BRPI0710023A2 - métodos e composições para a vacinação de aves domésticas - Google Patents

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Cherilyn L Heggen-Peay
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Abstract

<B>MéTODOS E COMPOSIçõES PARA A VACINAçãO DE AVES DOMéSTICAS<D>A presente invenção proporciona métodos de induzir uma resposta imune contra a espécie de Clostridium em aves, para proteger as aves da infecção por Clostridium, e/ou para proteger as aves de distúrbios relacionados, tais como a enterite necrótica. Os métodos podem ser praticados em ovo e/ou após a eclosão. A invenção adicionalmente proporciona composições e métodos para a distribuição de uma composição desta invenção em ovo diretamente para o corpo do embrião.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "MÉTODOS ECOMPOSIÇÕES PARA A VACINAÇÃO DE AVES DOMÉSTICAS".DECLARAÇÃO DE PRIORIDADE
O presente pedido reivindica o benefício, sob o 35 U.S.C. §119(e), do Pedido Provisório U.S. N2 60/787.567, depositado em 30 demarço de 2006, cujos conteúdos inteiros são incorporados por referêncianeste documento.
CAMPO DA INVENÇÃO
A presente invenção proporciona composições e métodos paraproduzir uma resposta imune em pacientes aviários, por distribuição de umacomposição imunizadora em ovo diretamente ao embrião do paciente aviário.A presente invenção adicionalmente proporciona composições e métodosimunogênicos para produzir uma resposta imune à espécie de Clostrídiumem pacientes aviários, para proteger os pacientes aviários da infecção porClostrídium, e para proteger os pacientes aviários de distúrbios relacionados,tais como a enterite necrótica.
ANTECEDENTES DA INVENÇÃO
A vacinação em ovo proporciona diversas vantagens para aindústria de aves domésticas sobre os métodos de controle atuais e avacinação potencial após a eclosão de aves, incluindo o potencial para adistribuição por automação, uniforme; a co-administração com outrasvacinas em ovo, desse modo, reduzindo o manuseio da ave após a eclosão;e o uso diminuído de antibióticos.
A descoberta que certas vacinas (por exemplo, as vacinasinativadas ou de não replicação) podem ser distribuídas para o corpo doembrião para produzir uma forte resposta imune (similar ou melhor doaquela esperada quando vacinando as aves no dia da eclosão) permite odesenvolvimento de dispositivos de automação que podem objetivar o corpodo embrião (especificamente evitando o fluido amniótico que circunda ocorpo do embrião) durante a aplicação em ovo de tais vacinas. Além disso,saber que as vacinas inativadas devem preferencialmente ser distribuídaspara o corpo do embrião permite que se desenvolvam composições devacinas que sejam mais compatíveis com a injeção no corpo do embrião.Antes desta descoberta, não se teria sido sabido ou esperado que a vacinainativada necessitasse ser administrada preferencialmente ao corpo doembrião para produzir uma forte resposta imune.
Assim, a presente invenção é um aperfeiçoamento sobre atécnica, proporcionando um modo mais eficiente de administrar vacinasinativas (mortas) em ovo. Antes desta invenção, não havia nenhumaindicação que a administração de vacina inativa aos fluidos embriônicos quecircundam o corpo do embrião (fluido amniótico) fosse algo diferente deadministrar a vacina inativada ao corpo do embrião. A presente invençãodemonstra que as vacinas inativadas necessitam ser distribuídas em ovo aocorpo do embrião apropriadamente em vez de aos fluidos que circundam ocorpo do embrião. Saber que o corpo do embrião é um alvo apropriado paraa eficácia ótima permite o desenvolvimento de vacinas inativadas e métodosde distribuição para a via em ovo. A invenção inclui a administração decomposições imunogênicas em ovo às aves domésticas e outras espéciesaviárias.
Desse modo, a presente invenção preenche uma necessidadena técnica por composições imunogênicas aperfeiçoadas para aadministração em ovo ao embrião e métodos para induzir uma respostaimune em aves, para proteger as aves de infecção e/ou contaminação porpatógenos aviários e outros, e para proteger as aves de distúrbiosrelacionados.
O Clostridium perfringens está associado com diversas doençasem aves domésticas, mais notavelmente a enterite necrótica (C. perfringenstipo A e tipo C), porém também incluindo a colangioepatite, a celulite, aserosões das moelas, e as infecções nos umbigos. Embora estas bactériasrepresentem um componente da flora intestinal normal, diversos fatorespodem predispor as aves ao desenvolvimento da doença. Tais fatoresincluem uma dieta tendo altos níveis de farinha de peixe, trigo, cevada oucenteio; a palha para cama em alta umidade; ou a exposição aos Coccídeos.Clinicamente, os sinais da doença geralmente incluem a diarréia, o apetitediminuído, as lesões intestinais, a depressão, e a mortalidade.Tradicionalmente, estas doenças são controladas por antibióticos noalimento; entretanto, o uso excessivo de antibióticos pode resultar nodesenvolvimento de cepas de bactérias resistentes aos antibióticos, as quaisapresentam um risco de saúde significativo aos humanos e animais.Ademais, em certas jurisdições, o uso de antibióticos é altamentedesfavorecido ou mesmo proibido.
Os outros métodos para controlar o Clostridium incluem umadieta que evite os ingredientes que irritam a mucosa intestinal, por exemplo,uma ração de milho-soja; uma palha para cama em baixa umidade tendomaterial absorvente, tal como lascas de madeira ou cascas de arroz; o usode um produto de exclusão competitivo para manter um balanço saudável damicroflora intestinal, por exemplo, Primalac (Star-Labs/Forage Research, Inc.,Clarksdale, MO), AVIGUARD® (Bayer Corporation, Kansas City, MO), e BIO-MOS® (Alltech, Inc., Nicholasville, KY); e a acidificação ou a desinfecçãointensa preventiva da água para minimizar as perdas durante um período dedoença. A vacinação tem sido usada para controlar as doenças relativas aoclostrídio em outras espécies, incluindo o gado, as ovelhas, as cabras e osporcos. Dois tipos principais de vacinas para o C. perfringens foramdesenvolvidos para as espécies que não são aves domésticas: os toxóides(toxinas inativadas) e os bacterina-toxóides (culturas bacterianas inativadas["mortas"] e toxinas inativadas). As antitoxinas (anticorpos específicos paraa(s) toxina(s)) são também usadas como prevenção contra, e tratamentopara, as doenças relativas ao clostrídio em espécies que não sejam avesdomésticas.
Que os inventores estejam cientes, não há nenhum relatórioanterior descrevendo a administração em ovo (isto é, a um ovo contendo umembrião aviário que se desenvolve) de uma vacina de C. perfringens. O usode vacinas de toxóides ou de toxóide-bacterina existentes em ovo é incertoporque tais vacinas geralmente requerem o uso de adjuvantes, que podemser nocivos para o embrião, podem inativar as vacinas vivas contra outrosorganismos que são tipicamente administradas durante o período em ovo(por exemplo, vacinar contra a doença de Marek), e/ou podem serincompatíveis com o equipamento de injeção em ovo existente. A vacinaçãoem ovo contra C. perfringens proporciona diversas vantagens para aindústria de aves domésticas sobre os métodos de controle atuais e avacinação após a eclosão potencial de aves, incluindo o potencial para adistribuição uniforme por automação; a co-administração com outras vacinasem ovo, desse modo reduzindo o manuseio da ave após a eclosão; e o usodiminuído de antibióticos.
Desse modo, há uma necessidade na técnica por composiçõesimunogênicas aperfeiçoadas e métodos para induzir uma resposta imunecontra o Clostridium em aves, para proteger as aves da infecção porClostridium, e para proteger as aves de distúrbios relacionados, tais como aenterite necrótica.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO
Em algumas modalidades, a presente invenção proporciona ummétodo de imunizar um paciente aviário contra um patógeno (por exemplo,um patógeno aviário ou um patógeno que não seja aviário carregado poruma ave), compreendendo administrar em ovo, durante o quarto final deincubação, uma dose imunizadora efetiva de uma composição que induzuma resposta imune contra o patógeno, onde a composição imunogênica éadministrada por injeção em ovo diretamente no corpo do embrião.
Nas modalidades adicionais da invenção, a composição induzuma resposta imune para tratar e/ou prevenir a infecção e/ou acontaminação da ave que resulta da exposição a, ou do contaTo com,patógenos que causam os seguintes exemplos não Iimitativos de doenças,infecções e/ou distúrbios: coccidiose, doença de Marek, doença bursalinfecciosa, doença de Newcastle, infecção de varíola aviária, infecção porClostridium spp., infIuenza aviária, bronquite infecciosa, infecção por vírus daanemia de pinto, Iaringotraqueíte aviária, infecção por metapneumovírusaviário, infecção por reovírus aviário, infecções por adenovírus aviário,infecção por rotavírus, infecção por astrovírus, hepatite por corpos deinclusão, síndrome da queda de postura, infecção por adenovírus, infecçãopor Escherichia coli, infecção por Mycoplasma spp., infecção por Salmonellaspp., infecção por Campylobacter spp., infecção por Listeria spp., infecçãopor Haemophillus spp., Pasteurella spp. e qualquer combinação destas.
Ainda nas modalidades adicionais da invenção, a composiçãopode compreender, consistir essencialmente em, e/ou consistir em, umagente não replicador que induz uma resposta imune contra um patógenoaviário e/ou um patógeno que causa doenças transmitidas por alimentos,tais como a infecção por Salmonella spp., a infecção por Campylobacter spp.,a infecção por Listeria spp., a infecção por Eseheriehia coli, etc,, como sãoconhecidas na técnica.
A presente invenção adicionalmente compreende métodos ondeuma dose imunizadora efetiva de duas ou mais composições que induzemuma resposta imune contra o patógeno aviário é administrada em ovo aoembrião, onde as duas ou mais composições são administradas de modosimultâneo ou seqüencial em qualquer ordem.
Adicionalmente, são proporcionados neste documento métodosonde uma dose imunizadora efetiva de duas ou mais composições queinduzem uma resposta imune contra o patógeno é administrada em ovo epelo menos uma composição é administrada ao embrião, onde as duas oumais composições são administradas de modo simultâneo ou seqüencial emqualquer ordem.
A presente invenção proporciona métodos de induzir umaresposta imune contra as espécies de Clostridium (por exemplo, Clostridiumperfringens) em aves, para proteger as aves da infecção por Clostridium,e/ou para proteger as aves de distúrbios relacionados, tais como a enteritenecrótica. Os métodos podem ser praticados em ovo e/ou após a eclosão. Apresente invenção adicionalmente proporciona composições imunogênicaspara induzir uma resposta imune contra as espécies de Clostridium em aves,para proteger as aves da infecção por Clostritium, e/ou para proteger asaves de distúrbios relacionados, tais como a enterite necrótica.
Desse modo, como um aspecto, a presente invençãoproporciona um método de imunizar um paciente aviário (por exemplo, umagalinha) contra a enterite necrótica, compreendendo administrar em ovo (porexemplo, durante o quarto final da incubação) uma dose imunizadora efetivade uma composição imunogênica que induz uma resposta imune contra oClostridium perfringens, onde a composição imunogênica é administrada porinjeção em ovo. Em certas modalidades, a composição imunogênica éadministrada ao âmnio ou ao embrião. O método pode opcionalmente serpraticado em combinação com outros regimes de imunização (por exemplo,vacinação contra a doença bursal infecciosa, a doença de Marek, a doençade Newcastle e/ou a coccidiose) e/ou alimentação em ovo de umaformulação nutriente e/ou modulador entérico.
Como um outro aspecto, a invenção proporciona umacomposição imunogênica compreendendo uma dose imunizadora efetiva deuma espécie de Clostridium atenuada em um veículo farmaceuticamenteaceitável. Em certas modalidades, a composição imunogênicaadicionalmente compreende um adjuvante, o qual pode ser, por exemplo,um adjuvante de deposição. Os adjuvantes representativos desta invençãoincluem, porém não estão limitados a um sal de alumínio, tal como gel dehidróxido de alumínio (alume), fosfato de alumínio, ou algamulina, e/oupodem também ser um sal ou géis minerais de cálcio, magnésio, ferro e/ouzinco, e/ou podem ser uma suspensão insolúvel de tirosina acilada, ouaçúcares acilados, polissacarídeos catiônica ou anionicamente derivados, oupolifosfazenos, e/ou saponinas, tais como Quil-A, e/ou emulsões de óleos,tais como água em óleo e água em óleo em água e/ou de Freund completoou incompleto ou qualquer combinação deles. Nas modalidadesrepresentativas, a composição imunogênica compreende uma emulsão deágua em óleo em água. Opcionalmente, a composição imunogênica podeadicionalmente compreender um ou mais agentes adicionais que induzemuma resposta imune contra outros patógenos aviários (por exemplo, umagente que induz uma resposta imune contra Eimeria, vírus da doençabursal infecciosa, vírus da doença de Marek e/ou vírus da doença deNewcastle) e/ou uma formulação nutriente e/ou um modulador entérico. Oum ou mais agentes adicionais pode ser agentes imunizadores queproduzem uma resposta imune protetora contra Eimería, vírus da doençabursal infecciosa, vírus da doença de Marek e/ou vírus da doença deNewcastle.
Como um aspecto adicional, a invenção proporciona umacomposição imunogênica compreendendo em um veículofarmaceuticamente aceitável:
(a) uma dose imunizadora efetiva de um toxóide deClostridium, uma bacterina de Clostridium, uma toxina de Clostridium, ouqualquer combinação dos precedentes; e
(b) uma dose imunizadora efetiva de uma vacina decoccidiose, uma vacina de doença de Marek, uma vacina de doença bursalinfecciosa, uma vacina de doença de Newcastle, uma vacina de varíolaaviária, ou qualquer combinação das precedentes.
A invenção também proporciona uma composição imunogênicacompreendendo em um veículo farmaceuticamente aceitável:
(a) uma dose imunizadora efetiva de um toxóide deClostridium, uma bacterina de Clostridium, uma toxina de Clostridium ouqualquer combinação dos precedentes; e
(b) uma emulsão de óleo.
Como ainda um outro aspecto, a invenção proporciona umacomposição imunogênica compreendendo em um veículofarmaceuticamente aceitável:
(a) uma dose imunizadora efetiva de um toxóide deClostridium, uma bacterina de Clostridium, uma toxina de Clostridium ouqualquer combinação dos precedentes; e
(b) um adjuvante compreendendo um adjuvante derivadode alumínio, uma saponina, um óleo, ou qualquer combinação dosprecedentes.
Nas modalidades adicionais, a presente invenção proporcionaum método de imunizar um paciente aviário contra infecção por uma espéciede Clostridium, compreendendo administrar ao paciente aviário uma doseimunizadora efetiva de uma composição de bacterina-toxóide de Clostridiumpor injeção em ovo durante o quarto final de incubação. Em algumasmodalidades da invenção, a espécie de Clostridium pode ser o Clostridiumperfringens.
A presente invenção também proporciona um método de=imunizar um paciente aviário contra infecção por uma espécie de Clostridium,compreendendo administrar ao paciente aviário uma dose imunizadoraefetiva de uma toxina recombinante ou seu fragmento imunogênico de umaespécie de Clostridium por injeção em ovo durante o quarto final deincubação. Em algumas modalidades, a toxina ou o seu fragmentoimunogênico é uma toxina de Clostridium perfringens ou seu fragmentoimunogênico.
Estes e outros aspectos da invenção são apresentados em maisdetalhe na descrição da invenção abaixo.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO
Certos aspectos da presente invenção são baseados nadescoberta inesperada que certas composições antigênicas ouimunogênicas permitem uma resposta imune mais efetiva em aves, quandoa composição é administrada em ovo diretamente ao corpo do embrião.
Assim, em uma modalidade, a presente invenção proporcionaum método de imunizar um paciente aviário contra um patógeno, o qualpode ser um patógeno aviário e/ou um patógeno que não é aviáriocarregado por um paciente aviário (por exemplo, um patógeno contido noalimento humano), compreendendo administrar em ovo, durante o quartofinal de incubação, uma dose imunizadora efetiva de uma composição queinduz uma resposta imune contra o patógeno aviário, onde a composiçãoimunogênica é administrada por injeção em ovo diretamente no corpo doembrião. Nos métodos desta invenção, a composição pode ser administradadiretamente no tecido do músculo esquelético no embrião e o tecido domúsculo esquelético pode ser, porém não está limitado ao tecido do músculodo peito e tecido do músculo do óvulo maduro. Nas modalidades adicionais,a composição pode ser administrada diretamente no embrião na cabeça,pescoço, ombro, asa, dorso, peito, perna ou qualquer combinação destes.Ademais, nos métodos desta invenção, a composição pode seradministrada subcutânea no corpo do embrião. Nas modalidades adicionais,a composição pode ser administrada subcutânea na cabeça, pescoço,ombro, asa, dorso, peito, perna ou qualquer combinação destes.
Qualquer via adequada de administração no embrião éapropriada no emprego dos métodos desta invenção. Por exemplo, acomposição pode ser administrada ao embrião de modo subcutâneo,intradérmico, intravenoso, intramuscular, intra-abdominal ou qualquercombinação destes.
O paciente aviário desta invenção pode ser qualquer ave e, emcertas modalidades, o paciente pode ser uma galinha, peru, pato, ganso,faisão, codorna, perdiz, galinha-de-angola, avestruz, ema ou pavão, bemcomo qualquer outra ave comercialmente processada e/ou qualquer ave,cujos ovos sejam acessíveis para manuseio nos métodos desta invenção.
Nas modalidades onde o paciente for uma galinha, é desejáveladministrar a composição desta invenção em ovo durante o período a partirdo dia 15 até o dia 20 de incubação, e nas modalidades particulares, acomposição pode ser administrada no dia 18 ou dia 19 de incubação.Quando o paciente for um peru, a composição desta invenção pode seradministrada durante o período a partir do dia 21 até o dia 28 de incubação e,nas modalidades particulares, as composições podem ser administradas nodia 24 ou dia 25 de incubação. Em outras modalidades, onde o paciente forum ganso, a composição desta invenção pode ser administrada durante operíodo a partir do dia 23 até o dia 31 de incubação e, nas modalidadesparticulares, as composições podem ser administradas no dia 28 ou dia 29de incubação. Nas modalidades adicionais, onde o paciente for um pato, acomposição desta invenção pode ser administrada durante o período a partirdo dia 21 até o dia 28 de incubação e, nas modalidades particulares, ascomposições podem ser administradas no dia 25 ou dia 26 de incubação.
Para as outras espécies aviárias, o quarto final de incubação e,assim, a faixa ótima de dias para a administração em ovo de umacomposição desta invenção, pode ser determinado de acordo com métodosbastante conhecidos na técnica. Por exemplo, um pato-do-mato tem umperíodo de incubação na faixa de 33-35 dias, um faisão comum tem umperíodo de incubação na faixa de 23-24 dias, uma codorna japonesa tem umperíodo de incubação de 17-18 dias, uma codorniz norte-americana tem umperíodo de incubação de 23 dias, uma perdiz tem um período de incubaçãode 22-23 dias, uma galinha-de-angola tem um período de incubação de 26-28 dias e um pavão tem um período de incubação de 28 dias.
Nas modalidades particulares desta invenção, a composiçãopode compreender, consistir essencialmente em, e/ou consistir em, umacomposição imunogênica e um adjuvante. Os exemplos não Iimitativos deadjuvantes desta invenção incluem um adjuvante derivado de alumínio, umasaponina, géis minerais, poliânions, polióis pluronic, derivados de saponina,lisolecitina e outras substâncias tensoativas similares, glicosídeos, todos ostipos de óleos e qualquer combinação destes. Nas modalidades particularesdesta invenção, a composição pode compreender uma emulsão de água emóleo em água.
Conforme contemplado neste documento, em algumasmodalidades da presente invenção, a composição desta invenção podecompreender um adjuvante, o qual, nas modalidades particulares, pode serum adjuvante tal como um adjuvante derivado de alumínio (por exemplo, ohidróxido de alumínio), uma saponina (por exemplo, Quil-A, incluindo QuiIAQS21), ou um óleo (tal como o Adjuvante de Freund completo ouincompleto), em qualquer combinação.
Os exemplos não Iimitativos adicionais de um adjuvante destainvenção incluem os sais minerais (por exemplo, hidróxido de alumínio;fosfato de alumínio; fosfato de cálcio), as emulsões de óleos e asformulações à base de tensoativos (por exemplo, os adjuvantes de óleosemulsificados de Freund; o Arlacel A; o óleo mineral; o adjuvante de óleo deamendoim emulsificado (adjuvante 65); o MF59 (emulsão de óleo em águaestabilizada detergente microfluidizada); o QS21 (saponina purificada); oAS02 [SBAS2] (óleo em água + MPL + QS21); o Montanide ISA-51; o ISA-720 (emulsão de água em óleo estabilizada), os produtos e os derivadosbacterianos [por exemplo, Bordatella pertussis; componente P40 derivado deCorynebacterlum granulosum; lipopolissacarideo (adjuvante para aimunidade tanto humoral quanto mediada por célula); Mycobacterium e seuscomponentes (MDPs, adjuvantes não aceitáveis em seres humanos); toxinada cólera (adjuvante mucoso)], os derivados microbianos (naturais esintéticos) [por exemplo, monofosforil lipídio A (MPL); Detox (MPL +esqueleto da parede celular de M. phlei); AGP [RC-529] (monossacarídeoacilado sintético); DC-Chol (imunoestimuladores lipoidais capazes de seauto-organizarem em lipossomos); OM-174 (derivado de lipídio A); motivosde CpG (oligonucleotídeos sintéticos contendo motivos de CpGimunoestimuladores); LT e CT modificadas (toxinas bacterianasgeneticamente modificadas para proporcionar efeitos adjuvantes nãotóxicos)], os imunomoduladores endógenos de galinha [citocinas; anticorpos;hGM-CSF ou hlL-12 (citocinas que podem ser administradas como proteínaou plasmídio codificado); Imudaptina (arranjo em série de C3d); Esqualeno],os adjuvantes particulados [virossomos (veículos lipossômicos unilamelaresincorporando antígeno); AS04 ([SBAS4] sal de Al com MPL); ISCOMs(complexo estruturado de saponinas e lipídios); polilactídeo co-glicolídeo(PLG)1 e veículos inertes (partículas de ouro; partículas de prata).
Os adjuvantes adicionais desta invenção podem incluir os géisminerais, os poliânions, os polióis pluronic, os derivados de saponina, alisolecitina e outras substâncias tensoativas similares. Os adjuvantesadicionais podem incluir os agonistas de receptores toll-like (TLR), incluindo,por exemplo, os agonistas de TLR-1 (por exemplo, tri-acil lipopeptídeos); osagonistas de TLR-2 [por exemplo, peptidoglicano de bactérias gram-positivas como estreptococos e estafilococos; ácido lipoteicóico]; osagonistas de TLR-3 (por exemplo, o RNA de fita dupla e os seus análogos,tais como poli 1:C); os agonistas de TLR-4 [por exemplo, lipopolissacarídeo(endotoxina) de bactérias gram-negativas como Salmonella e E. coli]; osagonistas de TLR-5 (por exemplo, flagelina de bactérias que têm mobilidadecomo Listeria); os agonistas de TLR-6 [por exemplo, com peptidoglicano deTLR-2 e certos lipídios (diacil lipopeptídeos)]; os agonistas de TLR-7 [porexemplo, os genomas de RNA de fita simples (ssRNA) de tais vírus comoinfluenza, sarampo, e caxumba; e as moléculas antivirais à base deguanosina sintéticas pequenas como a Ioxorribina e o ssRNA e os seusanálogos]; os agonistas de TLR-8 (por exemplo, liga o ssRNA); os agonistasde TLR-9 (por exemplo, o CpG não metilado do DNA do patógeno e seusanálogos; os agonistas de TLR-10 (função não definida) e TLR-11 (porexemplo, liga as proteínas expressas por diversos protozoários infecciosos(Apicomplexa). As galinhas têm um sistema de TLR bastante desenvolvido,com aproximadamente 10 TLRs amplamente similares àqueles detectadosnos mamíferos.
Mais exemplos dos adjuvantes desta invenção incluem osreceptores de complementos (PRRs secretados), onde o C3d (componentede complemento) é ativado por CHO microbianas. A via do complementoresulta na opsonização do patógeno e na fagocitose rápida.
Nas modalidades adicionais, um adjuvante desta invenção podeser uma seqüência de aminoácidos que é um peptídeo, um fragmento deproteína ou uma proteína inteira que funciona como o adjuvante, ou oadjuvante pode ser um ácido nucléico codificando um peptídeo, fragmentode proteína ou proteína inteira que funciona como um adjuvante. Conformeusado neste documento, o "adjuvante" descreve uma substância, a qualpode ser qualquer substância imunomoduladora capaz de ser combinadacom a vacina de polipeptídeo ou ácido nucléico para aumentar, aperfeiçoarou de outro modo modular uma resposta imune em um paciente, sem efeitodeletério sobre o paciente.
Um adjuvante desta invenção pode ser, porém não está limitadoa, por exemplo, uma citocina imunoestimuladora (incluindo, porém nãolimitada ao, GM/CSF, interleucina-2, interleucina-12, interferon-gama,interferon-4, fator de necrose tumoral-alfa, interleucina-1, fatorhematopoético fit3L, CD40L, moléculas co-estimuladoras B7.1 e moléculasco-estimuladoras B7.2), formulação de adjuvante SYNTEX 1 (SAF-1)composta de 5 por cento (peso/volume) de esqualeno (DASF, Parsippany,N.J.), 2,5 por cento de Pluronic1 polímero L121 (Aldrich Chemical,Milwaukee), e 0,2 por cento de polissorbato (Tween 80, Sigma) em soluçãosalina tamponada com fosfato. Os adjuvantes adequados também incluemum sal de alumínio, tal como o gel de hidróxido de alumínio (alume), fosfatode alumínio, ou algamulina, porém podem também ser um sal de cálcio,ferro ou zinco, ou podem ser uma suspensão insolúvel de tirosina acilada, ouaçúcares acilados, polissacarídeos derivados de modo catiônico ou aniônico,ou polifosfazenos.
Os outros adjuvantes são bastante conhecidos na técnica eincluem a N-acetil-muramil-L-treonil-D-isoglutamina (thr-MDP), a N-acetil-normuramil-L-alanil-D-isoglutamina (CGP 11637, referida como nor-MDP), aN-acetilmuramil-L-alanil-D-isoglutaminil-L-alanina-2-(1'-2'-dipalmitoil-sn-glicero-3-hidroxifosforilóxi)-etilamina (CGP 19835A, referida como MTP-PE)e RIBI, que contém três componentes extraídos de bactérias, o monofosforillipídio A, o dimicolato de trealose e o esqueleto da parede celular(MPL+TDM+CWS) em emulsão a 2% de esqualeno/Tween 80.
Os adjuvantes adicionais podem incluir, por exemplo, umacombinação de monofosforil lipídio A, preferivelmente o monofosforil lipídio A3-des-O-acilado (3-D-MPL), juntamente com um sal de alumínio. Um sistemade adjuvante melhorado envolve a combinação de um monofosforil lipídio Ae um derivado de saponina, particularmente a combinação de QS21 e 3D-MPL, como divulgada na publicação PCT número WO 94/00153 (cujosconteúdos inteiros são incorporados neste documento por referência), ouuma composição menos reatogênica, onde o QS21 é finalizado com ocolesterol, conforme divulgado na publicação PCT número WO 96/33739(cujos conteúdos inteiros são incorporados neste documento por referência).Uma formulação de adjuvante particularmente potente envolvendo QS21 3D-MPL e tocoferol em uma emulsão de óleo em água é descrita na publicaçãoPCT número WO 95/17210 (cujos conteúdos inteiros são incorporados nestedocumento por referência).
As composições e os métodos da presente invenção podem serempregados para induzir uma resposta imune, para tratar e/ou prevenir taisdoenças e distúrbios como a coccidiose, a doença de Marek, a doençabursal infecciosa, a doença de Newcastle1 a infecção de varíola aviária, ainfecção por Clostridium spp. (por exemplo, a enterite necrótica, a dermatitegangrenosa, a colangioepatite, as celulites, a enterite ulcerativa, o botulismo,a doença de Tyzzer), a influenza aviária, a bronquite infecciosa, a infecçãopor vírus da anemia de pinto, a laringotraqueíte aviária, o metapneumovírusaviário, a infecção por reovírus aviário, as infecções por adenovírus aviário,a infecção por rotavírus, a infecção por astrovírus, a hepatite por corpos deinclusão, a síndrome da queda de postura, a infecção por adenovírus, ainfecção por Escherichia coii, a infecção por Mycoplasma spp., a infecçãopor Salmoriella spp., a infecção por Campylobacter spp., a Listeria spp., ainfecção por Haemophillus spp., a infecção por Pasteureila spp., oStaphylococcus spp., o Streptoeoeeus spp., o Myeobaeterium spp., oErysipelothrix spp. e qualquer combinação destes.
Assim, em certas modalidades, a composição desta invençãopode compreender, consistir essencialmente em, e/ou consistir em, umantígeno ou imunógeno a partir de vírus da doença de Marek, vírus dabronquite infecciosa, Myeoplasma spp., vírus da Ieucose aviária, reovírus,poxvírus, adenovírus, cryptosporidium, vírus da anemia infecciosa de galinha,espécie Pasteurella, vírus da influenza aviária, vírus da doença deNewcastle (NDV), vírus da doença bursal infecciosa (IBDV), vírus dosarcoma de Rous1 Eseheriehia eoli, espécie de Eimeria, tal como Eimeriatenella (que causa coccidiose), espécie de Haemophilus, Mycoplasma,espécie de Listeria, espécie de Salmonella, espécie de Campylobaeteriespécie de Clostridium (por exemplo, C. perfringens, C. septieum, C. sordellii,C. diffieile, C. novyi, C. botulinum, C. eolinum, C. ehauvoei, C. fallax, C.sporogenes, e C. piliforme) e qualquer combinação destes.
A presente invenção é pretendida incluir os métodos e ascomposições para imunizar as aves contra patógenos, os quais podem serpatógenos que causam doença em aves e/ou patógenos que sãocarregados pelas aves (aves contaminadas) e são passados para os sereshumanos e outros animais que manuseiam ou comem tais avescontaminadas. Assim, a presente invenção proporciona composições quecompreendem, consistem essencialmente em, e/ou consistem em, umagente não replicador que induz uma resposta imune contra um patógenoaviário ou contra um patógeno que causa doença em outros animais porcontato com, ou ingestão de ovos ou carne ou outras partes do corpo de,uma ave contaminada. Tais patógenos podem incluir, porém não estãolimitados à Salmonella spp., Campylobacter spp., Listeria, Escherichia coli,Erysipelothrix sç>p., Mycobacterium spp., Clostridium spp., etc.
Em algumas modalidades, os métodos da invenção descritaneste documento podem adicionalmente compreender a etapa deadministrar uma dose de reforço da composição desta invenção ao pacienteaviário, após a eclosão.
Nas modalidades adicionais dos métodos desta invenção, umadose imunizadora efetiva de duas ou mais composições que induzem umaresposta imune contra o patógeno aviário é administrada em ovo ao embrião,onde as duas ou mais composições são administradas de modo simultâneoou seqüencial em qualquer ordem. Assim, as composições e os métodosdesta invenção podem ser empregados usando aparelho e tecnologia quecompreende administrar múltiplas composições em um único local, múltiplascomposições em múltiplos locais e/ou uma única composição em múltiploslocais. Tais métodos podem empregar um único local de entrada no ovo oumúltiplos locais de entrada no ovo. Os exemplos não Iimitativos de talaparelho e tecnologia são descritos na Patente U.S. N2 4.903.635, naPatente U.S. N2 5.136.979, na Patente U.S. N2 RE 35.973, na Patente U.S.N2 5.339.766, na Patente U.S. N2 6.032.612, na Patente U.S. N2 6.286.455,na Patente U.S. N2 5.158.038, na Patente U.S. N2 6.601.534 e na PatenteU.S. N2 6.981.470, cujos conteúdos inteiros são incorporados por referêncianeste documento.
Também estão incluídos neste documento os métodos ondeuma dose imunizadora efetiva de duas ou mais composições que induzemuma resposta imune contra o patógeno aviário é administrada em ovo e pelomenos uma composição é administrada ao embrião, onde as duas ou maiscomposições são administradas de modo simultâneo ou seqüencial emqualquer ordem. Em algumas modalidades destes métodos, pelo menosuma composição pode ser administrada ao âmnio, o qual inclui o fluidoamniótico, o corpo do embrião e o saco vitelino, e/ou a pelo menos umacomposição pode ser administrada diretamente no fluido amniótico, no corpodo embrião e/ou no saco vitelino, individualmente ou em qualquercombinação.
Em algumas modalidades desta invenção, os métodos podemadicionalmente compreender administrar em ovo um estimulante imune emqualquer tempo durante a incubação, onde o estimulante imune e acomposição são administrados de modo simultâneo ou seqüencial emqualquer ordem. Os métodos desta invenção podem também adicionalmentecompreender administrar em ovo uma formulação nutriente, um moduladorentérico, ou uma combinação destes em qualquer tempo durante aincubação, onde a formulação nutriente, o modulador entérico ou umacombinação destes e a composição são administrados de modo simultâneoou seqüencial em qualquer ordem.
Existem diversos aspectos do desenvolvimento embriônicoaviário que tornam o embrião um alvo atraente para a imunização.Primeiramente, visto que o maior período de desenvolvimento embriônicoocorre no ovo fora do trato reprodutivo maternal, o embrião pode serfacilmente acessado para a introdução das composições, tais como ascomposições imunogênicas desta invenção.
Em segundo lugar, o fato que o ovo é uma unidademulticompartimentalizada pode ser explorado para distribuir os materiaisbiológicos para locais embriônicos específicos. Por exemplo, o saco vitelinono embrião inicial funciona para fabricar o sangue. Imediatamente antes daeclosão, o saco vitelino apresenta uma função principalmente nutricional eem parte é levado para dentro do trato intestinal e, com isso, transportadopara as bolsas cecais durante e após a eclosão. Portanto, a administraçãode materiais ao saco vitelino pode resultar na distribuição para ambos ossistemas cecal ou vascular embriônicos. Além disso, a administração deuma composição desta invenção pode ser eficientemente realizada porinjeção na membrana corioalantóica ou na membrana da célula aérea.Finalmente, o acesso ao compartimento da musculatura embriônica pode serobtido por injeção embriônica direta na transferência no último quarto deincubação, e nas galinhas isto é geralmente realizado a partir do dia 17 até odia 19 de incubação.
A composição imunogênica pode ser introduzida em qualquerregião do ovo, incluindo a célula aérea, o albúmen, a membranacorioalantóica, o saco vitelino, a gema, o alantóide, o âmnio, ou diretamentena ave embriônica. Em uma modalidade particular da invenção, acomposição é introduzida no tecido muscular da ave embriônica, e em umaoutra modalidade, a composição é introduzida no tecido do músculoesquelético. Em certas modalidades, a introdução de uma molécula de ácidonucléico codificando uma proteína que permanece dentro da célula domúsculo pode ser usada para administrar uma proteína imunogênica direta eespecificamente nas células dos músculos. Alternativamente, uma moléculade ácido nucléico pode ser introduzida, a qual codifica uma proteína queserá secretada da célula do músculo, e este método pode ser usado paradistribuir uma proteína para o corpo inteiro da ave através do contato entre otecido muscular e o plasma. Os locais ilustrativos de introdução no tecido domúsculo esquelético são os tecidos do músculo do peito e do músculo doóvulo maduro, que estão localizados próximos à casca do ovo e, assim, sãoatingidos de modo relativamente fácil pelo aparelho de injeção, sem dano àsoutras estruturas embriônicas.
Pode ser usado qualquer meio adequado para introduzir acomposição desta invenção em ovo, incluindo a injeção em ovo, apulverização em alta pressão através da casca do ovo, e o bombardeiobalístico do ovo com micropartículas que carregam a composição. Emalgumas modalidades, a composição é administrada depositando-se umasolução aquosa, farmaceuticamente aceitável, no músculo, solução esta quecontém a composição a ser depositada.
Onde for usada a injeção em ovo, o mecanismo de injeção não écrítico, porém prefere-se que o método não danifique indevidamente ostecidos e os órgãos do embrião ou as membranas extra-embrionárias que ocircundam, de modo que o tratamento não diminuirá a taxa de eclosão. Oslocais preferidos de injeção são intramusculares e subcutâneos. Os locaispreferidos de injeção no tecido muscular são os tecidos do músculo esquelético, e mais particularmente do músculo do peito e do músculo doóvulo maduro, que estão localizados próximos à casca do ovo e, assim, sãoatingidos de modo relativamente fácil pelo aparelho de injeção, sem dano àsoutras estruturas embriônicas e sem comprometer a proteção proporcionadapela casca do ovo. Uma seringa adaptada com uma agulha de escala aproximadamente 18 a 26 é adequada para o propósito. Dependendo doestágio exato de desenvolvimento e da posição do embrião, uma agulha de1,905 a 10,16 centímetros (% a 4 polegadas) terminará no fluido acima dopinto ou no pinto propriamente dito. Um furo piloto pode ser perfurado oufurado através da casca, antes da inserção da agulha, para impedir o dano à agulha ou que ela fique cega. Se desejado, o ovo pode ser vedado com ummaterial vedante substancialmente impermeável a bactérias, tal como a ceraou similar, para impedir a entrada subseqüente de bactérias indesejáveis.
Em diversas modalidades desta invenção, a composição éadministrada ao corpo do embrião em uma agulha tendo um comprimento de cerca de 1,905 centímetro a cerca de 10,16 centímetros (3A de polegada acerca de 4 polegadas) [por exemplo, 2,54 centímetros (1 polegada), 3,175centímetros (1,25 polegada), 3,81 centímetros (1,5 polegada), 4,445centímetros (1,75 polegada), 5,08 centímetros (2,0 polegadas), 5,715centímetros (2,25 polegadas), 6,35 centímetros (2,5 polegadas), 6,985 centímetros (2,75 polegadas), 7,62 centímetros (3,0 polegadas), 8,255centímetros (3,25 polegadas), 8,89 centímetros (3,5 polegadas), 9,525centímetros (3,75 polegadas), ou 10,16 centímetros (4,0 polegadas)]. Alémdisso, uma agulha desta invenção pode ter uma escala variando de 15g a28g (por exemplo, 15g, 16g, 17g, 18g, 19g, 20g, 21 g, 22g, 23g, 24g, 25g, 26g, 27g ou 28g). Em algumas modalidades, a agulha pode ter umaextremidade não pontuda e, em algumas modalidades, a agulha pode teruma extremidade inclinada, com um ângulo de inclinação de cerca de 10° acerca de 45° (por exemplo, 11°, 12°, 13°, 14°, 15°, 16°, 17°, 18°, 19°, 20°, 2122°, 23°, 24°, 25°, 26°, 27°, 28°, 29°, 30°, 31°, 32°, 33°, 34°, 35°, 36°, 37°, 38°,39°, 40°, 41°, 42°, 43°, 44°, ou 45°).
Nas modalidades particulares desta invenção, nos métodos deadministrar uma composição desta invenção em ovo, a agulha pode passaratravés da casca na extremidade grande de um ovo, em um do ângulo emtorno de 1° a cerca de 20° (por exemplo, 1°, 2°, 3°, 4°, 5°, 6°, 7°, 8°, 9°, 10°,11°, 12°, 13°, 14°, 15°, 16°, 17°, 18°, 19°, ou 20°) a partir do eixo longo doovo.
A presente invenção também proporciona métodos onde acomposição desta invenção é administrada em ovo com um dispositivo deinjeção de automação.
Considera-se que um sistema de injeção de automação de altavelocidade para os embriões aviários será particularmente adequado parapraticar a presente invenção. Diversos tais dispositivos estão disponíveis, oexemplo sendo o sistema EMBREX INOVOJECT® (descrito na Pat. U.S. N24.681.063 para Hebrank), e nas Pats. U.S. N25 4.040.388, 4.469.047, e4.593.646 para Miller. A divulgação destas referências e de todas asreferências citadas neste documento é para ser incorporada aqui porreferência. Todos os tais dispositivos, como adaptados para praticar apresente invenção, compreendem um injetor contendo o DNA, conformedescrito neste documento, com o injetor posicionado para injetar um ovocarregado pelo aparelho com o DNA. Além disso, um aparelho de vedaçãooperativamente associado com o aparelho de injeção pode serproporcionado para vedar o furo no ovo, após a sua injeção.
O aparelho atualmente preferido para praticar a presenteinvenção é divulgado na Pat. U.S. N2 4.681.063 para Hebrank e na Pat. U.S.N2 4.903.625 para Hebrank, cujas divulgações são incorporadas nestedocumento por referência. Este dispositivo compreende um aparelho deinjeção para distribuir as substâncias fluidas para uma pluralidade de ovos eum aparelho de sucção, o qual se encaixa em, e suspende,simultaneamente uma pluralidade de ovos individuais a partir de suas partesque faceiam para cima e coopera com o injetor para injetar os ovosenquanto os ovos são encaixados no aparelho de sucção. As característicasdeste aparelho podem ser combinadas com as características do aparelhodescrito acima para praticar a presente invenção. Aqueles versados natécnica apreciarão que este dispositivo pode ser adaptado para a injeção emqualquer parte do ovo, por ajuste da profundidade de penetração do injetor,conforme discutido em maior detalhe abaixo.
As modalidades de um método e aparelho de injeção que podemser empregadas na presente invenção são descritas na Patente U.S. N26.032.612 (aparelho de injeção em ovo de múltiplos locais), na Patente U.S.N- 6.244.214 (aparelho para a injeção em ovo e a detecção de informaçãocom relação ao interior do ovo), nas Patentes U.S. N0S 6.176199, 6.510.811e 6.834.615 (métodos de localizar o fluido alantóico em um ovo), na PatenteU.S. N2 7.089.879 (métodos para manipular as células aéreas dentro dosovos aviários) e na Patente U.S. N2 7.165.507 (métodos e aparelho paraposicionar de modo correto um dispositivo dentro da cavidade subgeminalde um ovo), cujos conteúdos inteiros de cada uma são incorporados porreferência neste documento.
Assim, em algumas modalidades, o método e o aparelho sãoessencialmente como descritos em uma ou mais das patentes listadas acima,e envolvem posicionar um injetor ou agulha de injeção alongada naextremidade grande do ovo em um desvio do ângulo (A) a partir do eixolongo do dito ovo, o ângulo selecionado de modo que agulha sejadirecionada para o ombro ou o peito do dito embrião. A agulha é entãoinserida através da casca do ovo, ao longo de uma trajetória dedeslocamento essencialmente linear, até uma profundidade suficiente parapassar no ombro ou peito do embrião. A substância a ser depositada no ovo,que pode ser um líquido ou um sólido capaz de ser injetado com seringa (porexemplo, injetável) (porém é geralmente uma solução aquosa contendo acomposição desta invenção, conforme descrita neste documento), é entãoinjetada através da agulha. Em algumas modalidades, a agulha é retirada aolongo da trajetória de deslocamento essencialmente linear, e a etapa deinjetar a substância é realizada simultaneamente com a etapa de retirar aagulha, de modo que a substância é administrada ao longo da trajetória dedeslocamento dentro do ovo. O ângulo de desvio (A) é suficiente paraaumentar a probabilidade de injetar no músculo do ombro ou do peito.
Tipicamente, o ângulo é 1 a 20 graus, e preferivelmente o ângulo é de 2 a 3graus. Como um exemplo, a agulha pode ser inserida até uma profundidadesuficiente sob a casca do ovo, para passar no, ou passar no e através do,ombro ou do peito do embrião. O aparelho pode ser modificado para incluirmeios operavelmente associados com o aparelho, para posicionar o ovo emum ângulo em relação à agulha para atingir o dito ângulo (A), tal como pormontagem e posicionamento da(s) agulha(s) em um ângulo em relação aoaparelho de sucção.
Em um exemplo particular, os métodos da presente invençãopodem ser praticados com o aparelho descrito na Patente U.S. N- 6.244.214para Hebrank (cujos conteúdos inteiros são incorporados por referêncianeste documento), onde se descreve um aparelho (por exemplo, uma"sonda esperta") para identificar a estrutura e ou o compartimento específicodentro do ovo que está em contato com uma agulha que penetrou na cascado ovo, e métodos para empregar o aparelho para distribuir as composiçõespara estruturas e/ou compartimentos específicos dentro de um ovo.
Assim, em certas modalidades, a presente invenção proporcionaum método de introduzir uma substância no músculo de uma galinha em ovo,compreendendo: a) obter um ovo de galinha, onde o dito ovo contém umembrião de galinha em seu último quarto de incubação, antes de eclodir; b)posicionar uma agulha de injeção alongada na extremidade grande do ovo,em um desvio do ângulo cerca de 1 a 5 graus do eixo longo do dito ovo, odito ângulo selecionado de modo que a agulha seja direcionada para oombro ou o peito do dito embrião; c) inserir a dita agulha através da cascado dito ovo, ao longo de uma trajetória de deslocamento essencialmentelinear, até uma profundidade de cerca de 2,2225 centímetros a 3,81centímetros (7/8 de polegada a 1,5 polegada), no ombro ou peito do ditoembrião; e d) injetar a dita substância no ovo através da dita agulha.Em mais outras modalidades, proporciona-se um método nestedocumento para introduzir uma substância no músculo de uma galinha emovo, compreendendo: a) obter um ovo de galinha, onde o dito ovo contémum embrião de galinha de 17-19 dias; b) posicionar uma agulha de injeçãoalongada na extremidade grande do ovo, em um desvio do ângulo cerca de1 a 5 graus do eixo longo do dito ovo, o dito ângulo selecionado de modoque a agulha seja direcionada para o ombro ou o peito do dito embrião; c)inserir a dita agulha através da casca do dito ovo, ao longo de uma trajetóriade deslocamento essencialmente linear, até uma profundidade de cerca de2,2225 centímetros a 3,81 centímetros (7/8 de polegada a 1,5 polegada), noombro ou peito do dito embrião; e d) injetar a dita substância no ovo atravésda dita agulha. Em tais métodos, a agulha pode ser inserida até umaprofundidade suficiente para passar no, e através do, ombro ou peito do ditoembrião.
Também se proporciona neste documento um aparelho parainjetar simultaneamente o tecido muscular de embriões de galinhas em umapluralidade de ovos, durante os dias 17 a 19 de incubação, o dito dispositivocompreendendo: meio de encaixe para se encaixar na dita pluralidade deovos; meio de injeção que coopera com o dito meio de encaixe para inseriruma agulha alongada através das cascas dos ditos ovos, ao longo de umatrajetória de deslocamento essencialmente linear, até uma profundidade decerca de 2,2225 centímetros a 3,81 centímetros (7/8 de polegada a 1,5polegada), no ombro ou peito do dito embrião; e meio de posicionamentopara posicionar a dita agulha de injeção alongada na extremidade grande dodito ovo, em um ângulo de cerca de 1 a 5 graus de desvio a partir do eixolongo do dito ovo, de modo que a dita agulha esteja direcionada para oombro ou o peito do dito embrião. Em tal aparelho, o meio de encaixe podecompreender meio de sucção para suspender simultaneamente umapluralidade de ovos individuais.
Nas modalidades adicionais desta invenção, proporcionam-secomposições e métodos para induzir uma resposta imune à espécie deClostridium em um paciente aviário. Como um exemplo, a enterotoxemiaaguda, chamada enterite necrótica, em aves é causada pelo Clostridiumperfringens (os tipos AeC têm estado associados com a doença aviária). Aenterite necrótica pode ocorrer quando o alimento e a palha para camacontaminados com Clostridia são ingeridos pelas aves, e o organismo cresceno intestino e então forma esporos. Este processo de esporulação causa aliberação das toxinas alfa e beta, responsáveis pela necrose intestinal(particularmente no jejuno e no íleo). Os sinais clínicos incluem a depressão,o apetite diminuído e a diarréia. A mortalidade aguda pode ocorrer. Osfatores de predisposição para a infecção por C. perfringens e a enteritenecrótica incluem a dieta e o dano à mucosa intestinal. No contexto de avesdomésticas comerciais, a maioria dos casos de enterite necrótica ocorre emfrangos de duas a cinco semanas de idade. Assim, as modalidadesparticulares da presente invenção são dirigidas para as composições e osmétodos imunogênicos que protegem as aves contra Clostridium perfringense enterite necrótica, por exemplo, através da redução das taxas de infecçãoe/ou pela redução da gravidade da infecção e/ou da doença.
A presente invenção agora será descrita com referência àsmodalidades particulares da invenção. Esta invenção pode, entretanto, serincluída em diferentes formas e não deve ser interpretada como limitada àsmodalidades apresentadas neste documento. De preferência, estasmodalidades são proporcionadas de modo que esta divulgação seja eficientee completa, e inteiramente transmita o escopo da invenção para aquelesversados na técnica.
A não ser que de outro modo definidos, todos os termos técnicose científicos usados neste documento têm o mesmo significado comocomumente entendido por alguém de habilidade comum na técnica à qualpertence esta invenção. A terminologia usada na descrição da invençãoneste documento é para o propósito de descrever as modalidadesparticulares somente e não é pretendida ser Iimitativa da invenção.
Todas as publicações, pedidos de patentes, patentes, e outrasreferências mencionadas neste documento são incorporadas por referênciaem sua totalidade.A terminologia usada na descrição da invenção aqui contida épara o propósito de descrever as modalidades particulares somente e não épretendida ser Iimitativa da invenção. Conforme usadas na descrição dainvenção e nas reivindicações em anexo, as formas singulares "um", "uma","a" e "o" são pretendidas incluir as formas plurais também, a não ser que ocontexto claramente indique de outro modo.
Conforme usado aqui, "e/ou" refere-se a, e inclui, qualquer etodas as combinações possíveis de um ou mais dos itens listadosassociados, bem como a ausência de combinações, quando interpretado naalternativa ("ou").
Ademais, o termo "cerca de", conforme usado neste documentoquando se referindo a um valor mensurável, tal como uma quantidade de umcomposto ou agente desta invenção, dose, tempo, temperatura, e similares,é pretendido incluir as variações de ± 20%, ± 10%, ± 5%, ± 1%, ± 0,5%, oumesmo ± 0,1 % da quantidade especificada.
Os termos "aviário" e "pacientes aviários" ou "ave" e "pacientesaves", como usados neste documento, são pretendidos incluir os machos eas fêmeas de qualquer espécie aviária ou de ave, e em particular sãopretendidos incluir as aves domésticas que são comercialmente criadas paraovos, carne ou como animais domésticos. Desse modo, os termos "aviário" e"paciente aviário" ou "ave" e "paciente ave" incluem as galinhas, os perus,os patos, os gansos, a codorna, o faisão, os periquitos, os papagaios, ascacatuas, as calopsitas, as avestruzes, as emas e similares. Nasmodalidades particulares, o paciente é uma galinha ou um peru. A avedoméstica comercial inclui os frangos e as aves que põem ovos, que sãocriados para a produção de carnes e ovos, respectivamente.
Nas modalidades particulares, o paciente é um que estejacorrendo perigo de, ou seja suscetível à, infecção ou doença causada pelaespécie de Clostridium (por exemplo, a enterite necrótica causada porinfecção com Clostridium perfringens). Os fatores de risco para a enteritenecrótica são conhecidos na técnica e incluem, porém não estão limitadosaos fatores alimentares (por exemplo, uma dieta de alto teor em trigo,cevada, centeio ou farinha de peixe), condições insatisfatórias das palhaspara camas, e/ou exposição à Eimeria (por exemplo, exposição natural ouvacinas vivas de Eimeria). Assim, nas modalidades particulares, ascomposições e os métodos inventivos podem ser vantajosamenteempregados para reduzir a gravidade e/ou a incidência de enterite necróticaentre as aves que tenham sido vacinadas contra a coccidiose ou em bandosque estejam experimentando uma epidemia de coccidiose.
As outras doenças e distúrbios causados por infecção das avescom o Clostridium incluem, porém não estão limitados à enterite necrótica,dermatite gangrenosa, colangioepatite, celulites, enterite ulcerativa,botulismo e doença de Tyzzer. Assim, a presente invenção proporcionacomposições imunogênicas e métodos de seu uso para proteger as avescontra a infecção através de, por exemplo, Clostridium perfringens, C.septicum, C. sordellii, C. difficile, C. novyi, C. botulinum, C. colinum, C.chauvoei, C. fallax, C. sporogenes e/ou C. piliforme.
O paciente aviário desta invenção pode ser uma ave embriônica,viva, em ovo, ou pode ser uma ave que saiu do ovo, incluindo as aves quesaíram recentemente do ovo (isto é, aproximadamente os primeiros um, doisou três dias após a eclosão), adolescentes, e adultas.
Nas modalidades particulares, a ave é aproximadamente seis,cinco, quatro, três, duas ou uma semana de idade ou menos. Em outrasmodalidades representativas, o paciente aviário é um paciente nunca antestratado, isto é, não tinha sido anteriormente exposto ao antígeno contra oqual é desejada a imunidade.
O termo "administrar em ovo" ou "administração em ovo",conforme usado neste documento, a não ser que de outro modo indicado,significa administrar uma composição imunogênica (por exemplo, umavacina) a um ovo de ave contendo um embrião vivo, que se desenvolve, porquaisquer meios de penetração da casca do ovo e introduzir a composiçãoimunogênica. Tais meios de administração incluem, porém não estãolimitados à, injeção em ovo da composição imunogênica.
A presente invenção proporciona métodos de administrar umacomposição imunogênica a um paciente, para induzir uma resposta imunecontra a espécie de Clostridium, opcionalmente uma resposta imuneprotetora, no paciente. A composição imunogênica pode ser administrada aqualquer compartimento adequado do ovo (por exemplo, alantóide, sacovitelino, âmnio, célula aérea e/ou no embrião aviário propriamente dito),conforme seria aparente para alguém versado na técnica. Os métodos deadministração no embrião incluem, sem limitação, a administraçãoparenteral, tal como, por exemplo, a administração subcutânea,intramuscular, intra-abdominal, intravenosa, e/ou intra-articular. Nasmodalidades particulares, a composição imunogênica é administrada aoâmnio (por exemplo, por injeção axialmente através da extremidade grandedo ovo).
A composição imunogênica pode ser administrada ao ovo porqualquer método adequado. Nas modalidades particulares, a composiçãoimunogênica é administrada via injeção. O mecanismo da injeção no ovonão é crítico, porém em geral deve ser selecionado de modo que o métodonão danifique os tecidos e os órgãos do embrião ou as membranas extra-embrionárias que o circundam em uma proporção tal que o tratamentodiminua indevidamente a taxa de eclosão. Uma seringa adaptada com umagulha de escala aproximadamente 18 a 23 é geralmente adequada para opropósito. Os exemplos de agulhas adequadas para esta invenção incluemas agulhas tendo as seguintes escalas: escala 18, 19, 20, 21, 22, ou 23.Uma agulha desta invenção pode ser pelo menos 1,27 centímetro (Vzpolegada), 2,12 centímetros (5/6 de polegada), 1,905 centímetro (3á depolegada), 2,2225 centímetros (7/8 de polegada), 2,54 centímetros (1polegada), 3,175 centímetros (1 polegada e !4), 3,4925 centímetros (1 epolegada e 3/8), 3,81 centímetros (1 polegada e Vz), 4,1275 centímetros (1polegada e 5/8), 4,445 centímetros (1 polegada e %), 4,7625 centímetros (1polegada e 7/8) ou 5,08 centímetros (2,0 polegadas) de comprimento. Osexemplos de uma faixa de inclinações de uma agulha desta invenção é decerca de 5 graus a cerca de 45 graus (por exemplo, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12,13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22,23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 45, 56, 37, 38, 39, 40, 41, 42,43, 44 ou 45 graus). Em certas modalidades desta invenção, a faixa deinclinações de uma agulha desta invenção é de cerca de 12 graus a 20graus. Um furo piloto pode ser perfurado ou furado através da casca, antesda inserção da agulha, para impedir o dano à agulha ou que ela fique cega.Se desejado, o ovo pode ser vedado com um material vedantesubstancialmente impermeável a bactérias, tal como a cera ou similar, paraimpedir a entrada subseqüente de bactérias indesejáveis.
Um sistema de injeção no ovo de automação de alta velocidadepara os embriões aviários é particularmente adequado para praticar apresente invenção. Diversos tais dispositivos estão disponíveis, o exemplosendo aqueles divulgados nas Patentes U.S. N- 4.681.063 e 4.903.635 paraHebrank e nas Patentes U.S. N- 4.040.388, 4.469.047, e 4.593.646 paraMiller, cujos conteúdos inteiros de cada uma são incorporados nestedocumento. Tais dispositivos, como adaptados para praticar a presenteinvenção, compreendem geralmente um injetor contendo a composiçãoimunogênica, com o injetor posicionado para injetar um ovo carregado peloaparelho com a composição imunogênica. Além disso, se desejado, umaparelho de vedação operativamente associado com o aparelho de injeçãopode ser proporcionado para vedar o furo no ovo, após a sua injeção.
Em uma modalidade, o aparelho para praticar a presenteinvenção pode ser como divulgado na Pat. U.S. N2 4.681.063 para Hebranke na Pat. U.S. N2 4.903.625 para Hebrank, cujas divulgações sãoincorporadas neste documento por referência. Este dispositivo compreendeum aparelho de injeção para distribuir as substâncias fluidas para umapluralidade de ovos e um aparelho de sucção, o qual se encaixa em, esuspende, simultaneamente uma pluralidade de ovos individuais a partir desuas partes que faceiam para cima e coopera com o injetor para injetar osovos enquanto os ovos são encaixados pelo aparelho de sucção. Aquelesversados na técnica apreciarão que este dispositivo pode ser adaptado paraa injeção em qualquer parte do ovo, por ajuste da profundidade depenetração do injetor, conforme é conhecido na técnica. A presenteinvenção pode também ser praticada com o aparelho e os métodos descritosna Patente U.S. N2 6.244.214 para Hebrank (cujos conteúdos inteiros sãoincorporados por referência neste documento), onde se descreve umaparelho para identificar a estrutura e ou o compartimento específico dentrodo ovo que está em contato com uma agulha que penetrou na casca do ovo,e métodos para empregar o aparelho para distribuir as composições paraestruturas e/ou compartimentos específicos dentro de um ovo.
O volume apropriado da composição imunogênica a seradministrada dependerá do tamanho do ovo que está sendo tratado, com osovos de avestruz obviamente sendo capazes de ocupar mais volume do queos ovos de galinha. Nas modalidades particulares, a composiçãoimunogênica é administrada em um volume de cerca de 10 a cerca de 500,1000 ou 2000 μΙ ou mais, incluindo qualquer número entre 10 e 2000,mesmo se não explicitamente descrito neste documento, com os volumesilustrativos incluindo 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100, 125, 150, 175,200, 225, 250, 275, 300, 325, 350, 375, 400, 425, 450,475, 500, 525, 550, 575, 600, 626, 650, 675, 700, 725, 752, 775, 800, 850,900, 1000, 1100, 1200, 1300, 1400, 1500, 1600, 1700, 1800, 1900 ou 2000μl. Os outros volume adequados para a distribuição da composiçãoimunogênica podem ser prontamente determinados por aqueles versados natécnica.
De acordo com as modalidades particulares da presenteinvenção, os ovos (isto é, as aves embriônicas) administrados com acomposição imunogênica estão na última metade ou no último quarto daincubação em ovo (isto é, de desenvolvimento embriônico). Por exemplo,para os ovos de galinha, a última metade de incubação é a partir deaproximadamente o décimo segundo até o vigésimo dia de incubação (porexemplo, E12, E13, E14, E15, E16, E17, E17.5, E18, E18,5, E19, E19,5 e/ouE20), e o último quarto da incubação em ovo é a partir de aproximadamenteo décimo quinto até o vigésimo dia de incubação (por exemplo, E15, E15,5,E16, E16,5, E17, E17,5, E18, E18,5, E19 E19,5 e/ou E20). Nas modalidadesparticulares, o ovo é administrado com a composição imunogênica em tornodo décimo oitavo (E18 ou E18.5) ou décimo nono (E19 ou E19,5) dia deincubação em ovo. Em outras modalidades, os ovos de perua sãoadministrados com a composição imunogênica em torno do décimo quartoaté o vigésimo sétimo dia de incubação (E14, E15, E16, E17, E18, E19, E20,E21, E21.5, E22, E22,5, E23, E23,5, E24, E24,5, E25, E25,5, E26 e/ou E27),em torno do vigésimo primeiro até o vigésimo sétimo dia de incubação (porexemplo, E21, E21,5, E22, E22,5, E23, E23,5, E24, E24,5, E25, E25,2, E26,E26,5 e/ou E27), ou em torno do vigésimo quinto (E25 ou E25,5) dia deincubação. Aqueles versados na técnica apreciarão que a presente invençãopode ser realizada em qualquer tempo predeterminado em ovo, desde que aadministração resulte em uma resposta imune desejada à composiçãoimunogênica, sem níveis indevidos de morbidade e/ou mortalidade entre ospacientes tratados.
Alternativa ou adicionalmente, a invenção pode ser praticadapara administrar uma composição imunogênica a uma ave que saiu do ovo,incluindo as aves que saíram recentemente do ovo (isto é, aproximadamenteos primeiros um, dois e/ou três dias após a eclosão), adolescentes, e/ouadultas. Em certas modalidades, a administração é dentro aproximadamentedas primeiras seis, cinco, quatro, três e/ou duas semanas após a eclosãoe/ou mesmo dentro aproximadamente da primeira semana após a eclosão.De acordo com um aspecto da invenção, a administração é dentro dasprimeiras três semanas após a eclosão. Em outras modalidades, acomposição imunogênica é administrada em ovo (por exemplo, no primeiroquarto de incubação em ovo) e um reforço é administrado após a eclosão(por exemplo, dentro aproximadamente dos primeiros um, dois ou três diasou uma, duas ou três semanas após a eclosão).
Os métodos da invenção podem ser distinguidos dasabordagens de vacinação maternal, nas quais as aves fêmeas mais velhas(por exemplo, galinhas em torno de 10-15 semanas de idade) são vacinadaspara o propósito de proporcionar imunidade passiva a sua prole. Tais avesprovavelmente não são aves nunca antes tratadas, isto é, elas já tinham sidoexpostas ao Clostridium (por exemplo, Clostridium perfringens), e não estãosendo imunizadas para o propósito de proteger a ave vacinada, porém, emvez disso, para proteger a prole por transferência passiva de anticorpos.
As composições imunogênicas da presente invenção podem seradministradas às aves que saíram do ovo por quaisquer meios adequados.
Os meios ilustrativos são a administração oral (por exemplo, no alimento ouna água potável), a injeção intramuscular, a injeção subcutânea, a injeçãointravenosa, a injeção intra-abdominal, o colírio e/ou o spray nasal. Ademais,as aves podem ser administradas com as composições imunogênicas emuma caixa de pulverização, isto é, uma caixa na qual as aves são colocadase expostas a um vapor contendo vacina, ou por pulverização com via.
A invenção pode ser praticada para proteger uma ave da enteritenecrótica. Por "proteger", "protegendo" e "proteção" e termos similarespretende-se qualquer nível de proteção da enterite necrótica que seja dealgum benefício em uma população de pacientes, de modo tal que haja umaredução na incidência e/ou na gravidade da doença entre as aves tratadas,quer seja na forma de mortalidade diminuída, nas lesões diminuídas, nopeso do corpo aperfeiçoado, nas taxas de conversão de alimentosaperfeiçoadas, quer seja na redução de qualquer outro efeito prejudicial dadoença, independente de se a proteção é parcial ou completa. Aquelesversados na técnica entenderão que a proteção pode ser avaliada a partir deuma pluralidade de aves tratadas em comparação com as aves não tratadas,mesmo se as aves tratadas individuais não forem protegidas. Nasmodalidades particulares, a invenção proporciona um método de reduzir aincidência de enterite necrótica entre uma pluralidade de aves que sãoadministradas com as composições imunogênicas da invenção. Proporciona-se também um método de reduzir a morbidade e/ou a mortalidade entre umapluralidade de aves que são tratadas de acordo com a presente invenção.
Por "iniciar", "iniciado" ou "iniciando" (e suas variaçõesgramaticais), como usados aqui, pretende-se iniciar uma resposta imuneativa que é menos do que a protetora, até uma segunda dose (reforço) tersido dada em um tempo posterior após a eclosão.Por "reduzir", "reduzido", "reduzindo" e "redução" (e suasvariações gramaticais), como usados aqui, pretende-se uma diminuição noparâmetro indicado relacionado à infecção ou à doença (por exemplo,infecção, morbidade, mortalidade, incidência de enterite necrótica, lesões esimilares) que seja de algum valor ou benefício para o usuário (por exemplo,valor comercial), por exemplo, uma diminuição de pelo menos cerca de 20%,25%, 35%, 50%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 97% ou mais, em comparaçãocom as aves não tratadas.
A invenção também proporciona métodos de proteger as avesde infecção pela espécie de Clostridium, que resulta em qualquer nível deproteção que seja de algum benefício em uma população de pacientes, demodo tal que haja uma redução na incidência e/ou na gravidade da infecçãopor Clostridium entre as aves tratadas.
A invenção pode também ser praticada para induzir umaresposta imune ao Clostridium. Conforme usado neste documento, o termo"induzir" (ou suas variações gramaticais) uma resposta imune contra oClostridium é pretendido incluir agentes que induzam uma resposta imunecontra o organismo propriamente dito e/ou as toxinas produzidas peloorganismo, por meio de transferência passiva ou resposta imune ativa.Opcionalmente, a resposta imune que é induzida é uma resposta imuneprotetora, por exemplo, em métodos de vacinação. A proteção não érequerida se houver algum outro propósito para induzir a resposta imune,por exemplo, para propósitos de pesquisa ou para produzir anticorpo paraimunizações passivas ou como um reagente (por exemplo, para detectar,isolar e/ou identificar a espécie de Clostridium).
Conforme usado aqui, a não ser que de outro modo indicado, o"C. perfringens" é pretendido incluir o C. perfringens tipo A e/ou o C.perfringens tipo C e/ou qualquer outro tipo de C. perfringens que estejaimplicado na etiologia da enterite necrótica em aves. Nas modalidadesparticulares, a invenção proporciona métodos de proteger as aves dainfecção por C. perfringens tipo A e/ou C. perfringens tipo C. A invençãotambém proporciona métodos de induzir uma resposta imune contra o C.perfringens tipo A e/ou o C. perfringens tipo C. Os diferentes tipos de C.perfringens e as suas cepas são bastante conhecidos na técnica. Ver, porexemplo, AMERICAN ASSOCIATION OF AVIAN PATHOLOGISTS, ALABORATORY MANUAL FOR THE ISOLATION AND IDENTIFICATION OFPATHOGENS (3a ed. 1989).
O termo "dose imunizadora efetiva", como usado nestedocumento, a não ser que de outro modo indicado, significa uma dose dacomposição imunogênica suficiente para induzir uma resposta imuneprotetora nas aves tratadas, que é maior do que a imunidade inerente dasaves não imunizadas. No caso de aves tratadas em ovo, uma "doseimunizadora efetiva" indica uma dose suficiente para induzir uma respostaimune protetora nas aves que saíram dos ovos, que tenham sido tratadasem ovo, que é maior do que a imunidade inerente das aves que não foramimunizadas em ovo. Uma dose imunizadora efetiva em qualquer contextoparticular pode ser rotineiramente determinada usando métodos conhecidosna técnica.
Uma "dose imunizadora efetiva" pode compreender uma ou mais(por exemplo, duas ou três) doses da composição imunogênica, de modo aobter o nível desejado de proteção. As doses individuais podem seradministradas em ovo e/ou após a eclosão.
Conforme discutido acima, será aparente para aqueles versadosna técnica que, quando tratando uma pluralidade de aves (tal como naprodução de aves domésticas comerciais), a eficácia da dose e/ou dacomposição imunogênica pode ser estimada avaliando-se os efeitos davacinação sobre o bando como um todo. Em outras palavras, uma doseimunizadora efetiva ou uma vacina efetiva para o bando como um todo pode,contudo, não induzir uma resposta imune e/ou proporcionar proteçãosuficiente contra a doença nas aves individuais.
Os termos "vacinação" ou "imunização" são bem entendidos natécnica, e são usados de modo intercambiável neste documento. Porexemplo, os termos vacinação ou imunização podem ser entendidos seremum processo que aumenta a reação imune de um paciente ao antígeno(proporcionando uma resposta imune ativa) e, portanto, a sua capacidade deresistir, superar e/ou recuperar-se da infecção (isto é, uma resposta imuneprotetora).
Os termos "imunidade protetora" ou "resposta imune protetora",como usados neste documento, são pretendidos significar que o animalhospedeiro prepara uma resposta imune ativa à composição imunogênicae/ou que a composição imunogênica proporciona imunidade passiva, demodo tal que na exposição subseqüente ou em uma provocação, o animal écapaz de resistir ou superar a infecção e/ou a doença. Assim, uma respostaimune protetora diminuirá a incidência de morbidade e/ou mortalidade daexposição subseqüente ao patógeno entre as aves tratadas.
Uma "resposta imune ativa" ou "imunidade ativa" é caracterizadapor "participação dos tecidos e células dos hospedeiros após um encontrocom o imunógeno. Ela envolve a diferenciação e a proliferação das célulasimunocompetentes em tecidos linforreticulares, que resultam na síntese deanticorpo ou no desenvolvimento de reatividade mediada por células, ouambos." Herbert B. Herscowitz, lmmunophysiology: Cell Function andCellular Interactions in Antibody Formation, em IMMUNOLOGY: BASICPROCESSES 117 (Joseph A. Bellanti ed., 1985). Estabelecido de modoalternativo, uma resposta imune ativa é preparada pelo hospedeiro apósexposição aos imunógenos por infecção ou por vacinação. A imunidade ativapode ser contrastada com a imunidade passiva, que é adquirida através da"transferência de substâncias pré-formadas (anticorpo, fator de transferência,enxerto tímico, interleucina-2) de um hospedeiro ativamente imunizado paraum hospedeiro não-imune." Id.
Os modelos de enterite necrótica (NE) para avaliar a eficácia dasvacinas e das estratégias de vacinação são conhecidos na técnica. Porexemplo, Hofacre e outros (2003, J. Appl Poult. Res. 12:60-64)descreveram um modelo no qual as galinhas eram alimentadas com umadieta de milho soja com 26% de farinha de peixe a partir do dia 0 até o dia14 após a eclosão. A farinha de peixe foi removida da dieta no dia 14. Asaves foram provocadas com coccídios por gavagem oral no dia 14, entãodiariamente a partir dos dias 17-19 com C. perfringens por gavagem oral. Arazão de conversão do alimento, o peso do corpo e a pontuação das lesõesdo intestino foram usados para avaliar a presença e a gravidade da enteritenecrótica nas aves provocadas. As lesões de NE foram avaliadas no dia 22ou no dia 28, usando uma escala de O = nenhuma, 1 = branda, 2 =moderada e 3 = acentuada/grave. Outros modelos podem ser usados paraavaliar a eficácia da vacina e os regimes de vacina, como conhecidos natécnica. Em certas modalidades da presente invenção, a administração deuma composição desta invenção (por exemplo, uma quantidade efetiva deuma composição desta invenção) pode resultar em uma redução deaproximadamente 5, 10, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 60, 70, 75, 80, 90, ou100% nas lesões do intestino e/ou na alteração no peso do corpo nosanimais deste modelo ou de outro modelo conhecido ou aceito na técnica,em comparação com os animais não imunizados ou de controle.
Nas modalidades adicionais desta invenção, as composições eos métodos desta invenção podem ser usados para induzir uma resposta deanticorpo nas aves que é pelo menos maior do que, ou igual a, cerca de 0,5unidade de antitoxina/mL (por exemplo, pelo menos cerca de 0,5, 1,0, 1,5,2,0, 2,5, 3,0, 3,5, 4,0, 4,5, 5,0,5,5, 6,0, 6,5, 7,0, 7,5, 8,0, 8,5, 9,0, 9,5 ou 10 A.U. de anticorpo antitoxina porml de anti-soros da ave).
Nas modalidades adicionais onde as composições e os métodosdesta invenção são empregados, a porcentagem de ovos de uma populaçãode ovos nos quais uma composição desta invenção é distribuída para ocorpo do embrião pode ser de cerca de 70% a cerca de 100% (por exemplo,70, 71, 72, 73, 74, 75, 76, 77, 78, 79, 80, 81, 82, 83, 84, 85, 86, 87, 88, 89,90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98, 99 ou 100%) do número total de ovos napopulação de ovos aos quais a composição é administrada.
A presente invenção também inclui as composiçõesimunogênicas que induzem uma resposta imune ativa e/ou passiva contra C.perfringens (incluindo os tipos A e/ou C), e que opcionalmente podem serusadas para proteger uma ave contra a infecção por C. perfringens e/oupara proteger contra a enterite necrótica, conforme descrito em mais detalheabaixo.
As composições imunogênicas da invenção compreendem,consistem essencialmente em, e/ou consistem em (um) agente(s) queinduz(em) uma resposta imune contra o Clostridium. O agente imune deClostridium pode ser um antígeno replicador e/ou um antígeno nãoreplicador. Os antígenos replicadores e não replicadores desta invençãopodem ser distribuídos em ovo para o âmnio, para o embrião e/ou paraambos o âmnio e o embrião.
Além disso, as composições imunogênicas da invençãocompreendem, consistem essencialmente em, ou consistem em, uma doseimunizadora efetiva de um agente imunizador de Clostridium em um veículofarmaceuticamente aceitável. Nas modalidades representativas, acomposição imunogênica pode ser formulada com toxóides e/ou bacterinasde Clostridium. De acordo com esta modalidade, a composição imunogênicaopcional e adicionalmente compreende um adjuvante (ver abaixo). Ostoxóides são toxinas inativadas, e podem ser derivados de toxinas deClostridium, incluindo aquelas derivadas de C. perfringens, incluindo a toxinaalfa, a toxina beta, a toxina beta 2, a enterotoxina, a toxina epsilon, a toxinaiota, a toxina capa, a toxina lambda, e/ou a toxina teta; aquelas derivadas deC. sordellii, incluindo a toxina hemorrágica e/ou a toxina letal; aquelasderivadas de C. difficile, incluindo a toxina A (enterotoxina) e a toxina B(toxina citopática); aquelas derivadas de C. septicum, incluindo a toxina alfa;aquelas derivadas de C. novyl, incluindo a toxina alfa e/ou a toxina beta;e/ou aquelas derivadas de C. botulinum, incluindo a toxina tipo C. Osmétodos de produzir os toxóides são conhecidos na técnica e incluem, porexemplo, o tratamento da toxina com formaldeído ou calor (ver, por exemplo,Walker, (1992) Vaccine 10:977-990). As bacterinas são componentescelulares bacterianos e podem ser derivadas de uma espécie de Clostridium,tal como, por exemplo, a partir de C. perfringens tipos A e/ou C. perfringenstipo C. As vacinas de toxóides de C. perfringens são conhecidas na técnica(ver, por exemplo, a Patente U.S. N2 4.292.306 para Zemlyakova).Em outras modalidades, a composição imunogênicacompreende, consiste essencialmente em, ou consiste em, uma bactéria deClostridium (isto é, uma bacterina) morta (isto é, não replicadora),opcionalmente em uma emulsão de água em óleo em água (ver, porexemplo, a Patente U.S. N2 5.817.320 para Stone, que descreve aimunização em ovo de embriões aviários com vacinas em emulsão de óleo,cujos conteúdos inteiros são incorporados por referência neste documento),e/ou um veículo farmaceuticamente aceitável. Em outras modalidades, acomposição imunogênica compreende, consiste essencialmente em, ouconsiste em, Clostridium morto e um adjuvante (por exemplo, um adjuvantederivado de alumínio, tal como o hidróxido de alumínio, uma saponina, talcomo Quil-A, incluindo QuiIA QS21, ou um óleo, tal como de Freundcompleto ou incompleto), opcionalmente em uma emulsão de água em óleoem água e/ou um veículo farmaceuticamente aceitável.
Como uma alternativa adicional, a composição imunogênicacompreende, consiste essencialmente em, ou consiste em, um agente imunereplicador de Clostridium, por exemplo, C. perfringens vivo, o qual égeralmente um C. perfringens atenuado (isto é, com virulência reduzida) vivo.(Ver, por exemplo, a Publicação PCT N- PCT WO 2005/053737, cujosconteúdos inteiros são incorporados por referência neste documento, quantoaos ensinamentos sobre a produção de bactérias atenuadas vivas para usoem vacina.) Os métodos de produzir bactérias atenuadas são conhecidos natécnica e incluem, sem limitação: irradiação, tratamento químico, passagemem série em cultura, e similares. Em certas modalidades da invenção, asbactérias de Clostridium vivas (por exemplo, C. perfringens) sãoadministradas na presença de um agente que protege o paciente dos efeitospatológicos do organismo, por exemplo, através de co-administração de umfator neutralizador, como descrito na Patente U.S. N2 6.440.408 para Thomae outros, ou do interferon, como descrito na Patente U.S. N2 6.506.385 paraPoston e outros Opcionalmente, o Clostridium e o fator neutralizador e/ou ointerferon são administrados na mesma formulação.Os exemplos adicionais de composições imunogênicas incluemas composições imunogênicas compreendendo, consistindo essencialmenteem, ou consistindo em, antitoxinas (isto é, anticorpos que proporcionamimunidade passiva contra as toxinas alfa e/ou beta de Clostridiurrr, ver, porexemplo, a Patente U.S. N° 6.719.267 para Carroll e outros), peptídeosantigênicos que induzem uma resposta imune contra o Clostridium (incluindoas toxinas de C. perfringens-, ver, por exemplo, as Patentes U.S. N—5.817.317 e 5.851.827 para Titball e outros; a Patente U.S. N2 6.610.300para Segers e outros; a Patente U.S. N° 5.695.956 para McCIane e outros),e vacinas recombinantes que compreendem um ácido nucléico veículo (porexemplo, um plasmídio ou vírus) que libera um ácido nucléico codificando(um) peptídeo(s) ou proteína(s) antigênico(s) que induz(em) uma respostaimune contra o Clostridium.
Nas modalidades representativas, a composição imunogênicacompreende, consiste essencialmente em, ou consiste em, uma toxina alfae/ou beta recombinante de Clostridium, por exemplo, as toxinas alfa tendo aseqüência de aminoácidos como mostrada em SEQ ID NO:2 [seqüência detamanho natural de 370 aminoácidos; N° de Acesso do GenBank 1GYGB(Gl:21730290), cuja seqüência de codificação é proporcionada nestedocumento como SEQ ID NO:1], SEQ ID NO:4 (Cpa247-370; aminoácidos247-370 de SEQ ID NO:2; cuja seqüência de codificação é proporcionadaneste documento como SEQ ID NO:3), SÉQ ID NO:6 (aminoácidos 1-278 deSEQ ID NO:2; cuja seqüência de codificação é proporcionada nestedocumento como SEQ ID NO:5), SEQ ID NO:8 (Cpa247-370; aminoácidos261-300 de SEQ ID NO:2, cuja seqüência de codificação é proporcionadaneste documento como SEQ ID NO:7), conforme descrita neste documentoe/ou, por exemplo, nas Patentes U.S. N- 5.817.317 e 5.851.827 para Titballe outros, ou SEQ ID NO: 10 [seqüência de tamanho natural de 398aminoácidos, cuja seqüência de codificação é proporcionada nestedocumento como SEQ ID NO:9]. Em algumas modalidades, a toxina dapresente invenção é uma composição imunogênica compreendendo osaminoácidos 1-278 (SEQ ID NO:6) da seqüência de 370 aminoácidos (SEQID N0:2) da toxina alfa de C. perfringens.
Os exemplos adicionais de toxinas (incluindo os seusfragmentos imunogênicos) que podem ser usadas nas composições e nosmétodos desta invenção incluem, porém não estão limitados às, toxinas deC. perfringens [por exemplo, toxina alfa, Número de acesso CAA35186(Saint-Joanis e outros Mol. Gen. Genet. 219(3):453-460 (1989)0; toxina beta,Número de acesso CAA58246 (Steinthorsdottir e outros FEMS Microbiol.Lett. 130(2-3):273-278 (1995)); toxina beta 2, Número de acesso NP_150010(Shimizu e outros Proc. NatL Acad. Sei. U.S.A. 99(2):996-1001 (2002));enterotoxina, Número de acesso BAE79112 (Miyamoto e outros J. Bacteriol.188(4):1585-1598 (2006)); toxina epsilon, Número de acesso AAA23236(Havard e outros FEMS Microbiol. Lett. 97:77-82 (1992); toxina iota, Númerode acesso CAA51959 (Perelle e outros Infect. Immun. 61(12):5147-5156(1993)); toxina capa, Número de acesso NP_561089, Shimizu e outros Proc.NatL Acad. Sei. U.S.A. 99(2):996-1001 (2002)); toxina lambda, Número deacesso CAA35187 (Saint-Joanis e outros Mol. Gen. Genet. 219(3):453-460(1989)); e toxina teta, Número de acesso NP_561079 (Shimizu e outros Proc.Natl. Acad. Sci U.S.A. 99(2):996-1001 (2002))], toxinas de C. difficile [porexemplo, toxina A, Número de acesso A37052 (Wren e outros FEMSMicrobiol. Lett 70:1 -6(1990)); e toxina B, Número de acesso CAA43299 (vonEichel-Streiber e outros Mol. Gen. Genet. 233(1-2): 260-268 (1992))], toxinasde C. septicum [toxina alfa, Número de acesso AAB32892 (Ballard e outrosInfect. Immun. 63(1):340-344 (1995))] e toxinas de C. novyi [por exemplo,toxina alfa, Número de acesso AAB27213 (Bali e outros Infect. Immun.61 (7):2912-2918 (1993))].
Os termos "toxina" "toxina alfa", "toxina beta", "toxina epsilon"(ou um termo similar), etc., como usados neste documento, incluem a toxinade tamanho natural, bem como os peptídeos antigênicos ou imunogênicosou as variantes antigênicas ou imunogênicas (por exemplo, atenuadas)deles que induzem uma resposta imune (opcionalmente, uma respostaimune protetora) contra o Clostridium no paciente. Nas modalidadesparticulares, um peptídeo antigênico compreende pelo menos cerca de 6, 8,10, 12, 15, 18, 20, 25, 30, 50, 75 ou 100 ou mais aminoácidos contíguos datoxina de tamanho natural (ver, por exemplo, a seqüência da toxina alfa detamanho natural, como mostrada em SEQ ID NO;2 nas Patentes U.S. N—5.817.317 e 5.851.827 e em SEQ ID NO:2 neste documento).
Entende-se também que os fragmentos imunogênicos destainvenção podem ser combinados em qualquer ordem ou quantidade. Porexemplo, o fragmento 1-10 pode ser combinado com o fragmento 10-20 paraproduzir um fragmento de aminoácidos 1-20. Como um outro exemplo, ofragmento 1-20 pode ser combinado com o fragmento 50-60 para produzirum único fragmento desta invenção tendo 31 aminoácidos (AA 10-20 e AA50-60). Também os fragmentos podem estar presentes em númerosmúltiplos e em qualquer combinação em um fragmento desta invenção.Assim, por exemplo, o fragmento 1-150 pode ser combinado com umsegundo fragmento 1-150 e/ou combinado com o fragmento 400-500 paraproduzir um fragmento desta invenção.
Em algumas modalidades, um fragmento antigênico ouimunogênico de uma toxina de Clostridium desta invenção podecompreender o, consistir essencialmente no, e/ou consistir no, domínioamino terminal da toxina alfa de C. perfringens (aminoácidos 1-246 de SEQID NO:2), domínio carbóxi terminal da toxina alfa de C. perfringens(aminoácidos 256-370 de SEQ ID NO:2) e/ou fragmento entre estesdomínios (aminoácidos 247-255 de SEQ ID NO:2) em qualquer combinaçãoe com qualquer quantidade de sobreposição na seqüência de aminoácidosque resulta em um fragmento tendo atividade imunogênica. Esta linguagemé pretendida incluir todos os peptídeos e fragmentos de toxina possíveis,como se explicitamente descrito neste documento (por exemplo, qualquerpeptídeo ou fragmento compreendendo pelo menos cerca de 6, 8, 10, 12, 15,18, 20, 25, 30, 50, 75 ou 100 ou mais aminoácidos contíguos da seqüênciada toxina alfa de tamanho natural, como mostrada em SEQ ID NO;2 nas30 Patentes U.S. N- 5.817.317 e 5.851.827 e em SEQ ID NO:2 e SEQ IDNO: 10 neste documento). Nas modalidades particulares, o peptídeoantigênico não tem uma seqüência de aminoácidos tendo atividade dehidrolisar a fosfolipase C e/ou a esfingomielina (por exemplo, um peptídeode toxina alfa antigênico pode não ter os aminoácidos 1-240). A posição dealguns epítopos da toxina alfa de C. perfringens foi determinada (ver, porexemplo, Logan e outros, (1992) Infection and Immunity 59:4338-4382,cujos conteúdos inteiros são incorporados por referência quanto aosensinamentos dos epítopos da toxina alfa).
Os exemplos adicionais de toxinas recombinantes de Clostridiumque podem ser empregadas nos métodos desta invenção incluem, porémnão estão limitados a, uma toxina beta de Clostridium perfringens ou um seufragmento imunogênico, onde a toxina beta tem a seqüência de aminoácidoscomo descrita em SEQ ID NO:11. A toxina beta de SEQ ID NO:11 podeadicionalmente compreender uma mutação no aminoácido 62, 182, 197 ouem uma das regiões entre os números de aminoácidos 80-103, 145-147,281-291, 295-299 ou a jusante da posição do aminoácido 292 (comodescrito na Patente U.S. N2 6.610.300, cujos conteúdos inteiros sãoincorporados por referência neste documento), pelo que a toxina resultanteou o seu fragmento tem atividade imunogênica.
As seqüências de ácidos nucléicos e de aminoácidos dastoxinas alfa e beta de C. perfringens são conhecidas na técnica, ver, porexemplo, os N- de Acesso do GenBank DQ202275; NP_560952;NC_003366; AY823400; AY277724; AF204209; X17300; X13608; L43548;L43547; L77965 e L13198. Ver também, Sheedy e outros, Highly ConservedAlpha-Toxin Sequences of Avian Isolates of Clostridium perfringens, J. Clin.Microbioi 42:1345-1347 (2004), que apresenta uma análise das seqüênciasda toxina alfa de 25 cepas de C. perfringens derivadas de galinhas.
Nas modalidades adicionais desta invenção, a toxina deClostridium pode ser uma toxina epsilon (ε) de C. perfringens, tendo umaseqüência de aminoácidos como descrita em SEQ ID NO:12 (328aminoácidos; ou SEQ ID NO: 13. Nas modalidades adicionais, a toxina εpode compreender a seqüência de aminoácidos de SEQ ID NO:13, onde oresíduo 2 é uma prolina, como descrito na Patente U.S. N2 6.403.094, cujosconteúdos inteiros são incorporados por referência neste documento.Em certas modalidades, a presente invenção proporciona ummétodo de imunizar um paciente aviário contra a infecção por Clostridium,compreendendo administrar ao paciente aviário uma dose imunizadoraefetiva de uma composição de bacterina-toxóide de Clostridium por injeçãoem ovo durante o quarto final de incubação. Os métodos desta invençãopodem adicionalmente compreender a etapa de administrar uma dose dereforço da composição de bacterina-toxóide de Clostridium ao pacienteaviário, após a eclosão. A espécie de Clostridium desta invenção pode incluir,porém não está limitada ao Clostridium perfringens. Nas modalidadesparticulares desta invenção, a composição pode compreender uma vacinaVision CD®. Nas modalidades particulares onde o paciente for uma galinha,a composição de bacterina-toxóide pode ser administrada ao fluidoamniótico via uma agulha de 20g, 2,54 centímetros (1 polegada), no dia 18de incubação, ou uma agulha de 22g, 2,54 centímetros (1 polegada), no dia18 de incubação.
Nas modalidades adicionais desta invenção, proporcionam-semétodos de imunizar um paciente aviário contra a infecção por Clostridium,compreendendo administrar ao paciente aviário uma dose imunizadoraefetiva de uma toxina recombinante, ou fragmento imunogênico dela, deClostridium por injeção em ovo, durante o quarto final de incubação. Emalgumas modalidades, estes métodos podem adicionalmente compreender aetapa de administrar uma dose de reforço da toxina recombinante, ou de seufragmento imunogênico, ao paciente aviário, após a eclosão. Nasmodalidades particulares, a composição empregada nestes métodos podecompreender um adjuvante, o qual pode ser o Quil Aeo adjuvante deFreund incompleto. Nas modalidades onde o paciente for uma galinha, acomposição de bacterina-toxóide pode ser administrada ao corpo doembrião via uma agulha de 23g, 3,175 centímetros (1,25 polegada), duranteo dia 19 de incubação.
Ainda em modalidades adicionais, quando o paciente for umagalinha, uma toxina ou o seu fragmento imunogênico desta invenção podeser administrado ao corpo do embrião via uma agulha de 20 g, 3,81centímetros (1,5 polegada), durante o dia 19 de incubação. Também, a faixade dosagens de uma toxina (por exemplo, uma toxina alfa) ou seu fragmentoe/ou outra proteína ou glicoproteína de subunidade ou outro tipo de moléculabiológica usada como uma vacina desta invenção pode ser de cerca de 1 μga cerca de 1000 μg por dose, com uma faixa ilustrativa de cerca de 55 μg acerca de 60 μg por dose. Para as composições desta invençãocompreendendo vírus inativado, a concentração de vírus por dose pode sercerca de 103 EID5o/TCID5o a cerca de 1012 EID5o/TCID5o (EID = doseinfecciosa do ovo; TCID = dose infecciosa da cultura de tecido). Nasmodalidades que compreendem vírus ativado, a concentração de vírus pordose pode ser cerca de 10o·1 EID5o/TCID5oa cerca de 1012 EID5o/TCID5o. Nasmodalidades particulares desta invenção, a toxina desta invençãocompreende a, consiste essencialmente na, e/ou consiste na, seqüência deaminoácidos de SEQ ID NO:2, 4, 6, 8 ou 10, incluindo qualquer combinaçãodestas.
Conforme contemplado neste documento, em algumasmodalidades da presente invenção, a composição desta invençãoadicionalmente compreende um adjuvante, o qual, nas modalidadesparticulares, pode ser um adjuvante tal como um adjuvante derivado dealumínio (por exemplo, o hidróxido de alumínio), uma saponina (por exemplo,Quil-A, incluindo QuiIA QS21), ou um óleo (tal como o adjuvante de FreundCompleto ou Incompleto), em qualquer combinação. Os exemplos adicionaisde adjuvantes que podem ser empregados em quaisquer dos métodos dasinvenções descritas neste documento são proporcionados aqui.
Nas modalidades representativas, a composição imunogênicadesta invenção compreende, consiste em, ou consiste essencialmente em,uma enterotoxina de C. perfringens (CPE), toxina beta-2, toxina epsilon,toxina capa, toxina lambda, toxina teta, e/ou toxina iota, opcionalmente alémde uma toxina alfa e/ou beta de C. perfringens.
Em outras modalidades ilustrativas, a composição imunogênicacompreende, consiste essencialmente em, ou consiste em, um toxóide outoxóide/bacterina. A bacterina pode ser uma bacterina de C. perfringens tipoA e/ou tipo C. Por exemplo, uma composição imunogênica ilustrativacompreende, consiste essencialmente em, ou consiste em, um toxóide alfa euma bacterina de C. perfringens tipo A. Opcionalmente, a composiçãoimunogênica adicionalmente compreende um adjuvante, tal como umadjuvante derivado de alumínio (por exemplo, o hidróxido de alumínio), umasaponina (por exemplo, Quil-A, incluindo QuiIA QS21), ou um óleo (tal comoo adjuvante de Freund Completo ou Incompleto).
Uma composição imunogênica representativa da invençãocompreende, consiste essencialmente em, ou consiste em, uma doseimunizadora efetiva de um agente imunizador de C. perfringens em umaemulsão de água em óleo em água (ver, por exemplo, a Patente U.S. N25.817.320 para Stone), opcionalmente em um veículo farmaceuticamenteaceitável.
A composição imunogênica pode opcionalmente compreenderdois ou mais agentes que induzam uma resposta imune contra o C.perfringens (por exemplo, qualquer combinação dos agentes descritosacima).
Nas modalidades particulares, o agente que induz uma respostaimune contra C. perfringens (por exemplo, um toxóide, bacterina, C.perfringens atenuado, e/ou toxina e similar) é uma cepa de C. perfringensderivada de ave, opcionalmente uma derivada de galinha.
Conforme usado aqui, o termo "consiste essencialmente em" (eas variantes gramaticais) significa que a composição imunogênica nãocompreende nenhum outro agente imunogênico material diferente dosagentes indicados. O termo "consiste essencialmente em" não exclui apresença de outros componentes, tais como adjuvantes, imunomoduladores,e similares.
Por "farmaceuticamente aceitável" pretende-se um material quenão seja biologicamente, ou de outro modo, indesejável, isto é, o materialpode ser administrado a um paciente sem causar efeitos biológicosindesejáveis apreciáveis. Assim, tal composição farmacêutica pode serusada, por exemplo, para preparar composições para imunização. Osveículos fisiológica e farmaceuticamente aceitáveis podem conter outroscompostos, incluindo, porém não limitados aos estabilizantes, sais, tampões,adjuvantes e/ou conservantes (por exemplo, agentes antibacterianos,antifúngicos e antivirais), como são conhecidos na técnica. O veículofarmaceuticamente aceitável não necessita ser estéril, embora elegeralmente seja para a administração em ovo aos embriões aviários.
Nas modalidades particulares, a composição imunogênicaadicionalmente compreende um estimulante imune. Alternativamente, oestimulante imune pode ser administrado ao paciente em uma formulaçãoseparada. Os estimulantes imunes que podem ser usados nos presentesmétodos incluem, porém não estão limitados às, citocinas, fatores docrescimento, quimiocinas, sobrenadantes de culturas de células de linfócitos,monócitos, ou células de órgãos linfóides, preparações de células ouextratos de células (por exemplo, preparações fixas de Staphylococcusaureus ou lipopolissacarídeos), mitógenos, ou adjuvantes, incluindo assubstâncias farmacêuticas de baixo peso molecular. Os estimulantes imunespodem ser administrados em ovo em qualquer tempo durante a incubação.Opcionalmente, o estimulante imune e o agente que induz uma respostaimune contra o C. perfringens são administrados concorrentemente, demodo opcional na mesma formulação.
Conforme usada aqui, a palavra "concorrentemente" significasuficientemente próximo no tempo para produzir um efeito combinado (ouseja, concorrentemente pode ser simultaneamente, ou pode ser dois ou maiseventos ocorrendo dentro de um curto período de tempo antes e/ou depoisum do outro).
Qualquer adjuvante de vacina adequado pode ser usado deacordo com a presente invenção, incluindo os imunoestimulantes químicos ede polipeptídeos que aumentam a resposta do sistema imune aos antígenos.Os adjuvantes incluem, porém não estão limitados a um adjuvante derivadode alumínio (por exemplo, o hidróxido de alumínio), um fosfato de alumínio,óleos vegetais e animais (por exemplo, de Freund Incompleto ou completo),saponina (por exemplo, Quil-A, incluindo QuiIA QS21), Spur® (Intervet), esimilares. Os adjuvantes representativos desta invenção incluem, porém nãoestão limitados a um sal de alumínio, tal como o gel de hidróxido de alumínio(alume), fosfato de alumínio, ou algamulina, porém podem também ser umsal ou géis minerais de cálcio, magnésio, ferro ou zinco, ou podem ser umasuspensão insolúvel de tirosina acilada, ou açúcares acilados,polissacarídeos catiônica ou anionicamente derivados, ou polifosfazenos, ousaponinas, tais como Quil-A, ou emulsões de óleos, tais como água em óleoe água em óleo em água ou de Freund completo ou incompleto ou qualquercombinação destes.
A composição imunogênica pode opcionalmente conter um oumais estabilizantes. Qualquer estabilizante adequado pode ser usado,incluindo os carboidratos, tais como o sorbitol, o manitol, o amido, asacarose, a dextrina, ou a glicose; as proteínas, tais como a albumina ou acaseína; e os tampões, tais como o fosfato de metal alcalino e similar.
É freqüentemente conveniente imunizar uma ave contra doençasmúltiplas em um único curso de tratamento. Assim, nas modalidadesparticulares, a composição imunogênica compreende um ou mais agentesadicionais que induzem uma resposta imune contra outros patógenosaviários (por exemplo, virais, bacterianos ou fúngicos), opcionalmenteagentes imunizadores que produzem uma resposta imune protetora. Porexemplo, a composição imunogênica pode adicionalmente compreender umagente imunizador contra a coccidiose (isto é, Eimeriá), a doença bursalinfecciosa, a doença de Marek, a doença de Newcastle, a influenza aviária, avaríola aviária, o reovírus aviário, o metapneumovírus aviário, o adenovírusaviário, a bronquite infecciosa, a Salmonella spp., o Camplyobacter spp., aPasteurella spp., o Hemophilus paragallinarum e/ou o Mycoplasma spp. Asvacinas aviárias adequadas para uso em ovo ou após a eclosão sãoconhecidas na técnica e estão comercialmente disponíveis (por exemplo, avacina Bursaplex® para a doença bursal; a vacina Newplex® para a doençade Newcastle, e a vacina Inovocox® para a coccidiose, todas disponíveis daEmbrex, Inc., e a vacina HVT-SB-1 de Marek para a doença de Marek,disponível da Merial). As composições imunogênicas que compreendemagentes de vacina tanto contra a coccidiose (isto é, Eimeria) quanto contra aenterite necrótica (isto é, C. perfringens) são particularmente vantajosasporque a exposição à Eimeria é sabida aumentar a suscetibilidade das avesà enterite necrótica por perturbação do meio gastrointestinal.
Assim, como um aspecto adicional, a invenção inclui métodos deco-administrar uma composição imunogênica que compreende, consisteessencialmente em, ou consiste em, uma dose imunizadora efetiva de umagente imunizador de C. perfringens e uma dose imunizadora efetiva de umagente imunizador que proporciona proteção contra uma ou mais outrasdoenças aviárias (como descritas acima). Os agentes imunizadores múltiplospodem ser proporcionados em uma única formulação ou podem seradministrados simultânea ou seqüencialmente em qualquer ordem emformulações separadas. Conforme discutido acima, este aspecto dainvenção é particularmente adequado para a co-administração de vacinas decoccidiose e enterite necrótica.
Em uma outra modalidade representativa, o paciente aviário éprimeiramente imunizado contra a enterite necrótica e é então imunizadocontra a coccidiose ou vice-versa. Ambas as imunizações podem ocorrer emovo, ambas podem ocorrer após a eclosão, ou uma pode ser em ovo e umaapós a eclosão. Por exemplo, em uma modalidade ilustrativa, o pacienteaviário é imunizado contra a coccidiose em ovo e então é imunizado contra eenterite necrótica após a eclosão.
A invenção pode também ser praticada para administrar umagente imunizador de C. perfringens em ovo ou após a eclosão emconjunção com a "alimentação em ovo" (ver a Patente U.S. N2 6.592.878;incorporada por referência neste documento em sua totalidade) do pacienteaviário. Por exemplo, de acordo com certas modalidades, um agenteimunizador de C. perfringens e uma formulação nutriente e/ou moduladorentérico são administrados a um paciente aviário em ovo, opcionalmente pordistribuição para o âmnio. Opcionalmente, as vacinas contra outros agentesinfecciosos são administradas em ovo e/ou após a eclosão também(conforme descrito acima). O agente imunizador de C. perfringens e aformulação nutriente e/ou o modulador entérico podem ser administradossimultaneamente, na mesma composição ou em composições separadas,e/ou podem ser administrados seqüencialmente em qualquer ordem.
As modalidades adicionais da presente invenção podem incluiruma composição compreendendo um antígeno selecionado a partir do grupoque consiste em um toxóide alfa de C. perfringens, um fragmento antigênicode um toxóide alfa de C. perfringens, um fragmento antigênico inativo deuma toxina alfa de C. perfringens, e qualquer combinação destes; onde umaou mais doses de cerca de 0,1 a cerca de 1,0 ml_ (por exemplo, 0,1, 0,2, 0,3,0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, ou 1,0) por dose da composição são suficientespara induzir pelo menos 0,5 unidade antitoxina (A.U.) de anticorpo antitoxinaalfa por ml_ de anti-soros de uma ave (por exemplo, a galinha) vacinada coma vacina. Em algumas modalidades, a composição pode induzir pelo menoscerca de 0,5, 1,0, 1,5, 2,0, 2,5, 3,0, 3,5, 4,0, 4,5, 5,0, 5,5, 6,0, 6,5, 7,0, 7,5,8,0, 8,5, 9,0, 9,5 ou 10 A.U. de anticorpo antitoxina por ml_ de anti-soros daave.
Conforme usada neste documento, uma "unidade antitoxina" ou"A.U." de anticorpo antitoxina por ml_ de anti-soros (que pode ser usada demodo intercambiável com unidades de "Teste de Neutralização Antitoxina"ou unidades de "TNT") é definida pela capacidade dos soros de neutralizaros efeitos tóxicos de uma toxina em um bioensaio de camundongo. Nesteteste, uma quantidade conhecida de toxina, estabelecida pelos padrõesinternacionais como são conhecidos na técnica, é misturada com diluiçõesem série de soro de animais vacinados. A mistura é incubada uma hora natemperatura ambiente e então injetada intravenosamente nos camundongos.Os camundongos sobreviverão se a toxina for completamente neutralizadapelos soros, de outro modo eles morrem. As unidades antitoxina ou o título édeterminado como a recíproca da maior diluição de soros que neutralizou atoxina.
Nas modalidades adicionais, a composição pode compreenderum antígeno em uma preparação sem células. Em outras modalidades, oantígeno pode ser um toxóide alfa em um sobrenadante de toxóide alfa de C.perfringens. Em certas modalidades, a composição pode compreender,consistir essencialmente em, e/ou consistir em, um antígeno que pode serum toxóide alfa de C. perfringens Tipo A e/ou um toxóide alfa de C.perfringens Tipo C. Em algumas modalidades, a composição desta invençãopode compreender a toxina beta de C. perfringens, a toxina beta 2 de C.perfringens, a enterotoxina de C. perfringens, a toxina epsilon de C.perfringens, a toxina iota de C. perfringens, a toxina capa de C. perfringens,a toxina Iambda de C. perfringens, a toxina teta de C. perfringens, a toxinahemorrágica de C. sordelli, a toxina letal de C. sordeilii, a toxina A de C.difficiie, a toxina B de C. difficile, a toxina alfa de C. septicum, a toxina alfade C. novyi, a toxina beta de C. novyi e/ou qualquer combinação destas. Talcomposição pode adicionalmente compreender, consistir essencialmente em,e/ou consistir em, um ou mais antígenos virais, um ou mais antígenosbacterianos, e/ou um ou mais antígenos parasíticos, como descritos nestedocumento.
A presente invenção é explicada adicionalmente nos exemplosnão Iimitativos a seguir. Nestes Exemplos, "μΙ_" significa microlitros, >g"significa microgramas, "mL" significa mililitros, "cm3" significa centímetroscúbicos, "mm" significa milímetros, "mM" significa concentração emmilimoles, "mg" significa miligramas, "SC" significa graus Celsius e E18 e E19significam os dias de embrionização 18 e 19, respectivamente.
EXEMPLOS
Exemplo I. Resposta imune após vacinação em ovo com as vacinas deClostridium perfringens Tipos CeD (Siteguard G e Vision CD).
Projeto Experimental
Os ovos com os pintos foram injetados em ovo manualmentecom as vacinas comercialmente disponíveis de toxóide (Siteguard®) e debacterina-toxóide (vacina Vision® CD®) de Ciostridium perfringens. As avesque saíram dos ovos foram desenvolvidas para medir as respostas dosanticorpos. A avaliação do local da injeção foi efetuada. No dia O (eclosão),os grupos de tratamento de seleção receberam uma vacinação após aeclosão. Todas as aves foram alojadas em gaiolas (5 aves/gaiola). Cadagaiola foi suprida com uma dieta de Normal Broiler Starter (Primeiro Prato deuma Refeição Normal para Pintos). No dia 14, as aves foram trocadas paraBroiler Grower Feed (Alimento para o Desenvolvimento dos Pintos). As avesforam sangradas e o soro foi testado quanto a uma resposta do anticorpopelo ensaio de neutralização da toxina pelo soro.Materiais e MétodosMaterial de Injeção (Siteguard® G):
O Siteguard® G (adjuvante desconhecido) é uma vacina detoxóides de C. perfringens tipos C e D, produzida pela Schering-Plough. Elaprotege as ovelhas e o gado de doenças causadas pelas toxinas dos tipos Ce D. Para a vacinação, 4,0 mL (gado) ou 2,0 mL (ovelhas) da vacina sãoadministrados subcutaneamente (SQ) ou intramuscularmente (IM). Asvacinações de reforço são administradas três a quatro semanas após avacinação inicial e anualmente.
Material de Injeção (Vision® CD®):
A Vision® CD® (com o adjuvante patenteado 'Spur®') é umavacina de bacterina-toxóide de C. perfringens tipos CeD, produzida pelaIntervet. Ela protege o gado, as ovelhas, e as cabras da enterotoxemiacausada por C. perfringens tipos CeD. Para a vacinação, 2,0 mL da vacinasão administrados subcutaneamente ao animal (gado, ovelhas, ou cabras).Três a quatro semanas após a vacinação inicial, o animal recebe uns 2,0 ml(SQ) adicionais e é vacinado de novo anualmente após isso.
Protocolo de Injeção:
No E19, os ovos com os pintos foram injetados com os materiaisde teste alvejando o fluido amniótico ou o corpo do embrião de cada ovo.Além disso, no dia 0 após a eclosão, alguns grupos de tratamento injetadosem ovo e não injetados em ovo receberam uma vacinação ou imunização dereforço dos materiais de teste. Para a vacinação ou a imunização de reforçoapós a eclosão, 0,5 mL de vacina foi administrado por injeção subcutânea naparte de trás do pescoço.
Local da injeção:
Na hora da injeção, os ovos destinados para a avaliação do localda injeção foram injetados com corante. Os ovos sofreram então eutanásia enecropsia para a avaliação do local da injeção. O local da injeção foianalisado pelo qui-quadrado da razão de verossimilhança (Tabela 1).Sangramento:
Nos dias 7, 14, 21, e 28 após a eclosão, o sangue foi coletadode cada ave individual e reunido em vacutainers individuais (por grupo detratamento). Nos dias 7, 14 e 21; <0,5 ml_ de sangue foi coletado via a asaou a jugular. No dia 28, >0,5 mL de sangue foi coletado via perfuraçãocardíaca. O sangue foi então incubado na temperatura ambiente, por umahora. Então, as amostras de sangue foram colocadas em uma centrífugasobre tampo de mesa a 2400 RPMs, por 10 minutos. Assim que acentrifugação estava completa, o soro foi removido de cada amostra desangue e armazenado em uma placa de armazenagem de 96 cavidades (2-8-C ou -70-C) para as avaliações futuras da resposta imune.
Teste de Neutralização da toxina (beta) de Clostridium perfringens TipoC em Camundongos: Preparação da Amostra para a Inoculação doCamundongoA. Materiais
1. Toxina (beta) de Clostridium perfringens Tipo C - N° do Lote CVBLIRP513(04)
2. Antitoxina (beta) de Ciostridium perfringens Tipo C - N°- do Lote CVBLIRP486 Receipt
3. Diluente - 1% de peptona, 0,25% de NaCl pH 7,2, - N° do Lote BBL051006, ref. NB - NB 140 p. 87
4. Amostras de Soro de Galinha - EMHE1381, N° 140 p. 80
a. N2s das Amostras 7, 8, 9, 10A, 10B, 11 A, 11B, 12A, 12B, 13A,14A, 15A
5. Frascos pequenos estéreis de 3 ml e 1,8 ml.
B. Métodos:
30 1. Diluir a antitoxina beta padrão 1:50 em diluente, total de 10 ml.
a. Descongelar a antitoxina beta na temp. ambiente.
b. Misturar 200 μl de antitoxina beta e 9,8 ml de diluente = 1:50c. Manter sobre gelo.
2. Diluir a toxina beta 1:120 em diluente, total de 12 ml.
a. Descongelar a toxina beta na temp. ambiente.
b. Misturar 200 μΙ de toxina beta e 1,8 ml de diluente = 1:10
c. Misturar 1 ml da toxina beta diluída a 1:10 com 11 ml de diluente= 1:120
d. Manter sobre gelo.
3. Preparar a amostra de controle L0.
a. Misturar 0,5 ml de toxina beta (diluição a 1:120) com 0,5 ml dediluente.
b. Adicionar 1 ml de antitoxina beta (diluição a 1:50).
c. Misturar e incubar na temperatura ambiente por 1 hora.
d. Manter as amostras sobre gelo.
4. Preparar a amostra de controle L+.
a. Misturar 0,8 ml de toxina beta (diluição a 1:120) com 0,2 ml de
diluente.
b. Adicionar 1 ml de antitoxina beta (diluição a 1:50).
c. Misturar e incubar na temperatura ambiente por 1 hora.
d. Manter as amostras sobre gelo.
5. Preparar as 12 amostras de soro de teste.
a. Misturar 3,25 ml de toxina beta (diluição a 1:120) com 3,25 ml dediluente.
b. A cada um dos doze tubos de 1,8 ml, adicionar 0,5 ml de toxina
da etapa 5.a.
c. Etiquetar cada tubo com o número da amostra e o número do
grupo de tratamento.
d. Adicionar 0,5 ml de cada soro de galinha não diluído ao tuboapropriadamente etiquetado.
e. Misturar e incubar na temperatura ambiente por 1 hora.
f. Armazenar as amostras sobre gelo.
6. Todas as amostras não utilizadas são armazenadas a 2-7sC.Atividades Pré-Estudo
Setenta e oito camundongos brancos (CD-1) Swiss fêmeos (16-20 gramas de peso do corpo) foram adquiridos para uso no estudo. Oscamundongos foram enviados do vendedor (Charles River Laboratories) etransportados para a Instalação de Teste Clínico.
Os camundongos foram alojados em gaiolas, colocando 2camundongos por gaiola para os grupos do soro de galinha e 4 gaiolas de 5camundongos por gaiola para os grupos de controle. Os camundongosforam mantidos por um período de aclimação de 5 dias, antes do início doestudo no Dia 0. Os camundongos foram alojados e cuidados de acordo comos procedimentos padrões de operação e alimentados com dieta delaboratório padrão e servidos de água ad libitum.DiaO
Os camundongos foram examinados quanto à saúde e aspectonormais e colocados em teste arrolando setenta e seis camundongos. Doiscamundongos não foram arrolados no estudo e sofreram eutanásia. Cadacamundongo foi injetado intravenosamente (IV) com uma agulha de 26g χ3/8 na veia da cauda, de acordo com os grupos de tratamento descritos sobPROJETO DE ESTUDO. Os camundongos foram monitorados duas vezesao dia quanto aos sinais de choque, dor ou sofrimento, como evidenciadospelo que segue:
Letargia
Encolhimento
Pele com pêlo duro/amontoadoPostura arqueada
Ataxia
Anorexia ou incapacidade de atingir o alimento e a água.
Os camundongos moribundos sofreram eutanásia via doseexcessiva de CO2 de acordo com os procedimentos padrões de operação.Dia 1 (aproximadamente 24 horas após a inoculação)
Os camundongos foram observados e o número de mortalidades
registrado.RESULTADOS
Uma resposta do anticorpo específico positiva foi detectada nossoros das aves vacinadas em ovo (corpo do embrião objetivado) com umavacina de bacterina-toxóide de C. perfringens comercial, com e sem umreforço após a eclosão, usando o ensaio de neutralização da toxina pelosoro. Estes dados indicam que a administração de uma vacina de bacterina-toxóide de C. perfringes em ovo produz proteção parcial e a administraçãoem ovo seguida por um reforço após a eclosão confere proteção total contraC. perfringens (Tabela 2).
EXEMPLO II. Resposta imune após vacinação em ovo com uma preparaçãode vacina experimental contendo toxina alfa recombinante
Projeto Experimental
O estudo acima mencionado foi conduzido para determinar seuma resposta imune humoral (do anticorpo) poderia ser detectada nos pintos,após vacinação em ovo, em ovo + após a eclosão ou após a eclosão com atoxina alfa recombinante de Clostridium perfringens (SEQ ID NO:6)(fornecida pelo Dr. Glenn Songer, Depto. de Ciência e MicrobiologiaVeterinária, Universidade do Arizona), com o Adjuvante de FreundIncompleto e o Quil-A. A estratégia de imunização incluía alvejar o corpo doembrião em ovo no E18, bem como uma vacinação após a eclosão no dia 7.A resposta do anticorpo foi avaliada em 28 dias de idade.
No E18, os ovos com pintos foram manualmente injetados emovo com os materiais de controle (Quil A; Accurate Chemical & ScientificCorporation, Produto n° AP04991, grau adjuvante,' Batelada n° L77-238)emulsificados com Adjuvante de Freund Incompleto (IFA; Rockland, Lote n216235) ou toxina alfa recombinante de C. perfringens (55 ou 60 μg/dose)com adjuvante Quil A + IFA (13 ou 15 μg/dose). A avaliação do local dainjeção foi efetuada por injeção de corante. No dia 0 (eclosão), as avesforam alojadas em unidades de gaiolas (5 aves/gaiola). As aves receberamNormal Broiler Starter. Adicionalmente, algumas aves foram vacinadas nodia 7 ou 17 de acordo com o tratamento (0,2 mL de vacina por injeçãosubcutânea na parte de trás do pescoço). Os soros das aves foram entãoavaliados quanto à resposta do anticorpo específico via western blot.
Materiais e Métodos
Injeção:
No E18, os ovos com pintos foram injetados com os materiais deteste (toxina alfa de Clostridium perfringes + adjuvante de vacina) paraalvejar o corpo do embrião de cada ovo. Além disso, no dia 7 ou dia 17 apósa eclosão, alguns grupos de tratamento injetados em ovo e não injetados emovo receberam uma vacinação (Tabela 3).Local da injeção (SOI):
Na hora da injeção, os ovos destinados para a avaliação do SOIforam injetados com corante. Os ovos sofreram então eutanásia e necropsiapara a avaliação do SOI (Tabela 4).
Coleta dos soros:
Nos dias 7, 14, 21, e 28 após a eclosão, o sangue foi coletadode cada ave individual e reunido em vacutainers individuais. Nos dias 7, 14,e 21, <0,5 ml_ de sangue foi coletado via a asa ou a veia jugular. No dia 28,>0,5 mL de sangue foi coletado via perfuração cardíaca. O sangue foi entãoincubado na temperatura ambiente, por 1 hora. As amostras de sangueforam centrifugadas e o soro foi removido e armazenado em uma placa dearmazenagem de 96 cavidades (2-8QC ou -70-C) para a avaliação daresposta imune.
Teste de western blot:
A eletroforese em gel em placa de SDS foi realizada de acordocom o método de Laemmli (Nature 227:680-685 (1970)) como descrito porO'Farrell (J. Biol. Chem. 250:4007-4021 (1975), segunda dimensão), usandoum gel em placa de acrilamida a 10% (comprimento de 125 mm X largura de150 mm X espessura de 0,75 mm) sobreposto com um gel de empilhamentode 25 mm. A eletroforese foi efetuada a 12 mAmp por cerca de 3,5 horas ouaté que a frente de azul de bromofenol tivesse migrado para o final dos géisem placa. Após a eletroforese em gel em placa, o gel para manchar foicolocado em tampão de transferência (Tris a 12,5 mM, pH 8,8, glicina a 96mM, 20% de MeOH) e transmanchado sobre uma membrana de PVDFdurante a noite, a 200 mA e aproximadamente 100 volts/dois géis. Amembrana de PVDF foi então tingida com azul de Coomassie e secadaentre folhas de papel de filtro.
A membrana de PVDF foi tingida com Azul Brilhante deCoomassie R-250 e escaneada por computador de mesa antes e depois docorte em caminhos individuais. Cada caminho da mancha foi colocado emum recipiente separado e bloqueado por duas horas em leite seco semgordura a 5% em solução salina tamponada com Tween-20 Tris (TTBS) eenxaguado em TTBS. As manchas foram então incubadas em anticorpoprimário (diluído 1:100 em leite seco sem gordura a 2% em TTBS), durante anoite, e enxaguadas 3X10 minutos em TTBS.
A faixa do blot 1 (controle positivo) foi então colocada emanticorpo secundário [anti-lgG de cabra-HRP em coelho (Sigma, Cat. n2 A-5420 e Batelada η2 034K4858), diluído a 1:5.000 em 2% de NFDM emTTBS] por duas horas, enxaguado 3 X 10 minutos em TTBS, tratado comECL e exposto ao filme de raios x.
As faixas do blot restantes foram então colocadosindividualmente em anticorpo secundário [anti-lgG de galinha-HRP emcoelho (Bethyl, Cat. η2 A30-107P e Batelada η2 A30-107P-3), diluído a1:2.000 em leite seco sem gordura a 2% em TTBS] por duas horas,enxaguados 3 X 10 minutos em TTBS, tratados com ECL e expostos aofilme de raios x.
Os resultados dos estudos de western blotting são descritos na
Tabela 5.
Resultados
Uma resposta de anticorpo específico foi detectada nas avesvacinadas em ovo (corpo do embrião alvejado) com a toxina alfarecombinante com adjuvante Quil-A e IFA, com ou sem um reforço após aeclosão. Estes dados demonstram que a vacinação em ovo com uma toxinaalfa recombinante pode produzir uma resposta imune contra a toxina alfa deC. perfringens nos pintos.EXEMPLO III.
Uma vacina em emulsão de óleo inativada, comercialmentedisponível, para a doença de Newcastle, foi adquirida do Maine BiologicalLaboratories. A vacina foi administrada em ovo no E18 por meio da via dofluido amniótico ou em ovo no E19 por meio da via do corpo do embrião. Aadministração direcionada para o local ao fluido amniótico e ao corpo doembrião foi confirmada conduzindo uma análise do local da injeção usandocorante no E18 ou no E19. A administração direcionada para o local aofluido amniótico foi efetuada usando uma agulha não pontuda (Grupo 2). Aadministração direcionada para o local ao corpo do embrião foi feita usandouma agulha afiada de 3,175 centímetros (1,25 polegada) (Grupo 3). O sorosangüíneo foi coletado nos dias 14, 21 e 28 de idade e testado quanto aosanticorpos específicos para o vírus da doença de Newcastle (NDV) usandoELISA (Idexx, Inc.). As aves individuais diferentes foram sangradas em cadadia de coleta de sangue.
A análise do local da injeção no E18 indicou que 22/24 ovosforam injetados no fluido amniótico, 22/24 no fluido alantóico, e 0/24 nocorpo do embrião. A análise do local da injeção no E19 indicou que 7/10ovos foram injetados no corpo do embrião e 3/10 ovos foram injetados nofluido amniótico. A Tabela 6 mostra a resposta do anticorpo ao vírus dadoença de Newcastle após a vacinação em ovo das galinhas. A Tabela 7mostra os dados da porcentagem de eclosão.
O estudo demonstra que a resposta imune do embrião emdesenvolvimento é fortemente influenciada pelo local de administração emovo da vacina inativada em emulsão de óleo para doença de Newcastle(Tabela 6). Os embriões vacinados no fluido amniótico que circunda o corpodo embrião não responderam com os anticorpos específicos da doença deNewcastle. Por outro lado, os embriões vacinados diretamente no corpo doembrião responderam com uma forte resposta do anticorpo que aumentoucom a idade até 28 dias. Um total de 34 aves foi sangrado durante o cursodeste estudo e 26/34 eram positivas para os anticorpos para o vírus dadoença de Newcastle (Tabela 6). 26/34 é 76,5%, que é muito similar aoestudo do local da injeção onde 70% dos embriões imunizados no E19 foraminjetados no corpo do embrião. A porcentagem de eclosão estava dentro dasfaixas normais para os grupos tratados e não tratados (Tabela 7).
Exemplo IV.
Uma vacina em emulsão de óleo inativada, comercialmentedisponível, para a doença de Newcastle, foi adquirida do Maine BiologicalLaboratories. A vacina foi administrada em ovo no E19 por meio da via docorpo do embrião ou subcutânea na eclosão. A administração direcionadapara o local ao corpo do embrião foi feita usando uma agulha afiada de3,175 centímetros (1,25 polegada) (Grupo 3). A vacinação no dia da eclosãofoi feita injetando a vacina subcutânea na nuca dos pintos recentementesaídos dos ovos (Grupo 2). O soro sangüíneo foi coletado nos dias 21 deidade e testado quanto aos anticorpos específicos para o NDV usandoELISA (Idexx, Inc.). Os resultados são mostrados na Tabela 8.
Os dados apresentados na Tabela 8 mostram que os embriõesvacinados no corpo com a vacina em emulsão de óleo para a doença deNewcastle responderam, bem como os pintos vacinados pela via padrão dodia da eclosão. A porcentagem de eclosão estava dentro das faixas normaispara os grupos tratados e não tratados (Tabela 9).
Os dados apresentados nos exemplos Ill e IV acima mostramque o acerto do corpo do embrião é necessário para estimular uma respostaimune ativa a um antígeno inativado (neste caso, o vírus da doença deNewcastle). Estes dados também indicam que os embriões não são afetadosnegativamente pela injeção no corpo do embrião com um antígeno inativadoem um adjuvante de emulsão de óleo.
A injeção em ovo (antes da eclosão) no corpo do embrião podeser efetuada manualmente usando seringa e agulha, ou por um dispositivode injeção de automação também usando agulhas. Nos exemplos dadosneste documento, a seringa e a agulha foram usadas manualmente paraaplicar a vacina ao corpo do embrião ou ao fluido amniótico (exemplo Illsomente) que circunda o corpo do embrião. Para efetuar a injeção no corpodo embrião, a agulha foi inserida através de um furo na casca naextremidade da célula aérea do ovo. A agulha inserida passou através damembrana da célula aérea, das membranas e fluido alantóicos e finalmentepara a cavidade do âmnio onde o corpo do embrião reside. A seguir, aagulha penetrou no corpo do embrião e a vacina foi depositada. As injeçõesnos corpos dos embriões podem ocorrer em diversos locais dentro do corpodo embrião e incluem a deposição subcutânea, intradérmica, intravenosa,intramuscular e intra-abdominal da vacina, bem como qualquer combinaçãodestes locais. Além disso, as injeções nos corpos dos embriões podemocorrer na cabeça, pescoço, ombro, asa, dorso, peito ou perna, incluindoquaisquer combinações. A injeção no corpo do embrião não inclui adeposição da vacina exclusiva na célula aérea, na cavidade alantóica, nofluido amniótico ou na albumina.
A injeção no corpo do embrião em ovo pode ser feita usandoagulha de um comprimento variando de 1,905 centímetro a 10,16centímetros (3A de polegada até 4 polegadas) e escalas variando de 15 a 28.As pontas das agulhas podem variar de muito afiadas (hipodérmicas) aténão pontudas.
Nos exemplos Ill e IV, a vacina para o vírus da doença deNewcastle foi usada como o antígeno modelo. Entretanto, qualquer vacinaem emulsão de óleo adequadamente formulada, com massa antigênicasuficiente, seria esperada ser similar à vacina para a doença de Newcastletestada. Portanto, as vacinas inativadas para a doença bursal infecciosa, ainfluenza aviária, a bronquite infecciosa, o vírus da anemia infecciosa depinto, a laringotraqueíte, o reovírus aviário, o adenovírus, o rotavírus, oastrovírus, a hepatite por corpos de inclusão, a síndrome da queda depostura, a Escherichia coli, o Mycoplasma spp., a Salmonella spp., oCampylobacter spp, o Clostridium spp., o Haemophilus spp, a Pasteurellaspp. podem ser distribuídas em ovo diretamente para o corpo do embrião, deacordo com os métodos descritos neste documento. As vacinas feitas apartir destes agentes podem ser célula inteira ou subunidade. As vacinasfeitas a partir destes agentes podem ser produzidas convencionalmente emmeio de crescimento, ovos ou cultura de tecidos e/ou podem ser produzidaspor meio recombinante de acordo com métodos bastante conhecidos natécnica. Além disso, qualquer agente de doença que possa ser produzidopara ter massa antigênica suficiente para vacinar efetivamente os pintos nodia da eclosão, quando inativado, também seria esperado vacinarefetivamente os embriões em ovo se distribuído diretamente para o corpo doembrião.
O adjuvante usado na vacina testada nestes exemplos foi umaemulsão de óleo comercial típica. As vacinas inativadas que não ememulsão de óleo, com adjuvantes diferentes do óleo, seriam esperadasproduzir uma resposta imune ativa se distribuídas diretamente para o corpodo embrião, antes da eclosão. Os adjuvantes adequados incluiriam, porémnão estão limitados aos géis minerais, poliânions, polióis pluronic, derivadosde saponina, Iisolecitina e outras substâncias tensoativas similares,glicosídeos e todos os tipos de óleos e suas combinações.
EXEMPLO V.
As galinhas-da-terra sem patógenos específicos (SPF) foramvacinadas em ovo como se segue: Grupo 1: solução salina tamponada comfosfato (PBS); Grupos 2 e 3: 0,3 χ 109 EID50/dose de NDV inativado em PBS;Grupo 4: 0,3 χ 109 EID50/dose de NDV inativado misturados com umadjuvante de depósito de alúmen (Imject, Pierce; hidróxido de alumínio ehidróxido de magnésio); Grupo 5: uma vacina comercial em emulsão de óleopara NDV. No dia 11 de idade, os pacientes do Grupo 3 receberam umasegunda dose de NDV em PBS por injeção subcutânea. As vacinas dadasem ovo foram objetivadas para o corpo do embrião e uma análise do local dainjeção usando corante foi conduzida em um grupo separado de ovossimilares, para estimar a porcentagem de embriões injetados diretamente nocorpo do embrião. A vacinação em ovo foi feita no dia 19 de incubação comuma agulha de escala 23 de 3,175 centímetros (1,25 polegada). Quatorzeaves por grupo foram colocadas em gaiolas e desenvolvidas até 21 dias deidade.
As amostras de soro foram coletadas no dia 21 de idade etestadas quanto ao anticorpo de IgG para NDV por ELISA (Idexx, Inc.). Asamostras de soro dos Grupos 2, 4 e 5 foram também testadas quanto aoanticorpo específico para NDV por inibição da hemaglutinação (HI) usandoquatro unidades de HA. O número de amostras testadas por Hl diferedaquelas testadas por ELISA porque com diversas amostras não havia sorosuficiente coletado para conduzir o teste de Hl. As aves eram consideradasterem mostrado uma resposta do anticorpo mensurável (isto é,soroconvertidas) à vacinação se a amostra de soro tivesse um título doELISA > 200 ou um título de Hl de > 3,0 Iog2 (isto é, título de 1:8)..
Resultados.
A análise do local da injeção indica que as injeções nos corposdos embriões eram responsáveis por 78% de todas as injeções (Tabela 10).
A porcentagem de eclosão e a taxa de soroconversão para oNDV1 como medida por ELISA, são mostradas na Tabela 11. Na Tabela 12,é descrito o número de aves que se soroconverteu usando o teste de Hl.
A partir destes estudos, foram observados os seguintes pontos-chave. 1) o antígeno de NDV em PBS não estimulou uma resposta doanticorpo mensurável por ELISA de NDV, mesmo quando o antígeno deNDV inativado foi dado duas vezes como no Grupo 3 (uma vez em ovo enovamente no dia 11 de idade); 2) O NDV-Alúmen (Grupo 4) estimulou asoroconversão em 8/14 aves, quando medida por ELISA, enquanto a vacinacomercial em emulsão de óleo (Grupo 5) estimulou a soroconversão em10/13 aves, quando medida por ELISA; 3) O NDV-Alúmen (Grupo 4)estimulou a soroconversão em 12/14, quando medida por Hl, enquanto quea vacina em emulsão de óleo estimulou a soroconversão em 11/11 das aves,quando medida por Hl; e 5) A vacina comercial em emulsão de óleo para adoença de Newcastle (Grupo 5) estimulou uma resposta do anticorpo maisforte do que fez a vacina de NDV-Alúmen (Grupo 4). O exemplo Ill mostraque a administração em ovo de um antígeno apresentado em adjuvante dedepósito de emulsão de óleo requereu que a vacina fosse distribuída para ocorpo do embrião para estimular uma resposta do anticorpo mensurável porELISA. No presente exemplo, a análise do local de injeção em ovo indicouque 78% dos ovos receberam a vacina diretamente no corpo do embrião.EXEMPLO VI.
Um estudo foi conduzido usando as galinhas-da-terra SPF paradeterminar se o adjuvante de depósito de alúmen estimularia uma respostaimune quando administrado em ovo. Os grupos testados foram como sesegue: Grupo 1: solução de salina tamponada com fosfato (PBS) em ovo;Grupos 2 e 3: 1,2 χ 109 EID50 de NDV inativado por D-propiolactona/dose emPBS em ovo; Grupo 4: administração em ovo de 1,2 χ 109 EID5O de NDVinativado por G-propiolactona/dose misturados com alúmen em uma razãode alúmen para NDV de 30%:70%. O alúmen usado era uma soluçãocomercial de hidróxido de alumínio e hidróxido de magnésio (Imject, Peirce).O Grupo 3 recebeu uma dose adicional de antígeno de NDV em PBS no dia11 de idade, por injeção subcutânea. A administração da vacina em ovo foifeita no dia 19 de incubação, usando uma agulha de escala 23 de 3,175centímetros (1,25 polegada). As vacinas foram alvejadas em ovo para ocorpo do embrião e uma análise do local da injeção foi conduzida em umgrupo separado de ovos similares, para estimar a porcentagem de embriõesinjetados diretamente no corpo do embrião. As amostras de soro foramretiradas no dia 21 de idade e testadas quanto ao anticorpo para o NDV porELISA (Idexx, Inc.). As aves eram consideradas terem mostrado umaresposta do anticorpo mensurável (isto é, soroconvertidas) se o ELISAtivesse um título > 200.Resultados.
A análise do local da injeção indica que 81% dos embriões foraminjetados diretamente no corpo do embrião (Tabela 13). A porcentagem deeclosão e a taxa e a magnitude de soroconversão contra o vírus da doençade Newcastle são mostradas na Tabela 14.
Estes estudos proporcionaram os seguintes pontos-chave: 1) Osembriões foram injetados no E19 e os dados do local da injeção indicaramque 81% dos embriões foram injetados no corpo do embrião; e 2) Nesteestudo, o alúmen foi misturado com o NDV inativado por β-propiolactona emuma razão de 30% para 70% e isto diferiu do estudo descrito aqui noExemplo V, no qual o NDV inativado por calor foi misturado em uma razãode 50% de alúmen para 50% de antígeno de NDV. A diferença nasrespostas imunes nos dois estudos pode ser devida às diferenças noantígeno de NDV usado e/ou à diferença nas razões testadas de alúmenpara antígeno, bem como às diferenças no ELISA usado para medir osanticorpos.
No exemplo III, mostrou-se que o antígeno apresentado naemulsão de óleo adjuvante de depósito requer que a vacina seja distribuídapara o corpo do embrião em ovo, para estimular uma resposta do anticorpomensurável por ELISA. Neste estudo, a análise do local da injeção indicouque 81% dos embriões foram injetados no corpo do embrião, e a partirdestes dados seria esperado que aproximadamente 11 dos 14 ovosvacinados em ovo respondessem com uma resposta do anticorpo. O númeroreal que respondeu foi nove de 14.
Exemplo VII.
Uma vacina para a doença de Newcastle, em emulsão de óleo,comercial, foi dada por meio da via em ovo aos pintos. Este estudodeterminou a capacidade dos pintos de responderem aos antígenos de vírusda doença de Newcastle inativados quando distribuídos em ovo pela via dofluido amniótico e pela via intra-embrião. As aves foram sangradas em 13,21, 26 e 35 dias de idade e o título do anticorpo para o NDV foi determinadousando ELISA (Idexx, Inc.). A análise do local da injeção foi conduzida noE18 e no E19, usando corante.
Os dados da eclosão são mostrados na Tabela 16. Aporcentagem de eclosão era normal quando a vacina em emulsão de óleo foidistribuída para o corpo do embrião.
O local da injeção (Tabela 15) era muito preciso, com mais doque 90% dos embriões injetados pela via indicada para o tratamento (Tabela16).
Os dados da resposta do anticorpo específico para o vírus dadoença de Newcastle são mostrados na Tabela 17. Pode ser visto que asaves responderam ao antígeno de Newcastle quando a vacina foi distribuídaem ovo para o corpo do embrião ou subcutânea na eclosão. Quando avacina de NDV foi distribuída em ovo para o fluido amniótico, não houvenenhuma resposta do anticorpo, indicando que a vacina tem de ser dada aocorpo do embrião para estimular uma resposta imune apropriada.
O precedente é ilustrativo da presente invenção, e não é para ser interpretado como sua limitação. A invenção é definida pelasreivindicações que se seguem, com os equivalentes das reivindicações aserem incluídos nelas.
Tabela 1. Porcentagem de Eclosão e Local da Injeção
<table>table see original document page 64</column></row><table>
Os ovos que receberam o Vision CD ou o Siteguard G demonstraram taxas de eclosão globais ligeiramente menores do que os ovos que receberam omaterial de controle (82,5% e 75,0% vs. 95,0%, respectivamente.).Tabela 2. Resultados da neutralização da toxina pelo soro:
<table>table see original document page 65</column></row><table>continuação
<table>table see original document page 66</column></row><table>
Todos os soros foram reunidos (~5 aves/grupo)
• Uma resposta positiva específica foi detectada nas avesvacinadas em ovo (corpo do embrião alvejado) com a vacina de bacterina-toxóide de C. perfringens (Vision CD) seguida por um reforço após a eclosão.Os resultados sugeriram uma baixa resposta do anticorpo (proteção parcial)nas aves vacinadas em ovo sozinhas (sem reforço após a eclosão).
• Não foi observada nenhuma proteção nos soros das avesvacinadas com uma vacina de toxóide de C. perfringens (Siteguard).Tabela 3. Sumário do Estudo
<table>table see original document page 67</column></row><table>
Tabela 4. Porcentagem de Eclosão e Local da Injeção
<table>table see original document page 67</column></row><table>
A porcentagem de eclosão de 96% foi obtida após a vacinaçãoem ovo com a toxina alfa recombinante. Um alvejamento do embrião de5 72,16% foi obtido usando a agulha de 20g, 3,81 cm (1,5").Tabela 5. Detecção da resposta do anticorpo específico via westernblot.
<table>table see original document page 68</column></row><table>
• Os controles positivo e negativo atuaram conforme esperado,demonstrando a validade do teste.
• Foi detectada uma resposta do anticorpo específica nas avesvacinadas em ovo (corpo do embrião alvejado) com a formulação de toxinaalfa recombinante, com e sem um reforço após a eclosão.Tabela 6. Resposta do anticorpo das galinhas ao vírus da doença deNewcastle após administração em ovo direcionada para o local de umavacina inativada em emulsão de óleo para a doença de Newcastle
<table>table see original document page 69</column></row><table>
Tabela 7: Porcentagem de eclosão após administração em ovodirecionada para o local de uma vacina inativada em emulsão de óleopara a doença de Newcastle
<table>table see original document page 69</column></row><table>Tabela 8: Resposta do anticorpo das galinhas ao vírus da doença deNewcastle após administração em ovo intra-embrião ou administraçãosubcutânea no dia da eclosão de uma vacina inativada em emulsão de
<table>table see original document page 70</column></row><table>
Tabela 9: Porcentagem de eclosão após administração em ovo intra-embrião de uma vacina inativada em emulsão de óleo para a doença deNewcastle
<table>table see original document page 70</column></row><table>Tabela 10 : Local da Injeção usando corante
<table>table see original document page 71</column></row><table>
Tabela 11: Porcentagem de eclosão e resultados por ELISA para o NDVdas aves vacinadas em ovo com antígeno de NDV, antígeno de NDV-Alúmen ou uma vacina de NDV em emulsão de óleo
<table>table see original document page 71</column></row><table>
** NDV-OE = vacina em emulsão de óleo comercial para o NDV (LAHI)n/a = não aplicável
Tabela 12: Resultados da inibição da hemaglutinação para o NDV dospintos vacinados em ovo com antígeno de NDV-Alúmen ou uma vacinade NDV em emulsão de óleo
<table>table see original document page 71</column></row><table>
** NDV-OE = vacina em emulsão de óleo comercial para o NDV (LAHI)Tabela 13: Resultados do Local da Injeção
<table>table see original document page 72</column></row><table>
Tabela 14: Porcentagem de eclosão e Resultados por ELISA dos pintosvacinados em ovo com antígeno de NDV ou NDV-Alúmen,
<table>table see original document page 72</column></row><table>
*Ambos os tratamentos de NDV foram a partir do mesmo grupo de aves quesaíram dos ovos; n/a = não aplicável
Tabela 15: local da injeção para a distribuição em ovo direcionada parao local de uma vacina inativada em emulsão de óleo do vírus da doençade Newcastle.
<table>table see original document page 72</column></row><table>Tabela 16: Grupos de tratamento e porcentagem de eclosão para osgrupos de pintos que receberam uma vacina de NDV em emulsão deóleo em ovo.
<table>table see original document page 73</column></row><table>
1 NDV emulsão em óleo - formulados para os pintos no dia da idade, 1 doseem 0,1 ml
Tabela 17: Resposta do anticorpo ao NDV em pintos imunizados comuma vacina de NDV em emulsão de óleo em ovo.
<table>table see original document page 73</column></row><table>
1 NDV emulsão em óleo - formulados para os pintos no dia da idade, 1 doseem 0,1 ml<110> Doelling, Vivian W. Poston, Rebecca Heggan-Peay, Cherilyn I. Avakian, Alan P. Tyczkowski, Julius
<120> MÉTODOS E COMPOSIÇÕES PARA A VACINAÇÃO DE AVESDOMÉSTICAS
<130> 5175-184
<150> US 60/787.567<151> 30-03-2006
<160> 13
<170> PatentIn versão 3.3
<210> 1
<211> 1113
<212> DNA
<213> Clostridium perfringens
<220>
<221> CDS<222> (1)..(1110)
<400> 1
tgg gat gga aag att gat gga aca gga act cat gct atg att gta act48
Trp Asp Gly Lys Ile Asp Gly Thr Gly Thr His Ala Met Ile Val Thr15 10 15
caa ggg gtt tca ate tta gaa aat gat ctg tcc aaa aat gaa cca gaa96
Gln Gly Val Ser Ile Leu Glu Asn Asp Leu Ser Lys Asn Glu Pro Glu20 25 30
agt gta aga aaa aac tta gag att tta aaa gag aac atg cat gag ctt144
Ser Val Arg Lys Asn Leu Glu Ile Leu Lys Glu Asn Met His Glu Leu35 40 45
caa tta ggt tet act tat cca gat tat gat aag aat gea tat gat cta192
Gln Leu Gly Ser Thr Tyr Pro Asp Tyr Asp Lys Asn Ala Tyr Asp Leu50 55 60
tat caa gat cat ttc tgg gat cct gat aca gat aat aat ttc tca aag240
Tyr Gln Asp His Phe Trp Asp Pro Asp Thr Asp Asn Asn Phe Ser Lys65 70 75 80
gat aat agt tgg tat tta gct tat tet ata cct gac aca ggg gaa tca288Asp Asn Ser Trp Tyr Leu Ala Tyr Ser Ile Pro Asp Thr Gly Glu Ser85 90 95
caa ata aga aaa ttt tca gca tta gct aga tat gaa tgg caa aga gga5 336
Gln Ile Arg Lys Phe Ser Ala Leu Ala Arg Tyr Glu Trp Gln Arg Gly
100 105 110
aac tat aaa caa gct aca ttc tat ctt gga gag gct atg cac tat ttt10 384
Asn Tyr Lys Gln Ala Thr Phe Tyr Leu Gly Glu Ala Met His Tyr Phe115 120 125
gga gat ata gat act cca tat cat cct gct aat gtt act gcc gtt gat
15 432
Gly Asp Ile Asp Thr Pro Tyr His Pro Ala Asn Val Thr Ala Val Asp130 135 140
age gca gga cat gtt aag ttt gaa act ttt gca gag gaa aga aaa gaa
20 480
Ser Ala Gly His Val Lys Phe Glu Thr Phe Ala Glu Glu Arg Lys Glu145 150 155 160
cag tat aaa ata aac aca gca ggt tgc aaa act aat gag gat ttt tat
25 528
Gln Tyr Lys Ile Asn Thr Ala Gly Cys Lys Thr Asn Glu Asp Phe Tyr165 170 175
gct gat ate tta aaa aac aag gat ttt aat gca tgg tca aaa gaa tat
30 576
Ala Asp Ile Leu Lys Asn Lys Asp Phe Asn Ala Trp Ser Lys Glu Tyr180 185 190
gca aga ggt ttt gct aaa aca gga aaa tca ata tac tat agt cat gct
35 624
Ala Arg Gly Phe Ala Lys Thr Gly Lys Ser Ile Tyr Tyr Ser His Ala195 200 205
age atg agt cat agt tgg gat gat tgg gat tat gca gca aag gta act
40 672
Ser Met Ser His Ser Trp Asp Asp Trp Asp Tyr Ala Ala Lys Val Thr210 215 220
tta gct aac tet caa aaa gga aca gca gga tat att tat aga ttc tta
45 720
Leu Ala Asn Ser Gln Lys Gly Thr Ala Gly Tyr Ile Tyr Arg Phe Leu225 230 235 240
cac gat gta tca gag ggt aat gat cca tca gtt gga aag aat gta aaa
50 768
His Asp Val Ser Glu Gly Asn Asp Pro Ser Val Gly Lys Asn Val Lys245 250 255
gaa cta gta gct tac ata tca act agt ggt gaa aaa gat gct gga aca
55 816
Glu Leu Val Ala Tyr Ile Ser Thr Ser Gly Glu Lys Asp Ala Gly Thr260 265 270
gat gac tac atg tat ttt gga ate aaa aca aag gat gga aaa act caa60 864Asp Asp Tyr Met Tyr Phe Gly Ile Lys Thr Lys Asp Gly Lys Thr Gln275 280 285
gaa tgg gaa atg gac aac cca gga aat gat ttt atg act gga agt aaa912
Glu Trp Glu Met Asp Asn Pro Gly Asn Asp Phe Met Thr Gly Ser Lys290 295 300
gac act tat act ttc aaa tta aaa gat gaa aat cta aaa att gat gat960
Asp Thr Tyr Thr Phe Lys Leu Lys Asp Glu Asn Leu Lys Ile Asp Asp
305 310 315 320
ata caa aat atg tgg att aga aaa aga aaa tat aca gca ttc cca gat1008
lle Gln Asn Met Trp Ile Arg Lys Arg Lys Tyr Thr Ala Phe Pro Asp325 330 335
gct tat aag cca gaa aac ata aag ata ata gca aat gga aaa gtt gta1056
Ala Tyr Lys Pro Glu Asn Ile Lys Ile Ile Ala Asn Gly Lys Val Val340 345 350
gta gac aaa gat ata aat gag tgg att tca gga aat tca act tat aat1104
Val Asp Lys Asp Ile Asn Glu Trp Ile Ser Gly Asn Ser Thr Tyr Asn
355 360 365
ata aaa taa1113Ile Lys370
<210> 2<211> 370<212> PRT
<213> Clostridium perfringens<400> 2
Trp Asp Gly Lys Ile Asp Gly Thr Gly Thr His Ala Met Ile Val Thr15 10 15
Gln Gly Val Ser Ile Leu Glu Asn Asp Leu Ser Lys Asn Glu Pro Glu20 25 30
Ser Val Arg Lys Asn Leu Glu Ile Leu Lys Glu Asn Met His Glu Leu35 40 45
Gln Leu Gly Ser Thr Tyr Pro Asp Tyr Asp Lys Asn Ala Tyr Asp Leu50 55 60
Tyr Gln Asp His Phe Trp Asp Pro Asp Thr Asp Asn Asn Phe Ser Lys65 70 75 80Asp Asn Ser Trp Tyr Leu Ala Tyr Ser Ile Pro Asp Thr Gly Glu Ser85 90 95
Gln Ile Arg Lys Phe Ser Ala Leu Ala Arg Tyr Glu Trp Gln Arg Gly100 105 110
Asn Tyr Lys Gln Ala Thr Phe Tyr Leu Gly Glu Ala Met His Tyr Phe115 120 125
Gly Asp Ile Asp Thr Pro Tyr His Pro Ala Asn Val Thr Ala Val Asp 130 135 140
Ser Ala Gly His Val Lys Phe Glu Thr Phe Ala Glu Glu Arg Lys Glu145 150 155 160
Gln Tyr Lys Ile Asn Thr Ala Gly Cys Lys Thr Asn Glu Asp Phe Tyr165 170 175
Ala Asp Ile Leu Lys Asn Lys Asp Phe Asn Ala Trp Ser Lys Glu Tyr180 185 190
Ala Arg Gly Phe Ala Lys Thr Gly Lys Ser Ile Tyr Tyr Ser His Ala195 200 205
Ser Met Ser His Ser Trp Asp Asp Trp Asp Tyr Ala Ala Lys Val Thr210 215 220
Leu Ala Asn Ser Gln Lys Gly Thr Ala Gly Tyr Ile Tyr Arg Phe Leu225 230 235 240
His Asp Val Ser Glu Gly Asn Asp Pro Ser Val Gly Lys Asn Val Lys245 250 255
Glu Leu Val Ala Tyr Ile Ser Thr Ser Gly Glu Lys Asp Ala Gly Thr260 265 270
Asp Asp Tyr Met Tyr Phe Gly Ile Lys Thr Lys Asp Gly Lys Thr Gln275 280 285
Glu Trp Glu Met Asp Asn Pro Gly Asn Asp Phe Met Thr Gly Ser Lys290 295 300
Asp Thr Tyr Thr Phe Lys Leu Lys Asp Glu Asn Leu Lys Ile Asp Asp305 310 315 320Ile Gln Asn Met Trp Ile Arg Lys Arg Lys Tyr Thr Ala Phe Pro Asp325 330 335
Ala Tyr Lys Pro Glu Asn Ile Lys Ile Ile Ala Asn Gly Lys Val Val340 345 350
Val Asp Lys Asp Ile Asn Glu Trp Ile Ser Gly Asn Ser Thr Tyr Asn355 360 365
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<212> DNA
<213> Clostridium perfringens
<220>
<221> CDS<222> (1) . . (372)
<400> 3
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Pro Gly Asn Asp Phe Met Thr Gly Ser Lys Asp Thr Tyr Thr Phe Lys50 55 60
tta aaa gat gaa aat cta aaa att gat gat ata caa aat atg tgg att240
Leu Lys Asp Glu Asn Leu Lys Ile Asp Asp Ile Gln Asn Met Trp Ile
65 70 75 80
aga aaa aga aaa tat aca gea ttc cca gat gct tat aag cca gaa aac288
Arg Lys Arg Lys Tyr Thr Ala Phe Pro Asp Ala Tyr Lys Pro Glu Asn85 90 95
ata aag ata ata gea aat gga aaa gtt gta gta gac aaa gat ata aat336Ile Lys Ile Ile Ala Asn Gly Lys Val Val Val Asp Lys Asp Ile Asn100 105 110
gag tgg att tca gga aat tca act tat aat ata aaa ta374
Glu Trp Ile Ser Gly Asn Ser Thr Tyr Asn Ile Lys115 120
<210> 4
<211> 124
<212> PRT
<213> Clostridium perfringens
<400> 4
Asn Asp Pro Ser Val Gly Lys Asn Val Lys Glu Leu Val Ala Tyr Ile1 5 10 15
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25 Gly Ile Lys Thr Lys Asp Gly Lys Thr Gln Glu Trp Glu Met Asp Asn35 40 45
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Leu Lys Asp Glu Asn Leu Lys Ile Asp Asp Ile Gln Asn Met Trp Ile65 70 75 80
Arg Lys Arg Lys Tyr Thr Ala Phe Pro Asp Ala Tyr Lys Pro Glu Asn85 90 95
Ile Lys Ile Ile Ala Asn Gly Lys Val Val Val Asp Lys Asp Ile Asn100 105 110
45 Glu Trp Ile Ser Gly Asn Ser Thr Tyr Asn Ile Lys115 120
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<212> DNA
<213> Clostridiiim perfringens
<220>
<221> CDS
<222> (1)..(834)
<400> 510
15
20
25
30
35
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tgg gat gga aag att gat gga aca gga act cat gct atg att gta act48
Trp Asp Gly Lys Ile Asp Gly Thr Gly Thr His Ala Met Ile Val Thr15 10 15
caa ggg gtt tca ate tta gaa aat gat ctg tcc aaa aat gaa cca gaa96
Gln Gly Val Ser Ile Leu Glu Asn Asp Leu Ser Lys Asn Glu Pro Glu20 25 30
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144
Ser Val Arg Lys Asn Leu Glu Ile Leu Lys Glu Asn Met His Glu Leu35 40 45
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Tyr Gln Asp His Phe Trp Asp Pro Asp Thr Asp Asn Asn Phe Ser Lys65 70 75 80
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Asp Asn Ser Trp Tyr Leu Ala Tyr Ser Ile Pro Asp Thr Gly Glu Ser85 90 95
caa ata aga aaa ttt tca gea tta gct aga tat gaa tgg caa aga gga336
Gln Ile Arg Lys Phe Ser Ala Leu Ala Arg Tyr Glu Trp Gln Arg Gly100 105 110
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Asn Tyr Lys Gln Ala Thr Phe Tyr Leu Gly Glu Ala Met His Tyr Phe
115 120 125
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Gly Asp Ile Asp Thr Pro Tyr His Pro Ala Asn Val Thr Ala Val Asp130 135 140
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Ser Ala Gly His Val Lys Phe Glu Thr Phe Ala Glu Glu Arg Lys Glu
145 150 155 160
cag tat aaa ata aac aca gea ggt tgc aaa act aat gag gat ttt tat528
Gln Tyr Lys Ile Asn Thr Ala Gly Cys Lys Thr Asn Glu Asp Phe Tyr
165 170 175
gct gat ate tta aaa aac aag gat ttt aat gea tgg tca aaa gaa tat576
Ala Asp Ile Leu Lys Asn Lys Asp Phe Asn Ala Trp Ser Lys Glu Tyr
180 185 190gca aga ggt ttt gct aaa aca gga aaa tca ata tac tat agt cat gct624
Ala Arg Gly Phe Ala Lys Thr Gly Lys Ser Ile Tyr Tyr Ser His Ala195 200 205
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Ser Met Ser His Ser Trp Asp Asp Trp Asp Tyr Ala Ala Lys Val Thr210 215 220
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<212> PRT
<213> Clostridium perfringens
<400> 6
Trp Asp Gly Lys Ile Asp Gly Thr Gly Thr His Ala Met Ile Val Thr
1 5 10 15
Gln Gly Val Ser Ile Leu Glu Asn Asp Leu Ser Lys Asn Glu Pro Glu20 25 30
Ser Val Arg Lys Asn Leu Glu Ile Leu Lys Glu Asn Met His Glu Leu35 40 45
Gln Leu Gly Ser Thr Tyr Pro Asp Tyr Asp Lys Asn Ala Tyr Asp Leu50 55 60
55 Tyr Gln Asp His Phe Trp Asp Pro Asp Thr Asp Asn Asn Phe Ser Lys65 70 75 80
Asp Asn Ser Trp Tyr Leu Ala Tyr Ser Ile Pro Asp Thr Gly Glu Ser60 85 90 95Gln Ile Arg Lys Phe Ser Ala Leu Ala Arg Tyr Glu Trp Gln Arg Gly100 105 110
Asn Tyr Lys Gln Ala Thr Phe Tyr Leu Gly Glu Ala Met His Tyr Phe115 120 125
Gly Asp Ile Asp Thr Pro Tyr His Pro Ala Asn Val Thr Ala Val Asp130 135 140
Ser Ala Gly His Val Lys Phe Glu Thr Phe Ala Glu Glu Arg Lys Glu145 150 155 160
Gln Tyr Lys Ile Asn Thr Ala Gly Cys Lys Thr Asn Glu Asp Phe Tyr165 170 175
Ala Asp Ile Leu Lys Asn Lys Asp Phe Asn Ala Trp Ser Lys Glu Tyr180 185 190
Ala Arg Gly Phe Ala Lys Thr Gly Lys Ser Ile Tyr Tyr Ser His Ala195 200 205
Ser Met Ser His Ser Trp Asp Asp Trp Asp Tyr Ala Ala Lys Val Thr210 215 220
Leu Ala Asn Ser Gln Lys Gly Thr Ala Gly Tyr Ile Tyr Arg Phe Leu225 230 235 240
His Asp Val Ser Glu Gly Asn Asp Pro Ser Val Gly Lys Asn Val Lys245 250 255
Glu Leu Val Ala Tyr Ile Ser Thr Ser Gly Glu Lys Asp Ala Gly Thr260 265 270
Asp Asp Tyr Met Tyr Phe275
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<212> DNA
<213> Clostridium perfringens
<220><221> CDS<222> (1)..(120)<400> 7
tac ata tca act agt ggt gaa aaa gat gct gga aca gat gac tac atg48
Tyr Ile Ser Thr Ser Gly Glu Lys Asp Ala Gly Thr Asp Asp Tyr Met15 10 15
tat ttt gga ate aaa aca aag gat gga aaa act caa gaa tgg gaa atg96
Tyr Phe Gly Ile Lys Thr Lys Asp Gly Lys Thr Gln Glu Trp Glu Met20 25 30
gac aac cca gga aat gat ttt atg120
Asp Asn Pro Gly Asn Asp Phe Met35 40
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Tyr Ile Ser Thr Ser Gly Glu Lys Asp Ala Gly Thr Asp Asp Tyr Met15 10 15
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Asp Asn Pro Gly Asn Asp Phe Met35 40
<210> 9
<211> 1197
<212> DNA
<213> Clostridium perfringens
<220>
<221> CDS<222> (1)..(1194)
<400> 9
atg aaa aga aag att tgt aag gcg ctt att tgt gct acg cta gea act48
Met Lys Arg Lys Ile Cys Lys Ala Leu Ile Cys Ala Thr Leu Ala Thr15 10 15
age cta tgg gct ggg gea tca act aaa gtc tac gct tgg gat gga aag96
Ser Leu Trp Ala Gly Ala Ser Thr Lys Val Tyr Ala Trp Asp Gly Lys20 25 30
att gat gga aca gga act cat gct atg att gta act caa ggg gtt tca144
Ile Asp Gly Thr Gly Thr His Ala Met Ile Val Thr Gln Gly Val Ser35 40 45
ate tta gaa aat gat ctg tcc aaa aat gaa cca gaa agt gta aga aaa192
Ile Leu Glu Asn Asp Leu Ser Lys Asn Glu Pro Glu Ser Val Arg Lys50 55 60
aac tta gag att tta aaa gag aac atg cat gag ctt caa tta ggt tet240
Asn Leu Glu Ile Leu Lys Glu Asn Met His Glu Leu Gln Leu Gly Ser65 70 75 80
act tat cca gat tat gat aag aat gea tat gat cta tat caa gat cat288
Thr Tyr Pro Asp Tyr Asp Lys Asn Ala Tyr Asp Leu Tyr Gln Asp His85 90 95
ttc tgg gat cct gat aca gat aat aat ttc tca aag gat aat agt tgg336
Phe Trp Asp Pro Asp Thr Asp Asn Asn Phe Ser Lys Asp Asn Ser Trp100 105 110
tat tta gct tat tet ata cct gac aca ggg gaa tca caa ata aga aaa384
Tyr Leu Ala Tyr Ser Ile Pro Asp Thr Gly Glu Ser Gln Ile Arg Lys
115 120 125
ttt tca gea tta gct aga tat gaa tgg caa aga gga aac tat aaa caa432
Phe Ser Ala Leu Ala Arg Tyr Glu Trp Gln Arg Gly Asn Tyr Lys Gln130 135 140
gct aca ttc tat ctt gga gag gct atg cac tat ttt gga gat ata gat480
Ala Thr Phe Tyr Leu Gly Glu Ala Met His Tyr Phe Gly Asp Ile Asp
145 150 155 160
act cca tat cat cct gct aat gtt act gcc gtt gat age gea gga cat528
Thr Pro Tyr His Pro Ala Asn Val Thr Ala Val Asp Ser Ala Gly His
165 170 175
gtt aag ttt gaa act ttt gea gag gaa aga aaa gaa cag tat aaa ata576
Val Lys Phe Glu Thr Phe Ala Glu Glu Arg Lys Glu Gln Tyr Lys Ile180 185 190
aac aca gea ggt tgc aaa act aat gag gat ttt tat gct gat ate tta624
Asn Thr Ala Gly Cys Lys Thr Asn Glu Asp Phe Tyr Ala Asp Ile Leu
195 200 205
aaa aac aag gat ttt aat gea tgg tca aaa gaa tat gea aga ggt ttt672
Lys Asn Lys Asp Phe Asn Ala Trp Ser Lys Glu Tyr Ala Arg Gly Phe210 215 220
gct aaa aca gga aaa tca ata tac tat agt cat gct age atg agt cat720
Ala Lys Thr Gly Lys Ser Ile Tyr Tyr Ser His Ala Ser Met Ser His225 230 235 240
agt tgg gat gat tgg gat tat gca gca aag gta act tta gct aac tct768
Ser Trp Asp Asp Trp Asp Tyr Ala Ala Lys Val Thr Leu Ala Asn Ser
245 250 255
caa aaa gga aca gca gga tat att tat aga ttc tta cac gat gta tca816
Gln Lys Gly Thr Ala Gly Tyr Ile Tyr Arg Phe Leu His Asp Val Ser260 265 270
gag ggt aat gat cca tca gtt gga aag aat gta aaa gaa cta gta gct864
Glu Gly Asn Asp Pro Ser Val Gly Lys Asn Val Lys Glu Leu Val Ala275 280 285
tac ata tca act agt ggt gaa aaa gat gct gga aca gat gac tac atg912
Tyr Ile Ser Thr Ser Gly Glu Lys Asp Ala Gly Thr Asp Asp Tyr Met290 295 300
tat ttt gga ate aaa aca aag gat gga aaa act caa gaa tgg gaa atg960
Tyr Phe Gly Ile Lys Thr Lys Asp Gly Lys Thr Gln Glu Trp Glu Met
305 310 315 320
gac aac cca gga aat gat ttt atg act gga agt aaa gac act tat act1008
Asp Asn Pro Gly Asn Asp Phe Met Thr Gly Ser Lys Asp Thr Tyr Thr
325 330 335
ttc aaa tta aaa gat gaa aat cta aaa att gat gat ata caa aat atg1056
Phe Lys Leu Lys Asp Glu Asn Leu Lys Ile Asp Asp Ile Gln Asn Met
340 345 350
tgg att aga aaa aga aaa tat aca gca ttc cca gat gct tat aag cca1104
Trp Ile Arg Lys Arg Lys Tyr Thr Ala Phe Pro Asp Ala Tyr Lys Pro355 360 365
gaa aac ata aag ata ata gca aat gga aaa gtt gta gta gac aaa gat1152
Glu Asn Ile Lys Ile Ile Ala Asn Gly Lys Val Val Val Asp Lys Asp370 375 380
ata aat gag tgg att tca gga aat tca act tat aat ata aaa taa1197
Ile Asn Glu Trp Ile Ser Gly Asn Ser Thr Tyr Asn Ile Lys385 390 395
<210> 10<211> 398
<212> PRT
<213> Clostridium perfringens
<400> 10Met Lys Arg Lys Ile Cys Lys Ala Leu Ile Cys Ala Thr Leu Ala Thr15 10 15
Ser Leu Trp Ala Gly Ala Ser Thr Lys Val Tyr Ala Trp Asp Gly Lys20 25 30
Ile Asp Gly Thr Gly Thr His Ala Met Ile Val Thr Gln Gly Val Ser35 40 45
Ile Leu Glu Asn Asp Leu Ser Lys Asn Glu Pro Glu Ser Val Arg Lys50 55 60
Asn Leu Glu Ile Leu Lys Glu Asn Met His Glu Leu Gln Leu Gly Ser65 70 75 80
Thr Tyr Pro Asp Tyr Asp Lys Asn Ala Tyr Asp Leu Tyr Gln Asp His85 90 95
Phe Trp Asp Pro Asp Thr Asp Asn Asn Phe Ser Lys Asp Asn Ser Trp100 105 110
Tyr Leu Ala Tyr Ser Ile Pro Asp Thr Gly Glu Ser Gln Ile Arg Lys115 120 125
Phe Ser Ala Leu Ala Arg Tyr Glu Trp Gln Arg Gly Asn Tyr Lys Gln130 135 140
Ala Thr Phe Tyr Leu Gly Glu Ala Met His Tyr Phe Gly Asp Ile Asp145 150 155 160
Thr Pro Tyr His Pro Ala Asn Val Thr Ala Val Asp Ser Ala Gly His165 170 175
Val Lys Phe Glu Thr Phe Ala Glu Glu Arg Lys Glu Gln Tyr Lys Ile180 185 190
Asn Thr Ala Gly Cys Lys Thr Asn Glu Asp Phe Tyr Ala Asp Ile Leu195 200 205
Lys Asn Lys Asp Phe Asn Ala Trp Ser Lys Glu Tyr Ala Arg Gly Phe210 215 220
Ala Lys Thr Gly Lys Ser Ile Tyr Tyr Ser His Ala Ser Met Ser His225 230 235 240Ser Trp Asp Asp Trp Asp Tyr Ala Ala Lys Val Thr Leu Ala Asn Ser245 250 255
Gln Lys Gly Thr Ala Gly Tyr Ile Tyr Arg Phe Leu His Asp Val Ser260 265 270
Glu Gly Asn Asp Pro Ser Val Gly Lys Asn Val Lys Glu Leu Val Ala10 275 280 285
Tyr Ile Ser Thr Ser Gly Glu Lys Asp Ala Gly Thr Asp Asp Tyr Met290 295 300
Tyr Phe Gly Ile Lys Thr Lys Asp Gly Lys Thr Gln Glu Trp Glu Met305 310 315 320
Asp Asn Pro Gly Asn Asp Phe Met Thr Gly Ser Lys Asp Thr Tyr Thr325 330 335
Phe Lys Leu Lys Asp Glu Asn Leu Lys Ile Asp Asp Ile Gln Asn Met340 345 350
Trp Ile Arg Lys Arg Lys Tyr Thr Ala Phe Pro Asp Ala Tyr Lys Pro
30 355 360 365
Glu Asn Ile Lys Ile Ile Ala Asn Gly Lys Val Val Val Asp Lys Asp370 375 380
Ile Asn Glu Trp Ile Ser Gly Asn Ser Thr Tyr Asn Ile Lys385 390 395
<210> 11<211> 336<212> PRT
<213> Clostridium perfringens<400> 11
Met Lys Lys Lys Phe Ile Ser Leu Val Ile Val Ser Ser Leu Leu Asn15 10 15
Gly Cys Leu Leu Ser Pro Arg Leu Val Tyr Ala Asn Asp Ile Gly Lys20 25 30
Thr Thr Thr Ile Thr Arg Asn Lys Thr Ser Asp Gly Tyr Thr Ile Ile35 40 45
Thr Gln Asn Asp Lys Trp Ile Ile Ser Tyr Gln Ser Val Asp Ser Ser50 55 60
Ser Lys Asn Glu Asp Gly Phe Thr Ala Ser Ile Asp Ala Arg Phe Ile65 70 75 80
Asp Asp Lys Tyr Ser Ser Glu Met Thr Thr Leu Ile Asn Leu Thr Gly85 90 95
Phe Met Ser Ser Lys Lys Glu Asp Val Ile Lys Lys Tyr Asn Leu His100 105 110
Asp Asn Thr Asn Ser Thr Ala Ile Asn Phe Pro Val Arg Tyr Ser Ile115 120 125
Ser Ile Leu Asn Glu Ser Ile Asn Glu Asn Val Lys Ile Val Asp Ser130 135 140
Ile Pro Lys Asn Thr Ile Ser Gln Lys Thr Val Ser Asn Thr Met Gly145 150 155 160
Tyr Lys Ile Gly Gly Ser Ile Glu Ile Glu Glu Asn Lys Pro Lys Ala165 170 175
Ser Ile Glu Ser Glu Tyr Ala Glu Ser Ser Thr Ile Glu Tyr Val Gln180 185 190
Pro Asp Phe Ser Thr Ile Gln Thr Asp His Ser Thr Ser Lys Ala Ser195 200 205
Trp Asp Thr Lys Phe Thr Glu Thr Thr Arg Gly Asn Tyr Asn Leu Lys210 215 220
Ser Asn Asn Pro Val Tyr Gly Asn Glu Met Phe Met Tyr Gly Arg Tyr225 230 235 240
Thr Asn Val Pro Ala Thr Glu Asn Ile Ile Pro Asp Tyr Gln Met Ser245 250 255
Lys Leu Ile Thr Gly Gly Leu Asn Pro Asn Met Ser Val Val Leu Thr260 265 270
Ala Pro Asn Gly Thr Glu Glu Ser Ile Ile Lys Val Lys Met Glu Arg275 280 285
Glu Arg Asn Cys Tyr Tyr Leu Asn Trp Asn Gly Ala Asn Trp Val Gly290 295 300
Gln Val Tyr Ser Arg Leu Ala Phe Asp Thr Pro Asn Val Asp Ser His 305 310 315 320
Ile Phe Thr Phe Lys Ile Asn Trp Leu Thr His Lys Val Thr Ala Ile325 330 335
<210> 12<211> 328<212> PRT<213> Clostridium perfringens<400> 12
Met Lys Lys Asn Leu Val Lys Ser Leu Ala Ile Ala Ser Ala Val Ile 1 5 10 15
Ser Ile Tyr Ser Ile Val Asn Ile Val Ser Pro Thr Asn Val Ile Ala20 25 30
Lys Glu Ile Ser Asn Thr Val Ser Asn Glu Met Ser Lys Lys Ala Ser35 40 45
Tyr Asp Asn Val Asp Thr Leu Ile Glu Lys Gly Arg Tyr Asn Thr Lys50 55 60
35 Tyr Asn Tyr Leu Lys Arg Met Glu Lys Tyr Tyr Pro Asn Ala Met Ala65 70 75 80
Tyr Phe Asp Lys Val Thr Ile Asn Pro Gln Gly Asn Asp Phe Tyr Ile 85 90 95
Asn Asn Pro Lys Val Glu Leu Asp Gly Glu Pro Ser Met Asn Tyr Leu100 105 110
Glu Asp Val Tyr Val Gly Lys Ala Leu Leu Thr Asn Asp Thr Gln Gln115 120 125
Glu Gln Lys Leu Lys Ser Gln Ser Phe Thr Cys Lys Asn Thr Asp Thr130 135 140
55 Val Thr Ala Thr Thr Thr His Thr Val Gly Thr Ser Ile Gln Ala Thr145 150 155 160
Ala Lys Phe Thr Val Pro Phe Asn Glu Thr Gly Val Ser Leu Thr Thr60 165 170 175Ser Tyr Ser Phe Ala Asn Thr Asn Thr Asn Thr Asn Ser Lys Glu Ile180 185 190
Thr His Asn Val Pro Ser Gln Asp Ile Leu Val Pro Ala Asn Thr Thr195 200 205
Val Glu Val Ile Ala Tyr Leu Lys Lys Val Asn Val Lys Gly Asn Val210 215 220
Lys Leu Val Gly Gln Val Ser Gly Ser Glu Trp Gly Glu Ile Pro Ser225 230 235 240
Tyr Leu Ala Phe Pro Arg Asp Gly Tyr Lys Phe Ser Leu Ser Asp Thr245 250 255
Val Asn Lys Ser Asp Leu Asn Glu Asp Gly Thr Ile Asn Ile Asn Gly260 265 270
Lys Gly Asn Tyr Ser Ala Val Met Gly Asp Glu Leu Ile Val Lys Val275 280 285
Arg Asn Leu Asn Thr Asn Asn Val Gln Glu Tyr Val Ile Pro Val Asp290 295 300
Lys Lys Glu Lys Ser Asn Asp Ser Asn Ile Val Lys Tyr Arg Ser Leu305 310 315 320
Tyr Ile Lys Ala Pro Gly Ile Lys325
<210> 13<211> 283<212> PRT
<213> Clostridium perfringens<400> 13
Lys Ala Ser Tyr Asp Asn Val Asp Thr Leu Ile Glu Lys Gly Arg Tyr15 10 15
Asn Thr Lys Tyr Asn Tyr Leu Lys Arg Met Glu Lys Tyr Tyr Pro Asn20 25 30
Ala Met Ala Tyr Phe Asp Lys Val Thr Ile Asn Pro Gln Gly Asn Asp35 40 45Phe Tyr Ile Asn Asn Pro Lys Val Glu Leu Asp Gly Glu Pro Ser Met50 55 60
Asn Tyr Leu Glu Asp Val Tyr Val Gly Lys Ala Leu Leu Thr Asn Asp65 70 75 80
Thr Gln Gln Glu Gln Lys Leu Lys Ser Gln Ser Phe Thr Cys Lys Asn
85 90 95
Thr Asp Thr Val Thr Ala Thr Thr Thr His Thr Val Gly Thr Ser Ile
100 105 110
Gln Ala Thr Ala Lys Phe Thr Val Pro Phe Asn Glu Thr Gly Val Ser115 120 125
Leu Thr Thr Ser Tyr Ser Phe Ala Asn Thr Asn Thr Asn Thr Asn Ser130 135 140
Lys Glu Ile Thr His Asn Val Pro Ser Gln Asp Ile Leu Val Pro Ala145 150 155 160
Asn Thr Thr Val Glu Val Ile Ala Tyr Leu Lys Lys Val Asn Val Lys
165 170 175
Gly Asn Val Lys Leu Val Gly Gln Val Ser Gly Ser Glu Trp Gly Glu
180 185 190
Ile Pro Ser Tyr Leu Ala Phe Pro Arg Asp Gly Tyr Lys Phe Ser Leu195 200 205
Ser Asp Thr Val Asn Lys Ser Asp Leu Asn Glu Asp Gly Thr Ile Asn210 215 220
Ile Asn Gly Lys Gly Asn Tyr Ser Ala Val Met Gly Asp Glu Leu Ile225 230 235 240
Val Lys Val Arg Asn Leu Asn Thr Asn Asn Val Gln Glu Tyr Val Ile
245 250 255
Pro Val Asp Lys Lys Glu Lys Ser Asn Asp Ser Asn Ile Val Lys Tyr
260 265 270
Arg Ser Leu Tyr Ile Lys Ala Pro Gly Ile Lys275 280

Claims (70)

1. Método de imunizar um paciente aviário contra um patógeno,compreendendo administrar em ovo, durante o quarto final de incubação,uma dose imunizadora efetiva de uma composição que induz uma respostaimune contra o patógeno, onde a composição imunogênica é administradapor injeção em ovo diretamente no embrião.
2. Método da reivindicação 1, onde a composição é administradadiretamente no tecido do músculo esquelético no embrião.
3. Método da reivindicação 2, onde o tecido do músculoesquelético é selecionado a partir do grupo que consiste em tecido domúsculo do peito e tecido do músculo do óvulo maduro.
4. Método da reivindicação 1, onde a composição é administradadiretamente no embrião na cabeça, pescoço, ombro, asa, dorso, peito, pernaou qualquer combinação destes.
5. Método da reivindicação 1, onde a composição é administradaao embrião de modo subcutâneo, intradérmico, intravenoso, intramuscular,intra-abdominal ou qualquer combinação destes.
6. Método da reivindicação 5, onde a composição é administradaao embrião de modo subcutâneo.
7. Método da reivindicação 5, onde a composição é administradaao embrião de modo intra-abdominal.
8. Método da reivindicação 1, onde o paciente aviário é umagalinha.
9. Método da reivindicação 8, onde a composição é administradaa partir do dia 15 até o dia 20 de incubação.
10. Método da reivindicação 8, onde a composição éadministrada no dia 18 ou 19 da incubação.
11. Método da reivindicação 1, onde a composição compreendeuma emulsão de água em óleo em água.
12. Método da reivindicação 1, onde a composição éadministrada em uma agulha tendo um comprimento de 1,905 centímetro a-10,16 centímetros (¾ de polegada a 4 polegadas).
13. Método da reivindicação 12, onde a agulha tem uma escalavariando de escala 15 até a escala 28.
14. Método da reivindicação 12, onde a agulha tem umaextremidade não pontuda.
15. Método da reivindicação 12, onde a agulha tem umaextremidade afiada.
16. Método da reivindicação 15, onde a agulha tem umainclinação com um ângulo variando de cerca de 10° a cerca de 45°.
17. Método da reivindicação 12, onde a agulha passa através dacasca na extremidade grande de um ovo em um desvio do ângulo em tornode 1° a cerca de 20° a partir do eixo longo do ovo.
18. Método da reivindicação 1, adicionalmente compreendendoa etapa de administrar uma dose de reforço da composição ao pacienteaviário após a eclosão.
19. Método da reivindicação 1, onde a composição compreendeum adjuvante.
20. Método da reivindicação 19, onde o adjuvante compreendeum adjuvante derivado de alumínio, uma saponina, géis minerais, poliânions,polióis pluronic, derivados de saponina, lisolecitina e outras substânciastensoativas similares, glicosídeos, todos os tipos de óleos e qualquercombinação destes.
21. Método da reivindicação 1, onde a composição induz umaresposta imune para tratar e/ou prevenir coccidiose, doença de Marek,doença bursal infecciosa, doença de Newcastle, infecção de varíola aviária,infecção por Clostridium spp., infIuenza aviária, bronquite infecciosa,infecção por vírus da anemia de pinto, laringotraqueíte, infecção porpneumovírus aviário, infecção por reovírus aviário, infecção por adenovírusaviário, infecção por rotavírus, infecção por astrovírus, hepatite por corposde inclusão, síndrome da queda de postura, infecção por Escherichia coli,infecção por Mucoplasma spp., infecção por Salmonella spp., infecção porCampylobacter spp., infecção por Haemophillus spp., infecção por Listeriaspp., Pasteurella spp. e qualquer combinação destas.
22. Método da reivindicação 1, onde a composição compreendeum agente não replicador que induz uma resposta imune contra o patógeno.
23. Método da reivindicação 1, onde uma dose imunizadoraefetiva de duas ou mais composições que induzem uma resposta imunecontra o patógeno são administradas em ovo ao embrião, onde as duas oumais composições são administradas de modo simultâneo ou seqüencial emqualquer ordem.
24. Método da reivindicação 1, onde uma dose imunizadoraefetiva de duas ou mais composições que induzem uma resposta imunecontra o patógeno são administradas em ovo e pelo menos uma composiçãoé administrada ao embrião, onde as duas ou mais composições sãoadministradas de modo simultâneo ou seqüencial em qualquer ordem.
25. Método da reivindicação 24, onde pelo menos umacomposição é administrada ao âmnio, ao fluido amniótico, ao corpo doembrião, ao saco vitelino ou qualquer combinação destes.
26. Método da reivindicação 1, adicionalmente compreendendoadministrar em ovo um estimulante imune em qualquer tempo durante aincubação, onde o estimulante imune e a composição são administrados demodo simultâneo ou seqüencial em qualquer ordem.
27. Método da reivindicação 1, adicionalmente compreendendoadministrar em ovo uma formulação nutriente, um modulador entérico, ouuma combinação destes em qualquer tempo durante a incubação, onde aformulação nutriente, o modulador entérico ou uma combinação destes e acomposição são administrados de modo simultâneo ou seqüencial emqualquer ordem.
28. Método da reivindicação 1, onde a composição éadministrada em ovo com um dispositivo de injeção de automação.
29. Um método de imunizar um paciente aviário contra infecçãopor Clostridium, compreendendo administrar em ovo, durante o quarto finalde incubação, uma dose imunizadora efetiva de uma composiçãoimunogênica que induz uma resposta imune contra uma espécie deClostridium, onde a composição imunogênica é administrada por injeção em
30. Método da reivindicação 29, onde a composiçãoimunogênica é administrada ao âmnio.
31. Método da reivindicação 30, onde a composiçãoimunogênica é administrada axialmente através da extremidade grande doovo no fluido amniótico.
32. Método da reivindicação 29, onde a composiçãoimunogênica é administrada diretamente no corpo do embrião.
33. Método da reivindicação 32, onde a composiçãoimunogênica é administrada ao embrião de modo parenteral.
34. Método da reivindicação 29, onde o paciente aviário é umagalinha.
35. Método da reivindicação 34, onde a composiçãoimunogênica é administrada a partir do dia 15 até o dia 20 de incubação.
36. Método da reivindicação 34, onde a composiçãoimunogênica é administrada no dia 18 ou 19 da incubação.
37. Método da reivindicação 29, onde o paciente aviário é umperu.
38. Método da reivindicação 29, onde a composiçãoimunogênica compreende um toxóide de Clostridium perfringens.
39. Método da reivindicação 29, onde a composiçãoimunogênica compreende uma bacterina de Clostridium perfringens.
40. Método da reivindicação 29, onde a composiçãoimunogênica compreende um toxóide de Clostridium perfringens e umabacterina de Clostridium perfringens.
41. Método da reivindicação 29, onde a composiçãoimunogênica compreende uma toxina de Clostridium perfringens.
42. Método da reivindicação 41, onde a toxina de Clostridiumperfringens é uma toxina alfa de Clostridium perfringens.
43. Método da reivindicação 29, onde a composiçãoimunogênica compreende um Clostridium perfringens atenuado.
44. Método da reivindicação 29, onde a composiçãoimunogênica compreende uma emulsão de água em óleo em água.
45. Método da reivindicação 29, onde a composiçãoimunogênica compreende um adjuvante.
46. Método da reivindicação 45, onde o adjuvante compreendeum adjuvante derivado de alumínio, uma saponina, um óleo, ou qualquercombinação dos precedentes.
47. Método da reivindicação 29 adicionalmente compreendendoadministrar em ovo um estimulante imune em qualquer tempo durante aincubação.
48. Método da reivindicação 29, adicionalmente compreendendoadministrar em ovo uma vacina de coccidiose, uma vacina de doença deMarek, uma vacina de doença bursal infecciosa, uma vacina de doença deNewcastle, uma vacina de varíola aviária, ou qualquer combinação dasprecedentes.
49. Método da reivindicação 48, onde a composiçãoimunogênica e a vacina são administradas simultaneamente.
50. Método da reivindicação 48, onde a composiçãoimunogênica e a vacina são administradas na mesma formulação.
51. Método da reivindicação 29, adicionalmente compreendendoadministrar em ovo uma formulação nutriente, um modulador entérico, ouuma combinação destes.
52. Uma composição imunogênica compreendendo uma doseimunizadora efetiva de um Clostridium perfringens atenuado em um veículofarmaceuticamente aceitável.
53. A composição imunogênica da reivindicação 52, onde acomposição imunogênica compreende uma emulsão de água em óleo emágua.
54. A composição imunogênica da reivindicação 52, onde acomposição imunogênica compreende um adjuvante.
55. A composição imunogênica da reivindicação 52, onde acomposição imunogênica adicionalmente compreende uma vacina decoccidiose, uma vacina de doença de Marek, uma vacina de doença bursalinfecciosa, uma vacina de doença de Newcastle, uma vacina de varíolaaviária, ou qualquer combinação das precedentes.
56. A composição imunogênica da reivindicação 52, onde acomposição adicionalmente compreende uma formulação nutriente, ummodulador entérico, ou uma combinação destes.
57. Uma composição imunogênica compreendendo em umveículo farmaceuticamente aceitável:(a) uma dose imunizadora efetiva de um toxóide deClostridium perfringens, uma bacterina de Clostridium perfringens, umatoxina de C. perfringens, ou qualquer combinação dos precedentes; e(b) uma dose imunizadora efetiva de uma vacina decoccidiose, uma vacina de doença de Marek, uma vacina de doença bursalinfecciosa, uma vacina de doença de Newcastle, uma vacina de varíolaaviária, ou qualquer combinação das precedentes.
58. Uma composição imunogênica compreendendo em umveículo farmaceuticamente aceitável:(a) uma dose imunizadora efetiva de um toxóide deClostridium perfringens, uma bacterina de Clostridium perfringens, umatoxina de C. perfringens, ou qualquer combinação dos precedentes; e(b) uma emulsão de água em óleo em água.
59. Uma composição imunogênica compreendendo em umveículo farmaceuticamente aceitável:(a) uma dose imunizadora efetiva de um toxóide deClostridium perfringens, uma bacterina de Clostridium perfringens, umatoxina de C. perfringens, ou qualquer combinação dos precedentes; e(b) um adjuvante compreendendo um adjuvante derivadode alumínio, uma saponina, um óleo, ou qualquer combinação dosprecedentes.
60. Um método de imunizar um paciente aviário contra infecçãopor Clostridium, compreendendo administrar ao paciente aviário uma doseimunizadora efetiva de uma composição de bacterina-toxóide de Clostridiumpor injeção em ovo durante o quarto final de incubação.
61. Método da reivindicação 60, adicionalmente compreendendoa etapa de administrar uma dose de reforço da composição de bacterina-toxóide de Clostridium ao paciente aviário após a eclosão.
62. Método da reivindicação 60, onde o paciente aviário é umagalinha.
63. Método da reivindicação 60, onde a composiçãoadicionalmente compreende um adjuvante.
64. Método da reivindicação 60, onde a composiçãocompreende uma vacina Vision CD®.
65. Um método de imunizar um paciente aviário contra infecçãopor Clostridium, compreendendo administrar ao paciente aviário uma doseimunizadora efetiva de uma toxina recombinante ou seu fragmentoimunogênico de Clostridium por injeção em ovo durante o quarto final deincubação.
66. Método da reivindicação 65, adicionalmente compreendendoa etapa de administrar uma dose de reforço da toxina recombinante ou seu"j fragmento imunogênico ao paciente aviário após a eclosão.
67. Método da reivindicação 65, onde o paciente aviário é umagalinha.
68. Método da reivindicação 65, onde a toxina é administradacom um adjuvante.
69. Método da reivindicação 68, onde o adjuvante é Quil A eadjuvante de Freund incompleto.
70. Um método de imunizar um paciente aviário contra enteritenecrótica, compreendendo administrar em ovo, durante o quarto final deincubação, uma dose imunizadora efetiva de uma composição imunogênicaque induz uma resposta imune contra uma espécie de Clostridium, onde acomposição imunogênica é administrada por injeção em ovo.
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