BRPI0709960B1

BRPI0709960B1 - Anticorpo monoclonal do tipo igg1 ou igg3 humana glicosilado, seu uso e método de produção e composição farmacêutica

Info

Publication number: BRPI0709960B1
Application number: BRPI0709960-6A
Authority: BR
Inventors: Silke Hansen; Klaus-Peter Kuenkele; Dietmar Reusch; Ralf Schumacher
Original assignee: F. Hoffmann-La Roche Ag
Priority date: 2006-04-11
Filing date: 2007-04-10
Publication date: 2019-10-15
Also published as: US7846724B2; IL194165A0; EP2007809B2; ES2395136T5; IL301499B2; IL233150A0; US20140193404A1; CN103864923A; KR101275452B1; US11673958B2; AU2007236198A1; EP2007809B1; AU2007236198B2; AR060386A1; MX2008012953A; ECSP088814A; JP5078990B2; CR10300A; CA2647288C; CA3128738A1

Abstract

<b>anticorpos g licosi lados<d>a presente invenção refere-se a um anticorpo do tipo igg1 ou lgg3 humana, sendo glicosilado com uma cadeia de açúcar em asn297, sendo o dito anticorpo distinguido pelo fato de que a quantidade de fucose na dita cadeia de açúcar é pelo menos 99%, e além disso, a quantidade de ngna é 1% ou menos e/ou a quantidade de alfa-1 ,3-galactose do terminal n é 1% ou menos, e os usos dos mesmos.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para ANTICORPO

MONOCLONAL DO TIPO IGG1 OU IGG3 HUMANA GLICOSILADO, SEU

USO E MÉTODO DE PRODUÇÃO E COMPOSIÇÃO FARMACÊUTICA.

A presente invenção refere-se a um anticorpo recombinante que tem uma região Fc expressada e glicosilada, pela qual uma importante estrutura de carboidrato do núcleo, anexada à região Fc do anticorpo, é completamente fucosilada. A presente invenção refere-se também a células hospedeiras CHO (do ovário do hamster chinês), métodos para selecionar tais células hospedeiras CHO e o uso desse anticorpo recombinante. Antecedentes da Invenção

As imunoglobulinas ou anticorpos na sua forma nativa são usualmente glicoproteínas tetraméricas compostas de duas cadeias leves e pesadas. Os anticorpos contêm domínios constantes que designam os anticorpos a classes tais como IgA, IgD, IgE, IgM, e IgG, e várias subclasses tais como IgG1, IgG2, IgG3, e IgG4. Os anticorpos de seres humanos das classes IgG1 e IgG3 usualmente medeiam ADCC (citotoxicidade mediada por células dependentes de anticorpos).

Há também outras moléculas conhecidas que são similares a anticorpos e contêm, por exemplo, um domínio ligante de uma proteína heteróloga, tal como um recpetor, ligantes ou enzima, e a região Fc de um anticorpo. Tais proteínas de fusão Fc são descritas, por exemplo, por Staliba, P.et al., Nature Biotech. 16:1357-1360 (1998), e patente n^o US

5.610.297.

Os anticorpos monoclonais eliciam quatro funções efetoras: ADCC, fagocitose, citotoxicidade dependente de complementos (CDC) e taxa de meia-vida/depuração. ADCC e fagocitose são mediadas através da interação de anticorpos ligados a células com FcyR (receptores Fc gama); CDC através da interação de anticorpos ligados a células com uma série de proteínas que constituem o sistema de complementos. CDC está relacionado à ativação de C3 ligante de C1q e/ou ligação do receptor Fc da parte Fc. Caso a ativação de C3 ligante de C1q e/ou a ligação do receptor Fc de uma parte constante do anticorpo deva ser reduzida, usualmente são usados Segue-se folha 1a

Petição 870190064282, de 09/07/2019, pág. 6/13

1a

Petição 870190064282, de 09/07/2019, pág. 7/13 preendem uma região constante de cadeia pesada gama-1 com certas mutações tais como L234A e L235A ou D265A e N297A (documento n² WO

99/51642).

Sabe-se muito bem no estado da técnica modificar os domínios constantes de anticorpos para melhorar as funções efetoras. Tais métodos estão descritos, por exemplo, no documento n² WO 99/54342.

Routier, F.H. et al.,Glycoconjugate J. 14:201-207 (1997) relatam o padrão de glicosilação de um anticorpo lgG1 humanizado expressado em células CHO-DUKX. Este anticorpo apresenta uma razão molar de Fuc:Man de 0,8:3,0, que se refere a uma proporção de glicosilação de 80%. Niwa, R. et al.,J. Immunol. Methods 306:151-160 (2005) relatam anticorpos lgG1 e lgG3 anti-CD20 produzidos de forma recombinante em fucosilação de CHO DG44 de cerca de 90%. Mimura, Y. et al.,J. Immunol. Methods 247:205-216 (2001) relatam que butirato aumenta a produção de IgG quimérica humana em células CHO-K1 e ao mesmo tempo mantendo a função e o perfil de glicoformas. Os perfis de oligossacarídeos apresentam um teor considerável de estruturas de glicanos afucosilados. Raju, T.S., BioProcess International 1:44-53 (2003) relatam o impacto da variação de glicosilação por sistemas de expressão na atividade biológica de imunoglobulinas terapêuticas e na nomenclatura. Rituximab apresenta 9-10% de fucosilação (Niwa, R. et al.,J. Immunol. Methods 306:151-160 (2005). Fujii, S. J. Biol. Chem. 265:60096018 (1990) relatam que IgG bovina inclui cerca de 11% de IgG afucosilada. Mizouchi, T., J. Immunol. 129:2016-2020 (1982) relatam que IgG humana é cerca de 14% afucosilada. Bergwerff, A.A., Glycoconjugate J. 12:318-330 (1995) relata que os anticorpos produzidos em SP2/0 do camundongo contêm oligossacarídeos do ácido N-glicolil-neuramínico (NGNA) em grandes quantidades. Nahrgang, S. etal., em Animal Cell Technology: Products from Cells, Cells as Products, Bernard, A. et al. (editores), Kluwer Academic Publishers, Dordrecht, NL, 1999, páginas 259-261, relatam que para a expressão em CHO de lgG1 depois de transfecção transiente, uma glicosilação gobal deficiente é encontrada. Lund, J. et al., Mol. Immunol. 30:741-748 (1993) relatam a produção recombinante de um anticorpo quimérico de ca mundongo/humano em células de transfectoma do camundongo. O anticorpo lgG1 é afucosilado em uma quantidade de 13%. Patel, T.P. et al., Biochem. J. 285:839-845 (1992) relatam a glicosilação de anticorpos a partir de células de hibridoma e ascite do camundongo. Niwa, R. et al., J. Immunol. Methods 306:151-160 (2005), relatam para o anticorpo lgG1 de CD20 uma fucosilação de 91% depois da produção recombinante em CHO DG44, e Mori, K. et al., Biotech. Bioeng. 88:901-908, uma ficosilação de 94%. Davies, J. et al., Biotechnol. Bioeng. 74:288-294 (2001) relatam que a expressão de anticorpos com glicoformas alteradas leva a um aumento de ADCC. Sheeley, D.M. et al., Anal. Biochem. 247:1020110 (1997) comparam a glicosilação de anticorpos em diferentes sistemas de expressão. Shields, R.L. et al., J. Biol. Chem. 277:26733-26740 (2002) relatam que a falta de fucose em Fc de lgG1 humana melhora a ligação de FcyRIII e ADCC. Um anticorpo anti-Her2 sendo cerca de 90% fucosilado também apresenta ADCC em uma quantidade considerável. Zhu, L. et al., Nature Biotechnol. 23:1159-1169 (2005), relatam sobre a produção de anticorpos humanos em ovos de galinha. Os documentos n— WO 2004/087756 e WO 2005/005635 descrevem anticorpos aperfeiçoados contra IGF-1R.

Sumário da Invenção

A invenção compreende um anticorpo do tipo lgG1 ou lgG3 humana sendo glicosilado com uma cadeia de um açúcar em Asn297, sendo o dito anticorpo distinguido pelo fato de que a quantidade de fucose no dito açúcar é de pelo menos 99%, e além disso, a quantidade de NGNA é 1% ou menos e/ou a quantidade de alfa-1,3-galactose do terminal N é 1% ou menos.

De acordo com a invenção, o termo quantidade significa a quantidade do dito açúcar na cadeia de açúcar em Asn297, relacionada à soma de G0, G1, G2 (sem manose (4 e 5)) como 100% e como calculado no Exemplo 3.

De acordo com a invenção, é possível fornecer anticorpos e/ou células hospedeiras CHO com uma fucosilação de mesmo 99,4% ou mais, 99,5% ou mais, ou 99,9% ou mais.

De preferência, a quantidade de NGNA é 0,5% ou menos, mais preferivelmente 0,1% ou menos, e mesmo não-detectável por LCMS (Cromatografia Líquida/Espectrometria de Massas).

De preferência, a quantidade de alfa-1,3-galactose do terminal N é 0,5% ou menos, mais preferivelmente 0,1% ou menos, e mesmo nãodetectável por LCMS.

A cadeia de açúcar apresenta, de preferência, características de glicanos ligados ao N anexados a Asn297 de um anticorpo expressado de forma recombinante em uma célula CHO.

De preferência, o anticorpo é um anticorpo monoclonal. De preferência, o anticorpo é um anticorpo quimérico, humanizado ou humano.

A invenção compreende ainda uma célula CHO capaz de expressar de forma recombinante um anticorpo do tipo lgG1 ou lgG3 humana sendo glicosilada com uma cadeia de açúcar em Asn297, sendo o dito anticorpo distinguido pelo fato de que na cadeia de açúcar a quantidade de fucose é pelo menos 99%, e além disso, a quantidade de NGNA é 1% ou menos e/ou a quantidade de alfa-1,3-galactose do terminal N é 1% ou menos.

Tal linhagem de células é uma linhagem de células hu MAb<IGF-1 R>B1-E10_9-16 depositada segundo o Tratado de Budapeste no reconhecimento internacional do depósito de microorganismos com o propósito de processo de patente, com Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ), Alemanha, em 21 de junho de 2006 sob o Número de Acesso DSM ACC 2795.

As quantidades preferidas do açúcar estão mencionadas acima.

De preferência, a célula CHO é uma célula CHO que compreende deleção (por exemplo, DG44) ou inativação funcional de ambos alelos DHFR ou uma deleção de um alelo DHFR e uma inativação funcional do segundo alelo DHFR (por exemplo, DXB11).

A invenção compreende ainda uma composição de acordo com a invenção para uso em terapia médica humana.

O anticorpo da composição de acordo com a invenção é, de preferência, um anticorpo quimérico, um anticorpo humano, um anticorpo humanizado, um anticorpo não-humano, um anticorpo de cadeia única que compreende a parte constante da cadeia pesada de lgG1 ou lgG3, ou uma parte constante da cadeia pesada de IgG 1 ou lgG3.

A invenção compreende ainda o uso de um anticorpo de acordo com a invenção para a fabricação de um medicamento. De preferência, o medicamento é útil para imunossupressão para o tratamento de distúrbios mediados por células T, distúrbios auto-imunes, doenças infecciosas, doenças cancerígenas.

A invenção compreende ainda uma composição farmacêutica que compreende um anticorpo de acordo com a invenção.

Um outro objeto da invenção é um método para a seleção de uma célula CHO para a produção recombinante de um anticorpo monoclonal do tipo lgG1 ou lgG3 humana sendo glicosilado com uma cadeia de açúcar em Asn 297, sendo o dito anticorpo distinguido pelo fato de que a quantidade de fucose na dita cadeia de açúcar é pelo menos 99%, e além disso, a quantidade de NGNA é 1% ou menos e/ou a quantidade de alfa-1,3galactose do terminal N é 1% ou menos, sendo que o dito método compreende cultivar uma célula CHO transfectada com um anticorpo de lgG1 ou lgG3 e um gene de DHFR, sob pressão de seleção de DHFR e MTX, pegar clones individuais expandindo os clones e selecionando um clone que produz um anticorpo com o padrão de glicosilação de acordo com a invenção. De preferência, o cultivo é realizado por pelo menos duas, de preferência pelo menos três semanas.

Um outro objeto da invenção é o uso de uma célula CHO de acordo com a invenção para a produção recombinante de um anticorpo monoclonal.

Um outro objeto da invenção é um método para a produção recombinante de um anticorpo monoclonal em uma célula CHO de açodo com a invenção.

A célula CHO é uma célula hospedeira para a expressão recombinante de polipeptídeos heterólogos.

Breve Descrição do Desenho

A figura 1 é um gráfico de barras ilustrando a atividade de ADCC ou sua falta em anticorpos da invenção e em anticorpos de controle e comparativos.

Descrição Detalhada da Invenção

Os anticorpos contêm estruturas de carboidratos em posições conservadas nas regiões constantes da cadeia pesada, sendo que cada isótopo possui uma coleção distinta de estruturas de carboidratos ligadas a N, que afetam variavelmente a montagem, secreção ou atividade funcional de proteínas (Wright, A. e Morrison, S. L. Trends Biotechnol. 15:26-32 (1997). A estrutura do carboidrato anexado ligado em N varia consideravelmente, dependendo do grau de processamento, e pode incluir alto teor de manose, multiplamente ramificada, bem como oligossacarídeos complexos biantenados (Wright, A. e Morrison, S. L. Trends Biotechnol. 15:26-32 (1997).

Os anticorpos do tipo lgG1 e lgG3 são glicopropteínas que têm um sítio de glicosilação ligado a N conservado em Asn297 em cada domínio CH2. Os dois oligossacarídeos complexos biantenados anexados a Asn297 ficam enterrados entre os domínios CH2, formando contatos extensivos com a cadeia principal do polipeptídeo, e sua presença é essencial para o anticorpo mediar funções efetoras tal como a citotoxicidade celular dependente de anticorpo (ADCC) (Lifely, M.R. et al., Glycobiology 5:813-822 (1995); Jefferis, R. et al., Immunol. Rev. 163:59-76 (1998); Wright, A. e Morrison, S.L. Trends Biotechnol. 15:26-32 (1997).

Como aqui utilizado, o termo região Fc do tipo IgG humana inclui, de preferência, também variantes alélicas de ocorrência natural da região Fc de uma imunogllobulina (anticorpo), bem como variantes que têm alterações que são substituições, adições ou deleções, mas que não afetam a glicosilação de ASn297. Por exemplo, um ou mais aminoácidos podem ser deletados do terminal N ou terminal C da região Fc de uma imunoglobulina sem perda substancial da função biológica. Tais variantes podem ser selecionadas de acordo com regras gerais conhecidas nessas técnicas, de modo a ter efeito mínimo sobre a atividade (vide, por exemplo, Bowie, J.U. et al., Science 247:1306-1310 (1990)).

O termos anticorpo engloba as várias formas de anticorpos, incluindo, porém sem limitações, anticorpos integrais, fragmentos de anticorpos, anticorpos humanos, anticorpos humanizados e anticorpos produzidos por engenharia genética, desde que as propriedades características de acordo com a invenção sejam retidas. Portanto, um anticorpo de acordo com a invenção contém pelo menos uma parte Fc funcionalmente ativa (ligante de Fc) do tipo lgG1 ou lgG3 que compreende Asn glicosilado.

Os termos anticorpo monoclonal ou composição de anticorpo monoclonal, como aqui utilizado, referem-se a uma preparação de moléculas de anticorpo com seqüência de aminoácidos idêntica. Conseqüentemente, o termo anticorpo monoclonal humano refere-se a anticorpos que apresentam uma única especificidade de ligação, que têm regiões variáveis e constantes derivadas de seqüências de imunoglobulinas de linhagem germinal humana.

O termo anticorpo quimérico refere-se a um anticorpo monoclonal que compreende uma região variável, isto é, uma região ligante, de um fonte ou espécie, e pelo menos uma parte de uma região constante de uma fonte ou espécie diferente, preparada usualmente por técnicas de DNA recombinante. Os anticorpos quiméricos que compreendem uma região variável murina e uma região constante humana são especialmente preferidos. Tais anticorpos quiméricos murinos/humanos são o produto de genes de imunoglobulina expressados que compreendem segmentos de DNA que codificam regiões variáveis de imunoglobulina murina e segmentos de DNA que codificam regiões constantes de imunoglobulina humana. Os métodos para produzir anticorpos quiméricos envolvem técnicas de DNA recombinante convencionais e de transfecção gênica agora bem-conhecidas nessa área (vide, por exemplo, Morrison, S.L. etaL, Proc. NatL Acad. Sei. USA 81:68516855 (1984); patentes n²² US 5.202.238 e 5.204.244).

O termo anticorpo humanizado refere-se a anticorpos nos quais a estrutura ou regiões determinantes de complementaridade (CDR) foram modificadas para compreender a CDR de uma imunoglobulina de especificidade diferentes em comparação com aquela da imunoglobulina originária. Em uma modalidade preferida, uma CDR murina é enxertada na regi8 ão da estrutura de um anticorpo humano para preparar um anticorpo humanizado (vide, por exemplo, Riechmann, L. et al., Nature 332:323-327 (1988);

e Neuberger, M.S. et al., Nature 314:268-270 (1985)). As CDRs particularmente preferidas correspondem àquelas que representam seqüências que reconhecem os antígenos assinalados acima para anticorpos quiméricos e bifuncionais.

O termo anticorpo humano, como aqui utilizado, pretende incluir anticorpos que têm regiões variáveis e constantes derivadas de seqüências de imunoglobulinas de linhagem germinal humana. Tais regiões são 10 descritas, por exemplo, por Johnson, G e Wu, T.T. Nucleic Acids Res. 28:214-218 (2000) e as bases de dados lá referenciadas, e são úteis desde que as propriedades de acordo com a invenção sejam retidas. Os anticorpos humanos são bem-conhecidos nessas técnicas (van Dijk, M.A. e van de Winkel, J.G. Curr. Opin. Chem. Biol. 5:368-374 (2001)). Os anticorpos hu15 manos podem ser produzidos também em animais transgênicos (por exemplo, camundongos) que são capazes, após imunização, de produzir um repertório completo ou uma seleção de anticorpos humanos na ausência da produção de imunoglobulina endógena. A transferência da coleção de genes de imunoglobulinas de linhagem germinal humana nesses camundongos 20 mutantes de linhagem germinal resulta na produção de anticorpos humanos após desafio de antígenos (vide, por exemplo, Jakobovits, et al., Proc. Natl.Acad. Sei. USA 90:2551-2555 (1993); Jakobovits et al., Nature 362:255258 (1993); Bruggemann, M. et al., Year Immunol. 7:33-40 (1993)). Os anticorpos humanos podem ser produzidos também em bibliotecas de apresen25 tação de fagos (Hoogenboom, H.R. e Winter, G., J. Mol. Biol. 227:381-388 (1992);Marks, J.D. et al., J. Mol. Biol. 222:581-597 (1991)). As técnicas de Cole et al. e Boerner et al. também estão disponíveis para a preparação de anticorpos monoclonais humanos (Cole et al., Monoclonal Antibodies and Câncer Therapy, Alan R. Liss, página 77 (1995); e Boerner, P. et al., J. Im30 munol. 147:86-95 (1991)). Um anticorpo humano engloba as várias formas de anticorpos, de preferência anticorpos monoclonais, incluindo, porém sem limitações, anticorpos integrais, fragmentos de anticorpos e anticorpos pro9 duzidos por engenharia genética (anticorpos variantes ou mutantes), desde que as propriedades características de acordo com a invenção sejam retidas. São especialmente preferidos os anticorpos humanos recombinantes.

O termo anticorpo humano recombinante, como aqui utilizado, pretende incluir todos anticorpos humanos que são preparados, expressados, criados ou isolados por meios recombinantes, tais como anticorpos isolados a partir de uma célula hospedeira de acordo com a invenção, usando um vetor de expressão recombinante transfectado nessas célula hospedeira.

Os domínios constantes não estão envolvidos diretamente na ligação de um anticorpo a um antígeno, mas apresentam outras funções tais como funções efetoras. As regiões constantes da cadeia pesada que correspondem a lgG1 são denominadas cadeia γΐ. As regiões constantes da cadeia pesada que correspondem a lgG3 são denominas cadeia γ3. As cadeias pesadas γ constantes humanas são descritas detalhadamente por Kabat, E.A. et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5- edição, Public Health Service, Natonal Institutes of Health, Bethesda, MD (1991); e por Bruegemann, M. etal., J. Exp. Med. 166:1351-1361 (1987); Love, T.W. etal., Methods Enzymol. 178:515-527 (1989). Os domínios constantes do tipo lgG1 ou lgG3 são glicosilados em Asn297. Asn 297, de acordo com a invenção, significa o aminoácido asparagina localizado na posição aproximada 297 na região Fc; baseado em pequenas variações de seqüências de anticorpos, Asn297 pode estar localizado também alguns aminoácidos (usualmente não mais do que ± 3 aminoácidos) a montante ou a jusante. Por exemplo, em um anticorpo de acordo com a invenção Asn297 está localizado na posição de aminoácido 298.

A glicosilação de IgG 1 ou lgG3 humana ocorre em Asn297 como glicosilação de oligossacarídeos complexos biantenados fucosilados terminados com até 2 resíduos de Gal (galactose). Estas estruturas são designadas como resíduos de glicanos GO, G1 (ct1,6 ou a1,3) ou G2, dependendo da quantidade de resíduos de Gal no terminal (Raju, T. S., BioProcess International 1:44-53 (2003)). A glicosilação do tipo CHO de partes Fc do anticorpo está descrita por Routier, F.H., Glycoconjugate J. 14:201-207 (1997).

O termo região variável (região variável de uma cadeia leve (VL), região variável de uma cadeia pesada (VH)), como aqui utilizado, denota cada par de cadeias leve e pesada que ETA envolvido diretamente na ligação do anticorpo ao antígeno.

De acordo com a invenção, pode ser selecionado um anticorpo que produz uma célula hospedeira CHO que é capaz de fornecer por intermédio de expressão recombinante uma composição de anticorpo monoclonal que apresenta um padrão de glicosilação de acordo com a invenção. Tal célula CHO hospedeira compreende um ou mais vetores de expressão para a expressão recombinante desse anticorpo. De preferência, a célula hospedeira é estável transfectada com o(s) vetor(es) e o anticorpo que codifica ácidos nucléicos estão integrados no genoma da célula hospedeira CHO.

O termo célula CHO engloba as varias formas de células do ovários do hamster chinês (CHO) baseadas em alelos dhfr inativados, de preferência deletados (deficientes em desidrofolato redutase (dhfr')). Tais células dhfr’ e métodos para sua geração estão descritos, por exemplo, em Urlaub, G. et al„ Ce//33:405-412; Urlaub, G. et aí, Som. Call Molec. Genet. 12 555:566 (1986); Kolkekar etat., Biochemistry 36:10901-10909 (1997). De preferência, a célula é uma linhagem de célula DG44. Tais células CHO dhfr podem ser produzidas usando raios gama para eliminar o lócus dhfr inteiro. Em células do tipo selvagem não-mutadas dhfr é uma enzima essencial para a síntese de novo de glicina, purinas, e timidilato. Isto permite que o gene de dhfr codificado em plasmídeos seja usado como um marcador selecionável dominante e um ampliador de genes para a expressão de proteínas em linhagens de células deficientes em dhfr'. A mutação dhfr’ em células DG44 é estável e irreversível. As células CHO co-transfectadas exitosamente com vetor(es) de expressão para um anticorpo do tipo IgG 1 ou lgG3 humana e o gene de DHFR possuirão a fenótipo dhfr⁺ e podem ser selecionados facilmente cultivando as colônias em meio isento de timidina e hipoxantina e contendo opcionalmente metotrexato (MTX) para ampliação.

As células DG44 são bem-conhecidas no estado da arte e estão disponíveis, por exemplo, como linhagens de células, por exemplo, na Invi11 trogen Corpo. (USA). As células DG44 podem se desenvolver aderentes, em suspensão e/ou em meio isento de soro. Como aqui utilizados, os termos célula, linhagem de células e cultura de células são utilizados de forma intercambiável e todas as designações de linhagens de células CHO dhfr' (dois alelos dhfr deletados) incluem a progênie. Assim sendo, as palavras transformantes e células transformadas incluem a célula em questão primária e culturas derivadas dela sem levar em conta o número de transferências. Deve ser entendido também que toda progênie não precisa ser precisamente idêntica em conteúdo de DNA, devido a mutações deliberadas ou inadvertidas. A progênie variante que tem as propriedades de glicosilação de acordo com a invenção conforme tríadas quanto a elas na célula transformada originalmente está incluída.

De preferência, a linhagem de células CHO dhfr' é co-ampliada com pelo menos DHFR como um gene marcador selecionável. Por exemplo, um vetor de expressão mamífero que contém o marcador ou marcadores selecionáveis e o gene do anticorpo são co-transfectados dentro de células CHO recebedoras. As colônias resultantes podem ser selecionadas e as colônias que apresentam o fenótipo esperado são capazes de expressar o anticorpo. Marcadores selecionáveis adicionais podem ou não ser de uma natureza dominante. Os exemplos de marcadores selecionáveis adicionais para usar cotransfecção incluem adenosina desaminase (Kaufman, R.J. et al., Proc. Natl. Acad. Sei. USA 83:3136-3140 (1986)) asparagina sintetase (Cartier, M. et al., Mol. Cell Biol. 7:1623-1628 (1987), gene trpB de E. coli e gene hisD de Salmonella (Harman, S.C. e Mulligan, R.C., roc. Natl. Acad. Sei. USA 85:80478051 (1988), ribonucleotídeo redutase do camundongo M2 (Thelander, M. e Thelander, L., EMBO J. 8:2475-2479 (1989), gene humano de resistência a múltiplos fármacos (Kane, S.E. et al., Gene 84:439-446 (1989), glutamina sintetase (Bebbington, C.R. et al., DNA Cloning, volume III, D.M. Glover (editor), IRL Press, páginas 163-188, 1987), xantina guanina fosforribosil transferase (gpt) (Mulligan, R.C. e Berg, P., Science 209:1422-1427 (1980), higromicina B (Santerre, R.F. et al., Gene 30:147-156 (1984), gene de neomicina (Southern, P.J. e Berg, P., Mol. Appl. Genet. 1:327-341 (1982).

Os marcadores selecionáveis podem também fornecer a base sobre a qual os genes que codificam o anticorpo podem ser ampliados. Na co-transfecção de uma linhagem de células CHO, os DNAs dos vetores são frequentemente integrados no cromossoma da célula no mesmo lócus. Assim sendo, o uso de apenas um dos marcadores selecionáveis como a base para ampliação normalmente resulta em um aumento paralelo no número de cópias de ambos genes. Um marcador selecionável específico para uso desta maneira é dhfr que permite que a ampliação desejada seja obtida através do uso de concentrações crescentes de MTX. Um segundo marcador selecionável preferido é GS que permite ampliação pela adição de metionina sulfoximina (MSX).

Os marcadores selecionáveis estão evidentemente sob o controle de elementos reguladores de DNA de modo a proporcionar sua expressão. No caso do uso de dhfr como um marcador selecionável, os elementos reguladores são, de preferência, de uma fonte viral, tal como de vírus de tumor de DNA. É particularmente preferido o uso de um promotor tardio principal de SV40 ou adenovírus. Ele é particularmente vantajoso nesse aspecto para remover o elemento intensificador do promotor, e assim mutilando-o eficazmente. Esta modificação permite que níveis maiores de ampliação do gene em cada concentração de seleção de metrotrexato do que ocorrería de outra forma caso um promotor forte fosse usado. No caso do uso de neomicina como um marcador selecionável, um exemplo de um promotor apropriado é o promotor metalotioneína do camundongo.

O termo ácido nucléico ou molécula de ácido nucléico, como aqui utilizado, pretende incluir moléculas de DNA e moléculas de RNA. Uma molécula de ácido nucléico pode ser de filamento único ou filamento duplo, mas, de preferência, é DNA de filamento duplo.

Um ácido nucléico está ligado operacionalmente quando ele é colocado em uma relação funcional com outra seqüência de ácidos nucléicos. Por exemplo, o DNA para uma pré-seqüência ou líder secretória está ligada ao DNA para um polipeptídeo, caso ele esteja expressado como uma pré-proteína que participa na secreção do polipeptídeo; um promotor ou in tensificador está ligado operacionalmente a uma seqüência codificadora caso ele afete a transcrição da seqüência; ou um sítio de ligação de ribossoma está ligado operacionalmente a uma seqüência codificadora caso ele esteja posicionado de modo a facilitar a tradução. Geralmente, o termo ligado operacionalmente significa que as seqüências de DNA que estão sendo ligadas são cis, e no caso de uma líder secretora, contíguas e em uma estrutura de leitura. Entretanto, os intensificadores não têm de ser contíguos. A ligação é realizada por ligação em sítios de restrição convenientes. Caso tais sítios não existam, são usados adaptadores de oligonucleotídeos sintéticos ou ligantes de acordo com a prática convencional.

Os anticorpos de acordo com a invenção são produzidos de preferência por meios recombinantes. Tais meios são amplamente conhecidos nessas técnicas e compreendem a expressão de proteínas em células procarióticas e eucarióticas com subseqüente isolamento do polipeptídeo anticorpo e usualmente purificação até uma pureza farmaceuticamente aceitável. Para a expressão de proteínas, os ácidos nucléicos que codificam cadeias leves e pesadas ou fragmentos delas são inseridos dentro de vetores de expressão por métodos usuais. A expressão é realizada em células hospedeiras CHO e o anticorpo é recuperado das células ou sobrenadante, de preferência, depois da lise.

A produção recombinante de anticorpos é bem-conhecida nessas técnicas e está descrita, por exemplo, nos artigos revisionais de Makrides, S.C., Protein Expr. Purif. 17:183-202 (1999); Geisse, S. et al., Proteína Expr. Purif. 8:271-282 (1996); Kaufman, R.J., Mol. Biotechnol. 16:151:161 (2000); Werner, R.G., Drug Res. 48:870-880 (1998).

Os anticorpos podem estar presentes em células integrais, no sobrenadante, em um lisado celular, ou em uma forma parcialmente purificada ou substancialmente pura. A purificação é realizada para eliminar outros componentes celulares ou outros contaminantes, por exemplo, outros ácidos nucléicos ou proteínas celulares, por técnicas padronizadas, incluindo tratamento alcalino/SDS, formação de bandas com CsCI, cromatografia de coluna, eletroforese em gel de agarose, e outras bem-conhecidas nessa á rea (vide Ausubel, F. et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greende Publishing e Wiley Interscience, New York (1987)).

As seqüências de controle, que são apropriadas para procariotas, incluem, por exemplo, um promotor, opcionalmente uma seqüência operadora, e um sítio de ligação de ribossomas. As células eucarióticas reconhecidamente utilizam promotores, intensificadores e sinais de poliadenilação.

Os anticorpos monoclonais podem ser separados adequadamente de um meio de cultura de hibridomas por procedimentos convencionais de purificação de imunoglobulinas, tais como, por exemplo, proteína A em Sefarose, cromatografia com hidroxilapatita, eletroforese em gel, diálise, ou cromatografia de afinidade. O DNA e o RN que codificam os anticorpos monoclonais são isolados facilmente do hibridoma e seqüenciados usando procedimentos convencionais. As células de hibridoma podem servir como uma fonte de tais DNA e RNA. Depois de identificado e isolado, o DNA pode ser inserido em vetores de expressão, que são então transfectados dentro de células CHO, que de outra forma não produzem a proteína imunoglobulina, para obter a síntese de anticorpos monoclonais recombinantes nas células hospedeiras.

Em outro aspecto, a presente invenção fornece uma composição farmacêutica que compreende uma composição da presente invenção, formulada em conjunto com um veículo farmaceuticamente aceitável. De preferência, uma composição farmacêutica de acordo com o documento WO n²98/22136 é usada. Tal composição contém, por exemplo, em 1 mL, 2,0 mg de anticorpo, tampão de fosfato 15 mM, pH 6,5, cloreto de sódio 30 mM, 25 mg de manita, 10 mg de arginina, 0,1 mg de Tween®.

Como aqui utilizado, o termo veículo farmaceuticamente aceitável inclui qualquer um e todos solventes, meios de dispersão, revestimentos, agentes antibacterianos e antifúngicos, agentes isotônicos e retardantes de absorção, e similares, que são fisiologicamente compatíveis. De preferência, o veículo é apropriado para administração intravenosa, intramuscular, subcutânea, parenteral, espinhal ou epidérmica (por exemplo, por injeção ou infusão).

Um sal farmaceuticamente aceitável refere-se a um sal que retém a atividade biológica desjeada do anticorpo e não confere quaisquer efeitos colaterais indesejados (vide, por exemplo, Berge, S.M., et al., J. Pharm. Sei. 66:1-19 (1977)). Tais sais estão incluídos na invenção. Os exemplos de tais sais incluem sais de adição de ácidos e sais de adição de bases. Os sais de adição de ácidos incluem aqueles derivados de ácidos inorgânicos atóxicos, tais como sais de ácido clorídrico.

Uma composição da presente invenção pode ser administrada por uma série de métodos conhecidos nessas técnicas. Como deve ser avaliados pelos versados nessas técnicas, a via e/ou modo de administração variará dependendo dos resultados desejados.

Para administrar um composto da invenção por certas vias de administração, pode ser necessário revestir o composto ou co-administrar o composto com um material para impedir sua inativação. Por exemplo, o composto pode ser administrado a um indivíduo em um veículo apropriado, por exemplo, lipossomas, ou um diluente. Os diluentes farmaceuticamente aceitáveis incluem solução salina e soluções aquosas de tampões.

Os veículos farmaceuticamente aceitáveis incluem soluções ou dispersões aquosas estéreis e pós estéreis para preparação extemporânea de soluções ou dispersões injetáveis estéreis. O uso desses meios e agentes para substâncias farmaceuticamente ativas é conhecido nessas técnicas.

Os termos administração parenteral e administrado por via parenteral, como aqui utilizados, significam modos de administração, diferentes de administração entérica e tópica, usualmente por injeção, e inclui, sem limitações, injeção e infusão intravenosa, intramuscular, intra-arterial, intratecal, intracapsular, intra-orbital, intracardíaca, intradérmica, intraperitoneal, transtraqueal, subeutânea, subcuticular, intra-articular, subcapsular, subaracnóide, intra-espinhal, epidural, e intra-esternal.

Estas composições podem conter também adjuvantes, tais como conservantes, agentes umectantes, agentes emulsificantes, e agentes dispersantes. A prevenção da presença de microorganismos pode ser assegurada por procedimentos de esterilização, supra, e pela inclusão de vários agentes antibacterianos e antifúngicos, por exemplo, Paraben, coro-butanol, fenol, ácido sórbico, e similares. Pode ser desejável incluir agentes isotônicos, tais como açúcares, cloreto de sódio, e similares, nas composições. Além disso, a absorção prolongada da forma farmacêutica injetável pode ser criada pela inclusão de agentes que retardam a absorção tais como monoestearato de alumínio e gelatina.

Independentemente da via de administração selecionada, os compostos da presente invenção, que podem ser usados em uma forma hidratada apropriada, e/ou as composições farmacêuticas da presente invenção, são formulados em formas de dosagem farmaceuticamente aceitáveis por métodos conhecidos pelos versados nessas técnicas.

Os níveis reais da dosagem dos ingredientes ativos nas composições farmacêuticas da presente invenção podem ser variados de modo a obter uma quantidade do ingrediente ativo que seja eficaz para atingir a resposta terapêutica desejada para um paciente, composição, e modo de administração específico, sem ser tóxico para o paciente. O nível de dosagem selecionado dependerá de uma série de fatores farmacocinéticos, incluindo a atividade das composições específicas da presente invenção empregadas, ou do seu éster ou amida, via de administração, tempo de administração da taxa de excreção do composto específico que está sendo empregado, duração do tratamento, outros fármacos, compostos e/ou materiais usados em combinação com as composições específicas empregadas, a idade, sexo, peso, condição saúde geral e histórico médico anterior do paciente que está sendo tratado, e fatores similares bem-conhecidos nas técnicas de médicas.

A composição deve ser estéril e fluida até o grau em que a composição seja distribuível por seringa. Além da água, o veículo pode ser uma solução salina tamponada isotônica, etanol, poliol (por exemplo, glicerina, propilenoglicol, e polietilenoglicol líquido, e similares), e misturas apropriadas deles.

A fluidez apropriada pode ser mantida, por exemplo, pelo uso de um revestimento, tal como lecitina, pela manutenção do tamanho de partícula requerido no caso de dispersão, e pelo uso de surfactantes. Em muitos casos, é preferível incluir agentes isotônicos, por exemplo, açúcares, poliálcoois, tais como manitol ou sorbitol, e cloreto de sódio na composição. A absorção de longo prazo das composições injetáveis pode ser criada incluindo na composição um agente que retarda a absorção, por exemplo, monoestearato de alumínio ou gelatina.

Os exemplos e a figura que se seguem são fornecidos para auxiliar a compreensão da presente invenção, cujo âmbito verdadeiro está enunciado nas reivindicações apensadas. Deve-se entender que modificações podem ser feitas nos procedimentos enunciados, sem fugir do espírito da invenção.

Exemplos Linhagens de Células

A linhagem de células parental usada para a geração de uma linhagem de células para a expressão recombinante de IgG é uma linhagem de células do ovário do hamster chinês (CHO), CHO-DG44 (Flintoff, W.F. et al., Somat. Cell Genet. 2:245-261 (1976); Flintoff, W.F. et al., Mol. Cell. Biol. 2:275-285 (1982); Urlaub, G., et al. Ce//33:405-412 (1983); Urlaub, G., et al., Somat. Cell Genet. 12:555-566 (1986). As células CHO-DG44 perderam ambos lociendógenos para a enzima diidrofolato redutase (DHFR).

As células CHO-DG44 foram desenvolvidas em Meio Mínimo Alfa MEM (Gibco N² 22561), FCS 10% dialisado (Gibco N² 26400-044) e 2 mmol/L de L-gutamina, Hipoxantina 100 μΜ, timidina 16 μΜ (suplemento HT).

Plasmídeos

O sistema de expressão compreendeu o promotor CMV e está descrito na Tabela 1. Na qualidade de anticorpo, foi usado um anticorpo contra IGF-1R (documento n² WO 2005/005635; AK18 ou AK22).

Tabela 1

Bp	Elemento do Vetor/Segmento de DNA
1-26	Sítios de restrição singulares: SgrAI, Sse83871
27-614	Promotor de citomegalovírus (HCMV) humano (CMV-Prom) incluindo Promotor de CMV IE humano incluindo 5-UTR sintética
615-641	Ligante
642-780	Seqüência líder da cadeia pesada de Ig murina (L1, íntron de seqüência de sinais, L2)
642-686	L1
687-768	íntron de sinais (íntron SS)
769-780	L2
781-1105	Domínio da cadeia leve variável κ do anticorpo contra IGF-1R (AK18)
1106-1140	Ligante
1141-3134	íntron 2 híbrido da cadeia leve variável κ humana/camundongo
2433-2913	Fragmento do intensificador κ
3135-3475	Ligante
3476-3795	Região constante da cadeia leve κ (C-kapa)
3796-4098	Seqüência de poliadenilação da cadeia leve κ de Ig humana (C-kapa pA)
4099-4137	Ligante
4138-5800	Resistência à higromicina
4138-4485	Promotor SV40 (SV40 Prom) incluindo repetição de 72 pb, TATA, origem SV40
4486-4502	Ligante
5403-5528	Higromicina-B-fosfotransferase (Hyg)
5529-5535	Ligante
5536-5795	Sinal de poliadenilação de SV40 (SV40 pA)
5796-5800	Ligante
5801-6944	Diidrofolato redutase murina (DHFR)
5801-6088	Promotor de SV40 (SV40 Prom) incluindo a repetição de 72 pb encurtada, origem SV40
6089-6105	Ligante
6106-6672	Gene de DHFR murina (DHFR murina)
6673-6679	Ligante
6680-6944	Sinal de poliadenilação de SV40 (SV40 pA)
6945-7181	Ligante

7182-8941	Origem bacteriana de replicação e marcador seletivo derivado do plasmídeo pUC18
7182-7792	Origem de replicação (origem pUC)
7793-7939	Ligante
7940-8847	Gene de β-Lactamase (Ap(r))
8848-8941	Ligante
8942-9529	Promotor de citomegalovírus humano (HCMV) (CMV-Prom) incluindo promotor de CMV IE humano incluindo 5'-UTR sintética
9530-9556	Ligante
9557-9696	Seqüência líder da cadeia pesada de Ig murina (L1, íntron de seqüência de sinais, L2)
9557-9602	L1
9603-9685	íntron de sinais (íntron SS)
9686-9696	L2
9697-10051	Domínio da cadeia pesada de lgG1 humana/camundongo do anticorpo contra IGF-1R (AK18)
10052-10085	Ligante
10086-11682	íntron 2 híbrido da cadeia pesada humana/camundongo Incluindo a parte da região do segmento J da cadeia pesada de Ig do camundongo Incluindo o elemento intensificador da cadeia pesada de lgG1 humana (parte JH₃, JH₄) Elemento intensificador da cadeia pesada de Ig do camundongo
11683-11909	Ligante
11910-13504	Região constante da cadeia pesada de lgG1 humana (CHi-Articulação-CH2-CH₃)
11910-12203	CH1
12594-12638	Articulação
12757-13086	CH2
13184-13504	CH₃ ( sítio de divisão alternativo deletado)
13505-13967	Seqüência de poliadeninalçao da cadeia pesada de IgG 1 humana (IgG 1 pA)
13968-13970	SgrAI-Ligante

Exemplo 1

Transfecção e Seleção

A transfecção do plasmídeo de expressão foi conduzida com

Fugene (Roche Diagnostics GmbH). Um dia depois da transfecção, as células DG44 foram colocados sob pressão de seleção, consistindo em Meio Mínimo Alfa MEM, 10% de FCS dialisado e 2 mmol/L de L-Glutamina e metotrexato a 20 nM (MTX). Depois de 3 semanas sob pressão de seleção, clo5 nes individuais foram coletados da placa e expandidos.

Os sobrenadantes foram coletados e a presença do anticorpo foi analisada com ELISA específica de IgG. Subclones foram expandidos ainda mais e analisados quanto à produção do anticorpo específico.

Os clones foram adaptados para crescimento em cultura em 10 suspensão e meio isento de soro, HyQ SFM4 CHO-Utility (HyClone n²SH30516), contendo MTX a 20 nM. Em paralelo, o Pedrão de glicosilação foi determinado. Os subclones foram selecionados disponibilizando a desfucosilação de 2,0% ou menos (referente à quantidade molar total de oligossacarídeos).

Exemplo 2

Cultivo e Purificação x 10⁵ células /mL foram desenvolvidas em frascos de batedeira (Corning) enchidos com 30 mL de meio a 37°C, 5% de CO₂, 100 rpm, por 10 dias. A densidade celular foi medida por Contador CASY e o sobrenadante 20 foi retirado para determinação da concentração do anticorpo por cromatografia de afinidade com proteína A. Cerca de 20 mL de cada sobrenadante foram purificados para caracterização bioquímica adicional por cromatografia com proteína A (equilíbrio com PBS, lavagem com tampão de citrato de sódio a 25 mM. pH 5,2, eluição com tampão de citrato de sódio a 100 mM, pH 25 2,8, CIP com NaOH a 10 mM).

Exemplo 3

Análise da Glicoestrutura do Anticorpo

O material do anticorpo purificado foi analisado por Cromatografia Líquida/Espectrometria de Massa (LCMS) com análise do mapa de peptí30 deos. As amostras foram reduzidas (Tris/HCI 0,4 M, Guanidina/HCI a 8 M, pH 8,5, DTT (3 mg/mL)), carboximetiladas (ácido iodo-acético) e clivadas com tripsina. A mistura peptídeo/glicopeptídeo foi separada com RP-HPLC e analisada em linha com espectrometria de massas por spray de elétrons. Os espectros m/z da glicoestrutura que contém peptídeo foram integrados, e os resultados estão indicados na Tabela 2.

Tabela 2

Quantidade Relativa de Variantes de Glicosilação

Clone N²	GO (%)	G1 (%)	G2 (%)	Não-Fuc (%)	Man¹ (%)
1	38,4	51,4	10,2	0,1	0,5
2	44,3	47,6	8,1	0,1	0,6
3	42,8	48,7	8,5	0,2	0,8
4	49,2	43,6	7,2	0,3	1,2
5	62,7	33,0	4,3	0,6	1,0
6	60,4	35,5	4,2	0,5	1,2
7	40,4	49,8	9,8	0,3	0,6
8	46,9	45,9	7,3	0,3	1,1

Man: Estruturas com alto teor de manose portando quatro e cinco resíduos de manose, respectivamente.

GO, G1, G2: cadeias pesadas reduzidas com carboidrato do tipo complexo biantenado fucosilado com 1,2 ou 3 resíduos de galactose no terminal.

Não-fuc: cadeias pesadas reduzidas com carboidrato do tipo complexo biantenado sem fucose.

O clone 5 da linhagem de células CHO (hu MAB<IGF-1 R>B14E10_9_16) foi depositada segundo o Tratado de Budapeste no reconhecimento internacional do depósito de microorganismos com o propósito de processo de patente, com Deutsche Sammlung Von Mikroorganismen um Zellculturen GmbH (DSMZ), Alemanha, em 21 de junho de 2006, sob o Número de Acesso DSM ACC 2795.

Os meios usados para cultivo dos diferentes clones foram obtidos na Hyclone (HyQ SFM4 CHO-Utility, usado para clones 4-6) ou Sigma (C-8862, usado para os clones 1-3 e 7).

A análise do mapa de peptídeos por LCMS foi realizada por integração dos cromatogramas iônicos específicos de todos estados de carga elétrica para todos glicopeptídeos.

Bissecção de GlcNac, NGNA e alto teor de manose foram determinados da mesma maneira.

A bissecção de GlcNac e NGNA não foram detectáveis. A bissecção de GlcNac e NGNA não são detectáveis, e assim sendo, a quantida5 de de NGNA é 0,5% ou mais baixa, e é também 0,1% ou mais baixa.

A quantidade de bissecção de GlcNac também é 0,5% ou mais baixa, e 0,1% ou mais baixa.

Um cálculo exemplificativo de glicosilação (clone 3) está indicado na Tabela 3 (Tabela 3^ã: clone 3, Tabela 3b: clone 5; peptídeo que com10 preende Asn298, denominado H27).

Tabela 3a

	Área z = 2	Área z = 3	Área z = 4	Soma	Quantidade relativa (%)
H27 G0	616	198	0	814	28,7
H27 G1	734	424	0	1158	40,9
H27 G2	103	135	0	238	8,4
H27 G3	0	0	0	0	0,0
H27 G4	0	0	0	0	0,0
H27 G1 1NGNA	0	0	0	0	0,0
H27 G2 1NGNA	0	0	0	0	0,0
H27 G2 2NGNA	0	0	0	0	0,0
H27 G3 1NGNA	0	0	0	0	0,0
H27 G3 1NGNA	0	0	0	0	0,0
H27_G3_2NGNG0 menos GlcNAc e menos Man	0	57	0	57	2,0
G0 menos GlcNAc	330	0	0	330	11,7
G1 menos GlcNAc	208	0	0	208	7,4
Man5	22	0	0	22	0,8
G0 menos Fuc	5	0	0	5	0,2
G1 menos Fuc	0	0	0	0	0,0
Man4	0	0	0	0	0,0
Total				2833,15	100,00

quantidade relativa de glicoestruturas com NGNA	0,0
quantidade relativa de glicoestruturas com galactoses (G3 e G4)	0,0
quantidade relativa de alto teor de manose	0,8
quantidade realtiva de GO menos Fuc e G1 menos Fuc	0,2

Soma de G0	42,4
Soma de G1	48,2
Soma de G2	8,4
Soma total	99,0
Relacionado a 100% de GO-1-2
G0	42,8
G1	48,7
G2	8,5

Soma sem Man	99,2
Soma G0/1 menos Fuc	0,2
Quantidade relativa sem Fuc	0,2

Área: área de pico

H27_G0 - H27_G4: Glicopeptídeo H27 (contendo Asn298) com carboidrato do tipo complexo biantenado fucosilado com galactose no terminal x (por exemplo, G4 com e unidades de galactose)

Quantidade relativa sem Fuc: porcentagem de Fuc em relação a todos GO, G1, G2 sem glicoestrutura de manose (4 e 5) (alto teor de manose)

H27_G1_1NGNA - H27_G3_2NGNA : glicopeptídeo H27 contendo Asn298 com carboidrato do tipo complexo biantenado fucosilado com unidades de galactose no terminal x (por exemplo, G2 com 2 unidades) portando um a 10 dois ácidos N-glicolil-neuramínicos

Tabela 3b

Cálculo Exemplificativo de Glicosilação (c	one 5)
	Área z = 2	Área z = 3	Área z = 4	Soma	Quantidade relativa (%)
G0¹⁾	1108	318	0	1426	43,8
G1¹⁾	579	319	0	897	27,6
G2¹⁾	67	71	0	139	4,3
G3¹⁾	0	0	0	0	0,0
G4¹⁾	0	0	0	0	0,0
G1 1NGNA²⁾	0	0	0	0	0,0
G2 1NGNA²⁾	0	0	0	0	0,0
G2 2NGNA²⁾	0	0	0	0	0,0
G3 1 NGNA²⁾	0	0	0	0	0,0
G3 2NGNA²⁾	0	0	0	0	0,0
G0-GlcNAc-Man^3>	0	95	0	95	2,9
G0-GIcNAc³⁾	485	0	0	485	14,9
G1-GIcNAc³⁾	159	0	0	159	4,9
Man5⁴⁾	32	0	0	32	1,0
G0-Fuc⁵⁾	11	0	0	11	0,3
G1-Fuc⁵⁾	9	0	0	9	0,3
Man4⁴⁾	0	0	0	0	0,0
Total				3253,88	100,00

G0	62,7
G1	33,0
G2	4,3
glicoestrturas sem fucose	0,6
glicoestruturas portadoras de NGNA	0,0
glicoestruturas portadoras de hexoses adicionais (G3 + G4)	0,0
glicoestruturas com alto teor de manose	1,0

¹⁾Glicoestrutura do tipo complexo biantenado fucosilado com galactose no terminal x (0, 1,2, e 4, respectivamente) ²⁾ Glicoestrutura do tipo complexo biantenado fucosilado com galactose no terminal x (0, 1,2, e 4, respectivamente) com resíduos adicionais de ácido nglicolil-neuramínico ³⁾ Glicoestruturas do tipo complexo biantenado fucosilado (principalmente artefatos do método) ⁴⁾ Estruturas com alto teor de manose portadoras de quatro ou cinco resíduos de manose, respectivamente ⁵⁾ Glicoestruturas não-fucosiladas

Exemplo 4 Determinação de Funções Efetoras Mediadas por Anticorpo por HuMAbs anti-IGF-1R

Para determinar a capacidade de os anticorpos HuMAb gerados eliciarem mecanismos efetores imunes, foram realizados estudos de citotoxicidade de células dependente de anticorpo (ADCC).

Para estudar os efeitos dos anticorpos em ADCC, células de câncer prostático DU145 (HTB-81; 1 x 10⁶ em 2 a 4 mL de RPMI-FM) que expressam IGF-1R foram marcadas com 1 pL de solução de 2,2':6',2terpiridina-6,6-dicarboxilato de bis-(acetóxi-metila) (BATDA) por 25 min a 37°C em uma incubadora de células. As células foram lavadas quatro vezes com 10 mL de RPMI-FM e centrifugadas por 10 min a 200 x g com freio. Depois disso, as células foram ajustadas até uma concentração de 1 x 10⁵ células/mL. 5.000 células foram plaqueadas por cavidade em uma placa de fundo redondo correspondente a um volume de 50 pL. Anticorpos HuMAB foram adicionados em uma concentração final na faixa entre 25 e 0,1 ng/mL em um volume de 50 pL de meio de cultura de células. Subsequentemente, 50 pL de células efetoras, PBMC recém-isolado do sangue total ou células efetoras purificadas a partir dos cremes leucocitários (buffycoats), foram adicionados em uma razão de E:T na faixa de 25:1. As placas foram centrifugadas imediatamente por 1 min a 200 x g com freio, e incubadas por duas horas a 37°C. Depois da incubação, as células foram centrifugadas por 10 min a 200 x g, e 20 pL do sobrenadante foram transferidos para uma placa de microtitulação Optiplate 96-F. 200 μ!_ de solução de európio (à temperatura ambiente) foram adicionados, e a mistura foi incubada por 15 min em uma batedeira. A fluorescência resultante foi medida em um fluorômetro com resolução de tempo, usando o protocolo EU-TDA da Perkin Elmer.

A magnitude da lise celular por ADCC é expressa como % da liberação máxima de 6,6-dicarboxilato de ,2':6',2-terpiridina (TDA) a partir das células-alvo lisadas por detergente, corrigido quanto à liberação espontânea de TDA a partir das respectivas células-alvo. Com padrão referencial de um anticorpo que apresenta nenhuma ADCC ADCC (citotoxicidade me10 diada por células dependentes de anticorpos) é usado um anticorpo (monoclonal) contra KLH (hemocianina do molusco keyhole limpet) ou uma mistura de IgG isolada a partir de cerca de 35.000 doadores (Redimune). Um anticorpo isento de fucose a 75% contra IGF-IR foi usado como controle positivo. Um anticorpo de acordo com a invenção apresentou uma liberação de 15 TDA que está dentro de 3xSD da liberação de TDA do anticorpo-padrão (Figura 1).

Número de referência de arquivo da requerente ou agente: 23706 WO-SR

International application No. PCT/EP2007/003164

INDICAÇÕES REFERENTES A UM MICROORGANISMO DEPOSITADO OU OUTRO MATERIAL BIOLÓGICO (PCT Regra 13bis)

A. As indicações feitas abaixo referem-se ao microorganismo ou outro material biológico mencionado no relatório descritivo na página_________3/4_________ ,linha 27-29/1-2________.
B. IDENTIFICAÇÃO DE DEPÓSITO Outros depósitos estão identificados em uma folha adicional
Nome da instituição depositária Deutsche Sammlung Von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ)
Endereço da instituição depositária: (incluindo código postal e País) Mascheroder Weg 1b D-38124 Braunschweig
Data de depósito 21 de junho de 2006	Número de acesso DSM ACC2795
C. Indicações Adicionais (deixar em branco se não for aplicável) Esta informação continua em ® uma folha adicional

D. Estados designados para os quais as indicações são feitas: (se as indicações não forem para todos os estados)
CA (Canadá), EP (European Patent), SG (Singapura)
E. FORNECIMENTO SEPARADO DE INDICAÇÕES (deixar em branco se não for aplicável)
As indicações listadas adiante serão submetidas ao Escritório Internacional mais tarde (especificar a natureza geral das indicações, por exemplo, número de acesso do depósito)

Para uso apenas da repartição receptora

Para uso apenas do Escritório Internacional ___ Essa folha foi recebido com o pedido internacional

Essa folha foi recebida pelo escritório internacional em:

Responsável autorizado:

C. INDICAÇÕES ADICIONAIS (folha adicional)

Requerente : F. Hoffmann-La Roche AG, et al.

Referência do arquivo da requerente : 23706 WO-SR

Pedido de patente Internacional N° : PCT/EP2007/003164

Indicações Relacionadas à Resolução do Especialista em Consideração ao Material Biológico Depositado Referido no Relatório Descritivo

As indicações relacionadas ao material biológico depositado estão todas contidas no relatório descritivo.

As seguintes indicações adicionais não são requeridas ser parte do relatório descritivo e devem ser tratadas como “indicações separadas”. Elas se relacionam somente à resolução do especialista.

As indicações adicionais feitas abaixo se relacionam ao material biológico depositado referido como:

huMab<IGF-1 R>B1 -4E10_9-16 DSM ACC2795 no relatório descritivo, páginas 2/3

As indicações adicionais são:

Para designação no Canadá (CA):

Em consideração à designação do Canadá, amostras do material biológico depositado serão tornadas disponíveis até a concessão da patente Canadense, ou até a data na qual o pedido de patente for negado, ou for abandonado e não mais submetido à restauração, ou seja retirado, como previsto nas Regras 107 e 108 das Regras de Patentes sujeito ao Ato de Patentes Canadense, somente pela distribuição da amostra para um especialista independente nomeado pelo Comissário (Regra 104(4)).

Para designação no Escritório de Patentes Européias (EPO):

Em consideração à designação do EPQ, amostras do material biológico depositado serão tomadas disponíveis até a publicação da menção à concessão da patente Européia, ou até 20 anos a partir da data de depósito do pedido de patente ser negado ou retirado ou seja considerado para ser retirado, como previsto nos Regulamentos de Implementação sujeito ao EPO, somente pela distribuição da amostra para um especialista nomeado pelo requerente (Regra 28(4) EPC).

Para designação em Singapura (SG):

Os requerentes por meio desta notificam a nossa intenção de que as amostras da cultura supra-identificada devem estar disponíveis somente para os especialistas de acordo com o parágrafo 3 do Quarto Programa para as Regras de Patentes de 1995.

TRATADO DE BUDAPESTE SOBRE O RECONHECIMENTO INTERNACIONAL DO DEPÓSITO DE MICROORGANISMOS PARA FINS DE PROCESSAMENTO DE MATÉRIA DE

PATENTES

FORMATO INTERNACIONAL

Roche Diagnostics GmbH

Sandhofer Str. 116, D-68305 Mannheim F. Hoffmann-La Roche AG

124 Grenzacherstr., CH-4070 Bases Hoffmann-La ROche Inc.

340 Kingsland Stree, Nutley

RECIBO NO CASO DE DEPÓSITO ORIGINAL emitido por força da regra 7.1 pela

AUTORIDADE INTERNACIONAL DE DEPÓSITO identificada abaixo

NJ 07110-1199, USA

I. IDENTIFICAÇÃO DO MICROORGANISMO

Referência de identificação fornecida pelo depositante HM10932	Número de acesso fornecido pela AUTORIDADE INTERNACIONAL DE DEPÓSITO
	DSM ACC2795

II. DESCRIÇÃO CIENTIFICA E/OU DESIGNAÇÃO TAXONOMICA PROPOSTA

O microorganismo identificado acima (I) foi acompanhado por:

( X ) descrição científica ( ) designação taxonômica proposta (marcar com um X quando aplicável).

III. RECIBO E ACEITAÇAO

A presente Autoridade Internacional de Depósito aceita o microorganismo identificado acima (I), o qual foi recebido em 21.06.2006 (data do depósito original)¹.

IV. RECIBO DE REQUERIMENTO PARA CONVERSÃO
O microorganismo identificado acima (I) foi recebido pela presente Autoridade Internacional de Depósito em (data do depósito original) e o requerimento para a conversão do depósito original em um depósito conforme tratado de Budapeste foi recebido em (data do recibo do requerimento para conversão).	(data do depósito original) (data do recebimento
V. AUTORIDADE INTERNACIONAL DE DEPÓSITO
Nome: DSMZ-DEUTSCHE SAMMLUNG VON MIKROORGANISMEN UND ZELLKULTUREN GmbH Endereço : Mascheroder Weg 1 b D-38124 Braunschweig	Assinatura(s) da(s) pessoa(s) tendo o poder de representação da Autoridade Internacional de Depósito ou de oficial(is) responsável(is) Data: 28.06.2006

Quando aplicavel a Regra 6.4 (d), a referida data é a data a qual o status na Autoridade Internacional de depósito foi obtido.

Formato DSMZ-BP/4(página única) 12/2001

PATENTES

FORMATO INTERNACIONAL

Roche Diagnostics GmbH , Sandhofer Str. 116, D-68305 Mannheim F. Hoffmann-La Roche AG

124 Grenzacherstr., CH-4070 Bases Hoffmann-La ROche Inc.

340 Kingsland Stree, Nutley

DECLARAÇÃO DE VIABILIDADE

Emitido por força da regra 10.2 pela

AUTORIDADE INTERNACIONAL DE DEPÓSITO identificada abaixo

NJ 07110-1199, USA

I. DEPOSITANTE	II. IDENTIFICAÇÃO DO MICROORGANISMO
Nome: Roche Diagnostics GmbH Sandhofer Str. 116, D-68305 Mannheim Endereço: F. Hoffmann-La Roche AG 124 Grenzacherstr., CH-4070 Bases Hoffmann-La ROche Inc. 340 Kingsland Stree, Nutley NJ 07110-1199, USA	Número de acesso fornecido pela AUTORIDADE INTERNACIONAL DE DEPÓSITO DSM ACC2795 Data do depósito ou da transferência¹: 21.06.2006
III. DECLARAÇAO DE VIABILIDADE
A Viabilidade do microorganismo identificado acima (II) foi testado em 04-07-1997 \ Nessa data, o referido microorganismo foi (X )³ viável ( )³ inviável
IV. CONDIÇOES SOB AS QUAIS O TESTE DE VIABILIDADE E CONDUZIDA

V. AUTORIDADE INTERNACIONAL DE DEPOSITO
Nome: DSMZ-DEUTSCHE SAMMLUNG VON MIKROORGANISMEN UND ZELLKULTUREN GmbH Endereço : Mascheroder Weg 1 b D-38124 Braunschweig I · ...	Assinatura(s) da(s) pessoa(s) tendo o poder de representação da autoridade Internacional de Depósito ou de oficial(is) responsáveis) Data: 07-07-1997

e feito, a indica a data de deposito original ou, quando um novo deposito ou trani relevante mais recente (data do novo depósito ou data de transferência Nos casos relacionados à Regra 10.2(a) (ii) e (iii), referem-se ao teste de viabilidade mais recente.

Marcar com um X o campo aplicável

Preencher se a informação for requerida e se os resultados do teste foram negativos

Formato DSMZ-BP/9 (única página) 12/2001

Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Anticorpo monoclonal do tipo IgG1 ou IgG3 humana sendo glicosilado com uma cadeia de açúcar em Asn297, o dito anticorpo sendo caracterizado pelo fato de que:

a) a quantidade de fucose na dita cadeia de açúcar relacionada à soma de G0, G1, G2 sem manose 4 e manose 5 como 100% e como analisada por Cromatografia Líquida/Espectrometria de Massas (LCMS) com análise do mapa de peptídeos é pelo menos 99%,

b) e além disso, a quantidade de NGNA na dita cadeia de açúcar relacionada à soma de G0, G1, G2 sem manose 4 e manose 5 como 100% e como analisada por Cromatografia Líquida/Espectrometria de Massas (LCMS) com análise do mapa de peptídeos é 1% ou menos e a quantidade da alfa-1,3-galatose do terminal N na dita cadeia de açúcar relacionada à soma de G0, G1, G2 sem manose 4 e manose 5 como 100% e como analisada por Cromatografia Líquida/Espectrometria de Massas (LCMS) com análise do mapa de peptídeos é 1% ou menos.
2. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a quantidade de NGNA é 0,5% ou menos.
3. Anticorpo, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizado pelo fato de que a quantidade de alfa-1,3-galactose do terminal N é 0,5% ou menos.
4. Anticorpo, de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 3, caracterizado pelo fato de que o anticorpo é um anticorpo quimérico, humanizado ou humano.
5. Uso de um anticorpo como definido em qualquer uma das reivindicações de 1 a 4, caracterizado pelo fato de ser para a fabricação de um medicamento.
6. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende um anticorpo como definido em qualquer uma das reivindicações de 1 a 4.