BRPI0717983B1 - mutantes isolados de bactérias corineformes, polinucleotídeo isolado, vetor, microrganismo recombinante, e processo para produzir l-lisina - Google Patents

Description

(54) Título: MUTANTES ISOLADOS DE BACTÉRIAS CORINEFORMES, POLINUCLEOTÍDEO ISOLADO, VETOR, MICRORGANISMO RECOMBINANTE, E PROCESSO PARA PRODUZIR L-LISINA (51) Int.CI.: C12P 13/08; A23K 10/12; A23K 20/142; C12N 9/88; C12P 13/22 (30) Prioridade Unionista: 26/10/2006 DE 10 2006 050 489.5 (73) Titular(es): EVONIK DEGUSSA GMBH (72) Inventor(es): BRIGITTE BATHE; CAROLINE KREUTZER; GEORG THIERBACH (85) Data do Início da Fase Nacional: 24/04/2009

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para MUTANTES

ISOLADOS DE BACTÉRIAS CORINEFORMES, POLINUCLEOTÍDEO ISOLADO, VETOR, MICRORGANISMO RECOMBINANTE, E PROCESSO PARA PRODUZIR L-LISINA.

A presente invenção refere-se a mutantes e alelos do gene prpD1 de bactérias corineformes codificadores de variantes da 2-metilcitrato desidratase (EC no. 4,2,1,79) e métodos para produzir aminoácidos, especialmente L-lisina, L-triptofano, L-valina, L-isoleucina, e L-homoserina usando bactérias que compreendem esses alelos.

Técnica anterior

Aminoácidos são usados na medicina humana, na indústria farmacêutica, na indústria de alimentos e, de maneira muito especial, na nutrição animal.

Sabe-se que os aminoácidos são produzidos pela fermentação de cepas de bactérias corineformes, especialmente a Corynebacterium glutamicum. Devido à sua grande importância, o trabalho no sentido de melhorar os métodos de produção é realizado continuamente. Melhorias dos métodos podem ser tecnologias de fermentação, tais como, por exemplo, agitar e fornecer oxigênio, ou se referir à composição dos meios nutrientes, tais como, por exemplo, a concentração de açúcar durante a fermentação, ou o desenvolvimento à forma do produto mediante, por exemplo, cromatografia de troca iônica ou as propriedades de produção intrínsecas do próprio organismo.

Os métodos utilizados para melhorar as propriedades de produção desses micro-organismos são métodos de mutagênese, seleção e escolha de mutantes. As cepas obtidas desta maneira são resistentes a antimetabólitos ou são auxotróficas para metabólitos de importância reguladora e produzem os aminoácidos. Um anti-metabólito conhecido é o análogo da lisina S-(2-aminoetil)-L-cisteína (AEC).

Métodos de tecnologia de DNA recombinante vêm sendo igualmente usados há alguns anos para a melhoria das cepas produtoras de Laminoácidos da Corynebacterium mediante amplificação de genes individuais de biossíntese de aminoácidos e investigação dos efeitos sobre a produção de aminoácidos.

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O cromossomo da Corynebacterium glutamicum foi completamente sequênciado alguns anos atrás (Kalinowski et al., Journal of Biotechnology 104, 5-25 (2003)). O cromossomo da Corynebacterium effíciens foi igualmente sequênciado (Nishio et al., Genome Res. 13 (7), 1572-1579 (2003)).

Os dados das sequências correspondentes podem ser obtidos nos bancos de dados públicos. Bancos de dados adequados são, por exemplo, o dos European Molecular Biology Laboratories (EMBL, Heldelberg, Alemanha, e Cambridge, Reino Unido), o banco de dados do National Center for Biotechnology Information (NCBI, Bethesda, MD, EUA), o do Swiss Institute of Bioinformatics (Swissprot, Genebra, Suíça), o Protein Information Resource Database (PIR, Washington, DC, EUA) e o DNA Data Bank of Japan (DDBJ, 1111 Yata, Mishima, 411-8540, Japão).

Descrições sumárias da genética, do metabolismo e da impor15 tância industrial da Corynebacterium podem ser encontradas nos artigos de Ikeda, de Pfefferle et al. e de Mueller e Huebner no livro Microbial Production of L-Amino Acids (Advances in Biochemical Engineering 79, (2003), Springer Verlag, Berlim, Alemanha, editor: T. Scheper), na edição especial A New Era in Corynebacterium glutamicum Biotechnology do The Journal of

Biotechnology (volume 104 (1-3), 2003, editores: A. Pühler and T. Tauch) e no Handbook of Corynebacterium glutamicum (editores: L. Eggeling e M. Bott, CRC Press, Taylor & Francis Group, Boca Raton, FL, EUA, 2005).

A sequência de nucleotídeos do gene prpD1 codificador da 2metilcitrato desidratase da Corynebacterium glutamicum está em geral dis25 ponível inter alia nos bancos de dados do National Center for Biotechnology Information (NCBI) da National Library of Medicine (Bethesda, MD, EUA) sob o número de acesso AF434798. Ele pode também ser encontrado no pedido de patente EP 1 108 790 como a sequência no. 770.

Claes et al. (Journal of Bacteriology 184(10), 2728-2739 (2002)) relatam investigações genéticas, microbiológicas e bioquímicas dos genes prpD1, prpB1 e prpC1 da Corynebacterium glutamicum ATCC 13032.

Para maior clareza, a sequência de nucleotídeos do gene prpD1 codificador da 2-metilcitrato desidratase da Corynebacteríum glutamicum (gene wild type), de acordo com os dados do banco de dados do NCBI, está representada na SEQ ID NO:1 e a sequência de aminoácidos da 2metilcitrato desidratase codificada resultante dele está representada na SEQ ID NO:2 e 4. As sequências de nucleotídeos localizadas a montante e a jusante estão adicionalmente indicadas na SEQ ID NO:3.

Objetivo da invenção

O objetivo dos inventores foi proporcionar novos métodos para a melhoria da produção de aminoácidos, especialmente L-lisina, L-triptofano, L-valina, L-isoleucina e L-homoserina.

Descrição da invenção

A invenção refere-se a mutantes de bactérias corineformes gerados e isolados que preferencialmente secretam aminoácidos e que compreendem um gene ou alelo que codifica um polipeptídeo com atividade típica da 2-metilcitrato desidratase, caracterizados pelo fato de o polipeptídeo incluir uma sequência de aminoácidos na qual um dos aminoácidos proteinogênicos com exceção da L-prolina está presente na posição 272 ou em uma posição correspondente ou comparável da sequência de aminoácidos. A substituição da L-prolina pela L-leucina é preferida.

Dentre as bactérias corineformes, o gênero Corynebacteríum é preferido. No gênero Corynebacteríum, as seguintes espécies são preferidas:

Corynebacteríum efficiens (cepa de referência DSM44549),

Corynebacteríum glutamicum (cepa de referência ATCC13032),

Corynebacteríum thermoaminogens (por exemplo, a cepa FERM

BP-1539), e

Corynebacteríum ammoniagenes (cepa de referência ATCC6871), com preferência muito particular para a espécie Corynebacteríum glutamicum.

Alguns representantes da espécie Corynebacteríum glutamicum são conhecidos na técnica mais recente também sob outras designações de espécie. Estas incluem, por exemplo:

Corynebacterium acetoacidophilum ATCC 127270,

Corynebacterium HHurn DSM20137,

Corynebacterium melassecola ATCC17965,

Brevibacterium flavum ATCC 14067,

Brevibacterium lactofermentum ATCC127269,

Brevibacterium divaricatum ATCC 14020 e

Microbacterium ammoniaphilum ATCC 15354.

O termo Micrococcus glutamicus para a Corynebacterium glutamicum também vem sendo usado.

As cepas de bactérias corineformes empregadas nos métodos da invenção preferivelmente já possuem a capacidade de enriquecer o aminoácido desejado na célula e/ou secretá-lo no meio nutriente ao redor dela e acumulá-lo. O termo produzir também é usado doravante para essa atividade. Em particular, as cepas de bactérias corineformes empregadas possuem a capacidade de liberar ou acumular > (no mínimo) 0,25 g/l, > 0,5 g/l, >1,0 g/l, >1,5 g/l, > 2,0 g/l, > 4,0 g/l ou > 10,0 g/l ao aminoácido desejado em < (no máximo) 120 horas, < 96 horas, < 48 horas, < 36 horas, < 24 horas ou < 12 horas na célula ou no meio nutriente. Neste contexto, as cepas podem ter sido produzidas por mutagênese e seleção, por técnicas de DNA recombinante ou por uma combinação dos dois métodos.

Representantes conhecidas das cepas de bactérias corineformes produtoras ou secretoras de L-lisina são, por exemplo:

Corynebacterium glutamicum DM58-1/pDM6 (= DSM4697) descrita em EP 0 358 940.

Corynebacterium glutamicum MH20-22B (= DSM16835) descrita em Menkel et al. (Applied and Environmental Microbiology 55(3), 684-688 (1989)),

Corynebacterium glutamicum AHP-3 (= Ferm BP-7382) descrita em EP 1 108 790,

Corynebacterium glutamicum NRRL B-11474 descrita em US

4.275.157 e

Corynebacterium thermoaminogenes AJ12521 (- FERM BP3304) descrita em US 5.250.423.

Representantes conhecidas das cepas de bactérias corineformes produtoras ou secretoras de L-triptofano são, por exemplo;

Corynebacterium glutamicum K76 (=Ferm BP-1847) descrita em

US 5.563.052,

Corynebacterium glutamicum BPS13 (=Ferm BP-1777) descrita em US 5.605.818 e

Corynebacterium glutamicum Ferm BP-3055 descrita em US

5.235.940.

Representantes conhecidas das cepas de bactérias corineformes produtoras ou secretoras de L-valina são, por exemplo:

Brevibacterium lactofermentum FERM BP-1763 descrita em US

5.188.948,

Brevibacterium lactofermentum FERM BP-3007 descrita em US

5.521.074,

Corynebacterium glutamicum FERM BP-3006 descrita em US

5.521.074 e

Corynebacterium glutamicum FERM BP-1764 descrita em US

5.188.948.

Representantes conhecidas das cepas de bactérias corineformes produtoras ou secretoras de L-isoleucina são, por exemplo;

Brevibacterium flavum FERM BP-760 descrita em US 4.656.135, Brevibacterium flavum FERM BP-2215 descrita em US

5.294.547 e

Corynebacterium glutamicum FERM BP-758 descrita em US

4.656.135.

Representantes conhecidas das cepas de bactérias corineformes produtoras ou secretoras de L-homoserina são, por exemplo:

Micrococcus glutamicus ATCC 14296 descrita em US 3.189.526 e

Micrococcus glutamicus ATCC 14297 descrita em US 3.189.526. Dados sobre a classificação taxonômica das cepas desse grupo de bactérias podem ser encontrados inter alia em Seiler (Journal of General Microbiology 129, 1433-1477 (1983)), Kinoshita (1985, Glutamic Acid Bactéria, pp 115-142. In: Demain and Solomon (ed), Biology of Industrial Microorganisms. The Benjamin/Cummins Publishing Co., Londres, Reino Unido), Kãmpfer and Kroppenstedt (Canadian Journal of Microbiology 42, 989-1005 (1996)), Liebl et al. (International Journal of Systematic Bacteriology 41,255260 (1991)) e em US-A-5.250.434.

Cepas com a designação ATCC podem ser adquiridas da American Type Culture Collection (Manassas, VA, EUA). Cepas com a designação DSM podem ser adquiridas da Deutsche Sammlung von Mikroorganismen and Zellkulturen (DSMZ, Brunswick, Alemanha). Cepas com a designação NRRL podem ser adquiridas da Agricultural Research Service Patent Culture Collection (ARS, Peoria, Illinois, EUA). Cepas com a designação FERM podem ser adquiridas do National Institute of Advanced Industrial Science and Technology (AIST Tsukuba Central 6, 1-1-1 Higashi, Tsukuba Ibaraki, Japão).

Ao polipeptídeo codificado pelo gene prpD1 com atividade típica da 2-metilcitrato desidratase (PrpD1) é alocado o número EC 4,2,1,79 de acordo com a nomenclatura da IUPAC (International Union of Pure and Applied Chemistry).

Quimicamente, um gene é um polinucleotídeo. Outro termo para isso é ácido nucléico.

Aminoácidos proteinogênicos são os aminoácidos que ocorrem em proteínas naturais, ou seja, em proteínas de micro-organismos, plantas, animais e humanos. No contexto da presente invenção, aminoácidos proteinogênicos são o grupo de aminoácidos consistindo em L-ácido aspártico, Lasparagina, L-treonina, L-serina, L-ácido glutâmico, L-glutamina, glicina, Lalanina, L-cisteína, L-valina, L-metionina, L-isoleucina, L-leucina, L-tirosina, L-fenilalanina, L-histidina, L-lisina, L-triptofano, L-prolina e L-arginina e, quando apropriado, L-selenocisteína. Os L-aminoácidos incluem igualmente a L-homoserina.

Os mutantes de acordo com a invenção preferivelmente secretam os aminoácidos proteinogênicos mencionados, especialmente L-lisina, L-triptofano, L-valina, L-isoleucina ou L-homoserina. O termo aminoácido também inclui sais dos mesmos, tais como, por exemplo, lisina monohidrocloreto ou lisina sulfato no caso do aminoácido L-lisina.

A invenção refere-se ainda a mutantes de bactérias corineformes que compreendem um alelo prpD1 que codifica um polipeptídeo com a atividade enzimática típica da 2-metilcitrato desidratase que inclui a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:2, estando um dos aminoácidos proteinogênicos exceto a L-prolina presente na posição 272. A troca da L-prolina por L-leucina é preferida.

A invenção refere-se adicionalmente a mutantes de bactérias corineformes que compreendem um alelo prpD1 que codifica um polipeptídeo com a atividade enzimática típica da 2-metilcitrato desidratase, que compreende um aminoácido proteinogênico exceto a L-prolina, preferivelmente a L-leucina, na posição correspondente à posição 272 da sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:2, incluindo o gene uma sequência de nucleotídeos que é idêntica à sequência de nucleotídeos de um polinucleotídeo obtenível mediante uma reação em cadeia da polimerase (PCR) usando um par de iniciadores cujas sequências de nucleotídeos em cada caso incluem pelo menos 15 nucleotídeos consecutivos selecionados dentre a sequência de nucleotídeos entre as posições 1 e 750 da SEQ ID NO:3 ou SEQ ID NO:7 e da sequência de nucleotídeos complementar entre as posições 2245 e 3000 da SEQ ID NO:3 ou SEQ ID NO:7. Um exemplo de tal par de iniciadores apropriados está representado na da SEQ ID NO:9 e na SEQ ID NO: 10. O material DE PARTIDA preferido (modelo de DNA) é o DNA cromossômico de bactérias corineformes que foram tratadas em particular com um mutagênico. O DNA cromossômico é particularmente preferível do gênero Corynebacterium e de maneira muito particularmente preferível é aquele da espécie Corynebacterium glutamicum.

A invenção refere-se ainda a mutantes de bactérias corineformes que compreendem um alelo prpD1 que codifica um polipeptídeo com atividade enzimática típica da 2-metilcitrato desidratase, que inclui uma sequência de aminoácidos com um comprimento correspondente a 498 Laminoácidos com um dos aminoácidos proteinogênicos exceto a L-prolina, preferivelmente a L-leucina, estando presente na posição 272.

A invenção refere-se ainda a mutantes de bactérias corinefor5 mes que compreendem um alelo prpD1 codificador de um polipeptídeo com atividade enzimática típica da 2-metilcitrato desidratase, que compreende na posição 252 a 291 da sequência de aminoácidos a sequência de aminoácidos correspondente à posição 252 a 291 da SEQ ID NO:6 ou 8. A sequência de aminoácidos do polipeptídeo codificado preferivelmente compreende uma sequência de aminoácidos correspondente à posição 202 a 341 da SEQ ID NO: 6 ou 8 ou à posição 152 a 391 da SEQ ID NO: 6 ou 8 ou à posição 102 a 441 da SEQ ID NO:6 ou 8 ou à posição 52 a 491 da SEQ ID NO.6 ou 8 ou à posição 2 a 495 da SEQ ID NO: 6 ou 8 ou à posição 2 a 496 da SEQ ID NO: 6 ou 8 ou à posição 2 a 497 da SEQ ID NO: 6 ou 8. É muito particular15 mente preferível que o comprimento do polipeptídeo codificado inclua 498 aminoácidos.

A invenção refere-se ainda a mutantes de bactérias corineformes que compreendem um alelo prpD1 que codifica um polipeptídeo com atividade enzimática típica da 2-metilcitrato desidratase, que compreende na posição 272 ou na posição correspondente da sequência de aminoácidos um aminoácido proteinogênico com exceção da L-prolina, com preferência para a troca pela L-leucina, e cuja sequência de aminoácidos é adicionalmente pelo menos 90%, preferivelmente pelo menos 92% ou pelo menos 96% e de maneira muito particularmente preferível pelo menos 97% ou pelo menos 98% ou pelo menos 99% idêntica à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:6 ou SEQ ID NO:8.

A invenção refere-se ainda a mutantes de bactérias corineformes que compreendem um alelo prpD1 que codifica um polipeptídeo com a atividade enzimática típica da 2-metilcitrato desidratase, que compreende na posição 272 ou na posição correspondente da sequência de aminoácidos um aminoácido proteinogênico com exceção da L-prolina, com preferência para a troca pela L-leucina, e cuja sequência de nucleotídeos seja adicionalmente pelo menos 90%, preferivelmente pelo menos 92% ou pelo menos 94% e de maneira muito particularmente preferível pelo menos 97% ou pelo menos 98% ou pelo menos 99% idêntica à sequência de nucleotídeos da SEQ ID NO:5.

Sabe-se que trocas de aminoácidos conservativas alteram a atividade enzimática apenas de maneira não-substancial. Em conformidade com isso, o alelo prpD1 presente nos mutantes de acordo com a invenção e que codifica um polipeptídeo com atividade enzimática típica da 2metilcitrato desidratase, pode, além da sequência de aminoácidos mostrada na SEQ ID NO:6 ou na SEQ ID NO:8, compreender uma (1) ou mais troca(s) de aminoácidos conservativa(s). O polipeptídeo preferivelmente compreende não mais do que duas (2), não mais do que três (3), não mais do que quatro (4) ou não mais do que cinco (5) trocas de aminoácidos conservativas. A atividade enzimática permanece substancialmente não afetada por tais tro15 cas de aminoácidos conservativas.

No caso dos aminoácidos aromáticos, as trocas mútuas de fenilalanina, triptofano e tirosina são designadas trocas conservativas. No caso dos aminoácidos hidrofóbicos, as trocas mútuas de leucina, isoleucina e valina são designadas trocas conservativas. No caso dos aminoácidos polares, as trocas mútuas de glutamina e asparagina são designadas trocas conservativas. No caso dos aminoácidos básicos, as trocas mútuas de arginina, lisina e histidina são designadas trocas conservativas. No caso dos aminoácidos acídicos, as trocas mútuas de ácido aspártico e ácido glutâmico são designadas trocas conservativas. No caso dos aminoácidos compreendendo grupos hidroxila, as trocas mútuas de serina e treonina são designadas trocas conservativas.

Enquanto a presente invenção era desenvolvida, descobriu-se mediante a comparação da sequência de aminoácidos com o programa Clustal ((Thompson et al., Nucleic Acids Research 22, 4637-4680 (1994)) que a sequência de aminoácidos da 2-metilcritrato desidratase de diferentes bactérias, tais como, por exemplo, Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium bovis, Corynebacterium efficiens e Corynebacterium glutamicum, com10 preende uma sequência-motivo consistindo na sequência Arg-Glu-Leu-AspPhe-His-Asp-Thr-Phe-Leu-Ala-Ala-Asp/Glu-Tyr-Ser-His-Pro, uma sequênciamotivo consistindo na sequência Gly-lle-Cys-Leu-His-Glu-His-Lys-lle-AspHis-Val-Ala-His-Leu-Gly-Pro e também uma sequência-motivo consistindo na sequência Pro-Ala-Pro-lle-Trp-Glu-Gly-Glu-Asp-Gly-Val-lle-Ala-Trp-Leu-Leu. A designação Asp/Glu significa que Asp ou Glu podem estar presentes na posição correspondente.

Em conformidade com isso, os mutantes preferidos de bactérias corineformes são aqueles compreendendo um alelo prpD1 codificador de um polipeptídeo com atividade enzimática típica da 2-metilcitrato desidratase, que incluam pelo menos uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo de Arg-Glu-Leu-Asp-Phe-His-Asp-Thr-Phe-Leu-Ala-Ala-Asp/Glu-TyrSer-His-Pro, Gly-lle-Cys-Leu-His-Glu-His-Lys-lle-Asp-His-Val-Ala-His-LeuGly-Pro and Pro-Ala-Pro-lle-T rp-Glu-Gly-Glu-Asp-Gly-Val-lle-Ala-T rp-LeuLeu, e compreendendo na posição 272 ou na posição correspondente ou comparável da sequência de aminoácidos um dos aminoácidos proteinogênicos com exceção da L-prolina, preferivelmente a L-leucina.

A sequência-motivo de aminoácidos Arg-Glu-Leu-Asp-Phe-HisAsp-Thr-Phe-Leu-Ala-Ala-Asp/Glu-Tyr-Ser-His-Pro está presente, por exemplo, na SEQ IDO NO:2 e 4 ou 6 e 8 da posição 102 à 118. A sequênciamotivo de aminoácidos Gly-lle-Cys-Leu-His-Glu-His-Lys-lle-Asp-His-Val-AlaHis-Leu-Gly-Pro está presente, por exemplo, na SEQ IDO NO:2 e 4 ou 6 e 8 da posição 156 à 172. A sequência-motivo de aminoácidos Pro-Ala-Pro-lleTrp-Glu-Gly-Glu-Asp-Gly-Val-lle-Ala-Trp-Leu-Leu está presente, por exemplo, na SEQ ID NO:2 e 4 ou 6 e 8 da posição 240 à 255.

A invenção refere-se, enfim, a mutantes de bactérias corineformes que compreendem um alelo prpD1 que codifica um polipeptídeo com atividade enzimática típica da 2-metilcitrato desidratase, que inclui a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:6 ou da SEQ ID NO:8.

A invenção refere-se por fim também a mutantes de bactérias corineformes que compreendem um alelo prpD1 correspondente à SEQ ID NO:5 ou à SEQ ID NO:7.

Sabe-se que as enzimas do próprio hospedeiro, chamadas aminopeptidases, deletam a metionina terminal durante o processo de síntese.

A expressão uma posição correspondente à posição 272 da sequência de aminoácidos ou uma posição comparável à posição 272 da se5 quência de aminoácidos significa o fato de que mediante a inserção ou deleção de um códon codificador de um aminoácido da região N-terminal (em relação à posição 272 da SEQ ID NO:6 ou 8) do polipeptídeo codificado, a posição mencionada e o comprimento mencionado são formalmente incrementados em uma unidade no caso de uma inserção ou reduzidos em uma unidade no caso de uma deleção. Por exemplo, a deleção do códon GAG codificador do aminoácido L-ácido glutâmico na posição 19 da SEQ ID NO:6 ou 8 desloca a L-leucina da posição 272 para a posição 271. O comprimento mencionado seria então: 497 aminoácidos. Da mesma maneira, a inserção ou deleção de um códon codificador de um aminoácido da região C-terminal (em relação à posição 272) do polipeptídeo codificado incrementa formalmente o comprimento mencionado em uma unidade no caso de uma inserção ou o reduz em uma unidade no caso de uma deleção. Tais posições comparáveis podem ser facilmente identificadas mediante a comparação das sequências de aminoácidos sob a forma de um alinhamento com a ajuda, por exemplo, do programa Clustal ou do programa MAFFT.

A atividade enzimática permanece substancialmente nãoafetada por tais inserções e deleções. Substancialmente não-afetada significa que a atividade enzimática de tais variantes difere não mais do que 10%, não mais do que 7,5%, não mais do que 5%, não mais do que 2,5% ou não mais do que 1% da atividade do polipeptídeo com a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:6 ou 8.

Um método para determinar a atividade enzimática da 2metilcitrato desidratase é descrito em Horswill e Escalante-Semerena (Biochemistry 40(15), 4703-4713 (2001)).

A invenção correspondentemente também refere-se a alelos prpD1 codificadores das variantes polipeptídicas da SEQ ID NO:6 ou 8 que compreendem uma ou mais inserções ou deleções. O polipeptídeo preferi12 velmente compreende não mais do que 5, não mais do que 4, não mais do que 3, não mais do que 2 inserções ou deleções de aminoácidos.

As sequências-motivo Arg-Glu-Leu-Asp-Phe-His-Asp-Thr-PheLeu-Ala-Ala-Asp/Glu-Tyr-Ser-His-Pro, Gly-lle-Cys-Leu-His-Glu-His-Lys-lle5 Asp-His-Val-Ala-His-Leu-Gly-Pro e Pro-Ala-Pro-lle-Trp-Glu-Gly-Glu-Asp-GlyVal-lle-Ala-Trp-Leu-Leu são preferivelmente não-rompidas por tais inserções/deleções.

Os mutantes de acordo com a invenção podem ser produzidos usando-se métodos de mutagênese in vivo convencionais com populações celulares de bactérias corineformes usando-se substâncias mutagênicas tais como, por exemplo, N-metil-N’nitro-N-nitroso de guanidina (MNNG), etil metanossulfonato (EMS), 5-bromouracil ou luz ultravioleta. Métodos de mutagênese são descritos, por exemplo, no Manual of Methods for General Bacteriology (Gerhard et al. (Eds.), American Society for Microbiology, Washing15 ton, DC, EUA, 1981) ou em Tosaka et al. (Agricultural and Biological Chemistry 42(4), 745-752 (1978)) ou em Konicek et al. (Folia Microbiologica 33, 337-343 (1988)). Mutagêneses típicas com MNNG incluem concentrações de 50 a 500 mg/l ou mesmo concentrações maiores de até 1 g/l, um tempo de incubação de 1 a 30 minutos a um pH de 5,5 a 7,5. Sob essas condições, o número de células viáveis é reduzido em uma proporção de aproximadamente 50% a 90% ou aproximadamente 50% a 99% ou aproximadamente 50% a 99,9% ou mais.

Os mutantes ou células são removidos da população de células submetidas a mutagênese e são propagadas. Em uma etapa posterior, sua capacidade de secretar aminoácidos, preferivelmente L-lisina, L-triptofano, Lvalina, L-isoleucina ou L-homoserina em uma cultura descontínua usando-se um meio nutriente adequado é preferivelmente investigada. Meios nutrientes e condições de teste adequadas são descritos, inter alia, em US 6.221.636, em US 5.840.551, em US 5.770.409, em US 5.605.818, em US 5.275.940 e em US 4.224.409. No caso de utilização de sistemas robóticos adequados como descrito, por exemplo, em Zimmermann et al. (VDI Berichte No. 1841, VDI-Verlag, Düsseldorf, Alemanha 2004, 439-443) or Zimmermann (Chemie

Ingenenieur Technik 77 (4), 426-428 (2005)), numerosos mutantes podem ser investigados em pouco tempo. No geral, um máximo de 3000, um máximo de 10.000, um máximo de 30.000 ou também um máximo de 60.000 mutantes e, quando apropriado, ainda mais, são investigados. Mutantes que, em comparação com a cepa-mãe ou com a cepa de partida não submetida a mutagênese, secretam quantidades aumentadas de aminoácidos no meio de nutrição ou no interior da célula são identificados dessa maneira. Estes incluem, por exemplo, os mutantes cuja secreção de aminoácidos é aumentada em pelo menos 0,5%.

O DNA é então preparado ou isolado dos mutantes e o polinucleotídeo correspondente é sintetizado com a ajuda da reação da cadeia de polimerase usando-se pares de iniciadores que permitam amplificação do gene prpD1 ou do alelo prpD1 de acordo com a invenção ou da mutação de acordo com a invenção na posição 272. O DNA é preferivelmente isolado dos mutantes que secretam aminoácidos em uma quantidade aumentada.

É possível selecionar para este fim quaisquer pares de iniciadores da sequência de nucleotídeos localizada a montante e a jusante da mutação de acordo com a invenção e com a sequência de nucleotídeos que a complementa. Um dos iniciadores de um par de iniciadores nesse caso preferivelmente inclui pelo menos 15, pelo menos 18, pelo menos 20, pelo menos 21, pelo menos 24 nucleotídeos consecutivos selecionados da sequência de nucleotídeos entre as posições 1 e 1563 da SEQ ID NO:3 ou SEQ ID NO:7. O segundo iniciador pertencente a um par de iniciadores inclui pelo menos 15, pelo menos 18, pelo menos 20, pelo menos 21 ou pelo menos 24 nucleotídeos consecutivos selecionados da sequência de nucleotídeos complementar entre as posições 3000 e 1567 da SEQ ID NO:3 ou SEQ ID NO:7. Caso a amplificação da região de codificação seja desejada, o par de iniciadores é preferencialmente selecionado da sequência de nucleotídeos entre as posições 1 e 750 da SEQ ID NO:3 ou SEQ ID NO:7 e da sequência de nucleotídeos complementar entre as posições 3000 e 2245 da SEQ ID NO:3 ou SEQ ID NO:7. Um par de iniciadores adequado é, por exemplo, o par de iniciadores prpD1_XL_A1 e prpD1_XL_E1 representados pela SEQ ID NO:9 e SEQ ID NO: 10. Um produto de PCR preparado usando-se esse par de iniciadores está representado na SEQ ID NO: 13.

Caso se deseje amplificação de parte da região codificadora, como representado por exemplo na SEQ ID NO: 17 e 19, o par de iniciadores é preferencialmente selecionado da sequência de nucleotídeos entre as posições 751 e 1563 da SEQ ID NO:3 ou da SEQ ID NO:7 e da sequência de nucleotídeos complementar entre as posições 2244 e 1567 da SEQ ID NO:3 ou da SEQ ID NO:7.

O iniciador pode, além disso, ser equipado com sítios de reco10 nhecimento para enzimas de restrição, com um grupo biotina ou outros acessórios, como descrito na técnica anterior. O comprimento total do iniciador geralmente não ultrapassa 30, 40, 50 ou 60 nucleotídeos.

Os polinucleotídeos são preparados pela amplificação de sequências selecionadas, tais como o alelo prpD1 de acordo com a invenção, a partir, por exemplo, do DNA cromossômico proporcionado (modelo de DNA) por amplificação por PCR geralmente empregando-se DNA polimerases termoestáveis. exemplos de tais DNA polimerases são a Taq polimerase da Thermus aquaticus, que é comercializada inter alia pela Qiagen (Hilden, Alemanha), a polimerase Vent da Thermococcus litoralis, comercializada inter alia pelo New England Biolabs (Frankfurt, Alemanha) ou a polimerase Pfu da Pyrococcus furiosus, que é comercializada inter alia pela Stratagene (La Jolla, EUA). Polimerases com função à prova de leitura são preferidas. Função à prova de leitura significa que essas polimerases são capazes de reconhecer nucleotídeos incorretamente incorporados e de eliminar o erro mediante nova polimerização. (Lottspeich e Zorbas, Bioanalytik, Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg, Alemanha (1998)). exemplos de polimerases que têm função à prova de leitura são a polimerase Vent e a polimerase Pfu.

As condições da mistura da reação são configuradas de acordo com as informações do fabricante. As polimerases são geralmente fornecidas pelo fabricante junto com o tampão habitual, que normalmente tem concentrações de Tris/HC1 10-100 mM e KC1 6-55 mM a pH 7,5-9,3. Cloreto de magnésio é adicionado à concentração de 0,5-10 mM a não ser que esteja presente no tampão fornecido pelo fabricante. Além disso, desoxinucleotídeo trifosfatos são adicionados a uma concentração de 0,1-16,6 mM à mistura da reação. Os iniciadores são introduzidos na mistura de reação a uma concen5 tração final de 0,1-3 μΜ e o modelo de DNA na melhor das hipóteses com 10² a 10⁵ cópias. Também é possível empregar 10⁶ a 10⁷ cópias. A polimerase apropriada é adicionada à mistura da reação em uma quantidade de 25 unidades. Uma mistura de reação típica tem um volume de 20-100 μΙ.

Outras adições que podem ser incluídas na reação são albumina sérica bovina, Tween 20, gelatina, glicerol, formamida ou DMSO (Dieffenbach and Dveksler, PCR Primer - A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, EUA 1995).

Um teste de PCR típico consiste em etapas de temperatura consecutivamente repetidas em três etapas. No começo, a reação é iniciada pelo aumento da temperatura para 92°C-98°C por 4 a 10 minutos para desnaturação do DNA introduzido. Isso é seguido por repetições primeiro de uma etapa de desnaturação do DNA introduzido a aproximadamente 92-98° por 10-60 segundos, então uma etapa de ligação dos iniciadores ao DNA introduzido a uma temperatura particular, que depende dos iniciadores (temperatura de anelamento), a qual, de acordo com a experiência, é entre 50°C a 60°C e pode ser calculada individualmente para cada par de iniciadores, por 10-60 segundos. Informações detalhadas referentes a isto podem ser encontradas por aquele versado na técnica em Rychlik et al. (Nucleic Acids Research 18 (21): 6409-6412). Isso é subsequentemente seguido por uma etapa de síntese para estender os iniciadores introduzidos (extensão) no ponto ótimo de atividade indicado em cada caso para a polimerase, normalmente na faixa de 73°C a 67°C, preferivelmente 72°C a 68°C, dependendo da polimerase. A duração dessa etapa de extensão depende da eficiência da polimerase e do comprimento do produto de PCR a ser amplificado.

Em um teste de PCR típico, este passo leva 0,5-8 minutos, preferivelmente 2-4 minutos. Estas três etapas são repetidas 30 a 35 vezes, quando apropriado até 50 vezes. Uma etapa final de extensão de 4-10 minutos finaliza a reação. Os polinucleotídeos preparados desta maneira também são designados amplicons; o termo fragmento de ácido nucleico está igualmente em uso.

Um produto de PCR preparado usando-se o par de iniciadores 5 prpD1_XL_A1/prpD1_XL_E1 (ver SEQ ID NO:9 e SEQ ID NO;10) está representado na SEQ ID NO: 13.

Maiores instruções e informações sobre a PCR podem ser encontradas por aquele versado na técnica, por exemplo, no manual PCRStrategies (Innis, Felfand e Sninsky, Academic Press , Inc., 1995), no ma10 nual de Diefenbach e Dveksler PCR Primer - a laboratory manual (Cold Spring Harbor Laboratory Press, 1995) no manual de Gait Oligonucleotide synthesis: A Practical Approach (IRL Press, Oxford, Reino Unido, 1984) e em Newton e Graham PCR (Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg, Alemanha, 1994).

A sequência de nucleotídeos é subsequentemente determinada mediante, por exemplo, o método da terminação da cadeia, de Sanger, et al. (Proceedings of the National Academies of Sciences, U.S.A., 74, 5463-5467 (1977)), com as modificações indicadas por Zimmerman et al. (Nucleic Acids Research 18, 1067 (1990)) e o polipeptídeo codificado por essa sequência de nucleotídeos é analisado em particular com referência à sequência de aminoácidos. Para este fim, a sequência de nucleotídeos é inserida em um programa para a tradução da sequência de DNA em uma sequência de aminoácidos. Programas adequados são, por exemplo, o programa Patentin, que pode ser obtido em escritórios de patentes como, por exemplo, o US

Patent Office (USPTO), ou o Translate Tool, que pode ser obtido no servidor da ExPASy Proteonics na Internet (Gasteiger et al., Nucleic Acids Research 31, 3784-3788 (2003)).

Mutantes cujo alelo prpD1 codifica polipeptídeos com atividade enzimática típica da 2-metilcitrato desidratase, que compreendem na posi30 ção 272 da sequência de aminoácidos, ou em posição correspondente ou comparável, um dos aminoácidos proteinogênicos com exceção da L-prolina, são identificados desta maneira. A troca pela L-leucina é preferida.

O cromossomo completo do mutante é determinado quando apropriado. É possível, no que diz respeito a isso, empregar o método descrito por Marguiles et al., (Nature, 437(7057): 376-2720 (2005)) e Velicer et al. (Proceedings of the National Academy of Sciences, EUA, 103(21), 81078112 (2006)), que é conhecido daqueles versados na técnica pelo termo pirosequênciamento e permite que genomas completos sejam sequênciados rapidamente.

A invenção, em conformidade com isso, refere-se a um mutante de uma bactéria corineforme caracterizado pelo fato de ser obtenível pelas seguintes etapas:

a) tratamento de uma bactéria corineforme que tem a capacidade de secretar aminoácidos com um agente mutagênico,

b) isolamento e propagação do mutante gerado em a),

c) preferencialmente, determinação da capacidade do mutante de secretar em um meio, ou liberar no interior da célula, pelo menos 0,5% mais aminoácidos do que a bactéria corineforme empregada em a),

d) preparação de ácido nucleico do mutante obtido em b),

e) preparação de uma molécula de ácido nucleico (ou amplicon ou fragmento de ácido nucleico) usando a reação da cadeia da polimerase, do ácido nucleico de d), e de um par de iniciadores consistindo em um primeiro iniciador incluindo pelo menos 15 nucleotídeos consecutivos selecionados da sequência de nucleotídeos entre as posições 1 e 1563, preferivelmente de 1 a 750 da SEQ ID NO:3 ou da SEQ ID NO:7 e um segundo iniciador incluindo pelo menos 15 nucleotídeos consecutivos selecionados da sequência de nucleotídeos complementar entre as posições 3000 e 1567, preferivelmente 3000 e 2245 da SEQ ID NO:3 ou 7,

f) determinação da sequência de nucleotídeos da molécula de ácido nucleico obtida em e) e determinação da sequência de aminoácidos codificada,

g) quando apropriado, comparação da sequência de aminoácidos determinada em f) com a SEQ ID NO:6 ou 8, e

h) identificação de um mutante que compreenda um polinucleotídeo codificador de um polipeptídeo que compreenda na posição 272 ou em uma posição comparável um dos aminoácidos proteinogênicos com exceção da L-prolina, preferivelmente L-leucina.

Os mutantes gerados desta maneira normalmente compreendem uma (1) cópia do alelo prpD1 descrito.

A SEQ ID NO:5 representa, por exemplo, a região codificadora do alelo prpD1 de um mutante de acordo com a invenção. A região codificadora do gene de tipo selvagem é representada como SEQ ID NO:1. A SEQ ID NO:1 compreende na posição 814 a nucleobase citosina, na posição 815 a nucleobase citosina e na posição 816 a nucleobase citosina. A SEQ ID

NO:1, assim, compreende da posição 814 à 816 o códon CCC codificador do aminoácido L-prolina. A SEQ ID NO:5 compreende na posição 815 a nucleobase timina. Essa transição citosina-timina resulta na posição 814 a 816 no códon CTC codificador do aminoácido L-leucina.

Além disso, as sequências de nucleotídeos representadas na

SEQ ID NO:5 e 7 podem compreender trocas de base adicionais resultantes do tratamento com mutagênese mas não são expressadas por uma sequência de aminoácidos alterada. As mutações desse tipo são também designadas, por aqueles versados na técnica, como mutações silenciosas ou neutras. Essas mutações silenciosas podem igualmente já estar presentes na bactéria corineforme empregada no tratamento de mutagênese.

As bactérias corineformes usadas na mutagênese preferivelmente já possuem a capacidade de secretar o aminoácido desejado no meio nutriente ou caldo de fermentação que as envolve e/ou liberá-lo no interior das células.

Bactérias corineformes produtoras de L-lisina normalmente têm uma aspartato quinase insensível à inibição por feedback ou dessensibilizada. Aspartato quinases insensíveis à inibição por feedback ou dessensibili19 zadas significam aspartato quinases (LysC) que em comparação com a forma selvagem exibem menor sensibilidade à inibição por misturas de lisina e treonina ou misturas de aminoetilcisteína (AEC) e treonina ou apenas lisina ou apenas AEC. Os genes ou alelos codificadores dessas aspartato quina5 ses dessensibilizadas são também designados alelos lysc^FBR. Numerosos alelos lysc^FBR alelos estão descritos na técnica mais recente e codificam variantes da aspartato quinase que possuem trocas de aminoácidos em comparação com a proteína de tipo selvagem. A região codificadora do gene lysC de tipo selvagem. A região codificadora do gene lysC de tipo selvagem da Corynebacterium glutamicum correspondente ao número de acesso AX756575 do banco de dados da NCBI está representada na SEQ ID NO:11 e o polipeptídeo codificado por esse gene está representado na SEQ ID NO;12.

As bactérias corineformes produtoras de L-lisina empregadas nos métodos da invenção preferivelmente possuem um alelo lysC codificador de uma variante da aspartato quinase que possui a sequência de aminoácidos da SEQ ID ΝΟ.Ί2, esta última incluindo uma ou mais das trocas de aminoácidos selecionadas do grupo:

LysC A279T (L-alanina na posição 279 da proteína de aspartato quinase codificada de acordo com a SEQ ID NO: 12 trocada por

L-treonina; vide US 5.688.671 e números de acesso E06825, E06826, E08178 e I74588 a I74597),

LysC A279V (L-alanina na posição 279 da proteína de aspartato quinase codificada de acordo com a SEQ ID NO: 12 trocada por

L-valina; vide JP 6-261766 e número de acesso E08179.

LysC L297Q (L-leucina na posição 297 da proteína de aspartato quinase codificada de acordo com a SEQ ID ΝΟ.Ί2 trocada por L-glutamina; ver DE 102006026328,

LysC S301F (L-serina na posição 301 da proteína de aspartato quinase codificada de acordo com a SEQ ID NO: 12 trocada por

L-fenilalanina; ver US 6.844.176 e número de acesso E08180), LysC S301Y (L-serina na posição 301 da proteína de aspartato quinase codificada de acordo com a SEQ ID NO: 12 trocada por L-tirosina, ver Kalinowski et al. (Molecular and General Genetics 224, 317-324 (1990)) e número de acesso X57226),

LysC T308I (L-treonina na posição 308 da proteína de aspartato quinase codificada de acordo com a SEQ ID NO: 12 trocada por

L-isoleucina; ver JP 6-261766 e número de acesso E08181)

LysC T311I (L-treonina na posição 311 da proteína de aspartato quinase codificada de acordo com a SEQ ID NO: 12 trocada por L-isoleucina; ver WO 00/632728 e US 6.893.848),

LysC S317A (L-serina na posição 317 da proteína de aspartato quinase codificada de acordo com a SEQ ID NO: 12 trocada por L-alanina; ver US 5.688.671 e número de acesso I74589),

LysC R320G (L-arginina na posição 320 da proteína de aspartato quinase codificada de acordo com a SEQ ID NO: 12 trocada por glicina; ver Jetten et al. (Applied Microbiology and Biotechnology 43, 76-82 (995)) e número de acesso L27125),

LysC G345D (glicina na posição 345 da proteína de aspartato quinase codificada de acordo com a SEQ ID NO: 12 trocada por L-ácido aspártico; ver Jetten et al. (Applied Microbiology and

Biotechnology 43, 76-82 (995)) e número de acesso L16848),

LysC T380I (L-treonina na posição 380 da proteína de aspartato quinase codificada de acordo com a SEQ ID NO: 12 trocada por L-isoleucina; ver WO 01/49854 e número de acesso AX192358), e

LysC S381F (L-serina na posição 381 da proteína de aspartato quinase codificada de acordo com a SEQ ID NO: 12 trocada por L-fenilalanina; ver EP 0435132).

Preferência particular é dada ao alelo lysC^FBR lysC T311I (treonina na posição 311 da proteína de aspartato quinase codificada de acordo com a SEQ ID NO: 12 trocada por isoleucina) e a um alelo lysC^FBR compreendendo pelo menos uma troca selecionada do grupo de uma A279T (alanina na posição 279 da proteína de aspartato quinase codificada de acordo com a SEQ ID NO:12 trocada por treonina), S381F (serina na posição 317 da proteína de aspartato quinase codificada de acordo com a SEQ ID NO: 12 trocada por fenilalanina) e S317A (serina na posição 317 da proteína de aspartato quinase codificada de acordo com a SEQ ID NO: 12 trocada por ala5 nina).

O alelo lysC^FBR lysC T311I (treonina na posição 311 da proteína de aspartato quinase codificada de acordo com a SEQ ID NO: 12 trocada por isoleucina) é muito particularmente preferido.

A cepa DSM 16833 (WO 06/063660) tem, assim como a cepa 10 ATCC 21543 (US 3.708.395), um alelo lysC^FBR codificador de uma proteína de aspartato quinase que compreende a troca de aminoácido T3111.

A cepa NRRL B-11474 (US 4.275.157) tem um alelo lysC^FBR codificador de uma proteína de aspartato quinase que compreende as trocas de aminoácidos A279T e S381F.

Da maneira descrita acima, começando com a cepa ATCC

21543, foi isolado um mutante designado DM1916 que compreende um alelo prpD1 codificador de um polipeptídeo no qual a L-leucina está presente na posição 272 da sequência de aminoácidos. A sequência de nucleotídeos da região codificadora do alelo prpD1 do mutante DM1916 está representada como SEQ ID NO:5 e a sequência de aminoácidos do polipeptídeo codificado está representada como SEQ ID NO:6 ou 8.

É adicionalmente possível usar bactérias corineformes secretoras de L-lisina que possuem propriedades conhecidas na técnica mais recente.

Bactérias corineformes produtoras de L-triptofano normalmente possuem uma antranilato sintase insensível à inibição por feedback ou dessensibilizada. Antranilato sintase insensível à inibição por feedback ou dessensibilizada (TrpE) significa uma antranilato sintase que, em comparação com a forma selvagem, possui uma sensibilidade à inibição por triptofano ou

5-fluorotriptofano (Matsui et al., Journal of Bacteriology 169 (11): 5330 5332(1987)) ou análogos similares que é menor pelo menos em 5% a 10%, ou pelo menos em 10% a 15% ou pelo menos em 10% a 20%. Os genes ou alelos codificadores dessas antranilato sintases dessensibilizadas também são designados alelos trpE^FBR. exemplos de tais mutantes e alelos estão, por exemplo, descritos em US 6180373 e EP338474.

Bactérias corineformes produtoras de L-valina normalmente 5 possuem uma acetolactato sintase (aceto-hidroxiácido) insensível à inibição porfeedback ou dessensibilizada [EC no. 2.2.1.6].

A acetolactato sintase insensível à inibição por feedback significa uma acetolactato sintase que, em comparação com a forma selvagem, demonstra uma sensibilidade menor à inibição por um ou mais dos aminoá10 cidos selecionados do grupo de L-valina, L-isoleucina e L-leucina, preferivelmente L-valina. A acetolactato sintase (llvB, IlvN) da Corynebacteríum consiste em uma assim-chamada grande subunidade codificada pelo gene ilvB e uma assim-chamada pequena subunidade codificada pelo gene ilvN (Keilhauer et al., Journal of Bacteriology 175(17), 5595-5603 (1993)). WO

05/003357 e Elisakova et al. (Applied and Environmental Microbiology

71(1):207-13 (2005)) relatam sobre variantes da subunidade IlvN que conferem resistência à L-valina, L-isoleucina e L-leucina à acetolactato sintase. Uma variante compreende na posição 21 da sequência de aminoácidos Lácido aspártico em vez de L-isoleucina (IlvN 121 D) e na posição 22 L20 fenilalanina em vez de L-isoleucina (IlvN I22F). A segunda variante compreende na posição 20 da sequência de aminoácidos L-ácido aspártico em vez de glicina (IlvN G20D), na posição 21 da sequência de aminoácidos L-ácido aspártico em vez de L-isoleucina (IlvN 121 D) e na posição 22 L-fenilalanina em vez de L-isoleucina (llvn I22F).

As bactérias corineformes produtoras de L-isoleucina normalmente possuem uma treonina desidratase insensível à inibição por feedback ou dessensibilizada (=treonina deaminase).

A treonina desidratase insensível à inibição por feedback significa uma treonina desidratase (EC no. 4.3.1.19) que, em comparação com a forma selvagem, demonstra uma menor sensibilidade à inibição pela Lisoleucina. Os genes ou alelos codificadores dessa treonina desidratase FBR dessensibilizada são também designados alelos ilvA

A região codificadora do gene ilvA do tipo selvagem da Corynebacterium glutamicum correspondente ao número de acesso L01508 do banco de dados da NCBI está representada na SEQ ID NO: 17 e o polipeptídeo codificado por este gene está representado na SEQ ID NO: 18.

As variantes da treonina desidratase descritas em US 6.107.063 e em Morbach et al. (Applied and Environmental Microbiology 61 (12), 43154320 (1995)) compreendem uma ou mais das trocas de aminoácidos selecionadas do grupo:

IlvA M199V (L-metionina na posição 199 da proteína de treonina 10 desidratase codificada de acordo com a SEQ ID NO: 18 trocada por L-valina;

ver US 6.107.063),

IlvA A257G (L-alanina na posição 257 da proteína de treonina desidratase codificada de acordo com a SEQ ID NO:18 trocada por Larginina; ver US 6.107.063),

IlvA H278R (L-histidina na posição 278 da proteína de treonina desidratase codificada de acordo com a SEQ ID NO: 18 trocada por Larginina; ver US 6.107.063),

IlvA V323A (L-valina na posição 323 da proteína de treonina desidratase codificada de acordo com a SEQ ID NO: 18 trocada por L-alanina;

ver Morbach et al.),

IlvA L351S (L-leucina na posição 351 da proteína de treonina desidratase codificada de acordo com a SEQ ID NO: 18 trocada por L-serina; ver US 6.107.063),

IlvA D378G (L-ácido aspártico na posição 378 da proteína de 25 treonina desidratase codificada de acordo com a SEQ ID NO: 18 trocada por

L-glicina; ver Morbach et al.).

Os mutantes resultantes mostram, em comparação com a cepa inicial ou cepa-mãe empregada, excreção ou produção aumentada do aminoácido desejado em um processo de fermentação.

A invenção refere-se igualmente a um polinucleotídeo isolado codificador de um polipeptídeo com atividade enzimática típica da 2metilcitrato desidratase, que compreende na posição 272 ou em uma posi24 ção correspondente ou comparável da sequência de aminoácidos um aminoácido proteinogênico com exceção da L-prolina, com a troca pela Lleucina sendo preferível.

O polinucleotídeo de acordo com a invenção pode ser isolado de um mutante de acordo com a invenção. É ainda possível empregar métodos in vitro para a mutagênese do gene prpD1. Quando da utilização de métodos in vitro, polinucleotídeos isolados que compreendem um gene prpD1 de uma bactéria corineforme, preferivelmente o gene de forma selvagem da Corynebacterium glutamicum descrito na técnica anterior, são submetidos a um tratamento mutagênico.

Os polinucleotídeos isolados podem ser, por exemplo, DNA total ou DNA cromossômico isolado do gene prpD1 ou então amplicons do gene prpD1 preparados com a ajuda de reação em cadeia da polimerase (PCR). Amplicons deste tipo são também designados produtos de PCR. Instruções para a amplificação de sequências de DNA com a ajuda da reação em cadeia da polimerase podem ser encontradas por aquele versado na técnica inter alia no manual de Gait: Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach (IRL Press, Oxford, Reino Unido, 1984) e em Newton e Graham: PCR (Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg, Alemanha, 1994). É igualmente possível que o gene prpD1 a ser submetido a mutagênese primeiro seja incorporado em um vetor, em um bacteriófago ou plasmídeo, por exemplo.

Métodos adequados para a mutagênese in vitro são inter alia o tratamento com hidroxilamina de acordo com Miller (Miller, J. Η.: A Short Course in Bacterial Genetics. A Laboratory Manual and Handbook for Escherichia coli and Related Bactéria, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, 1992), o uso de oligonucleotídeos mutagênicos ((T. A. Brown: Gentechnologie für Einsteiger, Spektrum Akademischer Verlag, Heidelberg, 1993 e R. M. Horton: PCR-Mediated Recombination and Mutagenesis, Molecular Biotechnology 3, 93-99 (1995)) e o uso de uma reação em cadeia da polimerase usando uma DNA polimerase que demonstre uma alta taxa de erros. Uma DNA polimerase desse tipo é, por exemplo, a DNA polimerase Mutazyme (GeneMorph PCR Mutagenesis Kit, No.600550) da Stratagene (LaJolla, CA, EUA).

Instruções adicionais e revisões sobre a geração de mutações in vivo ou in vitro podem ser encontradas na técnica anterior e em livros-texto conhecidos de genética e biologia molecular tais como, por exemplo, o livro5 texto de Knippers (Molekulare Genetik, 6a. edição, Georg Thieme Verlag, Stuttgart, Alemanha, 1995), o de Winnacker (Gene and Klone, VCH Verlagsgesellschaft, Weinheim, Alemanha, 1990) ou o de Hagemann (Allgemeine Genetik, Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1986).

A invenção refere-se ainda a um polinucleotídeo isolado codifi10 cador de um polipeptídeo com atividade enzimática típica da 2-metilcitrato desidratase que inclui a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:2, com um dos aminoácidos proteinogênicos com exceção da L-prolina estando presente na posição 272 da sequência de aminoácidos. A troca pela Lleucina é preferida.

A invenção refere-se ainda a um polinucleotídeo isolado que codifica um polipeptídeo com atividade enzimática típica da 2-metilcitrato desidratase, que inclui uma sequência de aminoácidos com um comprimento de 498 aminoácidos e na qual um aminoácido proteinogênico com exceção da L-prolina, preferivelmente a L-leucina, está presente na posição 272.

A invenção refere-se ainda a um polinucleotídeo isolado codificador de um polipeptídeo com atividade enzimática típica da 2-metilcitrato desidratase que compreende na posição 252 a 291 da sequência de aminoácidos a sequência de aminoácidos correspondente à posição 252 a 291 da SEQ ID NO:6 ou 8. A sequência de aminoácidos do polipeptídeo codificado preferivelmente compreende uma sequência de aminoácidos correspondente à posição 202 a 341 da SEQ ID NO:6 ou 8 ou à posição 152 a 391 da SEQ ID NO:6 ou 8 ou à posição 102 a 441 da SEQ ID NO:6 ou 8 ou à posição 52 a 491 da SEQ ID NO:6 ou 8 ou à posição 2 a 495 da SEQ ID NO:6 ou 8 ou à posição 2 a 496 da SEQ ID NO:6 ou 8 ou à posição 2 a 497 da

SEQ ID NO:6 ou 8. O comprimento do polipeptídeo codificado de maneira muito particularmente preferível inclui 498 aminoácidos.

A invenção refere-se ainda a um polinucleotídeo isolado codifi26 cador de um polipeptídeo com atividade enzimática típica da 2-metilcitrato desidratase que compreende na posição 272 da sequência de aminoácidos ou em uma posição correspondente ou comparável um aminoácido proteinogênico com exceção da L-prolina, preferivelmente L-leucina, e que inclui uma sequência de nucleotídeos idêntica à sequência de nucleotídeos de um polinucleotídeo obtenível por reação em cadeia da polimerase (PCR) usando o par de iniciadores cujas sequências de nucleotídeos em cada caso incluem pelo menos 15 nucleotídeos consecutivos selecionados da sequência de nucleotídeos entre as posições 1 e 750 da SEQ ID NO:3 ou SEQ ID NO:7 e da sequência de nucleotídeos complementar entre as posições 3000 e 2245 da SEQ ID NO:3 ou SEQ ID NO:7. Um exemplo de tal par de iniciadores está representado na SEQ ID NO:9 e na SEQ ID NO: 10. O material inicial preferido (DNA modelo) é DNA cromossômico de bactérias corineformes tratadas em particular com um mutagênico. É particularmente preferível que o

DNA cromossômico seja do gênero Corynebacterium e de maneira muito particularmente preferível da espécie Corynebacterium glutamicum.

A invenção refere-se ainda a um polinucleotídeo isolado que se hibridiza com a sequência de nucleotídeos complementar à SEQ ID NO: 5 sob condições rigorosas e codifica um polipeptídeo com atividade enzimática típica da 2-metilcitrato desidratase que compreende na posição 272 da sequência de aminoácidos, ou em uma posição correspondente ou comparável, um aminoácido proteinogênico com exceção da L-prolina, preferivelmente L-leucina.

Instruções para a hibridização de ácidos nucleicos ou polinucleo25 tídeos podem ser encontradas por aquele versado na técnica no manual The DIG System Users Guide for Filter Hybridization from Boehringer Mannheim GmbH (Mannheim, Alemanha, 1993) e em Liebl et al., (International Journal of Systematic Bacteriology 41: 255-260 (1991)). A hibridização ocorre sob condições rigorosas, significando que os únicos híbridos formados são aqueles nos quais a sonda, isto é, um polinucleotídeo incluindo a sequência de nucleotídeos complementar à SEQ ID NO:5 e a sequência-alvo, isto é, os polinucleotídeos tratados ou identificados com a sonda, são pelo menos 90% idênticos. Sabe-se que o rigor da hibridização, incluindo as etapas de lavagem, é influenciado ou determinado pela variação da composição do tampão, da temperatura e da concentração de sal. A reação de hibridização é geralmente realizada em condições de rigor relativamente baixas em comparação com as etapas de lavagem (Hybaid Hybridisation Guide, Hybaid Limited, Teddington, Reino Unido, 1996).

É possível empregar na reação de hibridização, por exemplo, um tampão correspondendo a 5x SSC a uma temperatura aproximada de 50°C68°C. Neste caso, as sondas podem também se hibridizar com os polinucle10 otídeos que mostram menos de 90% de identidade com a sequência de nucleotídeos da sonda empregada. Tais híbridos são menos estáveis e são removidos por lavagem sob condições rigorosas. Isso pode ser alcançado, por exemplo, reduzindo-se a concentração de sal a 2x SSC e, quando apropriado, subsequentemente a 0,5x SSC (The DIG System User's Guide for

Filter Hybridisation, Boehringer Mannheim, Mannheim, Alemanha, 1995), ajustando-se a temperatura em aproximadamente 50°C-68°C, aproximadamente 52°C-68°C, aproximadamente 54°C-68°C, aproximadamente 56°C68°C, aproximadamente 58°C-68°C, aproximadamente 60°C-68°C, aproximadamente 62°C-68°C, aproximadamente 64°C-68°C, aproximadamente

66°C-68°C. As faixas de temperatura de aproximadamente 64°C-68°C ou aproximadamente 66°C-68°C são preferidas. É possível, quando apropriado, reduzir a concentração de sal a uma concentração correspondente a 0,2x SSC ou 0,1 x SSC. O tampão SSC compreende, quando apropriado, dodecil sulfato de sódio (SDS) a uma concentração de 0,1%. É possível aumentar paulatinamente a temperatura da hibridização em etapas de aproximadamente 1-2°C de 50°C a 68°C para isolar fragmentos de polinucleotídeos com pelo menos 90% ou pelo menos 91%, preferivelmente pelo menos 92% ou pelo menos 93% ou pelo menos 94% ou pelo menos 95% ou pelo menos 96% e de maneira muito particularmente preferível pelo menos 97% ou pelo menos 98% ou pelo menos 99% de identidade com a sequência ou sequência complementar da sonda empregada, e que codificam um polipeptídeo com atividade enzimática típica da 2-metilcitrato desidratase compreendendo a troca de aminoácidos de acordo com a invenção. A sequência de nucleotídeos do polinucleotídeo obtido desta maneira é determinada por meios conhecidos. Instruções adicionais para a hibridização são obteníveis sob a forma dos assim-chamados kits no mercado (p. ex., DIG Easy Hyb da Roche

Diagnostics GmbH, Mannheim, Alemanha, número de catálogo 1603558). As sequências de nucleotídeos obtidas desta maneira codificam polipeptídeos com atividade enzimática típica da 2-metilcitrato desidratase que são pelo menos 90%, preferivelmente pelo menos 92% ou pelo menos 94% ou pelo menos 96% e, de maneira muito particularmente preferível, pelo menos 97% ou pelo menos 98% ou pelo menos 99% idênticas à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:6 ou SEQ ID NO:8 e compreendem a troca de aminoácidos de acordo com a invenção.

A invenção refere-se adicionalmente a um polinucleotídeo isolado que codifica um polipeptídeo com atividade enzimática típica da 215 metilcitrato desidratase que compreende na posição 272 ou em uma posição correspondente ou comparável da sequência de aminoácidos qualquer aminoácido exceto a L-prolina, com preferência para a troca por L-leucina, e que inclui uma sequência de aminoácidos que é adicionalmente pelo menos 90%, preferivelmente pelo menos 92% ou pelo menos 94% ou pelo menos

96% e, de maneira muito partícularmente preferível, pelo menos 97% ou pelo menos 98% ou pelo menos 99% idêntica à sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:6 ou SEQ ID NO:8.

A invenção refere-se ainda a um polinucleotídeo isolado codificador de um polipeptídeo com a atividade enzimática da 2-metilcitrato desi25 dratase que compreende na posição 272 ou em uma posição correspondente ou comparável da sequência de aminoácidos um dos aminoácidos proteinogênicos com exceção da L-prolina, com preferência para a troca da Lleucina e que inclui uma sequência de nucleotídeos que é adicionalmente pelo menos 90%, preferivelmente pelo menos 92% ou pelo menos 94% ou pelo menos 96% e, de maneira muito partícularmente preferível, pelo menos 97% ou pelo menos 98% ou pelo menos 99% idêntica à sequência de nucleotídeos da SEQ ID NO:5.

Além disso, os polinucleotídeos isolados preferidos codificam um polipeptídeo com atividade enzimática típica da 2-metilcitrato desidratase que compreende na posição 272 da sequência de aminoácidos ou em uma posição correspondente ou comparável um aminoácido proteinogênico com exceção da L-prolina, preferivelmente a L-leucina, e que compreende pelo menos uma sequência-motivo ou uma sequência de aminoácidos selecionada do grupo de Arg-Glu-Leu-Asp-Phe-His-Asp-Thr-Phe-Leu-Ala-Ala-Asp/GluTyr-Ser-His-Pro, Gly-lle-Cys-Leu-His-Glu-His-Lys-lle-Asp-His-Val-Ala-HisLeu-Gly-Pro e Pro-Ala-Pro-lle-Trp-Glu-Gly-Glu-Asp-Gly-Val-lle-Ala-Trp-Leu10 Leu.

As designações Asp/Glu significam que Asp ou Glu podem estar presentes na posição correspondente.

A invenção refere-se ainda a um polinucleotídeo isolado que codifica um polipeptídeo com a atividade enzimática típica da 2-metilcitrato de15 sidratase que inclui a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:6 ou 8. O polipeptídeo codificado compreende, quando apropriado, uma (1) ou mais troca(s) de aminoácidos conservativas. O polipeptídeo preferivelmente compreende não mais do que duas (2), não mais do que três (3), não mais do que 4 (quatro) ou não mais do que cinco (5) trocas de aminoácidos conser20 vativas.

A invenção refere-se também a um polinucleotídeo isolado que codifica um polipeptídeo com a atividade enzimática típica da 2-metilcitrato desidratase que inclui a sequência de aminoácidos da SEQ ID NO:6 ou 8 incluindo uma extensão na porção amino terminal ou carbóxi terminal de pelo menos um (1) aminoácido. Essa extensão compreende não mais do que 50, 40, 30, 20, 10, 5, 3 ou 2 aminoácidos ou resíduos de aminoácidos.

A invenção, enfim, refere-se a alelos prpD1 que codificam variantes polipeptídicas da SEQ ID NO:6 ou 8, que compreendem pelo menos uma ou mais inserções ou deleções. Estas preferivelmente compreendem um máximo de 5, um máximo de 4, um máximo de 3 ou um máximo de 2 inserções ou deleções de aminoácidos. A sequência-motivo Arg-Glu-LeuAsp-Phe-His-Asp-Thr-Phe-Leu-Ala-Ala-Asp/Glu-Tyr-Ser-His-Pro e/ou Gly-lle30

Cys-Leu-His-Glu-His-Lys-lle-Asp-His-Val-Ala-His-Leu-Gly-Pro e/ou Pro-AlaPro-lle-Trp-Glu-Gly-Glu-Asp-Gly-Val-lle-Ala-Trp-Leu-Leu é/são preferivelmente não rompidas por tais inserções/deleções.

A invenção refere-se adicionalmente a um polinucleotídeo isola5 do que inclui a sequência de nucleotídeos mostrada na SEQ ID NO:5 ou 7.

A invenção refere-se, por fim, a um polinucleotídeo isolado compreendendo o alelo prpD1 do mutante DM1916.

A invenção adicionalmente refere-se a um polinucleotídeo isolado que inclui parte da região codificadora de um alelo prpD1 de acordo com a invenção, incluindo o polinucleotídeo isolado em cada caso a parte da região codificadora que compreende a troca de aminoácido na posição 272 da sequência de aminoácidos do polipeptídeo codificado.

Incluída em particular está uma molécula de ácido nucléico ou fragmento de DNA que codifica pelo menos uma sequência de aminoácidos correspondente à posição 252 a 291 da SEQ ID NO:2, ou que codifica pelo menos uma sequência de aminoácidos correspondente à posição 202 a 341 da SEQ ID NO: 2, ou que codifica pelo menos uma sequência de aminoácidos correspondente à posição 152 a 391 da SEQ ID NO: 2, ou que codifica pelo menos uma sequência de aminoácidos correspondente à posição 102 a

441 da SEQ ID NO: 2, ou que codifica pelo menos uma sequência de aminoácidos correspondente à posição 52 a 491 da SEQ ID NO: 2, ou que codifica pelo menos uma sequência de aminoácidos correspondente à posição 2 a 495 da SEQ ID NO: 2, ou que codifica de pelo menos uma sequência de aminoácidos correspondente à posição 2 a 496 da SEQ ID NO: 2, ou que codifica pelo menos uma sequência de aminoácidos correspondente à posição 2 a 497 da SEQ ID NO: 2, estando um dos aminoácidos proteinogênicos com exceção da L-prolina, preferivelmente a L-leucina, presente na posição correspondente à posição 272 da SEQ ID NO:2.

Um exemplo de um quadro de leitura de acordo com a invenção incluindo um polinucleotídeo codificador pelo menos da sequência de aminoácidos da posição 252 a 291 correspondente à SEQ ID NO:2, estando um dos aminoácidos proteinogênicos (Xaa) com exceção da L-prolina presente na posição correspondente à 272 da sequência de aminoácidos, está detalhado abaixo:

gcg tgg ctg tta tcg ggc aaa gat cat gtt tat cat gtg cca

Ala Trp Leu Leu Ser Gly Lys Asp His Vai Tyr His Vai Pro 5 255 260 265 ttg ccg gaa cac ggc gag nnn aag ctg ggg att cta gag

Leu Pro Glu His Gly Glu Xaa Lys Leu Gly lie Leu Glu 270 275 act tac aca aag gaa cat tca gcg gaa tat caa tcg cag 10 Thr Tyr Thr Lys Glu His Ser Ala Glu Tyr Gin Ser Gin

280 285 290

Ela está igualmente representada como SEQ ID NO: 17. A sequência de aminoácidos codificada por este quadro de leitura está representada como SEQ ID NO:18. A posição 21 da SEQ ID NO:18 corresponde à posição 272 da SEQ ID NO:2, 4, 6, ou 8.

As moléculas de ácido nucleico preferidas codificam pelo menos uma sequência de aminoácidos correspondente à posição 252 a 291 da

SEQ ID NO:6 ou 8, ou pelo menos correspondente à posição 202 a 341 da

SEQ ID NO:6 ou 8, ou pelo menos correspondente à posição 152 a 391 da

SEQ ID NO:6 ou 8, ou pelo menos correspondente à posição 102 a 441 da

SEQ ID NO:6 ou 8, ou pelo menos correspondente à posição 52 a 491 da

SEQ ID NO:6 ou 8, ou pelo menos correspondente à posição 2 a 495 da

SEQ ID NO:6 ou 8, ou pelo menos correspondente à posição 2 a 496 da

SEQ ID NO:6 ou 8, ou pelo menos correspondente à posição 2 a 497 da

SEQ ID NO:6 ou 8.

Um exemplo de um quadro de leitura de acordo com a invenção incluindo um polinucleotídeo codificador pelo menos da sequência de aminoácidos correspondente à posição 252 a 291 da SEQ ID NO:6 ou 8 está detalhado abaixo:

gcg tgg ctg tta tcg ggc aaa gat cat gtt tat cat gtg cca

Ala Trp Leu Leu Ser Gly Lys Asp His Vai Tyr His Vai Pro 255 260 265

260 ttg ccg gaa cac ggc gag ctc aag ctg ggg att cta gag

Leu Pro Glu His Gly Glu Leu Lys Leu Gly lie Leu Glu

270 275 act tac aca aag gaa cat tca gcg gaa tat caa tcg cag

Thr Tyr Thr Lys Glu His Ser Ala Glu Tyr Gin Ser Gin

280 285 290

O quadro de leitura está igualmente representado como SEQ ID

NO: 19. A SEQ ID NO:20 mostra a sequência de aminoácidos codificada por este quadro de leitura. A posição 21 da SEQ ID NO:20 corresponde à posi10 ção 272 da SEQ ID NO:2, 4, 6 ou 8.

As moléculas de ácido nucléico muito particularmente preferidas incluem pelo menos uma sequência de nucleotídeos correspondente à posição 1504 a 1623 da SEQ ID NO:7, ou pelo menos uma sequência de nucleotídeos correspondente à posição 1354 a 1773 da SEQ ID NO:7, ou pelo me15 nos uma sequência de nucleotídeos correspondente à posição 1204 a 1923 da SEQ ID NO:7, ou pelo menos uma sequência de nucleotídeos correspondente à posição 1054 a 2073 da SEQ ID NO:7, ou pelo menos uma sequência de nucleotídeos correspondente à posição 904 a 2223 da SEQ ID NO:7, ou pelo menos uma sequência de nucleotídeos correspondente à posição

754 a 2235 da SEQ ID NO:7, ou pelo menos uma sequência de nucleotídeos correspondente à posição 754 a 2238 da SEQ ID NO:7, ou pelo menos uma sequência de nucleotídeos correspondente à posição 754 a 2241 da SEQ ID NO:7.

Os quadros de leitura de acordo com a invenção, como mostra25 dos por exemplo na SEQ ID NO: 17 e 19 como sequência de nucleotídeos e na SEQ ID NO: 18 e na SEQ ID NO:20 sob a forma de sequência codificada de aminoácidos, podem adicionalmente compreender uma ou mais mutações que levem a uma ou mais trocas de aminoácidos conservativas. As mutações preferencialmente levam a um máximo de 4%, a um máximo de

2% ou a um máximo de 1% de trocas de aminoácidos conservativas. Os quadros de leitura de acordo com a invenção podem além disso compreender uma ou mais mutações silenciosas. Os quadros de leitura de acordo com a invenção preferivelmente compreendem não mais do que 4% e de maneira particularmente preferível não mais do que 2% a não mais do que 1% de mutações silenciosas.

Os polinucleotídeos isolados de acordo com a invenção podem ser usados na produção de cepas recombinantes de micro-organismos que, de uma maneira melhorada em comparação com a cepa inicial ou cepamãe, liberam aminoácidos no meio que os circunda ou acumulam esses aminoácidos no interior das células.

Um método amplamente utilizado para incorporar mutações em genes de bactérias corineformes é aquele da troca de alelos, que também é conhecido pelo nome substituição de genes. Neste método, um fragmento de DNA que compreende a mutação de interesse é transferido para a cepa desejada de uma bactéria corineforme e a mutação é incorporada por pelo menos dois eventos de recombinação ou eventos de crossover no cromossomo da cepa desejada, ou a sequência de um gene presente na cepa relevante é trocado pela sequência mutada.

Schwarzer e Pühler (Bio/Technology 9, 84-87 (1991) usaram este método para incorporar um alelo lysA que continha uma deleção e para incorporar um alelo lysA que continha uma inserção no cromossomo da C. glutamicum no lugar do gene de tipo selvagem. Scháfer et al. (Gene 145, 6973 (1994)) empregaram este método para incorporar uma deleção no operon hom-thrB da C. glutamicum. Nakagawa et al. (EP 1108790) e Ohnishi et al. (Applied Microbiology and Biotechnology 58(2), 217-223 (2002)) empregaram este método para incorporar várias mutações começando com os alelos isolados no cromossomo da C. glutamicum. Nakagawa et al. conseguiram desta maneira incorporar uma mutação designada Val59Ala no gene da homoserina desidrogenase (hom), uma mutação designada como Thr311 lie no gene da aspartato quinase (lysC ou ask), uma mutação designada Pro458Ser no gene da piruvato carboxilase (pyc) e uma mutação designada Ala213Thr no gene da glicose-6-fosfato desidrogenase (zwf) de cepas da C. glutamicum.

Um polinucleotídeo de acordo com a invenção que pode ser u34 sado em um método de acordo com a invenção inclui a região completa mostrada, por exemplo, na SEQ ID NO:5, ou inclui parte da região codificadora tal como, por exemplo, a sequência de nucleotídeos que codifica pelo menos a sequência de aminoácidos correspondente à posição 252 a 291 da

SEQ ID NO:6 ou 8 e que está representada como SEQ ID NO: 17 e 19. A parte da região codificadora correspondente à SEQ ID NO: 17 e 19 inclui um comprimento de > 120 nucleobases. As partes da SEQ ID NO: 7 que são preferidas são aquelas incluindo pelo menos a sequência entre as posições 1354 e 1773, ou pelo menos entre as posições 1204 e 1923, ou pelo menos entre as posições 1054 e 2073 e têm, correspondentemente, um comprimento > 420, > 720 ou de > 1020 nucleobases.

O fragmento de DNA compreendendo a mutação de interesse está neste método normalmente presente em um vetor, em particular um plasmídeo, que preferivelmente é submetido a replicação apenas limitada ou a nenhuma replicação pela cepa a ser proporcionada pela mutação. Em geral, uma bactéria do gênero Escherichia, preferivelmente da espécie Escherichia coli, é usada como hospedeira auxiliar ou intermediária na qual o vetor pode ser replicado.

Exemplos de vetores de plasmídeos são os vetores pK*mob e pK*mobsacB descritos por Scháfer et al. (Gene 145, 69-73 (1994)), tais como, por exemplo, o pK18mobsacB, e os vetores descritos em WO 02/070685 e WO 03/014362. Estes são replicativos na Escherichia coli, mas não nas bactérias corineformes. Vetores particularmente adequados são aqueles compreendendo um gene com um efeito dominante negativo condi25 cional tal como, por exemplo, o gene sacB (gene da levana sucrase), por exemplo, do Bacillus ou o gene galK (gene da galactose quinase), por exemplo, da Escherichia coli. (Um gene com um efeito dominante negativo condicional significa um gene que sob certas condições é desvantajoso, por exemplo, tóxico para o hospedeiro, mas que sob outras condições não tem efeitos negativos no hospedeiro que o carrega). Eles podem ser selecionados para eventos de recombinação nos quais o vetor é eliminado do cromossomo. Além disso, Nakamura et al. (US-A-6.303.2723) descreveram um plasmídeo sensível à temperatura para as bactérias corineformes que é capaz de se replicar apenas a temperaturas abaixo de 31 °C.

O vetor é então transferido para a bactéria corineforme por conjugação, por exemplo, pelo método de Schãfer ((Journal of Bacteriology 172, 1663-1666 (1990)) ou por transformação, por exemplo, pelo método de Dunican e Shivnan (Bio/Technology 7, 1067-1070 (1989)) ou pelo método de Thierbach et al. (Applied Microbiology and Biotechnology 29, 356-362 (1988)). A transferência do DNA pode, quando apropriado, também ser realizada por bombardeio com partículas.

A recombinação homóloga por meio de um primeiro evento de crossover que promove a integração e de um segundo evento de crossover adequado que promove a excisão no gene-alvo ou na sequência-alvo realiza a incorporação da mutação e resulta em uma bactéria recombinante.

Métodos que podem ser empregados para identificar e caracterizar as cepas resultantes são, interalia, aqueles de hibridização em Southern blot, da reação em cadeia da polimerase, da determinação de sequências, o método da fluorescência por transferência de energia por ressonância (FRET) (Lay et al. Clinicai Chemistry 43, 2262-2267 (1997)) ou métodos enzimológicos.

A invenção, de acordo com tudo isso, refere-se ainda a um método para a produção de uma bactéria corineforme no qual

a) um polinucleotídeo de acordo com a invenção é transferido para uma bactéria corineforme,

b) o gene da 2-metilcitrato desidratase que está presente no cromossomo da bactéria corineforme e que codifica uma sequência de aminoácidos com L-prolina na posição 272 ou em uma posição comparável da sequência de aminoácidos é trocado pelo polinucleotídeo que a) codifica uma sequência de aminoácidos que tem na posição 272 ou em uma posição comparável da sequência de aminoácidos outro L-aminoácido proteinogênico, preferivelmente L-leucina,

c) A bactéria corineforme obtida como nos passos a) e b) é propagada.

Uma bactéria corineforme recombinante que compreende em vez do gene prpD1 de tipo selvagem um (1) alelo prpD1 de acordo com a invenção é obtida dessa forma.

Um método adicional de acordo com a invenção para a produção de um micro-organismo consiste em

a) transferência de um polinucleotídeo de acordo com a invenção codificador de um polipeptídeo com atividade enzimática típica da 2-metilcitrato desidratase para um microorganismo.

b) replicação do polinucleotídeo no micro-organismo, e

c) propagação do micro-organismo obtido de acordo com as etapas a) e b).

Um organismo recombinante que compreende pelo menos uma (1) cópia ou uma pluralidade de cópias de um polinucleotídeo de acordo com a invenção codificador de uma 2-metilcitrato desidratase que compreende na posição 272 ou em uma posição comparável da sequência de aminoácidos do polipeptídeo codificado um dos aminoácidos proteinogênicos, com exceção da L-prolina, com preferência pela troca por L-leucina, é obtido desta forma.

A invenção refere-se ainda, de acordo com tudo isso, a hospedeiros ou células hospedeiras, preferivelmente micro-organismos, de maneira particularmente preferível bactérias corineformes e bactérias do gênero Escherichia, que compreendem os polinucleotídeos de acordo com a invenção. A invenção, da mesma forma, refere-se a micro-organismos produzidos usando-se os polinucleotídeos isolados. Os micro-organismos ou bactérias desse tipo são também designados micro-organismos recombinantes ou bactérias recombinantes. A invenção refere-se igualmente a vetores que compreendem os polinucleotídeos de acordo com a invenção. Por fim, a invenção refere-se igualmente a hospedeiros que compreendem estes vetores.

Pode ser adicionalmente vantajoso para uma melhor produção de L-aminoácidos, em particular L-lisina, L-triptofano, L-valina, L-isoleucina e

L-homoserina, superexpressar vários genes dos mutantes ou cepas recombinantes de acordo com a invenção. O uso de genes endógenos é no geral preferível.

Genes endógenos ou sequências de nucleotídeos endógenas significam os genes ou sequências de nucleotídeos, ou alelos, presentes na população de uma espécie.

Assim, para produzir L-licina, é possível superexpressar um ou mais dos genes selecionados do grupo de • um gene dapA codificador de uma dihidropicolinato sintase (DapA, EC no. 4.2.1.52), tal como, por exemplo, o gene dapA descrito em EP 0 197 335 do tipo selvagem da Corynebacterium glutamicum, • um gene lysA codificador de uma diaminopimelato decarboxilase (LysA, EC no. 4.1.1.20), tal como, por exemplo, o gene lysA descrito em US 6.090.597 da Corynebacterium glutamicum ATCC13869, • um gene zwf codificador de uma glicose-6-fosfato desidrogenase (Zwf, EC no. 1.1.1.49), tal como, por exemplo, o gene zwf descrito em JPA-09224661 e EP-A-1108790 do tipo selvagem da Corynebacterium glutamicum, • os alelos zwf da Corynebacterium glutamicum que são descritos em US-2003-0175911-A1 e que codificam uma proteína com atividade enzimática típica da glicose-6-fosfato desidrogenase, na qual, por exemplo, a L-alanina na posição 243 da sequência de aminoácidos é substituída por L-treonina, ou na qual o L-ácido aspártico da posição 245 é substituído por L-serina, • Um gene pyc codificador de uma piruvato carboxilase (Pyc, EC no. 6.4.1.1), tal como, por exemplo, o gene pyc descrito em DE-A-198 31 609 e EP 1108790 do tipo selvagem da Corynebacterium glutamicum, • o alelo pyc da Corynebacterium glutamicum que é descrito em EP 1 108 790 e que codifica uma proteína com atividade típica da piruvato carboxilase na qual a L-prolina na posição 458 da sequência de aminoácidos é substituída por L-serina, • os alelos pyc da Corynebacteríum glutamicum que são descritos em WO 02/31158 e particularmente EP1325135B1 e que codificam proteínas com atividade típica da piruvato de carboxilase que carregam um ou mais das trocas de aminoácidos selecionadas do grupo de L-valina na posição 1 substituída por L-metionina, L-ácido glutâmico na posição 153 substituído pelo L-ácido aspártico, L-alanina na posição 182 substituída por Lserina, L-alanina na posição 206 substituída por L-serina, L-histidina na posição 227 substituída por L-arginina, L-alanina na posição 455 substituída por glicina e L-ácido aspártico na posição 1120 substituído por L-ácido glutâmico.

• um gene lysC codificador de uma aspartato quinase (LysC, EC no. 2.7.2.4), tal como, por exemplo, o gene lysC descrito como SEQ ID NO:281 em EP-A-1108790 (ver também números de acesso AX120085 e

120365) e o gene lysC descrito como SEQ ID NO:25 em WO 01/00843 (ver também número de acesso AX063743) do tipo selvagem da Corynebacterium glutamicum, • um alelo lysC^FBR codificador de uma variante da aspartato quinase insensível à inibição por feedback, em particular correspondente à ta20 belal, • um gene lysE codificador de uma proteína de exportação de lisina (LysE), tal como, por exemplo, o gene lysE descrito em DE A 195 48 222 do tipo selvagem da Corynebacteríum glutamicum, • o gene aat codificador de uma aspartato aminotransferase (Aat, 25 EC no. 2.6.1.1) (o gene aat da Corynebacteríum glutamicum ATCC13032 é descrito por exemplo em Kalinowski et al. (Journal of Biotechnology 104 (13), 5 25 (2003); ver também número de acesso NC_006958), onde ele é designado gene aspB. Em US 6.004.773, um gene codificador de uma aspartato aminotransferase é designado aspC. Marienhagen et al. (Journal of Bacte30 riology 187 (22), 7693-7646 (2005)) referiram-se ao gene aat como gene aspT, e o gene zwa1 codificador da proteína Zwa1 do tipo selvagem da

Corynebacteríum glutamicum (US 6.632.644).

Superexpressão significa em geral um aumento da concentração ou atividade intracelular de um ácido ribonucleico, de uma proteína ou de uma enzima. No caso da presente invenção, alelos prpD1 ou polinucleotídeos que codificam 2-metilcitrato desidratases que compreendem na posição 272 da sequência de aminoácidos do polipeptídeo codificado um aminoácido proteinogênico, com exceção da L-prolina, com preferência para a troca por L-leucina, são superexpressados. Sabe-se que aminoácidos Nterminais, especialmente a metionina N-terminal, podem ser eliminados do polipeptídeo formado pelas enzimas do próprio hospedeiro - chamadas aminopeptidases. O aumento mencionado da concentração ou atividade de um produto de gene pode ser alcançado, por exemplo, pelo aumento do número de cópias dos polinucleotídeos apropriados em pelo menos uma cópia.

Um método amplamente utilizado para aumentar o número de cópias consiste na incorporação do gene ou alelo apropriado em um vetor, preferivelmente um plasmídeo, que é replicado pela bactéria corineforme. Vetores de plasmídeos adequados são por exemplo o pZ1 (Menkel et al., Applied and Environmental Microbiology (1989) 64: 549-554) ou os vetores pSELF descritos por Tauch et al. (Journal of Biotechnology 99, 79-91 (2002)). Um artigo de revisão do tópico dos plasmídeos na Corynebacteríum glutamicum pode ser encontrado em Tauch et al. (Journal of Biotechnology 104, 27-40 (2003)).

Outro método amplamente utilizado para se alcançar a superexpressão é o método de amplificação genética cromossômica. Neste método, pelo menos uma cópia adicional do gene ou alelo de interesse é introduzida no cromossomo de uma bactéria corineforme.

Em uma modalidade, como descrito por exemplo em Reinscheid et al. (Applied and Environmental Microbiology 60, 126-132 (1994)) para o operon hom-thrB, um plasmídeo não-replicativo na C. glutamicum e que compreende o gene de interesse é transferido para uma bactéria corineforme. A cepa resultante após recombinação homóloga por meio de um evento de crossover compreende pelo menos duas cópias do gene ou alelo rele40 vante.

Em outra modalidade, que é descrita em WO 03/040373 e US2003-0219881-A1, uma ou duas cópias do gene de interesse é introduzida por meio de pelo menos dois eventos de recombinação em um sítio desejado da C. glutamicum. Dessa maneira, por exemplo, uma cópia de um alelo lysC que codifica uma aspartato quinase insensível ao feedback por L-lisina foi incorporada no gene gluB da C. glutamicum.

Em ainda outra modalidade, que é descrita em WO 03/014330 e US-2004-0043458-A1, pelo menos uma cópia adicional do gene de interesse é incorporada ao gene ou alelo previamente presente no sítio natural por meio de pelo menos dois eventos de recombinação. Desta maneira, por exemplo, uma duplicação em tandem de um alelo lysC^FBR foi realizada no sítio natural do gene lysC.

É possível, por fim, aumentar o número de cópias com a ajuda de transposons e elementos IS (ver US 5.804.414, US 5.591.577).

Um método adicional para produzir uma superexpressão consiste em ligar o gene ou alelo apropriado de uma maneira funcional (operacionalmente ligada) a um promotor ou a um cassete de expressão. Promotores adequados para a Corynebacterium glutamicum estão descritos por exemplo no artigo de revisão de Patek et al. (Journal of Biotechnology 104(1-3), 311323 (2003). É possível da mesma maneira usar as variantes do promotor dapA descrito por Vasicova et al. (Journal of Bacteriology 181, 6188-6191 (1999)), por exemplo o promotor A25. Uma possibilidade adicional é usar o promotor GAP da Corynebacterium glutamicum (EP 06007373). Finalmente, os promotores amplamente conhecidos T3, T7, SP6, M13, lac, tac e tre descritos por Amann et al. (Gene 69(2), 301-315 (1988)) e Amann e Brosius (Gene 40(2-3), 183-190 (1985)) podem ser usados.

Uma outra possibilidade é mutar a região promotora e reguladora do sítio de ligação de ribossomo localizado a montante do gene estrutural. A expressão é igualmente melhorada mediante medidas para prolongar o tempo de vida do mRNA. A atividade enzimática é igualmente aumentada, além disso, evitando-se a degradação da proteína enzimática. Uma possível alternativa adicional é a superexpressão do gene ou alelo relevante mediante alteração da composição dos meios e da manipulação da cultura.

A atividade ou concentração da proteína apropriada é geralmente aumentada pelas medidas de superexpressão em pelo menos 10%, 25%,

50%, 75%, 100%, 150%, 200%, 300%, 400% ou 500%, no máximo até

1000% ou 2000% em relação à atividade ou concentração da proteína no micro-organismo inicial ou na cepa-mãe. Um micro-organismo inicial ou cepa-mãe significam um micro-organismo no qual as medidas de intervenção são realizadas.

A concentração da proteína pode ser determinada por fracionamento mono e bidimensional da proteína em gel e subsequente identificação ótica da concentração proteica usando no gel um software de análise apropriado. Um método útil para preparar o gel de proteínas no caso das bactérias corineformes e para identificar as proteínas é o procedimento descrito por Hermann et al. (Electrophoresis, 22:1712-23 (2001)). A concentração proteica pode igualmente ser determinada por hibridização por Western blot com um anticorpo específico para a proteína a ser detectada (Sambrook et al., Molecular cloning: a laboratory manual. 2nd Ed. Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, Nova Iorque, 1989) e subsequente ava20 liação ótica com software apropriado para determinar a concentração (Lohaus and Meyer (1998) Biospektrum 5:32-39; Lottspeich, Angewandte Chemie 272: 2630-2647 (1999)).

Pode ainda ser vantajoso para a produção de L-lisina, além do uso de alelos do gene prpD1 de acordo com a invenção, quando apropriado, juntamente com a superexpressão de pelo menos um dos genes selecionados do grupo supramencionado de genes, atenuar simultaneamente ou desligar um ou mais dos genes endógenos selecionados do grupo de • um gene pgi codificador da glicose-6-fosfato isomerase (Pgi, EC no. 5.3.1.9) tal como, por exemplo, o gene pgi descrito em US 6.586.214 e US 6.465.238 da Corynebacterium glutamicum, • um gene hom codificador da homoserina desidrogenase (Hom, EC no. 1.1.1.3), tal como, por exemplo, o gene hom descrito em EP-A42

0131171 da Corynebacterium glutamicum, • um gene thrB codificador da homoserina quinase (ThrB, EC no. 2.7.1.39) tal como, por exemplo, o gene thrB descrito por Peoples et al. (Molecular Microbiology 2 (1988): 63-72)) da Corynebacterium glutamicum e • um gene pfkB codificador da fosfofrutoquinase (PfkB, EC no. 2.7.1.56), tal como, por exemplo, o gene pfkB descrito em WO 01/00844 (sequência no. 57) da Corynebacterium glutamicum, • um gene mdh codificador da malato desidrogenase (Mdh, EC no. 1.1.1.37) como descrito, por exemplo, em WO 02/02778, • um gene mgo codificador da malato-quinona oxidoredutase (Mqo, EC no. 1.1.99.16), como descrito, por exemplo, em US 7.094.106 e PCT/EP2005/057216.

O termo atenuação descreve, neste contexto, a redução ou desligamento da atividade da atividade intracelular de uma ou mais enzimas (proteínas) em um micro-organismo codificadas pelo DNA apropriado usando, por exemplo, um promotor fraco ou usando um gene ou alelo codificador de uma enzima correspondente com atividade baixa ou desativadora do gene ou enzima (proteína) correspondente e, quando apropriado, combinando essas medidas.

As medidas de atenuação geralmente reduzem a atividade ou concentração da proteína correspondente a 0 a 75%, 0 a 50%, 0 a 25%, 0 a 10% ou 0 a 5% da atividade ou concentração da proteína de tipo selvagem, ou da atividade ou concentração da proteína no micro-organismo inicial.

Mutações adequadas para a geração de uma atenuação são transições, transversões, inserções e deleções de pelo menos um (1) par de bases ou nucleotídeo. Dependendo do efeito da troca de aminoácidos causada pela mutação sobre a atividade enzimática, é feita referência a mutações missense ou mutações nonsense. Uma mutação missense leva à troca de um dado aminoácido de uma proteína por outro, sendo a troca de aminoácidos em particular uma troca não-conservativa. Isso restringe a atividade ou a capacidade da proteína de funcionar e a reduz a um valor de 0 a 75%, 0 a 50%, 0 a 25%, 0 a 10% ou 0 a 5%. A mutação nonsense leva a um có43 don de parada na região codificadora do gene e assim à terminação prematura da tradução. Inserções ou deleções de pelo menos um par de bases em um gene leva a mutações por deslocamento do quadro de leitura, que levam à incorporação de aminoácidos incorretos ou ao término prematuro da tradu5 ção. Se a mutação resultar em um códon de parada na região codificadora, isso leva igualmente ao término prematuro da tradução. As medidas mencionadas são preferivelmente realizadas na parte 5’-terminal da região codificadora da porção N- terminal do polipeptídeo. Caso o comprimento total de um polipeptídeo (medido como o número de L-aminoácidos quimicamente ligados) é designado como 100%, a parte da sequência de aminoácidos pertencente à porção N-terminal do polipeptídeo - no contexto da presente invenção - compreende 80% dos L-aminoácidos após o aminoácido inicial Lformilmetionina.

Instruções adicionais para a geração de tais mutações perten15 cem à técnica mais avançada e podem ser encontradas em livros-texto conhecidos de genética e biologia molecular tais como, por exemplo, o livrotexto de Knippers (Molekulare Genetik, 6^a rdição, Georg Thieme Verlag, Stuttgart, Alemanha, 1995), o de Winnacker (Gene and Klone, VCH Verlagsgesellschaft, Weinheim, Alemanha, 1990) e o de Hagemann (Allgemei20 ne Genetik, Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1986). Medidas adicionais são descritas na técnica anterior.

Um método para reduzir seletivamente a expressão genética consiste em colocar o gene a ser atenuado sob o controle de um promotor que possa ser induzido pela adição de quantidades calculadas de IPTG (iso25 propil-p-D-tiogalactopiranosídeo) tais como, por exemplo, o promotor trc ou o promotor tac. Adequados a este fim são vetores tais como, por exemplo, o vetor de expressão da Escherichia coli pXK99E (WO0226787; depositado em concordância com o Tratado de Budapeste em 31 de julho de 2001 na DH5alpha/pxK99E como DSMI4440 na Deutsche Sammlung für Mikroorga30 nismen und Zellkulturen (DSMZ, Brunswick, Alemanha)) ou pVWEx2 (Wendisch, Ph. D. thesis, Berichte des Forschungszentrums Jülich, Jül-3397, ISSN 0994-2952, Jülich, Alemanha (1997)) que possibilitam a expressão

IPTG-dependente do gene clonado na Corynebacterium glutamicum.

Este método foi empregado por exemplo na patente WO0226787 para a expressão regulada do gene deaD pela integração do vetor pXK99EdeaD no genoma da Corynebacterium glutamicum e por Simíc et al. (Applied and Environmental Microbiology 68: 3321-3327 (2002)) para a expressão regulada do gene glyA pela integração do vetor pK18mobglyA’ na Corynebacterium glutamicum.

Um método adicional para reduzir especificamente a expressão genética é a técnica antissentido, nas quais oligodeoxinucleotídeos curtos ou vetores são trazidos para dentro das células-alvo para sintetizar RNA antissentido mais longo. O RNA antissentido é capaz de ligar-se lá a segmentos complementares de mRNAs específicos e reduzir sua estabilidade ou bloquear a traduzibilidade. Um exemplo pode ser encontrado por aquele versado na técnica em Srivastava et al. (Applied Environmental Microbiology 2000 Oct; 66 (10): 4366-4371).

As bactérias corineformes isoladas obtidas pelos métodos da invenção mostram uma secreção ou produção do aminoácido desejado em um processo de fermentação aumentada em comparação com a cepa inicial ou cepa-mãe empregada.

Bactérias isoladas significam os mutantes isolados e gerados e bactérias recombinantes, especialmente bactérias corineformes, de acordo com a invenção que compreendem um alelo prpD1 codificador de uma 2metilcitrato desidratase que compreende a troca de aminoácidos descrita na posição 272 da sequência de aminoácidos.

A produção das bactérias isoladas ou do processo de fermentação usando as mesmas em relação com um ou mais dos parâmetros selecionados do grupo de concentração (produto por volume), o rendimento do produto (produto formado por fonte de carbono consumida) e formação do produto (produto formado por volume e pelo tempo) ou então outros parâmetros do processo e combinações deles são melhorados em pelo menos 0,5%, pelo menos 1%, pelo menos 1,5% ou pelo menos 2% em relação à cepa inicial ou cepa-mãe ou processo de fermentação usando as mesmas.

As bactérias corineformes isoladas de acordo com a invenção podem ser cultivadas continuamente - como descrito, por exemplo, em

PCT/EP2004/008882 - ou de maneira descontínua (cultivo descontínuo) ou em um ou repetidos processos de cultivo alimentados descontínuos com o objetivo de produzir L-aminoácidos. Um resumo de natureza geral sobre métodos de cultivo conhecidos está disponível no livro-texto de Chmiel (Bioprozesstechnik 1. Einführung in die Bioverfahrenstechnik (Gustav Fischer Verlag, Stuttgart, 1991)) ou no livro-texto de Storhas (Bioreaktoren und periphere Einrichtungen (Vieweg Verlag, Brunswick/Wiesbaden, 1994)).

O meio de cultura ou meio de fermentação a ser usado deve satisfazer de maneira apropriada as exigências das respectivas cepas. Descrições de meios de cultura de vários micro-organismos estão disponíveis no Manual of Methods for General Bacteriology da American Society for Bacteriology (Washington D.C., EUA, 1981). Os termos meio de cultura, meio de fermentação e meio nutriente ou meio são intercambiáveis.

As fontes de carbono que podem ser usadas são açúcares e carboidratos tais como, por exemplo, glicose, sacarose, lactose, frutose, maltose, melaço, soluções contendo sacarose de beterraba ou produção de cana-de-açúcar, amido, hidrolisato de amido e celulose, óleos e gorduras tais como, óleo de soja, óleo de girassol, óleo de amendoim e óleo de coco, ácidos graxos tais como, por exemplo, ácido palmítico, ácido esteárico e ácido linolênico, álcoois tais como, por exemplo, glicerol, metanol e etanol e ácidos orgânicos tais como, por exemplo, ácido acético. Essas substâncias podem ser usadas isoladamente ou como uma mistura.

Fontes de nitrogênio que podem ser usadas são compostos orgânicos contendo nitrogênio tais como peptona, extrato de levedura, extrato de carne, extrato de malte, licor da maceração do milho, farinha de soja e ureia ou compostos inorgânicos tais como sulfato de amônia, cloreto de amônia, fosfato de amônia, carbonato de amônia e nitrato de amônia. As fon30 tes de nitrogênio podem ser usadas isoladamente ou como mistura.

Fontes de fósforo que podem ser usadas são ácido fosfórico, dihidrogênio fosfato de potássio ou fosfato hidrogênico dipotássico ou os sais contendo sódio correspondentes.

O meio de cultura deve, adicionalmente, compreender sais, por exemplo, sob a forma de cloretos ou sulfatos de metais, tais como, por exemplo, sódio, potássio, magnésio, cálcio e ferro, tais como, por exemplo, sulfato de magnésio ou sulfato de ferro, que são necessários para o crescimento. Finalmente, fatores de crescimento essenciais tais como aminoácidos, por exemplo, homoserina e vitaminas, por exemplo tiamina, biotina ou ácido pantotênico, podem ser empregados além das substâncias supramencionadas. É ademais possível adicionar ao meio de cultura precursores ade10 quados do aminoácido respectivo.

Os materiais iniciais mencionados podem ser acrescentados à cultura sob a forma de um lote único ou alimentados durante o cultivo de maneira adequada.

Para controlar o pH da cultura, compostos básicos tais como hi15 dróxido de sódio, hidróxido de potássio, amônia ou amônia aquosa, ou compostos acídicos tais como ácido fosfórico ou ácido sulfúrico são empregados de uma maneira apropriada. O pH é geralmente ajustado em um valor de 6,0 a 9,0, preferivelmente de 6,5 a 8. Para controlar a formação de espuma, é possível empregar agentes antiespumantes tais como, por exemplo, poligli20 col ésteres de ácido graxo. Para manter a estabilidade dos plasmídeos, é possível acrescentar ao meio substâncias de ação seletiva apropriadas, tais como, por exemplo, antibióticos. Para manter condições aeróbicas, oxigênio ou misturas gasosas contendo oxigênio tais como, por exemplo, ar, são introduzidas na cultura. É igualmente possível usar líquidos enriquecidos com peróxido de hidrogênio. A fermentação é realizada, quando apropriado, com excesso de pressão com, por exemplo, com um excesso de pressão de 0,03 a 0,2 MPa. A temperatura da cultura é normalmente de 20°C a 45°C e preferivelmente de 25° a 40°C. Em processos descontínuos, o cultivo é continuado até um volume máximo do aminoácido desejado ter sido formado. O obje30 tivo é normalmente alcançado em um prazo de 10 horas a 160 horas. Em processos contínuos, tempos de cultivo mais longos são possíveis.

Meios de fermentação adequados são descritos, inter alia, em

US 6.221.636, em US 5.840.551, em US 5.770.409, em US 5.605.818, em

US 5.275.940, em US 4.275.157 e em US 4.224.409.

Métodos para a determinação dos L-aminoácidos são conhecidos na técnica mais recente. A análise pode acontecer, por exemplo, como descrito por Spackman et al. (Analytical Chemistry, 30, (1958), 1190) por cromatografia de troca aniônica com subsequente derivação com ninidrina, ou pode acontecer por HPLC de fase reversa como descrito por Lindroth et al. (Analytical Chemistry (1979) 51: 1167-1174).

A invenção, correspondentemente, refere-se a um processo para produzir um L-aminoácido no qual

a) uma bactéria corineforme isolada é fermentada em um meio apropriado, compreendendo a bactéria um gene codificador de um polipeptídeo com atividade enzimática típica da 2-metilcitrato desidratase, no qual a L-prolina na posição 272 na sequência de aminoácidos do polipeptídeo, ou na posição correspondente, é substituída por outro aminoácido proteinogênico, preferivelmente a L-leucina e,

b) o L-aminoácido é acumulado no caldo de fermentação ou nas células da bactéria corineforme isolada.

Isso é geralmente seguido pela coleta do L-aminoácido acumulado no meio nutriente ou no caldo de fermentação e/ou nas células da bactéria para se obter um produto sólido ou líquido.

Um caldo de fermentação significa um meio de fermentação no qual um micro-organismo foi cultivado por um certo tempo e a uma certa temperatura. O meio de fermentação, ou os meios empregados durante a fermentação, compreende(m) todas as substâncias e componentes que garantem o crescimento do micro-organismo e a formação do aminoácido desejado.

Quando a fermentação está completa, o caldo de fermentação resultante correspondentemente compreende a) a biomassa do microorganismo que foi produzida como resultado do crescimento das células do micro-organismo, b) o aminoácido desejado formado durante a fermentação,

c) os subprodutos orgânicos formados durante a fermentação, e d) os constituintes do meio/meios de fermentação empregado(s) ou dos materiais iniciais tais como, por exemplo, vitaminas tais como a biotina, aminoácidos tais como a homoserina ou sais tais como o sulfato de magnésio, que não foram consumidos pela fermentação.

Os subprodutos orgânicos incluem substâncias que são produzidas pelos micro-organismos empregados na fermentação quando apropriado em adição ao L-aminoácido desejado resultante e são secretados quando apropriado. Estes incluem L-aminoácidos que somam menos do que 30%, 20% ou 10% em comparação com o aminoácido desejado. Estes incluem ainda ácidos orgânicos que têm de um a três grupos carboxila, tais como, por exemplo, ácido acético, ácido lático, ácido cítrico, ácido málico ou ácido fumárico. Também incluídos, enfim, estão açúcares tais como, por exemplo, trealose.

Caldos de fermentação típicos adequados para propósitos industriais normalmente possuem um teor de aminoácidos de 30 g/kg a 200 g/kg ou 40 g/kg a 180 g/kg ou 50 g/kg a 150 g/kg. O teor de biomassa (na forma de biomassa seca) é geralmente de 20 a 50 g/kg.

No caso do aminoácido L-lisina, substancialmente quatro diferentes formas de produto são conhecidas na técnica mais recente.

Um grupo de produtos contendo L-lisina inclui soluções alcalinas aquosas concentradas de L-lisina purificada (EP-B-0534865). Um outro grupo, como descrito por exemplo em US 6.340.486 e US 6.465.025, inclui concentrados contendo biomassa aquosos e acídicos de caldos de fermentação contendo L-lisina. O grupo melhor conhecido de produtos sólidos inclui pós ou formas cristalinas de L-lisina pura ou purificada que se encontra normalmente sob a forma de um sal, como, por exemplo, L-lisina monohidrocloreto. Um outro grupo de formas sólidas do produto é descrito, por exemplo, em EP-B-0533039. Além da L-lisina, a forma do produto lá descrita compreende a maior parte dos materiais iniciais usados durante a produção fermentativa e não consumidos e, quando apropriado, a biomassa do microorganismo empregado com um conteúdo de > 0% -100%.

No caso dos aminoácidos L-valina, L-isoleucina, L-prolina, L-triptofano e L-homoserina, as formas do produto conhecidas na técnica anterior são substancialmente aquelas contendo os aminoácidos relevantes em forma purificada ou pura (> 95% por peso ou > 98% por peso).

Correspondendo às diferentes formas do produto, uma ampla variedade de processos é conhecida mediante os quais o L-aminoácido é coletado, isolado ou purificado do caldo de fermentação para produzir o produto contendo L-aminoácido ou o L-aminoácido purificado.

L-aminoácidos puros sólidos são produzidos substancialmente 10 mediante métodos de cromatografia de troca iônica, quando apropriado, com o uso de cavão ativado e métodos de cristalização. No caso da lisina, a base correspondente ou um sal correspondente tal como, por exemplo, lisina mono-hidrocloreto (Lys-HCI) ou sulfato de lisina (Lys2-H₂So₄) é obtida dessa maneira.

No caso da lisina, EP-B-0534865 descreve um processo para a produção de soluções contendo L-lisina básicas aquosas a partir de caldos de fermentação. No processo ali descrito, a biomassa é removida do caldo de fermentação e descartada. Uma base tal como, por exemplo, sódio, potássio ou hidróxido de amônia é usada para ajustar um pH entre 9 e 11. Os constituintes minerais (sais inorgânicos) são removidos do caldo após concentração e resfriamento por cristalização e ou usado como fertilizante ou descartado.

Em processos para a produção de lisina usando as bactérias de acordo com a invenção, processos resultando em produtos que compreen25 dem componentes do caldo de fermentação também são empregados. Estes são usados em particular como aditivos para nutrição animal.

Dependendo das exigências, a biomassa pode ser removida integralmente ou parcialmente do caldo de fermentação por métodos de separação tais como, por exemplo, centrifugação, filtração, decantação ou uma combinação dos mesmos, ou ser deixados completamente nos produtos. Quando apropriado, a biomassa ou o caldo de fermentação contendo biomassa é desativada durante uma etapa de processamento apropriada, por exemplo por tratamento termal (aquecimento) ou pela adição de ácido.

Os constituintes químicos da biomassa são inter alia o envelope celular, por exemplo o peptídeoglicano e o arabinogalactano, a proteína ou polipeptídeo, por exemplo o polipeptídeo de 2-metilcitrato desidratase, lipídios e fosfolipídios e ácidos nucleicos (DNA e RNA), por exemplo, polinucleotídeos compreendendo a mutação de acordo com a invenção. Como resultado das medidas de desativação e/ou das etapas de processamento adicionais (por exemplo acidificação, secagem por pulverização, granulação, etc.), os ácidos nucleicos estão normalmente presentes como fragmentos com um comprimento de inter alia >40-60 bp, > 60 - 80 bp, > 80 - 100 bp, > 100 200 bp, > 200 - 300 bp, > 300 - 400 bp, > 400 - 500 bp, > 500 - 750 bp, > 750 - 1000 bp, > 1000 - 1250 bp, > 1250 - 1500 bp, > 1500 - 1750 bp, > 1750 - 2000 bp, > 2000 - 2500 bp, > 2500 - 3000 bp, > 3000 - 4000 bp, > 4000 - 5000 bp.

Em um procedimento, a biomassa é removida completamente ou quase completamente de forma que nenhuma (0%), ou não mais do que 30%, não mais do que 20%, não mais do que 10%, não mais do que 5%, não mais do que 1% ou não mais do que 0,1% de biomassa permaneça no produto produzido. Em um procedimento adicional, a biomassa não é removida, ou é removida apenas em pequenas proporções de forma que toda (100%) ou mais do que 70%, 80%, 90%, 95% ou 99,9% da biomassa permaneça no produto produzido. Em um processo de acordo com a invenção, correspondentemente, a biomassa é removida em proporções de > 0% a < 100%.

Por fim, o caldo de fermentação obtido após a fermentação pode ser ajustado, antes ou depois da remoção parcial ou completa da biomassa, a um pH ácido com um ácido inorgânico tal como, por exemplo, ácido clorídrico, ácido sulfúrico ou ácido fosfórico ou um ácido orgânico tal como, por exemplo, ácido propiônico (GB 1.439.728 ou EP 1.331.220). É igualmente possível acidificar o caldo de fermentação com o conteúdo completo de biomassa (US 6.340.486 ou US 6.465.025). Enfim, o caldo pode também ser estabilizado pela adição de bissulfito de sódio (NaHSCh, GB 1.439.728) ou outro sal, por exemplo, amônia, metal alcalino ou sal de metal alcalinoterroso ou ácido sulfuroso.

Durante a remoção da biomassa, sólidos orgânicos ou inorgânicos presentes onde apropriado no caldo de fermentação são parcial ou completamente removidos. Os subprodutos orgânicos dissolvidos no caldo de fermentação e os componentes não consumidos dissolvidos do meio de fermentação (materiais iniciais) permanecem pelo menos parcialmente (> 0%), preferivelmente até pelo menos 25%, de maneira particularmente preferível até pelo menos 50% e de maneira muito particularmente preferível até pelo menos 75% no produto. Quando apropriado, eles também permanecem completamente (100%) ou quase completamente, significando > 95% ou > 98% no produto. Neste sentido, o termo com base no caldo de fermentação significa que o produto compreende pelo menos parte dos componentes do caldo de fermentação.

Subsequentemente, a água é removida ou espessada ou concentrada do caldo por métodos conhecidos tais como, por exemplo, com a ajuda de um evaporador rotativo, evaporador de filme fino, evaporador de filme descendente, por osmose reversa ou por nanofiltração. Esse caldo de fermentação concentrado pode ser transformado em produtos de fluxo livre, em particular um pó de partículas finas ou preferivelmente grãos grandes, por métodos de liofilização, secagem por pulverização, granulação por pulverização ou por outros processos como descrito, por exemplo, no leito fluidificado circulante de acordo com PCT/EP2004/006655. Um produto desejado é isolado quando apropriado dos grânulos resultantes por peneiração ou remoção de pó.

É igualmente possível secar o caldo de fermentação diretamente, ou seja, sem concentração prévia por secagem por pulverização ou granulação por pulverização.

De fluxo livre significa pós que fluem livremente para fora de uma série de recipientes de vidro com orifícios de diferentes tamanhos, pelo menos para fora de recipientes com orifícios de 5 mm (milímetros) (Klein: Seifen, Õle, Fette, Wachse 94, 12 (1968)).

De partícula fina significa um pó com diâmetro de partículas predominantemente (> 50%) de 20 a 200 pm.

Grono significa um produto com diâmetro de partículas predominantemente (> 50%) de 200 a 2000 pm.

A determinação do diâmetro de partícula pode ser realizada por métodos de espectometria de difração a laser. Métodos correspondentes são descritos no livro-texto sobre TeilchengrõBenmessung in der Laborpraxis de R. H. Müller e R. Schuhmann, Wissenschaftliche Verlagsgesellschaft Stuttgart (1996) ou no livro-texto Introduction to Particle Technology de M. Rhodes, publicado por Wiley & Sons (1998).

O pó de livre fluxo, de partículas finas, pode por sua vez ser convertido por processos adequados de compactação ou granulação em um produto de grãos grandes, de fluxo muito livre, armazenável e substancialmente livre de pó.

O termo livre de pó significa que o produto compreende apenas pequenas proporções (< 5%) de tamanhos de partícula abaixo de 100 pm de diâmetro.

Armazenável no sentido de que essa invenção significa um produto que pode ser armazenado por pelo menos um (1) ano ou mais, preferivelmente por pelo menos 1,5 ano ou mais, de maneira particularmente preferível por dois (2) anos ou mais, em um ambiente seco e fresco sem que ocorra perda substancial (< 5%) do respectivo aminoácido.

A invenção refere-se ainda, de acordo com tudo isso, a um processo para produzir um produto contendo L-aminoácido, preferivelmente Llisina ou L-triptofano, preferivelmente um aditivo para nutrição animal, a partir de caldos de fermentação, caracterizado pelas seguintes etapas:

a) cultivo e fermentação de uma bactéria corineforme secretora de L-aminoácido que compreenda pelo menos um alelo prpD1 codificador de um polipeptídeo com atividade típica de 2-metilcitrato desidratase, que inclua uma sequência de aminoácidos na qual na posição 272 ou em posição comparável um aminoácido proteinogênico com exceção da L53 prolina, preferivelmente L-leucina, esteja presente, em um meio de fermentação,

b) remoção da biomassa formada durante a fermentação em uma quantidade de 0 a 100% por peso, e

c) secagem do caldo de fermentação obtida tal como em a) e/ou b) para obtenção do produto na forma em pó ou granular desejada, sendo adicionado um ácido selecionado do grupo de ácido sulfúrico, ácido fosfórico ou ácido clorídrico, quando apropriado, antes da etapa

b) ou c). A etapa a) ou b) é preferivelmente seguida pela remoção da água do caldo de fermentação (concentração) contendo L-aminoácidos.

A invenção refere-se ainda a um processo para a produção de um produto contendo sulfato de lisina que é descrito em princípio em DE 102006016158 e no qual o caldo de fermentação obtido usando-se o microorganismo de acordo com a invenção, do qual a biomassa foi removida completamente ou parcialmente quando apropriado, é adicionalmente processado pela realização de um processo que inclui pelo menos as seguintes etapas:

a) o pH é reduzido pela adição de ácido sulfúrico para 4,0 a 5,2, em particular 4,9 a 5,1, e a uma proporção molar sulfato/L-lisina no caldo de 0,85 a 1,2, preferivelmente 0,9 a 1,0, de maneira particularmente preferível de > 0,9 a < 0,95, quando apropriado, mediante adição de um composto contendo sulfato ou de uma pluralidade de compostos contendo sulfato e

b) a mistura obtida desta maneira é concentrada pela remoção da água e mediante granulação, quando apropriado, quando uma ou mais das seguintes medidas for/forem realizada(s) quando apropriado antes da etapa a):

c) medição da proporção molar sulfato/L-lisina para confirmar a quantidade necessária de composto(s) contendo sulfato

d) adição de um composto contendo sulfato selecionado do grupo de sulfato de amônia, bissulfato de amônia e ácido sulfúrico em proporções adequadas.

Quando apropriado, também antes da etapa b), um sal de ácido sulfuroso, preferivelmente bissulfito de metal alcalino, de maneira particular5 mente preferível bissulfito de sódio, é adicionado a uma concentração de 0,01 a 0,5 por peso, preferivelmente 0,1 a 0,3% por peso, de maneira particularmente preferível de 0,1 a 0,2% por peso, com base no caldo de fermentação.

Os compostos contendo sulfato preferidos que devem ser men10 cionados no contexto das etapas do processo acima são em particular o sulfato de amônia e/ou o bissulfato de amônio ou misturas correspondentes de amônia e ácido sulfúrico e o próprio ácido sulfúrico.

A proporção V de sulfato/L-lisina é calculada por meio da fórmula V = 2 x [SO₄ ² ] / [L-lisina], Essa fórmula leva em consideração o fato de que o ânion SO4²' tem duas cargas. Uma razão de V = 1 significa que a composição estoiquiométrica Lys2(SO₄) está presente, enquanto um resultado com uma proporção de V - 0,9 representa um déficit de 10% de sulfato e com uma proporção de V = 1,1 tem-se um excesso de 10% de sulfato.

É vantajoso empregar durante a granulação ou compactação os auxiliares ou veículos orgânicos ou inorgânicos habituais, tais como amido, gelatina, derivados da celulose ou substâncias similares, como normalmente usados no processamento de produtos alimentares ou rações como aglutinantes, agentes gelificantes ou espessantes, ou outras substâncias tais como, por exemplo, sílicas, silicatos (EP0743016A) ou estearatos.

É ainda vantajoso proporcionar óleos à superfície dos grânulos resultantes, como descrito em WO 04/054381. Óleos que podem ser usados são óleos minerais, óleos vegetais ou misturas de óleos vegetais, exemplos de tais óleos são óleo de soja, óleo de oliva, misturas óleo de soja/lecitina. Da mesma maneira, óleos de silicone, polietileno glicóis ou hidroxietilcelulo30 se também são apropriados. O tratamento das superfícies com os óleos mencionados produz uma maior resistência a abrasão no produto e uma redução do teor de pó. O teor de óleo do produto é 0,02 a 2,0% por peso, pre55 ferivelmente 0,02 a 1,0% por peso e de maneira particularmente preferível

0,2 a 1,0% por peso com base na quantidade total do aditivo para ração.

Os produtos preferidos têm uma proporção de > 97% por peso de um tamanho de partícula de 100 a 1800 pm ou uma proporção de > 95% por peso de um tamanho de partícula de 300 a 1800 pm de diâmetro. A proporção de pó, isto é, partículas com um tamanho de partícula de < 100 pm, é de maneira particularmente preferível não maior do que 0,5% por peso.

Alternativamente, contudo, o produto pode também ser absorvido em um veículo orgânico ou inorgânico conhecido e habitual no processamento de rações, tal como, por exemplo, sílicas, silicatos, polvilhos, farelos, farinhas, amidos, açúcares ou outros, e/ou ser misturado e estabilizado com os espessantes e aglutinantes costumeiros, exemplos do uso e do processamento dos mesmos estão descritos na literatura (Die Mühle + Mischfuttertechnik 132 (1995) 49, página 817).

Por fim, o produto pode ser também finalizado por processos de revestimento com formadores de filme tais como, por exemplo, carbonatos de metal, sílicas, silicatos, alginatos, estearatos, amidos, gomas e éteres celulósicos, como descrito em DE-C-4100920 até um estado no qual esteja estável para digestão por estômagos de animais, especialmente pelo estômago de ruminantes.

Para ajustar uma concentração desejada de aminoácidos no produto é possível, dependendo das exigências, adicionar o aminoácido apropriado durante o processamento sob a forma de um concentrado ou, se apropriado, de uma substância substancialmente pura ou seu sal em forma líquida ou sólida. Estes podem ser adicionados isoladamente ou como misturas ao caldo de fermentação ou concentrado resultante, ou então durante o processo de secagem ou granulação.

A invenção refere-se ainda a um processo para a produção de um produto contendo lisina sólida, como descrito em princípio em US 20050220933, e que inclui o desenvolvimento do caldo de fermentação obtido usando os micro-organismos de acordo com a invenção, de acordo com as seguintes etapas:

a) filtração do caldo de fermentação, preferivelmente filtração por membrana, para resultar em um sedimento contendo biomassa e um filtrado.

b) concentração do filtrado, preferivelmente de forma a resultar em um teor de sólidos de 48 a 52% por peso,

c) granulação do concentrado obtido na etapa b), preferivelmente a uma temperatura de 50°C a 62°C, e

d) revestimento dos grânulos obtidos em c) com um ou mais agentes de revestimento.

Os agentes de revestimento usados no revestimento na etapa d) são preferivelmente selecionados do grupo consistindo em d1) a biomassa obtida na etapa a), d2) um composto contendo L-lisina, preferivelmente selecionado do grupo de L-lisina hidrocloreto ou sulfato de Llisina, d3) uma substância substancialmente livre de L-lisina com um conteúdo de L-lisina de < 1% por peso, preferivelmente < 0,5% por peso, preferivelmente selecionado do grupo consistindo em amido, carragena, ágar, sílicas, silicatos, polvilhos, farelos e farinhas e d4) uma substância repelente de água, preferivelmente selecionada do grupo consistindo em óleos, polietileno glicóis e parafinas líquidas.

No caso da lisina, a proporção de ions durante a produção de produtos contendo lisina é preferivelmente ajustada de maneira que a proporção de ions equivalente à seguinte fórmula

2x[SO₄ ²]+[CI]-[NH₄ ⁺]-[Na⁺]-[K⁺]-2x[Mg²⁺]-2x[Ca²⁺]/[L-Lys] resulte em 0,68 a 0,95, preferivelmente 0,68 a 0,90, como descrito por Kushiki et al. em US 20030152633 (as concentrações molares devem ser colocadas entre os

No caso da lisina, o produto sólido produzido desta forma possui, com base no caldo de fermentação, um teor de lisina (como uma base de lisina) de 10% por peso até 70% por peso ou 20% por peso até 70% por peso, preferivelmente 30% por peso a 70% por peso e de maneira muito particularmente preferível de 40% por peso até 70% por peso, com base no peso seco do produto. Os teores máximos da base de lisina de 71% por peso,

72% por peso, 73% por peso são igualmente possíveis.

No caso de um aminoácido eletricamente neutro tal como o Ltriptofano, o produto sólido produzido desta maneira possui, com base no caldo de fermentação, um teor de aminoácidos de pelo menos 5% por peso, 10% por peso, 20% por peso, 30% por peso e no máximo 50% por peso, 60% por peso, 70% por peso, 80% por peso, 90% por peso ou até 95% por peso.

O teor de água do produto sólido é de até 5% por peso, preferivelmente de até 4% por peso, e de maneira particularmente preferível de menos do que 3% por peso.

A invenção, portanto, refere-se a um aditivo para rações contendo L-lisina baseado em caldo de fermentação, que exibe as seguintes características

a) um teor de lisina (como base) de pelo menos 10% por peso até um máximo de 73% por peso,

b) um teor de água não excedendo 5% por peso, e

c) um teor de biomassa correspondente a pelo menos 0,1% da biomassa presente no caldo de fermentação, sendo a biomassa, desativada quando apropriado, formada por bactérias corineformes de acordo com a invenção.

A invenção, portanto, refere-se também a um aditivo para ração contendo L-triptofano baseado em um caldo de fermentação, que exibe as seguintes características

a) um teor de triptofano de pelo menos 5% por peso até um máximo de 95% por peso,

b) um teor de água não excedendo 5% por peso, e

c) um teor de biomassa correspondente a pelo menos 0,1% da biomassa presente no caldo de fermentação, sendo a biomassa, desativada quando apropriado, formada por bactérias corineformes de acordo com a invenção.

A cepa MH20-22B foi depositada em 28 de outubro de 2004 na Deutsche Sammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ, Bruns5 wick, Alemanha) como DSM 16835.

O mutante DM1916 da Corynebacterium glutamicum de acordo com a invenção, que compreende L-leucina na posição 272 da sequência de aminoácidos do polipeptídeo PrpD1, foi depositada em 15 de maio de 2006 na Deutsche Sammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ,

Brunswick, Alemanha) como DSM 18258.

A presente invenção é explicada com maior detalhe abaixo por meio de exemplos de modalidades.

Exemplo 1

Mutagênese da cepa DM416 produtora de L-lisina

A cepa DM416 da Corynebacterium glutamicum foi empregada como cepa inicial para a mutagênese com N-metil-N’nitro-N-nitroso de guanidina (MNNG). A cepa DM416 é um mutante da Corynebacterium glutamicum que exige homoserina e leucina e está depositada sob a designação ATCC21543 na American Type Culture Collection (Manassas, VA, EUA).

A cepa DM416 foi cultivada em 10 ml de caldo LB (Merck,

Darmstadt, Alemanha), em um frasco Erlenmeyer de 100 ml a 33°C e 200 rpm em um agitador orbital Certomat do tipo BS-1 (B. Braun Biotech International, Melsungen, Alemanha) por 24 horas. A cultura foi então centrifugada, o sedimento foi ressuspendido em 10 ml de solução de NaCI a 0,9%. A sus25 pensão resultante foi novamente centrifugada e o sedimento resultante foi recolhido em uma solução de 10 ml de NaCI a 0,9%. 5 ml dessa suspensão celular foram tratados com 400 pg/ml de MNNG a 30°C e 200 rpm em um agitador (ver acima) por 15 minutos. A mistura mutagênica foi então centrifugada e o sedimento recolhido em 10 ml de tiossulfato de Na a 2% em tam30 pão de NaCI a 0,9% (pH = 6,0). A suspensão celular foi então diluída em uma proporção de 1:1000, 1:10.000 e 1:100.000 com solução de NaCI a 0,9% e alíquotas foram distribuídas em placas de ágar cérebro-coração (Merck, Darmstadt, Alemanha). Aproximadamente 4.000 mutantes foram isolados desta maneira.

Exemplo 2

Teste de produção dos mutantes da cepa DM416

Os mutantes obtidos no exemplo 1 foram cultivados em um meio nutriente adequado para a produção de lisina e o teor de lisina no sobrenadante da cultura foi determinado. Para este fim, os clones foram inicialmente cultivados em placas de ágar cérebro-coração (Merck, Darmstadt, Alemanha) a 33°C por 24 horas. Uma pré-cultura foi inoculada (10 ml de meio em um frasco Erlenmeyer de 100 ml) começando com cada uma dessas culturas em placas de ágar. O meio utilizado na pré-cultura foi o MM. A précultura foi incubada a 33°C e 240 rpm em um agitador por 24 horas. Uma cultura principal foi inoculada desta pré-cultura de tal forma que a DO (densidade ótica) (660 nm) da cultura principal foi 0,1 DO. O meio MM foi igualmente usado na cultura principal.

Meio MM

CSL	5 g/l
MOPS	20 g/l
Glicose (autoclavada separadamente)	50 g/l
Sais:
(NH4) 2so4)	25 g/l
KH2PO4	0,1 g/l
MgSO4 * 7 H2O	1,0 g/l
CaCI2 * 2 H2O	10 mg/l
FeSO4 * 7 H2O	10 mg/l
MnSO4 * H2O	5,0 mg/l
Biotina (esterilizada por filtração)	0,3 mg/l
Tiamina * HCI (esterilizada por filtração)	0,2 mg/l
L-leucina (esterilizada por filtração)	0,2 mg/l
L-homoserina (esterilizada por filtração)	0,2 mg/l
CaCO3	25 g/l

O CSL (licor da maceração do milho), o MOPS (ácido morfolino60 propanosulfônico) e a solução salina foram ajustados a um pH 7 com amônia aquosa e autoclavados. O substrato estéril, as soluções de vitamina e o CaCO3 seco autoclavado foram então adicionados.

O cultivo aconteceu em volumes de 10 ml em frascos de Erlenmeyer de 100 ml. A temperatura foi de 33°C, o número de revoluções igual a 250 rpm e a umidade de 80%.

Após 24 horas, a densidade ótica (DO) a um comprimento de onda de medição de 660 nm foi determinada com um Biomek 1000 ((Beckmann Instruments GmbH, Munich, Alemanha). A quantidade de lisina formada foi determinada com um analisador de aminoácidos da EppendorfBiotronik (Hamburg, Alemanha) por cromatografia de troca iônica e derivatização pós-coluna com detecção de ni-hidrina. Um mutante distinguido pela formação aumentada de lisina foi denominado DM1916.

Tabela 1

Cepa	DO (660)	Lisina HCI (g/i)
DM416	6,3	1,43
DM1916	6,3	1,61

Exemplo 3

Sequênciamento do alelo prpD1 do mutante DM1916

DNA cromossômico foi isolado do clone DM1916 pelo método de Eikmanns et al. ((Microbiology 140: 1817 - 1828 (1994)). A reação em cadeia da polimerase foi usada para amplificar um segmento de DNA carregando o gene ou alelo prpD1. Com base na sequência conhecida do gene prpD1 da C. glutamicum (sequência no. 770 em EP1108790), os seguintes oligonucleotídeos iniciadores foram selecionados para a PCR:

prpD1_XL_A1 (SEQ ID NO: 9):

5' gcgaattcta aactgcgtga ggttgtgg 3' prpD1_XL_A2 (SEQ ID NO: 10):

5' gcgaattctc cccacatcaa caccattc 3'

Os iniciadores representados foram sintetizados pela MWG Biotech (Ebersberg, Alemanha) e a reação de PCR foi realizada pelo método PCR padrão de Innis et al. (PCR Protocols. A Guide to Methods and Applica61 tions, 1990, Academic Press). Os iniciadores possibilitam amplificar o segmento de DNA que tem cerca de 1,63 kb de comprimento e que carrega o gene ou alelo prpD1. Além disso, os iniciadores contêm a sequência para um sítio de clivagem da endonuclease de restrição EcoRI, que está subli5 nhada na sequência de nucleotídeos representada acima.

O fragmento de DNA amplificado que tem um comprimento de cerca de 1,63 kb e que carrega o alelo prpD1 da cepa DM1916 foi identificado por eletroforese em um gel de agarose a 0,8%, isolado do gel e purificado pelos meios convencionais (QIAquick Gel Extraction Kit, Qiagen, Hilden).

A sequência de nucleotídeos do fragmento de DNA amplificado ou produto de PCR foi determinado por sequênciamento pela Agowa (Berlim, Alemanha). A sequência do produto de PCR está representada na SEQ ID NO: 13. A sequência da região codificadora está adicionalmente representada na SEQ ID NO:5. A sequência de aminoácidos da proteína de metilci15 trato desidratase relevante que foi obtida com a ajuda do programa Patentin está representada na SEQ ID NO:6.

A base timina está localizada na posição 815 da sequência de nucleotídeos da região codificadora do alelo prpD1 da cepa DM1916 (SEQ ID NO:5). A base citosina está localizada na posição correspondente do ge20 ne de tipo selvagem (SEQ ID NO: 1).

O aminoácido leucina está localizado na posição 272 da sequência de aminoácidos da proteína de metilcitrato desidratase da cepa DM1916 (SEQ ID NO:6). O aminoácido prolina está localizado na posição correspondente da proteína de tipo selvagem (SEQ ID NO:2).

O alelo prpD1 que compreende a base timina na posição 815 da região codificadora, e correspondentemente codifica uma proteína de metilcitrato desidratase que compreende o aminoácido leucina na posição 272 da sequência de aminoácidos, será designada doravante alelo prpD1_P272L. Na designação prpD1_P272L, o P significa L-prolina, o L significa L30 leucina e 272 indica a posição da troca de aminoácidos (ver SEQ ID NO:2 e 6).

O mutante da Corynebacterium glutamicum DM1916 que com62 preende L-leucina na posição 272 da sequência de aminoácidos do polipeptídeo PrpD1 foi depositado em 15 de maio de 2006 na Deutsche Sammlung für Mikroorganismen and Zellkulturen (DSMZ, Brunswick, Alemanha) como DSM 18258.

Exemplo 4

Troca do gene prpD1 de tipo selvagem da cepa DM416 pelo alelo prpD1_P272L

4.1 Construção do vetor de troca pK18mobsacB_prpD1_P272L O fragmento de DNA que tem um comprimento de cerca de 1,63 kb, que carrega o alelo prpD1_P272L e o qual foi preparado por PCR e descrito no exemplo 3, foi incorporado mediante mutagênese por troca com a ajuda do sistema sacB descrito em Schãfer et al. (Gene, 14, 69-73 (1994)) no cromossomo da cepa DM416 da C. glutamicum descrita no exemplo 1. Este sistema possibilita produzir e selecionar trocas de alelos realizadas por recombinação homóloga.

Para este fim, o fragmento prpD1_P272L de cerca de 1,63 kb foi clivado com a endonuclease de restrição EcoRI, identificado por eletroforese em um gel de agarose a 0,8% e então isolado do gel e purificado por métodos convencionais (QIAquick Gel Extraction Kit, Qiagen, Hilden).

O vetor de clonagem mobilizável pK18mobsacB foi digerido com a enzima de restrição EcoRI e as terminações foram defosforiladas com fosfatase alcalina (Alkaline Phosphatase, Boehringer Mannheim, Alemanha). O vetor preparado desta maneira foi misturado com o fragmento prpD1_P272L de aproximadamente 1,63 kb e a mistura foi tratada com T4 DNA ligase (A25 mersham-Pharmacia, Freiburg, Alemanha).

A cepa de E. coli S17-1 (Simon et al., Bio/Technology 1: 784791, 1993) foi então transformada com a mistura de ligação (Hanahan, In. DNA Cloning. A Practical Approach. Vol. 1, ILR-Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989). A seleção das células carreadoras do plasmídeo ocorreu mediante distribuição da mistura de transformação em placas de ágar LB (Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2nd Ed., Cold Spring Harbor, New York, 1989) com suplemento de 25 mg/l de kanamicina.

O DNA do plasmídeo foi isolado de um transformante com a ajuda do QIAprep Spin Miniprep Kit da Qiagen e examinado por divagem de restrição com a enzima Pstl e subsequente eletroforese em gel de agarose. O plasmídeo foi chamado pK18mobsacB_prpD1_P272L e está representado na figura 1.

4.2 Troca de alelos

O vetor pK18mobsacB_prpD1_P272L mencionado no exemplo 4.1 foi transferido por um protocolo de Scháfer et al. (Journal of Microbiology 172: 1663-1666 (1990)) por conjugação para a cepa DM416 da C. glutami10 cum. O vetor não é capaz de replicação independente na DM416 e permanece na célula apenas se for integrado no cromossomo como resultado de um evento de recombinação. A seleção de transconjugantes, isto é, de clones com o pK18mobsacB_prpD1_P272L integrado, ocorreu mediante distribuição da mistura de conjugação em placas com ágar LB (Sambrook et al.,

Molecular Cloning: A Laboratory Manual. 2^a Ed. Cold Spring Harbor, New York, 1989), o que foi suplementado com 15 mg/l de kanamicina e 50 mg/l de ácido nalidíxico. Transconjugantes insensíveis à kanamicina foram distribuídos em placas de ágar LB com 25 mg/l de kanamicina e incubados a 33°C por 24 horas. Mutantes nos quais o plasmídeo foi excisado como resul20 tado de um segundo evento de recombinação foram selecionados por cultivo não-seletivo de clones em meio líquido LB por 30 horas, seguido por distribuição em ágar LB com sacarose a 10% e incubação por 16 horas.

O plasmídeo pK18mobsacB_prpD1_P272L compreende, assim como o plasmídeo inicial pK18mobsacB, além do gene de resistência à ka25 namicina, uma cópia do gene sacB codificador da levana sucrase do Bacillus subtilis. A expressão induzível por sacarose leva à formação de levana sucrase que catalisa a síntese do produto levana, que é tóxico para a C. glutamicum. Assim, os únicos clones que crescem no ágar LB com sacarose são aqueles nos quais o pK18mobsacB_prpD1_P272L integrado foi excisa30 do como resultado de uma segunda recombinação. Dependendo da posição do segundo evento de recombinação em relação com o sítio da mutação, a troca ou incorporação de alelos acontece quando da excisão, ou a cópia ori64 ginal permanece no cromossomo do hospedeiro.

Aproximadamente 40 a 50 colônias foram testadas para o fenótipo crescimento na presença da sacarose e nenhum crescimento na presença da kanamicina. Para 4 colônias que exibiram o fenótipo crescimento na presença da sacarose e nenhum crescimento na presença da kanamicina, uma região do gene prpD1 cobrindo a mutação P272L e se iniciando no iniciador de sequênciamento pr1-2 (corresponde à posição da sequência de nucleotídeos 424-443 da região codificadora do gene prpD1 da SEQ ID NO:1) foi sequênciada pela Agowa (Berlim, Alemanha) para demonstrar que a mutação do alelo prpD1_P272L está presente no cromossomo. O iniciador pr1-2 usado foi sintetizado pela Agowa para este propósito:

pr1-2

5' ggt ate gcc act gcc tat ga 3'

Um clone contendo a base timina na posição 815 da região codi15 ficadora do gene prpD1, e assim tem o alelo prpD1_P272L, foi identificado desta forma. Este clone é designado cepa DM416prpD1_P272L.

Exemplo 6

Comparação da produção da cepa DM416prpD1_P272L com a da cepa inicial DM416

O teste de produção da cepa DM416prpD1_P272L da C. Glutamicum obtida no exemplo 5 foi realizado como descrito no exemplo 2. O resultado do teste está representado na tabela 2.

Tabela 2

Cepa	DO (660 nm)	Lisina HCl g/l
DM416	6,2	1,40
DM416prpD1 P272L	6,2	1,64

Breve descrição da figura:

Figura 1: mapa do plasmídeo pK18mobsacB_prpD1_P272L

As abreviações e designações usadas têm os significados abaixo. Os números de pares de bases mencionados são aproximações obtidas dentro do escopo de reprodutibilidade das medições.

Kan: gene de resistência à kanamicina

EcoRI:

Pstl:

prpD1:

sacB:

RP4-mob: oriV:

sítio de divagem da enzima de restrição EcoRI sítio de divagem da enzima de restrição Pstl alelo prpD1_P272L gene sacB região mob com a origem da replicação para transferência (oriT) origem da replicação V

Claims (13)

1. REIVINDICAÇÕES

   1. Mutantes isolados de bactérias corineformes, caracterizados pelo fato de que compreendem um gene compreendendo a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 5 ou SEQ ID NO: 7 ou sequências de

   5 nucleotídeos degeneradas dos mesmos, que codifica para um polipeptídeo apresentando atividade de 2-metilcitrato desidratase, apresentando a sequência de aminoácidos de acordo com SEQ ID NO: 6.
2. 2. Mutantes de bactérias corineformes, de acordo com a reivindicação 1, caracterizados pelo fato de que as bactérias corineformes são

   10 selecionadas a partir do grupo de Corynebacterium efficiens, Corynebacterium glutamicum, Corynebacterium thermoaminogenes e Corynebacterium aminogenes, preferencialmente Corynebacterium glutamicum.
3. 3. Mutantes de bactérias corineformes, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizados pelo fato de que são bactérias secretoras

   15 de L-aminoácidos, preferencialmente bactérias secretoras de L-lisina, L-valina, L-isoleucina, L-triptofano ou L-homoserina.
4. 4. Polinucleotídeo isolado, caracterizado pelo fato de que compreende a sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 5 ou SEQ ID NO: 7 ou sequências de nucleotídeos degeneradas dos mesmos, que codifica para

   20 um polipeptídeo apresentando a sequência de aminoácidos de acordo com SEQ ID NO: 6.
5. 5. Microrganismo recombinante, caracterizado pelo fato de que compreende o polinucleotídeo isolado, como definido na reivindicação 4.
6. 6. Microrganismo recombinante, de acordo com a reivindicação 5, 25 caracterizado pelo fato de que é uma bactéria corineforme ou uma bactéria do gênero Escherichia, preferencialmente do gênero Corynebacterium, e particularmente de preferência da espécie Corynebacterium glutamicum.
7. 7. Vetor, caracterizado pelo fato de que compreende o polinucleotídeo isolado, como definido na reivindicação 4.

   30
8. 8. Microrganismo recombinante, caracterizado pelo fato de que compreende o vetor, como definido na reivindicação 7.
9. 9. Microrganismo recombinante, de acordo com a reivindicação 8,

   Petição 870170085847, de 08/11/2017, pág. 4/9 caracterizado pelo fato de que é uma bactéria corineforme ou uma bactéria do gênero Escherichia, preferencialmente e em particular preferencialmente da espécie Corynebacterium glutamicum.
10. 10. Processo para produzir L-lisina, caracterizado pelo fato de que:

    (a) uma bactéria corineforme, como definida na reivindicação 3, 6 ou 9, e é fermentada em um meio apropriado, e (b) o L-aminoácido é acumulado no caldo de fermentação ou nas células da bactéria.
11. 11. Processo, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que L-lisina é isolada ou coletada junto com constituintes do caldo de fermentação e/ou da biomassa (> 0 a 100%), ou que:

    (a) a biomassa formada é removida em uma quantidade de 0 a 100% do caldo de fermentação obtido na etapa (b), como definida na reivindicação 10, e (b) um produto substancialmente seco e moldado é produzido, por um método selecionado a partir do grupo de granulação, compactação, secagem por pulverização e extrusão, do caldo obtido na etapa (a).
12. 12. Processo, de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que um ácido selecionado a partir do grupo de ácido sulfúrico, ácido clorídrico e ácido fosfórico é adicionado ao caldo de fermentação antes ou após a etapa (a), ou sendo que a água é removida do caldo resultante antes da ou na etapa (a), ou sendo que o produto moldado obtido em ou durante a etapa (b) é borrifado com um óleo.
13. 13. Processo, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que as seguintes etapas são realizadas:

    (a) filtração do caldo de fermentação, preferencialmente com um filtro de membrana, para resultar em um sedimento contendo biomassa e um filtrado, (b) concentração do filtrado, preferencialmente de maneira a resultar em um teor de sólidos de 48 a 52% por peso, (c) granulação do concentrado obtido na etapa (b),

    Petição 870170085847, de 08/11/2017, pág. 5/9 preferencialmente a uma temperatura de 50°3 a 62C, e (d) revestimento dos grânulos obtidos na etapa (c) com um ou mais agentes de revestimento.

    Petição 870170085847, de 08/11/2017, pág. 6/9

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