BRPI0619605A2 - moléculas de anticorpos contra amilóide de beta4 com glicosilação na região variável, uso das mesmas, método de preparação de uma molécula de anticorpo, composição e kit - Google Patents

Abstract

MOLéCULAS DE ANTICORPOS CONTRA AMILóIDE BETA4 COM GLICOSILAçãO NA REGIãO VARIáVEL, USO DAS MESMAS, MéTODO DE PREPARAçãO DE UMA MOLéCULA DE ANTI-CORPO, COMPOSIçãO E KIT. A presente invenção refere-se a uma preparação purificada de molécula de anticorpo que é caracterizada pelo fato de que pelo menos um sítio de ligação com antigeno compreende uma asparagina (Asn) glicosilada na região variável da cadeia pesada (VH). Mais especificamente, uma composição farmacêutica e uma composição para diagnóstico compreendendo a dita molécula de anticorpo e são fornecidas misturas de anticorpos que são capazes de reconhecer especificamente o pepitídio P-A41A134. A presente invenção refere-se em particular a uma mistura de anticorpos compreendendo um ou dois sítios glicosilados de ligação com antígeno com uma asparagina (Asn) glicosilada na região variável da cadeia pesada, isto é, misturas de isoformas de anticorpos compreendendo uma Asn glicosilada na região variável da cadeia pesada (VH). Também são descritas composições ou preparações de anticorpo compreendendo as isoformas de anticorpo especificamente glicosiladas. Além disso, são fornecidos os usos farmacêuticos e para diagnóstico desses anticorpos. As isoformas de anticorpos podem, por exemplo, ser usadas na intervenção farmacêutica da amiloidogênese, ou na formação da placa amilóide e/ou no diagnóstico da mesma.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "MOLÉCULAS DE ANTICORPOS CONTRA AMILÓIDE BETA4 COM GLICOSILAÇÃO NA REGIÃO VARIÁVEL, USO DAS MESMAS, MÉTODO DE PREPARAÇÃO DE UMA MOLÉCULA DE ANTICORPO, COMPOSIÇÃO E KIT".

A presente invenção refere-se a uma preparação purificada de molécula de anticorpo que é caracterizada pelo fato de que pelo menos um sítio de ligação com antígeno compreende uma asparagina (Asn) glicosilada na região variável da cadeia pesada (VH). Mais especificamente, é fornecida uma melócula de anticorpo purificada que é capaz de reconhecer especifi- camente o peptídio Αβ-Α4/Αβ4 e compreendendo uma glicosilação na região variável da cadeia pesada (VH). A presente invenção refere-se a uma mistu- ra de anticorpos compreendendo um ou dois sítios de ligação com antígeno glicosilado com uma asparagina (Asn) glicosilada na região variável da cadeia pesada, isto é, misturas de isoformas de anticorpos compreendendo uma Asn glicosilada na região variável da cadeia pesada (VH). Também são descritos composições ou preparações de anticorpo compreendendo as isoformas de anticorpo especificamente glicosiladas. Além disso, são fornecidos os usos farmacêuticos e diagnósticos desses anticorpos. As isoformas de anticorpo, por exemplo, podem ser usadas na intervenção farmacêutica da amiloidogênese ou na formação da placa amilóide e/ou no diagnóstico da mesma.

Aproximadamente 70% de todos os casos de demência são de- vidos ao mal de Alzheimer que está associado com o dano seletivo de regi- ões cerebrais e circuitos neurais críticos para a cognição. O mal de Alzhei- mer é caracterizado por entrançados neurofibrilares em particular em neurô- nios piramidais do hipocampo e por numerosas placas amilóides contendo em sua maior parte um núcleo denso de depósitos amilóides e halos difusos.

As placas neuríticas extracelulares contêm grandes quantidades de um peptídio predominantemente fibrilar denominado "amilóide β", '"A- beta", "Αβ4", "β-Α4" ou "Αβ"; vide Selkoe (1994), Ann. Rev. Cell BioL 10, 373-403, Koo (1999), PNAS VoL 96, pp. 9989-9990, US 4,666,829 ou Glen- ner (1984), BBRC 12, 1131. Esse amilóide β é derivado da "proteína precur- sora de Alzheimer/proteína precursora de β-amilóide" (APP). As APPs são glicoproteínas integrantes de membranas (vide Sisodia (1992), PNAS Vol. 89, pp. 6075) e são endoproteoliticamente clivadas dentro da seqüência Αβ por uma protease da membrana plasmática, α-secretase (vide Sisodia (1992), loc. cit.). Além disso, uma atividade adicional da secretase, particu- Iarmente a atividade da β-secretase e γ-secretase leva à liberação extracelu- Iar de β-amilóide (Αβ) compreendendo 39 aminoácidos (Αβ39), 40 aminoáci- dos (Αβ40), 42 aminoácidos (Αβ42) ou 43 aminoácidos (Αβ43); vide Sinha (1999), PNAS 96, 11094-1053; Price (1998), Science 282, 1078 a 1083; WO 00/72880 ou Hardy (1997), TINS 20, 154.

É de se notar que um Αβ tem várias formas ocorrendo natural- mente, pelas quais as formas humanas são referidas tal como os acima mencionados Αβ39, Αβ40, Αβ41, Αβ42 e Αβ43. A forma mais proeminente, Αβ42, tem a seqüência de aminoácidos (iniciando pela teminação N): DAE- FRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVVIA (SEQ ID NO 3). Nas Αβ41, Αβ40, Αβ39, estão faltando os aminoácidos com terminação C A, IA e VIA, respectivamente. Na froma Αβ43 um resíduo treonina adicional é compreendido na terminação C da seqüência acima mencionada (SEQ ID NO 3).

O tempo necessário para nuclear as fibrilas Αβ40 foi mostrado como sendo significativamente mais longo do que aquele para nuclear as fibrilas Αβ42; vide Koo, loc. cit. e Harper (1997), Ann. Rev. Biochem. 66, 385-407. Tal como revisto em Wagner (1999), J. Clin. Invest. 104, 1239- 1332, o Αβ42 é mais freqüentemente descoberto associado com placas neu- ríticas e considerado como sendo mais fibrilogênico in vitro. Também é su- gerido que o Αβ42 sirva como uma "semente" na polimerização dependente da nucleação dos peptídios Αβ não cristalinos oredenados; Jarrett (1993), Cell 93, 1055-1058.

O processamento da APP modificada e/ou a geração de placas extracelulares contendo depósitos protéicos não são conhecidos somente da patologia de Alzheimer, mas também de pacientes sofrendo de outros dis- túrbios neurológicos e/ou neurodegenerativos. Esses distúrbios compreen- dem, entre outras coisas, a síndrome de Down, a hemorragia cerebral here- ditária com amiloidase do tipo Dutch1 o mal de Parkinson, ALS (esclerose lateral amiotrófica), doença de Creutzfeld Jacob, demência relacionada com a AIDS e a neuropatia motora.

Até agora, foram descritos somente esquemas limitados de in- tervenção médica de doenças relacionadas com a placa amilóide. Por e- xemplo, os inibidores da colineserase tal como a galantamina, â rivastigmina ou o donepezil foram discutidos como sendo benéficos em pacientes de Al- zheimer em um estado da doença de brando para moderado. Entretanto, também foram reportados efeitos adversos devido à ação colinérgica desses fármacos. Embora esses tratamentos de aumento da ação colinérgica real- mente produzam algum benefício sintomático, a resposta terapêutica não é satisfatória para a maioria dos pacientes tratados. Foi previsto que uma me- lhora cognitiva significante ocorra em somente aproximadamente 5% dos pacientes tratados e há pouca evidência de que o tratamento significativa- mente altere o rumo dessa doença progressiva. Conseqüentemente, ainda permanece uma enorme necessidade clínica de tratamentos mais eficazes e em particular aqueles que possam deter ou atrasar a progressão da doença.

Também os antagonistas do receptor da NMDA, tal como a me- mantina, foram empregados mais recentemente. Entretanto, foram reporta- dos efeitos adversos devido as suas atividades farmacológicas. Além disso, tal tratamento com esses antagonistas de receptor da NMDA pode ser sim- plesmente considerado como tendo uma atuação sintomática e não como sendo verdadeiramente uma modificação da doença.

Também foram propostas aproximações de imunomodulação para o tratamento de distúrbios relacionados com a placa amilóide. O WO 99/27944 divulga conjugados, compreendendom partes de um peptídio Αβ e moléculas ricular, pelos quais a dita molécula ricular deve melhorar uma res- posta imune. Outra aproximação de imunização ativa é mencionada no WO 00/72880, em que também uns fragmentos Αβ são empregados para induzir uma resposta imune.

Também foram propostas aproximações de imunização passiva com anticorpos anti-Αβ genéricos no WO 99/27944 ou no WO 01/62801 e anticorpos humanizados específicos dirigidos contra porções da Αβ foram descritos nos WO 02/46237, WO 02/088306 e WO 02/088307. O WO 00/77178 descreve anticorpos que se ligam a um estado de transição adota- do pela β-amilóide durante a hidrólise. O WO 03/070760 divulga moléculas de anticorpos que reconhecem duas seqüências de aminoácidos descontí- nuas no peptídio Αβ.

O WO 03/016466 descreve um anticorpo anti-Αβ humanizado que é modificado para evitar qualquer glicosilação potencial na sua cadeia pesada, já que uma glicosilação na(s) região(ões) variável(is) de anticorpos 1CL foi postulada por Wallick (1988) J. Exp. Med. 168, 1099-1109.

O problema técnico que é a base de acordo com a presente in- venção é fornecer meios e métodos eficazes para o manejo médico de dis- túrbios amilóides, particularmente meios e métodos para a redução das pla- cas amilóides prejudiciais em pacientes que estejam necessitando de uma (correspondente) intervenção médica.

Em um primeiro aspecto, a presente invenção fornece uma me· lócula de anticorpo purificada que é caracterizada pelo fato de que pelo me- nos um sítio de ligação com antígeno compreende uma asparagina (Asn) glicosilada na região variável da cadeia pesada (VH). O anticorpo purificado e inventivo ou a composição de anticorpos de acordo com a presente inven- ção tal com aqui fornecido está em particular direcionado contra o Αβ e/ou um fragmento de Αβ. A melócula de anticorpo purificada tal com aqui forne- cida e em particular a composição de anticorpo ou a preparação de anticor- po de acordo com a presente invenção são úteis para a preparação de uma composição farmacêutica ou diagnostica para o tratamento, a melhoria e a prevenção de uma doença associada com a amiloidose e/ou com a forma- ção da placa amilóide. Um exemplo de tal doença é o mal de Alzheimer.

No contexto de acordo com a presente invenção foi surpreen- dentemente descoberto que moléculas purificadas de anticorpos, em que pelo menos um sítio de ligação com antígeno compreende uma glicosilação ligada ao N na região variável da cadeia pesada, é em particular útil, por e- xemplo, para a redução de placas amilóides. Além disso, foi descoberto no contexto de acordo com a presente invenção que os anticorpos glicosilados ou as composições de anticorpos glicosilados, tal com aqui fornecidos, são em particular úteis e eficazes em atravessar a barreira de sangue- cérebro/fronteira de sangue-cérebro, in vivo, tal como ilustrado por ligações plaquetárias bastante eficazes.

Isto está no contraste total com o que é ensinado pela técnica anterior. O WO 03/016466 divulga a existência de anticorpos sendo especifi- camente projetados com ausência de um sítio de glicosilação N na cadeia pesada e onde é ensinado que a glicosilação na estrutura de região variável possui um efeito negativo sobre a afinidade de ligação do anticorpo. É ensi- nado na técnica precedente que o anticorpo anti-Αβ descrito em uma forma desglicosilada da região CDR2 variável da cadeia pesada possui uma afini- dade marcadamente mais alta para o peptídio Αβ sintético e purificado in vitro.

Conseqüentemente, a presente invenção refere-se a uma molé- cula de anticorpo melhorada, purificada ou a uma preparação de anticorpo, em particular a uma preparação de molécula de anticorpo que é dirigida con- tra o peptídio Αβ4/Αβ (amilóide β) e é altamente eficiente in vivo. A melhora da presente preparação de molécula de anticorpo/anticorpo reside no forne- cimento de moléculas de anticorpos purificadas que compreende em pelo menos uma das suas regiões variáveis na cadeia pesada uma glicosilação N, por exemplo, na região CDR2 da dita região variável da cadeia pesada. Tal como acima mencionado, isto é, em contraste com a técnica precedente, de acordo com o WO 03/016466, que ensina que tal glicosilação N tem de ser evitada em anticorpos dirigidos contra, por exemplo, um Αβ.

Os exemplos de uma molécula de anticorpo de acordo com a presente invenção são as moléculas de imunoglobulina, por exemplo, molé- culas de IgG. As IgGs são caracterizadas por compreenderem duas cadeias leves e duas pesadas (ilustrado, por exemplo, na figura 14) e essas molécu- Ias compreendem dois sítios de ligação com antígeno. Os ditos sítios de li- gação com antígeno compreendendo as "regiões variáveis" consistindo em partes das cadeias pesadas (Vh) e partes das cadeias leves (VL). Os sítios de ligação com antígeno são formados pela justaposição dos domínios Vh e Vl. Para informação geral sobre moléculas de anticorpos ou moléculas de imunoglobulina vide também os manuais comuns, como o Abbas llCeIIuIar and Molecular Immunology", W.B. Sounders Company (2003).

Em um aspecto, por exemplo, no fornecimento de uma molécula de imunoglobulina tal como caracterizado na presente invenção, é descrito um anticorpo em que um sítio de ligação com antígeno compreende uma asparagina (Asn) glicosilada na região variável correspondente da cadeia pesada (VH). O dito anticorpo é daqui por diante mencionado como "ANTI- CORPO monoglicosilado"; vide também a figura 14.

Em outro aspecto, uma molécula de imunoglobulina é fornecida em que ambos os sítios de ligação com antígeno compreende uma aspara- gina (Asn) glicosilada na região variável de cadeias pesadas corresponden- tes (VH). A dita molécula de anticorpo é daqui por diante mencionada como "ANTICORPO diglicosilada", vide a figura 14.

Uma imunoglobulina em que nenhum sítio de ligação com antí- geno compreende uma asparagina (Asn) glicosilada na região variável da cadeia pesada (Vh) é daqui por diante mencionada como "ANTICORPO não glicosilado".

O ANTICORPO monoglicosilado, o ANTICORPO diglicosilada e o ANTICORPO não glicosilado podem compreender seqüências de aminoá- cidos idênticas ou seqüências de aminoácidos diferentes. O termo "ANTI- CORPO" compreende, conseqüentemente, moléculas de anticorpo, em par- ticular moléculas de anticorpos recombinantemente produzidas, tais como imunoglobulinas. Entretanto, tal como discutido abaixo, o termo "molécula de ANTICORPO" também compreende isoformas e modificações conhecidas das imunoglobulinas, como anticorpos de cadeia única ou fragmentos Fv de cadeia única (scAB/scFv) ou construtor de anticorpo biespecífico, as ditas isoformas e modificações sendo caracterizadas por compreenderem pelo menos uma região Vh glicosilada tal como aqui definido. Um exemplo espe- cífico de tal isoforma ou modificação pode ser um anticorpo sc (cadeia única) no formato Vh-Vl ou Vl-Vh, em que a dita Vh compreende a glicosilação tal como descrito na presente invenção. Também são contemplados os scFvs biespecíficos, por exemplo, nos formatos VH-VL-VH-VL, VL-VH-VH-VL, VH-VL- VL-VH, compreendendo a glicosilação na região CDR-2, tal como descrito na presente invenção.

No contexto de acordo com a presente invenção, o termo "AN- TICORPO" em letras maiúsculas é empregado para fornecer uma melhor lucidez. Entretanto, o termo "anticorpo" usado em letras minúsculas também é usado no contexto do presente pedido. "ANTICOR- RoTANTicoRpoSlVanticorpo" e "anticorpos" são usados de modo inter- cambiável.

O ANTICORPO monoglicosilado e o ANTICORPO diglicosilada foram aqui anteriormente referidos como "isoformas de ANTICORPOS glico- silados". Uma melócula de anticorpo purificada caracterizada pelo fato de que pelo menos um sítio de ligação com antígeno compreende uma aspara- gina (Asn) glicosilada na região variável da cadeia pesada (VH) é um ANTI- CORPO monoglicosilado que está livre de, ou está associado em muito bai- xa extensão, com uma isoforma selecionada de um ANTICORPO diglicosila- da e um ANTICORPO não glicosilado, isto é, "um ANTICORPO monoglicosi- lado purificado". Um ANTICORPO diglicosilada no contexto de acordo com a presente invenção está livre de, ou está associado em muito baixa extensão, com uma isoforma selecionada de um ANTICORPO monoglicosilado e um ANTICORPO não glicosilado, isto é, "um ANTICORPO diglicosilada purifica- do".

O termo "que está livre de, ou está associado em muito baixa extensão" denota a ausência completa das respectivas outras isoformas de glicosilação ou uma presença de uma outra isoforma glicosilada em uma concentração de no máximo 10%, por exemplo, no máximo 5%, por exem- plo, no máximo 4%, por exemplo, no máximo 3%, por exemplo, no máximo 2%, por exemplo, no máximo 1%, por exemplo, no máximo 0,5%, por exem- pio, no máximo 0,3%, por exemplo, no máximo 0,2%. Informação adicional nesse sentido é fornecida nos exemplos abaixo.

No contexto de acordo com a presente invenção, o termo "anti- corpo(s) monoglicosilado(s)" ou "ANTICORPO(S) monoglicosilado(s)" refere- sem a moléculas de anticorpos compreendendo uma glicosilação N em uma região (Vh) de uma molécula individual de anticorpo, por exemplo, de uma imunoglobulina, por exemplo, de uma IgG, por exemplo, de uma lgG1. Por exemplo, a dita "forma monoglicosilada", compreende uma glicosilação em uma região variável da cadeia pesada, por exemplo, na posição asparagina "Asn 52", tal como definida abaixo. Essa "forma da IgGI monoglicosilada ou isoforma monoglicosilada" também pode compreender, tal como aqui ilustra- do, a glicosilação no sítio de glicosilação bem conservada na porção Fc, por exemplo, a asparagina Asn 306 na porção Fcnão variável.

O termo "anticorpos(s) diglicosilada(s)" ou "ANTICORPO(S) di- glicosilada(s)" pelo significado adotado na presente invenção compreende a glicosilação aqui definida em ambas as regiões variáveis da região de cadeia pesada (Vh). Novamente, essa "forma duplamente glicosilada", compreende uma glicosilação na região variável tanto de cadeias pesadas, em particular na posição asparagina Asn 52, tal como detalhado abaixo, e tal como exem- plificado pelos exemplos anexos. Esta "Forma de IgGI duplamente glicosila- da ou isoforma duplamente glicosilada" também podem compreender, como aqui ilustrado, a glicosilação no sítio de glicosilação bem conservada na por- ção Fc não variável/constante, em particular na posição 306 da imunoglobu- lina exemplificada. A figura 14 em anexo, ilustra as moléculas de anticorpo correspondentes.

Os anticorpos destituídos de tal modificação pós-translacional na região variável, por exemplo, em ambas as regiões variáveis da cadeia pe- sada (ambas as regiões (Vh)) são, no contexto de acordo com a presente invenção considerados como uma "forma não glicosilada", não compreen- dendo nenhuma glicosilação na região variável da cadeia pesada. Ainda, essa "forma não glicosilada" pode compreender sem dúvidas a(s) glicosila- ção(s) na região Constante (região C) do anticorpo, por exemplo, e mais comumente no sítio de glicosilação bem conservada da porção Fc, em parti- cular a asparagina (Asn) 306, na porção Fc não variável/constante, tal como aqui definido, vide também SEQ ID NO 6. A asparagina (Asn) glicosilada na região variável da cadeia pe- sada (Vh) pode ser na complementaridade que determina a região 2 (região de CDR2). A dita asparagina (Asn) glicosilada na região variável da cadeia pesada (Vh) pode ser na posição 52 da região variável tal como definido a- baixo e tal como mostrado na SEQ ID NO 2 (ou na posição 52 de SEQ ID NO 6, compreendendo também a porção Fc da cadeia pesada de um anti- corpo, tal como aqui descrito).

As isoformas de ANTICORPO também podem compreender a- lém dessa(s) glicosilação(ões) na parte de constante/não variável das molé-

cuias de anticorpos, por exemplo, na porção Fc de um IgG, por exemplo, na porção Fc em um IgGI. Dita glicosilação na porção Fc refere-se a uma gli- cosilação bem conservada, que é caracterizada por estar localizada na posi- ção Asn306 da cadeia pesada, por exemplo, de acordo com a seguinte se- qüência:

QVELVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVS AINASGTRTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGK GNTHKPYGYVRYFDVWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAA LGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSWTVPSSS LGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLF PPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPRE EQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPR EPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTP PVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP GK (SEQ ID NO: 6)

Essa seqüência também é representada aqui abaixo e as regi- ões CDRs, as regiões CH, as regiões pesadas, bem como os dois Sítios de glicosilação N (N52 e N306) são indicados:

QVELVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWV S

AINASGTRYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAR GKGNTHKPYGYVRYFDVWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGG TAALGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSWTVP SSSLGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSV

FLFPPKPKDTLMISRTPEVTCWVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKP

REEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQ

PREPQyYTLPPSRDELTKNQVSLTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKT

TPPVLDSGSFFLYSKLTYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSL

SPGK(SEQ ID NO: 6);

|Enquandrãdõ|:CDR1, 2, 3;

Sublinhado: CH1: Itálico·, região de dobra; Duplo sublinhado: CH-2;

Sublinhado pontilhado; CH3;

Negrito N: Sítios de glicosilação ligados a N.

A região Fc da IgG dos anticorpos de acordo com a presente invenção pode ser um homodímero compreendido por regiões de dobra Iiga- das por pontes de dissulfeto intercadeias, domínios Ch2 glicosilados, carre- gando um oligossacarídeo ligado ao N na asparagina 306 (Asn-306) dos domínios CH2 e Cr3 não covalentesemente pareados. O oligossacarídeo da glicosilação na Asn-306 é do tipo complexo bifurcado e pode compreender um núcleo com estrutura de heptassacarídio com a adição variável de braço exterior de açúcares.

O oligossacarídeo influi ou determina a estrutura e a função do Fc (Jefferis (1998) Immunol Rev. 163, 50-76). As funções executoras, nume- rando determinadas interações Iigantes IgG-Fc/executora foram discutidas (Jefferis (2002) Immunol Lett. 82(1-2), 57-65 e Krapp (2003) J Mol Biol. 325(5), 979-89). Esta posição Fc conservada Asn-306 corresponde a "Asn- 297" no sistema Kabat (Kabat (1991) Sequences of Proteins of Immunologi- cal Interest, 5th Ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Be- thesda MD).

A cadeia pesada exemplificada pode ser codificada pela seguin- te seqüência:

caggtggaattggtggaaagcggcggcggcctggtgcaaccgggcggcagcctgcgtctgagctgcgc ggcctccggatttacctttagcagctatgcgatgagctgggtgcgccaagcccctgggaagggtctcgagt gggtgagcgctattaatgcttctggtactcgtacttattatgctgattctgttaagggtcgttttaccatttcacgtg ataattcgaaaaacaccctgtatctgcaaatgaacagcctgcgtgcggaagatacggccgtgtattattgc gcgcgtggtaagggtaatactcataagccttatggttatgttcgttattttgatgtttggggccaaggcaccctg gtgacggttagctcagcctccaccaagggtccatcggtcttccccctggcaccctcctccaagagcacctct gggggcacagcggccctgggctgcctggtcaaggactacttccccgaaccggtgacggtgtcgtggaac tcaggcgccctgaccagcggcgtgcacaccttcccggctgtcctacagtcctcaggactctactccctcag cagcgtggtgaccgtgccctccagcagcttgggcacccagacctacatctgcaacgtgaatcacaagcc cagcaacaccaaggtggacaagaaagttgagcccagatatcgtgcgatatcgtgcaatcttgtgacaaa actcacacatgcccaccgtgcccagcacctgaactcctggggggaccgtcagtcttcctcttccccccaaa acccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacga agaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgc gggaggagcagtacaacagcacgtaccgggtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctg aatggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaagccctcccagcceccatcgagaaaaccatctc caaagccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggatgagctgacc aagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggag agcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttc ctctacagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgc atgaggctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtctccgggtaaatga (SEQ ID NO: 5).

A dita cadeia pesada também pode compreender (em particular durante a sua produção recombinante) seqüências adicionais, como "se- qüências líder". Um exemplo correspondente é codificado pela seguinte se- qüência:

atgaaacacctgtggttcttcctcctgctggtggcagctcccagatgggtcctgtcc; (seguida por):

caggtggaattggtggaaagcggcggcggcctggtgcaaccgggcggcagcctgcgtctgagctgcgc ggcctccggatttacctttagcagctatgcgatgagctgggtgcgccaagcccctgggaagggtctcgagt gggtgagcgctattaatgcttctggtactcgtacttattatgctgattctgttaagggtcgttttaccatttcacgtg ataattcgaaaaacaccctgtatctgcaaatgaacagcctgcgtgcggaagatacggccgtgtattattgc gcgcgtggtaagggtaatactcataagccttatggttatgttcgttattttgatgtttggggccaaggcaccctg gtgacggttagctcagcctccaccaagggtccatcggtcttccccctggcaccctcctccaagagcacctct gggggcacagcggccctgggctgcctggtcaaggactacttccccgaaccggtgacggtgtcgtggaac tcaggcgccctgaccagcggcgtgcacaccttcccggctgtcctacagtcctcaggactctactccctcag cagcgtggtgaccgtgccctccagcagcttgggcacccagacctacatctgcaacgtgaatcacaagcc cagcaacaccaaggtggacaagaaagttgagcccaaatcttgtgacaaaactcacacatgcccaccgt gcccagcacctgaactcctggggggaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccGtcat gatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttc aactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacaaca gcacgtaccgggtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaaggagtacaagt gcaaggtctccaacaaagccctcccagcccccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagcc ccgagaaccacaggtgtâcaccctgcccccatcccgggatgagctgaccaagaaccaggtcagcctga cctgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggaga acaactacaagaGcacgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctctacagcaagctcaccgtg gacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccact acacgcagaagagcctctccctgtctccgggtaaatga (SEQ ID NO: 25) a seqüência correspondente de aminoácidos seria:

MKHLWFFLLLVAAPRWVLS (seguida por):

QVELVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVS AINASGTRTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGK GNTHKPYGYVRYFDVWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAA LGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSS LGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLF PPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPRE EQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPR EPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTP PVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP GK (SEQ ID NO: 26).

A seqüência acima mencionada também compreende um "pep- tídio de sinalização" o dito peptídio de sinalização é proteoliticamente clivado pela sinalpeptidase do hospedeiro durante as vias de secreção durante a produção das moléculas de anticorpos de acordo com a invenção em células de hospedeiro, tal como as células CHO.

Alternativamente, a dita cadeia pesada pode ser codificada por uma seqüência de ácidos nucléicos que é otimizada para a produção re- combinante tal como exemplificado pela seguinte seqüência: 1 atggagtttg ggctgagctg ggttttcctc gttgctcttt taagaggtga 51 ttcatggaga aatagagaga ctgagtgtga gtgaacatga gtgagaaaaa 101 ctggatttgt gtggcatttt ctgataacgg tgtccttctg tttgcaggtg 151 tccagtgt; seguida por:

ca ggtggagctg gtggagtctg ggggaggcct ggtccagcct 201 ggggggtccc tgagactctc ctgtgcagcg tctggattca ccttcagtag 251 ctatgccatg agctgggtcc gccaggctcc aggcaagggg ctcgagtggg 301 tgtccgccat aaacgccagc ggtacccgca cctactatgc agactccgtg 351 aagggccgat tcaccatctc cagagacaat tccaagaaca cgctgtatct 401 gcaaatgaac agcctgagag ccgaggacac ggctgtgtat tactgtgcga 451 gaggcaaggg gaacacccac aagccctacg gctacgtacg ctactttgac 501 gtgtggggcc aaggaaccct ggtcaccgtc tcctcaggtg agtcctcaca 551 acctctctcc tgcggccgca gcttgaagtc tgaggcagaa tcttgtccag 601 ggtctatcgg actcttgtga gaattagggg ctgacagttg atggtgacaa 651 tttcagggtc agtgactgtc tggtttctct gaggtgagac tggaatatag 701 gtcaccttga agactaaaga ggggtccagg ggcttttctg cacaggcagg 751 gaacagaatg tggaacaatg acttgaatgg ttgattcttg tgtgacacca 801 agaattggca taatgtctga gttgcccaag ggtgatctta gctagactct 851 ggggtttttg tcgggtacag aggaaaaacc cactattgtg attactatgc 901 tatggactac tggggtcaag gaacctcagt caccgtctcc tcaggtaaga 951 atggcctctc caggtcttta tttttaacct ttgttatgga gttttctgag 1001 cattgcagac taatcttgga tatttgccct gagggagccg gctgagagaa 1051 gttgggaaat aaatctgtct agggatctca gagcctttag gacagattat 1101 ctccacatct ttgaaaaact aagaatctgt gtgatggtgt tggtggagtc 1151 cctggatgat gggataggga ctttggaggc tcatttgagg gagatgctaa 1201 aacaatccta tggctggagg gatagttggg gctgtagttg gagattttca 1251 gtttttagaa tgaagtatta gctgcaatac ttcaaggacc acctctgtga 1301 caaccatttt atacagtatc caggcatagg gacaaaaagt ggagtggggc 1351 actttcttta gatttgtgag gaatgttcca cactagattg tttaaaactt 1401 catttgttgg aaggagctgt cttagtgatt gagtcaaggg agaaaggcat 1451 ctagcctcgg tctcaaaagg gtagttgctg tctagagagg tctggtggag 1501 cctgcaaaag tccagctttc aaaggaacac agaagtatgt gtatggaata 1551 ttagaagatg ttgcttttac tcttaagttg gttcctagga aaaatagtta 1601 aatactgtga ctttaaaatg tgagagggtt ttcaagtact cattttttta 1651 aatgtccaaa atttttgtca atcaatttga ggtcttgttt gtgtagaact 1701 gacattactt aaagtttaac cgaggaatgg gagtgaggct ctctcatacc 1751 ctattcagaa ctgactttta acaataataa attaagttta aaatattttt 1801 aaatgaattg agcaatgttg agttgagtca agatggccga tcagaaccgg 1851 aacacctgca gcagctggca ggaagcaggt catgtggcaa ggctatttgg 1901 ggaagggaaa ataaaaccac taggtaaact tgtagctgtg gtttgaagaa 1951 gtggttttga aacactctgt ccagccccac caaaccgaaa gtccaggctg 2001 agcaaaacac cacctgggta atttgcattt ctaaaataag ttgaggattc 2051 agccgaaact ggagaggtcc tcttttaact tattgagttc aaccttttaa 2101 ttttagcttg agtagttcta gtttccccaa acttaagttt atcgacttct 2151 aaaatgtatt tagaattcga gctcggtaca gctttctggg gcaggccagg 2201 cctgaccttg gctttggggc agggaggggg ctaaggtgag gcaggtggcg 2251 ccagcaggtg cacacccaat gcccatgagc ccagacactg gacgctgaac 2301 ctcgcggaca gttaagaacc caggggcctc tgcgcctggg cccagctctg 2351 tcccacaccg cggtcacatg gcaccacctc tcttgcagcc tccaccaagg 2401 gcccatcggt cttccccctg gcaccctcct ccaagagcac ctctgggggc 2451 acagcggccc tgggctgcct ggtcaaggac tacttccccg aaccggtgac 2501 ggtgtcgtgg aactcaggcg ccctgaccag cggcgtgcac accttcccgg 2551 ctgtcctaca gtcctcagga ctctactccc tcagcagcgt ggtgaccgtg 2601 ccctccagca gcttgggcac ccagacctac atctgcaacg tgaatcacaa 2651 gcccagcaac accaaggtgg acaagaaagt tggtgagagg ccagcacagg 2701 gagggagggt gtctgctgga agccaggctc agcgctcctg cctggacgca 2751 tcccggctat gcagccccag tccagggcag caaggcaggc cccgtctgcc 2801 tcttcacccg gagcctctgc ccgccccact catgctcagg gagagggtct 2851 tctggctttt tcccaggctc tgggcaggca caggctaggt gcccctaacc 2901 caggccctgc acacaaaggg gcaggtgctg ggctcagacc tgccaagagc 2951 catatccggg aggaccctgc ccctgaccta agcccacccc aaaggccaaa 3001 ctctccactc cctcagctcg gacaccttct ctcctcccag attccagtaa 3051 ctcccaatct tctctctgca gagcccaaat cttgtgacaa aactcacaca 3101 tgcccaccgt gcccaggtaa gccagcccag gcctcgccct ccagctcaag 3151 gcgggacagg tgccctagag tagcctgcat ccagggacag gccccagccg 3201 ggtgctgaca cgtccacctc catctcttcc tcagcacctg aactcctggg 3251 gggaccgtca gtcttcctct tccccccaaa acccaaggac accctcatga 3301 tctcccggac ccctgaggtc acatgcgtgg tggtggacgt gagccacgaa 3351 gaccctgagg tcaagttcaa ctggtacgtg gacggcgtgg aggtgcataa 3401 tgccaagaca aagccgcggg aggagcagta caacagcacg taccgtgtgg 3451 tcagcgtcct caccgtcctg caccaggact ggctgaatgg caaggagtac 3501 aagtgcaagg tctccaacaa agccctccca gcccccatcg agaaaaccat 3551 ctccaaagcc aaaggtggga cccgtggggt gcgagggcca catggacaga 3601 ggccggctcg gcccaccctc tgccctgaga gtgaccgctg taccaacctc 3651 tgtccctaca gggcagcccc gagaaccaca ggtgtacacc ctgcccccat 3701 cccgggatga gctgaccaag aaccaggtca gcctgacctg cctggtcaaa 3751 ggcttctatc ccagcgacat cgccgtggag tgggagagca atgggcagcc 3801 ggagaacaac tacaagacca cgcctcccgt gctggactcc gacggctcct 3851 tcttcctcta cagcaagctc accgtggaca agagcaggtg gcagcagggg 3901 aacgtcttct catgctccgt gatgcatgag gctctgcaca accactacac 3951 gcagaagagc ctctccctgt ccccgggcaa atga (SEQ ID NO: 23).

A seqüência "alternativa" de proteína, tal como mostrado acima como SEQ ID NO 23 compreende a mesma seqüência de codificação que a primeira alternativa, entretanto em uma organização genômica ligeiramente diferente, como íntrons adicionais e uma "seqüência líder ligeiramente dife- rente"/"seqüência de sinal". A dita "seqüência líder" também pode compre- ender, tal como mostrado acima de um íntron(s) (adicional). A pessoa versa- da na técnica tem capacidade suficiente para deduzir na seqüência tal como aqui mostrado, estrutura correspondente exon/íntron estrutura por métodos convencionais.

O anticorpo exemplificado descrito na presente invenção tam- bém pode compreender uma cadeia leve, a dita cadeia leve pode compre- ender ou ter a seguinte seqüência de aminoácidos:

DIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYG ASSRATGVPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFATYYCLQIYNMPITFGQGT KVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNAL QSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSP VTKSFNRGEC (SEQ ID NO: 8).

que pode ser codificado pela seguinte seqüência de ácidos nucléicos: gatatcgtgctgacccagagcccggcgaccctgagcctgtctccgggcgaacgtgcgaccctgagctgc agagcgagccagagcgtgagcagcagctatctggcgtggtaccagcagaaaccaggtcaagcaccgc gtctattaatttatggcgcgagcagccgtgcaactggggtcccggcgcgttttagcggctctggatccggca cggattttaccctgaccattagcagcctggaacctgaagactttgcgacttattattgccttcagatttataatat gcctattacctttggccagggtacgaaagttgaaattaaacgtacggtggctgcaccatctgtcttcatcttcc cgccatctgatgagcagttgaaatctggaactgcctctgttgtgtgcctgctgaataacttctatcccagaga ggccaaagtacagtggaaggtggataacgccctccaatcgggtaactcccaggagagtgtcacagagc aggacagcaaggacagcacctacagcctcagcagcaccctgacgctgagcaaagcagactacgaga aacacaaagtctacgcctgcgaagtcacccatcagggcctgagctcgcccgtcacaaagagcttcaaca ggggagagtgttag (SEQ ID NO: 7).

Também a "cadeia leve" de anticorpo exemplificada aqui descri- ta pode compreender "uma seqüência líder" que é em particular útil na pro- dução técnica. Uma seqüência correspondente pode ser (ou pode ser com- preendida, por exemplo, em um sistema de vetores) a seguinte seqüência: atggtgttgcagacccaggtcttcatttctctgttgctctggatctctggtgcctacggg (seguida por): gatatcgtgctgacccagagcccggcgaccctgagcctgtctccgggcgaacgtgcgaccctgagctgc agagcgagccagagcgtgagcagcagctatctggcgtggtaccagcágaaaccaggtcaagcaccgc gtctattaatttatggcgcgagcagccgtgcaactggggtcccggcgcgttttagcggctctggatccggca cggattttaccctgaccattagcagcctggaacctgaagactttgcgacttattattgccttcagatttataatat gcctattacctttggccagggtacgaaagttgaaattaaacgtacggtggctgcaccatctgtcttcatcttcc cgccatctgatgagcagttgaaatctggaactgcctctgttgtgtgcctgctgaataacttctatcccagaga ggccaaagtacagtggaaggtggataacgccctccaatcgggtaactcccaggagagtgtcacagagc aggacagcaaggacagcacctacagcctcagcagcaccctgacgctgagcaaagcagactacgaga aacacaaagtctacgcctgcgaagtcacccatcagggcctgagctcgcccgtcacaaagagcttcaaca ggggagagtgttag (SEQ ID NO: 27).

A dita seqüência codifica a seguinte seqüência de aminoácidos: MVLQTQVFISLLLWISGAYG (seguida por):

DIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYG ASSRATGVPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFATYYCLQIYNMPITFGQGT KVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNAL QSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSP VTKSFNRGEC (SEQ ID NO: 28).

Alternativamente, a dita cadeia leve também pode ser codificada por uma seqüência de ácidos nucléicos que é otimizada para a produção recombinante tal como exemplificado pela seguinte seqüência:

1 atggacatga gggtcctcgc tcagctcctg gggctcctgc tgctctgttt 51 cccaggtaag gatggagaac actagcagtt tactcagccc agggtgctca 101 gtactgcttt actattcagg gaaattctct tacaacatga ttaattgtgt 151 ggacatttgt ttttatgttt ccaatctcag gcgccagatg t;

Seguida por:

gatatcgtg

201 ttgacgcagt ctccagccac cctgtctttg tctccagggg aaagagccac 251 cctctcctgc cgggccagtc agagtgttag cagcagctac ttagcctggt 301 accagcagaa acctggccag gcgcccaggc tcctcatcta tggcgcatcc 351 agcagggcca ctggcgtgcc agccaggttc agtggcagtg ggtctgggac 401 agacttcact ctcaccatca gcagcctgga gcctgaagat ttcgcgacct 451 attactgtct gcagatttac aacatgccta tcacgttcgg ccaagggacc 501 aaggtggaaa tcaaacgtga gtagaattta aactttgcgg ccgcctagac 551 gtttaagtgg gagatttgga ggggatgagg aatgaaggaa cttcaggata 601 gaaaagggct gaagtcaagt tcagctccta aaatggatgt gggagcaaac 651 tttgaagata aactgaatga cccagaggat gaaacagcgc agatcaaaga 701 ggggcctgga gctctgagaa gagaaggaga ctcatccgtg ttgagtttcc 751 acaagtactg tcttgagttt tgcaataaaa gtgggatagc agagttgagt 801 gagccgtagg ctgagttctc tcttttgtct cctaagtttt tatgactaca 851 aaaatcagta gtatgtcctg aaataatcat taagctgttt gaaagtatga 901 ctgcttgcca tgtagatacc atgtcttgct gaatgatcag aagaggtgtg 951 actcttattc taaaatttgt cacaaaatgt caaaatgaga gactctgtag 1001 gaacgagtcc ttgacagaca gctcaagggg tttttttcct ttgtctcatt 1051 tctacatgaa agtaaatttg aaatgatctt ttttattata agagtagaaa 1101 tacagttggg tttgaactat atgttttaat ggccacggtt ttgtaagaca 1151 tttggtcctt tgttttccca gttattactc gattgtaatt ttatatcgcc

1201 agcaatggac tgaaacggtc cgcaacctct tctttacaac tgggtgacct

1251 cgcggctgtg ccagccattt ggcgttcacc ctgccgctaa gggccatgtg

1301 aacccccgcg gtagcatccc ttgctccgcg tggaccactt tcctgaggca

1351 cagtgatagg aacagagcca ctaatctgaa gagaacagag atgtgacaga

1401 ctacactaat gtgagaaaaa caaggaaagg gtgacttatt ggagatttca

1451 gaaataaaat gcatttatta ttatattccc ttattttaat tttctattag

1501 ggaattagaa agggcataaa ctgctttalc cagtgttata ttaaaagctt

1551 aatgtatata atcttttaga ggtaaaatct acagccagca aaagtcatgg

1601 taaatattct ttgactgaac tctcactaaa ctcctctaaa ttatatgtca

1651 tattaactgg ttaaattaat ataaatttgt gacatgacct taactggtta

1701 ggtaggatat ttttcttcat gcaaaaatat gactaataat aatttagcac

1751 aaaaatattt cccaatactt taattctgtg atagaaaaat gtttaactca

1801 gctactataa tcccataatt ttgaaaacta tttattagct tttgtgtttg

1851 acccttccct agccaaaggc aactatttaa ggacccttta aaactcttga

1901 aactacttta gagtcattaa gttatttaac cacttttaat tactttaaaa

1951 tgatgtcaat tcccttttaa ctattaattt attttaaggg gggaaaggct

2001 gctcataatt ctattgtttt tcttggtaaa gaactctcag ttttcgtttt

2051 tactacctct gtcacccaag agttggcatc tcaacagagg ggactttccg

2101 agaggccatc tggcagttgc ttaagatcag aagtgaagtc tgccagttcc

2151 tcccaggcag gtggcccaga ttacagttga cctgttctgg tgtggctaaa

2201 aattgtccca tgtggttaca aaccattaga ccagggtctg atgaattgct

2251 cagaatattt ctggacaccc aaatacagac cctggcttaa ggccctgtcc

2301 atacagtagg tttagcttgg ctacaccaaa ggaagccata cagaggctaa

2351 tatcagagta ttcttggaag agacaggaga aaatgaaagc cagtttctgc

2401 tcttacctta tgtgcttgtg ttcagactcc caaacatcag gagtgtcaga

2451 taaactggtc tgaatctctg tctgaagcat ggaactgaaa agaatgtagt

2501 ttcagggaag aaaggcaata gaaggaagcc tgagaatacg gatcaattct

2551 aaactctgag ggggtcggat gacgtggcca ttctttgcct aaagcattga

2601 gtttactgca aggtcagaaa agcatgcaaa gccctcagaa tggctgcaaa

2651 gagctccaac aaaacaattt agaactttat taaggaatag ggggaagcta

2701 ggaagaaact caaaacatca agattttaaa tacgcttctt ggtctccttg 2751 ctataattat ctgggataag catgctgttt tctgtctgtc cctaacatgc 2801 cctgtgatta tccgcaaaca acacacccaa gggcagaact ttgttactta 2851 aacaccatcc tgtttgcttc tttcctcagg aactgtggct gcaccatctg 2901 tcttcatctt cccgccatct gatgagcagt tgaaatctgg aactgcctct 2951 gttgtgtgcc tgctgaataa cttctatccc agagaggcca aagtacagtg

3001 gaaggtggat aacgccctcc aatcgggtaa ctcccaggag agtgtcacag 3051 agcaggacag caaggacagc acctacagcc tcagcagcac cctgacgctg 3101 agcaaagcag actacgagaa acacaaagtc tacgcctgcg aagtcaccca 3151 tcagggcctg agctcgcccg tcacaaagag cttcaacagg ggagagtgtt 3201 ag (SEQ ID NO: 24).

A "seqüência" acima para uma cadeia leve exemplificada tem também uma estrutura genômica ligeiramente diferente. Esta "seqüência alternativa" compreende íntrons diferentes e/ou adicionais. Conseqüente- mente a descrição das modalidades para "cadeia pesada" aplica-se aqui com as mudanças necessárias tendo sido feitas.

No contexto de acordo com a presente invenção, o termo "molé- cula de anticorpo" refere-se a moléculas completas de imunoglobulina, por exemplo, IgMs, IgDs, IgEs, IgAs ou IgGs, tais como IgGI, lgG2, lgG2b, lgG3 ou lgG4 bem como partes de tais moléculas de imunoglobulina, como frag- mentos Fab, fragmentos Fab', fragmentos F(ab)2, fragmentos F(ab)2 quimé- rico ou Fab' quimérico, fragmentos Fab quiméricos ou regiões isoladas Vh ou CDR (as ditas regiões isoladas Vh ou CDR sendo, por exemplo, integradas ou projetadas na(s) "estrutura(s)" correspondente). Também compreendidos pelo termo "molécula de anticorpo" estão os diacorpos e as moléculas com- preendendo um domínio Fc de anticorpo como um veículo ligado a pelo me- nos um meio de ligação/peptídio de antígeno, por exemplo, os pepticorpos, tal como descrito no WO 00/24782. Conseqüentemente, e no contexto de acordo com a presente invenção, o termo "região variável da cadeia pesada (Vh)" não está limitado a uma região variável em uma imunoglobulina com- pleta, mas também refere-se às partes correspondentes da dita região variá- vel da cadeia pesada (VH), como os CDRs, ou sozinhos ou em combinação com CDR1, 2 e/ou 3 ou a "estrutura" correspondente da região variável. Desse modo, uma molécula de anticorpo de acordo com a presente inven- ção também pode ser um anticorpo construtor compreendendo, o sítio de ligação com antígeno, os CDRs ou pelo menos um CDR de uma dada região variável da cadeia pesada (Vh) glicosilada. A dita parte correspondente da dita região variável da cadeia pesada (Vh) no anticorpo construtor de acordo com a presente invenção é glicosilado tal como aqui definido, por exemplo, compreende uma asparagina (Asn) glicosilada no sítio de ligação com antí- geno. Um exemplo de tal "parte isolada" de uma região variável da cadeia pesada (Vh) é a região CDR2 aqui exemplificada compreendida na SEQ ID NO 12 (ou codificada por uma seqüência de ácidos nucléicos, tal como mos- trado na SEQ ID NO 11).

Além disso, o termo "molécula de anticorpo" refere-se a molécu- las de anticorpo modificadas e/ou alteradas, tal como anticorpos quiméricos, humanizados ou totalmente humanizados.

As ditas moléculas de "anticorpos totalmente humanizados" também são caracterizados e descritos como anticorpos "completamente humanos". Todos esses anticorpos podem ser gerados por métodos conhe- cidos na técnica. Por exemplo, pela tecnologia de exposição de fago, molé- culas de anticorpo recombinante podem ser geradas devido ao uso de matu- ração in vitro que é o uso de uma imunoglobulina γ humana completa, γ es- trutura subclasse 1 (lgG1), tal como descrito por Knappik (2000) J Mol Bioi 296(1), 57-86. e Rauchenberger (2003) J Biol Chem. 278(40), 38194-205.

Tal como documentado pelos exemplos anexos, o termo anti- corpo, refere-se, por exemplo, a uma molécula IgG e, por exemplo, a uma IgG1. O termo também refere-se a anticorpos monoclonal ou policlonal modi- ficados ou alterados bem como a anticorpos recombinantemente ou sinteti- camente gerados/sintetizados. O termo também refere-se a anticorpos intac- tos bem como a fragmentos/partes do mesmo, tal como cadeias leves e pe- sadas separadas, Fab, Fab/c, Fv, Fab', F(ab')2. O termo "molécula de anti- corpo" também compreende derivados de anticorpo, anticorpos bifuncionais e anticorpos construtores, tal como anticorpo de cadeia única Fvs (scFv) ou anticorpo de proteína de fusão. Também contemplados são anticorpos cata- líticos e/ou proteolíticos compreendendo um domínio Vh glicosilado, por e- xemplo, um Vh-CDR glicosilado tal como aqui definido. O termo "molécula de anticorpo" refere-se também a molécula de anticorpo/anticorpo construtor recombinantemente produzida que pode compreender, além de uma especi- ficidade (por exemplo, contra ap/Αβ), uma outra ou uma nova especificidade. Tal construtor pode compreender, mas não se limitando a, Um construtor "biespecífico" ou "triespecífico". Os detalhes adicionais do termo "molécula de anticorpo" de acordo com a presente invenção são fornecidos abaixo.

Como indicado acima, também contemplados são um anticorpo de cadeia única, um anticorpo quimérico, um anticorpo enxertado de CDR, um anticorpo construtor bivalente, um anticorpo de proteína de fusão, um anticorpo de clonagem cruzada ou um anticorpo sintético compreendendo a glicosilação aqui definida em pelo menos um sítio de ligação com antígeno, por exemplo, em pelo menos uma ou a região variável da cadeia pesada aqui definida e sendo glicosilada. Quando, por exemplo, são produzidos an- ticorpos de cadeia única, a "região variável da cadeia pesada" aqui definida não está limitada a uma cadeia pesada por si, mas está destinada a se rela- cionar também às partes correspondentes derivadas de uma cadeia pesada de um anticorpo completo, por exemplo, uma imunoglobulina completa, tal como uma IgG. Tais partes podem ser ou as correspondentes CDRs sozi- nhas ou com partes de suas estruturas correspondentes. Além disso, as va- riantes genéticas dos genes da imunoglobulina também são enfocadas no contexto de acordo com a presente invenção. As variantes genéticas da, por exemplo, imunoglobulina de cadeia pesada G subclasse 1 (IgGI) pode com- preender os marcadores alotípicos G1m (17) ou G1m (3) no domínio CH1, ou o marcador alotípico G1m (1) ou o G1m (não 1) no domínio CH3. Aqui, preferivelmente é empregada uma IgGI do alotipo Gm(17)(z) e Gm(1)(a). Molécula de anticorpo de acordo com a presente invenção também compre- ende anticorpos modificados ou mutantes, tal como a IgG mutante com Iiga- ção do receptor da Fc realçada ou atenuada ou com ativação de comple- mento. Em uma modalidade, o anticorpo fornecido de acordo com a presen- te invenção é um anticorpo totalmente humanizado ou "completamente hu- mano".

Conseqüentemente, os anticorpos de acordo com a presente invenção também podem compreender anticorpos de clonagem cruzada, isto é, anticorpos compreendendo regiões de diferentes anticorpos (por exemplo, regiões de CDR) de um ou mais anticorpos genitores ou anticorpo(s) otimi- zados por afinidade, tal como descrito na presente invenção. Esses anticor- pos de clonagem cruzada podem ser anticorpos em diversas diferentes es- truturas, por exemplo, uma Estrutura de IgG, por exemplo, uma IgG (huma- na), lgG2a ou uma Estrutura lgG2b. Por exemplo, a dita estrutura de anti- corpo é de um mamífero, por exemplo, uma estrutura humana. Os domínios nas cadeias leves e pesadas têm a mesma estrutura geral e cada domínio compreende quatro regiões de estrutura, cujas seqüências são relativamente conservadas, unidas por três domínios hipervariáveis conhecidos como regi- ões de determinação de complementaridade (CDR1-3).

Tal como aqui utilizado, uma "região de estrutura humana" refe- re-se a uma região de estrutura que é substancialmente idêntica (aproxima- damente 85% ou mais, normalmente de 90 a 95% ou mais) à região de es- trutura de uma imunoglobulina humana que ocorre naturalmente. A região de estrutura de um anticorpo (por exemplo, as regiões de estrutura combinadas constituintes das cadeias leves e pesadas) serve para posicionar e alinhar as CDRs. As CDRs são responsáveis principalmente por se ligar a um epito- po de um antígeno. É de se notar que não somente os anticorpos de clona- gem cruzada descritos na presente invenção podem ser apresentados em uma estrutura de anticorpo preferida (humana), mas também as moléculas de anticorpos compreendendo as CDRs de anticorpos, tal como descrito na presente invenção, podem ser introduzidas em uma estrutura de imunoglo- bulina. Os exemplos de estruturas incluem a IgGI, a lgG2a e a lgG2b. O mais preferido são estruturas humanas e estruturas de IgGI humana, como a cadeia pesada de um ANTICORPO, tal como mostrado na, entre outras coisas, SEQ ID NO 6.

Em uma modalidade as isoformas do ANTICORPO podem com- preender, na região variável de cadeia pesada, um CDR1 compreendendo os seguintes aminoácidos: GFTFSSYAMS (SEQ ID NO 10);

A dita CDR1 podendo ser codificada pela seguinte seqüência de ácidos nucléicos:

ggatttacctttagcagctatgcgatgagc (SEQ ID NO 9).

As isoformas do ANTICORPO podem compreender a seguinte CDR2 na região variável da cadeia pesada:

AINASGTRTYYADSVKG (SEQ ID NO 12).

(N: sítio de glicosilação ligado a N na Asn-52 de uma cadeia pesada comple- to ta)

A dita CDR2 podendo ser codificada pela seguinte seqüência de ácidos nucléicos:

gctattaatgcttctggtactcgtacttattatgctgattctgttaagggt (SEQ ID NO 11).

A glicosilação N de acordo com a presente invenção está, por exemplo, compreendida na dita região CDR2 e está localizada na região va- riável da cadeia pesada correspondente da Asn52, a dita região variável (Vh) sendo codificada por uma molécula de ácido nucléico, tal como mostrado na SEQ ID NO 1, e tendo uma seqüência de aminoácidos tal como mostrado na SEQ ID NO 2.

Além disso, as isoformas do ANTICORPO podem compreender na sua região variável de cadeia pesada urna CDR3 compreendendo a se- guinte seqüência de aminoácidos:

GKGNTHKPYGYVRYFDV (SEQ ID NO 14).

A dita CDR3 pode ser codificada pela seguinte seqüência de ácidos nucléicos:

ggtaagggtaatactcataagccttatggttatgttcgttattttgatgtt (SEQ ID NO 13).

As isoformas do ANTICORPO podem compreender uma cadeia leve (L) que pode ser caracterizada pelas seguintes CDRs:

CDR1: RASQSVSSSYLA (SEQ ID NO 16);

agagcgagccagagcgtgagcagcagctatctggcg (SEQ ID NO 15);

CDR2: GASSRAT (SEQ ID NO 18);

ggcgcgagcagccgtgcaact (SEQ ID NO 17); CDR3: LQIYNMPI (SEQ ID NO 20); cttcagatttataatatgcctatt (SEQ ID NO 19).

As isoformas do ANTICORPO podendo compreender sítios adi- cionais com potencial de glicosilação (tal como conhecido na técnica, com- preendendo os motivos Asn-X-Ser/Thr) na seqüência de aminoácidos das cadeias pesadas do anticorpo, por exemplo, no sítio de glicosilação bem conservada na Asn 306 na porção Fc não variável (correspondente a "Asn297" no Kabat-sistema (Kabat (1991) Sequences of Proteins of Immuno- logical Interest, 5th ed., Bethesda, Md.: National Center for Biotechnology Information, National Library of Medicine), as ditas cadeias pesadas sendo ou compreendendo a seqüência tal como fornecidas acima, ou seja, a SEQ ID NO 6 (tal como codificada pela SEQ ID NO 5).

Em uma modalidade, de acordo com a presente invenção, as isoformas de ANTICORPO são caracterizadas pelo fato de que pelo menos um sítio de ligação com antígeno compreende uma asparagina (Asn) glicosi- lada na região variável da cadeia pesada (Vh), o dito Vh sendo codificado por:

(a) uma molécula de ácido nucléico compreendendo a seqüência de nucleotídios, tal como mostrado na SEQ ID NO 1:

CAGGTGGAATTGGTGGAAAGCGGCGGCGGCCTGGTGCAAC CGGGCGGCAGCCTGCG-TCTGAGCTGCGCGGCCTCCGGATTTACCTTTA GCAGCTATGCGATGAGCTGGGTGCGCCAAGCCCCTGGGAAGGGTCTC GAGTGGGTGAGCGCTATTAATGCTTCTGGTACTCGTACTTATTATGCTG ATTCTGTTAAGGGTCGTTTTACCATTTCACGTGATAATTCGAAAAACACC CTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGCGTGCGGAAGATACGGCCGTGTATT ATTGCGCGCGTGGTAAGGGTAATACTCATAAGCCTTATGGTTATGTTCG TTATTTTG ATGTTTGG G GCC AAG G CACCCTG GTG ACGGTTAGCTCA (SEQ ID NO: 1); (SEQ ID NO 1);

(b) uma molécula de ácido nucléico que codifica um polipeptídio possuindo a seqüência de aminoácidos tal como mostrado na SEQ ID NO 2:

QVELVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAP GKGLEWVSAINASGTRTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTA VYYCARGKGNTHKPYGYVRYFDVWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO 2; "Ν" em negrito representando a Asn aqui definida na posição 52 da região variável da cadeia pesada);

(c) uma molécula de ácido nucléico que se hibridiza com a molécula de ácido nucléico de (a) ou (b) e que codifica um polipeptídio que é capaz de se ligar ao ao pepitídio β-Α4/Αβ4, tal como mostrado na seguinte seqüência de aminoácidos:

DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVVIA (SEQ ID NO 3); ou um fragmento da mesma compreendendo pelo menos 15 aminoácidos;

(d) uma molécula de ácido nucléico que se hibridiza com a molécula de ácido nucléico de (a) ou (b) e que codifica um polipeptídio que é capaz de se ligar a pelo menos duas regiões no pepitídio β-Α4/Αβ4, tal como mostrado na seguinte seqüência de aminoácidos:

DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVVIA (SEQ ID NO 3); ou a pelo menos duas regiões de um fragmento da SEQ ID NO 3 compreendendo pelo menos 15 aminoácidos, em que as ditas duas regiões no pepitídio β-Α4/Αβ4, ou os ditos fragmentos das mesmas, com- preende os aminoácidos nas posições de 3 a 6, e nas posições de 18 a 26, da SEQ ID NO 3; ou

(e) uma seqüência de ácidos nucléicos que é degenerada a uma seqüência de ácidos nucléicos tal como definido em quaisquer item de (a) a (dí-

Uma pessoa versada na técnica é consciente do fato que o ter- mo "molécula de ácido nucléico que se hibridiza com a molécula de ácido nucléico de (a) ou (b) e que codifica um polipeptídio que é capaz de se ligar a pelo menos duas regiões no pepitídio β-Α4/Αβ4", tal como aqui emprega- do, refere-se a uma fita de codificação de uma molécula de ácido nucléico de dupla fita através da qual a fita de não codificação se hibridiza à acima mencionada molécula de ácido nucléico identificada de (a) e (b).

Tal como indicado acima, a melócula de anticorpo purificada compreendendo a Asn glicosilada aqui definida pode ser, entre outras coi- sas, caracterizada e descrita como uma molécula de anticorpo em que a re- gião variável compreendendo uma Asn glicosilada está compreendida em uma cadeia pesada selecionada do grupo consistindo em:

(a) um polipeptídio de cadeia pesada codificado por uma molécula de ácido nucléico tal como mostrado nas SEQ ID NO 5, 23 ou 25;

(b) um polipeptídio de cadeia pesada possuindo a seqüência de a - minoácidos tal como mostrado nas SEQ ID NO 6 ou 26;

(c) um polipeptídio de cadeia pesada codificado por uma molécula de ácido nucléico que se hibridiza com a molécula de ácido nucléico de (a) e que codifica um polipeptídio que é capaz de se ligar ao pepitídio β-Α4/Αβ4 tal como mostrado na seguinte seqüência de aminoácidos: DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVVIA (SEQ ID NO 3); ou um fragmento da mesma compreendendo pelo menos 15 aminoáci- dos; ou

(d) um polipeptídio de cadeia pesada codificado por uma molé- cula de ácido nucléico que se hibridiza com a molécula de ácido nucléico de (a) e que codifica um polipeptídio que é capaz de se ligar a pelo menos duas regiões no pepitídio β-Α4/Αβ4 tal como mostrado na seguinte seqüência de aminoácidos:

DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVVIA (SEQ ID NO 3); ou a pelo menos duas regiões de um fragmento de SEQ ID NO 3, com- preendendo pelo menos 15 aminoácidos, através da qual as ditas duas regi- ões no pepitídio β-Α4/Αβ4 ou os ditos fragmentos das mesmas compreen- dem os aminoácidos nas posições 3 a 6 e nas posições 18 a 26.

O anticorpo identificado acima mencionado (por exemplo, um anticorpo exemplificado de acordo com a presente invenção) pode também compreender uma cadeia L com a seguinte seqüência de aminoácidos: DIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYG ASSRATGVPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFATYYCLQIYNMPITFGQGT KVEIKRTV AAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNAL QSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSP VTKSFNRGEC (SEQ ID NO 22); ou uma cadeia L como, por exemplo, codi- ficado pela seguinte seqüência de ácidos nucléicos: gatatcgtgctgacccagagcccggcgaccctgagcctgtctccgggcgaacgtgcgaccctgagctgc agagcgagccagagcgtgagcagcagctatctggcgtggtaccagcagaaaccaggtcaagcaccgc gtctattaatttatggcgcgagcagccgtgcaactggggtcccggcgcgttttagcggctctggatccggca cggattttaccctgaccattagcagcctggaacctgaagactttgcgacttattattgccttcagatttataatat gcctattacctttggccagggtacgaaagttgaaattaaacgtacggtggctgcaccatctgtcttcatcttcc cgccatctgatgagcagttgaaatctggaactgcctctgttgtgtgcctgctgaataacttctatcccagaga ggccaaagtacagtggaaggtggataacgccctccaatcgggtaactcccaggagagtgtcacagagc aggacagcaaggacagcacctacagcctcagcagcaccctgacgctgagcaaagcagactacgaga aacacaaagtctacgcctgcgaagtcacccatcagggcctgagctcgcccgtcacaaagagcttcaaca ggggagagtgttag (SEQ ID NO 21).

Como impresso acima, a melócula de anticorpo purificada com- preendendo a Asn glicosilada aqui definido na cadeia pesada pode compre- ender, além disso, uma cadeia leve selecionada do grupo consistindo em:

(a) um polipeptídio de cadeia leve codificado por uma molécula de ácido nucléico tal como mostrado nas SEQ ID NO 7, 21, 24 ou 27;

(b) um polipeptídio de cadeia leve possuindo a seqüência de aminoácidos tal como mostrado nas SEQ ID NO 8, 22 ou 28;

(c) um polipeptídio de cadeia leve codificado por uma molécula de ácido nucléico que se hibridiza com a molécula de ácido nucléico de (a) e

que codifica um polipeptídio que é capaz de se ligar -ao pepitídio β-Α4/Αβ4, tal como mostrado na seguinte seqüência de aminoácidos:

DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVVIA

(SEQ ID NO 3); ou um fragmento da mesma compreendendo pelo menos 15 aminoácidos; ou

(d) um polipeptídio de cadeia leve codificado por uma molécula de ácido nucléico que se hibridiza com a molécula de ácido nucléico de (a) e que codifica um polipeptídio que é capaz de se ligar a, pelo menos, duas regiões no pepitídio β-Α4/Αβ4 tal como mostrado na seguinte seqüência de aminoácidos:

DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVVIA (SEQ ID NO 3); ou a pelo menos duas regiões de um fragmento de SEQ ID NO 3 compreendendo pelo menos 15 aminoácidos.

O termo "hibridização" ou "hibridiza", tal como aqui utilizado, no contexto de seqüências de moléculas de ácidos nucléicos/DNA pode se re- lacionar a hibridizações em condições estritas ou não estritas. Se não for adicionalmente especificado, as condições são preferivelmente não estritas. As ditas condições de hibridização podem ser estabelecidas de acordo com os protocolos convencionais descritos, por exemplo, em Sambrook, Russell "Molecular Cloning, A Labocamundongory Manuat', Cold Spring Harbor La- bocamundongory, N.Y. (2001); Ausubel, nCurrent Protocols in Molecular Bio- logy", Green Publishing Associates e Wiley Interscience, N.Y. (1989), ou Higgins e Hames (Eds.)"Nucleic acid hybridization, a practical approach" IRL Press Oxford, Washington DC, (1985). O ajuste das condições está bem dentro das habilidades do técnico e pode ser determinado de acordo com os protocolos descritos na técnica. Assim, somente a detecção das seqüências especificamente hibridizadas necessitará normalmente de condições estritas de hibridização e lavagem, tal como 0,1xSSC, 0,1% de SDS a 65°C. As con- dições de hibridização não estritas da detecção dos homólogos ou das se- qüências não exatamente complementares podem ser estabelecidas a 6xSSC, 1% de SDS a 65°C. Como é bem-conhecido, o comprimento da sonda e a composição do ácido nucléico a ser determinado constituem os parâmetros das condições de hibridização. Observe que as variações nas condições acima mencionadas podem ser realizadas pela inclusão e/ou a substituição de reagentes de bloqueio alternativos usados para suprimir a influência de fundo em experimentos de hibridização. Os reagentes de blo- queio típicos incluem o reagente de Denhardt, BLOTTO, heparina, DNA de esperma de salmão desnaturado, e formulações próprias comercialmente disponíveis. A inclusão de reagentes de bloqueio específicos pode necessi- tar da modificação das condições de hibridização acima descritas, devido a problemas com a compatibilidade. As moléculas de ácido nucléico também compreendem fragmentos das moléculas acima descritas. Tais fragmentos podem representar seqüências de ácidos nucléicos que codificam para uma molécula de anticorpo não funcional ou um fragmento não funcional do mesmo ou para uma CDR tal como aqui definido, e que têm um comprimen- to de pelo menos 12 nucleotídios, preferivelmente de pelo menos 15, mais preferivelmente de pelo menos 18, mais preferivelmente de pelo menos 21 nucleotídios, mais preferivelmente de pelo menos 30 nucleotídios, mesmo mais preferivelmente de pelo menos 40 nucleotídios e mais preferivelmente de pelo menos 60 nucleotídios. Além disso, moléculas de ácido nucléico que hibridiza com alguma das moléculas de ácido nucléico acima mencionadas também incluem fragmentos complementares, derivados e variantes alélicas dessas moléculas. Adicionalmente, um complexo de hibridização refere-se a um complexo entre duas seqüências de ácidos nucléicos em virtude da for- mação de ligações de pontes de hidrogêncio entre as bases complementa- res e entre bases complementares; essas ligações de pontes de hidrogêncio podem ser também estabilizadas pelas interações de empilhamento de ba- ses. Duas seqüências de ácidos nucléicos complementares se ligam por pontes de hidrogênio em uma configuração antiparalela. Um complexo de hibridização pode ser formado em solução (por exemplo, análise Cot e Rot) ou entre uma seqüência de ácidos nucléicos presentes na solução e outra seqüência de ácidos nucléicos imobilizada em um suporte sólido (por exem- plo, em membranas, em filtros, em chips, pinos ou lâminas de vidro, aos quais, por exemplo, as células foram fixadas). Os termos complementares ou complementaridade refere-sem à ligação natural de polínucleotídios sob condições salinas e de temperatura que permitam o pareamento das bases. Por exemplo, a seqüência "A-G-T" se liga à seqüência complementar "T-C- A". A complementaridade entre duas moléculas de fita simples pode ser "parcial", quando somente alguns ácidos nucléicos se ligam, ou pode ser completa quando existe a complementaridade total entre moléculas de fita simples. O grau de complementaridade entre fitas de ácidos nucléicos tem efeitos significantes na eficiência e na força da hibridização entre fitas de ácidos nucléicos. Isto possui importância particular em reações de amplifica- ção, que dependem da ligação entre fitas de ácidos nucléicos.

O termo "seqüências de hibridização" preferivelmente refere-se a seqüências que expõem uma identidade de seqüência de pelo menos 40%, preferivelmente de pelo menos 50%, mais preferivelmente de pelo me- nos 60%, mesmo mais preferivelmente de pelo menos 70%, particularmente preferida de pelo menos 80%, mais particularmente preferida de pelo menos 90%, até mais particularmente preferida de pelo menos 95% e bem mais preferivelmente uma identidade de pelo menos 97% com uma seqüência de ácidos nucléicos tal como descrito acima pela codificação de uma molécula de anticorpo. Além disso, o termo "seqüências de hibridização" preferivel- mente refere-se a seqüências que codificam uma molécula de anticorpo possuindo uma identidade de seqüência de pelo menos 40%, preferivelmen- te de pelo menos 50%, mais preferivelmente de pelo menos 60%, mesmo mais preferivelmente de pelo menos 70%, particularmente preferida de pelo menos 80%, mais particularmente preferida de pelo menos 90%, até mais particularmente preferida de pelo menos 95% e bem mais preferivelmente uma identidade de pelo menos 97% com uma seqüência de aminoácidos da molécula de anticorpo, tal como descrito acima.

De acordo com a presente invenção, o termo "idêntica" ou "per- centual de identidade" dentro do contexto de dois ou mais ácidos nucléicos ou de seqüências de aminoácidos, refere-se a duas ou mais seqüências ou subseqüências que são as mesmas, ou que possuem um percentual especí- fico de resíduos de aminoácidos ou nucleotídios que são os mesmos (por exemplo, a identidade de 60% ou de 65%, preferivelmente, a identidade de 70% a 95%, mais preferivelmente pelo menos uma identidade de 95%), quando comparadas e alinhadas para correspondência máxima sobre uma janela de comparação, ou sobre uma região indicada como medida utilizan- do um algoritmo de comparação de seqüências tal como conhecido na técni- ca, ou pelo alinhamento manual e a inspeção visual. Considera-se que se- qüências posuindo, por exemplo, de 60% a 95% de identidade ou possuindo uma seqüência de identidade maior são substancialmente idênticas. Tal de- finição também se aplica ao complemento de uma seqüência de teste. Prefe- rivelmente a identidade descrita existe sobre uma região que é pelo menos aproximadamente de 15 a 25 aminoácidos ou nucleotídios no comprimento, mais preferivelmente, sobre uma região que é aproximadamente de 50 a 100 aminoácidos ou nucleotídios no comprimento. Os que são versados na téc- nica saberão como determinar a identidade percentual entre duas/várias se- qüências utilizando, por exemplo, algoritmos tais como aqueles baseados nos softwares CLUSTALW (Thompson Nucl. Acids Res. 2 (1994), 4673- 4680) ou FASTDB (Brutlag Comp. App. Biosci. 6 (1990), 237-245), tal como conhecido na técnica.

Embora o algoritmo FASTDB tipicamente não considere se- qüências de eliminações internas de não correspondência ou de adições, isto é, as fendas, no seu cálculo, isso pode ser corrigido manualmente para evitar superestimativa da identidade%. O CLUSTALW, entretanto, realmente leva em conta a seqüência de fendas nos seus cálculos de identidade. Tam- bém disponível para aqueles que são versados nesta técnica estão os algo- ritmos BLAST e BLAST 2.0 (Altschul, Nucl. Acids Res. 25 (1997), 3389- 3402; Altschul, J. Mol. Evol. 36 (1993), 290-300; Altschul, J. MoL BioL 215 (1990), 403-410). O software BLASTN para seqüências de ácidos nucléicos usa como referência um comprimento de palavra (W) de valor 11, uma ex- pectativa (E) de valor 10, M=5, N=4, e uma comparação de ambas as fitas. Para seqüências de aminoácidos, o software BLASTP usa como referência um comprimento de palavra (W) de valor 3, e uma expectativa (E) de valor 10. A matriz de avaliação BLOSUM62 (Henikoff Proc. Natl. Acad. Sci., EUA, 89, (1989), 10915) usa alinhamentos (B) de valor 50, expectativa (E) de valor 10, M=5, N=4, e uma comparação de ambas as fitas.

Além disso, a presente invenção também refere-se a moléculas de ácido nucléico cujas seqüências são degeneradas em comparação com a seqüência de uma molécula de hibridização acima decrita. Quando usado de acordo com a presente invenção o termo "sendo degenerado como um re- sultado do código genético" significa que devido à redundância do código genético, diferentes seqüências de nucleotídios codificam para o mesmo aminoácido.

Para determinar se um resíduo de aminoácido ou um resíduo de nucleotídio em uma dada seqüência de anticorpo corresponde a uma certa posição na seqüência de aminoácidos ou na seqüência de nucleotídios de algumas das, por exemplo, SEQ ID NO 1, 5, 23 e 25, uma pessoa versada pode usar de meios e de métodos bem-conhecidos na técnica, compor e- xemplo, alinhamentos, manualmente ou usando softwares como aqueles mencionados também abaixo, em relação à definição do termo "hibridização" e aos graus de homologia.

Por exemplo, o BLAST 2.0, que significa Ferramenta de Pesqui- sa de Alinhamento Local Básico (BLAST) (Altschul (1997), loc. cit.; Altschul (1993), loc. cit.; Altschul (1990), loc. cit ), pode ser usado para procurar ali- nhamentos de seqüência locais. O BLAST, tal como discutido acima, produz alinhamentos tanto de nucleotídio como de. seqüências de aminoácidos para determinar a similaridade de seqüência. Por causa da natureza local dos alinhamentos, o BLAST é em particular útil na determinação de concordân- cias exatas ou na identificação de seqüências similares. A unidade funda- mental de produção do algoritmo do BLAST é o Par de Segmento de Alta Pontuação (HSP). Um HSP compõe-se de dois fragmentos de seqüência de comprimentos arbitrários, mas iguais, cujo alinhamento é localmente máximo e para o qual a pontuação de alinhamento encontra ou excede um limiar ou a pontuação de corte estabelecida pelo usuário. A aproximação do BLAST é procurar HSPs entre uma seqüência de investigação e uma seqüência do banco de dados, avaliar a significância estatística de qualquer concordância encontrada, e informar somente aquelas concordâncias que satisfaçam o limiar de significação selecionado pelo usuário. O parâmetro E estabelece o limiar estatisticamente significante para informar as concordâncias de se- qüência no banco de dados. O E é interpretado como o valor acima da fre- qüência esperada de ocorrência na possibilidade de um HSP (ou kit de HSPs) dentro do contexto da pesquisa de todo o banco de dados. Qualquer seqüência do banco de dados cuja concordância satisfaça o parâmetro E é informada na saída do software.

Técnicas de computação análogas utilizando BLAST (Altschul (1997), loc. cit.; Altschul (1993), loc. cit.; Altschul (1990), loc. cit.) são usados para procurar moléculas idênticas ou relacionadas em bancos de dados de nucleotídios tal como o GenBank ou o EMBL. Esta análise é muito mais rá- pida do que as múltiplas hibridizações à base de membrana. Além disso, a sensibilidade da pesquisa por computador pode ser modificada para deter- minar se determinada concordância é categorizada como exata ou similar. A base da pesquisa é a pontuação do produto que é definida como: % de identidade da seqüência x% máximo de pontuação BLAST 100

E se considera tanto grau da similaridade entre duas seqüências como o comprimento da seqüência concordante. Por exemplo, com uma pontuação de produto igual a 40, a concordância será exata dentro de um erro de 1 a 2%; e em 70, a concordância será exata. As moléculas similares são normalmente identificadas selecionando aquelas que mostram uma pon- tuação de produto entre 15 e 40, embora uma pontuação mais baixa possa identificar moléculas relacionadas. Outro exemplo de um software capaz de gerar alinhamentos de seqüência é o software CLUSTALW (Thompson, Nu- cl. Ácidos Res. 2 (1994), 4673-4680) ou FASTDB (Brutlag Comp. App. Bios- ci. 6 (1990), 237-245), tal como conhecido na técnica.

Em uma modalidade a presente invenção fornece isoformas de anticorpos glicosilados em que a glicosilação na Asn na região Vh é selecio- nada de um grupo consistindo em: (a) uma estrutura de açúcar do tipo complexo bifurcado sem nú- cleo de fucosilação;

(b) estruturas de açúcar do tipo híbrido bifurcado;

(c) estruturas de açúcar do tipo oligomanose bifurcada; e

(d) uma estrutura de bifurcação de qualquer uma das estruturas de acordo com a figura 5 em anexo, ou com a figura 27 em anexo.

A estrutura de açúcar correspondente, em uma modalidade de anticorpo/anticorpos de acordo com a presente invenção, não compreende uma fucosilação do núcleo.

A glicosilação N correspondente pode consistir predominante- mente em estruturas de açúcar do tipo complexo bifurcado (> 75%; princi- palmente de 80 a 90%) sem núcleo de fucosilação e altamente sialiado com até 80% de bifurcações. As estruturas menores de açúcar pertencem ao hí- brido bifurcado e do tipo oligomanose (< 25%), respectivamente, e são tam- bém mostrados nas Figuras 5 e 27, em anexo. As estruturas de glicosilação na região variável são resistentes à clivagem por N-glicosidase F a partir da proteína (aminoácido polipeptídio).

Em uma modalidade as estruturas de açúcar do complexo domi- nante bifurcado são também caracterizadas por:

- conter um ou dois ácidos siálicos ligados a um ou outro braço da bifurcação ou a ambos. O ácido siálico é do tipo ácido N - acetil neuramí- nico e está mais provavelmente ligado na ligação alfa 2,3 para as galactoses terminais ligadas por ligação beta 1,4. .

- não necessitar de núcleo de fucosilação, isto é, não necessitar de um resíduo fucose ligado na ligação alfa 1,6 à N-acetil-glicosamina mais interna na terminação reduzida da cadeia de açúcar.

Em uma modalidade as estruturas híbridas de açúcar são tam- bém caracterizadas por:

- conter uma bifurcação de tipo complexo (uma unidade Iacto- saminil (GIcNAc-GaI) ligada à estrutura de açúcar principal) tal como um braço da estrutura bifurcada. Este braço predominantemente contém o ácido N - acetil neuramínico ligado à galactose terminal ligada por ligação beta 1,4.

- possuir até 3 subunidades manose adicionais ligadas na estru- tura de açúcar principal como outra bifurcação.

- não necessitar de núcleo de fucosilação, isto é, não necessitar de um resíduo fucose ligado na ligação alfa 1,6 à N-acetil-glicosamina mais interna na terminação reduzida da cadeia de açúcar.

Em uma modalidade as estruturas de açúcar de tipo oligomano- se são adicionalmente caracterizadas por:

- conter 4 (Man4->GlcNAc2), 5 (Man5->GlcNAc2) ou 6 (Man6->GlcNAc2) subunidades manose na estrutura completa do açúcar, isto é, incluindo as 3 subunidades manose de ramificação, presentes em uma típica estrutura de açúcar principal ligada a N.

- não necessitar de núcleo de fucosilação, isto é, não necessitar de um resíduo fucose ligado na ligação alfa 1->6 à N-acetil-glicosamina mais interna na terminação reduzida da cadeia de açúcar

Em outra modalidade de acordo com a presente invenção, uma composição é fornecida compreendendo uma molécula de anticorpo que é caracterizada pelo fato de que um sítio de ligação com antígeno compreende uma asparagina (Asn) glicosilada na região variável da cadeia pesada (Vh) e uma molécula de anticorpo que é caracterizada pelo fato de que dois sítios de ligação com antígeno compreendem uma asparagina (Asn) glicosilada na região variável da cadeia pesada (VH), isto é, uma composição compreen- dendo ANTICORPO monoglicosilado e ANTICORPO diglicosilada, e é daqui por diante mencionada como COMPOSIÇÃO de ANTICORPO. O termo COMPOSIÇÃO de ANTICORPO também refere-se a composições compre- endendo moléculas compreendendo pelo menos uma região Vh glicosilada tal como aqui definido ou pelo menos uma CDR glicosilada da dita região VH, através da qual as ditas moléculas podem, entre outras coisas, ser imuno- globulinas ou isoformas e modificações de imunoglobulinas tal como descrito acima. A dita composição, por exemplo, também pode compreender anticor- pos de cadeia única (scFvs) ou moléculas biespecíficas compreendendo re- giões CDR glicosiladas derivadas da VH.

As novas definições da COMPOSIÇÃO DE ANTICORPO de a- cordo com a presente invenção são fornecidas abaixo.

A COMPOSIÇÃO DE ANTICORPO compreende ou compreende em uma extensão muito baixa moléculas de anticorpo "na Vh não glicosila- da", isto é, anticorpos que não compreendem a glicosilação aqui definida na região variável, particularmente a parte variável da cadeia pesada (Vh).

No contexto de acordo com a presente invenção e em particular no contexto das misturas de anticorpo aqui fornecidas, o termo "compreende ou compreende em uma extensão muito baixa moléculas de anticorpo" signi- fica que a COMPOSIÇÃO DE ANTICORPO compreende menos de 10%, por exemplo, menos de 5%, por exemplo, menos de 4%, por exemplo, menos de 3%, por exemplo, menos de 2%, por exemplo, menos de 1%, por exemplo, menos de 0,5% ou menos de a/uma isoforma não glicosilada, tal como des- crito na presente invenção. Conseqüentemente, em uma modalidade, a presente invenção fornece uma preparação de anticorpo compreendendo anticorpos monogli- cosilados e/ou diglicosiladas (a dita glicosilação sendo localizada na região variável da cadeia pesada) e sendo destituída de moléculas de anticorpos sem glicosilação na região variável.

Novamente, o termo "destituído de moléculas de anticorpos sem glicosilação na região variável" refere-se a preparações de anticor- pos/misturas de anticorpos/acúmulo de anticorpos compreendendo no má- ximo 10%, por exemplo, no máximo 5%, por exemplo, no máximo 4%, por exemplo, no máximo 3%, por exemplo, no máximo 2%, por exemplo, no má- ximo 1%, por exemplo, no máximo 0.5%, por exemplo, no máximo 4%, por exemplo, no máximo 3%, por exemplo, no máximo 2%, por exemplo, no má- ximo 1%, por exemplo, no máximo 0,5%, por exemplo, no máximo 0,3%, por exemplo, no máximo 0,2% de isoformas não glicosiladas, tal como descrito na presente invenção.

Em uma modalidade a presente invenção fornece uma composi- ção que não compreende mais do que 0,5% de isoformas de anticorpo que não são glicosiladas nas suas regiões variáveis, por exemplo, são não glico- siladas na região variável da cadeia pesada.

Tal como indicado acima, em uma modalidade de acordo com a presente invenção, é fornecida uma mistura de anticorpos mono e diglicosi- ladas, por exemplo, imunoglobulinas, a dita mistura sendo destituída de mo- léculas de anticorpos sem glicosilação na região variável. Os anticorpos des- tituídos de tal modificação pós-translacional na região variável, por exemplo, em ambas as regiões variáveis da cadeia pesada (ambas as regiões (Vh)) são, no contexto de acordo com a presente invenção, considerados como uma "forma não glicosilada", não compreendendo nenhuma glicosilação na região variável da cadeia pesada. Ainda, essa "forma não glicosilada" pode compreender, no entanto, a glicosilação na região constante (região C) do anticorpo, por exemplo e, mais comumente, no sítio de glicosilação bem conservada da porção Fc, em particular a asparagina (Asn) 306 na porção Fc não variável/constante tal como aqui definido. As isoformas de ANTICORPOS glicolisadas sozinhas ou como uma combinação de isoformas monoglicosiladas e diglicosiladas são prepa- rações de anticorpo terapêuticas muito úteis e vantajosas para o tratamento do Mal de Alzheimer (AD)1 e outros distúrbios relacionados com a amilóide, tal como a síndrome de Down, hemorragia cerebral hereditária com angiopa- tia amilóide cerebral, doença de Parkinson, ALS (esclerose lateral amiotrófi- ca), doença de Creutzfeld Jacob, demência relacionada com a AIDS e neu- ropatia motora. As isoformas de anticorpos glicosilados sozinhas ou como uma combinação de isoformas monoglicosiladas e diglicosiladas também são ferramentas para diagnósticos únicos.

Ambas as isoformas glicosiladas como descrito na presente in- venção mostram penetração cerebral melhorada e altamente eficaz in vivo. A penetração cerebral eficaz e a ligação específica com as placas de β ami- lóide podem ser demonstradas em camundongos PS2APP, um modelo de camundongo para amiloidose relacioanda com AD.

Além disso, pode ser descoberta a especificidade melhorada para placas de β amilóide genuinamente humanas por pigmentação de imu- noistoquímica in vitro com a viscosidade não específica significativamente reduzida. A concentração eficaz mínima para coloração consistente em pla- cas β amilóide humanas foi determinada como sendo 10 ng/ml, tal como do- cumentado pelos exemplos anexos:

Como documentado pelos exemplos anexos, a separação e a caraterização de anticorpos diferentemente glicosilados, por exemplo, imu- noglobulinas, mostrou que a glicosilação da região variável da cadeia pesa- da tem uma influência surpreendente sobre a ligação do antígeno aos peptí- dios Αβ, o valor diagnóstico, o perfil farmacológico e a atividade funcional. As moléculas de anticorpos purificadas podem ser submetidas à análise de espectrometia de massa (MS), estudos de ligação (Biacore) e mapeamento de epitopo (análise de Pepspot) pela ligação a uma Αβ solúvel, a dissocia- ção do agregado Αβ e a análise microscópica da ligação a placas β-amilóide in vivo e in vitro.

Em uma modalidade de acordo com a presente invenção, o AN- TICORPO purificado ou a COMPOSIÇÃO DE ANTICORPO é capaz de re- conhecer especificamente o peptídio Αβ-Α4/Αβ4.

Conseqüentemente, e tal como descrito na presente invenção, o ANTICORPO purificado ou a COMPOSIÇÃO DE ANTICORPO refere-se em uma modalidade específica a ANTICORPO ou COMPOSIÇÃO DE ANTI- CORPO capaz de reconhecer especificamente duas regiões (a região de terminação Nea parte central/média) de Αβ/Αβ4.

O termo "reconhecer especificamente" significa de acordo com a presente invenção que a molécula de anticorpo é capaz de interagir especifi- camente com e/ou se ligar a pelo menos dois aminoácidos de cada uma das duas regiões de β-Α4 tal como aqui definido. O dito termo refere-se à especi- ficidade da molécula de anticorpo, isto é, à sua capacidade de discriminar entre as regiões específicas do peptídio Αβ-Α4 tal como aqui definido e uma outra, não relacionada com a região do peptídio Αβ-Α4 ou uma outra, proteí- na/peptídio não relacioanda com a APP (sem relações) do peptídio de teste. Desse modo, a especificidade pode ser determinada experimentalmente pe- los métodos conhecidos na técnica e pelos métodos tal como aqui descrito e descrito. Tais métodos compreendem, mas não são limitados a testes Wes- tern blot, ELISA, RIA, ECL, IRMA e varreduras de peptídio. Tais métodos compreendem também a determinação de valores de K0 como, entre outros, ilustrado nos exemplos adicionais. A varredura de peptídio (ensaio pepspot) é empregada rotineiramente para mapear epítopos lineares em um antígeno de polipeptídio. A seqüência primária do polipeptídio é sintetizada sucessi- vamente sobre celulose ativada com os peptídios se sobrepondo ou ao ou- tro. O reconhecimento de determinados peptídios pelo anticorpo a ser testa- do para sua capacidade de detectar ou reconhecer um antígeno/epitopo es- pecífico é marcado pela rotina de desenvolvimento da cor (anticorpo secun- dário com uma enzima ou um corante/como a peroxidase de rabanete ou o 4-cloronaftol ou o peróxido de hidrogênio), por uma reação de quimiolumi- nescência ou por meios similares conhecidos na técnica. Nesse caso das reações de quimioluminescência, entre outras coisas, ou o uso de um anti- corpo fluorescente secundário, a reação pode ser quantificada. Se o anticor- po reagir com um determinado kit de peptídios se sobrepondo, alguém puder deduzir a seqüência mínima de aminoácidos que é necessária para a rea- ção; vide os exemplos ilustrativos fornecidos de acordo com esta invenção.

O mesmo ensaio pode revelar dois aglomerados distantes dos peptídios reativos, que indicam o reconhecimento de um epitopo discontí- nuo, isto é, epitopo conformacional no polipeptídio antigênico (Geysen (1986), Mol. Immunol. 23, 709-715).

Adicionalmente ao ensaio do pepspot, pode ser realizado o en- saio padrão de ELISA. Tal como demonstrado nos exemplos adicionados pequenos hexapeptídios podem ser ligados a uma proteína e revestido em uma imunoplaca e reagida com os anticorpos a serem testados. A pontua- ção pode ser realizada pelo desenvolvimento padrão da cor (por exemplo, um anticorpo secundário com peroxidase de rabanete e tetrametil benzidina com peróxido de hidrogênio). A reação em determinados cavidades é avali- ada pela densidade ótica, por exemplo, em 450 nm. O antecedente típico valor de fundo (= reação negativa) pode ser de 0,1 OD, a típica reação posi- tiva pode ser de 1 OD. Isto significa que a diferença (razão) positiva/negativa pode ser de mais que 10 vezes. Detalhes adicionais são dados nos exem- plos fornecidos. Métodos quantitativos adicionais para determinar a especifi- cidade e a capacidade "de reconhecer especificamente" as duas regiões ... aqui definidas do peptídio β-Α4 são dados abaixo.

O termo "duas regiões do peptídio β-Α4" refere-se a duas regi- ões relacionadas, por exemplo, aos aminoácidos de 3 a 6 da terminação N e a um epitopo central/médio na posição dos aminoácidos de 18 a 24 da SEQ ID NO 3 (peptídio β-Α4). Tal como documentado nos exemplos fornecidos, em particular o ANTICORPO a digliçosilada, uma isoforma aqui fornecida e exemplificada (vide exemplos adicionados) detecta duas porções da molécu- la Αβ, a primeira parte compreendendo o aminoácido de 1 a 10 na termina- ção N e a segunda parte compreendendo os aminoácidos de 17 a 26 na par- te central/média da molécula Αβ (tal como mostrado em SEQ ID NO 3). Desse modo, as misturas de anticorpos aqui fornecidas e compreendendo as isoformas mono e diglicosiladas dos anticorpos tal como aqui fornecido, as duas regiões podendo ser de algum modo espalhadas, por exemplo, os aminoácidos de 1 a 10 (ou a 11 ou a 12) ou uma parte mais curta da mesma, e os aminoácidos de 17 a 26 (ou aminoácidos de 16 a 27) ou uma parte mais curta compreendida entre os aminoácidos de 17 a 26, como, exemplo, os aminoácidos de 19 a 26 ou a 20 ou a 26). O termo de "peptídio β-Α4" no contexto da presente invenção refere-se aos aqui acima descritos Αβ39, Αβ41, Αβ43, particularmente ao Αβ40 e a Αβ42. O Αβ42 é descrito também na SEQ ID NO 3. É de se notar que o termo "duas regiões do peptídio β-Α4" também refere-se a um "epitopo" e/ou "a um determinante antigênico" que compreende as aqui definidas duas regiões do peptídio β-Α4 ou partes das mesmas. De acordo com a presente invenção, as ditas duas regiões do pep- tídio β-Α4 são separadas (ao nível da seqüência do aminoácido) na estrutura primária do peptídio β-Α4 pelo menos por um aminoácido, por exemplo, pelo menos por dois aminoácidos, por exemplo, pelo menos por três aminoáci- dos, por exemplo, pelo menos por quatro aminoácidos, por exemplo, pelo menos por cinco aminoácidos, por exemplo, pelo menos por seis aminoáci- dos. Tal como aqui mostrado e documentado nos exemplos adicionados, as moléculas de anticorpo/anticorpos de acordo com a presente invenção, de- tectam/interagem com e/ou se ligam a duas regiões do peptídio β-Α4 tal co- mo aqui definido, de modo que as duas ditas regiões são separadas (a nível da estrutura primária da seqüência de aminoácido) pelo menos por um ami- noácido e em que as ditas duas regiões de separação das seqüên- cias/"epitopo" podem compreender mais do que sete aminoácidos, mais de 8 aminoácidos, mais de 10 aminoácidos ou mesmo aproximadamente 14 ami- noácidos.

O termo "duas regiões do peptídio β-Α4" pode também se rela- cionar a um epitopo conformacional ou a um epitopo descontínuo consistin- do em duas ditas regiões ou porções do mesmo; vide também Geysen (1986), loc. cit. No contexto de acordo com a presente invenção, um epitopo conformacional é definido por duas ou mais seqüências discretas de amino- ácidos separadas na seqüência primária que vêm juntas na superfície quan- do o polipeptídio se dobra para a proteína nativa (Sela, (1969) Science 166, 1365 e Laver, (1990) Cell 61, 553-6). As moléculas de anticorpo de acordo com a presente invenção são visadas para ligar especificamente a/interagir com um epitopo(s) do conformacional composto de e/ou compreendendo as duas regiões de β-Α4 aqui descritas ou partes das mesmas, tal como descri- to aqui abaixo. As "moléculas de anticorpos" de acordo com a presente in- venção são presumidas por compreenderem uma especificidade dupla si- multânea e independente para (a) um estiramento de aminoácido compre- endendo os aminoácidos de 1 a 11 (ou (a) partes do mesmo) de β-Α4 e (b) a um estiramento do aminoácido compreendendo os aminoácidos de 16 a 27 (ou (a) partes do mesmo) de β-Α4 (SEQ ID NO 3). Os fragmentos ou as par- tes destes estiramentos compreendem pelo menos dois, na maioria dos ca- sos, pelo menos três aminoácidos.

As moléculas de anticorpo, por exemplo, imunoglobulinâs pode- riam, entre outras coisas, ser expresas em três sistemas: a) nas células em- brionárias humanas de rim cotendo o antígeno nuclear do vírus Epstein barr (HEK 293 EBNA, Invitrogen), b) nas células de ovário de hamster chinês transfectadas transientemente (CHO), e c) nas linhagens de células esta- velmente transfectadas (CHO K1 e CHO K1 SV, Lonza Biologics). As três moléculas diferentes de anticorpo (não glicosilado, monoglicosilado ou digli- cosilada) podem ser separadas por etapas específicas de purificação, com- preendendo a purificação da proteína A, cromatografia por troca de cátion, bem como a separação em coluna por exclusão de tamanho, como detalha- do abaixo.

Em uma modalidade de acordo com a presente invenção, a mo- lécula de anticorpo é produzida recombinantemente, por exemplo, em uma célula CHO ou em uma célula HEK 293, preferivelmente células CHO. Em uma modalidade em particular os testes-padrão de glicosilação acima identi- ficados podem ser obtidos após a expressão em células CHO. As células CHO são muito bem conhecidas na técnica e compreendem, entre outras coisas, as células CHO tal como empregados na parte experimental, tal co- mo as células CHO K1 ou CHO K1 SV. As células geralmente usadas de HEK 293 são as HEK 293 EBNA. A expressão recombinante do anticorpo glicosilado de acordo com a presente invenção é realizada, tal como mostrado nos exemplos, em um sistema eucariótico de expressão, particularmente, em células CHO. En- tretanto, células de expressão adicionais, isto é, células eucarióticas, podem ser visadas. As células eucarióticas compreendem, por exemplo, células fúngicas ou células animais. Os exemplos para células fúngicas apropriadas são as células do fermento, por exemplo, aquelas do gênero Saeeharomy- ces, por exemplo, aquelas de Saccharomyces da espécie cerevisiae. As cé- lulas animais apropriadas são, por exemplo, células de inseto, células de vertebrados, por exemplo, células de mamíferos, tais como, por exemplo, NSO, MDCK, U2-OSHela, NIH3T3, MOLT-4, Jurkat, PC-12, PC-3, IMR, NT2N, Sk-n-sk, CaSki, C33A. Também são visadas as linhagens de células humanas. Essas células de hospedeiro, por exemplo, células CHO, forne- cem modificações pós-translacionais às moléculas de anticorpo de acordo com a presente invenção, incluindo o peptídio líder ou a remoção da se- qüência de sinal, a dobradura e a estrutura de cadeias H (pesado) e cadeias L (claras) e o mais importante, a glicosilação da molécula em lados corretos, a saber, na região variável da cadeia pesada. Tal peptídio de sinalização ou a seqüência do líder é clivada proteoliticamente pela sinalpeptidase do hos- pedeiro durante a via secretória durante sua produção recombinante, por exemplo, em células CHO. Linhagens celulares adicionais apropriadas são conhecidas na técnica e são obtidas dos arquivos de linhagens de células, tal como a Coleção de Culturas do Tipo Americano (ATCC). De acordo com a presente invenção, também é contemplado que as culturas de célu- la/células primárias podem funcionar tal como as células de hospedeiro. As ditas células são em particular derivadas de insetos (tal como os insetos das espécies Drosophila ou Blatta) ou de mamíferos (tal como seres humanos, suínos, camundongos ou camundongos). As ditas células de hospedeiro também podem compreender células das, e/ou derivadas das, linhagens celulares tais como linhagens da célula neuroblastoma.

Desse modo, a molécula do anticorpo de acordo com a presente invenção é preparada usando um sistema de expressão recombinante. Um exemplo para tal sistema, tal como indicado acima, é um sistema de expres- são de células de mamíferos usando ovário de hamster chinês (CHO). Estas podem ser usadas com o sistema da glutamina sintetase (GS) (WO 87/04462; WO 89/01036; Bebbington, 1992, Biotechnology (N.Y.), 10, 169- 75). Este sistema envolve a transfecção de uma célula de CHO com um ge- ne que codifica a enzima do GS e os genes dos anticorpos desejados. As células CHO são então selecionadas das que crescem em meios livres de glutamina e submetidas também à inibição da enzima do GS usando a meti- onina sulfoximina (MSX). A fim sobreviver, as células amplificarão a expres- são da enzima do GS e concomitantemente a expressão do mAb.

Um outro sistema de expressão possível é o sistema dhfr de CHO, onde as células CHO são deficientes para a diidrofolato redutase (dh- fr) e dependentes da timidina e hipoxantina para seus crescimentos. A linha- gem de célula parenteral da CHO deficiente de dhfr é transfectada com o anticorpo e o gene do dhfr permitindo assim a seleção de transformantes da célula de CHO do fenótipo não deficiente de dhfr. A seleção é realizada na ausência da timidina e da hipoxantina. A expressão do gene do anticorpo pode ser aumentada pela amplificação usando o metotrexato (MTX). Este fármaco é um inibidor direto da enzima dhfr e permite o isolamento das colô- nias resistentes que amplificam o número da cópia dos seus genes do dhfr e conseqüentemente uma quantidade de genes de anticorpo suficientemente para sobreviver sob estas circunstâncias.

As moléculas purificadas do anticorpo, por exemplo, as imuno- globulinas, podem ser preparadas por um método compreendendo as etapas de:

(a) expressando recombinantemente uma molécula heteróloga do ácido nucléico codificando uma molécula do anticorpo tal como aqui aci- ma definida em uma célula de mamíferos, por exemplo, em uma célula CHO ou em uma célula HEK 293; e

(b) purificando da dita molécula do anticorpo recombinantemente expressada por um método compreendendo as etapas de: (b1) purificação em coluna da proteína A; (b2) purificação em coluna da troca iônica, por exemplo, a cro- matografia da troca de cátions; e, opcionalmente,

(b3) purificação em coluna por exclusão de tamanho. O protocolo de purificação pode compreender etapas adicionais, tais como etapas adicionais de concentração, por exemplo, por diafiltração ou etapas analíticas, por exemplo, envolvendo colunas analíticas. Méto- do/processo pode também compreender as etapas de inativação do vírus e/ou as etapas de remoção do vírus, por exemplo, através de filtra- ções/nanofiltrações. Também é contemplado e praticável que determinadas etapas em particular sejam repetidas (por exemplo, podem ser realizadas duas etapas de cromatografia de troca iônica) ou que determinadas etapas (cromatografia de exclusão de tamanho, por exemplo) possam ser omitidas.

A proteína A é um Iigante específico do grupo que se liga à regi- ão Fc da maioria dos isotipos da IgGI. Isso é sintetizado por algumas cepas do Staphylococcus aureus e pode ser isolada do mesmo e ligada aos grânu- los cromatográficos. Diversos tipos de preparações de gel estão disponíveis comercialmente.

Um exemplo para uma coluna de proteína A que pode ser usada é uma coluna MabSeIect (marca registrada). Idealmente a coluna é equili- brada com Tris/HCI 25 mM, NaCI 25 mM, EDTA 5 mM, o sobrenadante da cultura de células é carregado na coluna, a coluna é lavada com Tris/HCI 1 M pH 7,2 e o anticorpo é eluído em pH 3,2 usando ácido acético 100 mM.

A cromatografia de troca de cátion explora interações que se realizam entre grupos positivamente carregados em uma fase estacionária e a amostra na fase móvel. Quando é usado um trocador de cátions fraco (por exemplo, CM Toyopearl 650®), as seguintes etapas cromatográficas são e- xecutadas: Após o pré-equilíbrio com um ácido acético pH 4, carregamento do eluente de proteína A e da lavagem com 100 mM de ácido acético em pH 4 o anticorpo é eluído e fracionado pela aplicação das etapas de 250 mM de acetato de sódio (pH 7,8 a 8,5) e de 500 mM de acetato de sódio (pH 7,8 a 8,5). Com a primeira etapa são normalmente eluídas uma mistura da fração da isoforma diglicosilada e da fração da isoforma monoglicosilada; usando a segunda etapa, a fração da isoforma não glicosilada é eluída normalmente.

A partir de um trocador de cátion forte (por exemplo, SP Toyo- pearl 650) o anticorpo.pode ser eluído por etapas com sal: Após o equilíbrio da coluna com ácido acético 50 mM, pH 5,0 carregando o eluente da proteí- na A com pH 4 é executada a primeira etapa de eluição usando ácido acéti- co 50 mM e cloreto de sódio 210 mM. Então é aplicada uma segunda etapa de eluição com ácido acético 50 mM e cloreto de sódio 350 mM. Pela primei- ra etapa salina uma mistura da fração da isoforma diglicosilada e da fração da isoforma monoglicosilada é eluída normalmente; pela segunda etapa sa- Iina a isoforma não glicosilada é normalmente eluída.

Adicionalmente, o anticorpo também pode ser eluído de uma coluna forte de troca de cátion (SP-Sepharose® por exemplo) por um gradi- ente salino: Após o pré-equilíbrio, carregando e lavando a coluna em pH 4,5 um gradiente salino é aplicado de 50 mM MES pH 5,8 a 50 mM MES o clore- to de sódio pH 5,8 de/1 M. Aqui a isoforma diglicosilada, a isoforma monogli- cosilada e as frações da isoforma não glicosilada é eluída normalmente se- parada. Na seguinte fração da isoforma diglicosilada e na isoforma monogli- cosilada a fração pode ser acumulada para resultar no acúmulo do produto e/ou em uma mistura desejada do anticorpo.

Uma purificação adicional da mistura de moléculas di e monogli- cosilada do anticorpo, por exemplo, imunoglobulinas, pode ser executado pela cromatografia da exclusão do tamanho. Um exemplo de uma coluna útil é uma coluna de Superdex 200®. Os exemplos de tampões de corrida inclu- em a histidina/cloreto de sódio, por exemplo, os histidina 10 mM/125 mM cloreto de sódio/pH 6, e tampão de fosfato salino (PBS).

A cromatografia de troca aniônica no modo de fluxo direto segui- do por uma concentração/diafiltração é uma etapa alternativa de purificação. A Q-Sepharose® é um exemplo para uma resina para a etapa de troca aniô- nica. Por exemplo, o eluente da cromatografia SP pode ser três vezes diluí- do com os 37,5 mM Tris/HCI pH 7,9 e passado sobre uma coluna do Q- Sepharose pré-equilibrado com 25 de Tris/83 mM de acetato de sódio. Cor- rer através é coletado, ajustado a pH 5,5 e concentrado por ultrafiltração u- sando-se, por exemplo, uma membrana Hydrosart 30 kD®. No seguinte o concentrado pode ser diafiltrado contra, por exemplo, 10 volumes de 20 mM histidina/HCI pH 5,5.

O acima citado protocolo de purificação pode também compre- ender como uma etapa adicional (c) uma etapa analítica de cromatografia, como o uso de uma coluna Mono-S HR5/5. Entretanto, etapas, como a diafil- tração, por exemplo, para a concentração das moléculas do anticorpo, po- dem ser contempladas.

Em uma modalidade de acordo com a presente invenção, uma composição, uma preparação de anticorpo, ou um acúmulo de anticorpo, é fornecida compreendendo moléculas do anticorpo como descrita nisto ou moléculas do anticorpo como preparada pelo método fornecido acima. Nesta modalidade de acordo com a presente invenção, a composição dita compre- ende anticorpos mono- ou diglicosilada. Em uma outra modalidade, a com- posição dita compreende mono- e diglicosilada (na região(ões) variável da cadeia(s) pesado) os anticorpos diglicosilada e a composição dita são deri- vados das moléculas do anticorpo que faltam a glicosilação na região variá- vel. No contexto desta modalidade, "o termo pool de anticorpo" se refere a uma mistura (na(s) região(ões) variável(is) de anticorpos mono- e diglicosila- dos da(s) cadeia(s) pesada(s) que podem individualmente ter sido isolados e em seguida combinados a uma mistura. As misturas do anticorpo ou os a- cúmulos do anticorpo fornecidos nisto podem compreender 50% monoglico- silada e anticorpos diglicosilada de 50% como definido nisto. Entretanto, contemplado também são as relações de 30/70 a 70/30. Ainda, a pessoa versada na técnica está ciente que também outras relações contemplado nas misturas do anticorpo de acordo com a presente invenção. Por exemplo, também 10/90 ou 90/10, 20/80 ou 80/20 bem como 40/60 ou 60/40 podem ser empregados no contexto de acordo com a presente invenção. Como do- cumentado também nos exemplos, uma relação útil particular nas MISTU- RAS de ANTICORPO de acordo com a presente invenção compreende o anticorpo diglicosilada e monoglicosilada como aqui acima definida de é uma relação de 40/60 a 45/55. As composições fornecidas nisto são particularmente úteis no diagnóstico ou em uma composição farmacêutica.

Desse modo, a invenção fornece composições diagnosticas ou pharmaceutical compreendendo

(a) uma molécula do anticorpo como definida acima de compre- ender um local obrigatório do antígeno com uma Asn glicosilada;

(b) uma molécula do anticorpo como definida acima, compreen- dendo dois locais obrigatórios do antígeno com uma Asn glicosilada; ou, o mais preferivelmente,

(c) uma combinação das moléculas do anticorpo (a) a (b). A combinação (c) tal como aqui fornecido, compreendendo a(s) molécula(s) de anticorpo compreendendo um sítio de ligação de antígeno com uma Asn glicosilada e a(s) molécula(s) de anticorpo compreendendo dois sítios de ligação de antígeno com uma Asn glicosilada são isentos de isoformas não glicosilada (com relação à região variável da cadeia pesada). Tal como indicado acima, o termo isento de isoformas não glicosiladas (com relação à região variável da cadeia pesada)" refere-se às preparações de combinações/pools de anticorpo /anticorpo, em que menos de 5%, por e- xemplo, menos de 4%, menos de 3%, menos de 2%, menos de 1% ou mesmo menos de 0,5% da espécie do anticorpo em combinação dita é gli- cosilado de não na região variável da cadeia pesada. Como demonstrado nos exemplos, a dita preparações de combinações/anticorpo acúmu- los/anticorpo pode não compreender quase nenhum (menos de 0,5%) iso- formas não glicosilada. A porcentagem e/ou a quantidade de um isoforma dado de glicosilação (como definida nisto, por exemplo, glicosilação na regi- ão variável da cadeia pesada, vê entre outros figura adicionada 14) em uma dada COMPOSIÇÃO de ANTICORPO podem facilmente ser determinadas pelos métodos conhecidos na técnica. Estes métodos compreendem, mas não são limitados a, spectrometria maciça, de análise de SDS-PAGE troca de íon, HPLL, ELISA e similares.

Tal como mostrado nos exemplos adicionados, a imuno- decoração específica e sensível de placas β-amilóide de Alzheimer genuíno pelos anticorpos de acordo com a presente invenção é demonstrada in vitro com experimentos de coloração em imunoistoquímica usando crio-seções do tecido do cérebro humano dos pacientes de AD. A coloração eficaz de pla- cas β-amilóide das fatias do cérebro foi demonstrado também com anticor- pos anti-Αβ humano dos pacientes vacinada com Αβ (Hock, 2002, Nature Medicina, 8, 1270-1275). Adicionalmente, a imuno-decoração é demonstrada também em um modelo animal transgênico que caracteriza a carga da placa β-amilóide (Richards, 2003, J. Neuroscience, 23, 8989-9003). Em modelos animais similares tinha-se demonstrado que este emperramento da placa conduzido a seu afastamento e subseqüentemente a uma melhoria da doen- ça relacionou sintomas, visto que a participação de processos dependentes da Fc tinha sido discutida (Bard, 2000, Nature Medicina, 6, 916-919; Wilcock, 2003, Neurobiology Disease, 15,11 -20; Wilcock, 2004, J. Neuroscience, 24, 6144-6151). Além disso, emperramento eficaz do anti-Αβ os anticorpos às placas β-amilóide foram relatados ao correlato com progressão mais lenta da doença (Hock, 2002, Nature Medicina, 8, 1270-1275; Hock, 2003, Neu- ron, 38, 547-554). Esta análise pós-morte do tecido do cérebro humano su- gere que a fagocitose de células da microglia está envolvido mecanicamente na eliminação da placa no homem ((Nicoll, 2003, Nature Medicina, 9, 448- 452)). Conseqüentemente o anticorpo de acordo com a presente invenção - ou compreendido em particular em composições farmacêuticas é uma IgGI humana, que é responsável principalmente por processos dependentes da FcR nos seres humanos. O ornamento imunoeficiente da placa β-amilóide dos anticorpos da mistura de acordo com a presente invenção sugere que o fármaco será eficiente para formar uma imunização passiva para eliminar as placas β-amilóides existentes e para impedir a formação de novas placas em seres humanos.

Além disso, os anticorpos devem preferivelmente ser capazes de cruzar a barreira de sangue-cérebro para alcançar seu lugar de destino. Pa- ra moléculas grandes do tamanho como as IgGs humano este processo é dramaticamente reduzido, de modo que somente aproximadamente de 0,1% a 0,2% da concentração do plasma de um anticorpo podem ser atingidos no fluido cérebro-espinhal (FCE). O mecanismo de eliminação da placa é ainda um assunto de debates controversos, que puderam envolver efeitos periféri- cos no Αβ peptídio (Dodart, 2002, Nature Neuroscience, 5: 452-457). Assim, o anticorpo terapêutico gerado ou as misturas de acordo com a invenção correspondentes aos monoglicosilado e diglicosilado (na cadeia pesada da região variável), de acordo com a presente invenção, têm também a proprie- dade para despolimetrizar multímeros Αβ in vitro sem participação de pro- cessos dependentes da Fc e para ligar ao solúvel Αβ monômeros e oligô- merps no fluido cérebro-espinhal (FCE), uma vez que a neutralização de peptídeos Αβ monoméricos aou Αβ oligoméricos solúveis (intermediários da agregação por exemplo) podem também contribuir ao efeito abaixando ami- lóide total (Du, 2003, cérebro, 126: 1-5).

As composições de acordo com a presente invenção podem ser administradas na forma sólida ou líquida e podem ser, entre outros, em um forma de pó(s), comprimido(s), solução(ões) ou aerossol(is). A composição dita pode compreender sobre ou mais moléculas de anticorpos/anticorpo de acordo com a presente invenção o mais preferivelmente uma mistura de an- ticorpos monoglicosilados e diglicosilados tal como aqui fornecido. Refere-se que a composição farmacêutica dita, compreende opcionalmente um veículo e/ou um diluente farmaceuticamente aceitáveis. A composição farmacêutica aqui descrita pode ser particularmente útil" para o tratamento de distúrbios neurológicos e/ou neurodegenerativos. Os ditos distúrbios compreendem, mas não estão limitados o mal de Alzheimer, a esclerose lateral amiotrófica (ALS), a hemorragia cerebral hereditária com angiopatia amilóide cerebral (dutch), a síndrome de Down, demência relacionada com a AIDS, doença de Parkinson e distúrbios neuroniais relacionados ao envelhecimento. A com- posição farmacêutica de acordo com a presente invenção é, entre outras coisas, contemplada como uma potente inibidora da formação da placa ami- lóide ou como um potente estimulador para a despolimerização das placas amilóides. Conseqüentemente, a presente invenção fornece composições farmacêuticas compreendendo os compostos de acordo com a presente in- venção a serem usados para o tratamento de doenças/distúrbios amiloido- gênicos. O termo "doença/distúrbio amiloidogênico" inclui qualquer doença associada com ou causada pela formação ou pela deposição de fibrilas ami- lóides e/ou pela proteólise patológica do APP. Exemplos de doenças amiloi- dogênicas incluem, mas não estão limitados ao mal de Alzheimer (AD), sín- drome de Down, à demência associada com a formação do corpo de Lewy1 à doença de Parkinson com demência, ao distúrbio cognitivo suave, à de- mência angiopática e vascular amilóide cerebral. As doenças amiloidogêni- cas diferentes são definidas e/ou caracterizadas pela natureza do compo- nente polipeptídio dos depósitos amilóide. Por exemplo, a proteína β amilói- de é característica para os depósitos amilóides encontrados nos pacientes que têm o mal de Alzheimer.

Os exemplos de veículos, de excipientes e/ou de diluentes far- macêuticos apropriados são conhecidos bem na técnica e incluem as solu- ções salinas protegidas fosfato, água, emulsões, tais como emulsões de ó- leo/água, vários tipos de agentes umectantes, as soluções estéreis etc. As composições compreendendo tais veículos podem ser formuladas por méto- dos convencionais conhecidos cavidade. Os veículos apropriados podem compreender todo o material que, quando combinado com o anti-Ac o agen- te de ligação ou o anticorpo específico, retêm o emperramento da afinidade elevada de Αβ e é não reativo com os sistemas imunes do paciente incluindo excipientes, tensoativos; agentes de tonicidade e similares; vide Remington's Pharmaceutical Sciences (1980) 16- Ed, Osol, A.Ed. Estas composições farmacêuticas podem ser administradas ao paciente em uma dose apropria- da. A administração das composições apropriadas pode ser efetuada pelas maneiras diferentes, por exemplo, pela administração parenteral, subcutâ- nea, intraperitoneal, tópica, intrabronquial, intrapulmonar e intranasal e, se desejado para o tratamento local, pela administração do intralesional. As administrações parenterais incluem a administração intravenosa ou intra- arterial, intraperitoneal, intramuscular, intradérmica, subcutânea. É particu- larmente preferido que a dita administração seja realizada pela injeção e/ou pela liberação, por exemplo, a um local em uma artéria do cérebro ou dire- tamente no tecido do cérebro. As composições de acordo com a presente invenção podem também ser administradas diretamente no local do alvo, por exemplo, pela liberação biolística em um local externo ou interno do alvo, como o cérebro.

As composições farmacêuticas compreendendo os anticorpos glicosilados aqui descritos são preparadas misturando o anticorpo possuindo o grau desejado de pureza com os veículos, os excipientes, os estabilizado- res, os tensoativos, os tampões e/ou os agentes psicologicamente aceitáveis opcionais de tonicidade. Os veículos, os excipientes e/ou os estabilizadores aceitáveis são não tóxicos aos receptores nas dosages e nas concentrações empregadas, e incluem tampões tais como o fosfato, o citcamundongo, e outros ácidos orgânicos; antioxidantes incluindo o ácido ascórbico, a glutati- ona, a cisteína, o metionina e o ácido cítrico; conservantes (tais como o eta- nol, álcool benzílico, fenol, m-cresol, p-cloro-m-cresol, metil ou propil para- beno, cloreto benzalcônio ou combinações dos mesmos); aminoácidos tais como a arginina, a glicina, a ornitina, a lisina, a histidina, o ácido glutâmico, o ácido aspártico, a isoleucina, a leucina, a alanina, a fenilalanina, a tirosina, o triptofano, o metionina, o serina, o prolina e as combinações dos mesmos; monossacarídios, dissacarídios e outros carboidratos; polipeptídios de bai- xos pesos moleculares (menos do que aproximadamente 10 resíduos); pro- teínas, tais como a albumina da gelatina ou do soro; agentes quelantes tais como o.EDTA; açúcares tais como a trealose, a sacarose, a lactose, a glico- se, a manose, a maltose, a galactose, a frutose, a sorbose, a rafinose, a gli- cosamina, a N-metilglicosamina ("chamada de meglumina"), a galactosami- na e o ácido neuramínico; e/ou tensoativos não iônicos tais como o Tween, o Brij Pluronics, do Triton-X ou polietileno glicol (PEG).

A composição farmacêutica pode estar em uma forma líquida, em uma forma liofilizada ou em uma forma líquida reconstituída de uma for- ma liofilizada, ém que a preparação liofilizada deve ser reconstituída com uma solução estéril antes da administração. O procedimento padrão para reconstituição de uma composição liofilizada deve ser adicionar de volta um volume de água pura (tipicamente equivalente ao volume removido durante a liofilização), porém também as soluções compreendendo agentes antibac- terianos podem ser usadas para a produção de composições farmacêuticas para a administração parenteral; vide também Chen (1992), Drug Dev Ind Pharm 18, 1311-54.

Os exemplos de concentrações do anticorpo na composição farmacêutica podem variar de aproximadamente 1 mg/mL a aproximada- mente 200 mg/ml, ou de aproximadamente 50 mg/mL a aproximadamente 200 mg/mL, ou de aproximadamente 150 mg/mL a aproximadamente 200 mg/mL. Para maior clareza das razões, enfatiza-se que as concentrações tal como aqui indicadas se relacionam à concentração em um líquido ou em um líquido que seja exatamente reconstituído a partir de uma forma sólida.

Um formulação aquosa do anticorpo pode ser preparada em uma solução com pH controlado, por exemplo, com um pH que varia de a - proximadamente 4,0 a aproximadamente 7,0, ou de aproximadamente 5,0 a aproximadamente 6,0, ou que alternativamente seja de aproximadamente 5,5. Os exemplos de tampões que são apropriados para um pH dentro desta faixa de variação incluem os tampões de fosfato, histidina, citcamundongo, succinato, acetato e os outros tampões do ácidos orgânicos. A concentração do tampão pode ser de aproximadamente 1 mM a aproximadamente 100 mM, ou de aproximadamente 5 mM a aproximadamente 50 mM, dependen- do, por exemplo, do tampão e da tonicidade desejada da formulação.

Um agente de tonicidade pode ser incluído na formulação de anticorpo para modular a tonicidade da formulação. Os exemplos de agentes de tonicidade incluem o cloreto de sódio, o cloreto de potássio, a glicerina e quaisquer componentes do grupo dos aminoácidos, açúcares bem como combinações dos mesmos. Preferivelmente a formulação aquosa é isotôni- ca, embora as soluções hipertônicas ou hipotônicas possam ser apropriadas. O termo "isotônica" denota uma solução possuindo a mesma tonicidade que qualquer outra solução com a qual é comparada, como a solução salina fi- siológica e o soro do sangue. Os agentes de tonicidade podem ser usados em uma quantidade de aproximadamente 5 mM a aproximadamente 350 mM, em particular em uma quantidade de 105 mM a 305 nM.

Um tensoativo pode também ser adicionado à formulação de anticorpo para reduzir a agregação do anticorpo formulado e/ou para minimi- zar a formação de particulados na formulação e/ou para reduzir a adsorção. Os exemplos de tensoativos incluem os ésteres de ácidos graxos do polioxi- etileno sorbitano (Tween)1 os éteres alquílicos do polioxietileno (Brij), os éte- res do alquil fenil polioxietileno (Triton-X), os copolímeros do polioxietileno- polioxipropileno (Poloxamer, Pluronic), e dodecil sulfonato de sódio (SDS). Os ésteres de ácidos graxos de polioxietileno sorbitano preferidos são o Po- Iissorbato 20, (vendido sob a marca registrada de Tween 20®) e Polissorbato 80 (vendido sob a marca registrada de Tween 80®). Os copolímeros preferi- dos de polietileno-polipropileno são aqueles vendidos sob os nomes Pluro- nic® F68 ou Poloxamer 188™. Os éteres alquílicos preferidos do polioxietile- no são aqueles vendidos sob a marca registrada Brij™. Os exemplos de concentração do tensoativo podem variar de aproximadamente 0,001% a aproximadamente 1 % p/v.

Um lioprotetor também pode ser adicionado a fim proteger um ingrediente ativo lábil (por exemplo uma proteína) contra as condições de desestabilização durante o processo de liofilização. Por exemplo, os Iioprote- tores conhecidos incluem açúcares (glicose incluindo a sacarose); polióis (manitol incluindo, sorbitol e glicerol); e aminoácidos (alanina incluindo, glici- na e ácido glutâmico). O Iioprotetor é usado geralmente em uma quantidade de aproximadamente 10 mM a 500 nM.

Em uma modalidade, a formulação contém os agentes acima identificados (isto é anticorpo glicosilado, tensoativo, tampão, estabilizador e/ou agente de tonicidade) e está essencialmente livre de um ou mais con- servantes, tais como o etanol, álcool benzílico, fenol, m-cresol, p-cloro-m- cresol, metil ou propil parabeno, cloreto benzalcônio, e combinações dos mesmos.

Em uma outra modalidade, um conservante pode ser incluído na formulação, por exemplo, em concentrações quê variam de aproximadamen- te 0,001% a aproximadamente 2% (p/v). Em uma modalidade, a formulação do anticorpo de acordo com a presente invenção é um líquido ou um formu- lação Iiofilizada apropriada para administração parenteral, que pode com- preender:

- de aproximadamente 1 mg/mL a aproximadamente 200 mg/mL dos anticorpos glicosilados aqui descritos ou da COMPOSIÇÃO de ANTI- CORPO,

- de aproximadamente 0,001% a aproximadamente 1% de pelo menos um tensoativo;

- de aproximadamente 1 mM a aproximadamente 100 mM de um tampão;

- opcionalmente de aproximadamente 10 mM a aproximadamen- te 500 mM de um estabilizador e/ou de aproximadamente 5 mM a aproxima- damente 305 mM de um agente de tonicidade;

- em um pH de aproximadamente 4,0 a aproximadamente 7,0. Em uma modalidade preferida, a formulação parenteral de acor- do com a presente invenção é um líquido ou uma formulação Iiofilizada com- preendendo:

- de aproximadamente 1 a aproximadamente 200 mg/mL dos anticorpos glicosilados aqui descritos ou da COMPOSIÇÃO de ANTICOR- PO,

- 0,04% Tween 20 p/v,

- 20 mM de L-histidina,

- 250 mM de sacarose,

- em pH 5,5.

Em uma modalidade mais preferida, a formulação parenteral de acordo com a invenção compreende também uma formulação Iiofilizada compreendendo:

- 15 mg/mL dos anticorpos glicosilados aqui descritos ou da COMPOSIÇÃO de ANTICORPO,

- 0,04% Tween 20 p/v,

- 20 mM de L-histidina,

- 250 mM de sacarose,

- em pH 5,5;

ou - 75 mg/mL dos anticorpos glicosilados aqui descritos ou da COMPOSIÇÃO de ANTICORPO,

- 0,04% Tween 20 p/v,

- 20 mM de L-histidina,

- 250 mM de sacarose,

- em pH 5,5; ou

- 75 mg/mL dos anticorpos glicosilados aqui descritos ou da COMPOSIÇÃO de ANTICORPO,

- 0,02% Tween 20 p/v,

- 20 mM de L-histidina,

- 250 mM de sacarose,

- em pH 5,5; ou

- 75 mg/mL dos anticorpos glicosilados aqui descritos ou da COMPOSIÇÃO de ANTICORPO,

- 0,04% Tween 20 p/v,

- 20 mM de L-histidina,

- 250 mM de trealose,

- em pH 5,5; ou

- 75 mg/mL dos anticorpos glicosilados aqui descritos ou da COMPOSIÇÃO de ANTICORPO,

- 0,02% Tween 20 p/v,

- 20 mM de L-histidina,

- 250 mM de trealose,

- em pH 5,5.

Em uma outra modalidade mais preferida, a formulação parente- ral de acordo com a invenção compreende também uma formulação líquida compreendendo:

- 7,5 mg/mL dos anticorpos glicosilados aqui descritos ou da COMPOSIÇÃO de ANTICORPO, - 0,022% Tween 20 p/v,

- 120 mM de L-histidina,

- 250 125 mM de sacarose,

- em pH 5,5; ou

- 37,5 mg/mL dos anticorpos glicosilados aqui descritos ou da COMPOSIÇÃO de ANTICORPO,

- 0,02% Tween 20 p/v,

- 10 mM de L-histidina,

- 125 mM de sacarose,

- em pH 5,5; ou

- 37,5 mg/mL dos anticorpos glicosilados aqui descritos ou da COMPOSIÇÃO de ANTICORPO,

- 0,01% Tween 20 p/v,

- 10 mM de L-histidina,

- 125 mM de sacarose,

- em pH 5,5; ou

- 37,5 mg/mL dos anticorpos glicosilados aqui descritos ou da

COMPOSIÇÃO de ANTICORPO,

- 0,02% Tween 20 p/v,

- 10 mM de L-histidina,

- 125 mM de trealose,

- em pH 5,5; ou

- 37,5 mg/mL dos anticorpos glicosilados aqui descritos ou da COMPOSIÇÃO de ANTICORPO,

- 0,01% Tween 20 p/v,

- 10 mM de L-histidina,

- 125 mM de trealose,

- em pH 5,5; ou

- 75 mg/mL dos anticorpos glicosilados aqui descritos ou da COMPOSIÇÃO de ANTICORPO,

- 0,02% Tween 20 p/v,

- 20 mM de L-histidina,

- 250 mM de trealose,

- em pH 5,5; ou

- 75 mg/mL dos anticorpos glicosilados aqui descritos ou da COMPOSIÇÃO de ANTICORPO,

- 0,02% Tween 20 p/v,

- 20 mM de L-histidina,

- 250 mM de manitol,

- em pH 5,5; ou

- 75 mg/mL dos anticorpos glicosilados aqui descritos ou da COMPOSIÇÃO de ANTICORPO,

- 0,02% Tween 20 p/v,

- 20 mM de L-histidina,

- 140 mM de cloreto de sódio,

- em pH 5,5; ou

- 150 mg/mL dos anticorpos glicosilados aqui descritos ou da COMPOSIÇÃO de ANTICORPO,

- 0,02% Tween 20 p/v,

- 20 mM de L-histidina,

- 250 mM de trealose,

- em pH 5,5; ou

- 150 mg/mL dos anticorpos glicosilados aqui descritos ou da COMPOSIÇÃO de ANTICORPO,

- 0,02% Tween 20 p/v, - 20 mM de L-histidina,

- 250 mM de manitol,

- em pH 5,5; ou

- 150 mg/mL dos anticorpos glicosilados aqui descritos ou da

COMPOSIÇÃO de ANTICORPO,

- 0,02% Tween 20 p/v,

- 20 mM de L-histidina,

-140 rríM de cloreto de sódio,

- em pH 5,5; ou

-10 mg/mL de anticorpo A-beta,

- 0,01% Tween 20 p/v,

- 20 mM de L-histidina,

-140 mM de cloreto de sódio,

- em pH 5,5.

Em uma modalidade, a composição farmacêutica de acordo com a presente invenção é uma formulação líquida compreendendo: -10 mg/mL de anticorpo A-beta, - 0,01% Tween 20 p/v,

- 20 mM de L-histidina,

-140 mM de cloreto de sódio,

- em pH 5,5.

Em uma outra modalidade, a composição farmacêutica de acor- do com a presente invenção é uma formulação Iiofilizada compreendendo:

- 75 mg/mL de anticorpo A-beta,

- 0,04% Tween 20 p/v,

- 20 mM de L-histidina,

- 250 mM de sacarose, - em pH 5,5.

O termo "anticorpos glicosilados aqui descritos" no contexto das formulações exemplificadas pode compreender, de acordo com a presente invenção, os anticorpos monoglicosilados aqui definidos, os anticorpos digli- cosilados aqui definidos, bem como as misturas dos mesmos.

O regime de dosagem será determinado pelo médico atendente e pelos fatores clínicos. Tal como é conhecido nas práticas médicas, as do- sages para cada paciente dependem de diversos fatores, incluindo o tama- nho do paciente, a área da superfície corporal, a idade, o composto em par- ticular a ser administrado, o sexo, o tempo e rota de administração, a saúde em geral, e de outros fármacos que estejam sendo administrados simultane- amente. Farmaceuticamente a matéria ativa proteinácea pode estar presente nas quantidades entre 1 ng e 20 mg/kg de peso corporal por dose, por e- xemplo, entre 0,1 mg/kg a 10 mg/kg de peso corporal, por exemplo, entre 0,5 mg/kg de 5 mg/kg de peso corporal; entretanto, são contempladas as doses abaixo ou acima dessas faixas de exemplo, considerando especialmente os fatores acima mencionados. Se o regime for uma infusão contínua, deve também estar na faixa de 1 pg a 10 mg por quilograma de peso corporal por minuto.

As composições farmacêuticas tal como as aqui descritas po- dem ser formuladas para serem de rápida ação, de rápida liberação, de lon- ga atuação, ou de liberação lenta. Desse modo, as composições farmacêuti- cas podem também ser apropriadas para a liberação lenta ou para liberação controlada.

Preparações de lenta liberação podem ser preparadas usando os métodos bem-conhecidos na técnica. Os exemplos apropriados de prepa- rações de lenta liberação incluem matrizes semipermeáveis de polímeros hidrofóbicos sólidos contendo o anticorpo cujas matrizes estão na forma de produtos modelados, por exemplo, na forma de películas ou de microcápsu- las. Os exemplos matrizes de liberação controlada incluem os poliésteres, copolímeros de ácido L-glutâmico com o L-glutamato de etila, etileno com acetato de vinila não degradável, os hidrogéis, os polilactídios, copolímeros degradáveis do ácido lático com ácido glicólico e ácido poli-D-(-)-3- hidroxibutírico. A possível perda da atividade biológica e as possíveis mu- danças na imunogênicidade dos anticorpos compreendidos por preparações de lenta liberação podem ser evitadas pelo uso de aditivos apropriados, pelo controle do teor de umidade e pelo desenvolvimnto de composições especí- ficas da matriz polimérica.

O progresso pode ser monitorado pela avaliação periódica. As composições, isto é, os anticorpos monoglicosilados e/ou diglicosilados, de acordo com a presente invenção, ou de uma mistura dos mesmos, podem ser administrados localmente ou sistemicamente. É de se notar que os anti- corpos administrados perifericamente podem entrar no sistema nervoso cen- tral, vide, entre outros, Bard (2000), Nature Med. 6, 916-919. As preparações para a administração parenteral incluem soluções, suspensões, e emulsões, aquosas ou não aquosas, estéreis. Exemplos de solventes não aquosos são o propileno glicol, polietileno glicol, os óleos vegetais tais como o óleo de oliva, e ésteres orgânicos injetáveis tais como o oleatõ de etila. Os veículos aquosos incluem a água, as soluções alcoólico/aquosas, as emulsões ou as suspensões, incluindo meios salinos e tamponados. Os veículos para admi- nistração parenteral incluem a solução de cloreto de sódio, solução de Rin- ger dextrose, a solução de Ringer lactato, ou os óleos fixos. Os veículos pa- ra administração intravenosa incluem os repositores de fluidos e nutrientes, os repositores de eletrólito (tais como aqueles baseados em Ringer dextro- se), e similares. Os conservantes e outros aditivos podem também estar presentes como, por exemplo, antimicrobianos, antioxidantes, agentes que- lantes, gáses inertes e similares. Além disso, a composição farmacêutica de acordo com a presente invenção pode compreender alguns agentes adicio- nais dependendo do uso pretendido da composição farmacêutica. Os ditos agentes podem ser fármacos que agem sobre o sistema nervoso central, tais como, fatores neuroprotetores, inibidores da colinesterase, agonistas dos receptores muscarínico M1, hormônios, antioxidantes, inibidores de inflama- ção, etc. É particularmente preferido que as ditas composições farmacêuti- cas compreendam alguns agentes adicionais tais como, por exemplo, neuro- transmissores e/ou moléculas de substituição para neurotransmissores, vi- tamina E ou ácido do alfa-lipóico.

Uma pessoa versada na técnica, em particular mas não se Iimi- tando a bioquímicos, biólogos, químicos, farmacêuticos e grupos dos citados profissionais estão prontamente aptos a trabalhar e gerar as composições farmacêuticas acima citadas. Do mesmo modo qualquer pessoa versada na técnica, como médicos atendentes, possuem conhecimentos de como tais composições farmacêuticas podem ser administradas a um paciente que esteja necessitando de um tratamento com as composições farmacêuticas aqui definidas. Tal administração pode compreender a administração sistê- mica, por exemplo, através de infusões e/ou de injeções. Entretanto, tam- bém é contemplada a administração dos compostos e/ou das misturas com- postas de acordo com a presente invenção diretamente ao cérebro. Por e- xemplo, o composto ou a mistura composta ou a formulação composta po- dem ser administrados por injeção intraventricular ou intratecal diretamente ao cérebro, através de infusão lenta para minimizar preferivelmente o impac- to sobre o parênquima do cérebro. Também pode ser empregado um im- plante de liberação lenta no cérebro. Também é contemplado que aproxima- ções de terapias genéticas sejam empregadas, por exemplo, através uso de implantes de células recombinantes que produzem os anticorpos tal como definidos na presente invenção. Estas "células recombinantes" devem ser capazes de fornecer as glicosilações aqui definidas nas regiões/partes variá- veis dos anticorpos aqui descritos, em particular os anticorpos anti-Αβ de acordo com a presente invenção. Ainda, tal como indicado acima, uma van- tagem das misturas de anticorpos/anticorpo de acordo com a presente in- venção é sua potencialidade para cruzar a barreira de sangue-cérebro e se ligar às placas amilóides. As composições farmacêuticas abaixo descritas, de acordo com a presente invenção, podem ser usadas para o tratamento de todos os tipos de doenças até aqui desconhecidas ou que estejam relacio- nadas a, ou que sejam dependentes, da agregação patológica do APP ou do processamento patológico do APP. Elas podem ser particularmente úteis para o tratamento das doenças de Alzheimer e outras doenças onde os de- pósitos extracelulares da β-amilóide, pareçam exercer alguma influência. Elas devem ser desejavelmente empregadas em seres humanos, embora o tratamento animal também esteja abarcado pelos referidos métodos, pelos usos e pelas composições aqui descritas.

Em uma modalidade preferida de acordo com a presente inven- ção, a composição de acordo com a presente invenção, tal como descrita aqui acima, é uma composição para uso em diagnóstico compreendendo também, opcionalmente, meios apropriados para a detecção. A composição para uso em diagnóstico compreende pelo menos um dos compostos acima mencionados de acordo com a presente invenção, ou seja os anticorpos gli- cosilados aqui descritos.

A dita composição para uso em diagnóstico pode compreender os compostos de acordo com a presente invenção, em particular as molécu- las de anticorpo glicosilado de acordo com a presente invenção, a forma so- lúvel/fase líquida, mas também é contemplado que os ditos compostos este- jam ligados a, ou presos a, ou conectados a um suporte sólido.

Os suportes sólidos podem ser usados em combinação com a composição para uso em diagnóstico tal como aqui definido ou os compos- tos de acordo com a presente invenção podem ser diretamente ligados aos ditos suportes sólidos. Tais suportes são bem-conhecidos na técnica e com- preendem, entre outras coisas, materiais comercialmente disponíveis para colunas, grânulos de poliestireno, grânulos de látex, grânulos magnéticos, as partículas metálicas coloidais, superfícies e chips de vidro e/ou de silício, as tiras do nitrocelulose, as membranas, as folhas, os "duracytes", os cavidades e as paredes das placa de micros de reação, os tubos plásticos etc. Os compostos de acordo com a presente invenção, em particular os anticorpos de acordo com a presente invenção, podem estar ligados a muitos veículos diferentes. Os exemplos de veículos bem-conhecidos incluem o vidro, o poli- estireno, o cloreto de polivinila, o polípropileno, o polietileno, o policarbonato, o dextrano, o náilon, as amiloses, as celuloses naturais e modificadas, as poliacrilamidas, as agaroses, e a magnetita. A natureza do veículo pode ser solúvel ou insolúvel dependendo das finalidades de acordo com a presente invenção. Os marcadores e os métodos de marcação apropriados foram i- dentificados acima e também são mencionados aqui abaixo. Os métodos apropriados para a fixação e/ou imobilização dos referidos compostos de acordo com a presente invenção são bem-conhecidos e incluem, mas não estão limitados a, interações iônicas, hidrofóbicas, covalentes e assemelha- das.

É particularmente preferido que a composição para diagnóstico, de acordo com a presente invenção, seja empregada para a detecção e/ou a quantificação do APP e/ou os produtos do processamento do APP, tal como a β-amilóide ou para a detecção e/ou a quantificação de patologias e/ou da APP modificada por clivagem lateral ou geneticamente.

Tal como ilustrado nos exemplos anexos, as moléculas de anti- corpo glicosilado de acordo com a presente invenção são particularmente úteis como reagentes para diagnóstico na detecção de placas amilóides ver- dadeiramente humanas em seções do cérebro de pacientes com o Mal de Alzheimer através de imunofluorescência indireta.

É preferível que os ditos compostos de acordo com a presente invenção a serem empregados em uma composição para uso em diagnósti- co sejam detectavelmente marcados. Diversas técnicas disponíveis para a marcação de biomoléculas são bem conhecidas das pessoas versadas na técnica e são consideradas como estando dentro do alcance da presente invenção. Existem muitos marcadores e métodos diferentes de marcação conhecidos daqueles versados comum na técnica. Exemplos dos tipos de marcadores que podem ser usados na presente invenção incluem enzimas, radioisótopos, metais coloidais, compostos fluorescentes, compostos quimio- luminescentes, e compostos bioluminescentes.

Os marcadores geralmente usados compreendem, entre outros, os fluorocromos (tais como a fluoresceína, a rodamina, o vermelho Texas, etc.), as enzimas (tais como a peroxidase de rabanete, a β-galactosidase, a fosfatase alcalina), os isótopos radioativos (tais como 32P ou 125I), a biotina, a digoxigenina, os colóides metálicos, ou os compostos quimioluminescentes ou bioluminescentes (tais como os dioxetanos, o Iuminol ou os acridínios).

Os procedimentos de marcação, tais como as ligações covalentes das enzi- mas ou dos grupos biotinilados, as iodetações, as fosforilações, as biotinila- ções etc, são bem-conhecidos na técnica. Os métodos para detecção compreendem, mas não estão limi- tados a, auto-radiografia, microscopia de fluorescência, reações enzimáticas diretas e indiretas, etc. Os ensaios geralmente usados para a detecção compreendem métodos radioisotópicos ou não radioisotópicos. Esses com- preendem, entre outras coisas, o Westernblotting, os ensaios de sobreposi- ção, RIA (radioimunoensaio), IRMA (imunoensaio radioimunométrico), EIA (enzimaimunoensaio), ELISA (imonoensaio de ligação enzimática), FIA (en- saio de imunofluorescência), e o CLIA (ensaio de imunoquimioluminescên- cia).

Além disso, a presente invenção fornece um uso para as molé- culas de anticorpo glicosilado de acordo com a presente invenção, ou uma molécula do anticorpo produzida pelo método de acordo com a presente in- venção, ou por uma mistura de anticorpos monoglicosilados e diglicosilados, tal como aqui fornecidos para a preparação de uma composição farmacêuti- ca ou diagnostica para a prevenção, o tratamento e/ou o diagnóstico de uma doença associada com a amiloidogênese e/ou a formação da placa amilóide. É adicionalmente preferível que os compostos aqui descritos, em particular as moléculas de anticorpo de acordo com a presente invenção, sejam em- pregadas na prevenção e/ou no tratamento das neuropatologias associadas com o processamento da APP e/ou a amiloidogênese modificados ou anor- mais. As moléculas do anticorpo, por exemplo, no formato de imunoglobuli- nas (projetadas), tal como anticorpos com uma estrutura de IgG, em particu- lar em uma estrutura de IgGI, ou no formato de anticorpos quiméricos (parti- cularmente em anticorpos inteiramente humanizados ou anticorpos comple- tos), anticorpos biespecíficos, Fvs de cadeia única (scFvs) ou scFvs biespe- cíficas e similares, são empregados na preparação das composições farma- cêuticas aqui fornecidas. Também, as moléculas e as misturas de anticorpo aqui fornecidas são também úteis em ajustes diagnósticos tal como docu- mentado nos exemplos adicionados, já que as moléculas de anticorpo, de acordo com a presente invenção, interagem especificamente com a Αβ4 de- tectada e/ou os depósitos/placas amilóides.

Conseqüentemente um uso de acordo com a invenção dos com- postos da presente invenção é um uso para a preparação de uma composi- ção farmacêutica para o chamado melhoramento de um distúrbio neurológi- co, por exemplo, pela desintegração de placas β-amilóide, pela liberação (da placa) amilóide ou pela imunização passiva contra à formação da placa β- amilóide. Tal como ilustrado nos exemplos adicionais, as moléculas de anti- corpo de acordo com a invenção são particularmente úteis para impedir a agregação Αβ e na despolimerização de agregados amilóide já formados. Desse modo, os anticorpos glicosilados de acordo com a invenção do glico- silado ou uma mistura de anticorpos monoglicosilados e diglicosilados tal como aqui descrito devem ser empregados na redução dos depósitos/placas amilóides patológicos, na eliminação dos precursores das placas/placa ami- lóides, bem como na proteção neuronial. É particularmente contemplado que as moléculas de anticorpo de acordo com a presente invenção sejam em- pregadas na prevenção in vivo de placas amilóides bem como na liberação in vivo das placas/depósitos amilóides pré-existentes. Além disso, as molé- culas ou as misturas do anticorpo de acordo com a presente invenção po- dem ser empregadas na abordagem das imunizações passivas contra o pep- tídio Αβ e agregados de Αβ, ou seja, as placas β-amilóide. A liberação dos depósitos Αβ4/Αβ4 pode, entre outras coisas, ser conseguida pelo uso mé- dico dos anticorpos de acordo com a presente invenção compreendendo - uma porção Fe. A dita porção Fc de um anticorpo pode ser particularmente útil nas respostas imunes mediadas pelo receptor Fc, por exemplo, na atra- ção dos macrófagos (células e/ou microglia fagocitários) e/ou de células au- xiliares. Para a mediação das respostas imunológicas relacionadas com a porção Fc, a molécula de anticorpo de acordo com a presente invenção está preferivelmente em uma estrutura de IgGI (humana). Tal como aqui discuti- do, o paciente preferido para ser tratados com as moléculas de anticorpo, ou as misturas do anticorpo de acordo com a presente invenção, é um paciente humano. Outras estruturas, como as estruturas lgG2a ou lgG2b para as mo- léculas de anticorpo de acordo com a invenção também são contempladas. As estruturas de imunoglobulinas no formato das lgG2a e lgG2b são particu- larmente contempladas em um ambiente fisiológico de camundongos, por exemplo, em usos científicos das moléculas de anticorpo de acordo com a invenção, por exemplo, em testes com camundongos transgênicos expres- sando (humano) o tipo selvagem ou mutante da APP, fragmentos da APP e/ou Αβ4.

As doenças acima citadas que estão associadas com a amiloi- dogênese e/ou a formação da placa amilóide compreendem, mas não estão limitadas à demência, o Mal de Alzheimer, à neuropatia motora, à doença de Parkinson, à ALS (esclerose amiotrófica lateral), ao scrapie, demência rela- cioanda com o HIV, bem como na doença de Creutzfeld-Jakob, hemorragia cerebral hereditária com angiopatia amilóide cerebral (dutch), na síndrome de Down e os distúrbios neuroniais relacionados com o envelhecimento. As moléculas do anticorpo de acordo com a presente invenção e das composi- ções aqui fornecidas podem também ser úteis na melhora e ou na preven- ção dos processos inflamatórios que se relacionam com a amiloidogênese e/ou com a formação da placa amilóide.

Desse modo, a presente invenção fornece também um método para tratar, evitar e/ou retardar os distúrbios neurológicos e/ou neurodegene- rativos compreendendo a etapa de administração, a um paciente que sofra dos ditos distúrbios neurológicos e/ou neurodegenerativos, e/ou a um paci- ente que seja suscetível aos ditos distúrbios neurológicos e/ou neurodegene- rativos, de uma quantidade eficaz de uma molécula do anticorpo anti-Αβ ou uma mistura dos anticorpos monoglicosilado e/ou diglicosilado de acordo com a presente invenção, tal como aqui fornecido, e/ou de uma composição como aqui acima definida. O tratamento tal como aqui fornecido podendo compreender a administração dos compostos/composições de acordo com a presente invenção, sozinhos ou na forma de um tratamento de co-terapia, isto é, em combinação com outros fármacos ou medicamentos. Em uma modalidade particularmente preferida, de acordo com a presente invenção, é fornecido um método para tratar, impedir e/ou retardar os distúrbios neuroló- gicos e/ou neurodegenerativos, compreendendo a etapa de administrar a um paciente, que esteja necessitando da intervenção médica correspondente, a mistura dé anticorpos compreendendo os anticorpos monoglicosilados e di- glicosilados dirigidos contra a Αβ tal como aqui fornecidos.

O termo "tratamento" tal como aqui utilizado contempla a admi- nistração de anticorpos monoglicosilados e/ou diglicosilados (ou de misturas dos mesmos) tal aqui descrito a um paciente que esteja necessitando do mesmo. O dito paciente pode ser um paciente humano, em uma modalidade um ser humano que esteja sofrendo de ou que seja suscetível a um distúrbio relacionado ao processamento patológico do APP. Desse modo, o termo "tratamento" tal como aqui utilizado compreende a administração profilática bem cõmo a administração curativa dos compostos ou das misturas compos- tas aqui fornecidos.

Um distúrbio a ser tratado pelos compostos e pela composição aqui fornecidos é o mal de Alzheimer. No caso, os pacientes com diagnósti- co provável do mal de Alzheimer com base nos critérios do Institute of Neu- rological and Communicative Disorders and Stroke/Alzheimer's Disease and Reiated Disorders Association para este diagnóstico (critérios NINCDS/ADRDA) Mckhann et al., 1984.

Contemplado também no contexto de acordo com a presente invenção está o uso médico dos compostos e/ou das composições aqui for- necidos em um ajuste de "co-terapia" por exemplo no caso de distúrbios re- lacionados com a APP, tal como o mal de Alzheimer. Nesse aso, a co- terapia com medicamentos aprovados, como a memantina, o doneprezil, a rivastigmina ou o galantamina, é contemplada.

Ainda, em uma outra modalidade, a presente invenção fornece um kit compreendendo pelo menos uma molécula do anticorpo glicosilado tal como aqui definido ou uma mistura dos métodos monoglicosilado e/ou digli- cosilado de acordo com a invenção, tal como aqui fornecido. Vantajosamen- te, o kit de acordo com a presente invenção compreende também, opcional- mente (a) tampões, soluções de armazenamento e/ou os reagentes ou os materiais restantes necessários para a condução de ensaios com finalidades médicas, científicas ou de diagnóstico. Além disso, as partes do kit de acor- do com a presente invenção podem ser empacotadas individualmente em garrafas ou em frascos ou em uma combinação de recipientes ou em unida- des de múltiplos recipientes.

O kit de acordo com a presente invenção pode vantajosamente ser usado, entre outras coisas, para realizar o método de acordo com a pre- sente invenção e poderia ser empregado em diversas aplicações aqui referi- das, como por exemplo, como kits de diagnóstico, como ferramentas de pesquisa ou como ferramentas médicas. Adicionalmente, o kit de acordo com a presente invenção pode conter os meios para a detecção apropriada para as finalidades científicas, médicas e/ou diagnosticas. A fabricação dos kits segue preferivélmente os procedimentos padrão que são conhecidos da pessoa versada na técnica,

As figuras mostram:

figura 1: Mapa do plasmídio mostrando os locais da inserção para as se- qüências das caseias pesada e leve.

figura 2: Exemplo de um cromatograma analítico.

figura 3: Cromatograma de uma coluna de CMT como descrito no texto.

As isoformas diglicosilada e monoglicosilada são eluídas no pico duplo 1, a isoforma não glicosilada é eluida no pico 2.

figura 4: Análise ESI-MS da IgG inteira das isoformas do ANTICORPO A.

A massa molecular do pico principal é indicada em Da. (A): ANTICORPO A não glicosilado; (B):ANTICORPO monoglicosilado A; (C): ANTICORPO A diglicosilado.

Figura 5: Esquema do ANTICORPO deduzido dos padrão de glicosilação N. As estruturas que ocorrem somente são indicadas parcialmente pelos parêntese. A: Tipo Complexo; B: Tipo Híbrido; C: Tipo Oligomanose; GIcNAc = N-acetil-glicosamina, Man = manose; Gal = galactose; Fuc = fucose; Neu- Ac = ácido N-acetil-neuramíníco.

Figura 6: Apresentação esquemática da estrutura do carboidcamundongo em Asn306 do ANTICORPO A deduzido das análises de MS e de HPAEC- PAD. As estruturas que ocorrem somente parcialmente são indicadas pelos parênteses. GIcNAc = N-acetil-glicosamina, Man = manose; Gal = galactose;

Fuc = fucose; NeuAc = ácido N-acetil-neuramínico.

Figura 7: Ligação das isoformas do ANTICORPO A para Αβ40 fibrilar imo- bilizada (chip sensor da Biacore). Concentração de anticorpo 60 nM. Curva de ligação de uma mistura de todas as isoformas, isto é, antes que a purifi- cação também seja mostrada tal como indicado.

Figura 8: Mapeamento do epitopo da COMPOSIÇÃO DO ANTICORPO A pela análise pepspot. A) sinais do pepspot dos pontos únicos do decapeptí- dio indicado se sobrepondo; B) análise densitométrica da intensidade do si- nal dos pontos únicos do decapeptídio se sobrepondo. Figura 9: Ensaio de despolimerização. Isoformas da COMPOSIÇÃO DO ANTICORPO A e do ANTICORPO A induzem a liberação de Αβ biotinilada a partir de Αβ agregada.

Figura 10: COMPOSIÇÃO DO ANTICORPO A e compreendendo as iso- formas do ANTICORPO A capturam o Αβ solúvel do fluido cérebro-espinhal (FCE) humano. Média de 4 amostras do fluido cérebro-espinhal (FCE) dos pacientes do mal de Alzheimer analisados em acúmulos de 2. Duas imuno- precipitações seguidas de Western blots por acúmulos com quantificação das Αβ capturadas por densitometria de Western blot. O valor mais elevado de Αβ em uma dada série de Western blots foi considerado como 100%. Figura 11: Coloração de imunofluorescência indireta de placas amilóide humanas com isoformas de ANTICORPO A in vitro. Detecção altamente sensível e específica de placas de β-amilóide humanas genuínas ex vivo após coloração com ANTICORPO A com concentração de 10 ng/ml. O AN- TICORPO A ligado foi revelado com anticorpo de cabra anti-humano (H+L)- Cy3 para (A) COMPOSIÇÃO DO ANTICORPO A; (B) ANTICORPO A digli- cosilado; (C) ANTICORPO A monoglicosilado; e (D) ANTICORPO A não gli- cosilado. Barra de escala = 80 μιτι.

Figura 12: Imuno ornamentação in vivo de placas transgênicas do camun- dongo de PS2APP com as isoformas glicosiladas do ANTICORPO A revela- das pela microscopia confocal. A imuno ornamentação revela a ligação in vivo das isoformas do ANTICORPO A 3 dias após uma única dose de 1 mg de isoformas do ANTICORPO A. As imagens representativas da distribuição das isoformas do ANTICORPO A são mostradas para as isoformas diglicosi- Iada (a), monoglicosilada (b), e a isoforma não glicosilada (C) do ANTICOR- PO A. Barra da escala = 80 μιη.

Figura 13: Análise da ligação dos anticorpos anti-Αβ à superfície da célula APP. Anticorpo que liga às células humanas HEK293 transfectadas com APP e as células de controle não transfectadas são analisadas pela citome- tria de fluxo.

Figura 14: Esquema de ANTICORPO A não glicosilado, monoglicosilado e diglicosilado das moléculas de anticorpo (imunoglobulinas). Figura 15: Superfície total da placa (A), número total da placa (B) e número da placa e distribuição de tamanho (C) na região do tálamo após um trata- mento de 5 meses com a COMPOSIÇÃO DO ANTICORPO A (que compre- ende as isoformas monoglicosiladas e diglicosiladas do ANTICORPO A), diglicosilada e monoglicosilada do ANTICORPO A (20 mg/kg por semana, i.v.) ou do veículo.

Figura 16: Superfície total da placa (A), número total da placa (B) e número da placa e distribuição de tamanho (C) na região do córtex e do corpo caloso após um tratamento de 5 meses com a COMPOSIÇÃO DO ANTICORPO A (compreendendo as isoformas monoglicosiladas e diglicosiladas de ANTI- CORPO A), diglicosilada e monoglicosilada de ANTICORPO A (20 mg/kg por semana, i.v.) ou do veículo. Figura 17: Superfície total da placa (A), número total da placa (B) e número da placa e distribuição de tamanho (C) na região do hipocampo após um tratamento de 5 meses com a COMPOSIÇÃO DO ANTICORPO A (compre- endendo as isoformas monoglicosiladas e diglicosiladas de ANTICORPO A), diglicosilada e monoglicosilada de ANTICORPO A (20 mg/kg por semana, i.v.) ou do veículo.

Figura 18: Superfície total da placa (A), número total da placa (B) e número da placa e distribuição de tamanho (C) na região do subículo após um trata- mento de 5 meses com a COMPOSIÇÃO DO ANTICORPO A (compreen- dendo as isoformas monoglicosiladas e diglicosiladas do ANTICORPO A), diglicosilada e monoglicosilada de ANTICORPO A (20 mg/kg por semana, i.v.) ou veículo.

Figura 19: A medida de intensidade da fluorescência da COMPOSIÇÃO DO ANTICORPO A imunopigmentada limitada às placas β-amilóide após admi- nistração a cada duas semanas da dose de 0,1 mg/kg com 1, 2 e 4 aplica- ções por via i.v. aos camundongos PS2APP. A análise foi feita em 2 sema- nas após a última injeção.

Figura 20: A medida de intensidade da fluorescência da COMPOSIÇÃO DO ANTICORPO A imunopigmentada limitada às placas β-amilóide após admi- nistração mensal da dose de 0,15 mg/kg com 2 e 3 aplicações por via i.v. aos camundongos PS2APP. A análise foi feita em 2 semanas após a última injeção.

Figura 21: A medida de intensidade da fluorescência da COMPOSIÇÃO DO ANTICORPO A imunopigmentada limitada às placas β-amilóide após 4 inje- ções a cada duas semanas de 0,05, 0,1 e 0,30 mg/kg aos camundongos PS2APP, sugerindo a ligação da placa amilóide relacionada com a dose. A análise foi feita em 2 semanas após a última injeção.

Figura 22: A medida de intensidade da fluorescência da COMPOSIÇÃO DO ANTICORPO A imunopigmentada limitada às placas β-amilóide após 3 inje- ções mensais de 0,075, 0,15 e 0,45 mg/kg aos camundongos PS2APP, su- gerindo a ligação da placa amilóide relacionada com a dose. A análise foi feita em 2 semanas após a última injeção.

Figura 23: Secções do cérebro humano com AD coradas contra a Αβ com o anticorpo monoclonal murine (BAP-2) anti-Αβ após 40 horas de incubação com a COMPOSIÇÃO DO ANTICORPO A nas concentrações indicadas jun- tamente com macrófagos humanos primários diferenciados vivos (0,8 mi- lhões células/ml). Os resultados mostram a redução na carga amilóide indi- cativa do efeito de fagocitose celular dependente de antígeno da COMPO- SIÇÃO DO ANTICORPO A sobre as placas β-amilóide. Barra da escala = 300 pm.

Figura 24: Dose de resposta da COMPOSIÇÃO DO ANTICORPO A sobre as placas β-amilóide secções do cérebro humano com AD quando incuba- das com os 0,8 milhões células/ml. (A) mostra a área total da placa e (B) a intensidade da pigmentação.

Figura 25: A microscopia de fluorescência das células P388D1 incubadas com 0, 0,1, 1 e 10 μς/ml da COMPOSIÇÃO DO ANTICORPO A (A a D, res- pectivamente).

Figura 26: Medida quantitativa da dose de resposta da COMPOSIÇÃO DO ANTICORPO A usando contas fluoro conjugadas Αβ e células P3881D1 (mostrados em unidades de fluorescência relativas, RFU). Duas experiên- cias independentes indicam uma escala considerável de eficácia para COM-

POSIÇÃO DO ANTICORPO A.

Figura 27: Tabela mostrando diferentes estruturas de glicano do ANTI- CORPO A na região constante da cadeia pesada (Asn 306; primeiras duas colunas) e na região variável da cadeia pesada (Asn 52; terceira e quarta colunas).

EXEMPLOS:

Os seguintes exemplos, não Iimitantes ilustram a invenção.

Exemplo 1:

Geração de ANTICORPO um via técnicas de clonagem.

De acordo com a presente invenção, uma molécula IgGI foi ge- rada via técnicas de clonagem comuns. O ANTICORPO A é, na sua seqüên- cia de codificação e na sua seqüência de aminoácidos expressada caracteri- zada pela sua região variável da cadeia pesada (VH). O exemplo correspon- dente de uma cadeia pesada codificada por uma seqüência de DNA é como se segue: *

caggtggaattggtggaaagcggcggcggcctggtgcaaccgggcggcagcctgcgtctgagctgcgc ggcctccggatttacctttagcagctatgcgatgagctgggtgcgccaagcccctgggaagggtctcgagt gggtgagcgctattaatgcttctggtactcgtacttattatgctgattctgttaagggtcgttttaccatttcacgtg ataattcgaaaaacaccctgtatctgcaaatgaacagcctgcgtgcggaagatacggccgtgtattattgc gcgcgtggtaagggtaatactcataagccttatggttatgttcgttattttgatgtttggggccaaggcaccctg gtgacggttagctcagcctccaccaagggtccatcggtcttccccctggcaccctcctccaagagcacctct gggggcacagcggccctgggctgcctggtcaaggactacttccccgaaccggtgacggtgtcgtggaac tcaggcgccctgaccagcggcgtgcacaccttcccggctgtcctacagtcctcaggactctactccctcag cagcgtggtgaccgtgccctccagcagcttgggcacccagacctacatctgcaacgtgaatcacaagcc cagcaacaccaaggtggacaagaaagttgagcccagatatcgtgcgatatcgtgcaatcttgtgacaaa actcacacatgcccaccgtgcccagcacctgaactcctggggggaccgtcagtcttcctcttccccccaaa acccaaggacaccctcatgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacga agaccctgaggtcaagttcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgc gggaggagcagtacaacagcacgtaccgggtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctg aatggcaaggagtacaagtgcaaggtctccaacaaagccctcccagcccccatcgagaaaaccatctc caaagccaaagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggatgagctgacc aagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggag agcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttc ctctacagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgc atgaggctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtctccgggtaaatga (SEQ ID NO 5).

E os códigos para a cadeia H de imunoglobulina seguinte: QVELVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVS AINASGTRTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGK GNTHKPYGYVRYFDVWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAA LGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSS LGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLF PPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPRE EQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPR EPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTP PVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP GK (SEC ID NO 6).

A mesma cadeia pesada também pode ser codificada por uma seqüência compreendendo uma "seqüência líder" adicional tal como mostra- do na seguinte seqüência:

atgaaacacctgtggttcttcctcctgctggtggcagctcccagatgggtcctgtcc caggtggaattggtggaaagcggcggcggcctggtgcaaccgggcggcagcctgcgtctgagctgcgc ggcctccggatttacctttagcagctatgcgatgagctgggtgcgccaagcccctgggaagggtctcgagt gggtgagcgctattaatgcttctggtactcgtacttattatgctgattctgttaagggtcgttttaccatttcacgtg ataattcgaaaaacaccctgtatctgcaaatgaacagcctgcgtgcggaagatacggccgtgtattattgc gcgcgtggtaagggtaatactcataagccttatggttatgttcgttattttgatgtttggggccaaggcaccctg gtgacggttagctcagcctccaccaagggtccatcggtcttccccctggcaccctcctccaagagcacctct gggggcacagcggccctgggctgcctggtcaaggactacttccccgaaccggtgacggtgtcgtggaac tcaggcgccctgaccagcggcgtgcacaccttcccggctgtcctacagtcctcaggactctactccctcag cagcgtggtgaccgtgccctccagcagcttgggcacccagacctacatctgcaacgtgaatcacaagcc cagcaacaccaaggtggacaagaaagttgagcccaaatcttgtgacaaaactcacacatgcccaccgt gcccagcacctgaactcctggggggaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccGtcat gatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagttc aactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacaaca gcacgtaccgggtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaaggagtacaagt gcaaggtctccaacaaagccctcccagcccccatcgagaaaaccatctccaaagccaaagggcagcc ccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggatgagctgaccaagaaccaggtcagcctga cctgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtggagtgggagagcaatgggcagccggaga acaactacaagaccacgcctcccgtgctggactccgacggctccttcttcctctacagcaagctcaccgtg gacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgctccgtgatgcatgaggctctgcacaaccact acacgcagaagagcctctccctgtctccgggtaaatga (SEQ ID NO 25).

A seqüência de aminoácidos correspondente seria:

MKHLWFFLLLVAAPRWVLS QVELVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVS AINASGTRTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGK GNTHKPYGYVRYFDVWGQGTLVTVSSASTKGPSVFPLAPSSKSTSGGTAA LGCLVKDYFPEPVTVSWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSS LGTQTYICNVNHKPSNTKVDKKVEPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLF PPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPRE EQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKAKGQPR EPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTP PVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSP GK (SEQ ID NO 26).

Semelhantemente a cadeia leve de ANTICORPO A é codificada pela seqüência de nucleotídios seguinte:

gatatcgtgctgacccagagcccggcgaccctgagcctgtctccgggcgaacgtgcgaccctgagctgc agagcgagccagagcgtgagcagcagctatctggcgtggtaccagcagaaaccaggtcaagcaccgc gtctattaatttatggcgcgagcagccgtgcaactggggtcccggcgcgttttagcggctctggatccggca cggattttaccctgaccattagcagcctggaacctgaagactttgcgacttattattgccttcagatttataatat gcctattacctttggccagggtacgaaagttgaaattaaacgtacggtggctgcaccatctgtcttcatcttcc cgccatctgatgagcagttgaaatctggaactgcctctgttgtgtgcctgctgaataacttctatcccagaga ggccaaagtacagtggaaggtggataacgccctccaatcgggtaactcccaggagagtgtcacagagc aggacagcaaggacagcacctacagcctcagcagcaccctgacgctgagcaaagcagactacgaga aacacaaagtctacgcctgcgaagtcacccatcagggcctgagctcgcccgtcacaaagagcttcaaca ggggagagtgttag (SEQ ID NO 7).

E os códigos da seqüência de aminoácidos (Cadeia L) seguinte: DIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYG ASSRATGVPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFATYYCLQIYNMPITFGQGT KVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNAL QSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSP VTKSFNRGEC (SEQ ID NO 8).

Novamente, também aqui, "uma seqüência líder" pode ser em- pregada e as seqüências correspondentes seriam: atggtgttgcagacccaggtcttcatttctctgttgctctggatctctggtgcctacggg gatatcgtgctgacccagagcccggcgaccctgagcctgtctccgggcgaacgtgcgaccctgagctgc agagcgagccagagcgtgagcagcagctatctggcgtggtaccagcagaaaccaggtcaagcaccgc gtctattaatttatggcgcgagcagccgtgcaactggggtcccggcgcgttttagcggctctggatccggca cggattttaccctgaccattagcagcctggaacctgaagactttgcgacttattattgccttcagatttataatat gcctattacctttggccagggtacgaaagttgaaattaaacgtacggtggctgcaccatctgtcttcatcttcc cgccatctgatgagcagttgaaatctggaactgcctctgttgtgtgcctgctgaataacttctatcccagaga ggccaaagtacagtggaaggtggataacgccctccaatcgggtaactcccaggagagtgtcacagagc aggacagcaaggacagcacctacagcctcagcagcaccctgacgctgagcaaagcagactacgaga aacacaaagtctacgcctgcgaagtcacccatcagggcctgagctcgcccgtcacaaagagcttcaaca ggggagagtgttag (SEQ ID NO 27).

Esta seqüência codifica a seguinte seqüência de aminoácidos

MVLQTQVFISLLLWISGAYG

DIVLTQSPATLSLSPGERATLSCRASQSVSSSYLAWYQQKPGQAPRLLIYG ASSRATGVPARFSGSGSGTDFTLTISSLEPEDFATYYCLQIYNMPITFGQGT KVEIKRTVAAPSVFIFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFYPREAKVQWKVDNAL QSGNSQESVTEQDSKDSTYSLSSTLTLSKADYEKHKVYACEVTHQGLSSP VTKSFNRGEC (SEQ ID NO 28).

Essas seqüências acima são conhecidas a partir da MAB31 co- mo descrito no WO 03/070760.

Entretanto, as cadeias pesadas e leves do ANTICORPO A e- xemplificado também podem ser codificadas por uma seqüência tal como mostrado abaixo: a) A cadeia pesada:

atggagtttgggctgagctgggttttcctcgttgctcttttaagaggtgattcatggagaaatagagagactga gtgtgagtgaacatgagtgagaaaaactggatttgtgtggcattttctgataacggtgtccttctgtttgcaggt gtccagtgtcaggtggagctggtggagtctgggggaggcctggtccagcctggggggtccctgagactct cctgtgcagcgtctggattcaccttcagtagctatgccatgagctgggtccgccaggctccaggcaagggg ctcgagtgggtgtccgccataaacgccagcggtacccgcacctactatgcagactccgtgaagggccga ttcaccatctccagagacaattccaagaacacgctgtatctgcaaatgaacagcctgagagccgaggac acggctgtgtattactgtgcgagaggcaaggggaacacccacaagccctacggctacgtacgctactttg acgtgtggggccaaggaaccctggtcaccgtctcctcaggtgagtcctcacaacctctctcctgcggccgc agcttgaagtctgaggcagaatcttgtccagggtctatcggactcttgtgagaattaggggctgacagttgat ggtgacaatttcagggtcagtgactgtctggtttctctgaggtgagactggaatataggtcaccttgaagact aaagaggggtccaggggcttttctgcacaggcagggaacagaatgtggaacaatgacttgaatggttgat tcttgtgtgacaccaagaattggcataatgtctgagttgcccaagggtgatcttagctagactctggggtttttg tcgggtacagaggaaaaacccactattgtgattactatgctatggactactggggtcaaggaacctcagtc accgtctcctcaggtaagaatggcctctccaggtctttatttttaacctttgttatggagttttctgagcattgcag actaatcttggatatttgccctgagggagccggctgagagaagttgggaaataaatctgtctagggatctca gagcctttaggacagattatctccacatctttgaaaaactaagaatctgtgtgatggtgttggtggagtccctg gatgatgggatagggactttggaggctcatttgagggagatgctaaaacaatcctatggctggagggata gttggggctgtagttggagattttcagtttttagaatgaagtattagctgcaatacttcaaggaccacctctgtg acaaccattttatacagtatccaggcatagggacaaaaagtggagtggggcactttctttagatttgtgagg aatgttccacactagattgtttaaaacttcatttgttggaaggagctgtcttagtgattgagtcaagggagaaa ggcatctagcctcggtctcaaaagggtagttgctgtctagagaggtctggtggagcctgcaaaagtccagc tttcaaaggaacacagaagtatgtgtatggaatattagaagatgttgcttttactcttaagttggttcctaggaa aaatagttaaatactgtgactttaaaatgtgagagggttttcaagtactcatttttttaaatgtccaaaatttttgtc aatcaatttgaggtcttgtttgtgtagaactgacattacttaaagtttaaccgaggaatgggagtgaggctctçt cataccctattcagaactgacttttaacaataataaattaagtttaaaatatttttaaatgaattgagcaatgttg agttgagtcaagatggccgatcagaaccggaacacctgcagcagctggcaggaagcaggtcatgtggc aaggctatttggggaagggaaaataaaaccactaggtaaacttgtagctgtggtttgaagaagtggttttga aacactctgtccagccccaccaaaccgaaagtccaggctgagcaaaacaccacctgggtaatttgcattt ctaaaataagttgaggattcagccgaaactggagaggtcctcttttaacttattgagttcaaccttttaattttag cttgagtagttctagtttccccaaacttaagtttatcgacttctaaaatgtatttagaattcgagctcggtacagct ttctggggcaggccaggcctgaccttggctttggggcagggagggggctaaggtgaggcaggtggcgcc agcaggtgcacacccaatgcccatgagcccagacactggacgctgaacctcgcggacagttaagaac ccaggggcctctgcgcctgggcccagctctgtcccacaccgcggtcacatggcaccacctctcttgcagc ctccaccaagggcccatcggtcttccccctggcaccctcctccaagagcacctctgggggcacagcggc cctgggctgcctggtcaaggactacttccccgaaccggtgacggtgtcgtggaactcaggcgccctgacc agcggcgtgcacaccttcccggctgtcctacagtcctcaggactctactccctcagcagcgtggtgaccgt gccctccagcagcttgggcacccagacctacatctgcaacgtgaatcacaagcccagcaacaccaagg tggacaagaaagttggtgagaggccagcacagggagggagggtgtctgctggaagccaggctcagcg ctcctgcctggacgcatcccggctatgcagccccagtccagggcagcaaggcaggccccgtctgcctctt cacccggagcctctgcccgccccactcatgctcagggagagggtcttctggctttttcccaggctctgggca ggcacaggctaggtgcccctaacccaggccctgcacacaaaggggcaggtgctgggctcagacctgcc aagagccatatccgggaggaccctgcccctgacctaagcccaccccaaaggccaaactctccactccct cagctcggacaccttctctcctcccagattccagtaactcccaatcttctctctgcagagcccaaatcttgtga caaaactcacacatgcccaccgtgcccaggtaagccagcccaggcctcgccctecagctcaaggcggg acaggtgccctagagtagcctgcatccagggacaggccccagccgggtgctgacacgtccacctccatc tcttcctcagcacctgaactcctggggggaccgtcagtcttcctcttccccccaaaacccaaggacaccctc atgatctcccggacccctgaggtcacatgcgtggtggtggacgtgagccacgaagaccctgaggtcaagt tcaactggtacgtggacggcgtggaggtgcataatgccaagacaaagccgcgggaggagcagtacaa cagcacgtaccgtgtggtcagcgtcctcaccgtcctgcaccaggactggctgaatggcaaggagtacaa gtgcaaggtctccaacaaagccctcccagcccccatcgagaaaaccatctccaaagccaaaggtggga cccgtggggtgcgagggccacatggacagaggccggctcggcccaccctctgccctgagagtgaccgc tgtaccaacctctgtccctacagggcagccccgagaaccacaggtgtacaccctgcccccatcccgggat gagctgaccaagaaccaggtcagcctgacctgcctggtcaaaggcttctatcccagcgacatcgccgtg gagtgggagagcaatgggcagccggagaacaactacaagaccacgcctcccgtgctggactccgacg gctccttcttcctctacagcaagctcaccgtggacaagagcaggtggcagcaggggaacgtcttctcatgc tccgtgatgcatgaggctctgcacaaccactacacgcagaagagcctctccctgtccccgggcaaatga (SEQ ID NO 23).

b) A cadeia leve:

atggacatgagggtcctcgctcagctcctggggctcctgctgctctgtttcccaggtaaggatggagaacac tagcagtttactcagcccagggtgctcagtactgctttactattcagggaaattctcttacaacatgattaattgt gtggacatttgtttttatgtttccaatctcaggcgccagatgtgatatcgtgttgacgcagtctccagccaccctg tctttgtctccaggggaaagagccaccctctcctgccgggccagtcagagtgttagcagcagctacttagc ctggtaccagcagaaacctggccaggcgcccaggctcctcatctatggcgcatccagcagggccactgg cgtgccagccaggttcagtggcagtgggtctgggacagacttcactctcaccatcagcagcctggagcct gaagatttcgcgacctattactgtctgcagatttacaacatgcctatcacgttcggccaagggaccaaggtg gaaatcaaacgtgagtagaatttaaactttgcggccgcctagacgtttaagtgggagatttggaggggatg aggaatgaaggaacttcaggatagaaaagggctgaagtcaagttcagctcctaaaatggatgtgggagc aaactttgaagataaactgaatgacccagaggatgaaacagcgcagatcaaagaggggcctggagct ctgagaagagaaggagactcatccgtgttgagtttccacaagtactgtcttgagttttgcaataaaagtggg atagcagagttgagtgagccgtaggctgagttctctcttttgtctcctaagtttttatgactacaaaaatcagta gtatgtcctgaaataatcattaagctgtttgaaagtatgactgcttgccatgtagataccatgtcttgctgaatg atcagaagaggtgtgactcttattctaaaatttgtcacaaaatgtcaaaatgagagactctgtaggaacgag tccttgacagaGagctcaaggggtttttttcctttgtctcatttctacatgaaagtaaatttgaaatgatcttttttatt ataagagtagaaatacagttgggtttgaactatatgttttaatggccacggttttgtaagacatttggtcctttgtt ttcccagttattactcgattgtaattttatatcgccagcaatggactgaaacggtccgcaacctcttctttacaac tgggtgacctcgcggctgtgccagccatttggcgttcaccctgccgctaagggccatgtgaacccccgcgg tagcatcccttgctccgcgtggaccactttcctgaggcacagtgataggaacagagccactaatctgaaga gaacagagatgtgacagactacactaatgtgagaaaaacaaggaaagggtgacttattggagatttcag aaataaaatgcatttattattatattcccttattttaattttctattagggaattagaaagggcataaactgctttatc cagtgttatattaaaagcttaatgtatataatcttttagaggtaaaatctacagccagcaaaagtcatggtaaa tattctttgactgaactctcactaaactcctctaaattatatgtcatattaactggttaaattaatataaatttgtga catgaccttaactggttaggtaggatatttttcttcatgcaaaaatatgactaataataatttagcacaaaaata tttcccaatactttaattctgtgatagaaaaatgtttaactcagctactataatcccataattttgaaaactatttat tagcttttgtgtttgacccttccctagccaaaggcaactatttaaggaccctttaaaactcttgaaactactttag agtcattaagttatttaaccacttttaattactttaaaatgatgtcaattcccttttaactattaatttattttaagggg ggaaaggctgctcataattctattgtttttcttggtaaagaactctcagttttcgtttttactacctctgtcacccaa gagttggcatctcaacagaggggactttccgagaggccatctggcagttgcttaagatcagaagtgaagtc tgccagttcctcccaggcaggtggccGagattacagttgacctgttctggtgtggctaaaaattgtcccatgtg gttacaaaccattagaccagggtctgatgaattgctcagaatatttctggacacccaaatacagaccctgg cttaaggccctgtccatacagtaggtttagcttggctacaccaaaggaagccatacagaggctaatatcag agtattcttggaagagacaggagaaaatgaaagccagtttctgctcttaccttatgtgcttgtgttcagactcc caaacatcaggagtgtcagataaactggtctgaatctctgtctgaagcatggaactgaaaagaatgtagttt cagggaagaaaggcaatagaaggaagcctgagaatacggatcaattctaaactctgagggggtcggat gacgtggccattctttgcctaaagcattgagtttactgcaaggtcagaaaagcatgcaaagccctcagaat ggctgcaaagagctccaacaaaacaatttagaactttattaaggaatagggggaagctaggaagaaact caaaacatcaagattttaaatacgcttcttggtctccttgctataattatctgggataagcatgctgttttctgtctg tccctaacatgccctgtgattatccgcaaacaacacacccaagggcagaactttgttacttaaacaccatcc tgtttgcttctttcctcaggaactgtggctgcaccatctgtcttcatcttcccgccatctgatgagcagttgaaatc tggaactgcctctgttgtgtgcctgctgaataacttctatcccagagaggccaaagtacagtggaaggtgga taacgccctccaatcgggtaactcccaggagagtgtcacagagcaggacagcaaggacagcacctac agcctcagcagcaccctgacgctgageaaagcagactacgagaaacacaaagtctacgcctgcgaag tcacccatcagggcctgagctcgcccgtcacaaagagcttcaacaggggagagtgttag (SEQ ID NO 24). Exemplo 1.1:

Construção do Vetor.

Seqüências para o ANTICORPO A originadas da 2- leva de ma- turação depois da avaliação primária da Biblioteca MorphoSys HuCAL1 um fago sintético expõe a biblioteca. O DNA para o ANTICORPO A foi original- mente fornecido em vetores pMorph a partir da MorphoSys1 da Alemanha, e corresponde aos vetores expressando Fab na figura 2 do WO 03/070760, apêndice ρ 6/43. Na construção vetorial para os objetivos de acordo com a presente invenção, os vetores pEE 6.1 e pEE 14.4 (ambos comercialmente disponíveis pela Lonza Biologics), são codificados para se obter um constru- tor com ambas as cadeias em um vetor, vide a figura 1 em anexo; vide o WO 87/04462 ou o WO 89/01036. A seguinte estratégia de clonagem foi aplica- da:

A cadeia Ig kappa foi isolada do vetor MS-ROCHE #7.9.H7_lg_cadeia kappa (tal como descrito no WO 03/070760) através de PCR com o iniciador ACGTAAGCTTGCCGCCACCATGGTGTTGCAG (sen- tido, Hindlll; SEQ ID NO 29) e o iniciador ACGTGAATTCCTAA- CACTCTCCCCTGTT (anti-sentido, EcoRI; o SEQ ID NO 30) foi inserido na pCR 2.1 Topo TA e a inserção foi completamente seqüenciada. A cadeia Ig kappa inserida foi removida da pCR Topo 2.1 pela digestão com HinDII- 1/EcoRI e ligada no vetor pEE14.4 como uma inserção do Hindlll/EcoRI.

A cadeia pesada gama Ig 1 foi clonada a partir do vetor pMorph MS-ROCHE #7.9.H7_lgG1 através de PCR com o iniciador ACGTA- AGCTTGCCGCCACCATGAAACACCTG (sentido, Hindlll; SEQ ID NO 31) e o iniciador ACGTGAATTCTCATTTACCCGGAGACAG (anti-sentido, EcoRI; SEQ ID NO 32), inserido na pCR 2.1 Topo TA1 e a inserção foi completa- mente seqüenciada. A cadeia pesada Ig gamai inserida foi removida da pCR Topo 2.1 pela digestão com Hindlll/EcoRI e ligada no vetor pEE 6.4 como inserção da Hindlll/EcoRI. O cassete de expressão da cadeia pesada foi removido do pEE 6.4 IgGI pela digestão com Notl/Sall e o fragmento iso- lado foi inserido no pEE 14.4 kappa digerido com Sall/Notl resultando no construto de gene duplo final pEE 14.4 mAb-31.

Exemplo 1.2:

Transfecção de células CHO e expressão do ANTICORPO A.

As transfecções foram executadas de acordo com os protocolos padrão. A linhagem de células hospedeiras CHO K1 foi conseguida do ban- co de célula de trabalho da Lonza Biologics (WCB) #028-W2 (Lonza, 2002, 1-179) e a linhagem de célula hospedeira CHO K1 SV foi conseguida do banco mestre de célula de trabalho da Lonza Biologics (MCB) #269-M (Lon- za, 2003, 1-87).

As células aderentes CHO K1 derivadas do WCB #028-W2 fo- ram transfectada cojm o vetor pEE 14.4 MAb31 contendo tanto os genes da cadeia pesada quanto os genes da cadeia leve kappa por transfecção Iipos- sômica (Fugene, Roche Diagnostics). Os isolados da transfecção foram se- lecionados em DMEM, com suplemento GS (ambos da JRH Biosciences), 10% de FCE dializado (PAA Labocamundongories, CoS#RO-CEP 2001-083- Rev 00) e 50 μΜ de metionina sulfoximina (MSX da Sigma). 2 semanas de- pois, as colônias foram colhidas e transferidas para placa de micros de 96 cavidades e testadas por ELISA para a produção de anticorpo. 4 colônias com a expressão mais alta do ANTICORPO A foram clonadas pela diluição serial limitada para obter culturas derivadas de uma única célula, da qual 82 clones foram derivados depois de uma semana e espandidos. Um desses clones foi selecionado como aquele com a mais alta taxa de produção específica de 48 pg/célula/dia no estado aderente. Ela foi também subclonada por diluição Iimitante para obter bons produtores ex- pressando o ANTICORPO A com uma alta estabilidade (Pu, (1998) Mol Bio- technol, 10, 17-25). Adicionalmente, uma variante da suspensão de células CHO K1, as células CHO K1 SV do MCB #269-M foram transfectadas com o vetor pEE 14.4 MAb31 por eletroporação. Os transfectantes foram selecio- nados como antes e os clones resultantes foram submetidos à clonagem de célula única por diluição Iimitante resultando em vários clones de alta produ- tividade do ANTICORPO A.

Exemplo 1.3:

Adaptação de clones expressando o ANTICORPO A a uma cul- tura em suspensão.

As melhores propriedades de crescimento dos clones CHO K1 foram determinadas em meios DHI com diferentes hidrolisados de proteína: as células foram finalmente adaptadas a meios DHI sem glutamina (Invitro- gen), que é uma mistura de DMEM, F12 Ham e IMDM nas respectivas pro- porções de 1:1:2 (v:v:v) (Schlaeger e Schumpp1 1992, J Immunol Methods, 146, 111-20) com as seguintes modificações: hidrolisado de soja e arroz: soja de 0,2% HyPep 1510 e arroz de 0,2% HyPep 5603 (Kerry Bioscience), 0,03% Pluronic F68 (Invitrogen), 25 μΜ MSX (Sigma) e 5% FCS dialisada (PAA Labocamundongories). A concentração de FCS foi reduzida gradual- mente até que as células crescessem exponencialmente em meios DHI sem soro. Os bancos de sementes primárias em meios DHI sem soro foram con- gelados para vários clones de células recombinantes.

Os clones CHO K1 SV foram adaptados a partir do DMEM con- tendo 10% de FCS dialisada para uma cultura em suspensão nos meios de CD-CHO quimicamente definidos com 25μΜ MSX (Gibco-Invitrogen) em um procedimento de duas etapas (Lonza). Os bancos de célula foram criados em CD-CHO. Opcionalmente, quaisquer outros meios sem soro e sem prote- ína para células CHO poderiam ser usados para a cultura em suspensão e como uma base para expressar o anticorpo. Exemplo 2:

Produção do ANTICORPO A.

Produção de ANTICORPO A (por fermentação em batelada).

Os clones de CHO foram preparados para a fermentação de cul- turas de estoque em culturas de frascos agitados ou rotativos tal como se segue:

Um criofrasco dos respetivos clones foi descongelado nos respe- tivos meios de cultura contendo 25μΜ de MSX em um frasco agitado ou gi- ratório de 100 ml com um volume nominal de 50-75 ml.

As células foram então espandidas em alíquotas consecutivas de 1:5 para conseguir uma cultura de estoque com volume de 400-500 ml em frascos agitados ou giratórios. As células usadas para a inoculação dos fermentadores podem ser derivadas dessas culturas de estoque até 90 dias depois de descongelado. O conjunto de sementes constitui de uma etapa de 2x1 OOOmI em frascos agitado ou giratórios de 2 L, seguida por inoculação em um 10L fermentador como um novo vaso. Alternativamente, o fermenta- dor de 10 L pode funcionar como o próprio vaso de alimentação da batelada ou como inocular para alimentação do fermentador de batelada de 100 L. O MSX esteve presente nos meios de cultura para seleção até a inoculação no fermentador de 10 L onde ele foi estendido. Processo de Fermentação:

Dia 0: Partida com 3 a 4 χ 105/ml células (1:4 a 1:5 divisão para a cultura de sementes)

Dia 2 a 3: Partida da alimentação, a densidade de células deve estar acima de 1,5x106/ml.

Alimentação: Alimentação contínua ou em bolus a 2% por dia.

A composição de isoformas de ANTICORPO A foi controlada em todas as partes da fermentação por cromatografia de troca iônica (vide abai- xo).

Dia 14 a 18: Quando a viabilidade das células começou a cair (50%) e foram atingidos os títulos esperados, as células sobrenadantes foram colhidas por centrifugação e/ou filtração e esterilizada em filtro. Foi armazenada assepti- camente e também processada tal como descrito na seção seguinte.

A fermentação foi executada de acordo com protocolos padrão, vide, por exemplo, Werner, (1993), Arzneimittelforschung, 43, 1242-9 ou Rendall, (2003). Proceedings of the 18th ESACT meeting, 11 a 14 de maio de 2003, 1, 701-704). Exemplo 3:

Purificação do ANTICORPO A.

O processo de purificação foi baseado em três etapas de croma- tografia e uma etapa de diafiltração: cromatografia de afinidade, cromatogra- fia de troca catiônica, cromatografia de troca aniônica e diafiltração utilizando uma membrana de 100 kD, para a proteína A. Os tipos de gel e os tamanhos de coluna foram 1 I MabSeIect (GE Healthcare, Art. 17-5199, diâmetro de coluna de 9 cm, comprimento do leito 18 cm +/- 2 cm), 0.4 I CM-ToyopearI 650M (Toso Bioscience, Art. 007972, capacidade de pequenos íons = 85 microequivalentes/ml, diâmetro 5,0 cm, comprimento do leito 20 cm +/- 2 cm), 1.3 I Q-Sepharose FF (GE Healthcare, Art.17-0510-04), diâmetro 9 cm, comprimento do leito 20 +/- 2 cm. As colunas foram corridas na temperatura ambiente. As frações foram estocadas de 2 a 8°C. A detecção foi a 280 nm. Um módulo de ultrafiltração Biomax 100 com uma área de 0,1 m2 (Millipore Corp. Art. P2B100A01) foi usado para a concentração e diafiltração. Cromatografia da Proteína A

As seguintes soluções foram preparadas usando água purifica- da:

Solução A (tampão de equilíbrio): 25 mM Tris, 25 mM NaCI, 5 mM EDTA, ajustado a pH 7,1 +/- 0,1 com HCI.

Solução B (tampão de lavagem 1): ácido acético a 100 mM ajustado a pH 4,5+/-0,1 com NaOH.

Solução C (tampão de eluição): ácido acético a 100 mM ajustado a pH 3.2 +/- 0,1 com NaOH.

Solução D (tampão de lavagem 2): ácido acético a 100 mM, NaCI a 75 mM, pH 3 +/- 0,1.

Solução E: (tampão de regeneração): cloridrato camundongo de guanidina 2Μ, Tris 100 mM, ajustado a pH 7,5 +/- 0,1 com HCI.

Solução F (tampão de armazenamento): álcool benzílico a 200 mM, ácido acético a 100 mM, ajustado a pH 5,0 +/- 0,1 com NaOH.

A coluna foi primeiro equilibrada com 3 volumes de leito com a solução A.

Posteriormente foi carregada com a cultura de célula sobrena- dante clarificada (45 I, 386 mg/l de anticorpo).

Lavada com 5 volumes do leito da solução A;

Lavada com 3 volumes do leito da solução B;

E eluída com 3,5 volumes do leito da solução Ceo eluente foi recolhido;

Lavada com 3 volumes de coluna de solução D e;

Regenerada com 2 volumes de coluna de solução E;

Equilibrado com 3 volumes do leito de tampão A;

e lavado com volumes do leito de tampão F para armazenamento.

Uma taxa de fluxo linear de 100 cm/h foi usada para todas as etapas de cromatografia.

A carga de coluna foi 17,4 g de anticorpo/l de gel Mabselect e o rendimento total da mistura de isoformas foi de 96%.

Inativacão viral

A seguinte solução foi preparada usando água purificada: Solução G (solução de ajuste): acetato de sódio a 2 M. O pH do eluente da Proteína A foi ajustado a um pH entre 3,5 a 3,7 pela adição de acetato de sódio ou de ácido acético concentrado 2 M (solução G). Foi agitada durante 15 minutos e o pH foi ajustado a 4 +/- 0,1 acrescentando acetato de sódio de 2 M (solução G).

Cromatoarafia de troca catiônica

As soluções seguintes foram preparadas usando água purifica- da:

Solução H (tampão de equilíbrio): ácido acético de 100 mM, ajustado a pH de 4,0 +/- 0,1 com NaOH.

Solução I {tampão de eluição 1): acetato de sódio de 250 mM sem ajuste de pH; pH 7,8 a 8,5.

Solução J: (tampão de eluição 2): acetato de sódio de 500 mM sem ajuste de pH; pH 7,8 a 8,5.

Solução K (solução de regeneração): hidróxido de sódio a 0,5 M. Solução L (tampão de armazenamento): hidróxido de sódio a 0a01 M.

A coluna foi primeiro regenerada com 2 volumes do leito da so- lução K e depois equilibrada com 5 volumes de leito da solução H.

Em seguida, foi carregada com uma alíquota do eluente da Pro- teína A e lavado com 1 volume de leito da solução H.

Logo depois foi eluída com 6 volumes do leito da solução I. Nes- sa etapa foi eluída uma mistura das isoformas monoglicosilada e diglicosila- da. Na etapa seguinte 3 volumes do leito da solução J foram usados para eluir as isoformas não glicosiladas.

Depois do uso, a coluna foi regenerada com 2 volumes de leito da solução K, armazenada por 24 h neste tampão e então lavada novamente com 2 volumes do leito da solução K. Para armazenamento a coluna foi la- vada com 3 volumes de leito da solução L.

Um exemplo cromatograma é mostrado na figura 3. As frações da cromatografia foram analisadas por IEX analítico tal como descrito abaixo.

Uma taxa de fluxo linear de 100 cm/h foi usada para todas as etapas de cromatografia.

A carga da coluna foi de 14,3 g anticorpo/I CM-ToyopearI 650 M, e o rendimento foi de 79% da mistura das isoformas monoglicosilada e digli- cosilada e 6,2% das isoformas não glicosiladas.

Fluxo por cromatografia usando Q-Sepharose FF

As seguintes soluções foram preparadas com água purificada: Solução M (tampão de diluição): 37,5 mM Tris, ajustado a pH 7,9 ± 0,1 com ácido acético.

Solução N (solução de ajuste): Tris 2M.

Solução O (tampão de equilíbrio): acetato de sódio de 83 mm, 25 mM Tris, pH 7,5+/-0,1. Solução P (tampão de regeneração 1): NaOH de 0,5 M/NaC11M. A Solução Q (tampão de regeneração 2): ácido acético de 0,2 M/NaC11M. Solução R (tampão de armazenamento): NaOH a 0,01 M.

O eluente da coluna de CMT (ácida) foi primeiro diluído com a solução M a 1: 3 e depois ajustada para pH 7,5 com a solução N.

A coluna foi primeiro equilibrado com 2 volumes do leito da solu- ção O e depois o eluente diluído da coluna de CMT foi processado sobre a coluna e o fluxo através da mesma foi reunido. O produto foi lavado para fora da coluna com a solução O até que a absorção a 280 nm fosse mais baixa do que 0,1 (fluxo através do coletado).

A coluna foi regenerada com 1,5 volumes do leito da solução P1 armazenada por 1 h e depois regenerada com outros 1,5 volumes do leito da solução P. Depois a coluna foi regenerada com 2 volumes do leito da solu- ção Q e lavada com 3 volumes do leito da solução R e armazenada.

Uma taxa de fluxo linear de 100 cm/h foi usada para todas as etapas de cromatografia.

A carga de coluna foi 3,5 g de anticorpo/l de Q Sepharose FF, e o rendimento foi de 91% de mistura das isoformas monoglicosilada e diglico- silada.

Diafiltracão

A seguinte solução foi preparada usando água purificada: Solução S (tampão de diafiltração): Histidina a 20 mM, ajustado a pH 5,5 com HCl.

Um suporte com filtro Pellicon 2 (Millipore Corp.) foi equipado com 1 módulo de ultrafiltração do tipo Biomax 100 (Millipore Corp., área = 0,1 m2, Art. P2B100A01). Uma bomba da WATSON-MARLOW 501 U equi- pada com uma tubulação de silicone foi usado para a extração por meio de bombeamento. O sistema foi enxaguado com o tampão O e depois com 3,8 litros (1,1 g anticorpo/l) de fluxo através de cromatografia QS (pH ajustado para 5,5 com ácido acético concentrado) e foram concentrados a 250 a 300 ml dentro de 1 h de 4°C a 11 °C. Depois foi corrida a diafiltração (V = const.) com 3 litros do tampão S (aproximadamente 10 volumes) de 4°C a 110C. Finalmente o produto foi esterilizado por filtração com filtro Millipac 20 (Milli- pore Corp.). O rendimento da etapa de ultrafiltração/diafiltração foi de 91%. A concentração do produto foi 15 mg/ml. O produto pode ser congelado a - 70°C.

Método analítico IEX para a análise das frações

Coluna: Mono-S HR 5/5 (GE Healthcare, Art. 17-0547-01).

Tampão 1: 50 mM de ácido morfolinoetanossulfônico, pH ajustado a 5,8 com hidróxido de sódio.

Tampão 2: 50 mM de ácido morfolinoetanossulfônico, NaCI a 1 M pH ajusta- do a 5,8 com hidróxido de sódio.

Taxa de fluxo: 1 ml/min.

Detecção a: 280 nm.

Carga de amostra: 36 - 72 μ.

Gradiente de:

Tempo % tampão 2

0 min 0 1 0 25 63 27 63 28 0 35 0

Um exemplo de cromatograma é dado na Fig. 2. Rendimentos:

<table>table see original document page 88</column></row><table> <table>table see original document page 89</column></row><table>

Exemplo 4:

Caracterização de isoformas de ANTICORPO A por SDS-PAGE. A análise de SDS-PAGE foi realizada usando protocolos padrão

com o gel do Bis-Tris do gradiente de 4 a 12% NuPage (Invitrogen) e o mar- cador MARK12 (Invitrogen) como o controle. 1 a 3 pg de Proteína A sobre- nadante purificada das fermentações (Prod 01, 02, 03) ou das culturas gira- tórias (todas as faixas restantes) foram carregados por cada cavidade. A análise sob condições reduzidas resultou em uma única faixa para o pico 1 (ANTICORPO A diglicosilado), uma faixa dupla para o pico 2 (ANTICORPO A monoglicosilado) e uma única faixa para o pico 3 (ANTICORPO A não gli- cosilado) na faixa do peso molecular das cadeias pesadas. Os pesos mole- culares das duas faixas do pico 2 corresponderam aos pesos moleculares do pico 1 e do pico 2, respectivamente.

Resultados similares foram obtidos empregando diversos siste- mas da expressão como: transfecção transiente em células de HEK 293 EBNA, transfecção transiente em células CHO, e expressão estável em célu- las CHO. Exemplo 5:

Caracterização de isoformas de ANTICORPO A pela análise de Espectometria de massa (MS).

Um perfil completo da massa do anticorpo de todas as isoformas do ANTICORPO A foi determinado pela espectometria de massa por ioniza- ção da pulverização por elétron (ESI-MS).

Para isso, as amostras de ANTICORPO A foram preparadas sob condições não redutoras. As amostras eram desalinizadas nom ácido fórmi- co a 2% e na acetonitrila a 40% por filtração em gel G25 e usadas para a análise de ESI-MS em um espectrômetro de massa Q-Tof2 ou LCT da Wa- ters.

Uma separação pela massa molecular é obtida com uma dife- rença de 1623 entre o ANTICORPO A não glicosilado e ANTICORPO A mo- noglicosilado. A massa prevista para o ANTICORPO A não glicosilado a par- tir da seqüência do aminoácido é de 145.987 Da, que está de acordo com a massa experimental determinada de 145.979 Da. Similarmente, as isoformas monogíicosiladas e diglicosiladas do ANTICORPO A diferem por 1.624 Da, tal como indicado na figura 4. As diferenças observadas nas massas mole- culares são compatíveis com testes-padrão de glicosilação N sendo descri- tos mais detalhadamente aqui abaixo.

Exemplo 6:

A estrutura da glicosilação Asn-52 do ANTICORPO.

A Asn52 é parte da seqüência aaa-aaa-Asn-Ala-Ser-aaa-aaa da parte variável da cadeia pesada, que corresponde à seqüência Asn-aaa- Ser/Thr do consenso de glicosilação Ν. A glicosilação ligada a N de Asn52 foi confirmado mapeamento do peptídio triptossínico das isoformas do AN- TICORPO A e pela avaliação espectrométrica da massa do peptídio HC/T4 que contém Asn52. Em mapas anticorpo triptossínico do ANTICORPO A não glicosilado, exclusivamente um peptídio que corresponde pela massa ao peptídio glicosilado HC/T4 parece, indicando que Asn52 não era glicosilado, visto que no ANTICORPO A monoglicosilado ou diglicosilado os peptídios foram detectados pela massa correspondente ao HC/T4 que contém estrutu- ras ligadas ao N do açúcar.

Para confirmar também a glicosilação da seqüência do consenso no peptídio triptossínico HC/T4 da cadeia pesada, o peptídio glicosilado HC/T4 foi isolado dos mapas de isoformas do peptídio glicosilado do ANTI- CORPO A e analisado pela espectrometria de massa MALDI antes e depois da incubação com N-glicosidase F. Antes do tratamento com N-Glicosidase F, foram obtidas as massas correspondentes ao peptídio HC/T4 que contém estruturas ligadas ao N do açúcar. Entretanto, a massa do peptídio HC/T4 tratado com a N-Glicosidase F correspondeu à massa esperada ao HC/T4 não glicosilado +1Da, tal como esperado se uma cadeia do açúcar fosse removida da asparagina pela N-Glicosidase F (de Asn à Asp-conversão).

A presença de ácidos N-acetil-neuramínico nas estruturas do açúcar unidas a Ash52, também, indica a presença do tipo estruturas ligadas ao N do açúcar do tipo complexas e do híbridas. Para isso, as isoformas do ANTICORPO A glicosilado foram tratadas com o N-Glicosidase F, que remo- ve o Açúcar do N na Asn306, mas não na Asn52 e com ou sem a neuramini- dase e analisadas após a separação de HC e LC pela desnaturação e a re- dução e a dessalinização. As massas obtidas para o HC de ambas as apro- ximações diferiram por aproximadamente 291 Da ou por 582 Da, o que cor- responde a um ou 2 ácidos siálicos. A partir daí, concliu-se também que os açúcares ligados ao N do tipo do complexo e/ou híbrido estiveram unidos à Asn52.

Essa glicosilação Asn-52, uma glicosilação N, consistindo pre- dominantemente de estruturas de açúcar do tipo complexo bifurcado (> 75%; principalmente de 80 a 90%) sem fucosilação do núcleo e altamente sialida- do com o até 80% de bifurcações do tipo complexo contendo ácidos N-acetil- neuramínico. As estruturas menores de açúcar pertenceram ao híbrido bifur- cado e ao tipo oligomanose (< 25%), respectivamente (figura 5 ou figura 27).

As estruturas de glicosilação comuns a todas as Asn52 foi a resistência à clivagem por N-glicosidase F de ANTICORPO A intacto.

Exemplo 7:

A estrutura de glicosilação da Asn306 do ANTICORPO A.

Tal como indicado acima, ANTICORPO A contido unido à aspa- ragina 306 (Asn306) na porção Fc da cadeia pesada (HC) uma glicosilação do tipo anticorpo que consiste em uma cadeia bifurcada complexa do oligos- sacarídeo. Sabe-se bem que os anticorpos contêm diferentes isoformas de tal cadeia complexa do oligossacarídeo do tipo bifurcado, variando no grau de galactosilação terminal, de sialização e no grau de fucosilação do núcleo. Além disso, sabe-se que o grau de falta de fucosilação do núcleo na cadeia do açúcar localizada na Fc é importante para a eficácia in vivo dos anticor- pos, porque é bem aceito que o grau de fucosilação do núcleo modula as funções executoras dos anticorpos.

Para o ANTICORPO A em maior concentração, as variações típicas do anticorpo (Routier (1997), Glyoconjugate 14(2), 201-207; Raju (2003), BioProcess International, 44-52) nas cadeias de açúcar localizadas na Fc unidas a Asn306 foram encontrados relações de galactosilação termi- nal e de fucosilação do núcleo.

A heterogenicidade no grau do galactosilação terminal (As estru- turas GO: G1: G2) foi determinada para aproximadamente 35-40% nas estru- turas GO, aproximadamente 45% nas estruturas G1 e aproximadamente 15- 20% nas estruturas G2 (para a demonstração esquemática das estruturas vide a figura 6 ou a figura 27).

O teor de estruturas de açúcar na Fc em que falta a fucosilação do núcleo, isto é, faltando a unidade do fucose unida ao N-acetil-glicosamina mais interna da estrutura do açúcar do núcleo, é provavelmente importante para um anticorpo, já que a presença ou a ausência desta unidade de fucose pode modular a ligação do anticorpo aos receptores da Fc das células exe- cutoras, influenciando desse modo a atividade destas células.

Para o ANTICORPO A o teor relativo das isoformas da cadeia de açúcar em que falta a fucosilação do núcleo na Asn 306 foi determinada por dois métodos diferentes, tal como descrito nos seguintes itens: A) Espectrometria de massa do HC glicosilado completo:

As amostras de ANTICORPO A foram desnaturadas e reduzidas em cadeia leve (LC) e no HC glicosilado na presença do cloridcamundongo de guanidina a 6M e de TCEP a 250 mM. As amostras reduzidas foram des- salinizadas em ácido fórmico a 2% e em acetonitrila a 40% e usadas para a análise de ESI-MS em um espectrômetro de massa Q-Tof2 ou LCT da Wa- ters. A partir dos espectros de m/z obtidos os teores relativos das isoformas individuais do oligossacarídeo foram calculados pela altura do pico dos HCs glicosilados que contém as isoformas individuais do oligossacarídeo dos úni- cos estados selecionados de m/z. Para o cálculo do teor relativo do açúcar estrutura faltando na fucosilação do núcleo, altura do pico da estrutura GO em que falta a fucose do núcleo (GO-Fuc) relacionado com a soma de GO + (GO-Fuc).

As respectivas estruturas de carboidcamundongo foram atribuí- das de acordo com as diferenças das massas obtidas para o HC glicosilado e para o HC, cujas estruturas de oligossacarídeo foram removidas pela incu- bação com o N-Glicosidase F antes da análise de MS em experimentos de. controle.

B) Análise cromatográfica de oliqossacarídios liberados por HPEAC-PAD:

As amostras de ANTICORPO A são incubadas com N- Glicosidase F em tampão de fosfato de sódio em pH 7,2 a fim liberar as ca- deias do oligossacarídeo da Asn306 (as estruturas do açúcar em Asn52 não foram removidas do anticorpo intacto, não desnaturado sob as circunstân- cias usadas). As cadeias liberadas de açúcar foram separadas da proteína do ANTICORPO A pela filtração com centrifugação e analisadas em uma coluna de Carbo Pac PA200 da Dionex em um sistema BioLC, usando um gradiente do acetato de sódio em pH alcalino forte (pH= 13). A coluna usada foi capaz de resolver as cadeias não fucosiladas das fucosiladas do oligos- sacarídeo. A atribuição dos picos individuais obtidos às estruturas respecti- vas de carboidcamundongo foi feita comparando os tempos da retenção desses dos padrões apropriados dos oligossacarídios analisados na coluna de Carbo Pac PA200 e determinando a massa molar dos picos separados e coletados pela espectrometria de massa de MALDI, respectivamente. Para o cálculo do teor relativo das estruturas do açúcar em que faltam a fucosilação do núcleo, foi formada a soma da% área de todas as estruturas em que fal- tam a fucose do núcleo.

A análise de diversas bateladas (combinações de isoformas di- glicosiladas e monoglicosiladas do ANTICORPO A) e de isoformas purifica- das do ANTICORPO A, respectivamente, revelaram que o teor de cadeias não fucosiladas ligadas à Asn306 do oligossacarídeo ficou na faixa de 14% a 27% (medida pela MS) e 6% a 26% (medidos pela HPAEC-PAD), respecti- vamente.

Exemplo 8:

A determinação dos valores de ko para a COMPOSIÇÃO DO ANTICORPO A e as isoformas (por exemplo, anticorpos não glicosilados, monoglicosilados ou diglicosilados, de acordo com a presente invenção) li- gadas às fibras Αβ1-40 e Αβ1-42 in vitro pela ressonância do plasmônio de superfície (SPR).

A ligação do ANTICORPO A ao Αβ fibrilar foi medida online pela ressonância do plasmônio de superfície (SPR), e as afinidaoes das intera- ções moleculares foram determinadas como segue: Os equipamentos Biaco- re2000 e Biacore3000 foram usados para essas medidas. As fibras Αβ1-40 e Αβ1-42 foram geradas in vitro pela incubação de peptídios sintéticos em uma concentração de 200 pg/ml em tampão da acetato de sódio a 10 mM (pH 4,0) por três dias a 37°C. A análise de microscopia eletrônica confirmou uma estrutura fibrilar para ambos os peptídios, o Αβ1-40 mostrando umas fibras predominantemente mais curtas (< 1 mícron) e a Αβ1-42 mostrando fibras predominantemente mais longas (> i mícron). Estas fibras foram su- postas para representar a agregação dso peptídios Αβ no cérebro humano com AD mais proximamente do que misturas definidas da i11 de agregados amorfos e de precipitates desestruturados. As fibras foram diluídas a 1:10 e acopladas diretamente a um CM5 tal como descrito no manual de instrução do fabricante (BIAappIication Handbook, versão AB, Biacore AB, Uppsala, 1998).

Este procedimento do acoplamento incluiu uma etapa de ativa- ção, durante a qual os grupos do ácido carboxílico na superfície foram trans- feridos em grupos quimicamente reativos do éster de succinimida contatan- do a superfície com uma mistura aquosa de N-hidroxissuccinimida e de clo- ridcamundongo 1 - etil - 1 - (3-diaminopropil) - carbodiimida, e uma etapa do imobilização, durante a qual a superfície ativada foi contatada com as fibras dissolvidas no tampão do acetato a 10 mM (pH 4,5) em 200 a 350 unidades de ressonância (1 unidade do ressonância (RU) corresponde aproximada- mente a uma carga de superfície de 1 picograma/mm2). A superfície carre- gada da fibra foi contatada então com as soluções do anticorpo na faixa de concentração de 200 nM ≥ C ≥ 0,15 nM. As curvas típicas de resposta de- pendentes do tempo (= sensogramas) monitoradas durante a fase de asso- ciação (durante o contato com o tampão) e a fase de dissociação (contato posterior com tampão) são mostradas na figura 7.

Os valores de K0 para ligar às fibras Αβ1-40 e Αβ1-42 das iso- formas do ANTICORPO A são dados na tabela abaixo. Resumidamente, os valores de Kd foram calculados pela análise do tipo Scatchard usando res- postas de ligação dependentes da concentração de equilíbrio. Estas cons- tantes de ligação do equilíbrio podem ser obtidas de duas maneiras.

Devido ao processo muito lento da associação em baixos inter- valos de contato da concentração do anticorpo para alcançar o equilíbrio foram muito longos (figura 7). Não obstante, tais intervalos de contato pude- ram ser realizados em equipamentos Biacore e as respostas experimentais do equilíbrio puderam ser submetidas a uma análise de Scatchard.

Os dados da ligação do equilíbrio foram obtidos também por ex- trapolação das curvas dependentes da associação de um tempo mais curto até o infinito. Estes níveis de ligação do equilíbrio teoricamente obtidos fo- ram usados então outra vez para a determinação dos valores de KD.

Independentemente do modo de se determinar as respostas sensíveis ao equilíbrio, os pontos curvilíneos de Scatchard foram obtidos. Pelo traçado curvilíneo de Scatchard uma maior afinidade (bivalente) e uma menor afinidade (monovalente) foram derivadas para as isoformas do ANTI- CORPO A derivadas do segundo ciclo de maturação da afinidade. Estas du- as afinidades representam os valores superiores e indferiores de Kd da es- cala indicada na seguinte Tabela: <table>table see original document page 96</column></row><table>

A tabela acima mostra os valores de Kd dos complexos de baixa afinidade (monóvalente) e dos complexos de alta afinidade (bivalente) for- mados pela interação das isoformas do ANTICORPO A e de fibrilas Αβ1-40 tal como determinado pela ressonância do plasmônio de superfície. São da- dos os valores dé K0 determinado usando-se respostas extrapoladas do e- quilíbrio (marcado "extrapolação") e os valores determinados de K0 usando- se respostas determinadas experimentalmente pelo equilíbrio (marcado "ex- perimental"). Os valores extrapolados foram determinados pelo menos seis vezes e é fornecido um desvio-padrão. Os valores de Kd baseados em res- postas experimentais e em respostas extrapoladas do sensor do equilíbrio são iguais dentro dos limites dados por estes desvios-padrão.

Exemplo 9:

Mapeamento de Epítopo da COMPOSIÇÃO DO ANTICORPO A e isoformas (por exemplo, anticorpos não glicosilados, monoglicosilados ou diglicosilados, de acordo com a presente invenção) pela análise pepspot com decapeptídios.

Um epitopo (determinante antigênico) pode ser linear ou confor- macional. A dupla especificidade aqui descrita do epitopo foi definida pela reatividade do anticorpo com os dois peptídios lineares não seqüenciais.

O mapeamento do epitopo que mostra as aproximações que foram usadas para definir o reconhecimento específico do epitopo está ba- seado na tecnologia ELISA com os conjugados do hexapeptídio revestidos sobre as placa de micros ou na tecnologia do pepspot. A última tecnologia permite a detecção e a quantificação do anticorpo pelos protocolos que são conhecidos geralmente como Western blot de proteínas para membranas de pvdf.

As tecnologias aplicadas de mapeamento de peptídio são proje- tadas para detectar especificamente epítopos lineares, visto que não podem ser aplicados para mapeamento os epítopos especialmente mais complexos tais como epítopos descontínuos ou conformacionais. As técnicas disponí- veis para o mapeamento dos epítopos conformationais ou descontínuos, como a exploração do domínio e disposições combinatoriais do peptídio re- querem peptídios longos de até 36 aminoácidos (domínios) ou os peptídios combinados cada um consistindo 12 aminoácidos.

As técnicas aplicadas são consideradas conseqüentemente sendo específicas para epítopos lineares, excluindo os epítopos conformati- onais ou descontínuos ou os epítopos descontinuamente dispersos que são envolvidos.

Em conclusão, os dados apresentados mostram que as duas regiões dentro do peptídio Αβ aqui definido assemelha-se aos epítopos line- ares independentes reconhecidos simultaneamente baseados na única du- pla especificidade original do epitopo dos anticorpos investigados em único peptídio Αβ hexamérico ou decamérico.

A seguinte seqüência de aminoácidos que abrange Αβ (1-42) foi dividido em 43 decapeptídios se sobrepondo com um deslocamento estrutu- ral de 1 aminoácido. Os números refere-sem aos aminoácidos essenciais da seqüência Αβ(1-40) que têm que estar presentes no decapeptídio para a ótima ligação do anticorpo.

isevkm1daef rhdsgyevhh qklvffaedv gsnkgaiigl mvggv- VI42ATV IV (SEQ DO ID N9: 4). Desse modo, DAEF RHDSGYEVHH Q- KLVFFAEDV GSNKGAIIGL MVGGWIA (SEQ DO ID Ne: 3) representam os aminoácidos 1 a 42 do peptídio Αβ4/β-Α4.

Os 43 decapeptídios foram sintetizados com acetilação da ter- minação Nea terminação C são covalentemente ligados a uma folha da celulose ("pepspot") por um fornecedor comercial (Jerini BioTooIs, Berlim). A folha da celulose foi incubada por 2 horas em uma plataforma agitada com anticorpo monoclonal (1 pg/ml) com tampão de bloqueamento (50 mM Tris.HCI, 140 mM de NaCI, 5 mM NaEDTA1 0,05% NP40 (Fluka), 0,25% ge- latina (Sigma), fração V da albumina do soro de bovídeos a 1% (sigma), pH 7,4). A folha foi lavada 3 vezes por 3 minutos em uma plataforma agitada com TBS (10 mM Tris.HCI, 150 mM de NaCIl .pH 7,5). Depois foi pressiona- da sobre um papel de filtro, molhado com tampão do catodo (25 mM Tris base, 40 mM de ácido 6-aminoexano, 0,01% SDS, metanol a 20%) e transfe- rida para uma célula de blotinhg semi-seca com o lado do peptídio voltado para uma membrana de PVDF (Biorad) do tamanho igual.

A célula de bloting semi-seca consistiu nos papéis de filtro re- centemente molhados (Whatman N°3) ligeiramente maiores do que a folha do peptídio:

3 papéis molhados com tampão de catodo; a folha do peptídio;

uma folha de membrana de PVDF molhada com metanol; 3 papéis molharam com tampão 1 do anodo (base de 30mM Tris, metanol a 20%);

3 papéis molhados com tampão 2 do anodo (base de 0,3 mM Tris, metanol a 20%).

A transferência foi conduzida em uma densidade de corrente entre o catodo e o anodo de 0,8 mA/cm2 por uma hora, o que foi suficiente para eluir completamente o anticorpo da folha da celulose e o transferir para a membrana de PVDF. A membrana de PVDF foi imersa no tampão de blo- queamento por 10 minutos. A lgG(H+L) de cabra anti-humana marcada com fluorocromo IRdye800 (Rockland código ns 609-132-123) foi adicionada na diluição 1:10.000 no tampão de bloqueio da Odyssey (Li-Cor) e uma diluição adicional de 1:1 com PBS, 0,05% Tween 20. A membrana foi incubada em uma plataforma agitada por 1 hora. Foi lavada por 3x10 minutos com TBST (TBS com 0,005% Tween 20). A membrana foi seca e feita a varredura para o flurescência de 800 nm usando um escâner de flurescência de longo com- primento de onda (Odyssey) tal como mostrado em figura 8.

A atribuição exata de pontos reativos do anticorpo foi consegui- da marcando a membrana de PVDF com uma ponta de agulha. Os epítopos do anticorpo em questão foram definidos como a seqüência mínima de ami- noácidos nos peptídios reativos. A intensidade da flurescência foi integrada sobre cada ponto e gravada como a unidade relativa do flurescência (RFU). Para comparação dois anticorpos monoclonais de camundongo (BAP-1 que é equivalente ao anticorpo 6E10 (Kim (1998).) com especificidade para o domínio da terminação N, e o BAP-44 que é equivalente ao anticorpo 4G8 (Kim (1998)) com especificidade para o domínio médio) foram analisados da mesma maneira, com exceção de usar a Ig anti-camundongo em vez da Ig anti-humana, para a detecção.

É de se notar que a maturação da afinidade e a conversão dos fragmentos monovalentes de Fab em anticorpos IgGI de cadeia completa resultam geralmente em alguma seqüência de fronteira do reconhecimento do epitopo tal como indicado pelo pepspot e pelas análises de ELISA. Isto pode estar relacionado ao recrutamento de mais pontos de contato na área da interação do anticorpo-antígeno em conseqüência da maturação da afini- dade ou a uma ligação mais forte ao epitopo mínimo de tal modo que tam- bém as interações fracas com aminoácidos adjacentes podem ser detecta- das. O último pode ser o caso quando os peptídios derivados da Αβ são sondados com os anticorpos do comprimento total da IgG. Tal como ilustra- do na tabela abaixo, foram comparadas as seqüências do reconhecimento da terminação N e os epítopos médios foram estendidos por até três amino- ácidos quando o Fabs orignário e os anticorpos de IgG correspondentes completamente maturados. Entretanto, deve-se manter em mente que os decapeptídios foram modificados para a ligação covalente na terminação C do aminoácido este aminoácido pode conseqüentemente não estar facilmen- te acessível ao anticorpo de comprimento total devido ao impedimento esté- rico. Se este for o caso, a última terminação C do aminoácido não contribui significativamente para a seqüência de reconhecimento do epitopo e uma redução potencial da seqüência mínima do reconhecimento por um aminoá- cido na extremidade na terminação C tem que ser considerada na análise pepspot tal como usada na presente invenção.

<table>table see original document page 100</column></row><table>

A tabela acima refere-se à análise pepspot da ligação de anti- corpos IgG de comprimento total aos decapeptídios sobre uma folha de celu- lose. Os números refere-sem à posição do aminoácido na seqüência Αβ1-40 que têm que estar presentes no decapeptídio para a ligação do anticorpo. Uma extensão adicional ao epitopo é indicada nos suportes a fim indicar os aminoácidos de flanqueamento que são necessários para conseguir a má- xima ligação.

Exemplo 10:

Ensaio de despolimerização empregando as isoformas do AN- TICORPO A (por exemplo, anticorpos não glicosilados, monoglicosilados ou diglicosilados, de acordo com a presente invenção) que induz a liberação da Αβ biotinilada da Αβ agregada.

O arranjo experimental para testar o potencial das isoformas do ANTICORPO A em induzir a dissociação da agregação Αβ foi tal como se segue: A Αβ1-40 biotinilada foi incorporada primeiramente nas fibras Αβ1 -40/Αβ1 -42 preformadas antes do tratamento com as isoformas de AN- TICORPO A. A liberação de Αβ biotinilada foi medida usando um ensaio que emprega um conjugado de streptavidina-POD tal como descrito abaixo.

A Αβ sintética quando incubada no tampão aquoso durante di- versos dias espontâneamente agrega e dá forma às estruturas fibrillares sendo similares àquelas vistas em depósitos amilóides nos cérebros de pa- cientes com mal de Alzheimer. O seguinte no ensaio in vitro é apropriado à incorporação da medida ou a liberação da Αβ biotinilada em agregados Αβ preformados a fim analisar o potencial de neutralização da Αβ dos anticor- pos anti-Αβ e de outras proteínas Iigantes ao Αβ tais como a albumina (Bo- hrmann (1999) J. Biol. Chem. 274. 15990-15995). As isoformas do ANTI- CORPO A induzem a despolimerização de Αβ agregada tal como medido pela liberação do Αβ1-40 incorporado biotinilado.

Procedimento Experimental:

As placa de micros NUNC Maxisorb (MTP) foram revestidas com uma mistura de 1:1 de Αβ1-40 e de Αβ1-42 (2 μΜ cada um, 100 μΙ por cavi- dade) a 37°C por três dias. Sob estas circunstâncias altamente agregantes, a Αβ fibrilar foi absorvida e imobilizada na superfície do cavidade. A solução de revestimento foi então removida e as placas foram secas na temperatura ambiente por 2 a 4 horas. As placas secas puderam ser armazenadas a - 20°C. Para a incorporação da Αβ biotinilada as placas revestidas foram in- cubadas com 200 μl/cavidade de Αβ1-40 biotinilada a 20 nM em TBS que contém 0,05% de NaN3 a 37°C durante uma noite. Após lavagem da placa com 3 χ 300 μl/cavidade T-PBS, os anticorpos diluídos em série em TBS que contendo 0,05% de NaN3 foram adicionados e incubados a 37°C por 3 ho- ras. A placa foi lavada e analisada para a presença de Αβ1-40 biotinilado. Após lavagem com 3 χ 300 μl de T-PBS um conjugado de estreptavidina- POD (Roche Molecular Biochemicals), diluído a 1:1000 em T-PBS contendo 1% BSA1 foi adicionado (100 μl/cavidade) e incubado na temperatura ambi- ente por 2 horas. Os cavidades foram lavadas 3 χ com T-PBS e 100 μl/cavidade de uma solução recentemente preparada do tetrametil-benzidina (TMB). [Preparação da solução de TMB: 10 ml um ácido cítrico a 30 mM pH 4,1 (ajustado com KOH) + 0,5 ml TMB (12 mg TMB em 1 ml de acetona + 9 ml de metanol) + 0,01 ml 35% de H2O2]. A reação foi parada adicionando 100 μl/cavidade de H2SO4 1 N e a absorbância foi lida em 450 nm em um leitor de placa de micros.

Tal como documentado na figura 9 anexada, as isoformas de ANTICORPO A induzem a dissociação de Αβ agregadas tal como medido pela liberação da incorporado Αβ1-40 biotinilada. As isoformas de ANTI- CORPO Aeo anticorpo monoclonal BAP-1 de camundongo foram similar- mente ativos (figura 9), enquanto que os anticorpos BAP-2, BAP-17 e 4G8 foram claramente menos eficientes em liberar a Αβ biotinilada do volume de Αβ imobilizada (dados não mostrados). BAP-1 pode ser claramente diferen- ciada das isoformas do ANTICORPO A glicosilado por sua reatividade com APP de superfície de comprimento total da célula. Anticorpos como BAP-1 com tais propriedades não são úteis para aplicações terapêutica porque as reações auto-imunológicas potenciais podem ser induzidas. É interessante notar que BAP-2, apesar de sua especificidade para o resíduo 4-6 do ami- noácido que foi exposto no Αβ agregado tem uma atividade claramente mais baixa neste ensaio que indica que nem todos os anticorpos específicos da terminação N são a priori ingualmente eficientes em liberar Αβ dos agrega- dos preformados. A eficiência relativamente baixa de BAP-17 (terminação C específico) e do 4G8 (específico dos resíduos 16-24 do aminoácido) nesse ensaio foi devida à natureza oculta destes dois epítopos agregados dentro da Αβ. A BSA nas concentrações aqui usadas não teve nenhum efeito agre- gante sobre a Αβ.

A isoforma monoglicosilada exerceu uma capacidade mais ele- vada comparada com a isoforma diglicosilada para despolimetrizar o peptí- dio Αβ agregado in vitro, o que pode ser relevante também in vivo.

Exemplo 11:

COMPOSIÇÃO DO ANTICORPO A e compreendendo a captura

de isoformas solúveis (anticorpo monoglicosilados e diglicosilados de acordo com a presente invenção) Αβ do fluido cérebro-espinhal (FCE). A capacidade capturar o Αβ solúvel de amostras do fluido cére- bro-espinhal (FCE) humano foi determinada por imunoprecipitação (IP) e pela análise Western blot semi-quantitativa (WB). Procedimento Experimental:

A imunoprecipitação de amostras humanas do CFS foi feita de acordo com o seguinte esquema: 70 μΙ de FCE;

20 μΙ de tampão de incubação (50 mM Tris, NaCI a 140 mM, EDTA a 5 mM, 0,05% de NP-40, 1% de BSA1 0,25% de gelatina, 0,25% leite em pó, pH 7,2); 10 μΙ de isoformas do ANTICORPO A (1000 - 10 Mg/ml); 100 μΙ.

A solução foi mantida armazenada por uma hora a 4°C. 40 μΙ de proteína G em contas de Sepharose (Amersham Biosciences #17-0618-01; lavada com PBS, pasta e 50%) foram adicionados e incubados por 2 horas a 4°C no rotator. Depois de centrifugação em 500 g por 3 minutos a 4°C o so- brenadante foi removido e 200 μΙ PBS foram adicionados aos grânulos, transferidos aos tubos de filtro Millipore 0,45 μιη (Millipore # UFC30HVNB) e centrifugados a 500 g por 3 minutos a 4°C. 200 μΙ adicionais de PBS foram adicionado aos grânulos, girados em vórtice e centrifugados a 2.000 g por 3 minutos a 4°C.

Para o SDS-PAGE, 18 μΙ de proteína G foram aplicados ao gel NuPage com 10% de gel Bis-Tris juntamente com Αβ1-42 (Bachem) como padrão interno diretamente na amostra de tampão como padrão e corrida em tampão de MES do sistema.

O gel foi transferido à membrana Hybond C extra (sistema No- vex semi-seco) seca por 3 minutos na temperatura ambiente. A membrana foi transferida em PBS preaquecido e aquecida em microondas por 3 min a 600 W. O bloqueio foi feito por 1 hora com solução SuperBIock (Pierce) e uma obstrução adicional por 1 hora com 5% de leite em pó (BioRad) em T- PBS (0,1%Tween20em PBS).

A incubação foi feita durante a noite com anticorpo anti-Αβ W02 Anticorpo (1:1500-1:2000 da Genetics, Inc. Zurique, Suiça) a 4°C em um rotator, seguida por lavagem 3x com T-PBS por 5 min e incubação por 2 ho- ras na temperatura ambiente com IgG-HRP (Dako) anti-camundongo 1:5000 em T-PBS. Outra lavagem 3 χ com T-PBS por 5 min foi seguida pela incuba- ção com LumiLight Plus por 5 minutos na temperatura ambiente. Os Western blot foram digitalizados e analisados por densometria com um sistema de câmeras da Alfa Innotech Digital.

Tal como documentado na figura 10, a COMPOSIÇÃO DE AN- TICORPO A (compreendendo as isoformas monoglicosiladas e diglicosila- das do ANTICORPO A) se ligou eficientemente ao Αβ solúvel no fluido cére- bro-espinhal (FCE) humano tal como demonstrado pela imunoprecipitação e por experimentos de Western blot. Notavelmente, neste ensaio, o ANTI- CORPO A monoglicosilado foi mais eficiente na captura do Αβ solúvel do que o ANTICORPO A diglicosilado (figura 10).

Exemplo 12;

Imunopigmnetação in vitro de placas amilóides humanas pela COMPOSIÇÃO DO ANTICORPO A e suas isoformas (por exemplo, anticor- pos não glicosilados, monoglicosilados ou diglicosilados, de acordo com a presente invenção).

As isoformas glicosiladas do ANTICORPO A foram testadas pa- ra sua capacidade de pigmentar placas humanas genuínas de β-amilóide obtidas das seções do cérebro dos pacientes com mal de Alzheimer severo pela análise imunoistoquímica usando a imunofluorescência indireta. Foi demosntrada a coloração específica e sensível de placas humanas genuínas de β-amilóide.

As secções criostáticas do tecido não fixado do córtex temporal, obtidas pós-morte de um paciente que foi diagnosticado positivamente para o mal de Alzheimer foram marcadas por imunofluorescência indireta. Uma incubação de duas etapas sucessivas foi usada para detectar as isoformas ligadas de ANTICORPO A, que foram reveladas pela afinidade ao anticorpo de cabra purificado anti-humano (GAH) IgG (H+L) conjugado ao Cy3 (# 109- 165-003, lote 49353, Jackson Immuno Research). Os controles incluíram os anticorpos não relacionados de IgGI humana (sigma) e o anticorpo secun- dário sozinho, que deram todos resultados negativos.

Todos os tipos de placas β-amilóide foram sensivelmente e es- pecificamente detectados e revelaram consistentemente em uma concentra- ção de ANTICORPO A de 10 ng/ml (figura 11).

A coloração específica e sensível das placas de β-amilóide hu- mano genuíno foi demonstrada para as isoformas do ANTICORPO A glicosi- lado em uma concentração até 1 pg/ml.

Em uma concentração de 10 pg/ml foi observado um fundo pig- mentado, bem mais proeminente com a isoforma não glicosilada do ANTI- CORPO A. A isoforma não glicosilada exerceu uma viscosidade não especí- fica considerável observada na superfície das lâminas de vidro em quase todos os componentes do tecido que foram expostos após o processo secio- namento in vitro. Isto pareceu ser devido à ligação não específica que envol- ve interações tônicas e/ou hidrofóbicas.

Exemplo 13:

Ornamento in vivo da placa β-amilóide pelo ANTICORPO A em um modelo do camundongo do Mal de Alzheimer.

As isoformas glicosiladas do ANTICORPO A foram testadas em um estudo de dose única em camundongos duplamente transgênicos PS2APP (Richards (2003), J. Neuroscience, 23, 8989-9003) para sua capa- cidade imunoornamentar as placas β-amilóide in vivo. As isoformas do AN- TICORPO A glicosilado foram administradas em dose única de 1 mg/camundongo e após 3 dias os animais foram perfundidos com tampão de fosfato salino e os cérebros congelados em gelo seco e preparados por cri- osseccionamento.

Ambas as isoformas glicosiladas mostraram uma penetração melhorada e altamente eficaz do cérebro in vivo (em comparação à forma não glicosilada).

A penetração eficaz do cérebro e a ligação específica às placas β-amilóide foram demonstradas nos camundongos PS2APP, em um modelo de camundongo para amiloidose relacionada com AD. A presença dos anti- corpos limitados às placas β-amilóide foi avaliada usando seções não fixa- das do criostática por imunofluorescência indireta com marcação simples de anticorpo de cabra de IgG anti-humano (H+L) conjugado ao Cy3 (# 109-165- 003, Jackson Immuno Research) mostrado na figura 12 ou em seguida por contra-pigmentação com o imunoconjugado BAP-2-Alexa488 para visualizar a posição e a distribuição de todos os tipos de placas β-amilóide presentes no tecido.

Uma aproximação da pigmentação por imunoflurescência foi usada para detectar ANTICORPO A ligado. Após a adesão às lâminas de vidro pré-resfriadas, as seções hidratadas em PBS e foram tratadas com a acetona 100% e pré-resfriadas a -20°C por 2 minutos. Lavagem com PBS foi feita duas vezes por dois minutos. O bloqueio dos sítios de ligação não es- pecífica foi feito ou com PBS contendo 1% BSA ou por incubação seqüencial com bloqueador Ultra V (LabVision) por 5 mínimo seguida por uma lavagem com PBS e incubação em uma solução com força de bloqueio (BioGenex) com lâminas contendo 10% de soro normal de carneiro por 20 minutos. Após o lavagem com o PBS com o soro normal de carneiro a 10% as lâminas fo- ram incubadas com anticorpo de cabra purificado com afinidade (GAH)lgG(H+L) anti-humana conjugada a Cy3 (# 109-165-003, lote 49353, Jackson Immuno Research) em uma concentração de 15 pg/ml por 1 hora na temperatura ambiente. A contra-pigmentação para placas amilóide foi feita por incubação com BAP-2, um anticorpo monoclonal do camundongo contra o anticorpo conjugado para a Alexa 488 em uma concentração de 0,5 pg/ml por 1 hora na temperatura ambiente. Autoflurescência da Iipofuccina foi extinta pela incubação com 4 mM de CuSO4 em 50 mM de acetato de amônio. Após ter enxaguado as lâminas em água bidestilada e lavando-se com 2 χ 500 μΙ/lâmina de PBS, as lâminas foram presas no meio da monta- gem de flurescência (S3023 Dako).

A imagem foi feita por microscopia laser confocal e o processa- mento da imagem foi realizado para a análise quantitativa das colocaliza- ções pelos softwares IMARIS e COLOCALIZATION (Bitplane, Suíça).

Depois uma única dose de 1 mg por isoformas do ANTICORPO A glicosilado do camundongo foi avaliada como penetrando eficazmente a- través da barreira de sangue-cérebro e a imunoornamentação/ligação de todas as placas β-amilóide após três dias in vivo. As imagens representati- vas são mostradas em figura 12. Isto está em claro contraste com as formas não glicosiladas que não são detectáveis nas placas amilóides.

Exemplo 14:

Investigação da ligação das isoformas do ANTICORPO A ao precursor da proteína amilóide (APP) expressado na superfície das células HEK293:

O método da citometria de fluxo é bem-conhecido na técnica. As unidades relativas de flurescência (por exemplo, FL1-H) medidas pela liga- ção na superfície indicada pela citometria de fluxo da célula do respectivo anticorpo. Um deslocamento da flurescência na APP transfectada HEK293 comparando com as células HEK293 não transfectadas indicou a reação não desejada com a superfície da célula APP. Como um exemplo, os anticorpos BAP-1 e BAP-2 contra o domínio da terminação N mostraram que um deslo- camento significativo do sinal FL-1 em HEK293/APP (figura 13, linha grossa, painel do lado direito) comparado com as células HEK293 não transfectadas (figura 13, linha pontilhada, painel do lado esquerdo). Similarmente, o anti- corpo BAP-44 (específico para o epitopo médio Α-beta) mostrou um deslo- camento similar do tamanho. Em contraste, todas as isoformas do ANTI- CORPO A (figura 13 painel da mão esquerda) (específico para o terminação N e epítopos médios Α-beta) não mostraram nenhum deslocamento signifi- cativo na flurescência. As células não transfectadas HEK293 tiveram uma flurescência basal mais elevada do que a das células APP transfectadas de- vido às propriedades diferentes do tamanho e da superfície da célula. Um equipamento de FACScan foi usado em combinação com o pacote de soft- ware Cellquest Pro (ambos da Becton Dickinson).

As isoformas do ANTICORPO A foram destituídas da reatividade para as células de superfície APP (figura 13). Exemplo 15:

Análise morfométrica da placa Αβ de deposição em um modelo do camundongo para o Mal de Alzheimer. As potencialidades da COMPOSIÇÃO DO ANTICORPO A ou das isoformas de ANTICORPO A para reduzir a amiloidose in vivo foram estudadas nas várias regiões do cérebro (tálamo, neocórtex, hipocampo e subículo) usando a análise quantitativa de imagem com auxílio de computa- ção dos cérebros de camundongos PS2APP que receberam um tratamento de 5 meses com COMPOSIÇÃO de ANTICORPO A ou isoformas de ANTI- CORPO A.

Desse modo, os camundongos PS2APP machos transgênicos foram injetados i.v. com a COMPOSIÇÃO do ANTICORPO A ou as isofor- mas do ANTICORPO A e um veículo. Setenta e cinco camundongos PS2APP de 5 a 6 meses de idade foram divididos em cinco grupos (A-E)1 consistindo em 15 camundongos cada um. Começando no dia 0, cada ca- mundongo recebeu 0,1 mL do veículo (0 mg/kg), ou preparações de ANTI- CORPO A (20 mg/kg) pela injeção do bolus i.v. através da veia da cauda. Os grupos A, B, C, D eE de camundongos PS2APP receberam o veículo (histi- dina tamponada com salina), a COMPOSIÇÃO DO ANTICORPO A compre- endendo o ANTICORPO A monoglicosilado e ANTICORPO A diglicosilado e é desprovida do ANTICORPO A não glicosilado como definido acima, ANTI- CORPO A diglicosilado, o ANTICORPO A monoglicosilado e de ANTICOR- PO A não glicosilado, respectivamente.

A imunotolerânica contra os anticorpos anti-Αβ humanos admi- nistrado foi induzida pela injeção do anticorpo anti-CD4 (clone hibridoma GK 1.5 tal como comercialmente disponível pela ATCC). A monitoração de anti- corpos anti-fármaco indicou que os animais tratados com anticorpo desen- volvem somente uma resposta imune moderada após mais de 16 semanas de tratamento e que os anticorpos detectáveis são de baixa afinidade ou são produzidos somente em baixas quantidades (dados não mostrados). Após um tratamento de 5 meses os camundongos foram sacrificados. Os cérebros não fixados foram seccionados sagitalmente, incluindo o tálamo, formação do hipocampo e as áreas corticais. De cada hemisfério do cérebro foram preparadas 50 secções tal como segue: Começando no nível lateral ~1,92, 5 séries consecutivas de seções de 5x 10 μm e de 5x 20 μm foram obtidas. Não havia nenhuma abertura entre secções consecutivas, tendo por resulta- do um uso total de tecido de 750 μm. A série da secções termina conse- qüentemente aproximadamente no nível lateral 1,20 (Paxinos e Franklin, 2003). Para a análise morfométrica quantitativa cada 10a seção foi usada.

As seções foram coradas para depósitos amilóide com a isofor- ma diglicosilada de ANTICORPO A em uma concentração de 5 µg/ml. As colorações contra a Αβ usando um anticorpo monoclonal de camundongo (BAP-2) conjugado ao fluoróforo Alexa-488 a 5 µg/ml mostrou resultados comparáveis embora com pigmentação significativa intracelulaular e defundo dos neurônios, o que interferiu com a rotina de processamento da imagem descrita abaixo. Para a detecção um anticorpo de cabra purificado com afini- dade (GAH) anti-lgG humano (H+L) conjugado a Cy3 (# 109-165-003, lote 49353, Jackson Immuno Research) e foi aplicada uma concentração de 15 µg/ml por 1 hora na temperatura ambiente. Após a lavagem com 2 χ 500 μΙ PBS/lâmina, as lâminas foram encaixadas com meio da montagem do flu- rescência (S3023, Dako).

As imagens foram adquiridas usando um varredor 4100A micro- array pessoal de GenePix (Axon Instruments, Now Molecular Devices, CA, EUA). A carga da placa β-amilóide e o número de placas foram medidos u- sando dois parâmetros, ou seja, a porcentagem da área coberta pelas pla- cas β-amilóide e a quantidade de placas β-amilóide usando um método mor- fométrico equitativo por meio da análise de imagem auxiliada por computa- dor. A quantificação da carga e do número da placa foi feita com software MCID M7 Elite (Imaging Research Inc., St. Catherines/Ontario, Canada). As imagens em que foram feitas as varreduras foram realçadas por um filtro do extcamundongor de detalhes seguido por um filtro de intensidade de alvo. A imagem resultante foi então trasnformada em arquivo binário, ajustando o limiar de acordo com a intensidade da pigmentação. Os artefatos, os vasos sangüíneos e os efeitos de fronteira foram identificados na imagem original de referência e removidos depois da imagem digitalizada. As regiões de inte- resse foram esboçadas sobre a imagem de referência. Para a quantificação final, a área destas regiões e a área ocupada por placas assim como o nú- mero da placa foram medidas então na imagem digitalizada. Os pixels úni- cos foram ignorados. Os cálculos foram feitos com software comum de plani- lhas (Microsoft Excel, Redmond/WA, U.S.A.). O tamanho das placas foi se- parado em 11 grupos que variam de < 100 a > 1000 pm2 A avaliação esta- tística foi feita usando um teste t heterocedástico de dupla cauda.

Para a comparação e a avaliação estatística, a linhagem de ba- se da amiloidose (patologia da placa β-amilóide) foi determinada no início do estudo com um grupo (15 animais) de camundongos não tratados com idade de 6 meses. Os resultados são PS2APP descritos em figuras 15 a 18 com níveis de significância (*: p<0,05; **: p<0,01; ***: p<0,001).

A redução da placa amilóide foi mais pronunciada na região do tálamo (figura 15). A redução média da superfície da placa β-amilóide total foi determinada para os grupos tratados com anticorpo: 64% para COMPO- SIÇÃO DO ANTICORPO A, 70% para ANTICORPO A diglicosilado, .81% para ANTICORPO A monoglicosilado e 44% para o ANTICORPO A não gli- cosilado. A redução média do número de placas β-amilóide total foi desco- berto como sendo 70% para a COMPOSIÇÃO ANTICORPO A, 78% para ANTICORPO A diglicosilado, 82% para ANTICORPO A monoglicosilado e 36% para o ANTICORPO A não glicosilado. Notar que a significância para o ANTICORPO A não glicosilado foi baixa e as variações observadas foram consideráveis.

A redução da placa amilóide na região neocortical junto com o corpo caloso é descrita na figura 16. A redução média da superfície total da placa β-amilóide foi determinada para os grupos tratados anticorpo: 19% para COMPOSIÇÃO DO ANTICORPO A, 27% para ANTICORPO A diglico- silado, 30% para ANTICORPO A monoglicosilado e 10% para o ANTICOR- PO A não glicosilado. A redução média do número total de placas β-amilóide foi descoberto como sendo de 40% para a COMPOSIÇÃO ANTICORPO A, 46% para ANTICORPO A diglicosilado, 42% para ANTICORPO A monogli- cosilado e 11 % para o ANTICORPO A não glicosilado.

A redução da placa β-amilóide na região do hipocampo inteira é descrita em figura 17. A redução média do número total de placas β-amilóide foi determinada para os grupos tratados com anticorpo: 12% para COMPO- SIÇÃO DO ANTICORPO A, 24% para ANTICORPO A diglicosilado, 24% para ANTICORPO A monoglicosilado e 6% para o ANTICORPO A não glico- silado. A redução média no número total de placas β-amilóide foi descoberto como sendo 36% para a COMPOSIÇÃO de ANTICORPO A, 46% para AN- TICORPO A diglicosilado, 37% para ANTICORPO A monoglicosilado e 3% para o ANTICORPO A não glicosilado.

A redução da placa amilóide no subículo, uma região de susceti- bilidade elevada para a amiloidose é mostrada em figura 18. A redução mé- dia da superfície total da placa β-amilóide foi determinada para os grupos tratados anticorpo: 2% para COMPOSIÇÃO DO ANTICORPO A, 12% para ANTICORPO A diglicosilado, 5% para ANTICORPO A monoglicosilado e 1% para o ANTICORPO A não glicosilado. A redução média do número total de placas β-amilóide foi descoberto como sendo 22% para a COMPOSIÇÃO de ANTICORPO A, 36% para ANTICORPO A diglicosilado, 13% para ANTI- CORPO A monoglicosilado e 1% para a COMPOSIÇÃO do ANTICORPO A não glicosilado. A COMPOSIÇÃO DO ANTICORPO A e as isoformas princi- pais de glicosilação N (ANTICORPO A diglicosilado e ANTICORPO A mono- glicosilado) mostraram uma eficácia comparável à diminuição da caraga da placa β-amilóide e o número de placas. A redução da carga da placa foi mais pronunciada e estatisticamente significativa nas regiões com baixa ou moderada amiloidose.

A redução total do número de placas β-amilóide foi encontrada como sendo estatisticamente significativo após o tratamento com a COM- POSIÇÃO DO ANTICORPO A e ambas as isoformas compreendendo a Asn52 glicosilada do ANTICORPO A em todas as regiões medidas do cére- bro. Em contraste com isso, somente um efeito menor no número de placas β-amilóide foi descoberto no tálamo e em nenhum efeito significativo no e número da placas β-amilóide nas outras regiões investigadas do cérebro foi descoberto após o tratamento com a isoforma não glicosilada de Anticorpo A, que é excluída da COMPOSIÇÃO DO ANTICORPO A após a purificação tal como detalhado na invenção. Investigou-se também a potência de elimi- nação da placa com relação ao tamanho da placa. Geralmente, a eficácia dos anticorpos anti-Αβ humano testado foi encontrada mais pronunciada para a liberação de pequenas placas β-amilóide. Isto foi observado em todas as regiões do cérebro (figuras 15 C, 16 C, 17 C e 18 C). Em contraste, havia somente uma tendência mínima ou não significativa observada para a iso- forma não glicosilada de ANTICORPO A. A análise comparativa de ANTI- CORPO A e das isoformas principais de glicosilação da Asn52 demonstra uma capacidade comparável de abaixar a carga da placa, quando a isoforma não glicosilada não tiver nenhum efeito significativo em abaixar da placa. Exemplo 16:

Farmacocinética da ligação in vivo da COMPOSIÇÃO DO ANTI- CORPO A com as placas β-amilóide.

Duas freqüências de dosagem foram comparadas a fim investi- gar a cinética de ligação da COMPOSIÇÃO DO ANTICORPO A que com- preende o ANTICORPO A monoglicosilado e o ANTICORPO A diglicosilado e são desprovidos do ANTICORPO A não glicosilado tal como definido aci- ma.

Conseqüentemente, os camundongos machos transgênicos PS2APP foram injetados i.v. com a COMPOSIÇÃO do ANTICORPO A atra- vés da veia da cauda 4 vezes a cada duas semanas em intervalos em 0,05, 0,1 e 0,3 mg/kg ou em 3 vezes no intervalo mensal com o 0,075 mg/kg, 0,15 mg/kg e 0,45 mg/kg. Para a comparação, 0,1 mg/kg foi administrado uma vez e duas vezes a cada duas semanas em intervalos e em 0,15 mg/kg duas vezes em intervalo mensal. Seguindo a administração todos os camundon- gos foram sacrificados duas semanas após a última dosagem. O tecido não fixado do cérebro do PS2APP foi preparado para seccionar sagitalmente entre a lateral ~1,92 e 1,2 mM de acordo com Paxinos e Franklin, incluindo o tálamo, formação do hipocampo e as áreas corticais. Os cérebros foram se- cionados em 40 pm usando um criostato.

Uma aproximação de imunofluorescência ex vivo com imuno- pigmentação foi usada detectar a COMPOSIÇÃO DE ANTICORPO A ligada a anticorpos. Conseqüentemente, os cérebros foram secionados e incuba- dos com o anticorpo para detecção, um anticorpo de cabra com afinidade e purificado (GAH)lgG(H+L) anti-humana conjugado com Cy3 (# 109-165-003, lote 49353, Jackson Immuno Research) em uma concentração de 15 pg/ml por 1 hora na temperatura ambiente. A contrapigmentação para as placas β- amilóide foram feitas pela incubação com BAP-2, um anticorpo monoclonal do camundongo contra a Αβ conjugada ao fluoróforo Alexa488 em uma con- centração de 0,5?g/ml por 1 hora na temperatura ambiente.

As imagens foram gravadas no córtex occipital perto do cerebelo usando um microscópio Leica TCS SP2 AOBS confocal de varredura a laser tal como descrito acima. Processamento de imagem co mauxílio de compu- tador foi executado usando o software de IMARIS (Bitplane, Suiça). As ima- gens das placas foram selecionadas primeiramente usando a função de co- leta do software para os doses mais baixos exceto as duas doses mais ele- vadas de 0,3 e 0,45 mg/kg que requereram um ganho diferente de ajuste para a gravação linear do sinal. A função SURPASS foi usada para selecio- nar os voxels positivos após a fronteira (T) como a leitura para GAH-Cy3 ligado no local das placas β-amilóide. Os ajustes de fronteira foram 19 e 12 para grupos de uma dose mais baixo e mais elevado, respectivamente. Co- mo um controle para a placa β-amilóide a especificidade, as imagens dos GAH-Cy3 corados foram comparadas depois de dupla marcação com as imagens das placas coradas por conjugado monoclonal BAP2 de camun- dongo a Alexa488 e gravado em uma canaleta diferente.

A avaliação estatística para a descrição quantitativa de todas as imagens foi feita com o módulo do software IMARIS MeasurementPro. Os valores médios de intensidade da fluorescência do voxel (MVI) foram deter- minados a partir das placas de β-amilóide selecionadas nos grupos de bai- xas dosagens ou no sinal total das imagens nos grupos de dose elevada. A linha de base MVI (B) é devida ao ruído, ao espalhamento do sinal do tecido e à autoflurescência instrumental da lipofuscina. Para a correção do fundo, B foi determinado medindo a intensidade média do sinal em áreas separadas das placas β-amilóide e subtraído subseqüentemente do MVI de todas as imagens medidas (MVI -B = S). Os valores da intensidade de sinal (S) que se assemelham às intensidades calculadas a média nas placas obtidas a partir de 3 a 4 imagens de cada seção de um cérebro por camundongo e por grupo de dosagem. Para comparabilidade, as intensidades do sinal foram normalizadas a uma amostra de referência obtida de um estudo anterior.

Como referência forma usadas as seções do cérebro do camundongo de PS2APP após uma única dose de administração de 0,25 mg/kg. O ponto final da medida foi uma semana após de dosagem.

Todos os valores medidos da intensidade foram normalizados à intensidade média sobre as placas β-amilóide obtidos após uma única admi- nistração da dose da COMPOSIÇÃO DO ANTICORPO A a 0,25 mg/kg que foi medido uma semana após de dosagem (vide a tabela seguinte). Os valo- res normalizados para a intensidade relativa média do flurescência das pla- cas β-amilóide imunopositivas foram obtidos por CLSM após imunopigmen- tação e medindo as intensidades do sinal calculadas pela média de 3 ani- mais por o grupo de dosagem. As placas sem COMPOSIÇÃO DO ANTI- CORPO A detectável derivada do ANTICORPO A foram observadas somen- te nos grupos de dosagem mais baixa, muito provavelmente devido à ocu- pação limitada ou parcial da COMPOSIÇÃO DO ANTICORPO A derivada do ANTICORPO A na superfície da placa, que pôde ter sido perdida durante o processo de seccionamento. Conseqüentemente, somente as placas imuno- positivas foram incluídas para a análise comparativa.

Intensidade relativa média da flurescência por grupo de dosa- gem após a administração de múltiplas i.v. (em bolus) da COMPOSIÇÃO DO ANTICORPO A em camundongos transgênicos PS2APP é mostrada na se- guinte tabela: <table>table see original document page 115</column></row><table>

1: Os valores experimentais representam os valores da intensidade normali- zados ao valor obtido de uma única dose de 0,25 mg/kg após 1 semana.

A figura 19 mostra a ligação da COMPOSIÇÃO DE ANTICORPO

A em relação ao número de doses sucessivas a cada duas semanas de 0,1 mg/kg. Depois de duas aplicações a intensidade média pareceu aumentada, embora a extensão de imunopigmentação variasse consideravelmente e conseqüentemente não alcançasse uma significância. Após 4 injeções, as placas β-amilóide são imunopigmentadas mais homogeneamente, mas a intensidade média é aumentada somente ligeiramente. No total, os dados para cada duas semanas de aplicação indicam claramente uma tendência da ligação aumentado da placa que está correlacionada com o número das aplicações.

A figura 20 mostra a ligação da COMPOSIÇÃO DO ANTICOR- PO A em relação ao número de doses mensais sucessivas de 0,15 mg/kg. De modo interessante, os níveis comparáveis são obtidos após 2 e 3 aplica- ções. Isto não era necessariamente esperado e deve indicar a iniciação dos efeitos antecipados que contribuem para as diferenças dependentes do tem- po no mecanismo de eliminação, como a ativação atrasada da célula do mi- croglia.

A eficácia da ligação da COMPOSIÇÃO DO ANTICORPO A com relação à dose administrada é mostrada nas Figuras 21 e 22. A cada duas semanas as doses de 0,05, 0,1 e 0,3 mg/kg (figura 21) e as doses mensais de 0,075, 0,15 e 0,45 mg/kg (figura 22) mostraram claramente um compor- tamento em relação à dose. É também evidente que a resposta não é linear e os fatores adicionais como uma ativação temporariamente atrasada das células da microglia pudem contribuir para a não linearidade observada. As- sim pode-se concluir que as placas Αβ de camundongo que se ligam à COMPOSIÇÃO DO ANTICORPO A são relacionadas com a dosagem, com indicações de que as múltiplas dosagens são acumulativas.

Exemplo 17:

Análise da fagocitose celular dependente do antígeno.

A fim determinar o efeito fagocítico mediada pela COMPOSIÇÃO DE ANTICORPO A, placas Αβ genuínas das fatias do cérebro com AD pre- incubadas com concentrações diferentes da COMPOSIÇÃO DO ANTICOR- PO A compreendendo o ANTICORPO A monoglicosilado e ANTICORPO A diglicosilado e desprovidas do ANTICORPO A não glicosilado como definido acima e expostas aos monócitos primários humanos vivos.

As secções do tecido do cérebro humano com AD não fixado da região occipital do córtex foram preparadas de um caso severo de AD (está- gio IV de Braak). Antes de adicionar as seções vivas das células foram rei- dratadas com o PBS por 5 minutos. Os anticorpos de uma COMPOSIÇÃO DE ANTICORPO A foram aplicados por incubação em concentrações defini- das em PBS por 1 hora. Após a lavagem com PBS as células vivas foram adicionadas. Os monócitos primários humanos pré-estimulados foram usa- dos a 0,8 e 1,5 χ 106/ ml no meio RPMI 1640 (Gibco # 61870-044) com solu- ção antibiótica a 1% de uma solução conservada em estoque que contém 10.000 U/ml de penicilina e 10.000 mg/ml de estreptomicina (Gibco # 15140- 122) e incubadas a 37°C com 5% de dióxido de carbono por 2 a 4 dias. Os métodos para a preparação de monócitos primários humanos pré- estimulados são bem-conhecidos na técnica, por exemplo, pelo uso de fato- res estimulantes, como o macrófago fator estimulador de colônia (M-FCE).

Após a incubação, o meio de cultura delicadamente foi removido e as seções foram preservadas por fixação química com formaldeído a 2% em PBS por 10 minutos. A coloração da carga da placa Αβ residual foi feita pela incubação com BAP-2, um anticorpo monoclonal do camundongo con- tra o conjugado Αβ ao fluoróforo Alexa488 (Sondas moleculares: A-20181, kit de marcador monoclonal do anticorpo) em uma concentração de 10 mg/ml por 1 hora na temperatura ambiente.

A quantificação da remoção da placa foi determinada medindo a imunofluorescência das residual placas Αβ coradas. As imagens foram gra- vadas em um microscópio confocal de varredura a laser Leica TCS SP2 AOBS. Uma camada ótica foi gravada em um comprimento de onda de exci- tação a 488 nm em um ajuste de buraco de agulha de 4 Airy usando uma correção objetiva de HCX PL FL 20x/0,40 exceto em uma experiência, onde uma HCPL Fluotar 10x/0.30 objetiva em um ajuste do buraco da agulha de 3 foi usado preferivelmente. Os ajustes do equipamento foram mantidos cons- tantes para que todas as imagens permitam uma comparação quantitativa relacionai. Especificamente, a potência, o ganho e o offset do laser foram ajustados para permitir a intensidade do sinal monitorada dentro da escala dinâmica. Para cada COMPOSIÇÃO DE ANTICORPO A as concetrações na região da matéria cinzenta foram gravadas em posições comparáveis das seções consecutivas a fim minimizar as flutuações que venham possivel- mente das diferenças anatômicas na carga da placa. A ligação competitiva potencial da COMPOSIÇÃO DO ANTICORPO A e da detecção do anticorpo BAP-2, foi medida na ausência das células em todas as concentrações da COMPOSIÇÃO DO ANTICORPO A. Um anticorpo não relacionado humano IgGI (Serotec, PHP010) foi usado como um controle adicional. A análise de imagens foi realizada usando o software IMARIS (Bitplane, Suíça). A iso- superfície dos pixels BAP-2 positivos que representam objetos de ligação da BAP-2 s às placas foi criado pela intensidade da limitação. A área da super- fície e os valores totais de intensidade da fluorescência foram calculados usando do "a função de superfície iso" do módulo do software SurpassPro. Os dados foram expressos como a área pigmentada calculada pelos valores médios pigmnetados totais da intensidade e obtidos de 5 regiões da matéria cinzenta de uma seção do cérebro. A linha de base do sinal é composta pelo ruído do equipamento e peloo sinal de espalhgamento do tecido que foi des- coberto como sendo insignificante e conseqüentemente não subtraído do sinal total da intensidade.

O efeito quantitativo da COMPOSIÇÃO DO ANTICORPO A foi visualizado por uma diminuição na pigmentação da placa Αβ o que indica a fagocitose aumentada das Αβ placas nas secções do cérebro humano com AD tal como mostrado em figura 23. A imunoistoquímica revelou uma redu- ção pigmentável as placa Αβ claramente visível após uma pre-incubação com 100 ng/ml da COMPOSIÇÃO DO ANTICORPO A já após 40 horas. O efeito é muito pronunciado e nas concentrações da COMPOSIÇÃO DO AN- TICORPO A de 1 e 5 mg/ml. As placas Αβ são substancialmente e cada vez mais liberadas pela fagocitose celular com somente pouco das grandes pla- cas Αβ restantes em 5 mg/ml. Uma medida quantitativa baseada nos sinais do imunorreatividade expressados como a área e a intensidade da mesma experiência é mostrada em figura 24.

Alternativamente, o efeito fagocítico mediado pela COMPOSI- ÇÃO DE ANTICORPO A foi determinado usando conjugados Αβ com grânu- los fluorescentes de poliestireno. Conseqüentemente, grânulos fluorescentes (3 mM, carboxy YG de Fluoresbrite, Polisciences Inc.) foram acoplados com Αβ. Rapidamente, os grânulos foram lavados 2x pela suspensão e pela cen- trifugação no tampão de acoplamento (50 mM tampão do MES, pH 5,2, 1% DMSO). O pélete (aprox. 10 ul) foi suspensa no tampão do acoplamento de 200 ul e ativada por uma adição de 20 ul de uma solução de EDC a 20% (etil-diaminopropil-carbodiimida, Pierce) no tampão de acoplamento. Adição imediata de 20 pg Αβ (1-40) ou Αβ (1-42) (em 0,1% de hidróxido de amonio, Bachem) inicia a reação de acoplamento. Após uma incubação da noite os grânulos foram lavados com 3x 0,5 ml 10mM Tris.HCl pH 8.0 e do 3x 0,5ml do tampão de armazenamento (10 mM Tris.HCI pH 8.0, 0,05% BSA, 0,05% NaN3). A suspensão de 1% foi armazenada a 4°C até o uso. Enquanto os grânulos do carboxi NYO de Fluoresbrite foram o controle do negativo (flu- rescência vermelha) foram acoplados com todos os D-aminoácido Αβ (1-40) (em 0,1% hidróxido de amônio, Bachem).

Os monócitos/macrófagos da murina (linha P388D1 da célula) foram crescidos em kits transparentes C24 de cultura de tecido ou em placa de micros pretas C96 a aprox. Uma confluência de 50%. O meio de cultura foi IMEM com 5% FBS, glutamina e antibióticos. O bloqueio dos receptors não-específicos dos iniciadores em 10 ml de fucoidan (Fluka, 10 mg/ml em água) foi adicionada a 200 ml de volume da cultura e incubadas por 2 horas. A COMPOSIÇÃO DO ANTICORPO A foi adicionada em diluições em série e pré-incubadas por 30 minutos. A a suspensão do grânulo Αβ fluorescente (20 μΙ) foi adicionada e incubadas por 3 horas para permitir a fagocitose. As células aderentes foram lavadas 1x vigorosamente com o EDTA frio ao gelo e 2x com PBS a fim remover os aglutinatos aderidos na superfície da célula. Os grânulos residuais foram monitorados pela inspeção visual em um Zeiss Axiovert 405 ou pela quantificação usando um fluorímetro de microplate (Fluo- roscan, Labsystems) com ajustes do filtro de 444 nm (Exc) e de 485 nm (Em).

O efeito quantitativo da COMPOSIÇÃO DO ANTICORPO A na fagocitose do Αβ sintético dos agregados acoplados aos fluorobeads fluo- rescentes por células de P388D1 são mostrados em figura 25. A determina- ção quantitativa da dose de resposta da COMPOSIÇÃO DO ANTICORPO A é mostrada na figura 26. Duas experiências independentes revelaram uma escala de 30 a 200 ng/ml para EC5O e 10 a 60 ng/ml para MEC. O variabili- dade observada é causada provavelmente por diferenças de estequiometria na incubação, isto é, relação dos grânulos para as células. O declínio obser- vado da fagocitose do grânulo acima de uma concentração 200 ng/ml é de- vido à interação monovalente limitada do anticorpo com antígeno. Assim po- de-se concluir que a COMPOSIÇÃO DO ANTICORPO A induz eficientemen- te a fagocitose das placas Αβ das secções do tecido do cérebro com AD em um comportamento dependente da dose. LISTAGEM DE SEQÜÊNCIA <110> F. Hoffmann-La Roche AG

<120> Glicação de Anticorpo na Região Variável.

<130> K1314 PCT S3

<150> EP 05 02 7090.9

<151> 2005-12-12

<160> 32

<170> PatentIn versão 3.3 <210> 1 <211> 378 <212> DNA

<213> seqüência artificial <22 0>

<223> VH-região do ANTICORPO A <400> 1

caggtggaat tggtggaaag cggcggcggc ctggtgcaac cgggcggcag cctgcgtctg agctgcgcgg cctccggatt tacctttagc agctatgcga tgagctgggt gcgccaagcc cctgggaagg gtctcgagtg ggtgagcgct attaatgctt ctggtactcg tacttattat gctgattctg ttaagggtcg ttttaccatt tcacgtgata attcgaaaaa caccctgtat ctgcaaatga acagcctgcg tgcggaagat acggccgtgt attattgcgc gcgtggtaag ggtaatactc ataagcctta tggttatgtt cgttattttg atgtttgggg ccaaggcacc ctggtgacgg ttagctca <210> 2 <211> 126 <212> PRT

<213> seqüência artificial <220>

<223> VH-região do ANTICORPO A <400> 2

Gln Val Glu Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30

Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val

35 40 45

Ser Ala Ile Asn Ala Ser Gly Thr Arg Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val

50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Gly Lys Gly Asn Thr His Lys Pro Tyr Gly Tyr Val Arg Tyr

100 105 110

Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 125

<210> 3 <211> 42 <212> PRT

<213> seqüência artificial <22 0>

<223> A-beta <400> 3

Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr Glu Val His His Gln Lys 1 5 10 15

Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser Asn Lys Gly Ala Ile Ile

20 25 30

Gly Leu Met Val Gly Gly Val Val Ile Ala 35 40

4

52 PRT

seqüência artificial

Α-beta compreendendo a seqüência do peptídio

<210> <211> <212> <213> <220>. <223> 121

<400> 4

Ile Ser Glu Val Lys Met Asp Ala Glu Phe Arg His Asp Ser Gly Tyr

1

5

10

15

Glu Val His His Gln Lys Leu Val Phe Phe Ala Glu Asp Val Gly Ser

20

25

30

Asn Lys Gly Ala Ile Ile Gly Leu Met Val Gly Gly Val Val Ile Ala

35

40

45

Thr Val Ile Val

50

<210> 5

<211> 1391 <212> DNA

<213> seqüência artificial <220>

<223> cadeia pesada com região Fc do ANTICORPO A <400> 5

caggtggaat tggtggaaag cggcggcggc ctggtgcaac cgggcggcag cctgcgtctg agctgcgcgg cctccggatt tacctttagc agctatgcga tgagctgggt gcgccaagcc cctgggaagg gtctcgagtg ggtgagcgct attaatgctt ctggtactcg tacttattat gctgattctg ttaagggtcg ttttaccatt tcacgtgata attcgaaaaa caccctgtat

ctgcaaatga acagcctgcg tgcggaagat acggccgtgt attattgcgc gcgtggtaag ggtaatactc ataagcctta tggttatgtt cgttattttg atgtttgggg ccaaggcacc

ctggtgacgg ttagctcagc ctccaccaag ggtccatcgg tcttccccct ggcaccctcc

tccaagagca cctctggggg cacagcggcc ctgggctgcc tggtcaagga ctacttcccc

gaaccggtga cggtgtcgtg gaactcaggc gccctgacca gcggcgtgca caccttcccg

gctgtcctac agtcctcagg actctactcc ctcagcagcg tggtgaccgt gccctccagc

agcttgggca cccagaccta catctgcaac gtgaatcaca agcccagcaa caccaaggtg

gacaagaaag ttgagcccag atatcgtgcg atatcgtgca atcttgtgac aaaactcaca

catgcccacc gtgcccagca cctgaactcc tggggggacc gtcagtcttc ctcttccccc

caaaacccaa ggacaccctc atgatctccc ggacccctga ggtcacatgc gtggtggtgg

acgtgagcca cgaagaccct gaggtcaagt tcaactggta cgtggacggc gtggaggtgc

ataatgccaa gacaaagccg cgggaggagc agtacaacag cacgtaccgg gtggtcagcg

60 120 180 240 300 360 420 480 540 600 660 720 780 840 900 960 tcctcaccgt cctgcaccag gactggctga atggcaagga gtacaagtgc aaggtctcca 1020 acaaagccct cccagccccc atcgagaaaa ccatctccaa agccaaaggg cagccccgag 1080 aaccacaggt gtacacçctg cccccatccc gggatgagct gaccaagaac caggtcagcc 1140 tgacctgcct ggtcaaaggc ttctatccca gcgacatcgc cgtggagtgg gagagcaatg 1200 ggcagccgga gaacaactac aagaccacgc ctcccgtgct ggactccgac ggctccttct 1260 tcctctacag caagctcacc gtggacaaga gcaggtggca gcaggggaac gtcttctcat 1320 gctccgtgat gcatgaggct ctgcacaacc actacacgca gaagagcctc tccctgtctc 1380 cgggtaaatg a 1391

<210> 6

<211> 456

<212> PRT

<213> seqüência artificial

<220>

<223> cadeia pesada com região Fc do ANTICORPO A

<400> 6

Gln Val Glu Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30

Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45

Ser Ala Ile Asn Ala Ser Gly Thr Arg Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60

Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80

Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95

Ala Arg Gly Lys Gly Asn Thr His Lys Pro Tyr Gly Tyr Val Arg Tyr 100 105 110

Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser 115 120 125

Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr 130 135 140

Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro 145 150 155 160

Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val

165 170 175

His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser

180 185 190

Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile

195 200 205

Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val

210 215 220

Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala 225 230 235 240

Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro

245 250 255

Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val

260 265 270

Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val

275 280 285

Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln

290 295 300

Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln 305 310 315 320

Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala

325 330 335

Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro

340 345 350

Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr

355 360 365

Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser 370 375 380

Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr 385 390 395 400

Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr 405 410 415

Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe

420 425 430

Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys 435 440 445

Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 450 455

<210> 7 <211> 648 <212> DNA <213> seqüência artificial <220>

<223> cadeia leve do ANTICORPO A <400> 7

gatatcgtgc tgacccagag cccggcgacc ctgagcctgt ctccgggcga acgtgcgacc 60 ctgagctgca gagcgagcca gagcgtgagc agcagctatc tggcgtggta ccagcagaaa 120 ccaggtcaag caccgcgtct attaatttat ggcgcgagca gccgtgcaac tggggtcccg 180 gcgcgtttta gcggctctgg atccggcacg gattttaccc tgaccattag cagcctggaa 240 cctgaagact ttgcgactta ttattgcctt cagatttata atatgcctat tacctttggc 300 cagggtacga aagttgaaat taaacgtacg gtggctgcac catctgtctt catcttcccg 360 ccatctgatg agcagttgaa atctggaact gcctctgttg tgtgcctgct gaataacttc 420 tatcccagag aggccaaagt acagtggaag gtggataacg ccctccaatc gggtaactcc 480 caggagagtg tcacagagca ggacagcaag gacagcacct acagcctcag cagcaccctg 540 acgctgagca aagcagacta cgagaaacac aaagtctacg cctgcgaagt cacccatcag 600 ggcctgagct cgcccgtcac aaagagcttc aacaggggag agtgttag 648

<210> 8 <211> 215 <212> PRT <213> seqüência artificial <220>

<223> cadeia leve do ANTICORPO A <400> 8

Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 15 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser

20 25 30

Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu

35 40 45

Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu 65 70 75 80

Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Ile Tyr Asn Met Pro

85 90 95

Ile Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala

100 105 110

Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser

115 120 125

Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu

130 135 140

Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser 145 150 155 160

Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu

165 170 175

Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val

180 185 190

Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys

195 200 205

Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 215 <210> 9

<211> 30

<212> DNA

<213> seqüência artificial <220>

<223> cadeia pesada CDRl

<400> 9

ggatttacct ttagcagcta tgcgatgagc

<210> 10

<211> 10

<212> PRT

<213> seqüência artificial <22 0>

<223> cadeia pesada CDRl

<400> 10

Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr Ala Met Ser 1 5 10

<210> 11

<211> 51

<212> DNA

<213> seqüência artificial <220>

<223> cadeia pesada CDR2

<400> 11

gctattaatg cttctggtac tcgtacttat tatgctgatt ctgttaaggg

<210> 12

<211> 17

<212> PRT

<213> seqüência artificial <220>

<223> cadeia pesada CDR2

<400> 12 Ala Ile Asn Ala Ser Gly Thr Arg Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15

Gly

<210> 13 <211> 51

<212> DNA

<213> seqüência artificial <220>

<223> cadeia pesada CDR3 <400> 13

ggtaagggta atactcataa gccttatggt tatgttcgtt attttgatgt t <210> 14 <211> 17 <212> PRT <213> seqüência artificial <220>

<223> cadeia pesada CDR3 <400> 14

Gly Lys Gly Asn Thr His Lys Pro Tyr Gly Tyr Val Arg Tyr Phe Asp

1 5 10 15

Val

<210> 15

<211> 36

<212> DNA

<213> seqüência artificial <220>

<223> cadeia leve CDRl

<400> 15

agagcgagcc agagcgtgag cagcagctat ctggcg

<210> 16 <211> 12 <212> PRT <213> seqüência artificial <220>

<223> cadeia leve CDRl

<400> 16

Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser Tyr Leu Ala 1 5 10

<210> 17

<211> 21

<212> DNA

<213> seqüência artificial <22 0>

<223> cadeia leve CDR2

<400> 17

ggcgcgagca gccgtgcaac t 21

<210> 18

<211> 7 <212> PRT

<213> seqüência artificial <220>

<223> cadeia leve CDR2 <400> 18

Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr 15.

<210> 19

<211> 24

<212> DNA

<213> seqüência artificial <220>

<223> cadeia leve CDR3

<400> 19

cttcagattt ataatatgcc tatt 24

<210> 20 <211> 8

<212> PRT

<213> artificial sequenze

<220>

<223> cadeia leve CDR3

<400> 20

Leu Gln Ile Tyr Asn Met Pro Ile 1 5

<210> 21

<211> 648

<212> DNA

<213> seqüência artificial

<220>

<223> cadeia leve do ANTICORPO A

<400> 21

gatatcgtgc tgacccagag cccggcgacc ctgagcctgt ctccgggcga acgtgcgacc 60 ctgagctgca gagcgagcca gagcgtgagc agcagctatc tggcgtggta ccagcagaaa 120 ccaggtcaag caccgcgtct attaatttat ggcgcgagca gccgtgcaac tggggtcccg 180 gcgcgtttta gcggctctgg atccggcacg gattttaccç tgaccattag cagcctggaa 240 cctgaagact ttgcgactta ttattgcctt cagatttata atatgcctat tacctttggc 300 cagggtacga aagttgaaat taaacgtacg gtggctgcac catctgtctt catcttcccg 360 ccatctgatg agcagttgaa atctggaact gcctctgttg tgtgcctgct gaataacttc 420 tatcccagag aggccaaagt acagtggaag gtggataacg ccctccaatc gggtaactcc 480 caggagagtg tcacagagca ggacagcaag gacagcacct acagcctcag cagcaccctg 540 acgctgagca aagcagacta cgagaaacac aaagtctacg cctgcgaagt cacccatcag 600 ggcctgagct cgcccgtcac aaagagcttc aacaggggag agtgttag 648

<210> 22

<211> 215

<212 > PRT

<213> seqüência artificial

<220>

<223> cadeia leve do ANTICORPO A <400> 22

Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly 1 5 10 15

Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Ser

20 25 30

Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu

35 40 45

Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser

50 55 60

Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu 65 70 75 80

Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Ile Tyr Asn Met Pro

85 90 95

Ile Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala

100 105 110

Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser

115 120 125

Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu

130 135 140

Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser 145 150 155 160

Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu

165 170 175

Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val

180 185 190

Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys

195 200 205

Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 210 215

<210> 23 <211> 3984 <212> DNA <213> seqüência artificial <220>

<223> seqüência alternativa codificando cadeia pesada com região Fc do

ANTICORPO A <400> 23

atggagtttg ggctgagctg ggttttcctc gttgctcttt taagaggtga ttcatggaga 60

aatagagaga ctgagtgtga gtgaacatga gtgagaaaaa ctggatttgt gtggcatttt 120

ctgataacgg tgtccttctg tttgcaggtg tccagtgtca ggtggagctg gtggagtctg 180

ggggaggcct ggtccagcct ggggggtccc tgagactctc ctgtgcagcg tctggattca 240

ccttcagtag ctatgccatg agctgggtcc gccaggctcc aggcaagggg ctcgagtggg 3 00

tgtccgccat aaacgccagc ggtacccgca cctactatgc agactccgtg aagggccgat 360

tcaccatctc cagagacaat tccaagaaca cgctgtatct gcaaatgaac agcctgagag 42 0

ccgaggacac ggctgtgtat tactgtgcga gaggcaaggg gaacacccac aagccctacg 480

gctacgtacg ctactttgac gtgtggggcc aaggaaccct ggtcaccgtc tcctcaggtg 540

agtcctcaca acctctctcc tgcggccgca gcttgaagtc tgaggcagaa tcttgtccag 600

ggtctatcgg actcttgtga gaattagggg ctgacagttg atggtgacaa tttcagggtc 660

agtgactgtc tggtttctct gaggtgagac tggaatatag gtcaccttga agactaaaga 720

ggggtccagg ggcttttctg cacaggcagg gaacagaatg tggaacaatg acttgaatgg 780

ttgattcttg tgtgacacca agaattggca taatgtctga gttgcccaag ggtgatctta 840

gctagactct ggggtttttg tcgggtacag aggaaaaacc cactattgtg attactatgc 900

tatggactac tggggtcaag gaacctcagt caccgtctcc tcaggtaaga atggcctctc 960

caggtcttta tttttaacct ttgttatgga gttttctgag cattgcagac taatcttgga 1020

tatttgccct gagggagccg gctgagagaa gttgggaaat aaatctgtct agggatctca 1080

gagcctttag gacagattat ctccacatct ttgaaaaact aagaatctgt gtgatggtgt 1140

tggtggagtc cctggatgat gggataggga ctttggaggc tcatttgagg gagatgctaa 1200

aacaatccta tggctggagg gatagttggg gctgtagttg gagattttca gtttttagaa 1260

tgaagtatta gctgcaatac ttcaaggacc acctctgtga caaccatttt atacagtatc 1320

caggcatagg gacaaaaagt ggagtggggc actttcttta gatttgtgag gaatgttcca 13 80

cactagattg tttaaaactt catttgttgg aaggagctgt cttagtgatt gagtcaaggg 1440

agaaaggcat ctagcctcgg tctcaaaagg gtagttgctg tctagagagg tctggtggag 1500

cctgcaaaag tccagctttc aaaggaacac agaagtatgt gtatggaata ttagaagatg 1560 ttgcttttac tcttaagttg gttcctagga tgagagggtt ttcaagtact cattttttta ggtcttgttt gtgtagaact gacattactt ctctcatacc ctattcagaa ctgactttta aaatgaattg agcaatgttg agttgagtca gcagctggca ggaagcaggt catgtggcaa taggtaaact tgtagctgtg gtttgaagaa caaaccgaaa gtccaggctg agcaaaacac ttgaggattc agccgaaact ggagaggtcc ttttagcttg agtagttcta gtttccccaa tagaattcga gctcggtaca gctttctggg agggaggggg ctaaggtgag gcaggtggcg ccagacactg gacgctgaac ctcgcggaca cccagctctg tcccacaccg cggtcacatg gcccatcggt cttccccctg gcaccctcct tgggctgcct ggtcaaggac tacttccccg ccctgaccag cggcgtgcac accttcccgg tcagcagcgt ggtgaccgtg ccctccagca tgaatcacaa gcccagcaac accaaggtgg gagggagggt gtctgctgga agccaggctc gcagccccag tccagggcag caaggcaggc ccgccccact catgctcagg gagagggtct caggctaggt gcccctaacc caggccctgc tgccaagagc catatccggg aggaccctgc ctctccactc cctcagctcg gacaccttct tctctctgca gagcccaaat cttgtgacaa gccagcccag gcctcgccct ccagctcaag ccagggacag gccccagccg ggtgctgaca aactcctggg gggaccgtca gtcttcctct tctcccggac ccctgaggtc acatgcgtgg tcaagttcaa ctggtacgtg gacggcgtgg aggagcagta caacagcacg taccgtgtgg

aaaatagtta aatactgtga ctttaaaatg 1620

aatgtccaaa atttttgtca atcaatttga 1680

aaagtttaac cgaggaatgg gagtgaggct 1740

acaataataa attaagttta aaatattttt 1800

agatggccga tcagaaccgg aacacctgca 1860

ggctatttgg ggaagggaaa ataaaaccac 1920

gtggttttga aacactctgt ccagccccac 1980

cacctgggta atttgcattt ctaaaataag 2040

tcttttaact tattgagttc aaccttttaa 2100

acttaagttt atcgacttct aaaatgtatt 2160

gcaggccagg cctgaccttg gctttggggc 2220

ccagcaggtg cacacccaat gcccatgagc 2280

gttaagaacc caggggcctc tgcgcctggg 2340

gcaccacctc tcttgcagcc tccaccaagg 2400

ccaagagcac ctctgggggc acagcggccc 2460

aaccggtgac ggtgtcgtgg aactcaggcg 2520

ctgtcctaca gtcctcagga ctctactccc 2580

gcttgggcac ccagacctac atctgcaacg 2640

acaagaaagt tggtgagagg ccagcacagg 2700

agcgctcctg cctggacgca tcccggctat 2760

cccgtctgcc tcttcacccg gagcctctgc 2820

tctggctttt tcccaggctc tgggcaggca 2880

acacaaaggg gcaggtgctg ggctcagacc 2940

ccçtgaccta agcccacccc aaaggccaaa 3000

ctcctcccag attccagtaa ctcccaatct 3060

aactcacaca tgcccaccgt gcccaggtaa 3120

gcgggacagg tgccctagag tagcctgcat 3180

cgtccacctc catctcttcc tcagcacetg 3240

tccccccaaa acccaaggac accctcatga 3300

tggtggacgt gagccacgaa gaccctgagg 3360

aggtgcataa tgccaagaca aagccgcggg 3420

tcagcgtcct caccgtcctg caccaggact 3480 ggctgaatgg caaggagtac aagtgcaagg tctccaacaa agccctccca agaaaaccat ctccaaagcc aaaggtggga cccgtggggt gcgagggcca ggccggctcg gcccaccctc tgccctgaga gtgaccgctg taccaacctc gggcagcccc gagaaccaca ggtgtacacc ctgcccccat cccgggatga aaccaggtca gcctgacctg cctggtcaaa ggcttctatc ccagcgacat tgggagagca atgggcagcc ggagaacaac tacaagacca cgcctcccgt gacggctcct tcttcctcta cagcaagctc accgtggaca agagcaggtg aacgtcttct catgctccgt gatgcatgag gctctgcaca accactacac ctctccctgt ccccgggcaa atga <210> 24 <211> 3202 <212> DNA

<213> seqüência artificial <22 0>

<223> seqüência alternativa codificando cadeia leve do ANTICORPO A <400> 24

atggacatga gggtcctcgc tcagctcctg gggctcctgc tgctctgttt cccaggtaag 60

gatggagaac actagcagtt tactcagccc agggtgctca gtactgcttt actattcagg 120 gaaattctct tacaacatga ttaattgtgt ggacatttgt ttttatgttt ccaatctcag 180 gcgccagatg tgatatcgtg ttgacgcagt ctccagccac cctgtctttg tctccagggg 240 aaagagccac cctctcctgc cgggccagtc agagtgttag cagcagctac ttagcctggt 300 accagcagaa acctggccag gcgcccaggc tcctcatcta tggcgcatcc agcagggcca 360 ctggcgtgcc agccaggttc agtggcagtg ggtctgggac agacttcact ctcaccatca 420 gcagcctgga gcctgaagat ttcgcgacct attactgtct gcagatttac aacatgccta 480 tcacgttcgg ccaagggacc aaggtggaaa tcaaacgtga gtagaattta aactttgcgg 540 ccgcctagac gtttaagtgg gagatttgga ggggatgagg aatgaaggaa cttcaggata 600 gaaaagggct gaagtcaagt tcagctccta aaatggatgt gggagcaaac tttgaagata 660 aactgaatga cccagaggat gaaacagcgc agatcaaaga ggggcctgga gctctgagaa 720 gagaaggaga ctcatccgtg ttgagtttcc acaagtactg tcttgagttt tgcaataaaa 780 gtgggatagc agagttgagt gagccgtagg ctgagttctc tcttttgtct cctaagtttt 840

gcccccatcg 3540

catggacaga 3600

tgtccctaca 3660

gctgaccaag 3720

cgccgtggag 3780

gctggactcc 3840

gcagcagggg 3 900

gcagaagagc 3 960 3984

tatgactaca aaaatcagta gtatgtcctg aaataatcat taagctgttt gaaagtatga

900 ctgcttgcca tgtagatacc atgtcttgct gaatgatcag aagaggtgtg actcttattc 960

taaaatttgt cacaaaatgt caaaatgaga gactctgtag gaacgagtcc ttgacagaca 1020

gctcaagggg tttttttcct ttgtctcatt tctacatgaa agtaaatttg aaatgatctt 1080

ttttattata agagtagaaa tacagttggg tttgaactat atgttttaat ggccacggtt 1140

ttgtaagaca tttggtcctt tgttttccca gttattactc gattgtaatt ttatatcgcc 1200

agcaatggac tgaaacggtc cgcaacctct tctttacaac tgggtgacct cgcggctgtg 1260

ccagccattt ggcgttcacc ctgccgctaa gggccatgtg aacccccgcg gtagcatccc 1320

ttgctccgcg tggaccactt tcctgaggca cagtgatagg aacagagcca ctaatctgaa 1380

gagaacagag atgtgacaga ctacactaat gtgagaaaaa caaggaaagg gtgacttatt 1440

ggagatttca gaaataaaat gcatttatta ttatattccc ttattttaat tttctattag 1500

ggaattagaa agggcataaa ctgctttatc cagtgttata ttaaaagctt aatgtatata 1560

atcttttaga ggtaaaatct acagccagca aaagtcatgg taaatattct ttgactgaac 1620

tctcactaaa ctcctctaaa ttatatgtca tattaactgg ttaaattaat ataaatttgt 1680

gacatgacct taactggtta ggtaggatat ttttcttcat gcaaaaatat gactaataat 1740

aatttagcac aaaaatattt cccaatactt taattctgtg atagaaaaat gtttaactca 1800

gctactataa tcccataatt ttgaaaacta tttattagct tttgtgtttg acccttccct 1860

agccaaaggc aactatttaa ggacccttta aaactcttga aactacttta gagtcattaa 1920

gttatttaac cacttttaat tactttaaaa tgatgtcaat tcccttttaa ctattaattt 1980

attttaaggg gggaaaggct gctcataatt ctattgtttt tcttggtaaa gaactctcag 2040

ttttcgtttt tactacctct gtcacccaag agttggcatc tcaacagagg ggactttccg 2100

agaggccatc tggcagttgc ttaagatcag aagtgaagtc tgccagttcc tcccaggcag 2160

gtggcccaga ttacagttga cctgttctgg tgtggctaaa aattgtccca tgtggttaca 2220

aaccattaga ccagggtctg atgaattgct cagaatattt ctggacaccc aaatacagac 2280

cctggcttaa ggccctgtcc atacagtagg tttagcttgg ctacaccaaa ggaagccata 2340

cagaggctaa tatcagagta ttcttggaag agacaggaga aaatgaaagc cagtttctgc 2400

tcttacctta tgtgcttgtg ttcagactcc caaacatcag gagtgtcaga taaactggtc 2460

tgaatctctg tctgaagcat ggaactgaaa agaatgtagt ttcagggaag aaaggcaata 2520

gaaggaagcc tgagaatacg gatcaattct aaactctgag ggggtcggat gacgtggcca 2580

ttctttgcct aaagcattga gtttactgca aggtcagaaa agcatgcaaa gccctcagaa 2640

tggctgcaaa gagctccaac aaaacaattt agaactttat taaggaatag ggggaagcta 2700

ggaagaaact caaaacatca agattttaaa tacgcttctt ggtctccttg ctataattat 2760

ctgggataag catgctgttt tctgtctgtc cctaacatgc cctgtgatta tccgcaaaca 2820 acacacccaa gggcagaact ttgttactta aacaccatcc tgtttgcttc tttcctcagg 2880

aactgtggct gcaccatctg tcttcatctt cccgccatct gatgagcagt tgaaatctgg 2940

aactgcctct gttgtgtgcc tgctgaataa cttctatccc agagaggcca aagtacagtg 3 000

gaaggtggat aacgccctcc aatcgggtaa ctcccaggag agtgtcacag agcaggacag 3060

caaggacagc acctacagcc tcagcagcac cctgacgctg agcaaagcag actacgagaa 3120

acacaaagtc tacgcctgcg aagtcaccca tcagggcctg agctcgcccg tcacaaagag 3180

cttcaacagg ggagagtgtt ag 3202 <210> 25 <211> 1428 <212> DNA

<213> seqüência artificial <22 0>

<223> cadeia pesada com região Fc do ANTICORPO A e com a seqüência líder <400> 25

atgaaacacc tgtggttctt cctcctgctg gtggcagctc ccagatgggt cctgtcccag 60 gtggaattgg tggaaagcgg cggcggcctg gtgcaaccgg gcggcagcct gcgtctgagc 120 tgcgcggcct ccggatttac ctttagcagc tatgcgatga gctgggtgcg ccaagcccct 180 gggaagggtc tcgagtgggt gagcgctatt aatgcttctg gtactcgtac ttattatgct 240 gattctgtta agggtcgttt taccatttca cgtgataatt cgaaaaacaç cctgtatctg 300 caaatgaaca gcctgcgtgc ggaagatacg gccgtgtatt attgcgcgcg tggtaagggt 360 aatactcata agccttatgg ttatgttcgt tattttgatg tttggggcca aggcaccctg 420 gtgacggtta gctcagcctc caccaagggt ccatcggtct tccccctggc accctcctcc 480 aagagcacct ctgggggcac agcggccctg ggctgcctgg tcáaggacta cttccccgaa 540 ccggtgacgg tgtcgtggaa ctcaggcgcc ctgaccagcg gcgtgcacac cttcccggct 600 gtcctacagt cctcaggact ctactccctc agcagcgtgg tgaccgtgcc ctccagcagc 660 ttgggcaccc agacctacat ctgcaacgtg aatcacaagc ccagcaacac caaggtggac 720 aagaaagttg agcccaaatc ttgtgacaaa actcacacat gcccaccgtg cccagcacct 780 gaactcctgg ggggaccgtc agtcttcctc ttccccccaa aacccaagga caccctcatg 840 atctcccgga cccctgaggt cacatgcgtg gtggtggacg tgagccacga agaccctgag 900 gtcaagttca actggtacgt ggacggcgtg gaggtgcata atgccaagac aaagccgcgg 960 gaggagcagt acaacagcac gtaccgggtg gtcagcgtcc tcaccgtcct gcaccaggac 1020

tggctgaatg gcaaggagta caagtgcaag gtctccaaca aagccctccc agcccccatc 1080

gagaaaacca tctccaaagc caaagggcag ccccgagaac cacaggtgta caccctgccc 1140

ccatcccggg atgagctgac caagaaccag gtcagcctga cctgcctggt caaaggcttc 1200

5 tatcccagcg acatcgccgt ggagtgggag agcaatgggc agccggagaa caactacaag 12 60

accacgcctc ccgtgctgga ctccgacggc tccttcttcc tctacagcaa gctcaccgtg 1320

gacaagagca ggtggcagca ggggaacgtc ttctcatgct ccgtgatgca tgaggctctg 1380 cacaaccact acacgcagaa gagcctctcc ctgtctccgg gtaaatga 142 8 <210> 26 10 <211> 475 <212> PRT

<213> seqüência artificial <22 0>

<223> cadeia pesada com região Fc do ANTICORPO A e com a seqüência líder

15 <400> 26

Met Lys His Leu Trp Phe Phe Leu Leu Leu Val Ala Ala Pro Arg Trp 1 5 10 15

Val Leu Ser Gln Val Glu Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln 20 25 30

20 Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe 35 40 45

Ser Ser Tyr Ala Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu

50 55 60

Glu Trp Val Ser Ala Ile Asn Ala Ser Gly Thr Arg Thr Tyr Tyr Ala

25 65 70 75 80

Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn

85 90 95

Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val 100 105 110

30 Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Lys Gly Asn Thr His Lys Pro Tyr Gly Tyr 115 120 125

Val Arg Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser 130 135 140

Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser 145 150 155 160

Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp

165 170 175

Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr

180 185 190

Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr

195 200 205

Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln

210 215 220

Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp 225 230 235 240

Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro

245 250 255

Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro

260 265 270

Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr

275 280 285

Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn

290 295 300

Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg 305 310 315 320

Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val

325 330 335

Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser

340 345 350

Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys

355 360 365

Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp

370 375 380

Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu

Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe

Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly

Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr

<210> 27 <211> 708 <212> DNA

<220>

<223> cadeia leve do ANTICORPO A com a seqüência líder <400> 27

atggtgttgc agacccaggt cttcatttct ctgttgctct ggatctctgg tgcctacggg 60

20 gatatcgtgc tgacccagag cccggcgacc ctgagcctgt ctccgggcga acgtgcgacc 120

ctgagctgca gagcgagcca gagcgtgagc agcagctatc tggcgtggta ccagcagaaa 180

ccaggtcaag caccgcgtct attaatttat ggcgcgagca gccgtgcaac tggggtcccg 240

gcgcgtttta gcggctctgg atccggcacg gattttaccc tgaccattag cagcctggaa 300

cctgaagact ttgcgactta ttattgcctt cagatttata atatgcctat tacctttggc 360

25 cagggtacga aagttgaaat taaacgtacg gtggctgcac catctgtctt catcttcccg 420

ccatctgatg agcagttgaa atctggaact gcctctgttg tgtgcctgct gaataacttc 480

tatcccagag aggccaaagt acagtggaag gtggataacg ccctccaatc gggtaactcc 540

caggagagtg tcacagagca ggacagcaag gacagcacct acagcctcag cagcaccctg 600

acgctgagca aagcagacta cgagaaacac aaagtctacg cctgcgaagt cacccatcag 660

30 ggcctgagct cgcccgtcac aaagagcttc aacaggggag agtgttag 708 <210> 28 <211> 235 <212> PRT

<213> seqüência artificial <220>

<223> cadeia leve do ANTICORPO A com a seqüência líder <400> 28

Met Val Leu Gln Thr Gln Val Phe Ile Ser Leu Leu Leu Trp Ile Ser 1 5 10 15

Gly Ala Tyr Gly Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser

20 25 30

Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser

35 40 45

Val Ser Ser Ser Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala

50 55 60

Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Val Pro 65 70 75 80

Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile

85 90 95

Ser Ser Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Leu Gln Ile

100 105 110

Tyr Asn Met Pro Ile Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys

115 120 125

Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu

130 135 140

Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe 145 150 155 160

Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln

165 170 175

Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser

180 185 190

Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu

195 200 205

Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser 210 215 220

Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys 225 230 235

<210> 29 <211> 31 <212> DNA

<213> seqüência artificial <220>

<223> Iniciador sentido MS-Roche #7.9.H7_Ig_kapa <400> 29

acgtaagctt gccgccacca tggtgttgca g <210> 30 <211> 28 <212> DNA

<213> seqüência artificial <220>

<223> Iniciador anti-sentido MS-Roche #7.9.H7_Ig_kapa <400> 30

acgtgaattc ctaacactct cccctgtt <210> 31 <211> 31 <212> DNA

<213> seqüência artificial <220>

<223> Iniciador sentido MS-Roche #7.9.H7_IgGl <400> 31

acgtaagctt gccgccacca tgaaacacct g <210> 32 <211> 28 <212> DNA

<213> seqüência artificial <220> <223> Iniciador anti-sentido MS-Roche #7.9.H7_IgGl <400> 32

acgtgaattc tcatttaccc ggagacag 28

Claims (34)

1. Molécula de anticorpo purificado, caracterizada pelo fato de que pelo menos um antígeno que se liga ao sítio da dita molécula de anti- corpo compreende uma asparagina glicosilada (Asn) na região variável da cadeia pesada (VH).

2. Molécula de anticorpo purificado de acordo com a reivindica- ção 1, caracterizada pelo fato de que a dita asparagina glicosilada (Asn) na região variável da cadeia pesada (Vh) está na região CDR2.

3. Molécula de anticorpo purificado de acordo com a reivindica- ção 1 ou 2, caracterizada pelo fato de que a dita asparagina glicosilada (Asn) na região variável da cadeia pesada (Vh) está na posição 52 da SEQ ID NO -2 ou posição 52 de SEQ ID NO 6.

4. Molécula de anticorpo purificado de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizada pelo fato de que através da mesma a dita molécula de anticorpo é capaz de reconhecer especificamente o pepití- dio β-Α4/Αβ4.

5. Molécula de anticorpo purificado de acordo com a reivindica- ção 4, caracterizada pelo fato de que através da mesma o dito peptídeo β- Α4/Αβ4 tem a seguinte seqüência: DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVVIA (SEQ ID NO: -3) ou uma parte de pelo menos 15 aminoácidos da dita seqüência.

6. Molécula de anticorpo de acordo com qualquer uma das rei- vindicações 1 a 5, caracterizada pelo fato de que pelo menos um sítio de ligação com antígeno da dita molécula de anticorpo compreende uma aspa- ragina glicosilada (Asn) na região variável da cadeia pesada (Vh) e a dita Vh sendo codificada por: (a) uma molécula de ácido nucléico compreendendo a seqüência de nucleotídios tal como mostrado na SEQ ID NO 1: CAGGTGGAATTGGTGGAAAGCGGCGGCGGCCTGGTGCAACCGGGCGG CAGCCTGCGTCTGAGCTGCGCGGCCTCCGGATTTACCTTTAGCAGCTA TGCGATGAGCTGGGTGCGCCAAGCCCCTGGGAAGGGTCTCGAGTGGG TGAGCGCTATTAATGCTTCTGGTACTCGTACTTATTATGCTGATTCTGTT AAGGGTCGTTTTACCATTTCACGTGATAATTCGAAAAACACCCTGTATCT GCAAATGAACAGCCTGCGTGCGGAAGATACGGCCGTGTATTATTGCGC GCGTGGTAAGGGTAATACTCATAAGCCTTATGGTTATGTTCGTTATTTTG ATGTTTGGGGCCAAGGCACCCTGGTGACGGTTAGCTCA; (b) uma molécula de ácido nucléico que codifica um polipeptídio possuindo a seqüência de aminoácidos tal como mostrado na SEQ ID NO 2: QVELVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYAMSWVRQAPGKGLEWVS AINASGTRTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARGK GNTHKPYGYVRYFDVWGQGTLVTVSS (SEQ ID NO 2); (c) uma molécula de ácido nucléico que se hibridiza com a molé- cula de ácido nucléico de (a) ou (b) e que codifica um polipeptídio que é ca- paz de se ligar ao pepitídio β-Α4/Αβ4 tal como mostrado na seguinte se- qüência de aminoácidos: DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVVIA (SEQ ID NO: 3); ou que é capaz da ligação a um fragmento da mesma compreendendo pelo menos 15 aminoácidos; (d) uma molécula de ácido nucléico que se hibridiza com a mo- lécula de ácido nucléico de (a) ou (b) e que codifica um polipeptídio que é capaz de se ligar a pelo menos duas regiões no pepitídio β-Α4/Αβ4 tal como mostrado na seguinte seqüência de aminoácidos DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGWIA (SEQ ID NO: 3); ou a pelo menos duas regiões de um fragmento da SEQ ID NO 3 compreen- dendo pelo menos 15 aminoácidos através dos quais as duas ditas regiões no pepitídio β-Α4/Αβ4 ou o dito o fragmento da mesma compreende os ami- noácidos nas posições de 3 a 6 e nas posições de 18 a 26; ou (e) uma seqüência de ácidos nucléicos que é degenerada para uma seqüência de ácidos nucléicos tal como definido em qualquer uma das seqüências de (a) a (d).

7. Molécula de anticorpo de acordo com qualquer uma das rei- vindicações 1 a 5, caracterizada pelo fato de que a região variável compre- endendo uma asparagina glicosilada (Asn) é compreendida em uma cadeia pesada selecionada do grupo consistindo em: (a) um polipeptídio de cadeia pesada codificado por uma molé- cula de ácido nucléico tal como mostrado nas SEQ ID NO 5, 23 ou 25; (b) um polipeptídio de cadeia pesada possuindo a seqüência de aminoácidos tal como mostrado nas SEQ ID NO 6 ou 26; (c) um polipeptídio de cadeia pesada codificado por uma molé- cula de ácido nucléico que se hibridiza com a molécula de ácido nucléico definida em (a) e que codifica um polipeptídio que é capaz de se ligar ao pe- pitídio β-Α4/Αβ4, tal como mostrado na seguinte seqüência de aminoácidos: DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVVIA (SEQ ID NO: -3); ou um fragmento da mesma compreendendo pelo menos 15 aminoácidos; ou (d) um polipeptídio de cadeia pesada codificado por uma molé- cula de ácido nucléico que se hibridiza com a molécula de ácido nucléico definida em (a) e que codifica um polipeptídio que é capaz de se ligar a pelo menos duas regiões no pepitídio β-Α4/Αβ4, tal como mostrado na seguinte seqüência de aminoácidos DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVVIA (SEQ ID NO: -3); ou um fragmento da SEQ ID NO 3 compreendendo pelo menos 15 aminoá- cidos através dos quais as ditas duas regiões no pepitídio β-Α4/Αβ4, ou os ditos fragmentos das mesmas, compreende os aminoácidos nas posições de -3 a 6 e nas posições de 18 a 26.

8. Molécula de anticorpo de acordo com qualquer uma das rei- vindicações 1 a 7, caracterizada pelo fato de que dois sítios de ligação com antígeno còmpreendem a Asn glicosilada na região variável da cadeia pesa- da (VH).

9. Molécula de anticorpo de acordo com a reivindicação 8, carac- terizada pelo fato de que as regiões CDR2 das cadeias pesadas (Vh) com- preendem a Asn glicosilada.

10. Molécula de anticorpo de acordo com qualquer uma das rei- vindicações 1 a 9, caracterizada pelo fato de que a dita Asn é a Asn na posi- ção 52 de SEQ ID NO 2 ou é a Asn na posição 52 de SEQ ID NO 6.

11. Molécula de anticorpo de acordo com qualquer uma das rei- vindicações 1 a 10, caracterizada pelo fato de que através da qual a dita gli- cosilação na Asn na região Vh é selecionada do grupo consistindo em: (a) uma estrutura de açúcar do tipo complexo bifurcado; (b) uma estrutura de açúcar do tipo híbrido bifurcado; (c) uma estrutura de açúcar do tipo oligomanose bifurcada; e (d) uma estrutura de açúcar bifurcado de acordo com qualquer uma das estruturas fornecidas pela figura 5 ou pela figura 27.

12. Molécula de anticorpo de acordo com a reivindicação 11, caracterizada pelo fato de que através desta a dita estrutura de açúcar não compreende um núcleo de fucosilação.

13. Molécula de anticorpo de acordo com qualquer uma das rei- vindicações 2 a 12, caracterizada pelo fato de que através desta a dita regi- ão CDR-2 tem uma seqüência de aminoácidos tal como mostrado na SEQ ID NO 12.

14. Molécula de anticorpo de acordo com qualquer uma das rei- vindicações 1 a 13, caracterizada pelo fato de que é recombinantemente produzida.

15. Molécula de anticorpo de acordo com qualquer uma das rei- vindicações 1 a 14, caracterizada pelo fato de que é produzida em uma célu- la CHO.

16. Molécula de anticorpo de acordo com a reivindicação 15, caracterizada pelo fato de que através desta a dita célula CHO é CHO K1 ou CHO K1 SV.

17. Método de preparação de uma molécula de anticorpo, como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 16, caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de: (a) expressar recombinantemente uma molécula de ácido nu- cléico heteróloga codificando uma molécula de anticorpo tal como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 13 em uma célula de mamífero cul- tivada; (b) purificação da dita molécula de anticorpo recombinantemente expressada por um método compreendendo as etapas de: (b1) purificação através de coluna de proteína A; (b2) purificação através de coluna troca iônica; e (b3) purificação através de coluna de exclusão de tamanho.

18. Método de acordo com a reivindicação 17, caracterizado pe- lo fato de que a dita purificação através de coluna troca iônica compreende uma cromatografia de troca catiônica.

19. Método de acordo com a reivindicação 17 ou 18, caracteri- zado pelo fato de que compreende também como um passo adicional (c), uma cromatografia analítica e/ou uma nova etapa de concentração.

20. Composição, caracterizada pelo fato de que compreende uma molécula de anticorpo, na qual um antígeno que se liga ao sítio da dita molécula de anticorpo compreende uma asparagina glicosilada (Asn) na re- gião variável da cadeia pesada (Vh), e uma molécula de anticorpo, na qual os dois sítios de ligação com antígeno da dita molécula de anticorpo com- preendem uma asparagina glicosilada (Asn) na região variável da cadeia pesada (VH), e que compreendem menos do que 5% de uma molécula de anticorpo em que nenhum sítio de ligação com antígeno da dita molécula de anticorpo compreende uma asparagina glicosilada (Asn) na região variável da cadeia pesada (Vh).

21. Composição, caracterizada pelo fato de que compreende uma molécula de anticorpo como definida em qualquer uma das reivindica- ções 1 a 16 ou uma molécula de anticorpo preparada pelo método como de- finido em qualquer uma das reivindicações 17 a 19.

22. Composição de acordo com a reivindicação 20 ou 21, carac- terizada pelo fato de que é para uso diagnóstico ou uma composição farma- cêutica.

23. Uso de uma molécula de anticorpo como definida em qual- quer uma das reivindicações 1 a 16, ou de uma composição como definida em qualquer uma das reivindicações 20 a 22, caracterizado pelo fato de que é para a preparação de um medicamento para prevenção e/ou tratamento de uma doença associada com a formação da placa amilóide e/ou com a ami- loidogênese.

24. Uso, de uma molécula de anticorpo como definida em qual- quer uma das reivindicações 1 a 16, ou de uma composição como definida em qualquer uma das reivindicações 20 a 22, caracterizado pelo fato de que é para a preparação de um kit de diagnóstico para detecção de uma doença associada com a amiloidogênese e/ou a formação da placa amilóide.

25. Uso de uma molécula de anticorpo como definida em qual- quer uma das reivindicações 1 a 16, ou de uma composição como definida em qualquer uma das reivindicações 20 a 22, caracterizado pelo fato de que é para a preparação de um medicamento para a desintegração das placas β-amilóide.

26. Uso de uma molécula de anticorpo como definida em qual- quer uma das reivindicações 1 a 16, ou de uma composição como definida em qualquer uma das reivindicações 20 a 22, caracterizado pelo fato de que é para a preparação de uma composição farmacêutica de imunização passi- va contra formação da placa β-amilóide.

27. Uso de uma molécula de anticorpo como definida em qual- quer uma das reivindicações 1 a 16, ou de uma composição como definida em qualquer uma das reivindicações 20 a 22, caracterizado pelo fato de que é para a preparação de uma composição farmacêutica para o tratamento preventivo contra uma doença associada com a amiloidogênese e/ou a for- mação da placa amilóide.

28. Uso de acordo com a reivindicação 27, caracterizado pelo fato de que as placas preexistentes ou os intermediários de agregação da β- amilóide devem ser reduzidos.

29. Uso de uma molécula de anticorpo como definida em qual- quer uma das reivindicações 1 a 16, ou de uma composição como definida em qualquer uma das reivindicações 20 a 22, caracterizado pelo fato de que é para a preparação de um kit de diagnóstico para o diagnóstico de uma do- ença associada com amiloidogênese e/ou a formação da placa amilóide, em um paciente, ou para o diagnóstico da suscetibilidade de um paciente ao desenvolvimento de uma doença associada com a amiloidogênese e/ou com a formação da placa amilóide.

30. Uso de acordo com qualquer uma das reivindicações 23, 24 e 27 a 29, caracterizado pelo fato de que a dita doença é a demência, o mal de Alzheimer, a neuropatia motora, a síndrome de Down, a doença de Creutzfeld Jacob, a hemorragia cerebral hereditária com angiopatia amilóide cerebral (dutch), a demência associada com formação de corpo de Lewy, o mal de Parkinson, a demência relacionada com AIDS, a esclerose amiotrófi- ca lateral (ALS), ou com os distúrbios neuroniais relacionados ao envelheci- mento.

31. Kit, caracterizado pelo fato de que compreende uma molécu- la de anticorpo como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 16, ou tal como preparada pelo método como definido em qualquer uma das reivindicações 17 a 19, ou compreendendo uma composição, tal como defi- nida em qualquer uma das reivindicações 20 a 22.

32. Método para prevenção, tratamento ou melhoria de uma do- ença associada com a amiloidogênese e/ou com a formação da placa ami- lóide, caracterizado pelo fato de que compreende a administração da molé- cula de anticorpo, como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a -16, ou a administração da composição como definida em qualquer uma das reivindicações 20 a 22, a um mamífero que esteja necessitando de tal pre- venção ou tratamento.

33. Método de acordo com a reivindicação 32, caracterizado pe- lo fato de que a dita doença é a demência, o mal de Alzheimer, a neuropatia motora, a síndrome de Down, a doença de Creutzfeld Jacob, a hemorragia cerebral hereditária com angiopatia amilóide cerebral (dutch), a demência associada com formação de corpo de Lewy, o mal de Parkinson, a demência relacionada com AIDS, a esclerose amiotrófica lateral (ALS), ou com os dis- túrbios neuroniais relacionados ao envelhecimento.

34. Método de acordo com a reivindicação 32 ou 33, caracteri- zado pelo fato de que o dito mamífero é um ser humano.