u skladu sa upotrebom predmetnog pronalaska se pripremaju za skladištenje mešanjem antitela koje ima željeni stepen čistode po potrebi sa farmaceutski prihvatljvim nosačima, ekscipijensima ili sredstvima za stabilizaciju (Remington, The Science and Practice of Pharmacy 20th Ed. Mack Publishing (2000)), u obliku liofilizovanih formulacija ili vodenih rastvora. Prihvatljivi nosači, ekscipijensi, ili sredstva za stabilizaciju nisu toksični za recipijenta u dozama i koncentracijama u kojima se koriste, i mogu da sadrže pufere kao što su fosfatni, citratni, i druge organske kiseline; soli kao što je natrijum hlorid; antioksidanse uključujdi askorbinsku kiselinu i metionin; konzervanse (kao što je oktadecildimetilbenzil amonijum hlorid; heksametonijum hlorid; benzalkonijum hlorid, benzetonijum hlorid; fenol, butil ili benzil alkohol; alkil parabeni, kao što je metil ili propil paraben; katehol; resorcinol; cikloheksanol; 3-pentanol; i m-krezol); polipeptide niskih molekulskih masa (manje od oko 10 ostataka); proteine, kao što je albumin iz seruma, gelatin, ili imunoglobuline; hidrofilne polimere kao što je polivinilpirolidon; aminokiseline kao što je glicin, glutamin, asparagin, histidin, arginin, ili lizin; monosaharide, disaharide, i druge ugljene hidrate uključujudi glukozu, manozu, ili dekstrine; helirajuda sredstva kao što je EDTA; šedere kao što je saharoza, manitol, trehaloza ili sorbitol; suprotne jone koji obrazuju so kao što je natrijum; komplekse metala (npr. Zn-proteinske komplekse); i/ili ne-jonske surfaktante kao što su TWEEN™, PLURONICS™ ili polietilen glikol (PEG).

[0101] Lipozomi koji sadrže anti-CGRP antagonističko antitelo se dobijaju postupcima koji su poznati iz oblasti tehnike, kao što se opisuje u Epstein, et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 82:3688 (1985); Hwang, et al., Proc. Natl Acad. Sci. USA 77:4030 (1980); i U.S. Pat. Nos. 4,485,045 and 4,544,545. Lipozomi sa poboljšanim vremenom krvotoku su prikazani u U.S. Patent br. 5,013,556. Posebno korisni lipozomi mogu da se dobiju postupkom evaporacije reverzne faze sa lipidnom kompozicijom koja sadrži fosfatidilholin, holesterol i PEG-derivatizovani fosfatidiletanolamin (PEGPE). Lipozomi se istiskaju kroz filtere sa definisanim veličinama pora da se dobiju lipozomi sa željenim prečnikom.

[0102] Aktivni sastojci takođe mogu da budu zarobljeni u mikrokapsulama koje se pripremaju, na primer, postupcima koacervacije ili međuprostornom polimerizacijom, na primer, hidroksimetilceluloze ili želatinskih mikrokapsula i poli-(metilmetacilatnim) mikrokapsulama, redom, u koloidalnim sistemima za isporuku leka (na primer, lipozomima, mikrosferama albumina, microemulzijama, nano-česticama i nanokapsulama) ili u makroemulzijama. Takvi postupci su prikazani u Remington, The Science and Practice of Pharmacy 20th Ed. Mack Publishing (2000).

[0103] Mogu da se dobiju preparati sa odloženim oslobađanjem. Pogodni primeri preparata sa odloženim oslobađanjme uključuju polupropustljive matrice čvrstih hidrofobnih polimera koji sadrže antitelo, gde su matrice u obliku oblikovanih predmeta, npr. filmovi, ili mikrokapsule. Primeri matrica sa odloženim oslobađanjem uključuju include poliestre, hidrogelove (na primer, poli(2-hidroksietilmetakrilat), ili ’poli(v nilalkohol)), polilaktide (U.S. Pat. No. 3,773,919), kopolimere L-glutaminske kiseline i 7 etil-L-glutamat, ne-razgradivi etilen-vinil acetat, razgradive polimere mlečne kiseline-

2

glikolne kiseline kao što je LUPRON DEPOT ™ (injektabilne mikrosfere koje se sastoje iz kompolimera mlečne kiseline i glikolne kiseline i leuprolid acetat), saharoza acetat izobutirat, i poli-D-(-)-3-hidroksibuterna kiselina.

[0104] Formulacije koje se koriste za in vivo davanja moraju da budu sterilne. Ovo se brzo postiže, na primer, ceđenjem kroz sterilne membrane za ceđenje. Kompozicije terapeutskog anti-CGRP antagonističkog antitela se generalno drže u kontejneru koji ima sterilni pristupni ulaz, na primer, kesica sa intravenoznim rastvorom ili bočiča koja ima zatvarač koji je probušen sa hipodermnom iglom za injekcije.

[0105] U oblasti tehnike je dobro uspostavljena dijagnoza ili procena glavobolje. Procena može da se izvede na osnovu subjektivnih merenja, kao što je karakterizacija simptoma od strane pacijenta. Na primer, dijagnoza migrene može da se postavi na osnovu slededih kriterijuma: 1) epizodni napadi glavobolje koji traju 4 do 72 časova; 2) sa dva od slededih simptoma: unilateralni bol, pulsiranje, pogoršanje tokom kretanja, i bol umerenog ili srednjeg intenziteta; and 3) i jedan od slededih simptoma: mučnina ili povradanje, fotofobija ili fonofobija. Goadsby et al., N. Engl. J. Med.346:257-270, 2002.

[0106] Efikasnost tretmana može da se proceni postupcima koji su dobro poznati iz oblasti tehnike. Na primer, može da se proceni olakšanje u intenzitetu bola.Prema tome, u nekim izvođenjima, olakšanje u intenzitetu bola se subjektivno uočava nakon 1, 2, ili nekoliko časova nakon davanja anti-CGRP antitela. U nekim izvođenjima, učestalost napada glavobolje se subjektivno uočava nakon davanja anti-CGRP antitela.

B. Anti-CGRP antagonistička antitela

[0107] Pronalazak koristi anti-CGRP antagonističko antitelo, koje se odnosi na bilo koji molekul antitela koji blokira, suprimira ili smanjuje (uključujudi značajno) biološku aktivnost CGRP-a, uključujudi nishodne puteve koji su posredovani sa CGRP signalizacijom, kao što je vezivanje receptora i/ili pokretanje delijskog odgovora na CGRP.

[0108] Anti-CGRP antagonističko antitelo treba da ispoljava bilo koju od slededih karakteristika: (a) vezivanje za CGRP; (b) blokiranje CGRP od vezivanja za njegov receptor(e); (c) blokiranje ili smanjenje aktivacije receptora za CGRP (uključujudi aktivaciju cAMP-a); (d) inhibiranje biološke aktivnosti CGRP-a ili nishodnih puteva koji su posredovani signalnom funkcijom CGRP-a; (e) sprečavanje, ublažavanje, ili lečenje bilo kog aspekta glavobolje (npr., migrene); (f) povedanje uklanjanja CGRP-a; i (g) inhibiranje (smanjenje) sinteze CGRP-a, proizvodnje ili oslobađanja. U oblasti tehnike su poznata anti-CGRP antagonistička antitela. Videti, npr., Tan et al., Clin. Sci. (Lond). 89:565-73, 1995; Sigma (Missouri, US), proizvod broj C7113 (klon #4901); Plourde et al., Peptides 14:1225-1229, 1993.

[0109] Za svrhu ovog pronalaska, antitelo reaguje sa CGRP na način koji inhibira CGRP i/ili nishodne puteve koji su posredovani signalnom funkcijom CGRP-a. U nekim izvođenjima, anti-CGRP antagonističko antitelo prepoznaje humani CGRP. U nekim izvođenjima, anti-CGRP antagonističko antitelo vezuje oba i humani α-CGRP i β-CGRP. U nekim izvođenjima, anti-CGRP antagonističko antitelo se vezuje humani i CGRP pacova. U nekim izvođenjima, anti-CGRP antagonističko antitelo vezuje C-terminalni fragment koji ima aminokiseline 25-37 od CGRP. U nekim izvođenjima, anti-CGRP antagonističko antitelo vezuje C-terminalni epitop koji se nalazi u okviru aminokiselina 25-37 od CGRP.

[0110] Antitela koja su korisna u predmetnom pronalasku mogu da obuhvate monoklonska antitela, poliklonska antitela, fragmente antitela (npr., Fab, Fab’, F(ab’)2, Fv, Fc, etc.), himerna antitela, bispecifična antitela, heterokonjugovana antitela, jednolančana (ScFv), njihove mutante, kombinovane proteine koji sadrže porciju antitela (npr., domen antitela), humanizovana antitela, i bilo koju drugu modifikovanu konfiguraciju imunoglobulinskog molekula koja sadrži mesto prepoznavanja antigena željene specifičnosti, uključujudi varijante glikozilacije antitela, sekvence aminokiselina varijanti antitela, i kovalentno modifikovana antitela. Antitela mogu da budu mišja, pacovska, humana, ili bilo kog drugog porekla (uključujudi himerna ili humanizovana antitela).

[0111] U nekim izvođenjima, anti-CGRP antagonističko antitelo je monoklonsko antitelo. U nekim izvođenjima, anti-CGRP antagonističko antitelo je humanizovano. U nekim izvođenjima, antitelo je humano. U nekim izvođenjima, anti-CGRP antagonističko antitelo je antitelo G1 (kao što se ovde opisuju). U nekim izvođenjima, anti-CGRP antagonističko antitelo sadrži jedan ili više CDR(a) (kao što je jedan, dva, tri, četiri, pet, ili, u nekim izvođenjima, svih šest CDRa) antitela G1 ili varijanti od G1 koje su prikazane u Tabeli 6. U još drugim izvođenjima, anti-CGRP antagonističko antitelo sadrži sekvencu aminokiselina varijabilno regiona teškog lanca što je prikazano na Slici 5 (SEQ ID NO:1) i sekvencu aminokiselina varijabilnog regiona lakog lanca što je prikazano na Slici 5 (SEQ ID NO:2).

[0112] U nekim izvođenjima, antitelo sadrži modifikovani konstantni region, kao što je konstantni region koji je imunološki inertan koji se ovde opisuje. U nekim izvođenjima, konstantni region je modifikovan kao što se opisuje u Eur. J. Immunol. (1999) 29:2613-2624;i WO 99/58572. U drugim izvođenjima, antitelo sadrži konstantni region teškog lanca humanog IgG2 koji sadrži sledede mutacije: A330P331 u S330S331 (obeležavanje aminokiselina sa referencom prema divljem tipu IgG2 sekvence). Eur. J. Immunol. (1999) 29:2613-2624. U nekim izvođenjima, antitelo sadrži konstantni region IgG4 koji sadrži sledede mutacije: E233F234L235 u P233V234A235. U još drugim izvođenjima, konstantni region je aglikozilovan za N-vezanu glikozilaciju. U nekim izvođenjima, konstantni region je aglikozilovan za N-vezanu glikozilaciju mutacijom ostatka za vezivanje oligosaharida (kao što je Asn297) i/ili ogranilčavanja ostataka koji su deo sekvence za prepoznavanje N-glikozilacije u konstantnom regionu . U nekim izvođenjima, konstantni region je aglikozilovan za N-vezanu glikozilaciju. Konstantni region može da bude aglikozilovan za N-vezanu glikozilaciju enzimski ili eksprimiranjem u domadinu koji je deficijentan za glikozilaciju.

[0113] Afinitet vezivanja (KD) anti-CGRP antagonističkog antitela za CGRP (kao što je humani α-CGRP) može da bude oko 0,02 do oko 200 nM. U nekim izvođenjima, afinitet vezivanja je bilo koji od oko 200 nM, oko 100 nM, oko 50 nM, oko 10 nM, oko 1 nM, oko 500 pM, oko 100 pM, oko 60 pM, oko 50 pM, oko 20 pM, oko 15 pM, oko 10 pM, oko 5 pM, ili oko 2 pM. U nekim izvođenjima, afinitet vezivanja je manji od bilo kog oko 250 nM, oko 200 nM, oko 100 nM, oko 50 nM, oko 10 nM, oko 1 nM, oko 500 pM, oko 100 pM, ili oko 50 pM.

[0114] Jedan način za određivanje afiniteta vezivanja antitela za CGRP je merenjem afiniteta vezivanja monofunkcionalnih Fab fragmenta antitela. Da bi se dobili monofunkcionalni Fab

2

fragmenti, antitelo (na primer, IgG) može da se iseče papainom ili eksprimira rekombinantno. Afinitet anti-CGRP Fab fragmenta antitela može da se odredi površinskom plazmon rezonancijom (Biacore3000™ sistem površinske plazmon rezonancije (SPR), Biacore, INC, Piscataway NJ) koji je opremljen sa prethodno imobilizovanim senzorskim čipovima koji sadrže (SA) upotrebom HBS-EP pufera za pokretanje (0,01M HEPES, pH 7,4, 0.15 Nacl, 3mM EDTA, 0,005% v/v Surfaktant P20). Biotinilovani humani CGRP (ili bilo koji drugi CGRP) može da bude rastvoren u HBS-EP puferu do koncentracije koja je manja od 0,5 µg/mL i injektiraju preko individualnih kanala na čipu korišdenjem varijabilnih vremena za ostvarivanje kontakta, da bi se postigla dva opsega gustine antigena, ili 50-200 jedinica odgovora (RU) za detaljna kinetička ispitivanja ili 800-1,000 RU za skrining testove. Studije regeneracije su pokazale da 25mM NaOH u 25% v/v etanolu efektivno uklanja vezani Fab dok održava aktivnost CGRP-a na čipu preko 200 injekcija. Obično, serijska razblaženja (koncentracija u rasponu od 0,1-10x procenjene KD) prečišdenih Fab uzoraka se injektiraju 1 min na 100 mL/minuti i omogudava se vreme dispocijacije oko 2 sata. Koncentracije Fab proteina se određuju pomodu ELISA testa i/ili SDS-PAGE elektroforeze upotrebom Fab-a poznate koncentracije (kao što se određuje analizom aminokiselina) kao standarda. Kinetičke konstante asocijacije (kasoc) i brzina disocijacije (kdis) se istovremeno dobijaju uklapanjem podataka globalno sa 1:1 Langmuir modelom vezivanja (Karlsson, R. Roos, H. Fagerstam, L. Petersson, B. (1994). Methods Enzymology 6. 99-110) korišdenjem BIAevaluation programa. Vrednosti ravnotežene konstante disocijacije (KD) se računaju prema kasoc/kdis. Ovaj protokol je pogodan za upotrebu u određivanju afiniteta vezivanja antitela za bilo koji CGRP, uključujudi humani CGRP, CGRP drugog sisara (kao što je mišji CGRP, CGRP pacova, CGRP primata), kao i različitih oblika CGRP-a (kao što su α i β oblik). Afinitet vezivanja antitela se generalno meri na 25°C, ali takođe može da se meri na 37°C.

[0115] Anti-CGRP antagonistička antitela mogu da se dobiju bilo kojim postupkom koji je poznat iz oblasti tehnike. Način i režim imunizacije domadina životinje su generalno uskladu sa uspostavljenim i konvencionalnim postupcima za stimulaciju i proizvodnju antitela, kao što se dalje ovde opisuje. Generalni postupci za dobijanje humanih i mišjih antitela su poznati u oblasti tehnike i ovde se opisuju.

[0116] Podrazumeva se da bilo koji sisarski subjekat uključujudi ljude ili delija koja proizvodi antitelo može da bude manipulisana da služi kao osnova za proizvodnju sisarskih, uključujudi humanih, hibridoma delijskih linija. Obično, životinja domadin je inokulisana intraperitonealno, intramuskularno, oralno, subkutano, intraplantarno, i/ili intradermalno sa količinom imunogena, uključujudi kao što se ovde opisuje.

[0117] Hibridomi mogu da se dobiju od limfocita i imortalizovanih delija mijeloma delija korišdenjem opšteg postupka hibridizacije somatskih delija kog su razvili Kohler, B. i Milstein, C. (1975) Nature 256:495-497 or as modified by Buck, D. W., et al., In Vitro, 18:377-381 (1982). Dostupne linije mijeloma, uključujudi ali bez ograničenja na X63-Ag8.653 i one sa Salk Instituta, Centra za distribuciju delija, San Diego, Calif., USA, mogu da se koriste u postupku hibridizacije. Generalno, postupak uključuje fuzionisanje delija mijeloma i limfoidnih delija korišdenjem fuziogena odn. sredstva za ostvarivanje fuzije kao što je polietilen glikol, ili upotrebom električnih sredstava koja su dobro poznata stručnjacima iz oblasti tehnike. Nakon fuzije, delije se odvajaju iz medijuma za fuziju i gaje u selektivnom medijumu za rast, kao što je medijum koji sadrži hipoksantin-aminopterin-timidin (HAT), da bi se eliminisale roditeljske delije koje nisu hibridizovale. Bilo koji medijumi koji se ovde opisuju,

2

dopunjeni sa ili bez seruma, mogu da se koriste za kuturu hibridoma koji sekretuju monoklonska antitela. Kao druga alternativa za postupak fuzije delija, mogu da se koriste B delije koje su imortalizovne sa EBV da bi se proizvela anti-CGRP monoklonska antitela predmetnog pronalaska. Hibridomi se proširuju i subkloniraju, po potrebi, i supernatanti se ispituju za anti-imunogenu aktivnost upotrebom konvencionalnih postupaka imuno-testiranja (npr., radioimunotest, enzimski imunotest, ili fluorescentni imunotest).

[0118] Hibridomi koji mogu da se koriste kao izvor antitela obuhvataju sve derivate, delije potomke roditeljskih hibridoma koji proizvode monoklonska antitela koja su specifična za CGRP, ili njihovu porciju.

[0119] Hibridomi koji proizvode takva antitela mogu da se gaje in vitro ili in vivo upotrebom poznatih postupaka. Monoklonska antitela mogu da se izoluju iz medijuma kulture ili iz telesnih tečnosti, upotrebom konvencionalnih postupaka za prečišdavanje imunoglobulina kao što je nakupljanje pomodu amonijum sulfata, gel elektroforezom, dializom, hromatografijom, i ultraceđenjem, po potrebi. Ukoliko je neželjena aktivnost prisutna, može da se ukloni, na primer, prelaskom preparata preko adsorbenata koji su napravljeni od imunogena koji je vezan za čvrstu fazu i ispiranjem ili oslobađanjem željenih antitela sa imunogena. Imunizacija domadina životinje sa humanim CGRP, ili fragmentom koji sadrži ciljanu sekvencu aminokiselina koja je konjugovana sa proteinom koji je imunogen za vrstu koja treba da se imunizuje, npr., ’keyhole limpet ’hemocijanin (hemocijan iz Megathura crenulata), albumin iz seruma, tiroglobulin govečeta, ili inhibitor tripsina soje upotrebom bifunkcionalnog ili derivatizujudeg sredstva, na primer maleimidobenzoil sulfosukcinimid estra (konjugovan kroz ostatke cisteina), N-hidroksisukcinimid (kroz ostatke lizina), glutaradehid, sukcinatni anhidrid, SOCl2, ili R1N=C=NR, gde R i R1 su različite alkil grupe, može da se dobije populacija antitela (npr., monoklonskih antitela).

[0120] Po potrebi, anti-CGRP antagonističko antitelo (monoklonsko ili poliklonsko) od interesa može da bude sekvencirano i polinukleotidna sekvenca može zatim da bude klonirana u vektor za ekpresiju ili propagaciju. Sekvenca koja kodira antitelo od interesa može da se održava u vektoru u deliji domadinu i delija domadina zatim može da bude proširena i zamrznuta za bududu upotrebu. U alternativi, polinukleotidna sekvenca može da se koristi za genetsku manipulaciju da bi se "humanizovalo" antitelo ili da bi se poboljšao afinitet, ili druge karakteristike antitela. Na primer, konstantni region može da se izmeni tako da više liči na humane konstantne regione da bi se izbegao imunski odgovor ukolko se antitelo koristi u kliničkim istraživanjima za lečenje ljudi. Može biti poželjno vršiti genetsku manipulaciju sekvence antitela da bi se dobio vedi afnitet za CGRP i veda efikasnost za inhibiranje CGRP. Stručnjaku iz oblasti tehnike de biti jasno da jedna ili više polinukleotidnih promena može da se napravi u anti-CGRP antagonističkom antitelu i da se pored stoga još zadrži njegova sposobnost vezivanja za CGRP.

[0121] Postoje četiri opšta koraka za humanizovanje monoklonskog antitela. Oni su: (1) određivanje nukleotida i predviđanje sekvence aminokiselina početnih varijabilnih lakih i teških domena (2) dizajniranje humanizovanog antitela, tj., odluka koji de se okvirni region antitela koristiti tokom procesa humanizacije (3) stvarne metodologije/postupci za humanizaciju i (4) transfekcija i ekspresija humanizovanog antitela. Videti, na primer, U.S. Patent br-e. 4,816,567; 5,807,715; 5,866,692; 6,331,415; 5,530,101; 5,693,761; 5,693,762; 5,585,089; i 6,180,370.

2

[0122] Opisani su brojni "humanizovani" molekuli antitela koji sadrže mesto za vezivanje antigena koji se dobijaju od ne-humanog imunoglobulina, uključujudi himerna antitela koja imaju V region glodara ili modifikovane V regione glodara i njihovih povezanih regiona koji određuju komplementarnost (CDR-a) koji su kombinovani sa humanim konstantnim domenima. Videti, na primer, Winter et al. Nature 349:293-299 (1991), Lobuglio et al. Proc. Nat. Acad. Sci. USA 86:4220-4224 (1989), Shaw et al. J Immunol. 138:4534-4538 (1987), and Brown et al. Cancer Res. 47:3577-3583 (1987). Druge reference opisuju CDR-e porekom od glodara koji su graftovani u humani okvirni region (FR) pre kombinovanja sa odgovarajudim humanim konstantnim domenom. Videti, na primer, Riechmann et al. Nature 332:323-327 (1988), Verhoeyen et al. Science 239:1534-1536 (1988), i Jones et al. Nature 321:522-525 (1986). Druga referenca opisuje CDR-e koji su podržani rekombinantno pokrivenim okvirnim regionom glodara. Videti, na primer, objavu evropskog patenta br. 0519596. Ovi "humanizovani" molekuli su dizajnirani da minimizuju neželjeni imunološki odgovor prema glodarskim anti-humanim molekulima antitela koji ograničava the trajanje i efikasnost terapeutskih primena ovih grupa kod humanih recipijenata. Na primer, konstantni region antitela može da bude konstruisan tako da bude imunološki inertan (npr., ne pokrede lizu koja je posredovana komplementom). Videti, npr. WO 99/58572. Drugi postupci humanizovanih antitela koji takođe mogu da se koriste su prikazani u Daugherty et al., Nucl. Acids Res. 19:2471-2476 (1991) i u U.S. Patent Nos. 6,180,377; 6,054,297; 5,997,867; 5,866,692; 6,210,671; i 6,350,861; i u PCT objavi br. WO 01/27160.

[0123] U još drugoj alternativi, potpuno humana antitela mogu da se dobiju upotrebom komercijalno dostupnih miševa koji su genetski izmenjeni tako da eksprimiraju specifične humane imunoglobulinske proteine. Transgene životinje su dizajnirane da proizvode poželjnije (npr., potpuno humana antitela) ili jači imunski odgovor može takođe da se koristi za dobijanje humanizovanih ili humanih antitela. Primeri takve tehnologije su Xenomouse ™ od Abgenix, Inc. (Fremont, CA) i HuMAb-Mouse® i TC Mouse™ od Medarex, Inc. (Princeton, NJ).

[0124] U alternativi, antitela mogu da se dobiju rekombinantnii eksprimiraju upotrebom bilo kog postupka koji je poznat iz oblasti tehnike. U drugoj alternativi, antitela mogu da se rekombinantno dobiju pomodu postupka fagnog prikaza. Videti, na primer, U.S. Patent Nos. 5,565,332; 5,580,717; 5,733,743; i 6,265,150; i Winter et al., Annu. Rev. Immunol. 12:433-455 (1994). Alternativno, postupak fagnog prikaza (McCafferty et al., Nature 348:552-553 (1990)) može da se koristi za proizvodnju humanih antitela i fragmenata antitela in vitro, iz repertoara gena varijabilnog (V) domena imunoglobulina iz neimunizovanih donora. Prema ovom postupku, geni V domena antitela se kloniraju uokvir čitanja u ili veliki ili manji gen za protein omotača filamentoznog bakteriofaga, kao što je M13 ili fd, i prikazuju se kao funkcionalni fragmenti antitela na površini fagne čestice. Zbog toga što filamentozna čestica sadrži jednolančanu DNK kopiju fagnog genoma, selekcija koja se zasniva na funkcionalnim svojstvima antitela takođe dovodi do selekcije gena koji kodra antitelo koje ispoljava ova svojstva. Prema tome, fag imitira neka svojstva B delja. Fagni prikaz može da se izvodi u različitim formatima; za pregled videti, e.g., Johnson, Kevin S. and Chiswell, David J., Current Opinion in Structural Biology 3:564-571 (1993). Nekoliko izvora V-genskih segmenata mogu da s ekoriste za fagni prikaz. Clackson et al., Nature 352:624-628 (1991) su izolovali niz različih anti-oksazolon antitela iz male nasumične kombinatorne biblioteke V gena koji su dobijeni iz slezina imunizovanih miševa. Može da se konstruiše repertoar V gena od imunizovanih humanih donora i mogu da se

2

izoluju antitela za različite vrste antigena (uključujudi sopstvene antigene) u osnovi prema postupcima koji se opisuju u Mark et al., J. Mol. Biol.222:581-597 (1991), or Griffith et al., EMBO J.

12:725-734 (1993). U priridnom imunskom odgovoru, geni za antitela u visokoj stopi akumuliraju mutacije (somatske hipermutacije). Neke od uvedenih promena de dodaeliti vedi afinitet, i B delije koje ispoljavaju immunoglobulin na površini sa visokim afinitetom se preferencijalno umnožavaju i diferenciraju tokom narednog izazova antigenom. Ovaj prirodni proces može da se imitira korišedenjem postupka pod imenom "mešanje lanca." Marks, et al., Bio/Technol. 10:779-783 (1992)). U ovom postupku, afinitet "primarnih" humanih antitela koja se dobijaju fagnim prikazom može da se unapredi sekvencijalnim menjanjem gena u V region teškog i lakog lanca sa repertoarima varijanata koje se pojavljuju u prirodi (repertoari) gena V domena koji se dobijaju od neimunizovanih donora. Ovaj postupak omogudava proizvodnju antitela i fragmenata antitela sa afinitetima koji se nalaze u opsegu pM-nM. Strategija za dobijanje veom velikih repertoara fagnih antitela (takođe poznata pod imenom "majka svih biblioteka") je opisana od strane Waterhouse et al., Nucl. Acids Res.21:2265-2266 (1993). Mešanje gena može takođe da se koristi da se humana antitela izvedu od antitela glodara, gde humano antitelo ima slične afinitete i specifičnosti sa početnim antitelom glodara. Prema ovom postupku, koji se takođe zove "imprinting epitopa", gen V domena teškog ili lakog lanca antitela glodara koji se dobijaju postupkom fargnog prikaza se zamenjuje sa repertoarom humanih gena V domena, pri čemu se dobijaju glodarske-humane himere. Selekcija antigena dovodi do izolacije humanih varijabilnih regiona koji mogu ponovo da uspostave funkcionalno mesto za vezivanje antigena, tj., epitop reguliše (imprintuje) izbor partnera. Gde se proces ponavlja da bi se zamenio preostali V domen, dobija se humano antitelo (videti PCT objavu br. WO 93/06213, objavljenu 1 aprila, 1993). Za razliku od tradicionalne humanizacije antitela glodara pomodu CDR graftinga, ovaj postupak obezbeđuje kompletno humana antitela, koja nemaju okvirni region ili CDR ostatke glodarkog porekla.

[0125] Očigledno je da iako se gore navedena diskusija odnosi na humanizovana antitela, generalni principi koji se razmatraju se primenjuju za prilagođavanje antitela za upotrebu, na primer, kod pasa, mačaka, primata, konja i govečeta. Dalje je jasno da jedan ili više aspekata humanizovanja antitela koji su ovde prikazani mogu da se kombinuju, npr., CDR graftom, mutacijama okvirnog regiona i mutacijama CDR.

[0126] Antitela mogu rekombinantni da se dobiju prvo izolovanjem antitela i delija koje proizvode antitela iz životinja domadina, dobijanjem sekvence gena, i upotrebom genske sekvence za rekombinantno eksprimiranje antitela u delijama domadina (npr., CHO delijama). Drugi postupak koji može da se koristi je eksprimiranje sekvence antitela u biljakama (npr., duvan) ili transgene mleko. Prikazani su postupci za eksprimiranje rekombinantnih antitela u biljkama ili mleku. Videti, na primer, Peeters, et al. Vaccine 19:2756 (2001); Lonberg, N. and D. Huszar Int.Rev.Immunol 13:65 (1995); and Pollock, et al., J Immunol Methods 231:147(1999). U oblasti tehnike su poznati postupci za dobijanje derivata antitela, npr., humanizovanih, jednolančanih, itd..

[0127] Imunotestovi i tehnike sortiranja protočnom fliorocitometrijom kao što je sortiranje fluorescentno aktiviranh delija (FACS) takođe može da se koristi za izolovanje antitela koja su specifična za CGRP.

2

[0128] Antitela mogu da budu vezana za moge različite nosače. Nosači mogu da budu aktivni i/ili inertni. Primeri dobro poznatih nosača uključuju polipropilen, polistiren, polietilen, dekstran, najlon, amilaze, staklo, prirodne i modifikovane celuloze, poliakrilamidi, agaroze i magnetit. Priroda nosača može da bude ili rastvorljiva ili nerastvorljiva za svrhe pronalaska. Stručnjacima iz oblasti tehnike su poznati drugi pogodni nosači za vezivanje antitela, ili de biti u stanju da ih utvrde, upotrebom rutinskog eksperienta. U nekim izvođenjima, nosač sadrži ostatak koji cilja miokard.

[0129] DNK koji kodira monoklonsko antitelo se brzo izoluje se sekvencira upotrebom konvencionalnih postupaka (npr., upotrebo oligonukleotidnih proba koje mogu specifično da se vežu za gene koji kodiraju teške i lake lance monoklonskih antitela). Hibridoma delije služe kao poželjni izvor takve DNK. Jednom kada se izoluje, DNA može da se postavi u ekspresione vektore (kao što s uekpresioni vektori koji suprikazani u PCT objavi br. WO 87/04462), koji se dalje transfektuju udeliju domadina kao što su delije E. coli, mačje COS delije, delije ovarijuma kineskog hrčka (CHO), ili delije mijeloma koje na drugi način ne proizvode molekul imunoglobulina, d as edobije sinteza monoklonskih antitela u rekombinovanim delijma domadina. Videti, npr., PCT objavu br. WO 87/04462. DNK takođe može da bude modifikovana, na primer, supstitucijom kodirajude sekvence za konstantne domene teškog i lakog lanca umesto homologih mišjih sekvenci, Morrison et al., Proc. Nat. Acad. Sci. 81:6851 (1984), ili kovalentnim spajanjem sa celom kodirajudom sekvencom imunoglobulina ili delom kodirajude sekvence za polipeptid koji nije imunoglobulin. Na takav način, ovde dobijaju se "himerna" ili "hibridna" antitela koja imaju specifičnost vezivanja za anti-CGRP monoklonsko antitelo.

[0130] Anti-CGRP antagonistička antitela mogu da se identifikuju ili karakterizuju upotrebom postupaak koji su poznati iz oblasti tehnike, gde se meri i/ili detektuje redukcija, ublažavanje, ili neutralizacija biološke aktivnosti CGRP-a. Na primer, anti-CGRP antagonističko antitelo može da se identifikuje inkubacijom sredstva kandidata sa CGRP i pradenjem jedne ili više od slededih karakteristika: (a) vezivanje za CGRP; (b) blokiranje CGRP-a od vezivanja za njegov receptor(e); (c) blokiranje ili smanjenje aktivacije receptora za CGRP (uključujudi aktivaciju cAMP ); (d) inhibiranej biološke aktivnosti CGRP-a ili nishodnih puteva koji su posredovani signalnom funkcijom CGRP-a; (e) sprečavanje, ublažavanje, ili lečenje bilo kog aspekta glavobolje (npr., migrene); (f) povedanje uklanjanja CGRP-a; i (g) inhibiranje (smanjenje) sinteze CGRP-a, proizvodnje ili oslobađanja. U nekim izvođenjima, anti-CGRP antagonističko antitelo se identifikuje inkubiranjem kandidata sredstva sa CGRP i pradenjem vezivanja i/ili pratedeg smanjenja ili neutralizacije biološke aktivnosti CGRP-a. Test vezivanja može da se izvede sa prečišdenim CGRP polipeptidom(ima), ili sa delijama koje ih prirodno eksprimiraju, ili je izvršena transfekcija za eksprimiranje, CGRP polipeptid(a). U jednom izvođenju, test vezivanja je kompetitivni test vezivanja, gde se ispituje sposobnost kandidata antitela da bude u kompeticiji sa poznatim anti-CGRP antagonistom za vezivanje za CGRP. Test može da se izvede u različitim formatima, uključujudi ELISA format. U drugim izvođenjima, anti-CGRP antagonističko antitelo se identifikuje inkubiranjem kandidata sredstva sa CGRP i pradenjem vezivanja i pratedeg smanjenja aktivacije receptora za CGRP koji se eksprimira na površini delije.

[0131] Nakon početne identifikacije, aktivnost kandidata anti-CGRP antagonističkog antitela može dalje da se potvrdi i prečisti biotestovima, koji su poznati za ispitivanje ciljane biološke aktivnosti. Alternativno, biotestovi mogu da se koriste za direktno pretraživanje kandidata. Na primer, CGRP promoviše brojne merljive promene u responsivnim delijama. One uključuju, ali bez ograničenja, stimulaciju cAMP-a u deliji (npr., SK-N-MC delije). Antagonistička aktivnost takođe može da se meri upotebom animalnih modela, kao što je merenje vazodilatacije kože koja se indukuje stimulacijom safenoznog nerva pacova. Escott et al., Br. J. Pharmacol. 110: 772-776, 1993. Životinjski modeli glavobolja (kao što je, migrena) mogu dalje da se koriste za ispitivanje efikasnosti antagonističkih antitela ili polipeptida. Reuter, et al., Functional Neurology (15) Suppl.3, 2000. Neki od postupaka za idenifikaciju i karakterizaciju anti-CGRP antagonističkog antitela su detaljno opisani u Primerima.

[0132] Anti-CGRP antagonistička antitela mogu da se karakterišu upotrebom postupaka koji su dobro poznati iz oblasti tehnike. Na primer, jedan postupak je identifikacija epitope za koji se vezuje, ili "mapiranje epitopa." Postoje mnogi postupci iz oblasti tehnike za mapiranje i karakterizaciju položaja epitopa na proteinima, uključujudi rešavanje kristalne strukture kompleksa antitela sa antigenom, testova kompeticije, testova ekspresije genskih fragmenta, i testovima koji se zasnivaju na sintetičkim peptidima, kao što se opisuje, na primer, u poglavlju 11 Harlow and Lane, Using Antibodies, a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1999. U dodatnom primeru, mapiranje epitopa može da se koristi za određivanje sekvence za koju se vezuje anti-CGRP antagonističko antitelo. Mapiranje epitopa je komercijalno dostupno iz različitih izvora, na primer, Pepscan Systems (Edelhertweg 15, 8219 PH Lelystad, The Netherlands). Epitop može da bude linearni epitop, tj., da se nalazi u jednom nizu aminokiselina, ili konformacioni epitop koji se obrazuje tridimenzionalnim interagovanjem aminokiselina koje ne moraju neophodno da se nalaze u jednom nizu. Peptidi različitih dužina (npr., dužine najmanje 4-6 aminokiselina) mogu da budu izolovani ili sintetisani (npr., rekombinantno) i upotrebljeni za testove vezivanja sa anti-CGRP antagonističkim antitelom. U drugom primeru, epitop za koji se vezuje anti-CGRP antagonističko antitelo može da se odredi sistematskim skriningom korišdenjem peptide koji se preklapaju koji se dobijaju iz CGRP sekvence i određivanjem vezivanja sa anti-CGRP antagonističkim antitelom. Prema testovima ekspresije genskog fragmenta, otvorne kovir čitanja koji kodira CGRP je fragmentovan ili nasumično ili specifičnim genskim konstrukcijama i određuje se reaktivnost eksprimiranih fragmenata CGRP sa antitelom koje se testira. Genski fragmenti mogu, na primer, mogu da budu proizvedeni od strane PCR i zatim transkribuje i translatira in vitro, u prisustvu radioaktivnih aminokiselina. Vezivanje antitela za radioaktivno obeležena CGRP fragmenta se zatim određuje imunoprecipitacijom i gel elektroforezom. Određeni epitopi mogu takođe da budu identifikovani upotrebom velikih bibilioteka nasumičnih peptidnih sekvenci koje su prikazane na površini fagnih čestica (fagne biblioteke). Alternativno, definisana bibloteka preklapajudih peptidnih fragmenata može da se testira za vezivanje za antitelo koje se ispituje u jednostavnim testovima vezivanja. U dodatnom primeru, mutageneza domena za vezivanje antigena, eksperimenti zamene domena i skeniranje mutageneze alanina može da se izvde da bi se identifikovali potrebni ostaci, dovoljni i/ili neophodni za vezivanje epitopa. Na primer, eksperimenti mogu da se izvedu upotrebom mutiranog CGRP-a u kome su različiti fragmenti CGRP polipeptida zamenjeni (razmenjeni) sa sekvencama koje su blisko povezane sa, ali proteinom koji je antigenski različit (kao što je drugi član familije proteina neutrofina). Ispitivanjem vezivanja antitela za mutirani CGRP, može da se proceni značaj određenog CGRP fragmenta za vezivanje antitela.

[0133] Još drugi postupak koji može da se koristi za karakterizaciju anti-CGRP antagonističkog antitela je za upotrebu testova kompeticije sa drugim antitelima za koje je poznato da se vezuju za isti antigen, tj., različite fragmente koji se nalaze na CGRP, za određivanje da li se anti-CGRP

1

antagonističko antitelo vezuje za isti epitop kao druga antitela. Stručnjacima iz oblasti tehnike su poznati testovi kompeticije.

C. Antitelo G1 i antitela koja su sa njim povezana

[0134] Ovaj pronalazak obuhvata upotrebu antitela G1 i njegovih varijanti koje su prikazane u Tabeli 6.

[0135] Anti-CGRP antagonistička antitela se karakterišu bilo kojom od (jednom ili više) karakteristika koje slede: (a) vezivanjem za CGRP; (b) blokiranjem CGRP od vezivanja za njegov receptor(e); (c) blokiranjem ili smanjenjem aktivacije receptora za CGRP receptor activation (uključujudi aktivaciju cAMP); (d) inhibiranjem biološke aktivnosti CGRP-a ili nishodnih puteva koji su posredovani signalnom funkcijom CGRP-a; (e) sprečavanjem, ublažavanjem, ili lečenjem bilo kog aspekta glavobolje (npr., migrene); (f) povedanja uklanjanja CGRP-a; i (g) inhibiranja (redukovanja) sinteze CGRP-a, proizvodnje ili oslobađanje.

[0136] Bilo koje od slededih može da se koristi u pronalasku (a) antitelo G1 ili njegove varijante koje su prikazane u Tabeli 6; (b) fragment ili region antitela G1 ili njegove varijante koje su prikazane u Tabeli 6; (c) laki lanac antitela G1 ili njegove varijante koje su prikazane u Tabeli 6; (d) teški lanac antitela G1 ili njegove varijante koje su prikazane u Tabeli 6; (e) jedan ili više varijabilnih region(a) iz lakog lanca i/ili teški lanac antitela G1 ili njegovih varijanti koje su prikazane u Tabeli 6; (f) jedan ili više CDR(a) (jedan, dva, tri, četiri, pet ili šest CDR-a) antitela G1 ili njegovih varijanti koje su prikazane u Tabeli 6; (g) CDR H3 iz teškog lanca antitela G1; (h) CDR L3 iz lakog lanca antitela G1 ili njegoivh varijanti koje su prikazane u Tabeli 6; (i) tri CDR-a iz lakog lanca antitela G1 ili njegovih varijanti koje su prikazane u Tabeli 6; (j) tri CDR-a iz teškog lanca antitela G1 ili njegovih varijanti koje su prikazane u Tabeli 6; (k) tri CDR-a iz lakog lanca i tri CDR-a iz teškog lanca, antitela G1 ili njegovih varijanti koje su prikazane u Tabeli 6; i (l) antitelo koje sadrži bilo koji od (b) kroz (k).

[0137] CDR porcije antitela G1 (uključujudi Chothia i Kabat CDRs) su predstavljene dijagramom na Slici 5. Određivanje CDR regiona je poznato stručnjaku iz oblasti tehnike. Podrazumeva se da u nekim izvođenjima, CDR-i mogu da budu kombinacijia Kabat i Chothia CDR (takođe nazvani "kombinovani CDR-i" ili "prošireni CDR-i"). U nekim izvođenjima, CDR-i su Kabat CDR-i. U drugim izvođenjima, CDR-i su Chothia CDR-i. Drugim rečima, u izvođenjima koja imaju više od jednog CDR, CDR-i mogu da budu bilo koji od Kabat, Chothia, kombinovanih CDR-a, ili njihove kombinacije.

[0138] U nekim izvođenjima, antitelo koje je korisno u pronalasku sadrži najmanje jedan CDR, najmanje dva, najmanje tri, ili najmanje četiri, najmanje pet, ili svih šest CDR-a koji su u osnovi identični sa najmanje jednim CDR, najmanje dva, najmanje tri, najmanje četiri, najmanje pet ili svih šest CDR-a od G1 ili njegovih varijanti koje su prikazane na Tabeli 6. Druga izvođenja uključuju antitela koja imaju najmanje dva, tri, četiri, pet, ili šest CDR(a) koji su u osnovi identični sa najmanje dva, tri, četiri, pet ili šest CDR-a od G1 ili izvedenih od G1. U nekim izvođenjima, najmanje jedan, dva, tri, četiri, pet ili šest CDR(a) su najmanje oko 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, ili 99% identični sa najmanje jednim, dva, tri, četiri, pet ili šest CDRa od G1 ili njegovima varijantama koje su prikazane u Tabeli 6. Podrazumeva se da, za svrhe ovog pronalaska, specifičnost vezivanja i/ili

2

sveukupna aktivnost je generalno zadržana, iako opseg aktivnosti može da se razlikuje kada se poredi sa G1 ili njegovim varijantama koje su prikazane u Tabeli 6 (može da bude vedi ili manji).

[0139] Antitelo koje je korisno u pronalasku sadrži sekvencu aminokiselina G1 ili njegovih varijanti koje su prikazane u Tabeli 6 koja ima bilo oje od slededih: najmanje 5 susednih aminokiselina, najmanje 8 susednih aminokiselina, najmanje oko 10 susednih aminokiselina, najmanje oko 15 susednih aminokiselina, najmanje oko 20 susednih aminokiselina, najmanje oko 25 susednih aminokiselina, najmanje oko 30 susednih aminokiselina sekvence G1 ili njegovih varijanti koje su prikazane u Tabeli 6, gde su najmanje 3 aminokiseline iz varijabilnog regiona G1 (Slika 5) ili njegovih varijanti koje su prikazane u Tabeli 6. U jednom izvođenju, varijabilni region je iz lakog lanca G1. U drugom izvođenju, varijabilni region je iz teškog lanca G1. Antitelo iz primera ima susednu aminokiselinu (dužine su opisane ovde) iz oba varijabilna regiona i tekog i lakog lanca G1. U drugom izvođenju, 5 (ili više) susednih aminokiselina su iz regiona koji određuje komplementarnost (CDR) G1 što je prikazano na Slici 5. U nekim izvođenjima, susedne aminokiseline su iz varijabilnog regiona G1.

[0140] Afinitet vezivanja (KD) anti-CGRP antagonističkog antitela prema CGRP (kao što je humano α-CGRP) može da bude oko 0,06 do oko 200 nM. U nekim izvođenjima, afinitet vezivanja je bilo koji od oko 200 nM, 100 nM, oko 50 nM, oko 10 nM, oko 1 nM, oko 500 pM, oko 100 pM, oko 60 pM, oko 50 pM, oko 20 pM, oko 15 pM, oko 10 pM, oko 5 pM, ili oko 2 pM. U nekim izvođenjima, afinitet vezivanja je manji od bilo kog oko 250 nM, oko 200 nM, oko 100 nM, oko 50 nM, oko 10 nM, oko 1 nM, oko 500 pM, oko 100 pM, ili oko 50 pM.

[0141] U pronalasku mogu da se koriste jednolančani fragmeni varijabilnih regiona ("scFv") antitela kao što je G1. Jednolančni fragmenti varijabilnog regiona antitela se dobijaju povezivanjem varijabilnih regiona lakog i/ili teškog lanca korišdenjem kratkog peptida za povezivanje. Bird et al. (1988) Science 242:423-426. Primer peptide za povezivanje je (GGGGS)3 koji prmošdava otprilike 3,5 nm između karboksi kraja jednog varijabilnog regiona i amino kraja drugog varijabilnog regiona. Dizajnirane su i koriste se grupe za povezivanje grupe za povezivanje drugih sekvenci. Bird et al. (1988). Sa druge strane, grupe za povezivanje mogu da budu modifikovane za dodatne funkcije, kao što je vezivanje lekova ili vezivanje za čvrste podloge. Jednolančane varijante mogu da se proizvedu ili rekombinantno ili sintetički. Za sintetičku proizvodnju scFv, može da se koristi automatski sintetizator. Za rekombinantnu proizvodnju scFv, pogodni plazmid koji sadrži polinukleotid koji kodira scFv može da se uvede u pogodnu deliju domadina, ili eukariotsku, kao što je delija kvasca, biljna, insekta ili sisarska delija, prokariotska, kao što je E. coli. Polinukleotidi koji kodiraju scFv od interesa mogu da se dobiju rutinskim manipulacijama kao što je spajanje polunukleotida. Dobijeni scFv mogu da se dobiju standardnim postupcima za prečišdavanje proteina koji su poznati iz oblasti tehnike.

[0142] Takođe su obuhvadeni drugi oblici jednolančanih antitela, kao što su diantitela. Diantitela su bivalentna, bispecifična antitela kod kojih su VH i VL domeni ekprimirani na jednom polipeptidnom lancu, ali korišdenjem grupe za povezivanje koja je previse kratka da bi se omogudilo sparivanje između domenana istom lancu, čime se domeni prisiljavaju da se spare sa komplementarnim domenima drugog lanca što se dobijaju dva mesta za vezivanje antigena (videti e.g., Holliger, P., et al. (1993) Proc. Natl. Acad Sci. USA 90:6444-6448; Poljak, R. J., et al. (1994) Structure 2:1121-1123).

[0143] Na primer, bispecfična antitela, monoklonska antitela koja imaju specifičnost vezivanja za najmanje dva različita antigena, mogu da se dobiju upotrebom antitela koja su ovde prikazana. U oblasti tehnike su poznati postupci za dobijanje bispecifičnih antitela (videti, npr., Suresh et al., 1986, Methods in Enzymology 121:210). Tradicionalno, rekombinantna proizvodnja bispecifičnih antitela se zasniva na istovremnoj ekspresiji dva para teškog lanca-lakog lanca imunoglobulina, pri čemu dva teška lanca imaju različite specifičnosti (Millstein and Cuello, 1983, Nature 305, 537-539).

[0144] Prema jednom pristupu za dobijanje bispecifičnih antitela, varijabilni domeni antitela sa željenim specifičnostima vezivanja (mesta kombinovanja antitela sa antigenom) se kombinuju u sekvence konstantnog domena imunoglobulina. Kombinovanje je poželjno sa konstantnim domenom teškog lanca imunoglobulina, koji sadrži najmanje deo zgloba, CH2 i CH3 regiona. Poželjno je da se ima prvi konstanti region teškog lanca (CH1), koji sadži mesto koje je neophodno za vezivanjelakog lanca, koje se nalazi u najmanje jednom kombinovanom molekulu. DNK koji kodiraju kombinovane teške lance imunoglobulina i, po potrebi, laki lanac imunoglobulina, se insertuju u odvojene ekspresione vektore, i izvodi se kotransfekcija u pogodnom organizmu domadinu. Ovo obezbeđuje veliku fleksibilnost u podešavanju zajedničkih proporcija tri polipeptidna fragmenta u izvođenjima kada se nejednaki odnosi tri polipeptidna lanca koji se koriste u konstrukciji obezbeđuju optimum prinosa. Međutim, mogude je insertovati kodirajude sekvence za dva ili sva tri polipeptidna lanca u jedan ekspresioni vektor kada ekspresija najmanje dva polipeptidna lanca u jednakim odnosima dovodi do visokih prinosa ili kada odnosi nisu od posebnog značaja.

[0145] U jednom pristupu, bispecifična antitela se sastoje od hibridnog teškog lanca imunoglobulina sa prvom specifičnosti vezivanja u jednom delu, i hibridog para imunoglobulinskog teškog lancalakog lanca (koji obezbeđuje drugu specifičnost vezivanja) u drugoj ruci. Ova asimetrična struktura, sa lakim lancem imunoglobulina u samo jednoj polovini bispecifičnog molekula, olakšava odvajanje željenog bispecifičnog jedinjenja od neželjenih kombinacija lanaca imunoglobulina. Ovaj pristup se opisuje u PCT objavi br. WO 94/04690, koja je objavljena 3 marta, 1994.

[0146] Heterokonjugatna antitela, koja sadrže da kovalentno spojena antitela, takođe se nalaze u opsegu pronalaska. Takva antitela se koriste za ciljanje delija imunskog sistema za neželjene delije (U.S. Patent No. 4,676,980), i za lečenje HIV infekcije (PCT objave prijava br. WO 91/00360 i WO 92/200373; EP 03089). Heterokonjugatna antitela mogu da se dobiju upotrebom pogodnih postupaka za ukršteno povezivanje. Pogodna sredstva i tehnike za ukršteno povezivanje su dobro poznati iz oblasti tehnike, i opisani su u U.S. Patent No.4,676,980.

[0147] Himerna ili hibridna antitela takođe mogu da se dobiju in vitro upotrebom poznatih postupaka hemije sintetičkih proteina, uključujudi one koji obuhvataju sredstva za ukršteno povezivanje. Na primer, imunotoksini mogu da se dobiju upotrebom reakcije disulfidne izmene ili obrazovanjem tioetarske veze. Primeri pogodnih sredstava za ovu svrhu uključuju iminotiolat i metil-4-merkaptobutirimidat.

[0148] Humanizovana antitela koja sadrže jedan ili više CDR-a antitela G1 ili njegovih varijanti koje su prikazane u Tabeli 6, ili jedan ili više CDR-a koji se dobijaju od antitela G1 ili njegovih varijanti koje su prikazane u Tabeli 6 mogu da se dobiju bilo kojim postupcima koji su poznati iz oblasti tehnike. Na primer, mogu da se koriste četiri generalna koraka za humanizovanje monoklonskog antitela.

4

[0149] Mogu da se koriste modifikacije G1 antitela ili njegovih varijanti koje su prikazane u Tabeli 6, uključujudi funkcionalno ekvivalnetna antitela koja ne utiču zančajno na njihova svojstva i varijante koje imaju unapređenu ili smanjenu aktivnost i/ili afinitet. Na primer, sekvenca aminokiselina antitela G1 ili njegovi varijanti koje su prikazane u Tabeli 6 mogu da budu mutirane da se dobije željeni afinitet vezivanja za CGRP. Modifikacija polipeptida je rutinska praksa u oblasti tehnike i ovde nije neophodno detaljno pojašnjenje. Modifikacija polipeptida je predstavljena primerima u Primerima. Primeri modifikovanih polipeptida uključuju polipeptide sa konzervativnim supstitucijama ostataka aminokiselina, jednu ili više delecija ili adicija aminokiselina koje nemaju značajan štetan uticaj na promenu funkcionalne aktivnosti, ili upotreba hemijskih analoga.

[0150] Insercije sekvence aminokiselina uključuju amino- i/ili karboksil-terminalne fuzije u rasponu dužine od jednog ostatka do polipeptida koji sadrži stotinu ili više ostataka, kao i intrasekvencijalne insercije jednog ili višestrukih ostataka aminokiselina. Primeri terminalnih insercija uključuju antitelo sa N-terminalnim metionil ostatkom ili antitelo koje je kombinovano sa obeleživačem za epitop. Druge insercione varijante molekula antitela uključuju kombinovanje N- ili C kraja antitela enzima ili polipeptida koji povedava polu-život antitela u serumu.

[0151] Varijante supstitucije imaju najmanje jedan ostatak aminokiseline koji je uklonjen u molekulu antitela i različite ostatke koji su na njegovom mestu. Mesta koja su od najvedeg interesa za supstitucionu mutagenezu uključuju hipervarijabilne regione, ali se takođe razmatraju FR izmene. Konzervativne supstitucije su prikazane u Tabeli 1 ispod naslova "konzervativne supstitucije". Ukoliko takve supstitucije dovode do promene u biološkoj aktivnost, zatim više značajnih promena, koje se zovu "primeri zamena" u Tabeli 1, ili kao što se dalje opisuje u odnosu na klase aminokiselina, mogu da se uvedu i proizvodi mogu da se pretražuju.

Tabela 1: Supstitucije aminokiselina

[0152] Značajne modifikacije u biološkim svojstvima antitela se postižu biranjem supstitucija koje se značajno razlikuju u njihovom efektu na održavanje (a) struktura osnove polipeptida u oblasti supstitucije, na primer, kao konformacija ploče ili heliksa, (b) naelektrisanje ili hidrofobnost molekula na ciljnom mestu, ili (c) veličina bočnog lanca. Ostaci koji se prirodno pojavljuju se dele u grupe na osnovu zajedničkih svojstava bočnog lanca:

(1) Ne-polarne: Norleucin, Met, Ala, Val, Leu, Ile;

(2) Polarne bez naelektrisanja: Cys, Ser, Thr, Asn, Gln;

(3) Kisele (negativno naelektrisane): Asp, Glu;

(4) Bazne (pozitivno naelektrisane): Lys, Arg;

(5) Ostaci koji utiču na orijentaciju lanca: Gly, Pro; i

(6) Aromatične: Trp, Tyr, Phe, His.

[0153] Ne-konzervativne supstitucije se dobijaju zamenom člana jednog od ovih klasa za drugu klasu.

[0154] Bilo koji citeinski ostatak koji nije uključen u održavanje odgovarajude konformacije antitela takođe može da bude supstituisan, generalno sa serinom, da se poboljša oksidativna stabilnost molekula i spreči aberantno ukrštanje. Nasuprot tome, cisteinske veza(e) može da se doda u antitelo da poboljša njegovu stabilnost, posebno gde je antitelo fragment antitela kao što je Fv fragment.

[0155] Modifikacije aminokiselina mogu da imaju opseg od promena ili modifikovanja jedne il više aminokiseline do kompletnog redizajna regiona, kao što je varijabilni region. Promene u varijabilnom regionu mogu da menjaju afinitet vezivanja i/ili specifičnost. U nekim izvođenjima, ne više od jedne do pet konzervativnih supstitucija aminokiselina se prave u okviru CDR domena. U drugim izvođenjima, ne više od jedne do tri konzervativne supstitucije aminokiselina se dobijaju u okviru CDR domena U još drugim izvođenjima, CDR domen je CDR H3 i/ili CDR L3.

[0156] Modifikacije takođe uključuju glikozilovane i neglikozilovane polipeptide, kao i polipeptide sa drugim post-translacionim modifikacijama, kao što su, na primer, glikozilacija sa različitim šederima, acetilacija, i fosforilacija. Antitela su glikozilovana na konzervisanim položajima u njihovim konstantnim regionima (Jefferis and Lund, 1997, Chem. Immunol.65:111-128; Wright and Morrison, 1997, TibTECH 15:26-32). Oligosaharidni bočni lanci imunoglobulina utiču na funkciju proteina (Boyd et al., 1996, Mol. Immunol. 32:1311-1318; Wittwe and Howard, 1990, Biochem. 29:4175-4180) i intramolekulsku interakciju porcija glikoproteina, koja može da utiče na konformaciju i predstavi trodimenzionalnu površinu glikoproteina (Hefferis and Lund, supra; Wyss and Wagner, 1996, Current Opin. Biotech. 7:409-416). Oligosaharidi takođe mogu da služe da ciljaju dati protein do određenih molekula na osnovu specifičnih struktura za prepoznavanje. Takođe je prijavljeno da glikozilacija antitela utiče na antitelo zavisnu delijsku citotoksičnost (ADCC). Posebno, CHO delije sa tetraciklinregulisanom ekspresijom β(1,4)-N-acetilglukozaminiltransferaze III (GnTIII), glikoziltransferaza koja katalizuje obrazovanje deljenje GlcNAc, je prijavljeno da poboljšava ADCC aktivnost (Umana et al., 1999, Mature Biotech.17:176-180).

[0157] Glikozilacija antitela je obično ili N-vezana ili O-vezana. N-vezana se odnosi na vezivanje ugljenohidratnog ostatka za bočki lanac ostatka asparagina. Tripeptidne sekvence asparagin-X-serin, asparagin-X-treonin, i asparagin-X-cistein, gde je X bilo koja aminokiselina osim prolina, su sekvence za prepoznavanje enzimskog vezivanja ostatka ugljenog hidrata za bočni lanac asparagina. Prema tome, prisustvo ovih tripeptidnih sekvenci u polipeptidu kreira potencijalno mesto glikozilacije. O-vezana glikozilacija se odnosi na vezivanje jednog od šedera N-acetilgalaktozamina, galaktoze, ili ksiloze za hidroksiaminokiselinu, najviše uobičajeno za serin ili treonin, pored toga što takođe mogu da se koriste 5-hidroksiprolin ili 5-hidroksilizin.

[0158] Dodavanje mesta glikozilacije antitelu se pogodno postiže menjenjem sekvence aminokiselina tako da sadrži jednu ili više od gore opisanih tripeptidnih sekvenci (za N-vezana mesta glikozilacije). Promena takođe može da se dobije dodavanjem, ili supstitucijom sa, jednim ili više ostataka serina u sekvenci originalnog antitela (za O-vezana mesta glikozilacije).

[0159] Obrazac glikozilacije antitela može takođe da se promeni bez promene osnovne nukleotidne sekvence. Glikozilacija velikim delom zavisi od delije domadina koji se koristi za eksprimiranje antitela. S obzirom da tip delija koji se koristi za ekspresiju rekombinantnih glikoproteina, npr. antitela, kao potencijalnih terapeutika je retko nativna delija, mogu da se očekuju varijacije u obrascu glikozilacije (videti, npr. Hse et al., 1997, J. Biol. Chem.272:9062-9070).

[0160] Dodatno sa izborom delije domadina, faktori koji utiču na glikozilaciju tokom rekombinovane proizvodnje antitela uključuju način rasta, formulaciju medijuma, gustinu kulture, oksigenaciju, pH, šeme prečišdavanja i slično. Predloženi su različiti postupci za menjanje obrasca glikozilacije koja se postiže u odgovarajudem organizmu domadinu uključujudi uvođenje ili prekomernu ekspresiju određenih enzima koji su uključeni u proizvodnju oligosaharida (U. S. Patent Nos. 5,047,335; 5,510,261 and 5.278,299). Glikozilacija, ili određeni tipovi glikozilacije, mogu enzimski da se uklone sa glikoproteina, na primer upotrebom glikozidaze H (Endo H), N-glikozidaze F, endoglikozidaze F1, endoglikozidaze F2, endoglikozidaze F3. Dodatno, rekombinovana delija domadina može da bude genetski izmenjena na način da je defektna za obradu određenih tipova polisaharida. U oblasti tehnike su poznati ovi i slični postupci.

[0161] Drugi postupci modifikacije uključuju postupke kuplovanja koji su poznati iz oblasti tehnike, uključujudi, ali bez ograničenja, enzimska sredstva, oksidativnu supstituciju i heliranje. Modifikacije mogu da se koriste, na primer, za vezivanje obleživača u imunotestovima. Modifikovani G1 polipeptidi se dobijaju upotrebom postupaka koji su uspostavljeni u oblasti tehnike i mogu da se pretražuju upotrebom standardnih postupaka koji su poznati iz oblasti tehnike, od kojih su neki opisani u tekstu ispod i u Primerima.

[0162] U nekim izvođenjima, antitelo sadrži modifikovani konstantni region, kao što je konstantni region koji je imunološki inertan ili parcijalno inertan, npr., ne pokrede lizu koja je posredovana komplementom, nepokrede delijsku citotoksičnost koja je zavisna od antitela (ADCC), ili ne aktivira mikrogliju; ili ima smanjene aktivnosti (u poređenju sa nemodifikovanim antitelom) u bilo kom jednom ili više od slededih: pokretanje lize koja je posredovana komplementom, stimulaciju delijske citotoksičnosti koja je posredovana antitelima (ADCC), ili aktiviranje mikroglije. Za postizanje optimalnog nivoa i/ili efektorskih funkcija mogu da se koriste različite modifikacija konstantnog regiona. Videti, na primer, Morgan et al., Immunology 86:319-324 (1995); Lund et al., J. Immunology 157:4963-9157:4963-4969 (1996); Idusogie et al., J. Immunology 164:4178-4184 (2000); Tao et al., J. Immunology 143: 2595-2601 (1989); and Jefferis et al., Immunological Reviews 163:59-76 (1998). U nekim izvođenjima, konstantni region je modifikovan kao što se opisuje u Eur. J. Immunol. (1999) 29:2613-2624; PCT prijavi br. PCT/GB99/01441; i/ili UK Patent objavi patenta br. 9809951.8. U drugim izvođenjima, antitelo sadrži konstantni region teškog lanca humanog IgG2 koji sadrži sledede mutacije: A330P331 u S330S331 (obeležavanje aminokiselina sa referencom prema IgG2 sekvenci). Eur. J. Immunol. (1999) 29:2613-2624. U još drugim izvođenjima, konstantni region je aglikozilovan za N-vezanu glikozilaciju. U nekim izvođenjima, konstantni region je aglikozilovan za N-vezanu glikozilaciju mutiranjem glikozilovanog ostatka aminokiseline ili ostataka koji ograničavaju koji su deo sekvence za prepoznavanje N-glikozilacije u konstantnom regionu. Na primer, mesto N-glikozilacije N297 može da bude mutirano u A, Q, K, ili H. Videti, Tao et al., J. Immunology 143: 2595-2601 (1989); and Jefferis et al., Immunological Reviews 163:59-76 (1998). U nekim izvođenjima, konstantni region je aglikozilovan za N-vezanu glikozilaciju. Konstanti region može da bude aglikozilovan za N-vezanu glikozilaciju enzimski (kao što je uklanjanje ugljenog hidrata ezimom PNGazom), ili ekspresijom u deliji domadina koji je deficijentan za glikozilaciju.

[0163] Druge modifikacije antitela uključuju antitela koja su modifikovana kao što se opisuje u PCT objavi br. WO 99/58572, koja je objavljena 18 novembra, 1999. Ova antitela sadrže, zajedno sa domenom za vezivanje koji je specifičan za ciljni molekul, efektorski domen koji ima sekvencu aminokiselina koja je u osnovi homologa za celi ili deo konstantnog domena teškog lanca humanog imunoglobulina. Ova antitela mogu da se vežu za ciljani molekul bez pokretanja značajne lize koja je posredovana komplementom, ili destrukcije cilja koja je posredovana delijama. U nekim izvođenjima, efektorski domen može specifčno da veže FcRn i/ili FcγRIIb. Oni se obično zasnivaju na himernim domenima koji se dobijaju iz dva ili više CH2 domena teškog lanca humanog imunoglobulina. Antitela koj su na ovaj način modifikovana su posebno pogodna za upotrebu u hroničnoj terapiji antitelima, da se izbegnu inflamatorne i i druge nepoželjne reakcije sa konvencionalnom terapijom antitelima.

[0164] Takođe mogu da se koriste izvođenja merenja afiniteta. Na primer, afinitet zrelih antitela može da se proizvede postupcima koji su dobro poznati u oblasti tehnike (Marks et al., 1992, Bio/Technology, 10:779-783; Barbas et al., 1994, Proc Nat. Acad. Sci, USA 91:3809-3813; Schier et al., 1995, Gene, 169:147-155; Yelton et al., 1995, J. Immunol., 155:1994-2004; Jackson et al., 1995, J. Immunol., 154(7):3310-9; Hawkins et al, 1992, J. Mol. Biol., 226:889-896; i WO2004/058184).

[0165] Slededi postupci mogu da se koriste za podešavanje afiniteta antitela i za karakterizaciju CDR-a. Jedan način karakterizacije CDR-a antitela i/ili menjanja (kao što je poboljšanje) afiniteta vezivanja polipeptida, lkao što je antitelo, se zove "skeniranje mutageneze biblioteke". Generalno, skeniranje mutagenize bilioteke se izvodi prema slededem. Aminokiseline na jednom ii više položaja CDR-a se zamenjuju sa dve ili više (kao što je 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, ili 20) aminokiselina upotrebom postupaka koji su poznati iz oblasti tehnike. Naovaj način se dobijaju male biblioteke klonova (u nekim izvođenjima, jedna za svaki položaj aminokiseline koja se analizira), svaka sa kompleksnosti dva ili više članova (ukoliko su dve ili više aminokiselina supstituisane na svakom položaju). Generalno, biblioteka takođe uključuje klon koji sadrži nativnu (nesupstituisanu) aminokiselinu. Mali broj klonova, npr., oko 20-80 klonova (u zavisnosti od kompleksnosti biblioteke), iz svake biblioteke se pretražuje (izvodi se skining) za afinitet vezivanja za ciljani polipeptid (ili druge ciljeve vezivanja), i identifikuju se kandidati sa povedanim, istim, smanjenim ili bez vezivanja. Postupci za određivanje afiniteta vezivanja su dobro poznati u oblasti tehnike. Afinitet vezivanja može da se odredi upotrebom analize Biacore površinske plazmon rezonancije, kojom se uočavaju razlike u afinitetu vezivanja oko 2-puta ili vede. Biacore je posebno koristan kada se početno antitelo vezuje sa relativno visokim afinitetom, na primer KDoko 10 nM ili niža. Srining upotrebom Biacore površinske plazmon rezonancije se ovde opisuje u Primerima.

[0166] Afinitet vezivanja može da se odredi upotrebom Kinexa Biocensor, testovima scintilacione blizine, ELISA, ORIGEN imunotestovima (IGEN), fluorescentnim gašenjem, fluorescentnim transferom, i/ili prikazom kvasca. Takođe može da se izvede skrining afiniteta vezivanja korišdenjem odgovarajudeg biotesta.

[0167] U nekim izvođenjima, svaka aminokiselina u položaju CDR je zamenjena (u nekim izvođenjima, jedna tokom vremena) sa svih 20 prirodnih aminokiselina upotrebom postupaka tehnike za prepoznavanje mutageneze (od koji se neki ovde opisuju). Ovim se dobijaju male biblioteke klonova (u nekim izvođenjima, jedan za svaki položaj aminokiseline koja se analizira), svaki sa kompleksnošdu svih 20 članova (ukoliko su svih 20 aminokiselina supstituisani na svakom položaju).

[0168] U nekim izvođenjima, biblioteka u kojoj se izvodi skrining sadrži supstitucije u dva ili više položaja, koji mogu da budu isti CDR ili u dva ili više CDR-a. Prema tome, biblioteka može da sadrži supstitucije u dva ili više položaja u jednom CDR. Biblioteka može da sadrži supstituciju u dva ili više položaja i dva ili više CDR-a. Biblioteka može da sadrži supstituciju u 3, 4, 5, ili više položaja, što se pomenuti položaji nalazi u dva, tri, četiri, pet ili šest CDR-a. Supstitucija može da se dobije upotrebom kodona koji imaju nižu redundantnost. Videti, npr., Tabela 2 of Balint et al., (1993) Gene 137(1):109-18).

[0169] CDR može da bude CDRH3 i/ili CDRL3. CDR može da bude jedna ili više od CDRL1, CDRL2, CDRL3, CDRH1, CDRH2, i/ili CDRH3. CDR može da bude Kabat CDR, Chothia CDR, ili prošireni CDR.

[0170] Kandidati sa unapređenim vezivanjem mogu da se sekvenciraju, čime se identifikuje CDR mutant supstitucije što dovodi do unapređenog afiniteta (takođe nazvani "poboljšana" supstitucija). Kandidati koji vezuju mogu takođe da budu sekvencirani, čime se identifikuju CDR supstitucija koja zadržava vezivanje.

[0171] Mogu da se izvedu višestruke runde vezivanja. Na primer, kandidati (svaki sadrži supstituciju aminokiseline na jednom ili više položaja jednog ili više CDR-a) sa unapređenim vezivanjem su takođe korisni za dizajn druge biblioteke koja sadrži najmanje originalnu i supstituisanu aminokiselinu na svaki unapređen položaj CDR (tj., položaj aminokiseline u CDR gde mutant supstitucije pokazuje unapređeno vezivanje). Dobijanje, i skrining ili selekcija ove biblioteke se dalje razmatra u tekstu ispod.

[0172] Skeniranje mutagenize u biblioteci takođe obezbeđuje sredstva za karakterizaciju CDR, u meri učestalosti klonova sa unapređenim vezivanjem, istim vezivanjem, smanjenim vezivanjem ili bez vezivanja takođe obezbeđuje informaciju koja je u vezi sa značajem svakog položaja aminokiseline za stabilnost kompleksa antitela sa antigenom. Na primer, ukoliko položaj CDR zadržava vezivanje kada se promeni u svih 20 aminokiselina, taj položaj se identifikuje kao pložaj koji je malo verovatno neophodan za vezivanje antigena. Nasuprot tome, ukoliko položaj CDR zadržava vezivanje u samo malom procentu supstitucija, taj položaj se identifikuje kao položaj koji je važan za funkciju CDR. Prema tome, postupci za skeniranje mutageneze biblioteke stvaraju informaciju koja se odnosi na položaje u CDR-a koji mogu da se promene u mnoge različite aminokiseline (uključujudi svih 20 aminokiselina), i položaje u CDR-a koji ne mogu da se promene ili koji mogu da budu promenjeni u samo par aminokiselina.

[0173] Kandidati sa unapređenim afinitetom mogu da se kombinuju u drugoj bibilioteci, koja uključuje unapređenu aminokiselinu, originalnu aminokiselnu na tom položaju, i dalje može da uključi dodatne supstitucije na tom položaju, u zavisnosti od kompleksnosti biblioteke koja se navodi, ili omogudava upotrebom željenog postupka skrininga ili selekcije. Dodatno, po potrebi, položaj susedne aminokiseline može naumično da bude odabran za najmanje dve ili više aminokiselina. Nasumično biranje susednih aminokiselina može da omogudi dodatnu konformacionu fleksibilnost u mutiranom CDR, što zauzvrat može, da omogudi ili olakša vedi broj mutacija koje dovode do unapređenja. Biblioteka takođe može da sadrži supstituciju na položajima koji ne pokazuju unapređen afinitet u prvoj rundi skrininga.

[0174] Druga biblioteka se pretražuje ili selektuje za članove biblioteke sa poboljšanim i/ili izmenjenim afinitetom vezivanja upotrebom bilo kog postupka koji je poznati iz oblasti tehnike, uključujudi skrining upotrebom analize Biacore površinske plazmon rezonancije, i selekcije korišdenjem bilo kog postupka za selekciju koji jepoznat iz oblasti tehnike, uključujudi fagni prikaz, prikaz kvasca, i prikaz ribozoma.

[0175] U pronalasku su takođe korisni kombinovani proteini koji sadrže jedan ili više fragmenata ili regiona antitela (kao što je G1). U jednom izvođenju, obezbeđuje se kombinovani polipeptid koji sadrži najmanje 10 aminokiselina u redu varijabilnog regiona lakog lanca što je prikazano na SEQ ID NO:2 (Slika 5) i/ili najmanje 10 aminokiselina varijabilnog regiona teškog lanca što je prikazano na SEQ ID NO:1 (Slika 5). U drugim izvođenjima, obezbeđuje se kombinovani polipeptid koji sadrži najmanje oko 10, najmanje oko 15, najmanje oko 20, najmanje oko 25, ili najmanje oko 30 kontiruiranih aminokiselina varijabilnog regiona lakog lanca što je prikazano u SEQ ID NO:2 (Slika 5) i/ili najmanje oko 10, najmanje oko 15, najmanje oko 20, najmanje oko 25, ili najmanje oko 30 kontinuiranih aminokiselina varijabilnog regiona teškog lanca što je prikazano u SEQ ID NO:1 (Slika 5). U drugom izvođenju, kombinovani polipeptid sadrži varijabilni region lakog lanca i/ili varijabilni region teškog lanca G1, što je prikazano u SEQ ID NO:2 i SEQ ID NO:1 na Slici 5. U dugom izvođenju, kombinovani peptid sadrži jedan ili više CDR(a) G1. U još drugim izvođenjima, kombinovani polipeptid sadrži CDR H3 i/ili CDR L3 antitela G1. Za svrhe ovih pronalaska, G1 kombinovani protein sadrži jedan ili više G1 antitela i druga sekvenca aminokiselina za koju nije vezan u nativnom molekulu, na primer, heterologna sekvenca ili homologna sekvenca iz drugog regiona. Primeri heterolognih sekvenci uključuju, ali bez ograničenja "obeleživač" kao što je FLAG obeleživač ili 6His obeleživač. Obeleživači su dobro poznati u oblasti tehnike.

4

[0176] G1 kombinovani peptid može da se dobije upotrebom postupaka koji su poznati iz oblasti tehnike, na primer, sintetički ili rekombinantno. Obično, G1 kombinovani proteini se dobijaju pripremanjem ekspresije polinukleotida koji ih kodira upotrebom rekombinantnog postupka koji se ovde opisuje, iako takođe mogu da se dobiju upotrebom drugih postupaka iz oblasti tehnike, uključujudi, na primer, hemijsku sintezu.

Primeri

Primer 1: Dobijanje i karakterizacija monoklonskih antitela koja su specifična za CGRP

[0177] Dobijanje anti-CGRP antitela. Da bi se dobila anti-CGRP antitela koja imaju ukrštenu reaktivnost prema CGRP koji je poreklom iz pacova i čoveka, miševi se imunizuju sa 25-100 µg humanim α-CGRP ili β-CGRP konjugovanim sa KLH u adjuvansu (50 µl po šapici, 100 µl ukupno po mišu) u različitim intervalima. Imunizacija se generalno izvodi kao što se opisuje u Geerligs HJ et al., 1989, J. Immunol. Methods 124:95-102; Kenney JS et al., 1989, J. Immunol.. Methods 121:157-166; and Wicher K et al., 1989, Int. Arch. Allergy Appl, Immunol.89:128-135. Miševi se prvo imunizuju sa 50 µg humanog α-CGRP ili β-CGRP konjugovanog sa KLH u CFA (kompletnom Frojndovom adjuvansu). Nakon 21 dana, miševi se sekundarno imunizuju sa 25 µg humanog β-CGRP (za miševe koji su prvo imunizovani sa α-CGRP) ili α-CGRP (za miševe koji su prvo imunizovani sa β-CGRP)) konjugovanim sa KLH u IFA (nekompletnom Frojndovom adjuvansu). Dvadeset tri dana kasnije nakon druge imunizacije, treda imunizacija se izvodi sa 25 µg α-CGRP poreklom iz pacova konjugovanim sa KLH u IFA. Deset dana kasnije, ispituju se titri antitiela upotrebom ELISA. Četvrta imunizacija se izvodi sa 25 µg peptida (α-CGRP-KLH pacova) u IFA 34 dana nakon trede imunizacije. Konačni „booster“ se izvodi sa 100 µg rastvorljivim peptidom (α-CGRP pacova) 32 dana nakon četvrte imunizacije.

[0178] Splenociti se dobijaju iz imunizovanog miša i fuzionišu sa NSO delijama mijeloma u odnosu 10:1, sa polietilen glikolom 1500. Hibridi se zasejavaju na ploče sa 96 bunarida u DMEM koji sadrži 20% serum konja i počinje selekcija sa 2-oksaloacetat/piruvat/insulinom (Sigma), i hipoksantin/aminopterin/timidinom. Tokom dana 8, u sve bunaride se dodaje 100 µl DMEM koji sadrži 20% serum konja. Supernatanti hibrida se pretražuju upotrebom imunotesta sa hvatanjem antitela. Određivanje klase antitela se izvodi sa sekundarnim antitelima koja su specifična za klasu.

[0179] Panel delijskih linija koje proizvode monoklonska antitela se bira na osnovu njihovog vezivanja za CGRP čoveka i pacova za dalju karakterizaciju. Ova antitela i karakteristike su prikazane u tekstu ispod u Tabelama 2 i 3.

[0180] Prečišdavanje i dobijanje Fab fragmenta. Monoklonska antitela koja se biraju za dalju karakterizaciju su prečišdena iz supernatanta kultura hibridoma upotrebom afinitetne hromatografije koja sadrži protein A. Supernatanti su ekvilibrisani do pH 8. Supernatanti su zatim napunjeni u MabSelect kolonu koja sadrži protein A (Amersham Biosciences # 17-5199-02) ekvilibrisani sa PBS do pH 8. Kolona se ispira sa PBS, vrednosti 5 zapremina kolone, pH 8. Antitela se ispiraju sa 50 mM citratno-fosfatnim puferom, pH 3. Isprana antitela se neutralizuju sa 1M fosfatnim puferom, pH 8. Prečišdena antitela se dijalizuju sa PBS, pH 7,4. Koncentracije antitela se određuju upotrebom SDS-PAGE, korišdenjem standardne krive mišjeg monoklonskog antitela.

[0181] Fab-i se dobijaju proteolizom ukupnih antitela papainom, korišdenjem Immunopure Fab kita (Pierce # 44885) i prečišdavanjem protokom kroz hromatografiju koja sadrži protein A prema uputstvima proizvođača. Koncentracije se određuju upotrebom ELISA i/ili SDS-PAGE elektroforeze upotrebom Fab standarda poznate koncentracije (određeno analizom aminokiselina), i pomodu A280 upotrebom 10D=0,6 mg/ml (ili teorijski evivalent na osnovu sekvence aminokiseline).

[0182] Određivanje afiniteta Fab-a. Afiniteti anti-CGRP monoklonskih antitela se određuju na ili 25°C ili 37°C upotrebom sistema Biacore3000™ površinske plazmon rezonancije (SPR) (Biacore, INC, Piscataway NJ) sa puferom koji se odbija od samog proizvođača, HBS-EP (10 mM HEPES pH 7,4, 150 mM NaCl, 3 mM EDTA, 0,005% v/v polisorbat P20). Afinitet se određuje hvatanjem N-terminalno biotinilovanih CGRP peptida (po narudžbini od Gen-Script Corporation, New Jersey ili Global Peptide Services, Colorado) pomodu prethodno imobilizovanog streptavidina na SA čipu i merenjem kinetike vezivanja Fab antitela koje se titrira kroz površinu CGRP. Biotinilovani CGRP se rastvara u HBSEP i injektira u čip na koncentraciji manjoj od 0,001 mg/ml. Upotrebom varijabilnog vremena protoka kroz individualne kanale čipa, postižu se dva opsega gustine antitela: <50 jedinica odgovora (RU) za detaljna ispitivanja kinetike i oko 800 RU za ispitivanja koncentracije i skrining. Dvostruka ili trostruka serijska razblaženja obično na koncentracijama od 1 µM - 0.1 nM (ciljano na 0,1-10x procenjeno KD) il prečišdenih Fab fragmenta se injektiraju 1 minut na 100 µL/min i omogudava se vreme disocijacije u trajanju od 10 minuta. Nakon svakog ciklusa vezivanja, površine su regenerisane sa 25 mM NaOH u 25% v/v etanolu, koji se toleriše tokom stotina ciklusa. Kinetička konstanta vezivanja (kasoc) i brzina disocijacije (kdis) se dobijaju istovremeno uklapanjem podataka 1:1 Langmuir modela vezivanja (Karlsson, R. Roos, H. Fagerstam, L. Petersson, B. (1994). Methods Enzymology 6.99-110) upotrebom BIA programa za evaluciju. Globalne ravnotežne konstante disocijacije (KD) ili "afiniteti" se računaju iz odnosa KD= kdis/kasoc. Afiniteti mišjih Fab fragmenta su prikazani u Tabelama 2 i 3.

[0183] Mapiranje epitopa mišjih anti-CGRP antitela. Da bi se odredio epitop za kog se anti-CGRP antitela vezuju na humanom α-CGRP, afiniteti vezivanja Fab fragmenta za različite CGRP fragmente se mere kao što se opisuje u tekstu iznad hvatanjem N-terminalno biotinilovanih CGRP fragmenata aminokiselina 19-37 i aminokiselina 25-37 na SA senzor čipu. Slika 1 pokazuje njihove afinitete vezivanja koji se mere na 25°C. Kao što je prikazano na Slici 1, sva antitela, izuzev antitela 4901, se vezuju za humane fragmente α-CGRP 19-37 i 25-37 sa afinitetom koji je sličan sa njihovim afinitetom vezivanja za humani α-CGRP pune dužine (1-37). Antitelo 4901 se vezuje za humani α-CGRP fragment 25-37 sa šest puta nižim afinitetom nego što je vezivanje za humani α-CGRP fragment pune dužine, uglavnom zbog gubitka u brzini disocijacije. Podaci ukazuju na to da se ova anti-CGRP antitela generalno vezuju za C-terminalni kraj CGRP.

[0184] Pretraživanje prisustva alanina se izvodi za dalju karakterizaciju aminokiselina kod humanog α-CGRP koji je uključen u vezivanju anti-CGRP antitela. Različite varijante humanog α-CGRP sa jednom supstitucijom alanina se dobijanju sintezom peptida. Njihove sekvence aminokiselina su prikazane u Tabeli 4 zajedno sa svim drugim peptidima koji se koriste u Biacore analizi. Afiniteti Fab fragmenata anti-CGRP antitela prema ovim varijantama se određuju upotrebom Biacore kao što se opisuje u tekstu iznad. Kao što je prikazano na Slici 1, svih 12 antitela ciljaju C-terminalni epitop, pri čemu je aminokiselina F37 najvažniji ostatak. Mutacija F37 u alanin značajno smanjuje afinitet ili čak kompletno onemogudava vezivanje anti-CGRP antitela za peptid. Slededi najvažniji ostatak aminokiselina je G33, međutim, samo su antitela viskog afiniteta (7E9, 8B6, 10A8, i 7D11) pogođena zamenom alanina na ovom položaju. Ostatak aminokiseline S34 takođe ima značajnu, ali manju, ulogu u vezivanju ovih četiri visokoafinitetnih antitela.

4

Tabela 2. Karakteristike vezivanja anti-CGRP monoklonskih antitela za humani α-CGRP i njihova aktivnost antagonista

Tabela 3. Karakteristike vezivanja anti-CGRP monoklonskih antitela za α-CGRP pacova i aktivnost antagonista

Tabela 4. Sekvence aminokiselina humanih α-CGRP fragmenata (SEQ ID NOS:15-40) i peptida koji su u vezi sa njima (SEQ ID NOS:41-47). Svi peptidi su C-terminalno amidovani izuzev SEQ ID NOS:36-40.

Ostaci naznačeni tamnim slovima ukazuju na tačkaste mutacije.

4

Primer 2: Pretraživanje anti-CGRP antagonističkih antitela upotrebom in vitro testova.

[0185] Mišja anti-CGRP antitela se dalje pretražuju za aktivnost antagonista in vitro upotrebom delijski zasnovanog testa aktivacije cAMP-a i testa vezivanja.

[0186] Aktivnost antagonista merena cAMP testom. Pet mikrolitara humanog ili α-CGRP pacova (finalne koncentracije 50 nM) u prisustvu ili odsustvu anti-CGRP antitela (finalna koncentracija 1-3000 nM), ili α-CGRP pacova ili α-CGRP čoveka (finalna koncentracija 0,1 nM-10 mM; kao pozitivna kontrola za aktivaciju c-AMP-a) se sipa u ploču koja sadrži 384 bunarida (Nunc, Cat. No. 264657). Deset mikrolitara delija (humanih SK-N-MC ukoliko se koristi humani α-CGRP, L6 pacova od ATCC ukoliko se koristi α-CGRP pacova) u puferu za stimulaciju (20 mM HEPES, pH 7,4, 146 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, i 500 µM 3-lzobutil-1-metilksantin (IBMX)) se dodaju u bunaride ploče. Ploča se inkubira na sobnoj temperaturi 30 min.

[0187] Nakon inkubacije, cAMP aktivacija se izvodi upotrebom HitHunter™ Enzyme Fragment Complementation testa (Applied Biosystems) prema uputstvima proizvođača. Test se zasniva na genetski modifikovanom enzimu β-galaktosidazi koji se sastoji iz dva fragmenta –koji se zovu akceptor enzima (EA) i donor enzima (ED). Kada su dva fragmenta razdvojena, enzim je inaktivan. Kada su fragmenti zajedno oni mogu spontano da se rekombinuju da obrazuju aktivni enzim pomodu postupka komplementacije. Platforma EFC testa koristi konjugat ED-cAMP peptida gde je cAMP prepoznat od anti-cAMP. Ovaj ED fragment može ponovo da se spoji sa EA da se obrazuje aktivni enzim. U testu, anti-cAMP antitelo se optimalno titrira za vezivanje za ED-cAMP konjugat i inhibiranje obrazovanja enzima. Nivoi cAMP-a u uzorcima delijskog lizata se nalaze u kompeticiji sa ED-cAMP konjugatom za vezivanje za anti-cAMP antitelo. Količina slobodnog ED konjugata u testu je proporcionalna koncentraciji cAMP-a. Prema tome, cAMP se meri obrazovanjem aktivnog enzima koje se kvantifikuje prometom luminiscentnog supstrata β-galaktozidaze. Test aktivacije cAMP-a se izvodi dodavanjem 10 µl pufera za lizu i anti-cAMP antitela (u razmeri 1:1) nakon čega sledi inkubacija na sobnoj temperaturi u trajanju od 60 min. Zatim se u svaki bunarid dodaje 10 µl ED-cAMP reagensa i inkubira se 60 minuta na sobnoj temperaturi. Nakon inkubacije, u svaki bunarid se dodaje 20 µl EA reagensa i CL smeša (koja sadrži supstrat) (u razmeri 1:1) i inkubira 1-3 sati preko nodi na sobnoj temperaturi. Ploča se čita 1 sekundu/bunaridu na PMT instrumentu ili 30 sekundi/mestu na laseru. Identifikovana su antitela koja inhibiraju aktivaciju cAMP pomodu α-CGRP (naznačeno sa "da") u Tabelama 2 i 3 gore. Podaci u Tabelama 2 i 3 ukazuju na to da antitela koja pokazuju aktivnost antagonista u testu imaju generalno visok afinitet. Na primer, antitela koja imaju KD(određeno na 25°C) oko 80 nM ili manje za humani α-CGRP ili koja imaju KD(određeno na 37°C) oko 47 nM ili manje za α-CGRP pacova u ovom testu pokazuju aktivnost antagonista.

[0188] Test vezivanja radioliganda. Test za ispitivanje vezivanja se izvodi merenjem IC50anti-CGRP antitela u blokiranju CGRP od vezivanja za receptor kao što se prethodno opisuje. Zimmermann et al., Peptides 16:421-4, 1995; Mallee et al., J. Biol. Chem. 277:14294-8, 2002. Membrane (25 µg) iz SK-N-MC delija se inkubiraju 90 min na sobnoj temperaturi u puferu za inkubaciju (50 mM Tris-HCL, pH 7,4, 5 mM MgCL2, 0,1% BSA) koji sadrži 10 pM<125>I-(humanog α-CGRP u ukupnoj zapremini od 1 mL. Da bi se odredile koncentracije inhibicije (IC50), antitela ili neobeleženi CGRP (kao kontrola), od oko 100 puta vedim rastvorom štoka su rastvoreni u puferu za inkubaciju i istovremeno inkubirani sa membranama i 10 pM<125>I-(humanim α-CGRP. Inkubacija se završava ceđenjem kroz stakleni filter

4

koji sadrži mikrocevčice (GF/B, 1µm) koji je blokiran sa 0,5% polietilemiminom. Predstavljene su krive doznog odgovora su i Kivrednosti su određene korišdenjem jednačine: Ki= IC50/(1 ([ligand]/KD); gde je ravnotežna konstanta disocijacije KD= 8 pM za humani α-CGRP prema CGRP1 receptoru kao što se nalazi kod SK-N-MC delija, i Bmax= 0,025 pmol/mg proteinu. Prijavljena IC50vrednost (u terminima IgG molekula) se konvertuje za mesta vezivanja (množenjem sa 2) tako da može da se poredi sa afinitetima (KD) koji su određeni upotrebom Biacore (vidi Tabelu 2).

[0189] Tabela 2 pokazuje IC50mišjih antitela 7E9, 8B6, 6H2 i 4901. Podaci ukazuju na to da se afinitet antitela generalno nalazi u korelaciji sa IC50: antitela koja imaju vedi afinitet (niže KDvrednosti) imaju niži IC50u testu vezivanja radioliganda.

Primer 3: Efekat anti-CGRP antagonista antitela na vazodilataciju kože koja je indukovana stimulacijom nerva safenusa pacova

[0190] Za testiranje aktivnosti antagonista anti-CGRP antitela, ispituje se efekat antitela na vazodilataciju stimulacijom nerva safenusa pacova korišdenjem modela pacova kao što se prethodno opisuje. Escott et al., Br. J. Pharmacol. 110:772-776, 1993. U ovom modelu pacova, električna stimulacija nerva safenusa indukuje oslobađanjem CGRP sa krajeva nerva, što dovodi do povedanja u prokrvljenosti kože. Prokrvljenost u koži stopala kod Sprague Dwaley pacova muškog pola (170-300 g, od Charles River Hollister) se meri nakon stimulacije nerva safenusa. Pacovi se drže pod anestezijom koja sadrži 2% izofluran. Bretilijum tosilat (30 mg/kg, dato i.v.) se daje na početku eksperimnta da se minimizuje vazokonstrikciija usled istovremene stimulacije simpatičkih vlakana nerva safenusa. Telesna temperatura se održava na 37°C korišdenjem rektalne probe koja je termostatski povezana sa grejnom pločom koja je kontrolisana temperaturom. Jedinjenja uključujudi antitela, pozitivnu kontrolu (CGRP 8-37), i nosač (PBS, 0,01% Tween 20) se daju intravenozno kroz desnu femoralnu venu, osim za eksperiment koji je prikazan na Slici 3, jedinjenje koje se ispituje i kontrola se daju injekcijom kroz repnu venu, i za eksperimente koji su prikazani na Slikama 2A i 2B, antitela 4901 i 7D11 se daju injekcijom intraperiotnealno (IP). Jedinjenja pozitivne kontrole CGRP 8-37 (antagonist vazodilatacije), usled njegovog kratkog polu-života, se daje 3-5 min pre stimulacije nerva na 400 nmol/kg (200 µl). Tan et al., Clin. Sci, 89:656-73, 1995. Antitela se daju u različitim dozama (1 mg/kg, 2.5 mg/kg, 5 mg/kg, 10 mg/kg, i 25 mg/kg).

[0191] Za ekperimente koji su prikazani na Slikama 2A i 2B, antitelo 4901 (25 mg/kg), antitelo 7D11 (25 mg/kg), ili kontrola koja sadrži nosač (PBS sa 0,01% Tween 20) se daje intraperitonealno (IP) 72 časova pre stimulacije električnim pulsiranjem. Za eksperiment koji je prikazan na Slici 3, antitelo 4901 (1 mg/kg, 2.5 mg/kg, 5 mg/kg, ili 25 mg/kg) ili kontrola koja sadrži nosač (PBS sa 0,01% Tween 20) se daje intravenozno 24 časova pre stimulacije električnim pulsiranjem. Nakon davanja antitela ili kontrole koja sadrži nosač, nerv safenus desnog zadnjeg ekstremiteta se izlaže hirurški, seče proksimalno i pokriva plastičnim omotom da se spreči isušivanje. Laserska Doppler proba se postavlja preko medio-dorzalne strane kože šapice, koji je region inervisan sa nervom safenusom. Prokrvljenost kože, koja se meri kao fluks krvnih delija, se prati laserskim Doppler meračem protoka. Kada je stabilan protok osnovne linije (sa varijacijom koja je manja od 5%) uspostavlja se najmanje 5 min, nerv se postavlja preko bipolarnih elektroda od platine i električno stimulišu sa 60 pulseva (2 Hz, 10 V, 1 ms, tokom 30 sec) i zatim ponovo 20 minuta kasnije. Kumulativna promena u prokrvljenosti kože se procenjuje površinom ispod krive protoka u vremenu (AUC, koja je jednaka sa

4

hind limbpromenom u fluksu koja je pomnožena sa promenom u vremenu) za svaki odgovor fluksa na stimulaciju električnim pulsiranjem. Uzima se srednja vrednost odgovora protoka krvi na dve simulacije. Životinje se drže pod anestezijom u periodu od jednog do tri časa.

[0192] Kao što je prikazano na Slici 2A i Slici 2B, povedanje protoka krvi koje je stimulisano primenom električnih pulseva na nerv safenus je inhibiranan prisustvom CGRP 8-37 (400 nmol/kg, dato i.v.), antibody 4901 (25 mg/kg, dato ip), ili antitelom 7D11 (25 mg/kg, dato ip) u poređenju sa kontrolom. CGRP 8-37 se daje 3-5 min pre stimulacije nerva safenusa; i antitela se daju 72 časova pre stimulacije nerva safenusa. Kao što je prikazano na Slici 3, povedanje protoka krvi stimulisano primenom električnih pulseva na nerv safenus je inhibirano prisustvom antitela 4901 u različitim dozama (1 mg/kg, 2,5 mg/kg, 5 mg/kg, i 25 mg/kg) koje se daju intravenozno 24 h pre stimulacije nerva safenusa.

[0193] Za eksperimente koji su prikazani na Slikama 4A i 4B, nerv safenus se hirurški izloži pre davanja antitela. Nerv safenus desnog zadnjeg ekstremiteta se izlaže hirurški, seče proksimalno i pokriva sa plastičnim omotom da bi se sprečilo isušivanje. Laserska Doppler proba se postavlja preko medio-dorzalne strane kože šapice, što predstavlja region koji je inervisan nervom safenusom. Protok krvi u koži, koji se meri kao fluks krvnih delija, se prati laserskim Doppler meračme protoka. Trideset do četrdeset pet minuta nakon injekcije bretilijum tozilata, da se uspostavi stabilni fluks osnovnog nivoa (sa varijacijom koja je manja od 5%) u toku najmanje 5 min, nerv se postavlja preko bipoarnih elektroda od platine i električno stimuliše (2Hz, 10V, 1 ms, za 30 sec) i ponovo 20 minuta kasnije. Srednja vrednost odgovora fluksa protoka krvi na ove dve stimulacije se koriti za uspostavljanje odgovora osnovnog nivoa (vreme 0) za električnu stimulaciju. Antitelo 4901 (1 mg/kg ili 10 mg/kg), antitelo 7E9 (10 mg/kg), antitelo 8B6 (10 mg/kg), ili nosač (PBS sa 0,01% Tween 20) se zatim daju intravenozno (i.v.). Nerv se naknadno stimuliše (2Hz, 10V, 1 ms, tokom 30 sec) na 30 min, 60 min, 90 min, i 120 min nakon davanja anatitla ili nosača. Životinje se drže pod anestezijom tokom perioda od približno tri sata. Kumultivna promena u protoku krvi u koži se procenjuje površinom ispod krive protoka krvi i vremenu (AUC, koja je jednaka sa promenom u fluksu koja je pomnožena sa promenom u vremenu) za svaki odgovor fluksa na stimulacije električnim pulsevima.

[0194] Kao što je prikazano na Slici 4A, povedanje protoka krvi koje je stimulisano primenom eklektronskih pulseva na nerv safenus je značajno inhibirano prisustvom antitela 49011 mg/kg koje se daje i.v., kada se stimulacija elektronskim pulsevima primeni na 60 min, 90 min, i 120 min nakon davanja antitela, i povedanje protoka krvi stimuliše primenom elektronskih pulseva na nerv safenus je značajno inhibirana prisustvom antitela 4901 10 mg/kg koje se daje i.v., kada se stimulacija elektronskim pulsem primeni na 30 min, 60 min, 90 min, i 120 min nakon davanja antitela. Slika 4B pokazuje da povedanje protoka krvi koje je stimulisano primenom elektronskih pulseva na nerv safenus je značajno inhibirano prisutvom antitela 7E9 (10 mg/kg, dato i.v.) kada se stimulacija elektronskim pulsem primenjuje 30 min, 60 min, 90 min, i 120 min nakon davanja antitela, i prisustom antitela 8B6 (10 mg/kg, dato i.v.) kada se stimulacija elektronskim pulsem primenjuje 30 min nakon davanja antitela.

[0195] Ovi podaci ukazuju na to da su antitela 4901, 7E9, 7D11, i 8B6 efikasna u blokiranju aktivnosti CGRP-a kao što se meri vazodilatacijom kože koja je indukovana stimulacijom nerva safenusa pacova.

4

Primer 4. Karakterizacija anti-CGRP antitela G1 i njegovih varijanti

[0196] Sekvence aminokiselina za varijabilni region teškog lanca i varijabilni region lakog lanca anti-CGRP antitela G1 su prikazane na Slici 5. Slededi postupci se koriste za ekspresiju i karakterizaciju antitela G1 i njegovih varijanti.

[0197] Ekspresioni vektor koji se koristi. Ekspresija Fab fragmenta antitela je pod kontrolom IPTG inducibilnog lacZ promotera koji je sličan onom koji se opisuje u Barbas (2001) Phage display: a laboratory manual, Cold Spring Harbor, NY, Cold Spring Harbor Laboratory Press pg 2.10. Vector pComb3X), međutim, modifikacije uključuju dodavanje i ekspresiju slededih dodatnih domena: konstantnog domena humanog Kapa lakog lanca i CH1 konstantnog domena humanog imunoglobilina klase IgG2, C regiona lanca Ig gama-2, pristupni broj proteina P01859; kapa lakog lanca imunoglobulina (homosapiens), pristupni broj proteina CAA09181.

[0198] Dobijanje Fab-a u maloj razmeri. Iz transformisane E. Coli (ili korišdenjem TG1 delija kompetentnih za elektroporaciju ili hemijski kompetentnih Top 10 delija) sa Fab bibliotekom, pojedinačne kolonije se koriste za inokulaciju i master ploče (agar LB karbenicilin (50 µg/mL) 2% glukoza) i radne ploče (2 mL/bunaridu, 96-bunarida/ploči) gde svaki bunarid sadrži 1,5mL LB karbenicilin (50 µg/mL) 2% glukozu. Adhezivni zatvarač koji je propustljiv za gas (ABgene, Surrey, UK) se postavlja na ploču. Obe ploče se inkubiraju na 30°C 12-16h; radna ploča se intenzivno meša. Master ploča se čuva na 4°C do ponovne upotrebe, dok se delije iz glavne ploče transformišu u pelete (4000 oum, 4°C, 20 minuta) i resuspenduju u 1,0 mL LB karbenicilin (50 µg/mL) 0,5 mM IPTG da bi se indukovala ekpresija Fab-a intenzivnim mešanjem 5h na 30°C. Indukovane delije se centrifugiraju na 4000 oum, 4°C tokom 20 minuta i resuspenduju u 0,6 mL Biacore HBSEP puferu (10 mM Hepes pH 7,4, 150 mM NaCl, 3 mM EDTA, 0,005% v/v P20). Liza HB-SEP resuspendovanih delija se postiže zamrzavanjem (-80°C) i zatim otapanjem na 37°C. Delijski lizati se centrifugiraju na 4000 oum, 4°C tokom 1 h da bi se debris odvojio od supenatanta koji sadrže Fab, koji se zatim cede (0,2 µm) upotrebom Millipore MultiScreen test sistema sa pločom za ceđenje koja sadrži 96 bunarida i vakuumski kolektor. Biacore se koristi za analizu supernatanta koji se dobijaju nakon ceđenja koji se injektiraju preko CGRPs na senzor čipu. Klonovi koji ekprimiraju Fab-e koji su odabrani afinitetnom selekcijom su preuzeti sa master ploče, koji obezbeđuju DNK za PCR, sekvenciranje, i dobijanje plazmida.

[0199] Dobijanje Fab-a u velikoj razmeri. Da bi se dobili kinetički parametri, Fab-i se ekprimiraju u velikoj razmeri prema slededem. Erlenmajer baloni koji sadrže 150 mL LB karbenicilin (50 µg/mL) 2% glukozu su inokulirani sa 1 mL "početne" prekonodne kulture iz afnitetno odabranog klona E. coli koji eksprimira Fab. Ostatak početne kulture (∼3 mL) se koristi za dobijanje plazmidne DNK (QIAprep mini-prep, Qiagen kit) za sekvenciranje i dalju manipulaciju. Velika kultura se inkubira na 30°C uz intenzivno mešanje do postizanja OD600nmod 1,0 (obično 12-16 h). Delije se peletuju centrifugiranjem na 4000 oum, 4°C tokom 20 minuta, i resuspenduju u 150 mL LB karbenicilin (50 µg/mL) 0,5 mM IPTG. Nakon 5 h ekspresije 30°C, delije se peletuju centrifugiranjem na 4000 oum, 4°C tokom 20 minuta, resuspenduju u 10 mL Biacore HBS-EP pufera, i liziraju upotrebom jednog ciklusa zamrzavanja (-80°C)/ (37°C) otapanja. Delijski lizati se peletuju centrifugiranjem na 4000 oum, 4°C tokom 1 h, i supernatant se skuplja i cedi (0,2 µm). Supernatanti koji ostaju nakon ceđenja se pune na Ni-NTA superflow kolone sefaroze (Qiagen, Valencia. CA) koje se ekvilibrišu sa PBS, pH 8, zatim

4

ispiraju sa 5 PBS zapremina kolone, pH 8. Individualni Fab-i koji se ispiraju u različitim delovima sa PBS (pH 8) 300 mM Imidazolom. Delovi koji sadrže Fab-i se sakupljaju i dijalizuju u PBS-u, zatim se kvantifikuju upotrebom ELISA testa pre karakterizacije afiniteta.

[0200] Dobijanje celih antitela. Za ekspresiju celih antitela, varijabilni regioni teškog i lakog lanca se kloniraju u sisarske ekpresione vektore i transfekcija se vrši upotrebom lipofektamina u HEK 293 delijama za prolaznu ekpresiju. Antitela se prečišduju korišdenjem proteina A upotrebom standardnih postupaka.

[0201] Vektor pDb.CGRP.hFcGI je ekpresioni vektor koji sadrži teški lanac G1 antitela, i pogodan je za prolaznu ili stabilnu ekspresiju teškog lanca. Vektor pDb.CGRP.hFcGI ima nukleotidne sekvence koje odgovaraju slededim regionima: regionu promotora mišjeg citomegalovirusa (nukleotidi 7-612); sintetički intron (nukleotidi 613-1679); DHFR kodirajudi region (nukleotidi 688-1253); signalni peptid humanog hormona rasta (nukleotidi 1899-1976); varijabilni region teškog lanca G1 (nukleotidi 1977-2621); teški lanac konstantnog regiona humanog IgG2 koji sadrži sledede mutacije: A330P331 u S330S331 (obeležavanje aminokiselina u odnosu na divlji tip IgG2 sekvence; vidi Eur. J. Immunol. (1999) 29:2613-2624). Vektor pDb.CGRP.hFcGI je deponovan na ATCC 15 jula, 2005, i dodeljen mu je ATCC pristupni br. PTA-6867.

[0202] Vektor pEb.CGRP.hKGI je ekpresioni vektor koji sadrži laki lanac G1 antitela, i pogodan je za prolaznu ekspresiju lakog lanca. Vektor pEb.CGRP.hKGI ima nukleotidne sekvence koji odgovaraju slededim regionima: region promotora mišjeg citomegalovirusa (nukleotidi 2-613); humanom EF-1 intronu (nukleotidi 614-1149); signalnom peptidu humanog hormona rasta (nukleotidi 1160-1237); varijabilni region lakog lanac antitela G1 (nukleotidi 1238-1558); konstantni region humanog kapa lanca (nukleotidi 1559-1882). Vektor pEb.CGRP.hKGI je deponovan na ATCC 15 jula, 2005, i dodeljen mu je ATCC pristupni br. PTA-6866.

[0203] Biacore test za određivanje afiniteta. Afiniteti G1 monoklonskog antitela i njegovih varijanti se određuju na ili 25°C ili 37°C upotrebom Biacore3000™ sistema površinske plazmon rezonancije (SPR) (Biacore, INC, Piscataway NJ). Afinitet se određuje hvatanjem N-terminalno biotinilovanog CGRP ili fragmenata pomodu prethodno imobilizovanog strepatavidina (SA sensor čip) i merenjem kinetike vezivanja Fab fragmenata G1 antitela ili varijanti koje se titriraju kroz CGRP ili fragment na čipu. Svi Biacore testovi se izvode u HBS-EP puferu (10 mM HEPES pH 7,4, 150 mM NaCl, 3 mM EDTA, 0.005% v/v polisorbat P20). CGRP površine se pripremaju rastvaranjem N-biotinilovanog CGRP do koncentracije koja je manja od 0,001 mg/mL u HBS-EP bufer i injektiranjem kroz SA senzorski čip upotrebom vremena za kontakt koji se razlikuju. Površine niskog kapaciteta, koje odgovaraju nivoima hvatanja <50 jedinica odgovora (RU) se koriste za kinetička ispitivanja visoke rezolucije, gde površine visokog kapaciteta (oko 800 RU uhvadenog CGRP) se koriste za ispitivanja koncentracije, pretraživanja, i određivanja afiniteta rastvora. Kinetički podaci se dobijaju serijskim rastvaranjem Fab G1 u dvostruka ili trostruka povedanja koncentracija koje imaju opseg 1µM-0.1nM (ciljano na 0,1-10x procenjenu KD). Uzorci su obično ubrizgani 1 minut na 100 µL/min i omogudena su vremena disocijacije od najmanje 10 minuta. Nakon svakog ciklusa vezivanja, površine su regenerisane sa 25mM NaOH u 25% v/v etanolu, koji se toleriše preko stotina ciklusa. Ukupne serije titracije (obično dobijene u duplikatu) se globalno uklapaju u 1:1 Langmuir model vezivanja upotrebom BIAevaluation programa. Ovo je dovelo do jedinstvenog para konstanti kinetičke brzine asocijacije i disocijacije (redom, kasoci kdis) za svaku interakciju vezivanja, čiji odnos daje ravnotežnu konstantu disocijacije (KD= kdis/kasoc). Afiniteti (KDvrednosti) koje su određene na ovaj način su navedene u Tabelama 6 i 7.

[0204] Analiza interakcije vezivanja visoke rezolucije sa ekstremno sporim brzinama disocijacije. Za interakcije sa ekstremno sporim brzinama disocijacije (posebno, vezivanje Fab antitela G1 za humani h-CGRP na čipu na 25°C), afiniteti se dobijaju u eksperimentu koji se sastoji iz dva dela. Protokol koji se opisuje u tekstu iznad se koristi sa slededim modifikacijama. Brzina konstante asocijacije (kasoc) se određuje injektiranjem 2-strukih serija titracija (u duplikatu) koji imaju opseg 550 nM-1 nM za 30 sek na 100 µL/min i omogudavanjem faze disocijacije u trajanju od samo 30 sekundi. Brzina konstante disocijacije (kdis) se određuje injektiranjem tri koncentracije (visoke, srednje, i niske) istih serija titracije u duplikatu za 30sek i omoudavanjem faze disocijacije u trajanju od 2-sata. Afinitet (KD) svake interakcije se dobija kombinovanjem kasoci kdisvrednosti koje se dobijaju u oba tipa eksperimenta, kao što je prikazano u Tabeli 5.

[0205] Određivanje afiniteta rastvora pomodu Biacore. Afinitet rastvora koji sadrži G1 antitelo za α-CGRP pacova i F37A (19-37) čoveka α-CGRP se meri pomodu Biacore na 37°C. Koristi se CGRP površina čipa sa visokim kapacitetom (humani α-CGRP sa visokim afinitetom se koristi za svrhe detekcije) i HBS-EP pufer se pušta na 5 µL/min. Fab fragment G1 antitela na konstantnoj koncentraciji od 5 nM (sa ciljem da bude na ili ispod očekivane KDinterakcije zasnovane na rastvoru) prethodno se inkubira sa kompetitivnim peptidom, ili α-CGRP pacova ili F37A (19-37) čoveka α-CGRP, na finalnoj koncentraciji koja ima opseg od 1 nM do 1 µM u 3-strukim serijskim razblaženjima. Rastvori Fab antitela G1 u odsustvu ili prisustvu peptida kompeticije koji je zasnovan na rastvoru, se injektiraju preko CGRP koji se nalazi na čipu i prati se deplecija odgovora vezivanja koji se uočava na povrišni čipa kao rezultat kompeticije rastvora. Ovi odgovori vezivanja se konvertuju u "slobodne Fab koncentracije" korišdenjem kalibracione krive, koja se dobija samo titracijom Fab G1 antitela (5, 2,5, 1,25, 0,625, 0,325 i 0 nM) preko CGRP na čipu. "Slobodne Fab koncentracije" se predstavljaju u odnosu na koncentraciju peptida za kompeticiju u rastvoru koji se koristi za dobijanje svake tačke podatka i za uklapanje u model afiniteta rastvora upotrebom BIAevaluation softvera. Afiniteti rastvora koji su određeni na ovaj način (indirektno) su prikazani u Tabelama 5 i 7 i koriste se za određivanje afiniteta koji se dobijaju kada se Fab-ovi injekiraju direktno kroz N-biotinilovane CGRP-e na SA čipu. Blisko slaganje između afiniteta koje se određuje pomodu ova dva postupka potvrđuje da vezivanje N-biotinilovane verzije CGRP-a za čip ne menja njegovu prirodnu sposobnost vezivanja u rastvoru.

[0206] Tabela 5 ispod pokazuje afinitete vezivanja G1 antitela za humani α-CGRP, humani β-CGRP, α-CGRP pacova, β-CGRP pacova određeno od Biacore, protokom Fab fragmenata kroz N-biotinilovane CGRP-e koji se nalaze na SA čipu. Za bolje određivanje afiniteta kroz interakcije vezivanja sa ekstremno niskim brzinama disocijacije, afiniteti se takođe određuju u ekperimentu iz dva dela u cilju dopune orijentacije ovog testa, rastvor interakcije afiniteta α-CGRP pacova se takođe određuje (kao što se opisuje u tekstu iznad). Blisko slaganje afiniteta koji se mere u obe orijentacije afiniteta potvrđuje da se afinitet vezivanja prirodnog α-CGRP pacova u rastvoru ne menja kada je on N-biotinilovan i vezan za SA čip.

1

Tabela 5. Afiniteti vezivanja Fab-ova G1 antitela koji su titrirani kroz CGRP-e na čipu

[0207] Tabela 6 ispod pokazuje antitela koja imaju varijaciju sekvence aminokiselina u poređenju sa antitelom G1 i njihove afinitete za α-CGRP pacova i α-CGRP čoveka. Sve supstitucije aminokiselina u varijantama koje su prikazane u Tabeli 6 su opisane u odnosu na sekvencu G1. Afiniteti vezivanja Fab fragmenata su određeni upotrebom Biacore njihovim prelaskom preko CGRP-e na SA čipu.

Tabela 6. Sekvence aminokiselina i podaci afiniteta vezivanja za varijante antitela G1 koji su određeni na 37°C uporebom Biacore.

2

4

[0208] Za određivanje epitopa na humanom α-CGRP koje prepoznaje antitelo G1, koriste se Biacore testovi koji se opisuju u tekstu iznad. Humani α-CGRP se kupuje kao N-biotinilovana verzija da se omogudi njegovo visoko-afiniteno hvatanje pomodu SA senzorskog čipa. Određuje se vezivanje Fab fragmenta G1 za humani α-CGRP na čipu u odsustvu ili prisustvu CGRP peptida. Obično, 2000:1 mol peptida/rastvoru Fab (npr., 10 µM peptida u 50nM G1 Fab) se injektira kroz humani α-CGRP na čipu. Slika 6 pokazuje procenat vezivanja koje je blokirano kompetitorskim peptidom. Podaci koji su prikazani na Slici 6 ukazuju na to da peptidi koji blokiraju 100% vezivanje Fab-a G1 z humani α-CGRP su 1-37 (WT), 8-37, 26-37, P29A (19-37), K35A (19-37), K35E (19-37), i K35M (19-37) humanog α-CGRP; 1-37 of β-CGRP (WT); 1-37 α-CGRP pacova (WT); i 1-37 β-CORP pacova (WT). Svi ovi peptidi su amidovani na C-kraju. Peptidi F37A (19-37) i 19-37 (zadnji nije amidovan na C-kraju) humanog α-CGRP takođe blokiraju oko 80% do 90% vezivanja G1 Fab-a za humani α-CGRP. Peptid 1-36 (nije amidovan na C-kraju) humanog α-CGRP blokiraju oko 40% vezivanja G1 Fab-a za humani α-CGRP. Peptidni fragment 19-36 (amidovan na C-kraju) humanog α-CGRP; peptidni fragmenti 1-13 i 1-19 humanog α-CGRP (od kojih nijedan nije amidovan na C-kraju); i humani amilin, kalcitonin, i adrenomedulin (svi su amidovani na C-kraju) nisu u kompeticiji sa vezivanjem G1 Fa-a za humani α-CGRP na čipu. Ovi podaci pokazuju da G1 cilja C-terminalni epitop CGRP-a i da su oba identiteta terminalnog ostatka (F37) i njegova amidacija važni za vezivanje.

[0209] Takođe se određuju afiniteti vezivanja G1 Fab-a za varijante humanog α-CGRP (na 37°C). Tabela 7 ispod pokazuje afinitete kao što se meri direktno titriranjem G1 Fab-a preko N-biotinilovanog humanog α-CGRP i varijanti na čipu. Podaci u Tabeli 7 ukazuju na to da se antitelo G1 vezuje za C-terminalni epitope sa F37 i G33 koji su najvažniji ostaci. G1 se ne vezuje za CGRP kada se dodatni ostatak aminoskiseline (alanin) dodaje na C-terminalni kraj (koji je amidovan).

Tabela 7. Afiniteti vezivanja G1 Fab-a za humani α-CGRP i varijante koji su mereni na 37°C (videti Tabelu 4 za njihove sekvence aminokiselina)

[0210] Gornji podaci ukazuju na to da se epitop za koji se G1 vezuje nalazi na C-terminalnom kraju humanog α-CGRP, i aminokiseline 33 i 37 humanog α-CGRP su važne za vezivanje antitela G1. Takođe, amidacija ostatka F37 je važna za vezivanje.

Primer 5: Efekat anti-CGRP antagonističkog antitela G1 na vazodilataciju kože koja je indukovana stimulacijom nerva safenusa pacova

[0211] Da bi se ispitala antagonistička aktivnost anti-CGRP antitela G1, ispituje se efekat antitela na vazodilataciju kože stimulacijom nerva safenusa pacovaupotrebom odela pacova koji se opisuje u Primeru 3. Ukratko, pacovi se drže u anesteziji u 2% izofluranom. Bretilijum tozilat (30 mg/kg, dato i.v.) se daje na početku eksperimenta da se minimizuje vazokonstrikcija zbog pratede stimulacije simpatičkih vlakana nerva safenusa. Temperatura tela se održava na 37°C korišdenjem rektalne probe koja je termostatički povezana sa grejnim pokrivačem koji se temperaturno kontroliše. Nerv safenus desnog zadnjeg ekstremiteta se hirurški izlaže, seče proksimalno i pokriva plastičnim omotačem da bi se sprečilo isušivanje. Laserska Doppler proba se postavlja preko medio-dorzalne strane kože šape, koji predstavlja region koji je inervisan safenoznim nervom. Protok krvi u koži, koji se meri kao fluks krvnih delija, se prati sa laserskim Doppler metrom protoka. U eksperimentima za određivanja efekata antitela u okviru dva sata od injekcije trideset do četrdeset i pet minuta nakon injekcije bretilijum tozilata, kada je stabilan osnovni fluks (manje od 5% varijacije) uspostavljen za najmanje 5 min, nerv se postavlja preko bipolarnih elektroda od platine i električno stimuliše (2Hz, 10V, 1 ms, za 30 sec) i ponovo 20 minuta kasnije. Srednja vrednsot odgovora fluksa protoka krvi za ove dve stimulacije se koristiza upostavljanje odgovora osnovnog nivoa (vreme 0) na električnu stimulaciju. Antitelo G1 (1 mg/kg ili 10 mg/kg) ili nosač (PBS sa 0,01% Tween 20 jednake zapremine sa 10 mg/kg G1) se zatim daju intravenozno (i.v.). Nerv se zatim stimuliše (2Hz, 10V, 1 ms, 30 sek) na 30 min, 60 min, 90 min, i 120 min nakon davanja antitela. Životinje se drže pod anestezijom u periodu od približno tri sata. Ukupna promena protoka krvi u koži se procenjuje površinom koja se nalazi ispod krive fluksa u vremenu (AUC, koji je jednak promeni u fluksu pomnoženoj sa promenom u vremenu) za svaki odgovor fluksa na stimulaciju električnim pulsem.

[0212] Kao što je prikazano n Slici 7, povedanje protoka krvi koje je stimulisano primenom električnih pulseva na safenozni nerv je značajno inhibirano prisustvom antitela G1 na 1 mg/kg (dato i.v.) u poređenju sa nosačem, kada je safenozni nerv električno stimulisan na 90 min nakon davanja antitela. Povedanje protoka krvi koje je stimulisano primenom električnih pulseva na safenozni nerv je značajno inhibirano prisustvom antitela G1 na 10 mg/kg (dato i.v.) u poređenju sa nosačem, kada je safenozni nerv električno stimulisan na 90 minuta i 120 minut nakon davanja antitela.

[0213] U eksperimentima za određivanje efekata antitela u dužim vremenskim tačkama safenoznog testa, pacovima je data injekcija i.v. sa naznačenim dozama antitela 24 časova ili 7 dana pre pripreme životinje za stimulaciju safenoznog nerva kao što se opisuje u tekstu ispod. U ovim eksperimentima je mogude uspostaviti osnovni odgovor kod individualnih pacova na stimulaciju električnim pulsiranjem pre doziranja, tako da se tretirane grupe porede sa životinjama koje su dozirane nosačem (PBS, 0,01% Tween 20) 24 časova ili 7 dana.

[0214] Kao što je prikazano na Slikama 8A i 8B protok krvi koji je povedan u dorzomedijalnoj koži šape koji je pokrenut stimulacijom safenoznog nerva je značajno inhibiran u grupama koje su dozirane sa ili 10 mg/kg ili 3 mg/kg G1 na ili 24 časova ili 7 dana pre stimulacije u poređenju sa grupama koje sadrže nosač koje su dozirane u istim vremenskim tačkama.

[0215] Slika 8C predstavlja analizu usklađivanja krive koja se primenjuje na podatke doznog odgovora koji su predstavljeni na Slikama 8A i 8B za definisanje doze koja je neophodna za 50% maksimalni efekar (EC50). EC50na 24 časova je 1,3 mg/kg i EC50na 7 dana je nešto niži (0,8mg/kg).

Primer 6: Akutni efekat anti-CGRP antagonističkog G1 antitela u testu duralne arterije (zatvorenom kranijanlnom prozoru)

[0216] Model zatvorenog kranijalnog prozora: Svrha ovog eksperimenta je da se odredi akutni efekat anti-CGRP antagonističkih antitela i da se poredi sa akutinim efektom antagonista CGRP receptora BIBN4096BS. Eksperimenti se izvode kao što se prethodno opisuje (Williamson et al., Cephalalgia 17(4):518-24 (1997)) sa modifikacijama koje slede. Sprague Dawley pacovi (300-400g) su anestezirani 70mg/kg i.p. sa pentobarbitalom. Anestezija se održava sa 20mg/kg/hr i.v. pentobarbitalom. Izvršena je kanulizacija pacova kroz jugularnu venu za isporuku svih lekova. Krvni pritisak se prati upotrebom probe (mikro-tip katetera, Millar Instrumenti) sa navojem kroz femoralnu arteriju u abdominalnu aortu. Pacovi su traheotomizovani i brzina disanja se održava na 75 udisaja po minuti u zapremini od 3,5 mL. Nakon fiksiranja glave u stereotaktičkom instrumentu i uklanjanja skalpa, prozor 2x6mm u parijetalnoj površini koja je lateralna u odnosu na sagitalni nabor se dobija proređivanjem kosti sa zubnom bušilicom. Upotrebom mikromanipulatora, bipolarna elektroda od platine se postavlja na površinu i pokriva se sa teškim mineralnim uljem. Lateralno u odnosu na prozor elektrode kreira se drugi prozor veličine 5x6 mm i puni se sa teškim mineralnim uljem kroz koji se kontinuirano prati dijametar grane srednje meningealne arterije (MMA) pomodu CCD kamere i videom se analizira dijametar (Living Systems). Pacovi odmaraju ne manje od 45 minuta nakon dobijanja. Uspostavlja se osnovni odgovor na to električnu stimulaciju (15 V, 10 hz, 0,5 ms pulseva, 30 sekundi) i zatim se pacovi doziraju i.v. sa ekperimentalnim jedinjenjem (10mg/kg mu7E9, 300mg/kg BIBN4096BS ili PBS 0,01%Tween 20). Dodatne električne stimulacije se izvode na 5 (BIBN4096BS), 30, 60, 90 i 120 minuta nakon doziranja. Svi podaci se snimaju upotrebom čart softvera (ADInstruments).

[0217] Kao što je prikazano na Slici 9 mu7E9 na 10mg/kg značajno blokira MMA dilataciju koja je pobuđena stimulacijom električnog polja tokom 60 minuta nakon doziranja i održava efeakt kroz trajanje testa (120 minuta). Za poređenje BIBN4096BS blokira MMA dilataciju tokom 5 minuta doziranja ali efekat u potpunosti nestaje nakon 90 minuta. Veličina blokiranja može da se poredi između BIBN4096BS i mu7E9.

Primer 7: Hroničan efekat anti-CGRP antagonisitčkog G1 antitela u testu duralne arterije (zatvorenom kranijalnom prozoru)

[0218] Svrha ovog eksperimenta je da se odredi da li anti-CGRP antitelo još uvek može da blokira elekrično stimulisanu MMA dilataciju 7 dana nakon doziranja. Priprema pacova je identična sa gore opisanim akutnim eksperimentom (Primer 6) uz izuzetke koji slede. Pacovima je data i.v. injekcija (10mg/kg, 3mg/kg ili 1mg/kg G1) 7 dana pre kreiranja zatvorenog kranijalnog prozora i stimulacije. Nije bilo mogude uspostaviti osnovni nivo odgovora dilatacije na električnu stimulaciju pre doziranja kao kod akutnog eksperimenta tako da se grupe antitela porede sa dilatacijom MMA u nosaču (PBS, 0,01% Tween 20) doziranoj kontrolnoj grupi. Nakon što je pacovima omogudeno da se odmore ne manje od 45 minuta dura je elekrično stimulisana u vremenskim intervalima od 30 minuta. Stimulacije su izvedene na 2,5V, 5V, 10V, 15V i 20V, sve na 10hz, 0.5 ms pulseva tokom 30 sekundi.

[0219] Kao što je prikazano na Slici 10 G1 na 10 mg/kg i 3 mg/kg zančajno blokira MMA dilataciju koja je pobuđena elekričnom stimulacijom u opsegu od 10 do 20 volti. Ovi podaci pokazuju da G1 može da blokira električno stimulisanu MMA dilataciju do 7 dana nakon doziranja.

Primer 8: Model povlačenja valunga dejstvom morfina

[0220] Model odvikavanja od morfina kod pacova je upostavljeni model glodara za ispitivanje mehanizama koji obuhvataju vrude valunge u koji se javljaju u menopauzi (Sipe et al., Brain Res.

1028(2):191-202 (2004); Merchenthaler et al., Maturitas 30:307-316 (1998); Katovich et al., Brain Res. 494:85-94 (1989); Simpkins et al., Life Sciences 32:1957-1966 (1983)). U osnovi, pacovi postaju zavisni od morfina implantacijom peleta koji sadrže morfin ispod kože. Nakon uspostavljanja zavisnosti životinjama se injekcijom daje nalokson (antagonist opioida) koji ih šalje u trenutno odvikavanje. Ovo ovikavanje je povezano sa povedanjem temperature u koži, smanjenjem telesne temperature, povedanjem brzine srčanog rada i povedanjem koncentracije luteinizirajudeg hormona u serumu. Sve promene su slične po veličini i vremenu sa onim što se događa u humanim vrudim valunzima (Simpkins et al., Life Sciences 32:1957-1966 (1983)). Dalje, ukoliko se pacovi tretiraju sa estradiolom pre indukovanja povlačenja, simptomi toplotnih valunga se smanjuju (Merchenthaler et al., Maturitas 30:307-316 (1998)). Zbog toga se veruje da model odvikavanja od morfina imitira kliničke simptome toplotnih valunga.

[0221] Ovariektomizirani pacovi su naručeni od Charles River Laboratories. Ne manje od 7 dana nakon ovarijektomije kreira se zavisnost od morfina subkutanom implantacijom peleta koji sadrže morfin (osnova morfina od 75 mg). Dva dana kasnije implantira se još 2 peleta. Slededeg dana pacovima je intravenski data injekcija sa ili 10 mg/kg 4901 ***+ ili nosačem (PBS, 0,01% tween). Dva nakon drugog davanja peleta pacovi se anesteziraju upotrebom ketamina (90 mg/kg) i blago zadrže. Površinska temperatura termoelementa se postavlja na osnovu repa i rekatalni termoelement se koristi za merenje temperature jezgra. Podaci se snimaju upotrebom Chart software (ADInstruments). Nakon snimanja stabilne osnovne temperature 15 minuta, subkutano se injekcijom daje nalokson (1 mg/kg). Temperatura se u kontinuitetu snima slededih 60 minuta. Rezultati su prikazani na Slikama 11A i 11B.

Depozit biološkog materijala

[0222] Slededi materijali su deponovani kod American Type Culture Collection, 10801 University Boulevard, Manassas, Virginia 20110-2209, USA (ATCC):

Materijal Antitelo Br. ATCC Pristupni br Datum depozita pDb.CGRP.hFcGI G1 teški lanac PTA-6867 Jul 15, 2005 pEb.CGRP.hKGI G1 laki lanac PTA-6866 Jul 15, 2005

[0223] Vektor pEb.CGRP.hKGI je polinukleotid koji kodira varijabilni region G1 lakog lanca i kapa konstantni lanac lakog lanca; i vektor pDb.CGRP.hFcGI je polinukleotid koji kodira varijabilni region G1 teškog lanca i konstantni region teškog lanca IgG2 koji sadrži sledede mutacije: A330P331 u S330S331 (obeležavanje amino sekvence u odnosu na divlji tip IgG2 sekvence; videti Eur. J. Immunol. (1999) 29:2613-2624).

[0224] Ovi depoziti se dobijaju u skladu sa odredbama Budapest Treaty on the International Recognition of the Deposit of Microorganisms for the Purpose of Patent Procedure and the Regulations thereunder (Budapest Treaty). Ovo osigurava održavanje vijabilne kulture depozita 30 godina od datuma deponovanja. Depozit de biti dostupan od ATCC pod uslovima Budapest Treaty, i predmet dogovora između Rinat Neuroscience Corp. i ATCC, što osigurava permanentnu i neogrančenu dostupnost potomstva kulture depozita javnosti nakon izdavanja odgovarajudeg U.S. patenta ili javnom otvaranju za bilo koju U.S. ili stanu prijavu patenta, koja god dolazi prvo, i osigurava dostupnost potomstva onom koji je određen od U.S. Commissioner of Patents and Trademarks da imaju pravo na osnovu 35 USC Section 122 and the Commissioner’s rules pursuant (uključujudi 37 CFR Section 1.14 sa posebnom referencom na 886 OG 638).

[0225] Ovlašdeni prijavilac ove prijave pristaje da ukoliko kultura materijala depozita umre ili se izgubi ili se uništi nakon gajenja u kulturi pod stabilnim uslovima, materijali mogu da budu blagovremeno zamenjeni sa drugim ili istim. Dostupnost deponovanog materijala ne treba tumačiti

1

kao dozvolu za primenu pronalaska koja je u suprotnosti sa pravima odobrenih u nadležnosti bilo koje vlade u skladu sa njenim zakonima o patentu.

2

Sekvence antitela

[0226]

Sekvenca aminokiselina varijabilnog regiona teškog lanca G1 (SEQ ID NO:1)

Sekvenca aminokiselina varijabilnog regiona lakog lanca G1 (SEQ ID NO:2)

G1 CDR H1 (proširen CDR) (SEQ ID NO:3)

GFTFSNYWIS

G1 CDR H2 (proširen CDR) (SEQ ID NO:4) EIRSESDASATHYAEAVKG

G1 CDR H3 (SEQ ID NO:5)

YFDYGLAIQNY

G1 CDR L1 (SEQ ID NO:6)

KASKRVTTYVS

G1 CDR L2 (SEQ ID NO:7)

GASNRYL

G1 CDR L3 (SEQ ID NO:8)

SQSYNYPYT

Nukleotidna sekvenca varijabilnog regiona teškog lanca G1 (SEQ ID NO:9)

Nukleotidna sekvenca varijabilnog regiona lakog lanca G1 (SEQ ID NO:10)

Sekvenca aminokiselina teškog lanca celog antitela G1 (uključujudi modifikovani IgG2 kao što se ovde opisuje) (SEQ ID NO: 11)

Sekvenca aminokiselina lakog lanca celog antitela G1 (SEQ ID NO:12)

Nukleotidna sekvenca teškog lanca celog antitela G1 (uključujudi modifikovani IgG2 kao što se ovde opisuje) (SEQ ID NO:13)

4

Nukleotidna sekvenca lakog lanca celog antitela G1 (SEQ ID NO:14)

Poređenje sekvence aminokiselina humanog i CGRP pacova (humani α-CGRP (SEQ ID NO:15); humani β-CGRP (SEQ ID NO:43); α-CGRP pacova (SEQ ID NO:41); β-CGRP pacova (SEQ ID NO:44)): NH2-ACDTATCVTHRLAGLLSRSGGVVKNNFVPTNVGSKAF-CONH2(humani α-CGRP) NH2-ACNTATCVTHRLAGLLSRSGGMVKSNFVPTNVGSKAF-CONH2(humani β-CGRP) NH2-SCNTATCVTHRLAGLLSRSGGVVKDNFVPTNVGSEAF-CONH2 (α-CGRP pacova) NH2-SCNTATCVTHRLAGLLSRSGGVVKDNFVPTNVGSKAF-CONH2(β-CGRP pacova)

Obeležena izvođenja

[0227]

1. Antitelo sa afinitetom vezivanja (KD) za humani α-CGRP od 50 nM ili manje kao što se meri površinskom plazmon rezonancijom na 37 °C.

2. Antitelo prema obeleženom izvođenju 1, koje sadrži VH domen koji je manje od 90% identičan u sekvenci aminokiselina sa SEQ ID NO: 1.

3. Antitelo prema obeleženom izvođenju 2, gde ostatak aminokiseline na položaju 99 od SEQIDNO: 1 je L ili je zamenjen sa A, N, S, T, V ili R, i gde ostatak aminokiseline na položaju 100 od SEQIDNO: 1 je A, ili je zamenjen sa L, R, S, V, Y, C G, T, K ili P.

4. Antitelo prema obeleženom izvođenju 1, koje sadrži VL domen koji je najmanje 90% identičan u sekvenci aminokiselina sa SEQ ID NO: 2.

5. Antitelo prema obeleženom izvođenju 1, koje sadrži najmanje jedan CDR koji se bira iz grupe koja se sastoji od:

a. CDR H1 kao što se navodi u SEQ ID NO: 3;

b. CDR H2 kao što se navodi u SEQ ID NO: 4;

c. CDR H3 kao što se navodi u SEQ ID NO: 5;

d. CDR L1 kao što se navodi u SEQ ID NO: 6;

e. CDR L2 kao što se navodi u SEQ ID NO: 7;

f. CDR L3 kao što se navodi u SEQ ID NO: 8; i

g. varijante L1, L2 i H2 kao što je prikazano u Tabeli 6.

6. Antitelo prema obeleženom izvođenju 1, koje sadrži:

a. VH CDR3 kao što se navodi u SEQ ID NO: 5, ili sekvenca koja se razlikuje od SEQ ID NO: 5 za 1 ili 2 konzervativne zamene aminokiselina; i

b. VL CDR3 kao što se navodi u SEQ ID NO: 8, ili sekvenca koja se razlikuje od SEQ ID NO: 8 za 1 ili 2 konzervativne zamene aminokiselina.

7. Antitelo koje sadrži VH domen koji je najmanje 90% identičan u sekvenci aminokiselina sa SEQ ID NO: 1 i VL domen koji je najmanje 90% identičan u sekvenci aminokiselina sa SEQ ID NO:2.

8. Antitelo prema obeleženom izvođenju 7, gde je antitelo IgG, IgM, IgE, IgA, ili IgD molekul, ili je izvedeno iz navedenih molekula.

9. Antitelo prema obeleženom izvođenju 7, koje sadrži teški lanac koji je proizveden korišdenjem ekpresiong vektora sa ATCC pristupnim br. PTA-6867.

10. Antitelo prema obeleženom izvođenju 7, koje sadrži laki lanac koji je proizveden korišdenjem ekspresionog vektora sa ATCC pristupnim br. PTA-6866.

11. Farmaceutska kompozicija koja sadrži antitelo prema obeležnom izvođenju 1 i farmaceutski prihvatljiv ekscipijent.

12. Postupak za prevenciju ili lečenje najmanje jednog vazomotornog simptoma kod subjekta, koje obuhvata davanje subjektu efikasne količine anti-CGRP antagonističkog antitela.

13. Postupak prema obeleženom izvođenju 12, gde je pomenuti vazomotorni simptom migrena sa ili bez aure, hemiplegična migrena, klaster glavobolja, migrainozna neuralgija, hronična glavobolja, ili tenziona glavobolja.

14. Postupak prema obeleženom izvođenju 12, gde je pomenuti vazomotorni simptom vrudi valung.

15. Postupak prema obeleženom izvođenju 12, gde anti-CGRP antagonističko antitelo je bilo koje od antitela koje se opisuju u obeleženim izvođenjima 1 do 10.

16. Postupak prema obeleženom izvođenju 12, gde anti-GCRP antagonističko antitelo je antitelo koje je proizvedeno korišdenjem ekspresionih vektora ATCC sa pristupnim brojevima. PTA-6867 i PTA-6866.

LISTA SEKVENCI

[0228]

1

2

�

1

2

4

Claims

Patentni Zahtevi

1. Anti-CGRP antagonističko antitelo za upotrebu u prevenciji ili lečenju klaster glavobolje.

2. Anti-CGRP antagonističko antitelo za upotrebu prema zahtevu 1, gde je antitelo humano antitelo ili humanizovano antitelo.

3. Anti-CGRP antagonističko antitelo za upotrebu prema bilo kom prethodnom zahtevu, gde antitelo ima afinitet vezivanja (KD) za humani α-CGRP od 50 nM ili manje kao što se meri površinskom plazmon rezonancijom na 37°C.

4. Anti-CGRP antagonističko antitelo za upotrebu prema bilo kom prethodnom zahtevu, gde antitelo se vezuje za (a) C-terminalni fragment koji ima aminokiseline 25-37 od CGRP ili (b) C-terminalni epitop unutar aminokiselina 25-37 od CGRP.

5. Anti-CGRP antagonističko antitelo za upotrebu prema bilo kom prethodnom zahtevu, gde antitelo ima konstantni region teškog lanca IgG.

6. Anti-CGRP antagonističko antitelo prema zahtevu 5, gde antitelo ima konstanti region teškog lanca IgG1, IgG2, IgG3 ili IgG4.

7. Anti-CGRP antagonističko antitelo za upotrebu prema bilo kom prethodnom zahtevu, gde je antitelo: (a) antitelo koje ima CDR H1 kao što se navodi u SEQ ID NO: 3; CDR H2 kao što se navodi u SEQ ID NO: 4; CDR H3 kao što se navodi u SEQ ID NO: 5; CDR L1 kao što se navodi u SEQ ID NO: 6; CDR L2 kao što se navodi u SEQ ID NO: 7; i CDR L3 kao što se navodi u SEQ ID NO: 8; ili (b) varijantu antitela pod (a) kao što je prikazano u Tabeli 6.

8. Anti-CGRP antagonističko antitelo za upotrebu prema bilo kom prethodnom zahtevu, gde antitelo sadrži VH domen koji je najmanje 90% identičan u sekvenci aminokiselina sa SEQ ID NO: 1 i VL domen koji je najmanje 90% identičan u sekvenci aminokiselina sa SEQ ID NO: 2; na primer, gde antitelo sadrži VH domen SEQ ID NO: 1 i VL domen SEQ ID NO: 2.

9. Anti-CGRP antagonističko antitelo za upotrebu prema bilo kom prethodnom zahtevu, gde antitelo sadrži laki lanac koji je proizveden od ekspresionog vektora sa ATCC pristupnim br. PTA-6866 i/ili teški lanac koji je proizveden od ekspresionog vektora sa ATCC pristupnim br. PTA-6867.

10. Anti-CGRP antagonističko antitelo za upotrebu prema bilo kom prethodnom zahtevu, gde antitelo blokira ili smanjuje aktivaciju receptora za CGRP (uključujudi aktivaciju cAMP).

11. Anti-CGRP antagonističko antitelo za upotrebu prema bilo kom prethodnom zahtevu, gde se antitelo daje injekcijom; na primer, intraperitonealno, intravenozno, subkutano, ili intramuskularno.

12. Anti-CGRP antagonističko antitelo za upotrebu prema bilo kom prethodnom zahtevu, gde se antitelo daje 1 do 4 puta nedeljno.

13. Anti-CGRP antagonističko antitelo za upotrebu prema bilo kom prethodnom zahtevu, gde se antitelo daje u dnevnoj dozi od 3 µg/kg do 100 mg/kg.

14. Anti-CGRP antagonističko antitelo za upotrebu prema bilo kom prethodnom zahtevu, gde se antitelo daje oko 2 mg/kg.

15. Anti-CGRP antagonističko antitelo za upotrebu prema bilo kom prethodnom zahtevu, gde se antitelo daje čoveku.

16. Upotreba anti-CGRP antagonističkog antitela za dobijanje leka za prevenciju ili lečenje klaster glavobolje.

1