BRPI0717983A2 - Alelos de gene prpd1 de bactérias corineformes. - Google Patents

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "ALELOS DO GENE PRPD1 DE BACTÉRIAS CORINEFORMES".

A presente invenção refere-se a mutantes e alelos do gene prpD1 de bactérias corineformes codificadores de variantes da 2-metilcitrato desidratase (EC no. 4,2,1,79) e métodos para produzir aminoácidos, especi- almente L-Iisina1 L-triptofano, L-valina, L-isoleucina, e L-homoserina usando bactérias que compreendem esses alelos. Técnica anterior

Aminoácidos são usados na medicina humana, na indústria far- macêutica, na indústria de alimentos e, de maneira muito especial, na nutri- ção animal.

Sabe-se que os aminoácidos são produzidos pela fermentação de cepas de bactérias corineformes, especialmente a Corynebacterium glu- tamicum. Devido à sua grande importância, o trabalho no sentido de melho- rar os métodos de produção é realizado continuamente. Melhorias dos mé- todos podem ser tecnologias de fermentação, tais como, por exemplo, agitar e fornecer oxigênio, ou se referir à composição dos meios nutrientes, tais como, por exemplo, a concentração de açúcar durante a fermentação, ou o desenvolvimento à forma do produto mediante, por exemplo, cromatografia de troca iônica ou as propriedades de produção intrínsecas do próprio orga- nismo.

Os métodos utilizados para melhorar as propriedades de produ- ção desses micro-organismos são métodos de mutagênese, seleção e esco- lha de mutantes. As cepas obtidas desta maneira são resistentes a antime- tabólitos ou são auxotróficas para metabólitos de importância reguladora e produzem os aminoácidos. Um anti-metabólito conhecido é o análogo da Iisina S-(2-aminoetil)-L-cisteína (AEC).

Métodos de tecnologia de DNA recombinante vêm sendo igual- mente usados há alguns anos para a melhoria das cepas produtoras de L- aminoácidos da Corynebacterium mediante amplificação de genes individu- ais de biossíntese de aminoácidos e investigação dos efeitos sobre a produ- ção de aminoácidos. O cromossomo da Corynebacterium glutamicum foi completa- mente sequênciado alguns anos atrás (Kalinowski et ai, Journal of Biotech- nology 104, 5-25 (2003)). O cromossomo da Corynebacterium efficiens foi igualmente sequênciado (Nishio et ai, Genome Res. 13 (7), 1572-1579 (2003)).

Os dados das seqüências correspondentes podem ser obtidos nos bancos de dados públicos. Bancos de dados adequados são, por exem- plo, o dos European Molecular Biology Laboratories (EMBL, Heldelberg, A- lemanha, e Cambridge, Reino Unido), o banco de dados do National Center for Biotechnology Information (NCBI, Bethesda, MD, EUA), o do Swiss Insti- tute of Bioinformatics (Swissprot, Genebra, Suíça), o Protein Information Re- source Database (PIR, Washington, DC1 EUA) e o DNA Data Bank of Japan (DDBJ, 1111 Yata, Mishima, 411-8540, Japão).

Descrições sumárias da genética, do metabolismo e da impor- tância industrial da Corynebacterium podem ser encontradas nos artigos de Ikeda, de Pfefferle et ai. e de Mueller e Huebner no livro "Microbial Producti- on of L-Amino Acids" (Advances in Biochemical Engineering 79, (2003), S- pringer Verlag, Berlim, Alemanha, editor: T. Scheper), na edição especial "A New Era in Corynebacterium glutamicum Biotechnology" do The Journal of Biotechnology (volume 104 (1-3), 2003, editores: A. Pühler and T. Tauch) e no "Handbook of Corynebacterium glutamicum" (editores: L. Eggeling e M. Bott, CRC Press, Taylor & Francis Group, Boca Raton, FL, EUA, 2005).

A seqüência de nucleotídeos do gene prpD1 codificador da 2- metilcitrato desidratase da Corynebacterium glutamicum está em geral dis- ponível inter alia nos bancos de dados do National Center for Biotechnology Information (NCBI) da National Library of Medicine (Bethesda, MD, EUA) sob o número de acesso AF434798. Ele pode também ser encontrado no pedido de patente EP 1 108 790 como a seqüência no. 770.

Claes et ai (Journal of Bacteriology 184(10), 2728-2739 (2002)) relatam investigações genéticas, microbiológicas e bioquímicas dos genes prpD1, prpB1 e prpC1 da Corynebacterium glutamicum ATCC 13032.

Para maior clareza, a seqüência de nucleotídeos do gene prpD1 codificador da 2-metilcitrato desidratase da Corynebacterium glutamicum (gene "wild type"), de acordo com os dados do banco de dados do NCBI, está representada na SEQ ID NO:1 e a seqüência de aminoácidos da 2- metilcitrato desidratase codificada resultante dele está representada na SEQ ID NO:2 e 4. As seqüências de nucleotídeos localizadas a montante e a ju- sante estão adicionalmente indicadas na SEQ ID NO:3. Objetivo da invenção

O objetivo dos inventores foi proporcionar novos métodos para a melhoria da produção de aminoácidos, especialmente L-lisina, L-triptofano, L-valina, L-isoleucina e L-homoserina. Descrição da invenção

A invenção refere-se a mutantes de bactérias corineformes ge- rados e isolados que preferencialmente secretam aminoácidos e que com- preendem um gene ou alelo que codifica um polipeptídeo com atividade típi- ca da 2-metilcitrato desidratase, caracterizados pelo fato de o polipeptídeo incluir uma seqüência de aminoácidos na qual um dos aminoácidos protei- nogênicos com exceção da L-prolina está presente na posição 272 ou em uma posição correspondente ou comparável da seqüência de aminoácidos. A substituição da L-prolina pela L-Ieucina é preferida. Dentre as bactérias corineformes, o gênero Corynebacterium é

preferido. No gênero Corynebacterium, as seguintes espécies são preferi- das:

Corynebaeterium effieiens (cepa de referência DSM44549), Corynebaeterium glutamicum (cepa de referência ATCC13032), Corynebaeterium thermoaminogens (por exemplo, a cepa FERM

BP-1539), e

Corynebaeterium ammoniagenes (cepa de referência ATCC6871), com preferência muito particular para a espécie Corynebacteri- um glutamicum.

Alguns representantes da espécie Corynebacterium glutamicum

são conhecidos na técnica mais recente também sob outras designações de espécie. Estas incluem, por exemplo: Corynebacterium acetoacidophilum ATCC127270, Corynebacterium Iilium DSM20137, Corynebacterium melassecola ATCC17965, Brevibacterium fIavum ATCC14067, Brevibaeterium Iaetofermentum ATCC127269,

Brevibaeterium divaricatum ATCC14020 e Mierobacterium ammoniaphilum ATCC15354. O termo "Mieroeoecus glutamieus" para a Corynebaeterium glu- tamieum também vem sendo usado. As cepas de bactérias corineformes empregadas nos métodos

da invenção preferivelmente já possuem a capacidade de enriquecer o ami- noácido desejado na célula e/ou secretá-lo no meio nutriente ao redor dela e acumulá-lo. O termo "produzir" também é usado doravante para essa ativi- dade. Em particular, as cepas de bactérias corineformes empregadas pos- suem a capacidade de liberar ou acumular > (no mínimo) 0,25 g/l, > 0,5 g/l, > 1,0 g/l, > 1,5 g/l, > 2,0 g/l, > 4,0 g/l ou > 10,0 g/l ao aminoácido desejado em < (no máximo) 120 horas, < 96 horas, < 48 horas, < 36 horas, < 24 horas ou < 12 horas na célula ou no meio nutriente. Neste contexto, as cepas po- dem ter sido produzidas por mutagênese e seleção, por técnicas de DNA recombinante ou por uma combinação dos dois métodos.

Representantes conhecidas das cepas de bactérias corinefor- mes produtoras ou secretoras de L-Iisina são, por exemplo:

Corynebaeterium glutamieum DM58-1/pDM6 (= DSM4697) des- crita em EP 0 358 940. Corynebaeterium glutamieum MH20-22B (= DSM16835) descrita

em Menkel et ai (Applied and Environmental Microbiology 55(3), 684-688 (1989)),

Corynebaeterium glutamieum AHP-3 (= Ferm BP-7382) descrita em EP 1 108 790,

Corynebaeterium glutamieum NRRL B-11474 descrita em US

4.275.157 e

Corynebaeterium thermoaminogenes AJ12521 (= FERM BP- 3304) descrita em US 5.250.423.

Representantes conhecidas das cepas de bactérias corinefor- mes produtoras ou secretoras de L-triptofano são, por exemplo:

Corynebacterium glutamicum K76 (=Ferm BP-1847) descrita em US 5.563.052,

Corynebacterium glutamicum BPS13 (=Ferm BP-1777) descrita em US 5.605.818 e

Corynebacterium glutamicum Ferm BP-3055 descrita em US

5.235.940.

Representantes conhecidas das cepas de bactérias corinefor-

mes produtoras ou secretoras de L-valina são, por exemplo:

Brevibacterium Iactofermentum FERM BP-1763 descrita em US

5.188.948,

Brevibacterium Iactofermentum FERM BP-3007 descrita em US

5.521.074,

Corynebacterium glutamicum FERM BP-3006 descrita em US

5.521.074 e

Corynebacterium glutamicum FERM BP-1764 descrita em US

5.188.948.

Representantes conhecidas das cepas de bactérias corinefor-

mes produtoras ou secretoras de L-isoleucina são, por exemplo:

Brevibacterium flavum FERM BP-760 descrita em US 4.656.135, Brevibacterium flavum FERM BP-2215 descrita em US

5.294.547 e

Corynebacterium glutamicum FERM BP-758 descrita em US

4.656.135.

Representantes conhecidas das cepas de bactérias corinefor- mes produtoras ou secretoras de L-homoserina são, por exemplo:

Micrococcus glutamicus ATCC 14296 descrita em US 3.189.526

e

Micrococcus glutamicus ATCC 14297 descrita em US 3.189.526. Dados sobre a classificação taxonômica das cepas desse grupo de bactérias podem ser encontrados inter alia em Seiler (Journal of General Microbiology 129, 1433-1477 (1983)), Kinoshita (1985, GIutamicAcid Bacté- ria, pp 115-142. In: Demain and Solomon (ed), Biology of Industrial Microor- ganisms. The Benjamin/Cummins Publishing Co., Londres, Reino Unido), Kãmpfer and Kroppenstedt (Canadian Journal of Mierobiology 42, 989-1005 (1996)), Liebl et ai (International Journal of Systematie Baeteriology 41, 255- 260 (1991)) e em US-A-5.250.434.

Cepas com a designação "ATCC" podem ser adquiridas da A- merican Type Culture Collection (Manassas, VA, EUA). Cepas com a desig- nação "DSM" podem ser adquiridas da Deutsche Sammlung von Mikroorga- nismen and Zellkulturen (DSMZ, Brunswick, Alemanha). Cepas com a desig- nação "NRRL" podem ser adquiridas da Agricultural Research Service Pa- tent Culture Collection (ARS, Peoria, Illinois, EUA). Cepas com a designação "FERM" podem ser adquiridas do National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (AIST Tsukuba Central 6, 1-1-1 Higashi, Tsukuba Ibaraki, Japão).

Ao polipeptídeo codificado pelo gene prpD1 com atividade típica da 2-metiIcitrato desidratase (PrpDI) é alocado o número EC 4,2,1,79 de acordo com a nomenclatura da IUPAC (International Union of Pure and Ap- plied Chemistry).

Quimicamente, um gene é um polinucleotídeo. Outro termo para isso é ácido nucleico.

Aminoácidos proteinogênicos são os aminoácidos que ocorrem em proteínas naturais, ou seja, em proteínas de micro-organismos, plantas, animais e humanos. No contexto da presente invenção, aminoácidos protei- nogênicos são o grupo de aminoácidos consistindo em L-ácido aspártico, L- asparagina, L-treonina, L-serina, L-ácido glutâmico, L-glutamina, glicina, L- alanina, L-cisteína, L-valina, L-metionina, L-isoleucina, L-leucina, L-tirosina, L-fenilalanina, L-histidina, L-lisina, L-triptofano, L-prolina e L-arginina e, quando apropriado, L-selenocisteína. Os L-aminoácidos incluem igualmente a L-homoserina.

Os mutantes de acordo com a invenção preferivelmente secre- tam os aminoácidos proteinogênicos mencionados, especialmente L-lisina, L-triptofano, L-valina, L-isoleucina ou L-homoserina. O termo aminoácido também inclui sais dos mesmos, tais como, por exemplo, Iisina mono- hidrocloreto ou Iisina sulfato no caso do aminoácido L-lisina.

A invenção refere-se ainda a mutantes de bactérias corinefor-

mes que compreendem um alelo prpD1 que codifica um polipeptídeo com a atividade enzimática típica da 2-metilcitrato desidratase que inclui a seqüên- cia de aminoácidos da SEQ ID N0:2, estando um dos aminoácidos proteino- gênicos exceto a L-prolina presente na posição 272. A troca da L-prolina por L-Ieucina é preferida.

A invenção refere-se adicionalmente a mutantes de bactérias corineformes que compreendem um alelo prpD1 que codifica um polipeptí- deo com a atividade enzimática típica da 2-metilcitrato desidratase, que compreende um aminoácido proteinogênico exceto a L-prolina, preferivel- mente a L-leucina, na posição correspondente à posição 272 da seqüência de aminoácidos da SEQ ID NO:2, incluindo o gene uma seqüência de nucle- otídeos que é idêntica à seqüência de nucleotídeos de um polinucleotídeo obtenível mediante uma reação em cadeia da polimerase (PCR) usando um par de iniciadores cujas seqüências de nucleotídeos em cada caso incluem pelo menos 15 nucleotídeos consecutivos selecionados dentre a seqüência de nucleotídeos entre as posições 1 e 750 da SEQ ID NO:3 ou SEQ ID NO:7 e da seqüência de nucleotídeos complementar entre as posições 2245 e 3000 da SEQ ID NO:3 ou SEQ ID NO:7. Um exemplo de tal par de iniciado- res apropriados está representado na da SEQ ID NO:9 e na SEQ ID NO: 10. O material DE PARTIDA preferido ("modelo" de DNA) é o DNA cromossômi- co de bactérias corineformes que foram tratadas em particular com um mu- tagênico. O DNA cromossômico é particularmente preferível do gênero Corynebacterium e de maneira muito particularmente preferível é aquele da espécie Corynebacterium glutamicum. A invenção refere-se ainda a mutantes de bactérias corinefor-

mes que compreendem um alelo prpD1 que codifica um polipeptídeo com atividade enzimática típica da 2-metilcitrato desidratase, que inclui uma se- quência de aminoácidos com um comprimento correspondente a 498 L- aminoácidos com um dos aminoácidos proteinogênicos exceto a L-prolina, preferivelmente a L-leucina, estando presente na posição 272.

A invenção refere-se ainda a mutantes de bactérias corinefor- mes que compreendem um alelo prpD1 codificador de um polipeptídeo com atividade enzimática típica da 2-metilcitrato desidratase, que compreende na posição 252 a 291 da seqüência de aminoácidos a seqüência de aminoáci- dos correspondente à posição 252 a 291 da SEQ ID NO:6 ou 8. A seqüência de aminoácidos do polipeptídeo codificado preferivelmente compreende uma seqüência de aminoácidos correspondente à posição 202 a 341 da SEQ ID NO: 6 ou 8 ou à posição 152 a 391 da SEQ ID NO: 6 ou 8 ou à posição 102 a 441 da SEQ ID NO:6 ou 8 ou à posição 52 a 491 da SEQ ID N0.6 ou 8 ou à posição 2 a 495 da SEQ ID NO: 6 ou 8 ou à posição 2 a 496 da SEQ ID NO: 6 ou 8 ou à posição 2 a 497 da SEQ ID NO: 6 ou 8. É muito particular- mente preferível que o comprimento do polipeptídeo codificado inclua 498 aminoácidos.

A invenção refere-se ainda a mutantes de bactérias corinefor- mes que compreendem um alelo prpD1 que codifica um polipeptídeo com atividade enzimática típica da 2-metilcitrato desidratase, que compreende na posição 272 ou na posição correspondente da seqüência de aminoácidos um aminoácido proteinogênico com exceção da L-prolina, com preferência para a troca pela L-leucina, e cuja seqüência de aminoácidos é adicional- mente pelo menos 90%, preferivelmente pelo menos 92% ou pelo menos 96% e de maneira muito particularmente preferível pelo menos 97% ou pelo menos 98% ou pelo menos 99% idêntica à seqüência de aminoácidos da SEQ ID NO:6 ou SEQ ID NO:8.

A invenção refere-se ainda a mutantes de bactérias corinefor- mes que compreendem um alelo prpD1 que codifica um polipeptídeo com a atividade enzimática típica da 2-metilcitrato desidratase, que compreende na posição 272 ou na posição correspondente da seqüência de aminoácidos um aminoácido proteinogênico com exceção da L-prolina, com preferência para a troca pela L-leucina, e cuja seqüência de nucleotídeos seja adicio- nalmente pelo menos 90%, preferivelmente pelo menos 92% ou pelo menos 94% e de maneira muito particularmente preferível pelo menos 97% ou pelo menos 98% ou pelo menos 99% idêntica à seqüência de nucleotídeos da SEQ ID NO:5.

Sabe-se que trocas de aminoácidos conservativas alteram a ati-

vidade enzimática apenas de maneira não-substancial. Em conformidade com isso, o alelo prpD1 presente nos mutantes de acordo com a invenção e que codifica um polipeptídeo com atividade enzimática típica da 2- metilcitrato desidratase, pode, além da seqüência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO:6 ou na SEQ ID NO:8, compreender uma (1) ou mais troca(s) de aminoácidos conservativa(s). O polipeptídeo preferivelmente compreende não mais do que duas (2), não mais do que três (3), não mais do que quatro (4) ou não mais do que cinco (5) trocas de aminoácidos conservativas. A atividade enzimática permanece substancialmente não afetada por tais tro- cas de aminoácidos conservativas.

No caso dos aminoácidos aromáticos, as trocas mútuas de feni- lalanina, triptofano e tirosina são designadas trocas conservativas. No caso dos aminoácidos hidrofóbicos, as trocas mútuas de leucina, isoleucina e va- Iina são designadas trocas conservativas. No caso dos aminoácidos polares, as trocas mútuas de glutamina e asparagina são designadas trocas conser- vativas. No caso dos aminoácidos básicos, as trocas mútuas de arginina, Iisina e histidina são designadas trocas conservativas. No caso dos aminoá- cidos acídicos, as trocas mútuas de ácido aspártico e ácido glutâmico são designadas trocas conservativas. No caso dos aminoácidos compreendendo grupos hidroxila, as trocas mútuas de serina e treonina são designadas tro- cas conservativas.

Enquanto a presente invenção era desenvolvida, descobriu-se mediante a comparação da seqüência de aminoácidos com o programa Clustal ((Thompson et ai., Nucleic Acids Research 22, 4637-4680 (1994)) que a seqüência de aminoácidos da 2-metilcritrato desidratase de diferentes bactérias, tais como, por exemplo, Mycobacterium tuberculosis, Mycobacte- rium bovis, Corynebaeterium effieiens e Corynebaeterium glutamieum, com- preende uma sequência-motivo consistindo na seqüência Arg-Glu-Leu-Asp- Phe-His-Asp-Thr-Phe-Leu-Ala-Ala-Asp/Glu-Tyr-Ser-His-Pro, uma sequência- motivo consistindo na seqüência Gly-Ile-Cys-Leu-His-Glu-His-Lys-Ile-Asp- His-Val-Ala-His-Leu-Gly-Pro e também uma sequência-motivo consistindo na seqüência Pro-Ala-Pro-Ile-Trp-Glu-Gly-Glu-Asp-Gly-Val-Ile-Ala-Trp-Leu-Leu. A designação "Asp/GIu" significa que "Asp ou Glu" podem estar presentes na posição correspondente.

Em conformidade com isso, os mutantes preferidos de bactérias corineformes são aqueles compreendendo um alelo prpD1 codificador de um polipeptídeo com atividade enzimática típica da 2-metilcitrato desidratase, que incluam pelo menos uma seqüência de aminoácidos selecionada do grupo de Arg-Glu-Leu-Asp-Phe-His-Asp-Thr-Phe-Leu-Ala-Ala-Asp/Glu-Tyr- Ser-His-Pro, Gly-Ile-Cys-Leu-His-Glu-His-Lys-Ile-Asp-His-Val-Ala-His-Leu- Gly-Pro and Pro-Ala-Pro-Ile-Trp-Glu-Gly-Glu-Asp-Gly-Val-Ile-Ala-Trp-Leu- Leu, e compreendendo na posição 272 ou na posição correspondente ou comparável da seqüência de aminoácidos um dos aminoácidos proteinogê- nicos com exceção da L-prolina, preferivelmente a L-leucina.

A sequência-motivo de aminoácidos Arg-Glu-Leu-Asp-Phe-His- Asp-Thr-Phe-Leu-Ala-Ala-Asp/Glu-Tyr-Ser-His-Pro está presente, por exem- pio, na SEQ IDO NO:2 e 4 ou 6 e 8 da posição 102 à 118. A sequência- motivo de aminoácidos Gly-Ile-Cys-Leu-His-Glu-His-Lys-Ile-Asp-His-Val-Ala- His-Leu-Gly-Pro está presente, por exemplo, na SEQ IDO NO:2 e 4 ou 6 e 8 da posição 156 à 172. A sequência-motivo de aminoácidos Pro-Ala-Pro-Ile- Trp-Glu-Gly-Glu-Asp-Gly-Val-Ile-Ala-Trp-Leu-Leu está presente, por exem- pio, na SEQ ID NO:2 e 4 ou 6 e 8 da posição 240 à 255.

A invenção refere-se, enfim, a mutantes de bactérias corinefor- mes que compreendem um alelo prpD1 que codifica um polipeptídeo com atividade enzimática típica da 2-metilcitrato desidratase, que inclui a seqüên- cia de aminoácidos da SEQ ID NO:6 ou da SEQ ID NO:8. A invenção refere-se por fim também a mutantes de bactérias

corineformes que compreendem um alelo prpD1 correspondente à SEQ ID NO:5 ou à SEQ ID NO:7. Sabe-se que as enzimas do próprio hospedeiro, chamadas ami- nopeptidases, deletam a metionina terminal durante o processo de síntese.

A expressão "uma posição correspondente à posição 272 da se- qüência de aminoácidos" ou "uma posição comparável à posição 272 da se- qüência de aminoácidos" significa o fato de que mediante a inserção ou de- leção de um códon codificador de um aminoácido da região N-terminal (em relação à posição 272 da SEQ ID NO:6 ou 8) do polipeptídeo codificado, a posição mencionada e o comprimento mencionado são formalmente incre- mentados em uma unidade no caso de uma inserção ou reduzidos em uma unidade no caso de uma deleção. Por exemplo, a deleção do códon GAG codificador do aminoácido L-ácido glutâmico na posição 19 da SEQ ID NO:6 ou 8 desloca a L-Ieucina da posição 272 para a posição 271. O comprimento mencionado seria então: 497 aminoácidos. Da mesma maneira, a inserção ou deleção de um códon codificador de um aminoácido da região C-terminal (em relação à posição 272) do polipeptídeo codificado incrementa formal- mente o comprimento mencionado em uma unidade no caso de uma inser- ção ou o reduz em uma unidade no caso de uma deleção. Tais posições comparáveis podem ser facilmente identificadas mediante a comparação das seqüências de aminoácidos sob a forma de um alinhamento com a ajuda, por exemplo, do programa Clustal ou do programa MAFFT.

A atividade enzimática permanece substancialmente não- afetada por tais inserções e deleções. "Substancialmente não-afetada" signi- fica que a atividade enzimática de tais variantes difere não mais do que 10%, não mais do que 7,5%, não mais do que 5%, não mais do que 2,5% ou não mais do que 1% da atividade do polipeptídeo com a seqüência de aminoáci- dos da SEQ ID NO:6 ou 8.

Um método para determinar a atividade enzimática da 2- metilcitrato desidratase é descrito em Horswill e Escalante-Semerena (Bio- chemistry 40(15), 4703-4713 (2001)).

A invenção correspondentemente também refere-se a alelos prpD1 codificadores das variantes polipeptídicas da SEQ ID NO:6 ou 8 que compreendem uma ou mais inserções ou deleções. O polipeptídeo preferi- velmente compreende não mais do que 5, não mais do que 4, não mais do que 3, não mais do que 2 inserções ou deleções de aminoácidos.

As sequências-motivo Arg-Glu-Leu-Asp-Phe-His-Asp-Thr-Phe- Leu-Ala-Ala-Asp/Glu-Tyr-Ser-His-Pro, Gly-Ile-Cys-Leu-His-Glu-His-Lys-Ile- Asp-His-Val-Ala-His-Leu-Gly-Pro e Pro-Ala-Pro-Ile-Trp-Glu-Gly-Glu-Asp-Gly- Val-Ile-Ala-Trp-Leu-Leu são preferivelmente não-rompidas por tais inser- ções/deleções.

Os mutantes de acordo com a invenção podem ser produzidos usando-se métodos de mutagênese in vivo convencionais com populações celulares de bactérias corineformes usando-se substâncias mutagênicas tais como, por exemplo, N-metil-N'nitro-N-nitroso de guanidina (MNNG), etil me- tanossulfonato (EMS), 5-bromouracil ou luz ultravioleta. Métodos de muta- gênese são descritos, por exemplo, no Manual of Methods for General Bac- teriology (Gerhard et al. (Eds.), American Society for Microbiology, Washing- ton, DC, EUA, 1981) ou em Tosaka et al. (Agricultural and Biological Che- mistry 42(4), 745-752 (1978)) ou em Konicek et al. (Folia Microbiologica 33, 337-343 (1988)). Mutagêneses típicas com MNNG incluem concentrações de 50 a 500 mg/l ou mesmo concentrações maiores de até 1 g/l, um tempo de incubação de 1 a 30 minutos a um pH de 5,5 a 7,5. Sob essas condições, o número de células viáveis é reduzido em uma proporção de aproximada- mente 50% a 90% ou aproximadamente 50% a 99% ou aproximadamente 50% a 99,9% ou mais.

Os mutantes ou células são removidos da população de células submetidas a mutagênese e são propagadas. Em uma etapa posterior, sua capacidade de secretar aminoácidos, preferivelmente L-lisina, L-triptofano, L- valina, L-isoleucina ou L-homoserina em uma cultura descontínua usando-se um meio nutriente adequado é preferivelmente investigada. Meios nutrientes e condições de teste adequadas são descritos, inter alia, em US 6.221.636, em US 5.840.551, em US 5.770.409, em US 5.605.818, em US 5.275.940 e em US 4.224.409. No caso de utilização de sistemas robóticos adequados como descrito, por exemplo, em Zimmermann et al. (VDI Berichte No. 1841, VDI-Verlag, Düsseldorf, Alemanha 2004, 439-443) or Zimmermann (Chemie Ingenenieur Technik 77 (4), 426-428 (2005)), numerosos mutantes podem ser investigados em pouco tempo. No geral, um máximo de 3000, um máxi- mo de 10.000, um máximo de 30.000 ou também um máximo de 60.000 mu- tantes e, quando apropriado, ainda mais, são investigados. Mutantes que, em comparação com a cepa-mãe ou com a cepa de partida não submetida a mutagênese, secretam quantidades aumentadas de aminoácidos no meio de nutrição ou no interior da célula são identificados dessa maneira. Estes in- cluem, por exemplo, os mutantes cuja secreção de aminoácidos é aumenta- da em pelo menos 0,5%.

O DNA é então preparado ou isolado dos mutantes e o polinu- cleotídeo correspondente é sintetizado com a ajuda da reação da cadeia de polimerase usando-se pares de iniciadores que permitam amplificação do gene prpD1 ou do alelo prpD1 de acordo com a invenção ou da mutação de acordo com a invenção na posição 272. O DNA é preferivelmente isolado dos mutantes que secretam aminoácidos em uma quantidade aumentada.

É possível selecionar para este fim quaisquer pares de iniciado- res da seqüência de nucleotídeos localizada a montante e a jusante da mu- tação de acordo com a invenção e com a seqüência de nucleotídeos que a complementa. Um dos iniciadores de um par de iniciadores nesse caso pre- ferivelmente inclui pelo menos 15, pelo menos 18, pelo menos 20, pelo me- nos 21, pelo menos 24 nucleotídeos consecutivos selecionados da seqüên- cia de nucleotídeos entre as posições 1 e 1563 da SEQ ID NO:3 ou SEQ ID NO:7. O segundo iniciador pertencente a um par de iniciadores inclui pelo menos 15, pelo menos 18, pelo menos 20, pelo menos 21 ou pelo menos 24 nucleotídeos consecutivos selecionados da seqüência de nucleotídeos com- plementar entre as posições 3000 e 1567 da SEQ ID NO:3 ou SEQ ID NO:7. Caso a amplificação da região de codificação seja desejada, o par de inicia- dores é preferencialmente selecionado da seqüência de nucleotídeos entre as posições 1 e 750 da SEQ ID NO:3 ou SEQ ID NO:7 e da seqüência de nucleotídeos complementar entre as posições 3000 e 2245 da SEQ ID NO:3 ou SEQ ID NO:7. Um par de iniciadores adequado é, por exemplo, o par de iniciadores prpD1_XL_A1 e prpD1_XL_E1 representados pela SEQ ID NO:9 e SEQ ID NO: 10. Um produto de PCR preparado usando-se esse par de iniciadores está representado na SEQ ID NO: 13.

Caso se deseje amplificação de parte da região codificadora, como representado por exemplo na SEQ ID NO: 17 e 19, o par de iniciadores é preferencialmente selecionado da seqüência de nucleotídeos entre as po- sições 751 e 1563 da SEQ ID NO:3 ou da SEQ ID NO:7 e da seqüência de nucleotídeos complementar entre as posições 2244 e 1567 da SEQ ID NO:3 ou da SEQ ID NO:7.

O iniciador pode, além disso, ser equipado com sítios de reco- nhecimento para enzimas de restrição, com um grupo biotina ou outros a- cessórios, como descrito na técnica anterior. O comprimento total do inicia- dor geralmente não ultrapassa 30, 40, 50 ou 60 nucleotídeos.

Os polinucleotídeos são preparados pela amplificação de se- qüências selecionadas, tais como o alelo prpD1 de acordo com a invenção, a partir, por exemplo, do DNA cromossômico proporcionado ("modelo de DNA") por amplificação por PCR geralmente empregando-se DNA polimera- ses termoestáveis. exemplos de tais DNA polimerases são a Taq polimerase da Thermus aquaticus, que é comercializada inter alia pela Qiagen (Hilden, Alemanha), a polimerase Vent da Thermococcus litoralis, comercializada inter alia pelo New England Biolabs (Frankfurt, Alemanha) ou a polimerase Pfu da Pyrococcus furiosus, que é comercializada inter alia pela Stratagene (La Jolla1 EUA). Polimerases com função à prova de leitura são preferidas. Função à prova de leitura significa que essas polimerases são capazes de reconhecer nucleotídeos incorretamente incorporados e de eliminar o erro mediante nova polimerização. (Lottspeich e Zorbas, Bioanalytik, Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg, Alemanha (1998)). exemplos de polime- rases que têm função à prova de leitura são a polimerase Vent e a polimera- se Pfu.

As condições da mistura da reação são configuradas de acordo com as informações do fabricante. As polimerases são geralmente forneci- das pelo fabricante junto com o tampão habitual, que normalmente tem con- centrações de Tris/HC1 10-100 mM e KC1 6-55 mM a pH 7,5-9,3. Cloreto de magnésio é adicionado à concentração de 0,5-10 mM a não ser que esteja presente no tampão fornecido pelo fabricante. Além disso, desoxinucleotídeo trifosfatos são adicionados a uma concentração de 0,1-16,6 mM à mistura da reação. Os iniciadores são introduzidos na mistura de reação a uma concen- tração final de 0,1-3 μΜ e o modelo de DNA na melhor das hipóteses com 102 a 105 cópias. Também é possível empregar 106 a 107 cópias. A polime- rase apropriada é adicionada à mistura da reação em uma quantidade de 2- unidades. Uma mistura de reação típica tem um volume de 20-100 μΙ.

Outras adições que podem ser incluídas na reação são albumina sérica bovina, Tween 20, gelatina, glicerol, formamida ou DMSO (Dieffenba- ch and Dveksler, PCR Primer - A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, EUA 1995).

Um teste de PCR típico consiste em etapas de temperatura con- secutivamente repetidas em três etapas. No começo, a reação é iniciada pelo aumento da temperatura para 92°C-98°C por 4 a 10 minutos para des- naturação do DNA introduzido. Isso é seguido por repetições primeiro de uma etapa de desnaturação do DNA introduzido a aproximadamente 92-98° por 10-60 segundos, então uma etapa de ligação dos iniciadores ao DNA introduzido a uma temperatura particular, que depende dos iniciadores ("temperatura de anelamento"), a qual, de acordo com a experiência, é entre 50°C a 60°C e pode ser calculada individualmente para cada par de iniciado- res, por 10-60 segundos. Informações detalhadas referentes a isto podem ser encontradas por aquele versado na técnica em Rychlik et al. (Nucleic Acids Research 18 (21): 6409-6412). Isso é subseqüentemente seguido por uma etapa de síntese para estender os iniciadores introduzidos ("extensão") no ponto ótimo de atividade indicado em cada caso para a polimerase, nor- malmente na faixa de 73°C a 67°C, preferivelmente 72°C a 68°C, depen- dendo da polimerase. A duração dessa etapa de extensão depende da efici- ência da polimerase e do comprimento do produto de PCR a ser amplificado. Em um teste de PCR típico, este passo leva 0,5-8 minutos, preferivelmente 2-4 minutos. Estas três etapas são repetidas 30 a 35 vezes, quando apropri- ado até 50 vezes. Uma etapa final de "extensão" de 4-10 minutos finaliza a reação. Os polinucleotídeos preparados desta maneira também são desig- nados amplicons; o termo fragmento de ácido nucleico está igualmente em uso.

Um produto de PCR preparado usando-se o par de iniciadores prpD1_XL_A1/prpD1_XL_E1 (ver SEQ ID NO:9 e SEQ ID N0:10) está re- presentado na SEQ ID NO: 13.

Maiores instruções e informações sobre a PCR podem ser en- contradas por aquele versado na técnica, por exemplo, no manual "PCR- Strategies" (lnnis, Felfand e Sninsky, Academic Press , Inc., 1995), no ma- nual de Diefenbach e Dveksler "PCR Primer - a Iaboratory manual" (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1995) no manual de Gait "Oligonucleotide synthesis: A Practical Approach" (IRL Press, Oxford, Reino Unido, 1984) e em Newton e Graham "PCR" (Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg, Alemanha, 1994).

A seqüência de nucleotídeos é subseqüentemente determinada

mediante, por exemplo, o método da terminação da cadeia, de Sanger, et al. (Proceedings of the National Academies of Sciences, U.S.A., 74, 5463-5467 (1977)), com as modificações indicadas por Zimmerman et al. (Nucleic Acids Research 18, 1067 (1990)) e o polipeptídeo codificado por essa seqüência de nucleotídeos é analisado em particular com referência à seqüência de aminoácidos. Para este fim, a seqüência de nucleotídeos é inserida em um programa para a tradução da seqüência de DNA em uma seqüência de ami- noácidos. Programas adequados são, por exemplo, o programa "Patentin", que pode ser obtido em escritórios de patentes como, por exemplo, o US Patent Office (USPTO), ou o "Translate Tool", que pode ser obtido no servi- dor da ExPASy Proteonics na Internet (Gasteiger et al., Nucleic Acids Rese- arch 31, 3784-3788 (2003)).

Mutantes cujo alelo prpD1 codifica polipeptídeos com atividade enzimática típica da 2-metilcitrato desidratase, que compreendem na posi- ção 272 da seqüência de aminoácidos, ou em posição correspondente ou comparável, um dos aminoácidos proteinogênicos com exceção da L-prolina, são identificados desta maneira. A troca pela L-Ieucina é preferida. O cromossomo completo do mutante é determinado quando a- propriado. É possível, no que diz respeito a isso, empregar o método descri- to por Marguiles et ai, (Nature, 437(7057): 376-2720 (2005)) e Velicer et al. (Proceedings of the National Academy of Sciences, EUA, 103(21), 8107- 8112 (2006)), que é conhecido daqueles versados na técnica pelo termo "pi- rosequênciamento" e permite que genomas completos sejam sequênciados rapidamente.

A invenção, em conformidade com isso, refere-se a um mutante de uma bactéria corineforme caracterizado pelo fato de ser obtenível pelas seguintes etapas:

a) tratamento de uma bactéria corineforme que tem a capaci- dade de secretar aminoácidos com um agente mutagênico,

b) isolamento e propagação do mutante gerado em a),

c) preferencialmente, determinação da capacidade do mutan- te de secretar em um meio, ou liberar no interior da célula, pelo menos 0,5% mais aminoácidos do que a bactéria cori- neforme empregada em a),

d) preparação de ácido nucleico do mutante obtido em b),

e) preparação de uma molécula de ácido nucleico (ou ampli- con ou fragmento de ácido nucleico) usando a reação da cadeia da polimerase, do ácido nucleico de d), e de um par de iniciadores consistindo em um primeiro iniciador incluin- do pelo menos 15 nucleotídeos consecutivos selecionados da seqüência de nucleotídeos entre as posições 1 e 1563, preferivelmente de 1 a 750 da SEQ ID NO:3 ou da SEQ ID NO:7 e um segundo iniciador incluindo pelo menos 15 nu- cleotídeos consecutivos selecionados da seqüência de nu- cleotídeos complementar entre as posições 3000 e 1567, preferivelmente 3000 e 2245 da SEQ ID NO:3 ou 7,

f) determinação da seqüência de nucleotídeos da molécula de ácido nucleico obtida em e) e determinação da seqüên- cia de aminoácidos codificada, g) quando apropriado, comparação da seqüência de aminoá- cidos determinada em f) com a SEQ ID NO:6 ou 8, e

h) identificação de um mutante que compreenda um polinu- cleotídeo codificador de um polipeptídeo que compreenda

na posição 272 ou em uma posição comparável um dos

aminoácidos proteinogênicos com exceção da L-prolina, preferivelmente L-leucina.

Os mutantes gerados desta maneira normalmente compreen- dem uma (1) cópia do alelo prpD1 descrito. A SEQ ID NO:5 representa, por exemplo, a região codificadora

do alelo prpD1 de um mutante de acordo com a invenção. A região codifica- dora do gene de tipo selvagem é representada como SEQ ID NO:1. A SEQ ID NO:1 compreende na posição 814 a nucleobase citosina, na posição 815 a nucleobase citosina e na posição 816 a nucleobase citosina. A SEQ ID NO:1, assim, compreende da posição 814 à 816 o códon CCC codificador do aminoácido L-prolina. A SEQ ID NO:5 compreende na posição 815 a nucle- obase timina. Essa transição citosina-timina resulta na posição 814 a 816 no códon CTC codificador do aminoácido L-leucina.

Além disso, as seqüências de nucleotídeos representadas na SEQ ID NO:5 e 7 podem compreender trocas de base adicionais resultantes do tratamento com mutagênese mas não são expressadas por uma seqüên- cia de aminoácidos alterada. As mutações desse tipo são também designa- das, por aqueles versados na técnica, como mutações silenciosas ou neu- tras. Essas mutações silenciosas podem igualmente já estar presentes na bactéria corineforme empregada no tratamento de mutagênese.

As bactérias corineformes usadas na mutagênese preferivelmen- te já possuem a capacidade de secretar o aminoácido desejado no meio nu- triente ou caldo de fermentação que as envolve e/ou liberá-lo no interior das células.

Bactérias corineformes produtoras de L-Iisina normalmente têm

uma aspartato quinase insensível à inibição por feedback ou dessensibiliza- da. Aspartato quinases insensíveis à inibição por feedback ou dessensibili- zadas significam aspartato quinases (LysC) que em comparação com a for- ma selvagem exibem menor sensibilidade à inibição por misturas de Iisina e treonina ou misturas de aminoetilcisteína (AEC) e treonina ou apenas Iisina ou apenas AEC. Os genes ou alelos codificadores dessas aspartato quina- ses dessensibilizadas são também designados alelos lyscFBR Numerosos alelos lyscFBR alelos estão descritos na técnica mais recente e codificam va- riantes da aspartato quinase que possuem trocas de aminoácidos em com- paração com a proteína de tipo selvagem. A região codificadora do gene IysC de tipo selvagem. A região codificadora do gene IysC de tipo selvagem da Corynebacterium glutamicum correspondente ao número de acesso AX756575 do banco de dados da NCBI está representada na SEQ ID NO:11 e o polipeptídeo codificado por esse gene está representado na SEQ ID NO:12.

As bactérias corineformes produtoras de L-Iisina empregadas nos métodos da invenção preferivelmente possuem um alelo IysC codifica- dor de uma variante da aspartato quinase que possui a seqüência de amino- ácidos da SEQ ID NO: 12, esta última incluindo uma ou mais das trocas de aminoácidos selecionadas do grupo:

LysC A279T (L-alanina na posição 279 da proteína de aspartato quinase codificada de acordo com a SEQ ID NO: 12 trocada por

L-treonina; vide US 5.688.671 e números de acesso E06825, E06826, E08178 e I74588 a I74597),

LysC A279V (L-alanina na posição 279 da proteína de aspartato quinase codificada de acordo com a SEQ ID NO: 12 trocada por L-valina; vide JP 6-261766 e número de acesso E08179.

LysC L297Q (L-leucina na posição 297 da proteína de aspartato quinase codificada de acordo com a SEQ ID NO. 12 trocada por L-glutamina; ver DE 102006026328,

LysC S301F (L-serina na posição 301 da proteína de aspartato quinase codificada de acordo com a SEQ ID NO: 12 trocada por

L-fenilalanina; ver US 6.844.176 e número de acesso E08180), LysC S301Y (L-serina na posição 301 da proteína de aspartato quinase codificada de acordo com a SEQ ID NO: 12 trocada por L-tirosina, ver Kalinowski et al. (Molecular and General Genetics 224, 317-324 (1990)) e número de acesso X57226), LysC T308I (L-treonina na posição 308 da proteína de aspartato quinase codificada de acordo com a SEQ ID NO: 12 trocada por L-isoleucina; ver JP 6-261766 e número de acesso E08181) LysC T311I (L-treonina na posição 311 da proteína de aspartato quinase codificada de acordo com a SEQ ID NO: 12 trocada por L-isoleucina; ver WO 00/632728 e US 6.893.848), LysC S317A (L-serina na posição 317 da proteína de aspartato quinase codificada de acordo com a SEQ ID NO: 12 trocada por L-alanina; ver US 5.688.671 e número de acesso I74589), LysC R320G (L-arginina na posição 320 da proteína de asparta- to quinase codificada de acordo com a SEQ ID NO: 12 trocada por glicina; ver Jetten et al. (Applied Microbiology and Biotechno- Iogy 43, 76-82 (995)) e número de acesso L27125), LysC G345D (glicina na posição 345 da proteína de aspartato quinase codificada de acordo com a SEQ ID NO: 12 trocada por L-ácido aspártico; ver Jetten et al. (Applied Microbiology and Biotechnology 43, 76-82 (995)) e número de acesso L16848), LysC T380I (L-treonina na posição 380 da proteína de aspartato quinase codificada de acordo com a SEQ ID NO: 12 trocada por L-isoleucina; ver WO 01/49854 e número de acesso AX192358), e

LysC S381F (L-serina na posição 381 da proteína de aspartato quinase codificada de acordo com a SEQ ID NO: 12 trocada por L-fenilalanina; ver EP 0435132).

Preferência particular é dada ao alelo lysCFBR IysC T311I (treoni- na na posição 311 da proteína de aspartato quinase codificada de acordo com a SEQ ID NO: 12 trocada por isoleucina) e a um alelo lysCFBR compre- endendo pelo menos uma troca selecionada do grupo de uma A279T (alani- na na posição 279 da proteína de aspartato quinase codificada de acordo com a SEQ ID NO:12 trocada por treonina), S381F (serina na posição 317 da proteína de aspartato quinase codificada de acordo com a SEQ ID NO: 12 trocada por fenilalanina) e S317A (serina na posição 317 da proteína de as- partato quinase codificada de acordo com a SEQ ID NO: 12 trocada por ala- nina).

O alelo lysCFBR IysC T311I (treonina na posição 311 da proteína de aspartato quinase codificada de acordo com a SEQ ID NO: 12 trocada por isoleucina) é muito particularmente preferido.

A cepa DSM 16833 (WO 06/063660) tem, assim como a cepa ATCC 21543 (US 3.708.395), um alelo lysCFBR codificador de uma proteína de aspartato quinase que compreende a troca de aminoácido T3111.

A cepa NRRL B-11474 (US 4.275.157) tem um alelo lysCFBR co- dificador de uma proteína de aspartato quinase que compreende as trocas de aminoácidos A279T e S381F. Da maneira descrita acima, começando com a cepa ATCC

21543, foi isolado um mutante designado DM1916 que compreende um alelo prpD1 codificador de um polipeptídeo no qual a L-Ieucina está presente na posição 272 da seqüência de aminoácidos. A seqüência de nucleotídeos da região codificadora do alelo prpD1 do mutante DM1916 está representada como SEQ ID NO:5 e a seqüência de aminoácidos do polipeptídeo codifica- do está representada como SEQ ID NO:6 ou 8.

É adicionalmente possível usar bactérias corineformes secreto- ras de L-Iisina que possuem propriedades conhecidas na técnica mais re- cente.

Bactérias corineformes produtoras de L-triptofano normalmente

possuem uma antranilato sintase insensível à inibição por feedback ou des- sensibilizada. Antranilato sintase insensível à inibição por feedback ou des- sensibilizada (TrpE) significa uma antranilato sintase que, em comparação com a forma selvagem, possui uma sensibilidade à inibição por triptofano ou 5-fluorotriptofano (Matsui et ai, Journal of Bacteriology 169 (11): 5330 - 5332(1987)) ou análogos similares que é menor pelo menos em 5% a 10%, ou pelo menos em 10% a 15% ou pelo menos em 10% a 20%. Os genes ou alelos codificadores dessas antranilato sintases dessensibilizadas também são designados alelos trpEFBR. exemplos de tais mutantes e alelos estão, por exemplo, descritos em US 6180373 e EP338474.

Bactérias corineformes produtoras de L-valina normalmente possuem uma acetolactato sintase (aceto-hidroxiácido) insensível à inibição porfeedback ou dessensibilizada [EC no. 2.2.1.6].

A acetolactato sintase insensível à inibição por feedback signifi- ca uma acetolactato sintase que, em comparação com a forma selvagem, demonstra uma sensibilidade menor à inibição por um ou mais dos aminoá- cidos selecionados do grupo de L-valina, L-isoleucina e L-leucina, preferi- velmente L-valina. A acetolactato sintase (llvB, IIvN) da Corynebacterium consiste em uma assim-chamada grande subunidade codificada pelo gene ilvB e uma assim-chamada pequena subunidade codificada pelo gene ilvN (Keilhauer et ai, Journal of Bacteriology 175(17), 5595-5603 (1993)). WO 05/003357 e Elisakova et ai (Applied and Environmental Microbiology 71(1):207-13 (2005)) relatam sobre variantes da subunidade IIvN que confe- rem resistência à L-valina, L-isoleucina e L-Ieucina à acetolactato sintase. Uma variante compreende na posição 21 da seqüência de aminoácidos L- ácido aspártico em vez de L-isoleucina (IlvN 121 D) e na posição 22 L- fenilalanina em vez de L-isoleucina (IlvN I22F). A segunda variante compre- ende na posição 20 da seqüência de aminoácidos L-ácido aspártico em vez de glicina (IlvN G20D), na posição 21 da seqüência de aminoácidos L-ácido aspártico em vez de L-isoleucina (IlvN 121 D) e na posição 22 L-fenilalanina em vez de L-isoleucina (llvn I22F). As bactérias corineformes produtoras de L-isoleucina normal-

mente possuem uma treonina desidratase insensível à inibição por feedback ou dessensibilizada (=treonina deaminase).

A treonina desidratase insensível à inibição por feedback signifi- ca uma treonina desidratase (EC no. 4.3.1.19) que, em comparação com a forma selvagem, demonstra uma menor sensibilidade à inibição pela L- isoleucina. Os genes ou alelos codificadores dessa treonina desidratase

FBR

dessensibilizada são também designados alelos ilvA A região codificadora do gene ilvA do tipo selvagem da Coryne- bacterium glutamicum correspondente ao número de acesso L01508 do banco de dados da NCBI está representada na SEQ ID NO: 17 e o polipeptí- deo codificado por este gene está representado na SEQ ID NO: 18.

As variantes da treonina desidratase descritas em US 6.107.063

e em Morbach et al. (Applied and Environmental Microbiology 61 (12), 4315- 4320 (1995)) compreendem uma ou mais das trocas de aminoácidos sele- cionadas do grupo:

IIvA M199V (L-metionina na posição 199 da proteína de treonina desidratase codificada de acordo com a SEQ ID NO: 18 trocada por L-valina; ver US 6.107.063),

IIvA A257G (L-alanina na posição 257 da proteína de treonina desidratase codificada de acordo com a SEQ ID NO: 18 trocada por L- arginina; ver US 6.107.063), IIvA H278R (L-histidina na posição 278 da proteína de treonina

desidratase codificada de acordo com a SEQ ID NO: 18 trocada por L- arginina; ver US 6.107.063),

IIvA V323A (L-valina na posição 323 da proteína de treonina de- sidratase codificada de acordo com a SEQ ID NO: 18 trocada por L-alanina; ver Morbach et al.),

IIvA L351S (L-leucina na posição 351 da proteína de treonina desidratase codificada de acordo com a SEQ ID NO: 18 trocada por L-serina; ver US 6.107.063),

IIvA D378G (L-ácido aspártico na posição 378 da proteína de treonina desidratase codificada de acordo com a SEQ ID NO: 18 trocada por L-glicina; ver Morbach et al.).

Os mutantes resultantes mostram, em comparação com a cepa inicial ou cepa-mãe empregada, excreção ou produção aumentada do ami- noácido desejado em um processo de fermentação. A invenção refere-se igualmente a um polinucleotídeo isolado

codificador de um polipeptídeo com atividade enzimática típica da 2- metilcitrato desidratase, que compreende na posição 272 ou em uma posi- ção correspondente ou comparável da seqüência de aminoácidos um ami- noácido proteinogênico com exceção da L-prolina, com a troca pela L- Ieucina sendo preferível.

O polinucleotídeo de acordo com a invenção pode ser isolado de um mutante de acordo com a invenção. É ainda possível empregar métodos in vitro para a mutagênese do gene prpD1. Quando da utilização de métodos in vitro, polinucleotídeos isolados que compreendem um gene prpD1 de uma bactéria corineforme, preferivelmente o gene de forma selvagem da Coryne- bacterium glutamicum descrito na técnica anterior, são submetidos a um tra- tamento mutagênico.

Os polinucleotídeos isolados podem ser, por exemplo, DNA total ou DNA cromossômico isolado do gene prpD1 ou então amplicons do gene prpD1 preparados com a ajuda de reação em cadeia da polimerase (PCR). Amplicons deste tipo são também designados produtos de PCR. Instruções para a amplificação de seqüências de DNA com a ajuda da reação em ca- deia da polimerase podem ser encontradas por aquele versado na técnica interalia no manual de Gait: Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach (IRL Press, Oxford, Reino Unido, 1984) e em Newton e Graham: PCR (Spek- trum Akademischer Verlag, Heidelberg, Alemanha, 1994). É igualmente pos- sível que o gene prpD1 a ser submetido a mutagênese primeiro seja incorpo- rado em um vetor, em um bacteriófago ou plasmídeo, por exemplo.

Métodos adequados para a mutagênese in vitro são inter alia o tratamento com hidroxilamina de acordo com Miller (Miller, J. H.: A Short Course in Bacterial Genetics. A Laboratory Manual and Handbook for Esche- richia coli and Related Bactéria, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, 1992), o uso de oligonucleotídeos mutagênicos ((T. A. Brown: Gentechnologie für Einsteiger, Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg, 1993 e R. M. Horton: PCR-Mediated Recombination and Mutagenesis, Mole- cular Biotechnology 3, 93-99 (1995)) e o uso de uma reação em cadeia da polimerase usando uma DNA polimerase que demonstre uma alta taxa de erros. Uma DNA polimerase desse tipo é, por exemplo, a DNA polimerase Mutazyme (GeneMorph PCR Mutagenesis Kit, No.600550) da Stratagene (LaJolla, CA, EUA).

Instruções adicionais e revisões sobre a geração de mutações in vivo ou in vitro podem ser encontradas na técnica anterior e em livros-texto conhecidos de genética e biologia molecular tais como, por exemplo, o Iivro- texto de Knippers ("Molekulare Genetik", 6a. edição, Georg Thieme Verlag, Stuttgart, Alemanha, 1995), o de Winnacker ("Gene and Klone", VCH Ver- lagsgesellschaft, Weinheim, Alemanha, 1990) ou o de Hagemann ("Allge- meine Genetik", Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1986).

A invenção refere-se ainda a um polinucleotídeo isolado codifi- cador de um polipeptídeo com atividade enzimática típica da 2-metilcitrato desidratase que inclui a seqüência de aminoácidos da SEQ ID NO:2, com um dos aminoácidos proteinogênicos com exceção da L-prolina estando presente na posição 272 da seqüência de aminoácidos. A troca pela L- Ieucina é preferida.

A invenção refere-se ainda a um polinucleotídeo isolado que co-

difica um polipeptídeo com atividade enzimática típica da 2-metilcitrato desi- dratase, que inclui uma seqüência de aminoácidos com um comprimento de 498 aminoácidos e na qual um aminoácido proteinogênico com exceção da L-prolina, preferivelmente a L-leucina, está presente na posição 272. A invenção refere-se ainda a um polinucleotídeo isolado codifi-

cador de um polipeptídeo com atividade enzimática típica da 2-metilcitrato desidratase que compreende na posição 252 a 291 da seqüência de amino- ácidos a seqüência de aminoácidos correspondente à posição 252 a 291 da SEQ ID NO:6 ou 8. A seqüência de aminoácidos do polipeptídeo codificado preferivelmente compreende uma seqüência de aminoácidos corresponden- te à posição 202 a 341 da SEQ ID NO:6 ou 8 ou à posição 152 a 391 da SEQ ID NO:6 ou 8 ou à posição 102 a 441 da SEQ ID NO:6 ou 8 ou à posi- ção 52 a 491 da SEQ ID NO:6 ou 8 ou à posição 2 a 495 da SEQ ID NO:6 ou 8 ou à posição 2 a 496 da SEQ ID NO:6 ou 8 ou à posição 2 a 497 da SEQ ID NO:6 ou 8. O comprimento do polipeptídeo codificado de maneira muito particularmente preferível inclui 498 aminoácidos.

A invenção refere-se ainda a um polinucleotídeo isolado codifi- cador de um polipeptídeo com atividade enzimática típica da 2-metilcitrato desidratase que compreende na posição 272 da seqüência de aminoácidos ou em uma posição correspondente ou comparável um aminoácido protei- nogênico com exceção da L-prolina, preferivelmente L-leucina, e que inclui uma seqüência de nucleotídeos idêntica à seqüência de nucleotídeos de um polinucleotídeo obtenível por reação em cadeia da polimerase (PCR) usando o par de iniciadores cujas seqüências de nucleotídeos em cada caso incluem pelo menos 15 nucleotídeos consecutivos selecionados da seqüência de nucleotídeos entre as posições 1 e 750 da SEQ ID NO:3 ou SEQ ID NO:7 e da seqüência de nucleotídeos complementar entre as posições 3000 e 2245 da SEQ ID NO:3 ou SEQ ID NO:7. Um exemplo de tal par de iniciadores es- tá representado na SEQ ID NO:9 e na SEQ ID NO: 10. O material inicial pre- ferido (DNA "modelo") é DNA cromossômico de bactérias corineformes tra- tadas em particular com um mutagênico. É particularmente preferível que o DNA cromossômico seja do gênero Corynebacterium e de maneira muito particularmente preferível da espécie Corynebacterium glutamicum.

A invenção refere-se ainda a um polinucleotídeo isolado que se hibridiza com a seqüência de nucleotídeos complementar à SEQ ID NO: 5 sob condições rigorosas e codifica um polipeptídeo com atividade enzimática típica da 2-metilcitrato desidratase que compreende na posição 272 da se- qüência de aminoácidos, ou em uma posição correspondente ou compará- vel, um aminoácido proteinogênico com exceção da L-prolina, preferivelmen- te L-leucina.

Instruções para a hibridização de ácidos nucleicos ou polinucleo- tídeos podem ser encontradas por aquele versado na técnica no manual "The DIG System Users Guide for Filter Hybridization" from Boehringer Man- nheim GmbH (Mannheim, Alemanha, 1993) e em Liebl et ai., (International Journal of Systematic Bacteriology 41: 255-260 (1991)). A hibridização ocor- re sob condições rigorosas, significando que os únicos híbridos formados são aqueles nos quais a sonda, isto é, um polinucleotídeo incluindo a se- qüência de nucleotídeos complementar à SEQ ID NO:5 e a sequência-alvo, isto é, os polinucleotídeos tratados ou identificados com a sonda, são pelo menos 90% idênticos. Sabe-se que o rigor da hibridização, incluindo as eta- pas de lavagem, é influenciado ou determinado pela variação da composição do tampão, da temperatura e da concentração de sal. A reação de hibridiza- ção é geralmente realizada em condições de rigor relativamente baixas em comparação com as etapas de lavagem (Hybaid Hybridisation Guide, Hybaid Limited, Teddington, Reino Unido, 1996).

É possível empregar na reação de hibridização, por exemplo, um tampão correspondendo a 5x SSC a uma temperatura aproximada de 50°C- 68°C. Neste caso, as sondas podem também se hibridizar com os polinucle- otídeos que mostram menos de 90% de identidade com a seqüência de nu- cleotídeos da sonda empregada. Tais híbridos são menos estáveis e são removidos por lavagem sob condições rigorosas. Isso pode ser alcançado, por exemplo, reduzindo-se a concentração de sal a 2x SSC e, quando apro- priado, subseqüentemente a 0,5x SSC (The DIG System User's Guide for Filter Hybridisation, Boehringer Mannheim, Mannheim, Alemanha, 1995), ajustando-se a temperatura em aproximadamente 50°C-68°C, aproximada- mente 52°C-68°C, aproximadamente 54°C-68°C, aproximadamente 56°C- 68°C, aproximadamente 58°C-68°C, aproximadamente 60°C-68°C, aproxi- madamente 62°C-68°C, aproximadamente 64°C-68°C, aproximadamente 66°C-68°C. As faixas de temperatura de aproximadamente 64°C-68°C ou aproximadamente 66°C-68°C são preferidas. É possível, quando apropriado, reduzir a concentração de sal a uma concentração correspondente a 0,2x SSC ou 0,1 χ SSC. O tampão SSC compreende, quando apropriado, dodecil sulfato de sódio (SDS) a uma concentração de 0,1%. É possível aumentar paulatinamente a temperatura da hibridização em etapas de aproximada- mente 1-2°C de 50°C a 68°C para isolar fragmentos de polinucleotídeos com pelo menos 90% ou pelo menos 91%, preferivelmente pelo menos 92% ou pelo menos 93% ou pelo menos 94% ou pelo menos 95% ou pelo menos 96% e de maneira muito particularmente preferível pelo menos 97% ou pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade com a seqüência ou seqüên- cia complementar da sonda empregada, e que codificam um polipeptídeo com atividade enzimática típica da 2-metilcitrato desidratase compreendendo a troca de aminoácidos de acordo com a invenção. A seqüência de nucleotí- deos do polinucleotídeo obtido desta maneira é determinada por meios co- nhecidos. Instruções adicionais para a hibridização são obteníveis sob a forma dos assim-chamados kits no mercado (p. ex., DIG Easy Hyb da Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Alemanha, número de catálogo 1603558). As seqüências de nucleotídeos obtidas desta maneira codificam polipeptídeos com atividade enzimática típica da 2-metilcitrato desidratase que são pelo menos 90%, preferivelmente pelo menos 92% ou pelo menos 94% ou pelo menos 96% e, de maneira muito particularmente preferível, pelo menos 97% ou pelo menos 98% ou pelo menos 99% idênticas à seqüência de aminoáci- dos da SEQ ID NO:6 ou SEQ ID NO:8 e compreendem a troca de aminoáci- dos de acordo com a invenção.

A invenção refere-se adicionalmente a um polinucleotídeo isola- do que codifica um polipeptídeo com atividade enzimática típica da 2- metilcitrato desidratase que compreende na posição 272 ou em uma posição correspondente ou comparável da seqüência de aminoácidos qualquer ami- noácido exceto a L-prolina, com preferência para a troca por L-leucina, e que inclui uma seqüência de aminoácidos que é adicionalmente pelo menos 90%, preferivelmente pelo menos 92% ou pelo menos 94% ou pelo menos 96% e, de maneira muito particularmente preferível, pelo menos 97% ou pe- lo menos 98% ou pelo menos 99% idêntica à seqüência de aminoácidos da SEQ ID NO:6 ou SEQ ID NO:8.

A invenção refere-se ainda a um polinucleotídeo isolado codifi- cador de um polipeptídeo com a atividade enzimática da 2-metilcitrato desi- dratase que compreende na posição 272 ou em uma posição corresponden- te ou comparável da seqüência de aminoácidos um dos aminoácidos protei- nogênicos com exceção da L-prolina, com preferência para a troca da L- Ieucina e que inclui uma seqüência de nucleotídeos que é adicionalmente pelo menos 90%, preferivelmente pelo menos 92% ou pelo menos 94% ou pelo menos 96% e, de maneira muito particularmente preferível, pelo menos 97% ou pelo menos 98% ou pelo menos 99% idêntica à seqüência de nucle- otídeos da SEQ ID NO:5. Além disso, os polinucleotídeos isolados preferidos codificam um polipeptídeo com atividade enzimática típica da 2-metilcitrato desidratase que compreende na posição 272 da seqüência de aminoácidos ou em uma posição correspondente ou comparável um aminoácido proteinogênico com exceção da L-prolina, preferivelmente a L-leucina, e que compreende pelo menos uma sequência-motivo ou uma seqüência de aminoácidos seleciona- da do grupo de Arg-Glu-Leu-Asp-Phe-His-Asp-Thr-Phe-Leu-Ala-Ala-Asp/Glu- Tyr-Ser-His-Pro1 Gly-Ile-Cys-Leu-His-Glu-His-Lys-Ile-Asp-His-Val-Ala-His- Leu-Gly-Pro e Pro-Ala-Pro-Ile-Trp-Glu-Gly-Glu-Asp-Gly-Val-Ile-Ala-Trp-Leu- Leu.

As designações "Asp/GIu" significam que "Asp ou Glu" podem estar presentes na posição correspondente.

A invenção refere-se ainda a um polinucleotídeo isolado que co- difica um polipeptídeo com a atividade enzimática típica da 2-metilcitrato de- sidratase que inclui a seqüência de aminoácidos da SEQ ID N0:6 ou 8. O polipeptídeo codificado compreende, quando apropriado, uma (1) ou mais troca(s) de aminoácidos conservativas. O polipeptídeo preferivelmente com- preende não mais do que duas (2), não mais do que três (3), não mais do que 4 (quatro) ou não mais do que cinco (5) trocas de aminoácidos conser- vativas.

A invenção refere-se também a um polinucleotídeo isolado que codifica um polipeptídeo com a atividade enzimática típica da 2-metilcitrato desidra- tase que inclui a seqüência de aminoácidos da SEQ ID NO:6 ou 8 incluindo uma extensão na porção amino terminal ou carbóxi terminal de pelo menos um (1) aminoácido. Essa extensão compreende não mais do que 50, 40, 30, 20, 10, 5, 3 ou 2 aminoácidos ou resíduos de aminoácidos.

A invenção, enfim, refere-se a alelos prpD1 que codificam vari- antes polipeptídicas da SEQ ID NO:6 ou 8, que compreendem pelo menos uma ou mais inserções ou deleções. Estas preferivelmente compreendem um máximo de 5, um máximo de 4, um máximo de 3 ou um máximo de 2 inserções ou deleções de aminoácidos. A sequência-motivo Arg-Glu-Leu- Asp-Phe-His-Asp-Thr-Phe-Leu-Ala-Ala-Asp/Glu-Tyr-Ser-His-Pro e/ou Gly-Ile- Cys-Leu-His-Glu-His-Lys-Ile-Asp-His-Val-Ala-His-Leu-Gly-Pro e/ou Pro-Ala- Pro-Ile-Trp-Glu-Gly-Glu-Asp-Gly-Val-Ile-Ala-Trp-Leu-Leu é/são preferivel- mente não rompidas por tais inserções/deleções.

A invenção refere-se adicionalmente a um polinucleotídeo isola- do que inclui a seqüência de nucleotídeos mostrada na SEQ ID NO:5 ou 7.

A invenção refere-se, por fim, a um polinucleotídeo isolado com- preendendo o alelo prpD1 do mutante DM1916.

A invenção adicionalmente refere-se a um polinucleotídeo isola- do que inclui parte da região codificadora de um alelo prpD1 de acordo com a invenção, incluindo o polinucleotídeo isolado em cada caso a parte da re- gião codificadora que compreende a troca de aminoácido na posição 272 da seqüência de aminoácidos do polipeptídeo codificado.

Incluída em particular está uma molécula de ácido nucleico ou fragmento de DNA que codifica pelo menos uma seqüência de aminoácidos correspondente à posição 252 a 291 da SEQ ID NO:2, ou que codifica pelo menos uma seqüência de aminoácidos correspondente à posição 202 a 341 da SEQ ID NO: 2, ou que codifica pelo menos uma seqüência de aminoáci- dos correspondente à posição 152 a 391 da SEQ ID NO: 2, ou que codifica pelo menos uma seqüência de aminoácidos correspondente à posição 102 a 441 da SEQ ID NO: 2, ou que codifica pelo menos uma seqüência de ami- noácidos correspondente à posição 52 a 491 da SEQ ID NO: 2, ou que codi- fica pelo menos uma seqüência de aminoácidos correspondente à posição 2 a 495 da SEQ ID NO: 2, ou que codifica de pelo menos uma seqüência de aminoácidos correspondente à posição 2 a 496 da SEQ ID NO: 2, ou que codifica pelo menos uma seqüência de aminoácidos correspondente à posi- ção 2 a 497 da SEQ ID NO: 2, estando um dos aminoácidos proteinogênicos com exceção da L-prolina, preferivelmente a L-leucina, presente na posição correspondente à posição 272 da SEQ ID NO:2.

Um exemplo de um quadro de leitura de acordo com a invenção incluindo um polinucleotídeo codificador pelo menos da seqüência de ami- noácidos da posição 252 a 291 correspondente à SEQ ID NO:2, estando um dos aminoácidos proteinogênicos (Xaa) com exceção da L-prolina presente na posição correspondente à 272 da seqüência de aminoácidos, está deta- lhado abaixo:

gcg tgg ctg tta tcg ggc aaa gat cat gtt tat cat gtg cca Ala Trp Leu Leu Ser Gly Lys Asp His Val Tyr His Val Pro 255 260 265

ttg ccg gaa cac ggc gag nnn aag ctg ggg att cta gag Leu Pro Glu His Gly Glu Xaa Lys Leu Gly Ile Leu Glu

270 275

act tac aca aag gaa cat tca gcg gaa tat caa tcg cag Thr Tyr Thr Lys Glu His Ser Ala Glu Tyr Gln Ser Gln

280 285 290

Ela está igualmente representada como SEQ ID NO: 17. A se- qüência de aminoácidos codificada por este quadro de leitura está represen- tada como SEQ ID N0:18. A posição 21 da SEQ ID N0:18 corresponde à posição 272 da SEQ ID N0:2, 4, 6, ou 8.

As moléculas de ácido nucleico preferidas codificam pelo menos uma seqüência de aminoácidos correspondente à posição 252 a 291 da SEQ ID NO:6 ou 8, ou pelo menos correspondente à posição 202 a 341 da SEQ ID NO:6 ou 8, ou pelo menos correspondente à posição 152 a 391 da SEQ ID NO:6 ou 8, ou pelo menos correspondente à posição 102 a 441 da SEQ ID NO:6 ou 8, ou pelo menos correspondente à posição 52 a 491 da SEQ ID NO:6 ou 8, ou pelo menos correspondente à posição 2 a 495 da SEQ ID NO:6 ou 8, ou pelo menos correspondente à posição 2 a 496 da SEQ ID NO:6 ou 8, ou pelo menos correspondente à posição 2 a 497 da SEQ ID NO:6 ou 8.

Um exemplo de um quadro de leitura de acordo com a invenção inclu- indo um polinucleotídeo codificador pelo menos da seqüência de aminoáci- dos correspondente à posição 252 a 291 da SEQ ID NO:6 ou 8 está deta- lhado abaixo:

gcg tgg ctg tta tcg ggc aaa gat cat gtt tat cat gtg cca

Ala Trp Leu Leu Ser Gly Lys Asp His Val Tyr His Val Pro 255 260 265 ttg ccg gaa cac ggc gag ctc aag ctg ggg att cta gag Leu Pro Glu His Gly Glu Leu Lys Leu Gly Ile Leu Glu

270 275

act tac aca aag gaa cat tca gcg gaa tat caa tcg cag Thr Tyr Thr Lys Glu His Ser Ala Glu Tyr Gln Ser Gln

280 285 290

O quadro de leitura está igualmente representado como SEQ ID NO: 19. A SEQ ID N0:20 mostra a seqüência de aminoácidos codificada por este quadro de leitura. A posição 21 da SEQ ID N0:20 corresponde à posi- ção 272 da SEQ ID NO:2, 4, 6 ou 8.

As moléculas de ácido nucleico muito particularmente preferidas incluem pelo menos uma seqüência de nucleotídeos correspondente à posi- ção 1504 a 1623 da SEQ ID NO:7, ou pelo menos uma seqüência de nucleo- tídeos correspondente à posição 1354 a 1773 da SEQ ID NO:7, ou pelo me- nos uma seqüência de nucleotídeos correspondente à posição 1204 a 1923 da SEQ ID NO:7, ou pelo menos uma seqüência de nucleotídeos correspon- dente à posição 1054 a 2073 da SEQ ID NO:7, ou pelo menos uma seqüên- cia de nucleotídeos correspondente à posição 904 a 2223 da SEQ ID NO:7, ou pelo menos uma seqüência de nucleotídeos correspondente à posição 754 a 2235 da SEQ ID NO:7, ou pelo menos uma seqüência de nucleotídeos correspondente à posição 754 a 2238 da SEQ ID NO:7, ou pelo menos uma seqüência de nucleotídeos correspondente à posição 754 a 2241 da SEQ ID NO:7.

Os quadros de leitura de acordo com a invenção, como mostra- dos por exemplo na SEQ ID NO: 17 e 19 como seqüência de nucleotídeos e na SEQ ID NO: 18 e na SEQ ID N0:20 sob a forma de seqüência codificada de aminoácidos, podem adicionalmente compreender uma ou mais muta- ções que levem a uma ou mais trocas de aminoácidos conservativas. As mutações preferencialmente levam a um máximo de 4%, a um máximo de 2% ou a um máximo de 1% de trocas de aminoácidos conservativas. Os quadros de leitura de acordo com a invenção podem além disso compreen- der uma ou mais mutações silenciosas. Os quadros de leitura de acordo com a invenção preferivelmente compreendem não mais do que 4% e de maneira particularmente preferível não mais do que 2% a não mais do que 1% de mutações silenciosas.

Os polinucleotídeos isolados de acordo com a invenção podem ser usados na produção de cepas recombinantes de micro-organismos que, de uma maneira melhorada em comparação com a cepa inicial ou cepa- mãe, liberam aminoácidos no meio que os circunda ou acumulam esses a- minoácidos no interior das células.

Um método amplamente utilizado para incorporar mutações em genes de bactérias corineformes é aquele da troca de alelos, que também é conhecido pelo nome "substituição de genes". Neste método, um fragmento de DNA que compreende a mutação de interesse é transferido para a cepa desejada de uma bactéria corineforme e a mutação é incorporada por pelo menos dois eventos de recombinação ou eventos de "crossover" no cromos- somo da cepa desejada, ou a seqüência de um gene presente na cepa rele- vante é trocado pela seqüência mutada.

Schwarzer e Pühler (Bio/Technology 9, 84-87 (1991) usaram es- te método para incorporar um alelo IysA que continha uma deleção e para incorporar um alelo IysA que continha uma inserção no cromossomo da C. glutamicum no lugar do gene de tipo selvagem. Schâfer et al. (Gene 145, 69- 73 (1994)) empregaram este método para incorporar uma deleção no operon hom-thrB da C. glutamicum. Nakagawa et al. (EP 1108790) e Ohnishi et al. (Applied Microbiology and Biotechnology 58(2), 217-223 (2002)) emprega- ram este método para incorporar várias mutações começando com os alelos isolados no cromossomo da C. glutamicum. Nakagawa et al. conseguiram desta maneira incorporar uma mutação designada Val59Ala no gene da ho- moserina desidrogenase (hom), uma mutação designada como Thr3111le no gene da aspartato quinase (IysC ou ask), uma mutação designada Pro458Ser no gene da piruvato carboxilase (pyc) e uma mutação designada Ala213Thr no gene da glicose-6-fosfato desidrogenase (zwf) de cepas da C. glutamicum.

Um polinucleotídeo de acordo com a invenção que pode ser u- sado em um método de acordo com a invenção inclui a região completa mostrada, por exemplo, na SEQ ID NO:5, ou inclui parte da região codifica- dora tal como, por exemplo, a seqüência de nucleotídeos que codifica pelo menos a seqüência de aminoácidos correspondente à posição 252 a 291 da SEQ ID NO:6 ou 8 e que está representada como SEQ ID NO: 17 e 19. A parte da região codificadora correspondente à SEQ ID NO: 17 e 19 inclui um comprimento de > 120 nucleobases. As partes da SEQ ID NO: 7 que são preferidas são aquelas incluindo pelo menos a seqüência entre as posições 1354 e 1773, ou pelo menos entre as posições 1204 e 1923, ou pelo menos entre as posições 1054 e 2073 e têm, correspondentemente, um comprimen- to > 420, > 720 ou de > 1020 nucleobases.

O fragmento de DNA compreendendo a mutação de interesse está neste método normalmente presente em um vetor, em particular um plasmídeo, que preferivelmente é submetido a replicação apenas limitada ou a nenhuma replicação pela cepa a ser proporcionada pela mutação. Em ge- ral, uma bactéria do gênero Escherichia, preferivelmente da espécie Esche- richia coli, é usada como hospedeira auxiliar ou intermediária na qual o vetor pode ser replicado.

Exemplos de vetores de plasmídeos são os vetores pK*mob e pK*mobsacB descritos por Scháfer et ai. (Gene 145, 69-73 (1994)), tais co- mo, por exemplo, o pK18mobsacB, e os vetores descritos em WO 02/070685 e WO 03/014362. Estes são replicativos na Escherichia coli, mas não nas bactérias corineformes. Vetores particularmente adequados são aqueles compreendendo um gene com um efeito dominante negativo condi- cional tal como, por exemplo, o gene sacB (gene da Ievana sucrase), por exemplo, do Baciilus ou o gene galK (gene da galactose quinase), por e- xemplo, da Escherichia coli. (Um gene com um efeito dominante negativo condicional significa um gene que sob certas condições é desvantajoso, por exemplo, tóxico para o hospedeiro, mas que sob outras condições não tem efeitos negativos no hospedeiro que o carrega). Eles podem ser seleciona- dos para eventos de recombinação nos quais o vetor é eliminado do cro- mossomo. Além disso, Nakamura et ai (US-A-6.303.2723) descreveram um plasmídeo sensível à temperatura para as bactérias corineformes que é ca- paz de se replicar apenas a temperaturas abaixo de 31 °C.

O vetor é então transferido para a bactéria corineforme por con- jugação, por exemplo, pelo método de Schãfer ((Journal of Bacteriology 172, 1663-1666 (1990)) ou por transformação, por exemplo, pelo método de Du- nican e Shivnan (Bio/Technology 7, 1067-1070 (1989)) ou pelo método de Thierbach et ai (Applied Microbiology and Biotechnology 29, 356-362 (1988)). A transferência do DNA pode, quando apropriado, também ser reali- zada por bombardeio com partículas. A recombinação homóloga por meio de um primeiro evento de

"crossover" que promove a integração e de um segundo evento de "crosso- ver" adequado que promove a excisão no gene-alvo ou na sequência-alvo realiza a incorporação da mutação e resulta em uma bactéria recombinante.

Métodos que podem ser empregados para identificar e caracteri- zar as cepas resultantes são, interalia, aqueles de hibridização em Southern blot, da reação em cadeia da polimerase, da determinação de seqüências, o método da fluorescência por transferência de energia por ressonância (FRET) (Lay et al. Clinicai Chemistry 43, 2262-2267 (1997)) ou métodos en- zimológicos.

A invenção, de acordo com tudo isso, refere-se ainda a um mé-

todo para a produção de uma bactéria corineforme no qual

a) um polinucleotídeo de acordo com a invenção é transferido para uma bactéria corineforme,

b) o gene da 2-metilcitrato desidratase que está presente no cromossomo da bactéria corineforme e que codifica uma

seqüência de aminoácidos com L-prolina na posição 272 ou em uma posição comparável da seqüência de aminoá- cidos é trocado pelo polinucleotídeo que a) codifica uma seqüência de aminoácidos que tem na posição 272 ou em uma posição comparável da seqüência de aminoácidos ou-

tro L-aminoácido proteinogênico, preferivelmente L-leucina, c) A bactéria corineforme obtida como nos passos a) e b) é propagada.

Uma bactéria corineforme recombinante que compreende em vez do gene prpD1 de tipo selvagem um (1) alelo prpD1 de acordo com a invenção é obtida dessa forma.

Um método adicional de acordo com a invenção para a produ- ção de um micro-organismo consiste em

a) transferência de um polinucleotídeo de acordo com a in- venção codificador de um polipeptídeo com atividade en-

zimática típica da 2-metilcitrato desidratase para um micro-

organismo.

b) replicação do polinucleotídeo no micro-organismo, e

c) propagação do micro-organismo obtido de acordo com as etapas a) e b).

Um organismo recombinante que compreende pelo menos uma

(1) cópia ou uma pluralidade de cópias de um polinucleotídeo de acordo com a invenção codificador de uma 2-metilcitrato desidratase que compreende na posição 272 ou em uma posição comparável da seqüência de aminoácidos do polipeptídeo codificado um dos aminoácidos proteinogênicos, com exce- ção da L-prolina, com preferência pela troca por L-leucina, é obtido desta forma.

A invenção refere-se ainda, de acordo com tudo isso, a hospe- deiros ou células hospedeiras, preferivelmente micro-organismos, de manei- ra particularmente preferível bactérias corineformes e bactérias do gênero Escherichia, que compreendem os polinucleotídeos de acordo com a inven- ção. A invenção, da mesma forma, refere-se a micro-organismos produzidos usando-se os polinucleotídeos isolados. Os micro-organismos ou bactérias desse tipo são também designados micro-organismos recombinantes ou bactérias recombinantes. A invenção refere-se igualmente a vetores que compreendem os polinucleotídeos de acordo com a invenção. Por fim, a in- venção refere-se igualmente a hospedeiros que compreendem estes veto- res. Pode ser adicionalmente vantajoso para uma melhor produção de L-aminoácidos, em particular L-lisina, L-triptofano, L-valina, L-isoleucina e L-homoserina, superexpressar vários genes dos mutantes ou cepas recom- binantes de acordo com a invenção. O uso de genes endógenos é no geral preferível.

"Genes endógenos" ou "seqüências de nucleotídeos endógenas" significam os genes ou seqüências de nucleotídeos, ou alelos, presentes na população de uma espécie.

Assim, para produzir L-licina, é possível superexpressar um ou mais dos genes selecionados do grupo de

• um gene dapA codificador de uma dihidropicolinato sintase (DapA, EC no. 4.2.1.52), tal como, por exemplo, o gene dapA descrito em EP 0 197 335 do tipo selvagem da Corynebacterium glutamicum,

• um gene IysA codificador de uma diaminopimelato decarboxila- se (LysA, EC no. 4.1.1.20), tal como, por exemplo, o gene IysA descrito em US 6.090.597 da Corynebacterium glutamicum ATCC13869,

• um gene zwf codificador de uma glicose-6-fosfato desidrogena- se (Zwf, EC no. 1.1.1.49), tal como, por exemplo, o gene zwf descrito em JP- A-09224661 e EP-A-1108790 do tipo selvagem da Corynebacterium glutami- cum,

• os alelos zwf da Corynebacterium glutamicum que são descri- tos em US-2003-0175911-A1 e que codificam uma proteína com atividade enzimática típica da glicose-6-fosfato desidrogenase, na qual, por exemplo, a L-alanina na posição 243 da seqüência de aminoácidos é substituída por L-treonina, ou na qual o L-ácido aspártico da posição 245 é substituído por L-serina,

• Um gene pyc codificador de uma piruvato carboxilase (Pyc, EC no. 6.4.1.1), tal como, por exemplo, o gene pyc descrito em DE-A-198 31 609 e EP 1108790 do tipo selvagem da Corynebacterium glutamicum,

• o alelo pyc da Corynebacterium glutamicum que é descrito em EP 1 108 790 e que codifica uma proteína com atividade típica da piruvato carboxilase na qual a L-prolina na posição 458 da seqüência de aminoácidos é substituída por L-serina,

• os alelos pyc da Corynebacterium glutamicum que são descri- tos em WO 02/31158 e particularmente EP1325135B1 e que codificam pro- teínas com atividade típica da piruvato de carboxilase que carregam um ou

mais das trocas de aminoácidos selecionadas do grupo de L-valina na posi- ção 1 substituída por L-metionina, L-ácido glutâmico na posição 153 substi- tuído pelo L-ácido aspártico, L-alanina na posição 182 substituída por L- serina, L-alanina na posição 206 substituída por L-serina, L-histidina na po- sição 227 substituída por L-arginina, L-alanina na posição 455 substituída por glicina e L-ácido aspártico na posição 1120 substituído por L-ácido glu- tâmico.

• um gene IysC codificador de uma aspartato quinase (LysC, EC no. 2.7.2.4), tal como, por exemplo, o gene IysC descrito como SEQ ID NO:281 em EP-A-1108790 (ver também números de acesso AX120085 e

120365) e o gene IysC descrito como SEQ ID NO:25 em WO 01/00843 (ver também número de acesso AX063743) do tipo selvagem da Corynebacteri- um glutamicum,

• um alelo lysCFBR codificador de uma variante da aspartato qui- nase insensível à inibição por feedback, em particular correspondente à ta-

bela 1,

• um gene IysE codificador de uma proteína de exportação de Iisina (LysE)1 tal como, por exemplo, o gene IysE descrito em DE A 195 48 222 do tipo selvagem da Corynebacterium glutamicum,

• o gene aat codificador de uma aspartato aminotransferase (Aat, EC no. 2.6.1.1) (o gene aat da Corynebacterium glutamicum ATCC13032 é

descrito por exemplo em Kalinowski et al. (Journal of Biotechnology 104 (1- 3), 5 25 (2003); ver também número de acesso NC_006958), onde ele é de- signado gene aspB. Em US 6.004.773, um gene codificador de uma asparta- to aminotransferase é designado aspC. Marienhagen et al. (Journal of Bacte- riology 187 (22), 7693-7646 (2005)) referiram-se ao gene aat como gene aspT, e

• o gene zwal codificador da proteína Zwa 1 do tipo selvagem da Corynebacterium glutamicum (US 6.632.644).

Superexpressão significa em geral um aumento da concentração ou atividade intracelular de um ácido ribonucleico, de uma proteína ou de uma enzima. No caso da presente invenção, alelos prpD1 ou polinucleotí- deos que codificam 2-metilcitrato desidratases que compreendem na posi- ção 272 da seqüência de aminoácidos do polipeptídeo codificado um amino- ácido proteinogênico, com exceção da L-prolina, com preferência para a tro- ca por L-leucina, são superexpressados. Sabe-se que aminoácidos N- terminais, especialmente a metionina N-terminal, podem ser eliminados do polipeptídeo formado pelas enzimas do próprio hospedeiro - chamadas ami- nopeptidases. O aumento mencionado da concentração ou atividade de um produto de gene pode ser alcançado, por exemplo, pelo aumento do número de cópias dos polinucleotídeos apropriados em pelo menos uma cópia.

Um método amplamente utilizado para aumentar o número de cópias consiste na incorporação do gene ou alelo apropriado em um vetor, preferivelmente um plasmídeo, que é replicado pela bactéria corineforme. Vetores de plasmídeos adequados são por exemplo o pZ1 (Menkel et ai, Applied and Environmental Microbiology (1989) 64: 549-554) ou os vetores pSELF descritos por Tauch et al. (Journal of Biotechnology 99, 79-91 (2002)). Um artigo de revisão do tópico dos plasmídeos na Corynebacterium glutamicum pode ser encontrado em Tauch et al. (Journal of Biotechnology 104, 27-40 (2003)).

Outro método amplamente utilizado para se alcançar a superex- pressão é o método de amplificação genética cromossômica. Neste método, pelo menos uma cópia adicional do gene ou alelo de interesse é introduzida no cromossomo de uma bactéria corineforme.

Em uma modalidade, como descrito por exemplo em Reinscheid et al. (Applied and Environmental Microbiology 60, 126-132 (1994)) para o operon hom-thrB, um plasmídeo não-replicativo na C. glutamicum e que compreende o gene de interesse é transferido para uma bactéria corinefor- me. A cepa resultante após recombinação homóloga por meio de um evento de "crossover" compreende pelo menos duas cópias do gene ou alelo rele- vante.

Em outra modalidade, que é descrita em WO 03/040373 e US- 2003-0219881-A1, uma ou duas cópias do gene de interesse é introduzida por meio de pelo menos dois eventos de recombinação em um sítio deseja- do da C. glutamicum. Dessa maneira, por exemplo, uma cópia de um alelo IysC que codifica uma aspartato quinase insensível ao feedback por L-Iisina foi incorporada no gene gluB da C. glutamicum.

Em ainda outra modalidade, que é descrita em WO 03/014330 e US-2004-0043458-A1, pelo menos uma cópia adicional do gene de interesse é incorporada ao gene ou alelo previamente presente no sítio natural por meio de pelo menos dois eventos de recombinação. Desta maneira, por e- xemplo, uma duplicação em tandem de um alelo lysCFBR foi realizada no sítio natural do gene IysC.

É possível, por fim, aumentar o número de cópias com a ajuda de transposonse elementos IS (ver US 5.804.414, US 5.591.577).

Um método adicional para produzir uma superexpressão consis- te em ligar o gene ou alelo apropriado de uma maneira funcional (operacio- nalmente ligada) a um promotor ou a um cassete de expressão. Promotores adequados para a Corynebacterium glutamicum estão descritos por exemplo no artigo de revisão de Patek et al. (Journal of Biotechnology 104(1-3), 311- 323 (2003). É possível da mesma maneira usar as variantes do promotor dapA descrito por Vasicova et al. (Journal of Bacteriology 181, 6188-6191 (1999)), por exemplo o promotor A25. Uma possibilidade adicional é usar o promotor GAP da Corynebacterium glutamicum (EP 06007373). Finalmente, os promotores amplamente conhecidos T3, T7, SP6, M13, lac, tac e trc des- critos por Amann et al. (Gene 69(2), 301-315 (1988)) e Amann e Brosius (Gene 40(2-3), 183-190 (1985)) podem ser usados.

Uma outra possibilidade é mutar a região promotora e regulado- ra do sítio de ligação de ribossomo localizado a montante do gene estrutural. A expressão é igualmente melhorada mediante medidas para prolongar o tempo de vida do mRNA. A atividade enzimática é igualmente aumentada, além disso, evitando-se a degradação da proteína enzimática. Uma possível alternativa adicional é a superexpressão do gene ou alelo relevante median- te alteração da composição dos meios e da manipulação da cultura.

A atividade ou concentração da proteína apropriada é geralmen- te aumentada pelas medidas de superexpressão em pelo menos 10%, 25%, 5 50%, 75%, 100%, 150%, 200%, 300%, 400% ou 500%, no máximo até 1000% ou 2000% em relação à atividade ou concentração da proteína no micro-organismo inicial ou na cepa-mãe. Um micro-organismo inicial ou ce- pa-mãe significam um micro-organismo no qual as medidas de intervenção são realizadas.

A concentração da proteína pode ser determinada por fraciona-

mento mono e bidimensional da proteína em gel e subsequente identificação ótica da concentração proteica usando no gel um software de análise apro- priado. Um método útil para preparar o gel de proteínas no caso das bacté- rias corineformes e para identificar as proteínas é o procedimento descrito 15 por Hermann et ai (Electrophoresis, 22:1712-23 (2001)). A concentração proteica pode igualmente ser determinada por hibridização por Western blot com um anticorpo específico para a proteína a ser detectada (Sambrook et ai, Molecular cloning: a Iaboratory manual. 2nd Ed. Cold Spring Harbor La- boratory Press, Cold Spring Harbor, Nova Iorque, 1989) e subsequente ava- 20 liação ótica com software apropriado para determinar a concentração (Lo- haus and Meyer (1998) Biospektrum 5:32-39; Lottspeich, Angewandte Che- mie 272: 2630-2647 (1999)).

Pode ainda ser vantajoso para a produção de L-lisina, além do uso de alelos do gene prpD1 de acordo com a invenção, quando apropriado, juntamente com a superexpressão de pelo menos um dos genes seleciona- dos do grupo supramencionado de genes, atenuar simultaneamente ou des- ligar um ou mais dos genes endógenos selecionados do grupo de

• um gene pgi codificador da glicose-6-fosfato isomerase (Pgi, EC no. 5.3.1.9) tal como, por exemplo, o gene pgi descrito em US 6.586.214

e US 6.465.238 da Corynebacterium glutamicum,

• um gene hom codificador da homoserina desidrogenase (Hom, EC no. 1.1.1.3), tal como, por exemplo, o gene hom descrito em EP-A- 0131171 da Corynebacterium glutamicum,

• um gene thrB codificador da homoserina quinase (ThrB, EC no. 2.7.1.39) tal como, por exemplo, o gene thrB descrito por Peoples et al. (Mo- lecular Microbiology 2 (1988): 63-72)) da Corynebacterium glutamicum e

· um gene pfkB codificador da fosfofrutoquinase (PfkB, EC no.

2.7.1.56), tal como, por exemplo, o gene pfkB descrito em WO 01/00844 (seqüência no. 57) da Corynebacterium glutamicum,

• um gene mdh codificador da malato desidrogenase (Mdh, EC no. 1.1.1.37) como descrito, por exemplo, em WO 02/02778,

· um gene mgo codificador da malato-quinona oxidoredutase

(Mqo, EC no. 1.1.99.16), como descrito, por exemplo, em US 7.094.106 e PCT/EP2005/057216.

O termo "atenuação" descreve, neste contexto, a redução ou desligamento da atividade da atividade intracelular de uma ou mais enzimas 15 (proteínas) em um micro-organismo codificadas pelo DNA apropriado usan- do, por exemplo, um promotor fraco ou usando um gene ou alelo codificador de uma enzima correspondente com atividade baixa ou desativadora do ge- ne ou enzima (proteína) correspondente e, quando apropriado, combinando essas medidas.

As medidas de atenuação geralmente reduzem a atividade ou

concentração da proteína correspondente a 0 a 75%, 0 a 50%, 0 a 25%, 0 a 10% ou 0 a 5% da atividade ou concentração da proteína de tipo selvagem, ou da atividade ou concentração da proteína no micro-organismo inicial.

Mutações adequadas para a geração de uma atenuação são 25 transições, transversões, inserções e deleções de pelo menos um (1) par de bases ou nucleotídeo. Dependendo do efeito da troca de aminoácidos cau- sada pela mutação sobre a atividade enzimática, é feita referência a muta- ções missense ou mutações nonsense. Uma mutação missense leva à troca de um dado aminoácido de uma proteína por outro, sendo a troca de amino- 30 ácidos em particular uma troca não-conservativa. Isso restringe a atividade ou a capacidade da proteína de funcionar e a reduz a um valor de 0 a 75%, 0 a 50%, 0 a 25%, 0 a 10% ou 0 a 5%. A mutação nonsense leva a um có- don de parada na região codificadora do gene e assim à terminação prema- tura da tradução. Inserções ou deleções de pelo menos um par de bases em um gene leva a mutações por deslocamento do quadro de leitura, que levam à incorporação de aminoácidos incorretos ou ao término prematuro da tradu- 5 ção. Se a mutação resultar em um códon de parada na região codificadora, isso leva igualmente ao término prematuro da tradução. As medidas men- cionadas são preferivelmente realizadas na parte 5’-terminal da região codi- ficadora da porção N- terminal do polipeptídeo. Caso o comprimento total de um polipeptídeo (medido como o número de L-aminoácidos quimicamente 10 ligados) é designado como 100%, a parte da seqüência de aminoácidos per- tencente à porção N-terminal do polipeptídeo - no contexto da presente in- venção - compreende 80% dos L-aminoácidos após o aminoácido inicial L- formilmetionina.

Instruções adicionais para a geração de tais mutações perten- 15 cem à técnica mais avançada e podem ser encontradas em livros-texto co- nhecidos de genética e biologia molecular tais como, por exemplo, o Iivro- texto de Knippers ("Molekulare Genetik", 6a rdição, Georg Thieme Verlag, Stuttgart, Alemanha, 1995), o de Winnacker ("Gene and Klone", VCH Ver- lagsgesellschaft, Weinheim, Alemanha, 1990) e o de Hagemann ("Allgemei- 20 ne Genetik", Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1986). Medidas adicionais são descritas na técnica anterior.

Um método para reduzir seletivamente a expressão genética consiste em colocar o gene a ser atenuado sob o controle de um promotor que possa ser induzido pela adição de quantidades calculadas de IPTG (iso- 25 propil-p-D-tiogalactopiranosídeo) tais como, por exemplo, o promotor trc ou o promotor tac. Adequados a este fim são vetores tais como, por exemplo, o vetor de expressão da Escherichia coli pXK99E (W00226787; depositado em concordância com o Tratado de Budapeste em 31 de julho de 2001 na DH5alpha/pxK99E como DSMI4440 na Deutsche Sammlung für Mikroorga- 30 nismen und Zellkulturen (DSMZ, Brunswick, Alemanha)) ou pVWEx2 (Wen- disch, Ph. D. thesis, Berichte des Forschungszentrums Jülich, Jül-3397, ISSN 0994-2952, Jülich, Alemanha (1997)) que possibilitam a expressão IPTG-dependente do gene clonado na Corynebacterium glutamicum.

Este método foi empregado por exemplo na patente W00226787 para a expressão regulada do gene deaD pela integração do vetor pXK99EdeaD no genoma da Corynebacterium glutamicum e por Simic 5 et al. (Applied and Environmental Microbiology 68: 3321-3327 (2002)) para a expressão regulada do gene glyA pela integração do vetor pK18mobglyA’ na Corynebacterium glutamicum.

Um método adicional para reduzir especificamente a expressão genética é a técnica antissentido, nas quais oligodeoxinucleotídeos curtos ou 10 vetores são trazidos para dentro das células-alvo para sintetizar RNA antis- sentido mais longo. O RNA antissentido é capaz de ligar-se lá a segmentos complementares de mRNAs específicos e reduzir sua estabilidade ou blo- quear a traduzibilidade. Um exemplo pode ser encontrado por aquele versa- do na técnica em Srivastava et al. (Applied Environmental Microbiology 2000 15 Oct; 66 (10): 4366-4371).

As bactérias corineformes isoladas obtidas pelos métodos da invenção mostram uma secreção ou produção do aminoácido desejado em um processo de fermentação aumentada em comparação com a cepa inicial ou cepa-mãe empregada.

Bactérias isoladas significam os mutantes isolados e gerados e

bactérias recombinantes, especialmente bactérias corineformes, de acordo com a invenção que compreendem um alelo prpD1 codificador de uma 2- metilcitrato desidratase que compreende a troca de aminoácidos descrita na posição 272 da seqüência de aminoácidos.

A produção das bactérias isoladas ou do processo de fermenta-

ção usando as mesmas em relação com um ou mais dos parâmetros sele- cionados do grupo de concentração (produto por volume), o rendimento do produto (produto formado por fonte de carbono consumida) e formação do produto (produto formado por volume e pelo tempo) ou então outros parâme- 30 tros do processo e combinações deles são melhorados em pelo menos 0,5%, pelo menos 1%, pelo menos 1,5% ou pelo menos 2% em relação à cepa inicial ou cepa-mãe ou processo de fermentação usando as mesmas. As bactérias corineformes isoladas de acordo com a invenção podem ser cultivadas continuamente - como descrito, por exemplo, em PCT/EP2004/008882 - ou de maneira descontínua (cultivo descontínuo) ou em um ou repetidos processos de cultivo alimentados descontínuos com o 5 objetivo de produzir L-aminoácidos. Um resumo de natureza geral sobre mé- todos de cultivo conhecidos está disponível no livro-texto de Chmiel (Biopro- zesstechnik 1. Einführung in die Bioverfahrenstechnik (Gustav Fischer Ver- lag, Stuttgart, 1991)) ou no livro-texto de Storhas (Bioreaktoren und periphe- re Einrichtungen (Vieweg Verlag, Brunswick/Wiesbaden, 1994)).

O meio de cultura ou meio de fermentação a ser usado deve sa-

tisfazer de maneira apropriada as exigências das respectivas cepas. Descri- ções de meios de cultura de vários micro-organismos estão disponíveis no "Manual of Methods for General Bacteriology" da American Society for Bac- teriology (Washington D.C., EUA, 1981). Os termos meio de cultura, meio de fermentação e meio nutriente ou meio são intercambiáveis.

As fontes de carbono que podem ser usadas são açúcares e carboidratos tais como, por exemplo, glicose, sacarose, lactose, frutose, mal- tose, melaço, soluções contendo sacarose de beterraba ou produção de ca- na-de-açúcar, amido, hidrolisato de amido e celulose, óleos e gorduras tais 20 como, óleo de soja, óleo de girassol, óleo de amendoim e óleo de coco, áci- dos graxos tais como, por exemplo, ácido palmítico, ácido esteárico e ácido linolênico, álcoois tais como, por exemplo, glicerol, metanol e etanol e ácidos orgânicos tais como, por exemplo, ácido acético. Essas substâncias podem ser usadas isoladamente ou como uma mistura.

Fontes de nitrogênio que podem ser usadas são compostos or-

gânicos contendo nitrogênio tais como peptona, extrato de levedura, extrato de carne, extrato de malte, licor da maceração do milho, farinha de soja e ureia ou compostos inorgânicos tais como sulfato de amônia, cloreto de a- mônia, fosfato de amônia, carbonato de amônia e nitrato de amônia. As fon- tes de nitrogênio podem ser usadas isoladamente ou como mistura.

Fontes de fósforo que podem ser usadas são ácido fosfórico, di- hidrogênio fosfato de potássio ou fosfato hidrogênico dipotássico ou os sais contendo sódio correspondentes.

O meio de cultura deve, adicionalmente, compreender sais, por exemplo, sob a forma de cloretos ou sulfatos de metais, tais como, por e- xemplo, sódio, potássio, magnésio, cálcio e ferro, tais como, por exemplo, 5 sulfato de magnésio ou sulfato de ferro, que são necessários para o cresci- mento. Finalmente, fatores de crescimento essenciais tais como aminoáci- dos, por exemplo, homoserina e vitaminas, por exemplo tiamina, biotina ou ácido pantotênico, podem ser empregados além das substâncias supramen- cionadas. É ademais possível adicionar ao meio de cultura precursores ade- 10 quados do aminoácido respectivo.

Os materiais iniciais mencionados podem ser acrescentados à cultura sob a forma de um lote único ou alimentados durante o cultivo de maneira adequada.

Para controlar o pH da cultura, compostos básicos tais como hi- dróxido de sódio, hidróxido de potássio, amônia ou amônia aquosa, ou com- postos acídicos tais como ácido fosfórico ou ácido sulfúrico são empregados de uma maneira apropriada. O pH é geralmente ajustado em um valor de 6,0 a 9,0, preferivelmente de 6,5 a 8. Para controlar a formação de espuma, é possível empregar agentes antiespumantes tais como, por exemplo, poligli- col ésteres de ácido graxo. Para manter a estabilidade dos plasmídeos, é possível acrescentar ao meio substâncias de ação seletiva apropriadas, tais como, por exemplo, antibióticos. Para manter condições aeróbicas, oxigênio ou misturas gasosas contendo oxigênio tais como, por exemplo, ar, são in- troduzidas na cultura. É igualmente possível usar líquidos enriquecidos com peróxido de hidrogênio. A fermentação é realizada, quando apropriado, com excesso de pressão com, por exemplo, com um excesso de pressão de 0,03 a 0,2 MPa. A temperatura da cultura é normalmente de 20°C a 45°C e prefe- rivelmente de 25° a 40°C. Em processos descontínuos, o cultivo é continua- do até um volume máximo do aminoácido desejado ter sido formado. O obje- tivo é normalmente alcançado em um prazo de 10 horas a 160 horas. Em processos contínuos, tempos de cultivo mais longos são possíveis.

Meios de fermentação adequados são descritos, inter alia, em US 6.221.636, em US 5.840.551, em US 5.770.409, em US 5.605.818, em US 5.275.940, em US 4.275.157 e em US 4.224.409.

Métodos para a determinação dos L-aminoácidos são conheci- dos na técnica mais recente. A análise pode acontecer, por exemplo, como 5 descrito por Spackman et ai (Analytical Chemistry, 30, (1958), 1190) por cromatografia de troca aniônica com subsequente derivação com ninidrina, ou pode acontecer por HPLC de fase reversa como descrito por Lindroth et ai (Analytical Chemistry (1979) 51: 1167-1174).

A invenção, correspondentemente, refere-se a um processo para produzir um L-aminoácido no qual

a) uma bactéria corineforme isolada é fermentada em um meio apropriado, compreendendo a bactéria um gene codi- ficador de um polipeptídeo com atividade enzimática típica da 2-metilcitrato desidratase, no qual a L-prolina na posi-

ção 272 na seqüência de aminoácidos do polipeptídeo, ou

na posição correspondente, é substituída por outro amino- ácido proteinogênico, preferivelmente a L-Ieucina e,

b) o L-aminoácido é acumulado no caldo de fermentação ou nas células da bactéria corineforme isolada.

Isso é geralmente seguido pela coleta do L-aminoácido acumu-

lado no meio nutriente ou no caldo de fermentação e/ou nas células da bac- téria para se obter um produto sólido ou líquido.

Um caldo de fermentação significa um meio de fermentação no qual um micro-organismo foi cultivado por um certo tempo e a uma certa 25 temperatura. O meio de fermentação, ou os meios empregados durante a fermentação, compreende(m) todas as substâncias e componentes que ga- rantem o crescimento do micro-organismo e a formação do aminoácido de- sejado.

Quando a fermentação está completa, o caldo de fermentação resultante correspondentemente compreende a) a biomassa do micro- organismo que foi produzida como resultado do crescimento das células do micro-organismo, b) o aminoácido desejado formado durante a fermentação, c) os subprodutos orgânicos formados durante a fermentação, e d) os consti- tuintes do meio/meios de fermentação empregado(s) ou dos materiais inici- ais tais como, por exemplo, vitaminas tais como a biotina, aminoácidos tais como a homoserina ou sais tais como o sulfato de magnésio, que não foram 5 consumidos pela fermentação.

Os subprodutos orgânicos incluem substâncias que são produzidas pe- los micro-organismos empregados na fermentação quando apropriado em adição ao L-aminoácido desejado resultante e são secretados quando apro- priado. Estes incluem L-aminoácidos que somam menos do que 30%, 20% 10 ou 10% em comparação com o aminoácido desejado. Estes incluem ainda ácidos orgânicos que têm de um a três grupos carboxila, tais como, por e- xemplo, ácido acético, ácido lático, ácido cítrico, ácido málico ou ácido fumá- rico. Também incluídos, enfim, estão açúcares tais como, por exemplo, trea- lose.

Caldos de fermentação típicos adequados para propósitos indus-

triais normalmente possuem um teor de aminoácidos de 30 g/kg a 200 g/kg ou 40 g/kg a 180 g/kg ou 50 g/kg a 150 g/kg. O teor de biomassa (na forma de biomassa seca) é geralmente de 20 a 50 g/kg.

No caso do aminoácido L-lisina, substancialmente quatro dife- rentes formas de produto são conhecidas na técnica mais recente.

Um grupo de produtos contendo L-Iisina inclui soluções alcalinas aquosas concentradas de L-Iisina purificada (EP-B-0534865). Um outro gru- po, como descrito por exemplo em US 6.340.486 e US 6.465.025, inclui con- centrados contendo biomassa aquosos e acídicos de caldos de fermentação 25 contendo L-lisina. O grupo melhor conhecido de produtos sólidos inclui pós ou formas cristalinas de L-lisina pura ou purificada que se encontra normal- mente sob a forma de um sal, como, por exemplo, L-lisina mono- hidrocloreto. Um outro grupo de formas sólidas do produto é descrito, por exemplo, em EP-B-0533039. Além da L-lisina, a forma do produto lá descrita 30 compreende a maior parte dos materiais iniciais usados durante a produção fermentativa e não consumidos e, quando apropriado, a biomassa do micro- organismo empregado com um conteúdo de > 0% -100%. No caso dos aminoácidos L-valina, L-isoleucina, L-prolina, L-trip- tofano e L-homoserina, as formas do produto conhecidas na técnica anterior são substancialmente aquelas contendo os aminoácidos relevantes em for- ma purificada ou pura (> 95% por peso ou > 98% por peso).

5 Correspondendo às diferentes formas do produto, uma ampla

variedade de processos é conhecida mediante os quais o L-aminoácido é coletado, isolado ou purificado do caldo de fermentação para produzir o pro- duto contendo L-aminoácido ou o L-aminoácido purificado.

L-aminoácidos puros sólidos são produzidos substancialmente 10 mediante métodos de cromatografia de troca iônica, quando apropriado, com o uso de cavão ativado e métodos de cristalização. No caso da lisina, a base correspondente ou um sal correspondente tal como, por exemplo, lisina mo- no-hidrocloreto (Lys-HCI) ou sulfato de lisina (Lys2-H2So4) é obtida dessa maneira.

No caso da lisina, EP-B-0534865 descreve um processo para a

produção de soluções contendo L-lisina básicas aquosas a partir de caldos de fermentação. No processo ali descrito, a biomassa é removida do caldo de fermentação e descartada. Uma base tal como, por exemplo, sódio, po- tássio ou hidróxido de amônia é usada para ajustar um pH entre 9 e 11. Os 20 constituintes minerais (sais inorgânicos) são removidos do caldo após con- centração e resfriamento por cristalização e ou usado como fertilizante ou descartado.

Em processos para a produção de lisina usando as bactérias de acordo com a invenção, processos resultando em produtos que compreen- dem componentes do caldo de fermentação também são empregados. Estes são usados em particular como aditivos para nutrição animal.

Dependendo das exigências, a biomassa pode ser removida in- tegralmente ou parcialmente do caldo de fermentação por métodos de sepa- ração tais como, por exemplo, centrifugação, filtração, decantação ou uma 30 combinação dos mesmos, ou ser deixados completamente nos produtos. Quando apropriado, a biomassa ou o caldo de fermentação contendo bio- massa é desativada durante uma etapa de processamento apropriada, por exemplo por tratamento termal (aquecimento) ou pela adição de ácido.

Os constituintes químicos da biomassa são inter alia o envelope celular, por exemplo o peptídeoglicano e o arabinogalactano, a proteína ou polipeptídeo, por exemplo o polipeptídeo de 2-metilcitrato desidratase, lipí- 5 dios e fosfolipídios e ácidos nucleicos (DNA e RNA), por exemplo, polinucle- otídeos compreendendo a mutação de acordo com a invenção. Como resul- tado das medidas de desativação e/ou das etapas de processamento adicio- nais (por exemplo acidificação, secagem por pulverização, granulação, etc.), os ácidos nucleicos estão normalmente presentes como fragmentos com um 10 comprimento de inter alia >40-60 bp, > 60 - 80 bp, > 80 - 100 bp, > 100 - 200 bp, > 200 - 300 bp, > 300 - 400 bp, > 400 - 500 bp, > 500 - 750 bp,

> 750 - 1000 bp, > 1000 - 1250 bp, > 1250 - 1500 bp, > 1500 - 1750 bp,

> 1750 - 2000 bp, > 2000 - 2500 bp, > 2500 - 3000 bp, > 3000 - 4000 bp,

> 4000 - 5000 bp.

Em um procedimento, a biomassa é removida completamente ou

quase completamente de forma que nenhuma (0%), ou não mais do que 30%, não mais do que 20%, não mais do que 10%, não mais do que 5%, não mais do que 1% ou não mais do que 0,1% de biomassa permaneça no produto produzido. Em um procedimento adicional, a biomassa não é remo- 20 vida, ou é removida apenas em pequenas proporções de forma que toda (100%) ou mais do que 70%, 80%, 90%, 95% ou 99,9% da biomassa per- maneça no produto produzido. Em um processo de acordo com a invenção, correspondentemente, a biomassa é removida em proporções de > 0% a < 100%.

Por fim, o caldo de fermentação obtido após a fermentação pode

ser ajustado, antes ou depois da remoção parcial ou completa da biomassa, a um pH ácido com um ácido inorgânico tal como, por exemplo, ácido clorí- drico, ácido sulfúrico ou ácido fosfórico ou um ácido orgânico tal como, por exemplo, ácido propiônico (GB 1.439.728 ou EP 1.331.220). É igualmente 30 possível acidificar o caldo de fermentação com o conteúdo completo de bio- massa (US 6.340.486 ou US 6.465.025). Enfim, o caldo pode também ser estabilizado pela adição de bissulfito de sódio (NaHSOs, GB 1.439.728) ou outro sal, por exemplo, amônia, metal alcalino ou sal de metal alcalino- terroso ou ácido sulfuroso.

Durante a remoção da biomassa, sólidos orgânicos ou inorgâni- cos presentes onde apropriado no caldo de fermentação são parcial ou 5 completamente removidos. Os subprodutos orgânicos dissolvidos no caldo de fermentação e os componentes não consumidos dissolvidos do meio de fermentação (materiais iniciais) permanecem pelo menos parcialmente (> 0%), preferivelmente até pelo menos 25%, de maneira particularmente prefe- rível até pelo menos 50% e de maneira muito particularmente preferível até 10 pelo menos 75% no produto. Quando apropriado, eles também permanecem completamente (100%) ou quase completamente, significando > 95% ou > 98% no produto. Neste sentido, o termo "com base no caldo de fermenta- ção" significa que o produto compreende pelo menos parte dos componen- tes do caldo de fermentação.

Subsequentemente, a água é removida ou espessada ou con-

centrada do caldo por métodos conhecidos tais como, por exemplo, com a ajuda de um evaporador rotativo, evaporador de filme fino, evaporador de filme descendente, por osmose reversa ou por nanofiltração. Esse caldo de fermentação concentrado pode ser transformado em produtos de fluxo livre, 20 em particular um pó de partículas finas ou preferivelmente grãos grandes, por métodos de liofilização, secagem por pulverização, granulação por pul- verização ou por outros processos como descrito, por exemplo, no leito flui- dificado circulante de acordo com PCT/EP2004/006655. Um produto deseja- do é isolado quando apropriado dos grânulos resultantes por peneiração ou 25 remoção de pó.

É igualmente possível secar o caldo de fermentação diretamen- te, ou seja, sem concentração prévia por secagem por pulverização ou gra- nulação por pulverização.

"De fluxo livre" significa pós que fluem livremente para fora de uma série de recipientes de vidro com orifícios de diferentes tamanhos, pelo menos para fora de recipientes com orifícios de 5 mm (milímetros) (Klein: Seifen, Õle, Fette, Wachse 94, 12 (1968)). "De partícula fina" significa um pó com diâmetro de partículas predominantemente (> 50%) de 20 a 200 μιτι.

"Grono" significa um produto com diâmetro de partículas predo- minantemente (> 50%) de 200 a 2000 μιτι.

A determinação do diâmetro de partícula pode ser realizada por

métodos de espectometria de difração a laser. Métodos correspondentes são descritos no livro-texto sobre "TeilchengrõBenmessung in der Laborpra- xis" de R. H. Müller e R. Schuhmann, Wissenschaftliche Verlagsgesellschaft Stuttgart (1996) ou no livro-texto "Introduction to Particle Technology" de M. Rhodes, publicado por Wiley & Sons (1998).

O pó de livre fluxo, de partículas finas, pode por sua vez ser convertido por processos adequados de compactação ou granulação em um produto de grãos grandes, de fluxo muito livre, armazenável e substancial- mente livre de pó.

O termo "livre de pó" significa que o produto compreende a-

penas pequenas proporções (< 5%) de tamanhos de partícula abaixo de 100 μιτι de diâmetro.

"Armazenável" no sentido de que essa invenção significa um produto que pode ser armazenado por pelo menos um (1) ano ou mais, pre- ferivelmente por pelo menos 1,5 ano ou mais, de maneira particularmente preferível por dois (2) anos ou mais, em um ambiente seco e fresco sem que ocorra perda substancial (< 5%) do respectivo aminoácido.

A invenção refere-se ainda, de acordo com tudo isso, a um pro- cesso para produzir um produto contendo L-aminoácido, preferivelmente L- lisina ou L-triptofano, preferivelmente um aditivo para nutrição animal, a par- tir de caldos de fermentação, caracterizado pelas seguintes etapas:

a) cultivo e fermentação de uma bactéria corineforme secreto- ra de L-aminoácido que compreenda pelo menos um alelo prpD1 codificador de um polipeptídeo com atividade típica de 2-metilcitrato desidratase, que inclua uma seqüência de

aminoácidos na qual na posição 272 ou em posição com- parável um aminoácido proteinogênico com exceção da L- prolina, preferivelmente L-leucina, esteja presente, em um meio de fermentação,

b) remoção da biomassa formada durante a fermentação em uma quantidade de 0 a 100% por peso, e

5

c) secagem do caldo de fermentação obtida tal como em a)

e/ou b) para obtenção do produto na forma em pó ou gra- nular desejada,

sendo adicionado um ácido selecionado do grupo de ácido sulfú- rico, ácido fosfórico ou ácido clorídrico, quando apropriado, antes da etapa b) ou c). A etapa a) ou b) é preferivelmente seguida pela remoção da água do caldo de fermentação (concentração) contendo L-aminoácidos.

A invenção refere-se ainda a um processo para a produção de um produto contendo sulfato de lisina que é descrito em princípio em DE 102006016158 e no qual o caldo de fermentação obtido usando-se o micro- 15 organismo de acordo com a invenção, do qual a biomassa foi removida completamente ou parcialmente quando apropriado, é adicionalmente pro- cessado pela realização de um processo que inclui pelo menos as seguintes etapas:

25

20

a) o pH é reduzido pela adição de ácido sulfúrico para 4,0 a 5,2, em particular 4,9 a 5,1, e a uma proporção molar sulfa- to/L-lisina no caldo de 0,85 a 1,2, preferivelmente 0,9 a 1,0, de maneira particularmente preferível de > 0,9 a < 0,95, quando apropriado, mediante adição de um composto con- tendo sulfato ou de uma pluralidade de compostos conten- do sulfato e

b) a mistura obtida desta maneira é concentrada pela remo- ção da água e mediante granulação, quando apropriado,

quando uma ou mais das seguintes medidas for/forem realiza- da(s) quando apropriado antes da etapa a):

30

c) medição da proporção molar sulfato/L-lisina para confirmar a quantidade necessária de composto(s) contendo sulfato

d) adição de um composto contendo sulfato selecionado do grupo de sulfato de amônia, bissulfato de amônia e ácido sulfúrico em proporções adequadas.

Quando apropriado, também antes da etapa b), um sal de ácido sulfuroso, preferivelmente bissulfito de metal alcalino, de maneira particular- 5 mente preferível bissulfito de sódio, é adicionado a uma concentração de 0,01 a 0,5 por peso, preferivelmente 0,1 a 0,3% por peso, de maneira parti- cularmente preferível de 0,1 a 0,2% por peso, com base no caldo de fermen- tação.

Os compostos contendo sulfato preferidos que devem ser men- cionados no contexto das etapas do processo acima são em particular o sul- fato de amônia e/ou o bissulfato de amônio ou misturas correspondentes de amônia e ácido sulfúrico e o próprio ácido sulfúrico.

A proporção V de sulfato/L-lisina é calculada por meio da fórmu- la V = 2 x [SO42'] / [L-lisina]. Essa fórmula leva em consideração o fato de 15 que o ânion SO42' tem duas cargas. Uma razão de V = 1 significa que a composição estoiquiométrica Lys2(SO4) está presente, enquanto um resulta- do com uma proporção de V - 0,9 representa um déficit de 10% de sulfato e com uma proporção de V = 1,1 tem-se um excesso de 10% de sulfato.

É vantajoso empregar durante a granulação ou compactação os 20 auxiliares ou veículos orgânicos ou inorgânicos habituais, tais como amido, gelatina, derivados da celulose ou substâncias similares, como normalmente usados no processamento de produtos alimentares ou rações como agluti- nantes, agentes gelificantes ou espessantes, ou outras substâncias tais co- mo, por exemplo, sílicas, silicatos (EP0743016A) ou estearatos.

É ainda vantajoso proporcionar óleos à superfície dos grânulos

resultantes, como descrito em WO 04/054381. Óleos que podem ser usados são óleos minerais, óleos vegetais ou misturas de óleos vegetais, exemplos de tais óleos são óleo de soja, óleo de oliva, misturas óleo de soja/lecitina. Da mesma maneira, óleos de silicone, polietileno glicóis ou hidroxietilcelulo- 30 se também são apropriados. O tratamento das superfícies com os óleos mencionados produz uma maior resistência a abrasão no produto e uma re- dução do teor de pó. O teor de óleo do produto é 0,02 a 2,0% por peso, pre- ferivelmente 0,02 a 1,0% por peso e de maneira particularmente preferível

0,2 a 1,0% por peso com base na quantidade total do aditivo para ração.

Os produtos preferidos têm uma proporção de > 97% por peso de um tamanho de partícula de 100 a 1800 μηι ou uma proporção de > 95% 5 por peso de um tamanho de partícula de 300 a 1800 μηι de diâmetro. A pro- porção de pó, isto é, partículas com um tamanho de partícula de < 100 μιτι, é de maneira particularmente preferível não maior do que 0,5% por peso.

Alternativamente, contudo, o produto pode também ser absorvi- do em um veículo orgânico ou inorgânico conhecido e habitual no proces- 10 sarnento de rações, tal como, por exemplo, sílicas, silicatos, polvilhos, fare- los, farinhas, amidos, açúcares ou outros, e/ou ser misturado e estabilizado com os espessantes e aglutinantes costumeiros, exemplos do uso e do pro- cessamento dos mesmos estão descritos na literatura (Die Mühle + Mischfut- tertechnik 132 (1995) 49, página 817).

Por fim, o produto pode ser também finalizado por processos de

revestimento com formadores de filme tais como, por exemplo, carbonatos de metal, sílicas, silicatos, alginatos, estearatos, amidos, gomas e éteres celulósicos, como descrito em DE-C-4100920 até um estado no qual esteja estável para digestão por estômagos de animais, especialmente pelo estô- mago de ruminantes.

Para ajustar uma concentração desejada de aminoácidos no produto é possível, dependendo das exigências, adicionar o aminoácido a- propriado durante o processamento sob a forma de um concentrado ou, se apropriado, de uma substância substancialmente pura ou seu sal em forma 25 líquida ou sólida. Estes podem ser adicionados isoladamente ou como mistu- ras ao caldo de fermentação ou concentrado resultante, ou então durante o processo de secagem ou granulação.

A invenção refere-se ainda a um processo para a produção de um produto contendo lisina sólida, como descrito em princípio em US 20050220933, e que inclui o desenvolvimento do caldo de fermentação obti- do usando os micro-organismos de acordo com a invenção, de acordo com as seguintes etapas: a) filtração do caldo de fermentação, preferivelmente filtração por membrana, para resultar em um sedimento contendo biomassa e um filtrado.

b) concentração do filtrado, preferivelmente de forma a resul- tar em um teor de sólidos de 48 a 52% por peso,

c) granulação do concentrado obtido na etapa b), preferivel- mente a uma temperatura de 50°C a 62°C, e

d) revestimento dos grânulos obtidos em c) com um ou mais agentes de revestimento.

Os agentes de revestimento usados no revestimento na etapa d)

são preferivelmente selecionados do grupo consistindo em d1) a biomassa obtida na etapa a),

d2) um composto contendo L-lisina, preferivelmente selecio- nado do grupo de L-lisina hidrocloreto ou sulfato de L- lisina,

d3) uma substância substancialmente livre de L-lisina com um conteúdo de L-lisina de < 1% por peso, preferivel- mente < 0,5% por peso, preferivelmente selecionado do grupo consistindo em amido, carragena, ágar, sílicas, sili- catos, polvilhos, farelos e farinhas e

d4) uma substância repelente de água, preferivelmente sele- cionada do grupo consistindo em óleos, polietileno glicóis e parafinas líquidas.

No caso da lisina, a proporção de íons durante a produção de produtos contendo lisina é preferivelmente ajustada de maneira que a pro- porção de íons equivalente à seguinte fórmula

2x[S042']+[Cr]-[NH4+]-[Na+]-[K+]-2x[Mg2+]-2x[Ca2+]/[L-Lys] resulte em 0,68 a 0,95, preferivelmente 0,68 a 0,90, como des- crito por Kushiki et ai. em US 20030152633 (as concentrações molares de- vem ser colocadas entre os "[]".

No caso da lisina, o produto sólido produzido desta forma pos- sui, com base no caldo de fermentação, um teor de lisina (como uma base de lisina) de 10% por peso até 70% por peso ou 20% por peso até 70% por peso, preferivelmente 30% por peso a 70% por peso e de maneira muito par- ticularmente preferível de 40% por peso até 70% por peso, com base no pe- so seco do produto. Os teores máximos da base de lisina de 71% por peso, 72% por peso, 73% por peso são igualmente possíveis.

No caso de um aminoácido eletricamente neutro tal como o L- triptofano, o produto sólido produzido desta maneira possui, com base no caldo de fermentação, um teor de aminoácidos de pelo menos 5% por peso, 10% por peso, 20% por peso, 30% por peso e no máximo 50% por peso, 60% por peso, 70% por peso, 80% por peso, 90% por peso ou até 95% por peso.

O teor de água do produto sólido é de até 5% por peso, preferi- velmente de até 4% por peso, e de maneira particularmente preferível de menos do que 3% por peso.

A invenção, portanto, refere-se a um aditivo para rações conten- do L-lisina baseado em caldo de fermentação, que exibe as seguintes carac- terísticas

a) um teor de lisina (como base) de pelo menos 10% por peso até um máximo de 73% por peso,

b) um teor de água não excedendo 5% por peso, e

c) um teor de biomassa correspondente a pelo menos 0,1% da biomassa presente no caldo de fermentação, sendo a biomassa, desativada quando apropriado, formada por bactérias corineformes de acordo com a invenção.

A invenção, portanto, refere-se também a um aditivo para ração contendo L-triptofano baseado em um caldo de fermentação, que exibe as seguintes características

a) um teor de triptofano de pelo menos 5% por peso até um máximo de 95% por peso,

b) um teor de água não excedendo 5% por peso, e

c) um teor de biomassa correspondente a pelo menos 0,1% da biomassa presente no caldo de fermentação, sendo a biomassa, desativada quando apropriado, formada por bactérias corineformes de acordo com a invenção.

A cepa MH20-22B foi depositada em 28 de outubro de 2004 na Deutsche Sammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ, Bruns- wick, Alemanha) como DSM 16835.

O mutante DM1916 da Corynebacterium glutamicum de acordo com a invenção, que compreende L-Ieucina na posição 272 da seqüência de aminoácidos do polipeptídeo PrpDI, foi depositada em 15 de maio de 2006 na Deutsche Sammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ, Brunswick, Alemanha) como DSM 18258.

A presente invenção é explicada com maior detalhe abaixo por meio de exemplos de modalidades.

Exemplo 1

Mutagênese da cepa DM416 produtora de L-lisina A cepa DM416 da Corynebacterium glutamicum foi empregada

como cepa inicial para a mutagênese com N-metil-N’nitro-N-nitroso de gua- nidina (MNNG). A cepa DM416 é um mutante da Corynebacterium glutami- cum que exige homoserina e Ieucina e está depositada sob a designação ATCC21543 na American Type Culture Collection (Manassas, VA, EUA).

A cepa DM416 foi cultivada em 10 ml de caldo LB (Merck,

Darmstadt, Alemanha), em um frasco Erlenmeyer de 100 ml a 33°C e 200 rpm em um agitador orbital Certomat do tipo BS-1 (B. Braun Biotech Interna- tional, Melsungen, Alemanha) por 24 horas. A cultura foi então centrifugada, o sedimento foi ressuspendido em 10 ml de solução de NaCI a 0,9%. A sus- 25 pensão resultante foi novamente centrifugada e o sedimento resultante foi recolhido em uma solução de 10 ml de NaCI a 0,9%. 5 ml dessa suspensão celular foram tratados com 400 μg/ml de MNNG a 30°C e 200 rpm em um agitador (ver acima) por 15 minutos. A mistura mutagênica foi então centrifu- gada e o sedimento recolhido em 10 ml de tiossulfato de Na a 2% em tam- 30 pão de NaCI a 0,9% (pH = 6,0). A suspensão celular foi então diluída em uma proporção de 1:1000, 1:10.000 e 1:100.000 com solução de NaCI a

0,9% e alíquotas foram distribuídas em placas de ágar cérebro-coração (Merck, Darmstadt, Alemanha). Aproximadamente 4.000 mutantes foram isolados desta maneira.

Exemplo 2

Teste de produção dos mutantes da cepa DM416 Os mutantes obtidos no exemplo 1 foram cultivados em um meio

nutriente adequado para a produção de lisina e o teor de lisina no sobrena- dante da cultura foi determinado. Para este fim, os clones foram inicialmente cultivados em placas de ágar cérebro-coração (Merck, Darmstadt, Alema- nha) a 33°C por 24 horas. Uma pré-cultura foi inoculada (10 ml de meio em 10 um frasco Erlenmeyer de 100 ml) começando com cada uma dessas cultu- ras em placas de ágar. O meio utilizado na pré-cultura foi o MM. A pré- cultura foi incubada a 33°C e 240 rpm em um agitador por 24 horas. Uma cultura principal foi inoculada desta pré-cultura de tal forma que a DO (den- sidade ótica) (660 nm) da cultura principal foi 0,1 DO. O meio MM foi igual-

mente usado na cultura principal.

Meio MM

CSL 5 g/l

MOPS 20 g/l

Glicose (autoclavada separadamente) 50 g/l Sais:

(NH4) 2S04) 25 g/l

KH2PO4 0,1 g/l

MgSO4 *7 H2O 1,0 g/l

CaCI2 *2 H2O 10 mg/l

FeSO4 *7 H2O 10 mg/l

MnSO4 * H2O 5,0 mg/l

Biotina (esterilizada por filtração) 0,3 mg/l

Tiamina * HCI (esterilizada por filtração) 0,2 mg/l

L-Ieucina (esterilizada por filtração) 0,2 mg/l

L-homoserina (esterilizada por filtração) 0,2 mg/l

CaCO3 25 g/l

O CSL (licor da maceração do milho), o MOPS (ácido morfolino- propanosulfônico) e a solução salina foram ajustados a um pH 7 com amônia aquosa e autoclavados. O substrato estéril, as soluções de vitamina e o Ca- CO3 seco autoclavado foram então adicionados.

O cultivo aconteceu em volumes de 10 ml em frascos de Erlen- meyer de 100 ml. A temperatura foi de 33°C, o número de revoluções igual a 250 rpm e a umidade de 80%.

Após 24 horas, a densidade ótica (DO) a um comprimento de onda de medição de 660 nm foi determinada com um Biomek 1000 ((Beck- mann Instruments GmbH, Munich, Alemanha). A quantidade de lisina forma- 10 da foi determinada com um analisador de aminoácidos da Eppendorf- Biotronik (Hamburg, Alemanha) por cromatografia de troca iônica e derivati- zação pós-coluna com detecção de ni-hidrina. Um mutante distinguido pela formação aumentada de lisina foi denominado DM1916.

Tabela 1

Cepa DO (660) Lisina HCI (g/l) DM416 6,3 1,43 DM1916 6,3 1,61 Exemplo 3

Sequênciamento do alelo prpD1 do mutante DM1916 DNA cromossômicofoi isolado do clone DM1916 pelo método de Eikmanns et ai ((Microbiology 140: 1817 - 1828 (1994)). A reação em cadeia da polimerase foi usada para amplificar um segmento de DNA carregando o gene ou alelo prpD1. Com base na seqüência conhecida do gene prpD1 da C. glutamicum (seqüência no. 770 em EP1108790), os seguintes oligonucle- otídeos iniciadores foram selecionados para a PCR: prpD1_XL_A1 (SEQ ID NO: 9):

5' gcgaattcta aactgcgtga ggttgtgg 3'

prpD1_XL_A2 (SEQ ID NO: 10):

5' gcgaattctc cccacatcaa caccattc 3'

Os iniciadores representados foram sintetizados pela MWG Bio- tech (Ebersberg, Alemanha) e a reação de PCR foi realizada pelo método PCR padrão de Innis et ai (PCR Protocols. A Guide to Methods and Applica- tions, 1990, Academic Press). Os iniciadores possibilitam amplificar o seg- mento de DNA que tem cerca de 1,63 kb de comprimento e que carrega o gene ou alelo prpD1. Além disso, os iniciadores contêm a seqüência para um sítio de clivagem da endonuclease de restrição EcoRI, que está subli- nhada na seqüência de nucleotídeos representada acima.

O fragmento de DNA amplificado que tem um comprimento de cerca de 1,63 kb e que carrega o alelo prpD1 da cepa DM1916 foi identifica- do por eletroforese em um gel de agarose a 0,8%, isolado do gel e purificado pelos meios convencionais (QIAquick Gel Extraction Kit, Qiagen, Hilden).

A seqüência de nucleotídeos do fragmento de DNA amplificado

ou produto de PCR foi determinado por sequênciamento pela Agowa (Ber- lim, Alemanha). A seqüência do produto de PCR está representada na SEQ ID NO: 13. A seqüência da região codificadora está adicionalmente represen- tada na SEQ ID NO:5. A seqüência de aminoácidos da proteína de metilci- 15 trato desidratase relevante que foi obtida com a ajuda do programa Patentin está representada na SEQ ID NO:6.

A base timina está localizada na posição 815 da seqüência de nucleotídeos da região codificadora do alelo prpD1 da cepa DM1916 (SEQ ID NO:5). A base citosina está localizada na posição correspondente do ge- ne de tipo selvagem (SEQ ID NO:1).

O aminoácido Ieucina está localizado na posição 272 da se- qüência de aminoácidos da proteína de metilcitrato desidratase da cepa DM1916 (SEQ ID NO:6). O aminoácido prolina está localizado na posição correspondente da proteína de tipo selvagem (SEQ ID NO:2).

O alelo prpD1 que compreende a base timina na posição 815 da

região codificadora, e correspondentemente codifica uma proteína de metilci- trato desidratase que compreende o aminoácido Ieucina na posição 272 da seqüência de aminoácidos, será designada doravante alelo prpD1_P272L. Na designação "prpD1_P272L", o "P" significa L-prolina, o "L" significa L- Ieucina e 272 indica a posição da troca de aminoácidos (ver SEQ ID NO:2 e

6).

O mutante da Corynebacterium glutamicum DM1916 que com- preende L-Ieucina na posição 272 da seqüência de aminoácidos do polipep- tídeo PrpDI foi depositado em 15 de maio de 2006 na Deutsche Sammlung für Mikroorganismen and Zellkulturen (DSMZ, Brunswick, Alemanha) como DSM 18258.

5 Exemplo 4

Troca do gene prpD1 de tipo selvagem da cepa DM416 pelo ale- lo prpD1_P272L

4.1 Construção do vetor de troca pK18mobsacB_prpD1_P272L O fragmento de DNA que tem um comprimento de cerca de 1,63 kb, que carrega o alelo prpD1_P272L e o qual foi preparado por PCR e des- crito no exemplo 3, foi incorporado mediante mutagênese por troca com a ajuda do sistema sacB descrito em Schãfer et al. (Gene, 14, 69-73 (1994)) no cromossomo da cepa DM416 da C. glutamicum descrita no exemplo 1. Este sistema possibilita produzir e selecionar trocas de alelos realizadas por recombinação homóloga.

Para este fim, o fragmento prpD1_P272L de cerca de 1,63 kb foi clivado com a endonuclease de restrição EcoRI, identificado por eletroforese em um gel de agarose a 0,8% e então isolado do gel e purificado por méto- dos convencionais (QIAquick Gel Extraction Kit, Qiagen, Hilden).

O vetor de clonagem mobilizável pK18mobsacB foi digerido com

a enzima de restrição EcoRI e as terminações foram defosforiladas com fos- fatase alcalina (Alkaline Phosphatase, Boehringer Mannheim, Alemanha). O vetor preparado desta maneira foi misturado com o fragmento prpD1_P272L de aproximadamente 1,63 kb e a mistura foi tratada com T4 DNA Iigase (A- mersham-Pharmacia, Freiburg, Alemanha).

A cepa de E. coli S17-1 (Simon et al., Bio/Technology 1: 784- 791, 1993) foi então transformada com a mistura de ligação (Hanahan, In. DNA Cloning. A Practical Approach. Vol. 1, ILR-Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989). A seleção das células carreadoras do plasmídeo ocorreu 30 mediante distribuição da mistura de transformação em placas de ágar LB (Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2nd Ed., Cold Spring Harbor, New York, 1989) com suplemento de 25 mg/l de kanamicina. O DNA do plasmídeo foi isolado de um transformante com a aju- da do QIAprep Spin Miniprep Kit da Qiagen e examinado por clivagem de restrição com a enzima Pstl e subsequente eletroforese em gel de agarose. O plasmídeo foi chamado pK18mobsacB_prpD1_P272L e está representado 5 na figura 1.

4.2 Troca de alelos

O vetor pK18mobsacB_prpD1_P272L mencionado no exemplo

4.1 foi transferido por um protocolo de Scháfer et al. (Journal of Microbiology 172: 1663-1666 (1990)) por conjugação para a cepa DM416 da C. glutami- cum. O vetor não é capaz de replicação independente na DM416 e perma- nece na célula apenas se for integrado no cromossomo como resultado de um evento de recombinação. A seleção de transconjugantes, isto é, de clo- nes com o pK18mobsacB_prpD1_P272L integrado, ocorreu mediante distri- buição da mistura de conjugação em placas com ágar LB (Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2a Ed. Cold Spring Harbor, New York, 1989), o que foi suplementado com 15 mg/l de kanamicina e 50 mg/l de ácido nalidíxico. Transconjugantes insensíveis à kanamicina foram distri- buídos em placas de ágar LB com 25 mg/l de kanamicina e incubados a 33°C por 24 horas. Mutantes nos quais o plasmídeo foi excisado como resul- tado de um segundo evento de recombinação foram selecionados por cultivo não-seletivo de clones em meio líquido LB por 30 horas, seguido por distri- buição em ágar LB com sacarose a 10% e incubação por 16 horas.

O plasmídeo pK18mobsacB_prpD1_P272L compreende, assim como o plasmídeo inicial pK18mobsacB, além do gene de resistência à ka- 25 namicina, uma cópia do gene sacB codificador da Ievana sucrase do Bacillus subtilis. A expressão induzível por sacarose leva à formação de Ievana su- crase que catalisa a síntese do produto levana, que é tóxico para a C. glu- tamicum. Assim, os únicos clones que crescem no ágar LB com sacarose são aqueles nos quais o pK18mobsacB_prpD1_P272L integrado foi excisa- 30 do como resultado de uma segunda recombinação. Dependendo da posição do segundo evento de recombinação em relação com o sítio da mutação, a troca ou incorporação de alelos acontece quando da excisão, ou a cópia ori- ginal permanece no cromossomo do hospedeiro.

Aproximadamente 40 a 50 colônias foram testadas para o fenó- tipo "crescimento na presença da sacarose" e "nenhum crescimento na pre- sença da kanamicina". Para 4 colônias que exibiram o fenótipo "crescimento 5 na presença da sacarose" e "nenhum crescimento na presença da kanami- cina", uma região do gene prpD1 cobrindo a mutação P272L e se iniciando no iniciador de sequênciamento pr1-2 (corresponde à posição da seqüência de nucleotídeos 424-443 da região codificadora do gene prpD1 da SEQ ID NO:1) foi sequênciada pela Agowa (Berlim, Alemanha) para demonstrar que 10 a mutação do alelo prpD1_P272L está presente no cromossomo. O iniciador pr1-2 usado foi sintetizado pela Agowa para este propósito:

pr1-2

5' ggt ate gcc act gcc tat ga 3'

Um clone contendo a base timina na posição 815 da região codi- ficadora do gene prpD1, e assim tem o alelo prpD1_P272L, foi identificado desta forma. Este clone é designado cepa DM416prpD1_P272L.

Exemplo 6

Comparação da produção da cepa DM416prpD1_P272L com a da cepa inicial DM416 O teste de produção da cepa DM416prpD1_P272L da C. Gluta-

micum obtida no exemplo 5 foi realizado como descrito no exemplo 2. O re- sultado do teste está representado na tabela 2.

Tabela 2

Cepa DO (660 nm) Lisina HCI g/l DM416 6,2 1,40 DM416prpD1_P272L 6,2 1,64 Breve descrição da figura:

Figura 1: mapa do plasmídeo pK18mobsacB_prpD1_P272L

As abreviações e designações usadas têm os significados abai- xo. Os números de pares de bases mencionados são aproximações obtidas dentro do escopo de reprodutibilidade das medições.

Kan: gene de resistência à kanamicina EcoRI: sítio de clivagem da enzima de restrição EcoRI Pstl: sítio de clivagem da enzima de restrição Pstl prpD1: alelo prpD1_P272L sacB: gene sacB RP4-mob: região mob com a origem da replicação para transferência (oriT) oriV: origem da replicação V

Claims (61)

1. Mutantes isolados de bactérias corineformes que compreen- dem um gene codificador de um polipeptídeo com atividade típica da 2- metilcitrato desidratase, caracterizados pelo fato de que o polipeptídeo inclui uma seqüência de aminoácidos na qual um dos aminoácidos proteinogêni- cos com exceção da L-prolina está presente na posição 272 ou em uma po- sição correspondente ou comparável.

2. Mutantes de bactérias corineformes de acordo com a reivindi- cação 1, caracterizados pelo fato de que as bactérias corineformes tomam a forma de uma bactéria selecionada do grupo de Corynebacterium efficiens, Corynebacterium glutamicum, Corynebacterium thermoaminogenes e Cory- nebacterium aminogenes.

3. Mutantes de bactérias corineformes de acordo com a reivindi- cação 2, caracterizados pelo fato de que tomam a forma da Corynebaeteri- um glutamicum.

4. Mutantes de bactérias corineformes de acordo com as reivin- dicações 1, 2 ou 3, caracterizados pelo fato de que são bactérias secretoras de L-aminoácidos.

5. Mutantes de bactérias corineformes de acordo com a reivindi- cação 4, caracterizados pelo fato de que são bactérias secretoras de L- lisina, L-valina, L-isoleucina, L-triptofano ou L-homoserina.

6. Mutantes de bactérias corineformes de acordo com as reivin- dicações 1 a 5, caracterizados pelo fato de que o polipeptídeo codificado compreende L-Ieucina posição 272 ou em uma posição comparável.

7. Mutantes de bactérias corineformes de acordo com as reivin- dicações 1 a 5, caracterizados pelo fato de que o polipeptídeo codificado inclui a seqüência de aminoácidos da SEQ ID NO:2, com um dos aminoáci- dos proteinogênicos com exceção da L-prolina estando presente na posição 272.

8. Mutantes de bactérias corineformes de acordo com as reivin- dicações 1 a 6, caracterizados pelo fato dev que o gene inclui uma seqüên- cia de nucleotídeos idêntica à seqüência de nucleotídeos de um polinucleo- tídeo obtenível por meio de reação em cadeia da polimerase (PCR) usando- se DNA obtido de uma bactéria corineforme e um par de iniciadores consis- tindo em um primeiro iniciador incluindo pelo menos 15 nucleotídeos conse- cutivos selecionados da seqüência de nucleotídeos entre as posições 1 a750 da SEQ ID NO:3 ou SEQ ID NO:7, e um segundo iniciador incluindo pe- Io menos 15 nucleotídeos consecutivos selecionados da seqüência de nu- cleotídeos complementar entre as posições 3000 e 2245 da SEQ ID NO:3 ou SEQ ID NO:7.

9. Mutantes de bactérias corineformes de acordo com as reivin- dicações de 1 a 6 ou 8, caracterizados pelo fato de que o polipeptídeo codifi- cado inclui uma seqüência de aminoácidos com um comprimento correspon- dente a 498 L-aminoácidos.

10. Mutantes de bactérias corineformes de acordo com as rei- vindicações de 1 a 6 ou 8 a 9, caracterizados pelo fato de que o polipeptídeo codificado compreende da posição 252 a 291 da seqüência de aminoácidos a seqüência de aminoácidos correspondente à posição 252 a 291 da SEQ ID NO:6.

11. Mutantes de bactérias corineformes de acordo com as rei- vindicações de 1 a 6 ou 8 a 10, caracterizados pelo fato de que o polipeptí- deo codificado inclui uma seqüência de aminoácidos pelo menos 90% idênti- ca à seqüência de aminoácidos da SEQ ID NO:6.

12. Mutantes de bactérias corineformes de acordo com as rei- vindicações de 1 a 6 ou 8 a 10, caracterizados pelo fato de que o gene inclui uma seqüência de nucleotídeos pelo menos 90% idêntica à seqüência de nucleotídeos da SEQ ID NO:5.

13. Mutantes de bactérias corineformes de acordo com a reivin- dicação 6, caracterizados pelo fato de a proteína codificada incluir uma se- qüência de aminoácidos selecionada do grupo a) seqüência de aminoácidos de acordo com a SEQ ID NO:6. b) seqüência de aminoácidos de acordo com a SEQ ID NO:6 incluindo uma ou mais trocas de aminoácidos conservati- vas, e c) seqüência de aminoácidos de acordo com a SEQ ID NO:6 incluindo uma ou mais inserções ou deleções de aminoáci- dos.

14. Mutantes de bactérias corineformes de acordo com a reivin- dicação 7, caracterizados pelo fato de que a seqüência de aminoácidos da SEQ ID NO: 2 compreende L-Ieucina na posição 272.

15. Mutantes de bactérias corineformes de acordo com a reivin- dicação 14, caracterizados pelo fato de que o gene inclui a seqüência de nucleotídeos da SEQ ID NO:5 ou da SEQ ID NO:7.

16. Mutantes de bactérias corineformes caracterizados pelo fato de que são obteníveis pelas seguintes etapas: a) tratamento de uma bactéria corineforme que tem a capaci- dade de secretar aminoácidos com um agente mutagênico b) isolamento e propagação do mutante gerado em a), c) preparação de ácido nucleico do mutante obtido em b), d) preparação de uma molécula de ácido nucleico, usando a reação em cadeia da polimerase, do ácido nucleico de c) e de um par de iniciadores consistindo em um primeiro inici- ador incluindo pelo menos 15 nucleotídeos consecutivos selecionados da seqüência de nucleotídeos entre as posi- ções 1 e 1563 da SEQ ID NO:3 ou da SEQ ID NO:7 e de um segundo iniciador incluindo pelo menos 15 nucleotí- deos consecutivos selecionados da seqüência de nucleotí- deos complementar entre as posições 3000 e 1567 da SEQ ID NO:3 ou 7, e) determinação da seqüência de nucleotídeos da molécula de ácido nucleico obtida em d) e determinação da seqüên- cia de aminoácidos codificada, f) quando apropriado, comparação da seqüência de aminoá- cidos determinada em f) com a SEQ ID NO:6 e g) identificação de um mutante que compreenda um polinu- cleotídeo codificador de um polipeptídeo compreendendo na posição 272 ou em uma posição comparável um amino- ácido proteinogênico com exceção da L-prolina, preferivel- mente a L-leucina.

17. Mutantes de bactérias corineformes de acordo com a reivin- dicação 16, caracterizados pelo fato de que a etapa b) é seguida pela sele- ção de um mutante com a capacidade de secretar em um meio ou acumular no interior das células pelo menos 0,5% mais L-aminoácido do que a bacté- ria corineforme empregada na etapa a) da reivindicação 16.

18. Polinucleotídeo isolado codificador de um polipeptídeo com atividade enzimática típica da 2-metilcitrato desidratase, compreendendo na posição 272 da seqüência de aminoácidos ou em uma posição correspon- dente ou comparável um aminoácido proteinogênico com exceção da L- prolina.

19. Polinucleotídeo isolado de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo fato de que o aminoácido proteinogênico é L-leucina.

20. Polinucleotídeo isolado de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo codificado incluir a seqüência de aminoácidos da SEQ ID NO:2, com um dos aminoácidos proteinogênicos exceto a L-prolina estando presente na posição 272 da seqüência de amino- ácidos.

21. Polinucleotídeo isolado de acordo com a reivindicação 18 ou19, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo codificado inclui uma se- qüência de aminoácidos com um comprimento de 498 aminoácidos.

22. Polinucleotídeo isolado de acordo com a reivindicação 19, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo codificado compreende da po- sição 252 a 291 da seqüência de aminoácidos a seqüência de aminoácidos correspondente à posição 252 à 291 da SEQ ID NO:6.

23. Polinucleotídeo isolado de acordo com a reivindicação 18 ou19, caracterizado pelo fato de que é idêntico à seqüência de nucleotídeos de um polinucleotídeo obtenível por uma reação de cadeia da polimerase (PCR) usando DNA obtido de uma bactéria corineforme e usando um par de inicia- dores consistindo em um primeiro iniciador incluindo pelo menos 15 nucleo- tídeos consecutivos selecionados da seqüência de nucleotídeos entre as posições 1 e 750 da SEQ ID NO:3 ou SEQ ID NO:7, e um segundo iniciador incluindo pelo menos 15 nucleotídeos consecutivos selecionados da se- qüência de nucleotídeos complementar entre as posições 3000 e 2245 da SEQ ID NO:3 ou SEQ ID NO:7.

24. Polinucleotídeo isolado de acordo com a reivindicação 18 ou 19, caracterizado pelo fato de que se hibridiza com a seqüência de nucleotí- deos complementar à SEQ ID NO:5 sob condições rigorosas.

25. Polinucleotídeo isolado de acordo com a reivindicação 18 ou 19, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo codificado incluir uma se- quência de aminoácidos pelo menos 90% idêntica à seqüência de aminoáci- dos da SEQ ID NO:6.

26. Polinucleotídeo isolado de acordo com a reivindicação 18 ou 19, caracterizado pelo fato de que o polinucleotídeo inclui uma seqüência de nucleotídeos pelo menos 90% idêntica à seqüência de nucleotídeos da SEQ ID NO:5.

27. Polinucleotídeo isolado de acordo com a reivindicação 18 ou 19, caracterizado pelo fato de que a proteína codificada inclui uma seqüên- cia de aminoácidos selecionada do grupo a) seqüência de aminoácidos de acordo com a SEQ ID NO:6, b) seqüência de aminoácidos de acordo com a SEQ ID NO:6 incluindo uma ou mais trocas de aminoácidos conservati- vas, e c) seqüência de aminoácidos de acordo com a SEQ ID NO:6 incluindo uma ou mais inserções ou deleções de aminoáci- dos.

28. Polinucleotídeo isolado de acordo com uma ou mais das rei- vindicações de 20 a 27, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo codifi- cado inclui a seqüência de aminoácidos da SEQ ID NO:6.

29. Polinucleotídeo isolado de acordo com a reivindicação 28, caracterizado pelo fato de que inclui a seqüência de nucleotídeos da SEQ ID NO:5.

30. Polinucleotídeo isolado que inclui uma molécula de ácido nucleico codificadora de pelo menos um quadro de leitura com uma seqüên- cia de aminoácidos correspondente à posição 252 a 291 da SEQ ID NO:2, na qual um dos aminoácidos proteinogênicos com exceção da L-prolina está presente na posição correspondente à posição 272 da SEQ ID NO:2.

31. Polinucleotídeo isolado de acordo com a reivindicação 30, caracterizado pelo fato de que codifica pelo menos um quadro de leitura com uma seqüência de aminoácidos correspondente à posição 252 a 291 da SEQ ID NO:6.

32. Polinucleotídeo isolado de acordo com a reivindicação 30 ou 31, caracterizado pelo fato de que a seqüência de aminoácidos compreende uma ou mais trocas de aminoácidos conservativas, sendo que as trocas de aminoácidos conservativas não afetam a posição 272.

33. Polinucleotídeo isolado de acordo com a reivindicação 30, 31 ou 32 caracterizado pelo fato de que compreende uma ou mais mutações silenciosas.

34. Polinucleotídeo isolado de acordo com a reivindicação 31, caracterizado pelo fato de que inclui pelo menos a seqüência de nucleotí- deos correspondente à posição 1504 a 1623 da SEQ ID NO:7.

35. Processo para produzir uma bactéria corineforme recombi- nante, caracterizada pelo fato de que a) um polinucleotídeo isolado como definido na reivindicação 18 a 29, ou como definido na reivindicação 30 a 34 ser trans- ferido para uma bactéria corineforme, b) o gene da 2-metilcitrato desidratase que está presente no cromossomo da bactéria corineforme e que codifica uma seqüência de aminoácidos com L-prolina na posição 272 ser trocado pelo polinucleotídeo de a) que codifica uma se- qüência de aminoácidos que tem na posição 272 ou em uma posição comparável outro L-aminoácido proteinogêni- co, e c) a bactéria corineforme obtida como na etapa a) e b) é pro- pagada.

36. Processo de acordo com a reivindicação 35, caracterizado pelo fato de que o polinucleotídeo isolado como definido nas reivindicações 18 a 29 é usado.

37. Processo de acordo com a reivindicação 35, caracterizado pelo fato de que o polinucleotídeo isolado como definido nas reivindicações 30 a 34 é usado.

38. Processo de acordo com a reivindicação 35, caracterizado pelo fato de que o outro L-aminoácido na posição 272 é a L-leucina.

39. Processo para a produção de um micro-organismo recombi- nante caracterizado pelo fato de que a) um polinucleotídeo isolado como definido nas reivindica- ções 18 a 29 é transferido para um micro-organismo, b) o polinucleotídeo isolado é replicado no micro-organismo, e c) o micro-organismo obtido na etapa a) e b) é propagado.

40. Micro-organismo recombinante que compreende o polinucle- otídeo isolado como definido nas reivindicações 18 a 29 ou 30 a 34.

41. Micro-organismo recombinante de acordo com a reivindica- ção 40, caracterizado pelo fato de que é uma bactéria corineforme ou uma bactéria do gênero Escherichia.

42. Micro-organismo recombinante de acordo com a reivindica- ção 41, caracterizado pelo fato de que a bactéria corineforme toma a forma do gênero Corynebacterium.

43. Micro-organismo recombinante de acordo com a reivindica- ção 42, caracterizado pelo fato de que a bactéria do gênero Corynebacteri- um toma a forma da espécie Corynebacterium glutamicum.

44. Vetor que compreende o polinucleotídeo isolado como defi- nido nas reivindicações 18 a 29 ou 30 a 34.

45. Micro-organismo recombinante que compreende o vetor co- mo definido na reivindicação 44.

46. Micro-organismo recombinante de acordo com a reivindica- ção 45, caracterizado pelo fato de que é uma bactéria corineforme ou uma bactéria do gênero Escherichia.

47. Micro-organismo recombinante de acordo com a reivindica- ção 46, caracterizado pelo fato de que a bactéria corineforme toma a forma do gênero Corynebacterium.

48. Micro-organismo recombinante de acordo com a reivindica- ção 47, caracterizado pelo fato de que a bactéria do gênero Corynebacteri- um toma a forma da espécie Corynebacterium glutamicum.

49. Processo para produzir um L-aminoácido, caracterizado pelo fato de que a) uma bactéria corineforme isolada é fermentada em um 10 meio apropriado, compreendendo a bactéria pelo menos uma cópia de um gene codificador de uma polipeptídeo com atividade enzimática típica da 2-metilcitrato desidrata- se, sendo a L-prolina na posição 272 da seqüência de ami- noácidos do polipeptídeo, ou em posição comparável, tro- cada por outro aminoácido proteinogênico, e b) o L-aminoácido é acumulado no caldo de fermentação ou nas células da bactéria.

50. Processo de acordo com a reivindicação 49, caracterizado pelo fato de que a bactéria corineforme isolada é um mutante como definido nas reivindicações de 1 a 17.

51. Processo de acordo com a reivindicação 49, caracterizado pelo fato de que a bactéria corineforme isolada é uma bactéria corineforme recombinante compreendendo um polinucleotídeo isolado como definido nas reivindicações 19 a 34 ou foi produzida usando o mesmo.

52. Processo de acordo com a reivindicação 49, caracterizado pelo fato de que o L-aminoácido é isolado ou coletado.

53. Processo de acordo com a reivindicação 52, caracterizado pelo fato de que o L-aminoácido é purificado.

54. Processo de acordo com a reivindicação 49, caracterizado pelo fato de que o L-aminoácido é isolado ou coletado junto com constituin- tes do caldo de fermentação e/ou da biomassa (> 0 a 100%).

55. Processo de acordo com a reivindicação 49, caracterizado pelo fato de que a) a biomassa formada é removida em uma quantidade de 0 a 100% do caldo de fermentação obtido na etapa b) da rei- vindicação 51, e b) um produto substancialmente seco e moldado é produzido, mediante um método selecionado do grupo de granulação, compactação, secagem por pulverização e extrusão, do caldo obtido na etapa a).

56. Processo de acordo com a reivindicação 55, caracterizado pelo fato de que um ácido selecionado do grupo de ácido sulfúrico, ácido clorídrico e ácido fosfórico é adicionado ao caldo de fermentação antes ou após a etapa a).

57. Processo de acordo com a reivindicação 55, caracterizado pelo fato de que a água é removida do caldo resultante antes da ou na etapa a).

58. Processo de acordo com a reivindicação 55, caracterizado pelo fato de que o produto moldado obtido em ou durante a etapa b) é borri- fado com um óleo.

59. Processo de acordo com a reivindicação 49, caracterizado pelo fato de que as seguintes etapas são realizadas a) filtração do caldo de fermentação, preferivelmente com um filtro de membrana, para resultar em um sedimento con- tendo biomassa e um filtrado, b) concentração do filtrado, preferivelmente de maneira a re- sultar em um teor de sólidos de 48 a 52% por peso, c) granulação do concentrado obtido na etapa b), preferivel- mente a uma temperatura de 50°C a 62°C, e d) revestimento dos grânulos obtidos em c) com um ou mais agentes de revestimento.

60. Aditivo para ração contendo L-Iisina baseado em caldo de fermentação, que exibe as seguintes características a) um teor de Iisina (como base) de pelo menos 10% por peso até um máximo de 73% por peso, b) um teor de água não excedendo 5% por peso, e c) um teor de biomassa correspondente a pelo menos 0,1% da biomassa presente no caldo de fermentação, sendo a biomassa, desativada quando apropriado, formada por bactérias como definido em uma ou mais das reivindica- ções de 1 a 17 ou 40 a 43 ou 45 a 48.

61. Aditivo para ração contendo L-triptofano baseado em caldo de fermentação, que exibe as seguintes características a) um teor de triptofano de pelo menos 5% por peso, b) um teor de água não excedendo 5% por peso, e c) um teor de biomassa correspondente a pelo menos 0,1% da biomassa presente no caldo de fermentação, sendo a biomassa, desativada quando apropriado, formada por bactérias como definido em uma ou mais das reivindica- ções de 1 a 17 ou 40 a 43 ou 45 a 48.