BRPI0619436A2 - métodos e conjugados de aminoácido-poliglutamato - Google Patents

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Zhao Gang
Van Sang
Kumar Das Sanjib
Feng Zhongling
Fu Xiaoli
Wang Xinghe
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Abstract

MéTODOS E CONJUGADOS DE AMINOáCIDO-POLIGLUTAMATO. Vários aminoácidos poliglutamato biodegradáveis compreendendo unidades recorrentes das fórmulas gerais (I) e (II) são preparados. Tais polímeros são úteis para uma variedade de aplicações de liberação de droga, biomolécula e agente marcante.

Description

MÉTODOS E CONJUGADOS DE AMINOÁC IDO - POLIGLUTAMATO
O presente pedido reivindica prioridade para o Pedido Provisional US número 60/742.291, intitulado "MÉTODO E CONJUGADOS DE AMINOÁCIDO-POLIGLUTAMATO," depositado em 5 de dezembro de 2005; Pedido Provisional US número 60/757.917, intitulado "TAXANOS-ASPARTATO-POLIGLUTAMATO," depositado em 10 de janeiro de 2006; e Pedido Provisional US número 60/790.735, intitulado "MRI DE QUELATOS- ASPARTATO-POLIGLUTAMATO," depositado em 10 de abril de 2006; todos os quais são incorporados aqui a titulo de referência na integra.
HISTÓRICO DA INVENÇÃO
Campo da invenção
A invenção refere-se genericamente a polímeros biocompativeis solúveis em água com grupos funcionais pendentes e métodos para fazer os mesmos, e particularmente a conjugados de aminoácido poliglutamato úteis para uma variedade de aplicações na liberação de drogas, biomoléculas e agentes marcantes.
Descrição da técnica relacionada
Uma variedade de sistemas tem sido utilizada para a liberação de drogas, biomoléculas e agentes de marcantes. Por exemplo, tais sistemas incluem cápsulas, lipossomas, micropartículas, nanopartículas e polímeros.
Uma variedade de sistemas biodegradáveis baseados em poliéster foi caracterizada e estudada. Ácido poliláctico (PLA), ácido poliglicólico (PGA) e seus copolímeros de ácido poliláctico-co-glicólico (PLGA) são alguns dos biomateriais mais bem caracterizados com relação à forma e desempenho para aplicações de liberação de drogas. Vide Uhrich, K.E.; Cannizzaro, S.M.; Langer, R.S. e Shakeshelf, K.M. "Polymeric Systems for controlled drug release." Chem. Rev. 1999, 99, 3181-3198 e Panyam J., Labhasetwar V. xxBiodegradable nanoparticles for drug and gene delivery to cells and tissue." Adv Drug Deliv. Rev. 2003, 55, 329-47. Também, metacrilato de 2-hidroxipropila (HPLA) foi amplamente utilizado para criar um polímero para aplicações de liberação de drogas. Sistemas biodegradáveis baseados em poliortoésteres também foram investigados. Vide Heller, J.; Barr, J.; Ng, S.Y.; Abdellauoi, K.S. e Gurny, R. xxPoly(ortho esters) : synthesis, characterization, properties and uses." Adv. Drug Del. Rev. 2002, 54, 1015- 1039. Sistemas de polianidrido também foram pesquisados. Tais polianidridos são tipicamente biocompatíveis e podem degradar in vivo em compostos relativamente não tóxicos que são eliminados a partir do corpo como metabólitos. Vide Kumar, N.; Langer, R.S. e Domb, A.J. xxPolyanhydrides: an overview." Adv. Drug Del. Rev. 2002, 54, 889-91.
Polímeros baseados em aminoácido também foram considerados como uma fonte de alto potencial de novos biomateriais. Poli-aminoácidos tendo boa biocompatibilidade foram pesquisados para liberar compostos de baixo peso molecular. Um número relativamente pequeno de ácidos poliglutâmicos e copolímeros foram identificados como materiais candidatos para liberação de drogas. Vide Bourke, S.L. e Kohn, J. xxPolymers derived from the amino acid L- tyrosine: polycarbonates, polyarylates e copolymers with poly(ethylene glycol)." Adv. Drug Del. Rev., 2003, 55, 447- 466.
Drogas anticâncer hidrofóbicas administradas e proteínas terapêuticas e polipeptídeos sofrem freqüentemente de biodisponibilidade ruim. Essa biodisponibilidade ruim pode ser devido à incompatibilidade de soluções bífásicas de drogas hidrofóbicas e soluções aquosas e/ou remoção rápida dessas moléculas a partir da circulação sangüínea por degradação enzimática. Uma técnica para aumentar a eficácia de proteínas administradas e outros agentes de moléculas pequenas abrange conjugar o agente administrado com um polímero, como uma molécula de polietileno glicol ("PEG"), que pode fornecer proteção contra degradação enzimática in vivo. Tal técnica melhora freqüentemente o tempo de circulação e, conseqüentemente, a biodisponibilidade de um agente administrado.
O PEG tem desvantagens em certos aspectos, entretanto. Por exemplo, como o PEG é um polímero linear, a proteção estérica proporcionada pelo PEG é limitada, comparado com polímeros ramificados. Outra desvantagem do PEG é que ele geralmente é sensível à derivatização em seus dois terminais. Isso limita o número de outras moléculas funcionais (por exemplo, aquelas úteis para liberação de droga ou proteína em tecidos específicos) que podem ser conjugadas com o PEG.
Ácido poliglutâmico (PGA) é outro polímero escolhido para solubilizar drogas anticâncer hidrofóbicas. Muitas drogas anticâncer conjugadas com o PGA têm sido relatadas. Vide Chun Li, "Poly(L-glutamic acid)-anticancer drug conjugates." Adv. Drug Del. Rev., 2002, 54, 695-713. Entretanto, nenhum é atualmente aprovado pela FDA.
Paclitaxel, extraído da casca da árvore Pacific Yew (Wani e outros, "Plant antitumor agents. VI. The isolation and structure of taxol, a novel antileukemic and antitumor agent from Taxus brevifolia." J Am Chem. Soe. 1971, 93, 2325-7) é uma droga aprovada pela FDA para o tratamento de câncer ovariano e câncer de mama. Entretanto, como outras drogas anticâncer, paclitaxel sofre de biodisponibilidade ruim devido a sua hidrofobicidade e insolubilidade em solução aquosa. Um modo para solubilizar o paclitaxel é formular o mesmo em uma mistura de Cremophor-EL e etanol desidratado (1:1, v/v) (Sparreboom e outros. "Cremophor EL-mediated Alteration of Paclitaxel Distribution in Human blood: Clinicai Pharmacokinetic Implications." Câncer Research 1999, 59, 1454-1457). Essa formulação é atualmente comercializada como Taxol® (Bristol-Myers Squibb). Outro método de solubilizar paclitaxel é por emulsificação utilizando homogeneização de cisalhamento elevado (Constantinides e outros. "Formulation Development and antitumor activity of a filter-sterilizable emulsion of Paclitaxel." Pharmaceutical Research 2000, 17, 175-182). Recentemente, conjugados de polimero-paclitaxel foram avançados em vários experimentos clínicos (Ruth Duncan, "The drawing era of polymer therapeutics." Nature reviews Drug Discovery 2003, 2, 347-360). Mais recentemente, paclitaxel foi formulado em nanopartículas com proteína albumina humana e foi utilizado em estudos clínicos (Damascelli e outros "Intraarterial chemotherapy with polyoxyethylated castor oil free paclitaxel, incorporated in albumin nanoparticles (ABI-007): Phase II study of patients with squamous cell carcinoma of the head and neck and anal canal: preliminary evidence of clinicai activity." Câncer. 2001, 92, 2592-602, e Ibrahim e outros. "Phase I and pharmacokinetic study of ABI-007, a Cremophor- free, protein-stabilized, nanoparticle formulation of paclitaxel." Clin Câncer Res. 2002, 8, 1038-44). Essa formulação é atualmente comercializada como Abraxane® (American Pharmaceutical Partners, Inc.).
A imagem por ressonância magnética (MRI) é uma ferramenta importante em diagnóstico e para definir o grau de doenças porque não é invasivo e não irradia (vide Bulte e outros "Magnetic resonance microscopy and histology of the CNS." Trends in Biotechnology 2002, 20, S24-S28). Embora imagens de tecidos possam ser obtidas, a MRI com agentes de contraste melhora significativamente sua resolução. Entretanto, ions de metal paramagnéticos apropriados para agentes de contraste de MRI são freqüentemente tóxicos. Um dos métodos para reduzir toxicidade é quelar esses ions de metálicos com moléculas polidentadas como moléculas de pentaacetato dietilenetriamina (DTPA). Gd-DTPA foi aprovada pela FDA em 1988 para usos clínicos, e é atualmente comercializada como Magnevist®. Outros quelatos-Gd foram aprovados pela FDA e comercializados, e muitos outros estão em desenvolvimento (vide Caravan e outros, "Gadolinium (III) Chelates as MRI Contrast agents: Structure, Dynamics, and applications." Chem. Rev. 1999, 99, 2293-2352). Entretanto, Gd-DTPA não é ideal para alvejar tecidos de tumorais porque não tem especificidade. Quando Gd-DTPA é administrado via injeção IV, se difunde espontâneamente e rapidamente no espaço extravascular dos tecidos. Desse modo, grandes quantidades de agentes de contraste são normalmente necessárias para produzir imagens de contraste razoáveis. Além disso, é rapidamente eliminado através de filtração renal. Para evitar a difusão e a filtração, agentes de contraste MRI macromolecular foram desenvolvidos (Vide Caravan e outros. "Gadolinium (III) Chelates as MRI contrast agents: Structure, Dynamics and Applications. Chem. Rev. 1999, 99, 2293-2353. Esses agentes de contraste MRI-macromolecular incluem quelatos de MRI- proteina (vide Lauffer e outros. "Preparation and water relaxation properties of proteins labeled with paramagnetic metal chelates." Magn. Reson. Imaging 1985, 3, 11-16), quelatos de MRI-polissacarídeo (vide Sirlin e outros. "Gadolinium-DTPA-Dextran: a macromolecular MR Blood pool contrast agent." Acad Radiol. 2004, 11, 1361-1369) e quelatos de MRI-polímero (vide Lu e outros. "Poly(L- glutamic acid) GD(III)-DOTA conjugate with a degradable spacer for magnetic resonance imaging." Bioconjugate Chem. 2003, 14, 715-719, e Wen e outros. "Synthesis and Characterization of poly(L-glutamic acid) Gadolinium Chelate: a new biodegradable MRI contrast Agent." Bioconjugate Chem. 2004, 15, 1408-1415.
Recentemente, agentes de contraste de MRI específicos para tecidos foram desenvolvidos (vide Weinmann e outros. "Tissue-specific MR contrast agentes." Eur. J. Radiol. 2003, 46, 33-44). Entretanto, agentes de contraste de MRI específicos para tumores não foram relatados èm aplicações clínicas. Nanopartículas foram relatadas para alvejar tecidos tumorais através de um efeito de permeação intensificada e retenção (EPR) (vide Brannon-Peppas e outros. "Nanoparticle and target systems for câncer therapy." ADDR 2004, 56, 1649-1659).
SUMÁRIO DA INVENÇÃO
Agentes marcantes relativamente hidrofóbicos e drogas (como certas drogas anticâncer hidrofóbicas, proteínas terapêuticas e polipeptídeos) sofrem freqüentemente de biodisponibilidade ruim. Acredita-se que esse problema seja devido pelo menos em parte à solubilidade ruim desses agentes marcantes e drogas em sistemas aquosos. Certas drogas enzimaticamente degradáveis também sofrem de biodisponibilidade ruim porque são degradas relativamente rapidamente no sistema circulatório, resultando em rápida eliminação do corpo.
Os inventores descobriram uma série de novos aminoácidos-poliglutamato que são capazes de conjugar com um número de agentes, como agentes marcantes e/ou drogas. Em certas modalidades, os polímeros e os conjugados resultantes se acumulam preferencialmente em certos tecidos (por exemplo, tecidos tumorais), e desse modo são úteis para espalhar drogas (por exemplo, drogas anticâncer) e/ou agentes marcantes para partes especificas do corpo (por exemplo, tumores). Em certas modalidades, os polímeros e os polímeros conjugados resultantes formam nanopartícuias que solubilizam de forma eficaz o agente marcante e/ou droga em sistemas aquosos por dispersão do mesmo em um nível molecular, desse modo aumentando a funcionalidade e/ou biodisponibilidade.
Uma modalidade provê um polímero conjugado que compreende uma unidade recorrente da fórmula (I) e uma unidade recorrente da fórmula (II) como exposto abaixo, onde: cada η é independentemente 1 ou 2; cada A1 é oxigênio ou NR5; cada A2 é oxigênio; R1 e R2 são individualmente independentemente selecionados do grupo que consiste em alquila C1-10, arila C6-2or amônio, metal alcalino, um ligante polidentado, um precursor ligante polidentado com átomos de oxigênio protegidos, e um composto que compreende um agente; onde o agente é selecionado do grupo que consiste em uma droga anticâncer, um agente seletivo, um agente marcante óptico, e um agente marcante de ressonância magnética; em que pelo menos um entre R1 e R2 é um grupo que compreende um agente; R3 e R4 são individualmente independentemente selecionados do grupo que consiste em hidrogênio, amônio e um metal alcalino; onde o polímero conjugado compreende uma quantidade do agente na faixa de aproximadamente 1 a aproximadamente 50% (peso/peso) com base na razão mássica do agente para o polímero conjugado; R5 é hidrogênio ou alquila C1-4; e em que a quantidade do agente, a percentagem da unidade recorrente da fórmula (I) e a percentagem da unidade recorrente da fórmula (II) são selecionadas para fornecer uma solubilidade de polímero conjugado maior do que aquela de um conjugado de ácido poliglutâmico comparável que compreende substancialmente a mesma quantidade do agente, a solubilidade do polímero conjugado sendo maior quando uma solução de polímero conjugado testado, compreendendo pelo menos 5 mg/mL do polímero conjugado em 0,9%em peso de NaCl aquoso a aproximadamente 22tem maior claridade óptica em relação a uma faixa de pH mais ampla do que aquela de uma solução comparável de conjugado de ácido poliglutâmico testado.
Outra modalidade provê um método de fazer o polímero conjugado descrito acima, compreendendo a dissolução ou dissolução parcial de um reagente polimérico em um solvente para formar um reagente polimérico dissolvido ou parcialmente dissolvido; e a reação do reagente polimérico dissolvido ou parcialmente dissolvido com um segundo reagente, em que o segundo reagente compreende pelo menos um selecionado do grupo que consiste em um Iigant^ de polidentado, o precursor ligante de polidentado com átomos de oxigênio protegidos e o composto que compreende o agente.
Outra modalidade provê uma composição farmacêutica que compreende o polímero conjugado descrito aqui, e compreendendo ainda pelo menos um selecionado entre um excipiente farmaceuticamente aceitável, um transportador e um diluente.
Outra modalidade provê um método de tratar ou melhorar uma doença ou condição que compreende administrar uma quantidade eficaz do polímero conjugado descrito aqui para um mamífero necessitando do mesmo.
Outra modalidade provê um método de diagnosticar uma doença ou condição compreendendo administrar uma quantidade eficaz do polímero conjugado descrito aqui a um mamífero.
Outra modalidade provê um uso do polímero conjugado descrito aqui para a preparação de um medicamento para o tratamento ou melhora de uma doença ou condição. Outra modalidade provê um uso de um polímero conjugado, uso do conjugado de polímero descrito aqui para a preparação de um medicamento para o diagnóstico de uma doença ou condição.
Essas e outras modalidades são descritas com mais detalhe abaixo.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS
A figura 1 ilustra um esquema de reação para a preparação de poli-(γ-L-aspartil glutamina).
A figura 2 ilustra um esquema de reação para a preparação de ácido poli-(γ-L-aspartil glutamina)-poli-L- glutâmico.
A figura 3 ilustra outro esquema de reação para a preparação de poli-(γ-L-aspartil glutamina).
A figura 4 ilustra um esquema de reação para a preparação de poli-(γ-L-glutamil glutamina).
A figura 5 ilustra um esquema de reação para a preparação de ácido poli- ^-L-glutam;il glutamina)-poli-L- glutâmico.
A figura 6 ilustra um esquema de reação para a preparação de PGA-97-A-Texas Red.
A figura 7 ilustra um esquema de reação para a preparação de PGA-97-A-DTPA.
A figura 8 ilustra um esquema de reação para a preparação de PGA-97-A-DTPA-Gd(III) .
A figura 9 ilustra um esquema geral de reação para a preparação de PGA-A-PTX.
A figura 10 ilustra um esquema geral de reação para a preparação de PGA-G-PTX.
A figura 11 ilustra as estruturas químicas de ácido C2'-paclitaxel-glutâmico e de ácido C7-paclitaxel- glutâmico, e seus tempos LC-MS e HPLC. A figura 12 ilustra um esquema de reação para preparação de PGA-97-G-27.
A figura 13 mostra um gráfico que ilustra o efeito de PGA-44-A-20, PGA-97-A-20 e PGA(97k)-PTX-20 (controle) sobre a proliferação de células de melanoma B16F0 em várias concentrações diferentes da droga.
A figura 14 mostra um gráfico que ilustra o efeito de PGA-97-A10, PGA(97k)-PTX-10, sal de sódio de poli-(γ-L-aspartil) glutamina), e Taxol sobre a proliferação de células de melanoma B16F0 em várias concentrações diferentes da droga.
A figura 15 mostra um gráfico que ilustra as concentrações de plasma, de paclitaxel, de PGA-44-A19 e Taxol sobre tumores de melanoma B16F0 em camundongos nu/nu sem pêlo com o passar do tempo.
A figura 16 mostra um gráfico que ilustra as concentrações de paclitaxel de tumor de PGA-44-A-19 e Taxol em tumores de melanoma B16F0 em camundongos nu/nu sem pêlo com o passar do tempo.
A figura 17 mostra um gráfico que ilustra a mudança em peso corporal (%) após tratamento com PGA-21-G- 20, PGA-32-G-20, Abraxane, e solução salina em suas respectivas doses de tolerância máxima em camundongos nu/nu sem pêlo com o passar do tempo.
A figura 18 mostra um gráfico que ilustra o efeito antitumor de PGA-21-G-20, PGA-32-G-20, Abraxane, e solução salina em suas respectivas doses de tolerância máxima sobre tumores de melanoma B166FO transformados em EGF em camundongos nu/nu sem pêlo com o passar do tempo.
A figura 19 mostra um gráfico que ilustra a alteração em peso corporal (%) após tratamento com PGA-97- G-20, Taxol, Abraxane, e solução salina em suas respectivas doses de tolerância máxima em camundongos nu/nu sem pêlo com o passar do tempo.
A figura 20 mostra um gráfico que ilustra o efeito antitumor de PGA-97-G-20, Taxol, Abraxane e solução salina em suas respectivas doses de tolerância máxima em tumores de melanoma B166FO transformados em EGF em camundongos nu/nu sem pêlo com o passar do tempo.
A figura 21 mostra um gráfico que ilustra a alteração em peso corporal (%) após tratamento com PGA-32- G-20, PGA(32k)-PTX-20, e solução salina em suas respectivas doses de tolerância máxima em camundongos nu/nu sem pêlo com o passar do tempo.
A figura 22 mostra um gráfico que ilustra efeito antitumor de PGA-32-G-20, PGA(32K)-PTX-20, e solução salina em suas respectivas doses de tolerância máxima em tumores de melanoma B166FO transformados em EGF em camundongos nu/nu sem pêlo com o passar do tempo.
A figura 23 mostra um gráfico que ilustra liberação de paclitaxel com o passar do tempo em uma concentração de 2 mg por mL de polímeros conjugados de paclitaxel em tampões de fosfato.
A figura 24 mostra um gráfico que ilustra concentração de paclitaxel em plasma de PGA-21-G-19, PGA- 32-G-19, PGA-97-G-24 e Taxol com o passar do tempo.
A figura 25 mostra um gráfico que ilustra concentração de paclitaxel em um tumor com PGA-21-G-19, PGA-32-G-19, PGA-97-G-24, e Taxol com o passar do tempo.
A figura 26 mostra um gráfico que ilustra o efeito de acumulação do tumor com PGA-97-A-DTPA-Gd(III) e Omniscan™ (gadodimida) em tumores de melanoma B16F0 em camundongos nu/nu sem pêlo com o passar do tempo.
A figura 27 ilustra uma cópia de uma fotografia da imagem microscópica de elétron congelada-fraturada de PGA-44-A-20. A figura 28 mostra um gráfico que ilustra dispersão de luz estática (tamanho de partícula) versus concentração de PGA-44-A-20 e PGA-97-A-20.
A figura 29 mostra um gráfico que ilustra dispersão de luz estática (tamanho de partícula) versus concentração de PGA-21-G-20 e PGA-32-G-20.
DESCRIÇÃO DETALHADA DAS MODALIDADES PREFERIDAS
O termo "éster" é utilizado aqui em seu sentido comum, e desse modo inclui um grupo químico com fórmula - (R)n-COOR', onde ReR' são independentemente selecionados do grupo que consiste em alquila, cicloalquila, arila, heteroarila (ligado através de um anel de carbono) e heteroalicíclico (ligado através de um anel de carbono), e onde n é 0 ou 1.
O termo "amida" é utilizado aqui em seu sentido comum, e desse modo inclui um grupo químico com fórmula - (R)n-C(O)NHR' ou -(R)n-NHC(O)R', onde ReR' são independentemente selecionados do grupo que consiste em alquila, cicloalquila, arila, heteroarila (ligado através de um anel de carbono) e heteroalicíclico (ligado através de um anel de carbono), e onde n é 0 ou 1. Uma amida pode ser incluída em um aminoácido ou uma molécula de peptídeo ligada à molécula de droga como descrito aqui, desse modo formando um pró-medicamento.
Qualquer cadeia lateral de amina, hidróxido ou carboxila nos compostos revelados aqui pode ser esterifiçada ou ser trasnformada em amida. Os procedimentos e grupos específicos a serem utilizados para obter essa finalidade são conhecidos por aqueles versados na técnica e podem ser prontamente encontrados em fontes de referência como Greene e Wuts, Protective Groups in Organic Synthesis, 3a ed., John Wiley & Sons, Nova York, NY, 1999, que é incorporado aqui na íntegra. Como utilizado aqui, "alquila" se refere a uma cadeia de hidrocarboneto reta ou ramificada que compreende um grupo de hidrocarboneto totalmente saturado (nenhuma ligação dupla ou tripla). O grupo alquila pode ter de 1 a 20 átomos de carbono (sempre que aparecer aqui, uma faixa numérica como "1 a 20" se refere a cada número inteiro na faixa dada; por exemplo, "1 a 20 átomos de carbono" significa que o grupo alquila pode consistir em 1 átomo de carbono, 2 átomos de carbono, 3 átomos de carbono, etc., até e incluindo 20 átomos de carbono, embora a presente definição também cubra a ocorrência do termo "alquila" onde nenhuma faixa numérica é designada). O grupo alquila também pode ser uma alquila de tamanho médio tendo de 1 a 10 átomos de carbono. O grupo alquila também poderia ser um alquila menor tendo de 1 a 5 átomos de carbono. O grupo alquila dos compostos pode ser designado como "alquila C1- C4" ou designações similares. Como exemplo somente, "alquila C1-C4" indica que há um a quatro átomos de carbono na cadeia alquila, isto é a cadeia alquila é selecionada do grupo que consiste em metila, etila, propila, iso-propila, n-butila, iso-butila, sec-butila, e t-butila. Grupos típicos de alquila incluem, porém não são de modo algum limitados a, metila, etila, propila, isopropila, butila, isobutila, butila terciária, pentila, hexila e similares.
O grupo de alquila pode ser substituído ou não substituído. Quando substituído, o(s) grupo(s) substituinte(s) é (são) um ou mais grupo(s) individualmente e independentemente selecionados entre alquenila, alquinila, cicloalquila, cicloalquenila, cicloalquinila, arila, heteroarila, heteroaliciclila, aralquila, heteroaralquila, (heteroaliciclila) alquila, hidróxido, hidroxila protegida, alcóxi, arilóxi, acila, éster, mercapto, alquiltio, ariltio, ciano, halogênio, carbonila, tiocarbonila, O-carbamila, N-carbamila, O-tiocarbamila, N- tiocarbamila, C-amido, N-amido, S-sulfonamido, N- sulfonamido, C-carbóxi, C-carbóxi protegido, O-carbóxi, isocianato, tiocianato, isotiocianato, nitro, silila, sulfenila, sulfinila, sulfonila, haloalquila, haloalcóxi, trialometanossulfonila, trialometanossulfonamido e amino, incluindo grupos de amino mono- e di-substituídos, e os derivados protegidos dos mesmos. Sempre que um substituinte for descrito como sendo "opcionalmente substituído" aquele substituinte pode ser substituído com dos substituintes acima.
Um "quelato de metal paramagnético" é um complexo onde um ligante é ligado a um íon de metal paramagnético. Os exemplos incluem, porém não são limitados a, ácido 1, 4, 7,10-tetraazaciclododecano-l,4,7,10-tetraacético (DOTA)-Gd(III), DOTA-ítrio-88, DOTA-índio-111, ácido dietileno triamina pentaacético (DTPA)-Gd(III), DTPA-ítrio- 88, DTPA-índio-1111.
Um "ligante polidentado" é um ligante que pode se ligar através de dois ou mais pontos de fixação em um íon metálico através, por exemplo, de ligações covalentes coordenadas. Os exemplos de ligantes polidentados incluem, porém não são limitados a, ácido dietilenotriamina pentaacético (DTPA), ácido tetraazaciclododecano-1,4,7,10- tetraacético (DOTA), (1,2—etanodiildinitrilo) tetraacetato (EDTA), etilenodiamina, 2,2'-bipiridina (bipi), 1,10- fenantrolina (phen), 1,2,-bis (difenil fosfino) etano (DPPE), 2,4-pentanodiona (acac) e etanodioato (ox).
Um "precursor ligante polidentado com átomos de oxigênio protegidos" é um ligante polidentado que compreende átomos de oxigênio, como os átomos de oxigênio de ligação única de grupos carboxilas, que são protegidos com grupos de proteção apropriados. Grupos de proteção apropriados incluem, porém não são limitados a, alquilas inferiores, benzilas e grupos de silila.
Uma modalidade provê um polímero conjugado que compreende uma unidade recorrente da fórmula (I) e uma unidade recorrente da fórmula (II):
<formula>formula see original document page 16</formula>
onde cada η é independentemente 1 ou 2, cada A1 é oxigênio ou NR5, cada A2 é oxigênio, R1 e R2 são individualmente selecionados independentemente a partir do grupo que consiste em alquila C1-10 opcionalmente substituída, arila C6-20 opcionalmente substituída, amônio, metal alcalino, um ligante poíidentado, um precursor ligante poíidentado com átomos de oxigênio protegidos, e um composto que compreende um agente. Os exemplos de metal alcalino incluem Lítio (Li), sódio (Na), potássio (K), rubídio (Rb) e césio (Cs). Em uma modalidade, o metal alcalino é sódio.
0 agente pode compreender qualquer número de compostos ativos. Por exemplo, o agente pode ser selecionado do grupo que consiste em uma droga anticâncer, um agente seletivo, um agente marcante óptico, e um agente marcante de ressonância magnética. Pelo menos um dos grupos R1 e R2 é um grupo que compreende o agente. A unidade recorrente da fórmula (II) pode compreender ou não um agente. Em uma modalidade, R3 e R4 são individualmente selecionados independentemente do grupo que consiste em hidrogênio, amônio e um metal alcalino. Em outra modalidade, R5 é um átomo de hidrogênio ou um grupo de alquila C1-4.
A quantidade de agente presente no polímero conjugado pode variar em uma ampla faixa. Em uma modalidade, o polímero conjugado compreende uma quantidade do agente na faixa de aproximadametne 1 a aproximadamente 50% (peso/peso) com base na razão mássica do agente para o polímero conjugado. Em outra modalidade, o polímero conjugado compreende uma quantidade do agente na faixa de aproximadamente 5 a aproximadamente 40% (peso/peso) com base na razão mássica do agente para o polímero conjugado. Em outra modalidade, o polímero conjugado compreende uma quantidade do agente na faixa de aproximadamente 10 a aproximadamente 30% (peso/peso) com base na razão mássica do agente para o polímero conjugado.
Verificou-se agora que a quantidade do agente e as quantidades; em percentagem das unidades recorrentes da fórmula (I) e fórmula (II) podem ser selecionadas para controlar vantajosamente a solubilidade do polímero conjugado resultante. Por exemplo, em modalidades preferidas, a quantidade do agente e as quantidades em perecentagem das unidades recorrentes da fórmula (I) e fórmula (II) são selecionadas de modo que o polímero conjugado seja solúvel (ou insolúvel) em um pH específico e/ou faixa de pH de interesse. Em algumas modalidades, o peso molecular do polímero também é selecionado para controlar a solubilidade. Os exemplos fornecidos abaixo ilustram o controle sobre solubilidade por escolha apropriada da quantidade do agente, das quantidades em percentagem das unidades recorrentes da fórmula (I) e fórmula (II) e do peso molecular- Aqueles versados na técnica, informados pela orientação fornecida aqui, podem utilizar experimentação de rotina para identificar quantidades apropriadas do agente e quantidades em percentagem das unidades recorrentes da fórmula (I) e fórmula (II) que resultam em um polímero conjugado de com características de solubilidade desejadas. Tal controle sobre solubilidade pode ser vantajoso, dependendo da aplicação. Por exemplo, modalidades dos polímeros conjugados fornecidos aqui podem ser utilizadas para fornecer uma melhor liberação de drogas anticâncer que são contrariamente insuficientemente solúveis em tecidos selecionados,reduzindo preferivelmente efeitos colaterais indesejáveis, e/ou podendo reduzir a freqüência na qual um sujeito necessita tomar a droga anticâncer.
A quantidade do agente e as quantidades em percentagem das unidades recorrentes da fórmula (I) e fórmula (II) são preferivelmente selecionadas para fornecer uma solubilidade do polímero conjugado maior do que aquela de um comparável conjugado de ácido poliglutâmico que compreende substancialmente a mesma quantidade do mesmo agente. Em uma modalidade, a solubilidade do polímero conjugado é maior do que aquela de um comparável conjugado de ácido poliglutâmico. A solubilidade é medida pela formação de uma solução de polímero conjugado compreendendo pelo menos 5 mg/mL do polímero conjugado em 0,9% em peso de NaCl aquoso a aproximadamente 22°C, e pela determinação da claridade óptica. A claridade óptica pode ser determinada de forma turbidimétrica, por exemplo, por observação visual ou por métodos instrumentais apropriados conhecidos por aqueles versados na técnica. A comparação da solubilidade resultante com uma solução de conjugado de ácido poliglutâmico similarmente formado mostra uma melhor solubilidade evidenciada por maior claridade óptica em relação a uma faixa mais ampla de valores de pH. Desse modo, uma solubilidade de polímero conjugado é maior do que aquela de um comparável conjugado de ácido poliglutâmico que compreende substancialmente a mesma quantidade do agente quando uma solução de polímero conjugado testado, compreendendo pelo menos 5 mg/mL do polímero conjugado em 0,9% em peso de NaCl aquoso a aproximadamente 22°C, tem claridade óptica maior em relação a uma faixa de pH mais ampla do que aquela de uma solução de conjugado de ácido poliglutâmico testado, comparável. Aqueles versados na técnica entenderão que um "comparável" conjugado de ácido poliglutâmico é um material de controle no qual a porção de polímero do conjugado tem um peso molecular que é aproximadamente igual àquele do polímero conjugado em questão (compreendendo uma unidade recorrente da fórmula (I) e uma unidade recorrente da fórmula II)) com o qual está sendo comparado.
O polímero conjugado pode conter um ou mais átomos de carbono quiral. O carbono quiral (que pode ser indicado por um asterisco*) pode ter a configuração rectus (lado direito) ou sinister (lado esquerdo), e desse modo a unidade recorrente pode ser racêmica, enantiomérica ou enriquecida de forma enantiomérica. Os símbolos "n" e "*" (designando um carbono quiral), como utilizado em outpa parte aqui, têm o mesmo significado como especificado acima, a menos que mencionado de outro modo.
Polímeros compreendendo uma unidade recorrente da fórmula (I) e uma unidade recorrente da fórmula (II) são copolímeros que compreendem duas ou mais diferentes unidades recorrentes da fórmula (I) e fórmula (II). Além disso, polímeros compreendendo uma unidade recorrente da fórmula (I) e uma unidade recorrente da fórmula (II) podem ser copolímeros que compreendem outras unidades recorrentes que não são da fórmula (I) e nem da fórmula (II). O número de unidades recorrentes da fórmula (I) e unidades recorrentes da fórmula (II) no polímero não é limitado, porém está preferivelmente compreendido na faixa de aproximadamente 50 a aproximadamente 5.000, e mais preferivelmente de aproximadamente 100 a aproximadamente 2.000.
Uma ampla variedade de outras unidades recorrentes pode ser incluída no polímero conjugado com a unidade recorrente da fórmula (I) e a unidade recorrente da fórmula (II). Em uma modalidade, o polímero conjugado compreende ainda uma unidade recorrente da fórmula (III):
<formula>formula see original document page 20</formula>
onde o grupo R6 é hidrogênio, amônio ou um metal alcalino. Quando o grupo R6 é hidrogênio, então a unidade recorrente da fórmula (III) é uma unidade recorrente de ácido glutâmico.
O composto que compreende o agente pode ser conjugado com o polímero em muitas formas diferentes. Em uma modalidade, o composto que compreende o agente pode ser ligado diretamente à unidade recorrente. Em uma outra modalidade, o composto que compreende o agente compreende ainda um grupo ligante. Um grupo ligante é um grupo que liga o agente (ou o composto que compreende o agente) ao polímero. O grupo ligante pode ser relativamente pequeno. Por exemplo, o grupo ligante pode compreender uma amina, uma amida, um éter, um éster, um grupo hidroxila, um grupo carbonila, ou um grupo tiol. Alternativamente, o grupo ligante pode ser relativamente grande. Por exemplo, o grupo ligante pode compreender um grupo alquila, um grupo alcóxi, um grupo arila, um grupo arila (alquila Ci_6) , um grupo heteroarila, ou um grupo heteroarila (alquila Ci_6) .
O agente pode compreender qualquer tipo de composto ativo, Em uma modalidade, o agente pode ser um agente marcante óptico. Em uma modalidade preferida, o agente marcante óptico é um ou mais selecionados do grupo que consiste em um corante de acridina, um corante de coumarine, um corante de rodamina, um corante de xanteno, um corante de cianina, e um corante de pireno. Por exemplo, agentes marcantes óptico específicos podem incluir Texas Red, corante Alexa Fluor®, corante BODIPY®, Fluoresceína, corante Oregon Green®, e corante Rhodamine Green™, que são comercialmente disponíveis ou prontamente preparados por métodos conhecidos por aqueles versados na técnica.
Em outra modalidade, o agente compreende uma droga anticâncer. Em uma modalidade, a droga anticâncer pode ser selecionada do grupo que consiste em um taxanç, camptotecina ,e doxorubicina. Quando o agente compreende um taxano, é preferível que o taxano seja paclitaxel ou docetaxel. Paclitaxel pode ser conjugado com a unidade recorrente da fórmula (I) ou a unidade recorrente da fórmula (II) no átomo de oxigênio via o carbono-C2' do paclitaxel. Alternativamente ou além disso, paclitaxel pode ser conjugado com a unidade recorrente da fórmula (I) ou a unidade recorrente da fórmula (II) no átomo de oxigênio via o carbono Cl do paclitaxel.
Em outra modalidade, o agente compreende um agente marcante de ressonância magnética. Em uma modalidade, o agente marcante de ressonância magnética compreende um composto de metal paramagnético. Por exemplo, o agente marcante de ressonância magnética pode compreender um composto Gd(III). Em um tal caso, o composto Gd(III) pode ser:
<formula>formula see original document page 22</formula>
Em outra modalidade, o agente compreende um ligante polidentado. Em uma modalidade, o ligante polidentado pode ser capaz de reagir com um metal paramagnético para formar um agente marcante de ressonância magnética. Por exemplo, o ligante polidentado pode compreender vários grupos de ácido carboxilico e/ou carboxilato. Em uma modalidade, o ligante polidentado compreende um composto da estrutura a seguir:
<formula>formula see original document page 22</formula>
onde cada R7 é independentemente hidrogênio, amônio ou um metal alcalino.
Em outra modalidade, o agente compreende um precursor ligante polidentado. Em uma tal modalidade, os átomos de oxigênio do ligante polidentado são protegidos por um grupo de proteção apropriado. Grupos de proteção apropriados incluem, porém não são limitados a, alquilas inferiores, benzilas e grupos de silila. Um exemplo de um precursor ligante polidentado tendo grupos de proteção é fornecido como a seguir:
(I) no polimero conjugado, com base no número total de unidades recorrentes, pode variar em uma faixa ampla. Em uma modalidade, o polimero pode compreender aproximadamente 1% molar a aproximadamente 99% molar da unidade recorrente da fórmula (J) , com base no total de mols de unidades recorrentes das fórmulas (I) e (II). Em outra modalidade, o polimero pode compreender aproximadamente 1% molar a aproximadamente 50% molar da unidade recorrente da fórmula (I) com base no total de mols de unidades recorrentes das fórmulas (I) e (II). Em outra modalidade, o polimero pode compreender aproximadamente 1% molar a aproximadamente 30% molar da unidade recorrente da fórmula (I) com base no total de mols de unidades recorrentes das fórmulas (I) e (II). Em outra modalidade, o polimero pode compreender aproximadamente 1% molar a aproximadamente 20% molar da unidade recorrente da fórmula (I) com base no total de mols de unidades recorrentes das fórmulas (I) e (II). Em outra modalidade, o polimero pode compreender aproximadamente 1%
A percentagem de unidades recorrentes da fórmula molar a aproximadamente 10% molar da unidade recorrente da fórmula (I) com base no total de moles de unidades recorrentes das fórmulas (I) e (II) .
Além das unidades recorrentes das fórmulas (I) e (II) , o polímero conjugado pode compreender uma variedade de outras unidades recorrentes. Por exemplo, em uma modalidade, o polímero conjugado compreende unidades recorrentes da fórmula (III). A percentagem de unidades recorrentes da fórmula (I), com base no número total de unidades recorrentes em um polímero conjugado compreendendo unidades recorrentes das fórmulas (I), (II) e (III) pode variar em uma ampla faixa. Em uma modalidade, o polímero conjugado pode compreender aproximadamente 1% molar a aproximadamente 99% molar da unidade recorrente da fórmula (I) com base no total de mols de unidades recorrentes das fórmulas (I), (II) e (III). Em outra modalidade, o polímero conjugado pode compreender aproximadamente 1% molar a aproximadamente 50% molar da unidade recorrente da fórmula (I) com base no total de mols de unidades recorrentes das fórmulas (I), (II) e (III). Em outra modalidade, o polímero conjugado pode compreender aproximadamente 1% molar a aproximadamente 30% molar da unidade recorrente da fórmula (I) com base no total de mols de unidades recorrentes das fórmulas (I), (II) e (III). Em outra modalidade, o polímero conjugado pode compreender aproximadamente 1% molar a aproximadamente 20% molar da unidade recorrente da fórmula (I) com base no total de mols de unidades recorrentes das fórmulas (I), (II) e (III). Em outra modalidade, o polímero conjugado pode compreender aproximadamente 1% molar a aproximadamente 10% molar da unidade recorrente da fórmula (I) com base no total de mols das fórmulas (I), (II) e (III). Em uma modalidade, pelo menos um η na unidade recorrente da fórmula (I) e na unidade recorrente de fórmula (II) é 1. Em outra modalidade, pelo menos um η na unidade recorrente da fórmula (I) e na unidade recorrente da fórmula (II) é 2.
Em uma modalidade, a quantidade do agente, a percentagem da unidade recorrente da fórmula (I) e a percentagem da unidade recorrente da fórmula (II) no polimero conjugado são selecionadas para fornecer uma solubilidade de polimero conjugado maior do que aquele de um conjugado de ácido poliglutâmico comparável que compreende substancialmente a mesma quantidade do agente. A faixa de valores de pH na qual o polimero conjugado, compreendendo unidades recorrentes da fórmula (I) e da fórmula (II), que tem maior solubilidade do que aquela de um conjugado de ácido poliglutâmico comparável, pode ser estreita ou larga. Como observado acima, a solubilidade é medida pela formação de uma solução de polimero conjugado compreendendo pelo menos 5 mg/mL do polimero conjugado em 0, 9% em peso de NaCl aquoso a aproximadamente 22°C, e pela determinação da claridade óptica. Em uma modalidade, o polimero conjugado é solúvel em uma faixa de pH de pelo menos aproximadamente três unidades de pH. Em outra modalidade, o polimero conjugado é solúvel em uma faixa de pH de pelo menos aproximadamente 8 unidades de pH. Em outra modalidade, o polimero conjugado é solúvel em uma faixa de pH de pelo menos aproximadamente 9 unidades de pH. Em outra modalidade, a faixa de pH na qual o polimero conjugado é solúvel inclui pelo menos um valor de pH na faixa de aproximadamente 2 a aproximadamente 5, por exemplo, em pH = 2, pH = 3, pH = 4 e/ou pH = 5. Preferivelmente, a faixa de pH, em que o polimero conjugado é solúvel, é mais ampla do que a faixa de pH em que o conjugado de ácido poliglutâmico comparável é solúvel. Por exemplo, em uma modalidade, o polímero conjugado é solúvel em uma faixa de pH que é aproximadamente pelo menos uma unidade de pH mais larga, preferivelmente e aproximadamente pelo menos duas unidades de ph mais largo, do que a faixa de pH na qual o conjugado de ácido poliglutâmico comparável é solúvel.
A quantidade de polímero conjugado colocado em solução para medir a solubilidade também pode variar muito. Em uma modalidade, a solubilidade é medida quando a solução de polímero conjugado testado compreende aproximadamente pelo menos 5 mg/mL do polímero conjugado. Em outra modalidade, a solubilidade é medida quando a solução de polímero conjugado testado compreende aproximadamente pelo menos 10 mg/mL do polímero conjugado. Em outra modalidade, a solubilidade é medida quando a solução de polímero conjugado testado compreende aproximadamente pelo menos 25 mg/mL do polímero conjugado. Em outra modalidade, a solubilidade é medida quando a solução de polímero conjugado testado compreende aproximadamente pelo menos 100 mg/mL do polímero conjugado. Em outra modalidade, a solubilidade é medida quando a solução de polímero conjugado testado compreende pelo menos aproximadamente 150 mg/mL do polímero conjugado. Aqueles versados na técnica entenderão que o conjugado de ácido poliglutâmico comparável é testado aproximadamente na mesma concentração que aquele do polímero conjugado testado.
Polímeros, compreendendo uma unidade recorrente da fórmula (I) e uma unidade recorrente da fórmula (II), podem ser preparados de várias maneiras. Em uma modalidade, um reagente polimérico é dissolvido ou parcialmente dissolvido em um solvente para formar um reagente polimérico dissolvido ou parcialmente dissolvido. O reagente polimérico dissolvido ou parcialmente dissolvido é então reagido com um segundo reagente para formar um produto intermediário ou, em algumas modalidades, um polímero compreendendo uma unidade recorrente da fórmula (I) e uma unidade recorrente da fórmula (II) ..
O reagente polimérico pode compreender qualquer material apropriado capaz de formar um polímero que compreende uma unidade recorrente da fórmula (I) e uma unidade recorrente da fórmula (II). Em uma modalidade, o reagente polimérico compreende uma unidade recorrente da fórmula (IV):
<formula>formula see original document page 27</formula>
onde cada η é independentemente 1 ou 2, cada A3 é oxigênio, e R7 e R8 são individualmente independentemente selecionados do grupo que consiste em hidrogênio, amônio e um metal alcalíno.
Em uma modalidade, o reagente polimérico pode compreender uma unidade recorrente da fórmula (V):
<formula>formula see original document page 27</formula> onde R9 é hidrogênio, amônio ou um metal
alcalino.
O segundo reagente pode ser uma variedade de compostos. Em uma modalidade, o segundo reagente compreende pelo menos um selecionado do grupo que consiste em um ligante polidentado,. um precursor ligante polidentado com átomos de oxigênio protegidos, e um composto que compreende um agente. Em uma modalidade, o segundo reagente pode compreender uin substituinte. O substituinte pode ser selecionado do grupo que consiste em hidróxido e uma amina.
Em uma modalidade, o segundo reagente compreende um composto que compreende um agente. O agente pode ser qualquer composto ativo. Por exemplo, o composto que compreende o agente pode ser selecionado do grupo que consiste em uma droga anticâncer, um agente seletivo, um agente marcante óptico, e um agente marcante de ressonância magnética. Em uma modalidade, o agente marcante óptico pode ser selecionado do grupo que consiste em um corante de acridina, um corante de coumarine, um corante de rodamina, um corante de xanteno, um corante de cianina, e um corante de pireno. Em outra modalidade, a droga anticâncer pode ser selecionada do grupo que consiste em um taxano, camptotecina e doxorubicina. Em uma modalidade preferida, a droga anticâncer pode compreender taxano, e o taxano pode ser. selecionado do grupo que consiste em paclitaxel ou docetaxel.
Paclitaxel pode ser conjugado com o polímero em diversas maneiras. Em uma modalidade, paclitaxel é conjugado com a unidade recorrente da fórmula (I) no átomo de oxigênio ligado ao carbono-C2'. Em outra modalidade, paclitaxel é conjugado com a unidade recorrente da fórmula (I) no átomo de oxigênio ligado ao carbono Cl. Em uma modalidade, o composto, que compreende agente, compreende um agente marcante de ressonância magnética. Em outra modalidade, o agente marcante de ressonância magnética compreende um composto de metal paramagnético. Preferivelmente, o composto, que compreende o agente, compreende um composto Gd(III). Por exemplo, o composto que compreende o agente pode compreender a seguinte estrutura:
Em uma modalidade, um ligante polidentado pode ser conjugado com o polímero. Qualquer ligante polidentado pode ser utilizado. Em uma modalidade, o ligante polidentado pqde ser capaz de reação com um metal paramagnético para formar um agente marcante de ressonância magnética. Por exemplo, o ligante polidentado pode compreender vários grupos de ácido carboxílico e/ou carboxilato. Por exemplo, um ligante polidentado da seguinte estrutura pode ser conjugado com o polímero:
onde cada R7 é independentemente hidrogênio, amônio ou um metal alcalino.
Em outra modalidade, um precursor ligante polidentado tendo grupos de proteção pode ser conjugado com o polímero. Tal precursor tem seus átomos de oxigênio protegidos por um grupo(s) de proteção apropriado(s) . Grupos de proteção apropriados incluem, porém não são limitados a, alquilas inferiores, benzilas e grupos de silila. Um exemplo de um precursor ligante polidentado tendo grupos de proteção é fornecido como a seguir:
<formula>formula see original document page 30</formula>
Em uma modalidade, um método de fazer o polímero conjugado compreende em reagir o reagente polimérico dissolvido ou parcialmente dissolvido com o segundo reagente na presença de um agente de ligação. Qualquer agente de ligação apropriado pode ser utilizado. Em uma modalidade, o agente de ligação é selecionado do grupo que consiste em 1-etil-3-(3-dimetilaminopropil)-carbodiimida (EDC), 1,3-dicicloexilcarbodiimida (DCC), 1,1'-carbonil- diimidazol (CDX), carbonato de N,N'-disuccinimidil (DSC), hexafluorofosf^to N-óxido de N-[(dimetilamino)-1H-1, 2, 3- triazolo- [4, 5-b] piridina-1-il-metileno] -N-metil-metanamínio (HATU), hexafluorofosfato de 2- [ (ΙΗ-benzotriazol-1-il) - 1,1,3,3-tetrametilamínio (HBTU), hexafluorofosfato de 2- [(6-cloro-1H-benzotriazol-1-il)-1,1,3,3-tetrametilamínio (HCTU), hexafiuorofosfato de benzotriazol-1-il-oxi-tris- pirrolidino-fosfônio (PyBOP®) , hexafluorofosfato de bromo- tris-pirrolidino-fosfônio (PyBroP®) , tetrafluoroborato de 2-[(ΙΗ-benzotriazol-1-il)-1,1,3,3-tetrametilamínio (TBTU) e hexafluorofosfato de ' benzotriazol-1-il-oxi-tris- (dimetilamino)fosfônio (BOP). Qualquer solvente apropriado que permita que a reação ocorra pode ser utilizado. Em uma modalidade, o solvente pode ser um solvente polar aprótico. Por exemplo, o solvente pode ser selecionado do grupo que consiste em N,N-dimetilformamida (DMF), sulfóxido de dimetila (DMSO), N-metil-2-piridona (NMP), e N,N-dimetilacetamida (DMAc).
Em outra modalidade, a reação pode ainda compreender a reação do reagente polimérico dissolvido ou parcialmente dissolvido na presença de um catalisador. Qualquer catalisador que promova a reação pode ser utilizado. Em uma modalidade, o catalisador pode compreender 4-dimetilaminopiridina (DMAP).
Em uma modalidade, um polímero compreendendo uma unidade recorrente da fórmula (I) e uma unidade recorrente da fórmula (Il) pode ser produzido começando com ác|do poliglutâmico e um aminoácido como ácido aspártico e/ou glutâmico. Alternativamente, em outra modalidade, o polímero pode ser criado primeiramente convertendo o material de ácido poliglutâmico de partida em sua forma salina. A forma salina do poliglutâmico pode ser obtida por reação do ácido poliglutâmico com uma base apropriada, por exemplo, bicarbonato de sódio. A parte do aminoácido pode ser ligado ao grupo de ácido carboxílico pendente do ácido poliglutâmico, O peso molecular médio ponderai do ácido poliglutâmico não é limitado, porém é preferivelmente de aproximadamente 10.000 a aproximadamente 500.000 daltons, e mais preferivelmente de aproximadamente 25.000 a aproximadamente 300.000 daltons. Tal reação pode ser utilizada para criar poli- (γ-L-aspartil-glutamina) ou poli- (γ-L-glutamil-glutamina).
Em uma modalidade, o aminoácido é protegido por um grupo de proteção antes da ligação ao ácido poliglutâmico. Um exemplo de uma fração de aminoácido protegido apropriada para essa reação é o cloridrato de L- ácido d-t-butil éster aspártico, mostrado abaixo:
A reação do ácido poliglutâmico com o aminoácido pode ocorrer na presença de qualquer solvente apropriado. Em uma modalidade, o solvente pode ser um solvente aprótico. Em uma modalidade preferida, o solvente é N,N'- dimetilformamida.
Em uma modalidade, um agente de ligação como EDC, DCC, CDI, DSC, HATU, HBTU, HCTU, PyBOP®, PyBro®, TBTU e BOP pode ser utilizado. Em outras modalidades, ácido poliglutâmico e um aminoácido podem ser reagidos utilizando um catalisador (por exemplo, DMAP).
Após conclusão da reação, se os átomos de oxigênio do aminoácido forem protegidos, os grupos de proteção podem ser removidos utilizando métodos conhecidos como utilizar um ácido apropriado (por exemplo, ácido trifluoroacético). Se desejado, a forma salina do polímero obtido a partir da reação de ácido poliglutâmico com o aminoácido pode ser formada por tratamento na forma ácida do polímero com uma solução base adequada, por exemplo, solução de bicarbonato de sódio.
O polímero pode ser recuperado e/ou purificado por métodos conhecidos por aqueles versados na técnica. Por exemplo, o solvente pode ser removido por métodos adequados, por exemplo, evaporação rotativa.
Adicionalmente, a mistura obtida pela reação pode ser filtrada em uma solução ácida aquosa para induzir precipitação. O precipitado resultante pode ser então filtrado e lavado com água.
Em uma modalidade alternativa, um polímero compreendendo uma unidade recorrente da fórmula (I) e uma unidade recorrente da fórmula (II) pode incluir também uma unidade recorrente da fórmula (III) como exposto acima. Um método para formar um polímero que compreende unidades recorrentes das fórmulas (I), (II) e (III) é começando pela reação do ácido poliglutâmico com um aminoácido como ácido aspártico e/ou glutâmico, em uma quantidade que é menor do que 1,0 equivalente do aminoácido com base em ácido poliglutâmico. Por exemplo, em uma modalidade, 0,7 equivalentes de um aminoácido com base no ácido poliglutâmico pode ser reagido com ácido poliglutâmico, de modo que aproximadamente 70% das unidades recorrentes do polímero resultante compreendem o aminoácido. Como discutido acima, os átomos de oxigênio do aminoácido podem ser protegidos utilizando um grupo de proteção apropriado. Em uma modalidade, o aminoácido pode ser ácido L-aspártico ou ácido L-glutâmico. Em outra modalidade, os átomos de oxigênio do aminoácido podem ser protegidos com grupos de t-butila. Se os átomos de oxigênio do aminoácido forem protegidos, os grupos de proteção podem ser removidos utilizando métodos conhecidos como um ácido apropriado (por exemplo, ácido trifluoroacético).
A conjugação de um grupo que compreende um agente, um ligante polidentado, e/ou um precursor ligante polidentado com átomos de oxigênio protegidos no ácido de polímero ou na forma salina deste pode ser realizada de várias maneiras, por exemplo, por ligação covalente do grupo que compreende um agente, um ligante polidentado, e/ou um precursor ligante polidentado com átomos de oxigênio protegidos com vários polímeros. Um método para conjugar os grupos acima mencionados com o polímero obtido a partir de ácido poliglutâmico e/ou de sua forma salina é usando o calor (por exemplo, calor a partir do uso de um método de microondas). Alternativamente, a conjugação pode ocorrer em temperatura ambiente. Solventes apropriados, agentes de ligação, catalisadores, e/ou tampões genericamente conhecidos por aqueles versados na técnica e/ou como descritos aqui podem ser utilizados para formar o polímero conjugado. Como com ácido poliglutâmico, tanto a forma salina como a forma ácida do polímero obtido a partir do ácido poliglutâmico e/ou de sua forma salina e um aminoácido podem ser utilizados como material de partida para formar o polímero conjugado.
Agentes apropriados que podem ser conjugados com o polímero obtido a partir do ácido poliglutâmico e/ou de sua forma salina e um aminoácido incluem, porém não são limitados a, agentes ópticos, drogas anticâncer, agentes seletivos, agentes marcantes de ressonância magnética (por exemplo, compostos de metal paramagnético) , ligantes polidentado, e precursores ligantes polidentados com átomos de oxigênio protegidos.
Em uma modalidade, o polímero obtido a partir do ácido poliglutâmico e/ou de sua forma salina e um aminoácido pode ser conjugado com um agente óptico. Em uma modalidade, o agente óptico pode ser Texas Red-NH2.
<formula>formula see original document page 34</formula> Em uma modalidade especifica, um polímero compreendendo pelo menos uma unidade recorrente da fórmula (I) e pelo menos uma unidade recorrente da fórmula (II) pode reagir com DCC, corante Texas Red-NH2, piridina e 4- dimetilaminopiridina. A mistura é aquecida utilizando o método de microondas. Em uma modalidade, a reação é aquecida até uma temperatura na faixa de aproximadamente 100° - 150°C. Em outra modalidade, o tempo em que os materiais são aquecidos varia de 5 a 40 minutos. Se desejado, a mistura obtida pela reação pode ser resfriada à temperatura ambiente. Métodos apropriados conhecidos por aqueles versados na técnica podem ser utilizados para isolar e/ou purificar o polímero conjugado. Por exemplo, a mistura obtida pela reação pode ser filtrada em uma solução ácida aquosa. Qualquer precipitado que se forma pode ser então filtrado e lavado com água. Opcionalmente, o precipitado pode ser purificado por qualquer método apropriado. Por exemplo, o precipitado pode ser transferido à acetona e dissolvido, e a solução resultante pode ser filtrada novamente em uma solução de bicarbonato de sódio. Se desejado, a solução resultante da reação pode ser separada por diálise em água utilizando uma membrana de celulose e o polímero passa por um processo de liofilização e é isolado.
Conjugados compreendendo o corante Texas Red podem ser utilizados para fornecer um agente marcante a um tecido selecionado, como exemplificado nos exemplos abaixo. Os polímeros descritos acima podem ser formados em nanopartícuias em solução aquosa, por exemplo, como exemplificado a seguir.
Em uma modalidade, o polímero obtido a partir do ácido poliglutâmico e/ou de sua forma salina e um aminoácido pode ser conjugado a uma droga anticâncer. Em uma modalidade, a droga anticâncer pode ser um taxano, camptotecina e/ou doxorubicina. Em uma modalidade preferida, a droga anticâncer é um taxano como paclitaxel ou docetaxel.
Em uma modalidade, a droga antitumor conjugada ao polímero é paclitaxel. Em uma modalidade, paclitaxel pode ser unido ao polímero no átomo de oxigênio-C2'. Em outra modalidade, o paclitaxel pode ser unido ao polímero no átomo de oxigênio-C7. Em outra modalidade, a cadeia de polímero compreende paclitaxel que é acoplado ao polímero somente pelo átomo de oxigênio-C2'. Ainda em outra modalidade, a cadeia de polímero compreende paclitaxel que é acoplado ao polímero somente pelo átomo de oxigênio-C7. Ainda em outra modalidade, o polímero compreende tanto grupos de conjugado de paclitaxel-C2' como grupos de conjugado de paclitaxel-C7.
A droga anticâncer pode ser conjugada ao polímero obtido a partir de ácido poliglutâmico e/ou da forma salina deste e um aminoácido utilizando os métodos descritos acima com relação a Texas-Red.
Em uma modalidade, paclitaxel, preferivelmente na presença de um agente de ligação (por exemplo, EDC e/ou DCC) e um catalisador (por exemplo, DMAP), pode reagir com o polímero obtido a partir de ácido poliglutâmico e/ou da formai salina deste e um aminoácido em um solvente (por exemplo, um solvente aprótico como DMF). Agentes adicionais, como piridina ou hidróxido de benzotriazol podem; ser utilizados. Em uma modalidade, a reação pode ocorrer durante o período de 0,5 - 2 dias. Métodos apropriados conhecidos por aqueles versados na técnica podem.ser utilizados para isolar e/ou purificar o polímero conjugado. Por exemplo, a mistura obtida pela reação pode ser derramada em uma solução ácida para formar um precipitado. Qualquer precipitado que se forma pode ser então filtrado e lavado com água. Opcionalmente, o precipitado pode ser purificado por qualquer método apropriado. Por exemplo, o precipitado pode ser transferido à acetona e dissolvido, e a solução resultante pode ser filtrada novamente em uma solução de bicarbonato de sódio. Se desejado, a solução resultante da reação pode ser submetida à diálise em água utilizando uma membrana de celulose e o polímero pode passar por um processo de liofilização e ser isolado. O teor de paclitaxel no polímero resultante pode ser determinado por espectrometria UV.
Alternativamente, o composto compreendendo o agente pode reagir com um aminoácido como o ácido glutâmico e/ou aspártico no qual o composto compreendendo o agente é acoplado (por exemplo, por ligação covalente) ao aminoácido. O composto de agente-aminoácido pode então reagir com o ácido poliglutâmico ou seu sal para formar o polímero conjugado. Em uma modalidade, paclitaxel é reage com o ácido glutâmico para formar um composto no qual o paclitaxel é covalentemente ligado ao grupo de ácido carboxílico pendente do ácido glutâmico. O composto de ácido paclitaxel-glutâmico pode ser reagir com o ácido poliglutâmico ou seu sal para formar o polímero conjugado.
Em uma modalidade, paclitaxel reage com o ácido aspártico para formar um composto no qual o paclitaxel é covalentemente ligado ao grupo de ácido carboxílico pendente do ácido aspártico. O composto de ácido aspártico- paclitaxel pode ser então reagido com ácido poliglutâmico ou seu sal para formar o polímero conjugado. Se desejado, o paclitaxel acoplado ao aminoácido pelo oxigênio-C2' pode ser separado do paclitaxel acoplado ao aminoácido pelo oxigênio-C7 utilizando métodos de separação conhecidos (por exemplo, HPLC).
Após formação do polímero conjugado, qualquer quantidade livre de agente não ligado covalentemente ao polímero também pode ser medida. Por exemplo, cromatografia em camada fina (TLC) pode ser utilizada para confirmar a ausência substancial de paclitaxel livre que resta nas composições de polímeros conjugados com paclitaxel.
Em uma modalidade, o polímero obtido a partir de ácido poliglutâmico e/ou seu sal e um aminoácido pode ser conjugado a um ligante polidentado. Ligantes polidentados apropriados incluem, porém não são limitados a, ácido dietilenotriamínapentaacético (DTPA), ácido tetraazaciclododecano-1,4,7,10-tetraacético (DOTA), (1,2- etanodiildinitrilo)tetraacetato (EDTA), etilenodiamina, 2,2'-bipiridina (bipi), 1,10-fenantrolina (phen), 1,2,- bis(difenilfosfino)etano (DPPE), 2,4-pentanodiona (acac) e etanodioato (ox). Solventes apropriados, agentes de ligação, catalisadores, e/ou tampões, como genericamente conhecidos por aqueles versados na técnica e/ou descritos aqui, podem ser utilizados para formar o polímero conjugado. Em outra modalidade, o polímero obtido a partir do ácido poliglutâmico e/ou seu sal e um aminoácido pode ser conjugado a um precursor ligante polidentado com átomos de oxigênio protegidos. Como com ácido poliglutâmico, tanto a forma salina quanto a forma ácida do polímero obtido a partir de ácido poliglutâmico e/ou seu sal e um aminoácido podem ser utilizados como material de partida para formar o polímero conjugado.
Em uma modalidade, o ligante polidentado compreende DTPA. Em uma modalidade, o ligante polidentado como DTPA (com átomos de oxigênio protegidos), preferivelmente na presença de um agente de ligação (por exemplo, DCC) e um catalisador (por exemplo, DMAP) podem reagir com o polímero obtido a partir do ácido poliglutâmico e/ou seu sal e um aminoácido em um solvente (por exemplo, um solvente aprótico como o DMF). Se grupos de proteção estiverem presentes, a remoção pode ser obtida utilizando métodos apropriados. Por exemplo, o polímero conjugado com o precursor ligante de polidentado com átomos de oxigênio protegidos como DTPA com átomos de oxigênio protegidos por grupos de t-butila pode ser tratado com ácido como ácido trifluoroacético. Após remoção dos grupos de proteção, o ácido pode ser removido por evaporação rotativa. Em uma modalidade, DTPA pode ser tratado com uma base apropriada para remover os átomos de hidrogênio nos grupos -OH do ácido carboxílico. Em algumas modalidades, a base é bicarbonato de sódio.
Em uma modalidade, o polímero obtido a partir do ácido poliglutâmico e/ou de seu sal e um aminoácido pode ser conjugado com um agente marcante de ressonância magnética. Em uma modalidade, o agente marcante de ressonância magnética compreende um composto Gd(III). Um método para formar o agente marcante de ressonância magnética é a reação de um metal paramagnético com o polímero conjugado que compreende um ligante polidentado. Metais paramagnéticos apropriados incluem, porém não são limitados a Gd(III), índio-111 e ítrio-88. Por exemplo, um polímero conjugado compreendendo DTPA pode ser tratado com Gd(III) em uma solução de tampão por um período de várias horas. Métodos apropriados conhecidos por aqueles versados na técnica podem ser utilizados para isolar e/ou purificar o polímero conjugado. Por exemplo, a solução resultante da reação pode ser submetida à diálise em água utilizando uma membrana de celulose e o polímero pode passar por um processo de liofilização e ser isolado. A quantidade de metal paramagnético pode ser quantificada por medição de espectrometria de emissão óptica com plasma acoplado indutivamente (ICP-OES).
Os polímeros conjugados podem ser utilizados para liberar um agente marcante e/ou uma droga em um tecido selecionado, por exemplo, como exemplificado nos exemplos abaixo. Os polímeros descritos acima podem ser formados em nanopartículas em solução aquosa, por exemplo, como exemplificado abaixo. Conjugados compreendendo um polímero e uma droga podem ser formados em nanopartículas de modo similar. Tais nanopartículas podem ser utilizadas para liberar preferencialmente uma droga a um tecido selecionado.
Composições farmacêuticas
Em algumas modalidades, pró-medicamentos, metabólitos, estereoisômeros, hidratos, solvatos, polimorfos, e sais farmaceuticamente aceitáveis dos compostos revelados aqui (por exemplo, o polímero conjugado e/ou o agente que o mesmo compreende) são fornecidos.
Um "pró-medicamento" se refere a um agente que é convertido na droga de origem in vivo. Pró-medicamentos são freqüentemente úteis porque, em algumas situações, podem ser mais fáceis de administrar do que a droga de origem. Podem, por exemplo, ser biodisponíveis por administração oral ao passo que a de origem não é. O pró-medicamento também pode ter uma solubilidade melhor em composições farmacêuticas do que droga de origem. Um exemplo, sem limitação, de um pró-medicamento seria um composto que é administrado como um éster (o wpró-medicamento") para facilitar sua passagem através de uma membrana de célula onde solubilidade da água é prejudicial à mobilidade, mas que depois é hidrolisado de forma metabólica com o ácido carboxílico, a entidade ativa, quando dentro da célula onde a solubilidade em água é vantajosa. Um exemplo adicional de um pró-medicamento poderia ser um peptideo curto (poliaminoácido) ligado a um grupo ácido onde o peptideo é metabolizado para revelar seu sitio ativo. Procedimentos convencionais para a seleção e preparação de derivados de pró-medicamento apropriados são descritos, por exemplo, em Design of Prodrugs, (ed. H. Bundgaard, Elsevier, 1985), que é pelo presente incorporado aqui a titulo de referência na integra.
O termo "pró-medicamento de éster" se refere a derivados dos compostos revelados aqui formados pela adição de quaisquer de vários grupos de formação de éster que são hidrolisados sob condições fisiológicas. Os exemplos de grupos de pró-medicamentos de éster incluem pivoilóximetila, acetóximetila, ftalidila, indanila e metóximetila, bem como outros tais grupos conhecidos na técnica, incluindo um grupo (5-R-2-oxo-l,3-dioxoleno-4- il)metila. Outros exemplos de grupos de pró-medicamentos de éster podem ser encontrados, por exemplo, em T. Higuchi e V. Stella, em "Pro-drugs as novel Delivery systems," vol. 14, A.C.S. Symposium Series, American Chemical society (1975); e "Bioreversible Carriers in drug design: Theory and Application," editado por E.B. Roche, Pergamon Press: Nova York, 14-21 (1987) (fornecendo exemplos de ésteres úteis como pró-medicamentos para compostos contendo grupos de carboxila). Cada uma das referências acima mencionadas é aqui incorporada a titulo de referência na integra.
O termo "sal farmaceuticamente aceitável" se refere a um sal de um composto que não causa irritação significativa em um organismo ao qual é administrado e não anula a atividade biológica e propriedades do composto. Em algumas modalidades, o sal é um sal de adição ácido do composto. Sais farmacêuticos podem ser obtidos pela reação de um composto com ácidos inorgânicos como um halogeneto de hidrogênio (por exemplo, ácido clorídrico ou ácido bromídrico), ácido sulfúrico, ácido nítrico, ácido fosfórico e similares. Sais farmacêuticos também podem ser obtidos pela reação de um composto com um ácido orgânico como ácidos alifáticos ou carboxílicos aromáticos ou sulfônicos, por exemplo, ácido acético, ácido succinico, ácido láctico, ácido málico, ácido tartárico, ácido citrico, ácido ascórbico, ácido nicotínico, ácido metanossulfônico, ácido etanossulfônico, ácido p- toluenossulfônico, ácido salicílico ou ácido naftalenossulfônico. Sais farmacêuticos também podem ser obtidos pela reação de um composto com uma base para formar um sal como sal amomíaco, um sal de metal alcalino, como sal de sódio ou de potássio, um sal de metal alcalino terroso, como sal de cálcio ou de magnésio, um sal de bases orgânicas como dicicloexilamina, N-metil-D-glucamina, tris(hidróximetil)metilamina, alquilamina C1-C7, cicloexilamina, trietanolamina, etilenodiamina e sais com aminoácidos como arginina, lisina e similares.
Se a fabricação de formulações farmacêuticas envolver mistura intima dos excipientes farmacêuticos e do ingrediente ativo em sua forma salina, então pode ser desejável utilizar excipientes farmacêuticos que são não básicos, isto é, excipientes ácidos ou neutros.
Em várias modalidades, os compostos revelados aqui (por exemplo, o polímero conjugado e/ou agente que o mesmo compreende) podem ser utilizados individualmente, em combinação com outros componentes revelados aqui, ou em combinação com um ou mais outros agentes ativos nas áreas terapêuticas descritas aqui.
Em outro aspecto, a presente revelação refere-se a uma composição farmacêutica que compreende um ou mais agentes ativos de superfíce fisiologicamente aceitável, transportadores, diluentes, excipientes, agentes
suavizantes, agentes de suspensão, substâncias de formação de filme e meios auxiliares de revestimento, ou uma combinação dos mesmos; e um composto (por exemplo, o polímero conjugado e/ou agente que o mesmo compreende) revelado aqui. Transportadores ou diluentes
terapeuticamente aceitáveis são bem conhecidos na técnica farmacêutica, e são descritos, por exemplo, em Remington's Pharmaceutical Sciences, 18a edição, Mack Publishing Co., Easton, PA (1990), que é incorporado aqui a título de referência na íntegra. Preservativos, estabilizadores, corantes, edulcorantes, fragrâncias, agentes aromatizantes, e similares podem ser fornecidos na composição farmacêutica. Por exemplo, benzoato de sódio, ácido ascórbico e ésteres de ácido p-hidróxibenzóico podem ser adicionados como preservativos. Além disso, antioxidantes e agentes de suspensão podem ser utilizados. Em várias modalidades, álcoois, ésteres, álcoois alifáticos sulfatados, e similares podem ser utilizados como agentes ativos superficiais; sacarose, glicose, lactose, amido, celulose cristalizada, manitol, silicato de anidro leve, aluminato de magnésio, aluminato metassilicato de magnésio, silicato de alumínio sintético, carbonato de cálcio, carbonato de ácido de sódio, fosfato de hidrogênio de cálcio, carboximetil celulose de cálcio, e similares podem ser utilizados como excipientes; estearato de magnésio, talco, óleo endurecido e similares podem ser utilizados como agentes suavizantes; óleo de coco, azeite, óleo de gergelim, óleo de amendoim, soja podem ser utilizados como agentes de suspensão ou lubrificantes; celulode de ftalato acetato como um derivado de um carboidrato como celulose ou açúcar, ou copòlímero de metilacetato-metacrilato como um derivado de polivinila podem ser utilizados como agentes de suspensão; e plastificantes como ftalatos de éster e similares podem ser utilizados como agentes de suspensão.
O termo "composição farmacêutica" se refere a uma mistura de um composto revelado aqui (por exemplo, o polímero conjugado e/ou agente que o mesmo compreende) com outros componentes químicos, como diluentes ou transportadores. A composição farmacêutica facilita administração do composto a um organismo. Múltiplas técnicas de administrar um composto existem na prática incluindo, porém não limitado a, administração oral, por injeção, aerossol, parenteral e tópica. Composições farmacêuticas também podem ser obtidas pela reação dos compostos com ácidos inorgânicos ou orgânicos como ácido clorídrico, ácido bromídrico, ácido sulfúrico, ácido nítrico, ácido fosfórico, ácido metanossulfônico, ácido etanossulfônico, ácido p-toluenossulfônico, ácido salicílico e similares.
O termo "transportador" se refere a um composto químico que facilita a incorporação de um composto em células ou tecidos. Por exemplo, sulfóxido de dimetila (DMSO) é um transportador comumente utilizado visto que facilita a absorção de muitos compostos orgânicos nas células ou tecidos de um organismo.
O termo "diluente" se refere a compostos químicos diluídos em água que dissolverão o composto de interesse (por exemplo, o polímero conjugado e/ou o agente que o mesmo compreende) bem como estabilizarão a forma biologicamente ativa do composto. Sais dissolvidos em soluções tamponadas são utilizados como diluentes na técnica. Uma solução tamponada comumente utilizada é solução salina tamponada com fosfato porque simula as condições salinas do sangue humano. Uma vez que sais de tampão podem controlar o pH de uma solução em baixas concentrações, um diluente tamponado raramente modifica a atividade biológica de um composto. O termo wfisiologicamente aceitável" se refere a um transportador ou diluente que não anula a atividade biológica e propriedades do composto.
As composições farmacêuticas descritas aqui podem ser administradas a um paciente humano por si, ou em composições farmacêuticas onde são misturadas com outros ingredientes ativos, como em terapia de combinação, ou transportadores ou excipiente(s) apropriado(s). Técnicas para formulação e administração dos compostos do presente pedido podem ser encontradas em "Remington's Pharmaceutical Sciences", Mack Publishing Co., Easton, PA, 18a edição, 1990.
Vias de administração apropriadas podem incluir, por exemplo, administração oral, retal, transmucosa, tópica ou intestinal; liberação parenteral, incluindo injeções intramuscular, subcutânea, intravenosa, intramedular, bem como injeções intratecal, intraventricular direta, intraperitoneal, intranasal ou intraocular. Os compostos (por exemplo, o polímero conjugado e/ou o agente que o mesmo compreende) também podem ser administrados em formas de dosagem de liberação contínua ou controlada, incluindo injeções de depósito, bombas osmóticas, pílulas, adesivos transdérmicos (incluindo eletrotransporte) e similares, para administração pulsada, prolongada e/ou cronometrada em uma taxa predeterminada.
As composições farmacêuticas da presente invenção podem ser fabricadas em um modo que é ele próprio conhecido, por exemplo, por intermédio de processos convencionais de mistura, dissolução, granulação, feitura de drágeas, levigação, emulsificação, encapsulação, retenção ou formação de tabletes. Composições farmacêuticas para uso de acordo com a presente invenção podem ser desse modo formuladas convencionalmente utilizando um ou mais transportadores fisiologicamente aceitáveis compreendendo excipientes e meios auxiliares que facilitam processamento dos compostos ativos em preparações que podem ser utilizadas farmaceuticamente. A formulação adequada depende da via de administração escolhida. Qualquer uma das técnicas bem conhecidas, transportadores, e excipientes podem ser utilizados como. apropriado e como entendido na técnica; por exemplo, em Remington's Pharmaceutical Sciences, acima.
Injetáveis podem ser preparados em formas convencionais, como soluções ou suspensões líquidas, formas sólidas apropriadas para solução ou suspensão em líquido antes da injeção ou como emulsões. Excipientes apropriados são, por exemplo, água, solução salina, dextrose, manitol, lactose, lecitina, albumina, glutamato de sódio, cloridrato de cisteína, e similares. Além disso, se desejado, as composições farmacêuticas injetáveis podem conter quantidades menores de substâncias auxiliares não tóxicas, como agentes umectantes, agentes de tamponamento de pH e similares. Tampões fisiologicamente compatíveis incluem, porém não são limitados à, solução de Hank, solução de Ringer ou tampão de solução salina fisiológica. Se desejado, preparações de intensificação de absorção (por exemplo, lipossomas) podem ser utilizadas.
Para administração transmucosa, penetrantes apropriados à barreira a ser permeada podem ser utilizados na formulação.
Formulações farmacêuticas para administração parenteral, por exemplo, por injeção de bolo ou infusão contínua, incluem soluções aquosas dos compostos ativos em forma solúvel em água. Adicionalmente, suspensões dos compostos ativos podem ser preparadas como suspensões de injeção oleosa apropriadas. Solventes ou transportadpres lipofilicos apropriados incluem óleos graxos como óleo de gergelim, ou outros óleos orgânicos como óleos de soja, toranja ou amêndoa, ou ésteres de ácido graxo sintético, como oleato de etila ou triglicerideos ou lipossomas. Suspensões de injeção aquosa podem conter substâncias que aumentam a viscosidade da suspensão, como celulose de carboximetil de sódio, sorbitol ou dextrano. Opcionalmente, a suspensão também pode conter estabilizadores apropriados ou agentes que aumentam a solubilidade dos compostos p^ra permitir a preparação de soluções altamente concentradas. Formulações para injeção podem ser apresentadas em forma de dosagem de unidade, por exemplo, em ampolas ou em recipientes de múltiplas doses, com um preservativo adicionado. As composições podem assumir tais formas como suspensões, soluções ou emulsões em transportadores aquosos ou oleosos, e podem conter agentes de formulação como agentes de suspensão, de estabilização e/ou de dispersão. Alternativamente, o ingrediente ativo pode estar em forma de pó para constituição com um transportador apropriado, por exemplo, água isenta de pirogênio estéril, antes de uso.
Para administração oral, os compostos podem ser formulados prontamente por combinação dos compostos ativos com transportadores farmaceuticamente aceitáveis bem conhecidos na técnica. Tais transportadores permitem que os compostos da invenção sejam formulados como tabletes, pílulas, drágeas, cápsulas, líquidos, géis, xaropes, pastas, suspensões e similares, para ingestão oral pelo paciente a ser tratado. Preparações farmacêuticas para uso oral podem ser obtidas combinando os compostos ativos com excipiente sólido, opcionalmente triturando uma mistura resultante, e processando a mistura de grânulos, depois de adicionar meios auxiliares apropriados, se desejado, para obter tabletes ou núcleos de drágeas. Excipientes apropriados são, particularmente, cargas como açúcares, incluindo lactose, sacarose, manitol, ou sorbitol; preparações de celulose como, por exemplo, amido de milho, amido de trigo, amido de arroz, amido de batata, gelatina, goma tragacanto, celulose de metila, celulose de hidróxipropilmetila, celulose de carbóximetila de sódio, e/ou polivinilpirrolidona (PVP). Se desejado, agentes desintegrantes podem se adicionados, como polivinila pirrolidona reticulado, agar, ou ácido alginico ou um sal do mesmo com alginato de sódio. Núcleos de drágea são dotados de revestimentos apropriados. Para essa finalidade, soluções de açúcar concentradas podem ser utilizadas, podendo conter opcionalmente goma arábica, talco, polivinila pirrolidona, gel de carbopol, polietileno glicol, e/ou dióxido de titânio, soluções de laca, e solventes orgânicos apropriados ou misturas de solventes. Corantes ou pigmentos podem ser adicionados aos tabletes ou revestimentos de drágea para identificação ou pára caracterizar diferentes combinações de doses de composto ativo. Para essa finalidade, soluções de açúcar concentradas podem ser utilizadas, que podem conter opcionalmente goma arábica, talco, polivinil pirrolidona, carbopol gel, polietileno glicol, e/ou dióxido de titânio, soluções de laca, e solventes orgânicos apropriados ou misturas de solventes. Corantes ou pigmentos podem ser adicionados aos tabletes ou revestimentos de drágea para identificação ou para caracterizar diferentes combinações de doses de compostos ativos.
Preparações farmacêuticas que podem ser utilizados por via oral incluem cápsulas push-fit feitas de gelatina, bem como cápsulas vedadas, macias feitas de gelatina e plastificante, como glicerol ou sorbitol. As cápsulas push-fit podem conter os ingredientes ativos em mistura com carga como lactose, aglutinantes como amidos, e/ou lubrificantes como talco ou estearato de magnésio e, opcionalmente, estabilizadores. Em cápsulas macias, os compostos ativos podem ser dissolvidos ou suspensos em líquidos apropriados, como óleos graxos, parafinas líquidas, ou polietileno glicol líquido. Além disso, estabilizadores podem ser adicionados. Todas as formulações para administração oral devem estar em dosagens apropriadas para tal administração.
Para administração bucal, as composições podem ter a forma de tabletes ou pastilhas formuladas de modo convencional.
Para administração por inalação, os compostos para uso de acordo com a presente invenção são convenientemente fornecidos na forma de uma apresentação de pulverização de aerossol, a partir de embalagens pressurizadas ou um nebulizador, com o uso de um propelente apropriado, por exemplo, diclorodifluorometano, triclorofluorometano, diclorotetrafluoretano, dióxido de carbono ou outro gás apropriado. No caso de um aerossol pressurizado a unidade de dosagem pode ser determinada pela provisão de uma válvula para fornecer uma quantidade dosagem. Cápsulas e cartuchos de, por exemplo, gelatina para uso em um inalador ou insuflador, podem ser formulados contendo uma mistura de pó do composto e uma base de pó apropriada como lactose ou amido.
São adicionalmente reveladas aqui várias composições farmacêuticas bem conhecidas na técnica farmacêutica para usos que incluem liberação intraocular, intranasal e intraauricular. Penetrantes apropriados para esses usos são genericamente conhecidos na técnica. Composições farmacêuticas para liberação intraocular incluem soluções oftálmicas aquosas dos compostos ativos em forma solúvel em água, como colírios, ou em goma gellan (Sheddan e outros, Clin. Ther., 23(3):440-50 (2001)) ou hidrogéis (Mayer e outros, Ophthalmologica, 210(2): 101-3 (1996)); ungüentos oftálmicos; suspensões oftálmicas, como micropartículas, partículas poliméricas pequenas contendo droga que são suspensas em um transportador líquido médio (Joshi, A., J. Ocul. Pharmacol., 10(1): 29-45 (1994)), formulações solúveis em lipídeo (Alm e outros, Prog. Clin. Biol. Res., 312:447-58 (1989)), e microesferas (Mordenti, Toxicol. Sci., 52(1): 101-6 (1999)); e inserções oculares. Todas as referências acima mencionadas são incorporadas aqui a título de referência na íntegra. Tais formulações farmacêuticas apropriadas são mais freqüentemente e preferivelmente formuladas para serem estéreis, isotônicas e tamponadas para estabilidade e conforto. Composições farmacêuticas para liberação intranasal também podem incluir gotas e pulverizações freqüentemente preparadas para simular em muitos aspectos secreções nasais para assegurar manutenção da ação ciliar normal. Como revelado em Remington's Pharmaceutical Sciences, 18a edição, Mack Publishing Co., Easton, PA (1990), que é incorporada aqui a título de referência na íntegra, e bem conhecida por aqueles versados na técnica, formulações apropriadas são mais freqüentemente e preferivelmente isotônicas, levemente tamponadas para manter um pH de 5,5 a 6,5, e mais freqüentemente e preferivelmente incluem preservativos antimicrobianos e estabilizadores de drogas apropriados. Formulações fóirmacêuticas para liberação intraauricular incluem suspensões e ungüentos para aplicação tópica no ouvido. Solventes comuns para tais formulações aura.ts incluem glicerina e água.
Os compostos também podem ser formulados em composições retais como supositórios ou clister de retenção, por exemplo, contendo bases de supositório convencionais como manteiga de cacau ou outros glicerideos.
Além das formulações descritas anteriormente, os compostos também podem ser formulados como uma preparação de depósito. Tais formulações de atuação longa podem ser administradas por implantação (por exemplo, via subcutânea ou intramuscular) ou por injeção intramuscular. Desse modo, por exemplo, os compostos podem ser formulados com materiais poliméricos ou hidrofóbicos apropriados (por exemplo, como uma emulsão em um óleo aceitável) ou resinas de permuta iónica, ou como derivados pouco solúveis, por exemplo, como um sal pouco solúvel.
Para compostos hidrofóbicos, um transportador farmacêutico apropriado pode ser um sistema co-solvente compreendendo álcool de benzila, um surfactante não polar, um polímero orgânico miscível em água e uma fase aquosa. Um sistema co-solvente comum utilizado é o sistema co-solvente VPD, que é uma solução de álcool benzílico a 3% peso/volume, 8% peso/volume do surfactante não polar Polysorbate 80™, e 65% peso/volume de polietileno glicol 300, composto até o volume em etanol absoluto. Naturalmente, as proporções de um sistema co-solvente podem ser variadas consideravelmente sem destruir suas características de solubilidade e toxicidade. Além disso, a identidade dos componentes co-solventes pode variar: por exemplo, outros surfactantes não polares de baixa toxicidade podem ser utilizados em vez de POLYSORBATE 80™; o tamanho de fração de polietileno glicol pode variar; outros polímeros biocompatíveis podem substituir polietileno glicol, por exemplo, polivinila pirrolidona; e outros açúcares ou polissacarideos podem substituir dextrose.
Alternativamente, outros sistemas de liberação para compostos farmacêuticos hidrofóbicos podem ser empregados. Lipossomas e emulsões são exemplos bem conhecidos de veículos de distribuição ou transportadores para drogas hidrofóbicas. Certos solventes orgânicos como sulfóxido de dimetila também podem ser empregados, embora normalmente a custo de maior toxicidade. Adicionalmente, os compostos podem ser fornecidos utilizando um sistema de liberação contínua, como matrizes semipermeáveis de polímeros hidrobóficos sólidos contendo o agente terapêutico. Vários materiais de liberação contínua foram estabelecidos e são bem conhecidos por aqueles versados na técnica. Cápsulas de liberação contínua podem, dependendo de sua natureza química, liberar os compostos por algumas horas ou semanas até mais de 100 dias. Dependendo da natureza química e estabilidade biológica do reagente terapêutico, estratégias adicionais para estabilização de proteína podem ser empregadas.
Agentes destinados a serem administrados por via intracelular podem ser administrados utilizando técnicas bem conhecidas por aqueles com conhecimentos triviais na técnica. Por exemplo, tais agentes podem ser encapsulados em lipossomas. Todas as moléculas presentes em uma solução aquosa no momento de formação de lipossoma são incorporadas no interior aquoso. Os teores lipossomais são ambos protegidos do micro-ambiente externo e, como as lipossomas se fundem com membranas de célula, são eficientemente distribuídas no citoplasma da célula. A lipossoma pode ser revestida com um anticorpo específico de tecido. As lipossomas serão alvejadas e absorvidas seletivamente pelo órgão desejado. Alternativamente, moléculas orgânicas hidrofóbicas pequenas podem ser diretamente administradas por via intracelular.
Agentes de diagnóstico ou terapêuticos adicionais podem ser incorporados em composições farmacêuticas.
Alternativa ou adicionalmente, composições farmacêuticas podem ser combinadas com outras composições que contêm outros agentes terapêuticos ou de diagnóstico.
Métodos de administração
Os compostos ou composições farmacêuticas podem ser administrados ao paciente por qualquer meio apropriado. Exemplos não limitadores de métodos de administração incluem, entre outros, (a) administração através de vias orais, cuja administração inclui administração em cápsula, tablete, grânulo, pulverização, xarope ou outras tais formas; (b) administração através de vias não orais como retal, vaginal, intrauretral, intraocular, intranasal, ou intraauricular, cuja administração inclui administração como uma suspensão aquosa, um preparado oleoso ou similar ou como um gotejador, pulverização, supositório, pomadas, ungüento ou similar; (c) administração via injeção, subcutânea, intraperitoneal, intravenosa, intramuscular, intradérmica, intraorbital, intracapsular, intraespinal, intraesternal ou similar, incluindo distribuição por bomba infusora; (d) administração local como por injeção diretamente na área renal ou cardíaca, por exemplo, por implantação de depósito; bem como (e) administração tópica; como considerado apropriado por aqueles versados na técnica para colocar o composto ativo em contato com tecido vivo.
Composições farmacêuticas apropriadas para administração incluem composições onde os ingredientes ativos estão contidos em uma quantidade eficaz para obter sua finalidade pretendida. A quantidade terapeuticamente eficaz dos compostos revelados aqui necessária como uma dose dependerá da via de administração, do tipo de animal, incluindo ser humano, sendo tratado e das características físicas do animal específico em consideração. A dose pode ser moldada para obter um efeito desejado, porém dependerá de fatores tais como peso, dieta, medicação simultânea e outros fatores que aqueles versados na técnica médica reconhecerão. Mais especificamente, uma quantidade terapeuticamente eficaz significa uma quantidade de composto eficaz para evitar, aliviar ou melhorar sintomas de doença ou prolongar a sobrevivência do sujeito em tratamento. A determinação de uma quantidade terapeuticamente eficaz está bem compreendida na capacidade daqueles versados na técnica, especialmente às claras da invenção detalhada fornecida aqui.
Como será prontamente evidente para uma pessoa versada na técnica, a dosagem in vivo útil a ser administrada e o modo de administração específico variarão dependendo da idade, peso e espécie mamífera tratada, dos compostos específicos empregados, e do uso específico para o qual esses compostos são empregados. A determinação de níveis de dosagem eficazes, isto é, os níveis de dosagem necessários para obter o resultado desejado, pode ser realizada por uma pessoa versada na técnica utilizando métodos farmacológicos de rotina. Tipicamente, aplicações clínicas humanas de produtos são iniciadas em níveis de dosagem mais baixos, com o nível de dosagem sendo aumentado até que se obtenha o efeito desejado. Alternativamente, estudos in vitro aceitáveis podem ser utilizados para estabelecer doses úteis e vias de administração das composições identificadas pelos presentes métodos utilizando métodos farmacológicos estabelecidos.
Em estudos com animais não humanos, as aplicações de produtos potentes são iniciadas em níveis de dosagem mais elevados, com a dosagem sendo diminuída até que o efeito desejado não mais seja obtido ou os efeitos colaterais adversos desapareçam. A dosagem pode variar amplamente, dependendo dos efeitos desejados e da indicação terapêutica. Tipicamente, as dosagens podem estar entre aproximadamente 10 micrograma/kg e 100 mg/kg de peso corporal, preferivelmente entre aproximadamente 100 micrograma/kg e 10 mg/kg de peso corporal. Alternativamente as dosagens podem ser baseadas e calculadas a partir de área superficial do paciente, como entendido por aqueles versados na técnica.
A formulação exata, via de administração e dosagem para as composições farmacêuticas da presente invenção podem ser escolhidas pelo médico individual em vista da condição do paciente. (Vide,por exemplo, Fingi e outros 1975, em wThe Pharmacological basis of therapeutics," que é aqui incorporada a título de referência na íntegra, com referência específica ao capítulo 1, pág. 1). Tipicamente, a faixa de dose da composição administrada ao paciente pode ser de aproximadamente 0,5 a 1000 mg/kg do peso corporal do paciente. A dosagem pode ser uma única ou uma série de duas ou mais dadas no curso de um ou mais dias, como necessitado pelo paciente. Em casos onde dosagens de compostos para humanos forem estabelecidas para pelo menos alguma condição, a presente invenção utilizará aquelas mesmas dosagens, ou dosagens que estão entre aproximadamente 0,1% e 500%, mais preferivelmente entre aproximadamente 25% e 250%, da dosagem humana estabelecida. Onde nenhuma dosagem humana é estabelecida, como será o caso para composições farmacêuticas recentemente descobertas, uma dosagem humana apropriada pode ser inferida de valores ED50 ou ID50, ou outros valores apropriados derivados de estudos in vitro ou in vivo, como qualificado por estudos de toxicidade e estudos de eficácia em animais.
Deve ser observado que o médico atendente saberia como e quando terminar, interromper ou ajustar a administração devido à toxicidade ou disfunções do órgão. Inversamente, o médico atendente saberia também como ajustar o tratamento para níveis mais elevados se a resposta clínica não fosse adequada (evitando toxicidade) .
A magnitude de uma dose administrada no controle do distúrbio de interesse variará com a gravidade da condição a ser tratada e a via de administração. A gravidade da condição pode, por exemplo, se avaliada, em parte por métodos de avaliação de prognóstico padrão. Além disso, a dose e talvez a freqüência de dose, também variarão de acordo com a idade, peso corporal, e resposta do paciente individual. Um programa comparável com aquele discutido acima, pode ser utilizado em medicina veterinária.
Embora a dosagem exata seja determinada em uma base de droga a droga, na maioria dos casos, algumas generalizações, em relação à dosagem podem ser feitas. .0 regime de dosagem diário para um paciente humano adulto pode ser, por exemplo, uma dose oral entre 0,1 mg e 2000 mg de cada ingrediente ativo, preferivelmente entre 1 mg e 500 mg, por exemplo 5 a 200 mg. Em outras modalidades, uma dose intravenosa, subcutânea ou intramuscular de cada ingrediente ativo entre 0,01 mg e 100 mg, preferivelmente entre 0,1 mg e 60 mg, por exemplo 1 a 40 mg é utilizada.
Nos casos de administração de um sal farmaceuticamente aceitável, as dosagens podem ser calculadas com base de cálculo livre. Em algumas modalidades, a composição é administrada 1 a 4 vezes por dia. Alternativamente, as composições da invenção podem ser administradas por infusão intravenosa contínua, preferivelmente em uma dose de cada ingrediente ativo até 1000 mg por dia. Como será entendido por aqueles versados na técnica, em certas situações pode ser necessário administrar os compostos revelados aqui em quantidades que excedem, ou até mesmo excedem em excesso, a faixa de dosagem preferida acima mencionada para tratar de modo eficaz e agressivamente doenças ou infecções particularmente agressivas. Em algumas modalidades, os compostos serão administrados por um período de terapia contínua, por exemplo, por uma semana ou mais, ou por meses ou anos.
A quantidade de dosagem e intervalo podem ser ajustados individualmente para fornecer níveis de plasma do sítio ativo suficientes para manter os efeitos de modulação, ou concentração efetiva mínima (MEC). A MEC variará para cada composto, porém pode ser estimada a partir de dados in vitro. Dosagens necessárias para obter a MEC dependerão de características individuais e da via de administração. Entretanto, ensaios ou bioensaios de HPLC podem ser utilizados para determinar concentrações de plasma.
Intervalos de dosagem também podem ser determinados utilizando valor MEC. As composições devem ser administradas utilizando um regime que mantém níveis de plasma acima da MEC por 10 - 90% do tempo, preferivelmente entre 30-90% e mais preferivelmente entre 50-90%.
Em casos de administração local ou absorção seletiva, a concentração local efetiva da droga pode não estar relacionada à concentração de plasma.
A quantidade de composição administrada pode ser dependente do sujeito em tratamento, do peso do sujeito, da gravidade da doença, do modo de administração e da decisão do médico que prescreve. Os compostos revelados aqui (por exemplo, o polímero conjugado e/ou o agente que o compreende) podem ser revelados para eficácia e toxicidade utilizando métodos conhecidos. Por exemplo, a toxicologia de um composto especifico, ou de um subconjunto dos compostos, dividindo certos grupos químicos, pode ser estabelecida pela determinação de toxicidade in vitro para uma linhagem de células, como uma linhagem de células mamífera, e preferivelmente humana. Os resultados de tais estudos prevêem freqüentemente a toxicidade em animais, como mamíferos ou mais especificamente, seres humanos. Alternativamente, a toxicidade de compostos específicos em um modelo de animal, como camundongos, ratos, coelhos ou macacos pode ser determinada utilizando métodos conhecidos. A eficácia de um composto específico pode ser estabelecida utilizando vários métodos reconhecidos, como métodos in vitro, modelos de animais ou experimentos clínicos com humanos. Modelos in vitro reconhecidos existem para quase toda classe de condição, incluindo, porém não limitado a câncer, doença cardiovascular, e várias disfunções imunes. Similarmente, modelos animais aceitáveis podem qer utilizados para estabelecer a eficácia de produtos químicos para tratar tais condições. Ao selecionar um modelo para determinar a eficácia do produto químico, o técnico especializado pode ser guiado pela condição da técnica para escolher um modelo apropriado, uma dose, e uma via de administração e regime. Evidentemente, experimentos clínicos com humanos também podem ser utilizados para determinar a eficácia de um composto em seres humanos.
As composições podem, se desejado, ser apresentadas em um pacote ou dispositivo de distribuição que pode conter uma ou mais formas de dosagem unitária contendo o ingrediente ativo. O pacote pode, por exemplo, compreender folha de plástico ou de metal, como um pacote de ampolas (blister). O pacote ou dispositivo de distribuição pode ser acompanhado por instruções para administração. O pacote ou o dispositivo de distribuição também pode ser acompanhado com um aviso associado ao recipiente em forma determinada por um órgão governamental que regula a fabricação, uso ou venda de produtos farmacêuticos, cujo aviso reflete a aprovação pelo órgão da forma da droga para administração humana ou veterinária. Esse aviso, por exemplo, pode ser a rotulação aprovada pela U.S. Food and Drug Administration para prescrição de drogas, ou a inserção aprovada de produto. Composições compreendendo um composto da invenção formulado em um transportador farmacêutico compatível também podem ser preparadas, colocadas em um recipiente apropriado e rotuladas para tratamento de uma condição indicada.
EXEMPLOS
Os exemplos a seguir são fornecidos para descrever adicionalmente as modalidades descritas aqui, e não limitar o escopo da invenção.
Materiais:
Sais de sódio poli-L-glutamato com diferentes pesos moleculares (pesos moleculares médios de 41.400 (PGA(97k)), 17.600 (PGA(44k)), 16.000 (PGA(32k)) e 10.900 (PGA(21k)) daltons com base em dispersão de luz de múltiplos ângulos (MALS)); 1,3-dicicloexil carbodiimida (DCC); cloridrato de N-(3-dimetilaminopropil)-N'- etilcarbodiimida (EDC); hidróxibenzotriazol (HOBt); piridina; 4-dimetilaminopiridina (DMAP); N,N'- dimetilformamida (DMF); acetato de gadolínio; clorofórmio; e bicarbonato de sódio foram adquiridos da Sigma-Aldrich Chemical company. 0 Poli-L-glutamato foi convertido em ácido poli-L-glutâmico utilizando solução de ácido clorídrico 2 Ν. Ácido trifluoroacético (TFA) foi adquirido da Bioscience. Omniscan™ (gadodiamida) foi adquirido da GE healthcare.
Cloridrato de L-ácido β-t-butil α-t-butil éster aspártico (H-Asp(OtBu)-OtBu.HCl), cloridrato de L-ácido di- t-butil éster glutâmico (H-Glu(OtBu)-OtBu.HCl) , a- éster benzila de ácido Ν-α-CBZ-L-glutâmico (Z-Glu-Obzl) foram adquiridos de Novabiochem (La Jolla, CA) . Paclitaxel foi adquirido da PolyMed (Houston, Texas). 3H-paclitaxel foi adquirido da Moravek Biochemicals, Inc. O corante de sulforodamina B para teste citotóxico de MTT (viabilidade de célula) foi adquirido da Molecular Imaging Products Company (Michigan). O produto químico p-NH2-Bn-DPTA-penta (tBu éster) foi adquirido da Macrocyclics (Dallas, Texas). Cadaverine Texas Red® (corante Texas Red-NH2) foi adquirido da Molecular Probe. Soro bovino foi adquirido da Sigma. Foi centrifugado em 10.000 rpm para remover qualquer matéria em partículas.
1H NMR foi obtido da Joel (400 MHz) , e tamanhos de partícula foram medidas por ZetalPals (Brookhaven Instruments Corporation). A química de microonda foi realizada na Biotage. Pesos moleculares de polímeros foram determinados por cromatografia por exclusão de tamanho (SEC) combinado com um detector de dispersão de luz de múltiplos ângulos (MALS) (Wyatt Corporation).
Condições de análise de SEC-MALS:
. sistema HPLC: Agilent 1200
. Coluna: Shodex Ssb 806m HQ
(limite de exclusão para Pullulan é 20.000.000, tamanho de partícula: 13 mícron, tamanho (mm) ID x comprimento: 8,0 x 300)
. fase móvel: 1xDPBS ou 1% LiBr em DPBS (pH 7,0) . fluxo: 1 ml/min
. detector MALS: DAWN HELEOS da Wyatt
. detector DRI: Optilab rEX da Wyatt
. viscosimetro on-line: ViscoStar da Wyatt
. software: ASTRA 5.1.9 da Wyatt
. concentração de amostra: 1-2 mg/ml
. volume de injeção: 100 μΐ
valor dn/dc de polímero: 0,185 foi utilizado na medição.
BSA foi utilizado como controle antes de passar as amostras efetivas.
Utilizando o sistema e condições descritas acima (doravante mencionado como sistema Heleos com detector MALS), o peso molecular médio dos polímeros de partida (pesos moleculares médios de sais de sódio de poli-L- glutamato de 41.400, 17.600, 16.000 e 10.900 daltons reportados por Sigma-Aldrich utilizando seu sistema com MALS) foram experimentalmente verificados como sendo 49.000, 19.800, 19.450 e 9.400 daltons, respectivamente.
O teor de paclitaxel em conjugados de paclitaxel- polímero foi estimado por espectrometria UV/Vis (Lambda Bio 40, PerkinElmer), com base em uma curva padrão gerada com concentrações conhecidas de paclitaxel em metanol (λ = 228 nm).
A síntese de conjugados de paclitaxel-poli-L- glutamato (PGA-PTX) foi realizada como reportado em literatura anterior. Vide Li e outros "Complete regression of well-established tumors using a novel water-soluble poly(L-glutamic acid)-paclitaxel conjugate." Câncer Research 1998, 58, 2404-2409, cujo teor é aqui incorporado a título de referência na íntegra. A quantidade de paclitaxel em PGA(97k)-PTX-20 e PGA(32k)-PTX-20, preparado a partir do ácido poliglutâmico com pesos moleculares médios de 49.000 e 19.450 daltons, respectivamente, foi quantificada por espectrometria UV em λ = 229 nm como 20% em peso para peso. Diminuindo a quantidade de paclitaxel, 10% em peso baseado em peso total foi obtido para PGA(97k)- PTX-10 do ácido poliglutâmico com pesos moleculares médios de 4 9.000 daltons.
EXEMPLO 1
Um poli (γ-L-aspartil-glutamina) foi preparado de acordo com o esquema geral ilustrado na figura 1 como a seguir:
Ácido poliglutâmico (0,75 g), peso molecular médio de 4 9.000 daltons baseado no sistema Heleos com detector MALS, foi adicionado parcialmente em 100 mL de diclorometano (DCM). DCC (8,7 mL, 1 M em DCM) foi adicionado e agitado por 20 minutos. DCM foi então removido por evaporação rotativa, e o resíduo foi dissolvido com DMF (80 mL). H-asp (OtBu) - (OtBu) (2,44 g) , piridina (4 nL) e DMAP (0,1 g) foram adicionados e a mistura da reação foi agitada em temperatura ambiente por 15 - 24 horas. A mistura da reação foi filtrada em uma solução de água ácida (500 mL, pH < 2 baseado em papel de pH) . Um precipitado branco se formou, e foi filtrado e lavado com água. O precipitado branco foi então dissolvido em acetona (100 mL). A solução foi filtrada através de um filtro de 0,2 μm, e a acetona foi removida por evaporação rotativa. A estrutura do polímero intermediário foi confirmada via 1H- NMR pela preseiiça do pico para o grupo O-tBu em 1,4 ppm.
O polímero intermediário foi tratado com ácido trifluoroacético a 95% (TFA) em DCM por 5-8 horas. O DCM foi então adicionado até se formar um precipitado. O solvente foi removido, e o resíduo foi lavado com mais DCM. O resíduo foi colocado a vácuo para remover o DCM. O resíduo foi dissolvido novamente em metanol e água e então passou por um processo de diálise utilizando celulose de semimembrana (recorte de peso molecular 10.000 daltons) em água de osmose reversa (4 trocas de água) durante a noite. Poli-(γ-L-aspartil-glutamina) era substancialmente opticamente transparente em água e com pH 7 após diálise. Poli-(γ-L-aspartil-glutamina) (1,2 g) foi obtido como pó branco após passar por um processo de liofilização. A presença do polímero foi confirmada via 1H-NMR pelo desaparecimento de um pico para o grupo O-tBu em 1,4 ppm.
EXEMPLO 2
Um ácido poli-(γ-L-aspartil-glutamina)-poli-L- glutâmico foi preparado de acordo com o esquema geral ilustrado na figura 2 como a seguir:
O ácido poliglutâmico com um peso molecular médio de 4 9.000 daltons baseado no sistema Heleos com detector MALS (0, 075 g) foi parcialmente dissolvido em DMF (3 mL) . DCC (130 mg), H-asp (OtBu)-(OtBu) (0,11 g) , piridina (200 μL) , e DMAP (0,010 g) foram então adicionados. A reação foi realizada utilizando um método de microondas a 1200C por 30 minutos. A reação foi então resfriada até a temperatura ambiente. A conclusão da reação foi acompanhada por monitoração do desaparecimento total de H-asp(OtBu) - (OtBu) utilizando coluna em camada fina (TLC, Rf em . acetato de etila = 0,4). Após término, a mistura da reação foi filtrada em uma solução de água ácida (150 mL, pH <2 baseado em papel de pH) . Um precipitado branco se formou e foi filtrado è lavado com água. 0 precipitado branco foi então dissolvido em acetona (50 mL). A solução foi filtrada em uma solução de bicarbonato de sódio (0,5 M) e sofreu diálise utilizando celulose de semimembrana (corte de peso molecular 10.000 daltons) em água de osmose reversa (4 trocas de água) durante a noite. O polímero de éster intermediário obtido era branco após ser passar por liofilização. A estrutura do polímero foi confirmada via 1H NMR pela presença de um pico para o grupo 0-tBu em 1,4 ppm.
O polímero intermediário foi tratado com ácido trifluoroacético a 95% (TFA) em DCM por 5 horas. DCM foi adicionado até se formar um precipitado. 0 solvente foi então removido, e o resíduo foi lavado com DCM adicional. O resíduo foi colocado a vácuo para remover o DCM. O resíduo foi dissolvido novamente em metanol e água e então sofreu diálise utilizando celulose de semimembrana (corte de peso molecular 10.000 daltons) em água de osmose reversa (4 trocas de água) durante a noite. 0 ácido poli-(γ-L- aspartil-glutamina)-poli-L-glutâmico (0,10 g) foi obtido como pó branco após ser liofilizado. A estrutura do polímero foi confirmada via 1H-NMR pelo desaparecimento do pico para o grupo 0-tBu em 1,4 ppm.
EXEMPLO 3
Um poli (γ-L-aspartil-glutamina) foi preparado de acordo com o esquema geral ilustrado na figura 3 como a seguir:
O sal de sódio poliglutamato (10,0 g) com um peso molecular médio de 4 9.000 daltons baseado no sistema Heleos com detector MALS, EDC (33,8 g), HOBt (15,9 g) e H- asp(OtBu) - (OtBu)-HCl (32,0 g) foram misturados em DMF (700 mL). A mistura da reação foi agitada em temperatura ambiente por 15-24 horas, e então derramada em uma solução aquosa (3 L). Um precipitado branco se formou, e foi filtrado e lavado com água. 0 polímero intermediário foi então liofilizado. A estrutura do polímero intermediário foi confirmada via 1H-NMR pela presença de um pico para o grupo O-tBu em 1,4 ppm. O polímero intermediário foi tratado com TFA (200 mL) por 5 horas. A seguir, o TFA foi parcialmente removido por evaporação rotativa. Água foi adicionada ao resíduo e o resíduo sofreu diálise utilizando celulose de semimembrana (corte de peso molecular 10.000 daltons) em água de osmose reversa (4trocas de água) durante a noite. Poli-(y-L- aspartil-glutamina) era transparente em água e com pH 7 após diálise. Poli-(γ-L-aspartil-glutamina) (15,0 g) foi obtido como pó branco após ser liofilizado. A estrutura do polímero foi confirmada através de 1H-NMR pelo desaparecimento do pico para o grupo O-tBu a 1,4 ppm. O peso molecular médio de poli-(γ-L-aspartil-glutamina) foi medido e verificado sendo ele de 99.400 daltons.
EXEMPLOS 3a-3b
Síntese de poli-(γ-L-aspartil-glutamina) a partir de sais de sódio de poliglutamato com diferentes pesos moleculares médios (19.800 e 9.400 daltons baseado no sistema Heloes com detector MALS) foi realizada utilizando o procedimento no Exemplo 3, o peso molecular médio dos polímeros resultantes de poli-(γ-L-aspartil-glutamina) foram medidos e verificados como sendo 39.700 e 17.700 daltons, respectivamente.
EXEMPLO 4
Um poli-(γ-L-glutamil-glutamina) foi preparado de acordo com o esquema geral ilustrado na figura 4 como a seguir:
O sal de sódio poliglutamato (0,40 g) tendo um peso molecular médio de 19.800 daltons baseado no sistema Heleos com detector MALS, EDC (1,60 g) , HOBt (0,72 g) , e H- glu (OtBu)-(OtBu)-HCl (1,51 g) foram misturados em DMF (30 mL) . A mistura da reação foi agitada em temperatura ambiente por 15-24 horas e então foi despejada em solução de água destilada (200 mL). Um precipitado branco se formou e foi filtrado e lavado com água. O polímero intermediário foi então liofilizado. A estrutura do polímero intermediário foi confirmada via 1H-NMR pela presença de um pico para o grupo O-tBu a 1,4 ppm.
O polímero intermediário foi tratado com TFA (20 mL) por 5-8 horas. O TFA foi então parcialmente removido por evaporação rotativa. Água foi adicionada ao resíduo e o resíduo sofreu diálise utilizando celulose de semimembrana (corte de peso molecular 10.000 daltons) em água de osmose reversa (4 trocas de água) durante a noite. A poli-(γ-L- glutamil-glutamina) era transparente em água e com pH 7 após diálise. A poli-(γ-L-glutamil-glutamina) (0,6 g) foi obtida como pó branco após ser liofilizada. A estrutura do polímero foi confirmada via 1H-NMR pelo desaparecimento do pico para o grupo O-tBu a 1,4 ppm. O peso molecular médio da poli-(γ-L-glutamil-glutamina) foi medida e verificada sendo de 38.390 daltons.
EXEMPLOS 4a-4c
A síntese de poli-(γ-L-glutaminl-glutamina) a partir de sais de sódio poli-L-glutamato com diferentes pesos moleculares médios (49.000, 19.450 e 10.900 baseado no sistema Heleos com detector MALS) foi realizada utilizando o procedimento do Exemplo 4. Os pesos moleculares dè seus polímeros poli-(γ-L-glutamil-glutamina) foram medidos, e verificados sendo de 110.800, 37.400 e 19.800 daltons, respectivamente.
Exemplo 5
Um ácido poli-(γ-L-glutamil-glutamina)-poli-L- glutâmico foi preparado de acordo com o esquema geral ilustrado na figura 5 como a seguir: O sal de sódio poliglutamato (0,50 g) tendo um peso molecular médio de 4 9.000 daltons baseado no sistema Heleos com detector MALS, EDC (0,26 g), HOBt (0,11 g) , e H- glu (OtBu)-(OtBu)-HCl (0,05 g) foram misturados em DMF (30 mL). A mistura da reação foi agitada em temperatura ambiente por 15-24 horas e foi despejada em uma solução de aquosa (500 mL) . Um precipitado branco se formou e foi filtrado e lavado com água. O polímero intermediário foi liofilizado. A estrutura do polímero intermediário foi confirmada via 1H-NMR pela presença de um pico para o grupo O-tBu a 1,4 ppm.
O polímero intermediário foi tratado com TFA (20 mL) por 5-8 horas. O TFA foi parcialmente removido por evaporação rotativa. Água foi adicionada ao resíduo e o 15 resíduo sofreu diálise utilizando celulose de semimembrana (corte de peso molecular 10.000 daltons) em água de osmose reversa (4 trocas de água) durante a noite. O ácido poli- (γ-L-glutamil-glutamina)-poli-L-glutâmico era transparente em água e com pH 7 após diálise. O ácido poli-(γ-L- glutamil-glutamina)-poli-L-glutâmico (0,25 g) foi obtido como pó branco após ser liofilizado. A estrutura do polímero foi confirmada via 1H-NMR pelo desaparecimento do pico para o grupo O-tBu a 1,4 ppm. O peso molecular médio da poli-(γ-L-glutamil-glutamina) foi medida e verificada sende de 57.400 daltons.
EXEMPLO 6
Um polímero conjugado mencionado aqui como PGA- 97-A-Texas Red foi preparado de acordo com o esquema geral ilustrado na figura 6 como a seguir:
A poli- (γ-L-aspartil-glutamina) peso molecular médio de 99.400 daltons (100 mg) foi parcialmente dissolvido em DMF (3 mL) . DCC anidro (130 mg), corante Texas Red-NH2 (15 mg), piridina (200 pL), e DiyiAP (10 mg) foram adicionados. A reação foi realizada utilizando um método de microonda a 120°C por 30 minutos. A reação foi então resfriada até a temperatura ambiente. A mistura da reação foi filtrada em solução de água ácida (200 mL, pH <2 baseado em papel de pH) . Um precipitado roxo se formou, e foi filtrado e lavado com água. O precipitado roxo foi então dissolvido em acetona (50 mL) . A solução foi filtrada em solução de bicarbonato de sódio (0,5 M) e sofreu diálise utilizando celulose de semimembrana (corte de peso molecular 10.000 daltons) em água de osmose reversa (4 trocas de água) durante a noite. O polímero PGA-97-A-Texas Red (80 mg) foi obtido como um sólido roxo após ser liofilizado.
EXMEPLO 7
Um polímero conjugado mencionado aqui como PGA- 97-A-DTPA foi preparado de acordo com o esquema geral ilustrado na figura 7 como a seguir:
A poli- (γ-L-aspartil-glutamina) com peso molecular médio de 99.400 daltons (100 mg) foi dissolvida em DMF (5 mL). A DCC (200 mg) foi então adicionada à solução. Uma solução de p-NH2~Bn-DTPA-penta-(éster tBu) (400 mg) em DMF (5 mL) foi também adicionada à mistura da reação. Piridina anidra (300 μL) e o catalisador DMAP (20 mg) foram então adicionados. A mistura de reação foi agitada e aquecida até 120°C por 30 minutos sob condições de microonda. A mistura da reação foi então resfriada até a temperatura ambiente, e um precipitado se formou. O precipitado foi filtrado, e o sobrenadante foi acidificado a um pH de aproximadamente 2 com ácido clorídrico diluído em água. A solução contendo o polímero intermediário sofreu diálise em água por 2 dias com membrana de celulose (corte de peso molecular 10.000 daltons) e o polímero intermediário foi liofilizado. A estrutura do polímero intermediário foi confirmada por 1H-NMR.
O polímero intermediário foi:tratado com TFA por 4 horas. O TFA foi então removido por evaporação rotativa. O resíduo foi dissolvido em água e a solução sofreu diálise em água com membrana de celulose (corte de peso molecular - 10.000 daltons). O polímero foi então liofilizado. A estrutura do PGA-97-A-DTPA foi confirmada por 1H-NMR.
EXEMBLO 8
Um polímero conjugado mencionado aqui como PGA- 97-A-DTPA-Gd (III) foi preparado de acordo com o esquema geral ilustrado na figura 8 como a seguir:
O PGA-97-A-DTPA obtido a partir do exemplo 7 foi tratado com acetato de Gd(III) em tampão por 4 horas. A solução obtida pela reação sofreu diálise em água com membrana de celulose (corte de peso molecular - 10.000 daltons) por 3 dias e liofilizada para obter o polímero (86 mg). A quantidade de Gd(III) foi quantificada por medição por espectrometria de emissão óptica com plasma acoplado indutivamente (ICP-OES). Verificou-se que a quantidade de Gd(III) presente era 7% em peso para peso do polímero baseado em padrões de Gadolínio ICP (Ricca Chemical Company, Arlington, Texas (no. Do cat. PGD1KN-500)).
EXEMPLO 9
Um polímero conjugado mencionado aqui como PGA- 97-A-10 foi preparado de acordo com o esquema geral ilustrado na f:.gura 9 como a seguir:
A poli-(γ-L-aspartil-glutamina) com peso molecular médio de 99.400 daltons (351 mg) foi parcialmente dissolvida em DMF (40 mL). DCC (120 mg) e paclitaxel (44 mg) foram adicionados, respectivamente à mistura. DMF (10 mL) e uma quantidade catalítica de DMAP (100 mg) foram então adicionados à mistura. A mistura da reação foi agitada em temperatura ambiente por 1 dia. A conclusão da reação foi verificada por TLC que confirmou a ausência de paclitaxel livre. A mistura foi despejada em clorofórmio (300 mL) e um precipitado se formou. O resíduo foi obtido após filtração e foi então dissolvido novamente em metanol. A precipitação foi induzida pela adição de uma solução clorídrica aquosa 0.2 N e o resíduo foi isolado após centrifugação a 10.000 rpm. O resíduo foi então dissolvido novamente em 0.5 M de solução de bicarbonato de sódio. A solução de polímero sofreu diálise em água deionizada utilizando uma membrana de celulose (corte 10.000 daltons) em água de osmose reversa (4 trocas de água) por 1 dia. Uma solução clara foi obtida e liofilizada. O PGA-97-A-10 (340 mg) foi obtido e confirmado por 1H NMR. O teor de paclitaxel em PGA-97-A-10 foi determinado por espectrometria UV como 10% em peso para peso. A ausência de paclitaxel livre foi também confirmada por TLC.
EXEMPLO 10
Um polímero conjugado mencionado aqui como PGA- 97-A-20 foi preparado de acordo com o esquema geral ilustrado na figura 9 como a seguir:
A poli-(γ-L-aspartil-glutamina) com peso molecular médio de 99.400 daltons (750 mg) foi parcialmente dissolvido em DMF (50 mL). EDC (450 mg) e paclitaxel (210 mg) foram adicionados, respectivamente, à mistura. DMAP (100 mg), atuando como um catalisador, foi adicionado à mistura. A mistura da reação foi agitada em temperatura ambiente por 1 dia. A conclusão da reação foi verificada por TLC. A mistura foi derramada em uma solução de ácido clorídrico aquosa 0.2 N (300 mL). Um precipitado se formou e foi coletado após centrifugação em 10.000 rpm. O resíduo foi então dissolvido novamente em uma solução de bicarbonato de sódio 0.5 Μ. A solução de polímero sofreu iálise em água deionizada utilizando uma membrana de celulose (corte 10.000 daltons) em água de osmose reversa (4 trocas de água) por 1 dia. Uma solução clara foi obtida e liofilizada. O PGA—97-A-20 (700 mg) foi obtido e a estrutura confirmada por 1H NMR. O teor de paclitaxel em PGA-97-A-20 foi determinado por espectrometria UV como 20% em peso para peso.
EXEMPLOS 1Oa-IQb
A síntese de polímeros conjugados mencionados aqui como PGA-44-A-20 e PGA-21-A-20 a partir de polímeros de poli-(γ-L-aspartil-glutamina) com pesos moleculares médios de 39.700 e 17.700 daltons, respectivamente, foi realizada utilizando o procedimento do Exemplo 10. O teor de paclitaxel nos polímeros foi determinado por espectrometria UV como 20% em peso para peso.
EXEMPLO 10c
A síntese de um polímero conjugado mencionado aqui como PGA-44-A-19 a partir da poli-(γ-L-aspartil- glutamina) com peso molecular médio de 39.700 foi realizada utilizando o procedimento do Exemplo 10, com uma modificação da adição de uma mistura de paclitaxel e 3H- paclitaxel em vez da adição apenas do paclitaxel. 0 teor de paclitaxel no polímero foi determinado por espectrometria UV como 19% em peso para peso.
EXEMPLO 11
Um polímero conjugado mencionado aqui como PGA- 97-G-20 foi preparado de acordo com o esquema geral ilustrado na figura 10 como a seguir:
A poli-(γ-L-glutamil-glutamina) com peso molecular médio de 110.800 daltons (1,0 g) foi parcialmente dissolvida em DMF (55 mL) . EDC (600 mg) e paclitaxel (282 mg) foram adicionados, respectivamente, à mistura. DMAP (300 mg), atuando como um catalisador, foi adicionado na mistura. A mistura da reação foi agitada em temperatura ambiente por 1 dia. A conclusão da reação foi verificada por TLC. A mistura foi derramada em solução de ácido clorídrico 0.2 N diluída (300 mL). Um precipitado se formou e foi coletado após centrifugação a 10.000 rpm. O resíduo foi então dissolvido novamente em solução de bicarbonato de sódio 0.5 Μ. A solução de polímero sofreu diálise em água deionizada utilizando uma membrana de celulose (corte 10.000 daltons) em água de osmose reversa (4 trocas de água) por 1 dia. Uma solução clara foi obtida e liofilizada. O PGA-97-A-20 (1,1 g) foi obtido e confirmado por 1H NMR. O teor de paclitaxel em PGA-97-G-20 foi determinado por espectrometria UV como 20% em peso para peso.
EXEMPLOS 11a-11c
A síntese de polímeros conjugados mencionados aqui como PGA-44-G-20, PGA-32-G-20 e PGA-21-G-20 a partir 20 de polímeros de poli-(-γ-L-glutamil glutamina) com pesos moleculares médios de 38.390, 37.400 e 19.800 daltons, respectivamente, foi realizada utilizando o procedimento do exemplo 11. O teor de paclitaxel em cada um dos polímeros foi determinado por espectrometria UV como 20% em peso para peso. Ao aumentar a quantidade de paclitaxel, um carregamento mais elevado de paclitaxel foi obtido. Por exemplo, o PGA-32-G-40 foi preparado a partir de polímeros de poli-(γ-L-glutamil-glutamina) tendo um peso molecular médio de 37.400 daltons e utilizando o procedimento do Exemplo 11. O teor de paclitaxel foi determinado por espectrometria UV e verificou-se ser 40% em peso para peso, Exemplos 12a-12c
A síntese de polímeros conjugados mencionados aqui como PGA-97-G-24, PGA-32-G-19, PGA-21-G-19 a partir de polímeros poli-(γ-L-glutamil-glutamina) com pesos moleculares médios de 110.800, 37.400 e 19.800 daltons, respectivamente, foi realizada utilizando o procedimento no Exemplo 11, com uma modificação de adição de uma mistura de paclitaxel e 3H-paclitaxel em vez da adição apenas de paclitaxel. O teor de paclitaxel em PGA-97-G24, PGA-32-G- 19, PGA-21-G-19 foi determinado por espectrometria UV como 24%, 19%, e 19%, em peso para peso, respectivamente.
EXEMPLO 13
Síntese de C2'-PTX-Glu protegido e C7-PTX-qlu protegido Z-Glu-Obzl (2,6 g), paclitaxel (2,0 g) , EDC (1,5 g) e DMAP (300 mg) foram misturados em DMF (20 mL) e agitados por 15 horas. A medição por TLC mostrou que não restou paclitaxel livre na mistura. A mistura foi então derramada em 0.2 N de ácido clorídrico aquoso (100 mL) e produto orgânico foi extraído em acetato de etila (duas vezes x 50 mL) . As fases orgânicas foram combinadas e lavadas com 0.5 M de solução de bicarbonato de sódio (100 mL) . A fase orgânica foi então seca com anidro de sulfato de sódio. 0 acetato de etila foi removido por evaporação rotativa, e os produtos foram purificados por cromatografia de sílica de gel (hexano: acetato de etila, 1:1). 1H NMR confirmou que os produtos resultantes eram C2'-PTX- protegido (2,2 g) e C7-PTX-glu protegido (0,42 g).
Exemplo 13a
Síntese de C2'-PTX-Glu
<formula>formula see original document page 74</formula>
O C2'-PTX-Glu protegido (2,2 g) e 10% de Pd/C (0,20 g) foram agitados em metanol desoxigenado (150 mL) . Hidrogênio gasoso foi introduzido utilizando um balão. A reação foi hidrogenada por quatro horas. O TLC verificou que a reação foi até a conclusão. A solução foi filtrada através de um filtro de 0,2 μm. A solução era clara e o metanol foi removido por evaporação rotativa. 0 produto bruto foi purificado por método de HPLC de fase reversa utilizando gradiente de água e acetonitrila. O C2'-PTX-Glu (600 mg) foi obtido após purificação por HPLC e liofilizada, e o produto foi confirmado por LC-MS. 0 resultado é mostrado na figura 11. O C2'-PTX-glu tinha um tempo análise por HPLC de aproximadamente 32 minutos e um tempo de análise de LC-MS de aproximadamente 6,2 minutos.
Exemplo 13b
Síntese de C7-PTX-Glu
<formula>formula see original document page 75</formula>
O C7—PTX-Glu protegido (250 mg) e 10% de Pd/C (0,20 g) foram agitados em uma solução de metanol desoxigenado (150 mL). Hidrogênio gasoso foi introduzido na solução utilizando um balão, e a reação foi hidrogenada por quatro horas. Após o término da reação como mostrado por medição TLC, a solução foi filtrada através de um filtro de 0,2 μm. A solução era clara e o metanol foi removido por evaporação rotativa. 0 produto bruto foi adicionalmente purificado por HPLC de fase inversa utilizando gradiente de água e acetonitrila. O C7-PTX-Glu (30 mg) foi obtido após purificação por HPLC e liofilizado, e o produto foi confirmado por LC-MS. O resultado é mostrado na figura 11. O C7-PTX-glu tinha um tempo de análise de HPLC de aproximadamente 35 minutos e um tempo de análise de LC-MS de aproximadamente 6,4 minutos.
Exemplo 14
O polímero conjugado mencionado aqui como PLGA- 97-G-27 foi preparado de acordo com o esquema geral ilustrado na figura 12 como a seguir:
O ácido poli-L-glutâmico (210 mg) foi dissolvido em DMF (10 mL). ECC (65% por raol) e NHS (65% por mol) foram adicionados à mistura e foram agitados por 15 horas. Uma solução de C2'-PTX-Glu (105 mg) em DMF (2 mL) foi então adicionado à mistura. Em seguida, uma solução de bicarbonato de sódio 0.5 M (3 mL) foi adicionada. A mistura da reação foi agitada por 3 horas, e então derramada em uma solução de ácido clorídrico 0.2 N diluída (300 mL) . Um precipitado se formou e foi coletado após centrifugação a 10.000 rpm.
O resíduo foi então dissolvido novamente em uma solução de bicarbonato de sódio 0.5 Μ. A solução de polímero sofreu diálise em água desionizada utilizando uma membrana de celulose (corte 10.000 daltons) em água de osmose reversa (4 trocas de água) por 1 dia. Uma solução clara foi obtida e liofilizada. O produto resultante era PGA-97-G-27 (250 mg) , e foi confirmado por 1H NMR. O teor de paclitaxel em PGA-97-G-27 foi determinado por espectrometria UV como 27% em peso para peso. Exemplo 15
Síntese de PGA-97-G-Doxorubicina
<formula>formula see original document page 77</formula>
A poli- (γ-L-aspartil-glutamina) (70 mg), doxorubicina (30 mg), EDC (50 mg), HOBt (15 mg) foram dissolvidos em DMF (4 mL). A mistura foi colocada em um microonda a 120°Ç por 10 minutos, e então foi derramada em uma solução de 0.2N ácido clorídrico. Um precipitado se formou e foi coletado. O resíduo foi dissolvido novamente em uma solução de bicarbonato de sódio 0.5 M e sofreu diálise em água desionizada utilizando uma membrana de celulose (corte 10.000 daltons) em água de osmose reversa (4 trocas de água) por 1 dia. Uma solução vermelha clara foi obtida e liofilizada. A estrutura do produto resultante de PGA-97-G-Doxorubicina (80 mg) foi confirmada por 1H NMR.
Exemplo 16
Sintese de PGA-97-G-Camptotecina
<formula>formula see original document page 78</formula> Poli-(γ-L-aspartil-glutamina) (70 mg), glicil- camptotecina (30 mg), EDC (50 mg), HOBt (15 mg) foram dissolvidos em DMF (4 mL) . A mistura foi aquecida em um microonda a 120°C por 10 minutos. A mistura foi derramada em DCM (150 mL), e um precipitado se formou. 0 resíduo foi sonifiçado em uma solução de ácido clorídrico 0.2 N diluído por 15 minutos. 0 sólido resultante foi filtrado, lavado com água destilada, e então liofilizado. O PGA-97-G- camptotecina foi coletado como sólido amarelo claro (50 mg).
Exemplo 17
Solubilidade
A solubilidade de vários polímeros foi testada em diferentes níveis de pH e comparada com um controle de ácido Poli-L-glutâmico (PGA-19.800), peso molecular médio de 19.800 daltons. Os polímeros testados foram Poli-(y- glutamil)-poli-*L-glutamina (PGPG-19.800) , com peso molecular médio de 19.800 daltons; Poli-(γ-glutamil)-poli- L-glutamina (PGPG-37.400) com peso molecular médio de 37.400 daltons; poli-L-glutamato-paclitaxel-20% (PGA(32k)- PTX-20), que foi preparado a partir do polímero de partida PGA-19.800 e tendo um teor de paclitaxel de 20% em peso por peso; o PGA-21-G-20, que foi preparado a partir de um polímero de partida de poli-(γ-glutamil)-poli-L-glutamina- 19.800 e tendo um teor de paclitaxel de 20% em peso por peso; e PGA-32-G-20, que foi preparado a partir de um polímero de partida de poli- (γ-glutamil) -poli-L-glutamina- 37.400 e tendo um teor de paclitaxel de 20% em peso por peso.
Cada polímero (5 mg) foi adicionado a tampão de pH (1 mL) e a mistura foi sonif içada por 2 minutos. A seguir a mistura foi assentada em temperatura ambiente por 30 minutos. A solubilidade foi observada a olho e registrada em escala de 1 a 10, onde 1 é altamente insolúvel, 5 é uma suspensão turva e 10 é uma solução altamente clara. Os resultados são mostrados na Tabela 1 que se segue.
Tabela 1 - solubilidade
<table>table see original document page 80</column></row><table>
Exemplo 18a
Cultura e preparação de células
Células B16FO foram adquiridas da ATCC (CRL-6322, ATCC American1Type Culture Collectiçn, Rockville, MD) e foram cultivadas em meio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) com soro bovino fetal a 10% e 100 unidades/mL de penicilina. As células foram cultivadas a 37°C e em ambiente de 5% de CO2. 0 meio de cultura foi removido e descartado. As células foram enxaguadas com Solução de tampão de fosfato Dulbecco (DPBS), uma solução de ácido de tripsina-etilenodiaminetra-acético (EDTA) (0,5 ml) foi adicionada e as células foram observadas sob um microscópio invertido para se certificar de que foram dispersas. 0 meio de crescimento completo (6,0 a 8,0 ml) foi adicionado, e as células foram aspirados por pipetagem suave. A suspensão de célula em alíquotas apropriadas foi transferida para novas placas de cultura. As células cresceram a 37°C a 5% de CO2 por 24 horas antes de experimentos adicionais. Exemplo 18b
Estudos de absorção celular in vitro O PGA-97-A-Texas Red e o corante Texas Red (TR) foram separadamente dissolvidos em DPBS. As duas soluções contendo o corante foram adicionadas às células na concentração final de 0,1 μΜ a 10 μΜ. As células com os compostos foram incubados a 37°C por 8-24 horas, depois que as células foram lavadas 3 vezes com DPBS. As células tratadas foram examinadas sob um microscópio de fluorescência OLYMPUS, e os comprimentos de onda de excitação e emissão foram medidos a 591 e 612 nm, respectivamente. Os resultados mostram que as células absorveram o corante Texas Red a partir do PGA-97-A-Texas Red porém não a partir do Texas Red sozinho.
Três recipientes de amostras contendo aproximadamente o mesmo número de células de melanoma B16F0 foram incubados com PGA-97-A-Texas Red em 1 μΜ, PGA-97-A- Texas Red em 0,1 μΜ, e Texas Red sozinho a 10 μΜ, respectivamente por 24 horas. Fotografias de absorção celular in vitro de cada recipiente foram tiradas com a câmara em um sistema de microscópio de fluorescência Olympus. Na fotografia da amostra com PGA-97-A-Texas Red em 1 μΜ, aproximadamente 30% das células eram vermelhas. Na fotografia da amostra com PGA-97-A-Texas Red em 0,1 μΜ, aproximadamente 10% das células eram vermelhas. Na fotografia da amostra Texas Red sozinho em 10 μΜ, 0% das células eram vermelhas. Esses resultados mostram que as células absorvem corante a partir do PGA-97-A-Texas Red, porém não absorvem corante a partir do Texas Red sozinho. O polímero conjugado é eficaz para liberação de droga intercelular. Exemplo 18c
A absorção celular também foi confirmada por microscopia confocal (Olympus FV1000) . Os núcleos das células foram coloridas com Hoechst 33342 por 5-20 minutos, lavados com DPBS 2-3 vezes, e observados sob um microscópio confocal de varredura a laser. Os comprimentos de onda de excitação e emissão de Hoechst 33342 foram medidos em 405 e 461 nm, respectivamente. 0 Texas Red (TR) foi excitado com um laser 543 nm, e detectado em 615 nm sob o ambiente de 5% em CO2 a 37°C. Os resultados mostram que o corante Texas Red a partir do PGA-9 7-A-Texas Red foi absorvido por células B16F0 após 24 horas de exposição. O corante Texas red do PGA-97-A-Texas Red foi encontrado em citoplasma e excluído do núcleo.
Fotografias mostrando absorção celular in vitro do PGA-97-A Texas Red a 1 μΜ de microscopia confocal (Olympus FV100) foram tiradas para comparar absorção no citoplasma e absorção no núcleo. As fotografias mostram que o PGA-97-A-Texas Red foi absorvido por células B16F0 após 24 horas de exposição. PGA-97-A-Texas Red foi encontrado em citoplasma e excluído do núcleo.
Exemplo 19
Modelo de tumor singênico
Animais: camundongos nu/nu, fêmeas, de 6-8 semanas (22-25 g) . Tumores solitários foram produzidos por injeção de 2xl05 de células de melanoma de murino (B16F0) na coxa direita por via subcutânea. 5-7 dias após quando o tumor atingiu aproximadamente 500 mm3, o PGA-97-A-Texas Red ou corante Texas Red foi injetado por via intravenosa no tumor. Exemplo 20
PGA-97-A-Texas Red ou administração de TR e seção de criostato
O PGA-9 7-A-Texas Red e o Texas Red foram dissolvidos separadamente em DPBS e foram filtrados através de um filtro de 0,2 μm antes de serem administrados aos animais. 100 μl do PGA-97-A-Texas Red (carga de TR em 2,5%) ou do Texas Red em 0,1-10 mM foram injetados por via intravenosa no tumor usando o modelo de tumor singênico do Exemplo 19. Os tumores foram dissecados, incorporados sob temperatura ótima de corte e congelados em nitrogênio liquido. Seções de criostato (6-15n) foram feitas e foram fixas com paraformaldeído a 4% com 0.03 M de sacarose em gelo por 10-30 min. As seções foram lavadas 2 vezes com DPBS, coloridas com Hoechst 33342 (1μg/ml) por 10 minutos, e lavadas novamente com DPBS. As seções foram então montadas com um meio fluorescente (DakoCytomation) e cobertas com uma laminula. As seções de criostato do tum<pr foram observadas sob microscopia confocal de varredura a 20 laser. As imagens mostraram que corante Texas red do PGA- 97-A-Texas Red acumulou nas células de tumor in vivo após 24 horas de administração intravenosa do PGA-97-A-Texas Red porém não com o corante Texas Red sozinho.
Foram tiradas as fotografias da seção transversal de criostato de absorção de tecido de tumor in vivo do PGA- 97-A-Texas Red e do corante Texas Red sozinho. Para cada uma, três seções transversais diferentes foram tiradas para um total de seis imagens. Três fotografias das seções transversais diferentes do corante Texas Red sozinho foram observadas como verde, laranja-amarelo, e essencialmente preto. Três fotografias de seções transversais diferentes do PGA-97-A-Texas Red foram observadas como verde, amarelo- laranja e um pouco de área vermelha. 0 corante Texas Red do PGA-97-A-Texas Red foi observado em tecidos tumorais em uma das fotografias. Por outro lado, o corante Texas Red não foi observado na fotografia similar de Texas Red sozinho.
Esses resultados mostram que o corante Texas Red do PGA-97- A-Texas Red acumulou nas células tumorais in vivo após 24 horas de administração intravenosa do PGA-97-A-Texas Red, porém não com corante Texas Red sozinho.
Adicionalmente, o corante Texas Red do PGA-97-A- Texas Red poderia ser também visto nas células endoteliais ao longo do vaso sangüíneo do tumor. Fotografias adicionais foram tiradas de outra seção transversal do criostato do tecido tumoral, Um corante vermelho foi observado ao longo do vaso sangüíneo após 24 horas da administração intravenosa na cauda de veia, do PGA-97-A- Texas Red. Os resultados mostram que o PGA-97-A Texas Red poderia ser visto nas células endoteliais ao longo do vaso sangüíneo tumoral.
Exemplo 21
Estudos de MTT de citotoxicidade in vitro Polímeros conjugados descritos aqui contendo paclitaxel foram avaliados em relação ao seu efeito sobre a proliferação de células de melanoma B16F0 em várias concentrações diferentes da droga. O ensaio MTT citotóxico foi realizado como reportado em Monks e outros JNCI 1991, 83, 757-7 66, que é pelo presente incorporado a título de referência na íntegra. 0 PGA-44-A-20 foi preparado como nos exemplos 10a, a partir de poli-(γ-L-aspartil-glutamina) tendo um peso molecular médio de 39.700 daltons baseado no sistema Heleos com detector MALS, e a percentagem em peso de paclitaxel no polímero foi de 20% em peso por peso. O PGA-97-A-20 foi preparado como no Exemplo 10, a partir de poli-(γ-L-aspartil-glutamina) tendo um peso molecular médio de 99.400 daltons baseado no sistema Heleos com detector MALS, e a percentagem em peso de paclitaxel no polímero foi de 20% em peso por peso. 0 PGA(97k) -PTX-20 foi utilizado como o polímero de controle desse exemplo e foi preparado de acordo com o procedimento da literatura anterior a partir de ácido poli-L-glutâmico tendo peso molecular médio de 49.000 daltons baseado no sistema Heleos com detector MALS, a percentagem em peso de paclitaxel no polímero é de 20% em peso por peso (vide Li e outros, "Complete Regression of well-established tumors using a novel water soluble poly(L-glutamic acid)-paclitaxel conjugate." Câncer Research 1998, 58, 2404-2409). Os resultados são mostrados na figura 13. A viabilidade das células de melanoma diminuiu com a concentração aumentada de droga como mostrado na figura 13. Esses resultados indicam que o PGA- 44-A-20 e o PGA-97-A-20 são agentes anticâncer eficazes.
Exemplo 22
Estudos de MTT de citotoxicidade in vitro
Um polímero conjugado contendo paclitaxel foi comparado com um polímero de controle, um polímero que não continha paclitaxel, e com um controle de Taxol sem polímero para visualizar seu efeito sobre a proliferação de células de melanoma B16F0 em várias concentrações diferentes da droga. 0 ensaio de MTT citotóxico foi realizado como reportado em Monks e outros JNCI 1991, 83, 757-766. 0 PGA-97-A-10 foi preparado como no Exemplo 9, a partir do poli-(γ-L-aspartil-glutamina) com peso molecular médio de 99.400 daltons baseado no sistema Heleos com detector MALS,ρ e a percentagem em peso de paclitaxel no polímero foi de 10%. 0 PGA (97k)-PTX-IO utilizado como o polímero de controle desse exemplo foi preparado de acordo com a literatura anterior (Li e outros "Complete Regression of well-established tumors using a novel water soluble poly(L-glutamic acid)-paclitaxel conjugate." Câncer Research 1998, 58, 2404-2409), a partir do ácido poli-L- glutâmico com peso molecular médio de 49.000 daltons baseado no sistema Heleos com detector MALS, a percentagem em peso de paclitaxel no polímero é de 10%. O polímero não contendo paclitaxel era sal de sódio poli (γ-L-aspartil- glutamina).
Os resultados são mostrados na figura 14. 0 polímero de sal de sódio não tendo droga antitumor teve pouco efeito sobre a viabilidade da célula de melanoma. Adicionalmente, o PGA-97-A-10 foi comparado favoravelmente com o polímero de controle contendo a droga antitumor. Como mostrado pela figura 14, o PGA-97-A-10 atua como um agente anticâncer eficaz.
Exemplo 23
Animais e modelos tumorais para estudos farmacocinéticos
Camundongos sem pêlo (6-7 semanas de idade, peso corporal 25-30 gramas, fêmeas) foram adquiridos de Charles River Lab (Willington, MA) . Linhagens de células B16F0 foram adquiridas da ATCC (CRL-6322, ATCC Amiercan Type Culture Collection, Rockville, MD). As células B16F0 foram cultivadas em DMEM suplementado com soro bovino fetal a 10%, 2 μΜ de Glutamina, ImM de aminoácidos não essenciais, 1 mM de piruvato de sódio, lOOU/ml de penicilina e 100 ug/ml de estreptomicina. As células B16F0 colhidas a partir de cultura de tecido foram contadas e suspensas novamente até uma concentração de 5 χ IO6 por mL. Utilizando uma seringa TB, 0,4 mL (um total de 2 χ IO6 células) foi administrado via injeção subcutânea em cada camundongo. Quatro tumores foram inoculados por animal no ombro direito, ombro esquerdo, quadril direito, e quadril esquerdo. Exemplo 23a
No ponto quando o volume médio do tumor da população total de camundongos do Exemplo 23 tinha atingido 200-300 mm3 (6-8 mm de diâmetro), cada animal com tumor recebeu uma única injeção bolo IV de 3H-Taxol (controle) ou PGA-44-A-19 via uma cauda de veia.
PGA-44-A-19 foi preparado como no Exemplo 10c, a partir de poli (γ-L-aspartil-glutamina) com um peso molecular médio de 39.700 daltons baseado no sistema Heleos com detector MALS, e a percentagem em peso de paclitaxel no polímero foi de 19% em peso por peso. 0 controle para esse exemplo foi feito pelo Taxol. A dose de 3H-Taxol livre (controle) e do PGA-44-A-19 foi de 20 mg de paclitaxel equivalentes/kg. Para cada droga, grupos de 4 camundongos foram anestesiados em vários pontos de tempo (cada unidade é em horas): 0 (isto é, tão rapidamente quanto possível após a injeção IV), 0, 083, 0,25, 1, 0, 2, 0, 4, 0, 8, 0, 48, 72, 96, 120 e 144. Uma coleta de 0,5 ml de sangue obtido por punção cardíaca ou retro-orbital foi feita em tubos heparinizados. Posteriormente, os camundongos foram sacrificados antes de se recuperar da anestesia. As amostras de sajigue de cada camundongo foram centrifugadas em 11.000 rpm. O plasma sobrenadante (0,2 - 0,3 mL) a partir das amostras de sangue foi coletado e transferido para um novo frasco. 0,1 mL do plasma de cada amostra foi separadamente transferido para um novo frasco de 10 mL, e uma solução de cintilação líquida (5 mL) foi adicionada ao frasco. O teor de paclitaxel foi analisado utlizando um sistema de contagem LS6500 de cintilação líquida (Beckman) e calculado a partir da curva padrão de cada amostra. Os resultados são mostrados na figura 15. A concentração de paclitaxel de PGA-44-A-19 permaneceu muito mais elevada durante um período mais longo de tempo. Esses resultados indicara que o paclitaxel com PGA-44-A-19 tem eficácia em mais longo prazo em circulação de sangue do que com Taxol sozinho.
Exemplo 24
No ponto em que o volume médio de tumor da população inteira de camundongos do Exemplo 23 tinha atingido 200-300 mm3 (6-8 mm de diâmetro), cada animal com tumor (camundongos nu/nu sem pêlo) recebeu uma injeção de bolo IV única de 3H-Taxol (controle) ou de PGA-44-A-19 via uma cauda de veia.
0 PGA-44-A-19 foi preparado como no exemplo 10c, a partir de poli (γ-L-aspartil-glutamina) com peso molecular médio de 39.700 daltons baseado no sistema Heleos com detector MALS, e a percentagem em peso de paclitaxel no polímero foi de 19%. A dose de 3H-Taxol livre (controle) e de PGA-44-A-19 foi de 20 mg de paclitaxel equivalentes/kg. Para cada droga, grupos de 4 camundongos foram anestesiados em vários pontos de tempo (cada unidade está em horas): 0 (isto é, tão rapidamente quanto possível após a injeção IV), 0,083, 0,25, 1,0, 2,0 4,0, 8,0 48, 72, 96, 120 e 144. Tumores dos dois quadris e dos dois ombros foram colhidos independentemente. Posteriormente, os camundongos foram sacrificados antes de se recuperar da anestesia. Aproximadamente 80-180 mg de cada tumor foi colocado em um frasco de cintilação, e o tumor foi digerido com Soluene (solubilizador de tecido) (1 mL). Em seguida, 0,1 mL de tecido digerido foi transferido para um frasco de 10 mL, e um coquetel de cintilação líquido (5 mL) foi adicionado ao frasco. 0 conteúdo de paclitaxel foi analisado utilizando um sistema de contagem LS6500 de cintilação líquido (Beckman) e calculado a partir da curva padrão de cada amostra. 0 PGA-44-A-19 foi comparado com o Taxol controlador. Os resultados são mostrados na figura 16. 0 acúmulo tumoral de paclitaxel de PGA-44-A-19 permaneceu muito mais elevado durante um período de tempo mais longo. Esses resultados indicam que o paclitaxel do PGA-44-A-19 melhorou o acúmulo em tumores em comparação ao Taxol sozinho.
Exemplo 25
Animais e modelos tumorais para estudos de eficácia in vivo
Camundongos sem pêlo (6-8 semanas de idade, peso corporal 21-25 gramas, machos) foram adquiridos de Charles River Lab (Willington, MA) . Células estáveis B16-F0-EGFP foram mantidas em uma cultura de células cultivada em DMEM suplementado com Soro bovino a 10%, 100 U/ml de penicilina e 100 de μg/ml de estreptomicina. As células foram divididas 48 horas antes da inoculação de modo que estavam em um crescimento de fase Iog após serem colhidas. As células foram colhidas a partir da cultura de tecido utilizando tripsina-EDTA e o número de células viáveis foi determinado por contagem em um hemocitômetro na presença de tripano azul. As células foram suspensas até uma concentração de 5xl06 por ml em um meio DMEM sem soro. A suspensão de células tumorais foi inoculada utilizando uma seringa de insulina de 1 cm3 em uma concentração de 5 χ IO6 por ml sobre cada ombro e cada quadril por injeção de OfI ml de célula tumoral em suspensão (4 sitios/camundongo).
No dia da inoculação do tumor, os camundongos foram seqüencialmente colocados em um dos 6 grupos e foram alojados 3 camundongos em uma gaiola com um número total de 12 gaiolas. Cada camundongo foi perfurado na orelha sob anestesia no momento da inoculação tumoral de modo que poderia ser exclusivamente identificado durante todo o experimento. Cada gaiola foi rotulada com a droga, dose de droga administrada aos animais que continha, e o número de animais que continha.
Exemplo 25a
A toxicidade de perda de peso em uma dose de tolerância máxima (MTD) de polímeros feitos de acordo com os Exemplos 11a-11c foi medida. A MTD é definida aqui como a dose que produz uma perda máxima de peso corporal de 15% em 2 semanas. 0 PGA-21-G-20 e o PGA-32-G-20 foram preparados como revelado nos Exemplos Ilc e 11b, respectivamente, a partir dos polímeros poli(y-L- glutaminil-glutamina) de partida com peso molecular médio de 19.800 e 37.400 daltons, respectivamente, baseado no sistema Heleos com detector MALS, e a percentagem em peso de paclitaxel em cada um dos polímeros foi de 20%. 0 PGA- 21-G-20 e o PGA-32-G-20 foram dissolvidos em solução salina em 50 mg por mL. A droga anticâncer de controle para esse exemplo foi Abraxane, que é aprovada pela FDA como uma droga anticâncer. A solução salina foi também utilizada como controle negativo sem droga anticâncer. A quantidade efetiva de droga injetada foi determinada a partir do peso corporal de cada animal. A primeira dose de droga foi dada ao camundongo quando o tamanho médio do tumor da população inteira de camundongos atingiu aproximadamente 15 a aproximadamente 50 mm3 (o tamanho do tumor foi estimado a partir da fórmula (w2 χ l)/2 onde "1" é o diâmetro mais longo do tumor e é o diâmetro perpendicular ao diâmetro mais longo medido em milímetros). Os camundongos receberam 2 doses de droga nos dois dias consecutivos através de injeção na cauda de veia administrada sem anestesia. As soluções de matéria foram preparadas frescas no dia da injeção. As soluções de matéria de droga foram tiradas em uma seringa de 1 cm3 e injetada por via intravenosa. Os camundongos foram pesados até o decigrama mais próximo. Camundongos nu/nu sem pêlo receberam injeções com quantidades de dosagem mais elevadas tanto de PGA-21-G-20 em uma dose de 175 mg/kg como de PGA-32-G-20 em uma dose de 150 mg/kg comparado com Abraxane em dose de 100 mg/kg de paclitaxel equivalente. A mudança de peso corporal (%) após tratamento de cada droga foi independentemente observada e registrada com o passar do tempo (dias). Os resultados são mostrados na figura 17. 0 PGA-21-G-20 mostra pouca perda de peso corporal em uma dose muito mais elevada. O PGA-32-G-20 mostrou uma perda de peso corporal comparável com Abraxane em lima dosagem muito mais elevada. Esses resultados indicam que polímeros preferidos da presente invenção que são conjugados com drogas anticâncers são menos tóxicos para os camundongos.
Exemplo 26
Estudos de eficácia in vivo
Os efeitos antitumor do PGA-21-G-20, do PGA-32-G- 20 e do Abraxane, na dose de tolerância máxima (MTD) em tumores de melanoma B16F0-EGF em camundongos nu/nu sem pêlo, como descrito no Exemplo 25 com o passar do tempo com solução salina como controle negativo, foram medidos. 0 PGA-21-G-20 e o PGA-32-G-20 foram dissolvidos em solução salina em 50 mg por mL. A droga anticâncer de controle para esse exemplo era Abraxane, que é aprovada pela FDA como uma droga anticâncer. A solução salina foi utilizada como outro elemento de controle sem droga antitumor. A quantidade efetiva de droga injetada foi determinada a partir do peso corporal de cada animal. A primeira dose de droga foi dada ao camundongo quando o tamanho médio do tumor da população inteira de camundongos no estudo atingiu 15 a 50 mm3. Os camundongos receberam 2 doses de droga nos dois dias consecutivos via cauda de veia administradas por via intravenosa sem anestesia. As soluções de matéria foram preparadas frescas no dia da injeção. As soluções de matéria de droga foram tiradas em uma seringa de 1 cm3 e injetadas por via intravenosa. O tamanho do tumor foi medido até o 0,1 mm mais próximo. Camundongos nu/nu sem pêlo receberam injeções com quantidades de dosagem mais elevadas tanto de PGA-21-G-20 em uma dose de 175 mg/kg como de PGA-32-G-20 em uma dose de 150 mg/kg comparado com o controle de Abraxane em dose de 100 mg/kg de paclitaxel equivalente. A alteração de volume de tumor após tratamento de cada droga foi independentemente observada e registrada com o passar do tempo (dias). Os resultados são mostrados na figura 18. Tanto o PGA-21-G-20 como o PGA-32-G-20 inibiram significativamente o crescimento do tumor. Esses resultados indicam que polímeros preferidos da presente invenção que são conjugados com droga anticâncer são agentes anticâncer eficazes.
Exemplo 27
A toxicidade de perda de peso na MTD foi medida de um polímero feito de acordo com o exemplo 11. 0 PGA-97- G-20 foi preparado de acordo com o procedimento descrito no Exemplo 11. O material de partida foi poli (γ-L-glutamil- glutamina) com um peso molecular médio de 110.800 daltons baseado no sistema Heleos com detector MALS. A percentagem em peso de paclitaxel no polímero foi de 20%. 0 PGA-97-G-20 foi dissolvido em solução salina a 50 mg por mL. As drogas anticâncer de controle para esse exemplo foram Taxol e Abraxane, que são aprovadas pela FDA como drogas anticâncer. A solução salina foi utilizada como controle negativo sem droga antitumor. A quantidade efetiva de droga injetada foi determinada a partir do peso corporal de cada animal. A primeira dose de droga foi administrada quando o tamanho médio do tumor da população inteira de camundongos no estudo atingiu 15 a 50 mm3. Os camundongos receberam 2 doses de droga nos dois dias consecutivos através de injeção na cauda de veia sem anestesia. As soluções de matéria foram preparadas frescas no dia da injeção. As soluções de estoque de droga foram tiradas em uma seringa de 1 cm3 e injetadas por via intravenosa. Os camundongos foram pesados até o decigrama mais próximo. Camundongos nu/nu sem pêlo receberam injeções com quantidades de dosagem mais elevadas de PGA-97-G-20 (60 mg/kg) em comparação com Abraxane (100 mg/kg) e Taxol (50 mg/kg) em sua equivalência de paclitaxel. A alteração de peso corporal (%) após tratamento de cada droga foi independentemente observada e registrada com o passar do tempo (dias). Os resultados são mostrados na figura 19. Como mostrado na figura 19, o PGA-97-A-20 mostrou uma perda de peso corporal comparável com o de controle em uma dosagem muito mais elevada. Esses resultados indicam que polímeros preferidos da presente invenção que são conjugados com droga anticâncer têm toxicidade comparável com uma droga clinicamente aprovada.
Exemplo 28
Estudos de eficácia in vivo
Os efeitos antitumor do PGA-97-G-20, do Taxol e do Abraxane na dose de tolerância máxima (MTD) em tumores de melanoma B16F0-EGF em camundongos nu/nu sem pêlo com o passar do tempo com solução salina como controle negativo foram medidos. 0 PGA-97-G-20 foi dissolvido em solução salina em 50 mg por mL. As drogas anticâncer de controle para esse exemplo foram o Taxol e o Abraxane, que são aprovadas pela FDA como droga anticâncer. A solução salina foi utilizada como controle negativo sem droga antitumor. A quantidade efetiva de droga injetada foi determinada a partir do peso corporal de cada animal. A primeira dose de droga foi administrada quando o tamanho médio de tumor da população inteira de camundongos no estudo atingiu 15 a 50 mm3. Os camundongos receberam 2 doses de droga via injeção IV na cauda de veia sem anestesia no dia seguinte. Soluções de matéria foram preparadas frescas no dia da injeção. As soluções de matéria de droga foram tiradas em uma seringa de 1 cm3 e injetadas por via intravenosa. O tamanho do tumor foi medido até o 0,1 mm mais próximo. Camundongos nu/nu sem pêlo receberam injeções com quantidades de dosagem mais elevadas de PGA-97-G-20 em dose de 60 mg/kg comparado com o Abraxane em dose de 100 mg/kg e o Taxol 50 mg/kg em sua equivalência de paclitaxel. A alteração de volume de tumor após tratamento de cada droga foi independentemente observada e registrada com o passar do tempo (dias). Os resultados são mostrados na figura 20. Como mostrado na figura 20, o PGA-97—G—20 tinha um efeito significativo sobre o crescimento de tumor e melhor desempenho do que o Taxol e o Abraxane. Esses resultados indicam que polímeros preferidos da presente invenção que são conjugados com droga anticâncer são agentes anticâncer eficazes.
Exemplo 29
A toxicidade de perda de peso em dose de tolerância máxima de polímeros conjugados contendo paclitaxel para ácido poliglutâmico conjugada com paclitaxel foi medida. O PGA-32-G-20 foi preparado de acordo com o procedimento a partir do Exemplo 11b. 0 material de partida era polímero poli (γ-L-glutamil- glutamina) com peso molecular médio de 37.400 daltons baseado no sistema Heleos com detector MALS, e a percentagem em peso de paclitaxel em cada um dos polímeros foi de 20%. 0 PGA-32-G-20 foi comparado com um controle de ácido poliglutâmico com um peso molecular de 19.450 daltons (baseado no sistema Heleos com MALS) conjugado com paclitaxel de tal modo que a percentagem em peso de paclitaxel no polímero é de 20% (PGA(32k)-PTX-20) . A solução salina foi utilizada como um controle de base sem droga antitumor. Tanto o PGA-32-G-20 como o PGA(32k)-PTX-20 foram dissolvidos em solução salina em 50 mg por mL.
Solução salina foi utilizada como controle sem droga antitumor. A quantidade efetiva de droga injetada foi determinada a partir do peso corporal de cada animal. A primeira dose de droga foi administrada quando o tamanho médio de tumor da população inteira de camundongos no estudo atingiu 15 a 50 mm3. Os camundongos receberam 2 duas de droga via injeção IV na cauda de veia administrada sem anestesia no dia seguinte. As soluções de matéria foram preparadas frescas no dia da injeção. As soluções de matéria de droga foram tiradas em uma seringa de 1 cm3 . e injetadas por via intravenosa. Os camundongos foram pesados até o decigrama mais próximo. Camundongos nu/nu sem pêlo foram injetados com quantidades de dosagem mais elevada de PGA-32-G-20 em uma dose de 125 mg/kg em comparação com PGA(32k)-PTX-20 em uma dose de 100 mg/kg paclitaxel equivalente. A alteração de peso corporal (%) após tratamento de cada droga foi observada independentemente e registrada com o passar do tempo (dias). Os resultados são mostrados na figura 21. 0 PGA-32-G-20 mostrou uma perda de peso corporal comparável com o controle, em uma dosagem muito mais elevada. Esses resultados indicam que polímeros preferidos da presente invenção que são conjugados com droga anticâncer têm toxicidade comparável com uma droga em investigação.
Exemplo 30
Estudos de eficácia in vivo Os efeitos antitumor do PGA-32-G-20 e do PGA(32k)-PTX-20 na dose de tolerância máxima (MTD) em tumores de melanoma B16F0-EGF em camundongos nu/nu sem pêlo com o passar do tempo com solução salina como controle negativo foram medidos. Tanto o PGA-32-G-20 como o PGA(32k)-PTX-20 foram dissolvidos em solução salina em 50 mg por mL. A quantidade efetiva de droga injetada foi determinada a partir do peso corporal de cada animal. A primeira dose de droga foi administrada quando o tamanho médio de tumor da população inteira de camundongos no estudo atingiu 15 a 50 mm3. Os camundongos receberam 2 doses de droga via injeção IV na cauda de veia administrada sem anestesia no dia seguinte. As soluções de matéria foram preparadas frescas no dia da injeção. As soluções de matéria de droga foram tiradas em uma seringa de 1 cm3 e injetadas por via intravenosa. Os camundongos foram pesados até o decigrama mais próximo. Camundongos nu/nu sem pêlo receberam injeções com quantidades de dosagem mais elevadas de PGA-32-G-20 em uma dose de 125 mg/kg comparado com PGA (32k)-PTX-20 em uma dose de 100 mg/kg de paclitaxel equivalente. O tamanho do tumor foi medido até o 0,1 mm mais próximo. A alteração de volume de tumor após tratamento de cada droga foi independentemente observada e registrada com o passar do tempo (dias). Os resultados são mostrados na figura 22. 0 PGA-32-G-20 teve um efeito significativo sobre o crescimento de tumor e melhor desempenho do que PGA(32k)-PTX-20. Esses resultados indicam que polímeros preferidos da presente invenção que são conjugados com droga anticâncer são agentes anticâncer eficazes.
Exemplo 31
Polímeros conjugados foram testados para determinar a taxa na qual paclitaxel é liberado em relação à seleção de diferentes pesos moleculares dos polímeros. O PGA-21-G-20, o PGA-32-G-20, o PGA-97-G-20 e PGA(97k)-PTX-20 controlador foram colocados em tampões de fosfato em uma concentração de 2mg por mL e a taxa de liberação foi medida. A solução de conjugados de paclitaxel-polimero foi incubada a 37 °C. Uma alíquota de 50 μl foi tirada em diferentes pontos de tempo e foi congelada. Todas as alíquotas foram então analisadas por LC-MS. A área de integração de pico de droga liberada no perfil HPLC foi medida. A quantidade de paclitaxel liberado foi calculada a partir da curva padrão. Os resultados são ilustrados na figura 23, e mostram que à medida que o peso molecular dos polímeros conjugados aumentou, a percentagem de paclitaxel liberada diminuiu. Esses resultados indicam que a taxa de liberação do paclitaxel pode ser controlada pela seleção de diferentes pesos moleculares para o polímero.
Exemplo 32
Animais e modelos tumorais para estudos farmacocinéticos
Camundongos sem pêlo (6-7 semanas de idade, peso corporal 25 - 30 gramas, fêmeas) foram adquiridos de Charles River Lab (Willington, MA). Linhagens de células B16FO foram adquiridas da ATCC (CRL-6322, ATCC American Type Culture Collection, Rockville, MD) . As células B16F0 foram cultivadas em DMEM suplementado com soro bovino fetal a 10%, 2 μΜ de Glutamina, 1 mM de aminoácidos não essenciais, 1 mM de piruvato de sódio, 100 U/ml de penicilina e 100 ug/ml de estreptomicina. As células B16F0 colhidas de cultura de tecido foram contadas e suspensas novamente em uma concentração de 5 x 10^6 por mL. Utilizando uma seringa TB, 0,4 mL (um total de 2 x 10^6 células) foi administrado via injeção subcutânea em cada camundongo. Quatro tumores foram inoculados por animal no ombro direito, ombro esquerdo, quadril direito e quadro esquerdo. Exemplo 32a
Vários polímeros conjugados com droga foram testados contra Taxol de controle para determinar a concentração de paclitaxel em plasma com o passar do tempo.
No ponto em que o volume médio de tumor da população inteira de camundongos do Exemplo32 tinha atingido 200-300 mm3 (6-8 mm de diâmetro), cada animal com tumor recebeu uma única injeção de bolo IV de 3H-Taxol (controle) , de PGA-21-A-19, de PGA-32-A-19, de PGA-97-A-24 via uma cauda de veia.
O PGA-21-G-19 foi preparado a partir do polímero reagente poli- (γ-L-glutamil-glutamina) onde o peso molecular era 19.800 daltons, e a percentagem em peso de paclitaxel no polímero era 19%. 0 PGA-32-G-19 foi preparado a partir do polímero reagente poli-(γ-L-glutamil-glutamina) onde o peso molecular era de 37.400 daltons, e a percentagem em peso de paclitaxel no polímero era 19%. 0 PGA-97-G-24 foi preparado a partir do polímero reagente poli-(γ-L-glutamil-glutamina) onde o peso molecular era de 110.800 daltons, e a percentagem em peso de paclitaxel no polímero era 24%.
A dose de 3H-Taxol livre (controle), de PGA-21-A- 19, de PGA-32-A-19, e de PGA-97-A-24 era 20 mg de paclitaxel equivalentes/kg. Para cada droga, grupos de 4 camundongos foram anestesiados em vários pontos de tempo (cada unidade está em horas): 1,0, 2,0, 4,0 e 24. Uma coleta de 0,5 ml de sangue obtido por punção cardíaca ou retro-orbital foi feita em tubos heparinizados. Posteriormente, os camundongos foram sacrificados antes de se recuperar da anestesia. As amostras de sangue de cada camundongo foram centrifugadas em 11.000 rpm. 0 plasma sobrenadante (0,2 - 0,3 mL) das amostras de sangue foi coletado e transferido para um frasco novo. 0,1 mL do plasma de cada amostra foi separadamente transferido para um frasco de 10 mL novo, e uma solução de cintilação liquida (5 mL) foi adicionada ao frasco. O teor de paclitaxel foi analisado utilizando um sistema de contagem LS6500 de cintilação liquida (Beckman) e calculado a partir da curva padrão de cada amostra. Os resultados são mostrados na figura 24. Esses resultados mostram que a droga paclitaxel em polímeros conjugados preferidos da presente invenção têm uma duração mais longa em plasma em comparação ao Taxol.
Exemplo 33
Vários polímeros conjugados com droga foram testados contra um Taxol de controle para determinar a concentração de paclitaxel presente em um tumor com o passar do tempo. No ponto em que o volume médio do tumor da população inteira de camundongos do Exemplo 32 tinha atingido 200 - 300 mm3 (6-9 mm de diâmetro), cada animal com tumor recebeu uma única injeção IV de bolo de 3H-Taxol (controle), de PGA-21-A-19, de PGA-32-A-19, de PGA-97-A-24 via uma cauda de veia.
0 PGA-21-G-19 foi preparado a partir do polímero reagente poli-(γ-L-glutamil-glutamina) onde o peso molecular era de 19.800 daltons, e a percentagem em peso de paclitaxel no polímero era 19%. 0 PGA-32-G-19 foi preparado a partir do polímero reagente poli- (γ-L-glutamil-glutamina) onde o peso molecular era de 37.400 daltons, e a percentagem em peso de paclitaxel no polímero era de 19%. 0 PGA-97-G-24 foi preparado a partir do polímero reagente poli-(γ-L-glutamil-glutamina) onde o peso molecular era de 110.800 daltons, e a percentagem em peso de paclitaxel no polímero era de 24%. A dose de 3H-Taxol livre (controle), de PGA-2I-A- 19, de PGA-32-A-19, e de PGA-97-A-24 era 20 mg de paclitaxel equivalentes/kg. Para cada droga, grupos de 4 camundongos foram anestesiados em vários pontos de tempo (cada unidade está em horas): 1,0, 2,0, 4,0 e 24. Tumores a partir dos dois quadris e dos dois ombros foram colhidos independentemente. Posteriormente, os camundongos foram sacrificados antes de se recuperar da anestesia.
Aproximadamente 80-180 mg de cada tumor foi colocado em um frasco de cintilação, e o tumor foi digerido com Soluene (solubilizador de tecido) (1 mL) . Em seguida 0,1 mL de tecido digerido foi transferido para um frasco de 10 mL, e um coquetel de cintilação liquido (5 mL) foi adicionado ao frasco. 0 teor de paclitaxel foi analisado utilizando um sistema de contagem LS6500 de cintilação liquida (Beckman) e calculado a partir da curva padrão de cada amostra. Os resultados são mostrados na figura 25. Esses resultados- mostram que a droga paclitaxel em polímeros conjugados preferidos da presente invenção é mais concentrada em um tumor durante o curso de tempo em comparação com Taxol.
Exemplo 34
Animais e modelos tumorais.
Camundongos sem pêlo (6-7 semanas de idade, peso corporal 25-30 g, machos) foram adquiridos de Charles River Lab (Willington, MA) . A linhagem de células B16 foi adquirida da ATCC (CRL-6322, ATCC American Type Culture Collection, Roçkville, MD). As células B16 foram cultivadas em RMPI 1640 suplementado com soro bovino fetal a 10%, 2μΜ de glutamina, 1 mM de aminoácidos não essenciais, ImM de piruvato de sódio, 100 U/ml de penicilina e 100 ug/ml de estreptomicina. As células B16 colhidas a partir de cultura de tecido foram contadas e suspensas novamente a uma concentração de 5 χ IO6 por mL. Utilizando uma seringa TB, 0,2 mL (um total de 1 x 10^6 células) foi administrado via injeção subcutânea em cada camundongo. Um tumor foi inoculado por animal no quadril direito. O sitio de inoculação de tumor foi raspado antes da inoculação para tornar mais fácil a medição do tumor à medida que este cresce.
Exemplo 35
Imagem por ressonância magnética para acumulação de tumor
Imagens de camundongos foram adquiridas em um scanner GE 3T MR utilizando uma bobina de joelho pré- e pós-contraste. Os seguintes parâmetros para a imagem foram TE: minful, TR = 250 ms, FOV: 8 e 24 fatias/placa, e 1,00 de espessura de fatia coronal. O PGA-97-A-DTPA-Gd(III) foi preparado como nos exemplos 7-8, a partir de poli (γ-L- aspartil-glutamina) com peso molecular médio de 99.400 daltons baseado no sistema Heleos com detector MALS. O material de controle para esse Exemplo foi o Omniscan- Gd(III) -(DTPA-BMA (0,1 mmol Gd(III)/kg). A dose de injeção de PGA-97-A-DTPA-Gd (III) foi 0,1 mmol Gd(III)/kg. A dose de injeção de Omniscan™ foi 0,1 mmol Gd(III)/kg. Os dois compostos foram injetados via uma cauda de veia em camundongos anestesiados e imagens foram adquiridas em pré- injeção e em 6 minutos a 4 horas pós-injeção dos agentes de contraste. Os resultados da MRI são mostrados na figura 26. Como mostrado pela figura 26, a quantidade de quelato de PGA-97-A-DTPA-Gd(III) que acumulou no tecido do tumor é maior do que a molécula pequena Omniscan-Gd(III). Esses resultados indicam que os quelatos PGA-97-A-DTPA-Gd(III) aumentaram a especificidade e retenção. Exemplo 36
Estudos de formação de nanoparticulas Uma solução variada (filtrada através de filtro de 0,2 μm) foi adicionada sobre a poli-(g-aspartil- glutamina onde o peso molecular era de 99.400 daltons) em 1 mg/mL excetuado onde está indicado. Todas as soluções foram homogeneamente dissolvidas. O tamanho de partícula, a polidispersão e o índice de base foram medidos por dispersão de luz ZetalPals (Brookhaven Instruments Corporation). Os resultados foram resumidos na Tabela 2. Água MilliQ significa água que foi filtrada através do sistema de transferência com filtro de 0,2μπι.
Tabela 2. Ácido poliglutamato-aspártico sob formas de nanoparticulas
<table>table see original document page 102</column></row><table>
Exemplo 37
Formação de nanoparticulas de PGA-97-A-10 O PGA-97-A-10 foi dissolvido em água deionizada em várias concentrações. O tamanho de partícula, a polidispersão e o índice de base foram medidos por dispersão de luz (ZetalPals, Brookhaven Instruments Corporation). Os resultados são mostrados na Tabela 3 a seguir. Tabela 3 - Formação de nanopartícula de PGA-97-A- 10 em água deionizada
<table>table see original document page 103</column></row><table>
Exemplo 38
Uma imagem microscópica de elétron por congelamento de fratura de polímero conjugado com droga foi tirada por Nano Analytical Laboratory (San Francisco, CA). O polímero era PGA-44-A-20 que foi preparado a partir da poli-(g-L-aspartil-glutamina) onde o peso molecular era de 39.700 daltons, e a percentagem em peso de paclitaxel no polímero era de 20%. Foi transformada em uma concentração de 1 mg/mL em solução salina após ruptura do material pelo uso de energia de ondas sonoras (~5 min.) Após isso, foi envolta em parafilme, e enviada para a companhia imediatamente (no geral, aproximadamente um dia em trânsito). Depois da chegada, foi armazenada a 4°C. 0 polímero foi então colocado em uma solução salina aquosa para determinar se nanopartículas se formariam. Uma reprodução da imagem de microscópica de elétron é mostrada na figura 27. Como pode ser visto na imagem, nanopartículas de um polímero conjugado com droga preferido da presente invenção formou-se quando o polímero conjugado foi colocado em uma solução aquosa. Exemplo 39
Partículas dos polímeros conjugados com droga foram testados para determinar estabilidade em várias concentrações de droga. O PGA-44-A-20 e o PGA-97-A-20 foram formadas em partículas em várias concentrações de droga e os tamanhos de partícula foram medidos. Os resultados são mostrados na figura 28. As partículas permaneceram na faixa de tamanho de nanopartículas e eram estáveis mesmo com concentração aumentada de droga. Esses resultados indicam que nanopartículas estáveis podem ser formadas em uma ampla faixa de concentração de droga.
Exemplo 40
Partículas dos polímeros conjugados com droga foram testadas para determinar estabilidade em várias concentrações de droga. O PGA-21-G-20 e o PGA-32-G-20 foram formados em partículas em várias concentrações de drogas e os tamanhos de partícula foram medidos. Os resultados são mostrados na figura 29. As partículas permaneceram na faixa de tamanho de nanopartículas e eram estáveis mesmo com concentração aumentada de droga. Esses resultados indicam ainda que nanopartículas estáveis podem ser formadas em uma ampla faixa de concentração de droga.
Será entendido por aqueles versados na técnica que inúmeras e várias modificações podem ser feitas sem se afastar do espírito da presente invenção. Portanto, deve ser claramente entendido que as formas da presente invenção são somente ilustrativas e não pretendem limitar o escopo da presente invenção.

Claims (56)

1. Polímero conjugado caracterizado pelo fato de ter uma unidade recorrente da fórmula (I) e uma unidade recorrente da fórmula (II): <formula>formula see original document page 105</formula> em que: cada η é independentemente 1 ou 2, cada A1 é oxigênio ou NR5, cada A2 é oxigênio, R1 e R2 são cada um independentemente selecionados a partir do grupo que,consiste em alquila C1-10, arila C6-20, amônio, metal alcalino, um ligante polidentado, um precursor ligante polidentado com átomos de oxigênio protegidos, e um composto que compreende um agente; em que o agente é selecionado do grupo que consiste em uma droga anticâncer, um agente seletivo, um agente marcante óptico e um agente marcante de ressonância magnética; em que pelo menos um dos. grupos R1 e R2 é iam grupo que compreende um agente; R3 e R4 são cada um independentemente selecionados do grupo que consiste em hidrogênio, amônio e um metal alcalino; em que o polímero conjugado compreende uma quantidade do agente na faixa de aproximadamente 1 a aproximadamente 50% (peso/peso) baseado na razão mássica do agente com o polímero conjugado; R5 é um hidrogênio ou alquila C1-4; e em que a quantidade do agente, a percentagem da unidade recorrente da fórmula (I) e a percentagem da unidade recorrente da fórmula (II) são selecionadas para fornecer uma solubilidade de polímero conjugado maior do que aquela de um comparável conjugado de ácido poliglutâmico que compreende substancialmente a mesma quantidade do agente, a solubilidade do polímero conjugado sendo maior quando uma solução de polímero conjugado testado, compreendendo pelo menos 5 mg/mL do polímero conjugado em 0,9% em peso de NaCl aquoso a aproximadamente -22 °C, tem maior claridade óptica, em relação a uma faixa de pH mais larga do que aquela de uma solução de conjugado de ácido poliglutâmico testado comparável.
2. Polímero conjugado, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado, pelo fato de ter uma unidade recorrente da fórmula (III): <formula>formula see original document page 106</formula> em que o grupo R6 é hidrogênio, amônio ou um metal alcalino.
3. Polímero conjugado/ de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que o composto que compreende o agente compreende adicionalmente um grupo ligador.
4. Polímero conjugado, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2 ou 3, caracterizado pelo fato de que o agente é um agente marcante óptico.
5. Polímero conjugado, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que o agente marcante óptico é selecionado do grupo que consiste em um corante acridina, um corante cumarina, um corante rodamina, um corante xanteno, um corante cianina e um corante pireno.
6. Polímero conjugado, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1,, 2 ou 3, caracterizado pelo fato de que o agente é uma droga anticâncer.
7. Polímero conjugado, de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de' que a droga anticâncer é selecionada do grupo que consiste em taxano, camptotecina e doxorubicina.
8. Polímero conjugado, de acordo com a reivindicação 7, caracterizado p.eIo fato de que o taxano é selecionado do grupo que consiste em paclitaxel e docetaxel.
9. Polímero conjugado,. de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que o paclitaxel é conjugado à unidade recorrente de fórmula.(I) no átomo de oxigênio ligado ao carbono C2'.
10. Polímero conjugado, de acordo com a reivindicação. 8, caracterizado pelo fato de que o paclitaxel é conjugado à unidade recorrente de fórmula (I) no átomo de oxigênio ligado ao carbono C7.
11. Polímero conjugado, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2 ou 3, caracterizado pelo fato de que o agente é um agente marcante de ressonância magnética.
12. Polímero conjugado, de acordo com reivindicação 11, caracterizado pelo fato de qu'e o marcante de ressonância magnética compreende vim composto Gd(III).
13. Polímero conjugado, de acordo com a reivindicação 12, em que o composto Gd(III) compreende: <formula>formula see original document page 108</formula>
14. Polímero conjugado, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2 ou 3, caracterizado pelo fato de que o ligante polidentado compreende: <formula>formula see original document page 108</formula> em que cada R7 é independentemente hidrogênio, amônio ou um metal alcalino.
15. Polímero conjugado, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2 ou 3, caracterizado pelo fato de que o precursor ligante polidentado com átomos de oxigênio protegidos compreende: <formula>formula see original document page 109</formula>
16. Polimero conjugado, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, -13, 14 ou 15, caracterizado pelo fato. de que o polímero compreende aproximadamente 1% molar a aproximadamente 30% molar da unidade recorrente da fórmula (I) baseada no total de mols das unidades recorrentes das fórmulas (I) e (II).
17. Polímero conjugado, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 3,· 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, -13, 14 ou 15, caracterizado pelo fato de que o polímero conjugado compreende aproximadamente 1% molar a aproximadamente 20% molar da unidade recorrente da fórmula (I) baseada no total de mols de unidades recorrentes de fórmula (I) e (II).
18. Polímero conjugado, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, -13, 14 ou 15, caracterizado pelo fato de que o polímero conjugado compreende aproximadamente 1% molar a aproximadamente 10% molar da unidade recorrente de fórmula (I) baseada no total de mols de unidades recorrentes de fórmulas (I) e (II).
19. Polímero conjugado, de acordo com qualquer uma das reivindicações 2, 3, 4, 5, 6, .7, 8, 9, 10, 11, 12, -13, 14 ou 15, caracterizado pelo fato de que o polímero conjugado compreende aproximadamente 1% molar a aproximadamente 99% molar da unidade recorrente de fórmula (I) baseada no total de mols de unidades recorrentes de fórmulas (I), (II) e (III).
20. Polímero conjugado, de acordo com qualquer uma das reivindicações 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, -13, 14 ou 15, caracterizado pelo fato de que o polímero conjugado compreende aproximadamente 1% molar a aproximadamente 30% molar da unidade recorrente da fórmula (I) baseada no total de mols de unidades recorrentes de fórmula (I), (II) e (III) .
21. Polímero conjugado, de acordo com qualquer uma das reivindicações 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, -13, 14 ou 15, caracterizado pelo fato de que o polímero conjugado compreende aproximadamente ; 1% molar a aproximadamente 20% molar da unidade recorrente de fórmula (I) baseada no total de mols de unidades recorrentes de fórmula (I), (II) e (III).
22. Polímero conjugado, de acordo com qualquer uma das reivindicações 2, 3, 4,, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, -13, 14 ou 15, caracterizado pelo fato de que o polímero conjugado compreende aproximadamente 1% molar a aproximadamente 10% molar da unidade, recorrente de fórmula (I) baseada no total de mols de unidades recorrentes de fórmula (I), (II) e (III).
23. Polímero conjugado, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, -12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 ou 22, caracterizado pelo fato de que pelo menos um η é 1.
24. Polímero conjugado, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, -12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 ou 22, caracterizado pelo fato de que pelo menos um η é 2,
25. Polímero conjugado, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, -12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21 ou 22, caracterizado pelo fato de que o metal alcalino é sódio.
26. Polímero conjugado, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, -12, 13, 14, 15, 1.6, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 ou 25, caracterizado pelo fato de que a faixa mais larga de pH é de pelo menos aproximadamente 3 unidades de pH.
27. Polímero conjugado, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, -12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 ou 25, caracterizado pelo fato de que a faixa mais larga de pH é de pelo menos aproximadamente 8 unidades de pH.
28. Polímero conjugado, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, -12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 ou 25, caracterizado pelo fato de que a faixa mais larga de pH é de pelo menos aproximadamente 9 unidades de pH.
29. Polímero conjugado, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, -12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 ou 25, caracterizado pelo fato de que a faixa mais larga de pH inclui pelo menos um valor de pH na faixa de aproximadamente 2 a aproximadamente 5.,
30. Polímero conjugado, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, -12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 ou 25, caracterizado pelo fato de que a solução de polímero conjugado testado compreende pelo menos aproximadamente -10 mg/mL do polímero conjugado.
31. Polímero conjugado, de acordo com qualquer uma das reivindicações, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, -12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 ou 25, caracterizado pelo fato de que a solução de polímero conjugado testado compreende pelo menos aproximadamente -25 mg/mL do polímero conjugado.
32. Polímero conjugado, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3/ 4, 5, 6, 1, 8, 9, 10, 11, -12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 ou 25, caracterizado pelo fato de que a solução de polímero conjugado testado compreende pelo .menos aproximadamente 100 mg/mL do polímero conjugado.
33. Polímero conjugado, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, -12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 ou 25, caracterizado pelo fato de que a solução de polímero conjugado testado compreende pelo menos aproximadamente 150 mg/mL do polímero conjugado.
34. Método de fazer o polímero conjugado conforme qualquer uma das reivindicações 1 a 33 caracterizado pelo fato de dissolver ou dissolver parcialmente iam reagente polimérico em um solvente para formar um reagente polimérico dissolvido ou parcialmente dissolvido; e reagir o reagente polimérico dissolvido ou parcialmente dissolvido com um segundo reagente, era que o segundo reagente compreende pelo menos um selecionado do grupo que consiste no ligante polidentado, no precursor ligante polidentado com átomos de oxigênio protegidos e no composto que compreende o agente.
35. Método, de acordo reivindicação 34, caracterizado pelo fato . de que o reagente polimérico compreende uma unidade recorrente da fórmula (IV): <formula>formula see original document page 113</formula> em que cada η é independentemente 1 ou 2; cada A3 é oxigênio; e R7 e R8 são cada um independentemente selecionados do grupo que consiste em hidrogênio, amônio.e um metal alcalino.
36. Método, de acordo; reivindicação 34, caracterizado pelo fato de quê o reagente polimérico compreende uma unidade recorrente da fórmula (V): <formula>formula see original document page 113</formula> em que e R9 é hidrogênio, amônio ou um metal alcalino.
37. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 34, 35 ou 36, caracterizado pelo fato de que o segundo reagente compreende um substituinte selecionado do grupo que consiste em hidróxido e amina.
38. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 34, 35 ou 36, caracterizado pelo fato de que o agente é selecionado do grupo que consiste em uma droga anticâncer, um agente seletivo, iam agente marcante óptico e um agente marcante de ressonância magnética.
39. Método, de acordo com reivindicação 38, caracterizado pelo fato de que o agente marcante óptico é selecionado do grupo que consiste em um corante acridina, um corante cumarina, um corante rodamina, um corante xanteno, um corante cianina e um corante pireno.
40. Método, de acordo com reivindicação 38, caracterizado pelo fato de que a droga anticâncer é selecionada do grupo que consiste em taxano, camptotecina e doxorubicina.
41. Método, de acordo com reivindicação 40, caracterizado pelo fato de que. o taxano é selecionado do grupo que consiste em paclitaxel e docetaxel.
42. Método, de acordo com reivindicação 41, caracterizado pelo fato de que o paclitaxel é conjugado à unidade recorrente da fórmula (I) no átomo. de oxigênio ligado ao carbono C2'.
43. Método, de acordo com reivindicação 41/ caracterizado pelo fato de que o paclitaxel é conjugado à unidade recorrente da fórmula (I) no átomo de oxigênio ligado ao carbono Cl.
44. Método, de acordo com reivindicação 38, caracterizado pelo fato de que o marcante de ressonância magnética compreende um composto Gd(III).
45. Método, de acordo com reivindicação 44, caracterizado pelo fato de que o composto Gd (III) compreende: <formula>formula see original document page 115</formula>
46. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 34, 35 ou 36, caracterizado pelo fato de que o ligante polidentado compreende: <formula>formula see original document page 115</formula> em que cada R7 é independentemente hidrogênio, amônio ou um metal alcalino.
47. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações 34, 35 ou 36, caracterizado pelo fato de que o precursor ligante polidentado com átomos de oxigênio protegidos compreende: <formula>formula see original document page 115</formula> reivindicações 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, -45, 46, ou 47, caracterizado pelo fato de adicionalmente reagir o reagente polimérico dissolvido; ou parcialmente dissolvido na presença de um agente de ligação.
48. [Claim missing on original document]
49. Método, de acordo com reivindicação 48, caracterizado pelo fato de que o agente de ligação é selecionado a partir do grupo que consiste em l-etil-3-(3- dimetilaminopropil)>carbodiimida (EDC), 1,3-diciclohexil carbodiimida (DCC), 1,1'-carbonil-diimidazol (CDI), carbonato de N,N'-disuccinimidil (DSC), hexafluorofosfato de N-óxido N-[(dimetilamino)-1H-1,2,3-triazolo-[4, 5- b]piridina-1-il-metileno]-N-metilmetanaminio (HATU), hexafluorofosfato de 2-[(ΙΗ-benzotriazol-l-il)-1,1, 3, 3- tetrametilaminio (HBTU), hexafluorofosfato de 2-[(6-çloro- -1H-benzotriazol-l-il)-1,1,3,3-tetrametilaminio (HCTU), hexafluorofosfato de benzotriazol-l-il-oxi-tris- pirrolidino-fosfônio, hexafluorofosfato de bromo-tris- pirrolidino-fosfônio, tetrafluoroborato de 2-[(1H- benzotriazol-l-il)-1,1,3,3-tetrametilaminio (TBTU) e hexafluorofosfato de benzotriázol-1-il-oxi-tris- (dimetilamino)fosfônio (BOP).
50. Métodp, de acordo com qualquer uma das reivindicações 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, -45, 46, 47, 48, ou 49, caracterizado pêlo fato de que o solvente é um solvente aprótico polar:.
51. Método, de acordo com a reivindicação 50, caracterizado pelo fato de que o solvente é selecionado do grupo que consiste em Ν,Ν-dimetil formamida (DMF), sulfóxido de dimetila (DMSO), N-metil-2-piridona (NMP). e N,N-dimetilacetamida (DMAc).
52. Método, de acordo com qualquer uma..das reivindicações 34, 35, 36, 37, 38, 39, .40, 41, 42, 43, 44, -45, 46, 47, 48, 49, 50 ou 51, caracterizado pelo fato de adicionalmente reagir o reagente polimérico dissolvido ou parcialmente dissolvido na presença de um catalisador.
53. Método, de acordo com a reivindicação 52, caracterizado pelo fato de que o catalisador é 4- dimetilaminopiridina (DMAP).
54. Composição farmacêutica caracterizada pelo fato de ter o polímero conjugado conforme qualquer uma das reivindicações 1 a 33 e pelo menos um selecionado dentre um excipiente farmaceuticamente aceitável, um veículo e um diluente.
55. Uso de uma quantidade eficaz de um polímero conjugado conforme qualquer uma das reivindicações 1 a 33 caracterizado pelo fato de ser para a preparação de uma composição farmacêutica para tratar ou atenuar uma doença ou condição em um mamífero. .
56. Uso de uma quantidade eficaz de um polímero conjugado conforme qualquer uma das reivindicações 1 a 33 caracterizado pelo fato de ser para a preparação de uma composição farmacêutica para diagnosticar uma doença ou condição em um mamífero..
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