BRPI0719005A2 - Micro-organismos indutores de imunidade celular específica para carboidratos e frações dos mesmos - Google Patents

Micro-organismos indutores de imunidade celular específica para carboidratos e frações dos mesmos Download PDF

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BRPI0719005A2
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carbohydrate epitope
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Steffen Goletz
Philippe Ulsemer
Anja Loeffler
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Glycotope Gmbh
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Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "MICRO- ORGANISMOS INDUTORES DE IMUNIDADE CELULAR ESPECÍFICA PARA CARBOIDRATOS E FRAÇÕES DOS MESMOS".
CAMPO DA INVENÇÃO A presente invenção refere-se ao campo da prevenção e do tra-
tamento de doenças caracterizadas pela ocorrência de certos epitopos de carboidratos. A invenção proporciona nutracêuticos e composições farma- cêuticas compreendendo um micro-organismo positivo para o epitopo de carboidrato e frações dos mesmos que induzem uma resposta imunocelular carboidrato-específica eficaz contra células e doenças carboidrato-positivas. Ademais, ela proporciona métodos para a seleção, o isolamento e a identifi- cação de micro-organismos carboidrato-positivos apropriados como parte eficaz do nutracêutico ou da composição farmacêutica. Ela proporciona mé- todos para a geração de células dendríticas e linhagens de células dendríti- cas carboidrato-específicas assim como células T, clones de células T e li- nhagens de células T carboidrato-específicas. A invenção proporciona ainda formulações e métodos para a profilaxia e tratamento de doenças associa- das a certos epitopos de carboidratos.
ANTECEDENTES DA INVENÇÃO Antígenos de carboidratos ocorrem com freqüência em combi-
nação com doenças humanas. Por exemplo, a glicosilação aberrante é uma característica distintiva das células cancerosas, criadora assim de novas es- truturas de carboidrato que estão ausentes ou raramente presentes em célu- las humanas normais. Acreditava-se que essas estruturas de carboidratos eram candidatas adequadas para a geração de vacinas tumorais, mas os carboidratos são por si mesmos estruturas pobremente imunogênicas classi- ficadas como antígenos independentes das células T. Portanto, o desenvol- vimento de vacinas focou a geração de vacinas antitumorais sintéticas base- adas em carboidratos nas quais os epitopos de carboidratos são acoplados a estruturas transportadorasas potencializadoras de imunidade, proteínas naturais ou oligopeptídeos (tais como a MUC1) e combinados com adjuvan- tes adicionais para a indução de uma resposta imune e especialmente para a indução de uma resposta imunocelular. Os polissacarídeos são ligados a polipeptídeos imunogênicos tais como o toxioide tetânico ou diftérico, KLH ou epitopos T auxiliares de maneira a alterar a resposta imune de células de T-independente para T-dependente, gerando assim memória imunológica. A produção de tais vacinas é extraordinariamente difícil e dispendiosa. Além disso, tais vacinas representam antígenos não-naturais ou artificiais com efeitos colaterais desconhecidos ou adversos.
Até recentemente, acreditava-se que os carboidratos não eram apresentados pelas células apresentadoras de antígenos (por exemplo, célu- Ias dendríticas) às células imunes efetoras e que eles não mediavam respos- tas imunes das células T.
Hoje, alguns relatos mostram que carboidratos complexos não são removidos durante o processamento de glicoproteínas pelas células a- presentadoras de antígenos e podem ser apresentados a células restritas ao complexo principal de histocompatibilidade Il junto com o peptídeo.
No caso do antígeno MUC1, puderam ser demonstradas a inter- nalização, o processamento e a apresentação de glicopeptídeos em células dendríticas. MUC1 carregando carboidratos curtos sialilados induziu a ativa- ção e a maturação de células dendríticas fenotipicamente similares àquelas induzidas por LPS bacteriano, não tendo, assim, especificidade, mas essas DCs não foram capazes de induzir uma resposta imune do tipo Th1 após cocultivo com células T CD4+ alogênicas ou respostas citotóxicas CD8 (Car- los et al. (2005) J Immunol 175:1628-1635).
Peptídeos derivados da MUC1 O-glicosilados com um epitopo Tn induzem imunogenicidade celular em camundongos, mas a imunização com células dendríticas carregadas com glicopeptídeos não apresentou efei- to imunoterapêutico, nenhuma Iise seletiva de linhagens celulares murinas expressando MUC1 humana e os LTCs apresentaram reatividade cruzada entre formas glicosiladas e não-glicosiladas dos mesmos peptídeos, não sendo portanto a resposta imune nem eficaz, nem CH-específica (Stepensky et al. (2005) Clin Exp Immunol 143:139-149).
A MUC1 associada ao câncer que carrega curtas porções de açúcares de mono a tetrassacarídeos (tais como os antígenos tumorais Tn1 TF, S-Tn e S-TF) pode até mesmo induzir a supressão da resposta das célu- las T humanas (Agrawal et al. Nat Med 1998 Jan; 4(1 ):43-9).
A glicosilação bacteriana é completamente diferente da glicosi- lação eucariótica devido a um diferente perfil de enzimas envolvido no me- canismo de glicosilação. A maioria dos polissacarídeos das bactérias são polissacarídeos negativamente carregados que claramente falham em ativar as células T e, portanto, são geralmente classificados como antígenos de tipo 2 independentes das células T. Mais recentemente, relatou-se que po- Iissacarideos zwitteriônicos capsulares de algumas bactérias possuem a ca- pacidade de ativar células T CD4+. Entretanto, a restrição a MHCII dos po- lissacarídeos zwitteriônicos não está esclarecida e as células T são ativadas de uma maneira policlonal que não é antígeno-específica ou epitopo- específica, mas demonstra um uso amplo de νβ e reatividade cruzada, apa- rentemente semelhante à ativação ampla induzida por mitógenos (Cobb e Kasper, Cell Microbiol 2005; Eyon, Zenewicz, Flavell, Cell1 2005).
Ademais, carboidratos e antígenos carboidratos são em geral reconhecidos como imunogênicos fracos.
A imunidade do tipo Th 1 é considerada importante e necessária na rejeição de tumores e para elicitar respostas imunes potentes em várias doenças (Kobayashi et al., 1998, J Immunol. 160: 5869-5873). Foi demons- trado que alguns carboidratos de tumores curtos podem ser apresentados e reorganizados junto com certos aminoácidos como motivos de ligação ne- cessários combinados (as combined necessary binding motifs). Entretanto, isso não leva a uma resposta imune do tipo Th1. Em contraste, no caso da MUC1, a MUC1 desialilada (que apresenta porções de acúcares curtas tais como Tn ou TF) falha em induzir a produção de citocinas pelas células T e, assim, não há ativação das células T; no caso de açúcares sialilados, ocorre a indução da secreção de citocinas tais como a alfa-TNF junto com IL-6, que estão ligadas à metástase tumoral, à progressão tumoral e a um prognóstico ruim, assim, há falaha na ativação da resposta Th1 necessária e acredita-se haver uma conexão com o fato de o tumor escapar às respostas imunes (Carlos et al., J. Immunol.).
Este estado atual da técnica nos ensina que moléculas naturais que compreendem antígenos tumorais carboidratos humanos não são capa- zes de induzir uma imunidade celular tipo Th1 e citotóxica potente dirigida contra epitopos de carboidratos e que polissacarídeos de bactérias, particu- larmente os polissacarídeos capsulares, não são capazes de induzir respos- tas imunes antígeno-específicas.
Portanto, o uso dessas moléculas de carboidratos não seria a- dequado em abordagens com vacinas tumorais usando (i) células dendríti- cas para a apresentação dos antígenos carboidratos que não induziriam uma resposta imune citotóxica potente quando administradas em seres hu- manos e não seriam adequadas em abordagens com vacinas tumorais u- sando (ii) APCs tais como DCs para a apresentação dos antígenos carboi- dratos para a geração de células T antígeno-específicas em uma resposta tipo Th1 em uma terapia adotiva com células T nos pacientes.
Contudo, devido à importância dos antígenos carboidratos no desenvolvimento de doenças patológicas tais como o câncer, seria vantajoso obter meios de induzir uma resposta imunocelular carboidrato-específica eficaz.
O objetivo da presente invenção é proporcionar os meios res-
pectivos.
DESCRIÇÃO
De maneira a superar as desvantagens supramencionadas da técnica, a presente invenção proporciona os meios para a indução de uma resposta imunocelular carboidrato-específica eficaz contra um epitopo ou epitopos de carboidrato presente(s) em uma molécula de uma célula huma- na ou animal associada a uma doença do respectivo ser humano ou animal.
Até onde se sabe, essa surpreendente descoberta é o primeiro relato sobre a indução de uma resposta imune de tipo Th1 carboidrato- específica induzida por uma molécula natural.
De maneira ainda mais surpreendente, demonstrou-se pela pri- meira vez que uma resposta imune de tipo Th1 carboidrato-específica e uma resposta imune citotóxica das células T podem ser induzidas pela adminis- tração de quantidades adequadas de pelo menos um micro-organismo que expresse um epitopo de carboidrato (ou pelo menos uma fração do mesmo) associado com uma doença humana ou animal.
O uso de bactérias que em geral habitam o trato gastrointestinal
de seres humanos resulta em um agente profilático e terapêutico que não causa efeitos colaterais indesejados. A natureza de carboidrato é responsá- vel pela ausência de tolerogenicidade relevante e por não se apresentarem reações alérgicas relevantes. Uma vez que a glicosilação em micro-organismos é completa-
mente diferente da glicosilação em seres humanos ou animais, foi surpreen- dente que os micro-organismos proporcionados e obteníveis pela presente invenção tenham expressado um epitopo de carboidrato "humano" (ou parte dele) como ocorre na superfície de uma célula humana ou como é produzida em uma célula humana e que este antígeno humano ou parte dele seja a- presentado por células dendríticas após carregamento com os micro- organismos mencionados e induza uma reposta imunocelular eficaz contra o antígeno carboidrato mencionado que pode, no sentido da invenção, tam- bém ser ou compreender uma resposta imunocelular eficaz contra estruturas de carboidratos, conjugados de carboidratos ou uma célula de mamífero compreendendo o dito epitopo de carboidrato. Essas células dendríticas car- regadas são funcionalmente ativas e estimulam e ativam células T.
Mais surpreendentemente, essa resposta imune também é car- boidrato-específica e é, por exemplo, não predominantemente disparada pela seqüência de peptídeos subjacente.
Um aspecto importante da presente invenção é que o micro- organismo carboidrato-positivo é reconhecido por pelo menos uma molécula de ligação carboidrato, tal como, por exemplo, um anticorpo específico para o epitopo de carboidrato. Portanto, o micro-organismo carboidrato-positivo sofre ligação especificamente por um anticorpo específico para o epitopo de carboidrato quando posto em contato com o anticorpo mencionado. A estru- tura de carboidrato é assim acessível para o anticorpo específico para o dito epitopo de carboidrato no micro-organismo carboidrato-positivo da presente invenção e não é "ocultado" por outras estruturas. Essa importante caracte- rística, que pode ser determinada por meio de teste — testes adequados são descritos abaixo — garante que o micro-organismo carboidrato-positivo, e/ou a fração ou Iisado carboidrato-positivo do mesmo, carrega o epitopo de car- boidrato de interesse e é, assim, pelo menos imunoquimicamente quase i- dêntico ao epitopo de carboidrato de interesse e não um epitopo meramente similar ao epitopo de carboidrato de interesse. Essa característica é impor- tante para garantir que uma resposta imune seja disparada pelo micro- organismo carboidrato-positivo mencionado seja suficientemente específica para o epitopo de carboidrato de interesse. Tais anticorpos específicos para epitopos de carboidratos, que podem ser usados para determinar que um micro-organismo carrega o epitopo de carboidrato de interesse, reconhecem especificamente o epitopo de carboidrato em uma área com tumor relevante, por exemplo, e, portanto, de ocorrência natural. Isso garante ainda mais que o micro-organismo carrega o epitopo de carboidrato de interesse em uma forma que dispara a resposta imune desejada.
Os anticorpos específicos para epitopos de carboidratos podem, de acordo com isso, ser usados para determinar que os micro-organismos carboidrato-positivos da presente invenção carregam estruturas de carboi- dratos que mimetizam o epitopo de carboidrato de interesse como presente em tumores, por exemplo. Essa característica — especificidade para epito- pos de carboidratos — é decisiva para a capacidade do micro-organismo da presente invenção de disparar a resposta imune desejada. Devido ao fato dos micro-organismos da presente invenção se-
rem realmente carboidrato-positivos e serem selecionados de acordo com isso — o que pode ser determinado/realizado mediante o uso de anticorpos específicos para epitopos de carboidratos — a invenção proporciona micro- organismos carboidrato-positivos que induzem ou aumentam uma resposta imuno específica e, assim, potente, contra o epitopo de carboidrato de inte- resse. Como indicado acima, o dito epitopo de carboidrato é preferivelmente um epitopo de carboidrato humano e, portanto, um epitopo de carboidrato encontrado em ou apresentado por uma célula humana. A formulação da presente invenção ativa o sistema imune em uma maneira tumor-específica mediante a indução de altos níveis de anticorpos contra epitopos de carboi- dratos específicos. Até onde se sabe, a presente invenção é o primeiro aditi- vo alimentar/nutracêutico ou farmacêutico capaz de ativar um escudo imuno específico contra tumores e o primeiro aditivo alimentar capaz de induzir uma resposta imuno específica a um carboidrato e, em particular, uma res- posta imuno específica para o antígeno tumoral Core-1.
De acordo com uma modalidade, a invenção proporciona um método para identificar um micro-organismo carboidrato-positivo de acordo com a presente invenção, micro-organismo o qual é assim capaz de disparar uma resposta imuno específica.
Portanto, um método para isolar uma mistura de micro- organismos um micro-organismo carboidrato-positivo que carrega um epito- po de carboidrato de interesse preferivelmente humano, compreendendo:
(a) colocação em contato entre uma molécula de ligação carboi- drato específica para o epitopo de carboidrato de interesse e uma mistura de micro-organismos, e
(b) isolamento, da mistura mencionada, de pelo menos um mi- cro-organismo ligado à molécula de ligação carboidrato mencionada,
(c) opcionalmente, testagem para demonstrar que o micro- organismo isolado é um micro-organismo carboidrato-positivo mediante tes- tagem do micro-organismo isolado para ligação específica à molécula de ligação carboidrato mencionada.
Este método de seleção permite a identificação de micro-
organismos que carregam o epitopo de carboidrato de interesse e são, as- sim, componentes apropriados para as formulações de acordo com a pre- sente invenção. Como delineado acima, o dito epitopo de carboidrato é pre- ferivelmente um epitopo de carboidrato humano tal como, por exemplo, um marcador tumoral.
Como torna-se claro através dos exemplos, existem diversos e- pitopos de carboidrato que estão associados a doenças e em particular ao câncer (ver, por exemplo, a tabela 1). Além disso, há também moléculas de ligação conhecidas que se ligam especificamente aos epitopos de carboidra- tos mencionados de interesse (ver tabela 2). Ademais, métodos para a gera- ção de moléculas de ligação a carboidratos específicos para o epitopo de carboidrato de interesse também são descritos aqui.
De acordo com uma modalidade preferida, o método menciona- do compreende adicionalmente a testagem da indução de uma resposta i- munocelular carboidrato-específica eficaz e/ou resposta imune-humoral efi- caz contra o dito epitopo de carboidrato pelo micro-organismo mencionado e/ou fração e/ou Iisado do mesmo in vivo ou in vitro. De acordo com essa modalidade preferida, o micro-organismo carboidrato-positivo mencionado induz ou aumenta uma resposta imune contra o epitopo de carboidrato de interesse em pelo menus um ser humano ou animal que reconhece o epito- po de carboidrato de interesse e/ou a célula tumoral positiva para o dito epi- topo de carboidrato. Devido ao fato de que o micro-organismo é positivo pa- ra o epitopo de carboidrato de interesse, uma resposta imune contra o epito- po de carboidrato de interesse é induzida/aumentada após administração do micro-organismo identificado. Assim, estabelece-se um mecanismo de vigi- lância imune que pode, por exemplo, eliminar células tumorais recémsurgi- das que carregam o epitopo de carboidrato de interesse, impedindo assim o crescimento tumoral primário e/ou fortalece o sistema imune e/ou melhora uma resposta imune.
Portanto, de acordo com uma modalidade preferida, a etapa (d) compreende a testagem da indução de uma resposta imunocelular carboi- drato-específica eficaz contra o dito epitopo de carboidrato pelo micro- organismo carboidrato-positivo e/ou fração e/ou Iisado do mesmo para a ati- vação de células T de tipo Th1 CD4-positivas e/ou para a ativação de células T CD8-positivas citotóxicas, preferivelmente em pelo menos um animal ou humano e/ou in vitro. De acordo com uma modalidade, o teste de resposta imunocelu-
lar mencionado realizado na etapa (d) compreende
i) Carregamento de pelo menos uma célula dendrítica com a cé- lula carboidrato-positiva identificada nas etapas (a) a (c);
ii) colocação em contato entre uma quantidade apropriada de pelo menos uma célula dendrítica mencionada carregada com o micro- organismo carboidrato-positivo mencionado e de quantidade adequada de
células imunes que podem ser ativadas ou inibidas por uma célula dendríti- ca;
iii) cultivo de maneira a permitir a interação das células imunes mencionadas com as células dendríticas carregadas mencionadas;
iv) adição de uma quantidade apropriada de células apresenta- doras de antígenos (APCs) carregadas com uma quantidade apropriada de
pelo menos um segundo composto veículo do mesmo epitopo de carboidrato que o micro-organismo carboidrato-positivo, sendo o segundo composto mencionado diferente do micro-organismo carboidrato-positivo;
v) cultivo para re-estimulação das células imunes mencionadas; vi) confirmação da ocorrência da re-estimulação das células i-
munes.
Mediante a realização desse teste de resposta celular é possível confirmar se um determinado epitopo de carboidrato presente no micro- organismo carboidrato-positivo mencionado é capaz de disparar uma res- posta imunocelular. Até agora, a técnica anterior assumia que os carboidra- tos eram incapazes de disparar uma resposta imunocelular. Contudo, agora descobriu-se que certos epitopos de carboidratos são capazes de disparar uma resposta imunocelular. É, assim, importante proporcionar sistemas de teste para se determinar se um micro-organismo carboidrato-positivo identifi- cado pelo método da presente invenção é de fato capaz de disparar uma resposta celular respectiva, confirmando-se desta maneira se o dito micro- organismo é apropriado, por exemplo, para uma terapia. O teste mencionado usa células dendríticas uma vez que as células dendríticas são capazes de iniciar e, assim, estimular células imunes tais como as células T. As células dendríticas processam os compostos que encontram e apresentam os com- postos/antígenos processados em sua superfície. Entretanto, células de MHC tais como as células dendríticas podem apresentar apenas certos tipos de antígenos e é importante determinar se o antígeno/epitopo de interesse pode ser apresentado pelas células dendríticas, uma vez que apenas tais antígenos/epitopos são capazes de disparar uma resposta imunocelular.
As células dendríticas são, portanto, carregadas com o micro- organismo carboidrato-positivo identificado nas etapas (a) a (c). Condições apropriadas para o carregamento são aqui descritas.
As células dendríticas carregadas mencionadas são então pos- tas em contato com células imunes, em particular linfócitos tais como as cé- lulas T. As células imunes podem ser obtidas, por exemplo, de doadores φ 10 humanos. As células dendríticas que apresentam antígenos corresponden- tes aos receptores das células imunes ativam e assim estimulam os linfóci- tos, permitindo, dessa maneira, que eles proliferem e sobrevivam. Os linfóci- tos que não correspondem aos antígenos apresentados pelas células den- dríticas não são ativados e morrem. A primeira rodada de estimulação proporciona linfócitos ativados
que são específicos para qualquer antígeno correspondente apresentado pelas células dendríticas carregadas mencionadas. Entretanto, o objetivo da presente etapa é identificar se o micro-organismo carboidrato-positivo pode estimular uma resposta celular específica para o epitopo de carboidrato. Uma etapa de seleção é portanto realizada na qual os linfócitos
^ são re-estimulados de maneira a se determinar se o epitopo de carboidrato
do micro-organismo carboidrato-positivo estimula os linfócitos e, assim, dis- para uma reposta celular. Na etapa de seleção mencionada, células apre- sentadoras de antígenos tais como, por exemplo, células dendríticas, são carregadas com um segundo composto que também carrega o carboidrato de interesse. Contudo, o segundo composto mencionado é diferente do mi- cro-organismo carboidrato-positivo. Esse segundo composto também é pro- cessado pelas APCs e os antígenos são apresentados pelas APCs mencio- nadas. Uma vez que o segundo composto é diferente do micro-organismo carboidrato-positivo, a maioria dos antígenos apresentados, preferivelmente todos os antígenos — além do carboidrato de interesse — são diferentes dos antígenos apresentados na primeira rodada. Isso tem o efeito de fazer com que sobrevivam à segunda rodada de re-estimulação apenas aqueles linfócitos que encontram um antígeno correspondente apresentado pelas APCs. Caso as células dendríticas da primeira rodada assim como as APCs da segunda rodada apresentem ambas um antígeno compreendendo ou consistindo do epitopo de carboidrato de interesse, os linfócitos que reco- nhecem o antígeno mencionado são estimulados e assim sobrevivem à me- dida que também são re-estimulados. Os linfócitos que não encontram um parceiro correspondente quando em contato com as APCs mencionadas carregadas com o segundo composto veículo do epitopo de carboidrato de interesse morrem devido à falta de re-estimulação. Esta etapa de seleção garante que uma resposta celular contra o carboidrato de interesse seja de- tectada.
Modalidades adicionais no que se refere aos sistemas de teste proporcionados que podem ser usados em conjunção com a presente inven- ção são descritas nas reivindicações e no que segue.
Os micro-organismos carboidrato-positivos identificados pelo método mencionado que possuem as características e vantagens descritas e podem se usados na formulação de acordo com a presente invenção. A for- mulação de acordo com a presente invenção pode ser usada para fins profi- láticos e/ou terapêuticos e/ou no suporte às atividades imunológicas.
A invenção também proporciona formulações que podem ser usadas como composições farmacêuticas e como nutracêuticos e podem induzir as respostas imunes contra os epitopos de carboidrato em células humanas e de animais ou contra uma doença por uma série de diferentes vias de administração, incluindo a administração sistêmica tal como, sem limitação a, administração intraperitoneal, intravenosa, intradermal, subcutâ- nea mas, ainda mais surpreendentemente, por administração por via oral, mediando uma resposta imune sistêmica mesmo quando administrando os micro-organismo ou frações do mesmo por via oral. Uma formulação da invenção é uma nutracêutico ou composição
farmacêutica que compreende pelo menos um micro-organismo que sofre ligação especificamente de pelo menos uma molécula de ligação carboidrato que se liga a um epitopo de carboidrato presente em uma molécula de uma célula humana ou animal, ou a uma fração ou Iisado da mesma, sendo que o dito micro-organismo (ou uma fração ou Iisado do mesmo) da formulação mencionada, ou do nutracêutico mencionado ou da composição farmacêuti- ca mencionada, induz uma resposta imunocelular carboidrato-específica efi- caz contra o antígeno carboidrato mencionado em pelo menos um animal ou humano, preferivelmente uma resposta citotóxica das células T.
Em uma modalidade da invenção, a formulação da presente in- venção pode ser um nutracêutico e proporciona os meios para a indução de um escudo imuno específico contra doenças associadas a certos epitopos de carboidratos ou antígenos carboidratos. Isso ocorre em contraste com probióticos e pré-bióticos convencionais, que resultam não em respostas imunes antígeno-específicas, mas em uma indução inespecífica e geral do sistema imune. O uso da formulação da presente invenção como um nutra- cêutico apresenta diversas vantagens em comparação com as estratégias de vacinação convencionais. Uma delas é a conveniência para o paciente ou para a pessoa que a utiliza. A imunoestimulação é específica para o epitopo de carboidrato ou para o antígeno e pode até mesmo ser induzida bem antes do estabelecimento da doença ou tumor, formando um escudo imuno espe- cífico de maneira a prevenir, inibir ou reduzir o desenvolvimento de tais do- enças ou para ser usada em combinação com outras terapias da doença. Assim, terapias agressivas (tais como quimioterapia, radioterapia ou cirurgia) com efeitos colaterais graves podem ser evitadas. Em uma modalidade pre- ferida, o indivíduo não precisa necessariamente ir a um médico para seguir ativamente a profilaxia da doença, mas pode obter a formulação necessária incorporada em um alimento, diminuindo assim a barreira psicológica contra outras possibilidades de prevenção.
As composições farmacêuticas da invenção também têm a van- tagem de poderem ser direcionadas contra doenças que representam impor- tantes necessidades médicas nas quais carboidratos ou marcadores de car- boidratos possuem importante papel.
Sem pretender ser limitadores, exemplos de tais doenças e os epitopos de carboidratos associados estão listados na tabela 1.
Doença Epitopo de carboidrato Melanoma GM2, GD2, GDL3, GD3, 9-0-acetil GD2, 9-0-acetil GD3 Linfoma de células B GM2, GD2 Câncer de pequenas céluas do pulmão GM2, GM1 fucosila, Globo H, ácido po- lissiálico, sLe a (sialil-Lewis a) Câncer de mama GM2, Globo H, TF, Core-1, Galbetal- 3GalNAc-, Le y (Lewis-Y) Câncer de próstata GM2, Globo Η, Tn, sTn, Le y, sLe a, Co- re-1 Câncer de pulmão GM2 Globo H, Le y, Core-1 Câncer de cólon GM2, sTn, TF1 Le y, Core-1 Câncer de ovário GM2, Globo H1 sTn, TF, Le y, Core-1 Câncer de estômago GM2, Le y, Le a, sLe a, Core-1 Neuroblastoma GM2, GD2, GD3L, ácido polissiálico Sarcoma GM2, GD2, GD3L, GD3 Câncer de pâncreas sLe a, sLe χ (síalil Lewis x) Cânceres gastrointestinais sLe a, sLe χ Neoplasis Cd4+ DC 56+ sLe χ (CD15)
Contudo, o epitopo de carboidrato pode também ser apropriado para outras indicações, tais como, sem limitação a, TF para o câncer de pulmão, câncer de fígado, câncer de estômago, câncer de rim, câncer de próstata e Core-1 para câncer de rim e de fígado.
Surpreendentemente, a formulação da presente invenção age como um mecanismo de vigilância imune contra doenças ou células tumo- rais caboidrato-positivas após administração em um ser humano ou animal. Ela induz ou aumenta uma resposta imune epitopo carboidrato-específica em seres humanos ou animais que previne ou reduz a ocorrência de doen- ças ou células tumorais caracterizadas pela expressão do antígeno carboi- drato aplicado no humano ou animal.
A formulação da presente invenção induz altas titulações de an- ticorpos anticarboidratos específicos e/ou, ainda mais surpreendentemente, uma resposta imune ceular carboidrato-específica eficaz que reconhece o antígeno carboidrato ou as estruturas de carboidrato, conjugados de carboi- drato ou uma célula de mamífero compreendendo o dito epitopo de carboi- drato. Micro-organismos carboidrato-positivos apropriados podem ser identi- ficados com os métodos de seleção e sistemas de teste aqui descritos.
Devido à natureza biológica da formulação, sua produção é me- nos dispendiosa e requer menos tempo do que a produção de formulações imunoterapêuticas convencionais.
Surpreendentemente, a formulação da presente invenção tem propriedades adjuvantes internas. Assim, adjuvantes adicionais ou veículos imunopotenciadores não são necessários em todos os casos. A) Nutracêuticos e composições farmacêuticas
A presente invenção proporciona uma formulação selecionada do grupo compreendendo composições nutracêuticas e farmacêuticas, com- preendendo pelo menos um micro-organismo carboidrato-positivo reconhe- cido e que assim sofre ligação quando em contato com pelo menos uma mo- lécula de ligação carboidrato que reconhece especificamente um epitopo de carboidrato presente em uma molécula de uma célula humana ou animal, ou uma fração ou um Iisado da mesma, sendo que o dito micro-organismo, a fração mencionada ou o Iisado mencionado ou a formulação mencionada que os compreende induz uma resposta imunocelular carboidrato-específica eficiente contra o dito epitopo de carboidrato e/ou estrutura de carboidrato, conjugado de carboidrato ou célula de mamífero compreendendo o dito epi- topo de carboidrato.
Um importante aspecto da presente invenção é que o micro- organismo carboidrato-positivo e/ou o Iisado ou fração carboidrato-positiva do mesmo é reconhecido por pelo menos uma molécula de ligação carboi- drato, preferivelmente um anticorpo específico para o epitopo de carboidrato. Assim, o o micro-organismo carboidrato-positivo e/ou o Iisado ou fração car- boidrato-positiva do mesmo é sofre ligação especificamente da molécula de ligação carboidrato quando posto em contato com a molécula de ligação carboidrato mencionada. Desta maneira, uma estrutura de carboidrato simi- lar ou idêntica ao epitopo de carboidrato de interesse, que é preferencial- mente um epitopo de carboidrato humano, é assim acessível para a molécu- la de ligação carboidrato mencionada no micro-organismo carboidrato- positivo da presente invenção e não é "ocultada" por outras estruturas. Essa importante característica, que pode ser determinada mediante testagem— testes apropriados são descritos abaixo — garante que o micro-organismo carboidrato-positivo e/ou o Iisado ou fração carboidrato-positiva do mesmo carrega o epitopo de carboidrato de interesse e é, dessa forma, pelo menos imunoquimicamente quase idêntico ao epitopo de carboidrato de interesse e não um epitopo meramente similar ao epitopo de carboidrato de interesse. Essa característica é importante para garantir que uma resposta imune dis- parada pelo micro-organismo carboidrato-positivo mencionado seja suficien- temente específica para o epitopo de carboidrato de interesse. Tal molécula de ligação carboidrato, que pode ser usada para determinar que um micro- organismo carrega o epitopo de carboidrato de interesse, reconhece especi- ficamente o epitopo de carboidrato, por exemplo, em uma área com tumor relevante. Também compreendidos estão micro-organismos que não são naturalmente carboidrato-positivos, mas podem ser convertidos em micro- organismos carboidrato-positivos mediante tratamento químico, tal como, por exemplo, um tratamento com periodato. Os micro-organismos respectivos podem ser usados, por exemplo, após o tratamento com periodato (revelan- do o Core-1), como componentes das formulações da presente invenção se forem, devido ao tratamento químico, então reconhecidos pelas moléculas de ligação a carboidratos e forem, assim, convertidos em micro-organismos carboidrato-positivos.
Em uma modalidade preferida da presente invenção, a indução mencionada da resposta imunocelular carboidrato-específica eficaz mencio- nada ocorre em pelo menos um ser humano ou animal.
Em outra modalidade preferida da invenção, a indução mencio- nada da resposta imunocelular carboidrato-específica eficaz mencionada é realizada in vitro.
Em uma modalidade preferida da invenção, a resposta imunoce- lular carboidrato-específica eficaz mencionada compreende a ativação de células T CD4-positivas de tipo Th1 e/ou a ativação de células T citotóxicas CD8-positivas direcionadas contra o dito epitopo de carboidrato e/ou uma estrutura de carboidrato, conjugado de carboidrato ou uma célula de mamí- fero compreendendo o dito epitopo de carboidrato.
Em uma modalidade preferida da invenção, a resposta imunoce- Iular carboidrato-específica eficaz mencionada compreende a ativação de células T CD4-positivas de tipo Th1 e a ativação de células T citotóxicas CD8-positivas direcionadas contra o dito epitopo de carboidrato e/ou uma estrutura de carboidrato, conjugado de carboidrato ou uma célula de mamí- fero compreendendo o dito epitopo de carboidrato. A presente invenção proporciona formulações compreendendo
micro-organismos que apresentam epitopos de carboidratos humanos ou animais e/ou Iisados e/ou frações dos mesmos que induzem uma resposta imune epitopo carboidrato-específica eficaz, mais preferivelmente uma res- posta imunocelular carboidrato-específica eficaz e, ainda mais preferivel- mente, a resposta imunocelular mencionada compreende a ativação de célu- las T auxiliares Th1 e células T citotóxicas.
Em uma modalidade preferida, a presente invenção proporciona uma formulação selecionada do grupo compreendendo um nutracêutico e uma composição farmacêutica compreendendo pelo menos um micro- organismo que sofre ligação especificamente de uma molécula de ligação carboidrato que se liga a um epitopo de carboidrato presente em uma molé- cula de uma célula humana ou animal ou uma fração ou um Iisado da mes- ma, sendo que o dito micro-organismo ou uma fração ou um Iisado do mes- mo, ou a formulação mencionada, o nutracêutico mencionado, ou a compo- sição farmacêutica mencionada, induz uma resposta imunocelular carboidra- to-específica eficaz contra o dito epitopo de carboidrato e/ou uma estrutura de carboidrato, conjugado de carboidrato ou uma célula de mamífero com- preendendo o dito epitopo de carboidrato.
Em outra modalidade preferida, a invenção proporciona um nu- tracêutico compreendendo pelo menos um micro-organismo que carrega ou apresenta pelo menos um epitopo de carboidrato humano ou animal e/ou Iisados e/ou frações do mesmo que induzem uma resposta imune epitopo carboidrato-específica eficaz contra o dito epitopo de carboidrato ou uma estrutura de carboidrato, conjugado de carboidrato ou uma célula de mamí- fero compreendendo o dito epitopo de carboidrato; ainda mais preferível men- te a resposta imunocelular mencionada compreende a ativação de células T auxiliares Th1 e células T citotóxicas.
Preferivelmente, a composição farmacêutica da presente inven- ção é usada para impedir ou reduzir a ocorrência de células patológicas que expressam o epitopo de carboidrato humano ou animal e/ou prevenir ou re- duzir a disseminação ou metástase das células mencionadas, tais como, sem limitação a, células tumorais ou células cancerosas que expressam ou compreendem o epitopo de carboidrato humano ou animal.
Em outra modalidade da invenção, a composição farmacêutica é usada para tratar uma doença ou tumor que expressa o epitopo de carboi- drato humano ou animal. Em uma modalidade preferida da invenção, o nutracêutico ou a
composição farmacêutica da presente invenção é usada como uma vacina contra células ou doenças caracterizadas pela ocorrência do epitopo de car- boidrato ou uma parte do mesmo que medeia a especificidade.
As doenças ou tumores menciondos que estão associados com expressam o epitopo de carboidrato estão listados em outra parte deste.
A formulação farmacêutica da invenção compreende pelo me- nos um micro-organismo carboidrato-positivo e um veículo farmaceuticamen- te aceitável. A preparação e a administração de uma formulação desta in- venção (por exemplo, um fármaco compreendendo um micro-organismo carboidrato-positivo) está em concordância com as técnicas conhecidas. Por exemplo, a formulação pode ser combinada com adjuvantes galênicos con- vencionais para formar uma composição apropriada para o método desejado de aplicação. Por exemplo, os compostos desta invenção podem ser empre- gados em mistura com excipientes convencionais, isto é, substâncias veícu- Ioas orgânicas ou inorgânicas farmaceuticamente aceitáveis apropriadas para aplicação parenteral ou enteral que não reajam de maneira deletéria com os compostos ativos. Veículos farmaceuticamente aceitáveis apropria- dos incluem, sem limitação a, água, soluções salinas, álcoois, óleos vege- tais, polietilenoglicóis, gelatina, lactose, amilose, estearato de magnésio, pa- rafina viscosa, óleo aromatizante, monoglicerídeos e diglicerídeos de ácidos graxos, pentaeritrol, ésteres de ácidos graxos, hidroximetilcelulose, polivinil- pirrolidona, talco, etc.
O nutracêutico ou composição farmacêutica da presente inven- ção pode ser administrado a um ser humano ou animal por diferentes vias de aplicação ou administração. As vias preferidas de administração no senti- do da invenção estão descritas em outra parte deste. Em uma modalidade preferida da invenção, o nutracêutico ou
composição farmacêutica é aplicado oralmente em um ser humano ou ani- mal.
A invenção proporciona uma formulação selecionada do grupo compreendendo um nutracêutico e uma composição farmacêutica compre- endendo pelo menos um micro-organismo que sofreu ligação de pelo menos uma molécula de ligação carboidrato que reconhece especificamente um epitopo de carboidrato presente em uma molécula de uma célula humana ou animal, ou uma fração ou um Iisado da mesma, sendo que o dito micro- organismo ou a fração ou Iisado mencionado ou a formulação mencionada que os compreende induz uma resposta imunocelular carboidrato-específica eficaz contra o dito epitopo de carboidrato em pelo menos num animal ou humano. Assim, em qualquer outra parte deste, uma resposta imune contra um epitopo de carboidrato também significa uma resposta imune contra uma estrutura de carboidrato, conjugado de carboidrato ou uma célula de mamí- fero compreendendo o dito epitopo de carboidrato.
Em uma modalidade preferida, a formulação mencionada induz ou aumenta uma resposta imuno específica contra o dito epitopo de carboi- drato em um ser humano ou animal.
Em uma modalidade preferida, a formulação mencionada induz ou amenta uma resposta imuno específica contra o dito epitopo de carboi- drato em um ser humano ou animal, sendo o epitopo de carboidrato associ- ado a uma doença em seres humanos ou animais.
Em outra modalidade preferida, a resposta imuno específica mencionada contra o dito epitopo de carboidrato compreende uma resposta imune-humoral contra tal epitopo de carboidrato.
A resposta imune-humoral mencionada contra tal epitopo de carboidrato resulta na produção de anticorpos específicos contra carboidra- tos no humano ou animal e pode ser determinada pelos testes de resposta imunes humoral, como descrito abaixo. O aumento da resposta imune- humoral significa o aumento de uma titulação de anticorpos já presente con- tra o dito epitopo de carboidrato após a administração da formulação da in- venção.
Em outra modalidade preferida, a resposta imuno específica mencionada contra o dito epitopo de carboidrato compreende uma resposta imunocelular carboidrato-específica eficaz contra o dito epitopo de carboidra- to.
Em outra modalidade preferida, a resposta imunocelular carboi-
drato-específica eficaz mencionada compreende ativação de células T CD4- positivas do tipo Th1 e a ativação de células T citotóxicas CD8-positivas di- recionadas contra o dito epitopo de carboidrato.
Em outra modalidade preferida, a resposta imuno específica mencionada contra o dito epitopo de carboidrato compreende uma resposta imunocelular carboidrato-específica eficaz e uma resposta imune-humoral contra o dito epitopo de carboidrato.
Em uma modalidade preferida da invenção, o epitopo de carboi- drato é selecionado do grupo compreendendo TF, Core-1, Tn1 sialil-Tn, sialil- TF, Globo-H, Lewis-Y, sialil-Lewis-A, sialil-Lewis-X, ácido polissiálico, Lewis- X, GM2, GD2, GD3, 9-O-acetil GD3, 9-O-acetil GD2, GD3L, GM1 fucosil, Fucosil GM1, Lewis-A, Lewis B, sLac, cadeia sialilada tipo 1, antígeno CA 19-9, antígeno CA 72-4 e antígeno CA-50.
Em uma modalidade preferida da invenção, a molécula de liga- ção carboidrato é selecionada do grupo compreendendo pelo menos uma lectina, pelo menos uma selectina e/ou pelo menos um anticorpo e/ou pelo menos uma molécula derivada do mesmo que se liga a TF, Core-1, Tn, sialil- Tn, sialil-TF, Globo-H, Lewis-Y, sialil -Lewis-A, sialil -Lewis-X, ácido polissiá- Iico1 Lewis-X, GM2, GD2, GD3, 9-O-acetil GD3, 9-O-acetil GD2, GDL3, fuco- sil GM1, Lewis-A, Lewis-B, sLac, cadeia sialilada tipo 1, antígeno CA 19-9, antígeno CA 72-4 ou CA-50 ou a um epitopo compreendendo qualquer uma dessas estruturas ou partes das mesmas.
Em uma modalidade preferida, a invenção proporciona uma formulação selecionada do grupo compreendendo composições nutracêuti- cas e farmacêuticas compreendendo pelo menos um micro-organismo car- boidrato-positivo que sofre ligação de pelo menos uma molécula de ligação carboidrato que reconhece especificamente um epitopo de carboidrato pre- sente em uma molécula de uma célula humana ou animal ou uma fração ou um Iisado da mesma, sendo que o dito micro-organismo, a fração menciona- da ou o Iisado mencionado ou a formulação mencionada que os compreen- de, induz uma resposta imunocelular carboidrato-específica eficaz contra o dito epitopo de carboidrato e/ou uma estrutura de carboidrato, conjugado de carboidrato ou uma célula de mamífero compreendendo o dito epitopo de carboidrato em pelo menos um animal ou humano, sendo que
(i) a resposta imunocelular carboidrato-específica eficaz com- preende a ativação de células T CD4-positivas de tipo Th1 e/ou a ativação
de células T CD8-positivas citotóxicas direcionadas contra o dito epitopo de carboidrato e/ou uma estrutura de carboidrato, conjugado de carboidrato ou uma célula de mamífero compreendendo o dito epitopo de carboidrato, e
(ii) o epitopo de carboidrato é selecionado do grupo compreen- dendo TF, Core-1, Tn, sialil-Tn, sialil-TF, Globo-H, Lewis-Y, sialil-Lewis-A,
sialil-Lewis-X, ácido polissiálico, Lewis-X, GM2, GD2, GD3, 9-O-acetil GD3, GD3L, fucosil GM1, Fucosil GM1, Lewis-A, Lewis-B, sLac, cadeia sialilada tipo 1, antígeno CA 19-9, antígeno CA 72-4 e antígeno CA-50, e (íii) a molécula de ligação carboidrato é selecionada do grupo compreendendo lectinas, selectinas e/ou anticorpos e/ou moléculas deriva- das que se ligam a TF, Core-1, Tn, sialil-Tn, sialil-TF, Globo-H1 Lewis-Y, sia- lil-Lewis-A, sialil-Lewis-X, ácido polissiálico, Lewis-X, GM2, GD2, GD3, 9-0- acetil GD3, GD3L, fucosil GM1, Fucosil GM1, Lewis-A1 Lewis-B, sLac, cadeia sialilada tipo 1, antígeno CA 19-9, antígeno CA 72-4 ou antígeno CA-50 ou a uma estrutura de carboidrato compreendendo qualquer um desses epitopos de carboidrato ou partes dos mesmos.
Sem pretender ser limitadores, exemplos de estruturas de car- boidrato e as moléculas de ligação a carboidrato correspondentes estão lis- tadas na tabela 2.
Tabela 2
Epitopo de car- boidrato Molécula de ligação carboidral .o Iectina anticorpo monoclonal TF ou Core-1 galectina, lectinas tipo C de macrófagos, sialoadesina, PNA3, Jacalin3, MAL3, EEL3, ECL3 Nemod-TFI2, Nemod- TF22, A78-G/A72, HBT111, HH814, A68-B/A112 Tn lectinas tipo C de macrófagos, sialoadesina, BPL3, DBA3, GSL I3, MPL3, RCA3, SJS3, SBA3 HB-TnI11 sialil-Tn CA 72-4\ TKH2', HBSTnI11 Globo-H A69-A/E8', VK91J Lewis-Y A46-B/B102, A63-D/B122, A51-B/A62, A70-C/C82, A70-A/A92 sialil-Lewis-A E-selectina CA 195\ CA 50', 121SLE12 sialil-Lewis-X E-selectina CA19-91, KM9311U, T17410 Lewis-X 73-304, BG-7 (P12)4 Lewis-A CA 1951, MAB2108(7LE)4, BG-5 (T174)4, PR5C512 Lewis-B MAB2102 (2.25LE)4, BG- 6 (T218)4 cadeia sialilada de tipo 1 CA 2421 sLac CA 501, DU-PAN-21 ácido polissiálico MAL \\ó, SNAd Mab735y, 5A5" fucosil GM1 F1213 GM2 BP283b, PGNXlj GD2 Mab 1261, 3F8S, ME 36.11 GD3 R24b, MAB2053', ME 36.11 9-0-acetil GD2 3F8S 9-O-acetil GD3 ME3.111
1 Omtoft et al. Electrophoresis 1999, 20, 362-371
2 Glycotope GmbH, Berlim, www.qlycotope.com
3 Vector Laboratories, www.vectorlabs.com
4 Amano et al. Clin Diagn Lab Immunol 1997 (Sep), 540-544 5Acris Antibodies GmbH, www.acris-antibodies.com
6 Reaman et al. Câncer Res 1990 50 (1): 202-5 7ChEMICON International, Inc. www.chemicon.com 8Ye et al. 1992; 50(2): 197-201
9 Hussmann et al. J Histochem Cytochem 1990; 38 (2):209-15 10CaIbiochem, www.calbiochem.com
11 DakoCytomation Dako Deutschland GmbH, Alemanha, www.dakoqmbh.de
12 Dianova, Hamburgo, Alemanha
13 Livingston et al. Câncer Immunol Immunother (2005) 54: 1018-1025
14 Clausen et al. Mol Immunol (1988) 25: 199-204
O micro-organismo carboidrato-positivo e frações e Iisados do micro-organismo carboidrato-positivo e as combinações dos mesmos estão descritas em detalhe em Definições e em outras partes deste, assim como métodos para a identificação e isolamento dos micro-organismos menciona- dos e ou frações dos mesmos.
Em uma modalidade preferida adicional, a invenção proporciona um nutracêutico ou uma composição farmacêutica compreendendo pelo me- nos um micro-organismo carboidrato-positivo ou fração ou Iisado do mesmo que induz ou aumenta uma resposta imune epitopo carboidrato-específica contra o epitopo de carboidrato em pelo menos um ser humano ou animal, funcionando como um escudo contra células cancerosas positivas para o epitopo de carboidrato por ter o potencial de destruir células cancerosas que carregam ou compreendem o dito epitopo de carboidrato. Células cancerosas positivas para o epitopo de carboidrato no sentido da invenção significam células cancerosas que expressam, carre- gam ou compreendem o dito epitopo de carboidrato ou que produzem o dito epitopo de carboidrato ou que se associam ao epitopo de carboidrato.
Em uma modalidade preferida adicional, a invenção proporciona
um nutracêutico ou uma composição farmacêutica compreendendo pelo me- nos um micro-organismo carboidrato-positivo ou fração ou Iisado do mesmo que induz ou aumenta um resposta imune epitopo carboidrato-específica em pelo menos um ser humano ou animal, funcionando como um escudo contra células de uma doença associada com o dito epitopo de carboidrato por ter o potencial de destruir as células mencionadas.
Em uma modalidade preferida adicional da invenção, o nutra- cêutico é usado para construir a resposta imune epitopo carboidrato- específica mencionada, que funciona como um escudo contra as células contendo o carboidrato e que tem o potencial de destruir essas células, co- mo descrito acima, mediante administração oral do nutracêutico em (pelo menos um) indivíduo saudável.
Em uma modalidade preferida adicional, o nutracêutico da in- venção é usado para reduzir ou, de maneira ainda mais preferida, prevenir a ocorrência de uma doença ou tumor carboidrato-positivo mediante adminis- tração oral do nutracêutico em pelo menos um indivíduo saudável.
Em uma modalidade preferida da invenção, a composição far- macêutica compreendendo pelo menos um micro-organismo carboidrato- positivo ou fração ou Iisado do mesmo é usado para construir uma resposta imune epitopo carboidrato-específica que funciona como um escudo contra células cancerosas positivas para o epitopo de carboidrato por ter o potenci- al de destruir essas células, como mostrado aqui, por exemplo, pela indução de anticorpos específicos para o epitopo de carboidrato, da citotoxicidade dependente de complemento específica para o epitopo de carboidrato dos anticorpos para o epitopo de carboidrato contra células tumorais positivas para o epitopo de carboidrato, destruindo-as eficientemente, ou mediante secreção de TNF-alfa e/ou INF-gama por respostas de células T específicas para o epitopo de carboidrato, que são marcadores substitutos reconhecidos cientificamente por aqueles versados na técnica, para a destruição específi- ca, mediada por células T citotóxicas, das células tumorais que carregam o epitopo de carboidrato, como mostrado e descrito nos exemplos deste.
O nutracêutico ou a composição farmacêutica da invenção é u-
sado para tratar uma doença ou tumor carboidrato-positivo em pelo menos um ser humano ou animal.
Em uma modalidade preferida da invenção, o nutracêutico com- preendendo pelo menos um micro-organismo carboidrato-positivo ou fração do mesmo é usado para tratar uma doença ou tumor carboidrato-positivo mediante administração oral do nutracêutico em pacientes que sofrem dessa doença.
Em uma modalidade preferida da invenção, a composição far- macêutica compreendendo pelo menos um micro-organismo carboidrato- positivo ou fração do mesmo é usada para tratar uma doença ou tumor car- boidrato-positivo em pacientes que sofrem dessa doença.
Em uma modalidade preferida adicional, o nutracêutico ou com- posição farmacêutica da invenção é usado para reduzir ou, mais preferivel- mente, prevenir, a ocorrência de uma doença, tumor ou metástase carboi- drato-positiva.
Em uma modalidade preferida adicional, a invenção proporciona um nutracêutico ou uma composição farmacêutica compreendendo pelo me- nos um micro-organismo carboidrato-positivo ou fração do mesmo que reduz ou previne a disseminação ou a metástase de uma doença ou tumor carboi- drato-positivo em pelo menos um ser humano ou animal quando administra- do.
Em uma modalidade preferida adicional, a invenção proporciona uma formulação selecionada do grupo compreendendo um nutracêutico ou uma composição farmacêutica compreendendo pelo menos um micro- organismo carboidrato-positivo ou fração do mesmo que é usado para profi- Iaxia e tratamento de uma doença humana ou animal associada com um epitopo de carboidrato. Em uma modalidade preferida adicional, a invenção proporciona uma composição farmacêutica usada para prevenir ou reduzir a dissemina- ção do tumor ou metástase ou a disseminação de metástase ou do tempo de reinciência de um tumor ou de células tumorais carboidrato-positivas, para melhorar a qualidade de vida ou sobrevivência média ou taxa de tempo de reinciência, ou para tratar um paciente de tumor que tem ou teve um tumor positivo para epitopo de carboidrato mediante administração da composição farmacêutica em pacientes sofrendo dessa doença.
Em uma modalidade preferida adicional da invenção, o nutra- cêutico ou composição farmacêutica compreende pelo menos dois micro- organismos carboidrato-positivos ou frações dos mesmos.
Em outra modalidade preferida da invenção, o nutracêutico ou composição farmacêutica compreende pelo menos dois micro-organismos carboidrato-positivos ou frações dos mesmos sendo os micro-organismos carboidrato-positivos ou frações são positivos para o mesmo carboidrato.
Em outra modalidade preferida da invenção, o nutracêutico ou composição farmacêutica compreende pelo menos dois diferentes micro- organismos carboidrato-positivos ou frações dos mesmos sendo os micro- organismos carboidrato-positivos ou frações são positivos para carboidratos diferentes.
Em outra modalidade preferida da invenção, o nutracêutico ou composição farmacêutica supracitada da invenção compreende pelo menos um micro-organismo carboidrato-positivo e pelo menos uma fração de um micro-organismo carboidrato-positivo, preferencialmente de mais de um mi- cro-organismo carboidrato-positivo, sendo que o micro-organismo carboidra- to-positivo e a fração de um micro-organismo carboidrato-positivo são positi- vos para o mesmo carboidrato ou para carboidratos diferentes.
Em uma modalidade preferida adicional da invenção, o nutra- cêutico ou formulação farmacêutica compreende pelo menos um micro- organismo carboidrato-positivo ou fração do mesmo combinado com pelo menos um outro micro-organismo benéfico.
O micro-organismo benéfico mencionado é preferivelmente se- lecionado do grupo compreendendo Lactobacillus e Bifidobacterium.
Em outra modalidade preferida, o nutracêutico ou composição farmacêutica da invenção compreende pelo menos uma fração do micro- organismo carboidrato-positivo e pelo menos um micro-organismo carboidra- to-positivo.
Em uma modalidade preferida adicional, o nutracêutico ou com- posição farmacêutica da invenção compreende pelo menos uma fração do micro-organismo carboidrato-positivo combinada com pelo menos um outro micro-organismo benéfico, tal como, mas sem limitação a, um Iactobacillus e/ou bifidobacterium, ainda mais preferivelmente uma combinação de fra- ções de micro-organismos carboidrato-positivos de diferentes cepas combi- nados com outros micro-organismos benéficos.
A formulação da presente invenção selecionada do grupo com- preendendo um nutracêutico e uma composição farmacêutica pode consistir apenas em um micro-organismo ou fração do mesmo ou compreender in- gredientes ou componentes adicionais tais como, mas sem limitação a, mais de um micro-organismo ou fração do mesmo ou outros micro-organismos ou frações dos mesmos ou soluções-tampão ou veículos farmaceuticamente aceitáveis ou alimento como descrito em outra parte deste. O nutracêutico mencionado da invenção pode consistir apenas
em pelo menos um micro-organismo carboidrato-positivo ou fração do mes- mo, tal como, mas sem limitação a, um micro-organismo vivo ou morto, Iiofi- lizado, ou pasteurizado, ou lisados, ou componentes, ou frações dos mes- mos, ou em uma forma pelo menos parcialmente solubilizada em um líquido, ou ele pode consistir em componentes adicionais tais como, mas sem limita- ção a, outros nutrientes, aditivos nutricionais ou aditivos alimentares ou para bebidas, soluções ou emulsões conhecidas daqueles versados na técnica. O nutracêutico mencionado pode ser aplicado oralmente sob diferentes formas, tais como cápsulas, comprimidos, emulsões, pós, líquidos. O nutracêutico pode ser dado sozinho ou misturado com alimentos ou bebidas. O nutracêu- tico mencionado pode também ser qualquer alimento, bebida, componente de uma bebida ou alimento, um aditivo alimentar, ou ser um nutracêutico independente.
Em uma modalidade preferida, o nutracêutico é usado como uma cápsula ou um comprimido. Em outra modalidade preferida, o nutracêu- tico é misturado em um alimento ou bebidas tais como, mas sem limitação a, aquelas listadas em outra parte deste.
A presente invenção refere-se também a um nutracêutico com- preendendo pelo menos um micro-organismo que sofreu ligação de pelo menos uma molécula de ligação carboidrato que reconhece especificamente um epitopo de carboidrato presente em uma molécula de uma célula huma- na ou animal, ou uma fração ou um Iisado da mesma, sendo que o dito mi- cro-organismo, a fração mencionada ou o Iisado mencionado ou a formula- ção mencionada que os compreende, induz uma resposta imunocelular car- boidrato-específica eficaz contra o dito epitopo de carboidrato em pelo me- nos um animal ou humano. Em uma modalidade preferida da invenção, o nutracêutico men-
cionado é aplicado em um ser humano ou animal como um alimento ou adi- tivo alimentar.
Alimento, no contexto da invenção, é qualquer substância con- sumida por organismos vivos, incluindo bebidas líquidas. O alimento é a principal fonte de energia e de nutrição para animais/humanos e é geralmen- te de origem animal ou vegetal. O alimento é, de preferência alimento vege- tariano, o que compreende geralmente todos os tipos de alimentos livres de produtos animais, tais como carne, leite ou ovos. O alimento no contexto da invenção também preferivelmente o alimento não-vegetariano contendo pro- dutos animais. Alimento no contexto da invenção é:
(i) qualquer substância ou produto, seja processado, parcialmen- te processado ou não processado, que se destina a ser, ou que se espera razoavelmente que seja, ingerido por humanos, seja de valor nutricional ou não;
(ii) água e outras bebidas;
(iii) chiclete ou produtos doces; e/ou
(iv) artigos e substâncias usadas como ingredientes ou compo- nentes na preparação de um alimento.
O alimento no contexto da invenção é tradicionalmente obtido mediante agricultura, criação e pesca, com caça, coleta e outros métodos de subsistência localmente importantes para algumas populações, mas de me- nor relevância para outras. Na era moderna, em nações desenvolvidas, o fornecimento de alimentos é cada vez mais dependente da agricultura, da agricultura industral, de técnicas de aquacultura e de cultivo de peixes que têm o objetivo de maximizar a quantidade de alimento produzida ao mesmo tempo que minimiza os custos. Essas técnicas incluem uma dependência de ferramentas mecânicas que foram desenvolvidas, desde a debulhadora e a semeadora até o trator e a máquina de ceifar e debulhar, etc. Estas ferra- mentas foram combinadas com os pesticidas para promover alta produção e combater os insetos e mamíferos que reduzem a produção. Mais recente- mente, tem havido um movimento crescente no sentido de práticas agrícolas mais sustentáveis. Essa abordagem — que é parcialmente alimentada pela demanda do consumidor — encoraja a biodiversidade, a dependência de recursos locais e métodos de cultivo orgânicos.
Tipos de alimentos manufaturados (alimentos que contêm pelo menos um micro-organismo carboidrato-positivo ou fração do mesmo) no contexto da invenção são:
Bebidas: cerveja, suco, refrigerante, refresco, vinho, bebidas contendo leite, produtos do leite ou outras bebidas alcoólicas ou não- alcoólicas, por exemplo água, incluindo apenas água com gás, sucos de fru- ta e sucos de vegetais, refrigerantes, águas frescas, limonada, coca-cola, cerveja de gengibre, irn bru, bebida não alcoólica de raízes, salsaparilha, sorvete com club soda, dente-de-leão e bardana, refresco, um xarope com aroma de fruta diluído em água, bebidas esportivas, infusões, café, chá, be- bidas lácteas, por exemplo, leite, bebida de iogurte, leite achocolatado, milk- shake, gemada, leite de amêndoa, horchata, bebidas alcoólicas, coquetéis - bebidas misturadas, bebidas quentes, por exemplo chocolate quente, sidra quente, cappuccino ou chá de tapioca.
O pão é um alimento fundamental para muitas nações, é feito com massa fermentada de trigo ou outro cereal, por exemplo, farinha de centeio, pão de torrada (pão branco), integral, pão branco, multigrão, centei- o, semente de girassol, semente de abóbora, pizza, chapatis, tortilhas, ba- guetes, pitas, lavash, biscoitos, pretzels, naan, pão judeu, puris, bolo, pão de centeio integral, pão integral, pão de germe de trigo, integral, pão de farinha granarye muitas outras variações.
Bolos e cookies, por exemplo pão-de-ló, bolo de maçã, babka, buccellato, bolo de Bundt, bolo de manteiga, bolo borboleta, bolo de cenou- ra, queijada, bolo de chocolate, bolo de natal, bolo chiffon, croquembouche, bolinho, bolo de chocolate escuro, bolo de groselha, bolo das fadas, bolo de frutas, bolo de chocolate alemão, bolo génoise, pão de mel, massa, bolo de manteiga, bolo de leite quente, bolo de sorvete, bolos de laranja jaffa, bolo fermentado, torta lunar, panetone, bolo de abacaxi, pound cake, bolo rainha Elizabeth, "mizuyokan", bolo veludo vermelho, torta Sacher, bolo de frutas e marzipan, bolo de especiarias, bolo de pão-de-ló, "suncake", bolinhos servi- dos com chá, "tarte tatin", bolo de mil folhas ou bolo de casamento.
O queijo é um produto de leite coalhado do qual existem muitas variedades, por exemplo, queijo sardo, queijo testouri, queijo bokmakiri, queijo kwaito, queijo wookie, queijo ackawi, queijo basket, labneh, queijo jib- neh arabieh, queijo kenafa, queijo naboulsi, queijo paneer, queijo affineur, queijo montanhês, queijo brimsen, queijo dachsteiner, queijo tyrolean grey, queijo luneberg, queijo beauvoorde, queijo brussel's, hervé, queijo limburger, queijo maredsous, queijo passendale, queijo plateau de herve, queijo postei, queijo remedou, queijo dinamarquês azul, queijo dinamarquês tilsit ou queijo tilsit havarti, queijo allgãu emmental, queijo cambozola, queijo harzer, queijo limburger, queijo spundekás, queijo feta, queijo halloumi ou queijo muçarela.
A sobremesa é um prato, em geral doce, e geralmente servido após o prato principal, por exemplo, sorvete, por exemplo, biscoitos ou coo- kies, bolos, crumbles, cremes, frutas, sobremesas de gelatina, sorvetes, me- ringues, artigos de pastelaria, tortas ou pastéizinhos de fruta, pudins, sor- bets, suflês ou bolo com creme.
Batatas fritas, chips, por exemplo, chips de batatas ou "crisps", chips de tortilla ou chips de milho.
O alimento funcional (alimentos funcionais são denominados nu- tracêuticos, um misto de nutrição e farmacêutico, e pode incluir alimento que foi modificado geneticamente; a categoria geral inclui alimentos processados 5 feitos de ingredientes alimentares funcionais, ou fortificados com aditivos promotores da saúde, como produtos "enriquecidos com vitaminas" e tam- bém alimentos frescos (por exemplo, vegetais) que aos quais se ligam rei- vindicações específicas.
Geléia e gelatina, por exemplo, de groselha, de groselha verme- lha, de groselha preta, de frutas cítricas, de maça, de framboesa, de moran- go e ou geléia real.
Massa, por exemplo, massa moldada, campanelle, casarecci, cavatelli, conchiglie, conchiglioni, farfalle, fiori, fusili, fusili bucati, gemelli, gi- gli, gramigna, lumache, lumaconi, maltagliati, orecchiette, pipe, quadrefiore, radiatori, ricciolini, rotelle, rotini, spiralini, strozzapreti, torchio ou trofie.
Torta, por exemplo, de torta de bacon e ovos, torta de galinha e cogumelos, torta de carne em conserva, cornish pasty, torta de peixe, kala- kukko, torta de pizza, torta de porco, pastelão de carne, torta escocesa, torta do pastor, torta stargazy, torta de stake, torta de steake e rim, torta de maça, 20 torta de banana e creme, torta de amora preta, torta de vacínio, torta de ce- reja, torta de creme de chocolate, torta de creme de coco, torta de creme, torta de maça holandesa, torta de uva, torta de lima branca, torta de limão com merengue, torta de amoras mistas, torta de laranja, torta de pêssego, torta de ruibarbo, torta de morango com ruibarbo, torta de morango ou torta 25 com vinagre.
Pizzas, por exemplo, os tipos clássicos e seus respectivos com- plementos, incluindo marinara ou napolitana: tomate, azeite de oliva, oréga- no e alho; marguerita: tomate, azeite de oliva, folhas de manjericão frescas e muçarela de leite de vaca ou muçarela de leite de búfala; formaggio e pomo- 30 doro: tomate, azeite de oliva e queijo parmesão gratinado sendo folhas de manjericão opcionais; ripieno ou calzone: muçarela de leite de vaca ou mu- çarela de leite de búfala, às vezes também ricota, azeite de oliva e salame, outras carnes, vegetais, etc. ou stromboli: muçarela, carne, vegetais, etc.
Carnes processadas, por exemplo carne de anfíbios, rã, carne artificial, imitação de carne, carne in vitro, carne bovina, de búfalo, bife, vitela (bezerros), iaque, aves domésticas (pássaros), de galinha, de pato, de pás- 5 saros de caça, de peru, canídeos, frutos do mar, peixe, de tubarão, de crus- táceos, de caranguejo, de coelho, carne de carneiro, de ovelha, de porco, presunto (lombo), bacon (fatias de carne curada) ou insetos.
Sanduíches, por exemplo, aram sandwich, baguete recheada, sanduíche de bacon, pãozinho, hambúguer, burrito, sanduíche de batata frita, club sandwich, sanduíche de queijo grelhado, kebab, "georgia hots", misto quente: misto quente com atum, etc., panini, sanduíche de carne, taco, sanduíche para o chá, sanduíche tostado ou enroladinho.
Salada, por exemplo caesar salad, salada do chef, salada cobb, salada grega, salada italiana, salada mesclun, salada niçoise, saladas de 15 grãos tais como salada de vagem, salada sete grãos, salada de galinha, sa- lada de ovos, salada de frutas (frutas cortadas e descascadas servidas nos seus próprios sucos ou com tempero), salada larb, salada de macarrão, sa- lada de babata, salada somen, som tam, tabule, salada waldorf, watergate salad.
Molho, por exemplo molhos brancos, molho de cogumelo, molho
allemande, molho americano, molho suprême, molhos elouté Brown (elouté Brown sauces), molho bordelaise, molho chateaubriand, molho africano, mo- lho robert, molho bechamel, molho holandês, maionese, molho tártaro, cre- me para salada, molho de manteiga, beurre blanc, café de paris, molhos do- 25 ces, molho de peixe, molho sambai, molho barbecue, mole, molho de tomate ou tzatziki.
Lanches: confeitados, chips de batatas, chocolate, hardtacks, doce em barra, comida de baixo valor nutritivo, por exemplo, amendoim co- zido, doces em barra, cheetos, "chex mix", cookies, bolachas, combinações, 30 rodadas de fudge, hula hoops, sorvete, saque do pirata "moonpies", pirate’s booty, pipoca, pele de porco, chips de batatas, pretzels, smart puffs, refrige- rantes, snowballs, "comida de estudante", rocamboles, "tings", twinkies, "veggie booty" ou bolos zebra.
Sopas, por exemplo, sopas de sobremesa (ginataan, sopa filipi- na feita com leite de coco, leite, frutas e grãos de tapioca); oshiruko, uma sopa japonesa de feijão azuki ou sopas de frutas, sopa de cabaça, sopa de 5 miso, pho, ramen, saimin, sopa de batatas romena, avgolemono, borscht, bouillabaisse, callaloo, cock-a-leekie, fanesca, gazpacho, sopa de lentilhas, minestrone, sopa mulligatawny, caldo escocês, sopa de ervilha, solyanka, tarator, waterzooi.
Açúcar ou produtos com açúcar, por exemplo, xarope dourado, doces ou chocolates.
Iogurte, coalhadas, creme amargo, creme batido, por exemplo lassi, kefir, ayran, doogh ou tarator.
Bebidas em pó ou pastilhas, por exemplo, bebidas de vitaminas ou de minerais.
Cápsulas ou comprimidos.
Alimentos terapêuticos (alimentos terapêuticos são alimentos destinados a fins específicos, em geral nutricionais, terapêuticos), alimentos funcionais, alimentos medicinais, alimentos enterais, alimentos parenterais, alimentos para uso medicinal específico.
Exemplos são Ensure, uma bebida de milkshake destinada pri-
mariamente para a alimentação de idosos, e Plumpy’nut, um alimento base- ado em amendoim para a alimentação emergencial de crianças gravemente desnutridas.
Em outra modalidade preferida, a formulação da invenção é pro- duzida como medicamento para venda sem receita médica.
A resposta imune-humoral contra o epitopo de carboidrato men- cionada é uma resposta dos anticorpos contra o epitopo de carboidrato que pode ser detectada por pelo menos um dos testes de resposta imune- humoral 1, 2, 3, 4, 5 ou 6. Os testes respectivos também são úteis em con- 30 junto com o método de identificação de um micro-organismocarboidrato- positivo apropriado de acordo com a presente invenção.
Em uma modalidade preferida, a invenção proporciona um teste de resposta imune-humoral (teste de resposta imune-humoral 1) contra o epitopo de carboidrato compreendendo a testagem da ligação de um anti- corpo, de anticorpos no soro, de anticorpos ganhos do soro, do plasma ou das fezes em um ELISA para compostos tais como proteínas ou peptídeos 5 veículos o epitopo de carboidrato, sendo que a resposta imune-humoral po- sitiva contra o epitopo de carboidrato mostra uma ligação significativamente maior dos anticorpos ao composto carreando um dito epitopo de carboidrato (tal como uma proteína ou peptídeo) do que ao composto mencionado (tal como uma proteína ou peptídeo) sem o epitopo de carboidrato ou ao com- 10 posto mencionado (por exemplo, uma proteína ou peptídeo) após um trata- mento enzimático ou químico que destrói o epitopo de carboidrato. Em uma modalidade preferida, a ligação do anticorpo ou anticorpos mencionado(s) é significativamente maior após a administração do nutracêutico, da composi- ção farmacêutica, do micro-organismo carboidrato-positivo ou da fração do 15 mesmo ou de formulações compreendendo os mesmos do que a ligação do anticorpo correspondente, dos anticorpos no soro ou dos anticorpos ganhos do soro, do plasma ou das fezes, ganhos após a administração mencionada.
O tratamento enzimático ou químico mencionado do epitopo de carboidrato destrói a estrutura de carboidrato do epitopo de carboidrato. O 20 tratamento enzimático ou químico mencionado do epitopo de carboidrato pode ser realizado usando-se técnicas conhecidas daqueles versados na técnica tais como, sem se limitar a, tratamento com neuraminidase, sialida- se, glicosidase, galactosidase, glicosidase, exoglicosidase, fucosidase, Hex- NAcase ou ácido periódico (oxidação branda com periodato/tratamento com 25 periodato, como descrito nos exemplos).
Por exemplo, os epitopos de carboidrato Core-1 e Tn são des- truídos pelo tratamento com ácido periódico, como descrito nos exemplos.
Um exemplo de uma modalidade preferida do teste de resposta imune-humoral 1 está descrito com detalhe no exemplo 11.0 exemplo 11 descreve a testagem da resposta imune-humoral contra o epitopo de carboi- drato Core-1 em ELISA contra a asialoglicoforina, uma proteína que carrega o epitopo de carboidrato, contra a glicoforina, que é a mesma proteína, mas com o Core-1 mascarado pelo ácido siálico e contra a asialoglicoforina trata- da com ácido periódico, sendo que o tratamento com ácido periódico destrói a estrutura do Core-1.
Em outra modalidade preferida, a invenção proporciona um teste de resposta imune-humoral (teste de resposta imune-humoral 2) contra um epitopo de carboidrato compreendendo a testagem da ligação de um anti- corpo, dos anticorpos no soro, dos anticorpos ganhos do soro, do plasma ou das fezes, em um ELISA para estruturas de carboidrato conjugadas com poliacrilamida (conjugados PAA), sendo que uma resposta imune-humoral positiva contra um epitopo de carboidrato mostra uma ligação significativa- mente maior do anticorpo ou dos anticorpos aos conjugados de PAA com- preendendo o epitopo de carboidrato do que ao mesmo conjugado de PAA após tratamento enzimático ou químico que destrói o epitopo de carboidrato e/ou uma maior ligação do anticorpo ou dos anticorpos a um conjugado de PAA compreendendo o epitopo de carboidrato em comparação com um con- jugado de PAA que não compreende o epitopo de carboidrato, preferivel- mente ambos. Em uma modalidade preferida, a ligação do anticorpo ou dos anticorpos mencionados a um conjugado de PAA compreendendo o epitopo de carboidrato é significativamente maior após a administração do nutracêu- tico, da composição farmacêutica, do micro-organismo carboidrato-positivo ou da fração do mesmo do que aligação dos anticorpo correspondente, anti- corpos no soro, ou dos anticorpos ganhos do soro, do plasma ou das fezes, ganhos antes da administração mencionada.
Uma modalidade preferida do teste de resposta imune-humoral 2 está descrita em detalha no exemplo 11.
Em outra modalidade preferida, a invenção proporciona um teste de resposta imune-humoral (teste de resposta imune-humoral 3) contra o epitopo de carboidrato compreendendo a testagem da ligação de um anti- corpo, de anticorpos no soro, ou de anticorpos ganhos do soro, do plasma 30 ou das fezes em um teste por citometria de fluxo para determinar a sua liga- ção a células compreendendo o epitopo de carboidrato e a células não com- preendendo o epitopo de carboidrato, sendo que uma resposta imune- humoral positiva contra o epitopo de carboidrato mostra uma ligação signifi- cativamente maior dos anticorpos a células compreendendo o epitopo de carboidrato do que a células negativas para o o epitopo de carboidrato. Em uma modalidade preferida, a ligação do anticorpo ou dos anticorpos mencio- 5 nados a células que compreendem o epitopo de carboidrato é significativa- mente maior após a administração do nutracêutico, da composição farma- cêutica, do micro-organismo carboidrato-positivo ou da fração do mesmo ou formulações que os compreendem do que a ligação do anticorpo correspon- dente, dos anticorpos no soro, ou dos anticorpos ganhos do soro, do plasma 10 ou das fezes, ganhos antes da administração. Uma modalidade preferida do teste de resposta imune-humoral 3 é descrita em detalhe no exemplo 11.
Em outra modalidade preferida, a invenção proporciona um teste de resposta imune-humoral (teste de resposta imune-humoral 4) contra o epitopo de carboidrato compreendendo a testagem da ligação de um anti- 15 corpo, de anticorpos no soro, ou de anticorpos ganhos do soro, do plasma ou das fezes, em um teste de imunofluorescência para determinar a sua li- gação a células compreendendo o epitopo de carboidrato e a células negati- vas para o epitopo de carboidrato, sendo que uma resposta imune-humoral positiva contra o epitopo de carboidrato mostra uma ligação significativamen- 20 te maior do anticorpo ou dos anticorpos a células compreendendo o epitopo de carboidrato do que a células não compreendendo o epitopo de carboidra- to e/ou a células compreendendo o epitopo de carboidrato após tratamento enzimático ou químico que destrói o epitopo de carboidrato. Em uma moda- lidade preferida, a ligação a células compreendendo o epitopo de carboidrato 25 é significativamente maior após administração do nutracêutico, da composi- ção farmacêutica, do micro-organismo carboidrato-positivo ou da fração do mesmo ou de formulações compreendendo os mesmos do que a ligação do anticorpo correspondente, dos anticorpos no soro, ou dos anticorpos ganhos do soro, do plasma ou das fezes, ganhos antes da administração menciona- 30 da. O teste de imunofluorescência pode ser tornado mais quantitativo medi- ante diluições séricas dos antissoros e/ou mediante fotografias feitas em condições de exposição idênticas. Aqueles versados na técnica são capazes de identificar molécu- las veículo apropriadas e de acoplar estruturas apropriadas para obter a es- trutura de carboidrato adequada acoplada às moléculas veículo com ou sem reticulador. Aqueles versados na técnica são capazes também de selecionar 5 as células ou antígenos com ou sem tratamento enzimático ou químico e de selecionar e modificar os métodos apropriados para testar a resposta imune- humoral ao epitopo de carboidrato. Entretanto, os testes de resposta imune- humoral 1 a 4 supramencionados e especialmente as combinações preferi- das dos mesmos proporcionadas pela presente invenção são claramente 10 preferíveis e possuem claras vantagens no que diz respeito à especificidade como também é deixado claro pelos exemplos.
Em outra modalidade preferida, a invenção proporciona um teste de resposta imune-humoral (teste de resposta imune-humoral 5) contra o epitopo de carboidrato compreendendo a) incubação de uma quantidade adequada de células compre-
endendo o epitopo de carboidrato marcadas com uma quantidade adequada de um marcador tal como o európio ou o cromo 51, com uma quantidade adequada de um anticorpo, de anticorpos em soro, ou de anticorpos ganhos do soro, do plasma ou das fezes, com uma quantidade adequada de com- 20 plemento por um período adequado (normalmente entre 3 a 5 horas ou du- rante a noite);
b) medição da Iise celular pela determinação da liberação do marcador tal como o európio ou o cromo 51 após incubação sob (a) sendo que uma resposta imune-humoral positiva contra o epitopo de carboidrato 25 mostra uma Iise significativamente maior de células compreendendo o epito- po de carboidrato do que de células não compreendendo o epitopo de car- boidrato e/ou ela mostra uma Iise maior de células compreendendo o epitopo de carboidrato do que uma Iise sem complemento e/ou uma Iise sem o anti- corpo e/ou uma Iise com um anticorpo ou anticorpos que não se ligam ou 30 que se ligam menos a células compreendendo o epitopo de carboidrato.
O teste de resposta imune-humoral 5 mencionado testa a citoto- xicidade complemento-dependendete (CDC) específica para o carboidrato, um mecanismo efetor mediado por certos anticorpos, da resposta imune- humoral induzida ou anticorpos carboidrato-específicos em um teste de Iise de células-alvo. O teste compreende a incubação de uma quantidade ade- quada de células compreendendo o epitopo de carboidrato marcadas com uma quantidade apropriada de um marcador tal como o európio ou o cromo 51 com uma quantidade adequada de um anticorpo, ou de anticorpos no soro, ou de anticorpos ganhos do soro, do plasma ou das fezes, com uma quantidade adequada de complemento por um período apropriado (normal- mente entre 3 a 5 horas ou durante a noite). As células compreendendo o epitopo de carboidrato são marcadas com o marcador mencionado, tal como o európio ou o cromo 51, o que permite a medida das células que são Iisa- das. A quantidade de células Iisadas é determinada preferivelmente pela medição da liberação do marcador (por exemplo, európio ou cromo 51) após a incubação. Um controle adequado pode ser determinado por aqueles ver- sados na técnica tal como células carboidrato-negativas, um anticorpo ou uma mistura de anticorpos que não se liguem à célula-alvo e/ou sem com- plemento. O teste pode ser otimizado no que diz respeito às quantidades adequadas de anticorpos, número de células tumorais marcadas, concentra- ção do complemento e tempo de incubação por aqueles versados na técnica para o seu uso na invenção e como descrito.
A citotoxicidade complemento-dependente (CDC) da invenção é determinada preferivelmente usando-se uma análise de liberação de euró- pio. As células-alvo são incubadas por 10 minutos a 4°C em 800 μΙ de tam- pão de európio (50 mM de HEPES, pH 7,4, 93 mM de NaCI1 5mM de KCI, 2 25 mM de MgCL2, 10 mM de ácido dietilenotriamina penta-acético, 2 mM de acetato de európio (III), eletroporadas (710 V, 1 pulso, 30 ps) em um multi- porador (Eppendorf) e subsequentemente incubadas em gelo por outros 10 minutos. Em seguida, as células são lavadas 5 vezes em RPMI/SFB a 5% e semeadas em uma placa de fundo redondo com 96 cavidades (Nunc; 5 x 30 103/cavidade). Após a adição de 20 μΙ de solução contendo anticorpos em várias diluições dos controles correspondentes (meio, IgM humana de con- trole de isótipo), as amostras são incubadas por 20 minutos a temperatura ambiente. 10 μΙ de complemento diluído a 1:10 (complemento Baby rabbit) são adicionados aos cavidades correspondentes. Nas cavidadess de contro- le, 10 μΙ de RPMI/SFB a 5% são acrescentados em vez da solução de com- plemento. Para determinação da liberação espontânea, as células-alvo são 5 incubadas apenas com meio e a liberação máxima é determinada pela Iise completa do alvo com etanol. Após incubação a 37°C por 4 horas, a placa é centrifugada a 500 x g por 5 minutos e 20 μΙ de sobrenadante livre de células de cada placa são pipetados em 200 μΙ por cavidade de solução íntensifica- dora (Perkin-Elmer Wallac) na placa de fundo chato previamente preparada 10 (Nunc-lmmunoplate Maxisorp). Após incubação por 15 minutos a temperatu- ra ambiente, a fluorescência é determinada (fluorômetro Victor2, Perkin- Elmer Wallac). A citotoxicidade específica é obtida mediante a equação (lise experimental - Iise espontânea) / (lise máxima - Iise espontânea) x 100%.
Em outra modalidade preferida, a invenção proporciona um teste de resposta imune-humoral (teste de resposta humoral 6) contra o epitopo de carboidrato compreendendo
a) incubação de uma quantidade apropriada de células compre- endendo o epitopo de carboidrato e/ou de células não compreendendo o epitopo de carboidrato marcadas com uma quantidade apropriada de um
marcador tal como európio ou cromo 51, com uma quantidade apropriada de um anticorpo, de anticorpos no soro, ou de anticorpos ganhos do soro, do plasma ou das fezes, com uma quantidade apropriada de pelo menos uma célula imuneefetora ou mistura de células compreendendo células imunes efetoras ou células mononucleares do sangue periférico por um tempo ade- 25 quado, normalmente entre 3 a 5 horas ou durante a noite, e
b) medição da lise das células pela determinação da liberação do marcador tal como európio ou cromo 51 após incubação sob (a) sendo que uma resposta imune-humoral contra o epitopo de carboidrato mostra uma lise significativamente maior de células compreendendo o epitopo de
carboidrato do que de células negativas para o epitopo de carboidrato do que uma lise sem o anticorpo e/ou do que uma lise com um anticorpo ou anticorpos que não se ligam ou que se ligam menos a células compreen- dendo o epitopo de carboidrato.
O teste de resposta imune-humoral 6 mencionado testa a citoto- xicidade celular anticorpo-dependente (ADCC), um mecanismo efetor medi- ado por certos anticorpos, da resposta imune-humoral induzida ou os anti- 5 corpos específicos para o epitopo de carboidrato em um teste da lise das células-alvo em combinação com células imunes efetoras. O teste compre- ende a incubação de quantidades adequadas de células-alvo positivas para o epitopo de carboidrato marcadas com quantidades adequadas de anticor- pos em soro ou anticorpos ganhos do soro ou de um anticorpo para o epito- 10 po de carboidrato isolado com quantidades adequadas de células imunes efetoras tais como aquelas presentes nas PBMC (células mononucleares do sangue periférico) por um período adequado, normalmente entre 3 a 5 horas ou durante a noite. As células compreendendo o epitopo de carboidrato são marcadas com európio ou cromo 51, o que permite a medição das células 15 que são lisadas. A quantidade de células Iisadas é determinada preferivel- mente pela medição da liberação de európio ou cromo 51 após a incubação. Um controle adequado pode ser determinado por aqueles versados na técni- ca, tal como células negativas para o epitopo de carboidrato, um anticorpo ou uma mistura de anticorpos que não se ligue à célula-alvo e/ou sem célu- 20 Ias imunes efetoras (por exemplo, PBMCs). O teste pode ser otimizado para uso nesta invenção no que diz respeito às quantidades apropriadas de anti- corpos, números de células tumorais marcadas, números de células imunes efetoras e tempo de incubação por aqueles versados na técnica.
A citotoxicidade celular anticorpo-dependente (ADCC) da inven- 25 ção é preferencialmente determinada usando-se uma análise de liberação de európio. As células-alvo são incubadas por 10 minutos a 4°C em 800 μΙ de tampão de európio (50 mM de HEPES, pH 7,4, 93 mM de NaCI, 5mM de KCI, 2 mM de MgCL2, 10 mM de ácido dietilenotriamina penta-acético, 2 mM de acetato de európio (III), eletroporadas (710 V, 1 pulso, 30 ps) em um mul- 30 tiporador (Eppendorf) e subsequentemente incubadas em gelo por outros 10 minutos. Em seguida, as células são lavadas 5 vezes em RPMI/FCD a 5% e semeadas em placa de fundo redondo com 96 cavidades (Nunc; 5 x ο
10 /cavidade). Após adição de 20 μΙ de anticorpos específicos para o Core-1 em concentrações variadas (concentração final de 0,05 a 50 pg/ml em 200 μΙ de volume de incubação) ou dos controles correspondentes (meio, IgG de controle de isótipo), PBMCs (células mononucleares do sangue periférico, 80 5 μΙ) são adicionadas como células efetoras usando-se diferentes proporções células efetoras/células-alvo entre 100:1 e 10:1, preferencialmente de 50:1. Para determinar a liberação espontânea, 80 μΙ de RPMI/FCS a 5% sem célu- las efetoras são adicionados. A liberação máxima é determinada após lise completa das células-alvo com etanol.
Após incubação a 37°C por 4 horas, a placa é centrifugada a
500 x g por 5 minutos e 20 μΙ de sobrenadante livre de células de cada placa são pipetados em 200 μΙ por cavidade de solução intensificadora (Perkin- Elmer Wallac) na placa de fundo chato previamente preparada (Nunc- Immunoplate Maxisorp). Após incubação por 15 minutos a temperatura am- 15 biente, a fluorescência é determinada (fluorômetro Victor2, Perkin-Elmer Wal- lac). A citotoxicidade específica é obtida mediante a equação (lise experi- mental - lise espontânea) / (lise máxima - lise espontânea) x 100%.
Em uma modalidade preferida, os testes de resposta imune- humoral 1 a 6 compreendem ainda, antes do teste,
a. administração do nutracêutico, da composição farmacêutica,
do micro-organismo carboidrato-positivo ou da fração ou Iisado do mesmo ou de formulações compreendendo os mesmos a um ser humano ou animal;
b. isolamento do anticorpo, dos anticorpos no soro ou dos anti- corpos ganhos do soro, do plasma ou das fezes.
Em uma modalidade preferida adicional da invenção, um nutra-
cêutico ou uma composição farmacêutica compreendendo pelo menos um micro-organismo carboidrato-positivo ou fração ou Iisado do mesmo induz uma resposta imune-humoral contra o epitopo de carboidrato que é positiva para pelo menos dois testes de resposta imune-humoral dentre os testes de 30 resposta imune-humoral de 1 a 6 e, mais preferivelmente, positivo para os testes de resposta imune-humoral 1 e 3 e, mais preferivelmente, para os tes- tes de resposta imune-humoral 1, 2 e 3 e, mais preferivelmente, para os tes- tes de resposta imune-humoral 1, 2, 3 e 4 e, mais preferivelmente, para os testes de resposta imune-humoral 1, 2, 3, 4 e 6 e, ainda mais preferivelmen- te, para os testes de resposta imune-humoral 1, 2, 3, 4 e 5 e, da maneira mais preferível, positivo para todos os 6 testes de resposta imune-humoral.
5 Também são proporcionados testes de resposta imunocelular. A
resposta imunocelular mencionada contra o epitopo de carboidrato é uma resposta das células T contra o epitopo de carboidrato que pode ser detec- tada por pelo menos um dos testes de resposta imunocelular de 1 a 5. Mais preferivelmente, ela é uma resposta imunocelular contra o epitopo de car- 10 boidrato que é uma resposta citotóxica das células T ou uma resposta das células T auxiliares de tipo Th1 contra o epitopo de carboidrato. Mais preferi- velmente, ela é uma resposta imunocelular contra o epitopo de carboidrato que é uma resposta citotóxica das células T e uma resposta das células T auxiliares de tipo Th1 contra o epitopo de carboidrato que pode ser detecta- 15 da pelos testes de resposta imunocelular 1, 2, 3, 4 e 5. Os testes menciona- dos também podem ser usados em conjunto com os métodos de identifica- ção de um micro-organismo carboidrato positivo adequado descritos aqui de maneira a se testar/analisar quais micro-organismos carboidrato positivos são também capazes de disparar uma reposta imunocelular.
Os testes de resposta imunocelular mencionados compreendem
a colocação em contato entre células dendríticas carregadas com um micro- organismo carboidrato positivo junto com células imunes e cultivo por perío- dos apropriados e sob condições apropriadas e subsequente adição, para fins de re-estimulação, de células dendríticas carregadas com pelo menos 25 uma molécula veículo do epitopo de carboidrato e cultivo por períodos apro- priados e sob condições apropriadas e subsequente medição da quantidade de GM-CSF, TNF-alfa ou INF-gama secretados, ou da medição da prolifera- ção das células T, ou da inibição da secreção de GM-CSF, TNF-alfa ou INF- gama, ou da proliferação por anticorpos contra o epitopo de carboidrato, ou 30 a medição da apresentação do epitopo de carboidrato nas células dendríti- cas ou a medição da lise das células positivas para o epitopo de carboidrato pelas células imunes ativadas, preferencialmente células T ativadas. As células dendríticas mencionadas, aqui também denominadas DCs. podem ser qualquer célula dendrítica ou uma mistura de células den- dríticas ou uma mistura compreendendo células dendríticas ou pelo menos uma célula dendrítica. Elas podem derivar de doadores humanos saudáveis ou que têm uma doença tal como, sem limitação a, uma doença tumoral, ou a doença de Crohn, ou uma doença positiva para o epitopo de carboidrato ou uma das doenças listadas em outra parte deste, ou podem derivar de a- nimais. As DCs mencionadas podem ser obtidas e carregadas como conhe- cido daqueles versados na técnica e são normalmente obtidas de células precursoras CD34 ou células monocíticas CD14-positivas do sangue huma- no ou da medula óssea diferenciadas em células dendríticas imaturas (iDC) usando-se determinada combinação de moléculas apropriadas conhecidas daqueles versados na técnica. As iDCs são carregadas com o micro- organismo carboidrato-positivo ou com a molécula veículo do epitopo de carboidrato, ou com os controles apropriados e são adicionalmente amadu- recidas usando-se determinada combinação de moléculas apropriadas co- nhecidas daqueles versados na técnica para a obtenção de células dendríti- cas carregadas correspondentes a células dendríticas maduras carregadas (MDCs) capazes de ativar células T. Essas DCs podem também ser do tipo Langerhans.
Em uma modalidade preferida, as DCs mencionadas se origi- nam de uma linhagem de células dendríticas tal como, sem limitação a, a linhagem de células dendríticas humanas NEMOD-DC (obtenível da Glyco- tope GmbH, Berlim, Alemanha; www.qlycotope.com) ou MUTZ-3.
O carregamento das células dendríticas mencionado significa
que as células dendríticas são incubadas no estado apropriado de diferenci- ação e maturação com quantidades apropriadas de um micro-organismo carboidrato-positivo, ou frações ou Iisados do mesmo ou pelo menos uma molécula veículo do epitopo de carboidrato por um período apropriado; nor- 30 malmente isso ocorre durante a etapa de amadurecimento descrita acima em combinação com moléculas adequadas, normalmente por 24 a 48 horas, o que leva a células dendríticas carregadas capazes de ativar células imu- nes, preferivelmente células T, compreendendo células T carboidrato- específicas.
AS células imunes mencionadas podem ser PBMCs (células mononucleares do sangue periférico) ou outras populações celulares com- 5 preendendo células T CD4+ e/ou CD8+, preferivelmente células T CD4+ e CD8+. Aqueles versados na técnica sabem como obter essas células de um ser humano ou um animal e a geração dessas células pode compreender preparações por gradiente de ficoll do sangue humano ou de células sanguí- neas de leucaférese e podem compreender no caso enriquecimento posteri- 10 or por tecnologias de seleção magnética específicas para células T.
Em uma modalidade preferida, as células dendríticas são com- binadas em pelo menos uma molécula de MHC com as células imunes, pre- ferivelmente em uma molécula de MHC de classe I ou molécula de MHC de classe II, mais preferivelmente em pelo menos uma molécula de MHC de 15 classe I molécula de MHC de classe II, mais preferivelmente em mais molé- culas de MHC e de maneira mais preferível em todas as moléculas de MHC. Essa última condição pode ser alcançada mediante obtenção das células dendríticas e das células imunes do mesmo indivíduo.
Os períodos e condições apropriados mencionados para o culti- 20 vo das células imunes com as células dendríticas carregadas e para a sub- sequente adição das células dendríticas carregadas são conhecidos daque- les versados na técnica e podem ser otimizados pela consideração das con- dições nas quais as células se encontram. Normalmente, o tempo de incu- bação é de 7 a 10 dias para cada uma das duas etapas (ativação primária e 25 re-estimulação).
A molécula veículo do epitopo de carboidrato mencionada, no sentido dos testes de resposta imunocelular descritos, significa quantidades suficientes de uma célula ou célula tumoral veículoa do epitopo de carboidra- to, uma proteína veículoa do epitopo de carboidrato, ou um polipeptídeo veí- 30 culo do epitopo de carboidrato. A célula ou célula tumoral mencionada veícu- loa do epitopo de carboidrato pode estar viva ou morta, ou ser um Iisado dessas células ou uma fração das mesmas, mais preferivelmente um lisado. Uma proteína veículoa do epitopo de carboidrato pode ser qualquer proteína veículoa do epitopo de carboidrato, tal como proteínas carregadoras nas quais o epitopo de carboidrato se liga em tumores. Um polipeptídeo veículo do epitopo de carboidrato pode ser qualquer polipeptídeo veículo do epitopo 5 de carboidrato, preferivelmente aqueles que podem ser apresentados com epitopo de carboidrato na CDm.
O micro-organismo carboidrato-positivo mencionado no sentido dos testes de resposta imunocelular descritos significa quantidades suficien- tes do micro-organismo carboidrato-positivo particular que pode estar vivo ou morto, ou ser um Iisado daquelas células ou fração das mesmas, mais prefe- rivelmente um Iisado ou fração das mesmas.
Controles são usados para confirmar adicionalmente a positivi- dade da resposta imune. Aqueles versados na técnica são capazes de usar controles apropriados tais como aqueles descritos em maior detalhe abaixo 15 e no exemplo 12. Exemplos são o uso de controles que são carregados nas DCs como descrito para as moléculas veículo do epitopo de carboidrato e usados para re-estimulação e que podem compreender (i) células que são negativas para o epitopo de carboidrato ou que não o compreendem, prefe- rivelmente aquelas que estão relacionadas com ou se assemelham tanto 20 quanto possível às células positivas para o epitopo de carboidrato, no forma- to correspondente tal como vivas ou mortas, ou um Iisado daquelas células ou uma fração das mesmas; (ii) uma proteína não veículoa do epitopo de carboidrato, preferivelmente a mesma proteína que aquela usada como a molécula veículo do epitopo de carboidrato, mas sem o epitopo de carboidra- 25 to, preferivelmente sem qualquer glicosilação ou com uma estrutura de car- boidrato alongada ou encurtada não compreendendo o epitopo de carboidra- to, (iii) um polipeptídeo não veículo do epitopo de carboidrato, preferivelmen- te o mesmo polipeptídeo que aquele usado como a molécula veículo do epi- topo de carboidrato, mas sem o epitopo de carboidrato, preferivelmente sem 30 qualquer glicosilação ou com uma estrutura de carboidrato alongada ou en- curtada não compreendendo o epitopo de carboidrato. Controles adicionais podem ser (iv) MDCs não carregadas tratadas da mesma maneira que MDCs carregadas com as moléculas veículo do epitopo de carboidrato inclu- indo as moléculas necessárias e condições de maturação mas sem qualquer molécula adicional correspondendo à molécula veículo do epitopo de carboi- drato ou aos controles supramencionados (i-iii). Os exemplos e as modalida- 5 des preferidas descrevem em detalhe os controles mais adequados, enquan- to outros mais adequados podem ser selecionados por aqueles versados na técnica.
Em uma modalidade preferida da invenção, as células dendríti- cas são células dendríticas funcionais obtidas da linhagem celular da Ieuce- 10 mia MUTZ-3 [como descrito em DE10139428 A1, W02003/023023 A1, EP01419240, US20040265998, CA2457287, 10139428.4 (DE), PCT/EP02/09260, 02758474.7 (EP), US10/486.966, CA2.547.287)] ou célu- las derivadas da MUTZ-3 tais como NEMOD-DC (por exemplo, NMD-100 ou NMD-200 obteníveis da Glycotope GmbH, Berlim, Alemanha 15 [www.glycotope.com]). Essas células dendríticas são células dendríticas ati- vas plenamente capazes de ativar células T e processar e/ou apresentar antígenos em sua superfície, incluindo em moléculas de classe MHC. Em uma modalidade preferida adicional da invenção, as células dendríticas são células dendríticas funcionais obtidas da MUTZ-3 ou células derivadas da 20 MUTZ-3, tais como NMD-100 ou NMD-200 e as células imunes são combi- nadas na molécula de MHC de classe I tal como HLA-A2 ou HLA-B44, prefe- rivelmente HLA-A2 e HLA-B44. Em uma modalidade preferida adicional, um Iisado de células compreendendo o epitopo de carboidrato é usado como molécula veículo do epitopo de carboidrato.
Devido a variações de experimento a experimento, algo particu-
larmente comum no caso de métodos imunológicos celulares conhecidos daqueles versados na técnica, os controles precisam ser determinados em paralelo ao teste, como é de conhecimento daqueles versados na técnica.
De acordo com uma modalidade, a invenção proporciona um teste in vitro da resposta imunocelular contra um epitopo de carboidrato de interesse compreendendo
a) o carregamento de pelo menos uma célula dendrítica com um primeiro composto carboidrato-positivo, sendo que tal composto carboidrato- positivo carrega o epitopo de carboidrato de interesse;
b) a colocação em contato entre uma quantidade apropriada de pelo menos uma célula dendrítica mencionada carregada com o composto
carboidrato-positivo mencionado com uma quantidade apropriada de células imunes que podem ser ativadas ou inibidas por uma célula dendrítica;
c) o cultivo de maneira a permitir a interação de tais células imu- nes com as células dendríticas carregadas mencionadas;
d) a adição de uma quantidade apropriada de células apresen- tadoras de antígenos (APCs) carregadas com uma quantidade apropriada de
pelo menos um segundo composto carregando o mesmo epitopo de carboi- drato que o primeiro composto mencionado, sendo que o segundo composto mencionado é diferente do primeiro composto carboidrato-positivo mencio- nado;
e) cultivo para re-estimulação das células imunes mencionadas;
f) determinação da quantidade de células imunes re- estimuladas.
A invenção proporciona um método para determinar se certo e- pitopo de carboidrato é capaz de disparar uma resposta imunocelular. Até agora, a técnica anterior assumia que carboidratos são incapazes de dispa- rar respostas imunes celulares. Entretanto, descobriu-se agora que certos epitopos de carboidrato são capazes de disparar uma resposta imunocelular. É, assim, importante proporcionar sistemas de teste para determinar se um determinado epitopo de carboidrato é de fato capaz de disparar uma respos- ta correspondente, determinando assim se tal epitopo de carboidrato é um ponto de atuação adequado, por exemplo para terapia. A invenção usa, as- sim, células dendríticas uma vez que as células dendríticas são capazes de iniciar e, dessa maneira, estimular células imunes tais como células T. As células dendríticas processam os compostos que encontram e apresentam os compostos/antígenos processados em sua superfície. Entretanto, células de MHC tais como as células dendríticas podem apresentar apenas certos tipos de antígenos e é importante determinar se o o antígeno/epitopo de inte- resse pode ser apresentado por células dendríticas, uma vez que apenas tais antígenos/epitopos são capazes de disparar uma resposta imunocelular. Os princípios desse teste de resposta imunocelular também estão ilustrados na Figura 22.
5 As células dendríticas são, portanto, carregadas com o compos-
to de interesse que se acredita carregar ou carrega a estrutura de carboidra- to/epitopo de interesse. O composto mencionado pode, por exemplo, ser um micro-organismo que carrega o epitopo de carboidrato de interesse como aqui descrito, uma célula tumoral ou qualquer outro composto que carrega o 10 epitopo de carboidrato de interesse. Condições adequadas para o carrega- mento e compostos adequados veículos das estruturas de carboidrato são descritos aqui.
As células dendríticas carregadas mencionadas são então pos- tas em contato com células imunes, particularmente linfócitos como as célu- 15 Ias T. As células imunes podem ser obtidas, por exemplo, de doadores hu- manos. Células dendríticas apresentadoras de antígenos que combinam com os receptores das células imunes ativam e assim estimulam os linfóci- tos, permitindo, dessa maneira, que estes proliferem e sobrevivam. Os linfó- citos que não combinam com os antígenos apresentados pelas células den- 20 dríticas não são ativados e morrem.
A primeira rodada de estimulação proporciona linfócitos ativados específicos para qualquer antígeno correspondente apresentado por tais células dendríticas carregadas. Contudo, o objetivo do presente método é identificar se o epitopo de carboidrato/antígeno de interesse pode estimular uma resposta celular.
Portanto, uma etapa de seleção é realizada na qual os linfócitos são re-estimulados de maneira a se determinar se o carboidrato de interesse estimula os linfócitos e, assim, dispara uma resposta celular. Na etapa de seleção mencionada, células apresentadoras de antígenos tais como, por 30 exemplo, células dendríticas, são carregadas com um segundo composto que também carrega o carboidrato de interesse. Tal segundo composto, con- tudo, é diferente do primeiro composto. Este segundo composto também é processado pelas APCs e os antígenos são apresentados por tais APCs. À medida que o segundo composto é diferente do primeiro composto, a maior parte dos antígenos apresentados, preferivelmente todos os antígenos — além do epitopo de carboidrato de interesse — são diferentes dos antígenos 5 apresentados na primeira rodada. Isso tem o efeito de fazer com que sobre- vivam à segunda rodada de re-estimulação apenas aqueles linfócitos que encontram um antígeno correspondente apresentado pelas APCs mencio- nadas. Caso as células dendríticas da primeira rodada assim como as APCs da segunda rodada apresentem ambas um antígeno compreendendo ou 10 consistindo no epitopo de carboidrato de interesse, os linfócitos que reco- nhecem tal antígeno são estimulados e, assim, sobrevivem, à medida que são também re-estimulados. Os linfócitos que não encontram um parceiro correspondente quando em contato com as APCs mencionadas carregadas com o segundo composto mencionado que carrega o epitopo de carboidrato 15 de interesse morrem devido à falta de re-estimulação. Essa etapa de sele- ção garante que uma resposta celular contra o carboidrato de interesse seja detectada.
Na última etapa, determina-se se os linfócitos foram de fato re- estimulados. Isso pode ser feito, por exemplo, determinando-se — os produtos de secreção dos linfócitos que são secretados
quando tais linfócitos são (re)estimulados, tais como interferon-alfa, interfe- ron-gama ou GM-CSF
— a proliferação das células T.
Testes adequados para se determinar a ocorrência da re- estimulação são descritos aqui.
A especificidade do teste mencionado pode ser aumentada u- sando-se uma estrutura de ligação a carboidrato que reconheça especifica- mente tal epitopo de carboidrato de interesse quando apresentada pelas cé- lulas dendríticas/APCs. De acordo com tal modalidade, pelo menos uma 30 porção de tais linfócitos estimulados de acordo com a etapa c) são postos em contato com uma quantidade apropriada de células apresentadoras de antígeno (APCs) carregadas com uma quantidade apropriada de pelo menos um segundo composto veículo do mesmo epitopo de carboidrato que o pri- meiro composto, sendo que tal segundo composto é diferente do composto carboidrato-positivo mencionado, na presença de uma molécula de ligação carboidrato que reconheça o epitopo de carboidrato de interesse. A molécula 5 de ligação carboidrato mencionada que reconhece o epitopo de carboidrato de interesse mencionado bloqueia a interação das APCs com os linfócitos mencionados, impedindo assim a re-estimulação e, consequentemente, a sobrevivência das células. Essa etapa adicional garante adicionalmente que o carboidrato de interesse estimule os linfócitos de maneira específica e dis- 10 pare, assim, uma resposta imunocelular específica. Essa etapa de aumen- to/confirmação da especificidade pode ser feita seja em paralelo — dividin- do-se os linfócitos estimulados de acordo com a etapa c — ou realizando-se tal etapa de aumento/confirmação adicionalmente e, portanto, posteriormen- te.
De acordo com uma primeira modalidade (teste de resposta i-
munocelular 1) a quantidade/grau de linfócitos re-estimulados é determinada pela medição da secreção de GM-CSF. Por exemplo, a quantidade de GM- CSF secretada pode ser medida por ELISA ou ELISPOT.
De acordo com uma modalidade preferida, um teste de resposta imunocelular (modalidade de um teste de resposta imunocelular 1) contra o epitopo de carboidrato é proporcionado que compreende
a) colocação em contato entre uma quantidade apropriada de células dendríticas compreendendo pelo menos uma célula dendrítica, célu- las dendríticas, ou uma mistura de células compreendendo pelo menos uma 25 célula dendrítica, carregadas com uma quantidade adequada do micro- organismo carboidrato-positivo, um Iisado ou fração do mesmo, formulações compreendendo os mesmos, o nutracêutico ou a composição farmacêutica da invenção junto com uma quantidade apropriada de células imunes com- preendendo pelo menos uma célula imune, célula T CD4+, célula T CD8+, 30 uma mistura de células compreendendo pelo menos uma célula T ou células mononucleares do sangue periférico, que podem ser ativadas ou inibidas por uma célula dendrítica b) cultivo por um período apropriado e sob condições apropria- das
c) adição de uma quantidade apropriada de células dendríticas compreendendo pelo menos uma célula dendrítica, células dendríticas ou
uma mistura de células compreendendo pelo menos uma célula dendrítica carregada com uma quantidade apropriada de pelo menos uma molécula veículo do epitopo de carboidrato
d) cultivo por um período apropriado e sob condições apropria- das para re-estimulação
e) medição da quantidade secretada de GM-CSF por ELISA ou
ELISPOT, sendo que uma resposta imunocelular positiva contra o epitopo de carboidrato mostra (i) uma secreção significativamente maior de GM-CSF pelas células imunes re-estimuladas mencionadas com as células dendríti- cas mencionadas carregadas com uma molécula veículo do epitopo de car- 15 boidrato do que a secreção de GM-CSF pelas células imunes corresponden- tes re-estimuladas com células dentríticas não carregadas correspondentes e/ou maior do que a secreção de GM-CSF pelas células imunes correspon- dentes re-estimuladas com as células dendríticas correspondentes carrega- das com uma molécula que não carrega ou compreende o epitopo de car- 20 boidrato e/ou (ii) uma secreção de GM-CSF pelas células imunes menciona- das re-estimuladas com as células dendríticas mencionadas carregadas com uma proteína, peptídeo ou molécula que carrega ou compreende o epitopo de carboidrato significativamente maior do que a secreção de GM-CSF pelas células imunes correspondentes re-estimuladas com as células dendríticas 25 correspondentes carregadas com a proteína, peptídeo ou molécula corres- pondente que não carrega ou compreende o epitopo de carboidrato, e/ou (iii) uma secreção de GM-CSF pelas células imunes re-estímuladas menciona- das com as células dendríticas mencionadas carregadas com uma proteína, peptídeo ou molécula que carrega ou compreende o epitopo de carboidrato 30 significativamente maior do que a secreção de GM-CSF das células imunes correspondentes re-estimuladas com as células dendríticas correspondentes carregadas com a proteína, peptídeo ou molécula correspondente que car- rega ou compreende o epitopo de carboidrato mas quimicamente ou enzima- ticamente tratadas para a destruição do epitopo de carboidrato, e/ou (iv) uma secreção de GM-CSF pelas células imunes mencionadas re-estimuladas com as células dendríticas mencionadas carregadas com um Iisado ou fra- 5 ções de células compreendendo o epitopo de carboidrato significativamente maior do que a secreção de GM-CSF pelas células imunes correspondentes re-estimuladas com as células dendríticas correspondentes carregadas com uma Iisado de células negativas para o epitopo de carboidrato ou não o compreendendo.
"Células imunes correspondentes" significa que as mesmas cé-
lulas imunes, que são ou compreendem pelo menos uma célula imune, célu- la T CD4+, célula T CD8+, uma mistura de células compreendendo pelo me- nos uma célula T, ou células mononucleares do sangue periférico ou outras células e misturas de células descritas em outra parte, que podem ser ativa- 15 das ou inibidas por uma célula dendrítica, são usadas como controle ou teste comparativo com uma molécula de controle ou de teste, ou mistura de molé- culas, células, Iisados ou frações de células, micro-organismo ou frações do mesmo, do que aquelas que são usadas no lugar das células imunes men- cionadas de maneira a permitir uma comparação.
"Células dendríticas correspondentes" significa que as mesmas
células dendríticas que são ou compreendem pelo menos uma célula dendrí- tica, células dendríticas, ou uma mistura de células compreendendo pelo menos uma célula dendrítica ou outras células e misturas de células descri- tas em outra parte, são capazes de ativar células T carregadas com uma 25 quantidade apropriada de pelo menos uma molécula veículo do epitopo de carboidrato, são usadas para o controle ou teste comparativo com uma mo- lécula de teste ou controle, mistura de moléculas, células, Iisados de células ou frações, micro-organismo ou frações do mesmo ou sem qualquer, que aquelas usadas como células dendríticas de maneira a permitir uma compa- 30 ração.
Isso é conhecido daqueles versados na técnica e elas podem ser selecionadas por aqueles versados na técnica. Isso é mostrado em mai- or detalhe nos exemplos. Para esclarecer: por exemplo, a mesma quantida- de de células imunes da mesma preparação é colocada em contato com a mesma quantidade de células dendríticas da mesma preparação carregadas com a mesma quantidade de asialoglicoforina e em paralelo com a mesma 5 quantidade de glicoforina ou asialoglicoforina tratada com periodato e usada no teste para permitir condições ótimas de comparabilidade.
Variações são conhecidas daqueles versados na técnica e po- dem ser determinadas por eles ou estão descritas em maior detalhe nos e- xemplos.
O teste de resposta imunocelular 1 mencionado testa a ativação
de células T CD4+ e/ou CD8+ específicas para o epitopo de carboidrato por um micro-organismo carboidrato-positivo pela medição da secreção especí- fica induzida de GM-CSF compreendendo: colocação em contato entre célu- las dendríticas carregadas com um micro-organismo carboidrato-positivo, 15 Iisado ou fração do mesmo e células imune e cultivo por períodos apropria- dos em condições apropriadas e subsequente adição de células dendríticas carregadas com uma molécula veículo do epitopo de carboidrato para re- estimulação e cultivo por períodos apropriados em condições apropriadas e subsequente medição da quantidade de GM-CSF secretada em resposta a 20 esta re-estimulação. A medição mencionada da quantidade de GM-CSF se- cretada é realizada preferivelmente mediante ELISA ou ELISPOT, mais pre- ferivelmente ELISA, e é conhecida daqueles versados na técnica. Na moda- lidade mais preferida da invenção, o teste de resposta imunocelular 1 com- preende a colocação em contato entre células dendríticas funcionais obtidas 25 de células derivadas da MUTZ-3, NMD-100 ou NMD-200 carregadas com um micro-organismo carboidrato-positivo junto com PBMCs (células mono- nucleares do sangue periférico) combinadas pelo menos no MHC de classe I (HLA-A2) e (HLA-B44) e cultivo dessas células por tempos apropriados e em condições apropriadas, normalmente de 7 a 10 dias, e subsequente adição 30 para re-estimulação de células dendríticas obtidas de células derivadas da MUTZ-3 carregadas com Iisado de células compreendendo o epitopo de carboidrato, ou com uma molécula veículo do carboidrato e cultivo por perío- dos apropriados em condições apropriadas, normalmente de 7 a 9 dias, e subsequente medição da quantidade de GM-CSF secretada em uma análise ELISA ou ELISPOT. A análise ELISA e ELISPOT da liberação de GM-CSF são conhecidas daqueles versados na técnica e estão descritas em detalhe nos exemplos. Uma resposta imunocelular positiva contra o epitopo de car- boidrato mostra uma secreção de GM-CSF mais alta pelas células imunes re-estimuladas com DCs carregadas com um Iisado de células compreen- dendo o epitopo de carboidrato do que a secreção das células imunes re- estimuladas com DCs carregadas com um Iisado de células negativas para o epitopo de carboidrato e/ou mostra uma secreção de GM-CSF maior pelas células imune re-estimuladas com DCs carregadas com uma molécula veí- culo do epitopo de carboidrato do que as células imunnes re-estimuladas com DCs carregadas com uma molécula negativa para o epitopo de carboi- drato. Uma modalidade preferida do teste de resposta imunocelular 1 está descrita em detalhe no exemplo 12.
De acordo com uma segunda modalidade (teste de resposta i- munocelular 2) a quantidade/grau de linfócitos re-estimulados é determinada pela medição da quantidade de secreção de INF-gama ou TNF-alfa. Em uma modalidade preferida, o teste de resposta imunocelular 2 mencionado contra o epitopo de carboidrato compreende
a) colocação em contato entre uma quantidade apropriada de células dendríticas compreendendo pelo menos uma célula dendrítica, célu- las dendríticas, ou uma mistura de células compreendendo pelo menos uma célula dendrítica, carregadas com uma quantidade apropriada do micro-
organismo carboidrato-positivo, um lísado ou uma fração do mesmo, formu- lações que os compreendem, o nutracêutico ou a composição farmacêutica da invenção junto com uma quantidade adequada de células imunes com- preendendo pelo menos uma célula imune, célula T CD4+, célula CD8+, uma mistura de células compreendendo pelo menos uma célula T, ou célu- 30 Ias mononucleares do sangue periférico, que podem ser ativadas ou inibidas por uma célula dendrítica.
b) cultivo por um período apropriado e sob condições apropria- das
c) adição de uma quantidade apropriada de células dendríticas compreendendo pelo menos uma célula dendrítica, células dendríticas, ou uma mistura de células compreendendo pelo menos uma célula dendrítica,
5 carregadas com uma quantidade apropriada de pelo menos uma molécula veículo do epitopo de carboidrato
d) cultivo por um período apropriado e sob condições apropria- das para re-estimulação e
e) medição da quantidade de INF-gama e/ou TNF-alfa secretada 10 por ELISA ou ELISPOT, sendo que uma resposta imunocelular positiva con- tra o epitopo de carboidrato mostra (i) secreção de INF-gama e/ou TNF-alfa pelas células imunes re-estimuladas com as células dendríticas menciona- das carregadas com uma molécula que carrega ou compreende o epitopo de carboidrato significativamente maior do que a secreção de INF-gama e/ou
TNF-alfa pelas células imunes correspondentes re-estimuladas com as célu- las dendríticas correspondentes mencionadas não carregadas e/ou uma se- creção de INF-gama e/ou TNF-alfa pelas células imunes mencionadas re- estimuladas com células dendríticas mencionadas carregadas com uma mo- lécula que carrega ou compreende o epitopo de carboidrato maior do que a 20 secreção de INF-gama e/ou TNF-alfa pelas células imunes correspondentes re-estimuladas com as células dendríticas correspondentes carregadas com uma molécula que não carrega ou não compreende o epitopo de carboidrato e/ou (ii) uma secreção de INF-gama e/ou TNF-alfa pelas células imunes mencionadas re-estimuladas com as células dendríticas mencionadas carre- 25 gadas com uma proteína, um peptídeo, uma molécula que carrega ou com- preende o epitopo de carboidrato significativamente maior do que a secreção de INF-gama e/ou TNF-alfa pelas células imunes correspondentes re- estimuladas com as células dendríticas correspondentes carregadas com proteína, peptídeo ou molécula correspondente que não carrega ou compre- 30 ende o epitopo de carboidrato e/ou (iii) uma secreção de INF-gama e/ou TNF-alfa pelas células imunes re-estimuladas com as células dendríticas mencionadas carregadas com uma proteína, peptídeo ou molécula que car- rega ou compreende o epitopo de carboidrato significativamente maior do que a secreção de INF-gama e/ou TNF-alfa das células imunes correspon- dentes re-estimuladas com as células dendríticas correspondentes carrega- das com a correspondente proteína, peptídeo ou molécula que carrega ou 5 compreende o epitopo de carboidrato mas enzimaticamente ou quimicamen- te tratada para a destruição do epitopo de carboidrato e/ou (iv) uma secre- ção de INF-gama e/ou TNF-alfa pelas células imunes re-estimuladas com as células dendríticas mencionadas carregadas com um um Iisado ou frações de células compreendendo o epitopo de carboidrato significativamente maior 10 do que a secreção de INF-gama e/ou TNF-alfa das células imunes corres- pondentes re-estimuladas com as células dendríticas correspondentes car- regadas com um Iisado de células negativo para o epitopo de carboidrato ou que não o compreendem.
O teste de resposta imunocelular 2 mencionado testa a ativação de células T citotóxicas tais como os CTLs (linfócitos T citotóxicos) e/ou célu- las T auxiliares de tipo Th1 para células T citotóxicas ativadas epitopo- específicas por um micro-organismo carboidrato-positivo. A medição men- cionada da quantidade de IFN-gama e/ou TNF-alfa secretada é feita preferi- velmente por ELISA ou ELISPOT, mais preferencialmente ELISPOT e é co- nhecida daqueles versados na técnica. Na modalidade mais preferida da invenção, o teste de resposta imunocelular 2 compreende a colocação em contato entre células dendríticas funcionais obtidas de células derivadas da MUTZ-3 ou NMD-100 ou NDM-200 carregadas com um micro-organismo carboidrato-positivo junto com PBMCs (células mononucleares do sangue periférico) combinadas pelo menos no MHC de classe I (HLA-A2 e HLA-B44) e cultivo dessas células por períodos apropriados e sob condições apropria- das, normalmente de 7 a 10 dias, e subsequente adição para re-estimulação de células dendríticas funcionais obtidas de células derivadas da MUTZ-3, NMD-100 ou NMD-200 carregadas com Iisado de células compreendendo o epitopo de carboidrato ou uma molécula veículo do epitopo de carboidrato e cultivo por períodos apropriados e sob condições apropriadas, normalmente de 7 a 9 dias, e subsequente medição da quantidade da IFN-gama secreta- da mediante análise por ELISPOT e/ou da TNF-alfa secretada mediante análise por ELISA. A análise por ELISA e ELISPOT da TNF-alfa e da INF- gama é conhecida daqueles versados na técnica e é descrita em detalhes nos exemplos. Uma modalidade preferida do teste de resposta imunocelular 2 está descrita em detalhe no exemplo 12.
De acordo com uma terceira modalidade (teste de resposta imu- nocelular 3) a quantidade/grau de linfócitos re-estimulados é determinada pela medição da proliferação e/ou indução de proliferação. Em uma modali- dade preferida, o teste de resposta imunocelular 3 mencionado contra o epi- topo de carboidrato compreende
a) promoção de contato entre uma quantidade adequada de cé- lulas dendríticas compreendendo pelo menos uma célula dendrítica, células dendríticas, ou uma mistura de células compreendendo pelo menos uma célula, carregadas com uma quantidade adequada do micro-organismo car-
boidrato-positivo, um Iisado ou uma fração do mesmo, formulações que os compreendam, o nutracêutico ou a composição farmacêutica da invenção junto com uma quantidade adequada de células imunes compreendendo pelo menos uma célula imune, célula T CD4+, célula T CD8+, uma mistura de células compreendendo pelo menos uma célula T, ou células mononucle- 20 ares do sangue periférico, que podem ser ativadas ou inibidas por uma célu- la dendrítica.
b) cultivo por um período apropriado e sob condições apropria- das
c) adição de uma quantidade apropriada de células dendríticas compreendendo pelo menos uma célula dendrítica, células dendríticas, ou
uma mistura de células compreendendo pelo menos uma célula dendrítica, carregadas com uma quantidade apropriada de pelo menos uma molécula veículo do epitopo de carboidrato
d) cultivo por um período apropriado e sob condições apropria- das para re-estimulação e
e) medição da proliferação e/ou indução de proliferação, preferi- velmente usando-se a reação WST em combinação com uma medição colo- rimétrica (como descrito nos exemplos), sendo que uma resposta imunocelu- lar positiva contra o epitopo de carboidrato mostra (i) uma proliferação signi- ficativamente maior de células imunes ou um número significativamente maior de células T após um certo período de cultivo quando re-estimuladas 5 com as células dendríticas mencionadas carregadas com uma molécula car- regando ou compreendendo o epitopo de carboidrato do que a proliferação ou número quando re-estimuladas com as células dendríticas corresponden- tes não-carregadas e/ou do que a proliferação ou número quando re- estimuladas com as células dendríticas correspondentes carregadas com 10 uma molécula que não carrega ou compreende o epitopo de carboidrato e/ou (ii) uma proliferação significativamente maior de células imunes ou um número significativamente maior de células T após um certo período de cul- tivo quando re-estimuladas com as células dendríticas mencionadas carre- gadas com uma proteína, peptídeo ou molécula carregando ou compreen- 15 dendo o epitopo de carboidrato do que a proliferação ou o número quando re-estimuladas com as células dendríticas correspondentes carregadas com a proteína, peptídeo ou molécula correspondente que não carrega ou não compreende o epitopo de carboidrato e/ou (iii) uma proliferação de células imunes significativamente maior ou um número de células T significativa- 20 mente maior após um certo período de cultivo quando re-estimuladas com as células dendríticas correspondentes carregadas com uma proteína, pep- tídeo ou molécula carregando ou compreendendo o epitopo de carboidrato do que a proliferação ou o número de células imunes correspondentes re- estimuladas com as células dendríticas correspondentes carregadas com a 25 proteína, peptídeo ou molécula correspondente carregando ou compreen- dendo o epitopo de carboidrato mas enzimaticamente ou quimicamente tra- tadas para a destruição do epitopo de carboidrato e/ou (iv) uma proliferação significativamente maior de células imunes ou um número significativamente maior de células T após um certo período de cultivo quando re-estimuladas 30 com as células dendríticas mencionadas carregadas com um Iisado ou fra- ções de células carregando ou compreendendo o epitopo de carboidrato do que a proliferação ou o número de células imunes correspondentes re- estimuladas com as células dendríticas correspondentes carregadas com um Iisado de células negativas para o epitopo de carboidrato ou não o compre- endendo.
O teste de resposta imunocelular 3 mencionado testa a ativação de células T CD4+ e CD8+ para células T caboidrato-específicas ativadas por um micro-organismo carboidrato-positivo ou uma fração ou Iisado do mesmo pela medição da indução da proliferação das células T compreen- dendo: colocação em contato entre as células dendríticas carregadas com um micro-organismo carboidrato-positivo e células imunes e cultivo por perí- odos apropriados e sob condições apropriadas e subsequente adição de células dendríticas carregadas com uma molécula veículo do epitopo de car- boidrato para re-estimulação e cultivo por períodos apropriados e sob condi- ções apropriadas e subsequente medição da proliferação. A medição da in- dução da proliferação mencionada é realizada preferencialmente usando-se a reação WST em combinação com uma medição colorimétrica e dedução apenas das DCs e apenas das células imunes não-re-estimuladas, o que é conhecido daqueles versados na técnica e que está descrito no exemplo 12. Na modalidade mais preferida da invenção, o teste de resposta imunocelular 3 compreende: colocação em contato entre células dendríticas funcionais obtidas das células derivadas da MUTZ-3 ou NMD-100 ou NMD-200 carre- gadas com um micro-organismo carboidrato-positivo ou um Iisado ou uma fração do mesmo junto com PBMCs (células mononucleares do sangue peri- férico) combinadas pelo menos no MHC de classe I (HLA-A2 e HLA-B44) e cultivo dessas células por períodos apropriados e sob condições apropria- das, normalmente de 7 a 10 dias e subsequente adição para re-estimulação de células dendríticas funcionais obtidas de células derivadas da MUTZ-3 ou NMD-100 ou NMD-200 carregadas com Iisado de células compreendendo o epitopo de carboidrato ou a molécula veículo do epitopo de carboidrato e cultivo por períodos apropriados e sob condições apropriadas, normalmente de 7 a 9 dias, e subsequente medição da taxa de proliferação como acima descrito e como descrito em maior detalhe no exemplo 12. Uma resposta imunocelular positiva contra o epitopo de carboidrato mostra uma maior pro- liferação de células T re-estimuladas com células dendríticas carregadas com a molécula veículo do epitopo de carboidrato do que a taxa de prolifera- ção das DCs apenas e das células T postas em contato com MDCs não car- regadas ou DCs carregadas com o controle correspondente. Uma modalida- 5 de preferida do teste de resposta imunocelular 3 está descrita em detalhe no exemplo 12.
Em outra modalidade preferida, a invenção proporciona um teste de resposta imunocelular (teste de resposta imunocelular 4) contra o epitopo de carboidrato compreendendo (a) colocação em contato entre uma quantidade apropriada de
uma célula dendrítica, células dendríticas, ou uma mistura de células com- preendendo pelo menos uma célula dendrítica, carregadas com uma quanti- dade apropriada
(i) do micro-organismo carboidrato-positivo, um Iisado ou fra- ção do mesmo.
(ii) formulações que os compreendam,
(iii) o nutracêutico ou a composição farmacêutica da invenção
ou
(iv) uma molécula carregando ou compreendendo o epitopo de
carboidrato,
(v) uma mistura compreendendo uma molécula veículo do epi- topo de carboidrato,
(vi) uma célula positiva para ou compreendendo o epitopo de carboidrato, um Iisado ou fração da mesma,
junto com uma quantidade apropriada de pelo menos uma mo-
lécula de ligação ao carboidrato;
(b) testagem da ligação da molécula de ligação ao carboidrato mencionada.
Uma apresentação positiva do epitopo de carboidrato na(s) célu- la(s) dendrítica(s) mencionada(s) está presente quando a ligação da molécu- la de ligação ao carboidrato é maior à(s) célula(s) dendrítica(s) menciona- da(s) carregada(s) com uma molécula veículo do epitopo de carboidrato do que sua ligação a uma célula ou células dendrítica(s) correspondente(s) não carregada(s) e/ou a uma célula ou células dendrítica(s) carregada(s) com uma molécula que não carrega ou compreende o epitopo de carboidrato ou a uma molécula que carrega ou compreende o epitopo de carboidrato após 5 um tratamento enzimático ou químico que destrói o epitopo de carboidrato e/ou quando a ligação da molécula de ligação ao carboidrato é maior à célu- la ou célula(s) dendrítica(s) mencionada(s) carregadas com o micro- organismo carboidrato-positivo, Iisado ou fração do mesmo, do nutracêutico, da composição farmacêutica ou de formulações dos mesmos do que à célula 10 ou células dendríticas não carregadas ou do que à célula ou células dendríti- ca(s) carregadas com um micro-organismo que não se liga a uma molécula de ligação carboidrato ou a uma célula ou células dendrítica(s) correspon- dentes carregada(s) com o micro-organismo carboidrato-positivo após trata- mento enzimático ou químico que destrói o epitopo de carboidrato.
O teste de resposta imunocelular 4 mencionado testa a capaci-
dade das células dendríticas de apresentar o epitopo de carboidrato em sua superfície após carregamento com um micro-organismo carboidrato-positivo ou uma fração ou Iisado do mesmo, mostrando o potencial das células den- dríticas carregadas para processar e apresentar o epitopo de carboidrato 20 derivado do micro-organismo a células imunes tais como células T, compre- endendo a reunião de quantidades apropriadas de um micro-organismo car- boidrato-positivo ou de uma fração ou Iisado do mesmo e de células dendrí- ticas em um estado apropriado de diferenciação e de maturação, preferivel- mente DCs imaturas que são então amadurecidas em MDCs usando-se um 25 coquetel apropriado de moléculas conhecidas daqueles versados na técnica e medição da apresentação do epitopo de carboidrato pelas DCs carregadas pela testagem da ligação de uma molécula de ligação carboidrato da inven- ção à DC carregada mencionada. Tal testagem da ligação é realizada por métodos apropriados, preferivelmente imunocitoquímica, imunofluorescência 30 ou citometria de fluxo, mais preferivelmente por imunocitoquímica, que são conhecidos daqueles versados na técnica e que estão descritos nos exem- plos. O teste mostra uma apresentação positiva pelas DCs carrega- das quando a ligação da molécula de ligação ao carboidrato é maior às DCs carregadas com o micro-organismo carboidrato-positivo do que às DCs não carregadas, ou mais preferivelmente às DCs carregadas com um micro- 5 organismo que não está ligado por uma molécula de ligação ao carboidrato ou às DCs carregadas com o micro-organismo carboidrato-positivo após tra- tamento enzimático ou químico que destrói o epitopo de carboidrato. Em uma modalidade preferida da invenção, o teste de resposta imunocelular 4 compreende a colocação em contato entre quantidades apropriadas de célu- 10 Ias dendríticas imaturas funcionais obtidas de células derivadas da MUTZ-3 ou NMD-100 ou NMD-200 com Iisados de um micro-organismo carboidrato- positivo e subsequente cultivo e maturação por 24 h - 48 h usando-se um coquetel de moléculas apropriadas, tal como descrito no exemplo 12, e tes- tagem da apresentação do epitopo de carboidrato via microscopia por imu- 15 nofluorescência (imunocitoquímica) usando-se anticorpos específicos para o epitopo de carboidrato.
Uma modalidade preferida do teste de resposta imunocelular 4 está descrita em detalhe no exemplo 12.
A invenção proporciona também um teste de resposta imunoce- Iular (teste de resposta imunocelular 5) contra o epitopo de carboidrato com- preendendo
a) incubação de uma quantidade apropriada de células-alvo de uma linhagem celular compreendendo o epitopo de carboidrato marcado com uma quantidade apropriada de um marcador tal como európio ou cromo 25 51 com pelo menos uma célula imune direcionada contra o epitopo de car- boidrato ou uma mistura de células compreendendo pelo menos uma célula imune direcionada contra o epitopo de carboidrato por um período apropria- do (normalmente entre 3-6 horas ou durante a noite) e sob condições apro- priadas, e
b) medição da lise das células-alvo mediante determinação da
liberação do marcador tal como európio ou cromo 51, sendo que uma res- posta imunocelular positiva contra o epitopo de carboidrato mostra uma lise significativamente maior das células compreendendo o epitopo de carboidra- to do que de células negativas para o epitopo de carboidrato e/ou mostra uma lise significativamente maior das células compreendendo o epitopo de carboidrato incubadas com células imunes direcionadas contra o epitopo de 5 carboidrato, do que a lise das células compreendendo o epitopo de carboi- drato incubadas com as células imunes de controle correspondentes não direcionadas contra o epitopo de carboidrato.
O CIRT 5 testa a citotoxicidade específica para o epitopo de carboidrato das células imunes efetoras direcionadas contra o epitopo de carboidrato, tais como, mas sem limitação a, célula T, células T, clone de células T, linhagem de célula T, células T CD4-positivas, células T CD8- positivas, células NK e/ou PBMCs.
A geração de células imunes direcionadas contra o epitopo de carboidrato está descria em outra parte deste.
Em uma modalidade preferida da invenção, as células imunes
direcionadas contra o epitopo de carboidrato são obtidas mediante a admi- nistração da formulação da invenção, do micro-organismo carboidrato- positivo ou da fração ou Iisado do mesmo a um ser humano ou animal, mais preferivelmente pela administração da formulação da invenção, do micro- 20 organismo carboidrato-positivo ou da fração ou Iisado do mesmo, a um ser humano ou animal e subsequente isolamento das células imunes do humano ou animal.
Em outra modalidade preferida da invenção, as células imunes direcionadas contra o epitopo de carboidrato são re-estimuladas pelo menos 25 uma vez com células dendríticas carregadas com a formulação da invenção, o micro-organismo carboidrato-positivo ou a fração ou Iisado do mesmo ou uma molécula ou célula tumoral que carrega o epitopo de carboidrato antes do seu uso no CIRT 5.
Em uma modalidade mais preferida da invenção, as células i- munes direcionadas contra o epitopo de carboidrato são re-estimuladas mais de uma vez com células dendríticas carregadas com a formulação da inven- ção, o micro-organismo carboidrato-positivo ou a fração ou Iisado do mesmo, ou uma molécula ou célula tumoral que carrega o epitopo de carboidrato an- tes do seu uso no CIRT 5, sendo que o epitopo de carboidrato em veículos diferentes (tais como, mas sem limitação a, o epitopo de carboidrato de um micro-organismo, molécula, proteína ou célula tumoral) é usado em diferen- 5 tes rodadas de re-estimulação.
O teste compreende a incubação de quantidades apropriadas de células-alvo positivas para o epitopo de carboidrato marcadas com quanti- dades apropriadas de células direcionadas contra o epitopo de carboidrato por um período apropriado, normalmente entre 3 a 6 horas ou durante a noi- 10 te. As células positivas para o epitopo de carboidrato são marcadas com eu- rópio ou cromo 51, o que permite a medição das células que são lisadas. A quantidade de células lisadas é determinada preferivelmente pela medição da liberação de európio ou cromo 51 após a incubação. Um controle apro- priado pode ser determinado por aqueles versados na técnica, tal como célu- 15 Ias negativas para o epitopo de carboidrato ou células imunes corresponden- tes de controle não direcionadas contra o epitopo de carboidrato. O teste pode ser otimizado para uso na invenção no que diz respeito aos números apropriados de células tumorais marcadas, números de células imunes efe- toras e tempo de incubação por aqueles versados na técnica.
Em uma modalidade preferida, o CIRT 5 é realizado usando-se
uma análise de liberação de európio. As células-alvo são incubadas por 10 minutos a 4°C em 800 μΙ de tampão de európio (50 mM de HEPES, pH 7,4, 93 mM de NaCI1 5 mM de KCI, 2 mM de MgCI2, 10 mM de ácido dietilenotri- amina penta-acético, 2 mM de acetato de európio (III), eletroporadas (71OV, 25 1 pulso, 30 \js) em um multiporador (Eppendorf) e subsequentemente incu- badas em gelo por outros 10 minutos. Em seguida, as células são lavadas 5 vezes em RPMI/5% de SFB e semeadas em uma placa de fundo arredonda- do de 96 cavidades (Nunc; 5 x 103/cavidade). Em seguida, as células imunes direcionadas contra o epitopo de carboidrato ou as células imunes corres- 30 pondentes são adicionadas como células efetoras (100 μΙ/cavidade) usando- se diferentes proporções de células efetoras/células-alvo entre 100:1 e 5:1, preferivelmente proporções de células efetoras/células-alvo entre 50:1 e 20:1. Para determinar a liberação espontânea, 100 μΙ de RPMI/5% de SFB sem células efetoras são adicionados. A liberação máxima é determinada após a lise completa das células-alvo com etanol.
Após incubação a 37°C por 4 horas, a placa é centrifugada a 5 500 x g por 5 minutos e 20 μΙ de sobrenadante livre de células são pipetados em solução intensificadora (Perkin-Elmer Wallac) a 200 μΙ por cavidade so- bre a placa de fundo chato (Nunc-lmmunoplate Maxisorp) previamente pre- parada. Após incubação por 15 minutos a temperatura ambiente, a fluores- cência é determinada (fluorômetro Victor2, Perkin-Elmer Wallac). A citotoxi- 10 cidade específica é obtida mediante a equação (lise experimental - lise es- pontânea) / (lise máxima - lise espontânea) x 100%.
Em uma modalidade preferida adicional da invenção, um nutra- cêutico ou uma composição farmacêutica compreendendo pelo menos um micro-organismo carboidrato-positivo ou Iisado ou fração do mesmo induz 15 uma resposta imunocelular carboidrato-específica eficaz contra o epitopo de carboidrato que é positiva para pelo menos dois testes de resposta imunoce- lular dentre os testes de resposta imunocelular de 1 a 5.
Em ainda outra modalidade preferida da invenção, um nutracêu- tico ou uma composição farmacêutica compreendendo pelo menos um mi- 20 cro-organismo carboidrato-positivo ou Iisado ou fração do mesmo induz uma resposta imune-humoral e uma resposta imunocelular contra o epitopo de carboidrato que é positiva para pelo menos um teste de resposta imune- humoral e pelo menos um teste de resposta imunocelular.
Em ainda outra modalidade preferida da invenção, um nutracêu- 25 tico ou uma composição farmacêutica compreendendo pelo menos um mi- cro-organismo carboidrato-positivo ou Iisado ou fração do mesmo induz uma resposta imune-humoral e uma resposta imunocelular contra o epitopo de carboidrato que é positiva para pelo menos dois testes de resposta imune- humoral e dois testes de resposta imunocelular, preferivelmente positiva pa- 30 ra os testes de resposta imune-humoral 1 e 3 e para os testes de resposta imunocelular 1 e 3 e, mais preferivelmente, para os testes de resposta imu- ne-humoral 1, 2 e 3 e para os testes de resposta imunocelular 1, 2 e 3 e, ainda mais preferivelmente, para os testes de resposta imune-humoral 1, 2, 3 e 4 e para os testes de resposta imunocelular 1, 2, 3 e 4 e, ainda mais pre- ferivelmente, para os testes de resposta imune-humoral 1, 2, 3, 4 e 6 e para todos os 5 testes de resposta imunocelular e, ainda mais preferivelmente, 5 para os testes de resposta imune-humoral 1, 2, 3, 4 e 5 e para todos os 5 testes de resposta imunocelular e, da maneira mais preferível, positiva para todos os 6 testes de resposta imune-humoral e todos os 5 testes de resposta imunocelular.
Em outra modalidade preferida, a invenção proporciona os tes- tes de resposta imunocelular 1 a 5, nos quais a célula dendrítica, células dendríticas ou uma mistura de células compreendendo células dendríticas compreende pelo menos uma célula dendrítica que é uma célula dendrítica madura quando posta em contato com as células imunes mencionadas.
Em outra modalidade preferida, a invenção proporciona os tes- tes de resposta imunocelular 1 a 5, nos quais a célula dendrítica, células dendríticas ou uma mistura de células compreende células dendríticas fun- cionais obtidas de células derivadas da MUTZ-3.
Em outra modalidade preferida, a invenção proporciona os tes- tes de resposta imunocelular 1 a 5, nos quais as células imunes menciona- das são combinadas com as células dendríticas mencionadas em pelo me- nos uma molécula de MHC de classe I.
Em outra modalidade preferida, a invenção proporciona os tes- tes de resposta imunocelular 1 a 5, nos quais a molécula carredora do epito- po de carboidrato é um Iisado ou fração de células compreendendo o epito- po de carboidrato.
Em outra modalidade preferida, a invenção refere-se ao uso de qualquer um dos testes de resposta imune como descritos acima para se determinar a resposta imune contra o epitopo de carboidrato induzida ou aumentada pelo nutracêutico, pela composição farmacêutica, pelo micro- 30 organismo carboidrato-positivo ou pela fração do mesmo ou por formulações que os compreendam de acordo com esta invenção em pelo menos um ser humano ou animal. Em outra modalidade preferida, a invenção refere-se ao uso de qualquer um dos testes de resposta imune como descritos acima para a tes- tagem da resposta imune natural existente em um ser humano ou animal sem ou antes da administração do nutracêutico, da composição farmacêuti- 5 ca, do micro-organismo carboidrato-positivo ou da fração do mesmo ou de formulações que os compreendam em pelo menos um ser humano ou ani- mal.
Em outra modalidade preferida, a invenção refere-se ao uso de qualquer um dos testes de resposta imune como descritos acima para se 10 determinar e otimizar a quantidade eficaz, a quantidade eficaz máxima, a dose, o regime de dosagem, a via de administração, a composição, a formu- lação, os veículos e outras moléculas usadas com eles do nutracêutico, da composição farmacêutica, do micro-organismo carboidrato-positivo ou da fração do mesmo ou das formulações que os compreendam de acordo com 15 a invenção.
B) Provisão de micro-organismos carboidrato-positivos e méto- dos para a testagem do potencial de um micro-organismo carboidrato- positivo para induzir respostas imunes, método para isolar um micro- organismo carboidrato-positivo, métodos para identificar micro-organismos 20 carboidrato-positivos apropriados para nutracêuticos e composições farma- cêuticas.
A invenção proporciona um micro-organismo carboidrato- positivo que é reconhecido/ligado por pelo menos uma molécula de ligação carboidrato que também reconhece especificamente um epitopo de carboi- 25 drato presente em uma molécula de uma célula de humano ou animal, sen- do que o dito micro-organismo induz uma resposta imunocelular carboidrato- específica eficaz contra o dito epitopo de carboidrato em pelo menos um a- nimal ou humano.
As características e vantagens dos micro-organismos carboidra- to-positivos respectivos e dos métodos para sua obtenção estão descritas acima e abaixo. À medida que o micro-organismo carboidrato-positivo sofre ligação e é, assim, reconhecido por pelo menos uma molécula de ligação carboidrato que também reconhece especificamente o epitopo de carboidra- to de interesse em seu ambiente "natural" (por exemplo, em uma célula hu- mana ou animal, como, por exemplo, uma célula tumoral), garante-se que o micro-organismo carboidrato-positivo e/ou a fração ou Iisado carboidrato- 5 positivo do mesmo carregue uma estrutura de carboidrato que é pelo menos em termos imunoquímicos virtualmente idêntica ao epitopo de carboidrato de interesse. Essa característica é importante para garantir que uma resposta imune disparada pelo micro-organismo carboidrato-positivo mencionado seja suficientemente específica para o epitopo de carboidrato de interesse. Tais 10 moléculas de ligação a carboidrato, preferivelmente anticorpos, que podem ser usadas para determinar que um micro-organismo carrega o epitopo de carboidrato de interesse, reconhecem especificamente o epitopo de carboi- drato, por exemplo, em um ambiente com tumor relevante.
A invenção proporciona um micro-organismo carboidrato- 15 positivo ou fração ou Iisado do mesmo que é reconhecido e, assim, sofre ligação quando em contato com pelo menos uma molécula de ligação car- boidrato que reconheça especificamente um epitopo de carboidrato presente em uma molécula de um ser humano ou animal, o que induz uma resposta imunocelular carboidrato-específica eficaz e/ou uma resposta imune-humoral 20 eficaz contra o dito epitopo de carboidrato e/ou uma estrutura de carboidrato, conjugado de carboidrato ou uma célula de mamífero compreendendo o dito epitopo de carboidrato, em pelo menos um animal ou humano.
Em uma modalidade preferida, o micro-organismo carboidrato- positivo induz uma resposta imunocelular carboidrato-específica eficaz con- 25 tra o dito epitopo de carboidrato e/ou uma estrutura de carboidrato, conjuga- do de carboidrato ou uma célula de mamífero compreendendo o dito epitopo de carboidrato em pelo menos um animal ou humano, compreendendo pre- ferivelmente a ativação de células T CD4-positivas de tipo Th1 e/ou ativação de células T citotóxicas CD8-positivas.
A invenção proporciona um micro-organismo carboidrato-
positivo apropriado para uso em uma formulação de acordo com a invenção selecionada do grupo compreendendo um nutracêutico e uma formulação farmacêutica da invenção no qual o micro-organismo carboidrato-positivo sofre ligação de pelo menos uma molécula de ligação carboidrato que reco- nhece especificamente um epitopo de carboidrato presente em uma molécu- la de uma célula humana ou animal, sendo que o dito micro-organismo induz 5 uma resposta imunocelular carboidrato-específica eficaz contra o dito epito- po de carboidrato, preferivelmente em pelo menos um animal ou humano.
Em outra modalidade preferida, a resposta imune mencionada é induzida in vitro.
A invenção proporciona um micro-organismo carboidrato- positivo que induz um resposta imunocelular carboidrato-específica eficaz contra o dito epitopo de carboidrato, células tumorais positivas para o epito- po de carboidrato ou doenças positivas para o epitopo de carboidrato, prefe- rivelmente em pelo menos um ser humano ou animal e/ou in vitro.
Em uma modalidade preferida, a invenção proporciona ou usa o (i) micro-organismo carboidrato-positivo da invenção ou,
(ii) o nutracêutico ou a formulação farmacêutica compreendendo um micro-organismo carboidrato-positivo
que é selecionado do grupo compreendendo Escherichia coli, Streptococcus, Bacteroides, Rhuminococcus, Lactobaciilus, Bifidobacterium, Peptostreptococcus, Fusobacterium, Johnso- nella, Atopobium, Staphyiococcus, Eubacterium, Finegoldia, Clostridium, Eg- gerthelia, Butyribacterium, Citrobacter, Heiicobacter, Propionibacterium e Corynebacterium.
e mais preferivelmente selecionado do grupo compreendendo Eseheriehia coli, Baeteroidess, tais como Bacteroides ovatus, Bacteroides thetaiotaomicron, Bacteroides acidophilus, Bacteroides caccae;
e ainda mais preferivelmente selecionado do grupo compreen- dendo a nova cepa de Bacteroides ovatus AG6 (DSM 18726), a nova cepa de Bacteroides ovatus MU1 (DSM 18728) e a nova cepa de Eseherichia coli 30 LH2 (DSM 18727) depositadas na "DSZM - Deutsche Sammlung von Mikro- organismen und Zellkulturen GmbH" em Braunschweig (Alemanha), pela Glycotope GmbH, Robert-Rõssle-Str. 10, 13125, Berlim (Alemanha) em 20 de outubro de 2006, e da maneira mais preferível as novas cepas AG6 e MU1.
Em uma modalidade preferida adicional da invenção, o micro- organismo carboidrato-positivo do nutracêutico ou da formulação farmacêuti- ca é uma combinação de micro-organismos carboidrato-positivos de diferen- tes cepas.
Em uma modalidade preferida adicional da invenção, o micro- organismo carboidrato-positivo da formulação de acordo com a invenção é uma combinação de micro-organismos carboidrato-positivos de diferentes cepas selecionados dentre as cepas AG6, MU1 e LH2.
Em uma modalidade preferida adicional, o nutracêutico ou com- posição farmacêutica da invenção compreende pelo menos um micro- organismo carboidrato-positivo combinado com pelo menos um outro micro- organismo benéfico, tal como, mas sem limitação a, um Iactobacillus e/ou bifidobacterium, ainda mais preferivelmente uma combinação de micro- organismos carboidrato-positivos de diferentes cepas combinados com ou- tros micro-organismos benéficos.
Em uma modalidade preferida da invenção, o micro-organismo carboidrato-positivo é um micro-organismo não-patogênico.
Em uma modalidade preferida adicional da invenção, o micro- organismo carboidrato-positivo é isolado de um doador saudável.
Em uma modalidade preferida adicional da invenção, o micro- organismo carboidrato-positivo pode ser isolado de um doador saudável.
Em uma modalidade preferida adicional da invenção, o micro- organismo carboidrato-positivo é usado no nutracêutico ou a composição farmacêutica como um organismo vivo.
Em uma modalidade preferida adicional da invenção, o micro- organismo carboidrato-positivo é usado como um organismo vivo e é admi- nistrado oralmente.
Em uma modalidade preferida adicional da invenção, o micro- organismo carboidrato-positivo usado no nutracêutico ou na composição farmacêutica é sensível a pelo menos um antibiótico. Em uma modalidade preferida adicional da invenção, o micro- organismo carboidrato-positivo usado no nutracêutico ou na composição farmacêutica pode colonizar as vísceras.
Em outra modalidade preferida da invenção, o micro-organismo carboidrato-positivo usado no nutracêutico ou na composição farmacêutica está morto.
Em ainda outra modalidade preferida da invenção, o micro- organismo carboidrato-positivo usado no nutracêutico ou na composição farmacêutica está pasteurizado.
Em uma modalidade ainda mais preferida da invenção, o micro-
organismo carboidrato-positivo é usado no nutracêutico ou na composição farmacêutica como um organismo vivo e foi isolado de um doador humano saudável, pode colonizar as vísceras humanas e é sensível a antibióticos.
Em uma modalidade ainda mais preferida da invenção, o micro- organismo carboidrato-positivo é usado no nutracêutico em forma pasteuri- zada, foi isolado das vísceras de um doador humano e é sensível a antibióti- cos.
Em outra modalidade preferida da invenção, o micro-organismo carboidrato-positivo usado na composição farmacêutica está morto ou Iisa- do.
Em uma modalidade preferida adicional da invenção, o micro- organismo carboidrato-positivo usado no nutracêutico ou na composição farmacêutica é liofilizado.
A invenção proporciona ainda um método para testar o potencial de um micro-organismo carboidrato-positivo ou fração do mesmo para indu- zir uma resposta imune-humoral contra o epitopo de carboidrato compreen- dendo
a) administração de uma quantidade apropriada do micro- organismo carboidrato-positivo ou fração do mesmo a pelo menos um ser
humano ou animal
b) testagem da resposta imune em pelo menos um dos testes de resposta imune-humoral de 1-6 contra o epitopo de carboidrato. A invenção proporciona adicionalmente um método para a tes- tagem do potencial de um micro-organismo carboidrato-positivo ou fração do mesmo para induzir uma resposta imunocelular carboidrato-positiva eficaz contra o epitopo de carboidrato compreendendo 5 a) administração de uma quantidade apropriada do micro-
organismo carboidrato-positivo ou fração do mesmo a pelo menos um ser humano ou animal e
b) testagem da resposta imune em pelo menos um dos testes de resposta imunocelular contra o epitopo de carboidrato.
Em uma modalidade preferida, a invenção proporciona um mé-
todo para a testagem do potencial de qualquer um dos nutracêuticos, das composições farmacêuticas, dos micro-organismos carboidrato-positivos ou das frações dos mesmos, ou das formulações que os compreendam, para induzir uma resposta imune e para determinar qual resposta imune é induzi- da.
E outra modalidade preferida, a invenção proporciona um méto- do para determinar a dose, o regime de dosagem, a via de administração, a formulação, os veículos ou outros componentes usados nos ou com os nu- tracêuticos, composições farmacêuticas, micro-organimos carboidrato- positivos ou frações dos mesmos ou as formulações que os compreendam.
A invenção proporciona ainda um método para testar o potencial de um micro-orqanimo carboidrato-positivo para induzir uma resposta imune- humoral compreendendo pelo menos um dos testes de resposta imune- humoral de 1-6, preferivelmente pelo menos dois, mais preferivelmente três, 25 mais preferivelmente 4, mais preferivelmente 5 e, da maneira mais preferí- vel, todos os 6 testes de resposta imune-humoral, sendo que pelo menos um animal ou humano tenha recebido quantidades apropriadas do micro- organismo a ser testado, seja oralmente, seja sistemicamente (com ou sem adjuvantes adicionais), e que os anticorpos no soro ou os anticorpos ganhos 30 do soro, do plasma ou das fezes sejam testados preferivelmente em compa- ração com os anticorpos no soro ou os anticorpos ganhos do sangue, do plasma ou das fezes antes de os micro-organismos serem administrados. Aqueles versados na técnica são capazes de determinar quantidades ade- quadas do micro-organismo e maneiras de ganhar os anticorpos do sangue e os controles adequados. Os testes estão descritos em detalhe neste e/ou no exemplo 11.
A invenção proporciona ainda um método para testar o potencial
de um micro-organismo carboidrato-positivo para induzir uma resposta imu- nocelular compreendendo pelo menos um dos testes de resposta imunocelu- lar de 1 a 5, preferivelmente pelo menos dois, mais preferivelmente três e, da maneira mais preferível, todos os 5 testes de resposta imunocelular.
A invenção proporciona ainda um método para testar o potencial
de um micro-organismo carboidrato-positivo para induzir uma resposta imu- nocelular citotóxica compreendendo pelo menos o teste de resposta imuno- celular 2, preferivelmente 2 e 1, mais preferivelmente 2, 3 e, da maneira mais preferível, todos os 5 testes de resposta imunocelular.
Em ambas as modalidades da invenção, os testes são ou reali-
zados como descrito acima in vitro, ou os testes de resposta imunocelular de
1 a 3 e 5 foram realizados mediante a administração a pelo menos um ani- mal ou humano de quantidades apropriadas do micro-organismo a ser testa- do, seja oralmente, seja sistemicamente (com ou sem adjuvantes adicio- nais), e as células imunes foram ganhas do sangue e (i) testadas de acordo com os testes celulares de 1 a 3 ou 5 como descrito acima ou (ii) testados de acordo com os testes celulares de 1 a 3 ou 5 como descrito acima com a diferença de que as células imunes não são postas em contato com as célu- las dendríticas carregadas com um micro-organismo carboidrato-positivo e apenas as células dendríticas carregadas com a molécula veículo do epitopo de carboidrato foram adicionadas para re-estimulação. Usa-se (i) preferivel- mente para aumentar o efeito in vitro e para melhorar a leitura no caso de respostas mais fracas e usa-se (ii) preferivelmente no caso de respostas in- tensas. Aqueles versados na técnica são capazes de determinar quantida- des apropriadas do micro-organismo e os controles adequados. Os testes estão descritos em detalhe no exemplo 12.
A invenção proporciona ainda em uma modalidade preferida um método para testar o potencial de um micro-organismo carboidrato-positivo para induzir uma resposta imune-humoral e uma resposta imunocelular que corresponde a uma combinação dos métodos acima descritos, compreen- dendo pelo menos um dos testes de resposta imune-humoral de 1 a 6 e pelo 5 menos um dos testes de resposta imunocelular de 1 a 5, preferivelmente pelo menos dois dos testes de resposta imune-humoral de 1 a 6 e pelo me- nos um, mais preferivelmente pelo menos dois, dos testes de resposta imu- nocelular de 1 a 5, mais preferivelmente pelo menos três dos testes de res- posta imune-humoral de 1 a 6, mais preferivelmente pelo menos 4 dos testes 10 de resposta imune-humoral de 1 a 6 e todos os testes de resposta imunoce- lular de 1 a 5, mais preferivelmente pelo menos 5 dos testes de resposta imune-humoral de 1 a 6 e todos os testes de resposta imunocelular de 1 a 5 e, da maneira mais preferida, todos os 6 testes de resposta imune-humoral de 1 a 6 e todos os 5 testes de resposta imunocelular de 1 a 5.
A invenção também proporciona métodos para identificar um
micro-organismo carboidrato-positivo no sentido da invenção e métodos para isolar um micro-organismo carboidrato-positivo de uma mistura de micro- organismos de epitopo de carboidrato-positivos e -negativos.
A invenção proporciona ainda um método para isolar um micro- organismo carboidrato-positivo veículo da estrutura de carboidrato de inte- resse de uma mistura de micro-organismos compreendendo
(a) colocação em contato entre a molécula de ligação de carboi- drato específica para a estrutura de carboidrato de interesse em contato com uma mistura de micro-organismos e (b) isolamento de pelo menos um micro-organismo ligado à mo-
lécula de ligação carboidrato mencionada da dita mistura,
(c) testagem para verificar que o micro-organismo isolado é um micro-organismo carboidrato-positivo e que ele carrega a estrutura de car- boidrato de interesse.
Os detalhes do método respectivo também foram descritos aci-
ma.
Em uma modalidade preferida, a invenção proporciona ainda um método para isolar um micro-organismo carboidrato-positivo de uma mistura de micro-organismos em cuja etapa (b) partículas magnéticas são usadas para a separação/enriquecimento de micro-organismos ligados à dita molé- cula de ligação carboidrato.
Em uma modalidade preferida, a invenção refere-se a um méto-
do para isolar o micro-organismo como descrito em outra parte deste, com- preendendo:
(a) colocação da dita molécula de ligação carboidrato em conta- to com uma mistura de micro-organismos; e (b) isolamento de pelo menos um micro-organismo ligado à dita
molécula de ligação carboidrato ; e
(c) testagem do micro-organismo isolado para ligação específica isolado à molécula de ligação carboidrato e
(d) testagem da indução de uma resposta imunocelular carboi- drato-específica eficaz e/ou resposta imune-humoral contra dito epitopo de
carboidrato.
O dito epitopo de carboidrato pode, por exemplo, ser parte de uma estrutura de carboidrato, conjugado de carboidrato ou de uma célula de mamífero compreendendo o dito epitopo de carboidrato. Preferivelmente, 20 uma resposta imune-humoral ou celular respectiva é disparada em pelo me- nos um animal ou humano pelo micro-organismo mencionado e/ou fração e/ou Iisado do mesmo.
Em uma modalidade preferida, a invenção refere-se a um méto- do para isolar o micro-organismo como descrito em outra parte deste, com- preendendo:
(a) colocação em contato entre a molécula de ligação carboidra- to e uma mistura de micro-organismos; e
(b) isolamento de pelo menos um micro-organismo ligado à mo- lécula de ligação carboidrato mencionada; e
(c) testagem da ligação específica do micro-organismo isolado à
molécula de ligação carboidrato e
(d) testagem da indução de uma resposta imunocelular carboi- drato-específica eficaz contra o dito epitopo de carboidrato e/ou estrutura de carboidrato, conjugado de carboidrato ou uma célula de mamífero compre- endendo o dito epitopo de carboidrato pelo micro-organismo mencionado e/ou fração e/ou Iisado do mesmo, preferivelmente para a ativação de célu- 5 Ias T de tipo Th1 CD4-positivas e/ou para a ativação de células T CD8- positivas citotóxicas, preferivelmente em pelo menos um animal ou humano e/ou in vitro.
Em uma modalidade preferida, a invenção proporciona ainda um método para isolar um micro-organismo carboidrato-positivo de uma mistura 10 de micro-organismos, sendo que tal mistura de micro-organismos é uma mistura de pelo menos dois micro-organismos selecionados do grupo com- preendendo micro-organismos de um ser humano saudável e/ou paciente, de um animal, do solo, de alimento e/ou plantas.
Em uma modalidade preferida, a invenção proporciona ainda um 15 método para isolar um micro-organismo carboidrato-positivo de uma mistura de micro-organismos, sendo que tal mistura de micro-organismos é uma mistura compreendendo micro-organismos do trato gastrointestinal humano, das fezes humanas, do sangue humano, de tecido humano, de fluidos do corpo humano de indivíduos saudáveis ou pacientes.
Em uma modalidade preferida, a invenção proporciona ainda um
método para isolar um micro-organismo carboidrato-positivo de uma mistura de micro-organismos que é realizado sob condições anaeróbicas que permi- tem o isolamento de micro-organismos carboidrato-positivos anaeróbicos.
A mistura de micro-organismos mencionada pode ser qualquer 25 mistura de pelo menos dois diferentes micro-organismos, tais como, mas sem limitação a, aqueles ocorrendo na natureza, tais como, mas sem limita- ção a, no solo, em alimentos, plantas, animais no trato gastrointestinal hu- mano, no sangue humano, em tecidos humanos, em fluidos corporais huma- nos de indivíduos saudáveis ou pacientes, mais preferivelmente uma mistura 30 de micro-organismos de um indivíduo saudável. Os micro-organismos são preferivelmente colocados em uma solução adequada antes de a mistura ser posta em contato com uma molécula de ligação carboidrato. A molécula de ligação carboidrato é preferivelmente acoplada a um veículo, tal como con- tas magnéticas, que permite a separação do micro-organismo ligado a tal veículo. E após a colocação em contato entre a molécula de ligação carboi- dratos e a mistura de micro-organismos, aqueles micro-organismos ligados à 5 molécula de ligação carboidrato são separados daqueles não ligados ao an- ticorpo. Em uma modalidade alternativa, a molécula de ligação carboidrato não é acoplada a um veículo e o micro-organismo carboidrato-positivo é iso- lado junto com a molécula de ligação carboidrato por métodos que isolam especificamente o anticorpo, tais como proteína a, proteína G, proteína I ou 10 anticorpos anti-lgM ou anticorpos anti-lgG que são eles mesmos acoplados a um veículo tal como matyerial de leito cromatográfico de conta. Em uma modalidade preferida da invenção, micro-organismos carboidrato-positivos ligados à molécula de ligação carboidrato são inteiramente lavados com um tampão apropriado (tal como o PBS-a) e distribuídos em placa em meios 15 seletivos e não-seletivos tais como, mas sem limitação a, MRS, BSM, KF, N, S, WC, BHI, CBA e ST (para detalhes, ver tabela 3). As colônias resultantes são raspadas das placas e submetidas a rodadas adicionais de enriqueci- mento por afinidade com moléculas carboidrato-específicas. As colônias são selecionadas, redistribuídas e sua expressão de carboidratos é analisada 20 por ELISA e imunofluorescência (mais detalhes nos exemplos 1 a 9). Dessas descrições e dos exemplos, aqueles versados na técnica são capazes de ajustar ou otimizar os métodos para várias bactérias de várias fontes.
Em uma modalidade preferida especial, o método é realizado sob condições anaeróbicas que permitem o isolamento de micro-organismos carboidrato-positivos anaeróbicos, o que é importante, por exemplo, para a maioria dos micro-organismos das vísceras humanas.
O método está descrito em detalhe nos exemplos 1 a 9.
Em outra modalidade preferida, os micro-organismos são isola- dos de um alimento. Em uma modalidade ainda mais preferida, os micro- organismos são isolados do sistema gastrointestinal e, de maneira ainda mais preferível, das fezes humanas.
O método está descrito em detalhe nos exemplos 1 a 9. A invenção proporciona ainda um método para identificar um micro-organismo carboidrato-positivo apropriado para uso como componente dos nutracêuticos e composições farmacêuticas da invenção compreenden- do
a) testagem de um micro-organismo para sua ligalação a pelo
menos uma molécula de ligação carboidratos e
b) identificação deste micro-organismo carboidrato-positivo que está ligado a pelo menos uma molécula de ligação carboidratos, como aqui descrito.
Em uma modalidade preferida da invenção, a testagem da liga-
ção de um micro-organimos a pelo menos uma molécula de ligação carboi- dratos é feita por ELISA, sendo que um micro-organimo carboidrato-positivo mostra um sinal de ELISA com pelo menos uma molécula de ligação carboi- dratos de pelo menos 3 vezes, de maneira mais preferível 5 vezes e, de ma- neira ainda mais preferível, pelo menos 10 vezes o sinal de fundo.
São preferidos os micro-organismos carboidrato-positivos que mostram uma ligação reduzida da molécula de ligação carboidratos após o tratamento do micro-organismo carboidrato-positivo com enzimas ou quími- cos que destroem o epitopo de carboidrato, como descrito em outra parte deste.
Em uma modalidade preferida, a invenção refere-se a um méto- do para identificar o micro-organismo carboidrato-positivo como descrito em outra parte deste, compreendendo:
a) colocação em contato entre a molécula de ligação carboidra- tos e um micro-organismo ou uma mistura de micro-organismos; e
b) identificação do micro-organismo que está especificamente li- gado à molécula de ligação carboidratos mencionada; e
c) testagem da indução de uma resposta imunocelular e/ou hu- moral pelo micro-organismo mencionado e/ou frações e/ou Iisados do mes-
mo,
sendo que o dito micro-organismo induz uma resposta imunoce- lular e/ou humoral carboidrato-específica eficaz contra o dito epitopo de car- boidrato e/ou uma estrutura de carboidrato, conjugado de carboidrato ou uma célula de mamífero compreendendo o dito epitopo de carboidrato, pre- ferivelmente em pelo menos um animal ou humano e/ou in vitro.
Em outra modalidade preferida, a invenção refere-se a um mé- todo para identificar o micro-organismo, como descrito em outra parte deste, compreendendo:
a) colocação em contato entre a molécula de ligação carboidrato mencionda e um micro-organismo ou uma mistura de micro-organismos; e
b) identificação do micro-organismo que está especificamente Ii- gado à molécula de ligação carboidratos mencionada; e
c) testagem da indução de uma resposta imunocelular carboi- drato-específica eficaz pelo micro-organismo mencionado e/ou frações e/ou Iisados do mesmo,
sendo que o dito micro-organismo induz uma resposta imunoce- Iular carboidrato-específica eficaz contra o dito epitopo de carboidrato e/ou uma estrutura de carboidrato, conjugado de carboidrato ou uma célula de mamífero compreendendo o dito epitopo de carboidrato, preferivelmente em pelo menos um animal ou humano e/ou in vitro.
A indução de tal resposta imunocelular carboidrato-específica e- 20 ficaz contra o dito epitopo de carboidrato e/ou estrutura de carboidrato, con- jugado de carboidrato ou uma célula de mamífero compreendendo o dito epitopo de carboidrato pode ser medida pelos testes de resposta celular i- munocelular como descritos neste ou por métodos conhecidos daqueles ver- sados na técnica.
Em uma modalidade preferida, a invenção refere-se a um méto-
do para identificar um micro-organismo carboidrato-positivo adequado para uso nos nutracêuticos e composições farmacêuticas da invenção compreen- dendo
a) testagem da ligação de um micro-organismo carboidrato- positivo a pelo menos uma molécula de ligação carboidratos e
b) testagem da sua capacidade de induzir uma resposta imune em seres humanos ou animais que reconhecem o epitopo de carboidrato e/ou uma célula ou célula tumoral positiva para o epitopo de carboidrato e
c) identificação deste micro-organismo que está ligado a pelo menos uma molécula de ligação carboidrato, como descrito neste, e que in- duz uma reação imune em seres humanos ou animais que reconhecem o 5 epitopo de carboidrato e/ou uma célula ou célula tumoral carboidrato-positiva sendo positivo para pelo menos um dos testes de resposta imune-humoral de 1 a 6 ou pelo menos um testes de resposta imunocelular de 1 a 5, como descrito neste.
Em uma modalidade preferida, a invenção refere-se a um méto- 10 do para identificar um micro-organismo carboidrato-positivo apropriado para uso como um componente dos nutracêuticos e composições farmacêuticas da invenção nas quais a resposta imune induzida após administração de uma formulação de acordo com a invenção em um ser humano ou um ani- mal é uma resposta imune positiva para pelo menos um teste de resposta 15 imune-humoral contra o epitopo de carboidrato e pelo menos uma resposta imunocelular contra o epitopo de carboidrato, como descrito em outra parte deste.
Os métodos para identificar um micro-organismo carboidrato- positivo apropriado para uso como um componente dos nutracêuticos e 20 composições farmacêuticas da invenção podem ser usados para identificar um micro-organismo apropriado de cepas existentes, tais como as encontra- das na DSMZ, ou outras coleções de micro-organismos ou dos micro- organismos carboidrato-positivos isolados por um método de isolamento de um micro-organismo carboidrato-positivo de uma mistura de micro- 25 organismos de acordo com a invenção.
A invenção refere-se também a um método para isolar e identifi- car bactérias carboidrato-positivas compreendendo
a) isolar bactérias inteiras de amostras de fezes,
b) realização de enriquecimentos por afinidade de bactérias po- sitivas para o epitopo de carboidrato usando uma ou mais das moléculas de
ligação a carboidratos sob condições aeróbicas ou anaeróbicas,
c) plaqueamento das bactérias enriquecidas em diferentes mei- os seletivos e seleção das bactérias de acordo com a ligação a moléculas de ligação a carboidrato.
Em outra modalidade preferida, a invenção refere-se a um mé- todo para isolar e identificar uma bactéria carboidrato-positiva, compreen- dendo
a) isolar uma mistura de microorganismos compreendendo bac- térias inteiras de amostras de fezes
b) colocação em contato entre uma molécula de liaacão carboi- drato e uma mistura de micro-orqanismos
c) isolar o micro-organismo que se liga à molécula de ligação
carboidratos sob condições aeróbicas ou anaeróbicas usando separação por partículas magnéticas,
d) plaqueamento das bactérias enriquecidas em pelo menos um meio seletivo
e) identificação do micro-organismo que está ligado a pelo me-
nos uma molécula de ligação carboidratos.
Em outra modalidade preferida, a invenção refere-se a um mé- todo para isolar e identificar bactérias carboidrato-positivas compreendendo
a) geração de uma cepa bacteriana pura que sofre ligação de
pelo menos uma molécula de ligação carboidrato; e/ou
b) testagem da capacidade da diat cepa bacteriana pura men- cionada de induzir ou aumentar uma resposta imune contra o epitopo de carboidrato em pelo menos um ser humano ou animal.
Em outra modalidade preferida, a invenção proporciona um mé-
todo para testar o potencial de um micro-organismo carboidrato-positivo para induzir uma resposta imune epitopo carboidrato-específica compreendendo as seguintes etapas:
1) identificação de micro-organismos carboidrato-positivos e pro- dução em culturas puras;
2) identificação de cepas bacterianas das vísceras eficazs em
termos imunes;
3) geração de uma preparação carboidrato-positiva imunologi- camente e toxicologicamente testada como um aditivo nutricional pronto pa- ra testes em seres humanos;
4) indução ou aumento de uma resposta imune epitopo carboi- drato-específica em seres humanos; e, caso necessário,
5) isolamento, identificação e testagem de uma fração ou com-
ponente do micro-organismo mencionado carboidrato-positiva definida como eficaz em termos imunes.
Em uma modalidade preferida da invenção, a molécula de liga- ção carboidrato dos métodos descritos acima é selecionada do grupo com- preendendo anticorpos monoclonais, anticorpos policlonais, Iectinas e/ou selectinas e/ou moléculas derivadas.
Em uma modalidade preferida da invenção, o epitopo de carboi- drato dos métodos acima descritos é selecionado do grupo compreendendo TF, Core-1, Tn1 sialil-Tn, sialil-TF, Globo-H, Lewis-H, sialil-Lewis-A, sialil- 15 Lewis-X, ácido polissiálico, Lewis-X, GM2, GD2, GD3, 9-O-acetil GD3, 9-0- acetil GD2, GD3L, fucosil GM1, Fucosil GM1, Lewis-A, Lewis B, slac, cadeia sialilada de tipo 1, antígeno CA 19-9, antígeno 72-4 e/ou antígeno CA-50.
O método está descrito em detalhe nos exemplos 1-10.
A invenção refere-se também a um método para gerar micro- organismos carboidrato-positivos compreendendo
a) contato de um micro-organismo e um agente para a indução de mutações por mutagênicos químicos e/ou físicos tais como, mas sem li- mitação a, EMS, UV, metotrexato, micro-ondas, substâncias cancerogêni- cas, carcinogênicos, mutagênicos ou radiação sob condições que matam a
maioria dos micro-organismos e
b) cultivo dos micro-organismos sobreviventes sob condições
apropriadas
c) enriquecimento, isolamento e/ou identificação dos micro- organismos carboidrato-positivos como descrito em outra parte deste
d) testagem da capacidade do micro-organismo mencionado pa-
ra induzir ou aumentar uma resposta imune contra o epitopo de carboidrato em pelo menos um ser humano ou animal. A invenção refere-se também a um método para gerar micro- organismos carboidrato-positivos por engenharia genética compreendendo
a) introdução, desativação e/ou silenciamento dos genes, partes dos genes, DNA, RNA, RNA antissenso, oligonucleotídeos, oligopeptídeos
ou proteínas em um micro-organismo, afetando assim a biossíntese dos epi- topos de carboidrato, a degradação dos epitopos de carboidrato ou a bios- síntese ou a degradação dos carboidratos flanqueadores e
b) enriquecimento, isolamento, identificação e/ou testagem dos micro-organismos carboidrato-positivos como descrito em outra parte deste.
Em uma modalidade preferida, o dito micro-organismo é um mi-
cro-organismo negativo para o epitopo de carboidrato.
Em uma modalidade preferida adicional, o dito micro-organismo é um micro-organismo benéfico para o trato intestinal, tal como, mas sem limitação a Lactobacillus ou a Bifidobacterium.
Em uma modalidade preferida adicional, o dito micro-organismo
é um micro-organismo usado para a produção de um alimento convencional tal como, mas sem limitação a, o Lactobacillus ou a Bifidobacterium.
Em outra modalidade, o dito micro-organismo já é positivo para o epitopo de carboidrato e o método é usado para aumentar a quantidade de epitopos de carboidrato expressados na superfície celular.
Em uma modalidade preferida, o micro-organismo carboidrato- positivo isolado ou identificado por qualquer um dos métodos mencionados acima ou uma fração ou Iisado do mesmo é usado para fabricar um medi- camento ou um nutracêutico para a profilaxia e/ou terapia de uma doença 25 associada ao dito epitopo de carboidrato, sendo que o micro-organismo e/ou fração e/ou Iisado induz uma resposta imunocelular e/ou humoral carboidra- to-específica eficaz contra o dito epitopo de carboidrato e/ou estrutura de carboidrato, conjugado de carboidrato ou uma célula de mamífero compre- endendo o dito epitopo de carboidrato, em pelo menos um animal ou huma- 30 no.
Em outra modalidade preferida, o micro-organismo carboidrato- positivo isolado ou identificado por qualquer um dos métodos mencionados acima ou fração ou Iisado do mesmo é usado para fabricaçãor um fármaco ou um nutracêutico para a profilaxia e/ou terapia de uma doença associada ao dito epitopo de carboidrato, em que o micro-organismo e/ou fração e/ou Iisado mencionado induz uma resposta imunocelular carboidrato-específica 5 eficaz contra o dito epitopo de carboidrato e/ou estrutura de carboidrato con- jugado de carboidrato ou uma célula de mamífero compreendendo o dito epitopo de carboidrato, em pelo menos um animal ou humano, preferivel- mente a resposta imune compreende a ativação de células T de tipo Th1 CD4-positivas e/ou a ativação de células T citotóxicas CD8-positivas.
Procedimentos e condições apropriados para fabricação são co-
nhecidos daqueles versados na técnica ou podem ser ajustados por aqueles versados na técnica.
C) Provisão de frações do micro-organismo carboidrato-positivo
A invenção proporciona uma fração do micro-organismo carboi- 15 drato-positivo da invenção, em que o micro-organismo carboidrato-positivo presente em uma molécula de uma célula de um ser humano ou animal, em que a dita fração do micro-organismo carboidrato-positivo induz uma respos- ta imunocelular carboidrato-específica eficaz contra o dito epitopo de carboi- drato em pelo menos um animal ou humano sofre ligação de pelo menos 20 uma molécula de ligação carboidrato que reconhece especificamente um carboidrato.
A invenção proporciona uma fração adequada do micro- organismo carboidrato-positivo da invenção para uso em uma formulação da invenção selecionada do grupo compreendendo um nutracêutico ou uma composição farmacêutica.
A invenção proporciona uma fração adequada do micro- organismo carboidrato-positivo da invenção que induz uma resposta imune epitopo carboidrato-específica contra o epitopo de carboidrato ou células tumorais ou células positivas de epitopo de carboidrato em seres seres hu- manos ou animais.
A dita fração do micro-organismo carboidrato-positivo mencio- nada significa preparações ou purificações de partes menores dos ditos mi- cro-organismos tais como preparações de parede celular, preparações de envelope, lisados, preparações de lipopolissacarídeo, preparado de cápsulas ou preparados de polissacarídeos capsulares, que são descritas nos exem- plos (exemplo 10) ou em que aquele versado na técnica é capaz de otimizar e selecionar um método adequado ou uma combinação de métodos ade- quados. Eles compreendem preferivelmente pelo menos um componente carboidrato-positivo do dito micro-organismo carboidrato-positivo menciona- do. Eles podem ser obtidos por preparações ou purificações de pelo menos um micro-organismo carboidrato-positivo. Tais preparações e purificações podem ser obtidas pelos métodos conhecidos por aqueles versados na téc- nica, tais como aqueles descritos acima, ou fracionamento celular individual ou seqüencial, extração de água por fenol, extrações de éter digestões de Iisossoma ou métodos cromatográficos. O componente carboidrato-positivo ou a fração contendo o componente carboidrato-positivo é detectado pela ligação da fração a pelo menos uma molécula de ligação carboidrato em sis- temas de teste tais como, mas sem limitação a, ELISA ou dot blots que são conhecidos daqueles versados na técnica. Em uma modalidade preferida da invenção, a fração compreendendo um componente carboidrato-positivo é obtida por cromatografia de afinidade usando-se pelo menos uma molécula de ligação carboidratos.
Em uma modalidade preferida, uma única etapa de preparação ou purificação é usada. Em outra modalidade preferida, uma combinação de pelo menos etapas de preparação e de purificação são usadas.
Em uma modalidade preferida adicional, o componente carboi- 25 drato-positivo é enriquecido na dita dita fração quando comparado ao micro- organismo completo, como pode ser determinado mediante uma ligação maior de pelo menos uma molécula de ligação carboidratos à fração em comparação com o micro-organismo, por exemplo por ELISA, e preferivel- mente, quando o peso do material biológico contido no mesmo volume é i- 30 gual.
O dito componente carboidrato-positivo significa qualquer com- ponente de um micro-organismo carboidrato-positivo que é ligado por pelo menos uma molécula de ligação carboidrato. O dito componente carboidrato- positivo compreende pelo menos uma estrutura de carboidrato ou estrutura que mimetiza um carboidrato que pode estar disponível sob a forma da sua molécula natural, onde ela é parte de um micro-organismo, tal como um pep- 5 tídeo, oligopeptídeo, polipeptídeo, lipídio, ceramida, carboidrato, lipoproteína, polissacarídeo, oligossacarídeo, polissacarídeo, proteoglicano, Iipopolissaca- rídeo ou glicoproteína, ou como uma parte da dita molécula natural, ou sozi- nho. O componente carboidrato-positivo pode ser usado no sentido da in- venção como uma fração do micro-organismo carboidrato-positivo como tal 10 ou acoplado a outras estruturas-veículos não-naturais tais como proteínas, lipídeos, moléculas químicas tais como a poliacrilamida. Preferivelmente, ele é usado em sua forma natural. O componente carboidrato-positivo pode compreender uma única epitopoestrutura de carboidrato ou um estrutura que mimetiza um carboidrato ou unidades repetidas das ditas estruturas e pode 15 conter estruturas ou unidades de carboidrato adicionais ou outras estruturas biomoleculares. A dita estrutura mimetizadora de carboidrato é uma estrutu- ra que é ligada por pelo menos uma molécula de ligação carboidrato e induz uma resposta imune contra o epitopo de carboidrato, preferivelmente uma resposta imunocelular humoral ou resposta imuneculular carboidrato- 20 específica eficaz contra o dito epitopo de carboidrato e, mais preferivelmen- te, uma resposta imunocelular carboidrato-específica eficaz e uma resposta imune-humoral eficaz contra o dito epitopo de carboidrato e/ou células asso- ciadas ao dito epitopo de carboidrato.
O micro-organismo carboidrato-positivo do qual a fração carboi- drato-positiva é derivada está descrito em outra parte desta invenção.
Em uma modalidade preferida adicional da invenção, a fração do micro-organismo carboidrato-positivo (componente ativo) do nutracêutico ou da formulação farmacêutica compreende uma combinação de frações de um micro-organismo carboidrato-positivo ou, preferencialmente, de diferen- 30 tes micro-organismos carboidrato-positivos de diferentes cepas. As frações podem ser do mesmo tipo ou de tipos diferentes de preparação ou purifica- ção, preferencialmente é uma combinação de componentes carboidrato- positivos que possuem diferentes veículos moleculares ou estruturas mime- tizantes tais como, mas sem limitação a, um peptídeo, oligopeptídeo, poli- peptídeo, lipídio, ceramida, carboidrato, lipoprotreína, polissacarídeo, oligos- sacarídeo, polissacarídeo, proteoglicano ou glicoproteína outra uma parte de ou molécula natural ou sintética.
Em outra modalidade preferida da invenção, o componente car- boidrato-positivo não é parte do lipopolissacarídeo bacteriano.
Em uma modalidade preferida adicional, a dita fração do micro- organismo carboidrato-positivo compreende uma combinação de componen- tes carboidrato-positivos de micro-organismos carboidrato-positivos de pelo menos duas cepas diferentes.
Em outra modalidade preferida da invenção, a dita estrutura de carboidrato ou as ditas unidades repetidas mencionadas da mesma são ob- tidas por enriquecimento e/ou purificação e/ou isolamento de um micro- organismo carboidrato-positivo.
Em uma modalidade preferida adicional da invenção, a dita es- trutura de carboidrato ou as ditas unidades repetidas mencionadas são obti- das por síntese química, uma técnica, portanto, conhecida daqueles versa- dos na técnica.
Em uma modalidade preferida adicional da invenção, a dita es-
trutura de carboidrato ou as ditas unidades repetidas mencionadas da mes- ma são obtidas por enriquecimento e/ou purificação e/ou isolamento da cepa AG6.
Os detalhes são mostrados no exemplo 10.
Em uma modalidade preferida adicional da invenção, a dita es-
trutura de carboidrato ou as ditas unidades repetidas mencionadas da mes- ma são obtidas, portanto, por síntese química.
Aqueles versados na técnica são capazes de determinar condi- ções e médotos apropriados para sintetizar quimicamente a estrutura de carboidrato de acordo com a figura 8 ou unidades repetidas da mesma.
D) Métodos para a geração de células imunes direcionadas con- tra o epitopo de carboidrato A invenção proporciona um método para a geração de uma cé- lula dendrítica funcional contra o dito epitopo de carboidrato compreendendo a colocação em contato entre uma quantidade apropriada de uma célula dendrítica ou de uma mistura de células dendríticas ou de uma mistura de 5 células compreendendo pelo menos uma célula dendrítica e uma quantidade apropriada da formulação, como descrito em outra parte deste, por um perí- odo apropriado e sob condições apropriadas para gerar pelo menos uma célula dendrítica funcional contra o dito epitopo de carboidrato e/ou estrutura de carboidrato, conjugado de carboidrato ou uma célula de mamífero com- 10 preendendo o dito epitopo de carboidrato. Como delineado acima, o dito epi- topo de carboidrato é preferivelmente um epitopo humano e preferivelmente não-carregado. Preferivelmente, tais células dendríticas não estão carrega- das com peptídeos veículos do epitopo de carboidrato de interesse.
A invenção proporciona um método para a geração de uma cé- 15 lula dendrítica funcional contra o epitopo de carboidrato compreendendo a colocação em contato entre uma quantidade apropriada de uma célula den- drítica ou uma mistura de células dendríticas ou uma mistura de células compreendendo pelo menos uma célula dendrítica e uma quantidade apro- priada de pelo menos um micro-organismo carboidrato-positivo, Iisado ou 20 fração do mesmo, como descrito em outra parte deste, por um período apro- priado e sob condições apropriadas para gerar pelo menos uma célula den- drítica funcional carregada ao epitopo de carboidrato.
A invenção proporciona um método para a geração de uma cé- lula dendrítica funcional contra o epitopo de carboidrato compreendendo a 25 colocação em contato entre uma quantidade apropriada de uma célula den- drítica ou uma mistura de células dendríticas ou uma mistura de células compreendendo pelo menos uma célula dendrítica e uma quantidade apro- priada de pelo menos uma molécula veículo do epitopo de carboidrato ou pelo menos uma célula de patologia associada ao epitopo de carboidrato ou 30 pelo menos uma célula tumoral positiva de epitopo de carboidrato ou um Iisado ou uma fração da mesma, como descrito em outra parte deste, por um período apropriado e sob condições apropriadas para gerar pelo menos uma célula dendrítica funcional carregada com o epitopo de carboidrato.
A célula dendrítica funcional contra o epitopo de carboidrato mencionada é uma célula dendrítica ou uma mistura de células dendríticas que ativam pelo menos uma célula T contra o epitopo de carboidrato que 5 podem ser preferencialmente testadas mediante um teste de resposta imu- nocelular da invenção e é positiva contra o epitopo de carboidrato em pelo menos um dos testes de resposta imunocelular descritos em outra parte des- te. Em uma modalidade preferida, a célula dendrítica funcional apresenta o epitopo de carboidrato em sua superfície e pode ser detectada por um anti- 10 corpo específico de epitopo de carboidrato ou uma molécula de ligação a carboidrato, como descrito, por exemplo, no teste de resposta imunocelular 4. Em uma modalidade preferida da invenção, a célula dendrítica funcional contra o epitopo de carboidrato é obtida mediante colocação em contato en- tre uma célula dendrítica imatura ou uma mistura de células dendríticas ima- 15 turas ou uma mistura de células dendríticas compreendendo pelo menos uma célula dendrítica imatura e uma quantidade apropriada de pelo menos um micro-organismo carboidrato-positivo, Iisado ou fração do mesmo, como descrito em outra parte deste, por um período apropriado e sob condições apropriadas para amadurecer a célula dendrítica mencionada usando-se 20 condições apropriadas, como descrito em outra parte deste, e, como é do conhecimento daqueles versados na técnica, compreendendo, por exemplo, as moléculas TNF-alfa (fator de necrose tumoral alfa), LPS (lipopolissacarí- deo) ou BCG (bacilo Calmette-Guerin), INF-gama (interferon gama), dexa- metasona e/ou TGF-beta (fator de crescimento transformador beta), em uma 25 célula dendrítica funcional carregada com o epitopo de carboidrato. Em uma modalidade preferida da invenção, a célula dendrítica é derivada da MUTZ-3 ou NemodDC (obtenível da Glycotope GmbH, Berlim, Alemanha; www.qlvcotope.com) e células dendríticas imaturas preferidas adicionais fo- ram geradas a partir de células MUTZ-3 ou NemodDC sob condições apro- 30 priadas compreendendo o uso de IL-4 e GM-CSF, normalmente por cerca de uma semana, as células dendríticas imaturas resultantes ou iNMDC são pos- tas em contato com a dita quantidade adequada mencionada de pelo menos um micro-organismo carboidrato-positivo, Iisado ou ou fração do mesmo, as células são amadurecidas usando-se condições apropriadas compreenden- do, por exemplo, TNF-alfa, LPS, BCG, INF-gama, dexametasona ou TGF- beta, preferivelmente TNF-alfa, normalmente por cerca de um a dois dias, 5 resultando em células dendríticas maduras carregadas com o epitopo de carboidrato correspondente à célula dendrítica funcional contra o epitopo de carboidrato.
Em uma modalidade preferida, a invenção proporciona uma cé- luía dendrítica funcional produzida pelos métodos descritos acima, em que a célula dendrítica funcional é direcionada contra o epitopo de carboidrato e/ou estrutura de carboidrato, conjugado de carboidrato ou uma célula de mamí- fero compreendendo o dito epitopo de carboidrato.
Em outra modalidade preferida, a invenção proporciona uma cé- lula dendrítica funcional produzida pelos métodos descritos acima, em que a 15 célula dendrítica funcional é direcionada contra o dito antígeno carboidrato ou uma célula de mamífero compreendendo o dito antígeno carboidrato e induz uma resposta imunocelular carboidrato-específica eficaz e/ou uma resposta imune-humoral eficaz contra células e/ou doenças que expressam o dito epitopo de carboidrato.
Em uma modalidade preferida, a invenção proporciona um mé-
todo para a geração de uma célula T ativada, células T ativadas, clone de célula T ou linhagem de células T contra o epitopo de carboidrato e/ou estru- tura de carboidrato, conjugado de carboidrato ou uma célula de mamífero compreendendo o dito epitopo de carboidrato compreendendo (a) colocação em contato de uma quantidade apropriada de pelo
menos uma célula dendrítica funcional, como acima descrito, com uma quantidade apropriada de pelo menos uma célula T ou uma mistura de célu- las T ou uma mistura de células compreendendo pelo menos uma célula T, cultivo da dita célula T ou mistura de células T junto com as ditas células 30 dendríticas funcionais carregadas por um período apropriado e sob condi- ções apropriadas para ativar ou inicializar uma célula T ou células T contra o dito epitopo de carboidrato, e (b) re-estimulação de tais células T com uma quantidade apro- priada de pelo menos uma célula dendrítica funcional carregada com uma célula ou molécula humana ou animal veículoa do dito epitopo de carboidra- to.
A invenção proporciona um método para gerar uma célula T ati-
rada ou células T contra o epitopo de carboidrato compreendendo
(a) colocação em contato de uma quantidade apropriada de pelo menos uma célula dendrítica funcional ou uma mistura de células contendo pelo menos uma célula dendrítica funcional carregada com quantidades a-
propriadas do micro-organismo carboidrato-positivo, Iisado ou fração do mesmo e pelo menos uma célula T ou células T
(b) cultivo da dita célula T ativada ou células T junto com as di- tas células dendríticas funcionais carregadas por um período apropriado e sob condições apropriadas para ativar ou inicializar a célula T ou as células
T contra o epitopo de carboidrato.
A invenção proporciona um método para gerar uma célula T ati- rada ou células T contra o epitopo de carboidrato compreendendo
(a) colocação em contato de uma quantidade apropriada de cé- lulas dendríticas funcionais ou uma mistura de células contendo pelo menos
uma célula dendrítica funcional carregada com quantidades apropriadas da molécula veículo do epitopo de carboidrato, uma célula tumoral positiva de epitopo de carboidrato ou uma célula compreendendo dito o epitopo de car- boidrato, ou um Iisado ou uma fração dos mesmos e uma célula T ou células T ou uma mistura de células contendo pelo menos uma célula T
(b) cultivo da dita célula T ou células T ou mistura de células
contendo pelo menos uma célula T junto com as ditas células dendríticas funcionais carregadas por um período apropriado e sob condições apropria- das para ativar ou inicializar uma célula T ou células T contra o epitopo de carboidrato.
Em uma modalidade preferida, a invenção proporciona um mé-
todo para gerar uma célula T ativada ou células T contra o epitopo de car- boidrato compreendendo (a) colocação em contato de quantidades apropriadaa de células dendríticas funcionais carregadas com quantidades apropriadas do micro- organismo carboidrato-positivo ou um Iisado ou fração do mesmo e uma cé- lula T ou células T
(b) cultivo da dita célula T ou células T junto com as células den-
dríticas funcionais carregadas mencionadas por um período apropriado e sob condições apropriadas para ativar ou inicializar uma célula T ou células T contra o epitopo de carboidrato
(c) adição de células dendríticas funcionais carregadas com uma
molécula veículo do epitopo de carboidrato ou célula tumoral positiva de epi- topo de carboidrato ou uma célula compreendendo o epitopo de carboidrato ou um Iisado ou fração da mesma para re-estimulação
(d) cultivo por período apropriado e em condições apropriadas.
Em uma modalidade preferida, a invenção proporciona um mé-
todo para geração de uma célula T ou células T ativada(s) contra o epitopo de carboidrato compreendendo
(a) colocação em contato de uma quantidade apropriada de pelo menos uma célula dendrítica funcional carregada com uma quantidade a- propriada de pelo menos um micro-organismo carboidrato-positivo ou um
Iisado ou fração do mesmo e uma quantidade apropriada de pelo menos uma célula T ou uma mistura de células T ou uma mistura de células com- preendendo pelo menos uma célula T
(b) cultivo da dita célula T ou mistura de células T ou mistura de células compreendendo pelo menos uma célula T com as células dendríticas
funcionais carregadas por um período apropriado e sob condições apropria- das para ativar ou inicializar uma célula T ou células T contra o epitopo de carboidrato.
Em uma modalidade preferida, a invenção proporciona um mé- todo para a geração de uma célula T ativada ou células T contra o epitopo
de carboidrato compreendendo
(a) colocação em contato entre uma quantidade apropriada de pelo menos uma célula dendrítica funcional carregada com uma quantidade apropriada de pelo menos uma molécula veículo do epitopo de carboidrato ou célula tumoral positiva de epitopo de carboidrato, ou uma célula compre- endendo o epitopo de carboidrato ou um Iisado ou fração da mesma com uma quantidade apropriada de pelo menos uma célula ativada T ou uma 5 mistura de células T ou uma mistura de células compreendendo pelo menos uma célula T.
(b) cultivo da dita célula T ou mistura de células T ou mistura de células compreendendo pelo menos uma célula T com as células dendríticas funcionais carregadas por um período apropriado e sob condições apropria-
das para ativar ou inicializar uma célula T ou células T contra o epitopo de carboidrato.
Em outra modalidade preferida, a invenção proporciona um mé- todo para gerar uma célula T ou células T ativada(s) contra o epitopo de car- boidrato compreendendo as etapas (a) e (b) dos métodos precedentes e subsequentemente compreendendo,
(c) adição de uma quantidade apropriada de pelo menos uma célula dendrítica funcional carregada com uma quantidade apropriada de pelo menos uma molécula veículo do epitopo de carboidrato ou célula tumo- ral positiva de epitopo de carboidrato ou um Iisado ou fração do mesmo para
re-estimulação;
ou adição de uma quantidade apropriada de pelo menos uma célula dendrítica funcional carregada com uma quantidade apropriada de pelo menos um micro-organismo carboidrato-positivo, Iisado ou fração do mesmo para re-estimulação; e (d) cultivo por um período apropriado ou e sob condições apro-
priadas.
Em outra modalidade preferida, a invenção proporciona um mé- todo para a geração de uma linhagem de células T contra o epitopo de car- boidrato compreendendo as etapas (a), (b), (c) e (d) do método precedente e 30 subsequentemente compreendendo pelo menos uma rodada adicional de re- estimulação, em que uma rodada de re-estimulação compreende seja as etapas (e) e (f) ou as etapas (g) e (h), com (e) adição de uma quantidade apropriada de pelo menos uma célula dendrítica funcional carregada com uma quantidade apropriada de pelo menos uma molécula veículo do epitopo de carboidrato ou célula tumo- ral positiva de epitopo de carboidrato, ou célula compreendendo o epitopo de
carboidrato ou Iisado ou fração da mesma para re-estimulação;
(f) cultivo por um período apropriado e sob condições apropria- das
(g) adição de uma quantidade apropriada de pelo menos uma célula dendrítica funcional carregada com uma quantidade apropriada de
pelo menos um micro-organismo carboidrato-positivo, ou Iisado ou fração do mesmo para re-estimulação
(h) cultivo por um período apropriado e sob condições apropria- das
Em uma modalidade preferida adicional, a invenção proporciona um método para a geração de uma linhagem de células T contra o epitopo de carboidrato compreendendo adicionalmente duas rodadas adicionais da rodada de re-estimulação mencionada.
Em uma modalidade mais preferida, a invenção proporciona um método para a geração de uma linhagem de células T contra o epitopo de carboidrato compreendendo três rodadas adicionais da rodada de re- estimulação.
Em uma modalidade ainda mais preferida, a invenção propor- ciona um método para a geração de uma linhagem de células T contra o epi- topo de carboidrato compreendendo cinco rodadas adicionais da rodada de re-estimulação.
Em uma modalidade mais preferida adicional, a invenção pro- porciona um método para a geração de uma linhagem de células T contra o epitopo de carboidrato na qual é realizada pelo menos uma vez uma etapa adicional de clonagem das células antes de uma rodada das ditas rodadas de re-estimulação.
Em uma modalidade preferida, a célula T ativada ou células T são uma linhagem de células T contra o epitopo de carboidrato, em que pre- ferivelmente (c) e (d), que correspondem a uma rodada de re-estimulação, são realizadas duas vezes, mais preferivelmente três vezes, mais preferi- velmente 4 vezes e, da maneira mais preferível, uma linhagem de células T para a qual mais do que 4 rodadas de re-estimulação são realizadas.
5 Em uma modalidade preferida, a célula T ativada ou células T
são um clone de célula T contra o epitopo de carboidrato, em que preferi- velmente (c) e (d), que correspondem a uma rodada de re-estimulação, são realizadas duas vezes, mais preferivelmente três vezes, mais preferivelmen- te 4 vezes e, cfa maneira mais preferida, uma linhagem de células T para a 10 qual mais de 4 rodadas de re-estimulação são realizadas e as células são clonadas pelo menos uma vez, por exemplo por diluição celular única, antes da re-estimulação.
Em uma modalidade preferida adicional, a invenção proporciona um método para a geração de um clone de célula T contra o epitopo de car- boidrato, em que a célula dendrítica funcional mencionada é uma célula dendrítica madura.
Em uma modalidade preferida adicional, a invenção proporciona um método para a geração de um clone de célula T contra o epitopo de car- boidrato, em que a célula dendrítica funcional mencionada e a célula T ou células T são células humanas.
Em uma modalidade preferida adicional, a invenção proporciona um método para a geração de uma célula T ativada, um clone de célula T ou uma linhagem de células T contra o epitopo de carboidrato, em que a célula dendrítica funcional mencionada é uma célula derivada da MUTZ-3 [pedidos 25 de patente 10139428.4 (DE), PCT/EP02/09260, 02758474.7 (EP), US 10/486.966, CA 2.457.287, DE 10139428A1, WO 2003/023023A1, EP 01419240, US 20040265998, CA2457287], tal como, mas sem limitação a, Nemod-DC (obtenível da Glycotope GmbH, Berlim, Alemanha, www.qlvcotope.com).
Em uma modalidade preferida adicional, a invenção proporciona
um método para a geração de uma célula T ativada, um clone de célula T ou uma linhagem de células T, ativadas contra o epitopo de carboidrato, em que a célula dendrítica funcional e a célula T ou células T são combinadas em pelo menos uma molécula de MHC.
Em uma modalidade preferida, a invenção proporciona uma cé- lula T, células T, clone de célula T ou linhagem de células T ativadas produ- 5 zidas por qualquer um dos métodos acima descritos, em que a célula T, cé- lulas T1 clone de célula T ou linhagem de células T é direcionada contra o epitopo de carboidrato e/ou uma estrutura de carboidrato, conjugado de car- boidrato ou célula de mamífero compreendendo o dito epitopo de carboidra- to.
Em uma modalidade preferida adicional, a invenção proporciona
uma célula T, células T, clone de célula T ou linhagem de células T ativadas produzidas por qualquer um dos métodos acima descritos, em que a célula T, células T, clone de célula T ou linhagem de células T direcionada contra o epitopo de carboidrato e/ou uma estrutura de carboidrato, conjugado de car-
boidrato ou célula de mamífero compreendendo o dito epitopo de carboidrato e induz uma resposta imunocelular carboidrato-específica eficaz contra o epitopo de carboidrato e/ou células e/ou doenças associadas com o dito epi- topo de carboidrato.
Em uma modalidade preferida da invenção, a indução mencio-
nada da resposta imunocelular carboidrato-específica eficaz mencionada ocorre em pelo menos um ser humano ou animal.
Em outra modalidade preferida da invenção, a indução mencio- nada da resposta imunocelular carboidrato-específica eficaz mencionda é realizada in vitro.
Em uma modalidade preferida adicional, a invenção proporciona
a célula T ou células T ativada(s) contra o epitopo de carboidrato, a compo- sição celular compreendendo células T contra o epitopo de carboidrato, a linhagem de células T contra o epitopo de carboidrato ou o clone de célula T contra o epitopo de carboidrato obtido por um método como acima descrito.
Em uma modalidade preferida adicional, a invenção proporciona
a célula T ou células T ativada(s) contra o epitopo de carboidrato, a compo- sição celular compreendendo células T contra o epitopo de carboidrato, a linhagem de células T contra o epitopo de carboidrato ou o clone de célula T contra o epitopo de carboidrato como descrito acima compreendendo pelo menos uma célula T auxiliar CD4+ contra o epitopo de carboidrato.
Em uma modalidade preferida adicional, a invenção proporciona 5 a célula T ou células T ativada(s) contra o epitopo de carboidrato, a compo- sição celular compreendendo pelo células T contra o epitopo de carboidrato, a linhagem de células T contra o epitopo de carboidrato ou o clone de célula T contra o epitopo de carboidrato como descrito acima compreendendo pelo menos uma célula T citotóxica contra o epitopo de carboidrato.
Em uma modalidade preferida adicional, a invenção proporciona
a célula T ou células T ativada(s) contra o epitopo de carboidrato, a compo- sição celular compreendendo pelo menos uma célula T contra o epitopo de carboidrato, a linhagem de células T contra o epitopo de carboidrato ou o clone de célula T contra o epitopo de carboidrato como descrito acima que 15 mata pelo menos uma célula tumoral carboidrato-positiva ou uma célula de patologia associada com o epitopo de carboidrato ou secreta moléculas que medeiam a destruição de pelo menos uma célula tumoral.
A célula T ou células T ativada(s) contra o epitopo de carboidra- to, a composição celular compreendendo células T contra o epitopo de car- boidrato, a linhagem de células T contra o epitopo de carboidrato ou o clone de célula T contra o epitopo de carboidrato da invenção que destroem pelo menos uma célula tumoral positiva ou célula de patologia de epitopo de car- boidrato ou secretam moléculas que medeiam a destruição de pelo menos uma célula tumoral ou célula de patologia significam que a célula T ativada ou células T citotóxica(s) mencionada(s) ou células contra o epitopo de car- boidrato destorem uma célula tumoral ou célula de patologia positiva de epi- topo de carboidrato que pode ser determinada mediante o uso do teste de resposta celular imune correspondente descrito em outro lugar deste medin- do-se a secreção de INF-gama ou TNF-alfa ou mediante um teste de citoto- xicidade (tal como o teste de resposta imunocelular 5) no qual pelo menos uma célula tumoral positiva ou célula de patologia de epitopo de carboidrato marcada é Iisada pelas células T mencionadas como é de conhecimento, principalmente, daqueles versados na técnica mediante o uso das células T da invenção, por exemplo, células LTCs ou Th1, ou mediante a indução de uma resposta específica das células T auxiliares CD4 que medeiam a ativa- ção de respostas imunes humorais e celulares correspondentes que resul- 5 tam na destruição de pelo menos uma célula tumoral positiva de epitopo de carboidrato.
Aqueles versados na técnica são capazes de realizar a tarefa descrita usando os métodos e materiais aqui descritos. Eles podem determi- nar as melhores condições para obter as céluias dendríticas ou céluias T 10 funcionais, a melhor via de administração e/ou composições adequadas compreendendo-as e/ou que são descritas em maior detalhe nas modalida- des preferidas para geração e uso nos pedidos de patente DE 10139428A1, WO 2003/023023A1, EP 01419240, US 20040265998, CA 2457287.
A célula T ou células T ativada(s) mencionada(s) contra o epito- 15 po de carboidrato significam que a célula T, células T ou composição celular compreendendo células T são positivas para pelo menos um dos testes imu- nes celulares da invenção, preferivelmente para dois, mais preferivelmente para três e, da maneira mais preferível, para todos os 4. Preferivelmente, eles compreendem pelo menos uma célula auxiliadora CD4+ e, ainda mais 20 preferivelmente, pelo menos uma célula T citotóxica capaz de destruir pelo menos uma célula tumoral positiva de epitopo de carboidrato.
A célula ou célula(s) T mencionadas usadas para colocação em contato são ou pelo menos uma célula T CD4+ e/ou uma célula T CD8+ que foi previamente isolada ou enriquecida pelos métodos padrão conhecidos daqueles versados na técnica ou são uma composição celular que compre- ende pelo menos uma célula T CD4+ e/ou células CD8+.
O Iisado mencionado pode ser qualquer Iisado de um micro- organismo carboidrato-positivo ou de uma célula tumoral positiva de epitopo de carboidrato, respectivamente, tal como, mas sem limitação a, um Iisado gerado por repetidos congelamentos-descongelamentos, por sonicação, por força mecânica ou por indução de temperatura.
Para detalhes sobre a geração das células T específicas de epi- topo de carboidrato, vide exemplo 12.
Uma célula dentrítica funcional é uma célula que pode ativar uma célula T.
A ativação de uma célula T significa estimulação da proliferação 5 e/ou conversão de uma célula virgem para uma célula ativa. Uma célula T ativa secreta moléculas que induzem ou auxiliam uma resposta imune contra o alvo, o epitopo de carboidrato ou células tumorais ou células de patologia que carregam o epitopo de carboidrato, preferivelmente aquelas células T citotóxicas que medeiam a destruição de uma célula tumoral ou célula de 10 patologia positiva de epitopo de carboidrato.
Em uma modalidade preferida, a célula dendrítica funcional mencionada é uma célula dendrítica madura. Mais preferivelmente, o pre- cursor da célula dendrítica do qual a célula madura se deriva é obtido de um ser humano, mais preferivelmente de um ser humano do qual a célula T ati- 15 vada ou células T foram também obtidas ou que são combinadas em pelos menos uma molécula de classe MHC. Em uma modalidade mais preferida, a célula dendrítica funcional é derivada da MUTZ-3, e, de maneira ainda mais preferível, a célula ou células MUTZ-3 delas derivadas foram diferenciadas usando-se IL-4 e GM-CSF, carregada(s) com quantidades apropriadas do 20 micro-organismo carboidrato-positivo, Iisado ou fração do mesmo ou a molé- cula veículo do epitopo de carboidrato ou célula tumoral positiva de epitopo de carboidrato, Iisado ou fração da mesma e adicionalmente amadurecida usando-se, por exemplo, quantidades apropriadas de TNF-alfa para amadu- recer as células dendríticas correspondentes às células dendríticas funcio- 25 nais da invenção. Em uma modalidade ainda mais preferida, células dendrí- ticas funcionais carregadas são usadas junto com PBMCs (células mononu- cleares do sangue periférico) combinadas pelos menos em MHC de classe I (HLA-A2) e (HLA-B44).
Aqueles versados na técnica são capazes de determinar as con- dições apropriadas para gerar células dendríticas funcionais carregadas com o micro-organismo carboidrato-positivo, Iisado ou fração do mesmo ou com a molécula veículo do epitopo de carboidrato ou com a célula tumoral ou célula da patologia positiva de epitopo de carboidrato, ou com o Iisado ou fração da mesma, assim como com quantidades apropriadas e procedimentos de enri- quecimento ou purificação de uma célula T ou células T e condições apro- priadas para o cultivo de ambas as células juntas, compreendendo tempo de 5 cultivo, meios, condições de cultura e fatores adicionais necessários. As cé- lulas dendríticas funcionais são normalmente diferenciadas das células pre- cursoras dentro de 6-10 dias e carregadas e amadurecidas por outros 1 a 2 dias. O cultivo da célula T ativada ou células T mencionadas junto com as células dendríticas funcionais carregadas mencionadas é normalmente reali- 10 zado por 7 a 10 dias e a adição e cultivo de células dendríticas funcionais para re-estimulação normalmente por 7 a 9 dias para cada rodada de re- estimulação. Detalhes adicionais são mostrados no exemplo 12.
Em outra modalidade preferida, células dendríticas diferentes ou células dendríticas funcionais de fontes diferentes, tais como células dendrí- 15 ticas derivadas da MUTZ-3 e células dendríticas derivadas de doares de um ser humano são usadas nas diferentes etapas de inicialização e re- estimulação. Aqueles versados na técnica são capazes de selecionar os me- lhores detalhes de combinação.
A geração bem-sucedida de uma célula T, células T ou compo- 20 sições celulares compreendendo uma célula T, células T, células T CD4+ e/ou CD8+ contra o epitopo de carboidrato pode ser testada mediante o uso de pelo menos um teste de resposta imunocelular da invenção. Detalhes adicionais estão descritos em outra parte deste. Preferivelmente, pelo menos dois testes de resposta imunocelular são positivos, mais preferivelmente 25 três, mais preferivelmente quatro e, da maneira mais preferível, todos os cin- co.
A descrição usada aqui para as células dendríticas, seu uso e condições apropriadas e moléculas para o seu uso também é válida para os testes de resposta imunocelular descritos em outra parte deste e vice-versa, e será válida para todas as outras partes da invenção.
Em outra modalidade, a invenção proporciona uma célula T ati- vada contra o epitopo de carboidrato. Em outra modalidade, da invenção proporciona células T com- preendendo pelo menos uma célula T ativada contra o epitopo de carboidra- to.
Em outra modalidade, da invenção proporciona uma linhagem 5 de células T contra o epitopo de carboidrato.
Em outra modalidade, a invenção proporciona um clone de célu- la T contra o epitopo de carboidrato.
Em uma modalidade preferida, a linhagem de células T ou o clone de célula T foi gerado usando-se células dendríticas funcionais deriva- 10 das da MUTZ-3 (tais como Nemod-DC) carregadas com o micro-organismo carboidrato-positivo, o Iisado ou fração do mesmo em combinação com pelo menos uma rodada de re-estimulação com células dendríticas funcionais derivadas da MUTZ-3 carregadas com pelo menos uma molécula veículo do epitopo de carboidrato ou célula tumoral ou célula de patologia positiva de 15 epitopo de carboidrato, ou Iisado ou fração da mesma de um doador saudá- vel e, de maneira ainda mais preferível, de um paciente, e de maneira ainda mais preferível, de um paciente cuja doença ou tumor é positivo para a liga- ção com uma molécula de ligação carboidrato, preferivelmente com um anti- corpo específico de epitopo de carboidrato.
A invenção proporciona ainda um método para a geração de pe-
lo menos uma célula T ativada para uso como uma terapia tumoral compre- endendo a administração das células T ativadas contra as células tumorais positivas de epitopo de carboidrato em um paciente.
E) Métodos para induzir um escudo imune contra doenças asso- ciadas ao epitopo de carboidrato e métodos para prevenir e/ou tratar doen- ças associadas ao epitopo de carboidrato
A invenção proporciona um método para induzir ou aumentar uma resposta imunocelular carboidrato-específica eficaz e/ou resposta imu- ne-humoral eficaz contra o dito epitopo de carboidrato e/ou uma estrutura de 30 carboidrato, conjugado de carboidrato ou uma célula de mamífero compre- endendo o dito epitopo de carboidrato, em pelo menos um animal ou huma- no, compreendendo a administração em um ser humano ou em um animal de uma quantidade eficaz da formulação, como descrito em outra parte des- te.
Em uma modalidade preferida, a invenção proporciona um mé- todo para induzir ou aumentar uma resposta imunocelular carboidrato- específica eficaz contra o dito epitopo de carboidrato e/ou uma estrutura de carboidrato, conjugado de carboidrato ou uma célula de mamífero compre- endendo o dito epitopo de carboidrato, em pelo menos um animal ou huma- no, compreendendo a administração em um ser humano ou em um animal de uma quantidade eficaz da formulação, como descrito em outra parte des- te, sendo preferível que a resposta imunocelular carboidrato-específica efi- caz mencionada compreenda a ativação de células T CD4-positivas de tipo Th1 e/ou células T citotóxicas CD8-positivas; mais preferivelmente, a respos- ta imunocelular carboidrato-específica eficaz mencionada compreende a ati- vação de células T CD4-positivas de tipoThl e a ativação de células T cito- tóxicas CD8-positivas.
A indução da resposta imunocelular carboidrato-específica efi- caz mencionada é medida preferivelmente pelos testes de resposta imuno- celular como descritos em outra parte deste.
Em uma modalidade preferida, a invenção proporciona um mé- 20 todo para tratar um paciente de câncer ou um paciente sofrendo de uma do- ença associada ao epitopo de carboidrato compreendendo a administração de qualquer um dentre: a célula T ativada ou células T ativada(s) contra o epitopo de carboidrato, a composição celular compreendendo pelo menos uma célula T contra o o epitopo de carboidrato, a linhagem de células T con- 25 tra o o epitopo de carboidrato ou o clone de célula T contra o o epitopo de carboidrato como descrito acima ou uma composição compreendendo-os.
Em uma modalidade preferida, a invenção proporciona um mé- todo para tratar um paciente de câncer ou um paciente sofrendo de uma do- ença associada ao epitopo de carboidrato compreendendo a administração 30 de uma quantidade apropriada de pelo menos uma das células dendríticas funcionais contra o epitopo de carboidrato, tal como descrito acima, ou uma composição que as compreenda. Em uma modalidade preferida, a invenção proporciona um mé- todo para tratar um paciente de câncer em que o paciente tem ou teve uma célula de câncer positiva de epitopo de carboidrato.
Em uma modalidade mais preferida, a invenção proporciona um 5 método para tratar um paciente de câncer ou um paciente sofrendo de uma doença associada ao epitopo de carboidrato no qual a célula dendrítica fun- cional é autóloga.
Em outra modalidade preferida, a invenção proporciona um mé- todo para tratar um paciente de câncer ou um paciente sofrendo de uma do- ença associada ao epitopo de carboidrato no qual a célula dendrítica funcio- nal é alogênica, originando-se de um doador.
Em uma modalidade preferida, a invenção proporciona um mé- todo para tratar um paciente de câncer ou um paciente sofrendo de uma do- ença associada ao epitopo de carboidrato no qual a célula dendrítica funcio- nal é derivada da MUTZ-3.
Em uma modalidade preferida, a invenção proporciona um mé- todo para tratar um paciente de câncer ou um paciente sofrendo de uma do- ença associada ao epitopo de carboidrato no qual a célula dendrítica funcio- nal partilha pelo menos uma molécula de classe MHC com o paciente men- cionado.
A invenção proporciona ainda um método para tratar um pacien- te de câncer ou um paciente sofrendo de uma doença associada ao epitopo de carboidrato compreendendo a administração de qualquer um dentre: a célula T ativada ou células T ativada(s) contra o epitopo de carboidrato, a 25 composição celular compreendendo pelo menos uma célula T contra o epi- topo de carboidrato, uma linhagem de células T contra o epitopo de carboi- drato ou o clone de célula T contra o epitopo de carboidrato descritos em outra parte deste ou uma composição compreendendo pelo menos um de- les.
A invenção proporciona ainda um método para tratar um pacien-
te de câncer ou um paciente sofrendo de uma doença associada ao epitopo de carboidrato compreendendo a administração de uma quantidade apropri- ada de pelo menos uma das células dendríticas funcionais contra o epitopo de carboidrato descritas em outra parte deste ou uma composição que as compreenda.
Em uma modalidade preferida da invenção, pelo menos um dos métodos mencionados é usado para um paciente que tem ou teve uma célu- la cancerosa positiva de epitopo de carboidrato que é detectável por pelo menos uma molécula de ligação carboidrato ou anticorpo específico de epi- topo de carboidrato e é descrito em sua modalidade preferida em outra parte
Adicionalmente preferidos são os métodos mencionados nos
quais a célula dendrítica funcional é autóloga, adicionalmente preferidos quando a célula dendrítica funcional é alogênica, adicionalmente preferidos quando a célula dendrítica funcional se origina de um doador, sendo ainda mais preferidos quando a célula dendrítica funcional é derivada da MUTZ-3, 15 ainda mais preferida quando qualquer uma das células dendríticas funcio- nais partilha pelo menos uma molécula de classe MHC com o indivíduo ao qual é administrada.
A invenção proporciona um método para a indução ou aumento de uma resposta imune-humoral e/ou celular específica contra o epitopo de 20 carboidrato, contra a molécula veículo do epitopo de carboidrato ou contra células tumorais positivas de epitopo de carboidrato ou células de patologia positivas de epitopo de carboidrato compreendendo a administração em um ser humano ou animal de uma quantidade eficaz do nutracêutico, ou da composição farmacêutica, ou do micro-organismo carboidrato-positivo ou da 25 fração do mesmo que estão descritas em outra parte deste, ou de formula- ções que os compreendam.
A invenção proporciona um método para induzir uma resposta imunocelular carboidrato-específica eficaz contra o epitopo de carboidrato, contra a molécula veículo do epitopo de carboidrato, contra as células tumo- 30 rais positivas de epitopo de carboidrato ou contra as células de patologia positivas de epitopo de carboidrato compreendendo a administração em um ser humano ou animal de uma quantidade eficaz do nutracêeutico, ou da composição farmacêutica, ou do micro-organismo carboidrato-positivo ou da fração do mesmo, que estão descritos em outra parte deste, ou formulações que os compreendam.
Em outra modalidade preferida, a invenção proporciona um mé- 5 todo para induzir uma resposta imunocelular carboidrato-específica eficaz contra o epitopo de carboidrato em pelo menos um indivíduo compreenden- do a ativação de células T auxiliares CD4-positivas de tipo Th1 e células T citotóxicas CD8-positivas contra o o epitopo de carboidrato, detectável por pelo menos um dos testes de resposta imune descritos em outra parte deste. 10 Em outra modalidade preferida, a invenção proporciona um mé-
todo para induzir ou aumentar uma resposta imune-humoral e celular especí- fica contra o epitopo de carboidrato, contra a molécula veículo do epitopo de carboidrato ou contra as células tumorais positivas de epitopo de carboidrato ou contra as células de patologia positivas de epitopo de carboidrato com- 15 preendendo a administração em um ser humano ou animal de uma quanti- dade eficaz do nutracêutico, da composição farmacêutica ou do micro- organismo carboidrato-positivo ou da fração dao mesmo, que estão descritos em outra parte deste, ou formulações que os compreendem.
A invenção proporciona um método para induzir ou aumentar uma resposta imune epitopo carboidrato-específica que funciona como um escudo contra células de câncer ou de patologia positivas de epitopo de car- boidrato por ter o potencial de destruir pelo menos uma célula de câncer ou de patologia positiva de epitopo de carboidrato.
Em uma modalidade preferida, a invenção proporciona um mé- 25 todo para induzir uma resposta imune epitopo carboidrato-específica que funciona como um escudo contra células cancerosas positivas de epitopo de carboidrato por ter o potencial de destruir essas células como mostrado aqui, por exemplo, pela indução de anticorpos específicos de epitopo de carboi- drato, pela indução de uma citoxicidade complemento-dependente carboi- 30 drato-específica de anticorpos específicos de epitopo de carboidrato contra células tumorais ou de células patológicas positivas de epitopo de carboidra- to, destruindo-as eficazmente, e/ou pela secreção de TNF-alfa e/ou INF- gama por respostas de células T específicas de epitopo de carboidrato que são marcores substitutos cientificamente reconhecidos por aqueles versados na técnica para uma destruição celular específica mediada por células T cito- tóxicas para aquelas células tumorais ou patológicas veículoas do epitopo de 5 carboidrato, como mostrado nos exemplos e descrito neste, compreendendo a administração em um ser humano ou animal de uma quantidade eficaz do nutracêutico, da formulação farmacêutica, ou do micro-organismo carboidra- to-positivo ou da fração do mesmo, que são descritos em outra parte deste, ou de formulações que os compreendem.
A invenção proporciona ainda um método para reduzir ou, ainda
mais preferivelmente, para prevenir a ocorrência de um tumor, preferivel- mente um tumor positivo de epitopo de carboidrato, compreendendo a admi- nistração em um ser humano ou animal de uma quantidade eficaz do nutra- cêutico, ou da formulação farmacêutica, ou do micro-organismo carboidrato- 15 positivo ou da fração do mesmo, que estão descritos em outra parte deste, ou de formulações que os compreendam, preferivelmente em um indivíduo saudável.
A invenção proporciona ainda um método para reduzir ou, ainda mais preferivelmente, para prevenir a ocorrência de uma doença, preferivel- 20 mente de uma doença positiva de epitopo de carboidrato, compreendendo a administração em um ser humano ou animal de uma quantidade eficaz do nutracêutico, ou da formulação farmacêutica, ou do micro-organismo carboi- drato-positivo ou da fração do mesmo, que estão descritos em outra parte deste, ou de formulações que os compreendam, preferivelmente em um in- 25 divíduo saudável.
A invenção proporciona ainda um método para reduzir ou, ainda mais preferivelmente, para prevenir a disseminação ou metástase de um tumor, preferivelmente de um tumor positivo de epitopo de carboidrato, com- preendendo a administração em um ser humano ou animal de uma quanti- 30 dade eficaz do nutracêutico, ou da formulação farmacêutica, ou do micro- organismo carboidrato-positivo ou da fração do mesmo, que estão descritos em outra parte deste, ou de formulações que os compreendam. A invenção proporciona ainda um método para tratar um tumor, preferivelmente um tumor positivo de epitopo de carboidrato, compreenden- do a administração em um ser humano ou animal de uma quantidade eficaz do nutracêutico, ou da formulação farmacêutica, ou do micro-organismo car- 5 boidrato-positivo ou da fração do mesmo, que estão descritos em outra parte deste, ou de formulações que os compreendam.
A invenção proporciona ainda um método para tratar uma doen- ça, preferivelmente uma doença associada com o epitopo de carboidrato, compreendendo a administração em um ser humano ou animal de uma 10 quantidade eficaz do nutracêutico, ou da formulação farmacêutica, ou do micro-organismo carboidrato-positivo ou da fração do mesmo, que estão descritos em outra parte deste, ou de formulações que os compreendam.
A invenção proporciona ainda um método para reduzir ou, ainda mais preferivelmente, para prevenir a ocorrência de uma doença ou tumor 15 positivo de epitopo de carboidrato, compreendendo a administração em um ser humano ou animal de uma quantidade eficaz do nutracêutico, ou da for- mulação farmacêutica, ou do micro-organismo carboidrato-positivo ou da fração do mesmo, que estão descritos em outra parte deste, ou de formula- ções que os compreendam, preferivelmente em um indivíduo sadio.
Em uma modalidade preferida, a presente invenção proporciona
um método para a imunização ou vacinação de um ser humano ou um ani- mal contra um epitopo de carboidrato presente em uma molécula de uma célula humana ou animal compreendendo
(i) administração em um ser humano ou a um animal de uma quantidade eficaz de células imunes ou de um mistura de células compreen- dendo pelo menos uma célula imune direcionada contra o epitopo de carboi- drato, como descrito em outra parte deste, e a indução de uma resposta i- mune pela célula imune mencionada no humano ou animal (inicialização) e
(ii) intensificação da resposta imune pela administração de uma quantidade eficaz de uma formulação como descrita em outra parte deste.
Em uma modalidade preferida, a presente invenção proporciona um método para a imunização ou vacinação de um ser humano ou um ani- mal contra o epitopo de carboidrato presente em uma molécula de uma célu- la humana ou animal compreendendo
(i) administração a um ser humano ou a um animal de uma quantidade eficaz de células imunes ou de um mistura de células compreen-
dendo pelo menos uma célula imune direcionada contra o epitopo de carboi- drato pelo menos uma vez e a indução de uma resposta imune pela célula imune mencionada no humano ou animal (inicialização) e
(ii) intensificação da resposta imune pela administração de uma quantidade eficaz de uma composição farmacêutica compreendendo um
micro-organismo carboidrato-positivo e/ou uma fração do mesmo.
A célula imune mencionada direcionada contra o epitopo de car- boidrato por ser selecionada do grupo compreendendo célula ou células dendríticas, linhagem de células dendríticas, célula T ativada ou células T, linhagem de células T ou clone de célula T ou misturas compreendendo as 15 mesmas, em que a célula imune mencionada é direcionada contra o epitopo de carboidrato. A geração das células imunes mencionadas é descrita em outra parte deste.
Em uma modalidade preferida da invenção, a administração das células imunes; mencionadas e a inicialização são realizadas uma vez.
Em outra modalidade preferida da invenção, a administração
das células imunes mencionadas e a inicialização são realizadas duas ve- zes.
Em outra modalidade preferida da invenção, a administração das células imunes mencionadas e a inicialização são realizadas pelo menos de três a cinco vezes.
Em uma modalidade preferida da invenção, a intensificação da resposta imune pela administração de uma quantidade eficaz de uma com- posição farmacêutica compreendendo um micro-organismo carboidrato- positivo e/ou uma fração do mesmo é realizada uma vez.
Em outra modalidade preferida da invenção, a intensificação é
realizada 2-10 vezes, mais preferivelmente mais de 10 vezes, mais preferi- velmente até 20 vezes, da maneira mais preferida a intensificação é realiza- da continuamente em intervalos regulares em um período de vários meses a vários anos.
Em uma modalidade preferida da invenção, a intensificação da resposta imune é realizada 1 -5 vezes próximo à inicialização e, depois, em 5 intervalos de 3 meses a 1 ano ou de 1 ano a 10 anos.
Em uma modalidade preferida, a invenção proporciona um mé- todo para a indução de uma resposta inume celular e/ou humoral carboidra- to-específica eficaz contra um epitopo de carboidrato, preferivelmente uma resposta citotóxica das células T, presente em uma molécula de uma célula humana ou animal compreendendo
i) administração oral de um nutracêutico compreendendo um mi- cro-organismo carboidrato-positivo ou um Iisado ou fração do mesmo a um ser humano ou animal
ii) repetição da administração oral para a indução de um escudo 15 imune contra a ocorrência de uma doença caracterizada pela presença do
epitopo de carboidrato.
O nutracêutico da presente invenção pode ser qualquer alimento ou aditivo alimentar ou suplemento dietético ou alimento medicinal ou ali- mento para uso medicinal específico ou alimento para uso dietético especial - 20 ou alimento funcional e pode ser aplicado sob diferentes formas, como des- crito em outra parte deste.
Em uma modalidade preferida da invenção, o nutracêutico é administrado a intervalos irregulares.
Em uma modalidade preferida da invenção, o nutracêutico é administrado a intervalos regulares de diariamente a semanalmente, mais preferivelmente é uma aplicação inicial de pelo menos um intervalo semanal por um período de 1-6 meses com intervalos regulares subsequentes de administração repetida.
Em uma modalidade preferida da invenção, o nutracêutico é u- sado como um alimento clínico. Em ainda outra modalidade preferida, o nu- tracêutico é usado antes e/ou após a realização de uma biópsia, preferenci- almente de um tumor potencial. E ainda mais preferivelmente, o nutracêutico é usado antes e/ou após a cirurgia de um tumor, preferivelmente um tumor positivo de epitopo de carboidrato. E ainda mais preferivelmente, o nutracêu- tico é usado em combinação com outros tratamentos.
Em outra modalidade preferida, a presente invenção proporcio- na um método para a vacinação ou imunização de um ser humano ou um animal contra o epitopo de carboidrato e/ou doenças ou tumores positivos de epitopo de carboidrato compreendendo
(ii) administração em um ser humano ou um animal de uma quantidade eficaz de células dendríticas funcionais ou de uma mistura de
células compreendendo pelo menos uma célula dendrítica funcional direcio- nada contra o epitopo de carboidrato pelo menos uma vez e a indução de uma resposta imune pelas células dendríticas funcionais mencionadas no humano ou animal e
(iii) intensificação da resposta imune pela administração de uma
quantidade eficaz de uma composição farmacêutica compreendendo pelo
menos um micro-organismo carboidrato-positivo e/ou fração e/ou Iisado do mesmo pelo menos uma vez.
Em outra modalidade preferida, a presente invenção proporcio- na um método para a vacinação de um ser humano ou um animal contra um
epitopo de carboidrato presente em uma molécula de uma célula humana ou animal e/ou doenças ou tumores caboidrato-positivos compreendendo
(i) administração em um ser humano ou um animal de uma quantidade eficaz de células T ativadas, clone de célula T, linhagem de célu- las T ou uma mistura de células compreendendo pelo menos uma célula T
ativada direcionada contra o epitopo de carboidrato pelo menos uma vez e a indução de uma resposta imune pelas células T ativadas mencionadas no humano ou no animal e
(ii) intensificação da resposta imune pela administração de uma quantidade eficaz de uma composição farmacêutica compreendendo o mi-
cro-organismo carboidrato-positivo e/ou fração e/ou Iisado do mesmo pelo menos uma vez.
A geração de células dendríticas funcionais, células T ativadas, <■ linhagens de células T e clones de células T é descrita em outra parte deste.
Em uma modalidade preferida da invenção, a administração de acordo com os métodos anteriores sob (i) é realizada uma vez.
Em outra modalidade preferida da invenção, a administração de 5 acordo com os métodos anteriores sob (i) é realizada duas vezes.
Em outra modalidade preferida da invenção, a administração de acordo com os métodos anteriores sob (i) é realizada pelo menos três a cin- co vezes.
Em uma modalidade preferida da invenção, a intensificação da 10 resposta imune pela administração de uma quantidade eficaz de uma com- posição farmacêutica de acordo com (ii) dos métodos anteriores é realizada uma vez; em outra modalidade preferida da invenção, a intensificação é rea- lizada 2-10 vezes, mais preferivelmente mais de 10 vezes, mais preferivel- mente até 20 vezes, mais preferivelmente a intensificação é realizada conti- 15 nuamente em intervalos regulares por um período de vários meses a vários anos.
Em uma modalidade preferida da invenção, a intensificação da resposta imune é realizada 1 a 5 vezes próximo à inicialização e depois a intervalos de 3 meses a 1 ano ou de 1 a 10 anos.
Em uma modalidade preferida, a invenção proporciona um mé-
todo para a profilaxia e/ou tratamento de uma doença e/ou tumor positivo de epitopo de carboidrato compreendendo a administração de uma quantidade apropriada de uma formulação, um micro-organismo carboidrato-positivo ou fração do mesmo, uma célula dendrítica funcional ou uma célula T ativada, 25 linhagem de células T ou clone de célula T contra o epitopo de carboidrato e/ou uma estrutura de carboidrato, conjugado de carboidrato ou uma célula de mamífero compreendendo o dito epitopo de carboidrato, como descrito em outra parte deste, em um ser humano ou animal.
A invenção proporciona um método para a redução ou, ainda 30 mais preferivelmente, para a prevenção, da disseminação de uma doença positiva de epitopo de carboidrato compreendendo a administração em um ser humano ou em um animal de uma quantidade eficaz do nutracêutico ou da formulação farmacêutica, ou do micro-organismo carboidrato-positivo, ou da fração do mesmo, que são descritos em outra parte deste, ou formula- ções que os compreendam.
A invenção proporciona um método para o tratamento de uma 5 doença positiva de epitopo de carboidrato compreendendo a administração em um ser humano ou em um animal de uma quantidade eficaz do nutracêu- tico ou da formulação farmacêutica, ou do micro-organismo carboidrato- positivo, ou da fração do mesmo, que são descritos em outra parte deste, ou formulações que os compreendam.
A invenção proporciona um método para fortalecer o sistema
imune ou para melhorar uma resposta imune compreendendo a administra- ção em um ser humano ou em um animal de uma quatidade eficaz do nutra- cêutico ou da formulação farmacêutica, ou do micro-organismo carboidrato- positivo, ou da fração do mesmo, que são descritos em outra parte deste, ou 15 formulações que os compreendam. Isso pode ser, por exemplo, mas não se limita a, uma melhoria geral da condição do sistema imune, por exemplo contra doenças infecciosas ou tumores, uma melhoria da atividade de outros agentes estimuladores da imunidade ou probióticos ou pré-bióticos, ou uma ação como adjuvantes.
Em uma modalidade preferida, o nutracêutico, ou a formulação
farmacêutica, ou o micro-organismo carboidrato-positivo, ou a fração do mesmo que são descritos em outra parte deste, ou formulações que com- preendem aqueles dos métodos acima descritos compreendem pelo menos um micro-organismo, Iisado ou a fração selecionada do grupo compreen- 25 dendo a cepa Bacteroides ovatus AG6 (DSM 18726), a cepa Bacteroides ovatus MU1 (DSM 18728) e/ou a cepa Eseheriehia eoli LH2 (DSM 18727), mais preferivelmente da cepa AG6 e/ou MU1 depositada na "DSMZ - Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH" em Braunschweig (Alemanha), pela Glycotope GmbH, Robert-Rõssle-Str. 10, 30 13125 Berlim (Alemanha) em 20 de outubro de 2006.
O termo "formulação" significa qualquer substância ou composi- ção de substâncias em uma forma apropriada para administração compre- endendo pelo menos um dentre o nutracêutico, a composição farmacêutica, o micro-organismo carboidrato-positivo ou a fração do mesmo que pode compreender um veículo farmaceuticamente aceitável ou um veículo aceitá- vel para aditivos alimentares e/ou nutracêutico ou o nutracêutico, a composi- 5 ção farmacêutica, o micro-organismo carboidrato-positivo ou apenas a fra- ção do mesmo.
O termo "prevenir a ocorrência" se refere ao uso do nutracêuti- co, da composição farmacêutica, do micro-organismo carboidrato-positivo, ou da fração do mesmo, ou de formulações que os compreendam, a um su- 10 jeito, com o objetivo de reduzir o risco ou da taxa de probabilidade de de- senvolvimento de um câncer positivo de epitopo de carboidrato ou de uma doença positiva de epitopo de carboidrato.
A expressão "reduzir ou prevenir a disseminação de um tumor ou de uma doença ou metástase positiva de epitopo de carboidrato" se refe- 15 re ao uso do nutracêutico, da composição farmacêutica, do micro-organismo carboidrato-positivo ou da fração do mesmo, ou de formulações que os compreendam, a um sujeito, com o objetivo de reduzir o risco ou da taxa de probabilidade de metástase ou disseminação da doença a outros órgãos ou outras partes do corpo ou a outros indivíduos.
* 20 O termo "tratamento" se refere ao uso do nutracêutico, da com-
posição farmacêutica, do micro-organismo carboidrato-positivo, ou da fração do mesmo, ou de formulações que os compreendam, a um sujeito, com o objetivo de curar, sarar, aliviar, mitigar, alterar, remediar, melhorar ou afetar o câncer, os sintomas do câncer, a predisposição ao câncer, o tempo de so- 25 brevivência ou o tempo de progressão.
A doença positiva de epitopo de carboidrato mencionada ou do- ença associada com tal epitopo de carboidrato ou doença caracterizada pela presença do dito epitopo de carboidrato é qualquer doença associada a um príon, vírus, micro-organismo, bactéria ou outro material biológico que pode 30 sofrer ligação de pelo menos uma das moléculas de ligação a carboidratos, preferivelmente por pelo menos um dos anticorpos específicos de epitopo de carboidrato ou que está associado a um componente do corpo ou que ocorre no corpo de um ser humano ou animal, tal como, mas sem limitação a, uma célula, micro-organismo, vírus ou partícula que sofre ligação de pelo menos uma das moléculas de ligação a carboidrato, preferivelmente ligação de pelo menos um dos anticorpos específicos de epitopo de carboidrato.
5 A quantidade eficaz de qualquer um dentre o nutracêutico, a
composição farmacêutica, o micro-organismo carboidrato-positivo, ou a fra- ção do mesmo, ou as formulações que os compreendam, compreende mi- cro-organismos vivos ou mortos, ou Iisados ou frações desses micro- organismos que correspondem a ou são derivados de cerca de 1x106 ou 10 1x1014 UFCs por pessoa por dia (UFCs /pessoa/dia), em que a UFC é uma unidade formadora de colônias, uma medida para um micro-organismo, tal como é do conhecimento de e pode ser determinado por aqueles versados na técnica.
Em outra modalidade da invenção, a "quantidade eficaz" é a quantidade do nutracêutico, da composição farmacêutica, do micro- organismo carboidrato-positivo, ou da fração do mesmo, ou de formulações que os compreendam que induz uma resposta imune-humoral ou celular contra o epitopo de carboidrato em pelo menos um indivíduo, preferivelmen- te uma resposta imune-humoral e uma resposta imunocelular contra o epito- po de carboidrato, detectável por pelo menos um dos testes de resposta i~ mune contra o epitopo de carboidrato descritos em outra parte deste. Em outra modalidade da invenção, a quantidade eficaz é a quantidade do nutra- cêutico, da composição farmacêutica, do micro-organismo carboidrato- positivo, ou da fração do mesmo, ou de formulações que os compreendam, que induz uma resposta imunocelular carboidrato-específica eficaz contra o epitopo de carboidrato em pelo menos um indivíduo, preferivelmente com- preendendo a ativação de células T auxiliares CD4-positivas de tipo Th1 e/ou de células T citotóxicas CD8-positivas contra o epitopo de carboidrato, detectável por pelo menos um dos testes de resposta imune descritos em outra parte deste.
Em outra modalidade da invenção, a quantidade eficaz é a quantidade do nutracêutico, da composição farmacêutica, do micro- organismo carboidrato-positivo, ou da fração do mesmo, ou de formulações que os compreendam, necessária para conferir um escudo imune contra cé- lulas tumorais positivas de epitopo de carboidrato, para ter um efeito profilá- tico contra o câncer ou para ter um efeito terapêutico contra o câncer, ou 5 para ter um efeito profilático ou terapêutico contra qualquer doença positiva de epitopo de carboidrato, cada um em pelo menos um indivíduo.
A quantidade eficaz para um indivíduo ou grupo de indivíduos pode ser determinada e/ou otimizada por aqueles versados na técnica, pre- ferivelmente usando-se pelo menos um dos testes de resposta imune contra 10 o epitopo de carboidrato descritos em outra parte deste e preferivelmente aquelas combinações de testes de resposta imune contra o epitopo de car- boidrato que são descritos em outra parte deste como modalidades preferi- das e/ou testes de resposta clínica conhecidos daqueles versados na técnica ou descritos em outra parte deste.
Essas quantidades eficazs podem variar das quantidades ou
dosagens descritas acima ou quantidades ou dosagens preferidas descritas em outra parte deste para uma pessoa dependendo, por exemplo, do sujeito, do número e da programação das dosagens, do formato ou formulação do nutracêutico, da composição farmacêutica, do micro-organismo caboidrato- 20 positivo ou da fração do mesmo, da via e da programação de administração ou do objetivo para o qual ela é usada, tal como profilaxia ou tratamento, do estado de uma doença ou câncer positivo de epitopo de carboidrato, e elas podem variar dependendo da espécie, das raças, e entre um ser humano ou animal individual que recebe o nutracêutico, a composição farmacêutica, o 25 micro-organismo carboidrato-positivo, ou a fração do mesmo, ou as formula- ções que os compreendam. Aqueles versados na técnica são capazes de determinar a dosagem apropriada e/ou ótima, a via de administração e a programação para um indivíduo ou para um grupo de indivíduos, preferivel- mente usando-se a descrição e a modalidade da invenção descrita neste.
São preferidas aquelas quantidades e dosagens eficazs do nu-
tracêutico, da composição farmacêutica, do micro-organismo carboidrato- positivo, ou da fração do mesmo, ou de formulações que os compreendam que induzem ou aumentam a resposta imune mencionada contra o epitopo de carboidrato em mais do que um indivíduo, mais preferivelmente em um número significativo de indivíduos, mais preferivelmente em pelo menos 10%, mais preferivelmente em pelo menos 20%, mais preferivelmente em 5 pelo menos 30%, mais preferivelmente em pelo menos 40%, mais preferi- velmente em pelo menos 50% e, da maneira mais preferível, na maioria dos indivíduos.
Em uma modalidade preferida, a quantidade eficaz é a quanti- dade do nutracêutico mencionado, da composição farmacêutica menciona- 10 da, do micro-organismo carboidrato-positivo mencionado, ou da fração do mesmo mencionada, ou de formulações que os compreendam, conforme mencionado, que induz uma resposta imune contra o epitopo de carboidrato em pelo menos um indivíduo.
Em uma modalidade preferida, a resposta imune induzida ou aumentada mencionada é uma resposta imune-humoral e uma resposta i- munocelular contra o epitopo de carboidrato detectável por pelo menos um dos testes de resposta imune-humoral de 1 a 6 e por um dos testes de res- posta imunocelular de 1 a 5.
Em uma modalidade preferida, a quantidade eficaz é a quanti- dade do nutracêutico mencionado, da composição farmacêutica menciona- da, do micro-organismo carboidrato-positivo mencionado, ou da fração do mesmo mencionada, ou de formulações que os compreendam, conforme mencionado, necessárias para conferir um escudo imune contra células tu- morais positivas de epitopo de carboidrato, para ter um efeito profilático con- tra o câncer ou para ter um efeito terapêutico contra o câncer ou para ter um efeito profilático ou terapêutico contra outra doença positiva de epitopo de carboidrato, cada qual em pelo menos um indivíduo. Em outra modalidade preferida, a quantidade eficaz é a quantidade do nutracêutico mencionado, da composição farmacêutica mencionada, do micro-organismo carboidrato- positivo mencionado, ou da fração do mesmo mencionada, ou de formula- ções que os compreendam, conforme mencionado, que induz a resposta imune máxima ou próxima da máxima contra o epitopo de carboidrato em pelo menos um indivíduo.
Em uma modalidade ainda mais preferida, a quantidade eficaz preferida é a quantidade do nutracêutico, da composição farmacêutica, do micro-organismo carboidrato-positivo, ou da fração do mesmo, ou de formu- 5 lações que os compreendam que induz as respostas imunes máximas ou próximas das máximas contra o epitopo de carboidrato conforme detectado nos testes de resposta imune contra o epitopo de carboidrato por aqueles versados na técnica, em que esta resposta imune máxima não precisa ser tal que seja positiva em todos os testes de resposta imune, mas preferivel- 10 mente que dê as respostas de anticorpos máximas ou maiores titulações de anticorpos contra o epitopo de carboidrato e/ou as maiores respostas das células T contra o epitopo de carboidrato e, mais preferivelmente, contra as células tumorais positivas de epitopo de carboidrato, mais preferivelmente ambas, e, da maneira mais preferível, aquelas que aparecem pelo menos 15 nos testes de resposta imune-humoral de 1 a 3 contra epitopo de carboidra- to, as titulações de anticorpos mais altas e/ou pelo menos nos testes de res- posta imunocelular 1 ou 2 ou 3 as respostas de cálulas T mais altas contra o epitopo de carboidrato.
Em uma modalidade preferida, a quantidade eficaz do nutracêu- 20 tico mencionado, da composição farmacêutica mencionada, do micro- organismo carboidrato-positivo mencionado, ou da fração do mesmo men- cionada, ou de formulações compreendendo micro-organismos vivos ou mortos, ou Iisados ou frações desses micro-organismos que correspondem a ou são derivados de 1x106 a 1x1014 Cfu por indivíduo por dose.
Em uma modalidade mais preferida, a quantidade eficaz do nu-
tracêutico, da composição farmacêutica, do micro-organismo carboidrato- positivo, ou da fração do mesmo, ou de formulações que os compreendam, compreende micro-organismos vivos ou mortos, Iisados ou frações desses micro-organismos que correspondem a ou são derivados de 1x107 a 1x1013 30 Cfu/pessoa/dia, mais preferivelmente 2x108 a 1x1012 e, mais preferivelmen- te, 1x109 - 1x1011 Cfu/pessoa/dia.
As quantidades eficazs ou dosagens eficazs também podem va- riar, como é reconhecido por aqueles versados na técnica, dependendo da via de administração, do uso de excipientes e da possibilidade de coutiliza- ção com outros agentes, tais como aqueles para aumento da imunidade, para indução de uma resposta imune, para formar um escudo imune ou para prevenir ou tratar o câncer.
As quantidades eficazs ou dosagens eficazs também podem va- riar, como é reconhecido por aqueles versados na técnica, dependendo do formato de uso, tal como uso como o nutracêutico, como a composição far- macêutica, como o micro-organismo carboidrato-positivo, como a fração do 10 mesmo, ou como as formulações que os compreendam, assim como se compreenderem micro-organismos vivos ou mortos, Iisados ou frações dos mesmos, assim como o número de doses, assim como dos intervalos tempo- rais entre doses. Esses fatores podem ser determinados e otimizados por aqueles versados na técnica, preferivelmente mediante o uso da invenção, 15 testes e métodos da invenção proporcionados.
Em uma modalidade preferida, o nutracêutico é administrado o- ralmente desde mais de uma dose diária, a uma dose diária, semanal ou mensal, de um interveio temporal curto a uso por um ano, sendo preferível diariamente ou semanalmente por 4 semanas a dois anos.
Em outra modalidade preferida, uma única dose é administrada
a um indivíduo.
Em outra modalidade preferida, doses múltiplas são administra- das a um indivíduo.
Em outra modalidade preferida, a quantidade eficaz corresponde a uma dose única.
Em outra modalidade preferida, a quantidade eficaz corresponde a doses múltiplas.
Em uma modalidade preferida, a composição farmacêutica pode ser administrada sistemicamente começando com apenas uma dose até muitas doses, preferivelmente de semanalmente a mensalmente, até 3 do- ses mensais ou 6 doses mensais ou uma combinação escalonada das mesmas, e pode ser combinada com uma renovação da imunização de uma * vez a cada seis meses a anualmente, de uma vez a cada 5 anos a uma vez a cada dez anos.
Em outra modalidade preferida da invenção, a dosagem eficaz da formulação do nutracêutico compreendendo pelo menos um micro- 5 organismo carboidrato-positivo ou Iisado ou fração do mesmo em seres se- res humanos é de 0,1 mg/m2 - 10 g/m2, mais preferivelmente de 10 mg/m2 - 10 g/m2 e ainda mais preferivelmente de 0,1 mg/m2 - 10 g/m2.
Em outra modalidade preferida, a formulação é administrada primeiro sistemicamente e com renovações orais subsequentes da imuniza- 10 ção.
O termo "administração" significa promover o contato entre um ser humano ou um animal e uma quantidade eficaz do nutracêutico do nu- tracêutico, da composição farmacêutica, do micro-organismo carboidrato- positivo, ou da fração do mesmo, ou de formulações que os compreendam, 15 para os quais veículos adicionais podem ser usados. As vias de administra- ção incluem qualquer via para colocar o humano ou animal em contato com o nutracêutico, a composição farmacêutica, o micro-organismo carboidrato- positivo, ou a fração do mesmo, ou com as formulações que os compreen- dam. São preferidas aquelas vias de administração tais como, mas sem Iimi- ^ 20 tação a, administração oral, administração sistêmica, administração via ina- lação ou pelo contato com a pele ou outra epiderme, que levam a uma res- posta imune contra o epitopo de carboidrato, a um escudo imune contra o epitopo de carboidrato ou contra as células tumorais positivas de epitopo de carboidrato, a um efeito profilático contra o câncer ou a um efeito terapêutico 25 contra o câncer, que pode ser determinado em suas formas preferidas como acima descrito ou em outra parte deste. Aqueles versados na técnica podem selecionar a via de administração mais apropriada.
Exemplos para vias e de vias preferidas de administração e de formulações estão descritos a seguir:
30 Os nutracêuticos são preferivelmente administrados por via oral,
por exemplo seja como cápsulas, comprimidos, emulsões, pós, líquidos, sob a forma de qualquer alimento ou bebida, ou como um componente de um alimento ou de uma bebida tal como um aditivo alimentar. O nutracêutico pode ser administrado sozinho ou misturado com pelo menos um outro in- grediente; pode ser dado sozinho ou misturado com um alimento ou bebida.
Uma formulação para administração oral do nutracêutico, mas 5 também da composição farmacêutica, do micro-organismo carboidrato- positivo ou da fração do mesmo ou de formulações que os compreendam, podem ser qualquer forma oralmente aceitável de dosagem ou quantidade eficaz do nutracêutico, da composição farmacêutica, do micro-organismo carboidrato-positivo ou da fração do mesmo ou de formulações que os com- 10 preendam incluindo, mas sem limitação a, comprimidos, cápsulas, nanopar- tículas, emulsões e suspensões aquosas, dispersões e soluções. Veículos comumente usados para comprimidos incluem Iactose e amido de milho. Agentes lubrificantes, tais como estearato de magnésio, também são nor- malmente acrescentados a comprimidos. Para administração oral sob a for- 15 ma de cápsula, diluentes úteis incluem Iactose e amido de milho seco. Quando suspensões aquosas ou emulsões são administradas oralmente, o ingrediente ativo pode ser suspendido ou dissolvido em uma fase oleosa combinada com agentes emulsificantes ou suspensores. Se desejado, certos agentes adoçantes, aromatizantes ou corantes podem ser adicionados.
Uma formulação para administração oral pode ser qualquer for-
ma de dosagem oralmente aceitável ou quantidade eficaz do nutracêutico da composição farmacêutica, do micro-organismo carboidrato-positivo ou da fração do mesmo ou de formulações que os compreendam incluindo, mas sem limitação a, comprimidos, cápsulas, nanopartículas, emulsões e solu- 25 ções aquosas, dispersões e soluções. Veículos comumente usados para comprimidos incluem Iactose e amido de milho. Agentes lubrificantes, tais como estearato de magnésio, também são normalmente acrescentados a comprimidos. Para administração oral sob a forma de cápsula, diluentes ú- teis incluem Iactose e amido de milho seco. Quando soluções aquosas ou 30 emulsões são administradas oralmente, o ingrediente ativo pode ser sus- pendido ou dissolvido em uma fase oleosa combinada com agentes emulsifi- cantes ou suspensores. Se desejado, certos agentes adoçantes, aromatizan- tes ou corantes podem ser adicionados.
A formulação da presente invenção pode ser administrada oral ou parenteralmente. A administração parenteral inclui injeções tais como infusão por soro, injeções hipodérmicas, intravenosas ou intramusculares, 5 aplicação transdermal com ungüentos ou fármaco transdermal e aplicação retal com supositório. Quando a composição é administrada oralmente, ela pode ser preparada sob a forma de uma cápsula rígida, cápsula macia, grâ- nulo, pó, grânulo fino, pílula, trocisco, sistema de liberação gradual do ingre- diente ativo, líquido e suspensão. A preparação pode ser facilmente rea Iiza- 10 da por métodos convencionais do campo farmacêutico.
O modo de administração e as formas de dosagem afetarão, é claro, as quantidades terapêuticas dos compostos e das composições dese- jáveis e eficazes para a aplicação de tratamento dada. Quando a formulação da presente invenção for preparada sob a forma de administração oral, a 15 composição pode ser preparada usando-se ingredientes farmacêuticos con- vencionais em um fármaco normal, tais como agente de enchimento, exten- sor, aglutinante, desintegrador, tensoativo, diluentes tais como lubrificantes e excipientes. Exemplos particulares dos ingredientes convencionais incluem recipientes tais como lactose, açúcar branco, cloreto de sódio, glicose, ureia, >· 20 amido, carbonato de cálcio, caulim, celulose cristalina e ácido silícico; agluti- nantes tais como água, etanol, xarope simples, glicose líquida, amido líqui- do, solução de gelatina, carboximetilcelulose, goma laca, metilcelulose, fos- fato de potássio e polivinilpirrolidona; agentes desintegradores tais como amido seco, alginato de sódio, ágar em pó, Iaminaran em pó, bicarbonato de 25 sódio, carbonato de cálcio, ácidos graxos de polioxietileno sorbitol, Iauril sul- fato de sódio, ácido esteárico monoglicerídeo, amido e lactose; inibidores de determinação tais como açúcar branco, ácido esteárico, manteiga de cacau e óleo hidrogenado; absorventes tais como sal de amônio quaternário, e Iau- ril sulfato de sódio; agentes umidificantes tais como glicerina e amido; agen- 30 tes absorventes tais como amido, lactose, caulim, bentonita e ácido silicílico coloidal; e lubrificantes tais como talco purificado e estearato. Caso necessá- rio, a preparação inclui ainda corantes, conservantes, perfume, agente aro- matizante e agente adoçante. Sais farmaceuticamente aceitáveis são bem conhecidos daqueles versados na técnica e incluem sais básicos de ácidos inorgânicos e orgânicos, tais como ácido clorídrico, ácido bromídrico, ácido sulfúrico, ácido fosfórico, ácido metanossulfônico, ácido etanossulfônico, á- 5 cido málico, ácido tartárico, ácido cítrico, ácido lático, ácido oxálico, ácido succínico, ácido fumárico, ácido maleico, ácido benzóico, ácido salicílico, ácido fenilacético e ácido mandélico. Além disso, sais farmaceuticamente aceitáveis de compostos da presente invenção podem também ser formados com um cátion farmaceuticamente aceitável, por exemplo, caso um grupo 10 substituto compreenda uma porção caboxila. Cátions farmaceuticamente aceitáveis são bem conhecidos na técnica e incluem cátions alcalinos, cá- tions alcalinos de amônio terroso e cátions quaternários de amônio.
Em uma modalidade preferida, a via de administração da com- posição farmacêutica é selecionada do grupo consistindo em injeção intra- venosa, injeção intraperitoneal, injeção intramuscular, injeção intracranial, injeção intratumoral, injeção intraepitelial, administração transcutânea, admi- nistração esofageal, administração intra-abdominal, administração intra- apendicular, administração intra-arterial, administração intra-articular, admi- nistração intrabrônquica, administração intrabucal, administração intracapsu- lar, administração intracardíaca, administração intracartilaginosa, administra- ção intracavitária, administração intracefálica, administração intracólica, ad- ministração intracutânea, administração intracística, administração intrader- mal, administração intraductal, administração intraduodenal, administração intrafascicular, administração no tecido adiposo, administração intrafilamen- tar, administração intrafissural, administração intragástrica, administração intraglandular, administração intra-hepática, administração intraintestinal, administração intramelar, administração intralesional, administração intrali- gamentosa, administração intralingual, administração intramamária, adminis- tração intramedular, administração intrameníngica, administração intramio- cárdica, administração intranasal, administração intraocular, administração intraoperatória, administração intraoral, administração intraóssea, adminis- tração intraovária, administração intrapancreática, administração intraparie- tal, administração intrapélvica, administração pericárdica, administração in- traperineal, administração intraperitoneal, administração intraplacental, ad- ministração intrapleural, administração intrapontina, administração intrapros- tática, administração intrapulmonar, administração intrarraquidiana, adminis- 5 tração intrarretal, administração intrarrenal, administração intraescleral, ad- ministração intraescrotal, administração intrassegmentar, administração in- trasselar, administração intraespinhal, administração intraesplênica, adminis- tração intraesternal, administração intraestromal, administração intrassinovi- al, administração intratarssal, administração intratesticular, administração 10 intratoráxica, administração intratonsilar, administração intratraqueal, admi- nistração intratubária, administração intratimpânica, administração intraurete- ral, administração intrauretral, administração intrauterina, administração in- travaginal, administração intravascular, administração intraventricular, admi- nistração intravertebral, administração intravesical e administração intraví- 15 trea.
Em uma modalidade mais preferida da invenção, exemplos de vias de administração (=contato) incluem administração parenteral, por e- xemplo, intravenosa, intradermal, subcutânea, oral, transdermal (tópica), transmucosal, intraperitoneal, intranasal, retoenteral e oral.
‘ 20 Uma formulação da presente invenção pode incluir sais farma-
ceuticamente aceitáveis dos seus componentes. Sais farmaceuticamente aceitáveis incluem sais que são formados com ácidos orgânicos tais como, por exemplo, ácidos clorídricos ou fosfóricos, ou ácidos orgânicos tais como ácido acético, tartárico, ácido mandélico e similares. Sais formados com os 25 grupos carboxila livres também podem ser derivados de bases inorgânicas tais como, por exemplo, sódio, potássio, cálcio ou hidróxidos férricos e tais bases orgânicas como isopropilamina, trimetilamina, 2-etilamino etanol, his- tidina, procaína e similares. Veículos fisiologicamente toleráveis tais são bem conhecidos na técnica. Exemplos de veículos líquidos são soluções aquosas 30 estéreis que não contêm materiais além dos ingredientes ativos e água, ou contêm um tampão tal como fosfato de sódio, a um valor de pH fisiológico, soro fisiológico ou ambos, tais como solução salina com tampão fosfato. A- lém disso, veículos aquosos podem conter mais que um tampão salino, as- sim como sais tais como cloretos de sódio e de potássio, dextrose, propile- noglicóis, polietilenoglicóis e outros solutos. Composições líquidas podem também conter fases líquidas além de e excluindo água. Exemplos de tais 5 fases líquidas são glicerina, óleos vegetais tais como óleo de semente de algodão, ésteres orgânicos tais como oleato de etila e emulsões água-óleo. Uma formulação contém um micro-organismo carboidrato-positivo, Iisado ou fração do mesmo da presente invenção, normalmente uma quantidade pelo menos 0,1 peso percentual de micro-organismo carboidrato-positivo, Iisado 10 ou fração do mesmo em peso da composição total. Um peso percentual é uma proporção em peso de um micro-organismo carboidrato-positivo, Iisado ou fração do mesmo da composição total. Assim, por exemplo, 0,1 por cento em peso é 0,1 grama de um micro-organismo carboidrato-positivo, Iisado ou fração do mesmo por 100 gramas da composição total.
O termo "sal farmaceuticamente aceitável" se refere àqueles
sais de compostos que retêm a efetividade biológica e as propriedades das bases livres e que são obtidos por reação com ácidos inorgânicos tais como o ácido clorídrico, ácido bromídrico, ácido sulfúrico, ácido nítrico, ácido fosfó- rico, ácido metanossulfônico, ácido etanossulfônico, ácido p- 20 toluenossulfônico, ácido salicílico e similares. Sais farmaceuticamente acei- táveis incluem, por exemplo, sais de metais alcalinos, tais como o sódio e potássio, sais de terras alcalinas e sais de amônia.
A formulação compreendendo como ingrediente ativo o micro- organismo carboidrato-positivo, Iisado ou fração do mesmo, pode estar em 25 uma forma apropriada para o uso oral, por exemplo, como comprimidos, tro- ciscos pastilhas, suspensões aquosas ou oleosas, pós ou grânulos dispersí- veis, emulsões, cápsulas rígidas ou macias, ou xaropes ou elixires. Compo- sições destinadas a uso oral podem ser preparadas de acordo com qualquer método conhecido na técnica para a fabricação de composições farmacêuti- 30 cas e tais composições podem conter um ou mais agentes selecionados do grupo consistindo em agentes adoçantes, agentes aromatizantes, agentes corantes e agentes preservantes para proporcionar preparações farmaceuti- camente elegantes e palatáveis. Comprimidos contêm o ingrediente ativo em mistura com excipientes não-tóxicos e farmaceuticamente aceitáveis que são adequados para a fabricação de comprimidos. Esses excipientes podem ser, por exemplo, diluentes inertes, tais como carbonato de cálcio, carbonato 5 de sódio, lactose, fosfato de cálcio ou fosfato de sódio; agentes granuladores e desintegradores, por exemplo, amido de milho ou ácido algínico; agentes aglutinantes, por exemplo, amido, gelatina ou acácia, e agentes lubrificantes, por exemplo, estearato de magnésio, ácido esteárico ou talco. Os comprimi- dos podem ser não- revestidos ou podem ser revestidos por técnicas conhe- 10 cidas para adiar a desintegração e absorção no trato gastrointestinal e, as- sim, proporcionar uma ação prolongada por um período mais extenso. Por exemplo, um material de retardo tal como o monoesterato de glicerila ou di- esterato de glicerila pode ser empregado. Eles podem também ser revesti- dos pelas técnicas descritas nas patentes US 4.256.108, 4.166.452 e 15 4.265.874 para formar comprimidos terapêuticos osmóticos para o controle da liberação. A formulação de acordo com a presente invenção pode tam- bém, ou alternativamente, conter um ou mais fármacos, que podem ser liga- das a um agente modulador ou podem ficar livres dentro da composição. Virtualmente qualquer fármaco pode ser administrado em combinação com 20 um agente modulador como aqui descrito, para uma variedade de objetivos, como descrito abaixo. Exemplos de tipos de fármacos que podem ser admi- nistrados com um agente modulador incluem analgésicos, anestésicos, anti- fúngicos, antibióticos, fármacos contra o câncer (por exemplo, taxol ou mi- tomicina C), anti-inflamatórios (por exemplo, ibuprofeno e indometacina), 25 anti-helmínticos, antidepressivos, antídotos, antieméticos, anti-histamínicos, anti-hipertensivos, antimaláricos, agentes antimicrotúbulo (por exemplo, col- chicina ou vinca alcalóides), agentes antienxaqueca, antimicrobianos, antip- sicóticos, antipiréticos, antissépticos, agentes como, p, ex., inibidores da pro- teína quinase C ou inibidores da mobilização do cálcio intracelular, antiartríti- 30 cos, agentes antitrombina, antituberculínicos, antitussivos, antivirais, supres- sores do apetite, fármacos cardioativos, fármacos para dependência quími- ca, catárticos, agentes quimioterapêuticos, vasodilatadores coronarianos, cerebrais ou periféricos, agentes contraceptivos, depressivos, diuréticos, fatores de crescimento, agentes hormonais, hipnóticos, agentes imunossu- pressores, antagonistas narcóticos, parassimpatomiméticos, sedativos, esti- mulantes, simpatomiméticos, toxinas (por exemplo, toxina da cólera), tran- quilizantes e anti-infecciosos urinários.
Formulações para uso oral podem também ser apresentadas como cápsulas rígidas de gelatina nas quais o ingrediente ativo está mistu- rado com um diluente sólido inerte, por exemplo, carbonato de cálcio, fosfato de cálcio ou caulim, ou como cápsulas de gelatina macia nas quais o ingre- 10 diente ativo está misturado com água ou um meio oleoso, como, por exem- plo, óleo de amendoim, parafina líquida ou óleo de oliva. Suspensões aquo- sas contêm os materiais ativos em mistura com excipientes adequados para a produção de suspensões aquosas. Tais excipientes são agentes suspen- sores, por exemplo, carboximetilcelulose, metilcelulose, hidroxipropilmetilce- 15 lulose, alginato de sódio, polivinilpirrolidona, goma de tragacanto e goma acácia; agentes dispersantes ou umidificantes podem ser um fosfatídeo de ocorrência natural, por exemplo lecitina, ou produtos de condensação ou um óxido de alquileno com ácidos graxos, por exemplo, estearato de polioxieti- Ieno ou produtos de condensação de óxido de etileno com álcoois alifáticos 20 de cadeia longa, por exemplo, heptadecaetileno oxicetanol, ou produtos de condensação de óxido de etileno com ésteres parciais derivados de ácidos graxos e um hexitol tal como polioxietileno com ésteres parciais derivados de ácidos graxos e hexitol anidridos, por exemplo polioxietileno sorbitano mo- nooleato. As suspensões aquosas podem também conter um ou mais pre- 25 servantes, por exemplo p-hidroxibenzoato de etila ou n-propila, um ou mais agentes corantes, um ou mais agentes aromatizantes e um ou ma is agentes adoçantes, tais como sacarose ou sacarina.
Suspensões oleosas podem ser formuladas por suspensão do ingrediente ativo em um óleo vegetal, por exemplo óleo de arachís, óleo de oliva ou óleo de coco, ou em um óleo mineral tal como parafina líquida. As suspensões oleosas podem conter um agente espessante, por exemplo cera de abelha, parafina dura ou álcool cetílico. Agentes adoçantes tais como a- * queles mencionados acima e agentes aromatizantes podem ser adicionados para proporcionar uma preparaçõa oral palatável. Essas composições po- dem ser conservadas pela adição de uma antioxidante tal como o ácido as- córbico.
5 Pós e grânulos dispersantes apropriados para a preparação de
uma suspensão aquosa pela adição de água para proporcionar o ingrediente ativo em mistura com um agente dispersante ou umidificante, agente sus- pensor e um ou mais conservantes. Agentes dispersantes ou umidificantes apropriados e agentes suspensores são exemplificados, por exemplo, por 10 agentes adoçantes, aromatizantes e corantes, podem também estar presen- tes.
A formulação da invenção também pode estar na forma de e- mulsões de óleo-em-água. A fase oleosa pode ser um óleo vegetal, por e- xemplo, óleo de oliva ou óleo de arachis, ou um óleo mineral, por exemplo, 15 parafina líquida, ou misturas desses. Agentes emulsificantes adequados po- dem ser gomas de ocorrência natural, por exemplo, goma de acácia ou go- ma de tragacanto, fosfatídeos de ocorrência natural, por exemplo, soja, Ieci- tina, e ésteres ou ésteres parciais derivados de ácidos graxos e anidridos de hexitol, por exemplo, monooleato de sorbitano e produtos de condensação 20 dos referidos ésteres parciais com óxido de etileno, por exemplo, monoolea- to de sorbitano e polioxietileno. As emulsões podem também conter agentes adoçantes e flavorizantes.
Xaropes e elixires podem ser formulados com agentes adoçan- tes, por exemplo glicerol, propilenoglicol, sorbitol e sucrose. Tais formula- 25 ções podem também conter um demulcente, um conservante e agentes a- romatizantes e corantes. As composições farmacêuticas podem estar sob a forma de um suspensão aquosa ou oleagenosa injetável estéril. Essa sus- pensão pode ser formulada de acordo com a técnica conhecida usando-se aqueles agentes dispersantes, umidificantes ou suspensores que foram 30 mencionados acima. A preparação injetável estéril pode também estar em uma solução ou suspensão estéril injetável ou em um solvente não-tóxico parentalmente aceitável, por exemplo como absolução em 1,3-butanodiol. Entre os veículos e solventes aceitáveis que podem estar usados estão á- gua, solução de Ringer e solução isotônica de cloreto de sódio. Além disso, óleos estéreis, estáveis são convencionalmente empregados como solventes ou meios de suspensão. Para este fim, qualquer óleo estável insípido pode 5 ser empregado, incluindo mono ou diglicerídeos sintéticos. Além disso, áci- dos graxos tais como ácido oleico encontram uso na preparação de injetá- veis. Níveis de dosagem da ordem de 0,01 mg a cerca de 140 mg por quilo- grama de peso corporal por dia são úteis no tratamento das condições indi- cadas acima (cerca de 2,5 mg a 7 g por paciente por dia). Por exemplo, um 10 tumor positivo de epitopo de carboidrato pode ser eficazmente tratado pela administração de cerca de 0,01 a 50 mg do composto por quilograma de pe- so corporal por dia (cerca de 0,5 mg até cerca de 3,5 g por paciente por dia). A quantidade de ingrediente ativo que pode ser combinada com os materiais veículos para produzir uma única dosagem variará dependendo do hospe- 15 deiro tratado e do modo específico de administração. Por exemplo, uma for- mulação destinada a administração oral em seres seres humanos pode vari- ar de cerca de 5 a cerca de 95% da composição total. As formas das unida- des de dosagem conterão geralmente entre cerca de 1 mg a cerca de 10 g de ingrediente ativo. Será compreendido, contudo, que o nível de dosagem 20 específico de qualquer paciente particular dependerá de uma variedade de fatores, incluindo a atividade do composto específico empregado, da idade, do peso corporal, da saúde geral, do sexo, do tempo de administração da dieta, da via de administração, da taxa de excreção, da combinação fárma- cosa e da gravidade da doença particular sob terapia. A quantidade de do- 25 sagem eficaz dos compostos de acordo com a invenção variará dependendo de fatores que incluem o composto específico, a toxicidade e a atividade ini- bitória, da condição tratada e de se o composto é administrado sozinho ou com outras terapias. Normalmente, uma quantidade de dosagem eficaz fica- rá na faixa de cerca de 0,0001 mg/kg a 1500 mg/kg, mais preferivelmente de 30 1a 1000 mg/kg, mais preferivelmente de 1 a 150 mg/kg de peso corporal e, da maneira mais preferida, entre 50 a 100 mg/kg de peso corporal. A inven- ção refere-se também a um processo ou a um método para o tratamento das condições patológicas supramencionadas. Os compostos da presente inven- ção podem ser administrados profilaticamente ou terapeuticamente, de pre- ferência em uma quantidade eficaz contra os distúrbios mencionados, em um animal de sangue quente, por exemplo um ser humano, com necessida- 5 de de tal tratamento; os compostos são usados preferivelmente sob a forma de composições farmacêuticas ou nutracêuticas.
A formulação de excipientes e soluções transportadoras farma- ceuticamente aceitáveis é bem conhecida daqueles versados na técnica, assim como o desenvolvimento de regimes de dosagem e de tratamento 10 apropriados para o uso das composições particulares aqui descritas em uma variedade de regimes de tratamento, incluindo administrações e formulações orais, parenterais, intravenosas, intranasais e intramusculares.
A. Adminsitração oral
Em certas aplicações, as formulações aqui reveladas podem ser 15 administradas por via oral a um ser humano ou a um animal. Como tais, es- sas composições podem ser formuladas com um diluente inerte ou com um veículo comestível assimilável, ou podem ser acomodadas em cápsulas de gelatina rígida ou macia, ou podem ser incorporadas diretamente com o ali- mento da dieta.
► 20 Os compostos ativos podem até mesmo ser incorporados com
excipientes e usados sob a forma de comprimidos ingeríveis, pastilhas bu- cais, pastilhas, cápsulas, elixires, suspensões, xaropes e similares. Os com- primidos, pastilhas, pílulas, cápsulas e similares podem conter também os seguintes: um aglutinante, como goma tragacanto, acácia, amido de milho 25 ou gelatina; excipientes, tais como fosfato dicálcico; um agente desintegra- dor, tal como amido, amido de batata, ácido algínico e similares; um lubrifi- cante, tal como estearato de magnésio; e um agente adoçante, tal como sa- carina, lactose ou sacarina podem ser adicionados a um agente aromatizan- te, tal como pimenta, óleo de gualitéria, ou aromatizante de cereja. Quando a 30 forma de unidade de dosagem for uma cápsula, ela pode conter, além dos materiais do tipo acima, um veículo líquido. Vários outros materiais podem estar presentes como revestimentos ou para modificar de outra maneira a forma física da unidade de dosagem. Por exemplo, comprimidos, pílulas ou cápsulas podem ser revestidas com goma laca, açúcar ou ambos. Um xaro- pe ou elixir pode conter o composto ativo sacarose como agente adoçante, metil e propilparabeno como preservantes, uma tintura e aromatizante, tal 5 como aroma de cereja ou laranja. É claro que qualquer material usado na preparação de qualquer unidade de dosagem deve ser farmaceuticamente puro e substancialmente não-tóxico nas quantidades empregadas. Além dis- so, os compostos ativos podem ser incorporados em preparados e formula- ções de liberação prolongada.
Normalmente, essas formulações podem conter pelo menos
0,1% do composto ativo ou mais, ainda que o percentual do(s) ingrediente(s) ativo(s) possa(m), é claro, variar ficar convenientemente entre cerca de 1 a 2% e cerca de 60% ou 70% ou mais do peso ou do volume da formulação total. Naturalmente, a quantidade do(s) composto(s) ativo(s) em cada com- 15 posição terapeuticamente útil pode(m) ser preparada(s) de tal maneira que uma dosagem apropriada seja obtida em qualquer unidade de dosagem do composto. Fatores tais como a solubilidade, biodisponibilidade, meia-vida biológica, via de administração, prazo de validade do produto, assim como outras considerações farmacológicas serão contempladas por aquele versa- 20 do na técnica de preparação de tais formulações farmacêuticas e, como tais, uma variedade de regimes de dosagem e de tratamento podem ser desejá- veis.
Para a administração oral, as composições da presente inven- ção podem alternativamente ser incorporadas com um ou mais excipientes 25 sob a forma de um colutório bucal, dentifrício, pastilha bucal, spray oral ou formulação de administração sublingual. Por exemplo, um colutório bucal pode ser preparado incorporando-se o ingrediente ativo na quantidade exigi- da em um solvente apropriado, tal como uma solução de borato de sódio (solução de Dobell). Alternativamente, o ingrediente ativo pode ser incorpo- 30 rado em uma solução oral tal como uma solução contendo borato de sódio, glicerina e bicarbonato de potássio, ou dispersada em um dentifrício, ou adi- cionada em uma dose terapeuticamente eficaz em quantidade igualmente eficaz a uma composição que pode incluir água, aglutinantes, abrasivos, a- gentes aromatizantes e umectantes. Alternativamente, as composições po- dem ser moldado sob a de forma de comprimido ou solução que possa ser colocada sob a língua ou de outra maneira dissolvida na boca.
5 B. Administração injetável
Em certas circunstâncias, pode ser desejável administrar as formulações aqui reveladas por via parenteral, intravenosa, intramuscular ou até mesmo intraperitoneal. Soluções dos compostos ativos sob a forma de bases livres ou sais farmacologicamente aceitáveis podem ser preparadas 10 em água apropriadamente misturada com um tensoativo tal como hidroxi- propilcelulose. Dispersões podem também ser preparadas em glicerol, polie- tilenoglicóis líquidos e misturas dos mesmos e em óleos. Em condições normais de armazenamento e uso, esses preparados contêm um preservan- te para impedir o crescimento de micro-organismos.
15 As formas farmacêuticas apropriadas para uso injetável incluem
soluções estéreis aquosas ou dispersões e pós estéreis para a preparação extemporânea de soluções e dispersões estéreis injetáveis. Em todos os casos, a forma deve ser estéril e deve ser fluida ao ponto de ser facilmente colocada em uma seringa. Deve ser estável sob as condições de produção e >■ 20 armazenamento e deve ser preservada contra a ação contaminadora de mi- cro-organismos tais como bactérias e fungos. O veículo pode ser um meio solvente ou dispersivo contendo, por exemplo, água, etanol, poliol (por e- xemplo, glicerol, propilenoglicol e polietilenoglicol líquidos e similares), mistu- ras apropriadas dos mesmos e/ou óleos vegetais. Fluidez apropriada pode 25 ser mantida, por exemplo, pelo uso de um revestimento, tal como a lecitina, pela manutenção do tamanho de partícula exigido no caso de uma dispersão e pelo uso de tensoativos. A prevenção da ação de micro-organismos pode ser facilitada por vários agentes antibacterianos e antifúngicos, por exemplo, parabeno, clorobutanol, fenol, ácido sórbico, timesoral e similares. Em mui- 30 tos casos, será preferível incluir agentes isotônicos, por exemplo, açúcares ou cloreto de sódio. Absorção prolongada das composições injetáveis pode ser realizada pelo uso de composições de agentes retardadores da absor- ção, por exemplo, monoesterato de alumínio e gelatina.
Para administração parenteral em uma solução aquosa, por e- xemplo, a solução deve ser apropriadamente tamponada se necessário e o diluente líquido primeiro tornado isotônico com suficiente solução salina ou 5 glicose. Essas soluções aquosas em particular são especialmente apropria- das para administração intravenosa, intramuscular, subcutânea e intraperito- neal. Nesse contexto, um meio aquoso estéril que pode ser empregado será conhecido daqueles versados na técnica à Iuz da presente revelação. Por exemplo, uma dosagem pode ser dissolvida em 1 ml de solução isotônica de 10 NaCI e ou adicionada a 1000 ml de fluido para hipodermóclise ou injetada no sítio proposto de infusão. Alguma variação na dosagem será necessária de- pendendo da condição do sujeito em tratamento. A pessoa responsável pela administração determinará, de qualquer modo, a dose apropriada para o su- jeito individual. Além do mais, para administração humana, os preparados 15 devem satisfazer os padrões de esterilidade, pirogenicidade e os padrões gerais de segurança exigidos pelos escritórios nacionais ou regionais de pa- drões biológicos.
Soluções estéreis injetáveis são preparadas pela incorporação dos compostos ativos na quantidade exigida no solvente apropriado com 20 vários dos outros ingredientes enumerados acima, como necessário, e em seguida sofrer esterilização. Geralmente, as dispersões são preparadas pela incorportação dos vários ingredientes ativos esterilizados em um veículo es- téril que contém o meio dispersivo básico e os outros ingredientes necessá- rios daqueles enumerados acima. No caso de pós estéreis para a prepara- 25 ção de soluções estéreis injetáveis, os métodos preferidos de preparação são técnicas de secagem a vácuo e que produzem um pó com o ingrediente ativo mais qualquer ingrediente adicional desejado de uma solução estéril previamente filtrada do mesmo.
As composições reveladas neste podem ser formuladas sob uma forma neutra ou salina. Sais farmaceuticamente aceitáveis incluem os sais de adição de ácido (formados com o grupo amina livre da proteína) e que são formados com ácidos inorgânicos tais como, por exemplo, ácidos hidroclóricos ou fosfóricos, ou tais ácidos orgânicos como ácido acético, oxá- lico, tartárico, mandélico e similares. Sais formados com os grupos carboxila livres podem também ser derivados de bases inorgânicas tais como, por e- xemplo, sódio, potássio, amônio, cálcio ou hidróxidos férricos e bases orgâ- 5 nicas tais como isopropilamina, trimetilamina, histidina, procaína e similares. Quando da formulação, as soluções serão administradas de uma maneira compatível com a formulação da dosagem e em tal quantidade como for te- rapeuticamente efetivo. As formulações são facilmente administradas em uma variedade de formas de administração, tais como soluções injetáveis, 10 cápsulas de liberação de fármacos e similares.
Da forma como aqui utilizado, o termo "veículo" inclui qualquer e todos os solventes, meios de dispersão, veículos, revestimentos, diluentes, agentes antibacterianos e antifúngicos, agentes isotônicos e de retardamen- to de absorção, tampões, soluções transportadoras, suspensões, colóides e 15 similares. O uso de tais meios e agentes para substâncias farmaceuticamen- te ativas é bem conhecido na técnica. Exceto na medida em que qualquer meio convencional for incompatível com o ingrediente ativo, o seu uso nas composições terapêuticas é contemplado. Ingredientes ativos suplementares podem também ser incorporados às composições.
* 20 A expressão "farmaceuticamente aceitável" se refere a entida-
des e composições moleculares que não produzem uma reação alérgica ou reação indesejada similar quando administrado em um ser humano. O pre- parado de uma composição aquosa que contém uma proteína como ingredi- ente ativo é bem compreendida na técnica. Normalmente, tais composições 25 são preparadas como composições injetáveis, seja como soluções solúveis ou suspensões; formas sólidas apropriadas para solução em, ou suspensão em, um líquido antes da injeção também podem ser preparadas. O prepara- do pode também ser emulsificado.
Em outra modalidade preferida, a invenção proporciona um mé- 30 todos para induzir ou aumentar uma resposta imuno específica de epitopo de carboidrato e/ou impedir ou tratar uma doença positiva de epitopo de car- boidrato, em que o nutracêutico mencionado, a composição farmacêutica mencionada, o micro-organismo carboidrato-positivo mencionado ou a fra- ção do mesmo mencionada ou as formulações mencionadas que os com- preendem é administrado a um indivíduo sadio.
Em outra modalidade preferida, a invenção proporciona um mé- 5 todos para induzir ou aumentar uma resposta imuno específica de epitopo de carboidrato e/ou impedir ou tratar uma doença positiva de epitopo de car- boidrato, em que o nutracêutico mencionado, a composição farmacêutica mencionada, o micro-organismo carboidrato-positivo mencionado ou a fra- ção do menso mencionada ou as formulações mencionadas que os compre- 10 endem é administrado a um indivíduo com uma doença associada a um epi- topo de carboidrato, um câncer, um tumor, pelo menos uma célula tumoral ou cancerosa, ou pelo menos uma metástase.
Em particular, o nutracêutico, a composição farmacêutica, o mi- cro-organismo carboidrato-positivo ou a fração do menso ou formulações que os compreendam podem ser usados para induzir uma resposta imune contra um câncer, tumor, célula cancerosa ou células cancerosas ou a me- tástase derivada das mesmas, para induzir uma resposta imune que funcio- na como um escudo imune contra células tumorais, um câncer, tumor célula cancerosa ou células cancerosas ou a metástase derivada das mesmas, para tratar um tumor ou células cancerosas, metástase e/ou metástases, e/ou reduzir ou impedir a ocorrência, a disseminação ou metástase de um câncer, tumor, célula cancerosa ou células cancerosas ou a metástase deri- vada das mesmas em indivíduos saudáveis ou pacientes, respectivamente, cada uma compreendendo preferivelmente pelo menos uma célula tumoral caboidrato-positiva, selecionada de um câncer, tumor ou doenças cancero- sas ou tumorais como descrito abaixo ou em outra parte deste. Por exemplo, o tratamento é direcionado contra tumores ou cânceres primários, tumor re- sidual mínimo ou cânceres, recorrências e/ou metástases ou partes das mesmas. O tratamento dos tumores ou cânceres podem também ser efetua- do como um tratamento adjuvante. O nutracêutico, a composição farmacêu- tica, o micro-organismo carboidrato-positivo ou a fração do mesmo ou formu- lações que os compreendem podem também ser usados na profilaxia de doenças tumorais, tumores ou células tumorais positivas de epitopo de car- boidrato. Por exemplo, o uso profilático é direcionado à profilaxia de tumores e metástases. Esses agentes antitumorais são administrados de uma manei- ra apropriada de acordo com os métodos bem conhecidos ou como descrito neste. Uma variante preferida é a injeção ou a administração desses agen- tes antitumorais ou fármacos oralmente, intravenosamente, localmente nas cavidades corporais, por exemplo, pelas vias intraperitoneal, intrarretal, in- tragastrointestinal, localmente, p. exe., diretamente em um tumor, em órgãos ou vasos linfáticos (intranodais), mas também subcutâneamente, intradermi- camente ou sobre a pele e intramuscularmente. De uma maneira preferida, os tipos de administração podem também ser combinados, caso no qual a administração pode ser efetuada em diferentes dias de tratamento ou em um dia de tratamento, como descrito em detalhe em outro ponto deste. De acor- do com a invenção, também é possível combinar dois ou mais dos nutracêu- ticos da invenção, composições farmacêuticas, micro-organismos positivos de epitopo de carboidrato ou as frações dos mesmos ou formulações que os compreendem, assim como combinar uma combinação daquelas com um ou mais fármacos ou tratamentos tumorais, tais como terapias com anticorpos, quimioterapias ou radioterapias, apropriadamente administradas ou aplica- das ao mesmo tempo ou separadamente.
O câncer, tumor, células tumorais, células cancerosas ou a me- tástase derivada das mesmas é selecionada do grupo de doenças cancero- sas ou doenças tumorais da região do ouvido, nariz e garganta, dos pul- mões, mediastino, trato gastrointestinal, sistema urogenital, sistema gineco- 25 lógico, seio, sistema endócrino, pele, sarcomas ósseos e dos tecidos moles, mesoteliomas, melanomas, neoplasmas do sistema nervoso central, doen- ças cancerosas ou doenças tumorais durante a infância, linfomas, Ieucemi- as, síndromes paraneoplásticas, metástases com sítio primário desconheci- do, carcinomatoses peritoneais, malignidades relacionadas à imunossupres- 30 são e/ou metástases tumorais.
Mais especificamente, o câncer, tumor, células tumorais, células cancerosas ou a metástase derivada das mesmas podem compreender os tipos seguintes de câncer: adenocarcinoma do seio, da próstata ou do cólon; todas as formas de câncer do pulmão começando no tubo brônquico; câncer da medula óssea, melanoma, hepatoma, neuroblastoma, papiloma; apudo- ma, coristoma, branquioma; síndrome carcinóide maligna; doença carcinóide 5 do coração, carcinoma (por exemplo, carcinoma de Walker, carcinoma das células basais, carcinoma escamobasal, carcinoma de Brown-Pearce, carci- noma ductal, tumor de Ehrlich, carcinoma in situ, carcinoma de câncer 2 (câncer-2 carcinoma), carcinoma de células de Merkel, câncer de mucosa, carcinoma brônquico não-parvocelular, carcinoma de células pequenas, car- 10 cinoma papilar, carcinoma cirroso, carcinoma bronquioalveolar, carcinoma brônquico, carcinoma de células escamosas e carcinoma de células transitó- rias); desordem funcional histiocítica, leucemia (por exemplo, em conexão com a leucemia de células B, leucemia de células mistas, leucemia de célu- las destruidoras naturais, leucemia de células T, leucemia crônica de células 15 T, leucemia associada ao HTLV II, leucemia linfocítica aguda, leucemia Iinfo- cítica crônica, Ieukemia de mastócitos e leucemia mielóide); histiocitose ma- ligna, doença de Hodgkin, Iinfoma de não-Hodgkin, tumor solitário de células plasmáticas; reticuloendoteliose, condroblastoma; condroma, condrossarco- ma; fibroma; fibrossarcoma, tumores de células gigantes, histiocitoma; Iipo- 20 ma; lipossarcoma; leucossarcoma; mesotelioma; mixoma; mixossarcoma; osteoma; osteossarcoma; sarcoma de Ewing; sinovioma; adenofibroma; a- denolinfoma; carcinossarcoma; cordoma; craniofaringioma, disgerminoma, hamartoma; mesenquimoma; mesonefroma, miossarcoma, ameloblastoma, cementoma; odontoma; teratoma; timona, corioblastoma; adenocarcinoma, 25 adenoma; colangioma; cilindroma; cistadenocarcinoma, cistadenoma; tumor das células da granulosa; ginandroblastoma; hidradenoma; tumor das célu- las das ilhotas; tumor de células de Leydig; papiloma; tumor de células de Sertoli; tumor de célula de teca, leiomioma; leiomiossarcoma; mioblastoma; mioma; miossarcoma; rabdomioma; rabdomiossarcoma; ependimoma; gan- 30 glioneuroma, glioma; meduloblastoma, meningioma; neurilemoma; neuro- blastoma; neuroepitelioma, neurofibroma, neuroma, paraganglioma, para- ganglioma não-cromafinoma, angioqueratoma, hiperplasia angiolinfóide com eosinofilia; angioma esclerosante; angiomatose; glomangioma; hemangioen- dotelioma; hemangioma; hemangiopericitoma, hemangiossarcoma; Iinfangi- oma, linfangiomioma, linfangiossarcoma; pinealoma; cistossarcoma filóide; hemangiossarcoma; mixosarcoma, carcinoma ovariano; sarcoma (por exem- 5 pio, sarcoma de Ewing, experimentalmente, sarcoma de Kaposi e sarcoma de mastócitos); neoplasmas (por exemplo, neoplasmas ósseos, neoplasmas do seio, neoplasmas do sistema digestivo, neoplasmas colorretais, neoplas- mas sanguíneos, neoplasmas do pâncreas, neoplasmas da hipófise, neo- plasmas testiculares, neoplasmas orbitais, neoplasmas da cabeça e do pes- 10 coço, do sistema nervoso central, neoplasmas do órgão auditivo, da pelve, do trato respiratório e do trato urogenital); neurofibromatose e displasia cer- vical de células escamosas e/ou metástases derivadas de qualquer um des- tes.
Em uma modalidade preferida, o câncer, tumor, células tumo- rais, células cancerosas ou as metástases deles derivadas, é selecionado do grupo de doenças cancerosas ou doenças tumorais compreendendo pelo menos uma célula ou preferivelmente um número significativo de células ou mais preferivelmente uma maioria de células tumorais positivas de epitopo de carboidrato na definição de acordo com a invenção, selecionado do grupo de: tumores do ouvido, nariz e garganta, compreendendo tumores do nariz interno, seio nasal, nasofaringe, lábios, cavidade oral, orofaringe, laringe, hipofaringe, glândulas salivárias e paragnagliomas, tumores dos pulmões, compreendendo carcinomas brônquicos não-parvocelulares, carcinomas brônquicos parvocelulares, tumores do mediastino, tumores do trato gastro- intestinal, compreendendo tumores do esôfago, estômago, pâncreas, fígado, vesícula biliar e trato biliar, intestino delgado, cólon e carcinomas retais e anais, tumores urogenitais compreendendo tumores dos rins, uretra, bexiga, glândula da próstata, pênis e testículos, tumores ginecológicos compreendo tumores do colo, vagina, vulva, câncer uterino, doença maligna do trofoblas- to, carcinoma ovariano, tumor do tubo uterino (tubas de falópio), tumores da cavidade abdominal, carcinomas mamários, tumores dos órgãos endócrinos, compreendendo tumores da tireóide, paratireóide, córtex adrenal, tumores do pâncreas endócrino, tumores carcinóides, neoplasias endócrinas múlti- plas, sarcomas ósseos e dos tecidos moles, mesoteliomas, tumores de pele, melanomas compreendendo melanomas cutâneos e intraoculares, tumores do sistema nervoso central, tumores durante a infância, compreendendo re- 5 tinoblastoma, tumor de Wilms, neurofibromatose, neuroblastoma, sarcomas da família de Ewing, rabdomiosarcoma, Iinfomas compreendendo Iinfomas de não-Hodhkin, Iinfomas cutâneos das células T, Iinfomas primários do sis- tema nervoso central, doença de Hodgkin, Ieucemias compreendendo Ieu- cemias agudas, leucemia mielóide crônica e linfática, neoplasma de células 10 plasmáticas, síndromes mielodisplásticas, síndromes paraneoplásticas, me- tástases com tumor primário desconhecido, carcinomatoses peritoneais, ma- Iignidades relaconadas à imunossupressão compreendendo malignidades relacionadas à AIDS tais como sarcoma de Kaposi, Iinfomas associados à AIDS, Iinfomas associados à AIDS do sistema nervoso central, doença de 15 Hodgkin associada à AIDS e tumores anogenitais associados à AIDS, malig- nidades relacionadas a transplantes, tumores metastatizados compreenden- do metástases cerebrais, metástases pulmonares, metástases do fígado, metástases ósseas, metástases pleurais e pericárdicas e ascite maligna e/ou metástases derivadas de qualquer um destes.
Em outra modalidade preferida, o câncer, tumor, células tumo-
rais, células cancerosas ou as metástases derivadas destes é selecionado do grupo compreendendo doenças cancerosas ou doenças tumorais tais como carcinomas mamários, tumores gastrointestinais, incluindo carcinomas do cólon, carcinomas do estômago, carcinomas do pâncreas, câncer do có- 25 lon, câncer gástrico inicial, câncer do intestino delgado, carcinomas ovaria- nos, carcinomas cervicais, câncer de pulmão, câncer de próstata, carcinoma celular renal, melanoma maligno e/ou câncer de fígado e/ou metástases de- rivadas de qualquer um destes.
Em uma modalidade preferida adicional, o câncer, tumor, células tumorais, células cancerosas ou as metástases derivadas destes é selecio- nado do grupo de doenças cancerosas ou doenças tumorais compreenden- do pelo menos uma célula, preferivelmente um número significativo de célu- Ias ou mais preferivelmente uma maioria de células tumorais, que são positi- vas de epitopo de carboidrato na definição de acordo com a invenção, sele- cionada do grupo de carcinomas mamários, tumores gastrointestinais, inclu- indo carcinomas do cólon, carcinomas do estômago, carcinomas do pân- 5 creas, câncer do cólon, câncer gástrico inicial, câncer do intestino delgado, carcinomas ovarianos, carcinomas cervicais, câncer de pulmão, câncer de próstata, carcinomas celulares renais, melanoma maligno e/ou câncer de fígado e/ou metástases derivadas de qualquer um destes.
Em outra modalidade preferida, a invenção proporciona um mé- 10 todo para induzir ou aumentar uma resposta imuno específica de epitopo de carboidrato e/ou impedir ou tratar uma doença positiva de epitopo de carboi- drato, o câncer, um tumor, pelo menos um tumor ou célula tumoral ou celu- lar, ou pelo menos uma metástase compreendendo pelo menos uma célula positiva de epitopo de carboidrato.
15 Em uma modalidade preferida adicional, a invenção proporciona
um método para induzir ou aumentar uma resposta imuno específica de epi- topo de carboidrato e/ou prevenir ou tratar uma doença positiva de epitopo de carboidrato tendo o indivíduo tem um câncer, um tumor, pelo menos um tumor ou célula cancerosas, ou pelo menos uma metástase selecionada do ^ 20 grupo de doenças cancerosas ou doenças tumorais compreendendo carci- nomas mamários, tumores gastrointestinais, incluindo carcinomas do cólon, carcinomas do estômago, carcinomas do pâncreas, carcinomas do cólon, câncer gástrico inicial, câncer do intestino delgado, carcinomas ovarianos, câncer de pulmão, câncer de próstata, carcinomas celulares renais, mela- 25 noma maligno e/ou câncer de fígado e/ou metástases derivada de qualquer um destes.
Em uma modalidade preferida da invenção, a doença associada com o epitopo ou a doença positiva de epitopo de carboidrato é selecionada do grupo compreendendo distúrbios gastrointestinais, doença de Whipple, 30 sarcoidose, septicemia ou osteorradionecrose.
Os distúrbios gastrointestinais são preferivelmente selecionados do grupo compreendendo distúrbios funcionais do intestino e doenças infla- matórias intestinais, em que as doenças inflamatórias intestinais são sele- cionadas do grupo compreendendo doença de Crohn, ileíte e/ou colite ulce- rativa e os distúrbios funcionais do intestino são selecionados do grupo compreendendo refluxo gastroesofágico, dispepsia, síndrome do intestino 5 irritável e/ou dor abdominal funcional. O trato gastrointestinal no contexto da invenção consiste nos seguintes componentes: boca (cavidade bucal; inclui as glândulas salivares, mucosa, destes e língua), faringe, esôfago e cárdia, estômago, que inclui o antro e o piloro, intestino: intestino delgado, que tem três partes: duodeno, jejuno e íleo; intestino grosso, que tem três partes: ce- 10 co (o apêndice vermiforme ligado ao ao ceco); cólon (cólon ascendente, có- lon transverso, cólon descendente e flexura sigmóide); reto e/ou ânus.
Doenças associadas com o epitopo de carboidrato no sentido da invenção são também doenças inteiramente ou parcialmente devidas à for- mação de anticorpos e seus efeitos danosos sobre o organismo ou sistemas 15 de órgãos como um todo, isto é, devido à autoagressão. Uma classificação em termos de doenças autoimunes órgão-éspecíficas, intermediárias ou sis- têmicas pode ser feita. As doenças autoimunes órgão-específicas são tireoi- dite de Hashimoto, miexedema primário, tireotoxicose (doença de Basedow), anemia perniciosa, doença de Addison, miastenia grave e/ou diabete melito 20 juvenil. As doenças autoimunes intermediárias preferidas são síndrome de Goodpasture, anemia hemolítica autoimune, Ieucopenia autoimune, trombo- citopenia idiopática, pênfigo vulgar, oftalmia simpática, cirrose biliar, hepatite autoimune, colite ulcerosa e/ou síndrome de Sjõgren. As doenças autoimu- nes sistêmicas preferidas são artrite reumatóide, febre reumática, lúpus eri- 25 tematoso, dermatomiosite/polimiosite, esclerose sistêmica progressiva, gra- nulomatose de Wegener, panarterite nodosa e/ou hypersensitivity angiitis. Doenças autoimunes típicas são tireototoxicose, mixedema causado pela tireóide, tireoidite de Hashimoto, endocrinopatia generalizada, anemia perni- ciosa, gastrite crônica de tipo A, doenças de um único ou de todos os ele- 30 mentos corpusculares do sangue (por exemplo, anemia hemolítica autoimu- ne, trombocitopenia idiopática ou trombocitopatia; Ieucopenia idiopática ou agranulocitose), pênfigo vulgar e penfigóide, oftalmia simpática e numerosas formas de uveíte, cirrose biliar primária e hepatite autoimune crônica agres- siva, diabete melito tipo I, doença de Crohn e colite ulcerosa, síndrome de Sjõgren, doença de Addison, lúpus eritematoso disseminado e a forma dis- cóide de tal doença, como dermatomiosite e escleroderma, artrite reumatói- 5 de (=poliartrite crônica primária), nefrite da membrana basal antiglomerular. A base é uma reação imune agressiva devido à degeneração da tolerância imune a autodeterminantes e a uma redução da atividade de células T su- pressoras (com o marcador de linfócitos T8) ou um excesso de células T auxiliares (com o marcador de linfócitos T4) sobre as células supressoras; 10 além disso, a formação de antígenos é possível, por exemplo, pelo acopla- mento de proteínas hospedeiras e haptenos (por exemplo, fármacos) por tecido ontogenético não se desenvolvendo até que a autotolerância tenha se desenvolvido, por componentes protéicos desmascarados como resultado de alterações conformacionais das proteínas em conexão com, por exemplo, 15 infecção por vírus ou bactérias e por novas proteínas formadas em conexão com neoplasias.
Doenças septicêmicas no sentido da invenção são doenças de- vidas à invasão contínua ou periódica por bactérias patogênicas e/ou suas toxinas de um foco de doença e sua disseminação na via linfossanguínea ^ 20 para formar uma infecção geral ou local.
Septicemia no sentido da invenção é preferivelmente septicemia por ferimento (flegmão, tromboflebite, linfangite), septicemia puerperal (no caso de febre puerperal), septicemia otogênica (no caso da otitis media), septicemia tonsiologênica (no caso da angina, peritonsillitis), cholangitic sep- 25 ticemia (no caso da purulent cholecystitis, colangite), pylephlebitic septicemia (no caso da pylephlebitis), septicemia umbilical (no caso da onfalite, etc.), urossepticemia, assim como granuloma dental. A septicemia no sentido da invenção pode ser de aguda a altamente aguda (fulminante), subaguda (por exemplo, como endocartite lenta) ou crônica e, é claro, pode ser também 30 septicemia neonatal.
Portanto, as septicemias no sentido da invenção são todas alte- rações patogênicas em um paciente que podem ser associadas a febre in- termitente e calafrios, com tumor do baço, reações tóxicas ou dano à medula óssea ou sangue (leucocitose polinuclear, anemia, hemólise, trombocitope- nia) ou com reações patogênicas no coração e nervo vasomotor (taquicardi- a, centralização da circulação sanguínea, edemas, oliguria, possivelmente
5 choque) ou no trato digestivo (língua seca, saburrosa, diarréia), ou com sep- ticopiemia (piemia com formação de infarto séptico e abscesso metastático).
No sentido da invenção, as doenças preferidas incluem: AIDS, acne, albuminúria (proteinuria), síndrome de abstinência alcoólica, alergias, alopecia (perda de cabelo), ALS (esclerose lateral amiotrófica), doença de 10 Alzheimer, degeneração macular senil da retina, anemia, talassemia, sín- drome de ansiedade, esclerose aórtica ESCLREROSE AÓRTICA POR AN- TRAZ (Antharax), doença arterial oclusiva, arteriosclerose, oclusão arterial, arterite temporal, fístula arteriovenosa, asma, insuficiência respiratória, do- ença autoimune, prolapso do disco intervertebral, inflamação do peritôneo, 15 câncer do pâncreas, distrofia muscular de Becker, hiperplasia benigna da próstata (HBP), carcinoma da bexiga, hemofilia, carcinoma brônquico, cân- cer de mama, BSE, infecção por clamídia, dor crônica, cirrose, commotio cerebri (concussão cerebral), doença de Creutzfeld-Jacbob, carcinoma intes- tinal, tuberculose intestinal, diabetes insípido, diabetes melito, diabetes meli- 20 to juvenil, retinopatia diabética, distrofia muscular de Duchenne, carcinoma duodenal, distrofia muscular progressiva, ebola, disfunção erétil, obesidade, fibrose, câncer cervical, câncer do útero, hemorragia cerebral, encefalite, perda de cabelo, anemia hemolítica, incontinência urinária, alergia a animais domésticos (alergia a pelos de animais), câncer de pele, hesper zoster, infar- 25 to cardíaco, insuficiência cardíaca, cardiovalvulite, metástase cerebral, der- rame cerebral, tumor cerebral, câncer do testículo, isquemia, doença de Ka- hler (plasmocitoma), pólio (poliomielite), rarefação óssea, carcinoma do có- lon, eczema de contato, paralisia, cirrose do fígado, fibrose pulmonar, câncer do pulmão, edema pulmonar, câncer dos nodos linfáticos (Morbus Hodgkin), 30 linfogranulomatose, linfoma, lyssa, carcinoma gástrico, meningite, mucovis- cidose (fibrose cística), esclerose múltipla (MS), infarto do miocárdio, neuro- dermite, neurofibromatose, tumores neuronais, câncer do rim (carcinoma das células renais), osteoporose, carcinoma do pâncreas, pneumonia, poliartrite, polineuropatias, distúrbios da potência, esclerose progressiva sistêmica (PSS), câncer de próstata, carcinoma do reto, pleurisia, trauma craniocere- bral, carcinoma vaginal, sinusite, câncer de esôfago, tremor, tuberculose, dor 5 tumoral carbonizações, queimaduras, intoxicações, meningite viral, meno- pausa, sarcoma dos tecidos moles, tumor dos tecidos moles, distúrbios da circulação sanguínea cerebral, tumores do SNC.
Para testagem, um estudo com voluntários seres humanos deve ser realizado no qual são determinadas as titulações de anticorpos do soro 10 contra Core-1 mediante o uso dos testes de resposta imune-humoral de 1 a
6 para determinação da resposta dos anticorpos contra o Core-1 antes da aplicação do nutracêutico e, preferivelmente, voluntários sem nenhum ou com níveis baixos de anticorpos anticore-1 são selecionados para os testes em seres seres humanos. Nestes voluntários, o nutracêutico compreenden- 15 do AG6 ou MU1 ou um placebo deve ser oralmente administrado em um pe- ríodo de 3 a 30 semanas. Deve ser realizada aplicação oral de pelo menos duas diferentes dosagens. As respostas imunes são acompanhadas pela determinação da resposta dos anticorpos e/ou da resposta das células T contra o Core-1 usando-se pelo menos um dos testes de resposta imune- -·■ 20 humoral de 1 a 6 e/ou um dos testes de resposta imunocelular de 1 a 5 an- tes de e em intervalos apropriados após o início da administração oral do nutracêutico. Caso uma formulação tenha as características desejadas, há significativa elevação da resposta dos anticorpos contra o Core-1 e/ou da resposta das células T contra o Core-1 observada em um número significati- 25 vo de voluntários do grupo de voluntários que recebeu o nutracêutico em comparação a titulação antes do estudo, como testado positivamente pela testagem positiva em pelo menos um dos testes de resposta imune-humoral de 1 a 6 e/ou em pelo menos um dos testes de resposta imunocelular de 1 a 5. No grupo do placebo, a elevação da resposta dos anticorpos ou das célu- 30 Ias T contra o Core-1 deve ser menos freqüentemente observada ou ser ob- servada em uma menor medida.
Isso demonstra a efetividade do nutracêutico em seres seres humanos para a construção de uma resposta imune contra o Core-1 que funciona como um escudo contra células cancerosas positivas para o Core-1 para a prevenção, redução ou disseminação de tumores positivos para o Core-1 ou metástases ou o seu tratamento.
5 Para o teste do potencial terapêutico, um estudo deve ser reali-
zado com pacientes de câncer seres humanos imunocompetentes com tu- mores positivos para o Core-1 que tenham sofrido cirurgia para remoção da maior parte do tumor. As titulações séricas de anticorpos contra o Core-1 são então determinadas pelo uso de pelo menos um dos testes de resposta 10 imune-humoral de 1 a 6 para a determinação da resposta imune existente contra o Core-1 antes da primeira aplicação da composição farmacêutica. A composição farmacêutica compreendendo AG6 ou MU1 ou um placebo é administrada diversas vezes oralmente, intraperitonealmente ou intraveno- samente por um período de 3 a 70 semanas. A administração de pelo menos 15 duas diferentes dosagens apropriadas é realizada. As respostas imunes são seguidas pela determinação da resposta dos anticorpos e/ou das células T contra o Core-1 mediante a utilização de pelo menos um dos testes de res- posta humoral de 1 a 6 e/ou dos testes de resposta imunocelular de 1 a 5 e/ou as respostas clínicas são seguidas pela determinação do tempo para 20 progressão, sobrevivência sem tumor e/ou volumes e/ou sítios tumorais, ca- da um antes de a intervalos apropriados após o início da administração da composição farmacêutica. Há uma elevação significativa da resposta dos anticorpos contra o Core-1 e/ou das células T contra o Core-1 observada em um número significativo de voluntário do grupo que recebe a formulação da 25 invenção em comparação com a titulação antes do estudo, conforme positi- vamente testado pelo teste positivo em pelo menos um dos testes de res- posta imune-humoral de 1 a 6 e/ou em pelo menos um dos testes de respos- ta imune-humoral de 1 a 5 e/ou uma resposta clínica parcial ou completa ou um tempo prolongado para progressão ou tempo de sobrevivência em um 30 número significativo de pacientes recebedores da formulação. No grupo do placebo a elevação da resposta dos anticorpos contra o Core-1 é menos frequentemente observada ou é observada em uma menor medida e/ou uma resposta clínica significativamente menor é observada.
Isto pode mostrar a efetividade da composição farmacêutica em seres seres humanos para construir uma resposta imune contra Core-1, a qual funciona como um defensora contra células cancerosas positivas para 5 Core-1, para a prevenção, redução ou afastamento da ocorrência de tumo- res positivos para Core-1, ou metástase, ou seu tratamento.
O contato entre o micro-organismo positivo para o Core-1 ou fração do mesmo dentro do corpo do organismo vivo (humano/animal) pode iniciar a produção de anticorpos que se ligam à Core-1, ao antígeno do Co- 10 re-1, às células tumorais positivas à Core-1 em um número significativo de seres seres humanos ou animais.
Surpreendentemente, anticorpos contra o Core-1 podem funcio- nar como um mecanismo de vigilância imune contra células cancerosas re- cém-surgidas. De maneira ainda mais surpreendente, uma resposta imuno- 15 celular específica para o Core-1 compreendendo a ativação de células T CD4-positivas de tipo Th1 e/ou ativação de células T citotóxicas CD8- positivas direcionadas contra o Core-1 e/ou estrutura de carboidrato, conju- gado de carboidrato ou uma célula mamífera compreendendo o dito epitopo de carboidrato pode ser alcançada em um número significativo de seres se- >■ 20 res humanos ou animais.
Em um estudo com titulações de anticorpos séricos de voluntá- rios seres humanos saudáveis contra Tn ou Lewis ou Lewis-Y pode ser de- terminado mediante o uso de pelo menos um dos testes de resposta imune- humoral de 1 a 6, determinando-se a resposta imune existente contra Tn ou 25 Lewis antes da primeira aplicação do nutracêutico e preferencialmente vo- luntários com nenhum ou baixos níveis de anticorpos para Tn ou Lewis Y são selecionados para o teste com seres humanos. Nestes voluntários, o nutracêutico compreendendo um micro-organismo positivo para a Tn, ou um micro-organismo positivo para a Lewis-Y ou um placebo são administrados 30 oralmente por um período de 3 a 30 semanas. A aplicação oral de pelo me- nos duas diferentes dosagens é realizada. As respostas imunes são segui- das pela determinação da resposta dos anticorpos e das células T contra a Tn ou a Lewis Y mediante o uso de pelo menos um dos testes de resposta imune-humoral de 1 a 6 e pelo menos um dos testes de resposta imunocelu- lar de 1 a 5 antes de e a intervalos apropriados após o início da administra- ção oral do nutracêutico. Para formulações apropriadas uma elevação signi- 5 ficativa da resposta dos anticorpos contra a Tn ou Lewis Y e/ou da resposta T celular contra a Tn ou Lewis Y1 respectivamente, deve ser observada em um número significativo de voluntários do grupo de voluntários que recebe o nutracêutico em comparação à titulação antes do estudo como positivamen- te testado pela positividade em pelo menos um dos testes de resposta imu- 10 ne-humoral de 1 a 6 e/ou em pelo menos um dos testes de resposta imuno- celular de 1 a 5. No grupo do placebo a elevação da resposta dos anticorpos ou das células T contra a Tn ou a Lewis Y é menos frequentemente obser- vada ou é observada em uma menor medida. A indução da resposta imuno- celular é caracterizada pela ativação de células T específicas para a Tn ou 15 Lewis Y, tais como células Th1 CD4-positivas e/ou células T citotóxicas CD8-positivas, indicando a indução de uma resposta imunocelular eficaz para a Tn ou Lewis Y eficaz, respectivamente.
Isso pode demonstrar a efetividade do nutracêutico em seres se- res humanos para a construção de uma resposta imune contra a Tn ou Le- wis Y que funciona como um escudo contra células cancerosas positivas para a Tn ou Lewis Y para a prevenção, redução ou disseminação de tumo- res positivos para a Tn ou Lewis Y ou metástases ou o seu tratamento.
Antes da primeira aplicação da composição farmacêutica em um estudo com pacientes de câncer seres humanos imunocompetentes sofren- 25 do de tumores positivos para a Lewis Y, as titulações séricas dos anticorpos contra a Lewis Y são determinadas mediante o uso de pelo menos um dos testes de resposta imune-humoral de 1 a 6, determinando-se a resposta i- mune existente contra a Lewis Y.
Os pacientes são tratados no abiente adjuvante após a remoção da maior parte do tumor. A composição farmacêutica compreendendo uma cepa de bactérias positivas para a Lewis Y ou um placebo é administrada diversas vezes por via oral, intraperitoneal ou intravenosa por um período de 3 a 70 semanas. A administração de pelo menos duas diferentes dosagens é realizada. As respostas imunes são seguidas pela determinação da resposta dos anticorpos e/ou células T contra a Lewis Y mediante o uso de pelo me- nos um dos testes de resposta humoral de 1 a 6 e/ou dos testes de resposta 5 imunocelular de 1 a 5. A resposta clínica é seguida pela determinação do tempo de progressão, sobrevivência sem o tumor e/ou volumes e/ou sítios tumorais, cada uma antes de e a intervalos apropriados após o início da ad- ministração da composição farmacêutica. Há uma elevação significativa da resposta dos anticorpos contra a Lewis Y e/ou da resposta das células T 10 contra a Lewis Y observada em um número significativo de voluntários no grupo que recebe a formulação da invenção em comparação com a titulação antes do estudo, como positivamente testado pela positividade em pelo me- nos um dos testes de resposta imune-humoral de 1 a 6 ou em pelo menos um dos testes de resposta imunocelular de 1 a 5 e/ou por uma resposta clí- 15 nica parcial ou completa ou por um prazo prolongado de progressão ou tem- po de sobrevivência em um número significativo de pacientes recebedores da formulação.
A resposta das células T induzida demostra as características de uma resposta imunocelular específica para a Lewis Y compreendendo a -20 ativação de células T Th1 CD4-positivas e/ou células T citotóxicas CD8- positivas. No grupo do placebo a elevação da resposta dos anticorpos ou a resposta das células T contra a Lewis Y é menos frequentemente observada ou é observada em uma menor medida e/ou nenhuma ou resposta clínica é observada ou é significativamente menor.
25 Isso demonstra a efetividade da composição farmacêutica em
seres seres humanos para a construção de uma resposta imune contra a Lewis Y que funciona como um escudo contra células cancerosas positivas para a Lewis Y para a prevenção, redução ou disseminação da ocorrência de tumores positivos para a Tn ou Lewis Y ou metástases ou o seu trata- 30 mento.
O contato entre o micro-organismo positivo para a Lewis Y ou fração do mesmo dentro do corpo do organismo vivo (humano/animal) pode iniciar a produção de anticorpos que se ligam à Lewis Y, ao antígeno da Le- wis Y, às células tumorais positivas para a Lewis Y em um número significa- tivo de seres seres humanos ou animais. Surpreendentemente, anticorpos contra a Lewis Y podem funcionar como um mecanismo de vigilância imune 5 contra células cancerosas recém-surgidas. A indução de uma resposta imu- nocelular específica para a Lewis Y eficaz pode resultar na destruição de células tumorais positivas para a Lewis Y residuais ou recém-surgidas no paciente.
F) KITS
A invenção refere-se também a um kit para induzir uma resposta
imune-humoral e/ou celular específica em um ser humano ou animal contra o epitopo de carboidrato ou contra células tumorais positivas de epitopo de carboidrato, como descrito em outra parte deste, compreendendo o nutra- cêutico ou a formulação farmacêutica, ou o micro-organismo carboidrato- 15 positivo, ou a fração do mesmo ou formulações que os compreendam, que estão descritas em outra parte deste, e uma informação sobre o uso do kit.
A invenção refere-se também a um kit para induzir uma resposta imunocelular específica eficaz para o carboidrato em um ser humano ou a- nimal contra o epitopo de carboidrato ou contra células tumorais ou patológi- 20 cas positivas de epitopo de carboidrato, como descrito em outra parte deste, compreendendo o nutracêutico ou a formulação farmacêutica, ou o micro- organismo carboidrato-positivo, ou a fração do mesmo ou formulações que os compreendam, que estão descritas em outra parte deste, e uma informa- ção sobre o uso do kit.
A invenção refere-se também a um kit para reduzir ou prevenir a
ocorrência de uma doença ou tumor positiva de epitopo de carboidrato, pre- ferivelmente um tumor positivo de epitopo de carboidrato compreendendo o nutracêutico ou a formulação farmacêutica, ou o micro-organismo carboidra- to-positivo, ou a fração do mesmo ou formulações que os compreendam, 30 que estão descritas em outra parte deste, e uma informação sobre o uso do kit.
A invenção refere-se também a um kit para reduzir ou prevenir a < disseminação de uma doença ou metástase de um tumor positivo de epitopo de carboidrato, preferivelmente um tumor positivo de epitopo de carboidrato compreendendo o nutracêutico ou a formulação farmacêutica, ou o micro- organismo carboidrato-positivo, ou a fração do mesmo ou formulações que 5 os compreendam, que estão descritas em outra parte deste, e uma informa- ção sobre o uso do kit.
A invenção refere-se também a um kit para tratar uma doença ou tumor positivo de epitopo de carboidrato, preferivelmente um tumor posi- tivo de epitopo dé carboidrato, compreendendo o nutracêutico ou a formula- 10 ção farmacêutica, ou o micro-organismo carboidrato-positivo, ou a fração do mesmo ou formulações que os compreendam, que estão descritas em outra parte deste, e uma informação sobre o uso do kit.
A invenção refere-se a um kit para fortalecer o sistema imune ou para melhorar uma resposta imune, como descrito em outra parte deste, 15 compreendendo o nutracêutico ou a formulação farmacêutica, ou o micro- organismo carboidrato-positivo, ou a fração do mesmo ou formulações que os compreendam, que estão descritas em outra parte deste, e uma informa- ção sobre o uso do kit.
O kit pode incluir informações (folheto instrutivo, endereço na in- 20 ternet) explicando como combinar os componentes do kit. Tais informações podem também estar relacionadas com um esquema terapêutico.
A invenção refere-se também a um kit para a determinação da resposta imune contra o epitopo de carboidrato compreendendo pelo menos um dos testes de resposta imune contra o epitopo de carboidrato aqui des- 25 critos, preferivelmente pelo menos dois, e mais preferivelmente pelo menos um teste de resposta imune-humoral e um teste de resposta imunocelular, compreendendo pelo menos um dos materiais descritos sob o teste de res- posta imune correspondente e uma informação sobre o uso do kit. Em uma modalidade preferida, o kit compreende adicionalmente os controles corres- 30 pondentes e mais preferivelmente pelo menos um dos seguintes: o nutracêu- tico ou a formulação farmacêutica, ou o micro-organismo carboidrato- positivo, ou a fração do mesmo ou formulações dos mesmos, que estão descritas em outra parte deste, ou formulações que os compreendam.
A invenção refere-se também a um kit para a geração de pelo menos uma célula dendrítica funcional contra o epitopo de carboidrato, com- preendendo o nutracêutico, ou a formulação farmacêutica, ou o micro- organismo carboidrato-positivo, ou a fração do mesmo ou formulações que os compreendam e uma informação sobre o uso do kit.
Em uma modalidade preferida, o kit para gerar pelo menos uma célula dendrítica funcional contra o epitopo de carboidrato compreende ainda células dendríticas imaturas derivadas de uma linhagem celular dendrítica tal como, mas sem limitação a, a MUTZ-3 ou Nemod-DC.
A invenção refere-se também a um kit para a geração de pelo menos uma célula T ativada, células T, clone de célula T ou a linhagem de células T contra o epitopo de carboidrato, compreendendo o nutracêutico, ou a formulação farmacêutica, ou o micro-organismo carboidrato-positivo, ou a 15 fração do mesmo ou formulações que os compreendam e uma informação sobre o uso do kit.
A invenção refere-se também a um kit para isolar um micro- organismo carboidrato-positivo ou uma fração de um micro-organismo com- preendendo pelo menos uma molécula ou estrutura transportadora do epito- 20 po de carboidrato compreendendo pelo menos um anticorpo específico de epitopo de carboidrato ou molécula de ligação carboidrato e uma informação sobre o uso do kit.
A invenção refere-se também a um kit para a identificação de um micro-organismo positivo para o carboidrato ou uma fração de um micro- 25 organismo compreendendo pelo menos uma molécula ou estrutura transpor- tadora do epitopo de carboidrato compreendendo pelo menos um anticorpo específico de epitopo de carboidrato ou molécula de ligação carboidrato e uma informação sobre o uso do kit.
A invenção refere-se também a um kit para a identificação ou i- solamento de um micro-organismo ou fração de um micro-organismo positi- va para o carboidrato compreendendo pelo menos uma molécula ou estrutu- ra positiva de epitopo de carboidrato ou para a identificação de um micro- organismo positivo para o carboidrato apropriado para uso como um compo- nente de nutracêuticos e composições farmacêuticas da invenção compre- endendo pelo menos um anticorpo específico para o carboidrato ou molécula de ligação carboidrato e uma informação sobre o uso do kit.
Em uma modalidade preferida, o kit compreende pelo menos um
micro-organismo carboidrato-positivo, Iisado ou fração do mesmo como con- trole positivo.
G) MÉTODOS PARA A GERAÇÃO DE ANTICORPOS A invenção proporciona também um método para a geração de um anticorpo ou composição de anticorpos ou soro policlonal que reconhece o epitopo de carboidrato de interesse, compreendendo
(a) colocação em contato entre o nutracêutico, a composição farmacêutica, o micro-organismo carboidrato-positivo ou a fração do mesmo e um ser humano ou animal (b) indução ou aumento de uma resposta imune-humoral que
reconhece o epitopo de carboidrato e/ou uma célula tumoral positiva de epi- topo de carboidrato
(c) isolamento de tal anticorpo ou composição de anticorpos contra o epitopo de carboidrato De acordo com uma modalidade, na etapa (c) pelo menos uma
célula é gerada que produz o anticorpo ou composição de anticorpos men- cionada contra o epitopo de carboidrato. A etapa (c) mencionada pode ser realizada por vários métodos, tais como
(i) imortalização de pelo menos uma célula produtora do anticor- 25 po contra o epitopo de carboidrato, preferivelmente por fusão com uma li- nhagem celular imortal, como realizado na tecnologia de hibridoma, ou pre- ferivelmente por infecção com um vírus apropriado tal como o vírus Epstein Barr (VEB), ou por transfecção recombinante com pelo menos um gene que cause a imortalização da célula tal como E1 de EBV; ou 30 (ii) por análise da seqüência de peptídeos pelo menos das regi-
ões variáveis do anticorpo contra o epitopo de carboidrato ou pelo menos da região de ligação do anticorpo contra o epitopo de carboidrato responsável pela especificidade do anticorpo e transformação de células com DNA codifi- cador do anticorpo contra o epitopo de carboidrato como um anticorpo inte- gral de qualquer isótipo ou um fragmento do mesmo ou uma proteína de fu- são de um fragmento do anticorpo contra o epitopo de carboidrato ou do an- 5 ticorpo integral com pelo menos uma outra seqüência de aminoácidos ou de polipeptídeos.
Preferidas são as células capazes de produzir anticorpos esta- velmente, significando que as células podem passar por uma quantidade apropriada de ciclos de produção dos anticorpos, tais como, mas sem Iimita- 10 ção a, células de hibridoma e células de outras maneira imortalizadas ou por células transformadas recombinantemente de maneira estável tais como, mas sem limitação a, CHO1 SP2, YO, PerC.6, Hec293. Contudo, também a expressão transitória, tal como a expressão em células COS ou Hec293 ou células B são uma modalidade da invenção. O anticorpo monoclonal contra 15 o dito epitopo de carboidrato pode ser isolado do sobrenadante da cultura. Em uma modalidade preferida da invenção, tal célula produtora de um anti- corpo monoclonal contra o epitopo de carboidrato é obtida por clonagem de célula individual.
Em uma modalidade preferida, a invenção proporciona o ácido nucleico tal como DNA codificador do anticorpo monoclonal contra o epitopo de carboidrato ou um fragmento do mesmo.
Em uma modalidade preferida, a invenção proporciona um anti- corpo ou composição de anticorpos ou soro policlonal contra o epitopo de carboidrato, o anticorpo monoclonal contra o epitopo de carboidrato ou pelo 25 menos uma fração do mesmo. Em outra modalidade, a invenção proporciona uma célula produtora de um anticorpo ou composição de anticorpos contra o epitopo de carboidrato ou pelo menos uma fração dos mesmos. Em uma modalidade preferida adicional, a invenção proporciona um anticorpo mono- clonal contra o epitopo de carboidrato ou o fragmento do mesmo que é um 30 anticorpo humanizado ou um anticorpo humano de um camundongo trans- gênico.
Em uma modalidade preferida, a invenção proporciona a célula produtora um anticorpo ou composição de anticorpos contra o epitopo de carboidrato, o anticorpo monoclonal contra o epitopo de carboidrato ou pelo menos um fragmento do mesmo, como descrito acima.
O anticorpo contra o dito epitopo de carboidrato no sentido da 5 invenção pode ser qualquer anticorpo induzível em um ser humano ou um animal que reconhece o epitopo de carboidrato de interesse e/ou célula tu- moral veículoa de um epitopo de carboidrato de interesse, preferivelmente aqueles anticorpos que são anticorpos específicos de epitopo de carboidrato com os critérios de ligação ou especificidade descrito nas definições ou em 10 outra parte deste.
O anticorpo contra o dito epitopo de carboidrato pode ter and format tal como IgG, IgM, IgA1 IgE, IgD ou qualquer fragmento dos mesmos por tecnologias conhecidas daqueles versados na técnica tais como, mas sem limitação a, Fab, F(ab)2, anticorpos de cadeia única, anticorpos de do- 15 mínio único, multicorpos, proteínas de fusão de anticorpos, anticorpo ou an- ticorpos biespecífico(s) e anticorpos humanizados ou quimerizados.
Qualquer animal ou humano pode ser posto em contato com o nutracêutico, a composição farmacêutica, o micro-organismo carboidrato- positivo e/ou a fração do mesmo. São preferidos seres humanos e camun-
- 20 dongos, ratos, coelhos, cabras, camelos, galinhas, hamsters, porquínhos-da- índia ou macacos. Ainda mais preferidos são animais que aqueles versados na técnica sabem ser particularmente apropriados à geração de uma respos- ta dos anticorpos tais como, mas sem limitação a, coelhos, cabras, seres humanos, chimpanzés e camundongos para soros de anticorpos policlonais 25 e aqueles que os versados na técnica sabem ser particularmente apropria- dos à geração de anticorpos monoclonais tais como, mas sem limitação a, camundongos, ratos, seres humanos. Adicionalmente preferidos são ca- mundongos transgênicos que carregam pelo menos partes dos genes dos anticorpos seres humanos e seres humanos.
30 Por em contato significa usar qualquer método ou via de admi-
nistração em outra parte deste para administrar o nutracêutico a composição farmacêutica, o micro-organismo carboidrato-positivo e/ou a fração do mes- mo, que é capaz de induzir uma resposta humora! contra o epitopo de car- boidrato de interesse. Adjuvantes adicionais para aumentar a imunogenici- dade conhecidos daqueles versados na técnica podem ser usados. É prefe- rida a administração oral e sistêmica e, no contexto da última, a intravenosa, 5 a intradermal ou a subcutânea e ainda mais a administração periteoneal.
A indução da resposta imune-humoral contra o epitopo de car- boidrato de interesse pode ser testada nos testes de resposta imune- humoral da invenção e pelo menos um dos testes de resposta imune- humoral de 1 a 6 tem que ser positivo, como descrito em outra parte deste, 10 em que em uma modalidade preferida os anticorpos mencionados ganhos do soro, do plasma ou das fezes também incluem aqueles que são ganhos das células produtoras de anticorpos contra o epitopo de carboidrato de inte- resse, tais como células B, ou células B imortalizadas, ou células B expres- sando recombinantemente anticorpos contra o epitopo de carboidrato. Esses 15 anticorpos podem ser ganhos de uma variedade de maneiras conhecidas daqueles versados na técnica. Em uma modalidade preferida, soros do san- gue, ou frações de soros, ou um soro ou uma fração de um soro que foi pre- absorvido contra antígenos apropriados tais como antígenos microbianos negativos de epitopo de carboidrato de interesse, preferivelmente um micro- 20 organismo negativo de epitopo de carboidrato de interesse, ou anticorpos de uma célula produtora de anticorpos tal como aquelas descritas acima sob a forma de sobrenadantes celulares fracionados ou anticorpos purificados são usados como os anticorpos mencionados ganhos do soro, do plasma ou fe- zes em pelo menos um dos testes de resposta imune-humoral de 1 a 6.
DEFINIÇÕES
Nutracêutico
De acordo com a presente invenção, o termo "nutracêutico" sig- nifica qualquer nutriente, composição ou formulação de nutrientes que pode ser tomada oralmente por um ser humano ou animal tal como, mas sem Iimi- 30 tação a, nutrientes, aditivos nutricionais, aditivos alimentares, suplementos de dieta, alimento ou nutrição clínica, alimento ou nutrição medicinal, alimen- to enteral, nutrição clínica enteral, nutrição ou alimento para o cuidado da saúde, alimento para uso dietético especial, alimento para uso terapêutico específico ou alimento funcional que pode ser aplicado oralmente em dife- rentes formas, tais como, mas sem limitação a, cápsulas, comprimidos, e- mulsões, pós, líquidos, assim como sob a forma de qualquer alimento ou 5 bebida como parte dos mesmos. Em casos especiais, o nutracêutico pode ser dado parentalmente (alimento parenteral). O nutracêutico sozinho ou sua mistura com pelo menos um outro ingrediente pode ser dado sozinho ou misturado com um alimento ou bebida. O termo nutracêutico também signifi- ca qualquer alimento, bebida, cápsula, comprimido, emulsão, pó ou líquido. 10 Composição farmacêutica
De acordo com a presente invenção, o termo "composição far- macêutica" significa qualquer composição que pode ser usada como um fármaco, ou um produto farmacêutico ou um produto biológico, ou é um componente de um fármaco ou de um produto farmacêutico ou biológico.
15 Micro-organismo carboidrato-positivo
De acordo com a presente invenção, o termo "micro-organismo carboidrato-positivo" significa qualquer micro-organismo que é reconhecido e assim ligado quando em contato com pelo menos uma molécula de ligação carboidrato capaz de reconhecer especificamente um epitopo de carboidrato -20 (como definido em outra parte deste) em geral presente em uma molécula de uma célula humana ou animal. Preferivelmente, essa ligação pode ser inibida por tratamento brando com periodato e/ou pela remoção química ou enzimática parcial ou completa ou alteração do epitopo de carboidrato ou da estrutura da carboidrato compreendendo o epitopo de carboidrato e/ou pela 25 inibição da ligação da molécula de ligação carboidrato com quantidades a- propriadas de outra molécula de ligação carboidrato capaz de reconhecer o dito epitopo de carboidrato e/ou pela inibição da ligação da molécula de liga- ção carboidrato com quantidades apropriadas do epitopo de carboidrato ou de uma molécula, misturas de moléculas ou célula compreendendo o dito 30 epitopo de carboidrato quando incubadas com o micro-organismo durante estudos de ligação com a molécula de ligação carboidrato. Também com- preendidos pelo termo "micro-organismos carboidrato-positivos" estão os micro-organismos nos quais o epitopo de carboidrato de interesse é exposto somente após um tratamento enzimático ou químico tal como, por exemplo, um tratamento com periodato. O micro-organismo é, portanto, reconhecido e ligado quando em contato pelo menos com uma molécula de ligação carboi- 5 drato após o tal tratamento.
Um micro-organismo carboidrato-positivo pode ser qualquer mi- cro-organismo tal como, mas sem limitação a, bactérias, cianobactérias, eu- bactérias, fungos (cogumelos, leveduras, fuligem, mofo, etc.), vírus e proto- zoários, sendo preferidos micro-organismos bacterianos tais como, mas sem 10 limitação a, micro-organismos isolados do solo, de plantas, animais, seres humanos ou outros organismos vivos superiores tais como gatos, cães, por- cos, vacas, cabras, coelhos, camundongos, chimpanzés. Em uma modalida- de preferida, o micro-organismo carboidrato-positivo é um micro-organismo que se origina do sistema gastrointestinal humano.
Molécula de ligação carboidrato
De acordo com a presente invenção, o termo "molécula de liga- ção carboidrato" significa uma molécula que reconhece uma certa estrutura de carboidrato ou que se liga ao seu epitopo dependendo de um certo car- boidrato, tal como, mas sem limitação a, anticorpos monoclonais e policlo- nais carboidrato-específicos, Iectinas e selectinas e/ou moléculas derivadas. Preferivelmente, a molécula de ligação carboidrato mencionada reconhece especificamente um epitopo de carboidrato presente um uma célula humana ou animal tal como, por exemplo, um marcador tumoral. Mediante o uso de moléculas de ligação a carboidrato específicas para um epitopo de carboi- drato "humano", pode-se isolar um micro-organismo carboidrato-positivo car- regador de uma estrutura idêntica a ou que mimetiza o epitopo de carboidra- to de interesse, como pode ser determinado pela ligação de tal molécula de ligação carboidrato, que é preferencialmente um anticorpo. Exemplos de mo- léculas de ligação a carboidrato apropriadas estão descritos, por exemplo, na Tabela 2.
O anticorpo específico para o carboidrato pode ser um anticorpo integrai de qualquer animal ou humano tal como um murino, camundongo, * humano, IgM1 IgG, IgGI, lgG2, lgG3, lgG4, IgA, IgE, IgD humanizada ou quimérica ou qualquer fragmento de um anticorpo, desde que ele compreen- da a especificidade de ligação ou dependência do carboidrato, tal como Fab, F(ab)2 ou anticorpos de domínio único. Esses anticorpos podem também 5 conter pelo menos um aminoácido adicional ou mutações ou seqüências de polipeptídeos, tais como marcadores, reticuladores ou domínios de multime- rização e podem também se originar de outras fontes além dos animais, tais como plantas, e tais como seleções de bibliotecas de anticorpos sintéticos usando, por exemplo, monitor de fago ou monitor de Ribosoma, ou por re- 10 construção recombinante.
Epitopo de carboidrato
De acordo com a presente invenção, o termo "epitopo de car- boidrato" significa a estrutura à qual se liga, por contato, uma molécula de ligação carboidrato:
15 Tal epitopo de carboidrato pode, dessa maneira, eqüivaler à
porção de carboidrato à qual se liga tal molécula de ligação carboidrato ou então o epitopo de carboidrato pode compreender a porção de carboidrato à qual se liga a molécula de ligação carboidrato. Para maior clarificação, por exemplo, mas sem limitação a, (i) tal epitopo de carboidrato pode eqüivaler -20 ao tetrassacarídeo Lewis Y com todas as quatro unidades de carboidrato das quais são necessárias para a ligação da molécula de ligação carboidra- to, o anticorpo monoclonal A70-C/C8 ou o dito epitopo de carboidrato, tam- bém é Lewis Y compreendendo o trissacarídeo H-type 2, que é a exigência de especificidade de ligação mínima para a molécula de ligação carboidrato, o anticorpo monoclonal A46-B/B10, o qual também se liga ao tetrassacarí- deo da Lewis Y e/ou (ii) tal epitopo de carboidrato eqüivale à porção de car- boidrato à qual se liga um molécula de carboidrato, mas ele se liga diferen- temente, tal como, mas sem limitação a, ligação por ligações beta em vez de ligações alfa ou vice-versa ou por meio de um átomo de carboidrato diferen- te.
O termo epitopo de carboidrato pode também significar o antí- geno carboidrato que pode ser o mesmo que o epitopo de carboidrato ou ser qualquer estrutura compreendendo o epitopo de carboidrato descrito em ou- tra parte deste além de, por exemplo, uma parte/porção de peptídeo.
O epitopo de carboidrato pode consistir de estruturas de carboi- drato ou estruturas que mimetizam carboidratos, tais como polipeptídeos, 5 peptídeos, lipídios ou carboidratos ou combinações dos mesmos com estru- tura química diferente da do carboidrato mas que têm uma estrutura confor- macional que pode ser reconhecida por moléculas de ligação a carboidratos da invenção e que, assim, têm propriedades imunoquimicamente similares ou idênticas.
O epitopo de carboidrato pode sofrer ligação de outras biomolé-
culas (ou ser parte das mesmas), tais como, mas sem limitação a, polissaca- rídeos, peptidoglicanos, glicoproteínas, glicopeptídeos, glicolipídios, Iipopo- lissacarídeos, glicosaminoglicanos, polissacarídeos capsulares ou antígenos O.
O epitopo de carboidrato pode também ser reticulado por vários
reticuladores e a várias densidades a veículos naturais ou sintéticos tais co- mo poliacrilamida (aqui também denominada PAA) ou outras moléculas, tais como materiais de leito cromográfico (por exemplo, sefarose), biotína ou pro- teínas, tais como albumina sérica bovina (ASB), ovalbumin (Ova), hemocia- nina Keyhole Iimpet (KLH), toxinas, toxioides, epitopos T auxiliares.
O epitopo de carboidrato origina o corresponde a (por exemplo, mimetiza) um epitopo de carboidrato de uma célula humana ou animal e po- de estar presente na superfície da célula ou ser intracelular ou pode ser se- cretada pela célula humana ou animal. Preferivelmente, tal epitopo de car- boidrato é um marcador de patologia, p. e., um marcador tumoral.
Resposta imunocelular carboidrato-específica eficaz (RICCEE)
De acordo com a presente invenção, o termo "resposta imuno- celular carboidrato-específica eficaz" significa uma resposta imunocelular que é induzida pela administração de um imunogênico compreendendo um epitopo de carboidrato que preferivelmente apresenta as seguintes caracte- rísticas:
(i) a resposta imune contra o epitopo de carboidrato, significando que a resposta imune é carboidrato-específica ou dependente do carboidrato ou da disponibilidade do carboidrato, em que a resposta imune contra o epi- topo de carboidrato pode também ser ou compreender uma resposta imune contra pelo menos uma estrutura de carboidrato, conjugado de carboidrato 5 e/ou uma célula de mamífero compreendendo tal epitopo de carboidrato
(ii) a resposta imune é MHC-dependente
(iii) a resposta imune compreende uma resposta imune de tipo Th1 compreendendo a ativação de células T CD4-positivas de tipo Th1 e/ou
(iv) a indução de células T citotóxicas CD8-positivas
10 Preferivelemente a ativação de células T CD4-positivas de tipo
Th1 e a indução de células T citotóxicas CD8-positivas
A imunidade de tipo Th1 é caracterizada pela proliferação de cé- lulas T e pela secreção das citocinas INF-gama e/ou TNF-alfa e GM-CSF, que pode ser medida pelos testes de resposta imunocelular como revelados 15 neste ou por técnicas conhecidas daquele versado na técnica tais como, mas sem limitação a, análises de proliferação, ELISA, ELISpot ou citometria de fluxo.
A indução de células T citotóxicas CD8-positivas pode ser medi- da pelos testes de resposta imunocelular como revelados neste ou por técni- ^ 20 cas conhecidas daqueles versados na técnica.
A especificidade para o carboidrato da resposta imunocelular pode ser determinada pela re-estimulação das células T ativadas com o epi- topo de carboidrato, preferivelmente com o epitopo de carboidrato em um veículo diferente daquele usado para a inicialização da resposta das células 25 T, tal como, mas sem limitação a, Iisados ou frações de células que expres- sam o epitopo de carboidrato ou proteínas de peptídeos veículos do epitopo de carboidrato (no caso de inicialização com o epitopo de carboidrato em micro-organismos) e/ou por bloqueio da proliferação e/ou secreção de citoci- nas com moléculas de ligação a carboidrato e/ou um anticorpo específico de 30 classe MHC; preferivelmente, a especificidade da resposta imunocelular pa- ra o carboidrato é determinada pela re-estimulação das células T ativadas com o epitopo de carboidrato em um veículo diferente daquele usado na ini- cialização da resposta das células T e por bloqueio da proliferação ou secre- ção de citocinas com moléculas de ligação a carboidrato.
Fração de um micro-organismo carboidrato-positivo De acordo com a presente invenção, o termo "fração de um mi- cro-organismo carboidrato-positivo" significa um preparado ou purificação de uma parte ou partes de tal micro-organismo tal como, mas sem limitação a, um preparado de envelope ou parede celular, lisado, preparado de Iipopolis- sacarídeo, preparado de cápsulas ou preparado de cápsulas de polissacarí- deos. Eles compreendem pelo menos um componente carboidrato-positivo de tal micro-organismo carboidrato-positivo que sofre ligação por pelo menos uma das moléculas de ligação a carboidrato mencionadas que reconhecem o epitopo de carboidrato e/ou antígeno escolhido. Eles podem ser obtidos por preparação, purificação e/ou etapas de preparação ou purificação de pelo menos um micro-organismo carboidrato-positivo. Tais preparados e/ou purificações podem ser obtidos por métodos conhecidos daqueles versados na técnica tais como aqueles descritos acima ou tais como, mas sem limita- ção a, fracionamento celular único ou seqüencial, extrações de água por fe- nol, extrações mediante éter, digestões por Iisozima ou métodos cromatográ- ficos ou combinações dos mesmos. Ademais, o termo "fração de um micro- organismo carboidrato-positivo" também compreende componentes carboi- drato-positivos produzidos artificialmente que também são encontrados nos micro-organismo carboidrato-positivos da presente invenção. A figura 19, por exemplo, mostra alguns componentes positivos para o Core-1 e, assim, fra- ções de um micro-organismos positivo para o Core-1 (aqui: AG6). Esses componentes/frações positivos para o Core-1 do micro-organismo positivo para o Core-1 AG6 também poderiam ser produzidos quimicamente. O com- ponente carboidrato-positivo da fração contendo o componente carboidrato- positivo é detectado pela ligação da fração a pelo menos uma molécula de ligação carboidrato nos sistemas de teste tais como, mas sem limitação a, ELISA, citometria de fluxo, imunofluorescência ou dot blots, que são conhe- cidos daqueles versados na técnica. Em uma modalidade preferida da in- venção, a fração compreendendo um componente carboidrato-positivo é ob- tido por cromatografia de afinidade usando-se pelo menos um anticorpo car- boidrato-específico. Em uma modalidade preferida, uma única etapa de pre- paração ou purificação é utilizada. Em outra modalidade preferida, uma combinação de pelo menos duas etapas de preparação e/ou purificação é 5 utilizada.
Componente carboidrato-positivo
De acordo com a presente invenção, o termo "componente car- boidrato-positivo" significa qualquer componente de um micro-organismo carboidrato-positivo que sofre ligação quando em contato com pelo menos 10 um anticorpo carboidrato-específico ou molécula de ligação carboidrato. Tal componente carboidrato-positivo compreende pelo merios uma estrutura carboidrato-positiva compreendendo o epitopo de carboidrato como definido ou descrito em outra parte deste que pode estar disponível sob a forma da sua molécula natural onde é parte do micro-organismo, tal como um peptí- 15 deo, oligopeptídeo, polipeptídeo, lipídio, ceramida, carboidrato, lipoproteína, polissacarídeo, oligossacarídeo, polissacarídeo, proteoglicano ou glicoprote- ína, como uma parte de tal molécula ou sozinho. O componente carboidrato- positivo pode ser usado no sentido da invenção como uma fração do micro- organismo carboidrato-positivo como tal ou acoplado a outras estruturas
- 20 transportadorasas não-naturais tais como, mas sem limitação a, proteínas, lipídios, moléculas químicas tais como poliacrilamida. Preferivelmente, ele é usado em sua forma natural ou como uma parte de tal molécula natural. O componente carboidrato-positivo pode compreender um ou diferentes tipos de cadeia de carboidrato com um único epitopo de carboidrato ou múltiplos 25 epitopos de carboidrato de unidades repetidas de tais estruturas e pode con- ter estruturas ou unidades de carboidrato adicionais ou outras estruturas bi- omoleculares. Como descrito em outra parte deste, o epitopo de carboidrato pode também ser ou compreender uma estrutura que mimetiza um carboi- drato que é uma estrutura que pode sofrer ligação de pelo menos um anti- 30 corpo ou molécula carboidrato-específica e/ou pode induzir uma resposta imune contra o carboidrato, preferencialmente uma resposta imune-humoral contra o carboidrato e mais preferencialmente uma resposta imunocelular eficaz contra tal carboidrato e, ainda mais preferencialmente, uma resposta imune-humoral contra o carboidrato e uma resposta imunocelular eficaz con- tra o carboidrato.
Molécula natural
De acordo com a presente invenção, o termo "molécula natural"
significa qualquer biomolécula ou partes da mesma que ocorre em pelo me- nos um organismo vivo ou morto (tal como, mas sem limitação a, príon, ví- rus, micro-organismo, protozoário, bactérias, algas, fungos, plantas, animais, seres humanos) ou é produzida por esse organismo.
Moléculas naturais podem ser usadas como organismos inteiros
(tais como micro-organismos ou vírus) ou podem ser isoladas de fontes na- turais ou podem ser sintetizadas neles com exatamente as mesmas estrutu- ras tal como quando ocorrem na natureza.
Preferivelmente, as moléculas naturais não são combinações de 15 moléculas ou partes das mesmas que não ocorrem em um organismo em tal combinação e não estão acopladas ou conjugadas a veículos sintéticos ou naturais tais como proteínas, peptídeos, KHL, OVA, ASB, toxina, toxioide, epitopo T auxiliar, biotina, PAA, contas magnéticas, nanopartículas ou mate- rial de leito cromográfico.
Sem a intenção de definir limitações, a invenção será explicada
em maior detalhe com referência aos exemplos a seguir.
Legendas das figuras
Figura 1
Árvore sem raiz (unrooted tree) baseada nas seqüências alinha- das sem ambigüidade (1248 pares de bases) dos isolatos AG6, MU1, seus parentes mais próximos e a cepa tipo E. coli obtida com o método de ligação de vizinhos mais próximos (7).
Figura 2
2a: produtos de PCR da cepa de E. coli LH obtidos após amplificação com o iniciados OPL07 - coluna 1: Iadder de 1 kb; colunas 2-11:cepas LH 2-5, 8, 13-16, 18; coluna 12: cepa 32 E. coli DSMZ 8697
2a: cepa IVIU e AG6 obtidas após amplificação com o inicia- dos OPA18 - coluna 1: 1 kb ladder; corredores 2-5: cepas MU 1, 3-5; coluna 6: AB12; coluna 7: B. thetaiotaomicron DSMZ 2079; coluna 8: B. ovatus DSMZ 1896; coluna 9 - B. vulgatus DSMZ 1447; coluna 10: B. acidifaciens DSMZ 15896; colunas 11-13: AG6.
Figura 3
ELISA com cepas bacterianas revestidas AG6, LH2 e MU1 (5 x 106 bactérias/ml) e os anticorpos monoclonais Nemod-TFI específicos para o Core-1 e anticorpos A68-B/A11 menos específicos e anticorpos de controle A6-B/C2.
Figura 3a
ELISA com cepas bacterianas revestidas Helicobacter pylori NCTC 11637, cepa de E. coli DSMZ 8697 (cepa 32) e cepa Mu1 de Bacteri- oides ovatus (cada um a uma densidade correspondente a 10 x DOesonm 0,1) e os anticorpos monoclonais Nemod-TFI, Nemod-TF2 e A68-BA11.
Figura 4
Análises por SDS-PAGE e Western blot da preparação de cáp- sulas da cepa AG6
A) coloração com alcian blue de SDS-polyacrilamid gel
B) Western blot com DIG-glicano manchamento Figura 5
Enriquecimento de polissacarídeos positivos para o Core-1 por cromatografia de fase reversa.
Figura 6
Seqüência de unidades repetidas do polissacarídeo capsular positivo para o Core-1 da cepa AG6 da B. ovatus
Figura 7
Estrutura das unidades repetidas do polissacarídeo capsular po- sitivo para o Core-1 da cepa AG6 da B. ovatus (L-fuc: L-fucose; D-Gal: D- galactose; HexNac: N-acetil-hexosamina; D-Hex: D-hexose; OMe: grupo O- metil).
Figura 8
Estrutura das unidades repetidas do polissacarídeo capsular po- sitivo para o Core-1 da cepa AG6 da B. ovatus (L-fuc: L-fucose; D-Ga!: D- galactose; HexNac: N-acetil-hexosamina; D-Hex: D-hexose; OMe: grupo O- metil).
Figura 9
Análise de soros de camundongos pelo teste de resposta imune-
humoral 1
Anticorpos IgM contra AGP e AGP tratada com ácido periódico foram determinados por ELISA nos soros de camundongos imunizados com PBS (grupo L), bactérias negativas para o Core-1 (grupo I) e bactérias posi- tivas para o Core-1 (grupo K).
Diluição sérica: 1:200, dia 21.
Figura 10
Sinais ELISA de soros imunes sobre conjugados carboidrato- PAA. Valores médios de sinais ELISA de 4 camundongos C3H contra o con- jugado Gal beta-1-3GalNAc alfa 1-PAA em relação com o sinal ELISA contra GIcNAcP 1-2Gaipi-3GalNAcalfa-PAA (diluição dos soros: 1:100).
Figs. 11aa11e
Análise FACS de soros de camundongo de camundongos imu- nizados com PBS (grupo L), bactérias negativas para o Core-1 (grupo I) e bactérias negativas para o Core-1 (AG6, grupo K) no dia 21.
A) intensidade da fluorescência média da análise FACS
B) histogram overlay (preto: grupo L; azul: grupo I; vermelho:
grupo K)
FiguraHc
Mostra os resultados do teste de resposta imune-humoral 1 com
soros de camundongos imunizados com cepas bacterianas de Bacteroides ovatus MU-1, E. coli LH2, E. coli 086 DSMZ 8697 = 32 (são mostrados os valores médios de 4 camundongos por grupo).
Figura 11d
Mostra os resultados do teste de resposta imune-humoral 2 com
soros de camundongos imunizados com cepas bacterianas de Bacteroides ovatus MU-1, E. coli LH2, E. coli AG3, E. coli 086 DSMZ 8697 = 32 (são mostrados os valores médios de 4 camundongos por grupo).
Figura11e
Mostra os resultados do teste de resposta imune-humoral 3 com soros de camundongos imunizados com cepas bacterianas de Bacteroides ovatus MU-1, E. coli LH2, E. coli AG3, E. coli 086 DSMZ 8697 = 32 (são mostrados os valores médios de 4 camundongos por grupo).
Figura 12
Teste de resposta imune-humoral 1 dos soros de camundongo livre de germes (camundongo de controle e e camundongo diferente imuni- zado com a cepa bacteriana AG6).
Figura 13
Teste de resposta imune-humoral 1 dos soros de camundongos CH3 imunizados oralmente com A) 2 x 1011 (grupo A) ou B 2 x 1010 (grupo B) bactérias pasteurizadas da cepa AG6 diariamente nos dias O a 28. São mos- 15 trados sinais ELISA no dia 21 contra a glicoforina (GP), asialoglicoforina (AGP) e AGP tratada com periodato (AGP + PJ) de camundongos individu- ais.
Figura 14
Teste de resposta imune-humoral 3 dos soros de camundongos CH3 imunizados oralmente com bactérias positivas para o Core-1 pasteuri- zadas (cepa AG6). Soros do dia 0 e do dia 28 foram diluídos a 1:300 e anali- sados em citometria de fluxo em busca de ligação nas linhagens celulares NM-wt eNM-D4.
Figura 15
Produção de citocinas pelas células T geradas para Iisados de
bactérias positivas para o Core-1 (AG6 e MU1) após re-estimulação com DCs carregadas com MN-D4 (DC/D4) positivas para Core-1 ou -negative NMwt (DC/wt) ceI-Iysates de linhagens celulares tumorais humanas. Inibição da produção de citocinas por pré-incubação da NM-DC carregada com Iisa- do com anticorpo específico para o Core-1 (DC/D4+Ak).
A) Produção de GM-CSF pelas células T (CIRT 1)
B) Produção de TNF-alfa pelas células T (CIRT 2) Figura 16 Teste de resposta imunocelular 2: resultados de análise por E- LISpot para a produção de INF-gama por responder T cells após re- estimulação com DCs carregadas com Iisados positivos para o Core-1 (DC/D4) ou Iisados celulares negativos para o Core-1 (DC/wt) de linhagens celulares tumorais humanas e inibição da produção de citocinas mediante pré-incubação das NM-DCs carregadas com Iisado com anticorpos específi- cos para o Core-1 (DC/D4+Ak).
Figura 17
Teste de resposta imunocelular 3: análise de proliferação das células T (WST) ou de responder cells (R) após re-estimulação com DCs carregadas com Iisados celulares positivos para o Core-1 (DC/D4) ou Iisados celulares negativos para o Core-1 (DC/wt) de linhagens celulares tumorais humanas e inibição da proliferação mediante pré-incubação das NM-DCs carregadas com Iisado com anticorpos específicos para o Core-1 (DC/D4+Ak).
Figura 18
Teste de resposta imunocelular 4: análise por imunofluorescên- cia de mNM-DCs carregadas com bactérias negativas para o Core-1 (AG3) ou positvas para o Core-1 (AG6) ou linhagem celular negativa para o Core-1 (NM-wt) ou positiva para o Core-1 (NM-D4).
Figura 19
Estruturas de carboidrato dos componentes positivos para o Co-
re-1
L-fuc: L-fucose; D-GaINac: /V-acetilgalactosamina; D-Gal: D- galactosamina; Hex: hexose; HExNAc: /V-acetil-hexosamina; OMe: O- metilação. Tais estruturas são, por exemplo, encontradas na AG6.
Figura 20
O antígeno Core-1 oculto e exposto.
Figura 21
A figura 21 mostra os sinais ELISA contra o conjugado PAA Gaipi-3 um -PAA e o conjugado PAA Galpl-3 GIcNAc a-PAA no dia 21. Os < soros foram considerados positivos se o sinal em PAA 48 era pelo menos 30% mais alto do que os sinais na PAA 43. Considerando este critério, 5 (A1, A2, A3, B1 e B5) dos 6 camundongos desenvolveram uma resposta imune-humoral específica para o Core-1.
5 Figura 22
Mostra uma tabela na qual cepas positivas para o Core-1 assim como cepas que não foram positivas para o Core-1 foram caracterizadas por sua sensibilidade a diferentes antibióticos.
Figura 23
Visão geral de um teste de resposta imune de acordo com a pre-
sente invenção.
Exemplos Exemplo 1
Técnicas e meios de cultura anaeróbica
As técnicas anaeróbicas empregadas no cultivo de bactérias fo-
ram baseadas em métodos previamente descritos que foram resumidos por Breznac e Costilow. Meios preparados com cisteína-HCI como agente redu- tor foram dispensados em tubos para cultura anaeróbica (Ochs, Bovenden, Alemanha) ou garrafas de vidro para soro , deixando aproximadamente de 20 metade a um terço do volume total do recipiente como espaço para o gás de topo e os recipientes foram então selados com tampões de borracha butílica. As soluções preparadas sem agentes redutores (p. e., PBS-a) foram fervidas antes de serem dispensadas. Antes da autoclivagem, a fase gasosa foi substituída por N2/CO2 (80/20, v/v). Para se realizar isso, agulhas foram in- 25 seridas nas garrafas fechadas com tampões de borracha butílica e os recipi- entes foram evacuados por meio de uma bomba de vácuo (Vacuubrand, Wertheim, Alemanha). Após a evacuação, os recipientes, que foram repeti- damente agitados durante todo o processo, foram gaseados com N2/C02 (80/20, v/v). Esse procedimento de evacuação e gaseificados foi realizado 30 três vezes no total. Antes de entrar no recipiente, a mistura gasosa foi pas- sada por um catalisador de paládio aquecido para remover traços residuais de oxigênio nela presentes. Resazurina (1 mg Γ1) foi usado como indicador de redução.
O meio para plaqueamento foi despejado sob uma cabine de fluxo laminar e armazenado sob condições anóxicas por pelo menos 24 h antes do uso. Isso foi feito seja em jarros pressurizados anaeróbicos (1,5 x 5 105 Pa) ou com um AnaeroGen de 3,5 I (Oxoid, Basingtoke, Inglaterra) ou em câmara da vácuo anaeróbica (Don Whitley Scientific, Shipley, Inglaterra) com descargas repetidas de N2/C02/H2 (80/10/10, v/v/v). A manipulação das amostras foi realizada em uma câmera anaeróbica (estação de trabalho de atmosfera variável MACS, Don Whitley Scientific, Shipley, Inglaterra ou Coy 10 Laboratory Products, Grass Lake, EUA).
As soluções e materiais não-estéreis foram esterilzados por au- toclave (121 C, 1,2 x 105 Pa, 15 min). Compostos Heat-Iabile foram feitos como soluções-mãe concentradas em água milli-Q, sterile-filtered (0,22 pm, éster celulósico misto, Roth, Karlsruhe, Alemanha) e adicionados ao meio nas concentrações exigidas.
Exemplo 2
Enriquecimento por afinidade de micro-organismos positi- vos para o Core-1
2.1 Preparação de Dynabeads® recobertas com TF1 e TF2
Dois volumes de 100 μ! cada um de Dynabeads® (IgM M-450 do
rato anticamundongo), Dynal Biotech ASA, Oslo, Noruega) foram colocados em 2 tubos Eppendorf safe-lock (Eppendorf, Hamburgo, Alemanha), lavados duas vezes com 2 ml de solução salina tamponada com fosfato (PBS-a: 8,1 g Γ1, NaCI; 0,16 g Γ1, NaH2PO4H2O, 0,98 g Γ1 Na2HP04.2H20 1 g Γ1 ASB, pH 25 7,4) usando o Dynal Magnetic Particle Concentrator® -S (MPC®-S, Dynal Biotech, Oslo, Noruega) e suspendidos em 25 μΙ de PBS-a. Sobrenadantes de cultura Iiofilizados de TF1 ou TF2 foram dissolvidos em 1 ml de água puri- ficada para síntese milli-Q (milli-Q synthesis grade water) (Millipore, Billerica, MA, USA). Sobrenadantes de cultura TF1 ou TF2 (1 ml) foram adicionados 30 aos tubos com Dynabeads® e incubados por 30 min a 4°C em um agitador de tubos (modelo 34528, Snijders Scientific, Holanda). Os tubos foram colo- cados no MPC®-S e deixados para descansar por 3 min antes da remoção do fluido com uma pipeta. As Dynabeads® foram ressuspensas em 2 ml de PBS-a, colocadas no MPC®-S e o fluido removido por pipetagem. Essa eta- pa de lavagem foi realizada três vezes. As Dynabeads® lavadas foram sus- pensas em seu volume original de 100 μΙ de PBS-a. As Dynabeads® prepa- 5 radas desta maneira foram ou usadas imediatamente ou no prazo de duas semanas desde a preparação após uma etapa de lavagem tripla com 2 ml de PBS-a.
2.2 Coleta e processamento de amostras fecais para o enri- quecimento das Dynabeads®
Amostras fecais de oito voluntários (Tabela 3) foram coletadas
em tubos plásticos perfurados, mantidas sob condições anóxicas usando-se um AnaeroGen Compact (Oxoid, Basinfroke, Inglaterra) e armanzenadas a 4°C por um máximo de 4 h antes do processamento. Os voluntários foram adultos jovens que não tinham ingerido antibióticos por pelo menos 3 meses 15 antes da data da coleta das amostras e tinham consumido suas dietas usu- ais.
Tabela 3: parâmetros individuais no momento da coleta das amostras
fecais
Número do sujeito idade gênero 1- GH 24 feminino 2-RM 26 feminino 3-TC 25 masculino 4 - AG 27 feminino 5-AB 37 feminino 6-MU 36 feminino 7-LH 24 feminino 8-CA 50 masculino Uma diluição de 10 vezes das amostras fecais foi preparada em PBS-b (PBS-b: 8,5 g I'1 NaCL, 0,3 g I-1 KH2PO4, 0,6 I'1 Na2HPO4, pH 7,0 con- tendo 0,1 g Γ1 de peptona e 0,25 g Γ1 de cisteína-HCI). Seis contas de vidro de 3 mm de diâmetro foram adicionadas e as amostras diluídas foram ho- mogeneizadas por agitação a baixa velocidade. As amostras homogeneiza- das foram centrifugadas (300 x g, 1 min, 210C) para sedimentar os fragmen- tos. Uma porção de 200 μΙ do sobrenadante resultante foi adicionada a 1,8 ml de PBS-b resultando em uma diluição de aproximadamente 100 vezes da 5 amostra fecal original. Essas diluições foram lavadas uma vez com 2 ml de PBS-b (8000 x g, 5 min, 210C) e os peletizados foram suspendidos em 2 ml de PBS-b.
2.3 Procedimento de enriquecimento das Dynabeads®
Um volume de 20 μΙ da diluição de 100 vezes foi adicionado a 10 um tubo de 2ml contendo 180 μΙ de PBS-a e 5 μΙ de Dynabeads® recobertas com anticorpos TF1 ou de Dynabeads® recobertas com anticorpos TF2. Os tubos foram incubados por 30 min a 4°C em um agitador de tubos. Os tubos foram colocados no MPC0-S e deixados para descansar por 3 min antes da remoção de quanto sobrenadante quanto possível por aspiração com serin- 15 ga e agulha. As amostras foram lavadas três vezes com 2 ml de PBS-a, mais uma vez removendo-se tanto sobrenadante quanto possível.
2.4 Plaqueando em meio seletivo e meio não-seletivo
As amostras lavadas foram suspensas em 1 ml de PBS-b e alí- quotas de 100 μ foram dispersas nas placas em vários meios seletivos e não-seletivos (Tabela 4) e incubadas por 48 h a 37°C em uma câmara anae- róbica.
Tabela 4: meios empregados para spread-plating
Meios fabricante seletivos para abreviação de Man, Rogosa e Merck, Darms- lactobacilos, bacté¬ MRS Sharpe tadt, Alemanha rias láticas ácidas Bifidus selective Fluka, St. Gallen, bifidobactérias BSM medium Suíça K-F Streptococcus Oxoid estreptococos KF Ágar Nutrient Ágar Oxoid não-seletivo N Schaedler Anaero- Oxoid não-seletivo S be Ágar Wilkens Chalgren Oxoid não-seletivo WC Anaerobe Ágar Brain Heart Infusi- Biomérieux, não-seletivo BHI on Ágar Marcy I5EtoiIe, França Columbia Ágar with Biomérieux não-seletivo CBA 5% sheep blood Stamm Agar não-seletivo ST Os meios sólidos foram preparados de acordo com as instruções dos fabricantes. A composição do ágar ST foi como segue: 1 g I"1 de pepto- na protease, 9 g Γ1 de peptona de carne, 3 g Γ1 de NaCI, 2 g I'1 de Na2HPO4 2H20, 3 g Γ1 de extrato de carne, 4 g Γ1 de extrato de levedura, 6 g I'1 de D 5 (+)-glicose, o,5 ml I"1 de Tween 80, o,25 g Γ1 de cisteína-HCI, 1 mg Γ1 de re- sazurina, 0,1 g I"1 de MgSO4 7H20, 5 mg Γ1 de FESO4 7H20, 0,5 g Γ1, 3,4 mg Γ1 de MnSO4 2H20, 1,5 g Γ1 de ágar bacteriológico, pH 7,0.
Para os sujeitos 1 a 4, as colônias de um procedimento de enri- quecimento foram selecionadas por seleção com base em ELISA. Para os 10 sujeitos 5 a 8, o procedimento de enriquecimento das Dynabeads® foi repe- tido duas vezes como segue: após 48 h de incubação as colônias foram ras- padas das placas, suspensas em PBS-b dentro da faixa dos padrões de tur- bidez de McFarIand 3 a 5 (preparadas como em (13)). Como antes, uma alí- quota de 20 μΙ desta suspensão foi adicionada a 180 μΙ de PBS-a. O enri- 15 quecimento e o procedimento de plaqueamento foi realizado três vezes no total, como previamente descrito.
As amostras fecais de quatro outros sujeitos (5 AB, 6 MU, 7 LH e 8 CA) foram enriquecidas para bactérias positivas para o Core-1. O proce- dimento de enriquecimento foi ligeiramente modificado no sentido de ser rea- 20 Iizado três vezes no total. Isto é, as colônicas foram obtidas após o isola- mento inicial foram raspadas das placas e submetidas a enriquecimento adi- cional. Sessenta novos isolados foram obtidos desta maneira.
Exemplo 3
Identificação de isolatos 3.1 Bioquímica
As bactérias foram identificadas com o sistema VITEK (Biomérie- xu, Marcy 1’Etoile, França). As bactérias foram preparadas de acordo com as instruções do fabricante e os cartões de identificação foram usados como segue: cartões ANI para isolatos anaeróbicos e facultativamente bastonetes anaeróbicos gram-positivos capazes de crescer em MRS broth (suspeita de lactobacilos), cartões GPI para Gram-positive isolatos e cartões GNI+ para isolatos aeróbicos gram-negative.
A identidade bioquímica dos isolatos obtidos usando o sistema VITEK (Biomériexu, Marcy I1EtoiIe, França) está resumida na Tabela 5. Os isolatos anaeróbicos AG6, MU (1, 3-5) e AB12 pertencem todos ao grupo Bacteroides fragilis, enquanto os isolatos aeróbicos são todos membros das Enterobacteriaceae; ambos são gram-negativos.
Cepa identificação probabilidade AG6 Bacteroides ovatus 82 - 95% MU (1, 3-5) AB12 AG3 Eseheriehia coli 89 - 99% LH (2-5, 8, 13-16, 18) 3.3 Molecular (sequenciamento)
O DNA foi extraído com o Invisorb Genomic DNA Kit Ill (Invitek,
Berlim, Alemanha) de acordo com as instruções do fabricante para peletiza- dos de células lavadas do protocolo Ill B obtidas das culturas líquidas sus- pensas em 1 ml de tampão de Iise D. iniviador 27f (5’ AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG) e 1492r (5’ TAC CTT GTT ACG ACT T) (10) foram usadas para amplificar o gene do DNA ribossomal bacteriano.
Cada PCR foi realizada em triplicata e a mistura da reação (50 μΙ) continha: 50 mM de KCI, 20 mM de Tris-HCI, 1 mM de MgCI2, 0,25 mM de cada dNTP, 1 μΜ de cada iniciador, 2,5 unidades de Taq DNA polimerase (Invitrogen, Karlsruhe, Alemanha) e 1 μΙ do DNA modelo. O programa da 20 PCR foi: 94°C por 5 min, 30 ciclos de 94°C por 1 min, 55°C por 1 min e 72°C por 1 min e finalmente 72°C por 10 min. Os produtos de PCR foram purifica- dos com o High Pure PCR Product Purification Kit (Roche, lndianapolis, EU- A) de acordo com as instruções do fabricante. Os produtos foram analisados por eletroforese em um gel de agarose a 1 % (w/v) em tampão tris-acetato- 25 EDTA (4,84 g I'1 de Tris, 1,142 ml Γ1 de ácido acético glacial, 0,372 g Γ1 de EDTA, pH 8,0). A concentração de DNA foi estimada usando o Low DNA Mass Ladder (invitrogen, Carlsbad, EUA). Para sequenciamento, usa-se ou o iniciador 27f, 338f (5’ GCT GCC TCC CGT AGG AGT) (2), 338r (5’ ACT CCT ACG GGA GGC AGC), 968f (5’ AAC GCG AAG AAC CTT AC) (14) ou 1492r. As reações de se- quenciamento foram realizadas com o DYEnamic™ ET Dye Terminator Cy- 5 cie Sequencing Kit (Amersham Biosciences, Little Chalfont, Inglaterra) de acordo com as instruções do fabricante. Os produtos de sequenciamento foram analisados com o MegaBACE 1000 System (Molecular Dynamics, Sunnyvale, EUA). As seqüências foram reunidas e manualmente ajustadas usando-se a função ContigExpress do Vector NTI Suite 9.0.0 (Invitrogen, 10 Carlsbad, Alemanha). Elas foram subsequentemente alinhadas com se- qüências altamente similares (92% de similaridade ou mais) obtidas com a função BLAST do National Centerfor Biotechnology Information (NCBI) (1). Os percentuais de similaridade foram calculados a partir de seqüências ali- nhadas sem ambigüidade usando-se a função Sequence Identity Matrix do 15 software Bioedit1 versão 5.0.9 ou com o Similarity Matrix, versão 1.1, do Ri- bosomal Database Project. Os resultados do sequenciamento foram confir- mados por comparação com as seqüências obtidas de um 16S rRNA gene sequencing Service provider (AMODIA, Braunschweig, Alemanha).
A identidade dos isolatos está representada na Tabela 6 e uma unrooted phylogenetic tree baseada nas seqüências dos isolatos AG6, MU1, seus parentes mais próximo e da cepa tipo E. coli ATCC 11755 está repre- sentada na Figura 1.
Tabela 6: identificação das cepas isoladas com bases seqüências alinhadas sem ambigüidade dos genes rRNA 16S usando-se a função Simi- Iarity Matrix, versão 1.1, do Ribosomal Database Project (5) Cepa identidade Similaridade (%) com a cepa número de acesso AG6 Bacteroides o- 98,2 ATCC 8483T X83952 vatus Bacteroides the- 97,1 ATCC 29148T L16489 taiotaomicron MU1 Bacteroides o- 98,0 ATCC 8483T X83952 vatus Bacteroides the- 97,1 ATCC 29148T L16489 taiotaomicron AG3 Eseheriehia eoli 99,5 k12 MG1655 AE000460 GH1 Lactobacillus 99,4 JCM 8130T D79212 paraeasei sp. paraeasei L. paraeasei sp. 99,4 JCM 1171T D16550 tolerans 96 Staphyloeoecus 99,2 27836T L37603 warneri Staphyloeoecus 99,0 51129T AF041361 pasteuri TC7 Lactobacillus 99,6 JCM 1136T D16552 rhamnosus Lactobacillus 98,7 ATCC 15820 D86516 zeae 3.3 DNA polimórfico amplificado aletoriamente (DPAA)
Alguns isolatos positivos para o Core-1 obtidos com o procedi- mento de enriquecimento repetido das Dynabeads® pareciam muito seme- 5 Ihantes no que diz respeito à sua morfologia celular e à morfologia das suas colônias apesar de terem sido isolados de meios diferentes. As cepas tam- bém eram muito similares no que diz respeito aos seus perfis bioquímicos obtidos com o sistema VITEK. Surgiu a seguinte questão: as bactérias isola- das seriam cepas idênticas. O RAPD é um método que não exige informa- 10 ções de sequenciamento e que pode ser aplicado para distinguir cepas. Re- <· sumidamente, o DNA genômico total é amplificado por PCR com um inicia- dor de 10 pares de bases a baixo rigor de maneira que seqüências randômi- cas de DNA sejam amplificadas com base em seqüências homólogas ao iniciador presente no DNA-alvo. Os produtos de PCR resultantes podem ser separados por eletroforese com gel de agarose e o padrão resultante pode ser comparado entre cepas. Os padrões de banda resultantes para todas as cepas LH foram análogos para os cinco iniciadores RAPD empregados (O- PL07, M13, OPX14, OPA16, OPA18). O padrão claramente difere daquele da cepa de E. coli DSMZ 8697 (Fig 2a), uma cepa que se relatou ter ativida- de do grupo sanguíneo B. As cepas de MU também parecem muito similares (Figura 2b); contudo, o seu padrão de banda claramente difere daquele do de outras cepas de Bacteroides, incluindo a AG6. Pareceria que uma cepa positiva para o Core-1 foi repetidamente enriquecida de cada doador positivo durante o processo de isolamento. As cepas isoladas diferiam entre indiví- duos.
Exemplo 4
Cultivo e fixação de bactérias para a seleção com base no
ELISA
Colônias bem-separadas foram selecionadas aleatoriamente de >· 20 placas de ágar seletivas e não-seletivas e redistribuídas três vezes em meio não-seletivo. Colônias individuais foram selecionadas e inoculadas em ST (como acima, omitindo-se o ágar), caldo WC ou MRS, dependendo de qual proporcionava melhor crescimento e cultivadas durante a noite a 37°C. Es- sas culturas foram inoculadas (1%) em 300 ml de caldo ST, WC ou MRS fresco e cultivadas durante a noite a 37°C. As células foram peletizadas (8000 x g, 15 min, 4°C) e ressuspensa em 10 ml de PBS-c (8 g I'1 de NaCI, 0,2 g I'1 de KCI, 1,44 g I*1 de NA2HPO4, 0,24 g I'1 de KH2PO4) (12). Essa suspensão foi fixada por 3 a 4 h a 4°C pela adição 30 ml de solução de para- formaldeído (PFA) a 4% (preparada de acordo com (8)) em PBS-c. Em se- guida, as amostras foram lavadas com 40 ml de PBS-c (8000 x g, 15 min, 4°C) e os peletizados foram suspendidos em 15 ml de PBS-c, seguido da adição de igual volume de etanol gelado a 96%. As amostras foram armaze- nadas a -20°C até a análise.
A pureza das culturas foi checada pela comparação da morfolo- gia celular, assim como pelo comportamento sob coloração de Gram. As culturas foram espalhadas nas placas aerobicamente em CBA para determi- nar sua capacidade de crescer na presença de oxigênio e para checar a au- sência de contaminantes aeróbicos.
Exemplo 6: manutenção dos isolatos
Os estoques criogênicos foram mantidos em tubos Microbank (MAST Diagnostica, Reinfeld, Alemanha) de acordo com as instruções do 10 fabricante e armazenados a -80°C. As soluções de trabalho foram mantidas em caldo WC, ST e MRS. Elas foram subcultivadas a cada 14 dias. A pureza das culturas foi confirmada pela observação do comportamento sob colora- ção de Gram, pela morfologia celular e pela comparação periódica das mor- fologias celulares em placas de CBA tanto sob condições aeróbicas quanto 15 sob condições anaeróbicas.
Exemplo 6
Cultivo, fixação e liofilização das bactérias para experimen- tos com animais
Para uso em experimentos com animais as bactérias foram cul- 20 tivadas e fixadas como descrito na seção 3 com as seguintes modificações: o volume da cultura inicial chegava a aproximadamente 41. Antes da fixação, as bactérias foram lavadas uma vez com 100 ml de PBS-b (8000 x g, 15 mon, 4°C) e ressuspensas no menor volume possível de PBS-b. Essa sus- pensão foi dividida em duas porções iguais, uma para fixação (7.1), a outra 25 para liofilização (7.2).
6.1 Fixação
A porção para fixação foi lavada (8000 x g, 15 min, 4°C) e res- suspensa em 30 ml de PBS-c. Esta suspensão foi adicionada a 90 ml da solução de PFA a 4% em PBS-c e fixada por 3 a 4 h a 4°C. Para melhorar a 30 remoção de PFA, as amostras foram lavadas três vezes com 120 ml de PBS-c (8000 x g, 15 min, 4°C). As células peletizadas foram suspensas em 45 ml de PBS-c, seguido da adição de um volume igual de igual volume de etanol gelado a 96%. As amostras foram armazenadas a -20°C.
Antes da adminitração nos animais, as bactérias fixadas foram Iiofilizadas sob condições de esterilidade em tubos Lideac (Eppendorf, Ham- burgo, Alemanha) para evaporar o etanol. Para garantir a não-viabilidade 5 das bactérias fixadas, elas foram inoculadas (1%) em caldo WC e plaquea- das em CBA e monitoradas para a ausência de crescimento pelo período de uma semana.
6.2 Pasteurização
As suspensões bacterianas foram lavadas duas vezes em PBS e ressuspensas em um pequeno volume de PBS. As suspensões bacteria- nas foram incubadas a 72°C por 30 min. Como controle da desativação bem- sucedida, as bactérias foram incubadas em um meio de cultura apropriado como descrito no exemplo 4.
6.3 Liofilização
A porção para liofilização foi adicionada a volume igual de saca-
rose a 24% (filtração estéril) e dividida em alíquotas em porções de 300 μΙ em tubos Lideac de 2 ml. Essas alíquotas foram congeladas em nitrogênio líquido por 1 h e Iiofilizadas (Alpha 2-4, Christ, Osterode, Alemanha) após sua colocação em prateleiras pré-resfriadas a -80°C. Após a liofilização, as 20 tampas dos tubos foram fechadas e eles foram armazenados a 4°C usando- se um minissistema de geração de gás Anaerocult® (Merck, Darmstadt, Ale- manha) com a adição de sílica gel Orange (Roth, Karlsruhe, Alemanha) co- mo dessecante.
6.4 Determinação dos preparados bacterianos
Os números totais de células dos preparados bacterianos fixa-
dos e Iiofilizados foram determinados com uma câmara Thoma de 0,01 mm de profundidade (LO-Laboroptik, Friedrichsdorf, Alemanha). No caso das bactérias liofilizadas, as unidades formadoras de colônias (UFCs) foram de- terminadas por plaqueamento de diluições séricas de 10 vezes em WC ágar 30 durante a noite dos cultivos feitos durante a noite e imediatamente antes e após a liofilização. Para este fim, o Iiofilizado foi dissolvido em 300 μΙ de cal- do WC, deixado para descansar por 15 min, ressuspendido por agitação a baixa velocidade e diluído serialmente. As UCFs dos preparados foram de- terminados antes e após o uso em experimentos com animais para garantir a viabilidade. A pureza dos preparados foi checada como descrito na seção 4.
Exemplo 7
Amostras de soro
Sangue foi coletado com o sistema S-monvette (Sarstedt, Nüm- brecht, Alemanha) e o soro foi preparado de acordo com as instruções do fabricante. As amostras de soro foram armazenadas em alíquotas a -80°C antes da análise.
Exemplo 8
Extração da IgA fecal
Amostras fecais foram coletadas e armazenadas a -80°C. As fe- zes foram Iiofilizadas e os pesos secos líquidos registrados. Todas as mani- pulações foram realizadas em gelo. A IgA foi extraída de acordo com Grewal (6), com algumas modificações. As amostras Iiofilizadas (-30 mg) foram suspensas a uma proporção de 15 μΙ/mg peso seco em tampão de extração (PBS-Dulbecco (Biochrom, Berlim, Alemanha) com 1 g I'1 de ASB) com inibi- dores da protease (5 mg I'1 de Ieupeptina (Calbiochem, Merck), 48 pg ml"1 4- (2-aminoetil)benzenosulfonilfloreto (Merck), 1 pg ml'1 de aprotina, 2 pg ml'1 de bestatina (Sigma, Steinheim, Alemanha) e homogenizadas. As amostras foram misturas por agitação a cada 10 min. Após um período de incubação de 1 h, as amostras foram centrifugadas (16000 x g, 10 min, 4°C) e o sobre- nadante foi coletado em um novo tubo. O peletizado remanescente foi sus- pendido a uma proporção de 10 μΙ/mg peso seco em tampão de extração de IgA e homogeneizado. O procedimento de extração foi repetido e o sobrena- dante combinado com o sobrenadante da primeira etapa de extração. Esses sobrenadantes foram centrifugados (16000 x g, 10 min, 4°C) e o sobrena- dante resultante foi dispensado em novos tubos, congeladas em nitrogênio líquido e armazenado a -80°C até a análise. Exemplo 9
Seleção de cepas bacterianas por análise imunoabsorvente ligado a enzimas
As bactérias fixadas foram diluídas em PBS1 os números de cé- lulas foram ajustados em 1 x 10 , 5 x 106, 1 x 107, 1x 108 ou 5 x 108 célu- las/ml.
50 μΙ de solução bacteriana forma revestidos por cavidade em uma placa de microtitulação de 96 cavidades durante a noite a 37°C. As pla- cas foram lavadas 3 vezes com PBS/0,02% Tween 20 (etapas de lavagem idênticas foram realizadas em cada etapa de incubação). Após bloqueio das placas com PBS/ASB a 2%, placas ELISA foram incubadas com sobrena- dantes de cultura de hibridoma contendo diferentes anticorpos que reconhe- cem o Core-1 (Nemod-TF1, Nemod-TF2 ou A68/BA11 menos específico) ou anticorpos de controle (A63-B/C2) em diferentes diluições. Uma imunoglobu- Iina conjugada com perioxidase ploniclonal anticamundongo da cabra (Dako P0260) serviu como anticorpo secundário. A análise foi desenvolvida com TMB como substrato, a reação foi interrompida pela adição de 2,5 N H2SO4 e a extinção foi medida a 450/630 nm. Para a determinação da sensibilidade do periodato à ligação pelos anticorpos, as placas de ELISA recobertas fo- ram incubadas com periodato de sódio antes da incubação com anticorpos. Portanto, as placas foram lavadas com tampão de acetato (50 mM, pH 4,5) por 5 min e depois incubadas com 10 mM de ácido periódico em tampão de acetato de sódio por 1 h no escuro. As placas foram lavadas com tampão de acetato de sódio (5 min) e a reação foi interrompida pela adição de 50 mM de boro-hidreto de sódio em PBS (30 min).
Um exemplo desses resultados de ELISA é mostrado nas figu- ras 2 e 3a.
Exemplo 10
Preparação de componentes de bactérias contendo Core-1 10.1 Análise de preparados brutos de cápsula por análises
SDS-PAGE e Western blot
Preparações brutas de cápsula da cepa AG6 foram realizados de acordo com Pantosti et al. (1991, Infect. Immun. 59, 2075-2082).
A preparação das cápsulas foi analisada por SDS-PAGE e o po- lissacarídeo no preparado foi detectado por coloração com azul alciano de acordo com Karlyshev et al. (2001, J. Clin. Microbiol. 39, 279-284) mostran- 5 do uma variedade de bandas contendo carboidratos e alta porcentagem de carboidratos de alto peso molecular dentro do preparado (figura 4A). Após o Western blot, os polissacarídeos foram detectados pelo DIG-GIycan Detecti- on Kit (LaRoche Diagnostics), que mostrou fortes bandas a 37 e 26 kDa (fi- gura 4B). A detecção de polissacarídeo contendo Core-1 no Western blot foi 10 realizada usando-se o anticorpo específico para o Core-1 NEMOD-TF2 (so- brenadante da cultura) mostrando uma banda positiva para o Core-1 a 37 kDa (figura 4C).
10.2 Enriquecimento cromatográfico de polissacarídeos po- sitivos para core-1
Dentro da preparação da cápsula da cepa AG6 ainda havia con-
taminantes de lipopolissacarídeos, como mostrado pela medição do teor de KDO de 11,2 pmol/pg de acordo com Hara et al. (1989, Anal. Biochem. 179, 162-166) e por SDS-PAGE.
Assim, cápsulas de polissacarídeos e lipopolissacarídeos foram separadas por cromatografia de fase reversa em uma coluna de C18 usan- do-se um gradiente de propanol/metanol (vide figura 5) de acordo com Ha- shimoto et al. (2001, Eur. J. Biochem. 268, 3139-3144). Os polissacarídeos foram eluidos por um gradiente de eluente B (72% de propanol/8% de meta- nol em 0,1 M de acetato de amônio, pH 4,5). A detecção de polissacarídeos dentro das frações foi realizada por dot blot e DIG-GIycan Kit. A detecção do Core-1 foi realizada usando-se os anticorpos específicos para o Core-1 Ne- mod-TF1 e Nemod-TF2. Os polissacarídeos foram eluidos a concentrações de propanol de 14-19% e 25-43%. O carboidrato específico do Core-1 foram detectados apenas a propanol a 29-29,4% (RP1) e propanol a 39-42% (RP2), vide a figura 5, que mostra forte enriquecimento do polissacarídeo positivo para o Core-1 por este método.
As frações positivas para o Core-1 foram usadas em separações <· cromatográficas adicionais por hidrólise branda com ácido seguida por cro- matografia DEAE usando um gradiente de 0-0,5 M NaCI1 de acordo com Tzianabos et al. (1992, J, Biol. Chem. 267, 18230-18235). Por este método, os polissacarídeos positivos para o Core-1 foram separados em três frações 5 eluídas a 0 M NaCI (D1), 0,04 M NaCI (D2) e 0,9-0,17 M NaCI (D3), resul- tando em um enriquecimento posterior dos polissacarídeos positivos para o Core-1.
No processo de acordo com a presente invenção, polissacarí- deos capsulares de B. ovatus AG6 são purificados e sua estrutura analisada por espectometria de massa. Preferivelmente, o polissacarídeos capsulares da B. ovatus AG6 são acumulados pelo extração de água por fenol seguida pela extração por éter como já descrita por Pantosti et al. 1991. Em seguida, os polissacarídeos positivos para o Core-1 são acumulados de preparado capsular bruto (PCB) por cromatografia de fase reversa (C18 Synergi 4 um Fusion-RP 80i, 250 mm x 10 mm, Phenomenex). Os teores de monossacarí- deos do extrato bruto de polissacarídeo capsular e dos polissacarídeos posi- tivos para o Core-1 purificados são determinados por análise HPAEC-PAD (cromatografia de troca iônica de alto pH, detecção por amperometria pulsa- da). Enfim, a estrutura dos polissacarídeos capsulares positivos para o Core- ► 20 1 é analisada por espectometria de massa.
10.3 Análises dos monossacarídeos o extrato da preparação bruta e extrato capsular purificado da B. ovatus AG6
Na primeira etapa, o polissacarídeo positivo para o Core-1 da rough capsular preparation de B. ovatus AG6 foi acumulado por cromatogra- 25 fia de fase reversa, como já descrito antes. Em seguida, o produto da purifi- cação, assim como o teor de monossacarídeos dos polissacarídeos positivos para o Core-1 acumulados, foi determinado por análises HPAEC-PAD.
Antes da análise dos monossacarídeos, extratos de polissacarí- deos completamente hidrolisados por ácido trifluoroacético 2N (TFA) a 30 IOO0C por 4 h. Durante a hidrólise com TFA os grupos acetil foram perdidos. Portanto, os monossacarídeos glicosamina e galactosamina (GIcNH2 e Gal- NH2) não puderam distinguir entre /V-acetilglicosamina e N- acetilgalactosamina (GIcNac e GaINAc). Os monossacarídeos foram sepa- rados por cromatografia por troca de ânions em alto pH e detectados por amperometria pulsada, como já descrito antes. Para identificar os monossa- carídeos e determinar suas concentrações, padrões de monossacarídeos 5 externos e internos foram utilizados.
O teor proporcional de mossacarídeos do extrato de PCB, que foi determinado para a comparação de LPS e CPS (mencionada antes) ob- viamente variam entre o teor de proporcional de monossacarídeos do extrato de CPS determinado para esta comparação. Mas extratos de CPS foram 10 preparados de diferentes culturas de B. ovatus AG6, o que poderia ser uma explicação para a variedade mencionada de teores de monossacarídeos.
A produção de polissacarídeos positivos para o Core-1 acumu- lados por cromatografia de fase reversa foi de 30%. A comparação dos teo- res proporcionais de monossacarídeos dos extratos capsulares brutos e puri- ficados revelou um aumento de fucose, GalNAc/GalNH2, galactose e glicose, eNquanto a glicose poderia ser um contaminante (tabela 7). O teor propor- cional de ramnose, GlcNhh/GIcNAc e manose pôde ser reduzido por croma- tografia de fase reversa (tabela 7). O ácido galacturônico e o ácido glicorôni- co, que são componentes característicos de polissacarídeos capsulares, não puderam ser identificados no extrato de polissacarídeo positivo para o Core- 1 purificado. Esses dados poderiam indicar que a AG6 do B. Ovatus tem mais do que um polisscaraídeo capsular. Estes polissacarídeos capsulares poderiam ser separados um do outro por cromatografia de fase reversa. Tzi- anabos et al. (1992) também descreveram que a cápsula do B. fragilis con- siste em dois diferentes polissacarídeos.
Tabela 7: análise dos monossacarídeos do extrato bruto de po- lissacarídeo capsular (PSC) e extrato de polissacarídeo positivo para o Core-
1 purificado por cromatografia de fase reversa. O teor proporcional de mo- nossacarídeos é relatado na quantidade total de monossacarídeos. Monossacarí¬ Extrato bruto de CPS (%) Extrato purificado de CPS deos (%) Fucose 9,5 11,4 Ramnose 17,7 3,1 GalNH2/GalNAc 5,2 14,9 Galactose 4,6 6,9 Glicose 44,2 50 Manose 18,2 6,9 Ácido galacturô- 10 0 nico n. d. 3 2 O acúmulo de fucose, GalNH2/GalNAc e galactose poderia ser uma indicação de que os monossacarídeos são componentes das unidades repetidas do polissacarídeo positivo para o Core-1, enquanto os monossaca- 5 rídeos fortemente reduzidos poderiam ser contaminantes baixos
10.4 Análise estrutural do polissacarídeo positivo para o Core-1 por espectometria de massa
A estrutura do polissacarídeo positivo para o Core-1 foi analisa- da por matrix-assisted laser time-off flight mass spectometry (MALDI-TOF- MS), como já descrito acima, e por electrospray-ion-trap-mass-spectometry (ESl-lon-T rap-MS).
Para a espectometria de massa ESI-Ion-Trap o polissacarídeo positivo para o Core-1 acumulado foi fragmentado seja por hidrólise com ácido acídico a 1% (1,5 h a 100°C), seja por digestão enzimática com chon- 15 droitinase ABC (clivagem das ligações betai-44GalNAc/GlcNAc) ou com betai-3galactosidase). Além disso, a fragmentação por digestão dupla com condrotinase ABC/alfa1-3,4 fucosidase ou ácido acídico a 1%/beta1-3 galac- tosidase ocorreu (todas as enzimas recebidas da Glyko GmbH). Todas as digestões enzimáticas foram incubadas a 37°C durante a noite. Análises por 20 espectometria de massa (MS assim como MS/MS) foram realizadas no mo- do positivo e no modo negativo. Antes da análise, todas as amostras foram dessalinizados por Carbograph SPE (Aalltech Associates Inc.), como descri- to no manual do fabricante e diluídas em 2,5 mM de NH3/40% acetotrinila.
A estrutura dos fragmentos glicanos positivos para o Core-1, que já foi identificada por análises MALDI-MS, pôde ser verificada por de- terminação ESl-lon-Trap. Fragmentos adicionais também puderam ser iden- 5 tificados por espectometria de massa ESI-Ion-Trap (tabela 8).
Tabela 8: análise estrutural por espectometria de massa ESl- lon-Trap (modo positivo). O polissacarídeo positivo para Core-1 purificado foi
fragmentado por lidrólise com ácido acídico a 1% por 1,5 h a 100°C. MS MS/MS Massas determi¬ Seqüência identifi¬ Massas determi¬ Seqüência iden¬ nadas cada nadas (M+Na+) tificada (M+H+/M+NH4+) 425/442 HexNAc-HexNAc 573/590 HexNAc(HexNAc)- 390 HexNAc-Hex Hex 749/766 HexNAc(HexNAc- 595 HexNAc-HexNAc- Hex)-Hex Hex 529/545 DesHex-desHexM- HexNAc 690/706 DesHex-desHexM- HexNAc-Hex 733/750 DesHex- HexNAc(HexNAc)- Hex 674/591 DesHex-desHexM- 493 DexHex-desHex- HexNAc-HexNAc desHexM 633/650 Hex-desHEx- desHEx-desHexM HexNAc: N-acetil-hexosamina; Hex: hexose; desHex: desoxihe-
xose; M: grupo metil
A seqüência de unidades repetidas do polissacarídeo capsular positivo para o Core-1 foi determinada por sobreposição de fragmentos (figu- ra 6).
Análises por espectometria de massa de polissacarídeos ροβίθ- ι 5 vos para o Core-1 digeridos enzimaticamente deram indicações de ligações glicosídicas entre os monossacarídeos. Além disso, puderam ser identifica- das galactose (clivagem bem-sucedida pela betai-3 galactosidase) e fucose (clivagem bem-sucedida pela alfa1-3,4 fucosidase) (figura 7).
Esse resultado está em concordância com as análises de mo- nossacarídeos mencionadas antes, que revelaram um acúmulo de fucose, galactose e GaINAc.
10.5 Verificação da estrutura de core-1 como dissacarídeo ramificante da unidade repetida do polissacarídeo capsular
A estrutura de core-1 ramificante, Galbetal-3GalNAc, na unidade
repetida deveria ser identificada por digestão dupla com a exoglicosidase betai-3 galactosidase e HexNAcase (clivagem betai-2,3,4,6 Gal- Nac/GIcNAc) seguida por análise de monossacarídeos como descrito acima.
Duas amostras contendo quantidades iguais de polissacarídeo 10 positivo para o Core-1 foram filtradas para purificá-las de monossacarídeos livres. Em seguida, uma das amostras sofreu digestão com betai-3 galacto- sidase a 37°C durante a noite. Ambas amostras foram filtradas mais uma vez para separar a galactose livre da amostra digerida, enquanto a amostra não-digerida foi usada como controle negativo. Subsequentemente, os reti- 15 dos foram coletados e digeridos com HexNAcase. Finalmente, ambas amos- tras foram filtradas novamente. Todos os eluidos foram analisados por HPAEC-PAD.
Para controlar se a estrutura de core-1 foi removida pela dulpla digestão mas tinha sido deixada intacta pela digestão com HexNAcase (con- 20 trole negativo), os retidos foram analisados por dot blot usando-se o DIG- Glykan Detection Kit (Roche Diagnostics) para detectar polissacarídeos e com o anticorpo Nemod-TFI específico para o Core-1 para identificar a es- trutura de core-1.
Nos dois eluidos de amostras duplamente digeridas, galactose 25 (primeiro eluído) e GaINAc (segundo eluído) puderam ser identificadas por análise de monossacarídeos. Enquanto no eluído do controle negativo, que foi digerido apenas com a exoglicosidase HexNAcase, nem galactose, nem GaINAc puderam ser identificadas. Isso é uma forte indicação da ramificação da estrutura do Core-1 1, Galbetal-3GalNAc.
Análises dot blot do retido duplamente digerido e da amostra di-
gerida por HexNAcase usando-se o DIG-GIykan Detection Kit revelaram concentrações similares de polissacarídeos, que estavam aplicadas na membrana de nitrocelulose. A estrutura de core-1 não pôde ser detectada na amostra duplamente digerida, enquanto na amostra digerida por HexNAcase a estrutura de core-1 ainda foi identificada por imunoblot usando-se o anti- corpo Nemod-TFI.
5 10.6 Verificação da estrutura do polissacarídeo positivo pa-
ra o Core-1 por análise dos seus fragmentos separados
Para verificação adicional da estrutura do polissacarídeo positi- vo para o Core-1, o glicano foi fragmentado por hidrólise com ácido acídico a 1% (1,5 h, 100°C). Os fragmentos de glicano foram marcados com o fluoró- 10 foro 2-amino-benzamida (2-AB) como já descrito por J. C. Bigge et al. (1995). Para este procedimento, as amostras foram tornadas livres de partí- culas e sais por purificação em uma coluna Carbograoh SPE (Alltech Asso- ciates Inc.) e liofilizadas. O peletizado foi dissolvido em 5 μΙ de 2-AB em DMSO/ácido acético glacial/cianoboro-hidreto de sódio e incubado a 60°C 15 por 2 h. Os fragmentos marcados com 2-AB foram separados da 2-AB livre por cromatografia em papel. Finalmente, os fragmentos conjugados com 2- AB foram eluidos com água. Após a liofilização, o peletizado foi dissolvido em acetonitrila a 50%. Com base no seu tamanho, os fragmentos foram se- parados por HPLC de fase normal (coluna: Luna 3μΝΗ2 A100, Phenome- 20 nex, eluente A 15 mM NH4-acetato; eluente B: acetonitrila) com detecção por fluorescência. A seqüência de fragmentos foi analisada por espectome- tria de massa ESI. Finalmente, para a verificação das ligações glicosídicas e melhor identificação dos monossacarídeos como componentes dos fragmen- tos, os oligossacarídeos foram digeridos com a exoglicosidase betai-3 ga- 25 lactosidase, alfa 1-3,4 fucosidase e HexNAcase, como já descrito neste. O sucesso da digestão controlada por espectometria de massa ESI e a remo- ção dos monossacarídeos terminais foi identificada por HPAEC-PAD, como já descrito antes.
A estrutura já identificada de unidades repetidas do polissacaríe- deo positivo para o Core-1 foi confirmada pelo fato de as duas análises mos- trarem os fragmentos de oligossacarídeos e monossacarídeos clivados es- perados (tabela 9). Tabela 9:
Fragmentos de oli¬ exoglicosidase análises análises de mo¬ gossacarídeos ESI-MS nossacarídeos HexNAc-Hex betai-3 galactosi- HexNAc GalNAc/GalNH2 dase Hex galactose HexNAc- Hex DesHex-desHex- alfa1-3,4 fucosida- desHexM fucose desHexM se DesHex- desHexM DesHex- desHex DesHex-desHex a Ifa 1-3, 4 fucosida- desHex fucose se DesHex-desHexM- HexNAcase HexNAc n. d. HexNAcM-HexNAc (alfa 1-2,3,4,6 Gal- DesHex- N Ac/G IcN Ac) desHexM- HexNAc Em conclusão, a estrutura de unidades repetidas do polissacarí- deo capsular positivo para core-1 (figura 8) foi confirmada por uma variedade de análises.
Além disso, os resultados revelaram (por favor, vide também a
figura 19, em particular n° 5) que a ligação glicosídica entre a GaI-GaINAc e a molécula GaINAc fundamental é alfanumérica. Esta descoberta recebeu apoio das análises dot blot com mAbs TF1, TF2 e HH8, que são específicos para o anômero alfa da TF. Os mAbs A68-E/A2 e A68-E/E3, que são especí- 10 ficos para o TFbeta também foram usados. Assim, o Ag TFaIfa tumor- específico foi identificado dentro da estrutura ramificante do polissacarídeo capsular da AG6 do B. ovatus.
Exemplo 11 Modelos animais
11.1 Imunização intraperitoneal de camundongos com bac- térias mortas
11.1.1 Análise de soros de camundongo pelo teste de res- posta imune-humoral 1
Camundongos Balb/c fêmeas (Charles River, 4 por grupo) foram tratados com ciclofosfamida a uma dose de 50 mg/kg do peso corporal no dia -1. Nos dias 0, 7 e 4, os camundongos receberam 5 x 108 bactérias por injeção intraperitoneal (cepas AG3 (grupo L) 32 ou 53 negativas para o Co- re-1 ou cepas AG6 (grupo K) positivas para o Core-1) em PBS ou apenas PBS (grupo L). Amostras de soro foram tomadas nos dias -4, 21, 27 e 30.
Os soros dos camundongos foram analisados por ELISA em busca da ligação à core-1. Como antígeno do Core-1 serviu a asialoglicofori- na. Como controle negativo foi usado a asialoglicoforina tratada com ácido periódico. O tratamento com periodato destrói o anel exterior de carboidrato do Core-1, destruindo assim o epitopo de core-1.
Placas de fundo chato de 96 cavidades foram revestidas com asialoglicoforina A (AGP) em uma concentração de 2 pg/ml. A placa foi lava- da 3 vezes com PBS/Tween.
Metade da placa foi tratada com periodato como segue:
As cavidades foram incubadas por 5 minutos com 50 mM de tampão de acetato de sódio pH 4,5 seguido de 1 h de incubação com 10 mM 15 de ácido periódico em tampão de acetato no escuro. As cavidades foram incubadas por 5 minutos com 50 mM de tampão de acetato de sódio pH 4,5. A reação foi interrompida por incubação com boro-hidreto de sódio (50 mM em PBS, 30 min). Em seguida, as placas foram lavadas 5 vezes com PBS/Tween.
As placas foram então bloqueadas por adição de ASB a 2% por
30 min.
A incubação com diferentes diluições de soro de camundongo foi realizada por 1,5 h. A imunoglobulina que sofrerá ligação foi detectada com um anticorpo IgM anticamundongo da cabra conjugado com perioxidase (1:5000 em PBS/ABS a 1%). A análise foi desenvolvida com TMB como substrato e a reação foi interrompida por adição de 2,5 N H2SO4.
A figura 9 mostra a ligação dos anticorpos IgM do soro a AGP positivo para o core-1 e a AGP negativo para o core-1 (AGP+PJ). Apenas os soros de três entre quatro camundongos imuzados com bactérias positivas para o Core-1 (grupo K) mostraram forte ligação ao AGP, enquanto o sinal é reduzido após clivagem do Core-1 com PJ.
Portanto, as bactérias positivas para o Core-1 são capazes de induzir imunidade humoral direcionada à core-1 em camundongos.
111.1.2 Análise dos soros de camundongo pelo teste de resposta humoral 2
Camundongos C3H machos (Charles River, 4 por grupo) foram imunizados com 5 x 108 bactérias pasteurizadas por injeção intraperitoneal das cepas core-1 positivas e core-1 negativas em 200 pl de PBS nos dias 0, 7 e 14. Os soros foram coletados antes da imunização e nos dias 13, 21 e 28 e analisados pelo teste de resposta humoral 2.
Placas de microtitulação de fundo chato com 96 cavidades fo- 10 ram recobertas com diferentes conjugados de carboidrato-PAA (GlcNAcpi- 2Gaipi-3GalNAcalfa-PAA, Fucalfal-2GalNAcalfa-PAA, GaINAcaIfal-3Galp- PAA, Galalfal-3GalNAcp-PAA, Gal betai-3GalNAc alfai-PAA) em 5 pg/ml em tampão de revestimento (8,4 g/l NAHCO3, 3,56 g/l Na2CO3, pH=9,49) e incubadas durante a noite a 4°C.
As placas foram lavadas 3 vezes com PBS/Tween.
As placas foram então bloqueadas pela adição de ASB a 2% por
30 min.
As incubações com diferentes diluições de soro de camundongo foram realizadas por 1,5 h. A imunoglobulina que sofrerá ligação foi detecta- da com um anticorpo IgM anticamundongo da cabra conjugado com perioxi- dase (1:5000 em PBS/ABS a 1%). A análise foi desenvolvida com TMB co- mo substrato e a reação foi interrompida por adição de 2,5 N H2SO4.
A figura 10 mostra o valor médio dos sinais ELISA contra o con- jugado PAA Gal betai-3GalNAc alfa1-PAA em relação ao sinal ELISA contra 25 o GlcNAcpi-2Gaipi-3GalNAcalfa-PAA, para os soros de 4 camundongos por grupo no dia 0 (antes do soro imune) e no dia 21 [o sinal ELISA relativo é calculado de acordo com a equação: (sinais ELISA contra a Gal betai- 3GalNAc alfa1-PAA) * 100/ (sinal ELISA contra a GlcNAcpi-2Gaipi- 3GalNAcalfa-PAA)]. Os soros foram calculados como positivos se o soro 30 imune mostrasse um aumento de pelo menos 50% em comparação com o soro pré-imune. Pode ser demonstrado que apenas as cepas AG6 e MU1 positivas para o Core-1 induziram uma resposta imune-humoral específica para o Core-1 em camundongos.
11.1.3 Análise do soro do camundongo com o teste de res- posta imune-humoral 3
Camundongos Balb/c fêmeas (Charles River, 4 por grupo) foram 5 tratados com ciclofosfamida a uma dose de 50 mg/kg do peso corporal no dia -1. Nos dias 0, 7 e 4, os camundongos receberam 5 x 108 bactérias por injeção intraperitoneal (cepas AG3 (grupo L) 32 ou 53 negativas para o Co- re-1 ou cepas AG6 (grupo K) positivas para o Core-1) em PBS ou apenas PBS (grupo L). Amostras de soro foram tomadas nos dias -4, 21, 27 e 30.
Análises por citometria de fluxo foram realizadas de maneira a
analisar a ligação do soro dos camundongos às linhagens celulares tumorais humanas positivas e negativas para o Core-1 (NM-wt e NM-D$, respectiva- mente; NM-wt é a linhagem-mãe da NM-D4, como descrito em W02005/017130 A2 e EP1654353; a NM-D4 está depositada na DSMZ co- 15 mo DSM ACC2605). 3 x 105 células por tubo foram peletizadas e o peletiza- do foi ressuspendido em 50 μΙ de soro murino (diluído a 1:50 em PBS/ FCS a 10%), anticorpo de controle ou apenas PBS/FCS a 10% . As amostras fo- ram incubadas por 20 min a 4°C, lavadas com PBS e centrifugadas. Em se- guida, as células foram incubadas com anticorpo IgM anticamundongo da
cabra conjugado com Cy3 (Jackson Immuno Research, 1:200 em PBS/FCS a 10%) por 20 min a 4°C, lavadas com PBS e ressuspensas em 200 μΙ de PBS para análise por citometria de fluxo.
A figuras 11 a e b mostram a ligação dos anticorpos IgM do soro do rato às linhagens celulares humanas NM-wt (negativa para o Core-1) e 25 NM-D4 (positiva para o Core-1). Enquanto a ligação à linhagem Nm-wt nega- tiva para o Core-1 é comparável entre os camundongos imunizados com bactérias negativas para o Core-1 (grupo I) e bactérias positivas para o Co- re-1 (grupo K), há uma ligação significativamente mais forte de 3 entre 4 ca- mundongos do grupo K à linhagem NM-D4 positiva para o Core-1. Isso é 30 indicativo da especificidade da resposta imune-humoral em camundongos imunizados com as bactérias positivas para o Core-1.
11.1.4 Análise do soro do camundongo com os testes de resposta imune-humoral 1, 2 e 3
Camundongos C3H machos (Charles River, 4 camundongos por grupo) foram imunizados por injeção intraperitoneal com 1 x 109 bactérias pasteurizadas da cepa Bacteroides ovatus positiva para o Core-1 da cepa de 5 Bacteroides ovatus MU1, 1 x 109 bactérias pasteurizadas da cepa de E. coli LH2 positiva para a A69-BA11 e 1 x 109 bactérias pasteurizadas negativas para o Core-1 de cepas da E. coli (AG3, E. coli 086 DSMZ 8697 = 32) em 200 μΙ de PBS nos dias 0, 7 e 14. Os soros foram coletados antes da imuni- zação e nos dias 13, 21 e 28 e analisados pelos testes de resposta imune- 10 humoral 1, 2 e 3 como descrito acima.
Enquanto a cepa AG3 foi negativa para todos os testes de res- posta imune-humoral, o soro coletado dos camundongos após a imunização com as cepas de E. coli 086 e LH2 mostraram anticorpo reativos à AGP em TRIH 1. Ainda assim, apenas a cepa MU-1 positiva para o Core-1 mostrou 15 forte respostas imunes específicas fortes contra o Core-1 dos conjugados PAA (TRIH 2) e nas células tumorais humanas (TRIH 3) além da indução de anticorpos específicos para a AGP no TRIH. Assim, pudemos induzir uma forte resposta imune-humoral específica contra o Core-1 apenas com micro- organismos positivos para o Core-1 do Bacteroides ovatus (MU-1).
As figs. 11 c a e mostram os resultados.
11.2 Imunização oral de camundongos livres de germes com bactérias positivas para o Core-1 vivas
Camundongos C3H livres de germes foram imunizados com 2 x 109 bactérias vivas da cepa AG6 nos dias 2, 3, 4, 9, 10, 11, 16, 17 e 18. As amostras de soro foram tomadas no dia 0 (soro pré-imune) e nos dias 14 e
21 e analisadas em busca de anticorpos IgM específicos para a AGP no tes- te de resposta imune-humoral 1.
Os camundongos imunizados mostraram titulações anti-Core-1 maiores em comparação com os camundongos de controle, como demons- trado pela ligação do soro dos camundongos às placas de microtitulação recobertas com AGP. A detecção da IgM do camundongo ligada foi realizada com anticorpos Igm anticamundongo acoplados com perioxidase. A especifi- cidade do sinal para o Core-1 foi demonstrada pelo decréscimo do sinal E- LISA após o tratamento com ácido periódico (destruindo a estrutura de car- boidrato). Após 14 ou 21 dias, 3 de 3 camundongos tinham níveis elevados de anticorpos IgM contra o Core-1 enquanto os camundongos de controle 5 não demonstraram qualquer aumento dos sinais ELISA contra a AGP em comparação com AGP+PJ, como mostrado na figura 12.
11.3 Imunização oral de camundongos convencionais com bactérias pasteurizadas e vivas positivas para o Core-1
Camundongos C3H foram imunizados oralmente com 1 x 1011 (grupo A) ou 1 x 1010 (grupo B) bactérias pasteurizadas da cepa AG6 diari- amente nos dias 0 a 28. Amostras de soro foram tomadas no dia -1 (soro pré-imune) e nos dias 13, 21 e 35 e analisados em busca de anticorpos IgM AGP-específicos no teste de resposta imune-humoral 1.
O soro coletado dos camundongos após a imunização mostrou 15 diminuição das titulações anti-Core-1, como demonstrado pela ligação dos soros dos camundongos a placas de microtitulação revestidas com GP ou AGP (com e sem tratamento com ácido periódico). A detecção da IgM de camundongo ligada foi realizada com anticorpos IgM anticamundongo aco- plados com peroxidase. A especificidade do sinal para o Core-1 foi demons- 20 trada pela diminuição do sinal ELISA após o tratamento com ácido periódico (destruindo a estrutura de carboidrato; diminuição de pelo menos 30%) e pelo menor sinal contra a GP (aumento do sinal para AGP de pelo menos 50%).
Foi demonstrado que 5 entre 6 camundongos do grupo A e 5 en- tre 8 camundongos do grupo B tinham desenvolvido anticorpos específicos para o Core-1 pelo dia 21 (figura 13).
No teste de resposta imune-humoral 3 os soros de camundongo foram analisados para a ligação à linhagem celular tumoral positiva para o Core-1 NM-D4 em comparação com a linhagem negativa para Core-1 NM-wt 30 por citometria de fluxo. 3 x 105 células por tubo foram peletizadas e o peleti- zado foi ressuspendido em 50 μΙ de soro murino (diluído a 1:300 em PBS/ASB a 1 %), anticorpo de controle ou apenas PBS/ASB a 1 %. As amos- tras foram incubadas por 60 min a 4°C, lavadas com PBS e centrifugadas. Em seguida, as células foram incubadas com anticorpo IgM anticamundongo da cabra conjugado com biotina (Jackson Immuno Research; 1:200 em PBS/ASB a 1%) por 60 min a 4°C e lavadas com PBS. A seguir, as células 5 foram incubadas com estreptavidina conjugada com Cy3 (Jackson Immuno Research; 1:200 em PBS/ASB a 1%) por 60 min a 4°C e ressuspensas em 200 μΙ de PBS para análise por citometria de fluxo.
Os resultados foram calculados de acordo com a seguinte fór- mula:
(% de células positivas em NM-D4SOro imune - % de células positi-
vas em NM-D4soro pré-imune) / (% de células positivas em NM-Wt soro imune - % células positivas em NM-Wtsoro pré-imune) = X
Soros de camundongo com um quociente X > 10 foram encara- dos como positivos (com % de células positivas em NM-wt Soro imune - % de células positivas em NM-Wt soro pré-imune ^ 1 )■
No dia 28, 11 dos 13 camundongos tinham desenvolvido uma resposta imune-humoral contra a linhagem celular tumoral humana positiva para o Core-1 NM-D4, como mostrado na figura 14.
No teste de resposta imune-humoral 2, os soros de camundongo do dia 28 foram analisados em busca da ligação à Galpl-3 GaINAc a-PAA (PAA 48) ou Gaipi-3 GIcNAc a-PAA (PAA 43).
Placas de microtitulação de fundo chato de 96 cavidades foram revestidas seja com Gaipi-3 GaINAc a-PAA (PAA 48), seja com Gaipi-3 GIcNAc a-PAA (PAA 43), a 5 μg/ml em tampão de revestimento (8,4 g/l 25 NaHC03, 3,56 g/l NA2C03, pH = 9,49) e incubadas durante a noite a 4°C. Após o bloqueio, as incubações foram realizadas por 1,5 hora. A imunoglo- bulina que sofreu ligação foi detectada com um anticorpo IgM anticamun- dongo da cabra conjugado com perioxidase (1:5000 em PBS/ABS a 1%). A análise foi desenvolvida com TMB como substrato e a reação foi interrompi- 30 da por adição de 2,5 N H2SOP4.
Os resultados estão representados na Figura 21. Foi demons- trado que 5 de 13 camundongos tinham desenvolvido anticorpos específicos pelo dia 28.
Exemplo 12 Potencial de bactérias positivas para o Core-1 para a indução de uma resposta imunocelular (in vitro)
12.1 Geração de células dendríticas funcionais
A linhagem celular dendrítica NemodDC (pNM-DC) foi usada
como fonte de células apresentadoras de antígenos (APCs). As pNM-DCs foram diferenciadas em iNM-DCs e em seguida ocorreu o carregamento com Iisados de bactérias (LiBa) das seguintes cepas bacterianas: AG6, MU1, 52 e 53. 50 pg/ml de cada LiBa foram reunidos com citocinas de maturação ao 10 meio de cultura e as iNM-DCs foram diferenciadas até o seu estado maduro (mNM-DCs).
Mais detalhadamente, na primeira etapa, as pNM-DCs (1 x 105/ml) foram diferenciadas em iNM-DCs por incubação de 7 dias em meio NemodDC (70% de MEM-alfa; 20% de FCS; 10% de CM5637) com a adição 15 de 1000 U/ml de GM-CSF, 100 U/ml de IL-4 e 2,5 ng/ml de TNF-alfa. Em seguida 1 x 106/ml de Nm-DCs (iNM-DCs) imaturas foram carregadas seja com Iisados de bactérias (50 pg/ml), Iisados de células tumorais (1 x 106 cé- lulas tumorais Iisadas para carregamento em 1 x 106 NM-DCs) ou proteínas de AGP ou GP (20 pg/ml) e amadurecidas por 2 dias por adição de 75 ng/ml 20 de TNF-alfa.
O amadurecimento do fenótipo de mNM-DC é muito importante para a bem-sucedida ativação das células Te foi testado por meio de citome- tria de fluxo para a expressão de CD1a, CD11c, CD14, CD40, CD35, CD80, CD83, CD86, CD116, HLA-ABC e HLA-DR. Apenas aquelas DCs com fenó- 25 tipo correspondente ao fenótipo das DCs maduras foram usados na ativação das células T.
12.2 Geração de células T ativadas contra o Core-1 e detec- ção da produção de GM-CSF (teste de resposta imunocelular 1) e de produção TNF-alfa (teste de resposta imunocelular 2) usando ELISA
Após 7-10 dias de inicialização dos linfócitos T com NM-DCs
carregadas com Iisados bacterianos, as células T resultantes (0,7 x 106/ml) foram re-estimuladas com mNM-DCs (1 x 105/ml) carregadas com Iisados 'I
clulares tumorais positivos para o Core-1 (50 pg/ml). Após 48 h de incuba- ção os sobrenadantes foram coletados e analisados usando, para avaliação da produção de citocinas em resposta à linhagem celular tumoral humana positiva para o Core-1 NM-D4, os kits BD OptEIA® para GM-CSF e TNF-alfa.
5 As placas de 96 cavidades foram pré-revestidas com 50 μΙ de
anticorpos anti-seres humanos (GM-CSF ou TNF-alfa) diluídos a 1:250 em tampão de revestimento. Após as etapas de lavagem e de bloqueio, 100 μΙ de sobrenadantes ou padrões foram adicionados a microcavidades e incu- bados por 2 horas a temperatura ambiente. Para a curva padrão, o GM-CSF 10 humano recombinante em concentrações de 0; 7,8; 15,6; 31,2; 62.5; 125 e 250 pg/ml e a TNF-humana recombinante, em concentrações de 0; 4,7; 9,4; 18,8; 37,5; 75; 150 e 300 pg/ml foram usadas. Após lavagem, 100 μΙ de so- lução Working Detector preparada por cavidade foram adicionados e a placa foi incubada por 1 hora a temperatura ambiente. Na próxima etapa, 100 μΙ 15 de One-step Substrate Reagent TMB foram adicionados por cavidade. Após a incubação final por 30 minutos e adição de 50 μΙ de solução interruptora, as extensões foram lidas a 450 nm.
Os resultados demonstrados nas figuras 15A e B mostram evi- dências claras de que as células T geradas para Iisados bacterianos positi- 20 vos para o Core-1 são capazes de reconhecer DCs carregadas com Iisado celular positivo para o Core-1 da linhagem celular humana NM-D4 por pro- dução de citocinas inibidoras de tumores tais como a TNF-alfa e a GM-CSF. Em contraste, um nível muito baixo de citocinas foi liberado em resposta aos Iisados celulares negativos para o Core-1. Além do mais, esse reconheci- 25 mento foi inibido especificamente através da pré-incubação com NM-DCs carregadas com Iisado junto com anticorpos específicos para o Core-1.
12.3 Análise por ELISPOT para avaliação da secreção de IFN-gama pelos linfócitos T ativados direcionados contra o Core-1 (tes- te de resposta imunocelular 2)
A análise por ELISPOT foi usada para a avaliação da secreção
de IFN-gama em resposta á estimulação antígeno-específica. Essa análise permite a quantificação da capacidade funcional das células T pré- sensibilizadas para reconhecer antígenos do Core-1 de uma maneira antí- geno-específica.
Os linfócitos T foram primeiro ativados in vitro mediante coculti- vo com DCs carregadas com Iisados bacterianos. Após 7 a 10 dias de inicia- 5 lização, as células T ativadas foram coletadas e reapresentadas (redesafia- dos) (na proporção células T/DCs de 10:1) a DCs carregadas com Iisados celulares tumorais seres humanos positivos para o Core-1 (NM-D4) e nega- tivos para o Core-1 (NM-wt).
As cavidades da placa de ELISpot foram pré-revestidas com an- ticorpos de camundongo anti-IFN-gama humana (kit Mactech) que se ligam à base de nitrocelulose da placa de ELISpot. As células T reapresentadas foram transferidas para as cavidades e citocinas foram liberadas durante o período de incubação. A IFN-gama liberada localmente ao redor de cada célula T se liga ao anticorpo específico e é dessa forma "capturada" por ele. Após 24 horas de incubação, as células foram removidas. Um segundo anti- corpo contra anti-IFN-gama humana na concentração de 1 μΙ/ml é adiciona- do às cavidades; esse anticorpo biotinilado é acoplado a uma enzima capaz de converter um substrato em um produto insolúvel colorido. As placas são lavadas mais uma vez e estreptavidina conjugada com enzima-AP em uma concentração de ^g/ml é adicionada. Finalmente, um substrato precipitante BCIP + NBT é adicionado e a placa é incubada até manchas emergirem no lado das células que estão respondendo. As manchas coloridas são conta- das e analisadas usando-se um sistema de imagens digitais.
Os resultados mostraram que as células T geradas para Iisados 25 bacterianos positivos para o Core-1 (AG6 e MU1) são capazes de reconhe- cer DCs carregadas com Iisado celular positivo para o Core-1 da linhagem celular tumoral humana NM-D4 pela produção da citocina inidora de tumores IFN-gama (Figura 16). Um nível muito baixo de citocinas foi liberado em res- posta aos Iisados celulares negativos para o Core-1 (R+DC/wt). Além disso, 30 a especificidade do reconhecimento do Iisado celular positivo para o Core-1 (R+DC/D4) foi provado pelo bloqueio da liberação de citocinas com o anti- corpo Nemod TF1 específico para o Core-1 (R+DC/D4+Ak). * 12.4 Teste de resposta imunocelular 3: análise da prolifera-
ção das células T
As células T sensibilizadas e re-estimuladas, como descrito aci- ma para a análise por ELISpot, foram transferidas após a incubação da pla- 5 ca de ELISpot para uma placa de 96 cavidades e analisadas o reagente de proliferação celular colorimétrico WST-1 (Roche Molecular Biochemicals) cujo sal de tetrazólio é clivado pelas enzimas mitocondriais, de maneira que a quantidade de tintura desenvolvida (lida a 450 nm) se correlaciona direta- mente com o número de células metabolicamente ativas na cultura. A absor- 10 ção do meio de cultura mais wst-1 na ausência de células foi a posição nula para o leitor da análise reticulada por enzima imunoabsorvente. O procedi- mento consiste em uma adição em uma etapa de 10 μΙ por cavidade do rea- gente de proliferação WST (Roche) e incubação por 3 horas a 37°C e, em seguida, medição a 450 nm.
15 Os resultados demonstrados na figura 17 mostram evidências
claras de que as células T geradas para os Iisados bacterianos positivos pa- ra o Core-1 reconhecem DCs carregadas com Iisado celular positivo para o Core-1 da linhagem celular tumoral humana NM-D4, como demonstrado pela proliferação específica. Além disso, esse reconhecimento foi inibido especifi- ^20 camente através de pré-incubação de NM-DCs carregas com Iisado junto com anticorpos específicos para o Core-1.
12.5 Teste de resposta imunocelular 4: teste de imunofluo- rescência para a apresentação de Core-1 em DCs carregadas com Iisa- dos bacterianos
25 Para analisar o processamento e a apresentação do Core-1 por
NM-DCs carregadas com Iisado bacteriano, análises por imunofluorescência foram realizadas usando anticorpos monoclonais específicos para o Core-1 (Nemod-TF1, Nemod-TF2). A apresentação do antígeno do Core-1 proces- sado na superfície das DCs maduras foi demonstrada com a ajuda de imu- 30 nofluorescência. A imunofluorescência (IF) é uma técnica que permite a vi- sualização de um antígeno específico (Core-1) nas células mediante a liga- ção de um anticorpo específico para o Core-1 seguida da adição de um anti- corpo secundário marcado com fluorocromo, que é usado para o reconheci- mento do anticorpo primário.
Na primeira etapa, pNM-DCs (1x 105/ml) foram diferenciadas em iNM-DCs por incubação de 7 dias em meio NemodDC (70% de MEM-alfa;
5 20% de FCS; 10% de CM5637) com adição de 1000 U/ml de GM-CSF, 100 U/ml de IL-4 e 2,5 ng/ml de TBF-alfa. Em seguida, 1 x 106/ml NM-DCs imatu- ras (iNM-DCs) foram carregadas seja com Iisados de bactérias (50 pg/ml), Iisados celulares tumorais (1 x 108/ml células tumorais Iisadas para carre- gamento em 1 x 106/ml NM-DCs) ou proteínas da AGP e da GP (20 pg/ml) e 10 amadurecidas por 2 dias por adição de 75 ng/ml de TNF-alfa.
As DCs maduras e carregadas foram lavadas e 1 x 106 células por 50 μΙ foram colocadas na placa de microtitulação para coloração para imunofluorescência. 3 μg/ml de anticorpo específico para o Core-1 (Nemod- TF1) diluídos em meio de cultura (FCS a 10%) foram incubados com a sus- 15 pensão celular por 1 hora a temperatura ambiente. Após etapás de lavagem, 50 μΙ anticorpos IgM anticamundongo secundários da goat marcados com Cy3 e diluídos a 1:200 (Jackson/Dianova) foram adicionados e incubados por 20 minutos. Após as etapas de lavagem, 20 μΙ de suspensão celular fo- ram colocados em cada cavidade de um slide Multitest (10 cavidades, Roth). As 20 amostras marcadas por imunofluorescência foram examinadas com um microscó- pio de fluorescência Axioplan 2 equipado com uma câmera digital AxioCam (Zeiss).
A figura 18 mostra coloração específica para o Core-1 positiva das mNM-DCs maduras, que processaram Iisados positivos para o Core-1 AG6 e NM-D4, e imunofluorescência negativa nas mNM-DCs carregadas com Iisados negativos para o Core-1 (AG3 e NM-wt).
A invenção foi descrita em termos de modalidades preferidas, mas aquele versado na técnica perceberá que várias modificações, substitu- ições, omissões e alterações podem ser feitas sem que ocorra um afasta- mento do espírito da mesma. Da mesma maneira, pretende-se que o escopo 30 da presente invenção seja limitado apenas pelo escopo das reivindicações a seguir, incluindo os equivalentes das mesmas. Assim, ficará claro para aque- les versados na técnica à qual a invenção se direciona, que a presente in- venção pode ser corporificada em outras formas além daquelas especifica- mente revaladas acima sem se afastar do espírito ou das características es- senciais da invenção. As modalidades particulares da presente invenção, descritas acima, devem assim ser consideradas em todos os sentidos como 5 ilustrativas e não como restritivas. O escopo da presente invenção é apre- sentado nas reivindicações anexadas em vez de se limitar ao dos exemplos contidos na descrição acima. Deve se entender que várias alternativas das modalidades empregadas neste relatório descritivo podem ser empregadas na prática da invenção. Pretende-se que as reivindicações a seguir definam 10 o escopo da invenção e que o método e os meios dentro do escopo da in- venção dessas reivindicações e seus equivalentes estejam cobertos nelas.
Linhagens celulares:
NM-D4 (DSM ACC2605), NM-F9 (DSM ACC2606), ZR-75-1 (ATCC XRL-1500), CAMA-1 (ATCC HTB-21), KG-1 (DSM ACC 14) ou A-204 (DSM ACC 250). NM-wt ou NM-H9 9ou NM-H9D8 DSM ACC 2606). As li- nhagens celulares NM-9 e NM-D4 foram depositadas na DSMZ pela Nemod Biotherapeutics GmbH % Co. KG, Robert-Rossle-Strasse 10, 13125, Berlim, Alemanha (isto é, o depositante) que autoriza o solicitante da presente in- venção a se referir ao material biológica depositado aqui descrito e e dá o seu consentimento sem reservas e irrevogável ao solicitante da presente invenção para que o material biológico aqui descrito seja disponibilizado ao público de acordo com a Regra 28 (1) (d) da Convenção Européia de Paten- tes. A DSMZ tem sede em MascheroderWeg 1b, D-38124, Braunschweig, Alemanha. Os depósitos na DSMZ supramencionados foram feitos de acor- do com os termos do Tratado de Budapeste sobre o reconhecimento inter- nacional do depósito de micro-organismos para fins de procedimentos de patenteamento.
AG6 (DSM 18726), MU1 (DSM 18728) e a nova cepa de Esche- richia coli LH2 (DSM 18727) depositada na "DSMZ - Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zelljukturen GmbH" em Braunschweig (Alemanha) pela Glycotope GmbH, Robert-Rõssle-Str. 10, 13125, Berlim, Alemanha, em de outubro de 2006. Referência de depósito do solicitante
ou agente 48 603 K_
Pedido internacional no.
INDICAÇÕES REFERENTES AO MICRO-ORGANISMO OU OUTROS MA- TERIAIS BIOLÓGICOS DEPOSITADOS (Regra PCT 13bis)
A. As indicações feitas abaixo referem-se ao micro-organismo ou outros ma- teriais biológicos depositados mencionados na descrição de página 101 (inter alia)_, linha_24_.
B. IDENTIFICAÇAO DO DEPOSITO Depósitos adicionais estão identifi-
___cados em uma folha adicional [ X ]
NOME DA INSTITUIÇÃO DEPOSITANTE
Deutsche Sammlung Von Mikroorganismen und ZeiIkuIturen(DSMZ)
ENDEREÇO DA INSTITUIÇÃO DEPOSITANTE (INCLUINDO CODIGO POSTAL E PAÍS)
Mascheroder Weg 1 b 38124 Braunschweig DE
Data do depósito Número de acesso
14/08/2003 _ DSM ACC2605__
C. INDICAÇÕES ADICIONAIS (deixe Esta informação continua em folha em branco caso não se aplique) adicional [X]
D. ESTADOS DESIGNADOS PARA OS QUAIS SAO FEITAS INDICAÇÕES
(caso as indicações não sejam para todos os estados designados)
E. PRESTAÇAO SEPARADA DE INFORMAÇOES (deixe em branco caso
não se aplique)__
As indicações listadas abaixo serão submetidas posteriormente ao Escritório Internacional (especifique a natureza geral das indicações, por exemplo, "Número de acesso do depósito").
Para uso exclusivo do escritório Para uso exclusivo do Escritório recebedor Internacional [ X ] Este formulário foi recebido com [ ] Este formulário foi recebido pelo o pedido internacional Escritório Internacional em Funcionário autorizado Funcionário autorizado Giel-Barragen Ramos, Cecilia Formulário PCT/RO/134 (julho de 1998; reimpresso em janeiro de 2004) Nossa ref.: 48 603 K
Indicações adicionais de acordo com o formulário PCT/RO/134 para o número de acesso DSM ACC 2605
O solicitante requer por meio deste que naqueles países que têm uma determinação correspondente, o fornecimento de uma amostra do material biológico depositado ao qual se faz referência no pedido seja feito apenas a um especialista independente nomeado (exigência da "solução especializada" quando aplicável, em particular Austrália, Canadá, Croácia, Dinamarca, Alemanha, Islândia, Noruega, Cingapura, Espanha, Suécia, Rei- no Unido e Europa).
No caso da Europa, o solicitante requer de acordo com isso que uma amostra do material biológico depositado seja disponibilizada como de- terminado pela Regra EPC 28 (3) até a publicação da cessão da patente ou por 20 anos da data da protocolação do pedido, caso este seja indeferido, retirado ou considerado retirado, apenas pela emissão de uma amostra a um especialista nomeado pela pessoa que requer a amostra (Regra EPC 28 (4)). TRATADO DE BUDAPESTE SOBRE O RECONHECIMENTO INTERNA- CIONAL DO DEPÓSITO DE MICRO-ORGANISMOS COM O OBJETIVO DE PROCEDIMENTOS DE PATENTEAMENTO FORMULÁRIO INTERNACIONAL Nemod Biotherapeutics GmbH % Co. KG Robert-Rõssle-Str. 10 13125 Berlim
RECIBO NO CASO DE DEPÓSITO ORIGINAL emitido de acordo com a Regra 7, pela AUTORIDADE DEPOSITÁRIA INTERNACIONAL Identificada ao final desta página
I. IDENTIFICAÇAO DO MICRO-ORGANISMO Referência de identificação dada pelo DE- Número de acesso dado pela POSITANTE: AUTORIDADE DEPOSITÁRIA INTERNA¬ NM-D4 CIONAL DSM ACC 2605 II. DESCRIÇÃO CIENTIFICA E/OU DESIGNAÇÃO TAXONOMICA PROPOSTA
O micro-organismo identificado em I, acima, estava acompanhado de: ( X ) uma descrição científica ( ) uma designação taxonômica proposta (Marque com um X onde aplicável.)
III. RECEBIMENTO E ACEITAÇAO
Esta Autoridade Depositária Internacional aceita o micro-organismo identificado em I, acima, que foi recebido em 14/08/2003 (Data do depósito original.)
IV. RECEBIMENTO DE SOLICITAÇÃO DE CONVERSÃO_
O micro-organismo identificado sob I, acima, foi recebido por esta ^eP0S't0
Autoridade Depositária Internacional em 9
e uma solicitação para converter o depósito original em um depósi- (data do recebimento
to sob o Tratado de Budapeste foi recebido por ela em da solicitação)_
para conversão.
V. AUTORIDADE DEPOSITÁRIA INTERNACIONAL Nome: DSMZ - DEUTSCHE SAMMLUNG VON MIK- Assinatura(s) da(s) pessoa(s) com ROORGANISMEN o poder para representar a Autori¬ UND ZELLKULTUREN GmbH dade Depositária Internacional ou Endereço: Mascheroder Weg 1 b do(s) funcionário(s) autorizado(s) D-38124 Brauschweig Data: 16/10/2006 Onde a Regra 6.4 (d) se aplicar, esta data será a data na qual o status de autoridade depositária internacional foi adquirido .Referência de arquivo do solicitante
ou agente 48 603 K_
Pedido internacional no.
INDICAÇÕES REFERENTES AO MICRO-ORGANISMO OU OUTROS MA- TERIAIS BIOLÓGICOS DEPOSITADOS (Regra PCT 136/s)
A. As indicações feitas abaixo referem-se ao micro-organismo ou outros ma- teriais biológicos depositados mencionados na descrição de página 101 (inter alia)_, linha_24_.
B. IDENTIFICAÇAO DO DEPOSITO Depósitos adicionais estão identifi-
__cados em uma folha adicional [ X ]
NOME DA INSTITUIÇÃO DEPOSITANTE
Deutsche Sammlung Von Mikroorganismen und ZelIkuIturen(DSMZ)
ENDEREÇO DA INSTITUIÇÃO DEPOSITANTE (INCLUINDO CODIGO POSTAL E PAÍS)
Mascheroder Weg 1 b 38124 Braunschweig DE
Data do depósito Número de acesso
14/08/2003 _ DSM ACC2606__
C. INDICAÇÕES ADICIONAIS (deixe Esta informação continua em folha em branco caso não se aplique) adicional [X]
D. ESTADOS DESIGNADOS PARA OS QUAIS SAO FEITAS INDICAÇÕES
(caso as indicações não sejam para todos os estados designados)
E. PRESTAÇAO SEPARADA DE INFORMAÇOES (deixe em branco caso
não se aplique)__
As indicações listadas abaixo serão submetidas posteriormente ao Escritório Internacional (especifique a natureza geral das indicações, por exemplo, "Número de acesso do depósito").
Para uso exclusivo do escritório Para uso exclusivo do Escritório recebedor Internacional [ X ] Este formulário foi recebido com [ ] Este formulário foi recebido pelo o pedido internacional Escritório Internacional em Funcionário autorizado Funcionário autorizado Giel-Barragen Ramos, Cecilia Formulário PCT/RO/134 (julho de 1991 3; reimpresso em janeiro de 2004) Nossa ref.: 48 603 K
Indicações adicionais de acordo com o formulário PCT/RO/134 para o número de acesso DSM ACC 2606
O solicitante requer por meio deste que naqueles países que têm uma determinação correspondente, o fornecimento de uma amostra do material biológico depositado ao qual se faz referência no pedido seja feito apenas a um especialista independente nomeado (exigência da "solução especializada" quando aplicável, em particular Austrália, Canadá, Croácia, Dinamarca, Alemanha, Islândia, Noruega, Cingapura, Espanha, Suécia, Rei- no Unido e Europa).
No caso da Europa, o solicitante requer de acordo com isso que uma amostra do material biológico depositado seja disponibilizada como de- terminado pela Regra EPC 28 (3) até a publicação da cessão da patente ou por 20 anos da data da protocolação do pedido, caso este seja indeferido, retirado ou considerado retirado, apenas pela emissão de uma amostra a um especialista nomeado pela pessoa que requer a amostra (Regra EPC 28 (4)) TRATADO DE BUDAPESTE SOBRE O RECONHECIMENTO INTERNA- CIONAL DO DEPÓSITO DE MICRO-ORGANISMOS COM O OBJETIVO DE PROCEDIMENTOS DE PATENTEAMENTO FORMULÁRIO INTERNACIONAL Nemod Biotherapeutics GmbH & Co. KG Robert-Rõssle-Str. 10 13125 Berlim
RECIBO NO CASO DE DEPÓSITO ORIGINAL emitido de acordo com a Regra 7, pela AUTORIDADE DEPOSITÁRIA INTERNACIONAL Identificada ao final desta página
I. IDENTIFICAÇÃO DO MICRO-ORGANISMO Referência de identificação dada pelo DE- Número de acesso dado pela POSITANTE: AUTORIDADE DEPOSITÁRIA INTERNA¬ NM-F9 CIONAL DSM ACC 2606 II. DESCRIÇÃO CIENTIFICA E/OU DESIGNAÇÃO TAXONOMICA PROPOSTA
O micro-organismo identificado em I, acima, estava acompanhado de: (X ) uma descrição científica ( ) uma designação taxonômica proposta (Marque com um X onde aplicável.)
III. RECEBIMENTO E ACEITAÇÃO
Esta Autoridade Depositária Internacional aceita o micro-organismo identificado em I, acima, que foi recebido em 14/08/2003 (Data do depósito original.)
IV. RECEBIMENTO DE SOLICITAÇÃO DE CONVERSÃO_
O micro-organismo identificado sob I, acima, foi recebido por esta o^inal^0 dePosito Autoridade Depositária Internacional em
e uma solicitação para converter o depósito original em um depósi- (data do recebimento
to sob o Tratado de Budapeste foi recebido por ela em da solicitação)_
para conversão.
V. AUTORIDADE DEPOSITÁRIA INTERNACIONAL Nome: DSMZ - DEUTSCHE SAMMLUNG VON MIK- Assinatura(s) da(s) pessoa(s) com ROORGANISMEN o poder para representar a Autori¬ UND ZELLKULTUREN GmbH dade Depositária Internacional ou Endereço: Mascheroder Weg 1 b do(s) funcionário(s) autorizado(s) D-38124 Brauschweig Data: 16/10/2006 Onde a Regra 6.4 (d) se aplicar, esta data será a data na qual o status de autoridade depo-
sitária internacional foi adquirido Referência de arquivo do solicitante
ou agente 48 603 K__
Pedido internacional no.
INDICAÇÕES REFERENTES AO MICRO-ORGANISMO OU OUTROS MA- TERIAIS BIOLÓGICOS DEPOSITADOS (Regra PCT 13bis)
A. As indicações feitas abaixo referem-se ao micro-organismo ou outros ma- teriais biológicos depositados mencionados na descrição de página 101 (inter alia)_, linha 25_.
B. IDENTIFICAÇAO DO DEPÓSITO Depósitos adicionais estão identifi- cados em uma folha adicional [ X ] NOME DA INSTITUIÇÃO DEPOSITANTE
Deutsche Sammlung Von Mikroorganismen und ZelIkuIturen(DSMZ)
ENDEREÇO DA INSTITUIÇÃO DEPOSITANTE (INCLUINDO CÓDIGO POSTAL E PAÍS)
MascheroderWeg 1b 38124 Braunschweig DE
Data do depósito Número de acesso
15/09/2006 _ DSM ACC2806______
C. INDICAÇÕES ADICIONAIS (deixe Esta informação continua em folha em branco caso não se aplique) adicional [X]
D. ESTADOS DESIGNADOS PARA OS QUAIS SAO FEITAS INDICAÇÕES
(caso as indicações não sejam para todos os estados designados)
E. PRESTAÇAO SEPARADA DE INFORMAÇÕES (deixe em branco caso
não se aplique)_
As indicações listadas abaixo serão submetidas posteriormente ao Escritório Internacional (especifique a natureza geral das indicações, por exemplo, "Número de acesso do depósito").
Para uso exclusivo do escritório Para uso exclusivo do Escritório recebedor Internacional [ X ] Este formulário foi recebido com [ ] Este formulário foi recebido pelo o pedido internacional Escritório Internacional em Funcionário autorizado Funcionário autorizado Giel-Barragen Ramos, Cecilia Formulário PCT/RO/134 (julho de 1998; reimpresso em janeiro de 2004) Nossa ref.: 48 603 K
Indicações adicionais de acordo com o formulário PCT/RO/134 para o número de acesso DSM ACC 2806
O solicitante requer por meio deste que naqueles países que têm uma determinação correspondente, o fornecimento de uma amostra do material biológico depositado ao qual se faz referência no pedido seja feito apenas a um especialista independente nomeado (exigência da "solução especializada" quando aplicável, em particular Austrália, Canadá, Croácia, Dinamarca, Alemanha, Islândia, Noruega, Cingapura, Espanha, Suécia, Rei- no Unido e Europa).
No caso da Europa, o solicitante requer de acordo com isso que uma amostra do material biológico depositado seja disponibilizada como de- terminado pela Regra EPC 28 (3) até a publicação da cessão da patente ou por 20 anos da data da protocolação do pedido, caso este seja indeferido, retirado ou considerado retirado, apenas pela emissão de uma amostra a um especialista nomeado pela pessoa que requer a amostra (Regra EPC 28 (4)). TRATADO DE BUDAPESTE SOBRE O RECONHECIMENTO INTERNACIONAL DO DE- PÓSITO DE MICRO-ORGANISMOS COM O OBJETIVO DE PROCEDIMENTOS DE PA-
TENTEAMENTO FORMULÁRIO INTERNACIONAL
Glycotope GmbH Robert-Rõssle-Str. 10 13125 Berlim
RECIBO NO CASO DE DEPÓSITO ORIGINAL emitido de acordo com a Regra 7, pela AUTORIDADE DEPOSITÁRIA INTERNACIONAL Identificada ao final desta página
I. IDENTIFICAÇÃO DO MICRO-ORGANISMO Referência de identificação dada pelo DE- Número de acesso dado peia POSITANTE: AUTORIDADE DEPOSITÁRIA INTERNA¬ NM-H9D8 CIONAL DSM ACC 2806 II. DESCRIÇÃO CIENTIFICA E/OU DESIGNAÇÃO TAXONOMICA PROPOSTA
O micro-organismo identificado em I, acima, estava acompanhado de: ( ) uma descrição científica ( ) uma designação taxonômica proposta (Marque com um X onde aplicável.)
III. RECEBIMENTO E ACEITAÇÃO
Esta Autoridade Depositária Internacional aceita o micro-organismo identificado em I, acima, que foi recebido em 14/08/2003 (Data do depósito original.)
IV. RECEBIMENTO DE SOLICITAÇÃO DE CONVERSÃO_
O micro-organismo identificado sob I, acima, foi recebido por esta (dPta do deposito
Autoridade Depositária Internacional em 9 J
e uma solicitação para converter o depósito original em um depósi- (data do recebimento
to sob o Tratado de Budapeste foi recebido por ela em da solicitação)_
para conversão.
V. AUTORIDADE DEPOSITÁRIA INTERNACIONAL Nome: DSMZ - DEUTSCHE SAMMLUNG VON MIK- Assinatura(s) da(s) pessoa(s) com ROORGANISMEN o poder para representar a Autori¬ UND ZELLKULTUREN GmbH dade Depositária Internacional ou Endereço: Inhoffenstr. 1B do(s) funcionário(s) autorizado(s) D-38124 Brauschweig Data: 10/09/2006 Onde a Regra 6.4 (d) se aplicar, esta data será a data na qual o status de autoridade depo-
sitária internacional foi adquirido Referência de arquivo do solicitante
ou agente 48 603 K _
Pedido internacional no.
INDICAÇÕES REFERENTES AO MICRO-ORGANISMO OU OUTROS MA- TERIAIS BIOLÓGICOS DEPOSITADOS (Regra PCT 13bis)
A. As indicações feitas abaixo referem-se ao micro-organismo ou outros ma- teriais biológicos depositados mencionados na descrição de página 101 (inter alia)_, linha_36_.
B. IDENTIFICAÇAO DO DEPÓSITO Depósitos adicionais estão identifi- cados em uma folha adicional [ X ] NOME DA INSTITUIÇÃO DEPOSITANTE
Deutsche Sammlung Von Mikroorganismen und ZelIkuIturen(DSMZ)
ENDEREÇO DA INSTITUIÇÃO DEPOSITANTE (INCLUINDO CODIGO POSTAL E PAÍS)
Mascheroder Weg 1 b 38124 Braunschweig DE
Data do depósito Número de acesso
20/10/2006 _ DSM 18726_
C. INDICAÇÕES ADICIONAIS (deixe Esta informação continua em folha em branco caso não se aplique) adicional [X]
D. ESTADOS DESIGNADOS PARA OS QUAIS SAO FEITAS INDICAÇÕES
(caso as indicações não sejam para todos os estados designados)
E. PRESTAÇAO SEPARADA DE INFORMAÇOES (deixe em branco caso
não se aplique)__
As indicações listadas abaixo serão submetidas posteriormente ao Escritório Internacional (especifique a natureza geral das indicações, por exemplo, "Número de acesso do depósito").
Para uso exclusivo do escritório Para uso exclusivo do Escritório recebedor Internacional [ X ] Este formulário foi recebido com [ ] Este formulário foi recebido pelo o pedido internacional Escritório Internacional em Funcionário autorizado Funcionário autorizado Giel-Barragen Ramos, Cecília Formulário PCT/RO/134 (julho de 1998; reimpresso em janeiro de 2004) Nossa rei.: 48 603 K
Indicações adicionais de acordo com o formulário PCT/RO/134 para o número de acesso DSM 18726
O solicitante requer por meio deste que naqueles países que têm uma determinação correspondente, o fornecimento de uma amostra do material biológico depositado ao qual se faz referência no pedido seja feito apenas a um especialista independente nomeado (exigência da "solução especializada" quando aplicável, em particular Austrália, Canadá, Croácia, Dinamarca, Alemanha, Islândia, Noruega, Cingapura, Espanha, Suécia, Rei- no Unido e Europa).
No caso da Europa, o solicitante requer de acordo com isso que uma amostra do material biológico depositado seja disponibilizada como de- terminado pela Regra EPC 28 (3) até a publicação da cessão da patente ou por 20 anos da data da protocolação do pedido, caso este seja indeferido, retirado ou considerado retirado, apenas pela emissão de uma amostra a um especialista nomeado pela pessoa que requer a amostra (Regra EPC 28 (4))· TRATADO DE BUDAPESTE SOBRE O RECONHECIMENTO INTERNACIONAL DO DE- PÓSITO DE MICRO-ORGANISMOS COM O OBJETIVO DE PROCEDIMENTOS DE PA-
TENTEAMENTO FORMULÁRIO INTERNACIONAL
Glycotope GmbH Robert-Rõssle-Str. 10 13125 Berlim
RECIBO NO CASO DE DEPÓSITO ORIGINAL emitido de acordo com a Regra 7, pela AUTORIDADE DEPOSITÁRIA INTERNACIONAL Identificada ao final desta página
I. IDENTIFICAÇAO DO MICRO-ORGANISMO Referência de identificação dada pelo DE¬ Número de acesso dado pela PÔS ITANTE: AUTORIDADE DEPOSITÁRIA INTERNA¬ AG6 CIONAL DSM 18726 II. DESCRIÇÃO CIENTIFICA E/OU DESIGNAÇAO TAXONOMICA PROPOSTA
O micro-organismo identificado em I, acima, estava acompanhado de:
( ) uma descrição científica ( x ) uma designação taxonômica proposta (Marque com um X onde aplicável.)
III. RECEBIMENTO E ACEITAÇAO
Esta Autoridade Depositária Internacional aceita o micro-organismo identificado em que foi recebido em 14/08/2003 (Data do depósito original.)
acima,
IV. RECEBIMENTO DE SOLICITAÇAO DE CONVERSÃO
(data do original)
depósito
O micro-organismo identificado sob I, acima, foi recebido por esta Autoridade Depositária Internacional em e uma solicitação para converter o depósito original em um depósi- (data do recebimento
to sob o Tratado de Budapeste foi recebido por ela em da solicitação)_
para conversão.
V. AUTORIDADE DEPOSITARIA INTERNACIONAL
Nome: DSMZ - DEUTSCHE SAMMLUNG VON MIK-
ROORGANISMEN
UND ZELLKULTUREN GmbH
Endereço: Inhoffenstr. 1B
D-38124 Brauschweig_________
Assinatura(s) da(s) pessoa(s) com o poder para representar a Autori- dade Depositária Internacional ou do(s) funcionário(s) autorizado(s) Data: 24/10/2006
Onde a Regra 6.4 (d) se aplicar, esta data será a data na qual o status de autoridade depo- sitária internacional foi adquirido Referência de arquivo do solicitante
ou agente 48 603 K _
Pedido internacional no.
INDICAÇÕES REFERENTES AO MICRO-ORGANISMO OU OUTROS MA- TERIAIS BIOLÓGICOS DEPOSITADOS (Regra PCT 13bis)
A. As indicações feitas abaixo referem-se ao micro-organismo ou outros ma- teriais biológicos depositados mencionados na descrição de página 101 (inter alia)_linha_36_.
B. IDENTIFICAÇAO DO DEPÓSITO Depósitos adicionais estão identifi-
_____cados em uma folha adicional [ X ]
NÕME DA INSTITUIÇÃO DEPOSITANTE
Deutsche Sammlung Von Mikroorganismen und ZelIkuIturen(DSMZ)
ENDEREÇO DA INSTITUIÇÃO DEPOSITANTE (INCLUINDO CODIGO POSTAL E PAÍS)
Mascheroder Weg 1 b 38124 Braunschweig DE
Data do depósito Número de acesso
26/10/2006 _ DSM 18727_
C. INDICAÇÕES ADICIONAIS (deixe Esta informação continua em folha em branco caso não se aplique) adicional [X]
D. ESTADOS DESIGNADOS PARA OS QUAIS SAO FEITAS INDICAÇÕES
(caso as indicações não sejam para todos os estados designados)
E. PRESTAÇAO SEPARADA DE INFORMAÇOES (deixe em branco caso não se aplique)_
As indicações listadas abaixo serão submetidas posteriormente ao Escritório Internacional (especifique a natureza geral das indicações, por exemplo, "Número de acesso do depósito").
Para uso exclusivo do escritório Para uso exclusivo do Escritório recebedor Internacional [ X ] Este formulário foi recebido com [ ] Este formulário foi recebido pelo o pedido internacional Escritório Internacional em Funcionário autorizado Funcionário autorizado Giel-Barragen Ramos, Cecilia Formulário PCT/RO/134 (julho de 1998; reimpresso em janeiro de 2004) Nossa ref.: 48 603 K
Indicações adicionais de acordo com o formulário PCT/RO/134 para o número de acesso
DSM 18727
O solicitante requer por meio deste que naqueles países que têm uma determinação correspondente, o fornecimento de uma amostra do material biológico depositado ao qual se faz referência no pedido seja feito apenas a um especialista independente nomeado (exigência da "solução especializada" quando aplicável, em particular Austrália, Canadá, Croácia, Dinamarca, Alemanha, Islândia, Noruega, Cingapura, Espanha, Suécia, Rei- no Unido e Europa).
No caso da Europa, o solicitante requer de acordo com isso que uma amostra do material biológico depositado seja disponibilizada como de- terminado pela Regra EPC 28 (3) até a publicação da cessão da patente ou por 20 anos da data da protocolação do pedido, caso este seja indeferido, retirado ou considerado retirado, apenas pela emissão de uma amostra a um especialista nomeado pela pessoa que requer a amostra (Regra EPC 28 (4)). TRATADO DE BUDAPESTE SOBRE O RECONHECIMENTO INTERNACIONAL DO DE- PÓSITO DE MICRO-ORGANISMOS COM O OBJETIVO DE PROCEDIMENTOS DE PA-
TENTEAMENTO FORMULÁRIO INTERNACIONAL
Glycotope GmbH Robert-Rõssle-Str. 10 13125 Berlim
RECIBO NO CASO DE DEPÓSITO ORIGINAL emitido de acordo com a Regra 7, pela AUTORIDADE DEPOSITÁRIA INTERNACIONAL Identificada ao final desta página
I. IDENTIFICAÇAO DO MICRO-ORGANISMO Referência de identificação dada pelo DE¬ Número de acesso dado pela PÔS ITANTE: AUTORIDADE DEPOSITÁRIA INTERNA¬ LH2 CIONAL DSM 18727 II. DESCRIÇÃO CIENTIFICA E/OU DESIGNAÇAO TAXONOMICA PROPOSTA
O micro-organismo identificado em I, acima, estava acompanhado de:
( ) uma descrição científica ( x ) uma designação taxonômica proposta (Marque com um X onde aplicável.)
III. RECEBIMENTO E ACEITAÇAO
Esta Autoridade Depositária Internacional aceita o micro-organismo identificado em I, acima, que foi recebido em 26/10/2006 (Data do depósito original.)
IV. RECEBIMENTO DE SOLICITAÇAO DE CONVERSÃO
O micro-organismo identificado sob I, acima, foi recebido por esta ^ ,.Vi nOh Autoridade Depositária Internacional em '
e uma solicitação para converter o depósito original em um depósi- (data do recebimento
to sob o Tratado de Budapeste foi recebido por ela em da solicitação)_
para conversão.
V. AUTORIDADE DEPOSITARIA INTERNACIONAL
Nome: DSMZ - DEUTSCHE SAMMLUNG VON MIK-
ROORGANISMEN
UND ZELLKULTUREN GmbH
Endereço: Inhoffenstr. 1B
D-38124 Brauschweig__
Assinatura(s) da(s) pessoa(s) com o poder para representar a Autori- dade Depositária Internacional ou do(s) funcionário(s) autorizado(s) Data: 24/10/2006
Onde a Regra 6.4 (d) se aplicar, esta data será a data na qual o status de autoridade depo-
sitária internacional foi adquirido Referência de arquivo do solicitante ou agente 48 603 K_
Pedido internacional no.
INDICAÇÕES REFERENTES AO MICRO-ORGANISMO OU OUTROS MA- TERIAIS BIOLÓGICOS DEPOSITADOS (Regra PCT 13b/s)
A. As indicações feitas abaixo referem-se ao micro-organismo ou outros ma- teriais biológicos depositados mencionados na descrição de página 101 (inter alia)_, linha_36_.
B. IDENTIFICAÇAO DO DEPOSITO Depósitos adicionais estão identifi- cados em uma folha adicional [ X ] NOME DA INSTITUIÇÃO DEPOSITANTE
Deutsche Sammlung Von Mikroorganismen und ZelIkuIturen(DSMZ)
ENDEREÇO DA INSTITUIÇÃO DEPOSITANTE (INCLUINDO CODIGO POSTAL E PAÍS)
Mascheroder Weg 1 b 38124 Braunschweig DE
Data do depósito Número de acesso
26/10/2006 _ DSM 18728_
C. INDICAÇÕES ADICIONAIS (deixe Esta informação continua em folha em branco caso não se aplique) adicional [X]
D. ESTADOS DESIGNADOS PARA OS QUAIS SAO FEITAS INDICAÇÕES
(caso as indicações não sejam para todos os estados designados)
E. PRESTAÇAO SEPARADA DE INFORMAÇOES (deixe em branco caso
não se aplique)__
As indicações listadas abaixo serão submetidas posteriormente ao Escritório Internacional (especifique a natureza geral das indicações, por exemplo, "Número de acesso do depósito").
Para uso exclusivo do escritório Para uso exclusivo do Escritório recebedor Internacional [ X ] Este formulário foi recebido com [ ] Este formulário foi recebido pelo o pedido internacional Escritório Internacional em Funcionário autorizado Funcionário autorizado Giel-Barragen Ramos, Cecilia Formulário PCT/RO/134 (julho de 1998; reimpresso em janeiro de 2004) Nossa ref.: 48 603 K
Indicações adicionais de acordo com o formulário PCT/RO/134 para o número de acesso
DSM 18728
O solicitante requer por meio deste que naqueles países que têm uma determinação correspondente, o fornecimento de uma amostra do material biológico depositado ao qual se faz referência no pedido seja feito apenas a um especialista independente nomeado (exigência da "solução especializada" quando aplicável, em particular Austrália, Canadá, Croácia, Dinamarca, Alemanha, Islândia, Noruega, Cingapura, Espanha, Suécia, Rei- no Unido e Europa).
Nó caso da Europa, o solicitante requer de acordo com isso que uma amostra do material biológico depositado seja disponibilizada como de- terminado pela Regra EPC 28 (3) até a publicação da cessão da patente ou por 20 anos da data da protocolação do pedido, caso este seja indeferido, retirado ou considerado retirado, apenas pela emissão de uma amostra a um especialista nomeado pela pessoa que requer a amostra (Regra EPC 28 (4))· TRATADO DE BUDAPESTE SOBRE O RECONHECIMENTO INTERNA- CIONAL DO DEPÓSITO DE MICRO-ORGANISMOS COM O OBJETIVO DE PROCEDI- MENTOS DE PATENTEAMENTO
FORMULÁRIO INTERNACIONAL
Glycotope GmbH Robert-Rõssle-Str. 10 13125 Berlim
RECIBO NO CASO DE DEPÓSITO ORIGINAL emitido de acordo com a Regra 7, pela AUTORIDADE DEPOSITÁRIA INTERNACIONAL Identificada ao final desta página
I. IDENTIFICAÇAO DO MICRO-ORGANISMO Referência de identificação dada pelo DE- Número de acesso dado pela POSITANTE: AUTORIDADE DEPOSITÁRIA INTERNA¬ MU1 CIONAL DSM 18728 II. DESCRIÇÃO CIENTIFICA E/OU DESIGNAÇAO TAXONOMICA PROPOSTA
O micro-organismo identificado em I, acima, estava acompanhado de:
( ) uma descrição científica ( x ) uma designação taxonômica proposta (Marque com um X onde aplicável.)
III. RECEBIMENTO E ACEITAÇAO
Esta Autoridade Depositária Internacional aceita o micro-organismo identificado em I, acima, que foi recebido em 20/10/2006 (Data do depósito original.)
IV. RECEBIMENTO DE SOLICITAÇAO DE CONVERSÃO
(data do original)
depósito
O micro-organismo identificado sob I, acima, foi recebido por esta Autoridade Depositária Internacional em e uma solicitação para converter o depósito original em um depósi- (data do recebimento
to sob o Tratado de Budapeste foi recebido por ela em da solicitação)_
para conversão.
V. AUTORIDADE DEPOSITARIA INTERNACIONAL
Nome: DSMZ - DEUTSCHE SAMMLUNG VON
ROORGANISMEN
UND ZELLKULTUREN GmbH
Endereço: Inhoffenstr. 1B
D-38124 Brauschweig_
MIK-
Assinatura(s) da(s) pessoa(s) com o poder para representar a Autori- dade Depositária Internacional ou do(s) funcionário(s) autorizado(s) Data: 24/10/2006
Onde a Regra 6.4 (d) se aplicar, esta data será a data na qual o status de autoridade depo-
sitária internacional foi adquirido RELATORIO DE PESQUISA INTERNA¬ Pedido internacional no.: CIONAL PCT/EP2007/009765 A. CLASSIFICAÇÃO DO ASSUNTO INV. A61K39/02 A61K39/40 G01N33/53 A61P35/00 A23L1/30 De acordo com a Classificação Internacional de Patentes (CIP) ou tanto com a classificação nacional quanto com a CIP B. CAMPOS PESQUISADOS Documentação mínima pesquisada (sistema de classificação seguido de símbolos de classi¬ ficação) C07K A61K G01N A23L Documentação pesquisada além da documentação mínima na medida em que tais docu¬ mentos estão incluídos nos campos pesquisados Banco de dados eletrônico consultado durante a pesquisa internacional (nome do banco de dados e, quando possível, termos de pesquisa utilizados) EPO-InternaI1 BIOSIS, EMBASE, SCISEARCH, WPI Data C. DOCUMENTOS CONSIDERADOS RELEVANTES Categoria* Citação de documento, com indicação, quando apropriado, Pedido relevante das passagens relevantes no. X SPRINGER G F ET AL: "ORIGIN OF ANTI-THOMSEN 18-22, 24 FRIEDENREICH AND TN AGGLUTINANTS IN MAN AND IN WHITE LEGHORN CHICKS" BRITISH JOURNAL OF HAEMATOLOGY Vol. 47, no. 3, 1982, páginas 453-460, XP009088436 ISSN: 0007-1048 O documento inteiro [ X ] Documentos adicionais estão listados [ X ] Vide anexo da família da patente na continuação da caixa C * Categorias especiais dos documentos "T" documento posterior publicado após a citados: data da protocolização internacional ou data "A" documento que define o estado geral da prioritária não em conflito com o pedido, mas técnica que não é considerado particular¬ citado para se entender o princípio da teoria mente relevante subjacente à invenção "E" documento anterior, mas publicado na "X" documento de especial relevância: a in¬ ou após a data do protocolação internacio¬ venção reivindicada não pode ser considera¬ nal da nova ou não pode ser considerada repre¬ "L" documento que pode lançar dúvidas sentante de uma etapa inovadora quando o sobre a(s) reivindicação(ões) prioritária(s) documento é considerado sozinho que é citado para estabelecer a data de Ύ" documento de especial relevância: a in¬ publicação de outra citação ou por outra venção reivindicada não pode ser considera¬ razão especial (conforme especificado) da representante de uma etapa inovadora "O" documento que se refere a uma revela¬ quando o documento é combinado com um ção oral, uso, exibição ou outros meios ou mais de tais documentos, tal combinação "P" documento publicado antes da data da sendo óbvia para alguém versado na técnica. protocolação internacional mas após da data de prioridade reivindicada Data da finalização de fato da pesquisa Data da remessa do relatório de pesquisa internacional internacional 7 de abril de 2008 15/04/2008 Nome e endereço de correspondência do Funcionário autorizado ISA/ Domingues, Helena European Patent Office, P. B. 5818 Patent- Iaan 2 Formulário PCT/ISA/210 (página 2) (abril de 2005) RELATÓRIO DE PESQUISA INTERNACIONAL Pedido internacional no.: PCT/EP2007/009765 C. (continuação) DOCUMENTOS CONSIDERADOS RELEVANTES Categoria* Citação de documento, com indicação, quando apropriado, das passa¬ Pedido relevante no. gens relevantes X KLAAMAS K ET AL: "EXPRESSION OF TUMOR-ASSOCIATED 18,19 THOMSEN-FRIEDENREICH ANTIGEN (T AG) IN HELIOBACTER PY- LORI AND MODULATION OF T AG SPECIFIC IMMUNE RESPONSE IN INFECTED INDIVIDUALS" IMMUNOLOGICAL INVESTIGATIONS, MARCEL DEKKER, NEW YORK, NY, EUA vol. 31, no. 3/4, 2002, páginas 191-204 ΧΡ009047359 ISSN: 0882-0139 o documento inteiro X KURTENKOV OLEG ET AL "Better survival of Heliobacter pyloru infected 18, 19 patients with early gastric cancer is related to a higher Ievel of Thomsen- Friedenreich antigen-specific antibodies" IMMUNOLOGICAL INVESTIGATIONS, MARCEL DEKKER, NEW YORK, NY1 EUA vol. 32, no. 1-2, fevereiro de 2003 (02/2003), páginas 83-93, ΧΡ009088439 ISSN: 0882-0139 o documento inteiro X TAKAHASHI ET AL: "ANTITUMOR EFFECTS OF THE INTRAVESICAL 18, 22, INSTILLATION OF HEAT KILLED CELLS OF THE LACTOBACILLUS 24-26 CASEI STRAIN SHI ROTA ON THE MURINE ORTHOTOPIC BLADDER TUMOR MBT-2" JOURNAL OF UROLOGY, BALTIMORE, MD, EUA, vol. 166, no. 6, dezembro de 2001 (12/2001) páginas 2506-2511, ΧΡ005543483 ISSN: 0022-5347 o documento inteiro X GOLETZ S ET AL: "THOMSEN-FRIEDENREICH ANTIGEN: THE HID- 1-26 DEN TUMOR ANTIGEN" ADVANCES IN EXPERIMENTAL MEDICINE AND BIOLOGY, SPRING ST., NY , EUA vol. 535, 2003, páginas 147-162, ΧΡ00903410 ISSN: 0065-2598 páginas 150, 155 página 159 X BUTSCHAK G ET AL: "ISOLATION AND CHARACTERIZATION OF 1-9, THOMSEN-FRIEDENREICH-SPECIFIC ANTIBODIES FROM HUMAN 24-26 SERUM'' TUMOR BIOLOGY, KARGER, BASEL, SUÍÇA vol. 23, no. 3, maio de 2002 (05/2002), páginas 113-122, ΧΡ009034404 ISSN: 1010-4283 o documento inteiro Y FRANCO A: "CTL-based cancer preventive/therapeutic vaccines for 1-26 carcinomas: Role of tumour-associated carbohydrate-antigens” SCANDINAVIAN JOURNAL OF IMMUNOLOGY vol. 61, no. 5, maio de 2005 (05/2005), páginas 391-397, ΧΡ002448043 ISSN: 0300-9475 tabela 1 y CROCE M V ET AL: "THE USE OF CARBOHYDRATE ANTIGENS FOR 1-26 THE PREPARATION OF VACCINES FOR THERAPY IN BREAST CAN¬ CER" DRUGS OF TODAY / FÁRMACOS DE ACTUALIDAD, J. R. PROUS SS.A. INTERNATIONAL PUBLISHERS, ES. vol. 38, no. 11, 2002, páginas 759-768 ΧΡ008068597 ISSN: 0025-7656 o documento inteiro RELATORIO DE PESQUISA INTERNACIONAL Pedido internacional no.: PCT/EP2007/009765 C. (continuação) DOCUMENTOS CONSIDERADOS RELEVANTES Catego¬ Citação de documento, com indicação, quando Pedido rele¬ ria* apropriado, das passagens relevantes vante no. Y MACLEAN G D ET AL: "ACTIVE IMMUNIZATION 1-26 OF HUMAN OVARIAN CANCER PATIENTS AGAINST A COMMON CARCINOMA (THOMSEN-FRIEDENREICH DETERMINANT USING A SYNTHETIC CARBOHYDRATE ANTI- GEN" JOURNAL OF IMMUNOTHERAPY, LIPPINCOTT WILLIAMS & WILKINS, HAGERSTOWN, MD, USA, vol. 11, 1992, páginas 292-305, XP002948048 ISSN: 1524-9557 o document inteiro Y SUSAN FSLOVIN ET AL: 1-26 "Thomsen-Friedenreich (TF) antigen as a target for prostate cancer vaccine: clinicai trial results with TF cluster (c)-KLH plus QS21 conjugate vaccine in patients with biochemically relapsed prostate cancer" CANCER IMMUNOLOGY, IMMUNOTHERAPY, SPRINGER-VERLAG, BE, vol. 54, 694-702, XP019333138 ISSN: 1432-0851 o documento inteiro Y BAUMEISTER AND GOLETZ: "Voll funktions- 13-17,023 fãhige humane dendritische Zelllinie" LABORWELT, [online] vol. 6, 2005, XP002474237 Obtido na internet: URL: HTTP.V/WWW.NEMOD.COM/DOWNLOADS/NE MODDC %20IN%20LABORWELT%207.2.05.PDF o documento inteiro Y WO 2006/012616 A (UNIV NEW YORK [EUA]; 1-26 RITTENHOUSE-OLSON KATE [EUA]) 2 de fevereiro de 2006 (02/02/2006) exemplo 5 RELATORIO DE PESQUISA INTERNACIONAL
Pedido internacional no. PCT /EP2007/009765
Caixa no. Il Observações em casos nos quais certas reivindicações foram conside- radas impossíveis de pesquisar (contiuação do item 2 da primeira página)
Este relatório de pesquisa internacional não foi estabelecido no que diz respeito a certas reivindicações sob o Artigo 17 (2) (a) pelas seguintes razões:
1. [ ] Reivindicações nos.:
porque elas se referem a um assunto para o qual esta autoridade não exige pesqui- sa, especificamente:
2. [] Reivindicações nos.:
porque elas se referem a partes do pedido internacional que não se conformam com as exigências prescritas de maneira que nenhuma pesquisa internacional pode ser realizada, especificamente:
3. [ ] Reivindicações nos.:
porque elas são reivindicações dependentes e não estão redigidas de acordo com o segundo e o terceiro parágrafo da Regra 6.4 (a)
Caixa no. Ill Observações para casos nos quais falta unidade à invenção (continua- ção do item 3 da primeira página)
A autoridade de pesquisa internacional encontrou múltiplas invenções neste pedido internacional, como segue: vide folha adicional
1. [ ] Uma vez que taxas de pesquisas adicionais foram devidamente pagas pelo solicitante, este relatório de pesquisa internacional cobre todas as reivindicações passíveis de pesquisa.
2 [ X ] Uma vez que todas as reivindicações puderam ser pequisadas sem esforço que justificasse taxas adicionais, esta autoridade não exigiu o pagamento de taxas adicionais.
3. [ ] Uma vez que apenas algumas das taxas de pesquisa adicionais foram devida- mente pagas pelo solicitante, este relatório de pesquisa internacional cobre apenas aquelas reivindicações para as quais as taxas foram pagas, especificamente as rei- vindicações de nos.:
4. [ ] Nenhuma taxa de pesquisa adicional foi devidamente paga pelo solicitante. Consequentemente, este relatório de pesquisa internacional está restrito à primeira invenção mencionada nas reivindicações; ela está coberta pelas reivindicações nos.: Observação no protesto
[ ] As taxas de pesquisa adicionais estavam acompanhadas do protesto do solicitan- te e, quando aplicável, do pagamento de uma taxa de protesto [ ] As taxas de pesquisa adicionais estavam acompanhadas do protesto do solicitan- te, mas a taxa de protesto aplicável não foi paga no prazto especificado no convite.
[ ] nenhum protesto acompanhou o pagamento das taxas de pesquisa adicionais Formulário PCT/ISA/210 (continuação da primeira página (2)) (abril de 2005) INFORMAÇÕES ADICIONAIS (CONTINUAÇÃO DE PCT/ISA/210)_
Esta Autoridade de Pesquisa Internacional encontrou múltiplos (grupos de) invenções neste pedido internacional, como segue:
1. reivindicações 1-17 e 23
Diz respeito a aspectos referentes a um método para o isolamento e identi- ficação de um micro-organismo carboidrato-positivo compreendendo a co- locação em contato entre uma molécula de ligação carboidrato específic de epitopo de carboidrato de interesse em uma mistura de micro-organismos e isolamento de pelo menos um micro-organismo ligado a tal molécula de ligação carboidrato; e testagem da indução de uma resposta imunocelular e/ou humoral eficaz espécífica pelo dito epitopo de carboidrato. A invenção refere-se também a aspectos referentes a um método para gerar células dendríticas funcionais e células T ativadas contra um micro-organismo car- boidrato-positivo compreendendo a colocação em contato entre uma quan- tidade apropriada de células dendríticas funcionais e uma quantidade apro- priada de micro-organismos carboidrato-positivos; e colocação em contato entre pelo menos uma célula dendrítica funcional e pelo menos uma célula T.
2. reivindicações 18-22, 24-26
Refere-se a aspectos ligados a micro-organismo carboidrato-positivo, Iisado ou fração do mesmo; e a um nutracêutico ou composição farmacêutica compreendendo pelo menos um micro-organismo carboidrato-positivo e ao seu uso para a imunização e para o tratamento/profilaxia de uma doença associada com o dito epitopo de carboidrato, particularmente tumores. RELATORIO DE PESQUISA INTERNACIONAL Pedido internacional no.: Informações sobre membros da família de patentes PCT/EP2007/009765 Documento de patente citado Data de publicação Membro(s) da família Data de publica¬ no relatório de pesquisa de patentes ção WO 2006012616 A 02/02/2006 CA 2582252 A1 02/02/2006 EP 1789027 A2 30/05/2007 Formulário PCT/ISA/210 (anexo da família de patentes) (abril de 2005)
m

Claims (26)

1. Método para isolar um micro-organismo carboidrato-positivo compreendendo um epitopo de carboidrato de interesse de uma mistura de micro-organismos compreendendo (a) colocação em contato entre uma molécula de ligação carboi- drato específica para o epitopo de carboidrato de interesse e uma mistura de micro-organismos e (b) isolamento de pelo menos um micro-organismo ligado à mo- lécula de ligação carboidrato mencionada de tal mistura (c) opcionalmente, teste de micro-organismo isolado para verifi- car que se trata de micro-organismo carboidrato-positivo testando-se o mi- cro-organismo isolado em busca de ligação específica à molécula de ligação carboidrato.
2. Método de acordo com a reivindicação 1, compreendendo a- dicionalmente: (d) testagem da indução de uma resposta imunocelular carboi- drato-específica eficaz e/ou resposta imune-humoral eficaz contra o dito epi- topo de carboidrato pelo micro-organimo mencionado e/ou fração e/ou Iisado do mesmo in vivo ou in vitro.
3. Método de acordo com a reivindicação 3, sendo que a etapa (d) compreende o teste da indução de uma resposta imunocelular carboidra- to-específica eficaz contra o dito epitopo de carboidrato pelo micro-organimo carboidrato-positivo mencionado e/ou fração e/ou Iisado do mesmo para a ativação de células T do tipo Th1 CD4-positivas e/ou para a ativação de cé- lulas T CD8-positivas citotóxicas, preferivelmente em pelo menos um animal ou humano e/ou in vitro.
4. Método de acordo com a reivindicação 2 ou 3, sendo que a testagem da resposta imunocelular na etapa (d) compreende i) carregamento de pelo menos uma célula dendrítica com a cé- lula carboidrato-positiva identificada nas etapas (a) a (c); ii) colocação em contato entre uma quantidade apropriada de pelo menos uma célula dendrítica mencionada carregada com o micro- organismo carboidrato-positivo mencionado e uma quantidade apropriada de células imunes passíveis de ativação ou inibição por uma célula dendrítica; iii) cultivo de maneira a permitir a interação das células imunes mencionadas com as células dendríticas mencionadas; iv) adição de uma quantidade apropriada de células apresenta- doras de antígenos (APCs) carregadas com uma quantidade apropriada de pelo menos um segundo composto veículo do mesmo epitopo de carboidrato que o micro-organismo carboidrato-positivo, sendo o segundo composto di- ferente do primeiro micro-organismo carboidrato-positivo mencionado; v) cultivo para re-estimulação das células imunes mencionadas; vi) confirmação da ocorrência de re-estimulação das células i- munes.
5. Método de acordo com a reivindicação 4, sendo pelo menos uma porção das APCs carregadas com uma quantidade apropriada do se- gundo composto mencionado postas em contato com as células imunes na presença de uma molécula de ligação carboidrato capaz de reconhecer o epitopo de carboidrato de interesse.
6. Método de acordo com a reivindicação 4 ou 5, sendo a re- estimulação determinada pela determinação - dos produtos secretados pelas células imunes que são secre- tados quando tais células imunes são (re)estimuladas, tais como interferon alfa, interferon gama ou GM-CSF e/ou - da proliferação das células imunes.
7. Método de acordo com uma das reivindicações de 2 a 6, sen- do o teste de resposta imunocelular selecionado do grupo a seguir: (i) um teste de resposta imunocelular 1 em cuja etapa (d (vi)) a re-estimulação das células imunes é determinada pela medição da secreção de GM-CSF; (ii) um teste de resposta imunocelular 2 em cuja etapa (d (vi)) a quantidade/grau de linfócitos re-estimulados é determinada pela medição da quantidade de INF-gama e/ou TNF-alfa secretada; (iii) um teste de resposta imunocelular 3 em cuja etapa (d (vi)) a quantidade/grau de linfócitos re-estimulados é determinada pela medição da proliferação e/ou indução de proliferação; (iv) um teste de resposta imunocelular 4 contra o epitopo de carboidrato de interesse compreendendo (a) colocação em contato entre uma quantidade apropriada de uma célula dendrítica, células dendríticas, ou uma mistura de células com- preendendo pelo menos uma célula dendrítica, carregada com uma quanti- dade apropriada (i) do micro-organismo carboidrato-positivo, um Iisado ou fra- ção do mesmo, (ii) formulações que os compreendam, (iii) o nutracêutico ou a composição farmacêutica da invenção ou (iv) uma molécula veículo do epitopo de carboidrato ou que o compreenda, (v) uma mistura compreendendo uma molécula veículo do epito- po de carboidrato (vi) uma célula positiva para ou compreendendo o epitopo de carboidrato, um Iisado ou fração da mesma, e de com uma quantidade apropriada de pelo menos uma molé- cula de ligação carboidrato; b) testagem da ligação da molécula de ligação carboidrato mencionada à célula dendrítica, células dendríticas ou a uma mistura de cé- lulas; (v) um teste de resposta imunocelular 5 contra o epitopo de car- boidrato de interesse compreendendo (a) incubação de uma quantidade apropriada de células-alvo de uma linhagem celular compreendendo o epitopo de carboidrato de inte- resse marcado com uma quantidade apropriada de um marcador com pelo menos uma célula imune direcionada contra o epitopo de carboidrato ou uma mistura de células compreendendo pelo menos uma célula imune dire- cionada contra o epitopo de carboidrato de interesse, e (b) medição da Iise das células-alvo pela determinação da libe- ração do marcador, sendo que uma resposta imunocelular positiva contra o epitopo de carboidrato mostra uma Iise significativamente maior de células compreendendo o epitopo de carboidrato do que de células negativas para o epitopo de carboidrato e/ou mostra uma Iise significativamente maior de cé- lulas compreendendo o epitopo de carboidrato incubadas com células imu- nes dirigidas contra o epitopo de carboidrato, do que uma Iise de células compreendendo o epitopo de carboidrato incubadas com células imunes de controle correspondentes não direcionadas contra o epitopo de carboidrato.
8. Método de acordo com pelo menos uma das reivindicações de 2 a 7, em que a indução de uma resposta imune-humoral carboidrato- específica eficaz contra o dito epitopo de carboidrato é testada em um teste de resposta imune-humoral do grupo selecionado do grupo consistindo em a. teste de resposta imune-humoral 1 contra o epitopo de car- boidrato compreendendo testagem da ligação do anticorpo, dos anticorpos no soro ou anticorpos ganhos do soro, plasma ou fezes, em um ELISA para compostos-veículo do epitopo de carboidrato em que que uma resposta i- mune-humoral contra o epitopo de carboidrato mostra uma ligação significa- tivamente maior dos anticorpos ao composto veículo do epitopo de carboi- drato do que a tal composto sem o epitopo de carboidrato ou a tal composto (por exemplo, uma proteína ou peptídeo) após um tratamento enzimático ou químico que destrói o epitopo de carboidrato; b. teste de resposta imune-humoral 2 contra o epitopo de car- boidrato compreendendo testagem da ligação de um anticorpo, anticorpos no soro ou anticorpos ganhos do soro, plasma ou fezes, em um ELISA para estruturas de carboidrato acopladas a conjugados de poliacrilamida (PAA), em que que uma resposta imune-humoral positiva contra um epitopo de car- boidrato mostra uma ligação significativamente maior do anticorpo ou anti- corpos ao conjugado de PAA compreendendo o epitopo de carboidrato do que ao mesmo conjugado de PAA após tratamento enzimático ou químico que destrói o epitopo de carboidrato e/ou maior ligação do anticorpo ou anti- corpos a um conjugado PAA compreendendo o epitopo de carboidrato em comparação com um conjugado de PAA que não compreende o epitopo de carboidrato, preferivelmente ambos; c. teste de resposta imune-humoral 3 contra o epitopo de car- boidrato compreendendo testagem da ligação do anticorpo, anticorpos no soro ou anticorpos ganhos do soro, do plasma ou fezes em um teste de ci- tometria de fluxo em busca da sua ligação a células compreendendo o epi- topo de carboidrato e a células que não compreendem o epitopo de carboi- drato, em que que uma resposta imune-humoral positiva contra o epitopo de carboidrato mostra uma ligação significativamente maior dos anticorpos a células compreendendo o epitopo de carboidrato do que a células negativas para o epitopo de carboidrato; d. teste de resposta imune-humoral (teste de resposta imune- humoral 4) contra o epitopo de carboidrato compreendendo testagem da li- gação do anticorpo, anticorpos no soro, ou anticorpos ganhos do soro, plas- ma ou fezes em um teste de imunofluorescência para determinar sua ligação a células compreendendo o epitopo de carboidrato e a células negativas pa- ra o epitopo de carboidrato, em que que uma resposta imune-humoral positi- va contra o epitopo de carboidrato mostra uma ligação significativamente maior do anticorpo ou anticorpos a células comprendendo o epitopo de car- boidrato do que a células que não compreendem o epitopo de carboidrato e/ou a células compreendendo o epitopo de carboidrato após tratamento enzimático ou químico que destrói o epitopo de carboidrato; e. teste de resposta imune-humoral 5 contra o epitopo de car- boidrato compreendendo, i. incubação de uma quantidade apropriada de células compre- endendo o epitopo de carboidrato marcadas com uma quantidade apropria- da de marcador, com uma quantidade apropriada de um anticorpo, de anti- corpos no soro ou de anticorpos ganhos do soro, do plasma ou das fezes, com uma quantidade apropriada de complemento; ii. medição da Iise celular pela determinação da liberação do marcador mencionado após a incubação sob (a) em que que uma resposta imune-humoral positiva contra o epitopo de carboidrato mostra uma Iise sig- nificativamente maior de células compreendendo o epitopo de carboidrato do que de células não compreendendo o epitopo de carboidrato e/ou ela mostra uma Iise maior de células compreendendo o epitopo de carboidrato do que uma Iise sem complemento e/ou do que uma Iise sem o anticorpo e/ou do que uma Iise com um anticorpo ou anticorpos que não se ligam ou se ligam menos a células compreendendo o epitopo de carboidrato; f. um teste de resposta imune-humoral 6 contra o epitopo de carboidrato compreendendo, i) incubação de uma quantidade apropriada de células compre- endendo o epitopo de carboidrato e/ou células não compreendendo o epito- po de carboidrato, marcadas com uma quantidade apropriada de um marca- dor, com uma quantidade apropriada de um anticorpo ou anticorpos no soro ou de anticorpos ganhos do soro, plasma ou fezes, com uma quantidade apropriada de pelo menos uma célula imuneefetora ou mistura de células compreendendo células imunes efetoras ou células mononucleares do san- gue periférico, e ii) medição da Iise celular pela determinação da liberação do marcador após a incubação sob (a) em que que uma resposta imune- humoral positiva contra o epitopo de carboidrato mostra uma Iise significati- vãmente maior de células compreendendo o epitopo de carboidrato do que de células negativas para o epitopo de carboidrato do que uma Iise sem o anticorpo e/ou do que uma Iise sem um anticorpo ou anticorpos que não se ligam ou que se ligam menos a células compreendendo o epitopo de carboi- drato.
9. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações pre- cedentes em que que (i) o epitopo de carboidrato é selecionado do grupo compreen- dendo TF, Core-1, Tn, sialil-Tn, sialil-TF, Globo-H, Lewis-Y, sialil-Lewis-A, sialil-Lewis-X, ácido polissiálico, Lewis-X, GM2, GD2, GD3, 9-O-acetil GD3, GD3L, fucosil GM1, Fucosii GM1, Lewis-A, Lewis-B, sLac, cadeia sialiada de tipo 1, antígeno CA 19-9, antígeno CA 72-4 e antígeno CA-50, e (ii) a molécula de ligação carboidrato é selecionada do grupo compreendendo lectinas, selectinas e/ou anticorpos e/ou moléculas deriva- das das mesmos que se ligam a TF1 Core-1, Tn1 sialil-Tn, sialil-TF, Globo-H, Lewis-Y1 sialil-Lewis-A, sialil-Lewis-X, ácido polissiálico, Lewis-X1 GM2, GD2, GD3, 9-O-acetil GD3, GD3L, fucosil GM1, Fucosil GM1, Lewis-A, Lewis-B1 sLac, cadeia sialiada de tipo 1, antígeno CA 19-9, antígeno CA 72-4 e antí- geno CA-50 ou a uma estrutura de carboidrato compreendendo qualquer um desses epitopos de carboidrato ou partes dos mesmos.
10. Teste de resposta imunocelular compreendendo a) Carregamento de pelo menos uma célula dendrítica com um primeiro composto carboidrato-positivo, em que que tal composto carboidra- to-positivo carrega o epitopo de carboidrato de interesse; b) colocação em contato entre uma quantidade apropriada de pelo menos uma célula dendrítica mencionada carregada com o composto carboidrato-positivo e uma quantidade apropriada de células imunes passí- veis de ativação ou inibição por uma célula dendrítica; c) cultivo de maneira a permitir a interação das células imunes mencionadas com tais células dendríticas; d) adição de uma quantidade apropriada de células apresenta- doras de antígenos (APC) carregadas com uma quantidade apropriada de pelo menos um segundo composto veículo do mesmo epitopo de carboidrato que o primeiro composto, em que o referido segundo composto diferente do primeiro composto carboidrato-positivo mencionado; e) cultivo para re-estimulação das células imunes mencionadas; f) determinação da ocorrência da re-estimulação das células i- munes.
11. Método de acordo com a reivindicação 18, em que pelo me- nos uma porção de APC carregadas com uma quantidade apropriada do segundo composto mencionado é posta em contato com as células imunes na presença de uma molécula de ligação carboidrato capaz de reconhecer tal carboidrato de interesse.
12. Método de acordo com a reivindicação 18 ou 19, em que que a re-estimulação é determinada pela determinação - dos produtos de secreção das células imunes que são secre- tadas quando tais células imunes são (re)estimuladas, tais como interferon- alfa, interferon-gama ou GM-CSF e/ou - da proliferação das células imunes.
13. Método para a geração de uma célula funcional dendrítica contra um epitopo de carboidrato de interesse compreendendo a colocação em contato entre uma quantidade apropriada de uma célula dendrítica ou de uma mistura de células dendríticas ou uma mistura de células compreen- dendo pelo menos uma célula dendrítica e uma quantidade apropriada de um micro-organismo carboidrato-positivo ou fração ou Iisado do mesmo de uma das reivindicações deste e/ou uma estrutura de carboidrato, conjugado de carboidrato ou uma célula de mamífero compreendendo tal epitopo de carboidrato por um período apropriado sob condições apropriadas para gerar pelo menos uma célula dendrítica funcional contra o dito epitopo de carboi- drato e/ou uma estrutura de carboidrato, conjugado de carboidrato ou uma célula de mamífero compreendendo tal epitopo de carboidrato.
14. Método de acordo com a reivindicação 13, em que a célula dendrítica mencionada é de origem humana.
15. Método de acordo com a reivindicação 13 ou 14, em que que o dito epitopo de carboidrato não é um epitopo de carboidrato dipolar.
16. Método para a geração de uma célula T ativada, células T, clone de célula T ou linhagem de células T contra um epitopo de carboidrato e/ou uma estrutura de carboidrato, conjugado de carboidrato ou uma célula de mamífero compreendendo o epitopo de carboidrato compreendendo (a) promoção de contato entre uma quantidade apropriada de pelo menos uma célula dendrítica funcional de acordo com pelo menos uma das reivindicações de 13 a 15 e uma quantidade apropriada de pelo menos uma célula T ou uma mistura de células T ou uma mistura de células com- preendendo pelo menos uma célula T, cultivo de tais células T ou mistura de células T junto com as células dendríticas funcionais carregadas menciona- das para ativar um inicializar uma célula T ou células T contra tal antígeno carboidrato, e (b) re-estimulação de tais células T com uma quantidade apro- priada de células apresentadoras de antígenos (APC), preferivelmente pelo menos uma célula dendrítica funcional carregada com uma célula ou molé- cula humana ou animal veículoa do dito epitopo de carboidrato.
17. Célula dendrítica funcional, uma célula T ativada, células T1 clone de célula T ou linhagem de células T produzidas pelo método de qual- quer uma das reivindicações precedentes, em que que a célula T ativada, células T, clone de célula T ou linhagem de células T é direcionada contra o epitopo de carboidrato e/ou uma estrutura de carboidrato ou uma célula de mamífero compreendendo o dito epitopo de carboidrato.
18. Micro-organismo carboidrato-positivo ou fração ou Iisado do mesmo compreendendo um epitopo de carboidrato de interesse que é reco- nhecido por pelo menos uma molécula de ligação carboidrato que reconhece especificamente o epitopo de carboidrato de interesse, em que que tal micro- organismo, tal fração ou tal Iisado induz uma resposta imunocelular carboi- drato-específica eficaz contra o dito epitopo de carboidrato e/ou uma estrutu- ra de carboidrato, conjugado de carboidrato ou uma célula de mamífero compreendendo o dito epitopo de carboidrato.
19. Micro-organismo carboidrato-positivo obtenível pelo método de acordo com pelo menos uma das reivindicações de 1 a 9.
20. Formulação selecionada do grupo compreendendo composi- ções nutracêuticas ou farmacêuticas compreendendo pelo menos um micro- organismo carboidrato-positivo como definido na reivindicação 18 ou 19.
21. Formulação de acordo com a reivindicação 20, em que (a) que a resposta imunocelular carboidrato-específica eficaz mencionada compreende a ativação de células T CD4-positivas de tipo Th1 e/ou a ativação de células T citotóxicas CD8-positivas direcionadas contra o epitopo de carboidrato e/ou estrutura de carboidrato, conjugado de carboi- drato ou uma célula de mamífero compreendendo o dito epitopo de carboi- d rato e (b) o epitopo de carboidrato é selecionado do grupo consistindo em TF, Core-1, Tn, sialil-Tn, sialil-TF, Globo-H, Lewis-Y, sialil-Lewis-A, sialil- Lewis-X1 ácido polissiálico, Lewis-X1 GM2, GD2, GD3, 9-O-acetil GD3, GD3L, fucosil GM1, Fucosil GM1, Lewis-A1 Lewis-B1 sLac, cadeia sialiada de tipo 1, antígeno CA 19-9, antígeno CA 72-4 e antígeno CA-50, e (c) a molécula de ligação carboidrato é selecionada do grupo compreendendo Iectinas1 selectinas e/ou anticorpos e/ou moléculas deriva- das dos mesmos que se ligam a TF1 Core-1, Tn, sialil-Tn, sialil-TF, Globo-H1 Lewis-Y1 sialil-Lewis-A, sialil-Lewis-X, ácido polissiálico, Lewis-X, GM2, GD2, GD3, 9-O-acetil GD3, GD3L, fucosil GM1, Fucosil GM1, Lewis-A, Lewis-B1 sLac, cadeia sialiada de tipo 1, antígeno CA 19-9, antígeno CA 72-4 e antí- geno CA-50 ou a uma estrutura de carboidrato compreendendo pelo menos qualquer um desses epitopos de carboidrato ou partes dos mesmos.
22. Formulação de acordo com a reivindicação 20 ou 21 em que que a resposta imunocelular carboidrato-específica eficaz compreende a ativação de células T CD4-positivas de tipo Th1 e ativação das células T ci- totóxicas CD8-positivas direcionadas contra o dito epitopo de carboidrato e/ou uma estrutura de carboidrato, conjugado de carboidrato ou uma célula de mamífero compreendendo o dito epitopo de carboidrato.
23. Método para a imunização ou vacinação de um ser humano ou um animal contra um epitopo de carboidrato presente em uma molécula de uma célula de ser humano ou animal compreendendo (i) administração a um ser humano ou a um animal de uma quantidade apropriada de uma célula dendrítica funcional, célula T ativada, clone de célula T ou linhagem de células T ou uma mistura de células de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentens direcionada con- tra um epitopo de carboidrato de interesse e a indução de uma resposta i- mune contra o epitopo de carboidrato e/ou uma estrutura de carboidrato, conjugado de carboidrato ou uma célula de mamífero compreendendo tal epitopo de carboidrato pela célula mencionada do ser humano ou animal (inicialização) e (ii) intensificação da resposta imune pela administração de uma quantidade eficaz de uma formulação compreendendo pelo menos um mi- cro-organismo carboidrato-positivo reconhecido por pelo menos uma molé- cuia de ligação carboidrato que reconhece especificamente um epitopo de carboidrato presente em uma molécula de uma célula de ser humano ou a- nimal ou uma fração ou Iisado da mesma, em que que tal micro-organismo, tal fração ou tal Iisado ou tal formulação compreendendo os mesmos induz uma resposta imunocelular carboidrato-específica eficaz contra o epitopo de carboidrato e/ou estrutura de carboidrato, conjugado de carboidrato ou uma célula de mamífero compreendendo tal epitopo de carboidrato.
24. Método para induzir ou aumentar uma resposta imunocelular carboidrato-específica eficaz e/ou resposta imune-humoral eficaz contra um epitopo de carboidrato e/ou uma estrutura de carboidrato, conjugado de car- boidrato ou uma célula de mamífero compreendendo tal epitopo de carboi- drato em pelo menos um animal ou ser humano, compreendendo a adminis- tração em um ser humano ou animal de uma quantidade eficaz da formula- ção definida em qualquer uma das reivindicações 20 a 22.
25. Método para profilaxia e/ou tratamento de um tumor e/ou doença positiva para o epitopo de carboidrato compreendendo a administra- ção de uma quantidade apropriada de uma formulação, um micro-organismo carboidrato-positivo ou um Iisado ou fração do mesmo, uma célula dendrítica funcional ou uma célula T ativada, linhagem de células T ou clone de célula T contra o epitopo de carboidrato e/ou uma estrutura de carboidrato, conju- gado de carboidrato ou uma célula de mamífero compreendendo tal epitopo de carboidrato de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes, a um ser humano ou a um animal.
26. Uso de um micro-organismo carboidrato-positivo isolado ou identificado por um método como definido em qualquer uma das reivindica- ções 1 a 9, 11 a 16 e 23 a 25 ou uma fração ou um Iisado do mesmo para a produção de um medicamento ou um nutracêutico para a profilaxia e/ou te- rapia de uma doença associada com tal epitopo de carboidrato em que que tal micro-organismo e/ou fração e/ou Iisado do mesmo induz uma resposta imune celúlar carboidrato-específica e/ou uma resposta imune-humoral con- tra tal epitopo de carboidrato e/ou uma estrutura de carboidrato, conjugado de carboidrato ou uma célula de mamífero compreendendo tal epitopo de carboidrato em pelo menos um animal ou ser humano.
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