BRPI0707556A2 - veÍculo para vacina - Google Patents

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BRPI0707556A2
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Shinobu Watarai
Kenji Kono
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Nippon Biolog Inc
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Abstract

VEÍCULO PARA VACINA. A presente invenção refere-se a novos veículos para vacina, que podem ser usados para produzir vacinas que sejam capazes de indução eficiente de respostas imunes humoral e celular. Outro objeto da presente invenção é fornecer vacinas, que sejam capazes de indução eficiente de respostas imunes humoral e celular. A presente invenção revelou que os objetos mencionados acima da presente invenção poderia ser atingida por uso de lipossomas contendo poli(glicidol) succinilado e esta constatação conduziu à realização da invenção. Afirmado de maneira específica, a presente invenção pode atingir os objetos mencionados acima por fornecimento de veículos para vacina compreendendo lipossomas contendo poli(glicidol) succinilado.

Description

Pedido tal como depostiado (PCT)Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "VEÍCULOPARA VACINA".
CAMPO DA INVENÇÃO
A presente invenção refere-se a novos veículos para vacina u-sando Iipossomas tendo uma membrana de lipídeos fusogênica.
ANTECEDENTE DA TÉCNICA
O sistema imune de animais tem a função de diferenciação entrepróprio e não próprio e de eliminação do não próprio a partir do corpo. A re-ação imunológica em um corpo vivo, que é responsável para tal discrimina-ção entre próprio e não próprio é realizada por imunidade celular, que utilizamoléculas da classe I de MHC, ou por imunidade humoral, que utiliza molé-culas da classe Il de MHC. Por exemplo, se um corpo vivo for infectado comum vírus ou bactéria, como um patógeno infeccioso, ela tenta eliminar taispatógenos infecciosos por uso da imunidade celular ou imunidade humoralmencionadas acima.
Vacinação é freqüentemente utilizada como um meio para pre-venir aqueles patógenos infecciosos. No caso de humanos, assim como deanimais domesticados e animais de companhia, uma grande variedade devacinas são utilizadas.
Aquelas vacinas são grosseiramente divididas em dois tipos,vacinas inativadas (incluindo vacina toxóide) e vacinas atenuadas. Vacinasinativadas são aquelas vacinas, que um patógeno ou toxóide é tratado comformalina ou outros entes químicos para se tornarem não infecciosos e, en-tão, administrados em um estado inativado, ou elas são aquelas vacinas quesomente a porção de antígeno do patógeno é administrada; exemplos dessetipo de vacinas, que podem ser administradas a humanos, incluem vacinastríplices (vacina DPT; vacina contra difteria/tétano/coqueluche), vacina con-tra encefalite japonesa, vacina contra gripe, vacina contra toxóide de teta-nus, etc. Vacinas atenuadas, por outro lado, são aquelas vacinas que sãoadministradas na forma de patógenos, que são fracamente virulentos, mas,que têm, de fato, capacidade de infectar, como exemplificado por cepas ate-nuadas de ocorrência natural ou cepas criadas artificialmente de variantesatenuadas; exemplos desse tipo de vacinas, que podem ser administradas ahumanos, incluem vacina BCG, vacina contra a poliomielite, vacina contra osarampo, vacina contra a rubéola, vacina contra a caxumba, vacina contra avaricela (vacina contra catapora), etc.
Vacinas inativadas têm a vantagem de serem menos propensasa causar infecção mediada por patógeno e efeitos colaterais como um resul-tado de sua administração, mas, por outro lado, elas são caracterizadas pelacapacidade de adquirir somente imunidade humoral. Vacinas atenuadas, poroutro lado, usam patógenos vivos, portanto, elas têm a desvantagem de quea sua virulência poderia, por alguma razão, ser restaurada para desenvolverefeitos colaterais. Além disso, exceto no caso de algumas vacinas atenua-das (tal como a vacina contra a poliomielite), que devem ser administradasoralmente, vacinas são, em geral, administradas por injeção intramuscular,assim, elas têm problemas adicionais pelo fato de que as concentrações deanticorpos de IgG podem aumentar, porém, aquelas de anticorpos em outrasclasses (tais como, IgA e IgM) não o farão e que elas não podem induzir, demaneira completa, a resposta imune celular, que é importante para a prote-ção contra a infecção.
Infecção com patógenos infecciosos se inicia com aqueles pató-genos invadindo o corpo a partir da superfície das mucosas, como na muco-sa nasal, traqueal, intestinal e ocular, então, se a imunidade celular puderser induzida por vacinação, a invasão de patógenos para o corpo pode sercontida na fronteira. Embora as membranas de mucosas no corpo vivo recu-bram as superfícies de lúmens de tratos, tais como a cavidade oral, a cavi-dade nasal, o trato digestivo e os órgãos reprodutores, assim como as su-perfícies de mucosa dos olhos, o que está constantemente funcionando na-quelas superfícies é a imunidade de mucosa, que envolve, principalmente,IgA secretório e tecidos de Iinfa associados a mucosa contra microorganis-mos patogênicos (por exemplo, vírus e bactérias), antígenos alimentíceos esubstância exógena não própria, aos quais as membranas de mucosa estãoconstantemente expostas. A imunidade de mucosa contém a invasão daque-las substâncias exógenas não próprias para o corpo por exibição de diversasações, tais como supressão de incorporação de antígenos de proteína a par-tir das superfícies de mucosa, inibição da adsorção de bactérias ou vírus nosepitélios de mucosa e neutralização de vírus com os quais as células epiteli-ais tenham sido infectadas.
Entretanto, conforme mencionado acima, muitos casos da vaci-nação convencional tiveram o problema de falharem em aumentar as con-centrações de anticorpos de anticorpos nas classes não IgG (tais como IgAe IgM) ou de induzir completamente a resposta imune celular, assim, ne-nhuma resposta imune que envolva a produção de anticorpos específicosquanto ao antígeno (IgA secretório) pode ser induzido de maneira eficaz emsuperfícies de mucosa, que sejam sítios de infecção com patógenos infec-ciosos. Para solucionar esses problemas, foram realizados estudos com apresunção de que resposta imune específica quanto ao antígeno poderia serinduzida tanto sistemicamente quanto nas superfícies de mucosa em váriaspartes do corpo, por administração de antígenos via superfícies de mucosacomo na imunização oral ou na imunização nasal.
Com vistas a conferir tal imunidade por mucosa, têm sido feitastentativas de incorporar antígenos em Iipossomas e administrá-los às mem-branas de mucosa como vacinas. Por exemplo, mostrou-se que, por incorpo-ração de um antígeno de Salmonella enterica serovar Enteritidis, como umimunógeno em Iipossomas e gotejando-o por sobre os olhos de galinhas,resposta imune sistêmica poderia ser induzida para, por meio disso, inibir ainvasão de Salmonella enterica serovar Enteritidis através do lúmen intesti-nal (Documento 1 de não patente e Documento 2 de não patente).
No entanto, no campo da produção de vacina, deseja-se que,para desenvolver veículos para vacina, que possam alcançar aumentos ain-da mais eficientes nas concentrações de anticorpos de várias classes deanticorpos (em resposta imune humoral) e em resposta imune celular.
Documento 1 de não patente: Fukutome, K. et al., Developmentand Comparative Immunology, 25, 2001, 475-484.
Documento 2 de não patente: Li, W. et al, Development andComparative Immunology, 28, 2004, 29-38.DESCRIÇÃO DA INVENÇÃOPROBLEMAS A SEREM SOLUCIONADOS PELA INVENÇÃO
O objetivo da presente invenção é preparar novos veículos paravacina que possam ser usados para produzir vacinas que sejam capazes deindução eficiente de respostas imunes humoral e celular. Outro objeto dapresente invenção é fornecer vacinas que sejam capazes de indução eficien-te de respostas imunes humoral e celular.
MEIOS PARA SOLUCIONAR OS PROBLEMAS
Os presentes inventores revelaram que os problemas mencio-nados acima da presente invenção poderiam ser solucionados por uso deIipossomas contendo um lipídeo fusogênico (poli(glicidol) succinilado) e essaconstatação conduziu à realização da invenção. Afirmado de maneira espe-cífica, a presente invenção pode solucionar os problemas mencionados an-teriormente por fornecimento de veículos para vacina compreendendo Iipos-somas contendo poli(glicidol) succinilado.
EFEITOS DA INVENÇÃO
Por uso dos veículos para vacina acima descritos, que compre-endem Iipossomas contendo poli(glicidol) succinilado, vacinas eficientes po-dem ser obtidas, as quais atingem aumentos significativos em concentra-ções de anticorpos, quando comparadas com o caso de usar veículos paravacinas que compreendam os Iipossomas convencionais. Além disso, asvacinas preparadas por uso dos veículos para vacinas acima descritos sãocapazes de indução eficiente de não somente imunidade humoral, mas,também, de imunidade celular.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS
A Figura 1 é um gráfico mostrando as concentrações de anticor-pos de anticorpo de IgM específico quanto a OVA, anticorpo de IgG e anti-corpo de IgE no soro, para o caso em que camundongos BALB/c foram imu-nizados intraperitonealmente com uma vacina constituída por IipossomasOVA-SucPG, um vacina constituída por Iipossomas OVA e uma vacina so-mente composta por OVA.
A Figura 2 é um gráfico mostrando as concentrações de anticor-pos de subclasses de anticorpos de IgG específicos quanto a OVA (IgGI1lgG2a e lgG3) no soro para o caso em que camundongos BALB/c foram i-munizados intraperitonealmente com uma vacina constituída por Iipossomasde OVA-SucPG, uma vacina constituída por Iipossomas de OVA e uma vaci-na composta unicamente por OVA.
A Figura 3 é um gráfico mostrando os resultados de indução declasses de anticorpos no fluido intestinal para o caso de administraçãotransnasal.
A Figura 4 mostra os resultados de exame de expressão demRNA de gene IFN-γ e de gene IL-4 em linfócitos de baço a partir de ca-mundongos imunizados intraperitonealmente com uma vacina constituídapor Iipossomas de OVA-SucPG usando a técnica de RT-PCR.
A Figura 5 mostra, em gráficos, os resultados da quantificaçãode IFN-γ e de IL-4 no sobrenadante de cultura de linfócitos de baço a partirde camundongos imunizados intraperitonealmente com uma vacina constitu-ída por Iipossomas de OVA-SucPG.
A Figura 6 é um gráfico mostrando as concentrações de antíge-nos de anticorpo de IgM específico quanto a OVA, anticorpo de IgG e anti-corpo de IgE no soro, para o caso em que camundongos BALB/c foram imu-nizados intraperitonealmente com uma vacina constituída por Iipossomas deOVA-SucPG, uma vacina constituída por Iipossomas de OVA e uma vacinacomposta unicamente por OVA.
A Figura 7 é um gráfico mostrando as concentrações de anticor-pos de subclasses de anticorpo de IgG específico quanto a OVA (lgG1,lgG2a e lgG3) no soro para o caso em que camundongos BALB/c foram i-munizados intraperitonealmente com uma vacina constituída por Iipossomasde OVA-SucPG, uma vacina constituída por Iipossomas de OVA e uma vaci-na composta unicamente por OVA.
Figura 8 mostra os resultados do exame de expressão de mRNAde gene IFN-γ e de gene IL-4 em linfócitos de baço a partir de camundongosimunizados intraperitonealmente com uma vacina constituída por Iipossomasde OVA-SucPG usando a técnica de RT-PCR.A Figura 9 mostra, em gráficos, os resultados da quantificaçãode gene IFN-γ gene e de gene IL-4 no sobrenadante de cultura de linfócitosde baço a partir de camundongos imunizados intraperitonealmente com umavacina constituída por Iipossomas de OVA-SucPG.
A Figura 10 mostra, em gráficos, os resultados de anticorpos deconcentração de anticorpos no sangue a partir de galinhas imunizadas poradministração oftálmica de uma vacina constituída por Iipossomas de Suc-PG - antígeno de Salmonella enteritidis.
A Figura 11 é um gráfico mostrando os resultados de anticorposde concentração de anticorpos no sangue a partir de camundongos imuniza-dos por administração transnasal de uma vacina constituída por Iipossomasde SucPG - antígeno de Trypanosoma brucei.
A Figura 12 é um gráfico mostrando os resultados de anticorposde concentração de anticorpos no sangue a partir de vacas imunizadas poradministração transnasal de uma vacina constituída por Iipossomas deSucPG - antígeno de Staphylococcus aureus.
A Figura 13 é um gráfico mostrando os resultados de anticorposde concentração de anticorpos no leite a partir de vacas imunizadas por ad-ministração transnasal de uma vacina constituída por Iipossomas de SucPG
- antígeno de Staphylococcus aureus.
A Figura 14 é um gráfico mostrando os resultados de anticorposde título de anticorpo no sangue a partir de carpa imunizada por administra-ção oral de uma vacina constituída por Iipossomas de SucPG - antígeno deAeromonas salmonieida.
A Figura 15 mostra, em gráficos, os resultados de anticorpos deconcentração de anticorpos no fluido intestinal e na bile a partir de carpa i-munizada por administração oral de uma vacina constituída por Iipossomasde SucPG - antígeno de Aeromonas salmonieida.
A Figura 16 é um gráfico mostrando a mudança transicional nataxa de sobrevivência de carpa imunizada por administração oral de umavacina constituída por Iipossomas de SucPG - antígeno de Aeromonas sal-monieida.A Figura 17 é um gráfico mostrando os resultados de anticorposde concentração de anticorpos no sangue a partir de camundongos imuniza-dos por administração transnasal de uma vacina constituída por Iipossomasde SucPG - antígeno de Mycoplasma gallisepticum.
A Figura 18 é um gráfico mostrando os resultados de anticorposde concentração de anticorpos no sangue a partir de camundongos imuniza-dos por administração transnasal de uma vacina constituída por Iipossomasde SucPG - antígeno de vírus de Newcastle.MODOS PARA REALIZAÇÃO DA INVENÇÃO
Conforme descrito acima, a presente invenção é caracterizadapor fornecimento de veículos para vacina compreendendo Iipossomas quecontêm poli(glicidol) succinilado (SucPG). A vantagem de usar os veículospara vacina compreendendo tais Iipossomas é que, independentemente dese o imunógeno contido nos Iipossomas é uma vacina inativada ou uma va-cina atenuada e qualquer que seja a rota de administração, não somente asconcentrações de anticorpos de anticorpos de IgG, mas, aquelas de outrasclasses de anticorpos também podem ser elevadas e, além disso, imunidadecelular, assim como imunidade humoral também podem ser induzidas.
Acredita-se que imunidade celular, que é induzida a partir do usodo veículo para vacina da presente invenção, que compreende Iipossomascontendo poli(glicidol) succinilado (SucPG), tenha sido realizada por interna-lização do imunógeno dentro das células que apresentam antígeno. Para sermais específico, usando o veículo para vacina da presente invenção, pode-se incorporar o imunógeno aos lúmens de Iipossomas e, portanto, pode-seinternalizar o imunógeno dentro das células que apresentam antígeno. Comoum resultado, assim foi assumido, o imunógeno incorporado à célula queapresenta antígeno, combinado como um componente próprio com uma mo-lécula de classe I de MHC e apresentado, ele mesmo, como um antígeno nacélula que apresenta antígeno, finalmente induzindo imunidade celular.
O poli(glicidol) succinilado (SucPG), conforme usado aqui, é umcompostos anfifílico caracterizado por ter um grupo alquila. Tendo um grupoalquila, SucPG pode ser ancorado a uma membrana de lipossoma. O grupoalquila em SucPG contém, de preferência, 6 a 24 átomos de carbono, e,mais preferivelmente, contém grupos alquila tendo 6 a 18 átomos de carbo-no. O grupo alquila muitíssimo preferido é um grupo n-decila tendo 10 áto-mos de carbono. SucPG tem o esqueleto da cadeia principal sendo similaràqueles de polietileno glicol anfifílico e cadeias laterais com um grupo carbo-xila, assim, ele é caracterizado pelo fato de que ele estabiliza a membranade Iipossoma em um ambiente neutro, mas, de que, em um ambiente ácido,o grupo carboxila nas cadeias laterais está protonado para induzir a fusão demembrana. Por incorporação do SucPG à membrana de lipossoma, o Iipos-soma resultante (lipossoma de SucPG) chega a desenvolver fusogenicidadeem um ambiente ácido. Em outras palavras, quando o lipossoma de SucPGfor incorporado à célula que apresenta antígeno por endocitose, o pH no Ii-sossoma cai. Então, o lipossoma de SucPG exibe sua fusogenicidade e sefunde com a membrana de Iisossoma para fazer com que a substância anti-gênica encapsulada seja liberada no citoplasma (internalização do antígeno).
O SucPG, que deve ser usado na presente invenção, pode serpreparado por reação do polímero sintético poli(glicidol) com anidrido succí-nico, em Ν,Ν-dimetilformamida, a 80°C, durante 6 horas.
O que é característico da presente invenção é que poli(glicidol)succinilado seja adicionado ao lipídeo que compõe o lipossoma usado noveículo para vacina. Para ser mais específico, o veículo para vacina da pre-sente invenção contém poli(glicidol) succinilado em uma quantidade de 10 a40% em peso, de preferência, de 20 a 35% em peso, muitíssimo de prefe-rência, de 30% em peso, do lipídeo que compõe o lipossoma.
O veículo para vacina da presente invenção pode ser usado pa-ra administração transmucósica do imunógeno contido dentro do lipossoma.
O termo "mucosa" ou "membrana de mucosa", conforme usado aqui coleti-vamente se refere a sítios que cobrem as superfícies internas dos lúmens devísceras ocas, tais como órgãos digestivos, órgãos respiratórios e órgãosgenitourinários e suas superfícies livres estão sempre úmidas com secre-ções a partir de glândulas e células globulares. Membranas de mucosa, àsquais o veículo para vacina da presente invenção pode ser aplicado, incluemmembranas da cavidade oral, garganta, cavidade nasal, cavidade aural, sa-co conjuntivo, vagina e ânus. Por aplicação do Iipossoma contendo imunó-geno a essas superfícies de mucosa, o imunógeno pode ser incorporado aocorpo via as superfícies de mucosa.
O veículo para vacina da presente invenção também pode serusado para entrega por administração de não transmucosa do imunógenocontido dentro do Iipossoma do veículo para vacina. Na presente invenção,rotas diferentes da rota de transmucosa podem incluir administração intrape-ritoneal do imunógeno contido dentro do Iipossoma do veículo para vacina.Por exemplo, quando o imunógeno for administrado intraperitonealmente,ele pode ser incorporado ao corpo a partir das superfícies de órgãos na ca-vidade abdominal, conforme exemplificado pelo trato gastrointestinal, órgãosgenitais, fígado e pâncreas. Administrando-se dessa maneira o imunógenoao corpo, o imunógeno pode ser incorporado às células que apresentam an-tígeno presentes ubiqüamente no corpo.
Lipídeos que compões o Iipossoma na presente invenção inclu-em, por exemplo, fosfatidilcolinas, fosfatidiletanolaminas, fosfatidilserinas,ácidos fosfatídicos ou fosfatos de alquila de cadeia longa ou fosfatidilglice-róis, e colesteróis (Col). Ao se preparar Iipossomas na presente invenção, oslipídeos listados acima podem ser usados ou independentemente ou emcombinação de quaisquer dois ou mais daqueles lipídeos.
Fosfatidilcolinas, que são usadas como lipídeos para composi-ção do Iipossoma na presente invenção, incluem dimiristoil fosfatidilcolina(DMPC), dipalmitoil fosfatidilcolina (DPPC), distearoil fosfatidilcolina (DSPC),dioleil fosfatidilcolina (DOPC), Iecitina da gema do ovo (PC de ovo), etc.
Fofatidiletanolaminas, que são usadas como lipídeos para com-posição do Iipossoma na presente invenção, incluem dioleil fosfatidiletano-Iamina (DOPE), dimiristoil fosfatidiletanolamina, dipalmitiol fosfatidiletanola-mina, distearoil fosfatidiletanolamina (DSPE), etc.
Fosfatidilserinas, que são usadas como lipídeos para composi-ção do Iipossoma na presente invenção, incluem dioleil fosfatidilserina(DOPS), dipalmitoil fosfatidilserina (DPPS), etc.Ácidos fosfatídicos ou fosfatos de alquila de cadeia longa, quesão usados como lipídeos para composição do Iipossoma na presente in-venção, incluem ácido dimiristoil fosfatídico, ácido dipalmitoil fosfatídico, áci-do diestearoil fosfatídico, fosfato de dicetila, etc.
Fosfatidilgliceróis, que são usados como lipídeos para composi-ção do Iipossoma na presente invenção, incluem dimiristoil fosfatidilglicerol,dipalmitoil fosfatidilglicerol, distearoil fosfatidilglicerol, etc.
Dentre os compostos listados acima, aqueles que são particu-larmente preferidos para uso são DOPE, DPPC, DSPC, DPPS, DSPE, Col,etc.
Quando os lipídeos listados acima devam ser usados em adiçãosob mistura, as proporções nas quais os respectivos lipídeos são incorpora-dos podem ser determinadas como apropriadas pelo tamanho desejado doslipossomas, a fluidez desejada, etc. Na presente invenção, de preferência,lipossomas são preparados por mistura de DOPE e DPPC em 1:1.
Lipossomas são classificados como VML (vesículas multilamela-res), VDR (vesículas de desidratação - reidratação), VUG (vesículas unila-melares grandes) ou VUP (vesículas unilamelares pequenas), etc, depen-dendo de suas estruturas ou do método de sua preparação. O Iipossoma dapresente invenção, que contém poli(glicidol) succinilado (SucPG) tambémestá disponível em vários tipos de lipossomas, incluindo VML, VDR, VUG eVUP, que são compostos por camadas múltiplas.
Para preparar os lipossomas contendo SucPG, quaisquer méto-dos convencionalmente conhecidos de produção de Iipossoma podem serempregados. Uma variedade de métodos para produção de Iipossoma erampreviamente conhecidos no campo técnico de interesse.
Para dar exemplos de alguns métodos comuns para produçãode lipossoma, podem ser mencionados os seguintes: (1) um lipídeo é dissol-vido em um solvente orgânico adequado (tais como, clorofórmio, éter, etc) eo solvente é removido por destilação sob vácuo, para formar um fino filme delipídeo, o qual é, então, hidratado (ou intumescido) em água, por meios deagitação mecânica; (2) um lipídeo é dissolvido em um solvente orgânico (taiscomo, éter ou etanol) e a solução resultante é injetada em água aquecida àelevada temperatura por meios adequados (tais como uma seringa ou umbocal, sob pressão, em uma taxa constante, no processo do qual o solventeorgânico é removido por destilação ou diluído, por meio do que o lipídeoforma uma camada dupla para preparar lipossomas; (3) um lipídeo é mistu-rado com um tensoativo (tais como ácido cólico ou ácido deoxicólico) paraformar micelas em uma solução aquosa e a solução de micelas resultante éprivada do tensoativo (tais como ácido cólico ou ácido deoxicólico) por umaoperação adequada, tais como diálise ou filtração em gel, de modo a prepa-rar lipossomas; (4) um solvente orgânico tendo um lipídeo nele dissolvido éadicionado a uma fase aquosa, a qual é submetida a ultrassom para formaruma emulsão A/O, que, então, é privada do solvente orgânico para formarum gel, o qual é deixado sofrer inversão de fase por agitação mecânica, demodo a preparar lipossomas; (5) um filme fino de lipídeo é misturado comum solvente aquoso, de modo que ele seja hidratado ou intumescido e o re-cipiente é vibrado mecanicamente para separar o filme fino de lipídeo desuas supefrícies internas e, depois disso, o filme fino de lipídeo separado ésubmetido a ultrassom ou passado através de um orifício de um dado tama-nho por meio de uma prensa francesa, um aparelho de filtração pressuriza-do, ou uma extrusora, de modo a preparar lipossomas; e (6) lipossomas sãoIiofilizados e, então, reidratados com um solvente aquoso para, por meio dis-so, preparar lipossomas.
Com uma vista suplementando a atividade de aumento de imu-nidade, o veículo para vacina da presente invenção pode conter adicional-mente um adjuvante. Adjuvantes, que podem estar contidos no veículo paravacina, da presente invenção, incluem monofosforil lipídeo A, citocina, Iecti-na, etc.
O imunógeno, que pode estar contido no veículo para vacina dapresente invenção, pode incluir (mas, não limitados a) qualquer dos imunó-genos, com os quais humanos ou animais (mamíferos, peixes, etc) sejamdesejavelmente vacinados. Exemplos dos imunógenos incluem imunógenosderivados a partir de bactérias, imunógenos derivados a partir de vírus, eimunógenos derivados a partir de protozoário.
No caso, por exemplo, que o caso da aplicação do veículo paravacina da presente invenção é aplicado a imunógenos em humanos, os se-guintes podem estar contidos no veículo para vacina: um imunógeno deriva-do de vírus selecionado a partir de um antígeno de vírus de gripe, um antí-geno de vírus de SARS, um antígeno de vírus de AIDS e os similares; ou umimunógeno derivado de bactéria selecionado dentre antígeno patogênico deEscherichia co//0-157, antígeno de Salmonella, antígeno de Staphylococcusaureus, antígeno de Aeromonas, antígeno de bacilo da tuberculose e os si-milares; ou um imunógeno derivado de protozoário selecionado dentre antí-geno de trypasonoma, antígeno de coccidium, antígeno de malária, antígenode theileria e os similares.
Considere, então, o caso de aplicação do veículo para vacina dapresente invenção a imunógenos em animais; nesse caso, qualquer dos an-tígenos derivados de patógenos de doenças infecciosas importantes em a -nimais domésticos podem estar contidos e exemplos dos antígenos incluem:para galinhas, imunógenos derivados de bactéria, tais como an-tígeno de Salmonella enteriea serovar Enteritidis, antígeno de Haemophilusparagallinarum·, imunógenos derivados de vírus, tais como antígeno de vírusda gripe aviária, antígeno de vírus da Doença de Newcastle, antígeno devírus da bronquite infecciosa, imunógenos derivados de protozoários taiscomo antígeno de leucocytozoon, antígeno de elmeria;
para porcos, um imunógeno derivado de vírus, tais como antíge-no de vírus da gastroenterite infecciosa; um imunógeno derivado de bactéria,tais como antígeno de Bordetella bronchiseptica; e imunógenos derivados deprotozoário, tais como antígeno de toxoplasma, antígeno de eimeria;
para vacas, um imunógeno derivado de vírus, tais como antíge-no de vírus de diarréia viral bovina / doença de mucosa; imunógenos deriva-dos de bactéria, tais como antígeno de Staphylococcus aureus e antígeno deMyeobaeterium avium var paratuberculose; e imunógenos derivados de pro-tozoário, tais como antígeno de theileria, antígeno de babesia e os similares;
para cavalos, imunógenos derivados de vírus, tais como antíge-no de vírus da rinopneumonite eqüina e antígeno de vírus da gripe eqüina; eimunógenos derivados de protozoário, tais como antígeno de trypanosoma,antígeno de babesia; e
para peixes, imunógenos derivados de bactéria, tais como antí-geno de víbrio, antígeno de aeromonus; imunógenos derivados de vírus, taiscomo antígeno de vírus da necrose pancreática infecciosa, antígeno de iri—dovírus; e imunógenos derivados de protozoário, tais como antígeno de pro-tozoário ichthyobodo, antígeno de protozoário hexamita.EXEMPLOS
Exemplo 1: Preparação de Lipossomas de Poli(glicidol) Succinilado (SucPG)A uma composição de lipídeo consistindo em dipalmitoil fosfati-dilcolina (DPPC) (Sigma) e dioleil fosfatidiletanolamina (DOPE) (Sigma) emuma razão molar de 1:1 (cada uma sendo de 10 pmols), SucPG foi adicio-nado em uma razão em peso de lipídeo de 10%, 20% ou 30% para preparartrês tipos de Iipossomas contendo SucPG com diferentes concentrações deSucPG. O SucPG a ser usado no Exemplo 1 era de um tipo tendo um grupon-decila de Ci0 como um grupo alquila e ele foi sintetizado por um métododocumentado (Kono K. et al., J. Controlled Release, 68, 225-235 (2000); Ko-no K. et al., Biochim. Biophys. Acta, 1325, 143-154 (1997); or Kono K. et al.,Biochim. Biophys. Acta, 1193, 1-9 (1994)). Especificamente, po-li(epicloridrina) foi submetida à reação em dimetilformamida, na presença deacetato de potássio, à 175°C, durante 6 horas, para preparar poli(acetato deglicidila), que, por sua vez, foi submetido à reação em metil carbitol, na pre-sença de acetato de potássio, à 150°C, durante 1 hora, para sintetizar po-li(glicidol). O polímero de poli(glicidol) assim sintetizado foi reagido com ani-drido succínico em Ν,Ν-dimetilformamida, a 80°C, durante 6 horas, parapreparar SucPG.
Para preparar lipossomas, o procedimento descrito no Docu-mento 1 de não patente pode ser adotado. Especificamente, 2 pmols deDPPC, 2 pmols de DOPE e SucPG foram dissolvidos em um solvente orgâ-nico e misturados em um frasco cônico. Os lipídeos foram secados em umevaporador rotativo e colocados durante 30 minutos sob vácuo, em um des-secador. Como um antígeno modelo, 4 mg/mL de ovalbumina (OVA) foramadicionados e a mistura foi incubada a 35 - 40°C, durante 3 minutos, seguidopor vórtex vigoroso para dispersar o filme de lipídeo. Dessa maneira, o antí-geno modelo de OVA foi encapsulado nos lipossomas. Qualquer OVA, quenão foi encapsulada nos lipossomas, foi removida por repetida centrifugaçãoa 14.000 g, durante 20 minutos, a 4°C, de modo a purificar os lipossomastendo o antígeno modelo OVA ali encapsulados. Preparadas dessa maneiraforam vesículas multilamelares (lipossomas de OVA - SucPG) (VML).Exemplo 2: Estudo de Resposta Imune a partir de Administração Transmu-cósica de Vacina em Lipossomas de PoIi(QlicidoI) Succinilado
A finalidade desse Exemplo foi estudar a resposta imune a partirde administração transmucósica de uma vacina nos lipossomas contendoSucPG preparados no Exemplo 1, quando comparada com uma vacina noslipossomas livres de SucPG.
A vacina nos lipossomas contendo SucPG foi preparada confor-me descrito no Exemplo 1. Por outro lado, a vacina nos lipossomas livres deSucPG era uma vacina em vesículas multilamelares (lipossomas de OVA)(VML), que foram preparadas por encapsulação de OVA em uma composi-ção de lipídeo consistindo em DPPC e DOPE1 em uma razão molar de 1:1.
Os dois tipos de vacina assim preparados, uma nos lipossomasde OVA - SucPG e a outra nos lipossomas de OVA, assim como uma vacinaunicamente composta por OVA, foram administradas transnasalmente a ca-mundongos BALB/c duas vezes em um intervalo de 7 dias, cada vez paradar 100 pg por camundongo de OVA.
Sete dias depois da administração final do imunógeno, 0,1 mLde sangue foram tomados a partir do plexo venoso orbital e o soro coletadoa partir do sangue foi usado para estudar a produção de anticorpos anti-OVA(IgM, IgG e IgE) pelo procedimento ELISA. Além disso, sete dias depois daadministração final, o fluido intestinal foi coletado e estudado para a produ-ção de anticorpos anti-OVA (IgA e IgG) pelo procedimento ELISA. Em adi-ção, o soro imune obtido foi usado para fazer uma análise para subclassesanti-OVA-lgG pelo procedimento ELISA.Os resultados são mostrados nas Figuras 1 a 3. A Figura 1 mos-tra os resultados de indução de classe de anticorpos no soro, com respeito àresposta imune a partir de imunização transnasal dos camundongos BALB/ccom a vacina nos Iipossomas de OVA - SucPG, a vacina nos Iipossomas deOVA e a vacina unicamente composta por OVA; a coluna negra mostra oresultado de imunização somente com OVA (OVA); as colunas cinza mos-tram o resultado de imunização com os Iipossomas de OVA (OVA-lipo); e ascolunas brancas mostram o resultado de imunização com Iipossomas deOVA - SucPG (OVA-SucPG-Iipo). A Figura 2 mostra os resultados específi-cos com as subclasses de anticorpos de anti-OVA-lgG que foram induzidosno soro. A Figura 3 mostra os resultados de indução de classe de anticorposno fluido intestinal para o caso de imunização transnasal. Nas Figuras 2 e 3,os imunógenos associados com as respectivas colunas são os mesmos co-mo explicados acima em conexão com a Figura 1.
A partir dos resultados mostrados na Figura 1, pode ser vistoque, quando os camundongos BALB/c foram imunizados intranasalmentecom a variedade de imunógenos, anticorpos das classes de IgA e de IgGforam produzidos nos corpos de animais, com a produção do anticorpo declasse de IgG sendo geralmente maior do que aquela do anticorpo de classede IgA. Para cada classe de anticorpo, o relacionamento entre o tipo de veí-culo para vacina e a quantidade de produção de anticorpos foi investigada;mostrou-se que, em comparação com o caso de imunização com a vacinaunicamente composta por OVA ou com a vacina nos Iipossomas de OVA, aimunização com a vacina nos Iipossomas de OVA-SucPG foi capaz de pro-dução de anticorpos em uma eficiência significativamente elevada (p <0,0027).
Em adição, os resultados mostrados na Figura 2 indicam que aimunização com a vacina nos Iipossomas de OVA - SucPG poderia induzirnão somente IgGI, que era uma subclasse de IgG de tipo de Th2 (imunida-de humoral), mas, também, lgG2 e lgG3, que eram subclasses de IgG dotipo Th1 (imunidade celular). Por outro lado, quando a imunização foi efetua-da usando-se a vacina nos Iipossomas de OVA ou a vacina unicamentecomposta por OVA, IgGI foi praticamente todo o anticorpo que poderia serproduzido. Além disso, com relação à quantidade de produção daquele anti-corpo de IgGI, mostrou-se que a imunização com a vacina nos Iipossomasde OVA-SucPG foi capaz de produção de anticorpos em uma eficiência sig-nificativamente elevada (p < 0,011), quando comparado com o caso de imu-nização com as vacinas em outros veículos para vacina (as vacinas nos Ii-possomas de OVA e a vacina unicamente composta por OVA).
Adicionalmente em adição, a Figura 3 mostra o uso transnasalda vacina nos Iipossomas de OVA - SucPG foi capaz de produção de anti-corpos eficiente no fluido intestinal, quando comparada com a vacina noslipossomas de OVA.
Conseqüentemente, as seguintes observações gerais foram ob-tidas a partir da administração transnasal da vacina nos Iipossomas conten-do SucPG: ela foi capaz de introdução de antígeno eficiente em células queapresentam antígeno, finalmente induzindo produção de anticorpos elevadano sangue, assim como produção de anticorpos elevada no trato intestinal; eela foi potencialmente capaz de induzir não somente imunidade humoral,mas, também, resposta imune celular.
Exemplo 3: Indução de Resposta Imune Celular a partir de Administração
Transmucósica de Vacina em Lipossomas Contendo SucPGUma vez que foi mostrado, no Exemplo 2, que a imunização coma vacina, nos Iipossomas contendo SucPG, por administração transmucósicado antígeno, tinha o potencial de induzir a resposta imune celular, o Exemplo3 foi conduzido para estudar uma capacidade para exercer a resposta imunecelular para o caso de usar a vacina nos Iipossomas contendo SucPG.
A vacina nos Iipossomas de OVA-SucPG, preparada no Exem-plo 1, foi administrada transnasalmente em camundongos BALB/c duas ve-zes em um intervalo de 7 dias, cada vez para dar 100 pg por camundongode OVA. Sete dias depois da administração final, os camundongos foramsacrificados e o baço foi coletado e submetido à centrifugação por gradientede densidade para purificar os linfócitos de baço.
A partir dos linfócitos de baço purificados, RNA total foi extraídousando-se TRIzol™ (Invitrogen) e IFN-γ, que era um índice de imunidadecelular, e IL-4 foram verificados para expressão de mRNA pela técnica deRT-PCR.
Primeiro de tudo, cDNA foi sintetizado a partir do RNA total. ORNA total (1 pg a 5 pg) foi misturado com um iniciador de oligo(dT)i2-i8 (500ng) e dNTP Mix (10 nmols) para fazer um volume total de 12 pL; a mistura foisubmetida à reação a 65°C, durante 5 minutos, e submetida a um extinguidasobre gelo. Subseqüentemente, 4 pL de 5 χ de Tampão de Primeira Fita, 2pL de DTT 0,1 M e 1 pL de Inibidor de Ribonuclease Recombinante RNase-OUT™ (40 unidades/pL) (Invitrogen) foram adicionados e, seguindo umareação de 2 minutos a 42°C, transcriptase reversa SuperScript™ Il (Invitro-gen) foi adicionada em uma quantidade de 200 unidades. Seguindo umareação adicional de 50 minutos, a 42°C, a transcriptase reversa foi inativadapor realização de uma reação a 70°C, durante 15 minutos.
Um microlitro do cDNA resultante, 2,5 pmols de cada um dosiniciadores identificados abaixo, 37,5 nmols de MgCI2, 10 nmols de dNTPMix e 1 unidade de Taq DNA Polimerase (Invitrogen) foram adicionados aum tampão de PCR para fazer um volume total de 25 pL e reação de PCRfoi realizada em TaKaRa PCR Thermal Cycler MP TP3000 (TaKaRa). A rea-ção de PCR consistiu em uma reação de 5 minutos a 94°C, seguido por 35ciclos, em cada um dos quais consistindo em uma reação de 94°C χ 45 se-gundos, uma reação de 60°C χ 45 segundos e uma reação de 72°C χ 2 mi-nutos, e a reação final a 72°C durante 7 minutos. Seguindo a PCR, a amos-tra foi submetida à eletroforese sobre um gel de agarose a 2% e tornada vi-sível por manchamento com brometo de etídio.
No Exemplo 3, os seguintes iniciadores foram usados para am-plificar o gene IFN-yde camundongo:
forward primer: 5'-tgcatcttggcttgcagctcttcctcatggc-3' (SEQ ID NO: 1) e
reverse primer: 5'-tggacctgtgggttgttgacctcaaacttggc-3' (SEQ ID NO: 2);
e os seguintes iniciadores foram usados para amplificar o gene IL-4 de ca-mundongo:
forward primer: Sl-Ccagctagttgtcatcctgctcttctttctcg-S' (SEQ ID NO: 3) ereverse primer: 5'-cagtgatgtggacttggactcattcatggtgc-3' (SEQ ID NO: 4), cadaum destes iniciadores estando disponível a partir de CLONTEC.
Como iniciadores para a amplificação de um gene G3PDH decamundongo de controle, foram usados os seguintes:
forward primer: 5'-accacagtccatgccatcac-3' (SEQ ID NO: 5) e
reverse primer: 5'-tccaccaccctgttgctgta-3' (SEQ ID NO: 6).
Os resultados da medição para a expressão de mRNA de IFN-γe de IL4 são mostrados na Figura 4. Na Figura 4, a pista 1 mostra o resulta-do de RT-PCR realizada usando o controle positivo como um molde; a pista2 mostra o resultado de RT-PCR realizada usando, como um molde, o RNAtotal derivado a partir dos camundongos de controle negativo injetados intra-peritonealmente com 200 μΙ_ de salina fisiológica; a pista 3 mostra o resulta-do de RT-PCR realizada usando, como um molde, o RNA total derivado apartir dos camundongos imunizados intraperitonealmente com Iipossomasde OVA - SucPG; e a pista 4 mostra o resultado de RT-PCR realizada usan-do, como um molde, o RNA total derivado a partir dos camundongos de con-trole negativo imunizados intraperitonealmente com Iipossomas de SucPGlivre de OVA. Como mostra a Figura 4, tornou-se claro que o mRNA de IFN-γ, que foi um índice de reação imune celular, e o mRNA de IL-4, que foi umíndice de reação imune humoral, foram ambos expressos nos linfócitos debaço, a partir de camundongos imunizados com os Iipossomas de OVA -SucPG.
No Exemplo 3, os linfócitos de baço purificados também foramcultivados em um meio suplementado com OVA durante 5 dias, e as quanti-dades de IFN-γ e de IL-4, que foram liberadas para o sobrenadante da cultu-ra, foram medidas como índices de imunidade celular e de imunidade humo-ral, respectivamente. Para quantificar o IFN-γ e a IL-4 no sobrenadante dacultura, os kits de quantificação relevantes (Endogen) foram usados.
Os resultados da quantificação das quantidades de IFN-γ e deIL-4 liberados para o sobrenadante da cultura de linfócitos de baço são mos-trados na Figura 5. Na Figura 5: a pista 1 mostra a quantidade de IFN-γ oude IL-4, como produzidos a partir dos linfócitos de baço derivados a partirdos camundongos de controle negativo imunizados intranasalmente com osIipossomas de SucPG livres de OVA, e a pista 2 mostra a quantidade deIFN-you de IL-4 como produzidos a partir de linfócitos de baço derivados apartir dos camundongos imunizados intranasalmente, com os IipossomasOVA - SucPG. Como mostrado na Figura 5, tornou-se claro que, no sobre-nadante da cultura dos linfócitos de baço a partir dos camundongos imuni-zados com os Iipossomas de OVA - SucPG, IFN-γ, que foi um índice de rea-ção imune celular, e IL-4, que foi um índice de reação imune humoral, foramambos produzidos em níveis significativamente elevados de maneira estatís-tica(p< 0,0001).
A partir dos resultados descritos nos Exemplos 2 e 3, mostrou-seque a vacina nos Iipossomas contendo SucPG da presente invenção, quan-do ela for usada em imunização transnasal, pode induzir não somente imu-nidade humoral, mas, também, imunidade celular, e isso indica que os Iipos-somas contendo SucPG da presente invenção são úteis como veículo deantígeno para vacinas transmucósicas.
Exemplo 4: Estudo de Resposta Imune a partir de Administração NãoTransmucósica de Vacina em Lipossomas de Poli(qlicidol) Succinilado(SucPG)
A finalidade desse Exemplo era estudar a resposta imune a par-tir de administração não transmucósica de uma vacina nos Iipossomas con-tendo SucPG, preparados no Exemplo 1, quando comparada com uma vaci-na nos Iipossomas livres de SucPG.
A vacina nos Iipossomas contendo SucPG foi preparada confor-me descrito no Exemplo 1. Por outro lado, a vacina nos Iipossomas livres deSucPG era uma vacina em vesículas multilamelares (lipossomas de OVA)(VML), que foram preparadas por encapsulação de OVA em uma composi-ção de lipídeo consistindo em DPPC e de DOPE, em uma razão molar de 1:1.
Os dois tipos de vacinas assim preparados, um nos lipossomasde OVA - SucPG e a outra nos lipossomas de OVA, assim como uma vacinaunicamente composta por OVA foram administradas intraperitonealmente acamundongos de BALB/c duas vezes, em um intervalo de 7 dias, cada vezpara dar 100 μς por camundongo de OVA.
Sete dias depois da administração final do imunógeno, 0,1 ml_de sangue foram retirados a partir do plexo venoso orbital e o soro coletadoa partir do sangue foi usado para estudar a produção de anticorpos anti-OVA(IgM, IgG e IgE) pelo procedimento ELISA. Em adição, o soro imune obtidofoi usado para fazer uma análise para subclasses de anti-OVA-lgG pelo pro-cedimento ELISA.
Os resultados são mostrados nas Figuras 6 e 7. A Figura 6 mos-tra os resultados para a resposta imune a partir de imunização intraperitone-al dos camundongos BALB/c com a vacina nos Iipossomas de OVA-SucPG,a vacina nos Iipossomas de OVA e a vacina unicamente composta por OVA;as colunas negras mostram os resultados de imunização unicamente comOVA (OVA); as colunas cinzas mostram os resultados de imunização comIipossomas de OVA (OVA-lipo); e as colunas brancas mostram os resultadosde imunização com os Iipossomas de OVA-SucPG (OVA-SucPG-Iipo). A Fi-gura 7 mostra os resultados com as subclasses de anticorpos anti-OVA-lgGe os imunógenos associados com as respectivas colunas são os mesmosconforme explicado acima, em conexão com a Figura 6.
A partir dos resultados mostrados na Figura6, pode ser visto queos camundongos BALB/c foram imunizados intraperitonealmente com a vari-edade de imunógenos, anticorpos das classes IgM e IgG foram produzidosnos corpos de animais, com a produção dos anticorpos de classe IgG sendogeralmente maior do que do anticorpo de classe IgM. Para cada classe deanticorpo, o relacionamento entre o tipo de veículo para vacina e a quantida-de de produção de anticorpos foi investigado; mostrou-se que, em compara-ção com o caso de imunização com a vacina unicamente composta por O-VA, o caso de imunização com a vacina nos Iipossomas de OVA produziuuma quantidade maior de anticorpo, porém, nenhuma diferença significativafoi encontrada como o resultado de um teste t; por outro lado, uma compara-ção entre o caso de imunização com a vacina nos Iipossomas de OVA e ocaso de imunização com a vacina nos Iipossomas de OVA-SucPG mostrouque a imunização com a vacina nos Iipossomas de OVA - SucPG foi capazde produção de anticorpos com uma eficiência marcadamente elevada (p <0,0019).
Em adição, os resultados mostrados na Figura 7 indicam queimunização com a vacina nos Iipossomas de OVA - SucPG poderia induzirnão somente IgGI, que era uma subclasse de IgG do tipo Th2 (imunidadehumoral), mas, também, lgG2a e lgG3, que eram subclasses de IgG do tipoTh1 (imunidade celular). Por outro lado, quando a imunização foi efetuadausando a vacina nos Iipossomas de OVA ou a vacina unicamente compostapor OVA, IgGI foi praticamente todo o anticorpo que poderia ser produzido.Além disso, com relação à quantidade de produção daquele anticorpo IgGI,mostrou-se que a imunização com a vacina nos Iipossomas de OVA -SucPG foi capaz de produção de anticorpo com uma eficiência marcada-mente elevada (p < 0,019), quando comparada com o caso de imunizaçãocom a vacina em outros veículos para vacina (a vacina nos Iipossomas deOVA e a vacina unicamente composta por OVA).
Conseqüentemente, as seguintes observações gerais foram ob-tidas a partir da administração não transmucósica da vacina nos Iipossomascontendo SucPG: ela foi capaz de introdução de antígeno eficiente em célu-las que apresentam antígeno, finalmente induzindo elevada produção deanticorpos; e ela foi potencialmente capaz de induzir não somente imunidadehumoral, mas, também, resposta imune celular.
Exemplo 5: Indução de Resposta Imune Celular a partir de AdministraçãoNão Transmucósica de Vacina em Lipossomas Contendo SucPG
Uma vez que se mostrou, no Exemplo 4, que a imunização comum antígeno usando os Iipossomas contendo SucPG teve um potencial parainduzir resposta imune celular, o Exemplo 5 foi conduzido para estudar umacapacidade de exercer a resposta imune celular para o caso de usar os Ii-possomas contendo SucPG.
Os Iipossomas de OVA - SucPG, preparados no Exemplo 1, fo-ram administrados intraperitonealmente a camundongos BALB/c, duas vezesem um intervalo de 7 dias, cada vez para dar 100 pg por camundongo deOVA. Sete dias depois da administração final, os camundongos foram sacri-ficados e o baço foi coletado e submetido à centrifugação por gradiente dedensidade para purificar os linfócitos de baço. Usando-se os linfócitos debaço assim purificados, IFN-γ e IL-4 foram medidos para a expressão demRNA pela técnica de RT-PCR e as quantidades de IFN-γ e de IL-4 libera-das ao sobrenadante de cultura foram medidas pelo procedimento ELISA,conforme descrito no Exemplo 3.
Os resultados de medição para a expressão de mRNA de IFN-γe de IL-4 são mostrados na Figura 8. Na Figura 8: a pista 1 mostra o resulta-do de RT-PCR realizada usando, como um molde, o RNA total derivado apartir dos camundongos imunizados intraperitonealmente com os Iipossomasde OVA - SucPG; a pista 2 mostra o resultado de RT-PCR realizada usandoum controle positivo como um molde; a pista 3 mostra o resultado de RT-PCR realizada usando, como um molde, o RNA total derivado a partir doscamundongos de controle negativo imunizados intraperitonealmente comIipossomas de SucPG livres de OVA; e a pista 4 mostra o resultado de RT-PCR realizado usando, como molde, o RNA total derivado a partir dos ca-mundongos de controle negativo injetados intraperitonealmente com 200 μίde salina fisiológica. Conforme mostrado na Figura 8, tornou-se claro que omRNA de IFN-γ, que foi um índice de reação imune celular, e o mRNA de IL-4, que foi um índice de reação imune humoral, foram ambos expressos noslinfócitos de baço a partir dos camundongos imunizados com os Iipossomasde OVA - SucPG.
Em adição, os resultados da quantificação das quantidades deIFN-γ e de IL-4 liberadas ao sobrenadante da cultura de linfócitos de baçosão mostrados na Figura 9. Na Figura 9: a pista 1 mostra a quantidade deIFN-γ ou de IL-4 como produzida a partir dos linfócitos de baço derivados apartir dos camundongos de controle negativo imunizados intraperitonealmen-te com os Iipossomas de SucPG livre de OVA, e a pista 2 mostra a quanti-dade de IFN-γ ou de IL-4 conforme produzida a partir dos linfócitos de baçoderivados a partir dos camundongos imunizados intraperitonealmente comos Iipossomas de SucPG - OVA. Conforme mostrado na Figura 9, tornou-seclaro que, no sobrenadante da cultura dos linfócitos de baço a partir dos ca-mundongos imunizados com os Iipossomas de SucPG - OVA1 IFN-γ, que foium índice de reação imune celular, e IL-4, que foi um índice de reação imu-ne humoral, foram ambos produzidos em níveis significativamente elevadosde maneira estatística (p < 0,0001).
A partir dos resultados descritos nos Exemplos 4 e 5, mostrou-seque a vacina nos Iipossomas contendo SucPG da presente invenção, mes-mo quando ela for usada em imunização não transnasal, pode induzir nãosomente imunidade humoral, mas, também, imunidade celular, como no ca-so de imunização transnasal, e isto indica que os Iipossomas contendoSucPG da presente invenção são também úteis como um veículo para antí-geno para vacinas não transmucósicas.
Exemplo 6: Imunização Oftálmica (Transmucósica) de Galinhas com Vacinaem Lipossomas de Antíqeno de Salmonella - SucPG
A finalidade deste Exemplo era estudar a resposta imune a partirde administração oftálmica (transmucósica) a galinhas de uma vacina emIipossomas contendo SucPG contendo antígeno de Salmonella enteritidiscomo um imunógeno.
O antígeno de Salmonella enteritidis, ou o imunógeno a ser usa-do neste Exemplo, foi preparado da seguinte maneira. Primeiro, Salmonellaenteritidis (cepa 1227) foi inoculada em um meio de infusão para coração(Nissui Pharmaceutieal Co., Ltd.) e seguindo o cultivo, a 37°C, durante 14horas, 7 χ 1014 CFU da bactéria Salmonella enteritidis foram coletados. Abactéria Salmonella enteritidis coletada foi inativada por desnaturação com um excesso de formalina; seguindo a remoção de formalina, a aplicação deultrassom foi conduzida para preparar um fluido antigênico. Uma vacina emIipossomas contendo SucPG contendo o assim preparado antígeno de Sal-monella enteritidis (vacina em Iipossomas de antígeno de Salmonella enteri-tidis - SucPG) foi preparado por um método que era basicamente o mesmoque o procedimento descrito no Exemplo 1.
A vacina assim preparada em Iipossomas de antígeno de Sal-monella enteritidis - SucPG foi administrada uma vez a 5 galinhas (white Ie-ghorn) de 3 semanas de idade, depois do nascimento, por gotejamento porsobre os olhos para dar 100 pg por galinha de antígeno de Salmonella ente-ritidis.
Nos dias 14 e 35 depois da administração do imunógeno (desig-nados como "2 semanas (5 semanas de idade)" e "5 semanas (8 semanasde idade)", respectivamente), 2,0 ml_ de sangue foram coletados a partir daveia da asa (também chamada de veia basílica) e usando-se o soro coletadoa partir da amostra de sangue, a produção de anticorpo contra antígeno anti-Salmonella enteritidis (IgG ou IgA) foi estudada pelo procedimento ELISA.Como um controle, usou-se soro que tinha sido obtido a partir de galinhasindividuais que ainda deviam ser imunizadas com o antígeno de Salmonellaenteritidis (designados como pre (3 semanas de idade)).
Os resultados são mostrados na Figura 10. Na Figura 10, as co-lunas negras mostram que os resultados para a concentração do anticorpoIgG (Figura 10A) e as colunas brancas mostram os resultados para a con-centração de anticorpos do anticorpo IgA (Figura 10B). O símbolo "*" indicaa presença de uma diferença significativa (p < 0,0001) a partir das concen-trações de anticorpos dos anticorpos em galinhas individuais antes da imuni-zação (Dia 0). Os dados mostram média ± desvio padrão.
A partir dos resultados mostrados na Figura 10, pode ser vistoque, quando galinhas foram imunizadas por administração oftálmica da vaci-na em Iipossomas de SucPG - antígeno de Salmonella enteritidis, tanto aclasse IgG quanto a classe de IgA de anticorpos foram produzidos de manei-ra marcante no corpo, em comparação com o caso de "pre (3 semanas deidade)", mas, a partir de um ponto de vista de longo prazo (5 semanas (8semanas de idade) depois da administração final do imunógeno), a classeIgG de anticorpo tendeu a ser produzida em uma quantidade maior do que aclasse IgA de anticorpo.
A partir desses resultados, mostrou-se que a imunização de ga-linhas por administração oftálmica (transmucósica) da vacina em Iipossomasde SucPG - antígeno de Salmonella enteritidis pode induzir elevada produ-ção de anticorpos no sangue.Exemplo 7: Imunização Transnasal (Transmucósica) de Camundonqos comVacina em Lipossomas de SucPG - Antígeno de Trvoanosoma
A finalidade desse Exemplo foi estudar a resposta imune a partirde administração transnasal (transmucósica) a camundongos de uma vacinaem Iipossomas contendo SucPG contendo antígeno de Trypanosoma bruceicomo um imunógeno.
Para se obter o antígeno de Trypanosoma brucei, o imunógenoa ser usado neste Exemplo, protozoários Trypanosoma brucei foram coleta-dos. O método de coleta estava em acordo com um método publicado (La-nham, S. M., Nature1 218, 1273-1274 (1968)). De maneira específica, proto-zoários T. brucei (1 χ 105 parasitas) foram inoculados nas cavidades abdo-minal de ratos Wistar (Japan SLC, Inc.) e 4 dias depois, sangue integral foicoletado a partir de seus corações. O sangue coletado foi tratado com hepa-rina (10 unidades/mL) para inibição de proteção contra coagulação, e a ca-mada de células brancas foi coletada por centrifugação (1.300 g χ 10 minu-tos). Os protozoários foram purificados e colhidos a partir da camada de cé-lulas brancas coletada por meio de uma coluna de celulose DE52 (What-man). Os protozoários T. brucei coletados foram moídos por aplicação deultrassom para se obter o antígeno de T. brucei. Uma vacina em Iipossomascontendo SucPG contendo o antígeno de T. brucei assim preparado (vacinaem Iipossomas de SucPG - antígeno de T. brucei) foi preparado por um mé-todo que foi basicamente o mesmo que o procedimento descrito no Exemplo 1.
A vacina assim preparada em Iipossomas de SucPG - antígenode T. brucei foi administrativa transnasalmente a cinco camundongosBALB/c (Japan SLC, Inc.) 6 semanas de idade depois do nascimento, paradar 100 pg por camundongo de antígeno de T. brucei, e 2 semanas depois amesma quantidade de antígeno de T. brucei foi adicionalmente reforçadotransnasalmente para efetuar a imunização.
Quatorze dias depois da administração inicial do imunógeno (Dia14) e sete dias depois da administração final do imunógeno (Dia 21), 0,1 mLde sangue foram retirados a partir do plexo venoso orbital e o soro coletadoa partir do sangue foi usado para estudar a produção de anticorpos antiantí-geno de T. brucei (IgG e IgM) pelo procedimento ELISA. Como um controle,usou-se soro que tinha sido obtido a partir de camundongos individuais, queainda deviam ser imunizados com o antígeno de T. brucei (Dia 0).
Os resultados são mostrados na Figura 11. Na Figura 11, as co-
lunas negras mostram os resultados para a concentração de anticorpos doanticorpo IgM1 e as colunas brancas mostram os resultados para o título deanticorpos do anticorpo IgG. O símbolo "#" indica a presença de uma dife-rença significativa em ρ < 0,0012 a partir das concentrações de anticorposem camundongos individuais antes da imunização (Dia 0), o símbolo "$" in-dica a presença de uma diferença significativa em ρ < 0,0006, e o símbolo"*" indica a presença de uma diferença significativa em ρ < 0,0001. Os dadosmostram média ± desvio padrão.
A partir dos resultados mostrados na Figura 11, pode ser vistoque, quando camundongos foram imunizados por administração transnasalda vacina em Iipossomas de SucPG - antígeno de T. brucei, tanto a classeIgM quanto a classe IgG de anticorpos foram produzidas de maneira mar-cante no corpo, em comparação com o caso do Dia 0, e, em geral, a classeIgG de anticorpos tendeu a ser produzida em uma quantidade maior do quea classe IgM de anticorpo.
A partir desses resultados, mostrou-se que a imunização de ca-mundongos por administração transnasal (transmucósica) da vacina em Ii-possomas de SucPG - antígeno de T. brucei pode induzir elevada produçãode anticorpos no sangue. Exemplo 8: Imunização Transnasal (Transmucósica) de Vacas Lactantescom Vacina em Lipossomas de SucPG - Antígeno de Staphvlococcus aureusA finalidade deste Exemplo era estudar a resposta imune a partirde administração transnasal (transmucósica) a vacas de uma vacina em Ii-possomas contendo SucPG contendo antígeno de Staphylococcus aureuscomo um imunógeno.
Para preparar o antígeno de S. aureus, o imunógeno a ser usa-do neste Exemplo, S. aureus (cepa Cowan I) foi primeiro inoculada em ummeio LB (Nissui Pharmaceutical Co., Ltd.) e seguindo o cultivo à 37°C duran-te 14 horas, a bactéria S. aureus\o\ coletada. A bactéria S. aureus coletadafoi inativada por desnaturação com uma quantidade em excesso de formali-na; seguindo a remoção de formalina, aplicação de ultrassom foi conduzidapara preparar um fluido antigênico. Uma vacina em Iipossomas contendoSucPG contendo o antígeno de S. aureus assim preparado (vacina em Iipos-somas de SucPG - antígeno de S. aureus) foi preparada por um método queera basicamente o mesmo que o procedimento descrito no Exemplo 1.
A vacina assim preparada em Iipossomas de SucPG - antígenode S. aureus foi administrada transnasalmente a três vacas Iactantes deHolstein, para dar 5 mg por vaca de antígeno de S. aureus, e 14 dias depoisa mesma quantidade de antígeno de S. aureus foi adicionalmente reforçadatransnasalmente para efetuar a imunização.
Quatorze dias depois da administração inicial do imunógeno (Dia14) e 7 e 14 dias depois da administração final do imunógeno (Dia 21 e Dia28), 5 mL de sangue de sangue foram retirados a partir da veia cervical e osoro coletado a partir do sangue foi usado para estudar a produção de anti-corpos antiantígeno de S. aureus (IgA e IgG) pelo procedimento ELISA. Co-mo um controle, foi usado soro que tinha sido obtido a partir de vacas indivi-duais lactantes, que ainda deviam ser imunizadas com o antígeno de S. au-reus (Dia 0).
Os resultados são mostrados na Figura 12. Na Figura 12, as co-lunas negras mostram os resultados para a concentração de anticorpos doanticorpo IgA e as colunas brancas mostram os resultados para a concen-tração de anticorpos do anticorpo IgG. O símbolo "#" indica a presença deuma diferença significativa em ρ < 0,018 a partir das concentrações de anti-corpos em vacas lactantes individuais antes da imunização (Dia 0), o símbo-lo "&" indica a presença de uma diferença significativa em ρ < 0,039, o sím-bolo "*" indica a presença de uma diferença significativa em ρ < 0,0076, osímbolo indica a presença de uma diferença significativa em ρ < 0,0001,e o símbolo "t" indica a presença de uma diferença significativa em ρ <0,017. Os dados mostram média ± erro padrão.A partir dos resultados mostrados na Figura 12, pode ser mos-trado que, quando vacas Iactantes foram imunizadas por administraçãotransnasal das vacinas em Iipossomas de SucPG - antígeno de S. aureus,níveis quase comparáveis de classes de anticorpo IgG e de IgA de anticorpoforam produzidos de maneira comparável no sangue, em comparação com ocaso do Dia 0.
Quatorze dias depois da administração inicial do imunógeno (Dia14) e 7 e 14 dias depois da administração final do imunógeno (Dia 21 e Dia28), leite foi coletado a partir das vacas e estudados para a produção de an-ticorpos antiantígeno de S. aureus (IgG e IgA) pelo procedimento ELISA.Como um controle, foi usado leite que tinha sido obtido a partir de vacas Iac-tantes individuais, que ainda deviam ser imunizadas com o antígeno de S.aureus (Dia 0).
Os resultados são mostrados na Figura 13. Na Figura 13, as co-lunas negras mostram os resultados para a concentração de anticorpos doanticorpo IgA e as colunas brancas mostram os resultados para a concen-tração de anticorpos do anticorpos IgG. O símbolo "#" indica a presença deuma diferença significativa em ρ < 0,0046 a partir das concentrações de an-ticorpos em vacas Iactantes individuais antes da imunização (Dia 0), o sím-bolo "&" indica a presença de uma diferença significativa em ρ = 0,054, osímbolo "*" indica a presença de uma diferença significativa em ρ < 0,011, osímbolo indica a presença de uma diferença significativa em ρ < 0,02, eo símbolo "f" indica a presença de uma diferença significativa em ρ < 0,025.Os dados mostram média ± erro padrão.
A partir dos resultados mostrados na Figura 13, pode ser vistoque, quando vacas Iactantes foram imunizadas por administração transnasalda vacina em Iipossomas de SucPG - antígeno de S. aureus, tanto a classeIgG quanto a classe de IgA de anticorpo foram produzidas de maneira mar-cante no leite, em comparação com o caso do Dia 0, e, em geral, a classeIgA de anticorpo tendeu a ser produzida em uma quantidade maior do que aclasse IgG de anticorpo.
A partir desses resultados, mostrou-se que a imunização de va-cas Iactantes por administração transnasal (transmucósica) da vacina emIipossomas de SucPG - antígeno de S. aureus pode induzir, de maneiramarcante, produção de anticorpos elevada tanto no sangue quanto no leite.
Exemplo 9: Imunização Oral de Carpa com Vacina em Lipossomas deSucPG - Antígeno de Aeromonas salmonicida
A finalidade deste Exemplo foi estudar a resposta imune a partirde administração oral (transmucósica) a carpa de uma vacina em Iiposso-mas contendo SucPG antígeno de Aeromonas salmonicida como um imunógeno.
O antígeno de A. salmonicida, ou o imunógeno a ser usado nes-te Exemplo, foi preparado da seguinte maneira. Primeiro, A. salmonicida(cepa T1031) foi inoculado em um meio de infusão para coração e seguindoo cultivo à 20°C durante 24 horas, a bactéria A. salmonicida foi coletada e abactéria A. salmonicida coletada foi inativada por desnaturação com umaquantidade em excesso de formalina, aplicação de ultrassom foi conduzidapara preparar um fluido antigênico. Uma parte do antígeno de A. salmonicidafoi imediatamente utilizada como um imunógeno, enquanto que outra partefoi utilizada para preparar uma vacina em Iipossomas contendo SucPG con-tendo o antígeno de A. salmonicida. A vacina em Iipossomas contendoSucPG contendo o antígeno A. salmonicida inativado (vacina em Iipossomasde SucPG - antígeno de A. salmonicida) foi preparada por um método queera basicamente o mesmo que o procedimento descrito no Exemplo 1.
A vacina assim preparada em Iipossomas de SucPG - antígenode A. salmonicida foi administrada oralmente três vezes, em intervalos de 2semanas, a seis carpas (distribuídas a partir de Aquatic Life ConservationResearch Center, Research Institute of Environment, Agriculture and Fishe-ries, Osaka Prefectural Government) para imunização para dar 200 pg porcarpa do antígeno de A. salmonicida. Como um controle, somente o antíge-no de A. salmonicida foi administrado oralmente três vezes, em intervalos de2 semanas, a quatros carpas para imunização, para dar 200 pg por carpa doantígeno de A. salmonicida.
Na administração inicial do imunógeno (Dia 0), em sua segundaadministração (Dia 14), em sua terceira administração (Dia 28) e 14 dias de-pois de sua administração final (Dia 42), 1 mL de sangue foi retirado a partirdo pedúnculo caudal de cada carpa e o soro coletado a partir da amostra desangue foi usado para estudar a produção de anticorpo antiantígeno do anti-corpo anti-A de salmonicida pelo procedimento ELISA. Como um controle,foi usado soro que tinha sido obtido a partir de carpas individuais imunizadasunicamente com o antígeno de A. salmonicida.
Os resultados são mostrados em Figura 14. Na Figura 14, oscírculos negros (·) indicam os resultados para a concentração de anticorposdo anticorpo na carpa imunizada oralmente com a vacina em Iipossomas deSucPG - antígeno de A. salmonicida, enquanto que os triângulo negros (A)indicam os resultados para a concentração de anticorpos do anticorpo nacarpa imunizada oralmente somente com o antígeno de A. salmonicida. Osímbolo "*" indica a presença de uma diferença significativa (p < 0,01) a par-tir da concentração de anticorpos do anticorpo na carpa imunizada oralmen-te unicamente com o antígeno de A. salmonicida. Os dados mostram média± erro padrão.
A partir dos resultados mostrados na Figura 14, pode ser vistoque, quando carpas foram imunizadas por administração oral da vacina emIipossomas de SucPG - antígeno de A. salmonicida, a concentração de anti-corpos do anticorpo no sangue foi marcadamente intensificada em compara-ção com a carpa que foram oralmente imunizadas unicamente com antígenode A. salmonicida.
Com base nesses resultados, 14 dias depois da administraçãofinal da vacina em Iipossomas de SucPG - antígeno de A. salmonicida (Dia42), o fluido intestinal e a bile foram coletados a partir das carpas e estuda-dos para a produção de antiantígeno do anticorpo de anti A. salmonicida pe-lo procedimento ELISA. Como controles, foram usados o fluido intestinal e abile que tinham sido obtidos a partir de carpas individuais não imunizadas.Os resultados foram mostrados na Figura 15 para a concentra-ção de anticorpos no fluido intestinal (Figura 15A) e para a concentração deanticorpos do anticorpo na bile (Figura 15B). Em cada painel, a coluna negrase refere ao resultado para a concentração de anticorpos do anticorpo nascarpas individuais não imunizadas, enquanto que a coluna branca se refereao resultado para a concentração de anticorpos do anticorpo nas carpas in-dividuais imunizadas com a vacina em Iipossomas de SucPG - antígeno deA. salmonicida. O símbolo "*" indica a presença de uma diferença significati-va (p < 0,01) a partir da concentração de anticorpos do anticorpo nas carpasindividuais não imunizadas. Os dados mostram média ± erro padrão.
A partir dos resultados mostrados na Figura 15, pode ser vistoque, quando carpas foram imunizadas por administração oral da vacina emlipossomas de SucPG - antígeno de A. salmonicida, a concentração de anti-corpos do anticorpo foi marcadamente intensificado em cada um do fluidointestinal e da bile.
Além disso, 14 dias depois da administração final da vacina emIipossomas de SucPG - antígeno de A. salmonicida, seis carpas foram imer-sas em uma suspensão da bactéria A. salmonicida (1 χ 106 cfu/mL) durante60 minutos, de modo que elas seriam atacadas por A. salmonicida-, a mu-dança transicional subseqüente de sua taxa de sobrevivência foi registrada.Como controles, oito carpas individuais não imunizadas foram tratadas demaneira similar e a mudanças transicional subseqüente de sua taxa de so-brevivência foi registrada.
Os resultados são mostrados na Figura 16. Na Figura 16, os cír-culos negros (·) indicam a mudança transicional da taxa de sobrevivênciadas carpas imunizadas oralmente com a vacina em Iipossomas de SucPG -antígeno de A. salmonicida, enquanto que os triângulos negros (A) indicama mudança transicional da taxa de sobrevivência das carpas não imuniza-das. Como se depreende, a taxa de sobrevivência das carpas imunizadasoralmente com a vacina em Iipossomas de SucPG - antígeno de A. salmoni-cida foi maior do que a taxa de sobrevivência das carpas não imunizadas.
A partir desses resultados, mostrou-se que mesmo com o peixecarpa, a imunização por administração oral (transmucósica) da vacina emIipossomas de SucPG - antígeno de A. salmonicida pode induzir pode induzirelevada produção de anticorpos no sangue.Exemplo 10: Imunização Transnasal (Transmucósica) de Camundongos comVacina em Lipossomas de SucPG - Antíqeno de Mvcoplasma gallisepticum
A finalidade deste Exemplo era estudar a resposta imune a partirde administração transnasal (transmucósica) a camundongos de uma vacinaem Iipossomas contendo SucPG contendo antígeno de Mycoplasma galli-septicum como um imunógeno.
O antígeno de Mycoplasma gallisepticum, o imunógeno a serusado neste Exemplo, foi preparado da maneira seguinte. Primeiro, Myco-plasma gallisepticum (cepa S6) foi inoculada em meio Fray (Difco) suple-mentado com um extrato de lêvedo fresco e seguindo o cultivo à 37°C, du-rante 48 horas ou mais tempo, 3,58 χ 1011 CFU da bactéria Mycoplasma gal-lisepticum foi coletada. A bactéria Mycoplasma gallisepticum coletada foiinativada por desnaturação com uma quantidade em excesso de formalina;seguindo a remoção de formalina, aplicação de ultrassom foi conduzida parapreparar um fluido antigênico. Uma vacina em Iipossomas contendo SucPGcontendo o antígeno de Mycoplasma gallisepticum assim preparado (vacinaem Iipossomas de SucPG - antígeno de Mycoplasma gallisepticum) foi pre-parada por um método que era basicamente o mesmo que o procedimentodescrito no Exemplo 1.
A vacina assim preparada em Iipossomas de SucPG - antígenode Mycoplasma gallisepticum foi administrada transnasalmente a cinco ca-mundongos BALB/c (Japan SLC, Inc.) de 5 semanas de idade depois donascimento para dar 100 pg por cabeça de antígeno de Mycoplasma galli-septicum, e 2 semanas depois a mesma quantidade de antígeno de Myco-plasma gallisepticum foi adicionalmente reforçada transnasalmente para efe-tuar a imunização.
Sete dias depois da administração final do imunógeno (Dia 21),0,1 ml_ de sangue foi retirado a partir do plexo venoso orbital e o soro cole-tado a partir do sangue foi usado para estudar a produção de anticorpos an-tiantígeno de Mycoplasma gallisepticum (IgG e IgA) pelo procedimento ELI-SA. Como um controle, foi usado soro que tinha sido obtido a partir de ca-mundongos individuais que ainda deviam ser imunizados com o antígeno deMycoplasma gallisepticum (Dia 0).
Os resultados são mostrados na Figura 17. Na Figura 17, mostraos resultados de indução de classe de anticorpo em soro com respeito à res-posta imune a partir de administração transnasal da vacina em Iipossomasde SucPG - antígeno de Mycoplasma gallisepticum a camundongos; as co-lunas negras mostram os resultados para a concentração de anticorpos doanticorpo IgG e as colunas brancas mostra os resultados para a concentra-ção de anticorpos do anticorpo IgA.
A partir dos resultados mostrados na Figura 17, pode ser vistoque, quando camundongos foram imunizados por administração transnasaldo antígeno de Mycoplasma gallisepticum, tanto a classe de IgG quanto aclasse de IgA de anticorpo foram produzidos no corpo, e, em geral, a classeIgG de anticorpo tendeu a ser produzido em uma quantidade maior do que aclasse IgA de anticorpo. O símbolo "#" indica a presença de uma diferençasignificativa em ρ < 0,0063 a partir das concentrações de anticorpos noscamundongos individuais imediatamente antes da imunização com o antíge-no de Mycoplasma gallisepticum (Dia 0) e o símbolo "*" indica a presença deuma diferença significativa em ρ < 0,0003. Os dados mostram média ± erropadrão.
Conseqüentemente, mostrou-se que a administração transmu-cósica da vacina do antígeno de Mycoplasma gallisepticum, por meio dosIipossomas contendo SucPG, pode induzir elevada produção de anticorposno sangue e que ela é potencialmente capaz de induzir não somente imuni-dade humoral, mas, também, resposta imune celular.
Exemplo 11: Imunização Transnasal (Transmucósica) de Camundongos comVacina em Lipossomas de SucPG - Antígeno de Vírus de Doença de Newcastle
A finalidade deste Exemplo era estudar a resposta imune a partirde administração transnasal (transmucósica) a camundongos de uma vacinaem Iipossomas contendo SucPG contendo antígeno de vírus de Doença deNewcastle como um imunógeno.
O antígeno de vírus de Doença de Newcastle, o imunógeno aser usado neste Exemplo, foi preparado a partir de uma vacina viva comer-cial de Doença de Newcastle1 que foi submetida a ultrassom para prepararum fluido antigênico. Uma vacina em Iipossomas contendo SucPG contendoo antígeno de vírus de Doença de Newcastle assim preparado (vacina emIipossomas de SucPG - antígeno de vírus de Doença de Newcastle) foi pre-parada por um método que era basicamente o mesmo que o procedimentodescrito no Exemplo 1.
A vacina assim preparada em Iipossomas de SucPG - antígenode vírus de Doença de Newcastle assim preparada foi administrada transna-salmente a cinco camundongos de BALB/c (Japan SLC1 Inc.) de 5 semanasde idade depois do nascimento para dar 10O pg por cabeça de antígeno devírus de Doença de Newcastle, e 2 semanas depois a mesma quantidade deantígeno de vírus de Doença de Newcastle foi adicionalmente reforçadatransnasalmente para efetuar imunização.
Sete dias depois da administração final do imunógeno (Dia 21),0,1 mL de sangue foram retirados a partir do plexo venoso orbital e o sorocoletado a partir do sangue foi usado para estudar a produção de anticorposantiantígeno de vírus de Doença de Newcastle (IgG e IgA) pelo procedimen-to ELISA. Como um controle, foi usado soro que tinha sido obtido a partir decamundongos individuais que ainda deviam ser imunizados com o antígenode vírus de Doença de Newcastle (Dia 0).
Os resultados são mostrados na Figura 18. Na Figura 18, a co-luna negra mostra o resultado para a concentração de anticorpos do anticor-po IgG e as colunas brancas mostram os resultados para a concentração deanticorpos do anticorpo IgA. O símbolo "#" indica a presença de uma dife-rença significativa em ρ < 0,0027 a partir das concentrações de anticorposnos camundongos individuais antes de imunização (Dia 0) e o símbolo "*"indica a presença de uma diferença significativa em ρ < 0,00122. Os dadosmostram média ± erro padrão.
A partir dos resultados mostrados na Figura 18, pode ser vistoque, quando camundongos foram imunizados por administração transnasalda vacina em Iipossomas de SucPG - antígeno de vírus de Doença de New-castle, tanto a classe IgG quanto a classe IgA de anticorpo foram marcada-mente produzidos no corpo quando comparado com o caso do Dia O1 e, emgeral, a classe IgG de anticorpo tendeu a aumentar em um grau maior doque a classe IgA de anticorpo.
A partir desses resultados, mostrou-se que a imunização doscamundongos por administração transnasal (transmucósica) da vacina emIipossomas de SucPG - antígeno de vírus de Doença de Newcastle podeinduzir elevada produção de anticorpos no sangue.APLICABILIDADE INDUSTRIAL
Por uso dos veículos para vacina acima descritos, que compre-endem Iipossomas contendo poli(glicidol) succinilado, vacinas eficientes po-de ser obtidas, que conseguem aumentos marcantes em concentrações deanticorpos, quando comparado com o caso de uso de veículos para vacinasque compreendem os Iipossomas convencionais. Em adição, as vacinaspreparadas por uso dos veículos para vacina acima descritos são capazesde indução eficiente de não somente imunidade humoral, mas, também, i-munidade celular.LISTAGEM DE SEQÜENCIA
<110> Nippon Biologicals, Inc.
Veículo para vacinaN-79-1 (YCT-1236)JP 2006-0302462006-02-076
PatentIn versão 3.11
31DNA
Artificial
<120><130><150><151><160><170><210><211><212><213><220>
<223> Iniciador avante para amplificar gene de gama IFN de camundongo
<400> 1
tgcatcttgg cttgcagctc ttcctcatgg c 31
<210> 232DNA
Artificial
<211><212><213><220>
<223> Iniciador reverso para amplificar gene de gama IFN de camundongo
<400> 2
tggacctgtg ggttgttgac ctcaaacttg gc 32
<210> 3
32DNA
Artificial
<211><212><213><220><223><400>
Iniciador avante para amplificar gene de IL-4 de camundongo3
ccagctagtt gtcatcctgc tcttctttct cg
32<210> 4
<211> 32
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Iniciador reverso para amplificar gene de IL-4 de camundongo
<400> 4
cagtgatgtg gacttggact cattcatggt gc 32
<210> 5
accacagtcc atgccatcac
<210> 6
<211> 20
<212>DNA
<213> Artificial
<220>
<223> Iniciador avante para amplificar gene de G3PDH de camundongo.
<400>
<210>5
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223>Iniciador reverso para amplificar gene de G3PDH de camundongo.
<400> 6
tccaccaccc tgttgctgta

Claims (22)

1. Veículo para vacina compreendendo um Iipossoma contendopoli(glicidol) succinilado.
2. Veículo para vacina, de acordo com a reivindicação 1, o qualcontém 10 a 40% em peso de poli(glicidol) succinilado.
3. Veículo para vacina, de acordo com a reivindicação 2, o qualcontém 30% em peso de poli(glicidol) succinilado.
4. Veículo para vacina, de acordo com qualquer uma das reivin-dicações 1 a 3, no qual o lipídeo que compõe o Iipossoma compreendequalquer um de dioleil fosfatidiletanolamina (DOPE), distearoil fosfatidileta-nolamina (DSPE), dipalmitoil fosfatidilserina (DPPS), dipalmitoil fosfatidilcoli-na (DPPC), distearoil fosfatidilcolina (DSPC), dimiristoil fosfatidilcolina(DMPC), Iecitina de gema de ovo (PC de gema de ovo) ou colesterol, oucombinações de quaisquer dois ou mais dos mesmos.
5. Veículo para vacina, de acordo com qualquer uma das reivin-dicações 1 a 4, no qual o Iipossoma compreende a combinação de dioleilfosfatidiletanolamina (DOPE) e distearoil fosfatidiletanolamina (DSPE).
6. Veículo para vacina, de acordo com qualquer uma das reivin-dicações 1 a 5, o qual permite que o imunógeno contido no Iipossoma sejainternalizado dentro de uma célula que apresenta antígeno.
7. Veículo para vacina, de acordo com qualquer uma das reivin-dicações 1 a 6, o qual é para administração transmucósica do imunógenocontido no lipossoma.
8. Veículo para vacina, de acordo com qualquer uma das reivin-dicações 1 a 6, o qual é para administração não transmucósica do imunóge-no contido no lipossoma.
9. Vacina tendo um imunógeno incorporado em um veículo paravacina compreendendo um lipossoma contendo poli(glicidol) succinilado,imunógeno este deve ser administrado para imunização.
10. Vacina, de acordo com a reivindicação 9, a qual é para indu-ção de imunidade celular contra o imunógeno.
11. Vacina, de acordo com a reivindicação 10, a qual é tambémpara indução de imunidade humoral contra o imunógeno.
12. Vacina, de acordo com qualquer uma das reivindicações 9 a-11, a qual contém 10 a 40% em peso de poli(glicidol) succinilado no veículopara vacina.
13. Vacina, de acordo com a reivindicação 12, a qual contém-30% em peso de poli(glicidol) succinilado no veículo para vacina.
14. Vacina, de acordo com qualquer uma das reivindicações 9 a-13, na qual o lipídeo que compõe o Iipossoma do veículo para vacina com-preende qualquer um de dioleil fosfatidiletanolamina (DOPE), distearoil fosfa-tidiletanolamina (DSPE), dipalmitoil fosfatidilserina (DPPS), dipalmitoil fosfa-tidilcolina (DPPC), distearoil fosfatidilcolina (DSPC), dimiristoil fosfatidilcolina(DMPC), Iecitina de gema de ovo (PC de gema de ovo) ou colesterol, oucombinações de quaisquer dois ou mais dos mesmos.
15. Vacina, de acordo com qualquer uma das reivindicações 9 a-14, na qual o Iipossoma do veículo para vacina compreende a combinaçãode dioleil fosfatidiletanolamina (DOPE) e distearoil fosfatidiletanolamina(DSPE).
16. Vacina, de acordo com qualquer uma das reivindicações 9 a-15, a qual permite que o imunógeno contido no Iipossoma seja internalizadodentro de uma célula que apresenta antígeno.
17. Vacina, de acordo com qualquer uma das reivindicações 9 a-16, a qual é para administração transmucósica do imunógeno.
18. Vacina, de acordo com qualquer uma das reivindicações 9 a-16, a qual é para administração não transmucósica do imunógeno.
19. Vacina, de acordo com qualquer uma das reivindicações 9 a-18, na qual o imunógeno é selecionado a partir do grupo consistindo em an-tígenos derivados a partir de qualquer um de uma bactéria, um vírus e umprotozoário.
20. Vacina, de acordo com a reivindicação 19, na qual a bactériaé selecionada dentre Salmonella, Staphylococcus aureus, Aeromonas e My-coplasma.
21. Vacina, de acordo com a reivindicação 19, na qual o vírus évírus da Doença de Newcastle.
22. Vacina, de acordo com a reivindicação 19, na qual o proto-zoário é Trypanosoma.
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