BRPI0709726A2

BRPI0709726A2 - purificaÇço de anticorpo

Info

Publication number: BRPI0709726A2
Application number: BRPI0709726-3A
Authority: BR
Inventors: M. Wan Min; Avgeninos George; Zarbis-Papastoitsis Gregory
Original assignee: Abbott Biotechnology Ltd.
Priority date: 2006-04-05
Filing date: 2007-04-04
Publication date: 2011-07-26
Also published as: WO2007117490A3; US20150361168A1; US20180036407A1; KR20140071452A; JP2018172416A; US7863426B2; US20130280267A1; WO2007117490A2; US20170136122A1; EP2738179A1; IL194236A; CA2911000A1; US20130309242A1; US9913902B2; US8231876B2; US20150361169A1; US8906372B2; TW200808821A; US20150307605A1; US8916153B2

Abstract

PURIFICAÇçO DE ANTICORPO A invenção fornece um método para produzir uma preparação de anticorpo reduzido de proteína de célula hospedeira (HCP) de uma mistura compreendendo um anticorpo e pelo menos uma HCP, compreendendo uma etapa de separação de permuta de íon onde a mistura está sujeita a um primeiro material de permuta de íon, tal que a preparação do anti-corpo HCP reduzido é obtido.

Description

"PURIFICAÇAO DE ANTICORPO" 1 '

Aplicações Relacionadas ι

Aplicação de prioridade das reivindicações para Pedido Provisional dos Estados U-nidos No. de Série 60/789.725, depositado em 5 abril de 2006 e para o Pedido Provisionaldos Estados Unidos No. de Série 60/790.414, depositado em 6 de abril de 2006, os conteú-dos de cada um dos quis são incorporados aqui em sua totalidade.

Antecedente da Invenção

Em larga escala, a purificação econômica de proteínas é cada vez mais um pro-blema importante para a indústria de biotecnologia. De modo geral, as proteínas são produ-zidas por cultura celular, empregando quaisquer linhas de célula bacteriana ou de mamíferoplanejadas para produzir a proteína de interesse por inserção de um plasmídeo o recombi-nante compreendendo o gene para aquela proteína. Uma vez que as linhas de célula em-pregadas são de organismos vivos, elas devem ser alimentadas por meio de crescimentocomplexo, compreendendo açúcares, aminoácidos, e fatores de crescimento, usualmentesuprido por preparações de soro de animal. A separação da proteína desejada da misturade alimentos de compostos para as células e dos produtos derivados das próprias célulaspara uma pureza suficiente para usar como uma terapêutica humana apresenta um desafioformidável.

Sumário da Invenção

Há uma necessidade de métodos melhorados de obtenção de preparações de anti-corpo compreendendo uma quantidade reduzida de proteína de célula hospedeira, incluindoprocatepsina L. A invenção fornece um método para purificação de anticorpos expressadosem um sistema de expressão de célula hospedeira, onde a preparação de anticorpo resul-tante compreende uma quantidade reduzida de proteína de célula hospedeira, incluindo pro-catepsina L. O método melhorado da invenção também inclui o desenvolvimento de méto-dos reproduzíveis de proteínas de célula hospedeira acuradamente detectada, e um ensaiocinético.

A invenção fornece um método para produzir uma preparação de anticorpo de pro-teína de célula hospedeira (HCP) reduzida de uma mistura compreendendo um anticorpo epelo menos uma HCP, compreendendo uma etapa de separação por permuta de íon, ondea mistura é submetida a um primeiro material de permuta de íon, tal que a preparação deanticorpo de HCP reduzida é obtida. Em uma modalidade, a etapa de separação por permu-ta de íon compreende passar a mistura sobre o primeiro material de permuta de íon tal queum primeiro eluído tendo um nível reduzido de HCP é obtido. Em uma modalidade, o méto-do da invenção ainda compreende uma segunda etapa de separação por permuta de íon noqual o primeiro eluído é submetido a um segundo material de permuta de íon tal que umprimeiro fluxo atravessante tendo um nível reduzido de HCP é obtido. Em outra modalidade,o método da invenção ainda compreende uma etapa de separação por interação hidrofóbicaonde o primeiro fluxo atravessante é submetido a um primeiro material de interação hidrofó-bico tal que um segundo eluído tendo um nível reduzido de HCP é obtido.

Em uma modalidade da invenção, a etapa de separação por permuta de íon com-preende uma etapa de cromatografia de permuta de íon, onde a mistura é carregada emuma coluna compreendendo o primeiro material de permuta de íon, tal que um primeiro eluí-do tendo um nível reduzido de HCP é obtido. Em uma modalidade, a invenção ainda com-preende uma segunda etapa de cromatografia de permuta de íon compreendendo carregaro primeiro eluído em uma coluna compreendendo um segundo material de permuta de íon,tal que um primeiro fluxo atravessante é obtido.

Em uma modalidade, a invenção ainda compreende uma etapa de separação porinteração hidrofóbica compreendendo carregar o primeiro fluxo atravessante em uma colunacompreendendo um primeiro material de interação hidrofóbica, tal que o segundo eluído éobtido. Em uma modalidade, a etapa de separação por interação hidrofóbica compreendecromatografia de interação hidrofóbica. Em uma modalidade, a cromatografia de interaçãohidrofóbica é cromatografia de sefarose de fenila. Ainda em outra modalidade, a quantidadede anticorpo carregado no material de interação hidrofóbica varia de cerca de 20 a cerca de40 gramas de anticorpo por litro de material de interação hidrofóbica. Ainda em outra moda-lidade, a quantidade de anticorpo carregado no material de interação hidrofóbica varia decerca de 30 a cerca de 36 gramas de anticorpo por litro de material de interação hidrofóbica.

Em uma modalidade, a etapa de cromatografia de permuta de íon é cromatografiade permuta de cátion. Em outra modalidade, a cromatografia de permuta de cátion é ummetacrilato sintético com base em resina polimérica ligada a um grupo de sulfonato. Aindaem outra modalidade, a invenção ainda compreende lavar o material de permuta de íon comuma pluralidade de etapas de lavagem. Em uma modalidade, a pluralidade das etapas delavagem compreende um aumento em condutividade. Em uma modalidade, o material depermuta de íon é lavado com uma lavagem compreendendo cerca de 40-50% de tampão deeluição e cerca de 50-60% de água (por exemplo, água para injeção (WFI)). Em uma moda-lidade, o tampão de eluição é de 20 mM de Na2PO4, 150 mM de cloreto de sódio, pH 7.

Em uma modalidade, o primeiro eluído é submetido a inativação viral antes da pri-meira etapa de cromatografia de permuta de íon. Em uma modalidade, a inativação viral éobtida através de inativação viral por pH (por exemplo, inferior ao pH do primeiro eluído pa-ra, desse modo, inativar o vírus).

Em uma modalidade da invenção, a segunda etapa de cromatografia de permuta deíon compreende cromatografia de permuta de ânion. Em uma modalidade, a cromatografiade permuta de ânion é cromatografia Q sefarose.

A invenção, também, fornece um método para produzir uma preparação de anticor-po de proteína de célula hospedeira (HCP) reduzida de uma mistura compreendendo umanticorpo e pelo menos uma HCP1 onde o nível reduzido de HCP é obtido por alterar o pH ea condutividade do primeiro eluído tal que o pH e a condutividade do primeiro eluído estásubstancialmente similar ao pH e a condutividade do segundo material de permuta de íon.

Em uma modalidade, o pH do segundo material de permuta de íon varia de cerca de 7,7 acerca de 8,3. Em outra modalidade, o pH do primeiro eluído é alterado para variar de cercade 7,7 a cerca de 8,3. Também em outra modalidade, o pH do primeiro eluído é alteradopara cerca de 8,0. Em uma modalidade, a condutividade do segundo material de permuta deíon varia de cerca de 3,5 mS/cm a cerca de 5,2 mS/cm, ou de cerca de 3,5 mS/cm a cerca de 4,9 mS/cm. Em uma modalidade, a condutividade do primeiro eluído é alterada para vari-ar de cerca de 3,5 mS/cm a cerca de 5,2 mS/cm ou de cerca de 3,5 mS/cm a cerca de 4,9mS/cm.

Em uma modalidade da invenção, o primeiro eluído compreende uma variação decerca de 90 a cerca de 100 vezes menos HCP do que a mistura como determinado por umensaio imunossorvente ligado a enzima da HCP. Em outra modalidade, primeiro fluxo atra-vessante compreende uma variação de cerca de 840 a cerca de 850 vezes menos HCP doque o primeiro eluído como determinado por um ensaio imunossorvente ligado a enzima daHCP. Ainda em outra modalidade, o segundo eluído compreende uma variação de cerca de3 a cerca de 5 vezes menos HCP do que o primeiro fluxo atravessante como determinado por um ensaio imunossorvente ligado a enzima da HCP.

A invenção fornece um método para produzir uma preparação de anticorpo de pro-catepsina L reduzida de uma mistura compreendendo um anticorpo e procatepsina L, com-preendendo uma etapa de separação por permuta de íon onde a mistura é submetida a umprimeiro material de permuta de íon, tal que a preparação de anticorpo de procatepsina L reduzida é obtida.

Em uma modalidade, a etapa de separação por permuta de íon compreende passara mistura sobre o primeiro material de permuta de íon tal que um primeiro eluído tendo umnível reduzido de procatepsina L é obtido. Em uma modalidade, a etapa de separação porpermuta de íon compreende uma primeira etapa de cromatografia de permuta de íon, ondea mistura é carregada em uma coluna compreendendo o primeiro material de permuta deíon, tal que um primeiro eluído tendo um nível reduzido de procatepsina L é obtido.

Em uma modalidade, a invenção também compreende uma segunda etapa de se-paração por permuta de íon onde o primeiro eluído é submetido a um segundo material depermuta de íon tal que um primeiro fluxo atravessante tendo um nível reduzido de procatep-sina L é obtido. Em uma modalidade, a invenção ainda compreende uma segunda etapa decromatografia de permuta de íon compreendendo carregar o primeiro eluído em uma colunacompreendendo um segundo material de permuta de íon, tal que um primeiro fluxo através-sante é obtido.

Em uma modalidade, a invenção ainda compreende uma etapa de separação porinteração hidrofóbica onde o primeiro fluxo atravessante é submetido a um primeiro materialde interação hidrofóbico tal que um segundo eluído tendo um nível reduzido de procatepsinaL é obtido. Em outra modalidade, a invenção ainda compreende uma etapa de separaçãopor interação hidrofóbica compreendendo carregar o primeiro fluxo atravessante em umacoluna compreendendo um primeiro material de interação hidrofóbica, tal que um segundoeluído é obtido.

Em uma modalidade, a etapa de cromatografia de permuta de íon é cromatografiade permuta de cátion, incluindo, mas não limitada a um metacrilato sintético com base emresina polimérica ligada a um grupo de sulfonato.

Em outra modalidade, a etapa de cromatografia de permuta de íon ainda compre-ende lavar o material de permuta de íon com uma pluralidade de etapas de lavagem. Emuma modalidade, a pluralidade das etapas de lavagem compreende um aumento na condu-tividade. Em uma modalidade, o material de permuta de íon é lavado com um tampão delavagem compreendendo de cerca de 40-50% de tampão de eluição e de cerca de 50-60%de água (por exemplo, água por injeção (WFI)). Ainda em outra modalidade, o tampão deeluição é de 20 mM de Na2PO4, 150 mM de cloreto de sódio, pH 7.

Em uma modalidade da invenção, o primeiro eluído é submetido a inativação viralantes da etapa de cromatografia de permuta de íon. Em uma modalidade, a inativação vira!é obtida através inativação viral por pH (por exemplo, redução do pH do primeiro eluído pa-ra, desse modo, inativar o vírus).

Em uma modalidade, a etapa de cromatografia de permuta de íon compreendecromatografia de permuta de ânion. Em uma modalidade, a cromatografia de permuta deânion é cromatografia Q sefarose.

A invenção também descreve um método no qual o nível reduzido de procatepsinaL é conseguido por alterar o pH e a condutividade do primeiro eluído tal que o pH e a condu-tividade do primeiro eluído é substancialmente similar a pH e a condutividade do segundomaterial de permuta de íon. Em uma modalidade, o pH do segundo material de permuta deíon varia de cerca de 7,7 a cerca de 8,3. Em outra modalidade o pH do primeiro eluído éalterado para variar de cerca de 7,7 para cerca de 8,3. Ainda em outra modalidade na qual opH do primeiro eluído é alterado para cerca de 8,0. Ainda em outra modalidade, a condutivi-dade do segundo material de permuta de íon varia de cerca de 3,5 mS/cm a cerca de 5,2mS/cm, ou de cerca de 3,5 mS/cm a cerca de 4,9 mS/cm. Em uma modalidade, a condutivi-dade do primeiro eluído é alterada para variar de cerca de 3,5 mS/cm a cerca de 5,2 mS/cm,ou de cerca de 3,5 mS/cm a cerca de 4,9 mS/cm.

Em uma modalidade da invenção, a etapa de separação por interação hidrofóbicacompreende cromatografia de interação hidrofóbica. Em uma modalidade, a cromatografiade interação hidrofóbica é cromatografia de sefarose de fenila. Ainda em outra modalidade,a quantidade de anticorpo carregado no material de interação hidrofóbica varia de cerca de20 a cerca de 40 gramas de anticorpo por litro de material de interação hidrofóbica. Ainda em outra modalidade, a quantidade de anticorpo carregado no material de interação hidrofó-bica varia de cerca de 30 a cerca de 36 gramas de anticorpo por litro de material de intera-ção hidrofóbica .

Em uma modalidade, o primeiro eluído compreende atividade de catepsina L vari-ando entre cerca de 25 a 60 RFU/s/mg de anticorpo como medido por um ensaio cinético de catepsina L.

Em outra modalidade, o primeiro fluxo atravessante compreende atividade de ca-tepsina L variando entre cerca de 0,4 a cerca de 4 RFU/s/mg de anticorpo como medido porum ensaio cinético de catepsina L.

Ainda em outra modalidade, o segundo eluído compreende atividade de catepsina Lvariando entre cerca de 0,5 a cerca de 1,5 RFU/s/mg de anticorpo como medido por um en-saio cinético de catepsina L.

Em uma modalidade da invenção, o nível de procatepsina L é reprodutivelmentebaixo.

Em um aspecto particularmente preferido, a invenção fornece métodos de purifica- ção de anticorpo em que as quantidades elevadas de uma mistura de anticorpo de HCPpodem ser carregadas em uma resina de permuta de íon para obter redução em HCP namistura. Esta metodologia tem a vantagem que pode ser empregada com misturas de anti-corpo de HCP que não foi submetida à captura da proteína A antes da aplicação da misturade anticorpo de HCP à resina de permuta de íon. A captura da proteína A, na qual uma mis- tura de anticorpo de HCP é aplicada a uma coluna de proteína A tal que o anticorpo se liga aproteína A e ao fluxo atravessante de HCPs, tipicamente é empregada como uma etapa depurificação inicial em procedimentos de purificação de anticorpo como um meio para remo-ver as HCPs. Deste modo, os métodos da invenção são úteis para purificação de cargasgrandes de misturas de anticorpo de HCP sem a necessidade de executar uma cromatogra-fia de proteína A com uma etapa inicial.

Deste modo, em uma modalidade, a invenção fornece um método para produziruma preparação de anticorpo reduzido de proteína de célula hospedeira (HCP) de uma mis-tura compreendendo um anticorpo e pelo menos uma HCP, o método compreende:

(a) aplicar a mistura a uma primeira resina de permuta de íon em um tampão de equilíbrio onde mais do que 30 gramas de anticorpo por litro de resina são aplicadas;

(b) lavar a HCP da resina com uma pluralidade de etapas de lavagem; e

(e) eluir o anticorpo da resina com um tampão de eluição para formar um primeiroeluído,

tal que a preparação do anticorpo de HCP reduzido é obtida.

Em outra modalidade, cerca de 35-70 gramas de anticorpo por litro de resina sãoaplicadas. Ainda em outra modalidade, cerca de 70 gramas de anticorpo por litro de resinasão aplicadas. Em uma modalidade preferida, a mistura compreendendo um anticorpo epelo menos uma HCP não é submetida à captura da proteína A (por exemplo, não é aplica-da a coluna de proteína A) antes de aplicar a mistura à primeira resina de permuta de íon.

Preferivelmente, a pluralidade de etapas de lavagem compreende pelo menos umaprimeira lavagem e uma segunda lavagem, onde há um aumento na condutividade da pri-meira lavagem para a segunda lavagem. Mais preferivelmente, a primeira lavagem é comtampão de equilíbrio e a segunda lavagem é com uma mistura de tampão de eluição e água(por exemplo, WFI). Por exemplo, a mistura de tampão de eluição e água pode compreen-der cerca de 40-50% de tampão de eluição e cerca de 50-60% de água. Mais preferivelmen-te, a mistura de tampão de eluição e água pode compreender cerca de 45% de tampão deeluição e cerca de 55% de água. Em uma modalidade preferida, o tampão de eluição com-preende 20 mM de fosfato de sódio e 150 mM de cloreto de sódio. Nesta situação, uma mis-tura de tampão de eluição e água que é 45% de tampão de eluição e de cerca de 55% deágua é 9 mM de fosfato de sódio e 68 mM de cloreto de sódio. Em uma modalidade preferi-da, a primeira lavagem é com um tampão de equilíbrio compreendendo 20 mM de fosfato,25 mM de cloreto de sódio, a segunda lavagem é com um tampão compreendendo 9 mM defosfato, 68 mM de cloreto de sódio (45% de tampão de eluição, 55% de água) e o tampãode eluição compreende 20 mM de fosfato de sódio e 150 mM de cloreto de sódio.

Em uma modalidade, o método empregando a primeira resina de permuta de íon érealizado em pH 7. Em outra modalidade, o método empregando a primeira resina de per-muta de íon é realizado em pH 5. Ainda em outra modalidade, o método empregando a pri-meira resina de permuta de íon é realizado em um pH em uma faixa de cerca de pH 5 a cer-ca de pH 7, ou uma faixa de pH 5 a pH 7. Onde o pH 7 é empregado, preferivelmente cercade 35 gramas de anticorpo por litro de resina é aplicada. Onde o pH 5 é empregado, preferi-velmente cerca de 70 gramas de anticorpo por litro de resina é aplicada. Onde um pH nafaixa de cerca de pH 5 a cerca de pH 7 (por exemplo, pH 5 a pH 7) é empregado, preferi-velmente uma quantidade de anticorpo de cerca de 35 a cerca de 70 gramas de anticorpopor litro de resina (por exemplo, 35-70 gramas de anticorpo por litro de resina) é aplicada.

Em uma modalidade preferida, a melhor depuração da HCP da mistura de anticorpoda HCP é obtida (por exemplo, em pH 5) por carregar mais anticorpo na resina (por exem-pio, cerca de 70 gramas de anticorpo por litro de resina) que é obtida quando menos anti-corpo (por exemplo, cerca de 30 gramas de anticorpo por litro de resina) é carregado naresina. É pensado ser o resultado do descolamento da HCP da resina pelo anticorpo quandoas condições são empregadas em que a afinidade da ligação do anticorpo para a resina ésignificativamente maior do que aquela da HCP para a resina.

Preferivelmente1 a primeira resina de permuta de íon é uma resina de permuta decátión. Preferivelmente, a resina de permuta de cátion é formada em uma coluna e a misturacompreendendo o anticorpo e pelo menos uma HCP é aplicada à coluna. Preferivelmente, aresina de permuta de cátion compreende um metacrilato sintético com base em resina poli-mérica ligada a um grupo de sulfonato (por exemplo, Fractogel S). Alternativamente, a resi-na de permuta de cátion pode compreender, por exemplo, metacrilato ou poliestireno combase em polímeros sintéticos, sílica, agarose altamente reticulada com extensor de superfí-cie dextrana, copolímero reticulado de dextrana de alila e resinas de bisacrila de metileno N.N. ligadas a um grupo de sulfanato, tais como íons sulfônicos ou sulfoetila.

Em outro aspecto da invenção, após o método empregando a primeira resina depermuta de íon descrito acima é realizado, o método ainda compreende submeter o primeiroeluído a uma etapa de inativação viral. Por exemplo, onde a inativação viral pode ser obtidapor inativação viral por pH para formar uma preparação viralmente inativada (por exemplo, oprimeiro eluído é submetido a condições de pH baixo, tal como pH de cerca de 3,5, para,desse modo, inativar o vírus). Preferivelmente, a preparação viralmente inativada é aplicadaa uma segunda resina de permuta de íon, onde, antes de aplicar a preparação viralmenteinativada à segunda resina de permuta de íon, pH e condutividade da preparação viralmenteinativada é ajustada ser substancialmente similar a pH e condutividade da segunda resinade permuta de íon. Por exemplo, o pH da segunda resina de permuta de íon pode ser emuma faixa de cerca de pH 7,7 a cerca de pH 8,3 e o pH da preparação viralmente inativada éajustado ser em uma faixa de cerca de pH 7,7 a cerca de pH 8,3. Em outra modalidade, opH da segunda resina de permuta de íon pode ser em uma faixa de cerca de pH 7,8 a cercade pH 8,2 e o pH da preparação viralmente inativada é ajustada ser em uma faixa de cercade pH 7,8 a cerca de pH 8,2. Mais preferivelmente, o pH da segunda resina de permuta deíon é de cerca de pH 8,0 e o pH da preparação viralmente inativada é ajustada ser de cercade pH 8,0. Além disso, a condutividade da segunda resina de permuta de íon pode ser emuma faixa de cerca de 3,5 mS/cm a cerca de 5,2 mS/cm e a condutividade da preparaçãoviralmente inativada é ajustada ser em uma faixa de cerca de 3,5 mS/cm a cerca de 5,2mS/cm. Preferivelmente, a condutividade da segunda resina de permuta de íon é de cercade 5,0 mS/cm e a condutividade da preparação viralmente inativada é ajustada ser de cercade 5,0 mS/cm.

Em uma modalidade preferida, a segunda resina de permuta de íon é uma resinade permuta de íon. Por exemplo, a resina de permuta de ânion pode ser uma resina Q sefa-rose. Preferivelmente, a segunda resina de permuta de íon é formada em uma coluna e apreparação viralmente inativada é aplicada à coluna tal que um primeiro fluxo atravessante éobtido.

Em outro aspecto da invenção, após o primeiro fluxo atravessante é obtido da se-gunda resina de permuta de íon, o primeiro fluxo atravessante pode ser aplicada a uma co-luna de interação hidrofóbica tal que um segundo eluído é obtido. Em uma modalidade pre- ferida, a coluna de interação hidrofóbica é uma coluna de sefarose de fenila. Em uma moda-lidade, o primeiro fluxo atravessante aplicado à coluna de interação hidrofóbica compreendede cerca de 20 a cerca de 40 gramas de anticorpo por litro de material de coluna de intera-ção hidrofóbica. Em outra modalidade, o primeiro fluxo atravessante aplicado à coluna deinteração hidrofóbica compreende de cerca de 30 a cerca de 36 gramas de anticorpo porlitro de material de coluna de interação hidrofóbica. Devido à eficiência das etapas anterio-res no processo de purificação, foi achado que não é necessário para o paciente o segundoeluído, obtido da coluna de interação hidrofóbica, para fracionamento máximo do produto.Deste modo, em uma modalidade, o segundo eluído não é submetido ao fracionamento má-ximo do produto.

Em uma modalidade particularmente preferida, o método da invenção para produziruma preparação de anticorpo de proteína de célula hospedeira (HCP) reduzida de uma mis-tura compreendendo um anticorpo e pelo menos uma HCP compreende:

(a) aplicar a mistura a uma resina de permuta de cátion em um tampão de equilíbrioonde a mistura não tem sido submetida à captura da proteína A antes de aplicar à resina depermuta de cátion e onde mais do que 30 gramas de anticorpo por litro de resina são aplica-das;

(b) lavar a HCP da resina de permuta de cátion com uma pluralidade de etapas delavagem;

(c) eluir o anticorpo da resina de permuta de cátion com um tampão de eluição paraformar um primeiro eluído;

(d) submeter o primeiro eluído a uma etapa de inativação viral;

(e) aplicar a preparação viralmente inativada a uma resina de permuta de ânion pa-ra obter um primeiro fluxo atravessante; e

(f) aplicar o primeiro fluxo atravessante a uma coluna de interação hidrofóbica talque um segundo eluído é obtido;

tal que a preparação de anticorpo de HCP reduzido é obtida.

Em uma modalidade, a resina de permuta de cátion é em pH 7 e cerca de 35 gra-mas de anticorpo por litro de resina são aplicados. Em outra modalidade, a resina de permu-ta de cátion é em pH 5 e cerca de 70 gramas de anticorpo por litro de resina são aplicadas.Ainda em outra modalidade, o pH é em uma faixa de cerca de pH 5 a cerca de pH 7 {porexemplo, pH 5 a pH 7) e uma quantidade de anticorpo de cerca de 35 a cerca de 70 gramasde anticorpo por litro de resina (por exemplo, 35-70 gramas de anticorpo por litro de resina)é aplicada.

Preferivelmente, a pluralidade das etapas de lavagem compreende lavar a resinacom uma primeira lavagem empregando o tampão de equilíbrio e uma segunda lavagemempregando uma mistura do tampão de eluição e água. Por exemplo, a mistura de tampão de eluição e água podem compreender cerca de 40-50% de tampão de eluição e cerca de50-60% de água (por exemplo, WFI), mais preferivelmente cerca de 45% de tampão de elui-ção e cerca de 55% de água (por exemplo, WFI). Em uma modalidade preferida, o tampãode eluição compreende 20 mM de fosfato de sódio e 150 mM de cloreto de sódio. Nestasituação, uma mistura de tampão de eluição e água que é 45% de tampão de eluição e cer- ca de 55% de água é 9 mM de fosfato de sódio e 68 mM de cloreto de sódio. Em uma mo-dalidade preferida, a primeira lavagem é com um tampão de equilíbrio compreendendo 20mM de fosfato, 25 mM de cloreto de sódio, a segunda lavagem é com um tampão compre-endendo 9 mM de fosfato, 68 mM de cloreto de sódio (45% de tampão de eluição, 55% deágua) e o tampão de eluição compreende 20 mM de fosfato de sódio e 150 mM de cloreto de sódio.

Preferivelmente, no método descrito acima com as etapas de (a) até (f), antes deaplicar a preparação viralmente inativada à resina de permuta de íon ânion (isto é, entre asetapas (d) e (e)), pH e condutividade da preparação viralmente inativada é ajustada sersubstancialmente similar a pH e condutividade da resina de permuta de íon. Por exemplo, o pH da segunda resina de permuta de íon pode ser em uma faixa de cerca de pH 7,7 a cercade pH 8,3 e o pH da preparação viralmente inativada é ajustada ser em uma faixa de cercade pH 7,7 a cerca de pH 8,3. Em outra modalidade, o pH da segunda resina de permuta deíon pode ser em uma faixa de cerca de pH 7,8 a cerca de pH 8,2 e o pH da preparação vi-ralmente inativada é ajustada ser em uma faixa de cerca de pH 7,8 a cerca de pH 8,2. Mais preferivelmente, o pH da segunda resina de permuta de íon é de cerca de pH 8,0 e o pH dapreparação viralmente inativada é ajustada ser de cerca de pH 8,0. Além disso, a condutivi-dade da segunda resina de permuta de íon pode ser em uma faixa de cerca de 3,5 mS/cm acerca de 5.2 mS/cm e a condutividade da preparação viralmente inativada é ajustada ser emuma faixa de cerca de 3,5 mS/cm a cerca de 5.2 mS/cm. Preferivelmente, a condutividade da segunda resina de permuta de íon é de cerca de 5,0 mS/cm e a condutividade da prepa-ração viralmente inativada é ajustada ser de cerca de 5,0 mS/cm.

No método descrito acima com as etapas de (a) até (f), preferivelmente a resina depermuta de cátion é uma resina polimérica com base em metacrilato sintético ligada a umgrupo de sulfonato (por exemplo, Fractogel), a resina de permuta de ânion é uma resina Qsefarose e a coluna de interação hidrofóbica é uma coluna de sefarose de fenila.

Preferivelmente, o primeiro eluído compreende uma faixa de cerca de 90 a cerca de100 vezes menos de HCP do que a mistura como determinado por um ensaio imunossor-vente ligado a enzima da HCP. Preferivelmente, o primeiro fluxo atravessante compreendeuma faixa de cerca de 840 a cerca de 850 vezes menos de HCP do que o primeiro eluídocomo determinado por um ensaio imunossorvente ligado a enzima da HCP. Preferivelmente,o segundo eluído compreende uma faixa de cerca de 3 a cerca de 5 vezes menos da HCP do que o primeiro fluxo atravessante como determinado por um ensaio imunossorvente liga-do a enzima da HCP.

(a) aplicar a mistura a uma resina de permuta de cátion em um tampão de equilí-brio, onde a resina de permuta de cátion está em pH 7 e cerca de 35 gramasde anticorpopor litro de resina são aplicados, ou a resina de permuta de cátion está em um pH em umafaixa de pH 5 a pH 7 e cerca de 35 a cerca de 70 gramas de anticorpo por litro de resina sãoaplicadas, ou a resina de permuta de cátion está em pH 5 e cerca de 70 gramas de anticor-po por litro de resina são aplicadas;

(b) lavar a HCP da resina de permuta de cátion com etapas de lavagem compreen-dendo uma primeira lavagem empregando o tampão de equilíbrio e uma segunda lavagemempregando uma mistura de um tampão de eluição e água;

(c) eluir o anticorpo da resina de permuta de cátion com o tampão de eluição para formar um primeiro eluído;

(d) submeter o primeiro eluído a uma etapa de inativação viral, onde a inativação vi-ral é obtida por inativação viral por pH para formar uma preparação viralmente inativada;

(e) aplicar a preparação viralmente inativada a uma resina de permuta de ânion,onde, antes de aplicar a preparação viralmente inativada à resina de permuta de íon ânion,

pH e condutividade da preparação viralmente inativada é ajustada ser substancialmentesimilar para pH e condutividade da resina de permuta de ânion, tal que um primeiro fluxoatravessante é obtido; e

(f) aplicar ao primeiro fluxo atravessante a uma coluna de interação hidrofóbica talque um segundo eluído é obtido;

tal que a preparação do anticorpo de HCP reduzido é obtida.

Preferivelmente, a mistura de anticorpo não foi submetida à captura de uma proteí-na A antes de aplicar a resina de permuta de cátion. Preferivelmente, a mistura de tampãode eluição e água compreende cerca de 40-50% de tampão de eluição e cerca de 50-60%de água, mais preferivelmente cerca de 45% de tampão de eluição e cerca de 55% de água (por exemplo, WFI). Em uma modalidade preferida, o tampão de eluição compreende 20mM de fosfato de sódio e 150 mM de cloreto de sódio. Nesta situação, uma mistura de tam-pão de eluição e água que é de 45% de tampão de eluição e de cerca de 55% de água é 9mM de fosfato de sódio e 68 mM de cloreto de sódio. Em uma modalidade preferida, a pri-meira lavagem é com um tampão de equilíbrio compreendendo 20 mM de fosfato, 25 mM decloreto de sódio, a segunda lavagem é com um tampão compreendendo 9 mM de fosfato,68 mM de cloreto de sódio (45% tampão de eluição, 55% de água) e o tampão de eluiçãocompreende 20 mM de fosfato de sódio e 150 mM de cloreto de sódio. Preferivelmente, oprimeiro eluído compreende uma faixa de cerca de 90 a cerca de 100 vezes menos de HCPdo que a mistura como determinado por um ensaio imunossorvente ligado a enzima daHCP. Preferivelmente, o primeiro fluxo atravessante compreende uma faixa de cerca de 840a cerca de 850 vezes menos de HCP do que o primeiro eluído como determinado por umensaio imunossorvente ligado a enzima da HCP. Preferivelmente, o segundo eluído com-preende uma faixa de cerca de 3 a cerca de 5 vezes menos de HCP do que o primeiro fluxoatravessante como determinado por um ensaio imunossorvente ligado a enzima da HCP.

Em um aspecto preferido de quaisquer métodos de purificação descrito acima, aHCP compreende procatepsina L tal que uma preparação de anticorpo de procatepsina Lreduzida é obtida. Preferivelmente, o eluído compreende a atividade de catepsina L variandoentre cerca de 25 a cerca de 60 RFU/s/mg de anticorpo como medido por um ensaio cinéti-co de catepsina L. Preferivelmente, o primeiro fluxo atravessante compreende a atividade decatepsina L variando entre cerca de 0,4 a cerca de 4 RFU/s/mg de anticorpo como medidopor um ensaio cinético de catepsina L. Preferivelmente, o segundo eluído compreende aatividade de catepsina L variando de entre cerca de 0,5 a cerca de 1,5 RFU/s/mg de anti-corpo como medido por um ensaio cinético de catepsina L. Preferivelmente, o nível de pro-catepsina L é reprodutivelmente baixo.

Ainda em outro aspecto, a invenção pertence a um método para produzir uma pre-paração de anticorpo de proteína de célula hospedeira (HCP) reduzida de uma misturacompreendendo um anticorpo e pelo menos uma HCP, o método compreende:

(a) aplicar a mistura a uma resina de permuta de cátion para obter um primeiro elu-ído;

(b) aplicar o primeiro eluído a uma resina de permuta de íon ânion para obter umprimeiro fluxo atravessante; e

(c) aplicar o primeiro fluxo atravessante a uma coluna de interação hidrofóbica talque o segundo eluído é obtido;

tal que a preparação de anticorpo de HCP reduzida é obtida.

Preferivelmente, a mistura compreendendo um anticorpo e pelo menos uma HCPnão é submetida para capturar a proteína A antes de aplicar a mistura à primeira resina depermuta de íon. Preferivelmente, o método ainda compreende submeter o primeiro eluído auma etapa de inativação viral antes de aplicar o primeiro eluído à resina de permuta de íon.Por exemplo, inativação viral pode ser obtida por inativação viral por pH.Preferivelmente, a resina de permuta de cátion compreende um metacrilato sintéti-co com base em resina polimérica ligada a um grupo de sulfonato (por exemplo, a resina depermuta de cátion pode ser uma coluna de Fractogel S). Por exemplo, uma coluna de Frac-togel S pode ser equilibrada com um tampão de equilíbrio compreendendo 20 mM de fosfatode sódio, 25 mM de cloreto de sódio, a mistura pode ser aplicada à coluna, a coluna podeser pelo menos lavada uma vez com tampão de equilíbrio e o primeiro eluído pode ser obti-do por eluição com um tampão de eluição compreendendo 20 mM de fosfato de sódio, 150mM de cloreto de sódio.

Preferivelmente, a resina de permuta de ânion é uma coluna de Q sefarose. Porexemplo, uma coluna de Q sepharose pode ser equilibrada com um tampão de equilíbriocompreendendo 25 mM de trolamina, 40 mM de cloreto de sódio, pH 7,6.

Preferivelmente, a coluna de interação hidrofóbica é uma coluna de sefarose de fe-nila. Por exemplo, uma coluna de sefarose de fenila pode ser equilibrada com um tampão deequilíbrio compreendendo 20 mM de fosfato de sódio, 1,1 M (NH4)2SO4, pH 7, o primeirofluxo atravessante pode ser aplicado à coluna, a coluna pode ser pelo menos lavada umavez com tampão de equilíbrio e o segundo eluído pode ser obtido por desempenhar umaetapa gradiente de sal para 11 mM de fosfato de sódio, 0,625 M (NH4)2SO4, pH 7,0.

Preferivelmente, a inativação viral por pH é obtida por manter o primeiro eluído empH 3,5 durante aproximadamente uma hora.

Ainda em outro aspecto, a invenção pertence a um método para produzir uma pre-paração de adalimumabe de proteína de célula hospedeira (HCP) reduzida de uma misturacompreendendo adalimumabe e pelo menos uma HCP, o método compreende:

(a) aplicar a mistura a uma resina de permuta de cátion, onde a mistura não é sub-metida para capturar uma proteína A antes de aplicar a mistura à primeira resina de permutade íon, para obter um primeiro eluído;

(b) submeter o primeiro eluído a inativação viral por pH para obter uma preparaçãoviralmente inativada;

(c) aplicar a preparação viralmente inativada a uma resina de permuta de íon ânionpara obter um primeiro fluxo atravessante; e

(c) aplicar o primeiro fluxo atravessante a uma coluna de interação hidrofóbica talque um segundo eluído é obtido;

tal que a preparação de adalimumabe de HCP reduzida é obtida.

Preferivelmente, a resina de permuta de cátion é uma coluna de Fractogel S, a re-sina de permuta de ânion é uma coluna Q sefarose e a coluna de interação hidrofóbica éuma coluna de sefarose de fenila. Por exemplo, uma coluna de Fractogel S pode ser equili-brada com um tampão de equilíbrio compreendendo 20 mM de fosfato de sódio, 25 mM decloreto de sódio, a mistura pode ser aplicada à coluna, a coluna pode ser pelo menos umavez lavada uma vez com tampão de equilíbrio e o primeiro eluído pode ser obtido por elui-ção com um tampão de eluição compreendendo 20 mM de fosfato de sódio, 150 mM de clo-reto de sódio. Além disso, por exemplo, uma coluna Q sefarose pode ser equilibrada comum tampão de equilíbrio compreendendo 25 mM de trolamina, 40 mM de cloreto de sódio,pH 7,6. Além disso, por exemplo, uma coluna de sefarose de fenila pode ser equilibradacom um tampão de equilíbrio compreendendo 20 mM de fosfato de sódio, 1,1 M (NH4)2SO4,pH 7, o primeiro fluxo atravessante pode ser aplicado à coluna, a coluna pode ser pelo me-nos uma vez lavada com tampão de equilíbrio e o segundo eluído pode ser obtido por de-sempenhar uma etapa gradiente de sal para 11 mM de fosfato de sódio, 0,625 M (NH4)2SO4,pH 7,0. Além disso, por exemplo, inativação viral por pH pode ser obtida por manter o pri-meiro eluído em pH 3,5 durante aproximadamente uma hora.

Com respeito a todos os métodos de purificação descritos acima, em uma modali-dade preferida da invenção, o anticorpo é um anticorpo de fator alfa de necrose anti-tumoral(TNFa), ou porção de ligação de antígeno deste. Em uma modalidade, o anticorpo de anti-TNFa, ou porção de ligação de antígeno deste, é um anticorpo quimérico, um anticorpo hu-manizado ou um anticorpo multivalente. Em uma modalidade, o anticorpo de anti-TNFa, ouporção de ligação de antígeno deste, é infliximabe ou golimumabe.

Em outra modalidade, o anticorpo de anti-TNFa, ou porção de ligação de antígenodeste, é um anticorpo humano. Em uma modalidade, o anticorpo de anti-TNFa, ou porçãode ligação de antígeno deste, é um anticorpo humano isolado que dissocia do TNFa huma-no com um Kd de 1 x 10"8 M ou menos e uma constante taxa da constante do índice de dis-sociação de 1 x 10"3 s"1 ou menos, ambos determinados por ressonância de plásmon super-ficial, e neutraliza a citotoxicidade do TNFa humano em um ensaio L929 in vitro padrão comum IC50 de 1 x 10"7M ou menos.

Em outra modalidade, o anticorpo de anti-TNFa, ou porção de ligação de antígenodeste, é um anticorpo humano isolado com as seguintes características:

a) dissociar do TNFa humano com uma constante taxa da constante do índice dedissociação de dissociação de 1 x 10"1 s"1 ou menos, como determinado pela ressonância deplásmon superficial;

b) ter um domínio CDR3 de cadeia leve compreendendo a seqüência de aminoáci-do da SED ID No: 3, ou modificado da SEQ ID No: 3 por uma única substituição de alaninana posição 1, 4, 5, 7 ou 8 ou de uma a cinco substituições de aminoácidos conservadoresnas posições 1,3,4, 6, 7, 8 e/ ou 9;

c) ter um domínio CDR3 de cadeia pesada compreendendo a seqüência de amino-ácido da SEQ ID No: 4, ou modificada da SEQ ID No: 4 por uma única substituição de alani-na na posição 2, 3, 4, 5, 6, 8, 9, 10 ou 11 ou de uma a cinco substituições de aminoácidosconservadores nas posições 2, 3, 4, 5, 6, 8, 9, 10, 11 e/ ou 12.Ainda em outra modalidade, o anticorpo de anti-TNFa, ou porção de ligação de an-tígeno deste, é um anticorpo humano isolado com uma região variável de cadeia leve(LCVR) compreendendo a seqüência de aminoácido da SEQ ID No: 1 e uma região variávelde cadeia pesada (HCVR) compreendendo a seqüência de aminoácido da SEQ ID No: 2

Ainda em outra modalidade, o anticorpo de anti-TNFa, ou porção de ligação de an-tígeno deste, é adalimumabe.

A invenção fornece uma preparação de anticorpo a qual está substancialmente livrede HCP como medido por um ensaio imunossorvente ligado a enzima da HCP produzidoempregando quaisquer dos métodos da invenção. A invenção também fornece uma compo- sição farmacêutica compreendendo uma preparação de anticorpo de HCP reduzida produzi-da empregando quaisquer dos métodos da invenção, e um portador farmaceuticamente a-ceitável.

A invenção inclui uma composição farmacêutica compreendendo um anticorpo deum anticorpo de HCP reduzida, onde o nível da HCP compreende não mais do que cerca de 70 ng da HCP por mg de anticorpo como medido por um ensaio imunossorvente ligado aenzima da HCP, e um portador farmaceuticamente aceitável. Em uma modalidade, o nívelda HCP compreende não mais do que cerca de 13 ng da HCP por mg de anticorpo comomedido por um ensaio imunossorvente ligado a enzima da HCP. Em outra modalidade, onível da HCP compreende não mais do que cerca de 5 ng da HCP por mg de anticorpo co- mo medido por um ensaio imunossorvente ligado a enzima da HCP.

A invenção fornece uma composição compreendendo um anticorpo, onde a referidacomposição não tem nível detectável da HCP como determinado por um ensaio imunossor-vente ligado a enzima da HCP.

A invenção também fornece uma preparação de anticorpo a qual está substancial-mente livre de procatepsina L produzida empregando quaisquer dos métodos descritos aqui.A invenção também inclui uma composição farmacêutica compreendendo uma preparaçãode anticorpo de procatepsina L reduzida produzida empregando quaisquer dos métodosdescritos aqui, e um portador farmaceuticamente aceitável.

A invenção fornece uma composição farmacêutica compreendendo um anticorpo deum anticorpo de procatepsina L reduzida e um portador farmaceuticamente aceitável, ondeo nível de procatepsina L não é maior do que uma atividade de atividade de catepsina decerca de 3,0 RFU/s/mg de anticorpo.

Com respeito a todas as preparações de anticorpo descritas acima e composiçõesfarmacêuticas, preferível mente o anticorpo é um anticorpo de fator alfa de necrose anti- tumoral (TNFct), ou porção de ligação de antígeno deste. Em uma modalidade, o anticorpode anti-TNFa, ou porção de ligação de antígeno deste, é um anticorpo selecionado do grupoconsistido em humanizado, quimérico ou multivalente. Em uma modalidade, o anticorpo anti-TNFa, ou porção de ligação de antígeno deste, é infliximabe ou golimumabe.

Em outra modalidade, o anticorpo anti-TNFCT, ou porção de ligação de antígenodeste, é um anticorpo humano. Em uma modalidade, o anticorpo de anti-TNFa, ou porçãode ligação do antígeno deste, é um anticorpo humano isolado que dissocia do TNFct huma-no com um Kd de 1 χ 10"8 M ou menos e uma constante taxa da constante do índice de dis-sociação de 1 χ 10"3 s"1 ou menos, ambos determinados por ressonância de plásmon super-ficial, e neutraliza a citotoxidade do TNFct humano em um ensaio L929 in vidro padrão comum IC50 de 1 χ 10"7 M ou menos.

Em outra modalidade, o anticorpo de anti-TNFCT, ou porção de ligação de antígenodeste, é um anticorpo humano isolado com as seguintes características:

a) dissociar o TNFct humano com uma constante taxa da constante do índice dedissociação de 1 χ 103 s"1 ou menos, como determinado por ressonância de plásmon super-ficial;

b) ter um domínio CDR3 de cadeia leve compreendendo a seqüência de aminoáci-do da SEQ ID No: 3, ou modificada da SEQ ID No: 3 por uma única substituição de alaninana posição 1, 4, 5, 7 ou 8 ou de uma a cinco substituições de aminoácidos conservadoresnas posições 1, 3, 4, 6, 7, 8 e/ ou 9;

c) ter um domínio CDR3 de cadeia pesada compreendendo a seqüência de amino-ácido da SEQ ID No: 4, ou modificada da SEQ ID No: 4 por uma única substituição de alani-na na posição 2, 3, 4, 5, 6, 8, 9, 10 ou 11 ou de uma a cinco substituições de aminoácidosconservadores nas posições 2, 3, 4, 5, 6, 8, 9, 10, 11 e/ ou 12.

Ainda em outra modalidade, o anticorpo de anti-TNFCT, ou porção de ligação de an-tígeno deste, é um anticorpo humano isolado com uma região variável de cadeia leve(LCVR) compreendendo a seqüência de aminoácido da SEQ ID No: 1 e uma região variávelde cadeia pesada (HCVR) compreendendo a seqüência de aminoácido da SEQ ID No: 2

Ainda em outra modalidade, o anticorpo de anti-TNFCT, ou porção de ligação de an-tígeno deste, é adalimumabe.

A invenção inclui um método para tratar um distúrbio em que a atividade do TNFct éprejudicial compreendendo administrar a um paciente humano, composições farmacêuticascompreendendo um anticorpo obtido empregando quaisquer dos métodos da invenção. Emuma modalidade, a preparação é administrada ao paciente humano sobre um período pro-longado de tempo. Em uma modalidade, o período prolongado de tempo inclui pelo menoscerca de 3 meses, e pelo menos cerca de 4 meses ou pelo menos cerca de 5 meses.

Em uma modalidade, o distúrbio no qual a atividade do TNFct é prejudicial, é sele-cionado do grupo consistido em um distúrbio auto-imune, um distúrbio intestinal, e uma do-ença de pele. Em uma modalidade, o distúrbio auto-imune é selecionado do grupo consisti-do em artrite reumatóide, espondilite reumatóide, osteoartrite, artrite gotosa, uma alergia,esclerose múltipla, artrite psoriática, diabetes auto-imune, uveíte auto-imune, síndrome ne-frótica, e artrite reumatóide juvenil. Em outra modalidade, o distúrbio intestinal é doença deCrohn. Ainda em outra modalidade, a doença de pele é psoríase.

Em uma modalidade, a composição farmacêutica é administrada em combinaçãocom um agente terapêutico adicional. Em uma modalidade, o agente terapêutico adicional émetotrexato.

A invenção inclui um método para tratar um distúrbio em que a atividade do TNFa éprejudicial compreendendo administrar a um paciente humano a composição farmacêuticacompreendendo um anticorpo obtido empregando quaisquer dos métodos da invenção. Emuma modalidade, a preparação é administrada a um paciente humano sobre um períodoprolongado de tempo. Em uma modalidade, o período prolongado de tempo inclui pelo me-nos cerca de 3 meses, e pelo menos cerca de 4 meses ou pelo menos cerca de 5 meses.Em uma modalidade, o distúrbio no qual a atividade do TNFct é prejudicial, é selecionado dogrupo consistido em um distúrbio auto-imune, um distúrbio intestinal, e uma doença de pele.15 Em uma modalidade, o distúrbio auto-imune é selecionado do grupo consistido de artritereumatóide, espondilite reumatóide, osteoartrite, artrite gotosa, uma alergia, esclerose múlti-pla, artrite psoriática, diabetes auto-imune, uveíte auto-imune, síndrome nefrótica e artritereumatóide juvenil. Em uma modalidade, o distúrbio intestinal é doença de Crohn. Em umamodalidade, a doença de pele é psoríase.

A invenção fornece um artigo de fabricação compreendendo um material de emba-lagem, adalimumabe, e um rótulo ou encarte de embalagem contido no material de embala-gem indicando que a formulação de adalimumabe compreende não mais do que cerca de 70ng da HCP por mg de adalimumabe. Em uma modalidade, cerca de 70 ng da HCP por mgde adalimumabe é medida por um ensaio imunossorvente ligado a enzima da HCP.

A invenção também fornece um artigo de fabricação compreendendo um materialde embalagem, adalimumabe, e um rótulo ou encarte de embalagem contido no material deembalagem indicando que a formulação de adalimumabe compreende não mais do que cer-ca de 13 ng da HCP por mg de adalimumabe. Em uma modalidade, cerca de 13 ng da HCPpor mg de adalimumabe é medido por um ensaio imunossorvente ligado a enzima da HCP.

A invenção inclui um artigo de fabricação compreendendo um material de embala-gem, adalimumabe, e um rótulo ou encarte de embalagem contido no material de embala-gem indicando que a formulação de adalimumabe compreende não mais do que cerca de 5ng da HCP por mg de adalimumabe. Em uma modalidade, cerca de 5 ng de HCP por mg deadalimumabe é medido por um ensaio imunossorvente ligado a enzima da HCP.A invenção inclui um artigo de fabricação compreendendo um material de embala-gem, adalimumabe, e um rótulo ou encarte de embalagem contido no material de embala-gem indicando que a formulação de adalimumabe compreende não mais do que um nível deprocatepsina L do que aquele indicado por uma atividade de catepsina L de cerca de 3,0RFU/s/mg de adalimumabe. Em uma modalidade, atividade de catepsina L é medida por umensaio cinético de catepsina L.

A invenção, ainda fornece um ensaio cinético para determinar a quantidade de pro-catepsina L em um material derivado de um sistema de expressão de célula de mamíferocompreendendo contatar o material derivado de um sistema de expressão de célula de ma-mífero com uma enzima para processar a procatepsina L a uma forma de catepsina L ativa,tal que uma amostra de catepsina L é obtida; contatar a mostra de catepsina L com umsubstrato para a catepsina L; e determinar a atividade de catepsina L na amostra de catep-sina L como uma indicação da quantidade de procatepsina L no material derivado do siste-ma de expressão de célula de mamífero. Em uma modalidade, o sistema de expressão decélula de mamífero são células de Ovário de Hamster Chinês (CHO). Em outra modalidade,a enzima para processar a procatepsina L é uma endopeptidase. Ainda em outra modalida-de, o substrato para catepsina L compreende um rótulo. Ainda em outra modalidade, o rótu-lo é um agente fluorescente. Em uma modalidade, o agente fluorescente compreende umgrupo fluorescente de 7-amino-4-metil cumarina (AMC). Em uma modalidade, o substratopara catepsina L compreende arginina de Ieucina Z. Ainda em outra modalidade, a argininade Ieucina Z compreende um grupo de AMC.

Breve Descrição dos Desenhos

As figuras IA e IB mostram os perfis típicos de eluição para a etapa de cromatogra-fia de Fractogel S para cada processo, incluindo o processo da invenção (Figura IA) e pro-cesso A (Figura IB).

As figuras 2A e 2B mostram uma comparação do perfil de lavagem do fluxo atra-vessante da etapa de cromatografia FF de Q Sefarose, incluindo o processo da invenção(Figura 2A) e o processo A (Figura 2B).

As figuras 3A e 3B mostram uma comparação do perfil de eluição da etapa de cro-matografia HP de Sefarose de Fenila, incluindo o processo B (Figura 3A) e o processo A(Figura 3B).

A figura 4 mostra uma representação gráfica de uma redução de forma gradativaem procatepsina L para a proporção do processo B (forma de diamante) e proporção doprocesso A (forma quadrada).

A figura 5 mostra uma representação gráfica da redução de forma gradativa emHCP para a proporção do processo B (forma de diamante) e processo A (forma quadrada).

A figura 6 mostra que as leituras cinéticas da amostras em processo ativado indi-cam a relação linear do tempo de reação versus o sinal fluorescente.

Descrição Detalhada da Invenção

I. Definições

A fim de que a presente invenção possa ser mais facilmente entendida, certos ter-mos são primeiro definidos.

O termo "mistura", como empregado aqui, se refere a um material tendo viscosida-de o qual é para ser purificado compreendendo pelo menos um anticorpo de interesse oqual é procurado ser purificado de outras substâncias as quais podem também estar presen-tes. As misturas podem, por exemplo, serem soluções aquosas, sistemas de solventes or-gânicos, ou misturas de solventes orgânicos/ aquosos ou soluções. As misturas são muitasvezes misturas do complexo ou soluções compreendendo muitas moléculas biológicas (taiscomo proteínas, anticorpos, hormônios, e vírus), pequenas moléculas (tais como sais, açú-cares, lipídeos, etc.) e até mesmo material particulado. Ao mesmo tempo em que uma mis-tura típica de origem biológica pode começar como uma solução aquosa ou suspensão, po-de também conter solventes orgânicos empregados em etapas de separação anteriores taiscomo precipitações de solvente, extrações, e tipos. Os exemplos de misturas que podemconter substâncias biológicas receptivas, valiosas para a purificação por várias modalidadesda presente invenção incluem, mas não estão limitados a, uma cultura sobrenadante de umbioreator, uma suspensão de célula homogenizada, plasma, frações de plasma, e leite.

Por "purificar" um anticorpo de uma mistura compreendendo o anticorpo e uma oumais substâncias é pretendido aumentar o grau de pureza do anticorpo na mistura por re-mover (completamente ou parcialmente) pelo menos uma substância da composição. Asubstância pode ser uma impureza ou contaminante, tal como, mas não limitada a, uma pro-teína de célula hospedeira (HCP).25 O termo "proteína(s) de célula hospedeira" ou "HCP(s)" se refere às proteínas na

mistura que são diferentes do anticorpo de interesse e tipicamente se origina da fonte deprodução de anticorpo. As HCPs são desejavelmente excluídas da preparação final de anti-corpo.

O termo "reduzido" se refere a reduzir ou diminuir a quantidade de uma substância.30 Uma preparação reduzida inclui uma preparação a qual tem menos de uma substância, talcomo HCPs ou procatepsina L, relativa a uma quantidade inicial. Em uma modalidade, asubstância é uma impureza ou contaminante. Em uma modalidade, o termo "reduzido" signi-fica substancialmente menos da substância. Em outra modalidade, o termo "reduzido" nãosignifica quantidade da substância. Em uma modalidade, não quantidade de uma substância35 inclui "quantidade não detectável" empregando os ensaios descritos aqui.

O termo "substancialmente livre" não inclui a quantidade de uma substância, maspode também incluir uma quantidade mínima de uma substância. Em uma modalidade, anão quantidade de uma substância inclui "quantidade não detectável" empregando os en-saios descritos aqui.

O termo "proteína de célula hospedeira (HCP) reduzida" se refere a uma composi-ção, incluindo, mas não limitada a, um eluído, uma preparação, um fluxo atravessante, com- preendendo um anticorpo e uma quantidade reduzida ou diminuída de HCP(s) seguindouma ou mais etapas de purificação. Em uma modalidade, o termo "HCP reduzida" significasubstancialmente menos da HCP(s) na composição compreendendo um anticorpo. Em outramodalidade, o termo "HCP reduzida" não significa quantidade da HCP(s) na composiçãocompreendendo um anticorpo. Em uma modalidade, o termo "HCP reduzida" significa quan- tidade não detectável empregando os ensaios descritos aqui na composição compreenden-do um anticorpo.

O termo "procatepsina L reduzida" se refere a uma composição, incluindo, mas nãolimitada a, um eluído, uma preparação, um fluxo atravessante, compreendendo um anticor-po e uma quantidade reduzida ou diminuída de procatepsina L seguindo uma ou mais eta- pas de purificação. Em uma modalidade, o termo "procatepsina L reduzida" significa subs-tancialmente menos da HCP(s) na composição compreendendo um anticorpo. Em outramodalidade, o termo "procatepsina L reduzida" significa não quantidade da HCP(s) na com-posição compreendendo um anticorpo. Em uma modalidade, o termo "procatepsina L redu-zida" significa quantidade não detectável empregando os ensaios descritos aqui na compo- sição compreendendo um anticorpo.

O termo "reprodutivelmente baixo" se refere a uma habilidade para consistentemen-te obter uma quantidade reduzida ou diminuída, tal como uma habilidade para obter umaquantidade reduzida ou diminuída em pelo menos 80% do tempo, mais preferivelmente pelomenos 90% do tempo, mais preferivelmente pelo menos 95% do tempo e até mesmo mais preferivelmente pelo menos 98% do tempo.

O termo "etapa de separação por permuta de íon" se refere a uma etapa onde asimpurezas ou substâncias não desejadas, por exemplo, as HCPs ou procatepsina L1 sãopostas de lado de um anticorpo de interesse com base nas diferenças nas interações tôni-cas do anticorpo de interesse e a substância não desejada com um material carregado. Umexemplo de uma etapa de separação por permuta de íon inclui, mas não está limitada a,cromatografia de permuta de íon, incluindo cromatografia de permuta de ânion e cromato-grafia de permuta de cátion.

"Material de permuta de íon" se refere a um material iônico o qual é empregadocomo base para a separação das impurezas e substâncias não desejadas, por exemplo, as HCPs ou procatepsina L1 do anticorpo. Os exemplos de materiais de permuta de íon incluemresinas catiônicas e aniônicas.

"Material de permuta de cátion" se refere a uma resina de permuta de íon com Ii-gandos carregados negativamente ligados covalentemente, e que deste modo tem cátionslivres para permuta com cátions em uma solução com que uma resina é contatada. Umaampla variedade de resinas de permuta de cátion é conhecida na técnica, por exemplo, a-quelas onde os grupos ligados covalentemente são carboxilato ou sulfonato. As resinas depermuta de cátion comercialmente disponíveis incluem celulose CMC, SP-Sephadex™, eFast S-Sepharose™ (os dois últimos sendo comercialmente disponíveis por Pharmacia).

"Um material de permuta de ânion" se refere a uma resina de permuta de íon comgrupos carregados positivamente ligados covalentemente, tal como grupos de amino qua-ternário. Uma resina de permuta de ânion comercialmente disponível inclui DEAE celulose,TMAE, QAE Sephadex™, e Fast Q Sepharose™ (os dois últimos sendo comercialmentedisponíveis por Pharmacia).

Por "ligar" uma molécula a um material de permuta de íon é pretendido expor a mo-lécula ao material de permuta de íon sobre condições apropriadas (pH/ condutividade) talque a molécula é reversivelmente imobilizada em ou no material de permuta de íon em vir-tude das interações iônicas entre a molécula e um grupo carregado ou grupos carregadosdo material de permuta de íon.

O termo "etapa de interação hidrofóbica" se refere a uma etapa onde as substân-cias não desejadas, por exemplo, como HCPs ou procatepsina L, são postas de lado por umanticorpo de interesse com base nas diferenças nas interações hidrofóbicas do anticorpo deinteresse e a substância não desejada com um material hidrofóbico.

O termo "material de interação hidrofóbica" se refere a um material hidrofóbico oqual é empregado como a base para a separação das substâncias não desejadas, por e-xemplo, as HCPs ou procatepsina L, e o anticorpo. Os exemplos de materiais de interaçõeshidrofóbicas incluem Iigandos hidrofóbicos tais como grupos de alquila tendo de cerca de 2 acerca de 8 átomos de carbono, ou grupos de arila tal como fenila.

O termo "lavagem" ou "etapa de lavagem" inclui passar um tampão apropriado a-través ou sobre um material produzido, por exemplo, material de permuta de íon ou materialde interação hidrofóbica.

O termo "pluralidade das etapas de lavagem" inclui mais do que uma etapa de Ia-vagem sucessiva. Os tampões sucessivos podem ter variações de propriedades tais comopH, condutividade, concentração de solvente, etc., projetadas para dissociar e remover tiposde variações de impurezas que não são especificamente associadas com o material produ-zido, por exemplo, material de permuta de íon ou material de interação hidrofóbica. Em umamodalidade, a pluralidade das etapas de lavagem inclui uma lavagem intermediária, aindacompreendendo cerca de 40-50% de tampão de eluição.

Para "eluir" uma molécula (por exemplo, anticorpo ou substância contaminante) deum material é pretendido remover uma molécula a partir deste por alterar o tampão circun-dando o material e desse modo diminuir a interação da molécula e o material. Em uma mo-dalidade, um anticorpo é eluído de uma coluna de permuta de íon onde o tampão competecom o anticorpo para os sítios carregados no material de permuta de íon.

O termo "eluído" se refere a líquido compreendendo a molécula, (por exemplo, anti-corpo ou substância contaminante) o qual foi obtido subseqüente à ligação do anticorpo deinteresse para um material de cromatografia e adição de um tampão de eluição para disso-ciar o anticorpo. Os eluídos podem ser referidos como referente à etapa no processo depurificação. Por exemplo, o termo "primeiro eluído" se refere ao eluído da primeira etapa decromatografia, o termo "segundo eluído" se refere ao eluído da segunda etapa de cromato-grafia, etc.

O termo "fluxo atravessante" se refere a um líquido compreendendo uma molécula(por exemplo, anticorpo ou substância contaminante) o qual foi obtido por passar uma mistu-ra compreendendo a molécula sobre um material de cromatografia tal que a molécula passesobre o material sem ligação.

Um "tampão" se refere a uma substância a qual, está presente na solução, aumen-tando uma quantidade de ácido ou álcali que deve ser adicionada para causar mudança deunidade em pH. Uma solução buferada resiste às mudanças em pH pela ação destes com-ponentes conjugados com base em ácido. As soluções buferadas para uso com reagentesbiológicos são, de modo geral, capazes de manter uma concentração constante de íons dehidrogênio tal que o pH da solução está em uma faixa fisiológica. Os componentes de tam-pão tradicionais incluem, mas não estão limitados a, sais orgânicos e inorgânicos, ácidos ebases. Os exemplos de tampões para uso em purificação de moléculas biológicas (por e-xemplo, anticorpos) incluem o híbrido ou "Good" Buffers, veja, por exemplo, Good e outros(1966) Biochemistry 5:467 e Good e Izawa (1972) Methods Enzymol. 24:62. Os exemplaresde tampões incluem, mas não estão limitados a, TES, MES, PIPES, HEPES, MOPS,MOPSO, TRICINE e BICINE.

"Tampão de lavagem" como empregado aqui, todos se referem aqui à substânciaempregada para levar impurezas do material produzido, por exemplo, material de permutade íon ou material de interação hidrofóbica, ao qual o anticorpo é ligado.

O "tampão de eluição" se refere a uma substância que é empregada para dissociaro anticorpo do material produzido, por exemplo, material de permuta de íon ou material deinteração hidrofóbica, após ter sido lavado com uma ou mais substâncias de lavagem. Otampão de eluição atua para dissociar o anticorpo. As substâncias típicas de eluição sãobem conhecidas na técnica e podem ter concentrações elevadas de sais, Iigandos de afini-dades livres ou análogos, ou outras substâncias que promovem dissociação da substânciaalvo, por exemplo, anticorpo do material produzido. A condutividade e/ ou pH do tampão deeluição é/ são tal que o anticorpo é eluído da permuta de íon ou material de interação hidro-fóbica.

O termo "condutividade" se refere à habilidade de uma solução aquosa para condu-zir uma corrente elétrica entre dois eletrodos. Na solução, os fluxos de corrente por transpor-te de íon. Em conseqüência, com uma quantidade aumentada de íons presentes na solução aquosa, a solução terá uma condutividade elevada. A unidade de medição para condutivi-dade é mmhos (mS/cm), e pode ser medida empregando um negociado medidor de condu-tividade, por exemplo, por Orion. A condutividade de uma solução pode ser alterada pormudar a concentração de íons nele. Por exemplo, a concentração de um agente de armaze-namento e/ ou concentração de um sal (por exemplo, NaCI ou KCI) na solução pode seralterada a fim de obter a condutividade desejada. Em uma modalidade, a concentração desal de um tampão de lavagem ou qualquer outra solução aquosa empregada em cromato-grafia é modificada para obter a condutividade desejada.

O "pi" ou "ponto isoelétrico" de um polipeptídeo, tal como um anticorpo, se refere aopH em que a carga positiva do polipeptídeo equilibra sua carga negativa. O pl pode ser cal- culado na carga liquida dos resíduos de aminoácido do polipeptídeo ou pode ser determina-do por focagem isoelétrica.

O termo "inativação viral" inclui derreter um vírus contido na mistura não funcionalou remover um vírus da mistura para ser purificado. O vírus pode se originar da fonte deprodução de anticorpo, das etapas de processamento a jusante ou condições de fabricação. Os métodos para derreter um vírus não funcional ou remover um vírus incluem agentes deinativação química, ativação térmica, inativação de pH, etc. O termo "inativação viral por pH"inclui submeter um vírus a um pH suficiente para render o vírus não funcional.

O termo "TNFa humano" (abreviado aqui como hTNFa, ou simplesmente hTNF),como empregado aqui, é entendido se referir a uma citocina humano que existe como uma forma secretada de 17 kD e uma forma associada de membrana 26 kD, a forma ativa biolo-gicamente a qual é composta de um trímero de moléculas de 17kD ligadas não covalente-mente. A estrutura do hTNFa é descrita ainda em, por exemplo, Pennica, D., e outros (1984)Natureza 312:724-729; Davis1 J.M., e outros (1987) Biochemistry 26:1322-1326; e Jones, E.Y., e outros (1989) Natureza 338:225-228. O termo TNFa humano é entendido incluir TNFo humano recombinante (rhTNFa), o qual pode ser preparado por métodos de expressão re-combinante padrão ou comercialmente vendido (R & D Systems, Catálogo No. 210-TA, Min-neapolis, MN). O TNFa é também referido como TNF.

O termo "anticorpo", como empregado aqui, é entendido se referir as moléculas deimunoglobulina compreendidas de quatro cadeias de polipeptídeo, duas cadeias pesadas (H) e duas cadeias leves (L) interconectadas por ligações de dissulfeto. Cada cadeia pesadaé compreendida de uma região variável de cadeia pesada (abreviada aqui como HCVR ouVH) e uma região constante de cadeia pesada. A região constante de cadeia pesada écompreendida de três domínios, CHI, CH2 e CH3. Cada cadeia leve é compreendida deuma região variável de cadeia leve (abreviada aqui como LCVR ou VL) e uma região cons-tante de cadeia leve. A região constante de cadeia leve é compreendida de um domínio, CL.As regiões de VH e de VL podem ser ainda subdivididas nas regiões de hipervariabilidade,chamadas regiões de determinação de complementaridade (CDR), intercaladas com regiõesque são mais conservadas, chamada regiões de estrutura (FR). Cada VH e VL é compostade três CDRs e quatro FRs, disposta do terminal de amino ao terminal de carbóxi na seguin-te ordem: FRI, CDRI, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. Os anticorpos da invenção são descri-tos em mais detalhes em Patente dos Estados Unidos Nos. 6.090.382; 6.258.562; e6.509.015, cada dos quais é incorporado aqui por referência em sua totalidade. Em umamodalidade, o anticorpo da invenção é um anti-TNFα que interfere com a atividade do TN-Fa. Os exemplos de anticorpos anti-TNFα incluem, mas não estão limitados a, anticorposhumanos anti-TNFα e porções de anticorpos descritas aqui assim como aquelas descritasem Patente dos Estados Unidos Nos. 6.090.382; 6.258.562; 6.509.015, e em Pedidos de15 Patentes dos Estados Unidos Nos. de Série 09/801185 e 10/302356, cada dos quais é in-corporado aqui por referência. Em uma modalidade, o inibidor de TNFα empregado na in-venção é um anticorpo anti-TNFα, ou um fragmento deste, incluindo infliximabe (Remicade®,Johnson and Johnson; descrito em Patente dos Estados Unidos No. 5.656.272, incorporadoaqui por referência), CDP571 (um anticorpo lgG4 anti-TNF-alfa monoclonal humanizado),20 CDP 870 (um fragmento de anticorpo anti-TNF-alfa monoclonal humanizado), uma dAb deanti-TNF (Peptech), CNTO 148 (golimumabe; Medarex and Centocor), anticorpos descritosem WO 02/12502, e adalimumabe (Humira® Abbott Laboratories, uma mAb de anti-TNF hu-mano, descrita em US 6.090.382 como D2E7). Os anticorpos adicionais, ou fragmentos des-te, os quais podem ser empregados na invenção são descritos em Patente dos Estados U-25 nidos Nos. 6.593.458; 6.498.237; 6.451.983; e 6.448.380, cada dos quais é incorporado aquipor referência. O termo incluir o "anticorpo de interesse" o qual é o anticorpo que é o alvo doprocesso da invenção.

O termo "porção de ligação do antígeno" de um anticorpo (ou simplesmente "porçãode anticorpo"), como empregado aqui, se refere a um ou mais fragmentos de um anticorpoque retém a habilidade para especificamente se ligar a um antígeno (por exemplo, hTNFα).Tem sido mostrado que a função de ligação do antígeno de um anticorpo pode ser desem-penhada por fragmentos de um anticorpo de tamanho natural. Os exemplos de fragmentosde ligação abrangidos no termo "porção de ligação do antígeno" de um anticorpo incluem (i)um fragmento Fab, um fragmento monovalente consistido dos domínios das VL, VH, CL eCHI; (ii) um fragmento F(ab')2, um fragmento bivalente compreendendo dois fragmentosFab ligados por uma ligação de dissulfeto na região da dobradiça; (iii) um fragmento Fd con-sistido dos domínios das VH e CHI; (iv) um fragmento Fv consistido dos domínios das VL eVH de um braço único de um anticorpo, (v) um fragmento de dAb (Ward e outros. (1989)Natureza 341:544-546), os quais consistem de um domínio VH; e (vi) uma região de deter-minação de complementaridade isolada (CDR). Além disso, ainda que os dois domínios dofragmento Fv, VL e VH1 sejam codificados por genes separados, eles podem ser juntados,empregando os métodos recombinantes, por um Iigador sintético que os permite ser feitocomo uma cadeia de proteína única em que as regiões das VL e VH unem-se para formarmoléculas monovalentes (conhecidas como cadeia única Fv (scFv); veja, por exemplo, Birde outros (1988) Science 242:423-426: e Huston e outros (1988) Proc. Natl. Acad. Sci USA85:5879-5883). Tais anticorpos de cadeia única são também entendidos serem abrangidasno termo "porção de ligação do antígeno" de um anticorpo. Outras formas de anticorpos decadeira única, tal como diacorpos são também abrangidos. Os diacorpos são bivalentes, osanticorpos bi-específicos em que os domínios das VH e VL são expressados em uma cadeiade polipeptídeo único, mas empregando um Iigador que é também curto para permitir pare-amento entre os dois domínios na mesma cadeia, desse modo forçando os domínios unir-secom os domínios complementares de outra cadeia e criando dois sítios de ligação de antí-geno (veja, por exemplo, Holliger e outros, (1993) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 90:6444-6448:Poljak e outros (1994) Estrutura 2:1121-1123). As porções de anticorpos da invenção sãodescritas em ainda detalhes em Patente dos Estados Unidos Nos. 6.090.382, 6.258.562,6.509.015, cada das quais é incorporada aqui por referência em sua totalidade.

Os fragmentos de ligação são produzidos por tecnologias de DNA recombinante, oupor clivagem química e enzimática de imunoglobulinas intactas. Os fragmentos de ligaçãoincluem Fab, Fab', F(ab')2, Fabc, Fv, cadeias únicas, e anticorpos de cadeia única. Diferentedos anticorpos ou imunoglobinas "bi-específicas" ou "bi-funcionais", uma imunoglobulina ouanticorpo é entendido ter cada um seus sítios de ligação idênticos. Um "bi-específico" ou"anticorpo bi-funcional" é um anticorpo híbrido artificial tendo dois diferentes pares de cadeialeve/ pesada e dois diferentes sítios de ligação. Os anticorpos bi-específicos podem ser pro-duzidos por uma variedade de métodos incluindo fusão de hibridomas ou de ligação defragmentos Fab'. Veja, por exemplo, Songsivilai & Lachmann, Clin. Exp. Immunol. 79:315-321 (1990); Kostelny e outros, J. Immunol. 148, 1547-1553 (1992).

Uma "substituição de aminoácido conservador", como empregado aqui, é uma emque o resíduo de aminoácido é substituído por outro resíduo de aminoácido tendo uma ca-deia lateral similar. As famílias dos resíduos de aminoácido tendo cadeias laterais similarestêm sido definidas na técnica, incluindo cadeias laterais básicas (por exemplo, lisina, argini-na, histidina), cadeias laterais acídicas (por exemplo, ácido aspártico, ácido glutâmico), ca-deias laterais polares não carregadas (por exemplo, glicina, asparagina, glutamina, serina,treonina, tirosina, cisteína), cadeias laterais não polares (por exemplo, alanina, valina, Ieuci-na, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina, triptofano), cadeias laterais betas ramificadas(por exemplo, treonina, valina, isoleucina) e cadeias laterais aromáticas (por exemplo, tirosi-na, fenilalanina, triptofano, histidina).

Os "anticorpos quiméricos" se referem os anticorpos onde uma porção de cada dasseqüências de aminoácido das cadeias leves e pesadas é homóloga para seqüências cor-respondentes em anticorpos derivados para uma espécie particular ou pertencendo a umaclasse particular, ao mesmo tempo em que, o segmento restante das cadeias é homólogoas seqüências correspondentes de outras espécies. Em uma modalidade, a invenção carac-teriza um anticorpo quimérico ou fragmento de ligação do antígeno, em que as regiões vari-áveis de ambas as cadeias pesada e leve imita as regiões variáveis dos anticorpos deriva-dos de espécies de mamíferos, ao mesmo tempo em que, as porções constantes são homó-logas para as seqüências em anticorpos derivados de outras espécies. Em uma modalidadepreferida da invenção, os anticorpos quiméricos são feitos por enxerto das CDRs de um an-ticorpo de camundongo nas regiões da estrutura de um anticorpo humano.

Os "anticorpos humanizados" se referem a anticorpos os quais compreendem pelomenos uma cadeia compreendendo substancialmente resíduos da estrutura da região variá-vel de uma cadeia de anticorpo humano (referida como o anticorpo ou imunoglobulina re-ceptora) e pelo menos substancialmente uma região de determinação de complementarida-de (CDR) de um anticorpo não humano (por exemplo, camundongo). Além disso, o enxertodas CDRs, anticorpos tipicamente humanizados suportam ainda alterações a fim de melho-rar a afinidade e/ ou imunogenicidade.

O termo "anticorpo multivalente" se refere a um anticorpo compreendendo mais doque um sítio de reconhecimento de antígeno. Por exemplo, um anticorpo "bivalente" temdois sítios de reconhecimento de antígeno, apesar de que um anticorpo "tetravalente" temquatro sítios de reconhecimento de antígeno. Os termos "mono-específico", "bi-específico","tri-específico", "tetra-específico", etc., se referem ao número de diferentes especificidadesde sítio de reconhecimento de antígeno (em oposição ao número de sítios de reconhecimen-to de antígeno) presentes em um anticorpo multivalente. Por exemplo, um sítio de reconhe-cimento de antígeno do anticorpo "mono-específico" todos ligados ao mesmo epítopo. Umanticorpo "bi-específico" ou "dual específico" tem pelo menos um sítio de reconhecimento deantígeno que se liga ao primeiro epítopo e pelo menos um sítio de reconhecimento de antí-geno que se liga ao segundo epítopo que é diferente do primeiro epítopo. Um anticorpo"mono-específico multivalente" tem sítios múltiplos de reconhecimento de antígeno que to-dos se ligam ao mesmo epítopo. Um anticorpo "bi-específico multivalente" tem múltiplossítios de reconhecimento de antígeno, algum número o qual se liga um primeiro epítopo ealgum número o qual se liga ao segundo epítopo que é diferente do primeiro epítopo.

O termo "anticorpo humano", como empregado aqui, é entendido incluir os anticor-pos tendo regiões constantes e variáveis derivadas das seqüências de imunoglobina da Ii-nha germinal humana. Os anticorpos humanos da invenção podem incluir resíduos de ami-noácidos não encodificados por seqüências de imunoglobulina da linha germinal humana(por exemplo, mutações introduzidas por mutagênese in vitro de sítio específico ou ao acasoou por mutação in vitro somática), por exemplo, nas CDRs e em particular na CDR3. Entre-tanto, o termo "anticorpo humano", como empregado aqui, não é entendido para incluir anti-corpos em que as seqüências das CDR derivadas da linha germinal de outras espécies demamíferos, tal como um camundongo, tem sido enxertado nas seqüências da estrutura hu-mana.

O termo "anticorpo humano recombinante", como empregado aqui, é entendido in-cluir todos os anticorpos humanos que são preparados, expressados, produzidos ou isola-dos por meios recombinantes, tais como anticorpos expressados empregando um vetor deexpressão recombinante transfectado em uma célula hospedeira (descrita mais abaixo),anticorpos isolados de um recombinante, biblioteca de anticorpo humano combinatório (des-crita mais abaixo), anticorpos isolados de um animal (por exemplo, um camundongo) que étransgênico para genes de imunoglobulina humana (veja, por exemplo, Taylor e outros(1992) Nucl. Acids Res. 20:6287) ou anticorpos preparados, expressados, produzidos ouisolados por quaisquer outros meios que envolvam junção das seqüências de gene de imu-noglobulina humana para outras seqüências de DNA. Tais anticorpos humanos recombinan-tes têm regiões constantes e variáveis derivadas das seqüências de imunoglobulina da linhagerminal humana. Em certas modalidades, entretanto, tais anticorpos humanos recombinan-tes são submetidos à mutagênese in vitro (ou, quando um animal transgênico das seqüên-cias de Ig humana é empregado, mutagênese somática in vivo) e deste modo as seqüênciasde aminoácido das regiões das VH e VL dos anticorpos recombinantes são seqüências que,ao mesmo tempo em que, derivada de e relacionada com as seqüências das VL e VH dalinha germinal humana, não pode naturalmente existir no repertório da linha germinal deanticorpo humano in vivo.

Tais anticorpos quiméricos, humanizados, humanos, e dual específicos podem serproduzidos por tecnologias de DNA recombinante conhecidas na técnica, por exemplo, em-pregando métodos descritos em Pedido Internacional de PCT No. PCT/US86/02269; Pedidode Patente Européia No. 184.187; Pedido de Patente Européia No. 171.496; Pedido de Pa-tente Européia No. 173.494; Pedido Internacional de PCT No. WO 86/01533; Patente dosEstados Unidos No. 4.816.567; Pedido de Patente Européia No. 125.023; Melhor e outros(1988) Science 240:1041-1043; Liu e outros (1987) Proc. Natl. Acad. Sci USA 84:3439-3443;Liu e outros (1987) J. Immunol. 139:3521-3526; Sun e outros (1987) Proc. Natl. Acad. SciUSA 84:214-218; Nishimura e outros (1987) Câncer Res. 47:999-1005; Wood e outros(1985) Natureza 314:446-449; Shaw e outros (1988) J. Natl. Câncer Inst. 80:1553-1559;Morrison (1985) Science 229:1202-1207; Oi e outros (1986) BioTechniques 4:214; Patentedos Estados Unidos No. 5.225.539; Jones e outros (1986) Natureza 321:552-525; Verhoe-yan e outros (1988) Science 239:1534; e Beidler e outros (1988) J. Immunol. 141:4053-4060, Queen e outros, Proc. Natl. Acad. Sci USA 86:10029-10033 (1989), US 5.530.101, US5.585.089, US 5.693.761, US 5.693.762, Selick e outros, WO 90/07861, e Winter, US 5.225.539.

Um "anticorpo isolado", como empregado aqui, é entendido se referir a um anticor-po que está substancialmente livre de outros anticorpos tendo diferentes especificidades deantígenos (por exemplo, um anticorpo isolado que especificamente se liga ao hTNFa estásubstancialmente livre de anticorpos que especificamente se liga aos antígenos diferente do hTNFa). Um anticorpo isolado que especificamente se liga ao hTNFa pode, entretanto, terreatividade cruzada para outros antígenos, tal como moléculas do TNFa de outras espécies(discutido me mais detalhes abaixo). Além do mais, um anticorpo isolado pode ser substan-cialmente livre de outros materiais celulares e/ ou químicos.

Um "anticorpo neutralizante", como empregado aqui (ou um "anticorpo que neutrali- zou a atividade do hTNFa"), é entendido se referir a um anticorpo cuja ligação ao hTNFaresultada em inibição da atividade biológica do hTNFa. Esta inibição da atividade biológicado hTNFa pode ser avaliada por medir um ou mais indicadores da atividade biológica dohTNFa, tal como citotoxicidade do hTNFa induzido (qualquer dos dois in vitro ou in vivo),ativação celular de hTNFa induzido e ligação de hTNFa aos receptores de hTNFa. Estes indicadores de atividade biológica de hTNFa podem ser avaliados por um ou mais dos di-versos ensaios padrão in vitro ou in vivo conhecidos na técnica (veja, Patente dos EstadosUnidos 6.090.382). Preferivelmente, a habilidade de um anticorpo para neutralizar a ativida-de do hTNFa é avaliada por inibição da citotoxicidade do hTNFa induzido de células L929.Como parâmetro alternativo ou adicional da atividade do hTNFa, a habilidade de um anti- corpo para inibir a expressão do hTNFa induzido de ELAM-I em HUVEC, como medida deativação celular do hTNFa induzido, pode ser avaliado.

O termo "ressonância de plásmon superficial", como empregado aqui, se refere aum fenômeno óptico que permite analisar as interações bio-específicas em tempo real pordetecção das alterações em concentrações de proteína em um biosensor matricial, por e- xemplo, empregando o sistema BIAcore (Pharmacia Biosensor AB, Uppsala, Sweden andPiscataway, NJ). Para mais descrições, veja o exemplo 1 da Patente dos Estados Unidos6.258.562 e Jõnsson e outros (1993) Ann. Biol. Clin. 51:19; Jõnsson e outros (1991) Biote-chniques 11:620-627; Johnsson e outros (1995) J. Mol. Recognit. 8:125; e Johnnson e ou-tros (1991) Anal. Biochem. 198:268.

O termo "constante do índice de dissociação", como empregado aqui, é entendidose referir a constante do índice de dissociação para dissociação de um anticorpo do com-plexo anticorpo/ antígeno.O termo "Κd" como empregado aqui, é entendido se referir à constante dissociaçãode uma interação de anticorpo-antígeno particular.

O termo "IC50" como empregado aqui é entendido se referir à concentração do ini-bidor requerido para inibir o ponto final biológico de interesse, por exemplo, neutralizar a5 atividade de citotoxicidade.

O termo "molécula de ácido nucléico", como empregado aqui, é entendido incluirmoléculas de DNA e moléculas de RNA. Uma molécula de ácido nucléico pode ser filamentoúnico ou filamento duplo, mas preferivelmente é de DNA de filamento duplo.

O termo "molécula de ácido nucléico isolado", como empregado aqui em referênciaaos ácidos nucléicos codificando anticorpos ou porções de anticorpos (por exemplo, VH, VL,CDR3) que se ligam ao hTNFa, é entendido se referir a uma molécula de ácido nucléico naqual as seqüências de nucleotídeo codificando o anticorpo ou porção de anticorpo são livresde outras seqüências de nucleotídeo codificando anticorpos ou porções de anticorpos quese ligam aos antígenos diferentes do hTNFa, cuja outras seqüências podem naturalmenteflanquear o ácido nucléico em DNA genômico humano. Deste modo, por exemplo, um ácidonucléico isolado da invenção codificando uma região de VH de um anticorpo anti-hTNFa nãocontendo outras seqüências codificando outras regiões de VH que se ligam aos antígenosdiferentes do hTNFa.

O termo "vetor", como empregado aqui, é entendido se referir a uma molécula deácido nucléico capaz de transportar outro ácido nucléico ao qual foi ligado. Um tipo de vetoré um "plasmídeo", o qual se refere a uma alça de DNA de filamento duplo circular na qual ossegmentos de DNA adicionais podem ser ligados. Outro tipo de vetor é um vetor viral, ondeos segmentos de DNA adicionais podem ser ligados no genoma viral. Certos vetores sãocapazes de reprodução autônoma em uma célula hospedeira nas quais são introduzidos(por exemplo, vetores bacterianos tendo uma origem bacteriana de vetores de mamíferoepissômico e de reprodução). Outros vetores (por exemplo, vetores de mamíferos não epis-sômico) podem ser integrados ao genoma de uma célula hospedeira na introdução na célulahospedeira, e desse modo são replicados junto com o genoma hospedeiro. Além do mais,certos vetores são capazes de direcionar a expressão de genes para os quais são operati-vãmente ligados. Tais vetores são referidos aqui como "vetores de expressão recombinante"(ou simplesmente, "vetores de expressão"). Em geral, os vetores de expressão de utilidadeem tecnologia de DNA recombinante são muitas vezes na forma de plasmídeos. Na presen-te especificação, "plasmídeo" e "vetor" podem ser empregados alternadamente como oplasmídeo é a mais comumente forma empregada de vetor. Entretanto, a invenção é enten-dida incluir outras tais formas de vetores de expressão, tais como vetores virais (por exem-plo, reprodução deficiente de retroviroses, adenoviroses e viroses adeno-associadas), queservem de funções equivalentes.O termo "célula hospedeira recombinante" (ou simplesmente "célula hospedeira"),como empregado aqui, é entendido se referir a uma célula na qual um vetor de expressãorecombinante tem sido introduzido. Deve ser entendido que tais termos são entendidos nãose referir somente à célula de paciente particular, mas para progênie de tal célula. Porquecertas modificações podem ocorrer em gerações sucessivas devido a quaisquer influênciasambientais ou de mutação, tal como progênie não pode, de fato, ser idêntica as células ori-gem, mas são ainda incluídas no escopo do termo "célula hospedeira" como empregadoaqui.

O termo "kit" como empregado aqui se refere a um produto embalado ou artigo defabricação compreendendo componentes. O kit preferivelmente compreende uma caixa ourecipiente que retém os componentes do kit. A caixa ou recipiente é afixado com um proto-colo aprovado da Food and Drug Administration ou um rótulo. A caixa ou recipiente retém oscomponentes da invenção os quais são preferivelmente contidos nos vasos de propileno ouplástico, polietileno, polipropileno, etileno. Os vasos podem ser frascos ou tubos tampados.O kit pode também incluir instruções para administrar o anticorpo do TNFct da invenção. Emuma modalidade o kit da invenção inclui a formulação compreendendo o anticorpo D2E7humano, como descrito em PCT/IB03/04502 e Pedido dos Estados Unidos No. 10/222140.

Os vários aspectos da invenção são descritos em mais detalhes aqui.

II. Produção de anticorpo

A invenção aqui fornece métodos para purificar um anticorpo de uma mistura com-preendendo o anticorpo e uma ou mais HCPs. A mistura inicial é, de modo geral, um resul-tado da produção recombinante do anticorpo. Alternativamente, a mistura inicial pode resul-tar de produção do anticorpo por síntese de peptídeo (ou outros meios sintéticos) ou o anti-corpo pode ser purificado de uma fonte nativa do anticorpo.

Para expressar os anticorpos, ou porções de anticorpos da invenção, DNAs de co-dificação parcial ou cadeias pesadas e leves de tamanho natural são inseridas nos vetoresde expressão tal que os genes são operativamente ligados as seqüências de controle trans-Lacional e transcricional. Neste contexto, o termo "operativamente ligado" é entendido signi-ficar que um gene do anticorpo é ligado em um vetor tal que as seqüências de controletranslacional e transcricional no vetor servem sua função pretendida regular a transcrição etranslação do gene do anticorpo. O vetor de expressão e as seqüências de controle de ex-pressão são escolhidos serem compatíveis com a célula hospedeira de expressão empre-gada. O gene de cadeia leve do anticorpo e o gene de cadeia pesada do anticorpo podemser inseridos no vetor separado ou, mais tipicamente, ambos os genes são inseridos nomesmo vetor de expressão. Os genes dos anticorpos são inseridos no vetor de expressãopor métodos padrão (por exemplo, ligação de sítios de restrição complementar no vetor efragmento do gene do anticorpo, ou ligação de extremidade cega se os sítios de restriçãonão estão presentes). Antes da inserção das seqüências de cadeia pesada ou leve de anti-corpo ou anticorpo relacionado, o vetor de expressão pode anteriormente transportar se-qüências de região constante do anticorpo. Por exemplo, uma metodologia para converterseqüências das VL e VH de adalimumabe ou adalimumabe relacionada para genes de anti-corpo de tamanho natural é para inseri-las nos vetores de expressão anteriormente codifi-cando regiões constantes de cadeia leve e constante de cadeia pesada, respectivamente,tal que o segmento VH é operativamente ligado ao segmento(s) CH no vetor e o segmentoda VL é operativamente ligado ao segmento CL no vetor. Adicionalmente ou alternativamen-te, o vetor de expressão recombinante pode codificar um peptídeo sinal que facilita a secre-ção da cadeia de anticorpo de uma célula hospedeira. O gene da cadeia do anticorpo podeser clonado no vetor tal que o peptídeo sinal é ligado em estrutura ao terminal de amino dogene de cadeia do anticorpo. O peptídeo sinal pode ser um peptídeo sinal de imunoglobulinaou um peptídeo sinal heterólogo (isto é, um peptídeo sinal de uma proteína de não imuno-globulina).

Além disso, para genes de cadeia do anticorpo, os vetores de expressão recombi-nante da invenção transportam as seqüências reguladoras que controlam a expressão dosgenes de cadeia do anticorpo em uma célula hospedeira. O termo "seqüência reguladora" éentendido incluir promotores, realçadores e outros elementos de controle de expressão (porexemplo, sinais de poli-adenilações) que controlam a transcrição ou translação dos genesde cadeia do anticorpo. Tais seqüências reguladoras são descritas, por exemplo, em Goed-del; Gene Expressão Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego,CA (1990). Deve ser observado por aqueles versados na técnica que o plano do vetor deexpressão, incluindo a seleção de seqüências reguladoras pode depender de tais fatorescomo a escolha da célula hospedeira ser transformada, o nível de expressão da proteína desejada, etc. As seqüências reguladoras preferidas para expressão de célula hospedeirade mamífero inclui elementos virais que direcionam níveis elevados de expressão de proteí-na em células de mamífero, tal como promotores e/ ou realçadores derivados de citomega-lovírus (CMV) (tal como o CMV promotor/ realçador), Vírus Símio 40 (SV40) (tal como oSV40 promotor/ realçador), adenovírus, (por exemplo, o último promotor de adenovírus pre-dominante (AdMLP)) e polioma. Para mais descrição dos elementos reguladores virais, eseqüências destes, veja, por exemplo, Patente dos Estados Unidos No. 5.168.062 por Stins-ki, Patente dos Estados Unidos No. 4.510.245 por BeII e outros e Patente dos Estados Uni-dos No. 4.968.615 por Schaffner e outros.

Além disso, para os genes de cadeia do anticorpo e seqüências reguladoras, os ve- tores de expressão recombinante da invenção podem transportar as seqüências adicionais,tais como as seqüências que regulam a reprodução do vetor em células hospedeiras (porexemplo, origens de reprodução) e genes marcadores selecionáveis. O gene marcador se-lecionável facilita a seleção de células hospedeiras no vetor sendo introduzido (veja, porexemplo, Patentes dos Estados Unidos Nos. 4.399.216, 4.634.665 e 5.179.017, todas porAxel e outros). Por exemplo, tipicamente o gene marcador selecionável confere resistênciaàs drogas, tal como G418, higromicina ou metotrexato, em uma célula hospedeira em que ovetor tem sido introduzido. Os genes marcadores selecionáveis preferidos incluem o genediidrofolato redutase (DHFR) (para uso em células hospedeiras de dhfr com selação de me-totrexato/ amplificação) e o neo gene (para seleção G418).

Para expressão das cadeias pesadas e leves, o vetor(s) de expressão codificandoas cadeias leves e pesadas é transfectado em uma célula hospedeira por técnicas padrão.

As várias formas do termo "transfecção" são entendidas abranger uma ampla variedade detécnicas comumente empregadas para a introdução de DNA exógeno em uma célula hos-pedeira procariótica ou eucariótica, por exemplo, eletroporação, precipitação do fosfato decálcio, transfecção de dextrana de DEAB e tipos. Ainda que seja teoricamente possível ex-pressar os anticorpos da invenção em quaisquer células hospedeiras procarióticas ou euca-rióticas, a expressão de anticorpos em células eucarióticas, e mais preferivelmente célulashospedeiras de mamífero, é mais preferida porque tais células eucarióticas, e em particularcélulas de mamífero, são mais prováveis do que células procarióticas para reunir-se e secre-tar um anticorpo ativo imunologicamente e duplicado adequadamente. A expressão proca-riótica dos genes de anticorpo tem sido relatada ser ineficaz para produção de produçõeselevadas de anticorpo ativo (Boss e Wood (1985) Immunology Today 6:12-13).

As células hospedeiras adequadas para clonagem ou expressando o DNA aqui nosvetores, são células de eucariotos superiores ou, fermento, procariotos descritas acima. Osprocariotos adequados para este propósito incluem eubactéria, tal como organismos Grampositivos ou Gram negativos, por exemplo, Enterobacteriaceae tal como Escherichia, porexemplo, E. coli, Enterobacter, Erwinia, Klebsiella, Proteus, Salmonela , por exemplo, Sal-monela typhimurium, Serratia1 por exemplo, Serratia marcescans, e Shigella, assim comoBacilos tal como B. subtilis e B. Iicheniformis (por exemplo, B. Iicheniformis 41P descrito emDD 266.710 publicado em 12 de abril de 1989), Pseudomonas tal como P. aeruginosa, eStreptomyces. Uma E. coli preferida de clonagem hospedeira é E. coli 294 (ATCC 31.446),embora outras linhagens tais como E. coli B1 E. coli X1776 (ATCC 31.537), e E. coli W3110(ATCC 27,325) são adequadas. Estes exemplos são ilustrativos em vez de limitados.

Além disso, para micróbios eucarióticos, procariotos, tais como fungos filamentososou de fermento, são hospedeiros adequados de expressão ou clonagem para polipeptídeode codificação de vetores. Saccharomyces cerevisiae, ou fermento comum de padaria, é omais comumente empregado entre os microorganismos hospedeiros eucarióticos inferiores.Entretanto, uma quantidade de outros gêneros, espécies, e linhagens são aqui comumenteviáveis e úteis, até como Schizosaccharomyces pombe; hospedeiros de Kluyveromyces taiscomo , por exemplo, Κ. Iactis1 Κ. fragilis (ATCC 12.424), Κ. bulgaricus (ATCC 16.045), K.wickeramii (ATCC 24.178), K. waltii (ATCC 56.500), K. drosophilarum (ATCC 36.906), K.thermotolerans, e K. marxianus; yarrowia (EP 402.226); Piehia pastoris (EP 183.070); Cân-dida; Triehoderraa reesia (EP 244.234); Neurospora crassa; Schwariniomyces tais comoSchwanniomyces occidentalis; e fungos filamentosos até como, por exemplo, Neurospora,Penicillium, Tolypocladium, e hospedeiros Aspergillus tais como A. nidulans e A. niger.

As células hospedeiras adequadas para a expressão de anticorpos glicosilados sãoderivadas de organismos multicelulares. Os exemplos de células de invertebrados incluemcélulas de insetos e plantas. Numerosas linhagens baculovirais e variantes e corresponden-te células hospedeiras de insetos permissivas de hospedeiros tais como Spodoptera frugi-perda (lagarta), Aedes aegypti (mosquito), Aedes albopictus (mosquito), Drosophila melano-gaster (mosca das frutas), e Bombyx mori tem sido identificadas. Uma variedade de linha-gens virais para transfecção são publicamente viáveis, por exemplo, a variante L1 de Auto-grapha californica NPV e a linhagem Bm-5 de Bombyx mori NPV1 e tais viroses podem serempregadas como o vírus aqui de acordo com a presente invenção, particularmente paratransfecção de células do Spodoptera frugiperda. Culturas de células de plantas de algodão,milho, batata, feijão de soja, petúnia, tomate, e tabaco podem também ser utilizadas comohospedeiros.

As células hospedeiras preferidas de mamíferos para expressar os anticorpos re-combinantes da invenção incluem Ovário de Hamster Chinês (células de CHO) (incluindocélulas de CHO de dhfr, descrita em Urlaub and Chasin, (1980) PNAS USA 77:4216-4220,empregado como um marcador selecionável de DHFR, por exemplo, como descrito emKaufman and Sharp (1982) Mol. Biol. 159:601-621), células de mieloma NSO, células COS ecélulas SP2. Quando os vetores de expressão recombinante codificando genes dos anticor-pos são introduzidos nas células hospedeiras do mamífero, os anticorpos são produzidospor cultivar as células hospedeiras durante um período de tempo suficiente permitindo ex-pressão do anticorpo nas células hospedeiras ou, mais preferivelmente, secreção do anti-corpo no meio de cultura em que as células hospedeiras são cultivadas. Outros exemplos delinhas de células hospedeiras de mamífero úteis são linha CV1 de rim de macaco transfor-mada por SV40 (COS-7, ATCC CRL 1651); linha de rim embriônico humano (células 293 ou293 subclonadas para crescimento em cultura de suspensão, Graham e outros, J. Gen Virol.36:59 (1977)); células de rim de hamster bebê (BHK, ATCC CCL 10); células de ovário dehamster Chinês de DHFR (CHO, Urlaub e outros, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 77:4216(1980)); células de Sertoli de camundongo (TM4, Mather, Biol. Reprod. 23:243-251 (1980));células de rim de macaco (CVI ATCC CCL 70); células de rim de macaco verde africano(VERO-76, ATCC CRL-1587); células do carcinoma cervical humano (HELA, ATCC CCL 2);células de rim canino (MDCK, ATCC CCL 34); células de fígado de rato búfalo (BRL 3A,ATCC CRL 1442); células de pulmão humano (W138, ATCC CCL 75); células de fígado hu-mano (Hep G2, HB 8065); tumor mamário em camundongo (MMT 060562, ATCC CCL51);células TRI (Mather e outros, Annals Ν. Y. Acad. Sei. 383:44-68 (1982)); células MRC 5;células FS4; e uma linha do hepatoma humano (Hep G2).

As células hospedeiras são transformadas com os vetores de clonagem e expres-são descritos acima para produção de anticorpo e cultivadas em meios com nutrientes con-vencionais modificados como apropriado para indução de promotores, selecionando trans-formantes, ou amplificando os genes codificando as seqüências desejadas.

As células hospedeiras empregadas para produzir um anticorpo podem ser cultiva-das em uma variedade de meios. Os meios comercialmente disponíveis, tais como HanVsF10 (Sigma), Minimal Essential Meio ((MEM), (Sigma), RPMI-1640 (Sigma), e Dulbecco'sModificada EagIe1S Meio ((DMEM), Sigma) são adequados para cultivar as células hospedei-ras. Além disso, quaisquer dos meios descritos em Ham e outros, Meth. Enz. 58:44 (1979),Barnes e outros, Anal. Biochem. 102:255 (1980), Patentes dos Estados Unidos Nos. 4.767.704; 4.657.866; 4.927.762; 4.560.655; ou 5.122.469; WO 90/03430; WO 87/00195; ouPatente dos Estados Unidos No. Re. 30.985 podem ser empregados como meios de culturapara as células hospedeiras. Quaisquer destes meios podem ser suplementados quandonecessário com hormônios e/ ou outros fatores de crescimento (tais como insulina, transfer-rina, ou fator de crescimento epidérmico), sais (tais como cloreto de sódio, cálcio, magnésio, e fosfato), tampões (tal como HEPES), nucleotídeos (tais como adenosina e timidina), anti-bióticos (tal como droga gentamicina), elementos de traço (definidos como compostos inor-gânicos usualmente presentes nas concentrações finais na faixa micromolar), e glicose ouuma fonte de energia equivalente. Quaisquer outros suplementos necessários podem tam-bém ser incluídos em concentrações adequadas que seriam conhecidas por aqueles versa- dos na técnica. As condições de cultura, tais como temperatura, pH, e tipos, são aquelaspreviamente empregadas com a célula hospedeira selecionada para expressão, e deve serevidente para o técnico ordinariamente versado.

As células hospedeiras podem também ser empregadas para produzir porções deanticorpos intactos, tais como fragmentos Fab ou moléculas scFv. É entendido que as varia-ções no procedimento acima estão no escopo da presente invenção. Por exemplo, pode serdesejável transfectar uma célula hospedeira com DNA de codificação de qualquer cadeialeve ou cadeia pesada (mas não ambas) de um anticorpo desta invenção. A tecnologia deDNA recombinante podem também ser empregada para remover alguns ou todos os DNAsde codificação qualquer dos dois ou ambas as cadeias pesada e leve que não é necessária para ligar ao hTNFa. As moléculas expressadas para tais moléculas de DNA truncadas sãotambém abrangidas pelos anticorpos da invenção. Além disso, anticorpos bi-funcionais po-dem ser produzidos em que uma cadeia leve e uma pesada são um anticorpo da invenção ea outra cadeia pesada e leve são específicas para um antígeno diferente de hTNFa por reti-cular um anticorpo da invenção para um segundo anticorpo por métodos de reticulação quí-mica padrão.

Em um sistema preferido para expressão recombinante de um anticorpo, ou porçãode ligação do antígeno deste, da invenção, um vetor de expressão recombinante codificandoambas, a cadeia pesada do anticorpo e a cadeia leve do anticorpo é introduzido nas célulasdhfr de CHO por transfecção mediada por cálcio fosfato. No vetor de expressão recombinan-te, os genes de cadeia leve e pesada do anticorpo são cada qual operativamente ligada aoselementos reguladores promotores de AdMLP/ CMV realçador para níveis elevados de pro-pulsão de transcrição dos genes. O vetor de expressão recombinante também transporta ogene DHFR, o qual permite a seleção das células CHO que tem sido transfectada com ovetor empregando amplificação/ seleção de metotrexato. As células hospedeiras transfor-mantes selecionadas são cultivadas permitindo a expressão das cadeias leve e pesada doanticorpo e o anticorpo intacto é recuperado do meio de cultura. As técnicas de biologia mo-Iecular padrão são empregadas para preparar o vetor de expressão recombinante, transfec-tar as células hospedeiras, selecionar transformantes, cultivar as células hospedeiras e re-cuperar o anticorpo do meio de cultura.

Os anticorpos humanos recombinantes da invenção, incluindo adalimumabe ouuma porção de ligação do antígeno destes, ou anticorpos de adalimumabe relacionada des-critos aqui podem ser isolados por análise de uma biblioteca de anticorpo combinatória re-combinante, preferivelmente uma biblioteca de exibição fago de scFv, preparada empregan-do cDNAs de VH e VL humano preparado de mRNA derivado dos linfócitos humano. As me-todologias para preparar e analisar tais bibliotecas são conhecidas na técnica. Além disso,para kits comercialmente disponíveis para geração de bibliotecas de exibição de fago (porexemplo, a Pharmacia Recombinant Phage Antibody System, catálogo no. 27-9400-01; e okit de exibição de fago SurfZAP™, catálogo no.240612), os exemplos de métodos e reagen-tes particularmente acessível para uso em geração e análise de bibliotecas de exibição deanticorpo podem ser achados em, por exemplo, Ladner e outos, Patente dos Estados Uni-dos No. 5.223.409; Kang e outros, Publicação PCT No. WO 92/18619; Dower e outros, Pu-blicação PCT No. WO 91/17271; Winter e outros, Publicação PCT No. WO 92/20791; Mar-kland e outros, Publicação PCT No. WO 92/15679; Breitling e outros, Publicação PCT No.WO 93/01288; McCafferty e outros, Publicação PCT No. WO 92/01047; Garrard e outros,Publicação PCT No. WO 92/09690; Fuchs e outros (1991) Bio/ Technology 9:1370-1372;Hay e outros (1992) Hum Antibod Hybridomas 3:81-85; Huse e outros (1989) Science246:1275-1281; McCafferty e outros, Natureza (1990) 348:552-554; Griffiths e outros (1993)EMBO J 12:725-734; Hawkins e outros (1992) J Mol Biol 226:889-896; Cfalta son e outros(1991) Natureza 352:624-628: Gram e outros (1992) PNAS 89:3576-3580; Garrard e outros(1991) Bio/ Technology 9:1373-1377; Hoogenboom e outros (1991) Nuc Acid Res 19:4133-4137; e Barbas e outros (1991) PNAS 88:7978-7982.

Quando empregadas às técnicas recombinantes, o anticorpo pode ser produzido in-tracelularmente, no espaço periplasmático, ou diretamente secretado no meio. Se o anticor-po é produzido intracelularmente, como uma primeira etapa, as ruínas particuladas, quais-quer células hospedeiras ou células Iisadas (por exemplo, resultando de homogenização),são removidas, por exemplo, por centrifugação ou ultrafiltragem. Onde o anticorpo é secre-tado no meio, tais sistemas de expressão supernadantes são, de modo geral, primeiro con-centrados empregando um filtro de concentração de proteína comercialmente disponível,por exemplo, uma unidade de ultrafiltragem Amicon ou Millipore Pellicon.

Antes do processo da invenção, procedimentos para purificação de anticorpos dasruínas das células inicialmente depende do sítio de expressão do anticorpo. Alguns anticor-pos podem ser secretados diretamente da célula nos meios de crescimento circundante;outros são feitos intracelularmente. Para os anticorpos mais recentes, a primeira etapa deum processo de purificação envolve: dissolução da célula, a qual pode ser feita por umavariedade de métodos, incluindo cisalhamento mecânico, choque osmótico, ou tratamentosenzimáticos. Tal interrupção libera os conteúdos inteiros da célula no homogeneizado e,além disso, produz fragmentos subcelulares que são difíceis remover devido ao seu tama-nho pequeno. Estes são, de modo geral, removidos por filtragem ou por centrifugação dife-rencial. Onde o anticorpo não é secretado no meio, tais sistemas de expressão supernadan-tes são, de modo geral, primeiro concentrados empregando um filtro de concentração deproteína comercialmente disponível, por exemplo, uma unidade de ultrafiltragem Amicon ouMillipore Pellicon ultrafiltragem. Onde o anticorpo é secretado no meio, as células hospedei-ras recombinantes podem também ser separadas do meio da cultura celular, por exemplo,por filtragem de fluxo tangencial. Os anticorpos podem ser ainda recuperados do meio decultura empregando os métodos de purificação do anticorpo da invenção.

Em uma modalidade, o processo da invenção inclui anticorpos humanos, ou por-ções de ligação de antígeno deste, que se ligam ao TNFct humano com alta afinidade e umbaixo índice de desassociação ou dissociação, e tem uma elevada capacidade de neutrali-zação. Preferivelmente, os anticorpos humanos são recombinantes, neutralizando anticor-pos anti-hTNFα humano. O recombinante mais preferido, neutraliza o anticorpo empregadono método da invenção, é referido aqui como adalimumabe, também referido como adali-mumabe, Humira®, e D2E7 (a seqüência de aminoácido da região VL D2E7 é mostrada naSEQ ID No: 1; a seqüência de aminoácido da região VH D2E7 é mostrada na SEQ ID No:2). As propriedades de D2E7 (adalimumabe; Humira®) tem sido descritas em Salfeld e ou-tros, Patentes dos Estados Unidos Nos. 6.090.382, 6.258.562, e 6.509.015, as quais sãocada qual incorporada aqui por referência. Outros exemplos de anticorpos de TNFα incluemanticorpos anti-hTNFa murino humanizado e quimérico os quais têm suportado teste clínicopara tratamento de artrite reumatóide (veja, por exemplo, Elliott e outros (1994) Lancet344:1125-1127; Elliot e outros (1994) Lancet 344:1105-1110; Rankin e outros (1995) Br. J.Rheumatol. 34:334-342). Em outra modalidade, o anticorpo do TNFct empregado na inven-ção é infliximabe (Remicade®, Johnson and Johnson; descrita em Patente dos Estados Uni-dos No. 5.656.272, incorporada aqui por referência), CDP571 (um anticorpo lgG4 anti-TNF-alfa monoclonal humanizado), CDP 870 (um fragmento de anticorpo anti-TNF-alfa monoclo-nal humanizado), um dAb anti-TNF (Peptech), e CNTO 148 (golimumabe; Medarex andCentocor, veja, também WO 02/12502).

Em uma modalidade, os métodos da invenção incluem anticorpos de adalimumabee porções de anticorpos, anticorpos de adalimumabe relacionada e porções de anticorpos, eoutros anticorpos humanos e porções de anticorpos com propriedades equivalentes paraadalimumabe, tais como elevada afinidade por ligação ao IiTNFct com baixa dissociaçãocinéticas e elevada capacidade de neutralização. Em uma modalidade, a invenção fornecetratamento com um anticorpo humano isolado, ou uma porção de ligação de antígeno deste,que dissocia do TNFa humano com um Kd de 1 χ 10"8 M ou menos e uma constante taxa daconstante do índice de dissociação de 1 χ 10~3 s"1 ou menos, ambas determinadas por res-sonância de plásmon superficial, e neutraliza a citotoxidade do TNFa humano in a ensaioL929 in vidro padrão com um IC50 de 1 χ 10~7 M ou menos. Mais preferivelmente, o anticorpo humano isolado, ou porção de ligação de antígeno deste, dissocia do TNFct humano comuma constante do índice de dissociação de 5 χ 10"4 s"1 ou menos; ou até mesmo mais prefe-rivelmente, com uma constante do índice de dissociação de 1 χ 10"4 s"1 ou menos. Mais pre-ferivelmente, o anticorpo humano isolado, ou porção de ligação do antígeno deste, neutrali-za a citotoxidade do TNFct humano em um ensaio L929 in vitro padrão com um IC5o de 1 χ10-8M ou menos, até mesmo mais preferivelmente com um IC50 de 1 χ 10"9 M ou menos, eainda mais preferivelmente com um IC50 de 1 χ 10"10 M ou menos. Em uma modalidade pre-ferida, o anticorpo é um anticorpo recombinante humano isolado, ou uma porção de ligaçãode antígeno deste.

É bem conhecido na técnica que os domínios das CDR3 de cadeia leve e pesadado anticorpo representam um importante papel na afinidade/ especificidade da ligação deum anticorpo a um antígeno. Desta maneira, em outro aspecto, a invenção pertence aosmétodos de tratamento de artrite reumatóide por administrar anticorpos humanos obtidosempregando os métodos da invenção, onde os anticorpos têm lenta dissociação cinéticaspara associação com o IiTNFct e que tem domínios da CDR3 de cadeia pesada e leve que estruturalmente são idênticas a ou relacionadas por aqueles de adalimumabe. A posição 9da CDR3 da VL de adalimumabe pode ser ocupada por Ala ou Thr sem substancialmenteafetar a constante do índice de dissociação. Desta maneira, um motivo de consenso para aCDR3 da VL de adalimumabe compreende a seqüência de aminoácido: Q-R-Y-N-R-A-P-Y-(T/A) (SEQ ID No: 3). Adicionalmente, a posição 12 da CDR3 de VH de adalimumabe podeser ocupada por Tyr ou Asn1 sem substancialmente afetar a constante do índice de dissoci-ação. Desta modo, um motivo de consenso para a CDR3 da VH de adalimumabe compre- ende a seqüência de aminoácido: V-S-Y-L-S-T-A-S-S-L-D-(Y/N) (SEQ ID No: 4). Além domais, como demonstrado no Exemplo 2 da Patente dos Estados Unidos No. 6.090.382, odomínio da CDR3 das cadeias leves e pesadas de adalimumabe é acessível para substitui-ção com um resíduo de alanina única (na posição 1, 4, 5, 7 ou 8 na CDR3 da VL ou na posi-ção 2, 3, 4, 5, 6, 8, 9, 10 ou 11 na CDR3 da VH) sem substancialmente afetar a constante do índice de dissociação. Entretanto ainda, o versado técnico observará que, produz a ame-nabilidade dos domínios da CDR3 da VH e VL de adalimumabe para substituições por ala-nina, substituição de outros aminoácidos sem os domínios da CDR3 podem ser possível, aomesmo tempo em que, ainda reter a constante do índice de dissociação do anticorpo, emparticular as substituições por aminoácidos conservadores. Preferivelmente, não mais do que uma a cinco substituições de aminoácidos conservadores são feitas nos domínios daCDR3 da VH e/ ou VL de adalimumabe. Mais preferivelmente, não mais do que uma a trêssubstituições de aminoácidos conservadores são feitas nos domínios da CDR3 da VH e/ ouVL de adalimumabe. Adicionalmente, as substituições de aminoácidos conservadores nãodeveria ser feita em posições críticas de aminoácido ligação ao hTNFa. As posições 2 e 5 da CDR3 de VL de adalimumabe e as posições 1 e 7 da CDR3 da VH de adalimumabe pa-rece ser crítica para interação com hTNFa e deste modo, as substituições de aminoácidosconservadores preferivelmente não são feitas nas três posições (ainda que uma substituiçãode alanina na posição 5 da CDR3 da VL de adalimumabe é aceitável, como descrita acima)(veja, Patente dos Estados Unidos No. 6.090.382).

Desse modo, em outra modalidade, o anticorpo ou porção de ligação de antígenodeste preferivelmente contém as seguintes características:

a) dissociar do TNFa humano com a constante taxa da constante do índice de dis-sociação de 1 χ 10"3 ou menos, como determinado por ressonância de plásmon superficial;

b) ter um domínio da CDR3 de cadeia leve compreendendo a seqüência de amino-ácido da SEQ ID No: 3, ou modificada da SEQ ID No: 3 por uma única substituição de alani-na na posição 1, 4, 5, 7 ou 8 ou por uma a cinco substituições de aminoácidos conservado-res nas posições 1, 3, 4, 6, 7, 8 e/ ou 9;

c) ter um domínio da CDR3 da cadeia leve compreendendo a seqüência de amino-ácido da SEQ ID No: 4, ou modificada da SEQ ID No: 4 por uma única substituição de alani- na na posição 2, 3, 4, 5, 6, 8, 9, 10 ou 11 ou por uma a cinco substituições de aminoácidosconservadores nas posições 2, 3, 4, 5, 6, 8, 9, 10, 11 e/ ou 12.

Mais preferivelmente, o anticorpo, ou porção de ligação de antígeno deste, dissociado TNFfa humano com uma constante do índice de dissociação de 5 χ 10"4 s"1 ou menos. Atémesmo mais preferivelmente, o anticorpo, ou porção de ligação de antígeno deste, dissociado TNFff humano com uma constante do índice de dissociação de 1 χ 10"4 s"1 ou menos.

Ainda em outra modalidade, o anticorpo ou porção de ligação de antígeno deste,preferivelmente contém uma região variável de cadeia leve (LCVR) tendo um domínio daCDR3 compreendendo a seqüência de aminoácido da SEQ ID No: 3, ou modificada da SEQID No: 3 por uma única substituição de alanina na posição 1, 4, 5, 7 ou 8, e com uma regiãovariável de cadeia pesada (HCVR) tendo um domínio da CDR3 compreendendo a seqüên-cia de aminoácido da SEQ ID No: 4, ou modificada da SEQ ID No: 4 por uma única substitu-ição de alanina na posição 2, 3, 4, 5, 6, 8, 9, 10 ou 11. Preferivelmente, a LCVR ainda temum domínio da CDR2 compreendendo a seqüência de aminoácido da SEQ ID No: 5 (isto é,a CDR2 da VL de adalimumabe) e a HCVR ainda tem um domínio da CDR2 compreenden-do a seqüência de aminoácido da SEQ ID No: 6 (isto é, a CDR2 da VH de adalimumabe).Até mesmo mais preferivelmente, a LCVR ainda tem domínio da CDR1 compreendendo aseqüência de aminoácido da SEQ ID No: 7 (isto é, a CDR1 da VL de adalimumabe) e aHCVR tem um domínio da CDR1 compreendendo a seqüência de aminoácido da SEQ IDNo: 8 (isto é, a CDR1 da VH de adalimumabe). As regiões de estrutura para VL preferivel-mente são da família da linha germinal humana VKI, mais preferivelmente do gene Vk dalinha germinal humana A20, e mais preferivelmente das seqüências de estrutura VL de ada-Iimumabe mostradas nas Figuras 1A e 1B da Patente dos Estados Unidos No. 6.090.382. Asregiões de estrutura para VH preferivelmente são da família da linha germinal humana VH3,mais preferivelmente do gene da VH da linha germinal humana DP-31 e mais preferivelmen-te das seqüências de estrutura da VH de adalimumabe mostradas nas Figuras 2A e 2B daPatente dos Estados Unidos No. 6.090.382.

Desse modo, em outra modalidade, o anticorpo ou porção de ligação de antígenodeste preferivelmente contém uma região variável de cadeia leve (LCVR) compreendendo aseqüência de aminoácido da SEQ ID No: 1 (isto é, a VL de adalimumabe) e uma região va-riável de cadeia pesada (HCVR) compreendendo a seqüência de aminoácido da SEQ ID No:2 (isto é, a VH de adalimumabe). Em certas modalidades, o anticorpo compreende uma re-gião constante de cadeia pesada, tal como uma região constante IgGI, lgG2, lgG3, lgG4,IgA, IgE, IgM ou IgD. Preferivelmente, a região constante de cadeia pesada é uma regiãoconstante de cadeia pesada IgGI ou uma região constante de cadeia pesada lgG4. Alémdisso, o anticorpo pode compreender uma região constante de cadeia leve, qualquer umaregião constante de cadeia leve capa ou uma região constante de cadeia leve lambda. Pre-ferivelmente, o anticorpo compreende uma região constante de cadeia leve capa. Alternati-vamente, a porção do anticorpo pode ser, por exemplo, um fragmento Fab ou um fragmentoFv de cadeia única.Ainda em outras modalidades, o anticorpo ou porção de ligação de antígeno deste,preferivelmente contém domínios da CDR3 da VH e VL de adalimumabe relacionada, porexemplo, anticorpos, ou porções de ligação de antígeno deste, com uma região variável decadeia leve (LCVR) tendo um domínio da CDR3 compreendendo uma seqüência de amino-ácido selecionado do grupo consistido em SEQ ID No: 3, SEQ ID No: 11, SEQ ID No: 12,SEQ ID No: 13, SEQ ID No: 14, SEQ ID No: 15, SEQ ID No: 16, SEQ ID No: 17, SEQ ID No:18, SEQ ID No: 19, SEQ ID No: 20, SEQ ID No: 21, SEQ ID No: 22, SEQ ID No: 23, SEQ IDNo: 24, SEQ ID No: 25 e SEQ ID No: 26 ou com uma região variável de cadeia pesada(HCVR) tendo um domínio da CDR3 compreendendo uma seqüência de aminoácido sele-cionado do grupo consistido em SEQ ID No: 4, SEQ ID No: 27, SEQ ID No: 28, SEQ ID No:29, SEQ ID No: 30, SEQ ID No: 31, SEQ ID No: 32, SEQ ID No: 33, SEQ ID No: 34 e SEQID No: 35.

O anticorpo do TNFct empregado na invenção pode ser modificado. Em algumasmodalidades, o anticorpo do TNFct ou fragmentos de ligação de antígeno deste, é quimica-mente modificado para fornecer um efeito desejado. Por exemplo, pegilação de anticorpos efragmentos do anticorpo da invenção podem ser realizados por quaisquer das reações depegilação conhecidas na técnica, como descrito, por exemplo, nas seguintes referências:Focus on Growth Factors 3:4-10 (1992); EP 0 154 316; e EP 0 401 384 (cada um dos quaisé incorporado aqui por referência em sua totalidade). Preferivelmente, a pegilação é realiza-da através de uma reação de acilação ou uma reação de alquilação com uma molécula deglicol de polietileno reativo (ou um polímero solúvel em água análogo reativo). Um polímerosolúvel em água preferido para pegilação dos anticorpos e fragmentos de anticorpo da in-venção é polietileno glicol (PEG). Como empregado aqui, "polietileno glicol" é pretendidoabranger quaisquer das formas de PEG que tem sido empregado para derivar outras proteí-nas, tais como mono (CI-CIO) alcóxi- ou polietileno glicol de arilóxi.

Os métodos para preparo de anticorpos pegilados e fragmentos do anticorpo da in-venção querem, de modo geral, compreender as etapas de (a) reagir o anticorpo ou frag-mento do anticorpo com polietileno glicol, tal como um éster reativo ou aldeído derivado dePEG, sobre condições onde o anticorpo ou fragmento do anticorpo torna-se ligado a um oumais grupos de PEG, e (b) obter os produtos de reação. Deve ser evidente para alguémordinário de versatilidade na técnica para selecionar as condições ótimas de reação ou asreações de acilação com base em parâmetros conhecidos e no resultado desejado.

Os anticorpos pegilados e fragmentos do anticorpo podem, de modo geral, ser em-pregados para tratar distúrbios do TNFct relacionado da invenção por administrar os anticor-pos do TNFct e fragmentos do anticorpo descritos aqui. De modo geral, os anticorpos pegi-lados e fragmentos do anticorpo têm meia vida aumentada, quando comparada aos anticor-pos não pegilados e fragmentos do anticorpo. Os anticorpos pegilados e fragmentos do anti-corpo podem ser empregados sozinhos, junto, ou em combinação com outras composiçõesfarmacêuticas.

Ainda em outra modalidade da invenção, os anticorpos do TNFct ou fragmentosdestes podem ser alterados onde a região constante do anticorpo é modificada para reduzirpelo menos uma função efetora biológica mediada pela região constante em relação a umanticorpo não modificado. Para modificar um anticorpo da invenção tal que exibe ligaçãoreduzida para receptor Fc1 o segmento de região constante de imunoglobulina do anticorpopode ser transformado em regiões particulares necessárias para interações do receptor Fc(FcR) (veja, por exemplo, Canfield and Morrison (1991) J. Exp. Med. 173:1483-1491; e Lunde outros (1991) J. of Immunol. 147:2657-2662). A redução na habilidade de ligação do FcRdo anticorpo pode também reduzir outras funções efetoras as quais contam com as intera-ções do FcR, tal como opsonização e fagocitose e citotoxicidade celular dependente de an-tígeno.

Um anticorpo ou porção do anticorpo da invenção pode ser derivado ou ligado a ou-tra molécula funcional (por exemplo, outro peptídeo ou proteína). Deste modo, os anticorpose porções de anticorpos da invenção são entendidos para incluir formas modificadas de ou-tra forma e derivadas dos anticorpos anti-hTNFa humano descritos aqui, incluindo moléculasde imunoaderência. Por exemplo, um anticorpo ou porção de anticorpo da invenção podeser funcionalmente ligado (por acoplamento químico, fusão genética, associação não cova-lente ou de outra forma) para uma ou mais outras entidades moleculares, tal como outroanticorpo (por exemplo, um anticorpo bi-específico ou um diacorpo), um agente detectável,um agente citotóxico, um agente farmacêutico, e/ ou uma proteína ou peptídeo que podeservir associado ao anticorpo ou porção do anticorpo com outra molécula (tal como umaregião do núcleo da estreptavidina ou um rótulo de poli-histidina).

Um tipo de anticorpo derivado é produzido por reticular dois ou mais anticorpos (domesmo tipo ou de diferentes tipos, por exemplo, para criar anticorpos bi-específicos). Osreticuladores adequados incluem aqueles que são heterobifuncionais, tendo dois gruposreativos distintamente separados por um espaçador adequado (por exemplo, éster de m-maleimidobenzoil-N-hidroxisuccinimida) ou homobifuncional (por exemplo, suberato de di-succinimidila). Tais Iigadores estão disponíveis por Pierce Chemical Company, Rockford, IL.

Os agentes detectáveis úteis com os quais um anticorpo ou porção de anticorpo dainvenção pode ser derivado incluem compostos fluorescentes. Os exemplares de agentesdetectáveis fluorescentes incluem fluoresceína, isotiocianato de fluoresceína, rodamina, clo-reto de 5- dimetilamina-1-napfalenesulfonila, ficoeritrin e tipos. Um anticorpo pode tambémser derivado por enzimas detectáveis, tais como fosfatase alcalina, rábano picante peroxida-se, glicose oxidase e tipos. Quando um anticorpo é derivado por uma enzima detectável, édetectado por adição de reagentes adicionais para que a enzima use produzir um produtode reação detectável. Por exemplo, quando o agente detectável de rábano picante peroxi-dase está presente, a adição de peróxido de hidrogênio e diaminobenzidina conduzem a umproduto de reação colorido, o qual é detectável. Um anticorpo pode também ser derivado debiotina, e detectado através de medição indireta de ligação de estreptavidina ou avidina.

Um anticorpo, ou porção de anticorpo, da invenção pode ser preparado por expres-são recombinante de genes de cadeia pesada e leve de imunoglobulina em uma célula hos-pedeira. Para expressar um anticorpo recombinantemente, uma célula hospedeira é trans-fectada por um ou mais vetores de expressão recombinante transportando fragmentos deDNA codificando as cadeias pesadas e leves de imunoglobulina do anticorpo tal que as ca-deias pesada e leves são expressadas na célula hospedeira e, preferivelmente, secretadasno meio em que as células hospedeiras são cultivadas, de qual meio os anticorpos podemser recuperados. As metodologias de DNA recombinante padrão são empregadas para ob-ter genes de cadeia leve e pesada de anticorpo, incorporando estes genes nos vetores deexpressão recombinante e introduzindo os vetores nas células hospedeiras, tal como aque-Ias descritas em Sambrook, Fritsch and Maniatis (eds), Molecular Cloning; A Laboratory Ma-nual, Second Edition, Cold Spring Harbor, N.Y., (1989), Ausubel e outros (eds.) Current Pro-tocols in Molecular Biology, Greene Publitíbiag Associates, (1989) e em Patente dos Esta-dos Unidos No. 4.816.397 por Boss e outros.

Para expressar um anticorpo de adalimumabe ou um anticorpo de adalimumabe re- lacionada, fragmentos de DNA codificando as regiões variáveis de cadeia pesada e leve sãoprimeiro obtidos. Estes DNAs podem ser obtidos por amplificação e modificação das se-qüências variáveis de cadeia pesada e leve da linha germinal empregando a reação de ca-deia de polimerase (PCR). As seqüências de DNA da linha germinal para genes de regiãovariável de cadeia leve e pesada humano são conhecidas na técnica (veja, por exemplo, a base de dados da seqüência de linha germinal humana "Vbase"; veja, também Kabat e ou-tros (1991) Sequences of Proteína s of Immunological lnterest, Fifth Edition, U.S. Depart-ment of Health and Human Services, NIH Publication No. 91-3242; Tomlinson e outros(1992) "The Repertoire of Human Germine Vh Sequenees Reveals about Fifty Groups of VhSegments with Different Hypervariable Loops" J. Mol. Biol. 227:776-798; e Cox e outros(1994) "A Directory of Human Germ-Iine V78 Segments Reveals a Strong Bias in their Usage"Eur. J. Immunol. 24:827-836; os conteúdos de cada um dos quais são expressamente incor-porados aqui por referência). Para obter um fragmento de DNA codificando a região variávelde cadeia pesada de adalimumabe, ou um anticorpo de adalimumabe relacionada, ummembro da família VH3 dos genes da VH da linha germinal humana é amplificado por PCR padrão. Mais preferivelmente, a seqüência da linha germinal da VH de DP-31 é amplificada.Para obter um fragmento de DNA codificando a região variável de cadeia leve de adalimu-mabe, ou um anticorpo de adalimumabe relacionada, um membro da família VkI de genesda VL da linha germinal humana é amplificada por PCR padrão. Mais preferivelmente, a se-qüência da linha germinal da VL A20 é amplificada. Os iniciadores PCR adequados para usoem amplificar as seqüências da VL da linha germinal A20 e VH da linha germinal DP-31 po-dem ser projetados com base nas seqüências de nucleotídeo descritos nas referências su-pracitadas, empregando os métodos padrão.

Uma vez que os fragmentos da VL e da VH da linha germinal são obtidos, estasseqüências podem ser transformadas para codificar as seqüências de aminoácido de adali-mumabe ou adalimumabe relacionada descritas aqui. As seqüências de aminoácido encodi-ficado pelas seqüências do DNA da VL e da VH da linha germinal são primeiro comparadasàs seqüências de aminoácido da VL e da VH de adalimumabe ou adalimumabe relacionadapara identificar resíduos de aminoácido na seqüência de adalimumabe ou adalimumabe re-lacionada que diferme na linha germinal. Em seguida, os nucleotídeos adequados das se-qüências de DNA da linha germinal são transformados tal que a seqüência da linha germinaltransformada codifica a seqüência de aminoácido de adalimumabe ou adalimumabe relacio-nada, empregando o código genético para determinar quais mudanças de nucleotídeo deveser feitas. A mutagênese das seqüências da linha germinal é realizada por métodos padrão,tais como mutagênese mediada por PCR (em que os nucleotídeos transformados são incor-porados nos iniciadores de PCR tal que o produto PCR contenha as mutações) ou mutagê-nese dirigida ao sítio.

Uma vez que os fragmentos codificando os segmentos da VL e da VH de adalimu-mabe ou adalimumabe relacionada são obtidos (por amplificação e mutagênese dos genesda VL e da VH da linha germinal, como descrito acima), estes fragmentos de DNA podemser ainda manipulados por tecnologias de DNA recombinantes padrão, por exemplo, conver-ter os genes da região variável para genes de cadeia de anticorpos tamanho natural, paragenes de fragmentos Fab ou para um gene scFv. Nestas manipulações, um fragmento deDNA da VL ou VH codificando é operativamente ligado a outro fragmento de DNA codifican-do outra proteína, tal como uma região constante de anticorpo ou um Iigador flexível. O ter-mo "operativamente ligado", como empregado neste contexto, é entendido significar que osdois fragmentos de DNA são juntados tal que as seqüências de aminoácido encodificadapelos dois fragmentos de DNA permanecem na estrutura.

O DNA isolado codificando a região da VH pode ser convertido para um gene decadeia pesada de tamanho natural por operativamente ligar o DNA da VH codificando a ou-tra molécula de DNA codificando regiões constante de cadeia pesada (CHI, CH2 e CH3). Asseqüências dos genes de região constante de cadeia pesada humana são conhecidas natécnica (veja, por exemplo, Kabat e outros (1991) Sequences of Proteins of Immunologicallnterest, Fifth Edition, U.S. Department of Health and Human Services, NIH Publication No.91-3242) e fragmentos de DNA abrangendo estas regiões, podem ser obtidos por amplifica-ção de PCR padrão. A região constante de cadeia pesada por ser uma região constante deIgGI, lgG2, lgG3, lgG4, IgA1 IgE1 IgM ou IgD1 mas mais preferivelmente é uma região cons-tante de IgGI ou lgG4. Para uma gene de cadeia pesada de fragmento Fab1 o DNA de VHcodificando pode ser operativamente ligado a outra molécula de DNA codificando sozinha aregião constante CH1 de cadeia pesada.

O DNA isolado codificando a região da VL pode ser convertido para um gene decadeia leve de tamanho natural (assim como um gene de cadeia leve Fab) por operativa-mente se ligar ao DNA da VL codificando a outra molécula de DNA codificando a regiãoconstante de cadeia leve, CL. As seqüências dos genes de região constante de cadeia levede gene humana são conhecidas na técnica (veja, por exemplo, Kabat e outros (1991) Se-quences of Proteins of Immunological lnterest, Fifth Edition, U.S. Department of Health andHuman Services, NIH Publication No. 91-3242) e fragmentos de DNA abrangendo estasregiões podem ser obtidos por amplificação de PCR padrão. A região constante de cadeialeve pode ser uma região constante Iambda ou capa, mas mais preferivelmente é uma regi-ão constante capa.

Para criar um gene scFv, os fragmentos de DNA da VH e da VL codificando sãooperativamente ligados a outro fragmento codificando um Iigador flexível, por exemplo, codi-ficando a seqüência de aminoácido (GIy4-Ser)3, tal que as seqüências da VH e VL podemser expressadas como uma proteína de cadeia única contínua, com as regiões da VH e VLjuntadas pelo Iigador flexível (veja, por exemplo, Bird e outros (1988) Science 242:423-426;Huston e outros (1988) Proc. Natl Acad. Sei. USA 85:5879-5883; McCafferty e outros, Natu-reza (1990) 348:552-554).

Para expressar os anticorpos, ou porções de anticorpos da invenção, DNAs de co-dificação parcial ou cadeias pesadas e leves de tamanho natural, obtidos como descrito a-cima, são inseridos nos vetores de expressão tal que os genes são operativamente ligadosàs seqüências de controle translacional e transcricional. Neste contexto, o termo "operati-vamente ligado" é entendido significar que um gene do anticorpo é ligado em um vetor talque as seqüências de controle translacional e transcricional no vetor servem sua funçãopretendida regular a transcrição e translação do gene do anticorpo. O vetor de expressão eseqüências de controle de expressão são escolhidos serem compatíveis com a célula hos-pedeira de expressão empregada. O gene de cadeia leve do anticorpo e o gene de cadeiapesada do anticorpo podem ser inseridos no vetor separado ou, mais tipicamente, ambos osgenes são inseridos no mesmo vetor de expressão. Os genes dos anticorpos são inseridosno vetor de expressão por métodos padrão (por exemplo, ligação de sítios de restrição com-plementar no vetor e fragmento do gene do anticorpo, ou ligação de extremidade cega se ossítios de restrição não estão presentes). Antes da inserção das seqüências de cadeia pesa-da ou leve de adalimumabe ou adalimumabe relacionada, o vetor de expressão pode anteri-ormente transportar seqüências de região constante do anticorpo. Por exemplo, uma meto-dologia para converter seqüências VL e VH de adalimumabe ou adalimumabe relacionadapara genes de anticorpo de tamanho natural é para inseri-las nos vetores de expressão an-teriormente codificando regiões constantes de cadeia leve e constante de cadeia pesada,respectivamente, tal que o segmento VH é operativamente ligado ao segmento(s) CH novetor e o segmento VL é operativamente ligado ao segmento CL no vetor. Adicionalmenteou alternativamente, o vetor de expressão recombinante pode codificar um peptídeo sinalque facilita a secreção da cadeia de anticorpo de uma célula hospedeira. O gene da cadeiado anticorpo pode ser clonado no vetor tal que o peptídeo sinal é ligado em estrutura aoterminal de amino do gene de cadeia do anticorpo. O peptídeo sinal pode ser um peptídeosinal de imunoglobulina ou um peptídeo sinal heterólogo (isto é, um peptídeo sinal de umaproteína de não imunoglobulina).

Além disso, para genes de cadeia do anticorpo, os vetores de expressão recombi-nante da invenção transportam as seqüências reguladoras que controlam a expressão dosgenes de cadeia do anticorpo em uma célula hospedeira. O termo "seqüência reguladora" éentendido incluir promotores, realçadores e outros elementos de controle de expressão (porexemplo, sinais de poli-adenilações) que controlam a transcrição ou translação dos genesde cadeia do anticorpo. Tais seqüências reguladoras são descritas, por exemplo, em Goed-del; Gene Express Technology: Methods in Enzymology 185, Academic Press, San Diego,CA (1990). Deve ser observado por aqueles versados na técnica que o plano do vetor deexpressão, incluindo a seleção de seqüências reguladoras pode depender de tais fatorescomo a escolha da célula hospedeira ser transformada, o nível de expressão da proteínadesejada, etc. As seqüências reguladoras preferidas para expressão de célula hospedeirade mamífero inclui elementos virais que direcionam níveis elevados de expressão de proteí-na em células de mamífero, tal como promotores e/ ou realçadores derivados de citomega-lovírus (CMV) (tal como o CMV promotor/ realçador), Vírus Símio 40 (SV40) (tal como oSV40 promotor/ realçador), adenovírus, (por exemplo, ultimo promotor de adenovírus pre-dominante (AdMLP)) e polioma. Para mais descrição dos elementos reguladores virais, eseqüências destes, veja, por exemplo, Patente dos Estados Unidos No. 5.168.062 por Stins-ki, Patente dos Estados Unidos No. 4.510.245 por Bell e outros e Patente dos Estados Uni-dos No. 4.968.615 por Schaffner e outros

Além disso, para os genes de cadeia do anticorpo e seqüências reguladoras, os ve-tores de expressão recombinante da invenção podem transportar as seqüências adicionais,tais como as seqüências que regulam a reprodução do vetor em células hospedeiras (porexemplo, origens de reprodução) e genes marcadores selecionáveis. O gene marcador se-lecionável facilita a seleção de células hospedeiras no vetor sendo introduzido (veja, porexemplo, Patentes dos Estados Unidos Nos. 4.399.216, 4.634.665 e 5.179.017, todas porAxel e outros). Por exemplo, tipicamente o gene marcador selecionável confere resistênciaàs drogas, tal como G418, higromicina ou metotrexato, em uma célula hospedeira em que ovetor tem sido introduzido. Os genes marcadores selecionáveis preferidos incluem o genediidrofolato redutase (DHFR) (para uso em células hospedeiras dhfr com selação de meto-trexato/ amplificação) e o neo gene (para seleção G418).

As células hospedeiras preferidas de mamífero para expressar os anticorpos re-combinante da invenção inclui Ovário de Hamster Chinês(Células de CHO) (incluindo dhfr-Células de CHO, descrita em Urlaub and Chasin, (1980) PNAS USA 77:4216-4220, empre-gado com um Marcador selecionável de DHFR, por exemplo, como descrito em Kaufmanand Sharp (1982) Mol. Biol. 159:601-621), células de mieloma NSO , células COS e célulasSP2. Quando os vetores de expressão recombinante codificando anticorpo genes são intro-duzidos nas células hospedeiras de mamífero, os anticorpos são produzidos por cultivar ascélulas hospedeiras durante um período de tempo suficiente para permitir a expressão doanticorpo nas células hospedeiras ou, mais preferivelmente, secreção do anticorpo no meiode cultura em que as células hospedeiras são cultivadas. Os anticorpos podem ser recupe-rados do meio de cultura empregando métodos de purificação de proteína.

As células hospedeiras podem também ser empregadas para produzir porções deanticorpos intactos, tais como fragmentos Fab ou moléculas scFv. É entendida que as varia-ções no procedimento acima são no escopo da presente invenção. Por exemplo, pode serdesejável transfectar uma célula hospedeira com DNA codificando de qualquer cadeia leveou cadeia pesada (mas não ambas) de um anticorpo da invenção. A tecnologia de DNA re-combinante pode também ser empregada para remoção alguns ou todos DNA codificandoqualquer ou ambas as cadeias pesada e leve que não é necessária para se ligar ao hTNFa.As moléculas expressadas de tais moléculas de DNA truncada são também abrangidas pe-los anticorpos da invenção. Além disso, anticorpos bi-funcionais podem ser produzidos, emque uma cadeia leve e uma pesada são um anticorpo da invenção e outra cadeia leve e pe-sada são específicas para um antígeno diferente do hTNFa por reticular um anticorpo dainvenção a um segundo anticorpo por métodos de reticulação química padrão.

Em um sistema preferido para expressão recombinante de um anticorpo, ou porçãode ligação do antígeno deste, da invenção, um vetor de expressão recombinante codificaambas, a cadeia pesada do anticorpo e a cadeia leve do anticorpo são introduzidas nas cé-lulas do CHO de dhfr por transfecção mediada por cálcio fosfato. No vetor de expressãorecombinante, os genes de cadeia leve e pesada de anticorpo são cada um operativamenteligados aos elementos reguladores de promotor de AdMLP/ CMV realçador para propulsarníveis elevados de transcrição dos genes. O vetor de expressão recombinante tambémtransporta um gene DHFR, que permite selecionar células do CHO que foram transfectadascom o vetor empregando amplificação/ seleção de metotrexato. As células hospedeiras tran-formantes selecionadas são cultivadas para permitir expressão das cadeias leve e pesadado anticorpo e o anticorpo intacto é recuperado do meio de cultura. As técninas de biologiamolecular padrão são empregadas para preparar o vetor de expressão recombinante, trans-fectar as células hospedeiras, selecionar transformantes, cultivar as células hospedeiras erecuperar o anticorpo do meio de cultura.

Os anticorpos humanos recombinantes da invenção além da adalimumabe ou umaporção de ligação de antígeno deste, ou anticorpos de adalimumabe relacionada descritaaqui pode ser isolada por análise de uma biblioteca de anticorpo combinatória recombinante,preferivelmente uma biblioteca de exibição de fago scFv, preparada empregando uma VLhumana e cDNAs da VH preparada de mRNA derivado de linfócitos humano. As metodolo-gias para preparo e análise de tais bibliotecas são conhecidas na técnica. Além dos kits co-mercialmente disponíveis para gêneros de bibliotecas de exibição de fago (por exemplo,uma Pharmacia Recombinant Phage Antibody System, catálogo no. 27-9400-01; e o kit deexibição de fago Stratagene SurfZAP^, catálogo no. 240612), os exemplos de métodos ereagentes particularmente acessíveis para uso em gêneros e análise de bibliotecas de exibi-ção de anticorpo pode ser achados em, por exemplo, Ladner e outros, Patente dos EstadosUnidos No. 5.223.409; Kang e outros, Publicação PCT No. WO 92/18619; Dower e outros ,Publicação PCT No. WO 91/17271; Winter e outros, Publicação PCT No. WO 92/20791;Markland e outros, Publicação PCT No. WO 92/15679; Breitling e outros, Publicação PCTNo. WO 93/01288; McCafferty e outros, Publicação PCT No. WO 92/01047; Garrard e ou-tros, Publicação PCT No. WO 92/09690; Fuchs e outros (1991) Bio/ Technology 9:1370-1372; Hay e outros (1992) Hum Antibod Hybridomas 3:81-85; Huse e outros (1989) Science246:1275-1281; McCafferty e outros, Natureza (1990) 348:552-554: Griffiths e outros (1993)EMBO J 12:725-734; Hawkins e outros (1992) J Mol Biol 226:889-896: Cfalta son e outros(1991) Natureza 352:624-628: Gram e outros (1992) PNAS 89:3576-3580; Garrard e outros(1991) Bio/ Technology 9:1373-1377; Hoogenboom e outros (1991) Nuc Acid Res 19:4133-4137; e Barbas e outros (1991) PNAS 88:7978-7982.

Em uma modalidade preferida, para isolar anticorpos humano com elevada afini-dade e um baixo constante índice de dissociação para hTNFα, um anticorpo anti-hTNFamurino tendo elevada afinidade e um baixo constante índice de dissociação para hTNFa(por exemplo, MAK 195, o hidridoma para o qual tem o depósito número ECACC 87 050801)é primeiro empregado para selecionar seqüências de cadeia leve e pesada humana tendoatividade de ligação similar para hTNFα, empregando os métodos de aprendizado rápidoepítopo descritos em Hoogenboom e outros, Publicação PCT No. WO 93/06213. As bibliote-cas de anticorpo empregadas neste método são preferivelmente bibliotecas scFv prepara-das e analisadas como descrito em McCafferty e outros, Publicação PCT No. WO 92/01047,McCafferty e outros, Nature (1990) 348:552-554: e Griffiths e outros (1993) EMBO J 12:725-734. As bibliotecas de anticorpo scFv preferivelmente são analisadas empregando TNFαhumano recombinante como o antígeno.

Uma vez que os segmentos iniciais da VH e VL humana são selecionados, experi-mentos "misturados e em combinação", em que diferentes pares dos segmentos da VH e daVL inicialmente selecionados são analisados para ligação do hTNFα, são desempenhadospara selecionar combinações pares da VL/ VH preferidas. Adicionalmente, para melhorarainda a afinidade e/ ou baixar a constante do índice de dissociação para ligação do hTNFa,os segmentos da VH e da VL do par (es) da VH/ VL preferida pode ser aleatoriamente mu-tado, preferivelmente na região dà CDR3 da VH e/ ou VL, em um processo análogo para oprocesso de mutação somática in vivo responsável para maturação da afinidade de anticor-pos durante uma resposta imune natural. Esta maturação de afinidade in vitro pode ser efe-tuada por amplificação das regiões da VH e da VL empregando iniciadores PCR comple-mentares para a CDR3 da VH ou CDR3 da VL, respectivamente, cujos iniciadores tem sido"reforçado" com uma mistura aleatória das quatro bases de nucleotídeo em certas posiçõestal que os produtos PCR resultantes codifiquem os segmentos da VL e da VH nas mutaçõesaleatórias sendo introduzidas nas regiões da CDR3 da VL e/ ou da VH. Estes segmentos daVL e da VH mutados aleatoriamente podem ser reavaliados para se ligar ao hTNFα e se-qüências que exibem alta afinidade e um baixo índice de dissociação para ligação de hTNFαpodem ser selecionados.

A análise e isolação seguida de um anticorpo anti-hTNFα da invenção de uma bibli-oteca de exibição de imunoglobulina recombinante, ácido nucléico codificando o anticorposelecionado pode ser recuperado da embalagem de exibição (por exemplo, do genoma dofago) e subclonado em outros vetores de expressão por tecnologias padrão de DNA recom-binante. Se desejado, o ácido nucléico pode ser ainda manipulado para criar outras formasde anticorpo da invenção (por exemplo, ligados ao ácido nucléico codificando domínios deimunoglobulina adicionais, tais como regiões constantes adicionais). Para expressar um an-ticorpo humano recombinante isolado por análise de uma biblioteca combinatória, o DNAcodificando o anticorpo é clonado em um vetor de expressão recombinante e introduzido emcélulas hospedeiras de mamífero, como descrito em mais detalhes acima.

Os métodos de isolamento de anticorpos humano com alta afinidade e uma baixaconstante do índice de dissociação para hTNFa são também descritos em Patentes dos Es-tados Unidos Nos. 6.090.382, 6.258.562, e 6.509.015, cada uma das quais é incorporadaaqui por referência.

III. Purificação de anticorpo

A invenção fornece um método para produzir uma preparação de anticorpo de HCPreduzida de uma mistura compreendendo um anticorpo e pelo menos uma HCP. A invençãotambém fornece um método para produzir uma preparação de anticorpo de procatepsina Lreduzida de uma mistura compreendendo um anticorpo e pelo menos uma procatepsina L.

O processo de purificação da invenção começa na etapa de separação quando o anticorpofoi produzido empregando métodos descritos na Seção Il e métodos convencionais na técni-ca. Tipicamente na técnica, as misturas de anticorpo da HCP são submetidas para capturara proteína A (por exemplo, uma coluna de proteína A) como uma etapa de purificação inicial,uma vez que o anticorpo se liga a proteína A considerando que a HCP deseja o fluxo atra-vessante. Os métodos de purificação da invenção têm a vantagem que não é necessáriopara o paciente a mistura compreendendo um anticorpo e pelo menos uma HCP para captu-rar a proteína A (por exemplo, uma coluna de proteína A) como uma etapa inicial, ou comoqualquer etapa no método de purificação.

Uma vez que uma solução purificadora ou mistura compreendendo o anticorposendo obtida, a separação do anticorpo de outras proteínas produzidas pela célula, tais co-mo as HCPs1 é realizada empregando uma combinação de diferentes técnicas de purifica-ção, incluindo etapa (s) de separação por permuta de íon e etapa (s) de separação por inte-ração hidrofóbica. As misturas separadas das etapas de separação das proteínas na basede sua carga, grau de hidrofobicidade, e/ ou tamanho. Em uma modalidade da invenção, aseparação é realizada empregando cromatografia, incluindo catiônica, aniônica, e hidrofóbi-ca. Diversas resinas de cromatografia diferentes são viáveis para cada destas técnicas,permitindo precisar corte do esquema de purificação para a proteína particular envolvida. Aessência de cada um dos métodos de separação é que as proteínas podem ser causadaspor qualquer um por mover-se em diferentes velocidades reduzindo uma coluna longa, ob-tendo uma separação física que aumenta quando passam reduzindo ainda a coluna, ou poraderir seletivamente à separação do meio, sendo em seguida diferencialmente eluído pordiferentes solventes. Em alguns casos, o anticorpo é separado das impurezas quando asimpurezas especificamente aderem à coluna, e o anticorpo não, isto é, o anticorpo está pre-sente no fluxo atravessante.

Os métodos de purificação de anticorpos das proteínas não desejadas são forneci-dos abaixo, por exemplo, processo A. Em uma modalidade, a invenção inclui as etapas, in-divíduo mente ou em combinação, descritas abaixo no Processo A. O processo A forneceum método de purificação de uma mistura compreendendo um anticorpo empregando sepa-ração por permuta de íon (cromatografia de permuta de cátion e cromatografia de permutade ânion) e separação por interação hidrofóbica, resultando em uma preparação adequadade anticorpo para uso em uma composição farmacêutica. O processo A tem a vantagem quepode ser realizado sem a necessidade de executar a captura da proteína A como uma etapainicial em purificação de anticorpo. Em uma modalidade, o anticorpo purificado empregandoo processo A é adalimumabe. O processo A, de modo geral, compreende o seguinte:

Uma mistura compreendendo um anticorpo e impurezas, por exemplo, HCP(s), écarregado em uma coluna de permuta de íon, tal como uma coluna de permuta de cátion. Amistura pode ser carregada em carga de cerca de <30 g de anticorpo/ L por ciclo. A misturacarregada na coluna de cátion é subseqüentemente lavada com tampão de lavagem (tam-pão de equilíbrio). O anticorpo é em seguida eluído da coluna, e um primeiro eluído é obtido.

O primeiro eluído é em seguida muitas vezes viralmente inativado e o pH ajustadona preparação para cromatografia de permuta de ânion. O primeiro eluído é viralmente inati-vado por ajustar o pH para um pH baixo em relação ao tampão de eluição (descrito ainda naseção IIIC). O pH do eluído viralmente inativado é subseqüentemente ajustado em mais doque uma etapa para o pH final de cerca de 7,6, o qual é o pH da coluna de permuta de ânionque segue na seqüência.

Seguinte a inativação viral, o primeiro eluído é muitas vezes submetido a uma se-gunda etapa de separação por permuta de íon, onde o primeiro eluído é carregado em umacoluna de permuta de ânion (por exemplo, uma coluna Q Sefarose). A coluna é lavada comum tampão de lavagem, e um primeiro fluxo atravessante compreendendo o anticorpo éobtido.

O fluxo atravessante é ainda purificado por carregamento em uma coluna de intera-ção hidrofóbica (sefarose de fenila). A coluna é lavada, e o anticorpo é eluído da coluna talque um segundo eluído é obtido.

O processo B é descrito abaixo e fornece um método melhorado para produzir umapreparação de anticorpo de proteína de célula hospedeira (HCP) reduzida de uma misturacompreendendo um anticorpo. A linguagem "reduzida" quando se referindo a HCP ou proca-tepsina L, inclui melhora sobre os níveis, por exemplo, concentração ou atividade, de HCPou procatepsina L em pontos comparáveis no processo A. Em uma modalidade, o primeiroeluído do processo B compreende um nível reduzido de HCP ou procatepsina L em compa-ração ao primeiro eluído do processo A. Em uma modalidade, o primeiro fluxo atravessantedo processo B compreende um nível reduzido de HCP ou procatepsina L em comparaçãoao primeiro fluxo atravessante do processo A. Em uma modalidade, o segundo eluído doprocesso B compreende um nível reduzido de HCP ou procatepsina L em comparação aosegundo eluído do processo A. Em outra modalidade, a preparação de anticorpo resultandodo processo B compreende um nível reduzido de HCP ou procatepsina L em comparação apreparação de anticorpo resultando do processo A.

Processo B de modo geral compreende o seguinte:

A mistura compreendendo um anticorpo e impurezas, por exemplo, HCP(s), é car- regada em uma coluna de permuta de íon, tal como uma coluna de permuta de cátion. Amistura pode ser carregada em um carga de cerca de <35 g de anticorpo/ L por ciclo em pH7 ou em uma carga de cerca de <70 g de anticorpo/ L por ciclo em pH 5. A mistura carrega-da na coluna de cátion é subseqüentemente lavada com tampão de lavagem (tampão deequilíbrio). Seguinte ao tampão de lavagem de equilíbrio, uma etapa de lavagem intermediá-ria é realizada, onde a coluna é lavada com um tampão de intermediário que tem condutivi-dade similar ao tampão de eluição. A etapa de lavagem intermediária melhora a depuraçãode impurezas do processo relacionado. O anticorpo é em seguida eluído da coluna empre-gando o tampão de eluição, e um primeiro eluído é obtido.

O primeiro eluído é em seguida viralmente inativado e o pH ajustado na preparação para cromatografia de permuta de ânion. O primeiro eluído é viralmente inativado por ajustaro pH para um pH baixo em relação ao tampão de eluição. O pH e a condutividade do eluídoviralmente inativado é subseqüentemente ajustado em uma etapa para um pH final de cercade 7,8-8,2, o qual é o pH da coluna de permuta de ânion equilibrada que segue na seqüên-cia. Seguinte a inativação viral, o primeiro eluído é submetido a uma segunda etapa de se- paração por permuta de íon, onde o primeiro eluído é carregado em uma coluna de permutade ânion (por exemplo, uma coluna Q Sefarose). A coluna é lavada com um tampão de la-vagem, e um primeiro fluxo atravessante compreendendo o anticorpo é obtido.

O fluxo atravessante é ainda purificado por carregamento em uma coluna de intera-ção hidrofóbica (sefarose de fenila). A coluna é lavada, e o anticorpo é eluído da coluna tal que um segundo eluído é obtido. O resultado do processo B é a preparação tendo HCPsreduzidas, incluindo procatepsina L. Além disso, os resultados do processo B incluem a re-moção dos gargalos do processo, por exemplo, produtividade superior produzida em gradu-ação de cultura celular, pela movimento da depuração da HCP para a parte dianteira doprocesso e um melhoramento total na produção de anticorpo. Os detalhes adicionais quanto ao processo melhorado da invenção são fornecidos abaixo.

III.A. Separação por permuta de íon

A presente invenção caracteriza métodos para produzir uma preparação de anticor-po da HCP reduzida de uma mistura compreendendo um anticorpo e pelo menos uma HCPpor submeter à mistura a pelo menos uma etapa de separação por permuta de íon tal queum primeiro eluído compreendendo o anticorpo é obtido. A separação por permuta de íoninclui qualquer método pelo qual duas substâncias são separadas com base na diferençaem suas respectivas cargas iônicas.

No desempenho da separação, a mistura de anticorpo pode ser contatada com omaterial de permuta de íon, por exemplo, empregando uma técnica de purificação por banhoou cromatografia. Por exemplo, para purificação por banho, material de permuta de íon épreparado em ou equilibrado para o tampão de partida desejado. Uma pasta do material depermuta de íon é obtida. A solução de anticorpo é contatada com a pasta para absorver oanticorpo para ser separado do material de permuta de íon. A solução compreendendo aHCP(s) que não se liga ao material de permuta de íon é separada da pasta, por exemplo,por permitir a pasta para estabelecer e remover o sobrenadante. A pasta pode ser submeti-da a uma ou mais etapas de lavagem. Se desejada, a pasta pode ser contatada com umasolução de condutividade elevada para dessorver as HCPs que tem ligação com o materialde permuta de íon. Para o eluído ligado aos polipeptídeos, a concentração de sal pode seraumentada.

A cromatografia de permuta de íon pode também ser empregada como uma técnicade separação por permuta de íon. A cromatografia por permuta de íon separa as moléculascom base nas diferenças entre a carga total das moléculas. Para a purificação de um anti-corpo, o anticorpo deve ter uma carga oposta para aquele grupo funcional ligado ao materialde permuta de íon, por exemplo, resina, a fim de ligar-se. Por exemplo, anticorpos, os quaisde modo geral têm uma carga positiva total no pH do tampão abaixo de pl, deve se ligarbem ao material de permuta de cátion, o qual contém grupos funcionais carregados negati-vãmente.

Em cromatografia de permuta de íon, os emplastros carregados na superfície dosoluto são atraídos por cargas opostas atraídas para uma matriz de cromatografia, forne-cendo a força iônica do tampão circundante é inferior. A eluição é de modo geral obtida poraumentar a força iônica (isto é, condutividade) do tampão para competir com o soluto paraos sítios carregados da matriz de permuta de íon. Mudando o pH e desse modo alterando acarga do soluto é outro meio para obter a eluição do soluto. A carga em condutividade ou pHpode ser gradual (eluição gradiente) ou escalonado (eluição por etapa).

Os substituintes aniônicos e catiônicos podem ser ligados as matrizes a fim de for-mar suportes para a cromatografia. Os substituintes de permuta aniônica incluem grupos dedietilaminoetil (DEAE), aminoetil quaternário (QAE) e amino quaternário (Q). Os substituin-tes catiônicos incluem carboximetil (CM), sulfoetil (SE), sulfopropil(SP), fosfato (P) e sulfona-to (S). Resinas de permuta de íon de celulose tais como DE23, DE32, DE52, CM-23, CM-32e CM-52 são disponíveis por Whatman Ltd. Maidstone, Kent, U.K. Permutadores de íon reti-culados e com base em SEPHADEX® são também conhecidos. Por exemplo, DEAE-, QAE-,CM-, e SP- SEPHADEX® e DEAE-, Q-, CM- e S-SEPHAROSE® e SEPHAROSE® FastFlow são todos disponíveis por Pharmacia AB. Further, ambos DEAE e CM derivados de copolímeros de metacrilato de glicol etileno tais como TOYOPEARL DEAE-650S ou M eTOYOPEARL CM-650S ou M são disponíveis por Toso Haas Co., Philadelphia, Pa.

Em uma modalidade da invenção, a mistura compreendendo um anticorpo e pelomenos uma HCP é carregada em uma coluna de cromatografia de permuta (CEX) de cátion.A mistura é carregada na coluna CEX em um tampão de carregamento o qual pode ser mesmo como o tampão de equilíbrio empregado para equilibrar a coluna. Como a misturacompreendendo a HCP passa sobre a coluna CEX, a proteína alvo é absorvida pela resinaCEX e vários fluxos atravessantes da HCPs (tais como proteínas de célula hospedeira, ondea proteína alvo é produzida em uma célula hospedeira recombinante, ou outras impurezasderivadas do processo) ou se liga fracamente ou não especificamente a resina CEX. Em várias modalidades, a resina CEX é um metacrilato sintético com base em resina poliméricaligada a um grupo de sulfonato (Fractogel SO3 (Fractogel S)). Em uma modalidade, o tam-pão de equilíbrio compreende 20 mM de Na2PO4, 25 mM de NaCI, pH 6,8. Outros tampõesde equilíbrio adequados incluem, por exemplo, BIS e HEPES em concentrações fisiológicas,por exemplo, concentrações na faixa entre cerca de 0,5 mM e cerca de 100 mM (por exem- pio, 10 mM, 20 mM, 50 mM, etc.), e concentrações de sal fisiológico (por exemplo, cerca de0,15 mM de NaCI), e em pH de 5,0-9,0.

Nas modalidades exemplares, a cromatografia CEX é uma coluna de Fractogel S.Em uma modalidade, de cerca de 30 gramas (g) de anticorpo por litro (L) de resina a cercade 40 g de anticorpo por L de resina é carregado na coluna de Fractogel S. Em outra moda- lidade, cerca de 35 g de anticorpo por L de resina é carregado na coluna de Fractogel S empH 7. Tem sido descoberto que uma quantidade de carregamento de cerca de 35 g de anti-corpo por L de resina em pH 7 aumenta a purificação de impurezas, por exemplo, HCP(s) eprocatepsina L. As faixas operacionais aceitáveis de uma coluna de Fractogel S para serempregada no método da invenção são descritas na Tabela 1 abaixo.

Tabela 1: Faixas Operacionais aceitáveis para cromatografia de Fractogel S em pH

<table>table see original document page 53</column></row><table>centrado

para relação de WFI

Velocidade linear 75-300 cm/br

Ainda foi descoberto que a capacidade do carregamento da coluna pode ser au-mentada por realizar a cromatografia em pH 5. Em particular, foi descoberto que uma quan-tidade do carregamento de cerca de 70 g de anticorpo por L de resina em pH 5 aumenta apurificação de impurezas, por exemplo, HCP(s) e procatepsina L. Deste modo, em uma faixade pH de cerca de pH 5 a cerca de pH 7, uma quantidade de carregamento de cerca de 35 ga cerca de 70g de anticorpo por L de resina pode ser empregada.

Em seguida ao carregamento da mistura do anticorpo na coluna, a resina CEX éem então lavada com o tampão de lavagem. Em particular, foi descoberto que uma plurali-dade de etapas de lavagem com diferentes tampões de lavagem resultam ainda em umapreparação de anticorpo de HCP reduzida. Especificamente, foi descoberto que os níveis deprocatepsina L podem ser reduzidos pelo uso de uma primeira etapa de lavagem e uma e-tapa de lavagem intermediária empregando um tampão de lavagem e um tampão de lava-gem intermediário, respectivamente. Em uma modalidade, a resina CEX é primeiro lavadacom um tampão de lavagem o qual é o mesmo como o tampão de equilíbrio. Em certas mo-dalidades, o tampão de lavagem é 20 mM de Na2PO4, 25 mM de NaCI1 pH 6,8. Outros tam-pões de lavagem adequados incluem, por exemplo, BIS e HEPES em concentrações fisioló-gicas, por exemplo, concentração na faixa entre cerca de 0,5 mM e cerca de 100 mM (porexemplo, 10 mM, 20 mM, 50 mM, etc.), e concentrações de sal fisiológico (por exemplo, cer-ca de 0,15 mM de NaCI), e em pH de 5,0-9,0.

Em uma modalidade preferida da invenção, uma etapa de lavagem intermediária érealizada. Foi descoberto que os níveis reduzidos de HCP em geral, e em particular, proca-tepsina L, podem ser obtidas empregando um tampão de lavagem intermediária compreen-dendo, em parte, o mesmo tampão como o tampão de eluição CEX. A redução melhoradada HCP em geral, e em particular procatepsina L, resulta em parte, da condutividade au-mentada no tampão de lavagem intermediária. Aumentando a condutividade do tampão delavagem intermediária causa deslocamento de carga da HCP (s), a qual tem um pl inferiorem relação a aquele do anticorpo, deste modo causando ligação mais fracas da HCP(s) pa-ra lavagem através da coluna. A purificação aumentada por ligação mais fracas de impure-zas, por exemplo, HCP(s) incluindo procatepsina L, por sua vez fornece mais áreas de Iiga-ção para a substância alvo, por exemplo, o anticorpo. Em outras modalidades, o tampão delavagem intermediária contém de cerca de 40% a cerca de 50% de tampão de eluição e decerca de 50% a cerca de 60% de água para injeção. Em outra modalidade, o tampão delavagem intermediária contém 45% de tampão de eluição e 55% de água para injeção. Emuma modalidade, o tampão de lavagem empregado na lavagem intermediária é de 20 mMde Na2PO4, 150 mM de cloreto de sódio, pH 7.

Seguinte a pluralidade de lavagens, o anticorpo é eluído do primeiro material depermuta catiônica tal que um primeiro eluído tendo um nível reduzido de HCP é obtido. Oprimeiro eluído também tem um nível reduzido de procatepsina L por causa da etapa delavagem intermediária. Em uma modalidade, o primeiro eluído obtido empregando o métododa invenção compreende uma diminuição de cerca de 3 a cerca de 5 vezes nos níveis deHCP em comparação a uma etapa comparável do processo A. Em outra modalidade, o pri-meiro eluído obtido empregando o método da invenção compreende uma diminuição de cer-ca de 2 a cerca de 3 vezes na atividade de catepsina L em comparação a uma etapa com-parável do processo A. Em uma modalidade, o primeiro eluído compreende uma faixa decerca de 90 a cerca de 100 vezes menos de HCP do que a mistura como determinado porum ensaio imunossorvente ligado a enzima da HCP. Em outra modalidade, o primeiro eluídocompreende a atividade de catepsina L variando entre cerca de 25 a cerca de 60 RFU/s/mgde anticorpo como medido por um ensaio cinético de catepsina L.

Em uma modalidade preferida, o eluído inicial compreendendo o anticorpo é passa-do sobre um segundo material IE e um fluxo atravessante compreendendo ainda um nívelreduzido de HCP é obtido. Em algumas modalidades, a segunda etapa IE pode ser purifica-ção por banho como infra descrito. Em outras modalidades, a segunda etapa IE compreen-de carregar o primeiro eluído em uma segunda coluna de cromatografia de permuta de íon,lavando a coluna e obtendo um primeiro fluxo atravessante. O segundo material IE pode serresina de permuta de ânion (AEX), por exemplo, coluna de Q sepharose. Em algumas mo-dalidades, entre cerca de 30 g de anticorpo por L de resina e cerca de 40 g de anticorpo porL ou resina é carregado na coluna de permuta de ânion. Aumentando a quantidade de car-regamento entre cerca de 40 g de anticorpo por L de resina e cerca de 50 g de anticorpo porL de resina causam uma diminuição na purificação das impurezas, por exemplo, HCP(s).Quando a mistura compreendendo HCP passa sobre a coluna AEX, as várias HCP(s) seligam a resina AEX, e o anticorpo passa através ou se liga não especificamente a resinaAEX. Em certas modalidades, a resina de permuta de ânion é Q Sefarose.

Muitas vezes, a mistura do anticorpo pode ser purificada devendo estar presenteem um tampão da etapa de purificação prévia. Alguns tampões estão disponíveis e podemser selecionados por experimentação de rotina. Por exemplo, um tampão de equilíbrio de 25mM de trolamina, 40 mM de NaCI, pH 8 pode ser empregado. Em uma modalidade, antesde passar o eluído inicial sobre o segundo material ΙΕ, o segundo material IE pode ser equi-librado com um tampão de equilíbrio. Pode ser feito, por exemplo, por alterar o pH e a con-dutividade do primeiro eluído tal que o pH e a condutividade do primeiro eluído é substanci-almente similar ou corresponde ao pH e a condutividade do segundo material IE equilibrado,isto é, altera o pH e a condutividade do primeiro eluído tal que corresponda àquele do se-gundo material de permuta de íon equilibrado. Em algumas modalidades, o pH do materialAEX (por exemplo, Q sefarose) é ajustada com tampão de equilíbrio para variar de cerca de7,7 a cerca de 8,3. Em outras modalidades, o pH do eluído CEX (por exemplo, eluído inicial)é ajustado para variar de cerca de 7,7 a cerca de 8,3. Em certas modalidades, o pH de am-bos o material AEX e o eluído inicial é de cerca de 8. Em algumas modalidades, a condutivi-dade do material AEX varia de cerca de 3,5 mS/cm a cerca de 4,9 mS/cm. Em outra modali-dade, a condutividade do eluído inicial varia de cerca de 3,5 mS/cm a cerca de 4,9 mS/cm.Foi descoberto que o ajustamento da condutividade da carga e pH para aquele da conduti-vidade e pH do segundo material de permuta de íon realça a purificação da impureza. Emrelação ao processo A, foi descoberto que uma diminuição total na condutividade e/ ou umaumento em pH do primeiro eluído e/ ou segundo material de permuta de íon equilibradoresultado em purificação de HCP(s) aumentada.

Seguinte ao carregamento da mistura de anticorpo na coluna, a resina AEX é entãolavada com um tampão de lavagem. O tampão de lavagem pode ser o mesmo, tal como otampão de equilíbrio, por exemplo, 25 mM de trolamina, 40 mM de NaCI, pH 8. Em uma mo-dalidade, a lavagem pode ser misturada com o fluxo atravessante tal que um primeiro fluxoatravessante compreendendo o anticorpo e tendo um nível reduzido de HCP é obtido. Emoutra modalidade, o primeiro fluxo atravessante tem um nível reduzido de procatepsina L.

Em uma modalidade, o primeiro fluxo atravessante obtido empregando o método da inven-ção compreende uma diminuição de cerca de 7 a cerca de 700 vezes em níveis de HCP emcomparação a uma etapa comparável do processo A. Em outra modalidade, o primeiro fluxoatravessante obtido empregando o método da invenção compreende uma diminuição decerca de 6 a cerca de 25 vezes na atividade de catepsina L em comparação a uma etapacomparável do processo A. Em outras modalidades, o primeiro fluxo atravessante compre-ende uma faixa de cerca de 840 a cerca de 850 vezes menos de HCP do que o primeiroeluído como determinado por um ensaio imunossorvente ligado a enzima da HCP. Ainda emoutra modalidade, o primeiro fluxo atravessante compreende a atividade de catepsina L va-riando entre cerca de 0,4 a cerca de 4 RFU/s/mg de anticorpo como medido por um ensaiocinético de catepsina L.

Faixas operacionais aceitáveis para cromatografia de Q sefarose para serem em-pregadas no método da invenção são descritas abaixo na Tabela 2:

Tabela 2: Faixas operacionais aceitáveis para cromatografia FF de Q sefarose

<table>table see original document page 56</column></row><table>O uso de um material de permuta catiônica versus um material de permuta aniônicaé com base na carga total da proteína como supra discutido. Em conseqüência, está no es-copo desta invenção para empregar um material de permuta aniônica antes do uso de ummaterial de permuta catiônica. Além disso, está no escopo desta invenção para empregarsomente um material de permuta aniônica ou somente um material de permuta aniônica.

Os métodos da presente invenção podem opcionalmente incluir ainda as etapas depurificação. Os exemplos de procedimentos de purificações adicionais os quais podem serdesempenhados antes de, durante, ou seguinte ao método de cromatografia de permuta deíon incluindo fracionação em uma cromatografia de interação hidrofobia (por exemplo, umasefarose de fenila), precipitação de etanol, focagem isoelétrica, Reverse Phase HPLC, cro-matografia em sílica, cromatografia em heparina sefarose, ainda cromatografia de permutade ânion e/ ou ainda cromatografia de permuta de cátion, cromatofocagem, SDS-PAGE,precipitação de sulfato de amônio, cromatografia de hidroxilapatita, eletroforese em gel, diá-lise, e cromatografia por afinidade (por exemplo, empregando a proteína A, proteína G, umanticorpo, um substrato específico, ligando ou antígeno como o reagente de captura).

III.B. Separação por interação hidrofóbica

A presente invenção também caracteriza os métodos para produzir uma preparaçãode anticorpo de HCP reduzida de uma mistura compreendendo um anticorpo e pelo menosuma HCP ainda compreendendo uma etapa de separação por interação hidrofóbica onde oprimeiro fluxo atravessante é submetido a um primeiro material de interação hidrofóbica talque um segundo eluído tendo um nível reduzido de HCP é obtido.

No desempenho da separação, a mistura de polipeptídeo pode ser contatada com omaterial HIC, por exemplo, empregando uma técnica de purificação por banho ou empre-gando uma coluna. Antes da purificação HIC pode ser desejável remover quaisquer agentescaotrópico ou muitas substâncias hidrofóbicas, por exemplo, por passando a mistura atravésde uma pré-coluna.

Por exemplo, para purificação por banho, o material HIC é preparado em ou equili-brado para o tampão de equilíbrio desejado. Uma pasta do material HIC é obtida. A soluçãode anticorpo é contatada com a pasta para absorver o anticorpo sendo separado do materialHIC. A solução compreendendo as HCPs que não se ligam ao material HIC é separada dapasta, por exemplo, por permitir a pasta estabelecer e remover o sobrenadante. A pastapode ser submetida a uma ou mais etapas de lavagem. Se desejado, a pasta pode ser con-tatada com uma solução de condutividade inferior para dessorver os anticorpos que temligação com o material HIC. A fim de eluir os anticorpos de ligação, a concentração de salpode ser diminuída.

Em outras modalidades, a etapa de separação por interação hidrofóbica compreen-de carregar o primeiro fluxo atravessante em uma coluna compreendendo o primeiro materi-al de interação hidrofóbica e lavagem do primeiro material de interação hidrofóbica tal queum segundo eluído é obtido.

A etapa de separação por interação hidrofóbica pode incluir uma etapa de cromato-grafia de interação hidrofóbica (HIC). Enquanto a cromatografia de permuta de íon conta com as cargas de proteínas, por exemplo, anticorpos, para isolá-los, a cromatografia de inte-ração hidrofóbica usa as propriedades hidrofóbicas das mesma proteínas, por exemplo, an-ticorpos. Os grupos hidrofóbicos no anticorpo se ligam aos grupos hidrofílicos na coluna. Aproteína mais hidrofóbica, a mais forte deve se ligar a coluna. A etapa HIC remove, por e-xemplo, célula hospedeira derivada de impurezas (por exemplo, o DNA e outras espécies de produtos relacionadas por peso molecular elevado ou baixo).

As interações hidrofóbicas são mais poderosas em força iônica elevada, em conse-qüência, esta forma de separação é convenientemente desempenhada seguindo as precipi-tações de sal ou procedimentos de permuta de íon. A absorção do anticorpo para uma colu-na de HIC é favorecida por concentrações elevadas de sal, mas as concentrações atuais podem variar sobre uma faixa larga dependendo da natureza do anticorpo e o ligado da HICparticular escolhida. Os vários íons podem ser dispostos em uma série solufóbica assimchamada dependendo se eles promovem interações hidrofóbicas (efeitos de precipitaçãopor saturação) ou romper a estrutura de água (efeito caotrópico) e conduz ao enfraqueci-mento da interação hidrofóbica. Os cátions são ordenados em termos para aumentar o efei- to de precipitação por saturação como Ba++ <; Ca++ <; Mg++ <; Li+ <; Cs+ <; Na+ <; K+ <; Rb+<; NH4+, ao mesmo tempo em que, os ânions podem ser ordenados em termos para aumen-tar o efeito caotrópico como PO" <; SO4" <; CH3COOO" <; Cl" <; Br" <; NO3" <; CIO4" <; I" <;SCN"'

Em geral, sulfatos de NH4 ou Na, K efetivamente promovem interação de proteína ao ligando em HIC. Os sais podem ser formulados, o que influencia a força da interaçãocomo produzido pela seguinte relação: (NH4)SO4 >; Na2SO4 >; NaCI >; NH4CI >; NaBr >;NaSCN. Em geral, as concentrações de sal entre de 0,75 e cerca de 2M de sulfato de amô-nio ou entre cerca de 1 e 4M de NaCI são úteis.

As colunas de HIC normalmente compreendem uma matriz de base (por exemplo, material copolímero sintético ou agarose reticulada) ao qual, os Iigandos hidrofóbicos (porexemplo, grupos de arila ou alquila) são acoplados. A coluna da HIC preferida compreendeuma resina de agarose substituída por grupos de fenila (por exemplo uma coluna PhenylSepharose™). Muitas colunas de HIC estão disponíveis comercialmente. Os exemplos in-cluem, mas não estão limitados a, coluna de Phenyl Sepharose™ 6 Fast Flow com substitu- ição elevada e baixa (Pharmacia LKB Biotechnology, AB, Suécia); coluna de Phenyl Sepha-rose™ High Performance (Pharmacia LKB Biotechnology, AB, Suécia); coluna de Octyl Se-pharose™ High Performance (Pharmacia LKB Biotechnology, AB, Suécia); colunas de Frac-togel™ EMD Propyl ou Fractogel™ EMD Phenyl (E. Merck, Alemanha); Macro-Prep™ Mehylou Macro-Prep™ t-Butyl Supports (Bio-Rad, Califórnia); coluna de WP Hl-Propyl (C.sub.3)™(J. T. Baker, Nova Jersey); e éter de Toyopearl™, colunas de fenila ou butila (TosoHaas,PA).

Seguinte a qualquer etapa (s) de purificação preliminar, a mistura compreendendo oanticorpo de interesse e a HCP(s) pode ser submetida a HIC. Muitas vezes, a composiçãodo anticorpo pode ser purificada devendo estar presente em um tampão da etapa prévia depurificação. Entretanto, pode ser necessário adicionar um tampão a composição do anticor-po, antes da etapa de HIC. Muitos tampões estão disponíveis e podem ser selecionados porexperimentação de rotina. Em uma modalidade, o pH da mistura compreende o anticorpopara ser purificado e pelo menos uma HCP em um tampão de carregamento é ajustada paraum pH de cerca de 7 empregando ou um ácido ou base, dependendo do pH de partida, euma condutividade de cerca de 136 a cerca de 158 mS/cm. Em uma modalidade, a misturade anticorpo é diluída com um tampão compreendendo 40 mM de fosfato de sódio, 2,2 M de(NH4)zSO4, pH 7.

Antes de carregamento a mistura de anticorpo, a coluna pode ser equilibrada comtampão de equilíbrio. Em algumas modalidades, o tampão de equilíbrio é 20 mM de fosfatode sódio, 1,1 M de (NH4)2SO4, pH 7.

Em uma modalidade, a mistura, por exemplo, o primeiro fluxo atravessante com-preendendo o anticorpo, é carregado em uma coluna de HIC de sefarose de fenila. Em cer-tas modalidades, o carregamento da proteína para esta etapa varia entre cerca de 20 e cer-ca de 40 g de proteína por L de resina. Em outras modalidades, o carregamento da proteínapara esta etapa é de cerca de 35 g de proteína por L de resina. Em algumas modalidades,dois ou três ciclos de cromatografia podem ser requeridos para processar a quantidade intei-ra do material disponível.

Seguinte a ligação da proteína para a coluna de interação hidrofóbica, a coluna po-de ser lavada com um tampão de lavagem que pode ser o mesmo do tampão de equilíbrio,por exemplo, 1,1 M de (NH4)2SO4, pH 7.

O anticorpo é eluído da coluna empregando um tampão de eluição tal que um se-gundo eluído é obtido. O tampão de eluição pode ser selecionado empregando a experimen-tação de rotina. O pH do tampão de eluição varia entre cerca de 6 e cerca de 8 e tem umaconcentração baixa de sulfato de amônio (isto é, menos do que cerca de 1 M de (NH4)2SO4).

A condutividade do tampão de eluição varia de cerca de 87 a cerca de 101 mS/cm. Em umamodalidade, o tampão de eluição contém 11 mM de fosfato de sódio, 0,625 M de (NH4)2SO4lpH 7. Foi descoberto que as concentrações inferiores de sal resultam em menos ligação deadalimumabe a resina. O anticorpo é eluído do segundo material de permuta de íon tal queum segundo eluído tendo um nível reduzido de HCP é obtido. O segundo eluído tambémtem um nível reduzido de procatepsina L. Em uma modalidade, o segundo obtido empre-gando o método da invenção compreende uma diminuição de cerca de 10 a cerca de 96vezes nos níveis da HCP em comparação a uma etapa comparável do processo A. Em outramodalidade, o segundo eluído obtido empregando o método da invenção compreende umadiminuição de cerca de 5 a cerca de 15 vezes na atividade de catepsina L em comparação auma etapa comparável do processo A. Em uma modalidade, o segundo eluído compreendeuma faixa de cerca de 3 a cerca de 5 vezes menos de HCP do que o primeiro fluxo atraves-sante como determinado por um ensaio imunossorvente ligado a enzima da HCP. Em outramodalidade, o segundo eluído compreende a atividade de catepsina L variando entre cercade 0,5 a cerca de 1,5 RFU/s/mg de anticorpo como medido por um ensaio cinético de catep-sina L .

Faixas operacionais aceitáveis para a coluna de cromatografia de sefarose de fenilaempregadas nos métodos da invenção são mostradas abaixo na Tabela 3.

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As etapas de purificação ainda podem incluir etapas de remoção bem como etapasde nanofiltragem, ultrafiltragem e/ ou diafiltragem, como descritas aqui.

III.C. Inativação viral

A fim de fornecer uma margem de segurança, as viroses potenciais não detectadassão inativadas durante o processo de purificação. Os métodos de inativação viral são co-nhecidos na técnica e incluem inativação térmica (pasteurização), inativação por pH, trata-mento por solvente/ detergente, irradiação por raio gama e UV e a adição de certos agentesde inativação química tais como /3-propiolactona ou por exemplo, fenantrolina de cobre co-mo em Patente dos Estados Unidos No. 4.534.972, etc. Em algumas modalidades, submeterà mistura a inativação viral pode incluir inativação viral por pH. Os métodos da técnica deinativação viral por pH são também bem conhecidos na técnica. Por exemplo, os métodostípicos de inativação viral incluem incubar a mistura durante um período de tempo em pHbaixo, subseqüentemente neutralizando o pH e removendo os particulados por filtragem. Aescolha do nível de pH largamente depende do perfil da estabilidade do produto do anticor-po e componentes do tampão. É mostrado que a qualidade do anticorpo alvo durante a ina-tivação de vírus por pH baixo é afetada por pH e a duração da incubação do pH baixo. Ainativação do vírus é dependente nos mesmos parâmetros, além da concentração de proteí-na, que podem reduzir a inativação em concentrações elevadas. Deste modo, os parâme-tros adequados da concentração de proteína, pH e duração de inativação pode ser selecio-nados por experimentação de rotina.

O pH da mistura pode ser diminuído por qualquer ácido adequado incluindo, masnão limitado a, ácido cítrico, ácido acético, ácido caprílico, ou outros ácidos adequados. Emmodalidades preferidas, o pH da mistura é ajustada com 1 M de ácido cítrico.

Em algumas modalidades, a mistura é incubada em pH de cerca de 2,9 a cerca de3,9 durante cerca de 15 minutos a cerca de 180 minutos. Em outras modalidades, a misturaé incubada a cerca de pH 3,5 durante cerca de 60 minutos a cerca de 120 minutos. Aindatambém em outras modalidades, a mistura é incubada a cerca de pH 3,5 durante cerca de60 minutos a cerca de 180 minutos.

Em uma modalidade, a mistura compreendendo o anticorpo e HCPs é submetida àinativação viral antes da separação IE. Em outras modalidades, o eluído inicial é submetidoà inativação viral antes da separação IE. Em certas modalidades, o eluído inicial é submeti-do à inativação viral antes da cromatografia de permuta de ânion.

Seguinte a inativação viral, a mistura é ajustada quando necessária para outras e- tapas de purificação. Por exemplo, a mistura de pH ajustado pode ser submetida à filtragem.Em uma modalidade, seguinte a inativação viral por pH baixo e/ ou filtragem, o pH da mistu-ra é tipicamente ajustado para um pH mais neutro, por exemplo, de cerca de 6,5 a cerca de8,5. Por exemplo, a mistura pode ser estimulada com água para injeção (WFI) para obter opH desejado.

Os parâmetros de inativação de vírus por pH baixo empregado no método da in-venção são mostrados na Tabela 4 abaixo.

Tabela 4: Parâmetros operacionais aceitáveis para inativação de vírus por pH baixoParâmetros operacionais AOR

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A invenção inclui um método onde o primeiro eluído da coluna de permuta de íon ésubmetido à inativação viral antes da segunda etapa de cromatografia de permuta de íon.

Em uma modalidade, a inativação viral é obtida através de inativação viral por pH.

IV. Método para determinação níveis de proteína de célula hospedeira (HCP)A presente invenção também fornece métodos para determinar os níveis residuaisde concentração de Proteína de Célula Hospedeira (HCP) na composição do anticorpo puri-ficado. Como descrito acima, as HCPs são desejavelmente excluídas do produto de subs- tância de alvo final, por exemplo, o anticorpo. Os exemplares de HCPs incluem proteínasoriginadas da fonte da produção de anticorpo. A insuficiência para identificar e suficiente-mente remover as HCPs do anticorpo alvo pode conduzir a eficácia reduzida e/ ou reaçõesadversas do paciente.

Como empregado aqui, o termo "ensaio imunossorvente ligado a enzima da HCP"se refere a um ensaio imunossorvente ligado a enzima onde o segundo anticorpo emprega-do no ensaio é específico para as HCPs produzidos das células, por exemplo, células deCHO, empregadas para gerar o anticorpo, por exemplo, adalimumabe. O segundo anticorpopode ser produzido de acordo com métodos convencionais conhecidos por aqueles de ver-satilidade na técnica. Por exemplo, o segundo anticorpo pode ser produzido empregando asHCPs obtidas por produção por imitação e execuções de purificação, isto é, a mesma linhade célula empregada para produzir o anticorpo de interesse é empregada, mas a linha decélula não é transfectado com DNA do anticorpo. Em uns exemplares da modalidade, o se-gundo anticorpo é produzido empregando as HPCs similares àqueles expressados no sis-tema de expressão da célula de escolha, isto é, o sistema de expressão de célula emprega-do para produzir o anticorpo alvo.

De modo geral, ensaio imunossorvente ligado a enzima da HCP compreende inter-calar uma amostra líquida compreendendo as HCPs entre duas camadas de anticorpos, istoé, um primeiro anticorpo e um segundo anticorpo. A amostra é incubada durante qualquertempo, as HCPs na amostra são capturadas pelo primeiro anticorpo, por exemplo, anti-CHOde cabra, afinidade purificada (Cygnus). Um segundo anticorpo rotulado específico para asHCPs produzidas das células empregadas para gerar o anticorpo, por exemplo, Biotinylatedda HCP de anti-CHO, é adicionado, e se liga as HCPs na amostra. A quantidade de HCPcontida na amostra é determinada empregando o teste adequado com base no rótulo dosegundo anticorpo.

O ensaio imunossorvente ligado a HCP pode ser empregado para determinar o ní-vel das HCPs em uma composição de anticorpo, tal como um eluído ou fluxo atravessanteobtido empregando o processo descrito na seção Ill acima. A presente invenção tambémfornece uma composição compreendendo um anticorpo, onde a composição não tem níveldetectável de HCPs como determinado por um Ensaio Imunossorvente Ligado a Enzima daHCP ("ELISA"). Em uma modalidade, o primeiro eluído compreende entre cerca de 12.000 acerca de 19.500 ng/mg de HCP. Em uma modalidade, o segundo eluído compreende entrecerca de 1,0 e cerca de 0,0 ng/mg de HCP.

V. Métodos para determinar níveis de procatepsina L

A invenção fornece um ensaio cinético (ou ensaio cinético de catepsina L) para de-terminar a quantidade de procatepsina L em uma amostra. A procatepsina L é a proteína decélula hospedeira derivada de certos sistemas de expressão e, na ativação para catepsinaL, é conhecida por causar a fragmentação de proteínas, incluindo anticorpos tal como ada-limumabe. Os estudos têm demonstrado que a procatepsina L é sintetizada como um zimo-gênio inativo e mais tarde processado para formar a catepsina L ativada. A ativação de pro-catepsina L ocorre por remoção proteolítica da região de pro-peptídeo N-terminal pela quaisoutras proteases tais como por ativação autocataiítica ou catepsina D nas condições acídi-cas do Iisossoma (Turk e outros (1999) Eur J Biochem 259:929). Além disso, Mason e ou-tros (veja, Mason e outros (1992) Biochem Biophysical Res Comm 189: 1659) relatam que aativação de catepsina L pode ser obtida por um grau elevado em pH 5,5 com a adição demoléculas carregadas negativamente, tal como sulfato de dextrana, em condições de pHinferiores.

Os métodos prévios de detecção dos níveis de procatepsina L (ou a forma ativa decatepsina L) incluindo métodos analíticos tal como cromatografia de permuta de ânion fraca.Tais métodos são limitados, entretanto, quando as amostras em processo de teste, isto é,amostras obtidas do processo descrito acima na seção III, devido à interferência do sistemade tampão e efeitos da matriz. Deste modo, a invenção fornece um método enzimático dealta produtividade para melhor monitorar a procatepsina L, por exemplo, para o propósito deprocesso de monitoramento.

O ensaio cinético da invenção fornece um método de determinação de procatepsinaL em níveis que não podem ser facilmente detectados por ensaios de meta padrão. O en-saio cinético também fornece um meio de determinação que o nível de procatepsina L éreprodutivelmente baixo. Em uma modalidade, as amostra podem ser obtidas de qualquerponto no processo descrito na Seção III, a fim de confirmar ou determinar que o nível deprocatepsina L é sendo reduzido no processo total. A procatepsina L é ativada por removero amino terminal da proteína. Em uma modalidade, a ativação é obtida empregando umapeptidase, tal como, mas não limitada a, catepsina D. Uma vez ativada, a catepsina L podeseletivamente hidrolizar substratos. Um substrato é contatado com a amostra e monitoradopara a atividade de catepsina L com base nas mudanças para o substrato.

Em uma modalidade preferida, o substrato para catepsina L compreende um rótulo.O rótulo pode incluir qualquer agente que permite a atividade de catepsina ser determinada.Os exemplos de substratos rotulados dos quais a catepsina L pode seletivamente hidrolizarincluindo substratos sintéticos tal como Z-leucina-arginina-AMC (R & D Systems). O substra-to de peptídeo pode conter um grupo de cumarina de 7-amino-4-metil (AMC) que é extingüi-do pela ligação de amida entre o grupo de amino da AMC e o grupo de carboxila da argini-na. Na clivagem da ligação de amida por catepsina L, o grupo AMC liberada é fluorescente epode ser medido por excitação e emissão de comprimento de ondas de 380 nm e 460 nmrespectivamente. A excitação pode ser medida e empregada para determinar o nível da ati-vidade de catepsina L. A taxa de regeneração de substrato é diretamente proporcional aquantidade de catepsina L presente na amostra. A medição é empregada em combinaçãocom uma amostra de referência sendo conhecida a atividade de catepsina L e conhecida aquantidade de catepsina L. A atividade de catepsina L na amostra é então correlacionadacom a quantidade de anticorpo presente na amostra. Em uma modalidade, o primeiro eluídocompreende a atividade de catepsina L variando entre cerca de 25 a cerca de 60 RFU/s/mgde anticorpo. Em outra modalidade, o primeiro fluxo atravessante compreende atividade decatepsina L variando entre cerca de 0,4 a cerca de 4 RFU/s/mg de anticorpo. Em uma mo-dalidade, o segundo eluído compreende atividade de catepsina L variando entre cerca de0,5 a cerca de 1,5 RFU/s/mg de anticorpo.

Em uma modalidade, o ensaio cinético compreende determinar a quantidade deprocatepsina L em um material derivado de um sistema de expressão de célula de mamíferocompreendendo contatar o material com uma enzima para processar a procatepsina L paraformar a catepsina L ativa, tal que uma amostra de catepsina L é obtida. Uma vez ativada, acatepsina L pode seletivamente hidrolizar substratos, incluindo substratos sintéticos tal comoZ-leucina-arginina-AMC. Um substrato é então adicionado à amostra, incluindo, por exem-plo, Z-leucina-arginina-AMC, o qual contém um grupo de cumarina fluorescente de 7-amino-4-metil (AMC) que é extingüido por ligação de amida entre o grupo de amino da AMC e ogrupo de carboxila da arginina. Na clivagem da ligação de amida por catepsina L, o grupoAMC liberado é fluorescente e pode ser medido por excitação e emissão de comprimento deonda de 380 nm e 460 nm respectivamente. A atividade de catepsina L determinada é em-pregada como uma indicação da quantidade de procatepsina L no material derivado do sis-tema de expressão de célula de mamífero, por exemplo, células de ovário de hamster Chi-nês (CHO).

Em uma modalidade, o primeiro eluído compreende atividade de catepsina L vari-ando entre cerca de 25 a cerca de 60 RFU/s/mg de anticorpo. Em outra modalidade, o pri-meiro fluxo atravessante compreende atividade de catepsina L variando entre cerca de 0,4 acerca de 4 RFU/s/mg de anticorpo. Em uma modalidade, o segundo eluído compreende ati-vidade de catepsina L variando entre cerca de 0,5 a cerca de 1,5 RFU/s/mg de anticorpo.

A invenção também abranger as faixas intermediárias para as quantidades acimarelatadas são também entendidas serem parte da invenção. Por exemplo, as faixas de valo-res empregando uma combinação de qualquer dos valores acima relatados como limitessuperiores e/ ou inferiores são entendidos serem incluídos, assim como qualquer númeroentre a faixa descrita.

A invenção inclui quaisquer modificações acima mencionadas, sozinhas ou emcombinação com uma outra.

VI. Composições farmacêuticas

Os anticorpos obtidos empregando o processo da invenção podem ser incorpora-dos nas composições farmacêuticas adequadas para administrar a um paciente. Tipicamen-te, a composição farmacêutica compreende um anticorpo, ou porção de ligação de antígenodeste, e um portador farmaceuticamente aceitável. Como empregado aqui, "portador farma-ceuticamente aceitável" inclui qualquer e todos os solventes, meios de dispersão, revesti-mentos, agentes antibacterianos e antifúngicos, agentes retardantes de absorção e isotôni-cos, e tipos os quais são fisiologicamente compatíveis. Os exemplos de portadores farma-ceuticamente aceitáveis incluem um ou mais de água, salino, salino armazenado de fosfato,dextrose, glicerol, etanol e tipos, assim como combinações destes. Em muitos casos, é pre-ferível incluir agentes isotônicos, por exemplo, açúcares, poliálcoois tais como manitol, sorbi-tol, ou cloreto de sódio na composição. Os portadores farmaceuticamente aceitáveis podemainda compreender menor quantidade de substâncias auxiliares tais como agentes de emul-sificação ou umectação, preservativos ou tampões, os quais realçam a vida de prateleira ouefetividade de anticorpo, ou porção de ligação de antígeno destes.

Composições farmacêuticas compreendendo anticorpos, ou porções de ligação deantígeno destes, purificadas empregando os métodos da invenção podem ser achadas emuma variedade de formas. Estas incluem, por exemplo, formas de dosagem sólida, semi-sólida e líquida, tais como soluções líquidas (por exemplo, soluções injetáveis e infusíveis),dispersões ou suspensões, comprimidos, pílulas, pós, Iipossomas e supositórios. A formapreferida depende do modo pretendido de aplicação terapêutica e administração. As com-posições típicas preferidas são na forma de soluções injetáveis ou infusíveis, tais comocomposições similares àquelas empregadas para imunização passiva de humanos com ou-tros anticorpos ou outros inibidores do TNFa. O modo preferido de administração é parente-ral (por exemplo, intravenosa, subcutânea, intraperitoneal, intramuscular). Em uma modali-dade preferida, o anticorpo é administrado por injeção ou infusão intravenosa. Em outra mo-dalidade preferida, o anticorpo é administrado por injeção intramuscular ou subcutânea.

As composições tipicamente terapêuticas devem ser estéreis e estáveis sobre ascondições de fabricação e armazenagem. A composição pode ser formulada como uma so-lução, micro-emulsão, dispersão, lipossoma, ou outra estrutura ordenada adequada paraconcentração elevada de droga. As soluções injetáveis estéreis podem ser preparadas porincorporar o composto ativo (isto é, anticorpo, ou porção de ligação de antígeno deste) naquantidade requerida em um solvente adequado com uma ou uma combinação de ingredi-entes enumerados acima, como requerido, seguida por esterilização filtrada. De modo geral,as dispersões são preparadas por incorporar o composto ativo em um veículo estéril quecontém um meio de dispersão básico e os outros ingredientes requeridos daqueles enume-rados acima. No caso de pós estéreis para a preparação de soluções injetáveis estéreis, osmétodos preferidos da preparação são secagem à vácuo e secagem por congelamento queproduzem um pó do ingrediente ativo acrescido de qualquer ingrediente adicional desejadode uma solução estéril previamente filtrada destes. A fluidez adequada de uma solução po-de ser mantida, por exemplo, pelo uso de um revestimento tal como lecitina, pela manuten-ção da partícula de tamanho requerido no caso de dispersão e pelo uso de tensoativos. Aabsorção prolongada de composições injetáveis pode ser conduzida aproximadamente porincluir na composição um agente que retarda a absorção, por exemplo, sais de monoestea-rato, e gelatina.

Os compostos ativos suplementares podem também ser incorporados nas compo-sições. Em certas modalidades, um anticorpo, ou porção de ligação de antígeno deste, parauso nos métodos da invenção é co-formulado com e/ ou co-administrado com um ou maisagentes terapêuticos adicionais. Por exemplo, um anticorpo anti-hTNFa ou porção de anti-corpo da invenção pode ser co-formulada e/ ou co-administrada com um ou mais DMARDou uma ou mais NSAID ou um ou mais anticorpos adicionais que se ligam a outros alvos(por exemplo, anticorpos que se ligam a outras citocinas ou que se ligam as moléculas dasuperfície da célula), uma ou mais citocinas, receptor de TNFct solúvel (veja, por exemplo,Publicação PCT No. WO 94/06476) e/ ou um ou mais agentes químicos que inibem a ativi-dade ou produção de hTNFo (tais como derivados de cicloexano ilideno como descrito emPublicação PCT No. WO 93/19751) ou qualquer combinação deste. Além disso, um ou maisanticorpos da invenção podem ser empregados em combinação com dois ou mais agentesterapêuticos antecedentes. Tais combinações terapêuticas podem vantajosamente utilizardosagens inferiores dos agentes terapêuticos administrados, deste modo evitando possíveisefeitos colaterais, complicações ou nível baixo de resposta pelo paciente associado com asvárias monoterapias.

Em uma modalidade, a invenção inclui composições farmacêuticas compreendendouma quantidade efetiva de um anticorpo do TNFct, ou porção de ligação de antígeno deste,e um portador farmaceuticamente aceitável, onde a quantidade efetiva do anticorpo do TN-Fct pode ser efetiva para tratar um distúrbio de TNFct relacionado, incluindo, por exemplo,Doença de Crohn. Em uma modalidade, o anticorpo ou porção de anticorpo é incorporadoem uma formulação farmacêutica como descrita em PCT/IB03/04502 e Pedido dos EstadosUnidos No. 10/222140, incorporados aqui por referência. A formulação inclui uma concen-tração de 50 mg/ml da adalimumabe de anticorpo, onde uma seringa pre-carregada contém40 mg de anticorpo para injeção subcutânea.

Os anticorpos, ou porções de anticorpo, obtidos empregando os métodos da pre-sente invenção podem ser administrados por uma variedade de métodos conhecidos natécnica, ainda que para muitas aplicações terapêuticas, a rotina/ modo preferido de adminis-tração é injeção subcutânea. Em outra modalidade, a administração é através de infusão ouinjeção intravenosa. Como deve ser observado pelo versado na técnica, a rotina e/ ou modode administração deve variar dependendo dos resultados desejados. Em certas modalida-des, o composto ativo pode ser preparado com um portador que deve proteger o compostocom liberação rápida, tal como uma formulação de liberação controlada, incluindo sistemasde liberação micro-encapsulados e implantes, emplastros transdérmicos. Os polímeros bio-compatíveis, biodegradáveis podem ser empregados, tais como ácido polilático, poliortoés-teres, colágeno, ácido poliglicólico, poiianidridos, acetato de vinila etileno. Muitos métodospara a preparação de tais formulações são patenteados ou de modo geral conhecidos poraqueles versados na técnica. Veja, por exemplo, Sustained and Controlled Release DrugDefígado y Systems, J.R. Robinson, ed., Mareei Dekker, Inc., New York, 1978.

Os anticorpos, ou porção de ligação de antígeno destes, obtidos empregando osmétodos da invenção podem também ser administrados na forma de formulações de cristaisde proteína as quais incluem uma combinação de cristais de proteína encapsulados em umaforma de portador polimérico para formar partículas revestidas. As partículas revestidas daformulação de cristal de proteína podem ter uma morfologia esférica e serem micro-esferasde até 500 micrômetros de diâmetro ou podem ter algumas outras morfologias e serem mi-croparticulados. A concentração realçada de cristais de proteína permitem o anticorpo dainvenção ser liberada subeutaneamente. Em uma modalidade, os anticorpos da invençãosão liberados através de um sistema de liberação de proteína, onde uma ou mais de umacomposição ou formulação de cristal de proteína, é administrada a um paciente com umdistúrbio relacionado ao TNFa. As composições e métodos de preparo das formulações es-tabilizadas de cristais de anticorpo completo ou cristas de fragmentos do anticorpo são tam-bém descritos em WO 02/072636, o qual é incorporado aqui por referência. Em uma moda-lidade, uma formulação compreendendo os fragmentos de anticorpo cristalizados descritosem PCT/IB03/04502 e Pedido dos Estados Unidos No. 10/222140, incorporados aqui porreferência, são empregados para tratar um distúrbio relacionado ao TNFo empregando osmétodos de dose de variável múltipla da invenção.

Em certas modalidades, anticorpos, ou porção de ligação de antígeno destes, obti-do empregando os métodos da invenção pode ser oralmente administrados, por exemplo,com um diluente inerte ou um portador comestível assimilável. O composto (e outros ingre-dientes, se desejados) pode também ser fechado em uma cápsula de gelatina de casa ma-cia ou dura, comprimida em comprimidos, ou incorporada diretamente na dieta do paciente.Para administração terapêutica oral, os compostos podem ser incorporados com excipientese empregados na forma de comprimidos ingeríveis, comprimidos bucais, pastilhas, cápsulas,elixires, suspensões, xaropes, wafers, e tipos. Para administrar um composto da invençãodiferente da administração parenteral, pode ser necessário revestir o composto com, ou co-administrar o composto com, um material pra prevenir esta inativação.

As composições farmacêuticas da invenção podem incluir uma "quantidade tera-peuticamente efetiva" ou uma "quantidade profilaticamente efetiva" de um anticorpo ou por-ção de ligação de antígeno destes da invenção. Uma "quantidade terapeuticamente efetiva"se refere a uma quantidade efetiva, em dosagens e durante períodos de tempo necessários,para obter o resultado terapêutico desejado. Uma quantidade terapeuticamente efetiva doanticorpo, ou porção de ligação do antígeno destes, pode variar de acordo com os fatorestais como estágio da doença, idade, sexo, e peso do indivíduo, e a habilidade do anticorpo,porção de anticorpo, outros inibidores de TNFa para obter uma resposta desejada no indiví-duo. Uma quantidade terapeuticamente efetiva é também uma em que quaisquer efeitostóxicos ou prejudiciais do anticorpo, ou porção de ligação do antígeno destes, são mais im-portantes que os efeitos terapeuticamente benéficos. Uma "quantidade profilaticamente efe-tiva" se refere a uma quantidade efetiva, em dosagens e durante períodos de tempo neces-sários, para obter o resultado profilático desejado. Tipicamente, uma vez que uma dose pro-filática é empregada em paciente antes de ou em um estágio anterior da doença, a quanti- dade profilaticamente efetiva deve ser menor do que a quantidade terapeuticamente efetiva.

Os regimes de dosagem podem ser ajustados para fornecer a resposta desejadaideal (por exemplo, uma resposta terapêutica ou profilática). Por exemplo, uma pílula grandeúnica pode ser administrada, diversas doses divididas podem ser administrada durante umtempo ou a dose pode ser proporcionalmente reduzida ou aumentada como indicado pelasexigências da situação terapêutica. É especialmente vantajoso formular composições paren-terais em forma de unidade de dosagem para facilitar a administração e uniformidade dedosagem. A forma de unidade de dosagem como empregada aqui se refere a unidades fisi-camente discretas adequadas como dosagens unitárias para os pacientes mamíferos a se-rem tratados; cada unidade compreendendo uma quantidade pré-determinada de composto ativo calculado para produzir o efeito terapêutico desejado em associação com o portadorfarmacêutico requerido. As especificações para as formas de unidade de dosagem da in-venção são ordenadas por e diretamente dependente das (a) características únicas do com-posto ativo e o efeito profilático e terapêutico particular a ser obtido, e (b) como limitaçõesinerentes na técnica de compor tal composto ativo para o tratamento de sensibilidade em indivíduos.

Um exemplar de faixa não limitada para uma quantidade terapeuticamente ou profi-laticamente efetiva de um anticorpo, ou porção de ligação de antígeno destes, é de 10 a 200mg, mais preferivelmente de 20 a 160 mg, mais preferivelmente de 40 a 80 mg, e mais pre-ferivelmente de 80 mg. Em uma modalidade, a quantidade terapeuticamente efetiva de um anticorpo ou, porção de ligação do antígeno desta é de cerca de 20 mg. Em outra modalida-de, a quantidade terapeuticamente efetiva de um anticorpo ou porção desta é de cerca de40 mg. Ainda em outra modalidade, a quantidade terapeuticamente efetiva de um anticorpoou, porção de ligação de antígeno destes, é de cerca de 80 mg. Em uma modalidade, aquantidade terapeuticamente efetiva de um anticorpo ou porção destes para uso nos méto- dos da invenção é de cerca de 120 mg. Ainda em outra modalidade, a quantidade terapeuti-camente efetiva de um anticorpo, ou porção de ligação de antígeno destes, é de cerca de160 mg. Faixas intermediárias para as dosagens acima relacionadas, por exemplo, de cercade 78,5 a cerca de 81,5; de cerca de 15 a cerca de 25; de cerca de 30 a cerca de 50; decerca de 60 a cerca de 100; de cerca de 90 a cerca de 150; de cerca de 120 a cerca de 200,são também pretendido ser parte da invenção. Por exemplo, as faixas de valores empre-gando uma combinação de quaisquer dos valores relacionados acima como limites superio-res e/ ou inferiores são pretendidos serem incluídos.

É para ser notado que os valores das dosagens podem variar com o tipo e severi-dade da condição a ser aliviada. É para ser ainda entendido que para qualquer pacienteparticular, regimes de dosagem específica devem ser ajustados durante um tempo de acor-do com a necessidade do indivíduo e o julgamento profissional da pessoa administrando ousupervisionando a administração das composições, e que as faixas de dosagem apresenta-das aqui são exemplares somente e não são pretendidas limitar o escopo ou prática dacomposição reivindicada.

Os anticorpos, ou porções de anticorpos destes, obtido empregando os métodos dainvenção podem ser administrados em um regime de dosagem bi-semanal como descritoem WO 02/100330, um regime de dose baixa como descrito em WO 04/037205, e um regi-me de dosagem de variável múltipla como descrito em WO 05/110452, cada das quais éincorporada aqui por referência.

A invenção também se refere a composições farmacêuticas embaladas, artigos defabricação, ou kits compreendendo o anticorpo, ou porção de ligação de antígeno destes,obtidas empregando o processo da invenção. O artigo de fabricação pode compreender umanticorpo, ou porção de antígeno de ligação destes, obtido empregando o método da inven-ção e material de embalagem. O artigo de fabricação pode também compreender rótulo ouencarte de embalagem indicando uma formulação ou composição compreendendo o anti-corpo, ou porção de ligação do antígeno destes, tem um nível reduzido de HCP e/ ou proca-tepsina L. O artigo de fabricação pode compreender um rótulo ou encarte de embalagemcontido no material de embalagem indicando que a formulação de adalimumabe não com-preende mais do que cerca de 70 ng/mg de HCP ou um rótulo ou encarte de embalagemcontido no material de embalagem indicando que a formulação de adalimumabe não com-preende mais do que cerca de 13 ng/mg. O artigo de fabricação pode compreender um rótu-lo ou encarte de embalagem contido no material de embalagem indicando que a formulaçãode adalimumabe não compreende mais do que cerca de 5 ng HCP/mg de adalimumabe. Oartigo de fabricação pode também compreender material de embalagem indicando que aformulação de adalimumabe não compreende mais um nível de procatepsina L do que a-quele indicado por uma atividade de catepsina L de cerca de 3,0 RFU/s/mg de adalimumabe.

VII. Métodos de tratamento

Um método da invenção para produzir uma preparação de anticorpo HCP- ou pro-catepsina L reduzida que pode ser empregada para atividade de inibição do TNFct em umpaciente sofrendo de um distúrbio em que a atividade do TNFa é prejudicial. O TNFo foiimplicado na fisiopatologia de uma ampla variedade de distúrbios (veja, por exemplo, Moel-ler, A., e outros (1990) Cytokine 2:162-169; Patente dos Estados Unidos No. 5.231.024 porMoeller e outros; Publicação de Patente Européia No. 260 610 Bl por Moeller, Α.). O TNFafoi implicado na fisiopatologia de uma ampla variedade de distúrbios relacionados ao TNFaincluindo sepse, infecções, doenças auto-imunes, rejeição ao transplante e doença do en-xerto versus hospedeiro (veja, por exemplo, Moeller, A., e outros (1990) Cytokine 2:162-169;Patente dos Estados Unidos No. 5.231.024 por Moeller e outros; Publicação de Patente Eu-ropéia No. 260 610 Bl por Moeller, A., e outros Vasilli, P. (1992) Annu. Rev. Immunol.10:411-452; Tracey1 K.J. e Cerami, A. (1994) Annu. Rev. Med. 45:491-503). Um método dainvenção para produzir métodos de preparação de anticorpos de HCP- ou procatepsina Lreduzida os quais são benéficos para inibir a atividade do TNFa em um paciente sofrendo deum distúrbio relacionado ao TNFa, qualquer método compreende administrar a um pacienteuma dose por indução inicial e subseqüentemente administrar uma dose de a tratamento deum anticorpo, ou fragmento de ligação de antígeno destes, tal que a atividade do TNFa éinibida. Preferivelmente, o TNFa é TNFa humano e o paciente é um paciente humano. Emuma modalidade, o inibidor de TNFa é adalimumabe, também referido como HUMIRA®(D2E7).

Como empregado aqui, o termo "um distúrbio em que a atividade de TNFa é preju-dicial" é pretendido incluir doenças e outros distúrbios em que a presença do TNFa em umpaciente sofrendo do distúrbio tem sido mostrada ser ou é suspeitado de ser qualquer res-ponsável para a fisiopatologia do distúrbio ou um fator que contribui para uma piora do dis-túrbio. Deste modo, um distúrbio em que a atividade do TNFa é prejudicial é um distúrbio emque a inibição da atividade do TNFa é esperada para aliviar os sintomas e/ ou progredir ãodo distúrbio. Tais distúrbios podem ser evidenciados, por exemplo, por um aumento na con-centração de TNFa em um fluído biológico de um paciente sofrendo do distúrbio (por exem-plo, um aumento na concentração de TNFa em soro, plasma, fluído sinovial, etc. do pacien-te), que pode ser detectado, por exemplo, empregando um anticorpo anti-TNFa como des-crito acima. Existem numerosos exemplos de distúrbios em que a atividade do TNFa é pre-judicial. O uso de anticorpos de TNFa e porções de anticorpos obtidas empregando os mé-todos da invenção para o tratamento de distúrbios específicos é discutido mais abaixo:

A. Sepse

Fator de necrose tumoral tem um papel estabelecido na fisiopatologia de sepse,com efeitos biológicos que incluem hipotensão, supressão miocárdica, síndrome de derramevascular, necrose orgânica, estimulação da liberação de mediadores secundários tóxicos eativação da cascata de coagulação (veja, por exemplo, Moeller, A., e outros (1990) Cytokine2:162-169; Patente dos Estados Unidos No. 5.231.024 por Moeller e outros; Publicação dePatente Européia No. 260 610 Bl por Moeller1 A.; Tracey, KJ. e Cerami, A. (1994) Annu.Rev. Med. 45:491-503; Russell1 D e Thompson, R.C. (1993) Curr. Opin. Biotech. 4:714-721).Os métodos de dose múltipla variável da invenção podem ser empregados para tratar sepse em quaisquer aplicações clínicas, incluindo choque séptico, choque endotóxico, sepsegram-negativa e síndrome do choque tóxico.

Além disso, para tratar sepse, um anticorpo anti-hTNFa, ou porção de anticorpo,obtido empregando o processo da invenção pode ser co-administrado com um ou mais a -gentes terapêuticos adicionais que podem ainda aliviar a sepse, tal como um inibidor inter-leucina-1 (tal como aqueles descritos em Publicações PCT Nos. WO 92/16221 e WO92/17583), a citocina interleucina-6 (veja, por exemplo, Publicação PCT No. WO 93/11793)ou um antagonista de fator de ativação de plaqueta (veja, por exemplo, Pedido de PatenteEuropéia No. EP 374 510). Em uma modalidade preferida, um anticorpo anti-TNFff ou por-ção de anticorpo é administrada a um paciente humano em um subgrupo de pacientes com sepse tendo uma concentração de soro ou plasma de IL-6 acima de 500 pg/ml, e mais pre-ferivelmente de 1000 pg/ml, no momento do tratamento (veja, Publicação PCT No. WO95/20978 por Daum, L., e outros).

B. Doenças auto-imunes

Fator de necrose tumoral tem sido implicado na representação de um papel na fisi- opatologia de uma variedade de doenças auto-imunes. Por exemplo, o TNFct tem sido impli-cado em ativação de inflamação de tecido e causando destruição conjunta em artrite reuma-tóide (veja, por exemplo, Moeller1 A., e outros (1990) Cytokine 2:162-169; Patente dos Esta-dos Unidos No. 5.231.024 por Moeller e outros; Publicação de Patente Européia No. 260610 Bl por Moeller1 A.; Tracey e Cerami1 supra; Arend1 W.P. e Dayer1 J-M. (1995) Arth. Rheum. 38:151-160; Fava1 R.A., e outros (1993) Clin. Exp. Immunol. 94:261-266). O TNFfftambém tem sido implicado em promover a morte das células ilhotas e em mediar resistên-cia a insulina em diabetes (veja, por exemplo, Tracey e Cerami, supra; Publicação PCT No.WO 94/08609). O TNFff também tem sido implicado em mediar citotoxicidade para oligo-dendrócitos e indução de placas inflamatórias em esclerose múltipla (veja, por exemplo,Tracey e Cerami, supra). O TNFff também tem sido implicado em mediar a citotoxicidadepara oligodendrócitos e indução de placas inflamatórias em esclerose múltipla (veja, porexemplo, Tracey e Cerami, supra). Os anticorpos anti-hTNFff murino humanizado e quiméri-co tem suportado teste clínico para tratamento de artrite reumatóide (veja, por exemplo, Elli-ott, M.J., e outros (1994) Lancet 344:1125-1127; Elliot, MX, e outros (1994) Lancet 344:1105-1110; Rankin, E.C., e outros (1995) Br. J. Rheumatol. 34:334-342).

Os anticorpos de TNFff, tal como adalimumabe, podem ser empregados para tratardoenças auto-imunes, em particular àquelas associadas com inflamação. Os exemplos detais condições auto-imunes incluem artrite reumatóide, espondilite reumatóide, osteoartrite eartrite gotosa, alergia, esclerose múltipla, diabetes auto-imune, uveíte auto-imune e síndro-me nefrótica. Outros exemplos de condições auto-imunes incluem doenças auto-imunesmultissistêmica e perda de audição auto-imune.

Tipicamente, o anticorpo, ou porção de anticorpo, é administrado sistemicamente,ainda que certos distúrbios, administração local do anticorpo ou porção de anticorpo em umsítio de pode ser benéfico (por exemplo, administração local nas articulações com artritereumatóide ou aplicação tópica para úlceras diabéticas, sozinhas ou em combinação comum derivado de cicloexano-ilideno como descrito em Publicação PCT No. WO 93/19751). Osinibidores de TNFa1 incluindo anticorpos humanos, e porções de anticorpos tal como D2E7,também pode ser administrados com um ou mais agentes terapêuticos adicionais úteis notratamento por dose múltipla variável de doenças auto-imunes, como discutidos mais abai-xo.

Em uma modalidade da invenção, um anticorpo do TNFa obtido empregando osmétodos da invenção é empregado para tratar distúrbios auto-imunes tal como lúpus. O lú-pus foi mostrado ser associado com a atividade de TNF (Shvidel e outros (2002) Hematol J.3:32; Studnicka-Benke e outros (1996) Br J Rheumatol. 35:1067). O termo "lúpus" comoempregado aqui se refere a um distúrbio auto-imune inflamatório, crônico chamado lúpuseritematoso que pode afetas muitos sistemas orgânicos incluindo a pele, órgãos internos earticulações. O lúpus é um termo geral que inclui um número de tipos específicos de lúpus,incluindo lúpus sistêmico, nefrite do lúpus, e lúpus cerebrite. Em lúpus sistêmico (SLE), asdefesas naturais do corpo são viradas com o corpo e as células imunes se enganam ata-cando os tecidos do corpo. Os anticorpos podem ser produzidos o que pode reagir com ascélulas sangüíneas do corpo, órgãos, e tecidos. A reação conduz a células imunes atacandoos sistemas afetados, produzindo uma doença crônica. Nefrite do lúpus, também referidocomo doença glomerular por lúpus, é distúrbio do rim que é usualmente uma complicaçãode SLE, e é caracterizado por lesão para o glomérulo e perda progressiva da função do rim.O lúpus cerebrite se refere à outra complicação de SLE, que é a inflamação do sistema ner-voso central e/ ou cérebro. Outra doença auto-imune que pode ser tratada empregando umanticorpo do TNFa anticorpo é doença de Crohn1 a qual é descrita em mais detalhes abaixona Seção de Distúrbios Intestinais.

C. Doenças infecciosas

Fator de necrose tumoral tem sido implicado em mediação de efeitos biológicos ob-servados em uma variedade de doenças infecciosas. Por exemplo, o TNFa tem sido impli-cado em mediação de inflamação do cérebro e trombose capilar e infarto em malária. O TN-Fa também tem sido implicado em mediação de inflamação do cérebro, indução por rupturada barreira hematoencefálica, síndrome da causa do choque séptico e ativação do infartovenoso em meningite. O TNFct também tem sido implicado em caquexia indução, estimula-ção por proliferação viral e mediação por lesão do sistema nervoso central em síndrome daimunodeficiência adquirida (AIDS). Desse modo, os anticorpos, e porções de anticorpos,direcionados com o TNF, podem ser empregados para tratamento de doenças infecciosas, incluindo meningite bacteriana (veja, por exemplo, Pedido de Patente Européia No. EP 585705), malária cerebral, complexo de AIDS e AIDS relacionada (ARC) (veja, por exemplo,Pedido de Patente Européia No. EP 230 574), assim como infecção por citomegalovírussecundária para transplantação (veja, por exemplo, Fietze e outros (1994) Transplantation58:675). Os anticorpos, e porções de anticorpos, da invenção, também podem ser empre- gados para aliviar os sintomas associados doenças infecciosas, incluindo febre e mialgiasdevido à infecção (tal como resfriado) e caquexia secundária para infecção (por exemplo,secundária para AIDS ou ARC).

D. Transplantação

Fator de necrose tumoral tem sido implicado como um mediador de chave de rejei- ção a aloenxerto e doença do enxerto versus hospedeiro (GVHD) e em mediar uma reaçãoadversa que tem sido observada quando o anticorpo de rato OKT3, direcionado com o com-plexo CD3 de receptor de célula T, é empregado para inibir a rejeição de transplantes renais(veja, por exemplo, Eason e outros (1995) Transplantation 59:300; Suthanthiran e Strom(1994) New Engl. J. Med. 331 :365). Desse modo, os anticorpos, e porções de anticorpos, da invenção, podem ser empregados para inibir a rejeição ao transplante empregando tra-tamento com dose múltipla variável, incluindo rejeições de aloenxertos e xenoenxertos epara inibir GVHD. Ainda que o anticorpo ou porção de anticorpo possa ser empregado sozi-nho, mais preferivelmente é empregado em combinação com um ou mais agentes que ini-bem a resposta imune com o aloenxerto ou inibe GVHD. Por exemplo, em uma modalidade, um anticorpo ou porção de anticorpo da invenção é empregado em combinação com OKT3para inibir reações de OKT3 induzido. Em outra modalidade, um anticorpo ou porção de an-ticorpo da invenção é empregado em combinação com um ou mais anticorpos direcionadospara outros alvos envolvidos em regulação de respostas imune, tais como as moléculasCD25 da superfície da célula (receptor a de interleucina-2), CD11 a (LFA-I), CD54 (ICAM-I), CD4, CD45, CD28/CTLA4, CD80 (B7-1) et ou CD86 (B7-2). Ainda em outra modalidade, umanticorpo ou porção de anticorpo da invenção é empregado em combinação com um oumais agentes imunossupressores gerais, tal como ciclosporina A ou FK506.

E. Malignidade

Fator de necrose tumoral tem sido implicado em caquexia indução, estimulação de crescimento tumoral, realce de potencial metastático e mediação de citotoxicidade em ma-lignidades. Desse modo, os anticorpos, e porções de anticorpos, aqueles direcionados comTNF, podem ser empregados em tratamento de malignidades, onde o tratamento inibe ocrescimento tumoral ou metástase e/ ou alivia caquexia secundária para malignidade. Oanticorpo, ou porção de anticorpo, pode ser administrado sistemicamente ou localmentepara o sítio do tumor.

F. Distúrbios pulmonares

Fator de necrose tumoral tem sido implicado na fisiopatologia de síndrome da an-gústia respiratória de adulto (ARDS)1 incluindo estimulação da ativação de eucócito endote-Iial1 direcionando a citotoxicidade para pneumócitos e indução de síndrome de derrame vas-cular. O anticorpo obtido empregando os métodos da invenção pode ser empregado paratratar vários distúrbios pulmonares, incluindo síndrome da angústia respiratória de adulto(veja, por exemplo, Publicação PCT No. WO 91/04054), choque pulmonar, doença inflama-tória pulmonar crônica, sarcoidose pulmonar, fibrose pulmonar e silicose. O anticorpo, ouporção de anticorpo, pode ser administrado sistemicamente ou localmente para a superfíciepulmonar, por exemplo, como um aerosol. Um anticorpo, ou porção de anticorpo, tambémpode ser administrado com um ou mais agentes terapêuticos adicionais úteis no tratamento de distúrbios pulmonares, como mais abaixo.

Outros exemplos de distúrbios pulmonares em que o TNFa tem sido implicado nafisiopatologia incluem doença pulmonar intersticial idiopática e doenças das vias aéreas obs-trutivas crônicas (veja, por exemplo, Piquet e outros (1989) J Exp Med. 170:655; Whyte eoutros (2000) Am J Respir Crit Care Med. 162:755; Anticevich e outros (1995) Eur J Phar- macol. 284:221). A invenção ainda fornece métodos para tratar a atividade do TNFct em umpaciente sofrendo de tal distúrbio pulmonar, qualquer método compreende administrar aopaciente um anticorpo, ou porção de anticorpo, tal que a atividade do TNFct no paciente so-frendo de doença pulmonar intersticial idiopática ou uma doença das vias aéreas obstrutivascrônicas é inibida. Os exemplos de doenças pulmonares intersticiais idiopáticas e doenças das vias aéreas obstrutivas crônicas em que a atividade do TNFct é prejudicial são discuti-dos mais abaixo.

1. Doença pulmonar intersticial idiopática

Em uma modalidade, o anticorpo do TNFct obtido empregando o método da inven-ção é empregado para tratar pacientes que tem uma doença pulmonar intersticial idiopática. O termo "fibrose pulmonar idiopática" ou "IPF" se refere a um grupo de distúrbios caracteri-zados por inflamação e eventualmente cicatrização dos tecidos pulmonares profundos, dire-cionando para deficiência de respiratória. A cicatrização dos alvéolos (sacos de ar) e suasestruturas de sustentação (o interstício) em IPF eventualmente conduzem a uma perda dasunidades alveolares funcionais e uma redução da transferência de oxigênio do ar para o sangue. IPF é também referido como doença pulmonar parenquimatoso difusa; alveolite;alveolite fibrosante criptogênica (CFA); pneumonite pulmonar idiopática (IPP); e pneumoniteintersticial usual (UIP). IPF é muitas vezes empregada sinonimicamente com UIP("DPF/UTP") porque UIP é padrão celular mais comum observado na diagnose patológicade IPF. As doenças pulmonares intersticiais idiopáticas afetam os pulmões em três direções:primeiro, o tecido do pulmão é danificado em alguns lugares conhecidos e não conhecidos;segundo, as paredes dos sacos de ar no pulmão tornam-se inflamadas; e finalmente, cicatri-zação (ou fibrose) começa no interstício (ou tecido entre os sacos de ar), e o pulmão torna-se duro. Os exemplos de doenças pulmonares intersticiais idiopáticas incluem fibrose idiopá-tica pulmonar (IPF). O fator de necrose tumoral tem sido implicado na fisiopatologia de fibro-se pulmonar idiopática (IPF) (veja, Piquet e outros (1989) J Exp Med. 170:655; Whyte e ou-tros (2000) Am J Respir Crit Care Med 162:755 Corbett e outros (2002) Am J Respir CritCare Med. 165:690). Por exemplo, tem sido achado que os pacientes IPF tem níveis aumen-tados de expressão de TNF em macrófagos e em células epiteliais tipo Il (Piquet e outros(1993) Am J Pathol 143:651; Nash e outros (1993) Histopathology 22:343; Zhang e outros(1993) J Immunol 150:4188). Certos polimorfismos genéticos são também associados comexpressão aumentada de TNF, e são implicados em interpretar um papel em IPF e silicose(Whyte e outros, supra; Corbett e outros, supra).

Pacientes com IPF muitas vezes exibem certos sintomas, incluindo uma tosse seca,dor no tórax, e/ ou deficiência de respiração. As drogas comumente empregadas para o tra-tamento de IPF são prednisona e citoxano, ainda que apenas uma fração de pacientes me-lhore com o uso continuado destas drogas (American Torácica Society (2000) Am. J. Respir.Crit. Care Med. 161:646). A transplantação e administração por oxigênio dos pulmões sãooutras escolhas para o tratamento. Em uma modalidade, os anticorpos obtidos através dosmétodos da invenção podem ser empregados em combinação com outro agente terapêuti-co, por exemplo, oxigênio, para o tratamento de fibrose pulmonar idiopática.

Os exemplos de modelo s animais empregados para estudo de doença pulmonarintersticial idiopática e distúrbios obstrutivos das vias aéreas crônicos incluem ovalbumina(OVA) camundondo com asma alérgica induzida e camundongo com doença pulmonar obs-trutiva crônica induzida por fumaça de cigarro (veja, Hessel e outros (1995) Eur J Pharma-col. 293:401; Keast e outros (1981) J. Pathol. 135:249).

2. Distúrbio das vias aéreas obstrutivas crônicas

Em uma modalidade, um anticorpo do TNFα é empregado para tratar um pacienteque tem um distúrbio de fluxo de ar obstrutivo crônico. Nestas doenças, a obstrução do fluxode ar pode ser crônica e persistente e ou episódica e recorrente. A obstrução do fluxo de aré usualmente determinada por espirometria expiratória forçada, que é o registro do volumeexalado com o tempo durante uma expiração máxima. Em um paciente que não tem umfluxo de ar obstruído, uma expiração forçada total usualmente leva entre 3 e 4 segundos.

Em um paciente com distúrbio de fluxo de ar obstrutivo crônico, onde o fluxo de ar é obstruí-do, usualmente leva de 15 a 20 segundos e pode ser limitado por tempo de manutençãorespiratória. O volume expiratório forçado normal no primeiro segundo de expiração (FEVi) éfacilmente medido e acuradamente previsto com base na idade, sexo, e altura. A relação deFEV1 com a capidade viral forçada (FEV1/ FVC) normalmente excedem 0,75. Registro dofluxo de ar com o volume durante expiração forçada e a subseqüente inspiração forçada daalça di volume de fluxo é é também útil, principalmente para distinção superior do estreita-mento inferior das vias aéreas. Os exemplos de doenças das vias aéreas obstrutivas crôni-cas são descritas abaixo.

a. Asma

Fator de necrose tumoral tem sido implicado na fisiopatologia de asma, (Anticeviche outros (1995) Eur J Pharmacol. 284:221; Thomas e outros 1995. Am J Respir Crit CareMed. 152:76; Thomas e Heywood (2002) Thorax. 57:774). Por exemplo, os ataques de as-ma agudos têm sido achados ser associado com netrofilia pulmonar e níveis de TNF de BALelevados (Ordonez e outros (2000) Am J Respir Crit Care Med 161:1185). Tem sido achadaseveridade dos sistomas de asma correlatos com níveis de endotoxina na poeira da casa.Em ratos, os anticorpos anti-TNF reduz as mudanças na vias aéreas por endotoxina induzi-da (Kips e outros (1992) Am Rev Respir Dis 145:332).

O termo "asma" como empregado aqui, se refere a um distúrbio em que a inflama-ção das vias aéreas causa fluxo de ar dentro e fora dos pulmões para ser restrito. A asma étambém referida como asma brônquica, exercício induzido asma - brônquico, e doença dasvias aéreas reativas (RAD). Em alguns casos, a asma é associada com alergias e/ ou é fa-miliar. A asma inclui uma condição que é caracterizada por flutuações bastante difundidasno diâmetro ou calibre das vias aéreas brônquica sobre curtos períodos de tempo, resultan-do nas mudanças na função do pulmão. A resistência aumentada resultante ao fluxo de arproduz sintomas no paciente afetado, incluindo encurtamento da respiração (dispnéia),constrição do tórax ou "vedação," e chiado.

Os pacientes com asma são caracterizados de acordo com a diretriz de NIH, sãodescritas como intermitente branda, persistente branda, persistente moderada, e persistentesevera (veja, NAEPP Expert Panei Report Guidelines for the Diagnosis and Management ofAsthma-Update on Selected Topics 2002. JACI 2002; 110:S141-S209; Guidelines for theDiagnosis and Management of Asthma. Publicação NIH 97-4051, Julho de 1997). Os pacien-tes diagnosticados com asma persistente moderada são muitas vezes tratados com corti-costeróides inalados. Os pacientes diagnosticados com asma persistente severa são muitasvezes tratados com dose elevada de corticosteróides inalada e corticosteróides peroral.

b. Doença pulmonar obstrutiva crônica (COPD)

Fator de necrose tumoral tem sido implicado na fisiopatologia de doença pulmonarobstrutiva crônica, (Keatings (2000) Chest. 118:971; Sakao e outros (2001) Am J Respir CritCare Med. 163:420; Sakao e outros (2002) Chest. 122:416). O termo "doença pulmonar obs-trutiva crônica" ou "COPD" como empregado alternadamente aqui, se refere a um grupo dedoenças pulmonares caracterizadas por fluxo de ar limitado com graus variáveis com au-mento do saco de ar e destruição do tecido do pulmão. O termo COPD inclui bronquite crô-nica (hipersecreção da mucosa com hiperplasia de glândula submucosa de célula calicifor-me), bronquite obstrutiva crônica, ou enfisema (destruição das vias aéreas parênquima), oucombinações destas condições. O enfisema e bronquite crônica são as formas mais comunsde doença pulmonar obstrutiva crônica. A COPD é definida como obstrução irreversível dofluxo de ar.

Na COPD, a inflamação crônica conduz um estreitamento fixado de pequenas viasaéreas e parênquima do pulmão e destruição da parede alveolar (enfisema). É caracterizadapelo aumento de números de macrófagos alveolares, neutrófilos, e linfócitos T citotóxicos, ea liberação de mediadores inflamatórios múltiplos (lipídeos, quimiocinas, citocinas, fatoresde crescimento). Esta inflamação conduz a fibrose com um estreitamento da parede da viasaéreas e destruição parenquimatosa do pulmão. Há também um nível elevado de estresseoxidativo, que pode amplificar esta inflamação.

G. Distúrbios intestinais

Fator de necrose tumoral tem sido implicado na fisiopatologia de doença inflamató-ria do intestino incluindo Doença de Crohn (veja, por exemplo, Tracy e outros (1986) Scien-ce 234:470; Sun e outros (1988) J. Clin. Invest. 81:1328; MacDonaId e outros (1990) Clin.Exp. Immunol. 81:301). Os anticorpos anti-hTNFa de murino quimérico têm suportado testeclínico para tratamento de Doença de Crohn (van Dullemen e outros (1995) Gastroentero-Iogy 109:129). A invenção inclui tratamento compreendendo administrar a um anticorpo doTNFct obtido empregando o método da invenção para tratar distúrbios intestinais, tal comodoença inflamatória intestinal idiopática, empregando anticorpos humanos, ou fragmentosde ligação de antígeno destes. A doença inflamatória intestinal idiopática inclui duas síndro-mes, Doença de Crohn e colite ulcerativa. Em uma modalidade, um anticorpo obtido empre-gando o método da invenção é também empregado para tratar distúrbios muitas vezes as-sociados IBD e Doença de Crohn. O termo "doença inflamatória intestinal (IBD) relacionada"ou "Doença de Crohn relacionada ao distúrbio," com empregado alternadamente aqui, éempregado para descrever condições e complicações comumente associadas com IBD eDoença de Crohn.

A invenção inclui um regime de dose múltipla variável compreendendo administrarum anticorpo do TNFa para tratar Doença de Crohn. O tratamento de Doença de Crohn ébaseado na localização, extensão, e severidade da doença. As intervenções farmacológicasincluem agentes antiinflamatórios (aminosalicilatos e corticosteróides) e agentes imunomo-dulatórios (azatioprina e 6-mercaptopurina [6-MP], ciclosporina metotrexato [MTX], agentesantibióticos, e agentes biológicos). Os níveis de proteína C reativa (CRP) e velocidade desedimentação dos eritrócitos (ESR) refletem reações de fase aguda não específica. A en-doscopia é um meio primário de diagnose de Doença de Crohn. As características da radio-lógica Doença de Crohn são mostradas por exame do bário incluindo edema da mucosa,aftosa e ulcerações lineares, estreitamento assimétrico e de exatidão, na separação de al-ças adjacentes do intestino causadas por espessamento mesentérico. As anormalidadessão focais e assimétricas. A lesão histológica primária é uma úlcera aftosa. Os pacientescom Doença de Crohn podem ser avaliados empregando o índice de Atividade de Doençade Crohn (CDAI), que é uma medida padrão medida pela severidade da doença com eleva-das escores indicando atividade de doença mais severa.

Os exemplos de Doença de Crohn relacionada aos distúrbios que pode ser tratadaempregando os métodos da invenção incluindo fistulas na bexiga, vagina, e pele; obstruçõesintestinais; abscessos; deficiências nutricionais; complicações do uso de corticosteróide;inflamação das articulações; erythem nodosum; pioderma gangrenoso; e lesões dos olhos.Outros distúrbios comumente associados com Doença de Crohn incluem artralgias de Crohnrelacionad, fistulização de Crohn, colite indeterminante, e pouchitis.

H. Distúrbios cardíacos

Um anticorpo, ou fragmento de ligação de antígeno destes, obtido empregando ométodo da invenção também pode ser empregado para tratar os vários distúrbios coronaria-nos ou cardíacos, incluindo isquemia do coração (veja, por exemplo, Publicação de Pedidode Patente Européia No. EP 453 898) e insuficiência do coração (franqueza do músculo docoração) (veja, por exemplo, Publicação PCT No. WO 94/20139). O TNFa tem também sidoimplicado na fisiopatologia de restenose (veja, por exemplo, Clausell e outros (1994), supra;Medall e outros (1997) Heart 78:273).

Como empregado aqui, o termo "um distúrbio cardíaco em que a atividade do TNFaé prejudicial" é entendido incluir doenças coronarianas e cardiovascular em que a presençade TNFa em um paciente sofrendo do distúrbio tem sido mostrado ser ou é suspeitado serqualquer responsável para a fisiopatologia do distúrbio ou um fator que contribui para umapiora do distúrbio, incluindo distúrbios cardiovasculares, por exemplo, restenose. O termo"distúrbio cardiovascular" ou "distúrbio coronariano" como empregado alternadamente aqui,se refere a qualquer doença, distúrbio, ou estado envolvendo o sistema cardiovascular, porexemplo, o coração, os vasos sangüíneos, e/ ou o sangue. Um distúrbio coronariano é demodo geral caracterizado por um estreitamento dos vasos sangüíneos que fornecendo san-gue e oxigênio para o coração (artérias coronarias). Doença coronariana pode resultar dapreparação de material graxo e placa. Com artérias coronarias reduzidas, o fluxo de sanguepara coração pode ser lento ou parado. Os distúrbios coronarianos da invenção podem seaplicar a qualquer anormalidade de uma artéria, ou estrutural, histológica, bioquímica ouqualquer outra anormalidade. Um exemplo de doença cardíaca coronária é restenose. Emuma modalidade, um distúrbio coronariano se refere a qualquer doença, distúrbio, ou estadoenvolvendo o sistema cardiovascular excluindo isquemia do coração e insuficiência cardía-ca.

Os distúrbios coronarianos em que a atividade do TNFa é prejudicial muitas vezes resultado de um bloqueio em uma artéria. Tal bloqueio pode ser causado por um coágulo, oqual usualmente se forma em uma artéria coronária tendo sido previamente reduzida demudanças usualmente relacionada à aterosclerose. Por exemplo, se as placas ateroscleróti-cas contem as fissuras da parede arterial, pode causar a formação de um trombo, ou coágu-lo. Tais distúrbios podem ser evidenciados, por exemplo, por um aumento na concentração de TNFct em um fluído biológico de um paciente sofrendo do distúrbio (por exemplo, um au-mento na concentração de TNFct em soro, plasma, fluído sinovial, etc. do paciente), quepode ser detectado, por exemplo, empregando um anticorpo anti-TNFa como descrito aci-ma. Um distúrbio coronariano pode também causa por um desequilíbrio na pressão arterial,uma disfunção do coração, ou uma obstrução de um vaso sangüíneo, por exemplo, por umtrombo. Os distúrbios coronarianos incluem ambas as doença da artéria coronária e doençavascular periférica.

Existem numerosos exemplos de distúrbios cardíacos em que a atividade do TNFcté prejudicial, incluindo restenose. O uso dos anticorpos, porções de anticorpos, para de tra-tamento de distúrbios coronarianos específicos é discutido mais abaixo. Em certas modali- dades, um anticorpo, porção de anticorpo, é administrada ao paciente em combinação comoutro agente terapêutico, como descrito abaixo.

Os anticorpos obtidos empregando os métodos da invenção podem também serempregados para a inibição da atividade do TNFct em um paciente com distúrbio cardíaco. Ainvenção fornece métodos para inibir ou diminuir a atividade do TNFct em um paciente com um distúrbio coronariano, compreendendo administrar ao paciente um anticorpo, ou porçãode anticorpo, ou outro inibidor de TNFct da invenção tal que a atividade do TNFct no pacienteé inibida ou diminuída. Preferivelmente, o TNFct é TNFct humano e o paciente é um pacientehumano. Alternativamente, o paciente pode ser um mamífero expressando um TNFct comque um anticorpo da invenção reagindo por cruzamento. Entretanto também o paciente po- de ser um mamífero em que foi introduzido hTNFor (por exemplo, por administração de hTN-Fct ou por expressão de um IiTNFct transgene). Um anticorpo da invenção pode ser adminis-trado a um paciente humano para propósitos terapêuticos.

Além do mais, um anticorpo da invenção pode ser administrado a um mamífero nãohumano expressando um TNFct com que o anticorpo reage por cruzamento (por exemplo,um primata, porco ou camundongo) para propósitos veterinários ou como um modelo animalde doença humana. Quanto ao mais recente, tais modelos animais podem ser úteis paraavaliar a eficácia terapêutica de dose múltipla variável (por exemplo, testar as dosagens etempo lógico de administração). Os modelos animais comumente empregados para estudardistúrbios coronarianos, incluindo restenose, incluem modelo de ligação da artéria carótidade rato ou camundongo e o modelo de lesão da artéria carótida (Fems e outros (1991) Sci-ence 253:1129; Clowes e outros (1983) Lab. Invest. 49:208; Lindner e outros (1993) CircRes. 73:792). No modelo de ligação da artéria carótida, o fluxo de sangue arterial é inter-rompido por ligação do vaso próximo a bifurnação distai. Como descrito em Clowes e outros,o modelo de lesão da artéria carótida é desempenhada tal que a artéria carótida comum édesnuda do endotélio pela passagem intraluminal de um cateter balão introduzido atravésda artéria carótida externa. Em 2 semanas, a artéria carótida é acentuadamente reduzidadevido à constrição da célula de músculo pequeno, mas entre 2 e 12 semanas os duplosiniciais em espessura direcionando para uma diminuição no tamanho luminal. Quaisquerdestes modelos podem ser empregados para determinar a ação terapêutica potencial dosanticorpos de TNFo da invenção na prevenção e tratamento de restenose em humanos.

A invenção inclui tratamento de distúrbios cardiovasculares em que a atividade doTNFa é prejudicial, onde a inibição da atividade do TNFa é esperada para aliviar os sinto-mas e/ ou progredir ão da doença coronariana ou para prevenir a doença coronariana. Ospacientes sofrendo de ou em risco de desenvolver distúrbios coronarianos podem ser identi-ficados através de sintomas clínicos. Os sintomas clínicos em doença coronariana muitasvezes incluem dor no tórax, deficiência respiratória, fraqueza, períodos de desmaio, altera-ções de consciência, dor extrema, dispnéia noturna paroxística, ataques esquêmicos transi-tórios e outros tais fenômenos experimentado pelo paciente. Os sinais clínicos de doençacoronariana podem também incluir anormalidades EKG pulsos periféricos alterados, ruídosarteriais, sons cardíacos normais, taxas e sibilos, Distenção venosa da jugular, distençãovenosa da jugular, alterações neurológicas e outras tais descobertas percebidas pelo clínico.

Os distúrbios coronarianos podem também ser evidenciados, por exemplo, por um aumentona concentração de TNFct em um fluido biológico de um paciente sofrendo do distúrbio (porexemplo, um aumento na concentração de TNFa em soro, plasma, fluído sinovial, etc. dopaciente).

Os exemplos de um distúrbio cardiovascular incluem, mas não está limitado a, do-ença da artéria coronaria, angina pectoris, infarto do miocárdio, lesão do tecido cardiovascu-lar causada por parada cardíaca, lesão do tecido cardiovascular causada por desvio cardía-co, choque cardiogênico, e hipertensão, aterosclerose, espasmo da artéria coronaria, doen-ça da artéria coronaria, doença valvular, arritmias, e miocardiopatias. O uso dos anticorpos,porções de anticorpos, para tratamento de doenças cardiovasculares específicas são discu-tidos mais abaixo. Em certas modalidades, o anticorpo, porção de anticorpo, é administradaao paciente em combinação com outro agente terapêutico, como descrito abaixo.

1. RestenoseO termo "restenose" como empregado aqui se refere à recorrência de estenose,que é o estreitamento ou constrição de uma artéria. A restenose muitas vezes ocorre comouma lesão pre-oclusiva que se desenvolve em seguida a um procedimento reconstrutivo emum vaso sangüíneo do doente. O termo não é somente aplicado à recorrência de uma este- nose pre-existente, mas também para previamente normalizar os vasos que se tornam par-cialmente obstruídos em seguida ao desvio vascular. Em outra modalidade, a invenção for-nece um método de tratamento da restenose compreendendo administrar o anticorpo, ouporção de ligação de antígeno deste, obtido empregando a invenção a um paciente que temou está em risco de desenvolver restenose.

O TNFct tem sido implicado na fisiopatologia de restenose (veja, Zhou e outros(2002) Atheroesclerose. 161:153; Javed e outros (2002) Exp and Mol Pathol 73:104). Porexemplo, no modelo de carótida de fio de murino, TNF -/- camundongos demonstrados u-mas redução de sete vezes na hiperplasia inicial para camundongo do tipo selvagem (Zim-merman e outros (2002) Am J Phsiol Regul Integr Comp Physiol 283:R505). A restenosepode ocorre como o resultado de qualquer tipo de reconstrução vascular, ou na vasculaturacoronariana ou na periferia (Colqueimadura and Moore (1998) Myointimal Hiperplasia pp.690-709 em Vascular Surgery: A Comprehensive Review Philadelphia: Saunders). Por e-xemplo, estudos têm relatado ratos com restenose sintomática de 30-50% em seguida asangioplastias coronarianas (veja, Berk e Harris (1995) Adv. Intern. Med. 40:455). Após as endarterectomias de carótida, como mais exemplo, 20% dos pacientes estudados tem umestreitamento Iuminal maior do que 50% (Clagett e outros (1986) J. Vasc. Surg. 3:10). A res-tenose é evidenciada em diferentes graus de sintomatologia que acompanha lesões pre-oclusivas em diferentes localizações anatômicas, devido a uma combinação de fatores inclu-indo a natureza dos vasos envolvidos, a extensão da doença residual, e hemodinâmica Io- cal.

A "estenose," como empregada aqui se refere a um estreitamento de uma artériacomo observado em distúrbio oclusivo ou em restenose. A estenose pode ser acompanhadapor aqueles sintomas refletindo uma diminuição no fluxo sangüíneo passado o segmentoarterial reduzido, os quais causam o distúrbio concedendo aumento para a estenose é cha- mada uma disease (isto é, doença oclusiva ou doença de restenose). A estenose pode exis-tir assintomaticamente em um vaso, para ser detectada somente por uma intervenção diag-nostica tal como uma angiografia ou um estudo de laboratório vascular.

Os anticorpos obtidos empregando o método da invenção podem ser empregadospara tratar um paciente sofrendo de ou em risco de desenvolver restenose. Um paciente emrisco de desenvolver restenose inclui um paciente que tem suportado PTCA. O pacientepode ter também um stent inserido para prevenir restenose. O anticorpo do TNFct pode serempregado sozinho ou em combinação com um stent, para prevenir à re-ocorrência de es-tenose em um paciente sofrendo de doença cardiovascular.

2. Insuficiência cardíaca congestiva

O TNFa tem sido implicado na fisiopatologia de insuficiência cardíaca congestiva(veja, Zhou e outros (2002) Aterosclerose 161:153). Os níveis de soro do TNFa são eleva-dos em pacientes com insuficiência cardíaca congestiva de certo modo que é diretamenteproporcional à severidade da doença (Levine e outros (1990) N Engl J Med 323:236; Torre-Amione e outros (1996) J Am Coll Cardiol 27:1201). Além disso, os inibidores de TNFa têmtambém sido mostrados para melhorar os sintomas de insuficiência cardíaca congestiva(Chung e outros (2003) Circulation 107:3133).

Como empregado aqui, o termo "insuficiência cardíaca congestiva" inclui uma con-dição caracterizada por uma capacidade diminuída do coração para fornecer das demandasde oxigênio do corpo. Os sintomas e sinais de insuficiência cardíaca congestiva incluemfluxo sangüíneo diminuído para vários tecidos do corpo, acumulação de excesso de sanguenos vários órgãos, por exemplo, quando o coração é incapaz de produzir o sangue retorna-do para as grandes veias, dispnéia de esforço, fadiga, e/ ou edema periférico, por exemplo,edema periférico resultante de disfunção do ventrículo esquerdo. A insuficiência cardíacacongestiva pode ser aguda ou crônica. A manifestação da insuficiência cardíaca congestivausualmente ocorre secundária a uma variedade de distúrbios sistêmicos ou cardíacos quecompartilha uma perda permanente ou temporal da função cardíaca. Os exemplos de taisdistúrbios incluem hipertensão, doença da artéria coronaria, doença valvular, e miocardiopa-tias, por exemplo, miocardiopatias restritiva ou dilatada, hipertrófica.

Um "paciente que tem ou está sofrendo de insuficiência cardíaca congestiva" é umpaciente que tem um distúrbio envolvendo uma síndrome clínica de diversas etiologias liga-das pelo denominador comum de bombeamento cardíaco comprometido em que o coraçãonão pode bombear o sangue comensurável com as exigências dos tecidos metabolizadores,ou pode fazer, desse modo, somente de uma pressão de carga elevada. Um "paciente emrisco de desenvolver insuficiência cardíaca congestiva" é um paciente que tem uma propen-são de desenvolver insuficiência cardíaca congestiva por causa de certos fatores influenci-ando o sistema cardiovascular do paciente. É desejável reduzir o risco de ou prevenir o de-senvolvimento de insuficiência cardíaca congestiva nestes pacientes. A frase "com insufici-ência cardíaca congestiva" inclui paciente que estão em risco de sofrimento desta relativacondição para a população geral, até mesmo também não podem ter sofrido ainda, em vir-tude dos fatores de risco exibidos. Por exemplo, um paciente com hipertensão não tratadanão pode ter sofrido de insuficiência cardíaca congestiva, mas está em risco por causa deseu ou sua condição hipertensiva. Em uma modalidade da invenção, o anticorpo adalimu-mabe é empregado para tratar um paciente em riso de desenvolver insuficiência cardíacacongestiva.3. Síndromes coronarianas aguda

O TNFct tem sido implicado na fisiopatologia de síndromes coronarianas aguda (ve-ja, Libby (1995) Circulation 91:2844). As síndromes coronarianas aguda incluem aquelesdistúrbios onde o paciente experimenta a dor devido a uma restrição do fluxo sangüíneo nãoresultando em oxigênio o bastante alcançando the coração. Os estudos têm achado que oTNFa representa um papel nas síndromes coronarianas aguda. Por exemplo, em um mode-lo de ligação de transplantação coronariana cardíaco heterotrópico em rato novo capaz deinduzir o infarto do miocárdio na ausência de efeitos hemodinâmicos a jusante, administra-ção de receptor de TNF solúvel quimérico (sTNFR) de disfunção e remodeloação LV transi- tória abolida (Nakamura, e outros (2003) J. Cardiol. 41:41). Foi também achado que a inje-ção direta de um plasmídeo de expressão de sTNFR para o miocárdio, resultando na redu-ção do tamanho do infarto em infarto do miocárdio agudo (AMI) em ratos experimentais (Su-gano e outros (2002) FASEB J 16:1421).

Em uma modalidade, um anticorpo do TNFct é empregado para o tratamento ouprevenção de uma síndrome coronária aguda em um paciente, onde a síndrome coronáriaaguda é um infarto do miocárdio ou angina.

Como empregado aqui, o termo "infarto do miocárdio" ou "Ml" se refere a um ata-que do coração. Um infarto do miocárdio envolve a lesão permanente ou necorse de umaregião do coração devido a um fornecendo inadequado de oxigênio para aquela área. Esta necrose é tipicamente causada por uma obstrução em uma artéria coronaria de qualqueraterosclerose ou uma embolia. Os Mls os quais são tratados pelo anticorpo do TNFct obtidoempregando os métodos da invenção incluem ambos infarto do miocárdio de onda Q e ondanão Q. A maioria dos ataques do coração são causados por um coágulo que bloqueia umadas artérias coronarias (os vasos sangüíneos que trazem o sangue e o oxigênio para o músculo do coração). Por exemplo, um coágulo na artéria coronária interrompe o fluxo desangue e oxigênio para o músculo do coração, direcionando para a morte das células docoração naquela área. O músculo do coração danificado permanentemente pede esta habi-lidade para contrair, e músculo do coração restante necessita para compensar isto. Um Mlcan também ser causado por estresse opressivo no indivíduo.

O termo "angina" se refere um espasmódico, asfixia, ou dor sufocativa, e especial-mente como detonação por angina pectoris que é uma dor torácica paroxística devido, amaior parte muitas vezes, a anóxia do miocárdio. A angina inclui ambas as variantes anginae angina por esforço. Um paciente tendo angina tem doença cardíaca isquêmica a qual émanifestada por súbita, severa, dor substernal por pressão que muitas vezes irradia para o ombro esquerdo e ao longo do braço esquerdo. O TNFct tem sido implicado em angina, co-mo os níveis de TNFct são super-regulados em pacientes com ambos angina estável e Ml(Balbay e outros (2001) Angiology 52109).4. Arterosclerose

A "aterosclerose" como empregada aqui se refere a uma condição em que o mate-rial graxo é depositado ao longo das paredes das artérias. Este material graxo envolumosaa, endurece, e pode eventualmente bloquear as artérias. A aterosclerose é também referidacomo arteriosclerose, de endurecimento das artérias, e preparação de placa arterial. Os an-ticorpos policlonais direcionados como o TNFct têm sido mostrados ser efetivo em neutrali-zação da atividade do TNFct resultando em inflamação e restenose no modelo ateroscleróti-co de coelho (Zhou e outros, supra). Desse modo, um anticorpo do TNFct pode ser empre-gado para tratar ou prevenir pacientes aflingidos com ou em risco de ter aterosclerose.

5. Miocardiopatia

O termo "miocardiopatia" como empregado aqui é empregado para definir doençasdo miocárdio onde o músculo do coração ou miocárdio é enfraquecido, usualmente resul-tando em bombeamento de coração inadequado. A miocardiopatia pode ser causada porinfecções virais, infecções, ataques do coração, alcoolismo, longa duração, hipertensão se-vera (pressão sangüínea elevada), ou por causas auto-imunes.

Em aproximadamente 75-80% dos pacientes com insuficiência cardíaca de doençada artéria coronária é causa fundamental da miocardiopatia e é designada uma "miocardio-patia isquêmica." A miocardiopatia isquêmica é causada por ataques do coração, que levaas cicatrizes no músculo do coração ou miocárdio. O miocárdio afetado é então incapaz decontribuir para a função de bombeamento do coração bombeamento. A maior das cicatrizesou os mais numerosos ataques do coração, maior chance há de desenvolver miocardiopatiaisquêmica.

As miocardiopatias que não são atribuídas á doença da artéria coronária fundamen-tal, e são designadas "miocardiopatias não isquêmica." As miocardiopatias não isquêmicaincluem, mas não estão limitadas a miocardiopatia idiopática, hipertrófica miocardiopatia,miocardiopatia alcoólica, miocardiopatia dilatada, miocardiopatia periparto, e miocardiopatiarestritiva.

I. Espondiloartropatias

O TNFct tem sido implicado na fisiopatologia de uma ampla variedade de distúrbios,incluindo doenças inflamatórias tais como espondiloartopatias (veja, por exemplo, Moeller eoutros (1990) Cytokine 2:162; Patente dos Estados Unidos No. 5.231.024; Plublicação dePatente Européia No. 260 610). A invenção fornece métodos de dose múltipla variável parainibir a atividade do TNFct em um paciente sofrendo de uma espondiloartropatia, qualquermétodo compreende administar ao paciente um anticorpo, porção de anticorpo, tal que aatividade do TNFct no paciente sofrendo de uma espondiloartropatia é inibida.

Como empregado aqui, o termo "espondiloartropatia" ou "espondiloartropatias" éempregado se referindo a qualquer uma das diversas doenças afetando as articulações daespinha dorsal, onde tais doenças compartilham características clínicas comuns, radiológi-cas, e histológicas. Um número de espondiloartropatias compartilha de características gené-ticas, isto é são associadas com o alelo HLA-B27. Em uma modalidade, o termo espondilo-artropatia é empregado se referendo a qualquer uma das diversas doenças afetando as arti-culações da espinha dorsal, excluindo espondilite ancilosante, onde tais doenças comparti-lham caracterizas clínicas comuns, radiológicas, e histológicas. Os exemplos de espondilo-artropatias incluem espondilite ancilosante, artrite psoriática /espondilite, artrite enteropática,artrite reativa ou síndrome de Reiter, e espondiloartropatias não diferenciado. Os exemplosde modelo s animais empregados para estudar as espondiloartropatias incluem camundon- go transgênico ank/ank, ratos transgênicos HLA-B27 (veja, Taurog e outros (1998). TheSpondylarthritides. Oxford: Oxford University Press).

Os métodos de dose múltipla variável da invenção podem também ser empregadospara tartar paciente que estão em risco de desenvolver uma espondiloartropatia empregan-do métodos de cjose múltipla variável. Os exemplos de pacientes que estão em risco de ter espondiloartropatias incluem humanos sofrendo de artrite. As espondiloartropatias podemser assediadas com outras formas de artrite, incluindo artrite reumatóide. Em uma modali-Jade da invenção, os anticorpos são empregados em métodos de dose múltipla variávelpara tratar um paciente que sofre de uma espondiloartropatia associada com artrite reuma-tóide. Os exemplos de espondiloartropatias que podem ser tratados com um anticorpo doTNFa são descritos abaixo:

1. Espondilite ancilosante (AS)

O fator de necrose tumoral tem sido implicado na fisiopatologia de espondilite anci-losante (veja, Verjans e outros (1991) Arthritis Rheum. 34:486; Verjans e outros (1994) ClinExp Immunol. 97:45; Kaijtzel e outros (1999) Hum Immunol. 60:140). A espondilite ancilo- sante (AS) é um distúrbio inflamatório envolvendo a inflamação de uma ou mais vértebras. AAS é a doença inflamatória crônica que afeta o esqueleto axial e/ ou articulações periféricas,incluindo articulações entre a vértebra da espinha dorsal e articulações sacroilíacas e asarticulações entre a espinha dorsal e a pélvis. A AS pode eventualmente causar a vértebraafetada para fundir-se ou cultivar juntas. As espondiartropatias, incluindo AS, podem ser associadas com artrite psoriática (PsA) e/ ou doença inflamatória do intestino (IBD), incluin-do colite ulcerativa e Doença de Crohn.

As manifestações precoces de AS podem ser determinadas por testes radiográfi-cos, incluindo varredura de CT e varredura de MRI. As manifestações precoces de AS mui-tas vezes incluem sacroilites e mudanças nas articulações sacroilíacas como evidenciadopelo manchamento das margens corticais do osso subcondral, seguida por erosões e escle-rose. A fadiga tem também sido notada como um sintoma comum de AS (Duffy e outros(2002) ACR 66th Annual Scientific Meeting Abstract). Desse modo, os métodos de dosemúltipla variável compreendendo administrar um anticorpo, ou fragmentos de porção de li-gação de antígeno deste, da invenção podem ser empregados para tratar a AS.

Em uma modalidade, o método dose múltipla variável da invenção é empregado pa-ra tratar uma espondiloartropatia associada com IBD1 incluindo a AS. A AS é muitas vezestratada com medicações antiinflamatórias não esteroidais (NSAIDs), tais como aspirina ouindometacina. Desse modo, um anticorpo do TNFct empregado no método de dose múltiplavariável da invenção pode também ser administrado em combinação com os agentes co-mumente empregados para reduzir a inflamação e a dor comumente associada com espon-dilite ancilosante.

2. Artrite psoriática

Fator de necrose tumoral tem sido implicado na fisiopatologia de artrite psoriática(PsA) (Partsch e outros (1998) Ann Rheum Dis. 57:691; Ritchlin e outros (1998) J Rheuma-tol. 25:1544). Como referido aqui, artrite psoriática ou psoríase associado com a pele, serefere à artrite inflamatória crônica que é associada com psoríase, que é uma condição depele crônica comum que causa emplastros vermelhos no corpo. Cerca de 1 em 20 indiví-duos com psoríase deve desenvolver artrite junto com a condição de pele, e em cerca de75% dos casos, a psoríase precede a artrite. A PsA se exibe sozinha em uma variedade demeios, variando de artrite branda a severa, onde a artrite usualmente afeta os dedos e aespinha dorsal. Quando a espinha dorsal é afetada, os sintomas são similares àqueles deespondilite ancilosante, como descritos acima. O anticorpo do TNFct, ou fragmento de liga-ção de antígeno deste, obtido empregando a invenção pode ser empregado para tratamentode PsA.

A PsA é de vez em quando associada com artrite mutilante. A artrite mutilante serefere a um distúrbio que é caracterizado por erosão excessiva do osso resultando em umavolumosa, deformidade erosiva que mutila a articulação. Em uma modalidade, os anticorposobtidos empregando o método da invenção são empregados para tratar artrite mutilante.

3. Artrite reativa/ Síndrome de Reiter

O fator de necrose tumoral tem sido implicado na fisiopatologia da artrite reativa,que é também referida como síndrome de Reiter (Braun e outros (1999) Arthritis Rheum.42(10):2039). A artrite reativa (ReA) se refere à artrite que complica uma infecção em outraparte do corpo, muitas vezes em seguida as infecções entéricas ou urogenitais. A ReA émuitas vezes caracterizada por certos sintomas clínicos, incluindo inflamação das articula-ções (artrite), uretrite, conjuntivite, e lesões da pele e membranas mucosas. Além disso, aReA pode ocorrer em seguida à infecção com uma doença sexualmente transmitida ou in-fecção disentérica, incluindo clamídia, campilobactéria, salmonela, ou yersinia. Desse modo,os anticorpos obtidos empregando o método da invenção podem ser empregados para tratarReA.4. Espondiloartropatias não diferenciada

Em uma modalidade, os anticorpos obtidos empregando os métodos da invençãosão empregados para tratar pacientes sofrendo de espondiloartropatias não diferenciadas(veja, Zeidler e outros (1992) Rheum Dis Clin North Am. 18:187). Os outros termos empre- gados para descrever espondiloartropatias não diferenciadas incluem oligoartrite soronega-tiva e oligoartrite não diferenciada. As espondiloartropatias não diferenciadas, como empre-gadas aqui se referem a um distúrbio onde o paciente demonstra somente alguns dos sin-tomas associados com a espondiloartropatia. Esta condição é usualmente observada emadultos jovens que não têm IBD1 psoríase, ou os sintomas clássicos de AS ou síndrome de Reiter. Em alguns casos, as espondiloartropatias não diferenciadas podem ser uma indica-ção precoce de AS. Em uma modalidade, a invenção compreende administrar um anticorpodo TNFa, ou fragmento de ligação de antígeno deste, obtido empregando o processo reivin-dicado para tratar espondiloartropatias não diferenciadas.

J. Distúrbios metabólicos

O TNFa tem sido implicado na fisiopatologia de uma ampla variedade de distúrbios,incluindo distúrbios metabólicos, tais como diabetes e obesidade (Spiegelman e Hotamisligil(1993) Cell 73:625; Chu e outros (2000; Int J Obes Relat Metab Disord. 24:1085; Ishii e ou-tros (2000) Metabolism. 49:1616). O termo "distúrbio metabólico," como empregado aqui, serefere a doenças ou distúrbios que afetam como o corpo processa as substâncias necessá- rias para executar funções fisiológicas. Os exemplos de distúrbios metabólicos incluem, masnão limitados a, diabetes e obesidade. Em uma modalidade da invenção, o termo "distúrbiometabólico" é empregado para se referir a distúrbios que afetam como o corpo processa assubstâncias necessárias para executar as funções fisiológicas, excluindo diabetes auto-imune.

A invenção fornece métodos para inibir a atividade do TNFa em um paciente so-frendo de tal distúrbio metabólico, cujo método compreende administrar ao paciente um an-ticorpo, porção de anticorpo, tal que a atividade do TNFa no paciente sofrendo um distúrbiometabólico é inibida. Os anticorpos do TNFa podem também ser empregados para tratarpacientes que estão em risco de desenvolver um distúrbio metabólico.

Os distúrbios metabólicos são muitas vezes associados com artrite, incluindo artritereumatóide. Em uma modalidade, um inibidor de TNFa1 tal como um anticorpo, é empregadoem um regime de dose múltipla variável em um paciente que sofre de um distúrbio metabóli-co associado com artrite reumatóide. Em outra modalidade, a invenção compreende admi-nistrar um anticorpo do TNFa para tratar distúrbios associados diabetes ou obesidade.

Os exemplos de modelos animais para avaliar a eficácia de um anticorpo do TNFapara o tratamento de um distúrbio metabólico incluem camundongo transgênico NOD, ca-mundongo AKita, camundongo transgênico NSY e camundongo ob/ob (veja, Baeder e ou-tros (1992) Clin Exp lmmunol. 89:174; Haseyama e outros (2002) Tohoku J Exp Med.198:233; Makino e outros (1980): Exp.Anim. 29:1; Kolb (1987) Diabetes/Metabolism Reviews3:751; Hamada e outros (2001) Metabolism. 50:1282; Coleman1 (1978) Diabetologia1 14:141;Bailey e outros (1982) Int. J. Obesity 6:11). Os exemplos de modelos de animais emprega-dos para estudar vasculites incluem o modelo de camundongo HSV (doença de Behcet), omodelo de camundongo L. casei (doença Kawasaki), e o modelo de camundongo ANCA(doença de Kawasaki). Outros modelos de vasculite incluem linhagem McH5-lpr/lpr (Nose eoutros (1996) Am. J. Path. 149:1763) e a linhagem SCG/Kj de camundongos (Kinjoh e ou-tros (1993) Proc. Natl. Acad. Sci1 USA 90:3413). Estas linhagens de camundongo esponta-neamente desenvolvem glomerulonefrite crescente e vasculite necrosante das pequenasartérias e arteríolas do baço, estômago, coração, útero e ovários. Estes animais desenvol-vem hipergamaglobulinemia e auto-anticorpos ANCA que reagem com mieloperoxidase(MPO). Adicionalmente, a imunização de ratos com MPO humano resultada em glomerulo-nefrite crescente necrosante associada com ANCA (Brouwer e outros (1993) J. Exp. Med.177:905).

Os distúrbios metabólicos afetam com as substâncias dos processos do corpo ne-cessárias para executar funções fisiológicas. Um número de distúrbios metabólicos da in-venção compartilha certas características, isto é, é associada à resistência a insulina, faltade habilidade para regular o açúcar no sangue, ganho de peso, e aumento no índice demassa corpórea. Os exemplos de distúrbios metabólicos incluem diabetes e obesidade. Osexemplos de diabetes incluem diabetes melito do tipo 1, diabetes melito do tipo 2, neuropa-tia diabética, neuropatia periférica, retinopatia diabética, ulcerações diabéticas, ulceraçõesretinopáticas, macrovasculopatia diabética, e obesidade. Os exemplos de distúrbios metabó-licos os quais podem ser tratados empregando métodos de dose múltipla variável compre-endendo a administração de um anticorpo do TNFa anticorpo são descritos em mais deta-lhes abaixo:

1. Diabetes

O fator de necrose tumoral tem sido implicado na fisiopatologia de diabetes, (veja,por exemplo, Navarro e outros (2003) Am J Kidney Dis. 42:53; Daimon e outros (2003) Dia-betes Care. 26:2015; Zhang e outros (1999) J Tongji Med Univ. 19:203; Barbieri e outros(2003) Am J Hypertens. 16:537). Por exemplo, o TNFa é implicado na fisiopatologia pararesistência a insulina. Tem sido achado que os níveis de TNF em soro em pacientes comcâncer gastrointestinal correlatas com resistência à insulina (veja, por exemplo, McCaII eoutros (1992) Br. J. Surg. 79:1361).

O termo "diabetes" ou "distúrbio diabético" ou "diabetes melito," como empregadoalternadamente aqui, se refere a uma doença que é marcada por níveis elevados de açúcar(glicose) no sangue. A diabetes pode ser causada por muita pouca insulina (uma químicaproduzida pelo pâncreas para regular açúcar sangüíneo), resistência à insulina, ou ambas. Adiabetes inclui os dois mais comuns tipos do distúrbio, isto é, diabetes tipo I e diabetes tipoII, que resultam ambas da inabilidade do corpo regular a insulina. A insulina é um hormônioliberado pelo pâncreas em resposta aos níveis elevados de açúcar sangüíneo (glicose) no sangue.

O termo "diabetes tipo 1," como empregado aqui, se refere a uma doença crônicaque ocorre quando o pâncreas produz muito pouca insulina para regular os níveis de açúcarsangüíneo adequadamente. O diabetes tipo 1 é também referido como diabetes melito de-pendente de insulina, IDMM, diabetes juvenil, e diabetes - tipo I. A diabetes tipo 1 represen- ta o resultado de uma destruição auto-imune progredir iva das células β pancreáticas comsubseqüente deficiência a insulina.

O termo "diabetes tipo 2," se refere a uma doença crônica que ocorre quando opâncreas não produz insulina o bastante para manter os níveis normais de glicose no san-gue, muitas vezes porque o corpo não responde bem à insulina. A diabetes tipo 2 é também referida como diabetes melito não dependente à insulina, NDDM, e diabetes - tipo II.

A diabetes pode ser diagnosticada pela administração de um teste de tolerância àglicose. Clinicamente, a diabetes é muitas vezes dividida em diversas categorias básicas.Os exemplos primários destas categorias incluem diabetes melito auto-imune, diabetes meli-to não dependente à insulina (tipo 1 NDDM), diabetes melito dependente à insulina (tipo 2 IDDM), diabetes melito não auto-imune, diabetes melito não dependente à insulina (tipo 2NIDDM), e diabetes da maturidade no jovem (MODY). Mais uma categoria, muitas vezesreferida como secundária, se refere á diabetes conduzida quase pela mesma condição iden-tificável que causa ou permite uma síndrome diabética para desenvolve. Os exemplos se-cundários de categoria incluem diabetes causada por doença pancreática, anormalidades hormonais, diabetes induzido por química ou droga, diabetes causada por anormalidadesreceptora de insulina, diabetes associada com síndromes genéticas, e diabetes de outrascausas, (veja, por exemplo, Harrison's (1996) 14th ed., New York, McGraw-Hill).

A diabetes é muitas vezes tratada com dieta, dosagens de insulina, e várias medi-cações descritas aqui. Desse modo, um anticorpo do TNFct pode também ser administrado em combinação com agentes comumente empregados para tratar distúrbios metabólicos edor comumente associada com a diabetes.

Além disso, a frase "distúrbios associados com diabetes," como empregada aqui,se refere às condições e outras doenças que são comumente associadas com ou relaciona-da à diabetes. Os exemplos de distúrbios associados com a diabetes incluem, por exemplo, hiperglicemia, hiperinsulinemia, hiperlipidemia, resistência a insulina, metabolismo de glico-se prejudicado, obesidade, retinopatia diabética, degeneração macular, cataratas, nefropatiadiabética, glomeruloesclerose, neuropatia diabética, disfunção erétil, síndrome pré-menstrual, restenose vascular, colite ulcerativa, doença cardíaca coronária, hipertensão,angina pectoris, infarto do miocárdio, acidente vascular cerebral, pele e distúrbios do tecidoconjutivo, ulcerações do pé, acidose metabólica, artrite, e osteoporose.

A diabetes manifesta-se sozinha nas categorias antecedentes e podem causar di-versas complicações que são discutidas nas seguintes seções. Desse modo, o anticorpo, oufragmento de lição de antígeno deste, da invenção pode ser empregado para tratar diabetes.Em uma modalidade, um anticorpo do TNFct, ou fragmento de ligação de antígeno deste, éempregado para tratar diabetes associada com as categorias acima identificadas. Em outramodalidade, a invenção inclui administrar um anticorpo do TNFa para tratar distúrbios asso-ciados com a diabetes. A diabetes manisfesta-se sozinha em muitas complicações e condi-ções associadas com a diabetes, incluindo as seguintes categorias:

a. Neuropatia Diabética e Neuropatia Periférica

O fator de necrose tumoral tem sido implicado na fisiopatologia de neuropatia dia-bética e neuropatia periférica. (Veja, Benjafield e outros (2001) Diabetes Care 24:753; Qiange outros (1998) Diabetologia 41:1321; Pfeiffer e outros (1997) Horm Metab Res. 29:111).

O termo "neuropatia," também referido como diabética por dano do nervo, comoempregado aqui, se refere a uma complicação comum de diabetes em que os nervos sãodanificados como um resultado de hiperglicemia (níveis elevados de açúcar sangüíneo).Uma variedade de neuropatias diabéticas é reconhecida, tal como polineuropatia distai sen-sorimotor, neuropatia focai motora, e neuropatia autônoma.

O termo "neuropatia periférica," também conhecido como neurite periférica e neu-ropatia diabética, como empregado aqui, se refere à insuficiência dos nervos para transpor-tar informações para e do cérebro e medula espinhal. A neuropatia periférica produz sinto-mas tais como dor, perda de sensação, e a inabilidade para controlar os músculos. Em al-guns casos, a insuficiência de nervos para controlar os vasos sangüíneos, função intestinal,e outros órgãos resulta em pressão sangüínea anormal, digestão, e perda de outros proces-sos involuntários básicos. A neuropatia periférica pode envolver lesão a um nervo único ougrupo de nervos (mononeuropatia) ou pode afetar múltiplos nervos (polineuropatia).

As neuropatias que afetam poucas fibras mielinizadas e não mielinizadas dos ner-vos simpáticos e parassimpáticos são conhecidas como "neuropatias periféricas." Além dis-so, o distúrbio relacionado de neuropatia periférica, também conhecido como neurite perifé-rica e neuropatia diabética, se refere à insuficiência dos nervos para transportar informaçãopara e do cérebro e medula espinhal. Produz sintomas tais como dor, perda de sensação, ea inabilidade para controlar os músculos. Em alguns casos, a insuficiência dos nervos con-trolando os vasos sangüíneos, função intestinal, e outros órgãos resultada em pressão san-güínea anormal, digestão, e perda de outros processos involuntários básicos. A neuropatiaperiférica pode envolver lesão a um único nervo ou grupo de nervos (mononeuropatia) oupode afetar múltiplos nervos (polineuropatia).

O termo "neuropatia diabética" se refere a uma complicação comum de diabetesem que os nervos são danificados como um resultado de hiperglicemia (níveis elevados deaçúcar sangüíneo). A neuropatia diabética é também referida como neuropatia e dano no nervo diabético. A variedade de neuropatias diabéticas é reconhecida, tal como polineuropa-tia distai sensorimotor, neuropatia focai motora, e neuropatia autônoma,

b. Retinopatia diabética

O fator de necrose tumoral tem sido implicado na fisiopatologia de retinopatia diabé-tica (Scholz e outros (2003) Trends Microbiol. 11:171). O termo "retinopatia diabética" como empregado aqui, se refere à lesão progredir iva da retina dos olhos causada por diabetes delonga duração. A retinopatia diabética inclui retinopatia proliferativa. A neuropatia proliferati-va por sua vez inclui neovascularização, hemorragia da retina e descolamento da retina.

Em retinopatia avançada, pequenos vasos proliferar na superfície da retina. Estesvasos sangüíneos são frágeis, tendendo a sangrarem e podem causar hemorragias retinais. A hemorragia pode turvar a visão, e como a hemorragia é reabsorvida o tecido fibroso for-mas predisposição para deslocamento retinal e perda de visão. Além disso, a retinopatiadiabética inclui retinopatia proliferativa que inclui neovascularização, hemorragia retinal edeslocamento retinal. A retinopatia diabética também inclui "retinopatia antecedente" a qualenvolve mudanças ocorridas com as camadas da retina.

c. Ulcerações Diabéticas e Ulcerações retinopaticas

O fator de necrose tumoral tem sido implicado na fisiopatologia de ulcerações dia-béticas, (veja, Lee e outros (2003) Hum Immunol. 64:614; Navarro e outros (2003) Am JKidney Dis. 42:53; Daimon e outros (2003) Diabetes Care. 26:2015; Zhang e outros (1999) JTongji Med Univ. 19:203; Barbieri e outros (2003) Am J Hypertens. 16:537; Venn e outros(1993) Arthritis Rheum. 36:819; Westacott e outros (1994) J Rheumatol 21:1710).

O termo "ulcerações diabéticas," como empregado aqui, se refere a uma úlcera queresulta como uma complicação de diabetes. Uma úlcera é uma lesão tipo cratera na pele oumembrana mucosa causada por uma condição inflamatória, infecciosa, maligna ou distúrbiometabólico. Tipicamente as úlceras diabéticas podem ser achadas nos membros e mãos epés, mais tipicamente os pés. Estas úlceras, causadas por condições diabéticas, tais comoneuropatia e insuficiência vascular, podem conduzir à isquemia e fraca cura de ferida. Ulce-rações mais extensivas podem progredir para ostemielite. Uma vez desenvolve-se a ostemi-elite, pode ser difícil para erradicar com antibióticos somente e a amputação pode ser ne-cessária.

O termo "ulcerações retinopaticas," como empregado aqui se refere a uma úlcera aqual causa ou resulta em lesões para os olhos e a retina dos olhos. As ulcerações retinopa-ticas podem incluir condições que têm hemorragias retinóicas.d. Macrovasculopatia Diabética

0 fator de necrose tumoral tem sido implicado na fisiopatologia de macrovasculopa-tia diabética (Devaraj e outros (2000) Circulation. 102:191; Hattori e outros (2000) Cardio-vasc Res. 46:188; Clausell e outros (1999) Cardiovasc Pathol.8:145). O termo "macrovascu-lopatia diabética," também referido como "doença macrovascular," como empregado aqui,se refere a uma doença dos vasos sangüíneos que resultam de diabetes. A complicação damacrovasculopatia diabética ocorre quando, por exemplo, coágulos sangüíneos e de gordu-ra desenvolvidos nos grandes vasos sangüíneos e cola as paredes dos vasos. As macro-vasculopatias diabéticas incluem doenças tais como doença coronária, doença cerebrovas-cular, e doença vascular periférica, hiperglicemia e doença cardiovascular, e acidentes vas-culares cerebrais.

2. Obesidade

O fator de necrose tumoral tem sido implicado na fisiopatologia de obesidade (veja,por exemplo, Pihlajamaki J e outros (2003) Obes Res. 11:912; Barbieri e outros (2003) Am JHypertens. 16:537; Tsuda e outros (2003) J Nutr. 133:2125). O termo "obesidade" comoempregado aqui, se refere a uma condição em que o paciente tem um excesso gordura nocorpo em relação à massa do corpo sem gordura. Em uma modalidade, obesidade se referea uma condição em que um indivíduo pesa pelo menos cerca de 20% ou mais o desejávelmáximo para sua altura. Quando um adulto é mais do que 100 libras de sobrepeso, ele ouela é considerado ser "obesidade mórbida." Em outra modalidade, obesidade é definida co-mo um BMI (índice de massa corpórea ) acima de 30 kg/m2. A obesidade aumento o riscode uma pessoa de enfermidade e morte devido à diabetes, acidente vascular cerebral, do-ença da artéria coronária, hipertensão, colesterol elevado, e distúrbio do rim e da vesículabiliar. A obesidade pode também aumentar o risco para algum tipo de câncer, e pode ser umfator de riso para o desenvolvimento de osteoartrite e apnéia do sono.

K. Anemia

O TNFa tem sido implicado na fisiopatologia de uma ampla variedade de anemias(veja, por exemplo, Jongen-Lavrencic e outros (1997) J. Rheumatol. 24:1504; Demeter eoutros (2002) Ann Hematol. 81:566; DiCato (2003) The Oncologist 8 (suppl 1):19). A inven-ção fornece um método para inibir a atividade do TNFa em um paciente sofrendo de anemi-a, qualquer método compreende administrar ao paciente um anticorpo, porção do anticorpo,tal que a atividade do TNFa no paciente sofrendo de anemia é inibida. Em uma modalidade,a anemia é associada com artrite reumatóide.

O termo "anemia" como empregado aqui, se refere a um número anormalmentebaixo de células vermelhas circulantes ou uma concentração diminuída de hemoglobina nosangue. Os exemplos de anemia relacionada à artrite reumatóide incluem, por exemplo,anemia por doença crônica, anemia por deficiência de ferro, e anemia hemolítica auto-imune. Em uma modalidade, a invenção fornece um método de tratamento de anemias rela-cionada a, por exemplo, anemias relacionada à artrite reumatóide, anemias por infecção edoenças inflamatórias crônicas, anemia por deficiência de ferro, anemia hemolítica auto-imune, anemia mieloptisica, anemia aplásica, anemia hipoplásica, aplasia eritrocitária pura eanemia associada com insuficiência renal ou distúrbios endócrino, anemias megaloblásticas,defeitos em heme ou síntese globina, anemia causada por um defeito estrutural nas célulasvermelhas do sangue, por exemplo, anemia de célula foice, e anemias de origens não co-nhecidas tal como anemia sideroblática, anemia associada com infecções crônicas tais co-mo malária, tripanossomíase, HIV, vírus da hepatite ou outras viroses, e anemias mieloptisi-ca causada por deficiências da medula.

Os exemplos de modelos animais empregados para estudar anemia incluem ratosinoculados com polímeros peptidolglicano de polissacarídeo (veja, Coccia e outros, (2001)Exp Hematology. 29:1201-1209). Os exemplos de modelos animais empregados para estu-dar a dor são bem conhecidos na técnica, e incluem o modelo de ligação do nervo ciático dorato, e o modelo de ligação do nervo espinhal segmentar do rato (veja, Bennett e Zie1 (1988)Pain. 33:87-107; Kim e Chung, (1992) Pain 50:355-363).

L. Dor

O TNFa tem sido implicado na fisiopatologia de uma grande variedade de síndro-mes de dor (veja, por exemplo, Sorkin e outros (1997) Neuroscience. 81:255; Huygen e ou-tros (2002) Mediatores Inflamm. 11:47; Parada e outros (2003) Eur J Neurosci.17:1847). Otermo "dor" como empregado aqui, se refere a todos os tipos de dor. O termo deve se referira dores aguda e crônicas, tais como dor neuropática e dor pós-operatória, dor nas costasinferior crônica, cefaléias em salvas, herpes neuralgia, dor do membro-fantasma, dor central,dor dental, dor resistente a opióide, dor visceral, dor cirúrgica, dor por lesão no osso, dordurante o trabalho e liberação, dor resultante de queimaduras, incluindo queimadura de sol,dor pós-parto, enxaqueca, dor na angina, e dor por trato genitourinário relacionada incluindocistite. O termo também inclui dor nociceptiva ou nocicepção.

A invenção fornece métodos para inibir a atividade do TNFct em um paciente so-frendo de tal distúrbio por dor, qualquer método compreende administrar ao paciente umanticorpo, porção do anticorpo, tal que a atividade do TNFa no paciente sofrendo de dor éinibida. A dor tem sido definida em uma variedade de meios, incluindo dor nociceptiva e dorneuropática. A forma mais comumente experimentada de dor pode ser definida como o efei-to de estímulo nas terminações nervosas, que resultada na transmissão de impulsos no cé-rebro. A dor é também comumente associada com distúrbios inflamatórios, incluindo, porexemplo, artrite reumatóide. Em uma modalidade, o anticorpo da invenção é empregadopara tratar um paciente que sofre de dor associada com artrite reumatóide. Os exemplos dedistúrbios por dor em que a atividade do TNFa é prejudicial são discutidos mais abaixo.1. Dor neuropática

O fator de necrose tumoral tem sido implicado na fisiopatologia da dor neuropática(veja, Sommer (1999) Schmerz. 13:315; Empl e outros, (2001) Neurology. 56:1371; Schaferse outros (2003) J Neurosci. 23:3028). Como empregado aqui o termo "dor neuropática" serefere à dor que resulta de lesão a um nervo, medula espinhal, ou cérebro, e muitas vezesenvolvem supersensibilidade neural. Os exemplos de dor neuropática incluem dor nas cos-tas inferior crônica, dor associada com artrite, dor associada ao câncer, herpes neuralgia,dor do membro-fantasma, dor central, dor neuropática resistente a opióide, dor por lesão noosso, e dor durante o trabalho e liberação. Outros exemplos de dor neuropática incluem dorpós-operatória, cefaléias em salvas, dor dental, dor cirúrgica, dor resultante de severa, porexemplo grau três, queimaduras, dor pós-parto, dor na angina, dor de trato genitourináriorelacionado, e incluindo cistite.

A dor neuropática é distinguida de dor nociceptiva. A dor envolvendo um mecanis-mo nociceptivo usualmente é limitada em duração para o período de reparação de tecido ede modo geral é aliviada por agentes analgésicos viáveis ou opióides (Myers (1995) Regio-nal Anesthesia 20:173). A dor neuropática tipicamente é longa duração ou crônica e muitasvezes desenvolvem-se em dias ou meses seguidos em uma lesão do tecido agudo inicial. Ador neuropática pode envolver persistente, dor espontânea assim como alodinia, a qual é aresposta dolorosa para um estímulo que normalmente não é doloroso. A dor neuropáticatambém pode ser caracterizada por hiperalgesia, em que há uma resposta acentuada paraum estímulo doloroso que usualmente é trivial, tal como uma alfinetada. A dor nociceptivadiferente, dor neuropática de modo geral é resistente a terapia de opioíde (Myers, supra,1995). Desse modo, os anticorpos obtidos empregando os métodos da invenção podem serempregados tratar dor neuropática.

2. Dor nociceptiva

Como empregado aqui o termo "dor nociceptiva" se refere à dor que é transmitidoatravés de séries de reações neuronais intactas, isto é, dor causada por lesão no corpo. Ador nociceptiva inclui sensação somática e função normal da dor, e informa ao paciente deimpedindo a lesão do tecido. A série de reação nociceptiva existe para proteção do paciente,por exemplo, a dor experimentada em resposta a uma queimadura. A dor nociceptiva incluidor no osso, dor visceral, e dor associada com tecido macio.

O fator de necrose tumoral tem sido implicado na fisiopatologia de dor visceral (ve-ja, Coelho e outros (2000) Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 279:G781; Coelho e ou-tros (2000) Brain Res Buli. 52:223). A dor visceral é empregada referindo-se a dor nocicepti-va que é mediada por receptores em fibras nervosas Α-delta e C. As fibras nervosas A-deltae C que são localizadas na pele, osso, tecido conjuntivo, músculo e víscera. A dor visceralpode ser vaga na distribuição, espasmódico por natureza e é usualmente descrita como in-tensidade, sofrimento, pressão e cólica por natureza. Os exemplos de dor visceral incluemdor associada com um ataque do coração, onde a dor visceral pode ser percebida no braço,pescoço e/ ou costas, e dor na cápsula do rim, onde a dor visceral pode ser percebida nascostas e/ ou ombro direito. Desse modo, os anticorpos obtidos empregando a invenção po-dem ser empregados para tratar dor visceral.

M. Distúrbios hepáticos

O TNFct tem sido implicado na fisiopatologia de uma ampla variedade de distúrbioshepáticos (veja, por exemplo, Colletti e outros (1990) J Clin Invest. 85: 1936; Tiegs (1997)Acta Gastroenterol Belg. 60:176; Fernandez e outros (2000) J Endotoxin Res. 6:321). A in- venção fornece métodos para inibir a atividade do TNFa em um paciente sofrendo de taldistúrbio hepático.

Como empregado aqui, o termo "um distúrbio hepático no qual a atividade do TNFaé prejudicial" é entendido incluir doenças e outros distúrbios do fígado ou condições associ-adas com lesão hepatocelular ou distúrbios do trato biliar no qual a presença do TNFa em um paciente sofrendo do distúrbio tem sido mostrada ser ou é suspeitado de ser qualquerresponsável para a fisiopatologia do distúrbio ou um fator que contribui para uma piora dodistúrbio. Desse modo, um distúrbio hepático no qual a atividade do TNFa é prejudicial é umdistúrbio em que a inibição da atividade do TNFa é esperada aliviar os sintomas e/ ou pro-gredir do distúrbio hepático. Em uma modalidade, os distúrbios hepáticos se referem a umadoença no fígado humano ou condição associada com lesão hepatocelular ou um distúrbiodo trato biliar excluindo hepatite, hepatite alcoólica, hepatite viral.

Os exemplos de modelos de animais empregados para avaliar a eficácia terapêuti-ca de um agente para tratar um distúrbio hepático empregando métodos de dose múltiplavariável incluindo modelo de vírus de hepatite C de chipanzé (veja, Shimizu e outros (1990) Proc Natl Acad Sei. USA 87:6441). Os exemplos de modelos de animais empregados para oestudo da pele e distúrbios do distúrbio ungueal incluem, por exemplo, o modelo de camun-dongo com imunodeficiência severa combinada (SCID) (psoríase) e o pombo da linha Smith(SL) e camundongo depigmentando (vitiligo) (veja, Nickoloff (2000) Investig Dermatol SympProc. 5:67; Austin e outros (1995) Am J Pathol. 146:1529; Lerner e outros (1986) J Invest Dermatol. 87:299).

Os distúrbios hepáticos incluem muitas doenças e distúrbios onde as funções ina-dequadamente do fígado ou cessam a função. As lesões hepatocelulares podem incluir cir-rose alcoólica, dificiência de al antitipsina, cirrose auto-imune, cirrose criptogênica, hepatitefulminante, hepatite B e C, e esteatoepatite. Os exemplos de distúrbios do trato biliar inclu- em fibrose cística, cirrose biliar primária, colangite esclerosante e obstrução biliar (Wiesner(1996) "Current Indications, Contra Indications and Timing for Liver Transplatation" emTransplantation of the Liver, Saunders (publ.); Busuttil and Klintmalm (eds.) Chapter 6; Klein(1998) Partial Hipertension: The Role of Liver Transplantation, Musby (publ.) em CurrentSurgical Therapy 6.sup.th Ed. Cameron1 J. (ed).

O termo "hepatite" se refere à inflamação do fígado. A hepatite pode ser causadapor infecções em vários organismos, incluindo bactéria, viroses (Hepatite A, B1 C, etc.), ouparasitas. As toxinas químicas tais como álcool, drogas, ou poisonous mushrooms podemtambém Iesionar o fígado e causar to torna-se inflamado. Uma rara, mas extremamente pe-rigosa cause de hepatite resulta de overdose de acetaminofeno (Tylenol), que pode ser fatal.Além disso, as células imunes no corpo podem atacar o fígado e causa a hepatite auto-imune. A hepatite pode resolver rapidamente (hepatite aguda), ou causar doença de longaduração (hepatite crônica). Em alguns casos, progredindo a lesão no fígado ou insuficiênciado fígado podem resultar. A incidência e severidade da hepatite variam dependendo de mui-tos fatores, incluindo a causa da lesão do fígado e qualquer enfermidade fundamental nopaciente.

Em uma modalidade, a invenção caracteriza métodos para tratar um distúrbio hepá-tico em que a atividade do TNFct é prejudicial, compreendendo administrar ao paciente umaquantidade efetiva de um inibidor TNFa em uma dose por indução e subseqüentemente emuma dose de tratamento, tal que o referido distúrbio é tratado. Em uma modalidade, o dis-túrbio hepático é selecionado do grupo consistido em vírus da hepatite C, hepatite auto-imune, doença por gordura no fígado, vírus da hepatite B, hepatotoxicidade, e hepatite nãoalcoólica, incluindo esteatoepatite não alcoólica (NASH). Os exemplos de distúrbios hepáti-cos são ainda descritos abaixo.

1. Vírus da hepatite C (HCV)

O fator de necrose tumoral tem sido implicado na fisiopatologia do vírus da hepatiteC (veja, Gonzalez-Amaro. (1994) J Exp Med. 179:841; Nelson e outros (1997) Dig Dis Sci42:2487; Kallinowski e outros (1998) Clin Exp Immunol. 111:269). O termo "vírus da hepatiteC" ou "HCV" é empregado para descrever o vírus da hepatite o qual é o agente causador dehepatite não A, não Β. O vírus da hepatite C causa uma inflamação do fígado. A infecçãopor HCV causa hepatite C. A hepatite C no estagio agudo é, em geral, mais branda do que ahepatite B, mais uma proporção maior de tais infecções torna-se crônica. O HCV é a causamaior da hepatite aguda e doença crônica do fígado, incluindo cirrose e câncer no fígado. OHCV é uma das viroses (A, B, C, D, e E), que junto conta para a vasta maioria dos casos dehepatite viral. É um vírus RNA envolvido na família Flaviviridae que parecer ter uma faixahospedeira reduzida. Um importante aspecto do vírus é a mutabilidade relativa deste geno-ma, que por sua vez é provavelmente relacionada à elevada propensão (80%) de infecçãocrônica por indução. O HCV é agrupado nos diversos genótipos distintos que podem serimportantes em determinar a severidade da doença e a resposta ao tratamento. Em umamodalidade, a invenção fornece um método de dose múltipla variável para tratar a HCV.2. Hepatite Auto-imune (AIH)

O fator de necrose tumoral tem sido implicado na fisiopatologia de hepatite auto-imune (veja, Cookson e outros, (1999) Hepatology 30:851; Jazrawi e outros, (2003) LiverTranspl. 9:377). Como empregado aqui, "hepatite auto-imune" se refere a um distúrbio hepá-tico caracterizado por inflamação do fígado causado por células imunes vagabundas queencano as células normais do fígado para um tecido estranho ou patógeno (agente causa-dor da doença). A hepatite auto-imune é muitas vezes responsável por uma destruição pro-gressiva do parênquima hepática com uma mortalidade elevada se não tratado esquerdo(Johnson e outros (1993) Hepatology, 18:998). Uma das características da hepatite auto-imune é a presença de autoanticorpos circulantes em quase 90% do soro dos pacientes.Tais anticorpos podem ser empregados para identificar os pacientes que tem hepatite auto-imune.

As diferenças clínicas e sorológicas entre pacientes conduzindo a classificação deAEH nos dois tipos. O tipo 1 é caracterizado pela presença do músculo anti liso (SMA) e/ ouanticorpos anti nucleares (ANA) no soro dos pacientes, ao mesmo tempo em que, soro depacientes do tipo Il mostra anticorpos tipo 1 microsomal de rim anti-fígado (LKMI) (Homberge outros, (1987) Hepatology, 7:1333; Maggiore e outros (1993)J. Pediatr. Gastroenterol Nutr.17:376). Um marcador sorológico, anticorpos do tipo I citosol anti-fígado (LCI), tem sido i-dentificado em 30% dos pacientes com um AIH do tipo H. Além disso, LCI provado ser so-mente marcador sorológico em 10% dos pacientes testados (Martini e outros (1988) Hepato-logy, 8:1662). Em uma modalidade, o método da invenção é empregado para tratar AIH.

3. Doença por gordura no fígado

O fator de necrose tumoral tem sido implicado na fisiopatologia de doença por gor-dura no fígado (veja, Valenti e outros (2002) Gastroenerology 122:274; Li e outros, (2003)Hepatology 37:343). A doença por gordura no fígado se refere a uma doença onde a gordu-ra (hepatócitos) é excessivamente acumulada no fígado. A doença do fígado gordo é acredi-tada ser causado por supemutrição, hiperingestão de álcool, diabetes e efeitos colateraisdevido à administração de farmacêuticos. A doença do fígado gordo pode causar doençasseveras tal como hepatite crônica e cirrose hepática. Em pacientes com doença do fígadogordo, lipídeos, particularmente gordura neutra, acumulada em hepatócitos para a extensãoque a quantidade excede a faixa fisiologicamente permissível. De um ponto de vista bioquí-mico, um padrão para julgamento do fígado gordo é que o peso da gordura neutra é de cer-ca de 10% (100 mg/g de peso úmido) ou mais do peso úmido do tecido hepático. Em umamodalidade, o método da invenção é empregado para tratar doença do fígado gordo.

4. Vírus da hepatite B (HBV)

O fator de necrose tumoral tem sido implicado na fisiopatologia de vírus da hepatiteB (veja, Kasahara e outros, (2003) J Virol 77:2469; Wang (2003) World J Gastroenterol.9:641; Biermer e outros (2003) J Virol 77:4033). O termo "vírus da hepatite B" (HBV) é em-pregado para descrever o vírus (vírus da hepatite por soro) que produz hepatite viral tipo Bem humanos. É uma doença viral com um longo período de incubação (cerca de 50 a 160dias) em comparação ao vírus da hepatite A (vírus da hepatite infecciosa) que tem um curtoperíodo de incubação. O vírus da hepatite B é usualmente transmitido por injeção de sangueinfectado ou derivados do sangue ou meramente por uso de agulhas contaminadas, lance-tas ou outros instrumentos. Clinicamente e patologicamente, a doença é similar à hepatiteviral do tipo A; entretanto, não há imunidade protetora contrária. O antígeno viral (HBAg) éachado no soro após a infecção.

O vírus da hepatite B infecta humanos em taxas muito elevadas. Muitas pessoasque se tornam infectadas por hepatite B livram-se do vírus em 6 meses, onde um uma pe-quena infecção é conhecida como um caso "agudo" de hepatite B. É estimado que pelo me-nos cerca de 300 milhões de pessoas são portadoras crônicas de HBV. A infecção com ovírus resulta em uma faixa de sintomas clínicos incluindo menores sintomas do tipo gripe amorte. Em uma modalidade, o método de dose múltipla variável da invenção é empregadopara tratar infecção por HBV.

5. Hepatotoxicidade

O fator de necrose tumoral tem sido implicado na fisiopatologia de hepatotoxicidade(veja, Bruccoleri e outros (1997) Hepatology 25:133; Luster e outros (2000) Ann NY Acad Sei. 919:214; Simeonova e outros (2001) Toxicol Appl Pharmacol. 177:112). O termo hepa-totoxicidade se refere à lesão no fígado causada por medicações e outros químicos ou dro-gas. O melhor indicador para identificar a toxicidade do fígado em um paciente é a elevaçãode certas enzimas mediadas no sangue, tal como AST (aspartato aminotransferase), ALT(alanina aminotransferase), e GOT (glutamato oxalacetato transaminase).

A hepatotoxicidade pode causar lesão permanente e morte. Os sintomas iniciais dehepatotoxicidade podem incluir sintomas gastrointestinais agudo, por exemplo, diarréia se-vera. A segunda fase de hepatotoxicidade é caracterizada por abatimento de sintomas. Du-rante esta subsidência evidente, a evidência bioquímica de lesão hepática aparece. Oligúria(diminuição da produção de urina) é usual durante a segunda fase. A terceira fase, aquelade lesão hepática aberta, torna-se clinicamente evidente de 3 a 5 dias após ingestão doquímico, com a aparência de icterícia. A insuficiência renal pode também ocorrer. Os sinto-mas de hepatite quimicamente induzida (induzida por droga) são similares àqueles de hepa-tite infecciosa. Em uma modalidade, o método da invenção é empregado para tratar hepato-toxicidade.

6. Insuficiência hepática (por exemplo, insuficiência hepática crônica)

O fator de necrose tumoral tem sido implicado na fisiopatologia da insuficiência he-pática (por exemplo, insuficiência hepática crônica) (veja, Takenaka e outros, (1998) Dig DisSci 43:887; Nagaki e outros (1999) J Hepatol. 31:997; Streetz e outros, (2000) Gastroentero-logy. 119:446. A insuficiência hepática, incluindo insuficiência hepática crônica, usualmentese desenvolve durante um período de anos e é causada por um insulto repetido ao fígado(tal como, abuso de álcool ou infecção por vírus da hepatite) que lentamente Iesiona o ór-gão. Menos comumente, a insuficiência hepática é aguda, e ocorre durante um período dedias ou semanas. A causa de insuficiência hepática aguda inclui infecções por vírus da he-patite, drogas, gravidez, doença auto-imune, e súbito fluxo sangüíneo baixo para o fígado.Em uma modalidade, o método da invenção é empregado para tratar a insuficiência hepáti-ca.7. Hepatite não alcoólica, incluindo NASHO fator de necrose tumoral tem sido implicado na fisiopatologia de hepatite não al-coólica, incluindo esteatoepatite não alcoólica (veja, Crespo e outros, (2001) Hepatology.34:1158; Pessayre e outros (2002) 282(2):G193). O termo "esteatoepatite não alcoólica" ou"NASH" se refere ao desenvolvimento de mudanças histológicas no fígado que são compa-ráveis àquelas induzidas por ingestão excessiva de álcool, mas na ausência do abuso deálcool. A NASH é caracterizada por esteatose macro vesicular e/ ou micro vesicular, infla-mação Iobular e portal, e ocasionalmente corpos de Mallory com fibrose e cirrose. A NASH étambém comumente associada com hiperlipidemia, obesidade, e diabetes melito do tipo II.As condições clínicas adicionais que caracterizam esteatose hepática e inflamaçãoincluem jejum excessivo, desvio jejunoileal, nutrição de origem total, hepatite C crônica, do-ença de Wilson, e efeitos de drogas adversas tais como aquelas de corticosteróides, blo-queadores do canal de cálcio, doses elevadas dos estrogênios sintéticos, metotrexato e a-miodarona. Desse modo, o termo "esteatoepatite não alcoólica" pode ser empregado paradescrever aqueles pacientes que exibem estas descobertas por biópsia, acoplado com aausência de (a) consumação significante de álcool, (b) cirurgia prévia para lerda de peso, (c)história do uso de droga associada com esteatoepatite, (d) evidência de doença genética dofígado ou (e) infecção por hepatite C crônica (veja, por exemplo, Ludwig e outros, (1980)Mayo Clin. Proc. 55:434; Powell e outros (1990) Hepatol. 11:74). Em uma modalidade, osanticorpos obtidos empregando o método da invenção são empregados para tratar NASH.N. Distúrbios na pele e na unhaO fator de necrose tumoral tem sido implicado na fisiopatologia de distúrbios na pe-le e na unha. Em uma modalidade, os anticorpos obtidos empregando o método da inven-ção são administrados para tratar os distúrbios na pele e na unha. O termo "distúrbio na pe-le" ou "doença de pele" como empregado alternadamente aqui, se refere a anormalidades,diferente de feridas por lesão, da pele que tem induzido um estado de inflamação. Em umamodalidade, o distúrbio da pele da invenção é um distúrbio inflamatório da pele, onde a peleé caracterizada por dilatação capilar, infiltração leucocítica, vermelhidão, alta temperatura, e/ou dor. Os exemplos de distúrbios na pele incluem, mas não estão limitados a, psoríase,pênfigo vulgar, escleroderma, dermatite atópica, sarcoidose, eritema nodoso, hidradenitesupurativa, líquen plano, síndrome de Sweet, e vitiligo. Como empregado aqui, o termo "dis-túrbio na pele e na unha em que a atividade do TNFa é prejudicial" é entendido incluir dis-túrbios na pele e/ ou unha e outros distúrbios em que a presença do TNFa em um pacientesofrendo do distúrbio tem sido mostrado ser ou é suspeitado ser qualquer responsável paraa fisiopatologia do distúrbio ou um fator que contribui para uma piora do distúrbio, por exem-plo, psoríase. Desse modo, os distúrbios na pele e na unha em que a atividade do TNFa éprejudicial são distúrbios em que a inibição da atividade do TNFa é esperada para aliviar os sintomas e/ ou progressão do distúrbio. O uso dos anticorpos, porções de anticorpos, e ou-tros inibidores do TNFa da invenção no tratamento de distúrbios específicos na pele e naunha são discutidos mais abaixo. Em certas modalidades, o método de tratamento da inven-ção é desempenhado em combinação com outro agente terapêutico, como descrito abaixo.Em uma modalidade, os anticorpos obtidos empregando o método da invenção compreen- dendo administrar um anticorpo do TNFa em combinação com outro agente terapêutico éempregado para o tratamento de psoríase e o tratamento de psoríase associada com artrite.

1. Psoríase

O fator de necrose tumoral tem sido implicado na fisiopatologia de psoríase (Take-matsu e outros (1989) Arch Dermatol Res. 281:398; Victor and Gottlieb (2002) J Drugs Der- matol. 1 :264). O termo "psoríase" como empregado aqui, se refere a distúrbios de pele as-sociados com hiperplasia epidermal. O exemplo de psoríase inclui, mas não está limitado a,psoríase crônica em placa, psoríase gotada, psoríase inversa, psoríase pustular, psoríasevulgaris, e psoríase eritrodêrmica. A psoríase pode também ser associada com outros dis-túrbios inflamatórios, incluindo doença inflamatória do intestino (IBD) e artrite reumatóide (RA).

A psoríase é descrita como uma inflamação na pele (irritação e vermelhidão) carac-terizada por episódios freqüentes de vermelhidão, coceira, e escamas espessas, secas, níti-da na pele. Em particular, as lesões são formadas as quais envolvem alterações primárias esecundárias em proliferação epidermal, resposta inflamatória da pele, e uma expressão de moléculas reguladoras tais como fatores de Iinfocinas e inflamatórios. A pele psoriática émorfologicamente caracterizada por uma reviravolta aumentada das células epidermais,epiderme espessada, queratinização anormal, célula inflamatória infiltrada na epiderme eleucócito polimorfonuclear e infiltração linfócita na camada da epiderme resultando em umaumento no ciclo da célula basal. A psoríase muitas vezes envolve as unhas, que freqüen- temente exibe corrosão, separação da unha, espessamento, e descoloração. A psoríase émuitas vezes associada com outros distúrbios inflamatórios, por exemplo, artrite, incluindoartrite reumatóide, doença inflamatória do intestino (IBD), e Doença de Crohn. Aproximada-mente um terço dos pacientes com psoríase também têm artrite psoriática (PsA) que, comodescrito acima, causa endurecimento, dilatação das articulações, dor, e faixa reduzida demovimento (Greaves e outros (1995) N. Eng. J. Med. 332:581).

A evidência de psoríase é mais comumente observada no tronco, cotovelos, joe-lhos, couro cabeludo, dobras da pele, ou unhas das mãos, mas pode afetar quaisquer outodas as partes da pele. Normalmente, leva cerca de um mês para novas células de pelemover-se das camadas inferiores para a superfície. Em psoríase, o processo leva apenasuns poucos dias, resultando em uma preparação de células mortas da pele e formação deescamas espessas. Os sintomas de psoríase incluem: emplastros de pele, que são secosou vermelhos, revestido por escamas nítidas, emplastros elevados de pele, acompanhadaspor margens vermelhas, que podem rachar e torna-se dolorosa, e que são usualmente loca-lizadas nos cotovelos, joelhos, tronco, couro cabeludo, e mãos; lesões de pele, incluindopústulas, rachamento de pele, e vermelhidão na pele; dor na articulação ou dolorido quepode ser associado com artrite, por exemplo, artrite psoriática.

O tratamento para psoríase muitas vezes inclui corticosteróides tópicos, análogosde vitamina D, e retinóides orais ou tópicos, ou combinações destes. Em uma modalidade, oanticorpo do TNFct da invenção é administrado em combinação com ou na presença de umdestes tratamentos comuns. Os agentes terapêuticos adicionais os quais podem ser combi-nados com o anticorpo do TNFct obtido empregando os métodos da invenção para tratar depsoríase são descritos em mais detalhes abaixo.

A diagnose de psoríase é usualmente baseada na aparência da pele. Adicional-mente a biópsia da pele, ou raspagem e cultura de emplastros de pele podem ser necessá-rias para excluir outros distúrbios de pele. Um raio X pode ser empregado para provar du-rante a artrite psoriática se a dor da articulação é presente e persistente.

O desenvolvimento de psoríase em um paciente pode ser monitorado pela Avaliçãodo índice da Gravidade e Psoríase por Área (PASI) do paciente. O método para determinaro PASI tem sido descrito em Fredriksson and Pettersson (1978) Dermatológica 157:238 eMarks e outros (1989) Arch Dermatol 125:235. Resumidamente, o índice é baseado na ava-liação de quatro sítios anatômicos, incluindo a cabeça, extremidades superiores, tronco, eextremidades inferiores, para eritema, enduração, e escamação empregando uma escala de5 pontos (0= sem sintomas; I= leve; 2= moderada; 3= marcada; 4= muito marcada). Combase na extensão das lesões em um sítio anatômico produzido, a área afetada é nomeadapor valor numérico (0=0; 1 = < 10%; 2 = 10-29%; 3 = 30-49%; 4 = 50-69%; 5 = 70=89%; 6 =90-100%). A avaliação PASI é em seguida calculada, onde a faixa possível de avaliaçãoPASI é de 0,0 a 72,0 com avaliação mais elevada representando eritroderma completa dograu mais severo.

Em uma modalidade da invenção, um anticorpo do TNFct é empregado para o tra-tamento de psoríase, incluindo psoríase crônica em placa, psoríase gotada, psoríase inver-sa, psoríase pustular, pênfigo vulgar, psoríase eritrodêrmica, psoríase associada com doen-ça inflamatória do intestino (IBD), e psoríase associada com artrite reumatóide (RA). Emoutra modalidade, um anticorpo do TNFct1 tal como adalimumabe, é empregada para tratarpacientes que têm psoríase em combinação com PsA. Os tipos específicos de psoríase in-cluídos nos métodos de tratamento da invenção são descritos em detalhes abaixo:

a. Psoríase crônica em placas

O fator de necrose tumoral tem sido implicado na fisiopatologia da psoríase crônicaem placas (Asadullah e outros (1999) Br J Dermatol. 141:94). A psoríase crônica em placas(também referida como psoríase vulgar) é a forma mais comum de psoríase. A psoríasecrônica em placas é caracterizada por emplastos avermelhados elevados de pele, variandode cunhar por tamanho a muito grande. Em psoríase crônica em placa, as placas podem serúnicas ou múltiplas, podem variar em tamanho de alguns milímetros a diversos centímetros.

As placas são usualmente vermelhas com uma superfície escamosa, e reflete luz quandogentilmente arranhada, criando um efeito "nítido". As lesões (que são muitas vezes simétri-cas) de psoríase crônica em placas ocorrem sobre todo o corpo, mas com predileção parasuperfícies extensoras, incluindo os joelhos, cotovelos, regiões lombosacras, couro cabelu-do, e unhas. Ocasionalmente psoríase crônica em placa pode ocorre no pênis, vúlva e do-bramentos, mas a escamação é usualmente ausente. A dignose de pacientes com psoríasecrônica em placa é usualmente com base nas características clínicas descritas acima. Emparticular, a distribuição, cor e escamação nítida típica da lesão em psoríase crônica emplaca são características de psoríase crônica em placa.

b. Psoríase gotada

A psoríase gotada se refere a uma forma de psoríase com características de placasescamosas em forma de gota de água. Rubores de psoríase gotada de modo geral seguemuma infecção, mais notavelmente uma infecção de garganta estreptocócica. A diagnose depsoríase gotada é usualmente com base na aparência da pele, e o fato que há muitas vezesuma história recente de faringite.

c. Psoríase inversa

A psoríase inversa é uma forma de psoríase em que o paciente tem uniforme, usu-almente áreas úmidas de pele que são vermelhas e inflamadas, que é diferente a escama-ção associada com psoríase em placa. A psoríase inversa é também referida como psoríaseintertiginosa ou psoríase flexural. A psoríase inversa ocorre na maioria das vezes nas axilas,virilhas, sob os seios e em outras dobras da pele ao redor das genitais e nádegas, e, comoum resultado das localizações de apresentação, a fricção e a transpiração podem irritar asáreas afetadas.

d. Psoríase pustularA psoríase pustular, também referida como psoríase palmar plantar, é uma formade psoríase que causa bolhas carregadas de pus que variam em tamanho e localização,mas muitas vezes ocorre nas mãos e pés. As bolhas podem ser localizadas, ou dissemina-das sob grandes áreas do corpo. A psoríase pustular pode ser ambas tenras e dolorosas,podem causar febre.

e. Outros distúrbios de psoríase

Outros exemplos de distúrbios psoriáticos que podem ser tratados com o anticorpodo TNFct obtido empregando os métodos da invenção incluem psoríase eritrodêrmica, vul-gar, psoríase associada com IBD1 e psoríase associada com artrite, incluindo artrite reuma- tóide.

2. Pênfigo vulgar

O pênfigo vulgar é uma doença dermatológica sistêmica auto-imune séria que mui-tas vezes afeta a pele e membrana mucosa oral. A patogênese de pênfigo vulgar é pensadaser um processo auto-imune que é direcionado para desmossomos da membrana mucosaoral. Conseqüentemente, as células não aderem umas as outras. O distúrbio se manifestacomo grande fluido carregado, bolha propensa a ruptura, e tem uma aparência histológicadistintiva. Os agentes antiinflamatórios são somente terapia efetiva para esta doença quetem uma taxa de mortalidade elevada. As complicações que aparecem em pacientes so-frendo de pênfigo vulgar são dor intratável, interferência com nutrição e perda de fluido, einfecções.

3. Dermatite atópica/ eczema

A dermatite atópica (também referida como eczema) é o distúrbio de pele crônicocategorizado por placas de coceira e escamosa. Pessoas com eczema muitas vezes têmuma história familiar de condições alérgica tipo asma, febre de feno, ou eczema. A dermatite atópica é uma reação de hipersensibilidade (similar a uma alergia) que ocorre na pele, cau-sando inflamação crônica. A inflamação causada à pele torna-se sarnenta e escamosa. Airritação crônica e arranhão podem causar engrossamento à pele e tornando se dura textu-rada. A exposição a ambientes irritantes pode piorar os sintomas, como pode ressecar apele, exposição à água, mudanças de temperatura, e estresse.

Os pacientes com dermatite atópica podem ser identificados por certos sintomas,que muitas vezes inclui coceira intensa, bolhas com infiltração e descascando, vermelhidãode pele ou inflamação ao redor das bolhas, áreas de pele dura, seca, com erupção, seca,áreas bruta da pele por arranhão, e descargas/ sangramento no ouvido.

4. Sarcoidose

A sarcoidose é a doença em que a inflamação granulomatosa ocorre nos Iinfono-dos, pulmões, fígado, olhos, pele, e/ ou outros tecidos. A sarcoidose inclui sarcoidose cutâ-nea (sarcoidose da pele) e sarcoidose nodular (sarcoidose dos linfonodos). Os pacientescom sarcoidose podem ser identificados pelos sintomas, que muitas vezes incluem descon-forto geral, não comodidade, ou uma má sensação; febre; lesões de pele.

5. Eritema nodoso

O eritema nodoso se refere a um distúrbio inflamatório que é caratcerizado tenro,por nódulos vermelhos sobre a pele, tipicamente nas pernas anteriores inferiores. As lesõesassociadas com eritema nodoso muitas vezes começam como achatadas, mas firme, protu-berâncias dolorosas vermelhas quentes (aproximadamente uma polegada de lado a lado).Em alguns dias as lesões tornam-se purpúreas, e depois de terminada as diversas semanasdesbotam-se para um emplasto acastanhado achatado.

Em alguns casos, eritema nodoso pode ser associado com infecções incluindo, es-treptococo, coccidioidomicose, tuberculose, Hepatite B, sífilis, doença do arranhão de gato,tularemia, yersinia, leptospirose, psitacose, histoplasmose, mononucleose (EBV). Em outroscasos, o eritema nodoso pode ser associado com a sensibilidade a certas medicações inclu-indo, contraceptivo oral, penicilina, sulfonamidas, sulfonas, barbituratos, hidantoína, fenace-tina, salicilatos, iodetos, e progestina. O eritema nodoso é muitas vezes associado com ou-tros distúrbios incluindo, leucemia, sarcoidose, febre reumática, e colite ulcerativa.

Os sintomas de eritema nodoso usualmente presente sozinhos nas tíbias, porém aslesões podem também ocorrer em outras áreas do corpo, incluindo as nádegas, panturri-Ihas, tornozelos, coxas e extremidades superiores. Outros sintomas em pacientes com eri-tema nodoso podem incluir febre e mal-estar.

6. Hidradenite superativa

A hidradenite superativa se refere a um distúrbio de pele em que incha, doi, as le-sões inflamadas ou protuberâncias desenvolvas na virilha e de vez em quando sobre osombros e sobre os seios. A hidradenite superativa ocorre quando as saídas da glândula a-pócrina tomam-se bloqueada por suor ou são incapazes drenar normalmente por causa dodesenvolvimento incompleto da glândula. As secreções capturadas na força das glândulasde suor e bactéria no tecido circundante, causando enduração subcutânea, inflamação, einfecção. A hidradenite superativa é confinada as áreas do corpo que contém glândulas a-pócrinas. Estas áreas são de axilares, aréola do mamilo, virilha, períneo, circumanal, e regi-ões periumbilicais.

7. Líquen plano

O fator de necrose tumoral tem sido implicado na fisiopatologia de líquen plano (S-klavounou e outros (2000) J Oral Pathol Med. 29:370). Líquen plano se refere a um distúrbioda pele e das membranas mucosas resultando em inflamação, coceira, e lesões de peledistintiva. O líquen plano pode ser associado com Hepatite C ou certas medicações.

8. Síndrome de Sweet

As citocinas inflamatórias, incluindo fator de necrose tumoral, tem sido implicadasna fisiopatologia de síndrome de Sweet (Reuss-Borst e outros (1993) Br J Haematol.84:356). A síndrome de Sweet1 a qual foi descrita por R.D. Sweet em 1964, é caracterizadapelo súbito início de febre, leucocitose, e erupção cutânea. A erupção consiste de tenras,eritematosas, pápulas bem demarcadas e placas as quais mostram neutrofílica densa infil-trando-se microscopicamente. As lesões podem aparecer em qualquer parte, porém favore-ce o corpo superior incluindo a face. As lesões do indivíduo são muitas vezes descritas co-mo pseudovesicular ou pseudopustular, mas podem ser fracamente pustular, bolhosa, ouulcerativa. O envolvimento oral e do olho (conjunctivite ou episclerite) tem sido também fre-qüentemente relatado em pacientes com síndrome de Sweet. A leucemia tem sido também associada com síndrome de Sweet.

9. Vitiligo

O vitiligo se refere a uma condição de pele em que há perda de pigmento das áreasde pele resultando em emplastros brancos irregulares como a textura normal da pele. Aslesões características de vitiligo aparecem em áreas de depigmentadas achatadas. As mar- gens das lesões são nitidamente definidas porém irregulares. As áreas freqüentemente afe-tadas em pacientes com vitiligo incluem a face, cotovelos e joelhos, mãos e pés, e genitália.

10. Escleroderma

O fator de necrose tumoral tem sido implicado na fisiopatologia de escleroderma(Tutuncu e outros (2002) Clin Exp Rheumatol 20(6 Suppl 28):S146; Mackiewicz e outros(2003) Clin Exp Rheumatol. 21:41; Murota e outros (2003) Artritis Rheum. 48:1117). O escle-roderma se refere a uma doença de tecido conjuntivo difuso caracterizado por mudanças napele, vasos sangüíneos, músculos esqueléticos, e órgãos internos. O escleroderma é tam-bém referido como síndrome CREST ou esclerose sistêmica progressiva, e usualmente afe-ta pessoas entre 30-50 anos. As mulheres são afetadas muito mais vezes do que os ho- mens.

A causa de escleroderma é não conhecida. A doença pode produzir sintomas sis-têmicos ou locais. O curso e a severidade da doença variam largamente neste afetado. Oexcesso de colágeno deposita na pele e outros órgãos produzindo os sintomas. Lesão empequenos vasos sangüíneos na pele e órgãos afetados também ocorre. Na pele, ulceração, calcificação, e mudanças em pigmentação podem ocorrer. Características sistêmicas podemincluir fibrose e degeneração do coração, pulmões, rins e trato gastrointestinal.

Os pacientes sofrendo de escleroderma exibem certas características clínicas, in-cluindo, branqueamento, depressão, ou vermelhidão dos dedos e dedos dos pés em respos-ta ao calor e frio (fenômeno de Raynaud), dor, endurecimento, e dilatação de dedos e articu- lações, espessamento de pele e mãos brilhantes e antebraço, refluxo esofágico ou azia,dificuldade em engolir, e deficiência respiratória. Outros sintomas clínicos empregados paradiagnose escleroderma incluem uma velocidade elevada de sedimentação dos eritrócitos(ESR)1 um elevado fator de reumatóide (RF), um teste de anticorpo antinuclear positivo,análise de urina que mostra a proteína e sangue microscópico, um raio X do tórax que podemostrar a fibrose, e os estudos da função pulmonar que mostra doença pulmonar restritiva.11. Distúrbios nas unhasOs distúrbios nas unhas incluem qualquer anormalidade da unha. O termo "distúr-bio na unha" ou "doença na unha" como empregado aqui, se refere às condições onde asunhas das mãos ou unhas dos dedos dos pés de cor anormal, forma, textura, ou espessura.Os distúrbios específicos nas unhas incluem, mas não estão limitados a, corrosão, coiloni-quia, linhas de Beau, unhas em forma de colher, onicólise, unhas amarelas, pterígio (obser-vado em líquen plano), e leuconiquia. A corrosão é caracterizada pela presença de peque-nas depressões na superfície da unha. Elevações lineares ou de rugas podem desenvolver-se junto da unha ocorrendo em uma direção "longitudinal" ou "transversal". As linhas de Be-au são depressões lineares que ocorrem "transversal" (transversa) na unhas dos dedos dasmãos. A leuconiquia descreve linhas brancas ou manchas nas unhas. A coiloniquia é umaforma anormal das unhas dos dedos das mãos onde a unha tem rugas elevadas e é fina ecôncava. A coiloniquia é muitas vezes associada com deficiência em ferro.Os distúrbios nas unhas que podem ser tratados com o anticorpo do TNFo da in-venção também incluem unhas psoriáticas. As unhas psoriáticas incluem mudanças nasunhas as quais são atribuíveis à psoríase. Em alguns casos a psoríase pode ocorre somen-te nas unhas e em parte alguma senão no corpo. As mudanças psoriáticas na faixa das u-nhas de branda a severa, de modo geral refletindo a extensão do envolvimento psoriático daplaca da unha, matriz da unha, isto é, tecido pelo qual a unha cresce no leito ungueal, isto é,tecido sobre a unha, e pele na base da unha. Lesão no leito ungueal pelo tipo pustular depsoríase pode resultar na perda da unha. As mudanças de unha em queda de psoríase nascategorias gerais que podem ocorre separadamente ou tudo junto. Em uma categoria deunhas psoriáticas, a placa de unha é profundidade enterrada, provavelmente devido aosdefeitos no crescimento da unha causado por psoríase. Em outra categoria, a unha tem umadescoloração de amarelo a amarelo rosa, provavelmente devido ao envolvimento psoriáticodo leito ungueal. Um terceiro subtipo de unha psoriáticas é caracterizado por áreas brancasque aparecem sob a placa da unha. As áreas brancas são atualmente bolhas de ar sinali-zando as manchas onde a placa da unha é convenientemente separada do leito ungueal.Pode também ser pele avermelhada ao redor da unha. Uma quarta categoria é evidenciadapela placa de unha esfarelando-se em emplastros amarelado, isto é, onicodistropia, prova-velmente devido ao envolvimento psoriático na matriz da unha. Uma quinta categoria é ca-racterizada pela perda da unha em totalidade devido ao envolvimento psoriático da matrizda unha e leito ungueal.Os anticorpos obtidos empregando o método da invenção podem também ser em-pregados para tratar distúrbios nas unhas muitas vezes associados com líquen plano. Asunhas em paciente com líquen plano muitas vezes mostram afinação e superfície áspera daplaca da unha com rugas longitudinal ou pterígio.

Os anticorpos obtidos empregando a invenção podem ser empregados para tratardistúrbios nas unhas, tais como aqueles descritos aqui. Muitas vezes os distúrbios nas u-nhas são associados dos distúrbios de pele. Em uma modalidade, a invenção trata de dis-túrbios nas unhas empregando um anticorpo do TNFa. Em outra modalidade, o distúrbio naunha é associado com outro distúrbio, incluindo um distúrbio de pele tal como psoríase. Emoutra modalidade, o distúrbio associado com o distúrbio na unha é artrite, incluindo artritepsoriática.

12. Outros distúrbios na pele e na unha

Os anticorpos obtidos empregando o método da invenção podem ser empregadospara tratar outros distúrbios na pele e na unha, tal como dermatite actínica crônica, penfigói-de bolhoso, e alopecia em áreas. A dermatite actínica crônica (CAD) é também referida co-mo síndrome reticulóide actínica/ dermatite por fotossensibilidade. CAD é uma condição emque a pele torna-se inflamada, particularmente em áreas que foram expostas a luz artificialou luz do sol. Comumente, paciente CAD tem alergias a certas substâncias que entram emcontato com sua pele, particularmente várias flores, madeiras, perfumes, protetores solarese compostos de borracha. O penfigóide bolhoso se refere a um distúrbio de pele caracteri-zado pela formação de grandes bolhas no tronco e extremidades. A alopecia em áreas serefere à pele de cabelo caracterizada por emplastros em círculo por calvície completa nocouro cabeludo ou barba.

O. Vasculites

O TNFff tem sido implicado na fisiopatologia de uma variedade de vasculites, (veja,por exemplo, Deguchi e outros (1989) Lancet.2:745). Em uma modalidade, a invenção for-nece um método de dose múltipla variável para inibir a atividade do TNFa em um pacientesofrendo de uma vasculite em que a atividade do TNFa é prejudicial.

O termo "vasculite" ou "vasculites" como empregado alternadamente aqui, se referea um grupo de distúrbios que são caracterizados pela inflamação de vasos sangüíneos. Osvasos sangüíneos de todos os tamanhos podem ser afetados, do maior vaso do corpo (aaorta) ao menor dos vasos sangüíneos na pele (vasos capilares). O tamanho do vaso san-güíneo afetado varia de acordo com tipo específico de vasculites. Como empregado aqui, otermo "uma vasculite em que a atividade do TNFa é prejudicial" é entendido incluir vasculiteem que a presença de TNFa em um paciente sofrendo do distúrbio tem sido mostrado serou é suspeitado ser qualquer responsável pela fisiopatologia do distúrbio ou um fator quecontribui para uma piora do distúrbio. Tais distúrbios podem ser evidenciados, por exemplo,por um aumento na concentração de TNFa em um fluido biológico de um paciente sofrendodo distúrbio (por exemplo, um aumento na concentração de TNFct em soro, plasma, fluídosinovial, etc. do paciente), que pode ser detectado, por exemplo, empregando um anticorpoanti-TNFtf como descrito acima.

Existem numerosos exemplos de vasculites em que a atividade do TNFct é prejudi- ciai, incluindo doença de Behcet. O uso dos anticorpos, ou porções de ligação de antígenodestes, para tratar de vasculites específicas é discutido mais abaixo. Em certas modalida-des, o anticorpo, ou porção de anticorpo, obtido empregando a invenção é administrada aopaciente em combinação com outro agente terapêutico, como descrito abaixo.

O anticorpo, ou porção de anticorpo, obtido empregando a invenção pode também ser empregado para tratar vasculite em que a atividade do TNFct é prejudicial, onde a inibi-ção da atividade do TNFct é esperada para aliviar os sintomas e/ ou progressão de vasculiteou para prevenir as vasculites. Os pacientes sofrendo de ou em risco de desenvolver vascu-lite podem ser identificados através de testes e sintomas clínicos. Por exemplo, pacientescom vasculites muitas vezes desenvolvem anticorpos para certas proteínas no citoplasma de neutrófilos, anticorpos contra o citoplasma de neutrófilos (ANCA). Deste modo, em al-guns casos, as vasculites podem ser evidenciadas por testes (por exemplo, ensaio imunos-sorvente ligado a enzima), que mede a presença de ANCA.

A vasculite e suas conseqüências podem ser a única manifestação de doença oupode ser um componente secundário de outra doença primária. A vasculite pode ser confi- nada a um único órgão ou pode simultaneamente afetar diversos órgãos, e dependendo dasíndrome, artérias e veias de todos os tamanhos podem ser afetadas. A vasculite pode afe-tar qualquer órgão do corpo.

Nas vasculites, o vaso lúmen é usualmente comprometido, o qual é associado comisquemia dos tecidos supridos pelo vaso envolvido. A faixa ampla de distúrbios que podem resultar do processo é devido ao fato de que qualquer tipo, tamanho e localização de vaso(por exemplo, artéria, veia, arteríola, vênula, capilar) podem estar envolvidos. As vasculitessão de modo geral classificadas de acordo com o tamanho dos vasos afetados, como des-crito abaixo. Deve ser notado que alguns pequenos e grandes vasos de vasculites podemenvolver artérias de tamanho médio; porém vasos de vasculites de tamanho médio ou gran-de não envolvem vasos menores do que as artérias. A doença por vaso grande inclui, masnão está limitada a, arterite de célula gigante, também conhecida como arterite temporal ouarterite craniana, polimialgia reumática, e doença de Takayasu ou arterite, que é tambémconhecida como síndrome do arco da aorta, arterite em fêmea jovem e doença de Pulse-less. Doença do vaso médio inclui, mas não está limitada a, poliarterite nodosa clássica e doença de Kawasaki, também conhecida como síndrome do Iinfonodo mucocutâneo. Exem-plos não limitados de doença de pequenos vasos são Síndrome de Behcet, granulomatosede Wegner, poliangeíte microscópica, vasculites de hipersensibilidade, também conhecidascomo vasculites cutânea, vasculites de pequeno vaso, púrpura de Henoch-Schonlein, granu-Iamatose alérgica e vasculites, também conhecida como síndrome de Churg Strauss. Outrasvasculites incluem, mas não estão limitadas a, vasculites do sistema nervoso central isolado,e tromboangite obliterante, também conhecida como doença de Buerger. A poliarterite no-dosa clássica (PAN), PAN microscópica, e granulomatose alérgica também muitas vezesagrupadas juntas e são chamadas vasculites necrosante sistêmica. Uma outra descrição devasculite é descrita abaixo:

1. Vasculites de grande vaso

Em uma modalidade, o anticorpo de TNFct obtido empregando a invenção pode serempregado para tratar pacientes que têm vasculites de grande vaso. O termo "grandes(s)vaso" como empregado aqui, se refere à aorta e as maiores ramificações direcionadas pararegiões do corpo. Os grandes vasos incluem, por exemplo, a aorta, e suas ramificações eveias correspondentes, por exemplo, a artéria subclavicular; a artéria braquiocefálica; a arté-ria carótida comum; a veia inonimada; veias jugulares internas e externas; as veias e arté-rias pulmonares; a veia cava; as veias e artérias; as veias e artérias femorais; e as artériasda carótida. Os exemplos de vasculites de grande vaso são descritos abaixo.

a. Arterite de célula gigante (GCA)

O fator de necrose tumoral tem sido implicado na fisiopatologia de arterite de célulagigante (Sneller (2002) Cleve. Clin. J. Med. 69:SII40; Schett e outros (2002) Ann. Rheum.Dis. 61 :463); a arterite de célula gigante (GCA), se refere a uma vasculite envolvendo infla-mação e lesão para vasos sangüíneos, particularmente as artérias médias e grandes queramificam da artéria carótida externa do pescoço. A GCA é também referida como arteritetemporal ou arterite craniana, e é a vasculite primária mais comum no idoso. Quase exclusi-vamente afeta indivíduos acima dos 50 anos de idade, entretanto, existem casos bem do-cumentados de pacientes de 40 anos e mais moço. A GCA usualmente afeta artérias extra-craniana. A GCA pode afetar as ramificações das artérias da carótida, incluindo a artériatemporal. A GCA é também uma doença sistêmica que pode envolver artérias em múltiplaslocalizações.

Histopatologicamente, a GCA é a pan-arterite com célula mononuclear inflamatóriainfiltrada na parede do vaso com freqüente formação de célula gigante tipo Langhans. Háproliferação da intima, inflamação granulomatosa e fragmentação da lâmina elástica interna.As descobertas patológicas em órgãos é o resultado de isquemia relacionada aos vasosenvolvidos.

Os pacientes sofrendo de GCA exibem certos sintomas clínicos, incluindo febre, ce-faléia, anemia e elevada velocidade de sedimentação dos eritrócitos (ESR). Outras indica-ções típicas de GCA incluem claudicação da língua ou maxilar, brandura do couro cabeludo,sintomas constitutionais, edema do disco óptico claro (particularmente edema do disco 'cal-cário branco'), e transtornos na visão. A diagnose é confirmada por biópsia da artéria temporal.

b. Polimialgia reumática

O fator de necrose tumoral tem sido implicado na fisiopatologia de polimialgia reu-mática (Straub e outros (2002) Rheumatology (Oxford) 41:423; Uddhammar e outros (1998)Br. J. Rheumatol. 37:766). A polimialgia reumática se refere a um distúrbio reumático que éassociado com dor muscular moderada a severa e endurecimento no pescoço, ombro , equadril, mais perceptível pela manhã. A expressão IL-6 e IL-1/? também foi detectada emuma maioria dos monócitos circulantes em pacientes com a polimialgia reumática. A polimi-algia reumática pode ocorre independentemente, ou pode coexitir com our preceder a GCA,que é uma inflamação dos vasos sangüíneos.

c. Arterite de Takayasu

O fator de necrose tumoral tem sido implicado na fisiopatologia de arterite de Taka-yasu (Kobayashi e Numano (2002) Intern. Med. 41:44; Fraga e Medina (2002) Curr. Rheu-matol. Rep. 4:30). A arterite de Takayasu se refere a uma vasculite caracterizada por umainflamação da aorta e suas maiores ramificações. A arterite de Takayasu (também conheci-da como Síndrome do arco da aorta, arterite em fêmea jovem e doença de Pulseless) afetaa aorta torácica e abdominal e suas principais ramificações ou as artérias pulmonares. Oespessamento fibrótico da parede aórtica e suas ramificações (por exemplo, artérias subcla-viculares, carótida e inominada) pode conduzir a redução de tamanho do lúmen dos vasosque aparecem do arco aórtico. Esta condição também tipicamente afeta as artérias renais.

A arterite de Takayasu primariamente afeta homens jovens, usualmente da idadede 20-40 anos de idade, particularmente de descendência asiática, e pode ser manifestadapor mal-estar, artralgias e o início gradual da claudicação da extremidade. Muitos pacientestêm pulsos reduzidos assimetricamente, usualmente junto com uma pressão sangüínea dife-rencial nos braços. A estenose da artéria renal e/ ou coronariana pode ocorre.

As características clínicas de arterite de Takayasu podem ser divididas nas caracte-rísticas da doença inflamatória precoce e as características da doença posterior. As caracte-rísticas clínicas do estagio inflamatório precoce da doença de Takayasu são: mal-estar, fe-bre de grau baixo, perda de peso, mialgia, artralgia, e eritema multiforme. Os estágios poste-riores da doença de Takayasu são caracterizados por estenose fibriótica das artérias etrombose. O condutor resultando em características clínicas são fenômenos isquêmicos, porexemplo pulsos arteriais assimétricos, discrepância da pressão sangüínea entre os braços,transtorno visual, por exemplo, escotomata e hemianopia, outras características neurológi-cas incluindo vertigem e síncope, hemiparesia ou acidente vascular cerebral. As caracterís-ticas clínicas resultam da isquemia devido a trombose e estenose arterial.

2. Doença de médio vasoEm uma modalidade, o anticorpo do TNFct obtido empregando a invenção pode serempregado para tratar pacientes que têm vasculites de médio vaso. O termo "médio(s) va-so" é empregado para se referir àqueles vasos sangüíneos os quais são condutores dasartérias viscerais. Os examplos de médio vaso incluem as artérias mesentéricas e veias, asartérias iliácas e veias, e as artérias maxilares e veias. Os exemplos de vasculites de médiovaso são descritos abaixo.

a. Poliarterite nodosa

O fator de necrose tumoral tem sido implicado na fisiopatologia de poliarterite nodo-sa (DiGiroIamo e outros (1997) J. Leukoc. Biol. 61:667). A poliarterite nodosa, ou periarteritenodosa se refere à vasculite a qual é uma doença séria do vaso sangüíneo em que as arté-rias de tamanho médio e pequeno tornam-se dilatadas e danificadas porque são atacadaspor células imunes velhas. A poliarterite nodosa usualmente afeta adultos mais freqüente-mente do que as crianças. Leciona os tecidos supridos pelas artérias afetadas porque nãoreceberam bastante oxigênio e nutrição sem um fornecimento sangüíneo adequado.

Os sintomas que são exibidos em pacientes com poliarterite nodosa de modo geralresultam de lesão para órgãos afetados, muitas vezes a pele, coração, rins, e sistema ner-voso. Os sintomas generalizados de poliarterite nodosa incluem febre, fadiga, fraqueza, per-da de apetite, e perda de peso. Dores musculares (mialgia) e dores na articulação (artralgia)são comuns. A pele dos pacientes com poliarterite nodosa podem também mostrar erup-ções, dilatações, úlceras, e protuberâncias (lesões nodulares).

A PAN clássica (poliarterite nodosa) é uma arterite sistêmica de pequena e médiaarterite muscular na qual o envolvimento das artérias renais e viscerais é comum. Os vasosabdominais têm aneurismas ou oclusões em 50% dos pacientes de PAN. A PAN clássicanão envolve as artérias pulmonares ainda que os vasos brônquicos possam ser envolvidos.Granulomas, eosinofilia significante e uma diatese alégica não são parte da síndrome. Aindaque qualquer sistema de órgão possa ser envolvido, as manifestações mais comuns incluemneuropatia periférica, mononeurite multiplex, isquemia intestinal, isquemia renal, dor testicu-lar e livedo reticularis.

b. Doença de Kawasaki

O fator de necrose tumoral tem sido implicado na fisiopatologia de doença de Ka-wasaki (Sundel (2002) Curr. Rheumatol. Rep. 4:474; Gedalia (2002) Curr. Rheumatol Rep.4:25). Ainda que a causa da doença de Kawasaki seja desconhecida, associada com infla-mação aguda das artérias coronarianas, sugerindo que a lesão do tecido associado comesta doença pode ser mediada por agentes proinflamatórios tais como TNFa. A doença deKawasaki se refere a uma vasculite que afeta as membranas do muco, linfonodos, revesti-mento dos vasos sangüíneos, e o coração. A doença de Kawasaki é também muitas vezesreferida como a síndrome do Iinfonodo mucocutâneo, doença do Iinfonodo mucocutâneo, epoliarterite infantil. Pacientes afligidos com doença de Kawasaki desenvolvem vasculite mui-tas vezes envolvendo as artérias coronarianas que podem conduzir a miocardite e pericardi-te. Muitas vezes a inflamação aguda diminui, as artérias coronarianas podem desenvolveraneurisma, trombose, e conduzir ao infarto do miocárdio .

A doença de Kawasaki é uma vasculite sistêmica febril associada com edema naspalmas e nas solas dos pés, com aumento dos Iinfonodos cervicais, lábios rachados e "lín-gua em morango". Ainda que a resposta inflamatória seja achada em vasos por todo o cor-po, o sítio mais comum de lesão na extremidade do órgão é as artérias coronarianas. A Do-ença de Kawasaki predominantemente afeta crianças inferiores a idade de 5. A incidênciamais elevada é no Japão mas é convenientemente cada vez mais reconhecido no Ocidentee é agora a causa principal de doença do coração adquirida pelas crianças dos Estados U-nidos. A complicação mais séria de doença de Kawasaki é arterite coronariana e formaçãode aneurisma que ocorre em um terço dos pacientes não tratados.

3. Deonça de pequenso vassos

Em uma modalidade, um anticorpo do TNFa é empregado para tratar pacientes quetêm vasculites de pequeno vaso. O termo "pequeno(s) vaso" é empregado para se referir aarteríolas, vênulas e vasos capilares. As arteríolas são artérias que contém somente 1 ou 2camadas de células musculares verdadeiras e são terminais para a e contínua com a redecapilar. As vênulas transportam o sangue da rede capilar para as veias e os vasos capilaresconectam-se as arteríolas e vênulas. Os exemplos de vasculides de pequenos vasos sãodescritos abaixo.

a. Doença de Behcet

O fator de necrose tumoral tem sido implicado na fisiopatologia de doença de Beh-cet (Sfikakis (2002) Ann. Rheum. Dis. 61:ii51-3; Dogan e Farah (2002) Oftalmologia. 52:23).A doença de Behcet é um distúrbio crônico que envolve inflamação dos vasos sangüíneospor todo o corpo. A doença de Behcet pode também causar vários tipos de lesões na pele,artrite, inflamação do instestino, e meningite (inflamação das membranas do cérebro e me-dula espinhal). Como um resultado da doença de Behcet, o paciente com o distúrbio podeter inflamação nos tecidos e órgãos por todo o corpo, incluindo o aparelho gastrointestinal,sistema nervoso central, sistema vascular system, pulmões, e rins. A doença de Behcet étrês vezes mais comum em machos do que fêmeas e é mais comum no leste Mediterrêneoe Japão.

Os pacientes que têm doença de Behcet podem mostra sintomas clínicos incluindoúlceras orais recorrentes (semelhantes as feridas no cancro), úlceras genitais recorrentes, einflamação nos olhos. Os níveis de soro do TNFa,IL-S, EL-I, TL-6 INF-i arida IL-12 são ele-vados em pacientes de Behcet, e a produção de três fatores têm sido mostrados serem ele-vados nos monócitos de pacientes de Behcet (veja, por exemplo, Inflammatory Disease ofBlood Vessels (2001) Mareei Dekker, Inc., eds. G.S. Hoffman and CM. Weyand1 p.473).

b. Granulomatose de Wegener

O fator de necrose tumoral tem sido implicado na fisiopatologia de granulomatosede Wegener (Marquez e outros (2003) Curr. Rheumatol. Rep. 5:128; Harman e Margo(1998) Surv. Ophthalmol. 42:458). A granulomatose de Wegener se refere a uma vasculiteque causa a inflamação dos vasos sangüíneos no aparelho respiratório superior (nariz, sinu-ses, ouvidos), pulmões, e rins. A granulomatose de Wegener é também referida como gra-nulomatose da linha média. A granulomatose de Wegener inclui uma inflamação granuloma-tosa envolvendo o aparelho respiratório, e a vasculite necrosante afetar vasos de tamanhospequenos a médio. Os pacientes que têm granulomatose de Wegener muitas vezes tambémtêm artrite (inflamação na articulação). A glomerulonefrite pode também estar presente nospacientes afetados, mas virtualmente qualquer órgão pode estar envolvido.

Os pacientes afetados com granulomatose de Wegener tipicamente mostram sin-tomas clínicos compreendendo sinusite recorrente ou hemorragia nasal, ulcerações muco-sais, otite média, tosse, hemoptise e dispnéia. Os primeiros sintomas de granulomatose deWegener freqüentemente incluem sintomas no aparelho respiratório superior, dores na arti-culação, fraqueza e fadiga.

c. Síndrome de Churg-Strauss

O fator de necrose tumoral tem sido implicado na fisiopatologia da síndrome deChurg-Strauss (Gross (2002) Curr. Opin. Rheumatol. 14:11; Churg (2001) Mod. Pathol.14:1284). A síndrome de Churg-Strauss se refere a uma vasculite que é sistêmica e mostrasinais de manifestação precoce de asma e eosinofilia. A sindrome de Churg-Strauss é tam-bém referida como granulomatose alérgica e angiite, e ocorre colocação de rinite alérgica,asma e eosinofilia. A sinusite e infiltração pulmonar também ocorrem em síndrome deChurg-Strauss, primariamente afetar o pulmão e o coração. A neuropatia periférica, arteritecoronarianas e envolvimentos gastrointestinais são comuns.

Os pacientes afligidos com síndrome de Churg-Strauss podem ser diagnosticadosde acordo com o critério estabelecido pela American College of Rheumatology (ACR). Estescritérios foram entendidos para distinguir CSS de outras formas de vasculites. Nem todos ospacientes alcançam todos os critérios. Alguns, de fato, podem ter somente 2 ou 3 critérios,outra vez são ainda classificado como síndrome de Churg-Strauss. A ACR selecionou 6 ca-racterísticas da doença (critério) como sendo aqueles que mais distinguem síndrome deChurg-Strauss de outras vasculites. Estes critérios incluem: 1) asma; 2) eosinofilia [>10%no diferencial da conta WBC]; 3) mononeuropatia; 4) infiltração pulmonar transitória em rai-os X do tórax; 5) anormalidades do seio paranasal; e 6) biópsia compreendendo um vasosangüíneo com eosinófilos extravascular.

P. Outros distúrbios relacionados ao TNFαEm uma modalidade, a invenção caracteriza um método de dose múltipla variávelpara tratar um distúrbio relacionado ao TNFa em que a atividade do TNFa é prejudicial,compreendendo administrar a um paciente um anticorpo TNFa tal que o referido distúrbiorelacionado so TNFa é tratado. Os exemplos de distúrbios relacionados ao TNFa em que aatividade do TNFa é prejudicial, são discutidos mais abaixo.

1. Artrite Juvenile

O fator de necrose tumoral tem sido implicado na fisiopatologia de artrite juvenil, in-cluindo artrite reumatóide juvenil (Grom e outros (1996) Arthritis Rheum. 39: 1703; Mangge eoutros (1995) Arthritis Rheum. 8:211). Em uma modalidade, o anticorpo do TNFa da inven-ção é empregado para tratar artrite reumatóide juvenil.

O termo "artrite reumatóide juvenil" ou "JRA" como empregado aqui se refere a umacrônica, doença inflamatória que ocorre antes da idade de 16 que pode causar lesão do te-cido da articulação ou conjuntivo. A JRA é também referida como um poliartrite juvenil crôni-ca e doença de Still.

A JRA causa endurecimento e inflamação da articulação por mais de 6 semanasem crianças de 16 anos de idade ou menos. A inflamação causa vermelhidão, dilatação,quentura, e irritabilidade nas articulações. Qualquer articulação pode ser afetada e a infla-mação pode limitar a mobilidade das articulações afetadas. Um tipo de JRA pode tambémafetar os órgãos internos. A JRA é muitas vezes classificada em três tipos pelos números dearticulações envolvidas, os sintomas, e a presença ou ausência de certos anticorpos acha-dos por um teste de sangue. Estas classificações ajudam medico a determinar como a do-ença irá progredir e se os órgãos internos ou pele são afetados. As classificações da JRAincluem o seguinte

a. JRA pauciarticular, onde o paciente tem quatro ou menos articulações são afeta-das. Pauciarticular é a forma mais comum de JRA, e tipicamente afeta grandes articulações,tais como os joelhos.

b. HRA poliarticular, onde cinco ou mais articulações são afetadas. As pequenas ar-ticulações, tais como aquelas nas mãos e pés, são mais comumente envolvidas, mas a do-ença pode também afetar grandes articulações.

c. JRA sistêmica é caracterizada por dilatar a articulação, febre, uma erupção leve

na pele, e pode também afetar órgãos internos tais como o coração, fígado, baço, e Iinfono-dos. A JRA sistêmica é também referida como doença de Still. Uma pequena porcentagemdestas crianças desenvolve artrite em muitas articulações e pode ter artrite severa que con-tinua na maioridade.

2. EndometrioseO fator de necrose tumoral tem sido implicado na fisiopatologia de endometriose,quando mulheres com endometriose têm elevados níveis peritoneais do TNF (Eisermann eoutros (1988) Fértil Steril 50:573; Halme (1989) Am J Obstet Gynecol 161 :1718; Mori e ou-tros (1991) Am J Reprod Immunol 26:62;. Taketani e outros (1992) Am J Obstet Gynecol167:265; Overton e outros (1996) Hum Reprod 1996; 11:380). Em uma modalidade, o anti-corpo do TNFa pode ser empregado para tratar endometriose. O termo "endometriose" co-mo empregado aqui se refere a uma condição na qual o tecido que normalmente alinha ocrescimento do útero (endométrio) em outras áreas do corpo, causando dor, sangramentoirregular, e freqüentemente infertilidade.

3. Prostatite

O fator de necrose tumoral tem sido implicado na fisiopatologia de prostatite, comohomens prostatite crônica e dor pélvica crônica têm significativamente níveis elevados doTNF e IL-I no sêmen comparado aos controles (Alexander e outros (1998) Urology 52:744;Nadler e outros (2000) J Urol 164:214; Orhan e outros (2001) Int J Urol 8:495). Além disso,em um modelo de rato os níveis do TNF de prostatite foram também aumentados em com-paração aos controles (Asakawa e outros (2001) Hinyokika Kiyo 47:459; Harris e outros(2000) Próstata 44:25). Em uma modalidade, o anticorpo do TNFa da invenção é emprega-do para tratar prostatite.

O termo "prostatite" como empregado aqui se refere a uma inflamação da próstata.A prostatite é também referida como síndrome de dor pélvica. A prostatite manifesta-se so-zinha em uma variedade de formas, prostatite não bacteriana, prostatite aguda, prostatitebacteriana, e prostatite aguda. A prostatite aguda se refere a uma refere a uma inflamaçãoda glândula da próstata que se desenvolve subitamente. A prostatite aguda é usualmentecausada por uma infecção bacteriana da glândula da próstata. A prostatite crônica é umainflamação da glândula da próstata que se desenvolve gradualmente, contínua durante umperíodo prolongado, e tipicamente tem sintomas sutis. A prostatite crônica é também usual-mente causada por uma infecção bacteriana.

4. Neovascularização de coróide

O fator de necrose tumoral tem sido implicado na fisiopatologia neovascularizaçãode coróide. Por exemplo, membranas neovasculares de coróide retiradas cirurgicamente,vasos neovasculares de manchado positivo para ambos TNF e IL-I (Oh H e outros (1999)Invest Ophthalmol Vis Sd 40:1891). Em uma modalidade, o anticorpo do TNFa é empregadopara tratar neovascularização de coróide. O termo "neovascularização de coróide" comoempregado aqui se refere ao crescimento de novos vasos sangüíneos que se originam dacoróide através de uma ruptura na membrana de Bruch no epitélio pigmentar sub-retiniano(sub-RPE) ou espaço sub-retiniano. A neovascularização de coróide (CNV) é uma maiorcausa de perda visual em pacientes com a condição.

5. Ciática

O fator de necrose tumoral tem sido implicado na fisiopatologia da ciática (Ozaktaye outros (2002) Eur Espine J. 11:467; Brisby e outros (2002) Eur Spine J. 11:62). Em umamodalidade, o anticorpo do TNFct da invenção é empregado para tratar à ciática. O termo"ciática" como empregado aqui se refere a uma condição envolvendo movimento prejudica-do e/ ou sensação nas pernas, causada por lesão do nervo ciático. A ciática é também co- mumente referida como neuropatia o nervo ciático e disfunção do nervo ciático. A ciática éuma forma de neuropatia periférica. Ocorre quando há lesão do nervo ciático, localizado nascostas das pernas. O nervo ciático controla os músculos das costas do joelho e perna inferi-or e fornece a sensação nas costas da coxa, parte inferior da perna e sola dos pés. A ciáticapode ser indicativa de outro distúrbio, incluindo um disco herniado lombar, estenose espi- nhal, doença degenerativa do disco, espondilolistese istmica e síndrome piriforme.

6. Síndrome de Sjogren

O fator de necrose tumoral tem sido implicado na fisiopatologia da síndrome deSjogren (Koski e outros (2001) Clin Exp Rheumatol. 19:131). Em uma modalidade, o anti-corpo do TNFct da invenção é empregado para tratar síndrome de Sjogren. O termo "sín-drome de Sjogren" como empregado aqui se refere a um distúrbio inflamatório sistêmicocaracterizado por boca seca, dilaceramento diminuído, e outras membranas de mucosassecas, e é muitas vezes associados com distúrbios reumáticos auto-imunes, tal como artritereumatóide. Secura dos olhos e boca são os sintomas mais comuns da síndrome. Os sinto-mas podem ocorrer sozinhos, ou com sintomas associados com a artrite reumatóide ou ou- tras doenças do tecido conjuntivo. Pode ser um aumento associado das glândulas salivares.Outros órgãos podem tornar-se afetados. A síndrome pode ser associada com artrite reuma-tóide, lúpus eritematoso sistêmico, escleroderma, polimiosite, e outras doenças.

7. Uveíte

O fator de necrose tumoral tem sido implicado na fisiopatologia de uveíte (Wakefield e Lloyd (1992) Kytokine 4:1; Woon e outros (1998) Curr Eye Res. 17:955). Em uma modali-dade, o anticorpo do TNFct da invenção é empregado para tratar uveíte. O termo "uveíte"como empregado aqui se refere a uma inflamação da úvea, que é a camada entre a esclerae a retina, que inclui a íris, o corpo ciliar, e a coróide. A uveíte é também comumente referi-da como irite, pars planite, croidite, corioretinite, uveíte anterior, e uveíte posterior. A forma mais comum de uveíte é uveíte anterior, que envolve a inflamação na parte dianteira dosolhos, que é usualmente isolada da íris. A condição é muitas vezes chamada irite. Em umamodalidade, o termo uveíte se refere a uma inflamação da úvea que exclui a inflamaçãoassociada com uma doença auto-imune, isto é, uveíte auto-imune excluída.

8. Degeneração macular úmida

O fator de necrose tumoral tem sido implicado na fisiopatologia da degeneraçãomacular úmida. Em uma modalidade, o anticorpo do TNFct da invenção é empregado paratratar a degeneração macular úmida. O termo "degeneração macular úmida" como empre-gado aqui se refere a um distúrbio que afeta a mácula (a parte central da retina do olho) ecausa a diminuição acuidade visual e possível perda da visão central. Os pacientes comdegeneração macular úmida desenvolve novos vasos sangüíneos sob a retina, que causahemorragia, dilatação, e tecido de cicatriz.

9. Osteoporose

O fator de necrose tumoral tem sido implicado na fisiopatologia de osteoporose,(Tsutsumimoto e outros (1999) J Bone Miner Res. 14:1751). A osteoporose é empregadapara se referir a um distúrbio caracterizado pela perda progressiva da densidade óssea eafinação do tecido ósseo. A osteoporose ocorre quando o corpo fracassa ao formar bastanteosso novo, ou também quando muito osso velho é reabsorvido pelo corpo, ou ambos. Oanticorpo do TNFa, ou fragmento de ligação de antígeno destes, da invenção podem serempregados para tratar osteoporose.

10. Osteoartrite

O fator de necrose tumoral tem sido implicado na fisiopatologia de osteoartrite,(Veηη e outros (1993) Arthritis Rheum. 36:819; Westacott e outros (1994) J Rheumatol.21:170). A osteoartrite (OA) é também referida como hipertrófica osteoartrite, osteoartrose,e doença degenerativa da articulação. A OA é uma doença degenerativa crônica das articu-lações esqueléticas, que afetam articulações específicas, comumente os joelhos, quadris,articulações das mãos e espinha dorsal, em adultos de todas as idades. A OA é caracteriza-da por um número de manifestações seguidas incluindo degeneração e afinação da cartila-gem articular com desenvolvimento associado de "úlceras" ou crateras, formação de osteofi-to, hipertrofia do osso nas margens, e mudanças na membrana sinovial e aumento das arti-culações afetadas. Além disso, a osteoartrite é acompanhada por dor e endurecimento, par-ticularmente após atividade prolongada. O anticorpo, ou fragmento de ligação de antígenodestes, da invenção pode ser empregado para tratar osteoartrite. As características radio-gráficas característica da osteoartrite incluem estreitamento do espaço da articulação, escle-rose subcondral, osteofitose, formação de cisto subcondral, corpo ósseo solto (ou "articula-ção de camundongo").

As medicações empregadas para tratar osteoartrite incluem uma variedade de dro-gas antiinflamatórias não esteroidais, (NSAIDs). Além disso, inibidores COX 2, incluindoCelebrex1 Vioxx, e Bextra, e Etoricoxib, são também empregados para tratar a AO. Os este-róides, os quais são injetados diretamente na articulação, podem também ser empregadospara reduzir a inflamação e dor. Em uma modalidade da invenção, os anticorpos do TNFctda invenção são administrados em combinação com NSAIDs, um inibidor de COX 2, e/ ouesteróides.

11. Outros

Os métodos da invenção, também podem ser empregados para tratar vários outrosdistúrbios em que a atividade do TNFα é prejudicial. Os exemplos de outras doenças e dis-túrbios em que a atividade do TNFα tem sido implicando na e patofisiologia, e deste modoque pode ser tratado empregando um anticorpo, ou porção do anticorpo, da invenção, inclu-indo distúrbios inflamatórios do osso, doença de reabsorção óssea, transtornos de coagula-ção, queimaduras, lesão de reperfusão, formação de quelóide, formação de tecido de cica-triz, pirexia, doença periodontal, obesidade, toxicidade por radiação, caquexia relacionada àidade, doença de Alzheimer, edema cerebral, lesão cerebral inflamatória, câncer, síndromeda fadiga crônica, dermatomiosite, reações a droga, tal como síndrome de Stevens-Johnsone reação de Jarisch-Herxheimer, dema em e/ ou ao redor da medula espinhal, febres perió-dicas familiares, síndrome de Felty, fibrose, glomerulonefritite (por exemplo, glomerulonefritepós-estreptocócica ou nefropatia por IgA), livrando-se das próteses, poliangeíte microscópi-ca, distúrbio misto do tecido conjuntivo, mieloma múltiplo, câncer e caquexia, distúrbio múlti-plo de órgãos, síndrome mielodisplásica, orchitism osteolysis, pancreatite, incluindo aguda,crônica, e abscesso pancreático, polimiosite, insuficiência renal progressiva, pseudogota,pioderma gangrenoso, policondrite reincidente, doença cardíaca reumática, sarcoidose, co-Iangite esclerosante, acidente vascular cerebral, reparação aneurisma aórtico toracoabdo-minal (TAAA), síndrome periódica associada ao receptor do TNF (TRAPS), sintomas rela-cionada a vacinação da Febre Amarela, doenças inflamatórias associadas com o ouvido,inflamação crônica do ouvido, otite média crônica com ou sem colesteatoma, inflamação doouvido pediátrico, miotose, câncer ovariano, câncer colorretal, terapia associada com sín-drome inflamatória induzida (por exemplo, síndromes seguida a administração de IL-2), eum distúrbio associado com uma lesão por reperfusão.

É entendido que todos os distúrbios relacionados ao TNFα do acima mencionadoincluem ambas as formas adulta e juvenil da doença quando adequada. É também entendi-do que todos os distúrbios acima mencionados incluem ambas as formas crônica e agudada doença. Além disso, os métodos de dose múltipla variável da invenção podem ser em-pregados para tratar cada dos distúrbios relacionados ao TNFα acima mencionados sozinhoou em combinação com uma outra, por exemplo, um paciente que está sofrendo de uveíte elúpus.

Agentes terapêuticos adicionais

A invenção pertence às composições farmacêuticas e métodos de uso destes parao tratamento de um distúrbio relacionado ao TNFα empregando um regime de dose múltiplavariável. As composições farmacêuticas compreendem um primeiro agente que previne ouinibe um distúrbio relacionado ao TNFα. A composição farmacêutica e os métodos de usopodem compreender um segundo agente que é um ingrediente farmacêutico ativo; que é, osegundo agente é terapêutico e sua função é além de um ingrediente inativo, tal como umportador farmacêutico, preservativo, diluente, ou tampão. O segundo agente pode ser útilem tratamento ou prevenção dos distúrbios relacionados ao TNFa. O segundo agente podediminuir ou tratar pelo menos um sintoma (s) associado com doença alvejada. O primeiro eo segundo agentes podem enxertar seus efeitos biológicos por mecanismos similares ounão relacionados de ação; ou qualquer um ou ambos o primeiro e segundo agentes podemenxertar seus efeitos biológicos por uma multiplicidade de mecanismos de ação. Uma com-posição farmacêutica podem também compreender um terceiro composto, ou até mesmomais ainda, onde o terceiro (e quarto, etc.) composto tem as mesmas características de umsegundo agente.

Deve ser entendido que as composições farmacêuticas descritas aqui podem ter oprimeiro e segundo, terceiro, ou agentes adicionais no mesmo portador farmaceuticamenteaceitável ou em um diferente portador farmaceuticamente aceitável para cada modalidadedescrita. Ainda deve ser entendido que o primeiro, segundo, terceiro e agente adicional po-dem ser administrados simultaneamente ou seqüencialmente nas modalidades descritas.Alternativamente, um primeiro e segundo agente pode ser administrado simultaneamente, eum terceiro agente ou adicional pode ser administrado antes ou após primeira dupla de a-gentes.

A combinação de agentes empregados nos métodos e composições farmacêuticasdescrita aqui pode ter uma terapêutica aditiva ou efeito sinérgico na condição (s) ou doen-ça(s) alvejada para tratamento. A combinação de agentes empregados nos métodos ou composições farmacêuticas descritas aqui também pode reduzir um efeito prejudicial asso-ciado com pelo menos um dos agentes quando administrada sozinho ou sem o outro agen-te(s) da composição farmacêutica particular. Por exemplo, a toxicidade dos efeitos colateraisde um agente pode ser atenuada por outro agente da composição, deste modo permitindouma dosagem elevada, melhorando a complacência do paciente, melhorando o resultado terapêutico. Os efeitos aditivos ou sinérgicos, benefícios, e vantagens das composições seaplicam as classes de agentes terapêuticos, quaisquer classes estruturais ou funcionais, oupara os próprios compostos individuais.

Os compostos ativos suplementares podem também ser incorporados nas compo-sições. Em certas modalidades, um anticorpo ou porção do anticorpo da invenção é co-formulado com e/ ou co-administrado com um ou mais agentes terapêuticos adicionais quesão úteis para tratar distúrbio relacionado ao TNFa em que a atividade do TNFa é prejudici-al. Por exemplo, um anticorpo anti-hTNFa, porção de anticorpo, ou outros inibidores do TN-Fa da invenção podem ser co-formulados e/ ou co-administrados com um ou mais anticor-pos adicionais que se ligam a outros alvos (por exemplo, anticorpos que se ligam a outrascitocinas ou que se ligam as moléculas da superfície da célula), uma ou mais citocinas, re-ceptor do TNFa solúvel (veja, por exemplo, Publicação PCT No. WO 94/06476) e/ ou um oumais agentes de química que inibem a atividade ou produção do hTNFa (tal como derivadosde cicloexano-ilideno como descritos em Publicação PCT No. WO 93/19751). Além disso,um ou mais anticorpos ou outros inibidores do TNFa da invenção podem ser empregadosem combinação com dois ou mais dos agentes terapêuticos antecedentes. Tal combinaçãode terapias pode vantajosamente utilizar dosagens inferiores dos agentes terapêuticos ad-ministrados, deste modo evitando possíveis toxicidades ou complicações associadas com asvarias monoterapias. O agente(s) terapêutico específico é de modo geral selecionado combase no distúrbio relacionado ao TNFa particular sendo tratado, como discutido abaixo.

11. Outros

Os métodos da invenção, também podem ser empregados para tratar vários outrosdistúrbios em que a atividade do TNFa é prejudicial. Os exemplos de outras doenças e dis-túrbios em que a atividade do TNFa tem sido implicando na e patofisiologia, e deste modoque pode ser tratado empregando um anticorpo, ou porção do anticorpo, da invenção, inclu-indo distúrbios inflamatórios do osso, doença de reabsorção óssea, transtornos de coagula-ção, queimaduras, lesão de reperfusão, formação de quelóide, formação de tecido de cica-triz, pirexia, doença periodontal, obesidade, toxicidade por radiação, caquexia relacionada aidade, doença de Alzheimer, edema cerebral, lesão cerebral inflamatória, câncer, síndromeda fadiga crônica, dermatomiosite, reações a droga, tal como síndrome de Stevens-Johnsone reação de Jarisch-Herxheimer, dema em e/ ou ao redor da medula espinhal, febres perió-dicas familiares, síndrome de Felty, fibrose, glomerulonefritite (por exemplo, glomerulonefritepós-estreptocócica ou nefropatia por IgA), livrando-se das próteses, poliangeíte microscópi-ca, distúrbio misto do tecido conjuntivo, mieloma múltiplo, câncer e caquexia, distúrbio múlti-plo de órgãos, síndrome mielodisplásica, orchitism osteolysis, pancreatite, incluindo aguda,crônica, e abscesso pancreático, polimiosite, insuficiência renal progressiva, pseudogota,pioderma gangrenoso, policondrite reincidente, doença cardíaca reumática, sarcoidose, co-langite esclerosante, acidente vascular cerebral, reparação aneurisma aórtico toracoabdo-minal (TAAA), síndrome periódica associada ao receptor do TNF (TRAPS), sintomas rela-cionada a vacinação da Febre Amarela, doenças inflamatórias associadas com o ouvido,inflamação crônica do ouvido, otite média crônica com ou sem colesteatoma, inflamação doouvido pediátrico, miotose, câncer ovariano, câncer colorretal, terapia associada com sín-drome inflamatória induzida (por exemplo, síndromes seguida a administração de IL-2), eum distúrbio associado com uma lesão por reperfusão.

É entendido que todos os distúrbios relacionados ao TNFa do acima mencionadoincluem ambas as formas adultas e juvenis da doença quando adequada. É também enten-dido que todos os distúrbios acima mencionados incluem ambas as formas crônicas e agu-das da doença. Além disso, os métodos de dose múltipla variável da invenção podem serempregados para tratar cada dos distúrbios relacionados ao TNFa acima mencionados so-zinho ou em combinação com uma outra, por exemplo, um paciente que está sofrendo deuveité e lúpus.

Agentes terapêuticos adicionais

A invenção pertence às composições farmacêuticas e métodos de uso destes parao tratamento de um distúrbio relacionado ao TNFa empregando um regime de dose múltipla variável. As composições farmacêuticas compreendem um primeiro agente que previne ouinibe um distúrbio relacionado ao TNFa. A composição farmacêutica e os métodos de usopodem compreender um segundo agente que é um ingrediente farmacêutico ativo; que é, osegundo agente é terapêutico e sua função é além de um ingrediente inativo, tal como umportador farmacêutico, preservativo, diluente, ou tampão. O segundo agente pode ser útil em tratamento ou prevenção dos distúrbios relacionados ao TNFct. O segundo agente podediminuir ou tratar pelo menos um sintoma (s) associado com doença alvejada. O primeiro eo segundo agentes podem enxertar seus efeitos biológicos por mecanismos similares ounão relacionados de ação; ou qualquer um ou ambos o primeiro e segundo agentes podemenxertar seus efeitos biológicos por uma multiplicidade de mecanismos de ação. Uma com- posição farmacêutica podem também compreender um terceiro composto, ou até mesmomais ainda, onde o terceiro (e quarto, etc.) composto tem as mesmas características de umsegundo agente.

Deve ser entendido que as composições farmacêuticas descritas aqui podem ter oprimeiro e segundo, terceiro, ou agentes adicionais no mesmo portador farmaceuticamente aceitável ou em um diferente portador farmaceuticamente aceitável para cada modalidadedescrita. Ainda deve ser entendido que o primeiro, segundo, terceiro e agente adicional po-dem ser administrados simultaneamente ou seqüencialmente nas modalidades descritas.Alternativamente, um primeiro e segundo agente pode ser administrado simultaneamente, eum terceiro agente ou adicional pode ser administrado antes ou após primeira dupla de a- gentes.

A combinação de agentes empregados nos métodos e composições farmacêuticasdescrita aqui pode ter uma terapêutica aditiva ou efeito sinérgico na condição (s) ou doen-ça(s) alvejada para tratamento. A combinação de agentes empregados nos métodos oucomposições farmacêuticas descritas aqui também pode reduzir um efeito prejudicial asso- ciado com pelo menos um dos agentes quando administrada sozinho ou sem o outro agen-te(s) da composição farmacêutica particular. Por exemplo, a toxicidade dos efeitos colateraisde um agente pode ser atenuada por outro agente da composição, deste modo permitindouma dosagem elevada, melhorando a complacência do paciente, melhorando o resultadoterapêutico. Os efeitos aditivos ou sinérgicos, benefícios, e vantagens das composições seaplicam as classes de agentes terapêuticos, quaisquer classes estruturais ou funcionais, oupara os próprios compostos individuais.

Os compostos ativos suplementares podem também ser incorporados nas compo-sições. Em certas modalidades, um anticorpo ou porção do anticorpo da invenção é co-formulado com e/ ou co-administrado com um ou mais agentes terapêuticos adicionais quesão úteis para tratar distúrbio relacionado ao TNFa em que a atividade do TNFa é prejudici-al. Por exemplo, um anticorpo anti-hTNFa, porção de anticorpo, ou outros inibidores do TN-Fa da invenção podem ser co-formulados e/ ou co-administrados com um ou mais anticor-pos adicionais que se ligam a outros alvos (por exemplo, anticorpos que se ligam a outrascitocinas ou que se ligam as moléculas da superfície da célula), uma ou mais citocinas, re-ceptor do TNFa solúvel (veja, por exemplo, Publicação PCT No. WO 94/06476) e/ ou um oumais agentes de química que inibem a atividade ou produção do hTNFa (tal como derivadosde cicloexano-ilideno como descritos em Publicação PCT No. WO 93/19751). Além disso,um ou mais anticorpos ou outros inibidores do TNFa da invenção podem ser empregadosem combinação com dois ou mais dos agentes terapêuticos antecedentes. Tal combinaçãode terapias pode vantajosamente utilizar dosagens inferiores dos agentes terapêuticos ad-ministrados, deste modo evitando possíveis toxicidades ou complicações associadas com asvarias monoterapias. O agente(s) terapêutico específico é de modo geral selecionado combase no distúrbio relacionado ao TNFa particular sendo tratado, como discutido abaixo.Os exemplos não limitados de agentes terapêuticos com que um anticorpo, porçãode anticorpo, ou outros inibidores do TNFa podem ser combinados em um método de dosemúltipla variável de tratamento da invenção incluem o seguinte: droga(s) anti-inflamatórianão esteroidal (NSAIDs); droga(s) anti-inflamatória supressiva de citocina (CSAIDs); CDP-571/ BAY-10-3356 (anticorpo anti-TNFa humanizado; Celltech/ Bayer); cA2/ infliximabe e(anticorpo anti-TNFa quimérico; Centocor); 75 kdTNFR-lgG/ etanercepte e (proteína de fu-são de IgG receptor do TNF de 75 kD; Immunex; veja, por exemplo, Arthritis & Rheumatism(1994) Vol. 37, S295; J. Invest. Med. (1996) Vol. 44, 235A); 55 kdTNF-lgG (proteína de fu-são de IgG receptor do TNF de 55 kD; Hoffmann- LaRoche); IDEC-CE9.1/SB 210396 (anti-corpo anti-CD4 primatizado não esgotado; IDEC/ SmithKIine; veja, por exemplo, Arthritis &Rheumatism (1995) Vol. 38, SI85); DAB 486-IL-2 e/ ou DAB 389-IL-2 (proteínas de fusão IL-2; Seragen; veja, por exemplo, Arthritis & Rheumatism (1993) Vol. 36, 1223); Anti-Tac (anti-IL-2Ra humanizado; Protein Design Labs/ Roche); IL-4 (citocina anti-inflamatória; DNAX/Schering); IL-10 (SCH 52000; IL-10 recombinante, citocina anti-inflamatória; DNAXJ Sche-ring); agonistas IL-4; IL-10 e/ ou IL-4 (por exemplo, anticorpos agonistas); IL-1RA (antago-nista receptor de IL-1; Synergen/ Amgen); anacinra (Kineret®/ Amgen); TNF-bp/s-TNF (pro-teína de ligação do TNF solúvel; veja, por exemplo, Arthritis & Rheumatism (1996) Vol. 39,No. 9 (suplemento), S284; Amer. J. Physiol. - Heart and Circulatory Physiology (1995) Vol.268. pp. 37-42); R973401 (inibidor de fosfodiesterase Tipo IV; veja, por exemplo, Arthritis &Rheumatism (1996) Vol. 39, No. 9 (suplemento), S282); MK-966 (Inibidor COX-2; veja, porexemplo, Arthritis & Rheumatism (1996) Vol. 39, No. 9 (suplemento), S81); Iloprost (veja, porexemplo, Arthritis & Rheumatism (1996) Vol. 39, No. 9 (suplemento), S82); metotrexato; tali-domida (veja, por exemplo, Arthritis & Rheumatism (1996) Vol. 39, No. 9 (suplemento),S282) e drogas relacionadas a talidomida (por exemplo, Celgen); Ieflunomida (inibidor decitocina e anti-inflamatório; veja, por exemplo, Arthritis & Rheumatism (1996) Vol. 39, No. 9(suplemento), S131; Inflammation Research (1996) Vol.45, pp. 103-107); ácido tranexâmico(inibidor de ativação de plasminogênio; veja, por exemplo, Arthritis & Rheumatism (1996)Vol. 39, No. 9 (suplemento), S284); T-614 (inibidor de citocina; veja, por exemplo, Arthritis &Rheumatism (1996) Vol. 39, No. 9 (suplemento), S282); prostaglandina E1 (veja, por exem-plo, Arthritis & Rheumatism (1996) Vol. 39, No. 9 (suplemento), S282); Tenidap (droga anti-inflamatória não esteroidal; veja, por exemplo, Arthritis & Rheumatism (1996) Vol. 39, No. 9(suplemento), S280); Naproxeno (droga anti-inflamatória não esteroidal; veja, por exemplo,Neuro Report (1996) Vol. 7, pp. 1209-1213); Meloxicam (droga anti-inflamatória não esteroi-dal); Ibuprofeno (droga anti-inflamatória não esteroidal); Piroxicam (droga anti-inflamatórianão esteroidal); Diclofenaco (droga anti-inflamatória não esteroidal); Indomethacin (drogaanti-inflamatória não esteroidal); Sulfasalazina (veja, por exemplo, Arthritis & Rheumatism(1996) Vol. 39, No. 9 (suplemento), S281); Azatioprina (veja, por exemplo, Arthristis &Rheumatism (1996) Vol. 39, No. 9 (suplemento), S281); inibidor ICE (inibidor da enzima in-terleucina-1 β convertendo a enzima); inibidor zap-70 e/ ou Ick (inibidor da tirosina quinasezap-70 ou Ick); inibidor VEGF e/ ou inibidor VEGF-R (inibidores de fator de crescimento decélula endotelial vascular ou receptor de fator de crescimento de célula endotelial vascular;inibidores de angiogenese); drogas anti-inflamatórias de corticosteróide (por exemplo,SB203580); inibidores do TNF convertase; anticorpos anti-IL-12; anticorpos anti-IL-18; inter-leucina-11 (veja, por exemplo, Arthritis & Rheumatism (1996) Vol. 39, No. 9 (suplemento),S296); interleucina-13 (veja, por exemplo, Arthritis & Rheumatism (1996) Vol. 39, No. 9 (su-plemento), S308); inibidores de interleucina-17 (veja, por exemplo, Arthritis & Rheumatism(1996) Vol. 39, No. 9 (suplemento), S120); ouro; penicilamina; cloroquina; hidroxicloroquina;clorambucila; ciclosporina; ciclofosfamida; irradiação do linfóide total; globulina anti-timócito;anticorpos anti-CD4; toxinas CD5; colágeno e peptídeo administrados oralmente; Iobenzaritedissódica; Cytokine Regulating Agents (CRAs) HP228 e HP466 (Houghten Farmaceuticals,Inc.); oligodesoxinucleotídeos de fosforotioato de anti-sentido ICAM-I (ISIS 2302; Isis Far-maceuticals, Inc.); receptor 1 complementar solúvel (TP10; T CeII Sciences, Inc.); predniso-na; orgoteína; glicosaminoglicano polissulfato; minociclina; anticorpos anti-IL2R; lipídeosbotânico e de marina (ácidos graxo de semente de planta e peixe; veja, por exemplo, DeLu-ca e outros (1995) Rheum. Dis. Clin. North Am. 21.:759-777); auranofino; fenilbutazona; áci-do meclofenamico; ácido flufenamico; globulina imune intravenosa; zileutona; azaribina; áci-do micofenólico (RS-61443); tacrolimo (FK-506); sirolimo (rapamicina); amiprilose (terafecti-na); cladribina (2-clorodeoxiadenosine); metotrexato; antivirais; e agentes imune de modula-ção. Quaisquer dos agentes acima mencionados podem ser administrados em combinaçãocom o anticorpo do TNFa da invenção para tratar um distúrbio relacionado ao TNFct empre-gando a dose múltipla variável ou método de dose única dos tratamentos da invenção.

Em uma modalidade, o anticorpo do TNFa da invenção é administrado em combi- nação com um dos seguintes agentes para o tratamento de artrite reumatóide empregandoo método de dose múltipla variável de tratamento da invenção: inibidor de pequena moléculade KDR (ABT-123), inibidor de pequena molécula de Tie-2; metotrexato; prednisona; cele-coxibe; ácido fólico; sulfato de hidroxicloroquina; rofecoxibe; etanercepte; infliximabe; ana-cinra (Kineret®/ Arngen); leflunomida; naproxeno; valdecoxibe; sulfasalazina; ibuprofeno;metilprednisolona; meloxicam; acetato de metilprednisolona; tiomalato sódico de ouro; aspi-rina; azatioprina; acetonida de triancinolona; napsilato de propoxifeno/ apap; folato; nabume-tona; diclofenaco; piroxicam; etodolaco; diclofenaco de sódio; oxaprozina; oxicodona hcl;bitartarato hidrocodona/ apap; diclofenaco de sódio/ misoprostol; fentanila; anacinra, recom-binante humano; tramadol hcl; salsalato; sulindaco; cianocobalamin/ fa/ piridoxina; acetami- nofeno; alendronato de sódio; prednisolona; sulfato de morfina; hidrocloreto de lidocaína;indometacina; sulfato de glicosamina/ condroitina; ciclosporina; sulfadiazina ; amitriptilinahcl; oxicodona hcl/ acetaminofeno; olopatadina hcl; misoprostol; sódio naproxeno; omepra-zol; mofetila de micofenolato; ciclofosfamida; rituximabe; IL-I TRAP; MRA; CTLA4-IG; IL- 18BP; ABT-874;. ABT-325 (anti-IL 18); anti-IL 15; BIRB-796; SCIO-469; VX-702; AMG-548;VX-740; Roflumilast; IC-485; CDC-801; e mesopram. Em outra modalidade, o anticorpo doTNFa da invenção é administrado empregando um método de dose múltipla variável para otratamento de um distúrbio relacionado ao TNFa em combinação com um dos agentes men-cionados acima para o tratamento de artrite reumatóide. Em outra modalidade, os agentesadicional mencionados acima são empregados em combinação com um anticorpo do TNFa no método de dose única de tratamento da invenção.

Em uma modalidade, o anticorpo do TNFa da invenção é administrado empregandoo regime de dose múltipla variável em combinação com um dos seguintes agentes para otratamento de um distúrbio relacionado ao TNFa em que a atividade do TNFa é prejudicial:anticorpo anti-IL 12 (ABT 874); anticorpo anti-IL 18 (ABT 325); inibidor de pequena molécula de LCK; inibidor de pequena molécula de COT; anticorpo anti-ILI; inibidor de pequena molé-cula de MK2; anticorpo anti-CD19; inibidor de pequena molécula de CXCR3; inibidor de pe-quena molécula de CCR5; inibidor de pequena molécula de CCR 11 anti-E/L selecionadoanticorpo; inibidor de pequena molécula de P2X7; inibidor de pequena molécula de IRAK-4;agonista de pequena molécula de receptor de glicocorticóide; receptor de anticorpo anti-C5a; inibidor de pequena molécula de receptor C5a; anticorpo anti-CD32; e CD32 comouma proteína terapêutica.

Ainda em outra modalidade, um anticorpo do TNFa obtido empregando a invenção124

pode ser administrado em combinação com um agente antibiótico ou antiinfeccioso. Os a-gentes antiinfecciosos incluem aqueles agentes conhecidos na técnica para tratar infecçõesvirais, fungais, parasíticas ou bacterianas. O termo, "antibiótico," como empregado aqui, serefere a uma substância química que inibe o crescimento de, ou mata, microorganismos.

Abrangido por este termo está o antibiótico produzido por um microorganismo, assim comoantibióticos sintéticos (por exemplo, análogos) conhecidos na técnica. Os antibióticos inclu-em, mas não estão limitados a, claritromicin (Biaxin®), ciprofloxacino (Cipro®), e metronidazol(Flagyl®).

Em outra modalidade, um anticorpo do TNFa obtido empregando a invenção pode ser administrado com um agente terapêutico adicional para tratar ciática ou dor. Os exem-plos de agentes que podem ser empregados para reduzir ou inibir os sintomas de ciática oudor incluem bitartarato hidrocodona /apap, rofecoxibe, ciclobenzaprina hcl, metilprednisolo-na, naproxeno, ibuprofeno, oxicodona hcl/ acetaminofeno, celecoxibe, valdecoxibe, acetatode metilprednisolona, prednisona, fosfato de codeína /apap, tramadol hcl/ acetaminofeno, metaxalone, meloxicam, metocarbamol, hidrocloreto de lidocaína, diclofenaco de sódio, ga-bapentina, dexametasona, carisoprodol, cetorolaco de trometamina, indometacina, acetami-nofeno, diazepam, nabumetona, oxicodona hcl, tizanidina hcl, diclofenaco de sódio/misoprostol, napsilato de propoxifeno /apap, asa/ oxicod/ oxicodona ter, ibuprofeno/hidrocodona bit, tramadol hcl, etodolaco, propoxifeno hcl, amitriptilina hcl, carisoprodol/ co- deína fos/ asa, sulfato de morfina, multi-vitaminas, sódio de naproxeno, citrato de orfenadri-na, e temazepam.

Ainda em outra modalidade, o distúrbio relacionado ao TNFct é tratado com um an-ticorpo do TNFa obtido empregando a invenção em combinação com hemodiálise.

Em outra modalidade, um anticorpo do TNFa obtido empregando a invenção pode ser empregado em combinação com uma droga empregada para tratar Doença de Crohn ouum distúrbio relacionado ao Crohn no regime de dose múltipla variável da invenção. Os e-xemplos de agentes terapêuticos que podem ser empregados para de Crohn incluem mesa-lamina, prednisona, azatioprina, mercaptopurina, infliximabe, budesonida, sulfasalazina, me-tilprednisolona sod succ, difenoxilato/ atrop sulf, hidrocloreto loperamide, metotrexato, ome- prazol, folato, ciprofloxacina/ dextrose em água, bitartarato de hidrocodona/ apap, hidroclo-reto de tetraciclina, fluocinonida, metronidazol, timerosal/ ácido bórico, sulfato de hiosciami-na, colestiramina /sacarose, hidrocloreto ciprofloxacino, hidrocloreto meperidino, hidrocloretode midazolam, oxicodona hcl/ acetaminofeno, hidrocloreto de prometazina, fosfato de sódio,sulfametoxazol/ trimetoprima, celecoxibe, policarbofil, napsilato de propoxifeno, hidrocortiso-na, multivitaminas, balsalazida dissódica, fosfato de codeína /apap, colesevelam hcl, ciano-cobalamin, ácido fólico, levofloxacin, natalizumabe, metilprednisolona, interferon-gama, esargramaostima (GM-CSF). Em uma modalidade, o metotrexato é administrado para o tra-tamento de Doença de Crohn em um dose de 2,5 mg a 30 mg por semana.

Em outra modalidade, um anticorpo do TNFct é administrado em combinação comum agente terapêutico adicional para tratar asma no regime de dose múltipla variável dainvenção. Os exemplos de agentes que podem ser empregados para reduzir ou inibir ossintomas de asma incluem os seguintes: albuterol; salmeterol/ fluticasona; sódio; propionatode fluticasona; budesonida; prednisona; xinafoato de salmeterol; Ievalbuterol hcl; sulfato/ipratrópio; fosfato de sódio de prednisolona; acetonida de triancinolona; dipropionato de be-clometasona; ipratrópio de bromida; Azitromicina ; acetato de pirbuterol; prednisolona; teofi-Iina anidrosa ; zafirlucaste; metilprednisolona sod succ; claritromicin; fumarato de formoterol;vacina para vírus de resfriado; metilprednisolona; triidrato; injeção para alergia; sódio decromolyn; cefprozil; hidrocloreto de fexofenadina; flunisolida/ mentol; levofloxacin; amoxicili-na/ clavulanato, dispositivo auxiliar de inalação, guaifenesin, fosfato de dexametasona sod;moxifloxacino hcl; hiclato; guaifenesin/ metorfan D; gatifloxacino; pefedrina/ cod/ clorfenir;hidrocloreto de cetirizina; furoato de mometasona; xinafoato de salmeterol; benzonatato;cefalexin; pe/ hidrocodona /clorfenir; cetirizina hcl/ pseudoef; fenilefrina/ cod/ prometaazina;codeína / prometazina; flunisolida; dexametasona; guaifenesin/ pseudoefrina; amina de clor-fenir/ hidrocodona; nedocromil de sódio; sulfato de terbutalina; epinefrina e sulfato de metil-prednisolona.

Em outra modalidade, o anticorpo do TNFo da invenção é administrado em combi-nação com um agente terapêutico adicional para tratar COPD. Os exemplos de agentes quepodem ser empregados para reduzir ou inibir os sintomas de COPD incluem, sulfato de al-buterol/ ipratrópio; ipratrópio de bromida; salmeterol/ fiuticasona; albuterol; salmeterol; xina-foato; propionato de fluticasona; prednisona; teofilina anidroso; levofloxacin; metilprednisolo-na sod succ; montelucaste de sódio; budesonida; fumarato de fo/7rioterol; acetonida de tri-ancinolona; guaifenesin; azitromicina; beclometasona; dipropionato; Ievalbuterol hcl; fluniso-lida; sódio; triidrato; gatifloxacino; zafirlucaste; furoate; amoxicilina/ clavulanato; flunisolida/me/ítol; clofeniramina/ hidrocodona; sulfato de metaproterenol; metilprednisolona; efedrina/cod/ clorfenir; acetato de epirbuterole; efedrina/ loratadina; sulfato de terbutalina; tiotrópio debromida; (R,R)-formoterol; TgAAT; Cilomilaste Roflumilast.

Em outra modalidade, o anticorpo do TNFct da invenção é administrado em combi-nação com um agente terapêutico adicional para tratar IPF. Os exemplos de agentes quepodem ser empregados para reduzir ou inibir os sintomas de IPF incluem prednisona; azati-oprina; albuterol; colquicinas; sulfato; digoxina; interferon gama; metilprednisolona sod succ;furosemida; lisinopril; nitroglicerina; espironolactona; ciclofosfamida; ipratrópio bromida; acti-nomicina d; alteplase; propionato de fluticasona; levofloxacino; sulfato de metaproterenol;sulfato de morfina; oxicodona hcl; cloreto de potássio; acetonida de triancinolona; tacrolimoanidroso; cálcio; interferon alfa; metotrexato; mofetila de micofenolato.Em uma modalidade da invenção, um anticorpo do TNFct é administrado em com-binação com um agente que é comumente empregado para tratar espondiloartropatias. Osexemplos de tais agentes incluem não esteroidal, drogas anti-inflamatória drogas (NSAIDs),inibidores COX 2, incluindo Celebrex®, Vioxx®, e Bextra®, e etoricoxibe. A fisioterapia é tam-bém comumente empregada para tratar espondiloartropatias, usualmente em conjunçãocom drogas inflamatórias não esteroidais.

Em outra modalidade, o anticorpo do TNFa da inveção pode ser administrado emcombinação com um agente terapêutico adicional para tratar espondilite ancilosante. Osexemplos de agentes os quais podem ser empregados para reduzir ou inibir os sintomas deespondilite ancilosante incluem ibuprofeno, diclofenaco e misoprostol, naproxeno, meloxi-cam, indometacina, diclofenaco, celecoxibe, rofecoxibe, sulfasalazina, prednisona, metotre-xato, azatioprina, minociclina, prednisona, etanercepte, e infliximabe.

Em outra modalidade, o anticorpo do TNFa da invenção é administrado em combi-nação com um agente terapêutico adicional para tratar artrite psoriática. Os exemplos deagentes os quais podem ser empregados para reduzir ou inibir os sintomas de artrite psoriá-tica incluem metotrexato; etanercepte; rofecoxibe; celecoxibe; ácido fólico; sulfasalazina;naproxeno; leflunomida; acetato de metilprednisolona; indometacina; sulfato de hidroxicloro-quina; sulindaco; prednisona; dipropionato de betametasona aumentada; infliximabe; meto-trexato; folato; acetonida de triancinolona; diclofenaco; dimetilsulfoxido; piroxicam; diclofena- co de sódio; cetoprofeno; meloxicam; prednisona; metilprednisolona; nabumetona; tolmetinade sódio; calcipotrieno; ciclosporina; diclofenaco; sódio /misoprostol; fluocinonida; sulfato deglicosamina; tiomalato sódico de ouro; hidrocodona; bitartarato /apap; ibuprofeno; risedrona-to de sódio; sulfadiazina; tioguanina; valdecoxibe; alefacepte; e efalizumabe.

Em uma modalidade o inibidor do TNFa é administrado em seguida a um procedi-mento inicial para tratar doença cardíaca coronária no regime de dose múltipla variável dainvenção. Os exemplos de tais procedimentos incluem, mas não são limitados a enxerto dedesvio da artéria coronária (CABG) e angioplastia por balão coronariano transluminal percu-tâneo (PTCA) ou angioplastia. Em uma modalidade, o inibidor do TNFa é administrado a fimde prevenir estenose de re-ocorrência. Em outra modalidade da invenção, o inibidor do TN-Fa é administrado a fim de prevenir ou tratar restenose. A invenção também fornece ummétodo de tratamento, onde o inibidor do TNFa é administrado antes de, em conjunçãocom, ou em seguida a inserção de uma sonda na artéria de um paciente recebendo um pro-cedimento para tratar doença cardíaca coronária. Em uma modalidade o sonda é adminis-trada em seguida ao CABG ou PTCA.

Uma ampla variedade de enxertos por sonda por ser utilizada no contexto da pre-sente invenção, dependendo do sítio e natureza de tratamento desejado. Os enxertos porsonda podem ser, por exemplo, enxertos por tubo ou bifurcado, cilíndrico ou estreitado, ex-pansível ou balão expansível, unicorpo, ou, modular. Além do mais, o enxerto por sondapode se adaptado para liberar a droga em somente nas extremidades distais, ou junto aocorpo inteiro do enxerto por sonda. O inibidor do TNFo da invenção pode também ser admi-nistrado em uma sonda. Em uma modalidade, o anticorpo do TNFct, incluindo, por exemplo,adalimumabe/ D2E7/ HUMIRA® é administrado por uma sonda de eluição de droga.

O anticorpo do TNFct pode ser administrado em combinação com um agente tera-pêutico adicional tratar restenose. Os exemplos de agentes que podem ser empregadospara tratar ou prevenir restenose incluem sirolimo, paclitaxel, everolimo, tacrolimo, ABT-578,e acetaminofeno.

O anticorpo do TNFct da invenção pode ser administrado em combinação com umagente terapêutico adicional para tratar de infarto do miocárdio. Os exemplos de agentesque podem ser empregados para tratar ou prevenir infarto do miocárdio incluem aspirina,nitroglicerina, tartrato de metoprolol, enoxaparin de sódio, heparina de sódio, bisulfato declopidogrel, carvedilol, atenolol, sulfato de morfina, sucinato de metoprolol, varfarina de só- dio, lisinopril, mononitrato de isosorbida, digoxina, furosemida, simvastatina, ramipril, tenec-teplase, maleato de enalapril, torsemida, retavase, potássio de losartana, quinapril hcl/magcarb, bumetanida, alteplase, enalaprilate, hidrocloreto de amiodarona, m-hidrato de tirofibanhcl, hidrocloreto de diltiazem, captopril, irbesartana, valsartana, hidrocloreto de propranolol,fosinopril de sódio, hidrocloreto de lidocaína, eptifibatida, cefazolina de sódio, sulfato de a-tropina, ácido aminocapróico, espironolactona, interferon, hidrocloreto de sotalol, cloreto depotássio, docussato de sódio, dobutamina hcl, alprazolam, pravastatina de sódio, atorvasta-tina de cálcio, hidrocloreto de midazolama, hidrocloreto de meperidina, dinitrato de isosorbi-da, epinefrina, hidrocloreto de dopamina, bivalirudina, rosuvastatina, ezetimiba/ sinvastatina,avasimiba, abciximabe, e cariporide.

O anticorpo do TNFct da invenção pode ser administrado em combinação com umagente terapêutico adicional para tratar angina. Os exemplos de agentes que podem serempregados para tratar ou prevenir angina incluindo: aspirina; nitroglicerina; mononitrataisosorbida; atenolol; succinato de metoprolol; tartrato de metoprolol; besilato de amlodipina;digoxina; hidropclorito de dilitiazem; dinitrato de isosorbida; bisulfato de clopidogrel; nifedipi- na; atorvastatina de cálcio; cloreto de potássio; sinvastatina; verapamil hcl; furosemida; pro-pranolol hcl; carvedilo; lisinopril; sprionolactona; hidroclorotiazida; maleato de enalapril; ma-dolol; ramipril; enoxaparina de sódio; heparina de sódio; valsartanaa; hidrocloreto de sotalol;fenofibrato; ezetimibe; bumetanide; losartana de potássio; lisinopril/ hidroclorotiazido; felodi-pina; captopril; e fumarato de bisoprolol.

Em uma modalidade da invenção, um anticorpo do TNFct é administrado em com-binação com um agente que é comumente empregado para tratar vírus da hepatite C. Osexemplos de tais agentes incluim Interferon alfa-2a, Interferon alfa-2b, Interferon alfa conl,Interferon alfa-nl, Interferon Pegilado alfa-2a, Interferon Pegilado alfa-2b, Ribavirina1 Pegin-terferon alfa-2b e ribavirina, Ácido ursodesoxicólico, Ácido glicirrízico, Timalfasina1 Maxami-na, e VX-497.O anticorpo do TNFa pode ser administrado em combinação com corticosteróidestópicos, análogos de vitamina D1 e retinóides orais ou tópicos, ou combinações destes, parao tratamento de psoríase. Além disso, o anticorpo do TNFa pode ser administrado em com-binação com um dos seguintes agentes para o tratamento de psoríase: inibidor de pequenamolécula de KDR (ABT-123), inibidor de pequena molécula de Tie-2, calcipotriena, propiona-to de clobetasol, acetonida de triancinolona, propionato de halobetasol, tazarotena, metotre-xato, fluocinonida, betametasona diprop aumentada, fluocinolona, acetonida, acitretin,shampoo de alcatrão, valerato de betametasona, furoato de mometasona, cetoconazole,pramoxina/ fluocinolone, valerato de hidrocortisona, flurandrenolida, uréia, betametasona,propionato de clobetasol/ emol, propionato de fluticasona, azitromicina, hidrocortisona, fór-mula de umidificação, ácido fólico, desonida, alcatrão de carvão, diacetato de diflorasona,etanercepte, folato, ácido lático, metoxsaleno, hc/bismuto subgal/ znox/ resor, acetato demetilprednisolona, prednisona, proteção solar, ácido salicílico, halcinonida, antralina, pivala-to de clocortolona, extrato de carvão, alcatrão de carvão/ ácido salicílico, alcatrão de carvão/ácido salicílico/ enxofre, desoximetasone, diazepam, emoliente, emoliente pimecrolimus,fluocinonide/ emoliente, óleo mineral/ óleo de rícino/ na lact, óleo mineral/ óleo de amendo-im, petróleo/ miristato de isopropila, psoralen, ácido salicílico, sabão/ tribromsalan, timerosal/ácido bórico, celecoxibe, infliximabe, alefacepte, efalizumabe, tacrolimo, pimecrolimus,PUVA1 UVB e outra fototerapia e sulfasalazina.Um anticorpo, porção do anticorpo, pode ser empregado em combinação com ou-tros agentes para tratar condições de pele. Por exemplo, um anticorpo, porção do anticorpo,ou outro inibidor do TNFa da invenção é combinado com terapia PUVA. PUVA é a combina-ção de psoralen (P) e radiação ultravioleta de longas ondas (UVA) que é empregado paratratar muitas diferentes condições de pele. Os anticorpos, porções de anticorpos, ou outrosinibidores de TNFa da invenção podem também ser combinados com pimecrolimus. Emoutra modalidade, os anticorpos da invenção são empregados para tratar psoríase, onde osanticorpos são administrados em combinação com tacrolimo. Em outra modalidade, tacroli-mo e inibidores do TNFa são administrados em combinação com metotrexato e/ ou ciclospo-rina. Ainda em outra modalidade, o inibidor do TNFa da injeção é administrado com trata-mento com laser excimer para tratar psoríase.Os exemplos não limitados de outros agentes terapêuticos com que um anticorpodo TNFa pode ser combinado para tratar um distúrbio na pele ou unha incluem fototerapiaUVA e UVB. Outros exemplos não limitados que podem ser empregados em combinaçãocom um inibidor do TNFa inclui agentes terapêuticos anti-IL-12 e anti-IL-18, incluindo os an-ticorpos.

Em uma modalidade, o anticorpo do TNFa pode ser administrado em combinaçãocom um agente terapêutico adicional no tratamento de doença de Behcet. Os agentes tera-pêuticos adicionais que podem ser empregados para tratar doença de Behcet incluem, masnão estão limitados a, prednisona, ciclofosfamida (Cytoxan), Azatioprina (também chamadaimuran, metotrexato, trimetoprima/ sulfametoxazol (também chamado bactrim or septra) eácido fólico.

Quaisquer um dos agentes terapêuticos acima mencionados, sozinhos ou em com-binação com estes, podem ser administrados a um paciente sofrendo de distúrbio relaciona-do ao TNFa em que o TNFa é prejudicial, em combinação com o anticorpo do TNFa empre-gando um regime de tratamento de dose múltipla variável da invenção. Em uma modalidade,qualquer um dos agentes terapêuticos acima mencionados, sozinhos ou em combinaçãocom estes, pode ser administrado a um paciente sofrendo de artrite reumatóide, além disso,para um anticorpo do TNFa para tratar um distúrbio relacionado ao TNFa. Deve ser entendi-do que os agentes terapêuticos adicionais podem ser empregados em terapia de combina-ção como descrito acima, mas também pode ser empregado em outras indicações descritasaqui onde um efeito benéfico é desejado.

Esta invenção é ainda ilustrada pelos seguintes exemplos que não devem ser inter-pretados como limitados. Os conteúdos de todas as referências, patentes e pedidos de pa-tentes publicados citado por toda esta aplicação são incorporados aqui por referência.

Exemplos

Exemplo 1: Procedimento de purificação por adalimumabe

Neste exemplo, um processo de purificação para purificar uma mistura de adalimu-mabe e proteínas de células hospedeiras (HCPs) foi planejado, qualquer processo é referidocomo processo A. No processo A, a mistura de adalimumabe e HCP não foi submetida auma etapa de cromatografia da proteína A. A primeira coluna empregada no processo A foiuma resina de permuta de cátion, Fractogel S, com aquela adalimumabe ligada ao mesmotempo com HCP correndo direto. A adalimumabe foi então eluída da coluna Fractogel S emum primeiro eluído. Logo depois, o primeiro eluído foi submetido à inativação viral por pHpara obter uma preparação viralmente inativada. Logo depois, a preparação viralmente ina-tivada foi aplicada a uma resina de permuta de íon ânion, uma coluna de Q sepharose, paraque a adalimumabe não se ligasse, para desse modo obter um primeiro fluxo atravessante.O primeiro fluxo foi então aplicado a uma coluna de interação hidrofóbica, uma coluna desefarose de fenila, para que a adalimumabe se ligasse e HCP corresse direto, para dessemodo obter um segundo eluído. Ainda processando e embalando o segundo eluído foi de-sempenhado para obter o produto engarrafado final.

Em mais detalhes, o processo A compreende as seguintes etapas:Etapa 1: coluna Fractogel S1 100 χ 20 cm (157 L), ν = 175 cm/hr, Carga < 30 g deproteína /L de resina por ciclo, equilibrada com 20 mM de fosfato de sódio, 25 mM de cloretode sódio. Após o carregamento de adalimumabe, a coluna foi lavada uma vez com tampãode equilíbrio e eluído com um tampão de eluição compreendendo 20 mM de fosfato de só-dio, 150 mM de cloreto de sódio para obter o primeiro eluído;

Etapa 2: filtragem de delipídeos;

Etapa 3: ultrafiltragem;

Etapa 4: inativação por pH em pH 3,5 durante 1 hora; após a inativação foi comple-ta, pH foi ajustado de 6,8 a 7,5, a série de filtros foi lavada com dois volumes de 50 mM detrolamina;

Etapa 5: coluna FF de Q Sefarose, 60 χ 30 cm (85L), ν = 150 cm/hr, Carga <40 gde proteína /L de resina por ciclo, equilibrada em um tampão de equilíbrio compreendendo25 mM de trolamina, 40 mM de cloreto de sódio, pH 7,6; fluxo atravessante obtido;

Etapa 6: coluna HP de sefarose de fenila, 80 χ 15 cm (75 L), ν = 75 cm/hr (eluir em 37,5 cm/hr), Carga 20-40 g de proteína /L de resina por ciclo, equilibrada com um tampão deequilíbrio compreendendo 20 mM de fosfato de sódio, 1,1 M (NH4)2SO4, pH 7, lavada umavez com tampão de equilíbrio e eluído por desempenhar um sal gradiente em etapas para11 mM de fosfato de sódio, 0,625 M (NH4)2SO4, pH 7,0, para desse modo obter um segundoeluído, com fracionamento de produto máximo se carga < 35 g de proteína /L de resina;

Etapa 7: filtragem viral;

Etapa 8: Diafiltragem/ ultrafiltragem final;

Etapa 9: engarrafagem final

Mais detalhes do processo A são também descritos no Exemplo 2 abaixo.

Exemplo 2: Purificação de adalimumabe para melhorar a produção e diminuição deimpurezas

As modificações foram introduzidas para a captura e operações de purificação su-periores no processo de fabricação do anticorpo de adalimumabe, isto é, processo A descri-to no Exemplo 1 acima. O processo modificado é referido aqui como "processo B", e incluias seguintes etapas especialmente: O material de partida foi a mistura obtida do processo de fermentação empregando o sistema de expressão da célula do Ovário de Hamster Chi-nês (CHO). A mistura foi primeiro separada empregando cromatografia de permuta de cá-tion, isto é, uma coluna Fractogel S1 onde a adalimumabe foi capturada na coluna (referidacomo "captura"). A carga na coluna Fractogel S foi aumentada devido à remoção. Um méto-do melhorado de lavar a coluna Fractogel S foi empregado para diminuir a quantidade deproteína de célula hospedeira (HCP). A coluna Fractogel S com dalimumabe ligada foi lava-da com uma pluralidade de lavagens, incluindo uma lavagem intermediária que foi uma la-vagem de condutividade mais alta compreendendo 45% de tampão de eluição e 55% deágua por injeção (WFI). Em seguida a captura e lavagem, a adalimumabe foi eluída da colu-na Fractogel Seo eluído submetido a cromatografia de permuta de ânion , isto é, uma colu-na Q Sefarose. Antes de executar o primeiro eluído de adalimumabe sobre a coluna depermuta de ânion, o eluído foi viralmente inativado empregando um método melhorado combase no pH e condutividade. A preparação de adalimumabe foi coletada no fluxo atraves-sante da coluna de ânion, e foi subseqüentemente separada ainda de acordo com cromato-grafia de interação hidrofóbica, isto é, coluna de sefarose de fenila. O eluído da coluna desefarose de fenila foi ainda processado para filtragem viral, ultrafiltragem final, e engarrafa-gem final de acordo com os métodos padrão na técnica.

O processo Bé um método de purificação melhorado para obter uma preparaçãode anticorpo tendo um nível reduzido de HCP e procatepsina L. Os processos descritos aquiforam desempenhados empregando um volume de 6.000 L, entretanto, deve ser notado queas modificações descritas no processo B podem ser empregadas com qualquer volume.Uma comparação entre as modificações do processo A versus o processo B é fornecida na

Tabela 5 (modificações no processo B são realçadas em negrito):

Tabela 5: Comparação do processo A e processo B

Unidade de Operação Processo AProcesso BColuna Fractogel S100 χ 20 cm (157 L)100 χ 20 cm (157 L) v = 175 cm/hrv = 175 cm/hr

Carga <30 g deCarga <35 g de

proteína/ L por cicloproteina/ L por cicloLavagem 1 = Tampão deLavagem 1 = Tam-pão de

equilíbrioequilíbrioLavagem 2 = 45% detampão de eluição: 55% de WFIEluição = tampão deeluiçãoEluição = tampão deeluição

Filtragem de delípideoNão há chance para esta etapa do processo.Ultrafiltragem Não há chance para esta etapa do processo.Inativação por pHApós a inativação Após a inativaçãocompleta, ajustar completa, ajustaro pH a 6,8 - 7,5o pH a 6,8 - 7,5Série de filtros de Série de filtros delavagem com 2 volumesaproximadamente 2,5de 50 mM de trolaminade volumes deWFI1 para obter

condutividade na faixa de 3,9 - 5,2 mS/ cmColuna FF de Q60 χ 30 cm (85 L)60 χ 30 cm (85 L)Sefarose ν = 150 cm/ hrv = 150 cm/ hrCarga <40 g de Carga <40 g deproteína/ L de resinaproteina/ L de resinapor ciclopor cicloColuna HP Sefarose80 χ 15 cm (75 L)80 χ 15 cm (75 L)de fenilv = 75 cm/ hr (eluídov = 75 cm/ hr (eluídode 37,5 cm/ hr)de 37,5 cm/ hr)Carga de 20 - 40 g deCarga de 20 - 40 g deproteína/ L de resina proteína/ L de resinapor ciclo com por ciclo não comfracionamento defracionamento depico de produto se pico de produto secarga <35 g/ L de carga <35 g/ L deresinaresina

Filtragem Viral Não há chance para esta etapa do processo.

Ultrafiltragem final/ Não há chance para esta etapa do processo.diafiltragem

Engarrafagem finalNão há chance para esta etapa do processo.

As modificações para as várias etapas no processo B são descritas em mais deta-lhes abaixo:

Cromatografia por cátion

A recuperação primária e operações de captura do processo B compreendem fil-tragem profunda, cromatografia de permuta de cátion de Fractogel SO3 (Fractogel S), a se-gunda serve para capturar a adalimumabe da colheita purificadora e impurezas relacionadasao processo de redução (por exemplo, célula hospedeira do CHO e meios de impurezas).

Uma coluna longa de 100 cm de diâmetro χ 20 cm (volume de cama de 157 L) foi emprega-da para esta operação. A coluna foi acondicionada com resina Fractogel S (EM Industries,Hawthorne, NY) e a assimetria e Altura Equivalente a uma Placa Teórica (HETP) são medi-dos para determinar a qualidade da embalagem. A coluna foi em seguida sanitizada com 1,0M de NaOH durante 1 hora, e armazenada em 0,1 M de NaOH até que esteja pronta parauso.

A cromatografia de permuta de cátion pode ser afetada por carregamento de prote-ína, força iônica (controlada por diluição de colheita filtrada), pH e velocidade linear. O car-regamento de proteína pode afetar a seletividade, a resolução (pureza) e a produção. A for-ça iônica (controlada por diluição de carga) e o pH da amostra de carga podem afetar a ca-pacidade de ligação, a seletividade, a resolução e a produção. A velocidade linear pode afe-tar as propriedades do transporte de massa, potencialmente resultando em ligação diminuí-da e resolução em muitas taxas de fluxo elevado e dispersão axial em muitas taxas de fluxo baixo.

A carga máxima para a coluna de Fractogel S foi aumentada para 35 g de proteínapor litro de resina. A coluna de cátion foi equilibrada com 20 mM de fosfato de sódio, 25 mMde NaCI, pH 7. Em seguida a equilibração, a coluna é carregada com <35 g de proteína /Lde resina de filtragem profunda diluída. Uma parte da filtragem profunda foi diluída com a- proximadamente 1,3 partes de água para reduzir a condutividade para aproximadamente 6,1mS/cm. A coluna foi em seguida lavada por linha de base com tampão de equilíbrio seguidapor uma lavagem com 9 mM de fosfato de sódio, 68 mM de NaCI, pH 7 (equivalente a 45%de tampão de eluição, 55% de WFI). O produto foi eluído da coluna em uma fração únicacom 20 mM de fosfato de sódio, 150 mM de NaCI, pH 7 (tampão de eluição). A mistura do produto é coletada de 10% de deflexão da escala total do produto máximo A2eo em ambasas extremidades principais e posteriores. A coluna foi girada quando necessária para pro-cessar a adalimumabe crua. Os eluídos Fractogel S de cada ciclo de coluna foram mistura-dos no mesmo tanque de coleta. Entre cada ciclo, a coluna foi regenerada com 25 mM defosfato de sódio, 1,0 M de NaCI, pH 7. Os estudos desempenhados em escala laboratorial demonstraram que a recupera-ção eficiente do produto e redução em HCP pode ser obtida em faixas de carga elevada doque a Faixa Operacional Aceitável (AOR) previamente estabelecida de 15 a 30 g de proteína/L de resina. A análise de ruptura de adalimumabe versus a carga da coluna indica que 5%da ruptura calculada ocorre em 38 g/L de resina em pH 7. Em conseqüência, uma AOR revi-sada de <35 g de proteína /L de resina foi estabelecida para a etapa de cromatografia deFractogel S. Em resumo, o limite da carga foi também aumentado para 35 gramas de prote-ína por litro de resina para aumentar a capacidade do processo.

Em outro conjunto de experimentos com a resina Fractogel, o efeito do pH na ruptu-ra de adalimumabe versus a carga da coluna foi examinada. Em particular, uma curva da ruptura do produto foi empregada para determinar a capacidade da ligação dinâmica de re-sina sob condições de carregamento definidas. A tabela 6 abaixo resume a recuperação osdados para o estudo da capacidade de carregamento de Fractogel carregamento nas condi-ções de pH 7 previamente descritas. A recuperação de percentagem em 10 g/L foi normali-zada a 100%.

Tabela 6 Recuperação de dados para estudar a capacidade de carregamento de

Fractogel em pH 7

<table>table see original document page 134</column></row><table><table>formula see original document page 135</column></row><table>

Produção da etapa de Fractogel >50%, BR-068.Os resultados em pH 7 mostram mais do que 90% de recuperação de adalimumabefoi observada para as condições de carregamento de menos do que 50 g de adalimumabepor litro de resina de Fractogel. A ruptura de adalimumabe foi plotada versus a capacidadede carregamento para gerar uma cura de ruptura teórica. Em pH 7, 10% da ruptura teóricafoi achada ser em 54 g de adalimumabe por litro de resina de Fractogel. Também em pH 7,5% da ruptura teórica foi achada ser em 38 g de adalimumabe por litro de resina de Fracto-gel, confirmando os resultados descritos acima.Um estudo similar foi realizado como descrito acima a não ser que a carga e asprimeiras condições de pH de lavagem foram ajustadas a pH 5. A coluna de cátion foi equili-brada com 24 mM de ácido cítrico e 51 mM de fosfato de sódio, dibásica, pH 5. Em seguidaao equilíbrio, a coluna foi carregada com até 80 g de proteína /L de resina da filtragem pro-funda diluída. A colheita da cultura celular foi ajustada por pH para 5,0 com 3M de ácidoacídico antes da filtragem profunda. Uma parte da filtragem profunda foi diluída com aproxi-madamente o mesmo volume de água para reduzir a condutividade para aproximadamente8 a 10 mS/cm. Mais uma vez, a ruptura de adalimumabe foi plotada versus a capacidade docarregamento para gerar uma curva de ruptura teórica. Sob as condições estudadas, 10%da ruptura teórica foi achada ser de aproximadamente 74 g de adalimumabe por litro de re-sina de Fractogel. 5% da ruptura teórica foi achada ser de aproximadamente 73 g de adali-mumabe por litro de resina de Fractogel. Devido ao caráter da permuta de cátion da resina,reduzir o pH da condições de cromatografia da capacidade de ligação dinâmica de adali-mumabe significativamente aumentada. Comparando as curvas de ruptura em pH 5 e pH 7,a ligação entre a molécula de adalimumabe e a resina de Fractogel foi observada ser muitomais forte m pH inferior. Foi também achado que a capacidade dinâmica de carregamentoelevado em pH 5, uma melhor depuração de HCP foi obtida. A tabela 7 abaixo resume osdados para o estudo da capacidade de carregamento de Fractogel vs. a HCP presente noeluído nas condições de pH 5 testada recentemente. Os dados claramente indicam que sobas condições testadas, a remoção de HCP por adalimumabe tem ocorrido.Tabela 7 HCP presente no eluído de Fractogel em capacidade diferentes de carre-gamento em pH 5

<table>table see original document page 136</column></row><table>

Uma vez que a análise de ruptura de adalimumabe versus a carga de coluna em pH5 indicou 5% da ruptura calculada ocorre em 73 g/L resina, uma AOR revisada de <70 g deproteína /L de resina pode ser estabelecida para a etapa de cromatografia de Fractogel Sem pH 5. Em resumo, o limite de carga, que previamente foi aumentado para 35 gramas deproteína por litro de resina em pH 7 (como descrito acima), pode ser ainda aumentado a 70gramas de proteína por litro de resina por redução do pH para 5.

Lavagem intermediária

Para ainda reduzir a quantidade de impurezas na preparação de adalimumabe,uma etapa de lavagem intermediária foi desempenhada antes da eluição da adalimumabeda coluna de cátion (veja Tabela 8 abaixo). Esta lavagem adicional foi ajustada em relação àcondutividade do tampão de eluição, e ajudada para melhorar a purificação de HCPs. A in-serção de uma etapa de lavagem intermediária antes da eluição reduzir a quantidade deHCP eluída com adalimumabe por mais de 60% comparada ao processo A. Os parâmetrosinvestigados incluindo a combinação de tampão de eluição com água empregados na lava-gem (% do tampão de eluição), condutividade, pH, volume de lavagem, faixa de fluxo e ida-de da resina. A lavagem ideal consiste de uma combinação de 45% de tampão de eluição(20 mM de fosfato de sódio, 150 mM de cloreto de sódio, pH 7) e 55% de água. A tabela 8apresenta dados comparando o nível de HCP no eluído de Fractogel S com e sem a lava-gem adicional. As amostras do eluído de Fractogel S foram examinadas por HCP e compa-radas com os níveis de HCP no eluído de um processo de Fractogel S de escala piloto, queincorporou uma carda elevada e a etapa de lavagem. Os dados da escala piloto indicam quea adição da segunda etapa de lavagem significativamente melhora a purificação de HCPpela etapa Fractogel S.

Tabela 8: Os níveis de HCP no eluído de Fractogel com e sem etapa de lavagemde pré-eluição em escala laboratorial

Carga de Coluna Etapa de Produção HCP (ng/MG deAmostrapor g de proteína/ (%) adalimumabe) L de resinaLote A sem 2alavagema259619410Lote B sem 2alavagema259622992

Lote C sem 2alavagem3 259321931Lote D sem 2alavagema259720037Cargab L 6000,escala piloto0com 2a etapade Iavagem3095 4914

a A amostra de eluído foi coletada do lote de 6.000 L indicado e analizada para con-teúdo de HCP

b A carga consistida de uma combinação de colheita filtrada de vários lotes

c O tamanho da coluna da escala piloto é 10 (D) χ 21 (L) cm; 2° tampão de lava-gem; 45% de tampão de eluição (20 mM de fosfato de sódio, 150 mM de cloreto de sódio,pH 7,2), 55% de água para injeção.

Os perfis de eluição típicos para a etapa de cromatografia de Fractogel S para cadaprocesso são fornecidos na Figura 1. O processo B inclui a etapa de lavagem adicional in-termediária acima mencionada antes da eluição, deste modo, a extremidade principal daeluição máximo é trapaceada com menos espécies de eluição inicial detectadas do que a-quelas do processo prévio. Em resumo, uma etapa de lavagem intermediária, exatamenteantes da eluição de adalimumabe, foi introduzida à etapa de Fractogel S para melhorar apurificação da impurezas relacionadas ao processo, tais como HCPs.

Inativação viral

A etapa de inativação de ph inferior do processo B fornece uma margem de segu-rança por potencial de inativação não detectado envolveu viroses que podem estar presen-tes na filtragem de delipídeos. A mistura viral inativada é subseqüentemente filtrada e neu-tralizada por pH para remoção de particulados e minimiza a biocarga. A qualidade da adali-mumabe durante a inativação de vírus por pH inferior pode ser afetada por pH e a duraçãoda incubação de pH inferior. A inativação por vírus é dependente naqueles mesmos parâme-tros, e pode ser afetada pela concentração de proteína, que pode reduzir a inativação emconcentrações elevadas. O tempo de incubação mínima em pH inferior foi aumentado de 15minutos para 60 minutos. A análise das amostras de fabricação considerada antes e após aetapa de pH inferior confirmou que a adalimumabe pode ser seguramente mantida em pH3,5 durante 1 hora sem comprometer sua habilidade de proteger as células L929 de murinocomo os efeitos citotóxico do fator de necrose tumoral (TNF).

Em seguida a inativação, o pH e a condutividade do eluído viral inativado foram a-justados de acordo com o tampão de equilíbrio da seguinte coluna, por exemplo, coluna QSefarose. O pH foi ajustado a 7,8 - 8,2, com um pH alvo de 8,0. Em resumo, o pH e a con-dutividade da mistura viral inativada, que serve como a carga FF de Q Sefarose, foi ajustadapara igualar o pH e a condutividade do tampão de equilíbrio da Q Sefarose.

Ânion cromatografia

A etapa de coluna aniônica, isto é, Q Sefarose, serve para reduzir as impurezas re- lacionadas ao processo tal como HCP, especificamente incluindo procatepsina L, assim co-mo DNA e insulina. Uma coluna de 60 cm de diâmetro χ 30 cm de comprimento (volume decama 85 L) foi empregada para a cromatografia FF de Q Sefarose. A coluna foi acondicio-nada com resina FF de Q Sefarose (Amersham Pharmacia, Piscataway, NJ) e assimetria eHETP foram medido para determinar a qualidade da embalagem. A coluna foi em seguida sanitizada com 1,0 M de NaOH durante 1 hora, e armazenada em 25 mM de fosfato de só-dio, 20% de isopropanol até que esteja pronto para uso.

O equilíbrio da resina foi efetuado com 25 mM de trolamina, 40 mM de NaCI, pH 8(tampão de equilíbrio). O carregamento de proteína máximo para esta etapa foi <40 g deproteína /L de resina por ciclo. As impurezas relacionadas ao processo absorvidas para a resina, e adalimumabe fluida através da coluna. O material diluído, filtrado, inativado porvírus foi tipicamente processado em dois ciclos de aproximadamente igual quantidades; osciclos adicionais podem ser requeridos para processar todos os materiais viáveis. O carre-gamento e a eluição foram desempenhados em 150 cm/hr, e o fluxo atravessante da colunaé coletado em seguida um A28O aumenta acima de 2% da escala total. A coluna foi em se- guida lavada com tampão de equilíbrio e a lavagem foi coletada até que o A28O retorne para5% da escala total. A lavagem é misturada com fluxo total e é planejada a FTW de Q Sefa-rose. Entre os ciclos, a coluna foi regenerada com 25 mM de fosfato de sódio, 1,0 M de Na-Cl, pH 7, e em seguida equilibrada com tampão de equilíbrio.

A cromatografia de permuta de ânion operada na forma de fluxo atravessante pode ser afetada por carregamento de proteína, força iônica (condutividade, a qual pode ser con-trolada por diluição da filtragem por inativação de pH inferior), pH e velocidade linear. O car-regamento da proteína pode afetar a seletividade e produção. A força iônica e o pH da a-mostra de carga podem afetar a capacidade de ligação e seletividade. A velocidade linearpode afetar as propriedades do transporte de massa, potencialmente resultando em ligaçãodiminuída dos processos relacionado a impurezas em muitas taxas de fluxo elevado e dis-persão axial em muitas taxas de fluxo baixo. As taxas de pH e a condutividade da nova car-ga têm sido estabelecidas com base em estudos laboratoriais.Estudos laboratoriais indicam que a redução de HCP pela etapa FF de Q SefaroseFF pode ser realçada por alterações para as condições de carregamento. Os parâmetrosinvestigados incluem o pH da carga, a condutividade e as gramas de proteína carregadospor L de resina. O ajustamento da condutividade da carga e o pH para igualar àquele dotampão de equilíbrio da coluna (5 mS/cm, pH 8), e limitando a carga <40 g de adalimumabe/L de resina resultando em purificação melhorada de HCP e procatepsina L. A tabela 9 a-presenta dados da escala laboratorial mostrando a redução em HCP sob o processo A (pH7,7, condutividade de 6,65 mS/cm) e as condições do processo melhorado de pH 8 e condu-tividade de 5 mS/cm do processo B.

Estudos laboratoriais indicam que a redução de HCP pela etapa FF de Q SefaroseFF pode ser realçada por alterações para as condições de carregamento. Os parâmetrosinvestigados incluem o pH da carga, a condutividade e as gramas de proteína carregadospor L de resina. O ajustamento da condutividade da carga e o pH para igualar àquele dotampão de equilíbrio da coluna (5 mS/cm, pH 8), e limitando a carga <40 g de adalimumabe/L de resina resultando em purificação melhorada de HCP e procatepsina L. A tabela 9 a-presenta dados da escala laboratorial mostrando a redução em HCP sob o processo A (pH7,7, condutividade de 6,65 mS/cm) e as condições do processo melhorado de pH 8 e condu-tividade de 5 mS/cm do processo B. Limitando a carga na coluna de Q sefarose para 40 g/Lde resina fornecendo um melhoramento de quatro vezes em purificação de HCP e as modi-ficações adicionais para o pH e a condutividade da carga produzindo ainda um melhoramen-to de três vezes na redução de HCP.

Quantidade HCP por carga Fluxo através Redução dede carga porCondições (ng/ mg de da HCP (ng/ vezes emG de proteína/ de carga adalimumabe) mg de adalimumabe HCPL de resina

80pH de 7,7, 726 4521,6

6,65 mS/cm

40pH de 7,7,

6,65 mS/cm7261146,4

40pH de 8,1,

5,08 mS/cm72637,619,3

O fluxo atravessante reduzido por HCP compreendendo a adalimumabe obtida dacoluna de permuta de íon foi subseqüentemente empregado em cromatografia de interaçãohidrofóbica.

Cromatografia de interação hidrofóbicaO objetivo da coluna de cromatografia HP sefarose de fenila foi para ainda reduziras impurezas relacionadas ao produto e relacionadas ao processo tais como proteínas decélulas hospedeiras e agregados, respectivamente. Uma coluna de 80 cm de diâmetro χ 15cm de comprimento (volume de cama 75 L) foi empregada para esta operação. A coluna foiacondicionado com resina HP de sefarose de fenila (Amersham Pharmacia, Piscataway1 NJ)e assimetria e HETP foram medidos para determinar a qualidade da embalagem. A colunafoi em seguida sanitizada com 1,0 M de NaOH durante 1 hora, e armazenada em 25 mM deFosfato de Na, 20% de isopropanol até que esteja pronta para uso.O equilíbrio da resina foi efetuado com 20 mM de fosfato de sódio, 1,1 M de(NH4)2SO4, pH 7,0 (tampão de equilíbrio). O carregamento da proteína durante esta etapa foide 20 a 40 g de proteína por L de resina, e dois ou três ciclos de cromatografia foram reque-ridos para processar o a quantidade inteira de material viável. A coluna operada em umavelocidade linear de 75 cm/hr. O fluxo atravessante de Q Sefarose foi diluído com um volu-me igual de 40 mM de fosfato de sódio, 2,2 M de (NH4)2SO45 em pH 7,0. Em seguida aocarregamento a coluna foi lavada com 20 mM de fosfato de sódio, 1,1 M de (NH4)2SO4, pH7,0. O produto foi eluído por desempenhar um sal gradiente em etapa para 11 mM de fosfa-to de sódio, 0,625 M de (NH4)2SO4s em pH 7,0. O produto foi coletado como a absorvênciaaumentada acima de 50% de UV da escala total e continuada até a absorvência diminuirpara menos do que 20% de UV da escala total como as caudas máximas.As modificações do processo para as etapas de cromatografia FF de Q Sefarose eFractogel S significativamente reduzida a carga da redução da impureza relacionada ao pro-cesso colocado na etapa HP de Sefarose de fenila. Como uma conseqüência das mudan-ças, a maior função da etapa HP de Sefarose de Fenila foi a remoção de agregados da ada-limumabe.O processo A requerida de tal modo nas cargas da coluna de 35 g de proteína /L deresina ou mais, o produto foi coletado como absorvência de UV aumentada acima de 50%de deflexão da escala total e continua até a absorvência diminuir para < 20% da escala total.Nos carregamentos da coluna abaixo de 35 g de proteína /L de resina, o primeiro volume dacoluna de 0,15 do eluído máximo foi excluído da mistura coletada para melhorar a purifica-ção de HCP nesta etapa. A incorporação das modificações nestas etapas de cromatografiaprévia no processo B alivia a necessidade durante a exclusão máxima na cargas abaixo de35 g de proteína /L de resina uma vez que a carga de HCP de aproximação foi significativa-mente reduzida. A redução na carga de HCP de expansão permitida da faixa da carga semfracionamento. O efeito desta carga permite o processamento do material total de cada fer-mentação pelo processo de recuperação sem o corte máximo de HP de Sefarose de fenila.A faixa do fluxo linear para a operação de Sefarose de foi investigada em escala la-boratorial. A carga de adalimumabe foi mantida constante e as faixas de fluxo de 25 a 125cm/hr foram examinadas. A faixa de fluxo afetará a recuperação do produto mas não temimpacto na qualidade do produto quando avaliado por SEC (% de monômero) e purificaçãode HCP (Tabela 10), justificando a faixa de mais ampla de 25 a 125 cm/hr. As faixas de fluxoalvo para operação de fabricação de Sefarose de fenila permanecem como previamenteestabelecida em 75 cm/hr e 37,5 cm/hr durante a fase de eluição.

Tabela 10: Avaliação da faixa de fluxo de Sefarose de fenila

<table>table see original document page 141</column></row><table>)

a Limite da ação da produção da etapa de Sefarose de Fenila: >48%b Limite da ação de SEC da etapa de Sefarose de Fenila: >98% de monômero

As faixas operacionais aceitável para cromatografia de HP de Sefarose de fenila fo-ram investigadas. A cromatografia de interação hidrofóbica pode ser afetada por carrega-mento de proteína, força iônica (condutividade), e velocidade linear. O carregamento de pro-teína pode afetar a seletividade e a produção. A força iônica da mostra de carga pode afetara capacidade de ligação, a seletividade e resolução. A velocidade linear pode afetar as pro-priedades do transporte de massa, potencialmente resultando em resolução diminuída doprocesso relacionado às impurezas em muitas taxas de fluxo elevado e dispersão axial emmuitas taxas de fluxo baixo. A faixa da taxa de fluxo linear é expandida de 25 para 125cm/hr. As outras faixas operacionais de aceitáveis para a cromatografia de sefarose de feni-la não são alteradas daquelas previamente estabelecidas para o processo de 6.000 L e sãolistados na Tabela 10.

O desempenho comparável das operações de purificação superior em ambos osprocessos foi demonstrado. As mudanças introduzidas como parte do processo B melhora-do incluem: ajustamento do pH e a condutividade da mistura viral inativada, que serve comoa carga FF de Q Sefarose, para combinar o tampão de equilíbrio de Q Sefarose, limitando acarga de Q Sefarose para menos do que 40 g de proteína por litro de resina, e eliminaçãodo requerimento para fracionar o eluído da Sefarose de fenila em cargas de menos do que35 g de proteína por litro de resina. A qualidade de intermediários, como determinado porensaios WCX-10 e SEC, foram comparáveis entre os dois processos.

Os perfis de eluição típicos para as etapas de cromatografia de HP de Sefarose deFenila e FF de Q Sefarose para cada processo são fornecidos nas Figuras 2 e 3, respecti-vamente. O fluxo atravessante de Q Sefarose compreendendo a adalimumabe foi coletado.As quantidades do volume de carga para o processo B foram mais elevadas do que o pro-cesso prévio, devido as cargas maiores na etapa de cromatografia prévia (Fractogel S) evolume de diluição aumentado; em conseqüência o volume do fluxo atravessante total écorrespondentemente maior.

Em resumo, um requerimento para fracionar o eluído de Sefarose de fenila para ascargas de menos do que 35 g de proteína por litro de resina foi eliminados devido aos de-senvolvimentos em purificação de impureza resultando das mudanças nas operações de QSefarose e Fractogel S. Além disso, a faixa da taxa de fluxo linear foi expandida de 25 a 125cm/hr.

Redução por HCP

O processo B incluídas as modificações para as etapas de cromatografia de Q Se-farose e Fractogel S que foram implementadas para melhorar o controle as impurezas rela-cionadas ao processo tal como proteína de célula hospedeira (HCP) e, especificamente,procatepsina L. Um estudo foi responsabilizado por avaliar o impacto do processo B na re-moção daquelas impurezas. A capacidade das colunas de HP de Sefarose de fenila, FF deQ Sefarose e Fractogel S para remover as proteínas de células hospedeiras do CHO foiavaliada em escala de fabricação; Os níveis de proteína de célula hospedeira foram deter-minados pelo Ensaio Imunossorvente Ligado a Enzima da HCP (veja, Exemplo 3) e os da-dos são expressados em ng de HCP/mg de adalimumabe.

As amostras representativas foram consideradas durante o processo B e examina-das por HCP. Os resultados são apresentados na Tabela 11. As mudanças para as etapasde cromatografia representam mais condições cromatográficas rigorosas que seriam espe-radas para melhorar a purificação de HCP purificação. Os resultados da filtragem de delipí-deos relatados são aqueles do processo A. A etapa de filtragem de delipídeos não foi alte-rada no processo B, em conseqüência o fator de redução de obtido nesta etapa é incluídano desempenho global do processo B. Na média, o processo B é capaz de remover mais doque 4,35 Iog10 de HCP. Ambas a cromatografia de Fractogel S e cromatografia FF de Q Se-farose depurada mais do que 1 Iog10 de HCP, e a etapa de filtragem profunda também depu-rada mais em seguida a 1 Iog10. A HCP adicional foi removida pela coluna de Sefarose defenila, entretanto, o valor da purificação não foi calculável porque ambos os níveis de HCPdo eluído e a carga foram abaixo do nível de quantitação. A substância de droga produzidapor processo B exibiu os níveis de HCP abaixo do limite da quantitação (LOQ) para os trêslotes de validação.

Tabela 11: Purificação da proteína de célula hospedeira

<table>table see original document page 142</column></row><table><table>table see original document page 143</column></row><table>

Os melhoramentos globais nos níveis de HCP e procatepsina L são também mos-trados nas Tabelas 12 e 13, respectivamente, onde o processo B mostrou significantes di-minuições em ambos os níveis em comparação ao processo A.

Mapeamento do processo de procatepsina L

As amostras intermediárias do processo foram consideradas nas diversas etapas eanalisadas por fluorescência gerada por ativação de procatepsina L por catepsina L. Os re-sultados são mostrados na Tabela 14 abaixo para as amostras do processo B e processo A.A carga de Fractogel S e carga de Sefarose de fenila e amostras do eluído não pode seravaliado devido a interferência com o método. A etapa de cromatografia FF de Q Sefarosetem a capacidade de remover mais do que 90% da enzima detectável na carga. O fluxo a-travessante de Q Sefarose e a lavagem (FTW) do processo melhorado contem aproxima-damente 50% menos procatepsina L ativável do que a WTF de Q Sepharose do processoprévio de 6.000. As reduções também ocorrem entre as etapas de Fractogel S e a Q Sefa-rose durante as quais a filtragem de delipídeos, concentração por ultrafiltragem, baixa inati-vação viral por pH e operações de filtragem profunda são desempenhadas.

Tabela 14: Mapeamento de procatepsina L do processo A e processo B

<table>table see original document page 144</column></row><table>a O fator de redução é calculado empregando dados pré-arredondados para cadalote e a média das três execuções é relatada.

A comparação da redução de procatepsina L nos processos A e B é exibida na Fi-gura 4. O processo B exibe níveis de procatepsina L inferior ao do processo A em cada eta-pa intermediária, indicando que as modificações para as etapas de cromatografia de Q Sefa-rose e Fractogel S melhoram o processo de desempenho com respeito à remoção destaimpureza.

Mapeamento do processo de HCP

As amostras intermediárias do processo foram coletadas de ambos os processos Ae B, e analisadas por conteúdo de HCP. Este estudo foi desempenhado a fim de diretamen-te comparar os dois processos para a redução da HCP. Os resultados da análise de HCPsão mostrados na Tabela 15. A remoção significante de HCP ocorre nas etapas Q Sefarosee Fractogel S em ambos os processos, mas o processo B exibe purificação de HCP melho-rada através de ambas de três etapas. A etapa Fractogel S melhorada, a qual inclui a se-gunda etapa de lavagem antes do produto de eluição, tem um fator de redução de 96 (1,96log10) considerando a mesma etapa no processo prévio produzindo um fator de redução de48 (1,67 log]0). Ambos os processos exibem um fator de redução de 50 efetuado pela filtra-gem de delipídeos, desempenhados entre as etapas de cromatografia de Fractogel SeQSepharose. A operação de Q Sefarose no processo B é desempenhada com a carga ajusta-da para o pH e a condutividade do tampão de equilíbrio da coluna. O fator de redução deHCP obtido pela etapa de Q Sefarose melhorada é quatro vezes maior do que aquele de-monstrado pelo processo prévio (21 vs. 5). A redução ainda ocorre através da etapa de Se-farose de Fenila tal que o nível de HCP é abaixo do nível da quantificação na mistura UF/DF do processo melhorado e substância de droga, as amostras de substância de droga pré-via exibem níveis muito baixo, mas mensuráveis de HCP.

Tabela 15: Mapeamento de proteína de célula hospedeira dos processos AeBAmostra Lotes do processo B (ng HCP/mg adalimumabe)

<table>table see original document page 145</column></row><table><table>table see original document page 146</column></row><table>

aTodas as amostras de lote melhorado para esta etapa foram abaixo de 5 ng/ mgde limite de quantitação. O valor A de 5 ng/ mg foi empregado para estimular o fator de re-dução.A comparação da redução de HCP no processo B versus o processo A, plotado emuma escala logio, é exibida na Figura 5. O processo B exibe níveis de HCP inferiores aos doprocesso A em cada etapa intermediária, incluindo uma diferença de 10 vezes seguinte aetapa de Q Sefarose, indicando que as modificações para as etapas de cromatografia de QSefarose e Fractogel melhoram o desempenho do processo com relação a remoção dasHCPs.

Impacto da captura e das operações de purificação superior na capacidade do pro-cedimento

Duas mudanças foram introduzidas para aumentar a capacidade do procedimentoda captura e das operações de purificação superior no processo Β. A primeira foi o aumentono limite da carga permitida na coluna de Fractogel S de 30 g de proteína /L de resina para35 g de proteína /L de resina em pH 7 e de 30 g de proteína /L de resina para 70 g de prote-ína /L de resina em pH 5. Todas estas mudanças permitidas do material de colheita filtradado bioreator para ser carregado na coluna de Fractogel S. A carga média na coluna de Frac-togel S foi de aproximadamente 9% mais alto no processo melhorado (em pH 7) do que acarga no processo prévio (Tabela 16).

A segunda mudança foi a remoção do requerimento para fracionar o produto máxi-mo de Sefarose de Fenila com cargas menores do que 35 g de proteína /L de resina. O fra-cionamento resultado em descartar uma porção significante do produto máximo a fim deadequadamente controlar as proteínas de células hospedeiras. As mudanças executadasnas etapas de Q Sefarose e Fractogel S para controlar os níveis de procatepsina L e as pro-teínas de células hospedeiras fazendo o fracionamento da Sefarose de fenila máxima nãonecessária. Esta mudança permitida executando os três ciclos da Coluna de sefarose defenila em uma faixa de carga inferior para o processo B resultando em um aumento de 12%na carga total na coluna de sefarose de fenila comparada com o processo A.

A Tabela 16 compara as cargas nas colunas de Sefarose de Fenila e Fractogel Sbem como as quantidades de substâncias de droga finais dos processos melhorados e pré-vios. O processo melhorado exibe um aumento global de aproximado de 8% na produção deadalimumabe para as três fornadas de validação.

Tabela 16: Comparação das cargas de coluna de Sefarose de Fenila e Fractogel Se substâncias de droga produzidas nos processo AeB

<table>table see original document page 147</column></row><table><table>table see original document page 148</column></row><table>

aA carga e a produção são expressadas em gramas de proteína.

O método melhorado de purificação de purificação melhorada de adalimumabe doanticorpo de HCP e procatepsina L (em relação ao processo A), resultando em níveis redu-zidos na substância da droga. Mais especificamente, em uma comparação de dados de libe-ração de lote de substância de droga, os seguintes níveis de HCP e procatepsina L foramdeterminados, como descritos na Tabela 17.

Tabela 17: Comparação de HCP e procatepsina L nos processos A e B

<table>table see original document page 148</column></row><table>

a Especificação procatepsina L não se aplica ao processo A.l; valores fornecidosapenas para informação.

b de 14 a 17 lotes abaixo do limite de LOQ de 5 πg/mg; um valor de 5 ng/mg em-pregado para calcular um desvio médio e padrão.

c LOQ abrangendo de 3,30 a 3,85.

d LOQ abrangendo de 3,29 a 3,61.

e LOQ foi de 3,3 (LOQ = Limite de quantificação)

A caracterização estendida da substância de droga produzida empregando o pro-cesso B foi desempenhada. A substância de droga dos três lotes de validação foi analisadae comparada com uma referência de adalimumabe padrão, empregando os ensaios incluin-do análise de aminoácido, dicroísmo circular, centrifugação analítica, espectrometria demassa LC QSTAR, mapeamento de peptídeo LYS C e tríptico não reduzido com MS detec-ção, ensaio sem sulfidrila, mapeamento de peptídeo tríptico MS detecção, imunomancha-mento, bioensaio L929, e BIAcore. Todas as fornadas de substância de droga fabricada peloprocesso melhorado alcançam os critérios de aceitação e são comparáveis à referência pa-drão.Em resumo, o desempenho do processo tem sido demonstrado ser comparável aoprocesso A nos estágios de purificação superior, fermentação e captura. O processo B1 en-tretanto, exibe capacidade melhorada com relação a redução de proteína de célula hospe-deira e procatepsina L1 assim como um aumento na capacidade com relação a produção deadalimumabe. A liberação de substância de droga testada e estudos de caracterização es-tendidos ainda demonstram a comparabilidade da substância de droga de adalimumabeproduzida por processo B com aquela produzida por processo A.

Tabela 12: Melhoramento total dos níveis de HCP.

<table>table see original document page 149</column></row><table>

Redução Q de HCP (dobro) 6,51 5,69 9,22 12,30 21,15 7,20

* o lote foi operado com filtro de delipídeo no processo<table>table see original document page 150</column></row><table>Tabela 13

<table>table see original document page 151</column></row><table><table>table see original document page 152</column></row><table>Exemplo 3: Ensaio para detecção de HCP

O exemplo seguinte descreve um método de Ensaio Imunossorvente Ligado a En-zima da HCP para a determinação da concentração de Proteína de Célula Hospedeira(HCP) residual em amostras de substância de droga de adalimumabe obtida do processo B,descrita no Exemplo 2. O Ensaio Imunossorvente Ligado a Enzima (ELIZA) foi empregadopara imprensar a amostra compreendendo o antígeno de HCO entre duas camadas de anti-corpos específicos. Isto foi seguido pelo bloqueador de sítios não específicos com Caseína.A amostra foi em seguida incubada durante qualquer tempo as moléculas de antígeno foramcapturadas pelo primeiro anticorpo (anti-CHO de cabra Cisne de anticorpo de revestimento(Ovário de hamster chinês), purificado por afinidade). Um segundo anticorpo (proteína decélula hospedeira anti-CHO biotinilada) foi em seguida adicionado, a qualquer fixado ao an-tígeno (proteínas de células hospedeiras de CHO). Importantemente, o segundo anticorpoespecífico para as HCPs foi produzido das células empregadas para gerar o anticorpo. Neu-travidina de HRP conjugada foi adicionada, a qual se liga à proteína de célula hospedeiraanti-CHO biotinilada. Isto foi seguido pela adição de substrato azul Κ. O substrato cromogê-nico foi hidrolisado pela enzima ligada ao anticorpo conjugado, produzindo uma cor azul. Areação ficou parada com 2 M de H3PO4, mudando a cor para amarelo. A intensidade da corfoi diretamente proporcional à quantidade de antígeno ligado ao poço. O Ensaio Imunossor-vente Ligado a Enzima da HCP mostrou melhoramento para determinar os níveis HCP emuma preparação de anticorpo do que dos métodos do Ensaio Imunossorvente Ligado a En-zima padrão.

Exemplo 4: Ensaio cinético de catepsina L

Um ensaio cinético foi desenvolvido e empregado para qualificar a atividade de ca-tepsina L para intermediar o processo de fabricação de adalimumabe do processo B (vejaExemplo 2). O ensaio HPLC por permuta de ânion fraco (WAX-10 HPLC) empregado paramedir a HCP para teste liberação de substância de droga não poderia ser empregado paraeste estudo uma vez que o conteúdo da proteína variável e composição do tampão das a-mostras em processo podem interferir com o método. A inabilidade para diretamente quanti-ficar a procatepsina L no processo intermediária a indução para o desenvolvimento de umensaio que medi a atividade de catepsina L por um método fluorescente cinético. O ensaiocinético, isto é, um método enzimático fluorescente de alta produtividade, tem menos interfe-rência para as amostras em processo do que os métodos padrão empregados para detectaros níveis de procatepsina L. O ensaio cinético também fornece um meio para investigar aconfiabilidade do processo para purificação as amostras em processo de adalimumabe des-crito nos Exemplos 1 e 2.

Este método força a ativação da procatepsina L nas amostras para a catepsina Lpor adição de sulfato de dextrana. Um substrato de peptídeo fluorogênico, Z-Ieucina-arginina-AMC (cumarina de 7-amino-4-metil), foi empregado para detectar a atividade decatepsina L em excitação de 380 nm e emissão de 460 nm. O nível de atividade de fluores-cência nas amostras foi determinado pelo declive do sinal fluorogênico gerado pela clivagemdo substrato por segundo. A faixa deste ensaio de atividade fluorescente foi determinada serentre 0,0144 a 1,04 RFU/sec. Esta atividade foi correlacionada à quantidade de adalimuma-be presente na amostra de teste; em conseqüência, os resultados são relatados como ada-Iimumabe RFU/sec/mg. As condições de ativação ideais para cada amostra intermediária doprocesso empregam software JMP derivado de experimentos DOE. As condições de ativa-ção recomendada para este ensaio são resumidas na Tabela 16.

Materiais e métodos

Preparação de 500 mM de solução de matéria-prima DTT

7.7 gramas de Ultrapure DTT (Invitrogen) foram adicionadas em 90 mL de água Mi-Ii-Q e misturado até homogeneizar. A solução foi coroar a solução com água Mili-Q para umvolume final de 100 mL. Este 500 mM de matéria-prima de foi em seguida aliquotado e ar-mazenado a-80°C.

Preparação do tampão de ativação (25 mM de NaOAc, 5 mM de EDTA de pH 5,5)

3.44 gramas de acetato de sódio (J.T. Baker), 0,38 gramas de EDTA (J.T. Baker) e950 mL de água Mili-Q foram adicionados a um recipiente adequado e misturados até ho-mogeneizar completamente. O pH do tampão foi ajustado para 5,5 com 1 M de HCI, e con-duzido até o volume final de 1 L em um frasco volumétrico. O tampão foi filtrado através deum filtro de 0,22 μνη e armazenado a 4°C antes do uso. 500 //L de solução de matéria-primade DTT (500 mM descrito acima) foram adicionados a 50 mL de tampão para uma concen-tração final de 5 mM no dia de uso.

Preparação de sulfato de dextrana + 0,1 % de solução de matéria-prima de azida desódio

1 grama de sulfato de dextrana (EM Science) foi adicionado em 90 mL de água Mili-Q e misturados até homogeneizar. 100 /yL de azida de sódio foram adicionados de uma so-lução de matéria-prima (J.T. Baker). A solução foi coroada até um volume final de 100 mL.Esta solução foi em seguida aliquotada e armazenada a — 80°C.

Estrutura de ensaio cinético

As amostras para serem testadas, para a atividade de catepsina L, requerem a ati-vação da proenzima (procatepsina L) para enzima ativa (catepsina L). Isto foi efetuado pordiluir as amostras no tampão de ativação, adicionando sulfato de dextrana e incubada a37°C durante um tempo adequado (detalhes discutidos abaixo). Após a ativação, as amos-tras podem ser armazenadas a — 80°C e permanecerem estáveis. As ótimas condições deativação determinadas para as amostras em processo são mostradas na Tabela 18.

Tabela 18: Sumário das condições de ativação refinada para as amostras em pro-cesso

<table>table see original document page 155</column></row><table>

No dia do teste, uma alíquota as amostras de teste foram removidas de — 80°C edescongelada em um banho de gelo. Uma vez que a amostra de teste tem descongelado,(2x) 100 μL de cada amostra foi carregada em uma placa de micro-título de poliestireno ne-gro (Corning cat# 3650). Uma alíquota de Substrato Vll de Peptídeo Fluorogênico Z-L-R-AMC (R&D Systems) foi descongelada ao mesmo tempo em que protegida da luz. O subs-trato foi diluído de 1:1350 com o tampão de acetato para uma concentração final de 20 μΜ.100 μL do substrato fluorogênico foi adicionado a cada poço. A placa foi em seguida mistu-rada durante ~1 segundo e incubada a 37°C durante 3 minutos, ao mesmo tempo em queprotegida da luz. A placa foi em seguida colocada na leitora de placa fluorescente que foifixada a 37°C. O comprimento de onda de excitação foi fixado a 380 nm e a emissão foi fi-xada a 460 nm. A fluorescência de cada poço foi medida a cada 3 minutos durante 30 minu-tos e a taxa de hidrólise de substrato foi calculada. Os resultados, os quais tomam em con-sideração o fator de diluição, foram em seguida divididos pela concentração de adalimuma-be para comparação. Os resultados empregando este ensaio cinético são descritos acimano Exemplo 2.

A concentração de adalimumabe foi determinada por A28O empregando um coefici-ente de extinção de 1,39. A quantificação de adalimumabe foi desempenhada em amostrasde estudo empregando análise de Poros A. As diluições de amostra foram aplicadas paraobter leituras na curva padrão. Um sistema Shimadzu HPLC foi configurado com cartuchosensor de Imunodetecção de Poros A (aplicado por Biosystems, Foster City, CA). A colunafoi mantida em temperatura ambiente. O sistema foi executado em 2 mL/mínuto. A tempera-tura da bandeja auto classificadora foi em 4°C. A absorvência foi monitorada em 280 nm. Otampão A foi IX PBS; o tampão B foi de 0,1 M de ácido acético e 150 mM de cloreto de só-dio. A amostra foi injetada e a Adalimumabe foi eluída empregando 100% do tampão B.

A reviravolta do peptídeo fluorogênico empregando a carga Fractogel (veja primeiroeluído no Exemplo 2; processo B) do material obtido da expressão da célula CHO de adali-mumabe é mostrada ria Figura 6. A amostra foi diluída a 200, 50 e 20//g/mL de adalimuma-be com tampão de ativação empregando 0,5 yug/mL de sulfato de dextrana, e incubada a37°C durante 16 hours. Este lote em 50 e 20 /vg/mL mostrou respostas lineares. Os valoresde R2 são 99. Entretanto, o lote em 200//g/mL mostrou reviravolta de substrato não linear para a extremidade do tempo de medição de 30 minutos, resultando em um valor de R2 infe-rior de 0,91. Em conseqüência, cuidadosa diluição de amostra é crítica para manter a taxade hidrólise linear.

Os ensaios foram também desempenhados para confirmar que o ensaio cinéticoempregando a atividade de catepsina para determinar o nível de procatepsina foi submisso com diretrizes ICH, incluindo análise de precisão, incluindo precisão de repetabilidade. Alémdisso, foi determinado que o tipo de recipiente, por exemplo, fracos de polipropileno e vidroinfluenciam da atividade de catepsina L. Os resultados sugerem que elevados níveis de ca-tepsina L são obtidos quando incubados em um recipiente de polipropileno em oposição auma recipiente de vidro. Em ambos os casos, a adição de 0,5 yug/mL de sulfato de dextrana foi requerida para a ativação de procatepsina L em pH 5,5.

Em resumo, a precisão do ensaio cinético demonstra que este ensaio é válido paradetecção do potencial de atividade de catepsina L dos processos intermediários de adali-mumabe.

Este pedido é relacionado à Patente dos Estados Unidos Nos. 6.090.382, 6.258.562, e 6.509.015. Este pedido é também relacionado ao Pedido de Patente dos Esta-dos Unidos No. De Série 09/801.185, depositado em 7 de março de 2001; Pedido de Paten-te dos Estados Unidos No. de Série 10/302.356, depositado em 22 de novembro de 2002;Pedido de Patente dos Estados Unidos No. de Série 10/163657, depositado em 5 de junhode 2002; e Pedido de Patente dos Estados Unidos No. de Série 10/133715, depositado em26 de abril de 2002; Pedido de Patente dos Estados Unidos No. de Série 10/222140, deposi-tado em 16 de agosto de 2002; Pedido de Patente dos Estados Unidos No. de Série10/693233, depositado em 24 de outubro de 2003; Pedido de Patente dos Estados UnidosNo. de Série 10/622932, depositado em 18 de julho de 2003; Pedido de Patente dos Esta-dos Unidos No. de Série 10/623039, depositado em 18 de julho de 2003; Pedido de Patente dos Estados Unidos No. de Série 10/623076, depositado em 18 de julho de 2003; Pedido dePatente dos Estados Unidos No. de Série 10/623065, depositado em 18 de julho de 2003;Pedido de Patente dos Estados Unidos No. de Série 10/622928, depositado em 18 de julhode 2003; Pedido de Patente dos Estados Unidos No. de Série 10/623075, depositado em 18de julho de 2003; Pedido de Patente dos Estados Unidos No. de Série 10/623035, deposita- do em 18 de julho de 2003; Pedido de Patente dos Estados Unidos No. de Série 10/622683,depositado em 18 de julho de 2003; Pedido de Patente dos Estados Unidos No. de Série10/622205, depositado em 18 de julho de 2003; Pedido de Patente dos Estados Unidos No.de Série 10/622210, depositado em 18 de julho de 2003; e Pedido de Patente dos EstadosUnidos No. de Série 10/623318, depositado em 18 de julho de 2003. Este pedido é tambémrelacionado à PCT/US05/ 12007, depositado em 11 de abril de 2005. Os conteúdos inteirosde cada uma destas patentes e pedidos de patentes são incorporados aqui por referência.

Equivalentes

Aqueles versados na técnica reconhecerão, ou serão hábeis para verificar empre-gando não mais do que experimentação de rotina, muitos equivalentes pata as modalidadesespecíficas da invenção descrita aqui. Tais equivalentes são entendidos serem abrangidospelas seguintes reivindicações. Os conteúdos de todas as referências, patentes e pedidosde patentes publicados citados por todo este pedido são incorporados aqui por referência.Listagem de Seqüência

<110> Abbott Biotechnology Ltd.<120> Purificação de Anticorpo<130> BBI-240CPPC

<140> Concorrentementeemanexo<141> Concorrentementeemanexo

<150> 60/789725<151> 5-4-2006

<150> 60/790414<151> 6-4-2006

<160> 37

<170> SEQ rápida paia versão Windows 4.0

<210> 1<211> 107<212> PRT<213> Seqüência Artificial

<220><223> Região variável de cadeia leve de adalimumabe

<400> 1Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser vai Gly1 5 10 15Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Arg Asn Tyr20 25 30Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile35 40 45Tyr Ala Ala ser Thr Leu Gln Ser Gly vai Pro ser Arg Phe Ser Gly50 55 60ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro65 70 75 80Glu Asp Val Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Arg Tyr Asn Arg Ala Pro Tyr85 90 95Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys vai Glu Ile Lys100 105

<210> 2<211> 121<212> PRT

<213> Seqüência Artificial

<220><223> Região variavel de cadeia pesada de adalimumabe

<400> 2Glu vai Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg1 5 10 15Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr20 25 30Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val35 40 45Ser Ala Ile Thr Trp Asn ser Gly His lie Asp Tyr Ala Asp Ser vai50 55 60Glu Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr65 70 75 80Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys85 90 95Ala Lys Val Ser Tyr Leu Ser Thr Ala Ser ser Leu Asp Tyr Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser115 120

<210> 3

<211> 9

<212> PRT

<213> Seqüência Artificial

<220>

<223> Região variável de cadeia leve de adalimumabe CDR3

<221> Variante<222> 9

<223> Xaa = Thr ou Ala<400> 3

Gln Arg Tyr Asn Arg Ala Pro Tyr xaa1 5

<210> 4

<211> 12

<212> PRT

<213> Seqüência Artificial

<220>

<2 2 3> Região variável de cadeia pesada de adalimumabe cdr3

<221> Variante<222> 12

<223> Xaa = Tyr ou Asn<400> 4

Val Ser Tyr Leu Ser Thr Ala ser ser Leu Asp xaa1 5 10

<210> 5

<211> 7

<212> PRT

<213> Seqüência Artificial

<220>

<2 2 3> Região variável de cadeia leve de adalimumabe cdr2

<400> 5

Ala Ala Ser Thr Leu Gln Ser1 5

<210> 6<211> 17<212> PRT

<213> Seqüência Artificial

<220>

<223> Região variável de cadeia pesada de adalimumabe cdr2<400> 6

Ala lie Thr Trp Asn Ser Gly His Ile Asp Tyr Ala Asp Ser Val Glu

1 5 10 15

Gly

<210> 7<211> 11<212> prt

<213> Seqüência Artificial

<220>

<22 3> Região variável de cadeia leve de adalimumabe cdri<400> 7

Arg Ala Ser Gln Gly Ile Arg Asn Tyr Leu Ala15 10

<210> 8<211> 5<212> prt

<213> Seqüência Artificial

<220>

<223> Região variável de cadeia pesada de adalimumabe cdri

<400> 8

Asp Tyr Ala Met His1 5

<210> 9

<211> 107

<212> prt

<213> Seqüência Artificial

<220>

<223> Região variável de cadeia leve 2SD4

<400> 9

Asp lle Gln Met Thr Gln Ser Pro ser Ser Leu Ser Ala ser lle Gly1 5 10 15Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Gly Ile Arg Asn Tyr20 25 30 Leu Ála Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile35 40 45 Tyr Ala Ala ser Thr Leu Gln ser Gly vai Pro Ser Arg Phe Ser Gly50 55 60 Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr He Ser Ser Leu Gln Pró65 70 75 80Glu Asp vai Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Lys Tyr Asn Ser Ala Pro Tyr85 90 95Ala Phe Gly Gln Gly Thr Lys vai Glu Ile Lys 100 105

<210> 10<211> 121<212> PRT

<213> Seqüência Artificial

<220>

<223> Região variável de cadeia pesada 2SD4

<400> 10

Gln Val Gln Leu vai Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Arg

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Asp Asp Tyr

20 25 30

Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Asp Trp vai

35 40 45

Ser Ala Ile Thr Trp Asn ser Gly His Ile Asp Tyr Ala Asp Ser vai

50 55 60

Glu Gly Arg Phe Ala Val Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ala Leu Tyr65 70 75 80Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Pro Glu AspThr Ala vai Tyr Tyr Cys

85 90 95

Thr Lys Ala Ser Tyr Leu Ser Thr Ser Ser Ser Leu Asp Asn Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 11<211> 9<212> PRT

<213> Seqüência Artificial

<220>

<223> Região variável de cadeia leve CDR3 2SD4

<400> 11

Gln Lys Tyr Asn Ser Ala Pro Tyr Ala1 5

<210> 12<211> 9<212> PRT

<213> Seqüência Artificial

<223> Região variável de cadeia leve CDR3 EP B12

<400> 12

Gln Lys Tyr Asn Arg Ala Pro Tyr Ala1 5

<210> 13<211> 9<212> PRT

<213> Seqüência Artificial

<220>

<223> Região variável de cadeia leve CDR3 VL10E4

<400> 13

Gln Lys Tyr Gln Arg Ala Pro Tyr Thr

1 5

<210> 14<211> 9<212> PRT

<213> Seqüência Artificial

<223> Região variável de cadeia leve CDR3 VL100A9

<400> 14

Gln Lys Tyr Ser Ser Ala Pro Tyr Thr1 5

<210> 15<211> 9<212> PRT

<213> Seqüência Artificial

<220>

<223> Região variável de cadeia leve CDR3 VLL100D2<400> 15

Gln Lys Tyr Asn Ser Ala Pro Tyr Thr1 5

<210> 16<211> 9<212> PRT<213> Seqüência Artificial

<220><223> Região variável de cadeia leve CRD3 VLL0F4

<400> 16Gln Lys Tyr Asn Arg Ala Pro Tyr Thr1 5

<210> 17<211> 9<212> PRT<213> Seqüência Artificial

<220><223> Região variável de cadeia leve CDR3 LOES

<400> 17Gln Lys Tyr Asn Ser Ala Pro Tyr Tyr1 5

<210> 18<211> 9<212> PRT<213> Seqüência Artificial

<220><223> Região variável de cadeia leve CDR3 VLL0G7

<400> 18Gln Lys Tyr Asn Ser Ala Pro Tyr Asn1 5

<210> 19<211> 9<212> PRT<213> Seqüência Artificial

<220><223> Região variável de cadeia leve CDR3 VLL0G9

<400> 19Gln Lys Tyr Thr Ser Ala Pro Tyr Thr1 5

<210> 20<211> 9<212> PRT<213> Seqüência Artificial

<220><223> Região variável de cadeia leve CDR3 VLL0H1

<400> 20Gln Lys Tyr Asn Arg Ala Pro Tyr Asn1 5

<210> 21<211> 9<212> PRT

<213> Seqüência Artificial

<220>

<223> Região variável de cadeia leve CDR3 VLLOHIO

<400> 21

Gln Lys Tyr Asn Ser Ala Ala Tyr Ser1 5

<210> 22<211> 9<212> PRT

<213> Seqüência Artificial

<220>

<223> Região variável de cadeia leve CDR3 VL1B7

<400> 22

Gln Gln Tyr Asn Ser Ala Pro Asp Thr1 5

<210> 23<211> 9<212> PRT

<213> Seqüência Artificial

<220>

<223> Região variável de cadeia leve CDR3 VL1C1

<400> 23

Gln Lys Tyr Asn Ser Asp Pro Tyr Thr1 5

<210> 24<211> 9<212> PRT

<213> Seqüência Artificial

<220>

<2 2 3> Região variável de cadeia leve CDR3 VL0.1 F4

<400> 24

Gln Lys Tyr Ile Ser Ala Pro Tyr Thr1 5

<210> 25<211> 9<212> PRT

<213> Seqüência Artificial

<220>

<223> Região variável de cadeia leve CDR3 VL0.1H8

<400> 25

Gln Lys Tyr Asn Arg Pro Pro Tyr Thr15<210> 26<211> 9<212> PRT

<213> Seqüência Artificial

<220>

<223> Região variável de cadeia leve CDR3 LOE7.A

<400> 26

Gln Arg Tyr Asn Arg Ala Pro Tyr Ala1 5

<210> 27<211> 12<212> PRT

<213> Seqüência Artificial

<220>

<223> Região variável de cadeia pesada CDR3 2SD4

<400> 27

Ala Ser Tyr Leu Ser Thr Ser Ser Ser Leu Asp Asn1 5 10

<210> 28<211> 12<212> PRT

<213> Seqüência Artificial

<220>

<2 2 3> Região variável de cadeia pesada CDR3 VH1B11

<400> 28

Ala Ser Tyr Leu Ser Thr Ser Ser Ser Leu Asp Lys1 5 10

<210> 29<211> 12<212> PRT

<213> Seqüência Artificial

<220>

<223> Região variável de cadeia pesada CDR3 VH1D8

<400> 29

Ala Ser Tyr Leu Ser Thr ser Ser Ser Leu Asp Tyr1 5 10

<210> 30

<211> 12

<212> PRT

<213> Seqüência Artificial

<220>

<223> Região variável de cadeia pesada CDR3 VH1A11

<400> 30

Ala Ser Tyr Léu Ser Thr ser Ser Ser Leu Asp Asp1 5 10

<210> 31δ

<211> 12

<212> PRT

<213> Seqüência Artificial

<220>

<223> Região variável de cadeia pesada CDR3 VH1B12

<400> 31

Ala Ser Tyr Leu Ser Thr Ser Phe Ser Leu Asp Tyr1 5 10

<210> 32<211> 12<212> PRT

<213> Seqüência Artificial

<220>

<223> Região variável de cadeia pesada CDR3 VH1E4

<400> 32

Ala Ser Tyr Leu Ser Thr Ser Ser Ser Leu His Tyr1 5 10

<210> 33

<211> 12

<212> PRT

<213> Seqüência Artificial

<220>

<223> Região variável de cadeia pesada CDR3 VH1F6

<400> 33

Ala Ser Phe Leu Ser Thr Ser Ser Ser Leu Glu Tyr1 5 10

<210> 34<211> 12<212> PRT

<213> Seqüência Artificial

<220>

<223> Região variável de cadeia pesada CDR3 3C-H2

<400> 34

Ala Ser Tyr Leu Ser Thr Ala Ser Ser Leu Glu Tyr1 5 10

<210> 35<211> 12<212> PRT

<213> Seqüência Artificial

<220>

<223> Região variável de cadeia pesada CDR3 VH1 -D2.N

<400> 35

Val Ser Tyr Leu Ser Thr Ala Ser Ser Leu Asp Asn1 5 10

<210> 36<211> 321<212> DNA<213> Seqüência Artificial

<220>

<223> Região variável de cadeia leve de adalimimabe

<400> 36

gacatccaga tgacccagtc tccatcctcc ctgtctgcat ctgtagggga cagagtcacc 60atcacttgtc gggcaagtca gggcatcaga aattacttag cctggtatca gcaaaaacca 120gggaaagccc ctaagctcct gatctatgct gcatccactt tgcaatcagg ggtcccatct 180cggttcagtg gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag cctacagcct 240gaagatgttg caacttatta ctgtcaaagg tataaccgtg caccgtatac ttttggccag 300gggaccaagg tggaaatcaa a 321

<210> 37

<211> 363

<212> DNA

<213> Seqüência Artificial

<223> Região variável de cadeia pesada de adalimimabe

<400> 37

gaggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttggtacagc ccggcaggtc cctgagactc 60

tcctgtgcgg cctctggatt cacctttgat gattatgcca tgcactgggt ccggcaagct 120

ccagggaagg gcctggaatg ggtctcagct atcacttgga atagtggtca catagactat 180

gcggactctg tggagggccg attcaccatc tccagagaca acgccaagaa ctccctgtat 240

ctgeaaatga acagtctgag agctgaggat acggccgtat attactgtgc gaaagtctcg 300

taccttagca ccgcgtcctc ccttgactat tggggccaag gtaccctggt caccgtctcg 360

agt 363

Claims

1. Método para produzir uma preparação de anticorpo de proteína de célula hospe-deira (HCP) reduzido de uma mistura compreendendo um anticorpo e pelo menos umaHCP1 o método, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende:(a) aplicar a mistura a uma primeira resina de permuta de íon em um tampão deequilíbrio onde mais do que 30 gramas de anticorpo por litro de resina são aplicadas;(b) lavar a HCP da resina com uma pluralidade de etapas de lavagem; e(c) eluir o anticorpo da resina com um tampão de eluição para formar um primeiroeluído,tal que a preparação do anticorpo de HCP reduzido é obtida.

2. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de quecerca de 35-70 gramas de anticorpo por litro de resina são aplicados.

3. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de quecerca de 70 gramas de anticorpo por litro de resina são aplicados.

4. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que amistura compreendendo um anticorpo e pelo menos uma HCP não é submetida a capturada proteína A antes de aplicar a mistura à primeira resina de permuta de íon.

5. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de que apluralidade das etapas de lavagem compreendem pelo menos uma primeira lavagem e umasegunda lavagem, onde há um aumento na condutividade da primeira lavagem para a se-gunda lavagem.

6. Método, de acordo com a reivindicação 5, CARACTERIZADO pelo fato de que aprimeira lavagem é com tampão de equilíbrio e a segunda lavagem é com uma mistura detampão de eluição e água.

7. Método, de acordo com a reivindicação 6, CARACTERIZADO pelo fato que amistura de tampão de eluição e água compreende cerca de 40-50% de tampão de eluição ecerca de 50-60% de água.

8. Método, de acordo com a reivindicação 7, CARACTERIZADO pelo fato de que amistura de tampão de eluição e água compreende cerca de 45% de tampão de eluição e cerca de 55% de água.

9. Método, de acordo com a reivindicação 8, CARACTERIZADO pelo fato que otampão de eluição compreende 20 mM de fosfato de sódio e 150 mM de cloreto de sódio.

10. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de queé realizado em pH 7.

11. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de queé realizado em um pH entre cerca de pH 5 e cerca de pH 7.

12. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de queé realizado em pH 5.

13. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de quea primeira resina de permuta de íon é uma resina de permuta de cátion.

14. Método, de acordo com a reivindicação 13, CARACTERIZADO pelo fato de que a resina de permuta de cátion é formada em uma coluna e a mistura compreendendo o anti-corpo e pelo menos uma HCP é aplicada à coluna.

15. Método, de acordo com a reivindicação 14, CARACTERIZADO pelo fato de quea resina de permuta de cátion compreende um metacrilato sintético com base em resinapolimérica ligada a um grupo sulfonato.

16. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de quetambém compreende submeter o primeiro eluído à uma etapa de inativação viral.

17. Método, de acordo com a reivindicação 16, CARACTERIZADO pelo fato de quea inativação viral é obtida por inativação viral de pH para formar uma preparação viralmenteinativada.

18. Método, de acordo com a reivindicação 17, CARACTERIZADO pelo fato de quea preparação viralmente inativada é aplicada a uma segunda resina de permuta de íon, on-de, antes de aplicar a preparação viralmente inativada à segunda resina de permuta de íon,pH e condutividade da preparação viralmente inativa é ajustada para ser substancialmentesimilar a pH e condutividade da segunda resina de permuta de íon.

19. Método, de acordo com a reivindicação 18, CARACTERIZADO pelo fato de queo pH da segunda resina de permuta de íon está em uma faixa de cerca de pH 7,7 a cerca depH 8,3 e o pH da preparação viralmente inativada é ajustado para estar em uma faixa decerca de pH 7,7 a cerca de pH 8,3.

20. Método, de acordo com a reivindicação 19, CARACTERIZADO pelo fato de queo pH da segunda resina de permuta de íon é de cerca de pH 8,0 e o pH da preparação vi-ralmente inativada é ajustado para ser de cerca de pH 8,0.

21. Método, de acordo com a reivindicação 18, CARACTERIZADO pelo fato de quea condutividade da segunda resina de permuta de íon está em uma faixa de cerca de 3,5mS/cm a cerca de 5,2 mS/cm e a condutividade da preparação viralmente inativada é ajus-tada para estar em uma faixa de cerca de 3,5 mS/cm a cerca de 5,2 mS/cm.

22. Método, de acordo com a reivindicação 21, CARACTERIZADO pelo fato de quea condutividade da segunda resina de permuta de íon é de cerca de 5,0 mS/cm e a conduti-vidade da preparação viralmente inativada é ajustada para ser de cerca de 5,0 mS/cm.

23. Método, de acordo com a reivindicação 18, CARACTERIZADO pelo fato de quea segunda resina de permuta de íon é uma resina de permuta de ânion.

24. Método, de acordo com a reivindicação 23, CARACTERIZADO pelo fato de quea resina de permuta de ânion é uma resina Q sefarose.

25. Método, de acordo com a reivindicação 18, CARACTERIZADO pelo fato de quea segunda resina de permuta de íon é formada em uma coluna e a preparação viralmenteinativada é aplicada à coluna tal que um primeiro fluxo atravessante é obtido.

26. Método, de acordo com a reivindicação 25, CARACTERIZADO pelo fato de queo primeiro fluxo atravessante é aplicado em uma coluna de interação hidrofóbica tal que umsegundo eluído é obtido.

27. Método, de acordo com a reivindicação 26, CARACTERIZADO pelo fato de quea coluna de interação hidrofóbica é uma coluna de sefarose de fenila.

28. Método, de acordo com a reivindicação 26, CARACTERIZADO pelo fato de queo primeiro fluxo atravessante aplicado à coluna de interação hidrofóbica compreende decerca de 20 a cerca de 40 gramas de anticorpo por litro de material de coluna de interaçãohidrofóbica.

29. Método, de acordo com a reivindicação 28, CARACTERIZADO pelo fato de queo primeiro fluxo atravessante aplicado a coluna de interação hidrofóbica compreende decerca de 30 a cerca de 36 gramas de anticorpo por litro de material de coluna de interaçãohidrofóbica.

30. Método, de acordo com a reivindicação 26, CARACTERIZADO pelo fato de quea segunda eluição não é submetida a fracionamento máximo do produto.

31. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de quecompreende:(a) aplicar a mistura à uma resina de permuta de cátion em um tampão de equilíbrioonde a mistura não tem sido submetida a captura da proteína A antes de aplicar à resina depermuta de cátion e onde mais do que 30 gramas de anticorpo por litro de resina são aplica-das;(b) lavar a HCP da resina de permuta de cátion com uma pluralidade de etapas delavagem;(c) eluir o anticorpo da resina de permuta de cátion com um tampão de eluição paraformar um primeiro eluído;(d) submeter o primeiro eluído a uma etapa de inativação viral;(e) aplicar a preparação viralmente inativada a uma resina de permuta de ânion pa-ra obter um primeiro fluxo atravessante; e(f) aplicar o primeiro fluxo atravessante a uma coluna de interação hidrofóbica talque um segundo eluído é obtido;tal que a preparação de anticorpo de HCP reduzido é obtida.

32. Método, de acordo com a reivindicação 31, CARACTERIZADO pelo fato de quea resina de permuta de cátion está em pH 7 e cerca de 35 gramas de anticorpo por litro deresina são aplicadas.

33. Método, de acordo com a reivindicação 31, CARACTERIZADO pelo fato de quea resina de permuta de cátion está em pH 5 e cerca de 70 gramas de anticorpo por litro deresina são aplicadas.

34. Método, de acordo com a reivindicação 31, CARACTERIZADO pelo fato de quea pluralidade de etapas de lavagem compreende lavar a resina com uma primeira lavagemempregando o tampão de equilíbrio e uma segunda lavagem empregando uma mistura dotampão de eluição e água.

35. Método, de acordo com a reivindicação 34, CARACTERIZADO pelo fato de quea mistura de tampão de eluição e água compreende cerca de 40-50% de tampão de eluiçãoe cerca de 50-60% de água.

36. Método, de acordo com a reivindicação 31, CARACTERIZADO pelo fato de queantes de aplicar a preparação viralmente inativada à resina de permuta de íon ânion, pH econdutividade da preparação viralmente inativada é ajustada para ser substancialmente si-milar a pH e condutividade da resina de permuta de ânion.

37. Método, de acordo com a reivindicação 31, CARACTERIZADO pelo fato de queo primeiro eluído compreende uma faixa de cerca de 90 a cerca 100 vezes menos de HCPdo que a mistura como determinado por um ensaio imunossorvente ligado a enzima deHCP.

38. Método, de acordo com a reivindicação 31, CARACTERIZADO pelo fato de queo primeiro fluxo atravessante compreende uma faixa de cerca de 840 a cerca 850 vezesmenos de HCP do que o primeiro eluído como determinado por um ensaio imunossorventeligado a enzima de HCP.

39. Método, de acordo com a reivindicação 31, CARACTERIZADO pelo fato de queo segundo eluído compreende uma faixa de cerca de 3 a cerca 5 vezes menos de HCP doque o primeiro fluxo atravessante como determinado por um ensaio imunossorvente ligado aenzima de HCP.

40. Método, de acordo com a reivindicação 1, CARACTERIZADO pelo fato de quecompreende:(a) aplicar a mistura a uma resina de permuta de cátion em um tampão de equilí-brio, onde a resina de permuta de cátion está em pH 7 e cerca de 35 gramas de anticorpopor litro de resina são aplicados, ou a resina de permuta de cátion está em um pH em umafaixa de pH 5 a pH 7 e cerca de 35 a cerca de.70 gramas de anticorpo por litro de resina sãoaplicadas, ou a resina de permuta de cátion está em pH 5 e cerca de 70 gramas de anticor-po por litro de resina são aplicadas;(b) lavar a HCP da resina de permuta de cátion com etapas de lavagem compreen-dendo uma primeira lavagem empregando o tampão de equilíbrio e uma segunda lavagemempregando uma mistura de um tampão de eluição e água;(c) eluir o anticorpo da resina de permuta de cátion com o tampão de eluição paraformar um primeiro eluído;(d) submeter o primeiro eluído a uma etapa de inativação viral, onde a inativação vi-ral é obtida por inativação viral de pH para formar uma preparação viralmente inativada;(e) aplicar a preparação viralmente inativada a uma resina de permuta de ânion,onde, antes de aplicar a preparação viralmente inativada à resina de permuta de íon ânion,pH e condutividade da preparação viralmente inativada é ajustada para ser substancialmen-te similar a pH e condutividade da resina de permuta de ânion, tal que um primeiro fluxo a-travessante é obtido; e(f) aplicar o primeiro fluxo atravessante a uma coluna de interação hidrofóbica talque um segundo eluído é obtido;tal que a preparação do anticorpo de HCP reduzido é obtida.

41. Método, de acordo com a reivindicação 40, CARACTERIZADO pelo fato de quea mistura de anticorpo não tem sido submetida a captura da proteína A antes de aplicar a resina de permuta de cátion.

42. Método, de acordo com a reivindicação 40, CARACTERIZADO pelo fato de quea mistura do tampão de eluído e água compreende cerca de 40-50% de tampão de eluição ecerca de 50-60% de água.

43. Método, de acordo com a reivindicação 40, CARACTERIZADO pelo fato de que o primeiro eluído compreende uma faixa de cerca de 90 a cerca de 100 vezes menos deHCP do que a mistura como determinado por um ensaio imunossorvente ligado a enzimade HCP.

44. Método, de acordo com a reivindicação 40, CARACTERIZADO pelo fato de queo primeiro fluxo atravessante compreende uma faixa de cerca de 840 a cerca de 850 vezes menos de HCP do que o primeiro eluído como determinado por um ensaio imunossorventeligado a enzima de HCP.

45. Método, de acordo com a reivindicação 40, CARACTERIZADO pelo fato de queo segundo eluído compreende uma faixa de cerca de 3 a cerca de 5 vezes menos de HCPdo que o primeiro fluxo atravessante como determinado por um ensaio imunossorvente Iiga-do a enzima de HCP.

46. Método, de acordo com a qualquer uma das reivindicações de 1-45,CARACTERIZADO pelo fato de que a HCP compreende procatepsina L tal que uma prepa-ração de anticorpo de procatepsina L reduzido é obtida.

47. Método, de acordo com a reivindicação 46, CARACTERIZADO pelo fato de que o primeiro eluído compreende atividade de catepsina L variando entre cerca de 25 a cercade 60 RFU/s/mg de anticorpo como medido por um ensaio cinético de catepsina L.

48. Método, de acordo com a reivindicação 46, CARACTERIZADO pelo fato de queo primeiro fluxo atravessante compreende atividade de catepsina L variando entre cerca de-0,4 a cerca de 4 RFU/s/mg de anticorpo como medido por um ensaio cinético de catepsinaL.

49. Método, de acordo com a reivindicação 46, CARACTERIZADO pelo fato de queo segundo eluído compreende atividade de catepsina L variando entre cerca de 0,5 a cercade 1,5 RFU/s/mg de anticorpo como medido por um ensaio cinético de catepsina L.

50. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 46-49,CARACTERIZADO pelo fato de que o nível de procatepsina L é reprodutivelmente baixo.

51. Método, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1-45,CARACTERIZADO pelo fato de que o anticorpo é um anticorpo de fator alfa de necrosetumoral (TN Fa), ou porção de ligação de antígeno deste.

52. Método, de acordo com a reivindicação 51, CARACTERIZADO pelo fato de queo anticorpo anti-TNFa, ou porção de ligação de antígeno deste, é um anticorpo humanizado,um anticorpo quimérico ou um anticorpo multivalente.

53. Método, de acordo com a reivindicação 51, CARACTERIZADO pelo fato de queo anticorpo anti-TNFa, ou porção de ligação de antígeno deste, é infliximabe ou golimuma-be.

54. Método, de acordo com a reivindicação 51, CARACTERIZADO pelo fato de queo anticorpo anti-TNFa, ou porção de ligação de antígeno deste, é um anticorpo humano.

55. Método, de acordo com a reivindicação 54, CARACTERIZADO pelo fato de queo anticorpo anti-TNFa, ou porção de ligação de antígeno deste, é um anticorpo humano iso-lado que dissocia-se de TNFa humano com a Kd de 1 χ 10® M ou menos e uma constante detaxa Koff de 1 χ 10~3 s"1 ou menos, ambos determinados por ressonância de plásmon super-ficial, e neutraliza a citotoxicidade de TNFa humano em um ensaio L929 in vitro padrão comum IC50 de 1 χ 10"7 M ou menos.

56. Método, de acordo com a reivindicação 54, CARACTERIZADO pelo fato de queo anticorpo anti-TNFa, ou porção de ligação de antígeno deste, é um anticorpo humano iso-lado com as seguintes características:a) dissociar-se de TNFa humano com uma constante de taxa Koff de 1 χ 10"3 s"1 oumenos, como determinado por ressonância de plásmon superficial;b) ter um domínio CDR3 de cadeia leve compreendendo a seqüência de aminoáci-do de SEQ ID No: 3, ou modificado da SEQ ID No: 3 por uma única substituição de alaninana posição 1, 4, 5, 7 ou 8 ou por uma a cinco substituições de aminoácido conservativas nasposições 1, 3, 4, 6, 7, 8 e/ ou 9;c) ter um domínio CDR3 de cadeia pesada compreendendo a seqüência de amino-ácido de SEQ ID No: 4, ou modificado da SEQ ID No: 4 por uma única substituição de alani-na na posição 2, 3, 4, 5, 6, 8, 9, 10 ou 11 ou de uma a cinco substituições de aminoácidoconservativas nas posições 2, 3, 4, 5, 6, 8, 9, 10, 11 e/ ou 12.

57. Método, de acordo com a reivindicação 54, CARACTERIZADO pelo fato de queo anticorpo anti-TNFa, ou porção de ligação de antígeno deste, é um anticorpo humano iso-lado com uma região variável de cadeia leve (LCVR) compreendendo a seqüência de ami-noácido da SEQ ID No: 1 e uma região variável de cadeia pesada (HCVR) compreendendoa seqüência de aminoácido da SEQ ID No: 2.

58. Método, de acordo com a reivindicação 54, CARACTERIZADO pelo fato de queo anticorpo anti-TNFa, ou porção de ligação de antígeno deste, é adalimumabe.

59. Preparação de anticorpo, CARACTERIZADA pelo fato de que é substancial-mente livre de HCP como medido por ensaio imunossorvente ligado a enzima de HCP pro-duzido empregando o método de qualquer uma das reivindicações de 1-45.

60. Composição farmacêutica, CARACTERIZADA pelo fato de que compreendeuma preparação de anticorpo de HCP reduzido produzida empregando o método de qual-quer uma das reivindicações de 1-45, e um veículo farmaceuticamente aceitável.

61. Composição farmacêutica compreendendo um anticorpo de HCP reduzido,CARACTERIZADA pelo fato de que o nível de HCP compreende não mais do que cerca de-70 ng de HCP por mg de anticorpo como medido por um ensaio imunossorvente ligado aenzima de HCP, e um veículo farmaceuticamente aceitável.

62. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 61,CARACTERIZADA pelo fato de que o nível de HCP compreende não mais do que cerca de-13 ng de HCP por mg de anticorpo como medido por um ensaio imunosssorvente ligado aenzima de HCP.

63. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 61,CARACTERIZADA pelo fato de que o nível de HCP compreende não mais do que cerca de-5 ng de HCP por mg de anticorpo como medido por um ensaio imunossorvente ligado a en-zima de HCP.

64. Composição compreendendo um anticorpo, CARACTERIZADA pelo fato deque a referida composição não tem nível detectável de HCP como determinado por um en-saio imunossorvente ligado a enzima de HCP.

65. Preparação de anticorpo, CARACTERIZADA pelo fato de que é substancial-mente livre de procatepsina L produzida empregando o método de qualquer uma das reivin-dicações de 1-45.

66. Composição farmacêutica, CARACTERIZADA pelo fato de que compreendeuma preparação de anticorpo de procatepsina L reduzido produzida empregando o métodode qualquer uma das reivindicações de 1-45, e um veículo farmaceuticamente aceitável.

67. Composição farmacêutica, CARACTERIZADA pelo fato de que compreendeum anticorpo, um anticorpo de procatepsina L reduzido e um veículo farmaceuticamenteaceitável, CARACTERIZADO pelo fato de que o nível de procatepsina L não é maior do queuma atividade de catepsina de cerca de 3,0 RFU/s/mg de anticorpo.

68. Composição ou preparação de qualquer uma das reivindicações de 59-67,CARACTERIZADA pelo fato de que um anticorpo de fator alfa de necrose anti-tumoral(TNFff), ou porção de ligação de antígeno deste.

69. Método de tratamento de uma doença em que a atividade de TNFct é prejudici-al, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende administrar a um paciente humano acomposição ou preparação de acordo com a reivindicação 68.

70. Artigo de fabricação, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende um ma-terial de embalagem, adalimumabe, e um rótulo ou encarte da embalagem contido dentro domaterial de embalagem indicando que a formulação de adalimumabe compreende não maisdo que cerca de 70 ng de HCP por mg de adalimumabe.

71. Artigo de fabricação, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende um ma-terial de embalagem, adalimumabe, e um rótulo ou encarte da embalagem contido dentro domaterial de embalagem indicando que a formulação de adalimumabe compreende não maisdo que cerca de 13 ng de HCP por mg de adalimumabe.

72. Artigo de fabricação, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende um ma-terial de embalagem, adalimumabe, e um rótulo ou encarte da embalagem contido dentro domaterial de embalagem indicando que a formulação de adalimumabe compreende não maisdo que cerca de 5 ng de HCP por mg de adalimumabe.

73. Artigo de fabricação, CARACTERIZADO pelo fato de que compreende um ma-terial de embalagem, adalimumabe, e um rótulo ou encarte da embalagem contido dentro domaterial de embalagem indicando que a formulação de adalimumabe compreende não maisum nível de procatepsina L do que aquele indicado por uma atividade de catepsina L de cer-ca de 3,0 RFU/s/mg de adalimumabe.