ES2317020T3 - Anticuerpos frente al receptor del factor de crecimiento similar a la insulina i y la utilizacion de los mismos. - Google Patents
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Abstract
Un método para la selección de un anticuerpo frente a IGF-IR a partir de una diversidad de anticuerpos frente a IGF-IR que se caracteriza en que un ensayo de fosforilación celular utilizando células 3T3 que proporcionan entre 400.000 y 600.000 moléculas de IGF-IR por célula en un medio que contiene 0,5% de suero bovino fetal (FCS) inactivado por calor, se realiza con dichos anticuerpos y que dicho anticuerpo se selecciona si no muestra actividad estimuladora de IGF-IR que se mide como fosforilación de PKB a una concentración de 10 µM cuando se compara con dicho ensayo sin dicho anticuerpo.
Description
Anticuerpos frente al receptor del factor de
crecimiento similar a la insulina I y la utilización de los
mismos.
La presente invención está relacionada con
anticuerpos dirigidos frente al receptor del factor de crecimiento
similar a la insulina I (IGF-IR), métodos para su
producción, composiciones farmacéuticas que contienen dichos
anticuerpos, y la utilización de los mismos.
El receptor del factor de crecimiento similar a
la insulina I (IGF-IR, EC 2.7.112, antígeno CD 221)
pertenece a la familia de las proteínas tirosina quinasas
transmembranales (LeRoith, D., et al., Endocrin. Rev. 16
(1995) 143-163; y Adams, T.E., et al., Cell.
Mol. Life Sci. 57 (2000) 1050-1063). El
IGF-IR se une al IGF-I con alta
afinidad e inicia la respuesta fisiológica a este ligando in
vivo. El IGF-IR también se une al
IGF-II, sin embargo con una afinidad ligeramente
inferior. La sobreexpresión del IGF-IR promueve la
transformación neoplásica de las células y existen evidencias de
que el IGF-IR está involucrado en la transformación
maligna de las células y es por lo tanto una diana útil para el
desarrollo de agentes terapéuticos para el tratamiento del cáncer
(Adams, T.E., et al., Cell. Mol. Life Sci. 57 (2000)
1050-1063).
Los anticuerpos frente a IGF-IR
son bien conocidos en el estado de la técnica y son investigados por
sus efectos antitumorales in vitro e in vivo (Benini,
S., et al., Clin. Cancer Res. 7 (2001)
1790-1797; Scotlandi, K., et al., Cancer
Gene Ther. 9 (2002) 296-307; Scotlandi, K., et
al., Int. J. Cancer 101 (2002) 11-16; Brunetti,
A., et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 165 (1989)
212-218; Prigent, S.A., et al., J. Biol.
Chem. 265 (1990) 9970-9977; Li, S.L., et
al., Cancer Immunol. Immunother. 49 (2000)
243-252; Pessino, A., et al., Biochem.
Biophys. Res. Commun. 162 (1989) 1236-1243; Surinya,
K.H., et al., J. Biol. Chem. 277 (2002)
16718-16725; Soos, M.A., et al., J. Biol.
Chem., 267 (1992) 12955-12963; Soos, M.A., et
al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86 (1989)
5217-5221; O'Brien, R.M., et al., EMBO J. 6
(1987) 4003-4010; Taylor, R., et al.,
Biochem. J. 242 (1987) 123-129; Soos, M.A., et
al., Biochem. J. 235 (1986) 199-208; Li, S.L.,
et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 196 (1993)
92-98; Delafontaine, P., et al., J. Mol.
Cell. Cardiol. 26 (1994) 1659-1673; Kull, F.C. Jr.,
et al. J. Biol. Chem. 258 (1983) 6561-6566;
Morgan, D.O., y Roth, R.A., Biochemistry 25 (1986)
1364-1371; Forsayeth, J.R., et al., Proc.
Natl. Acad. Sci. USA 84 (1987) 3448-3451; Schaefer,
E.M., et al., J. Biol. Chem. 265 (1990)
13248-13253; Gustafson, T.A., y Rutter, W.J., J.
Biol. Chem. 265 (1990) 18663-18667; Hoyne, P.A.,
et al., FEBS Lett. 469 (2000) 57-60; Tulloch,
P.A., et al., J. Struct. Biol. 125 (1999)
11-18; Rohlik, Q.T., et al., Biochem.
Biophys. Res. Comm. 149 (1987) 276-281; y Kalebic,
T., et al., Cancer Res. 54 (1994) 5531-5534;
Adams, T. E., et al., Cell. Mol. Life Sci. 57 (2000)
1050-1063; Dricu, A., et al., Glycobiology 9
(1999) 571-579; Kanter-Lewensohn,
L., et al., Melanoma Res. 8 (1998) 389-397;
Li, S.L., et al., Cancer Immunol. Immunother. 49 (2000)
243-252). Los anticuerpos frente a
IGF-IR también se describen en gran cantidad de
publicaciones adicionales, por ejemplo, Arteaga, C.L., et
al., Breast Cancer Res. Treatment 22 (1992)
101-106; y Hailey, J., et al., Mol. Cancer
Ther. 1 (2002) 1349-1353.
En particular, el anticuerpo monoclonal frente a
IGF-IR denominado \alphaIR3 se utiliza ampliamente
en la investigación para el estudio de los procesos mediados por
IGF-IR y las enfermedades mediadas por
IGF-I como el cáncer. El
alfa-IR-3 se describe en Kull, F.C.,
J. Biol. Chem. 258 (1983) 6561-6566. Mientras tanto,
se han publicado alrededor de cien publicaciones relacionadas con
la investigación y uso terapéutico de \alphaIR3 en relación a su
efecto antitumoral, sólo y junto con agentes citostáticos como la
doxorubicina y la vincristina. El \alphaIR3 es un anticuerpo
monoclonal murino que se conoce porque inhibe la unión de
IGF-I al receptor de IGF pero no inhibe la unión de
IGF-II al IGF-IR. El \alphaIR3
estimula a altas concentraciones la proliferación de células
tumorales y la fosforilación de IGF-IR (Bergmann,
U., et al., Cancer Res. 55 (1995) 2007-2011;
Kato, H., et al., J. Biol. Chem. 268 (1993)
2655-2661). Existen otros anticuerpos (por ejemplo,
el 1H7, Li, S.L., et al., Cancer Immunol. Immunother. 49
(2000) 243-252) que inhibe la unión de
IGF-II a IGF-IR de forma más
potente que la unión al IGF-I. Un resumen del estado
de la técnica de los anticuerpos y sus propiedades y características
se describe en Adams, T.E., et al., Cell. Mol. Life Sci. 57
(2000) 1050-1063.
La mayoría de los anticuerpos descritos en el
estado de la técnica son de origen murino. Tales anticuerpos no
son, tal como se conoce en el estado de la técnica, útiles para la
terapia de pacientes humanos sin alteraciones adicionales como la
quimerización o la humanización. En base a estas desventajas, los
anticuerpos humanos son preferibles como agentes terapéuticos en el
tratamiento de pacientes humanos. Los anticuerpos humanos son bien
conocidos en el estado de la técnica (van Dijk, M.A., y van de
Winkel, J.G., Curr. Opin. Pharmacol. 5 (2001)
368-374). En base a esta tecnología, pueden
producirse anticuerpos humanos frente a una gran variedad de dianas.
Ejemplos de anticuerpos humanos frente a IGF-IR se
describen en WO 02/053596.
No obstante, existe todavía una necesidad de
anticuerpos frente a IGF-IR con beneficios
concluyentes para pacientes que necesitan una terapia antitumoral.
El beneficio relevante para el paciente es, en términos sencillos,
una reducción en el crecimiento tumoral y una prolongación
significativa del tiempo de progresión provocado por el tratamiento
con el agente antitumorogénico.
La invención comprende un anticuerpo que se une
a IGF-IR e inhibe la unión de IGF-I
e IGF-II al IGF-IR, que se
caracteriza en que dicho anticuerpo
a) es del isotipo IgG1,
b) muestra una proporción de valores CI_{50}
de inhibición de la unión de IGF-I al
IGF-IR respecto a la inhibición de la unión de
IGF-II al IGF-IR, de 1:3 a 3:1,
c) inhibe en al menos un 80%, preferiblemente en
al menos un 90%, a una concentración de 5 nM, la fosforilación de
IGF-IR en un ensayo de fosforilación celular
utilizando células HT29 en un medio que contiene suero fetal bovino
(FCS) al 0,5% inactivado por calor, cuando se compara con un ensayo
sin dicho anticuerpo, y
d) no muestra actividad estimuladora de
IGF-IR medida como fosforilación de PKB a una
concentración de
10 \muM en un ensayo de fosforilación celular utilizando células 3T3 que proporcionan de 400.000 a 600.000 moléculas de IGF-IR por células en un medio que contiene suero fetal bovino (FCS) al 0,5% inactivado por calor, cuando se compara con un ensayo sin dicho anticuerpo.
10 \muM en un ensayo de fosforilación celular utilizando células 3T3 que proporcionan de 400.000 a 600.000 moléculas de IGF-IR por células en un medio que contiene suero fetal bovino (FCS) al 0,5% inactivado por calor, cuando se compara con un ensayo sin dicho anticuerpo.
Los anticuerpos de acuerdo con la invención
muestran beneficios para pacientes que necesitan de una terapia
antitumoral y proporcionan una reducción en el crecimiento tumoral y
una prolongación significativa del tiempo de progresión. Los
anticuerpos de acuerdo con la invención poseen propiedades nuevas e
innovadoras que provocan un beneficio para un paciente que padece
una enfermedad asociada con una desregulación de IGF, especialmente
una enfermedad tumoral. Los anticuerpos de acuerdo con la invención
se caracterizan por las propiedades mencionadas anteriormente. Las
propiedades son por lo tanto específicas de la unión a
IGF-IR, de la inhibición de la unión de
IGF-I e IGF-II a
IGF-IR en la proporción anteriormente mencionada,
siendo del isotipo IgG1, y que no active la señalización de
IGF-IR aún en células que sobreexpresen
IGF-IR a una concentración 200 veces superior a la
de su valor de CI_{50}. Los anticuerpos que no poseen "actividad
mimética de IGF-I" proporcionan una gran ventaja
cuando se utilizan como agentes terapéuticos.
Preferiblemente, un anticuerpo de acuerdo con la
invención induce de forma adicional la muerte celular del 20% de las
células o más, en una preparación de células que expresan
IGF-IR tras 24 horas a una concentración de dicho
anticuerpo de 100 nM mediante ADCC.
Preferiblemente, y de forma adicional, los
anticuerpos de acuerdo con la invención inducen la muerte celular
del 20% de las células o más, en una preparación de células que
expresan IGF-IR tras 4 h a una concentración de
dicho anticuerpo de 100 nM mediante CDC.
Preferiblemente, a una concentración de 5 nM,
los anticuerpos de acuerdo con la invención inhiben completamente la
transducción de señales del IGF-IR mediadas por
IGF-I en las células tumorales.
La invención también comprende ácidos nucleicos.
Los polipéptidos codificados son capaces de ensamblarse junto con
las correspondientes cadenas de anticuerpo definidas a
continuación:
a) una cadena pesada de anticuerpo que comprende
los CDR, CDR1 (aa 31-35), CDR2 (aa
50-66) y CDR3 (aa 99-107) del Id. de
Sec. Nº 1 o 3;
b) una cadena ligera de anticuerpo que comprende
los CDR, CDR1 (aa 24-34), CDR2 (aa
50-56) y CDR3 (aa 89-98) del Id. de
Sec. Nº 2 o 4.
El anticuerpo es preferiblemente un anticuerpo
monoclonal y, además, un anticuerpo quimérico (cadena constante
humana), un anticuerpo humanizado y especialmente preferible un
anticuerpo humano.
El anticuerpo se une al IGF-IR
humano (EC 2.7.1.112, SwissProt P08069) en competición con el
anticuerpo 18.
El anticuerpo se caracteriza además por una
afinidad de 10^{-8} M (K_{D}) o menos, preferiblemente de
alrededor de 10^{-9} a 10^{-13} M.
El anticuerpo no muestra preferiblemente una
concentración detectable dependiente de la inhibición de la unión de
la insulina al receptor de la insulina.
Preferiblemente, la invención proporciona
anticuerpos que comprenden regiones determinantes de la
complementariedad (CDR) con las siguientes secuencias:
a) una cadena pesada de anticuerpo que comprende
los CDR, CDR1 (aa 31-35), CDR2 (aa
50-66) y CDR3 (aa 99-107) del Id. de
Sec. Nº 1 o 3;
b) una cadena ligera de anticuerpo que comprende
los CDR, CDR1 (aa 24-34), CDR2 (aa
50-56) y CDR3 (aa 89-98) del Id. de
Sec. Nº 2 o 4.
El anticuerpo es preferiblemente del tipo IgG1 y
proporciona por lo tanto unión del complemento C1q e induce CDC. El
anticuerpo se caracteriza además por la capacidad de unirse al
receptor IgGFc y de inducir citotoxicidad celular dependiente de
anticuerpo (ADCC).
El anticuerpo de acuerdo con la invención
prolonga de forma considerable el tiempo de progresión en modelos
tumorales de xenoinjertos relevantes en comparación con los animales
tratados con vehículo y reduce el crecimiento tumoral. El anticuerpo
inhibe la unión del IGF-I e IGF-II
al IGF-IR in vitro e in vivo,
preferiblemente en la misma forma para IGF-I e
IGF-II.
La invención proporciona además líneas celulares
de hibridoma que producen dichos anticuerpos monoclonales
antagonistas de acuerdo con la invención.
Las líneas celulares preferibles de hibridoma de
acuerdo con invención, <IGF-1R> HUMAB Clon 18
(anticuerpo 18) y <IGF-1R> HUMAB Clon 22
(anticuerpo 22), se depositaron en el Deutsche Sammlung von
Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ), Alemania.
\vskip1.000000\baselineskip
Los anticuerpos obtenibles de dichas líneas
celulares son realizaciones preferibles de la invención.
La invención proporciona además ácidos nucleicos
que codifican dichos anticuerpos, vectores de expresión que
contienen dichos ácidos nucleicos, y células huésped para la
producción recombinante de dichos anticuerpos.
La invención proporciona además métodos para la
producción recombinante de dichos anticuerpos.
La invención proporciona además métodos para
tratar el cáncer, que comprende la administración a un paciente
diagnosticado con cáncer (y por lo tanto en necesidad de una terapia
antitumoral) una cantidad efectiva de un anticuerpo antagonista
frente a IGF-IR de acuerdo con la invención. El
anticuerpo puede administrarse solo, en una composición
farmacéutica, o alternativamente en combinación con un tratamiento
citotóxico como radioterapia o un agente citotóxico o un profármaco
del mismo.
La invención comprende además la utilización de
un anticuerpo de acuerdo con la invención para el tratamiento del
cáncer y para la fabricación de una composición farmacéutica de
acuerdo con la invención. Además, la invención comprende un método
para la fabricación de una composición farmacéutica de acuerdo con
la invención.
La invención comprende además una composición
farmacéutica que contiene un anticuerpo de acuerdo con la invención
con una cantidad farmacéuticamente efectiva, opcionalmente junto con
un tampón y/o un adyuvante útil para la formulación de anticuerpos
para propósitos farmacéuticos.
La invención proporciona además composiciones
farmacéuticas que comprenden tales anticuerpos en un transportador
farmacéuticamente aceptable. En una realización, la composición
farmacéutica puede incluirse en un artículo de fabricación o
equipo.
La invención comprende además un vector que
contiene un ácido nucleico de acuerdo con la invención, capaz de
expresar dicho ácido nucleico en una célula huésped procariota o
eucariota.
La invención comprende además una célula huésped
procariota o eucariota que comprende un vector de acuerdo con la
invención.
La invención comprende además un método para la
producción de un anticuerpo recombinante humano de acuerdo con la
invención, que se caracteriza porque expresa un ácido nucleico de
acuerdo con la invención en una célula huésped procariota o
eucariota y la recuperación de dicho anticuerpo de dicha célula
huésped. La invención comprende además el anticuerpo obtenible
mediante dicho método recombinante.
La invención comprende además un método para la
selección de un anticuerpo frente a IGF-IR a partir
de una diversidad de anticuerpos frente a IGF-IR
que se caracteriza en que se realiza un ensayo de fosforilación
celular que utiliza células 3T3 que proporcionan de 400.000 a
600.000 moléculas de IGF-IR por célula en un medio
que contiene suero fetal bovino (FCS) al 0,5% inactivado por calor
con dichos anticuerpos y que selecciona dicho anticuerpo que no
muestra actividad estimuladora de IGF-IR medida como
fosforilación de PKB a una concentración de 10 \muM cuando se
compara con dicho ensayo sin dicho anticuerpo. Preferiblemente el
anticuerpo posee una o más de las propiedades adicionales
anteriormente mencionadas.
La invención comprende además un método para la
preparación de una composición farmacéutica que se caracteriza en
seleccionar un anticuerpo frente a IGF-IR a partir
de una diversidad de anticuerpos frente a IGF-IR
realizando un ensayo de fosforilación celular que utiliza células
3T3 que proporcionan de 400.000 a 600.000 moléculas de
IGF-IR por célula en un medio que contiene suero
fetal bovino (FCS) al 0,5% inactivado por calor con dichos
anticuerpos y que selecciona dicho anticuerpo que no muestra
actividad estimuladora de IGF-IR medida como
fosforilación de PKB a una concentración de 10 \muM cuando se
compara con dicho ensayo sin dicho anticuerpo, produciendo dicho
anticuerpo mediante expresión recombinante, recuperando dicho
anticuerpo y combinando dicho anticuerpo con un tampón
farmacéuticamente aceptable y/o adyuvante. Preferiblemente el
anticuerpo posee una o más de las propiedades adicionales
anteriormente mencionadas.
El término "anticuerpo" abarca las
diferentes formas de anticuerpos que incluye pero no se limita a
anticuerpos enteros, fragmentos de anticuerpo, anticuerpos humanos,
anticuerpos humanizados y anticuerpos genéticamente modificados
siempre que se retengan las propiedades características de acuerdo
con la invención.
"Fragmentos de anticuerpo" comprende una
porción de un anticuerpo de longitud completa, generalmente al menos
la porción de unión a antígeno o la región variable del mismo.
Ejemplos de fragmentos de anticuerpo incluye diacuerpos, moléculas
de anticuerpo de cadena única, inmunotoxinas, y anticuerpos
multiespecíficos formados de fragmentos de anticuerpo. Además, los
fragmentos de anticuerpo comprenden polipéptidos de cadena única que
poseen las características de una cadena VH, es decir, que son
capaces de ensamblarse junto con una cadena VL o con una cadena VL
unida a IGF-1R, es decir, que son capaces de
ensamblarse junto con una cadena VH a una región de unión a antígeno
funcional y proporcionar por lo tanto la propiedad de inhibir la
unión de IGF-I e IGF-II al
IGF-IR.
"Fragmentos de anticuerpo" también
comprende los fragmentos que per se no son capaces de
proporcionar funciones efectoras (ADCC/CDC) pero proporcionan esta
función en una forma de acuerdo con la invención tras combinarse con
dominio(s) constante(s) de anticuerpo
apropiado(s).
Los términos "anticuerpo monoclonal" o
"composición de anticuerpo monoclonal" tal como se utiliza aquí
se refiere a una preparación de moléculas de anticuerpo de una
composición de aminoácidos única. De acuerdo con esto, el término
"anticuerpo monoclonal humano" se refiere a anticuerpos que
muestran una especificidad de unión única que posee regiones
variables y constantes derivadas de secuencias de inmunoglobulina de
línea germinal humana. En una realización, los anticuerpos
monoclonales humanos se producen mediante un hibridoma que incluye
una célula B obtenida de un animal transgénico no humano, por
ejemplo un ratón transgénico, con un genoma que comprende un
transgén de cadena pesada humana y un transgén de cadena ligera
humana fusionado a una célula inmortalizada.
El término "anticuerpo quimérico" se
refiere a un anticuerpo que comprende una región variable, es decir,
una región de unión, de un origen o especie, y al menos una porción
de una región constante derivada de un origen o especie diferente,
normalmente obtenido mediante técnicas de DNA recombinante. Los
anticuerpos quiméricos que comprenden una región variable murina y
una región constante humana son especialmente preferibles. Tales
anticuerpos quiméricos murino/humano son el producto de expresión de
los genes de las inmunoglobulinas que comprenden segmentos de DNA
que codifican las regiones variables de la inmunoglobulina murina y
segmentos de DNA que codifican las regiones constantes de la
inmunoglobulina humana. Otras formas de "anticuerpos
quiméricos" abarcadas por la presente invención son aquellas en
que la clase o subclase ha sido modificada o cambiada por aquella
del anticuerpo original. Tales anticuerpos "quiméricos" también
se denominan "anticuerpos de cambio de clase". Los métodos
para producir anticuerpos quiméricos implica técnicas de DNA
recombinante convencional y técnicas de transfección génica, bien
conocidas en la técnica actual. Véase, por ejemplo, Morrison, S.L.,
et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81 (1984)
6851-6855; Patentes Estadounidenses Nº 5.202.238 y
5.204.244.
El término "anticuerpo humanizado" se
refiere a anticuerpos en los que las regiones marco o "regiones
determinantes de complementariedad" (CDR) se han modificado para
comprender las CDR de una inmunoglobulina de diferente
especificidad comparada con la de la inmunoglobulina parental. En
una realización preferible, una CDR murina se inserta en una región
marco de un anticuerpo humano para preparar el "anticuerpo
humanizado". Véase, por ejemplo, Riechmann, L., et al.,
Nature 332 (1988) 323-327; y Neuberger, M.S., et
al., Nature 314 (1985) 268-270. Las CDR
particularmente preferibles corresponden a aquellas que representan
las secuencias que reconocen los antígenos mencionados anteriormente
para los anticuerpos quiméricos y bifuncionales.
El término "anticuerpo humano", como se
utiliza aquí, pretende incluir anticuerpos con las regiones
variables y constantes derivadas de secuencias de inmunoglobulina
de línea germinal humana. La cadena pesada variable deriva
preferiblemente de la secuencia de línea germinal
DP-50 (GenBank LO6618) y la cadena ligera variable
deriva preferiblemente de la secuencia de línea germinal L6 (GenBank
X01668). Las regiones constantes del anticuerpo son regiones
constantes de IgG1 humano. Dichas regiones pueden ser alotípicas y
están descritas en, por ejemplo, Johnson, G., y Wu, T.T., Nucleic
Acids Res. 28 (2000) 214-218 y en las bases de datos
referenciadas en ellos y son útiles ya que retienen las propiedades
de inducción de ADCC y preferiblemente de CDC de acuerdo con la
invención.
El término "anticuerpo humano
recombinante", tal como se utiliza aquí, pretende incluir todos
los anticuerpos humanos que se han preparado, expresado, creado o
aislado mediante medios recombinantes, como los anticuerpos
aislados a partir de una célula huésped como una célula
SP2-0, NS0 o CHO o a partir de un animal (por
ejemplo, un ratón) que es transgénico para los genes de la
inmunoglobulina humana o anticuerpos expresados utilizando un
vector de expresión recombinante transfectado en una célula huésped.
Tales anticuerpos humanos recombinantes tienen las regiones
variables y constantes derivadas de las secuencias de
inmunoglobulina de línea germinal humana reorganizadas. Los
anticuerpos recombinantes humanos de acuerdo con la invención se han
sometido a una hipermutación somática in vivo. Por lo tanto,
las secuencias de aminoácido de las regiones VH y VL de los
anticuerpos recombinantes son secuencias que, aunque son derivadas y
están relacionadas con las secuencias VH y VL de la línea germinal
humana, pueden no aparecer naturalmente en un repertorio de
anticuerpos de línea germinal humana
in vivo.
in vivo.
Tal como se utiliza aquí, "unión" se
refiere a la unión de un anticuerpo a un IGF-IR con
una afinidad de alrededor de 10^{-13} a 10^{-8} M (K_{D}),
preferiblemente de alrededor de 10^{-13} a 10^{-9} M.
El termino "molécula de ácido nucleico",
tal como se utiliza aquí, pretende incluir moléculas de DNA y
moléculas de RNA. Una molécula de ácido nucleico puede ser de cadena
doble o de cadena sencilla, pero preferiblemente es un DNA de cadena
doble.
Los "dominios constantes" no están
involucrados directamente en la unión del anticuerpo a un antígeno
pero están involucrados en las funciones efectoras (ADCC, unión del
complemento, y CDC). El dominio constante de un anticuerpo de
acuerdo con la invención es del tipo IgG1. Los dominios constantes
humanos que poseen estas características se describen en detalle en
Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological
Interest, 5ª Ed. Public Health Service, National Institutes of
Health, Bethesda, MD. (1991), y por Brüggemann, M., et al.,
J. Exp. Med. 166 (1987) 1351-1361; Love, T.W., et
al., Methods Enzymol. 178 (1989) 515-527. Se
muestran ejemplos en los Id. de Sec. Nº 5 a 8. Otros dominios
constantes útiles y preferibles son los dominios constantes de los
anticuerpos obtenibles a partir de las líneas celulares de hibridoma
depositadas con DSMZ para esta invención. Los dominios constantes
útiles en la invención proporcionan unión al complemento. Se
proporcionan ADCC y opcionalmente CDC mediante la combinación de
dominios variables y constantes.
La "región variable" (región variable de
una cadena ligera (VL), región variable de una cadena pesada (VH))
tal como se utiliza aquí denota cada par de cadenas ligeras y
pesadas que están directamente involucradas en la unión del
anticuerpo al antígeno. Los dominios de las cadenas ligeras y
pesadas variables humanas tienen la misma estructura general y cada
dominio comprende cuatro regiones marco (FR) cuyas secuencias están
ampliamente conservadas, conectadas por tres "regiones
hipervariables" (o regiones determinantes de complementariedad,
CDR). Las regiones marco adoptan una conformación de lámina \beta
y las CDR pueden formar bucles que conectan la estructura de lámina
\beta. Las CDR de cada cadena se mantienen en su estructura
tridimensional a través de las regiones marco y formar junto con
las CDR de la otra cadena el punto de unión del antígeno. Las
regiones CDR3 de las cadenas pesada y ligera del anticuerpo juegan
un papel particularmente importante en la especificidad/afinidad de
la unión de los anticuerpos de acuerdo con la invención y por lo
tanto proporcionan otro objeto de la invención.
Los términos "región hipervariable" o
"porción de unión del antígeno de un anticuerpo", como se
utiliza aquí, se refiere a los residuos aminoacídicos de un
anticuerpo que son responsables de la unión del antígeno. La región
hipervariable comprende los residuos aminoacídicos de las
"regiones determinantes de complementariedad" o "CDR".
Las regiones "marco" o "FR" como se define aquí, son
aquellas regiones del dominio variable diferentes de los residuos
de la región hipervariable. Por lo tanto, las cadenas ligeras y
pesadas de un anticuerpo comprenden de N- a
C-terminal los dominios FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3,
CDR3 y FR4. Especialmente, la CDR3 de la cadena pesada es la región
que contribuye la mayor parte de la unión del antígeno. Las regiones
CDR y FR se determinan de acuerdo con la definición estándar de
Kabat et al., Sequences of Proteins of Immunological
Interest, 5ª Ed., Public Health Service, National Institutes of
Health, Bethesda, MD (1991) y/o aquellos residuos de un "bucle
hipervariable".
El término "unión a IGF-IR"
tal como se utiliza aquí significa la unión del anticuerpo al
IGF-IR en un ensayo in vitro, preferiblemente
en un ensayo de unión en el que el anticuerpo está unido a una
superficie y la unión de IGF-IR se mide mediante
Resonancia de Plasmón en Superficie (SPR). Unión significa una
afinidad de unión (K_{D}) de 10^{-8} M o inferior,
preferiblemente 10^{-13} a 10^{-9} M.
La unión a IGF-IR puede
investigarse mediante un ensayo BIAcore (Pharmacia Biosensor AB,
Uppsala, Suecia). La afinidad de la unión se define mediante los
término ka (constante de la tasa para la asociación del anticuerpo
del complejo anticuerpo/antígeno), kd (constante de disociación), y
K_{D} (kd/ka). Los anticuerpos de acuerdo con la invención
muestran una K_{D} de 10^{-10} M o inferior.
La unión de IGF-I e
IGF-II al IGF-IR también está
inhibida por los anticuerpos de acuerdo con la invención. La
inhibición se mide como CI_{50} en un ensayo para la unión de
IGF-I/IGF-II al
IGF-IR en células tumorales. Tal ensayo está
descrito en el Ejemplo 7. En dicho ensayo, la cantidad de
IGF-I o IGF-II o fragmentos de unión
a IGF-IR de los mismos radiomarcados unidos al
IGF-IR proporcionados en la superficie de dichas
células tumorales (por ejemplo HT29) se mide sin y con
concentraciones aumentadas del anticuerpo. Los valores de CI_{50}
de los anticuerpos de acuerdo con la invención para la unión de
IGF-I y IGF-II al
IGF-IR no son superiores a 2 nM y la proporción de
los valores de CI_{50} para la unión de
IGF-I/IGF-II al
IGF-IR es de alrededor de 1:3 a 3:1. Los valores de
CI_{50} se miden como los valores de la media o mediana de al
menos tres mediciones independientes. Los valores de CI_{50}
únicos están fuera de rango.
El término "inhibir la unión de
IGF-I e IGF-II al
IGF-IR" tal como se utiliza aquí se refiere a
inhibir la unión de IGF-I o IGF-II
marcados con I^{125} al IGF-IR presentado en la
superficie de las células tumorales HT29 (ATCC
HTB-38) en un ensayo in vitro. Inhibir
significa un valor de CI_{50} de 2 nM o inferior.
El término "células que expresan
IGF-IR" se refiere a las células que
sobreexpresan el receptor IGF-I en al menos 20.000
receptores/célula. Dichas células son, por ejemplo, líneas celulares
tumorales como NCI H322M o HT29, o una línea celular (por ejemplo
3T3 ATCC CRL1658) que sobreexpresa IGF-IR después de
la transfección con un vector de expresión para
IGF-IR. La cantidad de receptores por célula se mide
de acuerdo con Lammers, R., et al., EMBO J. 8 (1989)
1369-1375.
El término "inhibición de la fosforilación de
IGF-IR" se refiere a un ensayo de fosforilación
celular utilizando células 3T3 que proporcionan de 400.000 a 600.000
moléculas de IGF-IR por célula en un medio que
contiene suero fetal bovino (FCS) al 0,5% inactivado por calor
cuando se compara con dicho ensayo sin dicho anticuerpo. La
fosforilación se detecta mediante Western blot utilizando un
anticuerpo específico para las proteínas fosforiladas en la
tirosina. Dicho ensayo se describe en el Ejemplo 11. La inactivación
por calor del FCS se realiza mediante un calentamiento por un corto
periodo de tiempo a 56ºC para inactivar el sistema del
complemento.
El término "inhibición de la fosforilación de
PKB" se refiere a un ensayo de fosforilación celular utilizando
células 3T3 que proporcionan de 400.000 a 600.000 moléculas de
IGF-IR por célula en un medio que contiene suero
fetal bovino (FCS) al 0,5% inactivado por calor cuando se compara
con dicho ensayo sin dicho anticuerpo. La fosforilación se detecta
mediante Western blot utilizando un anticuerpo específico para el
PKB fosforilado en la serina 473 del PKB (Akt 1, Nº Acceso del Swiss
Prot P31749). Dicho ensayo se describe en el Ejemplo 11.
El término "citotoxicidad celular dependiente
de anticuerpo (ADCC)" se refiere a la lisis de células tumorales
diana humanas mediante un anticuerpo de acuerdo con la invención en
presencia de células efectoras. La ADCC se mide preferiblemente
mediante el tratamiento de una preparación de células que expresan
IGF-IR con un anticuerpo de acuerdo con la
invención en presencia de células efectoras como las recién aisladas
PBMC o células efectoras purificadas de la capa leucocitaria, como
los monocitos o las células NK. La ADCC se encuentra si el
anticuerpo induce la lisis (muerte celular) del 20% o más de las
células tumorales tras 24 horas a una concentración de 100 nM. Si
la ADCC se encuentra que es más pronunciada a las 4 h que a las 24
h, entonces la medición se realiza a las 4 h. El ensayo se realiza
preferiblemente con células tumorales marcadas con ^{51}Cr o Eu y
se mide específicamente la liberación de ^{51}Cr o Eu. Los
controles incluyen la incubación de las células tumorales diana con
las células efectoras pero sin el anticuerpo.
El término "citotoxicidad dependiente del
complemento (CDC)" se refiere a la lisis de células tumorales
diana humanas mediante un anticuerpo de acuerdo con la invención en
presencia del complemento. La CDC se mide preferiblemente mediante
el tratamiento de una preparación de células que expresan
IGF-IR con un anticuerpo de acuerdo con la
invención en presencia del complemento. La CDC se encuentra si el
anticuerpo induce la lisis (muerte celular) del 20% o más de las
células tumorales tras 4 horas a una concentración de 100 nM. El
ensayo se realiza preferiblemente con células tumorales marcadas con
^{51}Cr o Eu y se mide la liberación de ^{51}Cr o Eu. Los
controles incluyen la incubación de las células tumorales diana con
el complemento pero sin el anticuerpo.
El término "inhibición completa de la
transducción de señales mediadas por IGF-I" se
refiere a la inhibición de la fosforilación de
IGF-IR mediada por IGF-I. Para dicho
ensayo, las células que expresan IGF-IR,
preferiblemente las células H322M, se estimulan con
IGF-I y se tratan con un anticuerpo de acuerdo con
la invención (es útil una concentración de anticuerpo de 5 nM o
superior). En consecuencia, se realiza un SDS PAGE y se mide la
fosforilación de IGF-IR mediante análisis por
Western blot con un anticuerpo específico para la tirosina
fosforilada. La inhibición completa de la transducción de señales
se encuentra si en el Western blot no se detecta de forma visible
ninguna banda que se refiera al IGF-IR
fosforilado.
Los anticuerpos de acuerdo con la invención
muestran una unión al mismo epítopo de IGF-IR que el
anticuerpo 18 o están inhibidos en la unión al
IGF-IR debido a un impedimento estérico de la unión
gracias al anticuerpo 18. La inhibición de la unión puede detectarse
mediante un ensayo SPR utilizando el anticuerpo 18 inmovilizado y el
IGF-IR a una concentración de 20-50
nM y el anticuerpo a detectar a una concentración de 100 nM. Una
reducción de la señal del 50% o más muestra que el anticuerpo
compite con el anticuerpo 18. Dicho ensayo puede realizarse de la
misma forma pero utilizando el anticuerpo 22 como anticuerpo
inmovilizado.
El término "epítopo" significa cualquier
determinante de proteína capaz de unirse específicamente a un
anticuerpo. Los epítopos normalmente consisten en agrupamientos de
moléculas químicamente activas en superficie, como aminoácidos o
cadenas laterales de azúcares, y que normalmente poseen
características estructurales tridimensionales específicas así como
características de carga específicas. Los epítopos conformacionales
y los no conformacionales se distinguen en que no hay unión a los
conformacionales pero sí en los no conformacionales en presencia de
solventes desnaturalizantes.
Los anticuerpos de acuerdo con la invención
incluyen, además, dichos anticuerpos que poseen "modificaciones de
secuencia conservativas", nucleótidos y modificaciones de
secuencia de aminoácidos que no afectan o alteran las
características mencionadas anteriormente del anticuerpo de acuerdo
con la invención. Las modificaciones pueden introducirse mediante
técnicas estándar conocidas en la técnica, como la mutagénesis
dirigida al sitio y la mutagénesis mediada por PCR. Las
sustituciones conservativas de aminoácidos incluye las que el
residuo de aminoácido está sustituido con un residuo de aminoácido
que posee una cadena lateral similar. Las familias de residuos de
aminoácido que poseen cadenas laterales similares han sido definidos
en la técnica. Estas familias incluyen aminoácidos con cadenas
laterales básicas (por ejemplo, lisina, arginina, histidina),
cadenas laterales acídicas (por ejemplo, ácido aspártico, ácido
glutámico), cadenas laterales polares no cargadas (por ejemplo
glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina,
cisteína, triptófano), cadenas laterales no polares (por ejemplo,
alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina,
metionina), cadenas laterales beta-ramificadas (por
ejemplo, treonina, valina, isoleucina) y cadenas laterales
aromáticas (por ejemplo, tirosina, fenilalanina, triptófano,
histidina). Así, un residuo de aminoácido no esencial predicho en un
anticuerpo humano anti-IGF-IR puede
estar preferiblemente sustituido por otro residuo de aminoácido de
la misma familia de cadenas laterales.
Pueden realizarse sustituciones de aminoácidos
mediante mutagénesis basada en el modelaje molecular tal como se
describe en Riechmann, L., et al., Nature 332 (1988)
323-327 y Queen, C., et al., Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 86 (1989) 10029-10033.
En una realización preferible de la invención,
los anticuerpos de acuerdo con la invención se caracterizan además
por una o más características seleccionadas del grupo seleccionado
de los parámetros de unión ka, kd y K_{D}, que se unen al mismo
epítopo que los anticuerpos 18 y 22, los valores de CI_{50} para
la inhibición de la unión de IGF-I e
IGF-II al IGF-IR en células
tumorales, y los valores de CI_{50} para la inhibición de la
fosforilación de IGF-IR tras la estimulación de
IGF-I en células tumorales. La inhibición de la
fosforilación de IGF-IR conduce a la inhibición de
la fosforilación de elementos corriente abajo como el PKB, la
regulación negativa de IGF-IR en células tumorales,
y la influencia en el crecimiento tridimensional de células
tumorales in vitro. Los anticuerpos se caracterizan además
preferiblemente por sus valores farmacocinéticos y farmacodinámicos,
y la reactividad cruzada para otras
especies.
especies.
Los anticuerpos de acuerdo con la invención
inhiben la fosforilación de la tirosina del IGF-IR y
preferiblemente también la fosforilación de la tirosina de PKB en
una extensión similar.
Los anticuerpos de acuerdo con la invención
preferiblemente regulan negativamente el nivel de proteína de
IGF-IR en células tumorales y en tumores, por
ejemplo en tumores xenoinjertados.
Los anticuerpos de acuerdo con la invención
inhiben preferiblemente el crecimiento tridimensional de las células
tumorales en un ensayo de formación de colonias así como la
proliferación de las células que expresan IGF-IR
(por ejemplo células NIH 3T3).
Los anticuerpos de acuerdo con la invención
preferiblemente no inhiben la unión de la insulina al receptor de la
insulina en un ensayo de competición de unión en células 3T3 que
sobreexpresan el receptor de la insulina utilizando el anticuerpo en
una concentración de 200 nmol/l.
Los anticuerpos de acuerdo con la invención se
producen preferiblemente mediante métodos recombinantes. Tales
métodos son ampliamente conocidos en el estado de la técnica y
comprenden expresión de proteínas en células procariotas y
eucariotas con el posterior aislamiento del polipéptido del
anticuerpo y normalmente la purificación en una pureza
farmacéuticamente aceptable. Para la expresión de proteína, los
ácidos nucleicos que codifican las cadenas pesada y ligera o
fragmentos de las mismas se insertan en el vector de expresión
mediante métodos estándar. La expresión se realiza en células
huésped procariotas o eucariotas apropiadas como las células CHO,
células NS0, células SP2/0, células HEK293, células COS, levaduras,
o células de E. coli, y se recupera el anticuerpo de las
células (sobrenadante o células tras la lisis).
La producción recombinante de anticuerpos se
conoce bien en el estado de la técnica y se describe, por ejemplo,
en la revisión de los artículos de Makrides, S.C., Protein Expr.
Purif. 17 (1999) 183-202; Geisse, S., et al.,
Protein Expr. Purif. 8 (1996) 271-282; Kaufman,
R.J., Mol. Biotechnol. 16 (2000) 151-161; Werner,
R.G., Drug Res. 48 (1998) 870-880.
Los anticuerpos pueden estar presentes en
células enteras, en un lisado celular, o en una forma parcialmente
purificada o sustancialmente pura. La purificación se realiza para
eliminar otros componentes celulares u otros contaminantes, por
ejemplo otros ácidos nucleicos celulares o proteínas, mediante
técnicas estándar, que incluye tratamiento alcalino/SDS, bandas de
CsCl, cromatografía en columna, electroforesis en gel de agarosa, y
otros bien conocidos en la técnica. Véase Ausubel, F., et
al., ed. Current Protocols in Molecular Biology, Greene
Publishing y Wiley Interscience, New York (1987).
La expresión en células NS0 se describe en, por
ejemplo, Barnes, L.M., et al., Cytotechnology 32 (2000)
109-123; y Barnes, L.M., et al., Biotech.
Bioeng. 73 (2001) 261-270. La expresión transitoria
se describe en, por ejemplo, Durocher, Y., et al., Nucl.
Acids. Res. 30 (2002) E9. El clonaje de los dominios variables se
describe en Orlandi, R., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA
86 (1989) 3833-3837; Carter, P., et al.,
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89 (1992) 4285-4289; y
Norderhaug, L., et al., J. Immunol. Methods 204 (1997)
77-87. Un sistema de expresión transitorio
preferible (HEK 293) se describe en Schlaeger, E.-J., y Christensen,
K., en Cytotechnology 30 (1999) 71-83 y en
Schlaeger, E.-J., en J. Immunol. Methods 194 (1996)
191-199.
Las secuencias control que son adecuadas para
procariotas, por ejemplo, incluyen un promotor, opcionalmente una
secuencia operador y un punto de unión del ribosoma. Las células
eucariotas utilizan promotores, potenciadores y señales de
poliadenilación.
Un ácido nucleico está "ligado de forma
operativa" si está situado en una relación funcional con otra
secuencia de ácido nucleico. Por ejemplo, el DNA de una presecuencia
o líder secretor está ligado de forma operativa al DNA de un
polipéptido si se expresa como preproteína que participa en la
secreción del polipéptido; un promotor o potenciador está ligado de
forma operativa a una secuencia codificante si afecta a la
transcripción de la secuencia; o un lugar de unión a ribosomas está
ligado de forma operativa a una secuencia codificante si está
posicionado de forma que facilita la traducción. Generalmente,
"ligado de forma operativa" significa que las secuencias de DNA
ligadas están contiguas, y en el caso de un líder secretor,
contiguas y en marco de lectura. Sin embargo, los potenciadores no
tienen que estar contiguos. La unión se consigue mediante una
ligación en las dianas de restricción convenientes. Si tales dianas
no existen, se utilizan adaptadores o enlazantes sintéticos
oligonucleotídicos de acuerdo con la práctica convencional.
Los anticuerpos monoclonales están separados de
forma adecuada del medio de cultivo mediante procedimientos
convencionales de purificación de inmunoglobulinas como, por
ejemplo, proteína A - Sefarosa, cromatografía en hidroxiapatita,
electroforesis en gel, diálisis o cromatografía de afinidad. Los DNA
y RNA que codifican los anticuerpos monoclonales se aíslan y
secuencian fácilmente utilizando procedimientos convencionales. Las
células de hibridoma pueden servir como fuente de tales DNA y RNA.
Una vez aislados, los DNA pueden insertarse en vectores de
expresión, que entonces se transfectan en células huésped como las
células HEK 293, células CHO o células de mieloma que de otro modo
no producirían las proteínas de inmunoglobulina, para obtener la
síntesis de anticuerpos monoclonales recombinantes en las células
huésped.
Las variantes de la secuencia de aminoácidos del
anticuerpo anti IGF-IR humano se preparan
introduciendo los cambios de nucleótido apropiados en el DNA del
anticuerpo, o mediante la síntesis de péptidos. Tales modificaciones
pueden realizarse, sin embargo, sólo en un rango muy limitado, por
ejemplo, como se ha descrito anteriormente. Por ejemplo, las
modificaciones no alteran las características anteriormente
mencionadas del anticuerpo como el isotipo de la IgG y la unión del
epítopo, pero pueden mejorar el rendimiento de la producción
recombinante, la estabilidad de la proteína o facilitar la
purificación.
También puede sustituirse cualquier residuo de
cisteína que no está involucrado en mantener la correcta
conformación del anticuerpo
anti-IGF-IR, generalmente con
serina, para mejorar la estabilidad oxidativa de la molécula y
prevenir el entrecruzamiento aberrante. Contrariamente, pueden
añadirse enlaces de cisteína al anticuerpo para mejorar su
estabilidad (particularmente cuando el anticuerpo es un fragmento de
anticuerpo como el fragmento Fv).
Otro tipo de variante de aminoácidos del
anticuerpo es el que altera el patrón de glucosilación original del
anticuerpo. Por alterar, se entiende eliminar una o más porciones de
carbohidratos que se encuentran en el anticuerpo, y/o añadir uno o
más sitios de glucosilación que no están presentes en el anticuerpo.
La glucosilación de los anticuerpos es normalmente del tipo
N-unido. N-unido se refiere a la
unión de la porción de carbohidrato a la cadena lateral de un
residuo de asparagina. Las secuencias de tripéptidos
asparagina-X-serina y
asparagina-X-treonina, en la que X
es cualquier aminoácido excepto prolina, son las secuencias de
reconocimiento para la unión enzimática de la porción de
carbohidrato a la cadena lateral de asparagina. Así, la presencia de
cualquiera de estas secuencias de tripéptidos en un polipéptido
crea un sitio de glucosilación potencial. La adición de los sitios
de glucosilación al anticuerpo se logra de forma adecuada por la
alteración de la secuencia de aminoácidos como la que contiene una o
más de las secuencias de tripéptidos descritas anteriormente (para
los sitios de glucosilación N-unidos).
Las moléculas de ácidos nucleicos que codifican
variantes de la secuencia de aminoácidos del anticuerpo
anti-IGF-IR se preparan mediante
una variedad de métodos conocidos en la técnica. Estos métodos
incluyen, pero no se limitan a, aislamiento a partir de una fuente
natural (en el caso de las variantes de secuencia de aminoácido
naturales) o preparación mediante mutagénesis mediada por
oligonucleótido (o dirigida), mutagénesis por PCR, y mutagénesis en
casete de una variante preparada con anterioridad o una versión sin
variar del anticuerpo anti-IGF-IR
humanizado.
La invención también pertenece a los
inmunoconjugados que comprenden el anticuerpo de acuerdo con la
invención conjugado con un agente citotóxico como un agente
quimioterapéutico, toxina (por ejemplo, una toxina enzimáticamente
activa de origen bacteriano, fúngico, vegetal o animal, o fragmentos
de los mismos), un isótopo radioactivo (es decir, un
radioconjugado) o un profármaco de un agente citotóxico. Los agentes
útiles en la generación de tales inmunoconjugados se han descrito
anteriormente. Las toxinas enzimáticamente activas y fragmentos de
las mismas que pueden utilizarse incluyen la cadena A de la
difteria, fragmentos activos que no se unen de la toxina de la
difteria, cadena A de la exotoxina (de Pseudomonas
aeruginosa), cadena A de la ricina, cadena A de la abrina,
cadena A de la modeccina, alfa-sarcina, proteínas de
Aleuritesfordii, proteínas de diantina, proteínas de
Phytolaca americana (PAPI, PAPII, y PAP-S),
inhibidor de momordica charantia, curcina, crotina, inhibidor
de sapaonaria officinalis, gelonina, mitogelina,
restrictocina, fenomicina, enomicina y los tricotecenos.
Los conjugados del anticuerpo y del agente
citotóxico se crean utilizando una serie de agentes de acoplamiento
de proteínas bifuncionales como el propionato de
N-succinimidil-3-(2-piridilditiol)
(SPDP), iminotiolano (IT), derivados bifuncionales de imidoésteres;
(como adipimidato de dimetilo HCL), ésteres activos (como suberato
de disuccinimidilo), aldehídos (como glutaraldehído), compuestos
bis-azido (como
bis(p-azidobenzoil) hexanodiamina),
derivados de bis-diazonio (como
bis-(p-diazoniobenzoil)-etilendiatnina),
diisocianatos (como tolieno 2,6-diisocianato), y
compuestos fluor bis-activos (como
1,5-difluoro-2,4-dinitrobenceno).
Por ejemplo, una inmunotoxina de ricino puede prepararse como se ha
descrito en Vitetta, E.S., et al., Science 238 (1987)
1098-1104). El ácido
1-isotiocianatobencil-3-metildietilen
triaminapentaacético (MX-DTPA) marcado con
carbono-14 es un ejemplo de agente quelante para la
conjugación de radionucleótidos con el anticuerpo. Véase WO
94/11026.
Otro tipo de modificación covalente involucra
glicósidos de acoplamiento químico o enzimático al anticuerpo.
Estos procedimientos son ventajosos ya que no requieren de la
producción del anticuerpo en una célula huésped que posea
capacidades de glucosilación para la glucosilación N- o
O-unida. Dependiendo del modo de acoplamiento
utilizado, el(los) azúcar(es) puede(n) estar
unido(s) a (a) arginina e histidina, (b) grupos carboxilo
libres, (c) grupos sulfhidrilo libres como los de la cisteína, (d)
grupos hidroxilo libres como los de la serina, treonina, o
hidroxiprolina, (e) residuos aromáticos como los de la fenilalanina,
tirosina, o triptófano, o (f) el grupo amida de la glutamina. Estos
métodos se describen en WO 87/05330, y en Aplin, J.D., y Wriston,
J.C. Jr., CRC Crit. Rev. Biochem. (1981)
259-306.
La eliminación de cualquier porción de
carbohidrato presente en el anticuerpo puede lograrse de forma
química o enzimática. La desglucosilación química requiere de la
exposición del anticuerpo al compuesto ácido
trifluorometanosulfónico, o un compuesto equivalente. Este
tratamiento resulta en la escisión de la mayoría o de todos los
azúcares excepto el azúcar enlazante
(N-acetilglucosamina o
N-acetilgalactosamina), dejando el anticuerpo
intacto. La desglucosilación química se describe en Sojahr, H.T., y
Bahl, O.P., Arch. Biochem. Biophys. 259 (1987) 52-57
y en Edge, A.S., et al. Anal. Biochem. 118 (1981)
131-137. La escisión enzimática de las porciones de
carbohidrato en los anticuerpos puede lograrse mediante la
utilización de una serie de endo- y exo-glucosidasas
como las descritas por Thotakura, N.R., y Bahl, O.P., Meth. Enzymol.
138 (1987) 350-359.
Otro tipo de modificación covalente del
anticuerpo comprende la unión del anticuerpo a una serie de
polímeros no proteicos, por ejemplo, polietilenglicol,
polipropilenglicol, o polioxialquilenos, de la forma descrita en las
Patentes Estadounidenses Nº 4.640.835; 4.496.689; 4.301.144;
4.670.417; 4.791.192 o 4.179.337.
En aún otro aspecto, la invención proporciona
células B aisladas de un animal transgénico no humano, por ejemplo
un ratón transgénico, que expresa los anticuerpos anti
IGF-IR humanos de acuerdo con la invención.
Preferiblemente, las células B aisladas se obtienen de un animal
transgénico no humano, por ejemplo, un ratón transgénico, que se ha
inmunizado con una preparación purificada o enriquecida de antígeno
IGF-IR y/o células que expresan
IGF-IR. Preferiblemente, el animal transgénico no
humano, por ejemplo un ratón transgénico, posee un genoma que
comprende un transgén de cadena pesada humana y un transgén de
cadena ligera humana que codifican toda o una porción de un
anticuerpo de la invención. Estas células B aisladas se inmortalizan
entonces para proporcionar una fuente (por ejemplo un hibridoma) de
anticuerpos anti-IGF-IR humano. De
acuerdo con esto, la presente invención también proporciona un
hibridoma capaz de producir anticuerpos monoclonales humanos de
acuerdo con la invención. En una realización, el hibridoma incluye
una célula B obtenida de un animal transgénico no humano, por
ejemplo, un ratón transgénico que posee un genoma que comprende un
transgén de cadena pesada humana y un transgén de cadena ligera
humana que codifican toda o una porción de un anticuerpo de la
invención, fusionado a una célula inmortalizada.
En una realización particular, el animal
transgénico no humano es un ratón transgénico que posee un genoma
que comprende un transgén de cadena pesada humana y un transgén de
cadena ligera humana que codifican toda o una porción de un
anticuerpo de la invención. El animal transgénico no humano puede
inmunizarse con una preparación purificada o enriquecida de
antígeno IGF-IR y/o células que expresan
IGF-IR. Preferiblemente, el animal transgénico no
humano, por ejemplo, un ratón transgénico, es capaz de producir
isotipos de IgG1 de anticuerpos monoclonales humanos frente a
IGF-IR.
Los anticuerpos monoclonales humanos de acuerdo
con la invención pueden producirse mediante la inmunización de un
animal transgénico no humano, por ejemplo, un ratón transgénico, que
posee un genoma que comprende un transgén de cadena pesada humana y
un transgén de cadena ligera humana que codifican toda o una porción
de un anticuerpo de la invención, con una preparación purificada o
enriquecida de antígeno IGF-IR y/o células que
expresan IGF-IR. Las células B (por ejemplo células
B del bazo) del animal se obtienen entonces y se fusionan con
células de mieloma para formar células de hibridoma inmortales, que
secretan anticuerpos monoclonales humanos frente a
IGF-IR.
En una realización preferible, los anticuerpos
monoclonales humanos dirigidos frente a IGF-IR
pueden generarse utilizando ratones transgénicos portadores de
partes del sistema inmune humano en lugar del sistema murino. Estos
ratones transgénicos, referidos aquí como ratones "HuMAb",
contienen un minilocus del gen de la inmunoglobulina humana que
codifica los genes de la inmunoglobulina humana no redistribuidos
que incluye la cadena pesada (\mu y \gamma) y la cadena ligera
\kappa (genes de las regiones constantes), junto con las
mutaciones dirigidas que inactivan los loci de las cadenas
endógenas \mu y \kappa (Lonberg, N., et al., Nature 368
(1994) 856-859). De acuerdo con esto, los ratones
presentan una expresión reducida de la IgM o K de ratón, y en
respuesta a la inmunización, los transgenes introducidos de las
cadenas pesada y ligera humanas producen un cambio de clase y una
mutación somática para generar anticuerpos monoclonales IgG humanos
de alta afinidad (Lonberg, N., et al., Nature 368 (1994)
856-859; revisado en Lonberg, N., Handbook of
Experimental Pharmacology 113 (1994) 49-101;
Lonberg, N., y Huszar, D., Intern. Rev. Immunol. 25 (1995)
65-93; y Harding, F., y Lonberg, N., Ann. N. Acad.
Sci 764 (1995) 536-546). La preparación de ratones
HuMAb se describe en Taylor, L., et al., Nucleic Acids
Research 20 (1992) 6287-6295; Chen, J., et
al., International Immunology 5 (1993) 647-656;
Tuaillon, N., et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA 90 (1993)
3720-3724; Choi, T.K., et al., Nature
Genetics 4 (1993) 117-123; Chen, J., et al.,
EMBO J. 12 (1993) 821-830; Tuaillon, N., et
al., Immunol. 152 (1994) 2912-2920; Lonberg, N.,
et al., Nature 368 (1994) 856-859; Lonberg,
N., Handbook of Experimental Pharmacology 113 (1994)
49-101; Taylor, L., et al., Int. Immunol. 6
(1994) 579-591; Lonberg, N., y Huszar, D., Intern.
Rev. Immunol. 25 (1995) 65-93; Harding, F., y
Lonberg, N., Ann. N. Acad. Sci 764 (1995) 536-546;
Fishwild, D.M., et al., Nat. Biotechnol. 14 (1996)
845-851. Véase además, Patentes Estadounidenses Nº
5.545.806; 5.569.825; 5.625.126; 5.633.425; 5.789.650; 5.877.397;
5.661.016; 5.814.318; 5.874.299; 5.545.807; 5.770.429; WO 98/24884;
WO 94/25585; WO 93/1227; WO 92/22645; y WO 92/03918.
Para generar anticuerpos monoclonales
completamente humanos frente a IGF-IR, los ratones
HuMAb pueden inmunizarse con una preparación purificada o
enriquecida de antígeno IGF-IR y/o células que
expresan IGF-IR de acuerdo con el método general,
como se describe en Lonberg, N., et al., Nature 368 (1994)
856-859; Fishwild, D.M., et al., Nat.
Biotechnol. 14 (1996) 845-851 y WO 98/24884.
Preferiblemente, los ratones serán de 6-16 semanas
de edad en la primera inmunización. Por ejemplo, puede utilizarse
una preparación purificada o enriquecida de antígeno
IGF-IR soluble (por ejemplo purificado a partir de
células que expresan IGF-IR) para inmunizar los
ratones HuMAb por vía intraperitoneal. En el caso de que las
inmunizaciones utilizando una preparación purificada o enriquecida
de antígeno IGF-IR no resulte en anticuerpos, los
ratones pueden también inmunizarse con células que expresan
IGF-IR, por ejemplo, una línea de células tumorales,
para promover la respuesta inmune. La experiencia adquirida con
varios antígenos mostró que los ratones transgénicos HuMAb responden
mejor cuando se inmunizan inicialmente por vía intraperitoneal
(i.p.) con antígeno en adyuvante completo de Freund, seguido por
cualquier otra inmunización semanal i.p. (por ejemplo, hasta un
total de 6) con antígeno en adyuvante incompleto de Freund. La
respuesta inmune puede monitorizarse durante el curso del protocolo
de inmunización con muestras de plasma obtenidas por sangrados
retroorbitales. El plasma puede analizarse mediante ELISA, y pueden
utilizarse los ratones con una titulación suficiente de
inmunoglobulina humana anti-IGF-IR
para la inmortalización de las correspondientes células B. Los
ratones pueden inyectarse de nuevo por vía intravenosa con antígeno,
3 o 4 días antes de su sacrificio y de la extracción del bazo y de
los nódulos linfáticos. Se espera que sea necesario realizar
2-3 fusiones por cada antígeno. Muchos ratones se
inmunizarán
por cada antígeno. Por ejemplo, pueden inmunizarse un total de doce ratones HuMAb de las cepas HCo7 y HCo12.
por cada antígeno. Por ejemplo, pueden inmunizarse un total de doce ratones HuMAb de las cepas HCo7 y HCo12.
Los ratones HCo7 poseen una disrupción JKD en
sus genes endógenos de la cadena ligera (kappa) (como se describe en
Chen, J., et al., EMBO J. 12 (1993) 821-830),
una disrupción CMD en sus genes endógenos de la cadena pesada (como
se describe en el Ejemplo 1 de WO 01/14424), un transgén KCo5 humano
de la cadena ligera kappa (como se describe en Fishwild, D.M., et
al., Nat. Biotechnol. 14 (1996) 845-851), y un
transgén HCo7 humano de la cadena pesada (como se describe en la
Patente Estadounidense Nº 5.770.429).
Los ratones HCo12 poseen una disrupción JKD en
sus genes endógenos de la cadena ligera (kappa) (como se describe en
Chen, J., et al., EMBO J. 12 (1993) 821-830),
una disrupción CMD en sus genes endógenos de la cadena pesada (como
se describe en el Ejemplo 1 de WO 01/14424), un transgén KCo5 humano
de la cadena ligera kappa (como se describe en Fishwild, D.M., et
al., Nat. Biotechnol. 14 (1996) 845-851), y un
transgén HCo12 humano de la cadena pesada (como se describe en el
Ejemplo 2 de WO 01/14424).
Pueden aislarse los linfocitos de ratón y
fusionarse con una línea celular de mieloma de ratón utilizando PEG
basado en los protocolos estándar para generar hibridomas. Los
hibridomas resultantes se criban entonces para la producción de
anticuerpos específicos de antígeno. Por ejemplo, las suspensiones
celulares únicas de linfocitos esplénicos y de linfocitos derivados
de los nódulos linfáticos a partir de ratones inmunizados se
fusionan hasta un sexto de la cantidad de células de mieloma de
ratón no secretoras SP 2/0 (ATCC, CRL 1581) con 50% de PEG. Las
células se plaquean a aproximadamente 2 x 10^{5} en placas
microtituladas de fondo plano, seguido por cerca de dos semanas de
incubación en medio selectivo.
Los pocillos individuales se analizan por ELISA
para la presencia de anticuerpos monoclonales IgM e IgG humanos
anti-IGF-IR. Una vez aparezca un
crecimiento extensivo del hibridoma, se analiza el medio,
normalmente tras 10-14 días. Los hibridomas que
secretan anticuerpo se replaquean, se analizan de nuevo, y si son
positivos para anticuerpos monoclonales IgG humanos
anti-IGF-IR, pueden subclonarse al
menos dos veces mediante dilución limitante. Los subclones estables
se cultivan entonces in vitro para producir anticuerpos en
medio de cultivo de tejidos para su caracterización.
Ya que las secuencias CDR son responsables de
las interacciones anticuerpo-antígeno, es posible
expresar los anticuerpos recombinantes de acuerdo con la invención
construyendo vectores de expresión que incluye las secuencias CDR
de acuerdo con la invención en secuencias marco de otros anticuerpos
humanos diferentes (véase, por ejemplo, Riechmann, L., et
al., Nature 332 (1998) 323-327; Jones, P., et
al., Nature 321 (1986) 522-525; y Queen, C.,
et al., Proc. Natl. Acad. Véase U.S.A. 86 (1989)
10029-10033). Tales secuencias marco pueden
obtenerse de las bases de datos públicas de DNA que incluye las
secuencias génicas de anticuerpo humano de línea germinal. Estas
secuencias de línea germinal difieren de las secuencias génicas del
anticuerpo maduro debido a que éstas no incluyen genes variables
completamente ensamblados, que están formados por la unión
V(D)J durante la maduración de las células B. las
secuencias génicas de línea germinal también difieren de las
secuencias de un anticuerpo de repertorio secundario de alta
afinidad incluso a través de la región variable individual.
La invención preferiblemente comprende un
fragmento de ácido nucleico que codifica un polipéptido que se une
al IGF-IR, en el que dicho polipéptido inhibe la
unión de IGF-I e IGF-II al
IGF-IR, seleccionado del grupo que consiste en
a) una cadena pesada de anticuerpo que comprende
los CDR, CDR1 (aa 31-35), CDR2 (aa
50-66) y CDR3 (aa 99-107) del Id. de
Sec. Nº 1 o 3;
b) una cadena ligera de anticuerpo que comprende
los CDR, CDR1 (aa 24-34), CDR2 (aa
50-56) y CDR3 (aa 89-98) del Id. de
Sec. Nº 2 o 4.
Las regiones variables de las cadenas ligera y
pesada reconstruidas se combinan con secuencias de promotor, inicio
de traducción, región constante, 3' sin traducir, poliadenilación, y
finalización de la transcripción para formar construcciones de
vectores de expresión. Las construcciones de expresión de la cadena
pesada y ligera pueden combinarse en un único vector,
cotransfectarse, transfectarse de forma seriada, o transfectarse
separadamente en células huésped que están entonces fusionadas para
formar una célula huésped única que expresa ambas cadenas.
De acuerdo con esto, la invención proporciona un
método para la producción de un anticuerpo recombinante humano de
acuerdo con la invención, que se caracteriza por la expresión de un
ácido nucleico que codifica
a) una cadena pesada de anticuerpo que comprende
los CDR, CDR1 (aa 31-35), CDR2 (aa
50-66) y CDR3 (aa 99-107) del Id. de
Sec. Nº 1 o 3;
b) una cadena ligera de anticuerpo que comprende
los CDR, CDR1 (aa 24-34), CDR2 (aa
50-56) y CDR3 (aa 89-98) del Id. de
Sec. Nº 2 o 4.
La invención comprende además la utilización de
un anticuerpo de acuerdo con la invención para la detección de
IGF-IR in vitro, preferiblemente mediante un
ensayo inmunológico para determinar la unión entre
IGF-IR de una muestra y el anticuerpo de acuerdo con
la invención.
En otro aspecto, la presente invención
proporciona una composición, por ejemplo una composición
farmacéutica, que contiene un o una combinación de anticuerpos
monoclonales humanos, o la porción de unión a antígeno de los
mismos, de la presente invención, formulado junto con un
transportador farmacéuticamente aceptable.
Las composiciones farmacéuticas de la invención
también pueden administrarse en terapia de combinación, es decir,
combinado con otros agentes. Por ejemplo, la terapia de combinación
puede incluir una composición de la presente invención con al menos
un agente anti-tumoral u otra terapia
convencional.
Un "agente quimioterapéutico" es un
compuesto útil en el tratamiento del cáncer. Ejemplos de agentes
quimioterapéuticos incluye Adriamicina, Doxorubicina,
5-Fluorouracilo, Citosina arabinósido
("Ara-C"), Ciclofosfamida, Tiotepa, Taxotere
(docetaxel), Busulfán, Gemcitabina, Citoxina, Taxol, Metotrexato,
Cisplatino, Melfalán, Vinblastina, Bleomicina, Etopósido,
Ifosfamida, Mitomicina C, Mitoxantrona, Vincristina, Vinorelbina,
Carboplatino, Tenipósido, Daunomicina, Carminomicina, Aminopterina,
Dactinomicina, Mitomicina, Esperamicinas (véase Patente
Estadounidense Nº 4.675.187), Melfalán y otras mostazas nitrogenadas
relacionadas.
El término "agente citotóxico" tal como se
utiliza aquí se refiere a una sustancia que inhibe o previene la
función de las células y/o provoca la destrucción celular. El
término pretende incluir isótopos radioactivos, agentes
quimioterapéuticos, y toxinas como las toxinas enzimáticamente
activas de origen bacteriano, fúngico, vegetal o animal, o
fragmentos de las mismas.
El término "profármaco" tal como se utiliza
en esta solicitud se refiere a un precursor o forma derivada de una
sustancia farmacéuticamente activa que es menos citotóxica en
células tumorales en comparación con el fármaco parental y que puede
activarse enzimáticamente o convertirse en la forma parental más
activa. Véase, por ejemplo, Wilman, "Prodrugs in Cancer
Chemotherapy" Biochemical Society Transactions, 14, pp.
375-382, 615th Meeting Belfast (1986), y Stella
et al., "Prodrugs: A Chemical Approach to Targeted Drug
Delivery", Directed Drug Delivery, Borchardt et al.,
(ed.), pp. 247-267, Humana Press (1985). Los
profármacos de esta invención incluyen, pero no se limitan a,
profármacos que contienen fosfato, profármacos que contienen
tiofosfato, profármacos que contienen sulfato, profármacos que
contienen péptidos, profármacos con D-aminoácidos
modificados, profármacos glicosilados, profármacos con anillo
\beta-lactámico, profármacos que contienen
fenoxiacetamida opcionalmente sustituida o profármacos que contienen
fenilacetamida opcionalmente sustituida, profármacos con
5-fluorocitosina y otros profármacos con
5-fluorouridina que pueden convertirse en el fármaco
libre citotóxico más activo. Ejemplos de fármacos citotóxicos que
pueden transformarse a la forma de profármaco para su uso en esta
invención incluyen, pero no se limitan a, aquellos agentes
quimioterapéuticos descritos anteriormente.
Tal como se utiliza aquí, "transportador
farmacéuticamente aceptable" incluye cualquier disolvente, medio
de dispersión, recubrimiento, agente antibacteriano y antifúngico,
agente isotónico y retardante de la absorción, y similares que sea
fisiológicamente compatible. Preferiblemente, el transportador es
adecuado para la administración intravenosa, intramuscular,
subcutánea, parenteral o espinal (por ejemplo, mediante inyección o
infusión).
Una "sal farmacéuticamente aceptable" se
refiere a una sal que retiene la actividad biológica deseada del
anticuerpo y no muestra ningún efecto toxicológico indeseado (véase
por ejemplo, Berge, S.M., et al., J. Pharm. Sci. 66 (1977)
1-19). Tales sales están incluidas en la invención.
Ejemplos de tales sales incluyen las sales de adición ácida y
básica. Las sales de adición ácida incluyen aquellas derivadas de
ácidos inorgánicos no tóxicos, como las sales de clorhidrato.
Una composición de la presente invención puede
administrarse mediante una variedad de métodos conocidos en la
materia. Como podrá apreciarse por un experto en la materia, la ruta
y/o modo de administración variará dependiendo de los resultados
deseados.
Para administrar un compuesto de la invención
mediante ciertas vías de administración, puede ser necesario
recubrir el compuesto o coadministrar el compuesto junto con un
material para prevenir su inactivación. Por ejemplo, el compuesto
puede administrarse a un sujeto en un transportador apropiado, por
ejemplo, liposomas o un diluyente. Los diluyentes farmacéuticamente
aceptables incluyen la solución salina y las soluciones de tampón
acuoso.
Los transportadores farmacéuticamente aceptables
incluyen soluciones acuosas estériles o dispersiones y polvos
estériles para la posterior preparación de soluciones o dispersiones
estériles inyectables. El uso de tales medios y agentes para las
sustancias farmacéuticamente activas es conocido en la materia.
Las frases "administración parenteral" y
"administrado por vía parenteral" tal como se utiliza aquí
indican modos de administración diferentes de la administración
enteral y tópica, normalmente por inyección, e incluyen, sin
limitación, la inyección e infusión intravenosa, intramuscular,
intraarterial, intratecal, intracapsular, intraorbital,
intracardíaca, intradermal, intraperitoneal, transtraqueal,
subcutánea, subcuticular, intraarticular, subcapsular,
subaracnoidea, intraespinal, epidural e intraesternal.
Estas composiciones pueden también contener
adyuvantes como los conservantes, agentes humectantes, agentes
emulsificantes y agentes dispersantes. La prevención de presencia de
microorganismos puede asegurarse mediante un proceso de
esterilización, anterior, y mediante la inclusión de varios agentes
antibacterianos y antifúngicos, por ejemplo, parabeno, clorbutanol,
fenol y ácido sórbico. También puede ser deseable incluir en las
composiciones agentes isotónicos, como azúcares o cloruro sódico.
Además, la absorción prolongada de la forma farmacéutica inyectable
puede conseguirrse mediante la inclusión de agentes que retardan la
absorción como el monostearato de aluminio y la gelatina.
Independientemente de la vía de administración
seleccionada, los compuestos de la presente invención, que pueden
utilizarse en una forma hidratada adecuada, y/o las composiciones
farmacéuticas de la presente invención, se formulan en formas de
dosificación farmacéuticamente aceptables mediante los métodos
convencionales conocidos por los expertos en la materia.
Los niveles de dosificación reales de los
ingredientes activos pueden variarse en las composiciones
farmacéuticas de la presente invención con el fin de obtener una
cantidad de ingrediente activo que sea efectiva para alcanzar la
respuesta terapéutica deseada para un paciente en particular,
composición, y modo de administración, sin ser tóxico para el
paciente. El nivel de dosificación seleccionado dependerá de una
variedad de factores farmacocinéticos que incluyen la actividad de
las composiciones particulares empleadas de la presente invención,
la vía de administración, el tiempo de administración, la tasa de
excreción del compuesto particular a emplear, la duración del
tratamiento, otros fármacos, compuestos y/o materiales utilizados en
combinación con las composiciones particulares empleadas, la edad,
sexo, peso, condición, salud general e historia médica previa del
paciente a ser tratado, y factores similares bien conocidos en la
ciencia médica.
La composición debe ser estéril y fluida de modo
que la composición sea dosificable mediante una jeringa. Además del
agua, el transportador es preferiblemente una solución salina
isotónica.
Se puede mantener una fluidez adecuada, por
ejemplo, mediante el uso de recubridores como la lecitina,
manteniendo el tamaño de partícula necesario en el caso de la
dispersión y mediante el uso de tensioactivos. En muchos casos, es
preferible incluir agentes isotónicos en la composición, por
ejemplo, azúcares, polialcoholes como el manitol o sorbitol, y
cloruro de sodio.
Id. de Sec. Nº 1-4 Secuencias de
nucleótido y aminoácidos de los dominios de las regiones variables
de las cadenas ligera y pesada de los anticuerpos 18 y 22.
Id. de Sec. Nº 5 y 6 Secuencias de nucleótido y
aminoácidos del dominio de la región constante humana.
Figura 1 Expresión en superficie de
IGF-IR en cultivos a baja y elevada densidad
celular.
Figura 2 Ensayo WST (células NCI H322M) de
inhibición de la proliferación en cultivo 3D.
Figura 3 Ensayo de formación de colonias para la
inhibición de la proliferación en cultivo 3D (imagen
microscópica).
Figura 4 Ensayo de formación de colonias para la
inhibición de la proliferación en cultivo 3D
(cuantificación).
ctr = control; Cl 18 = anticuerpo 18.
ctr = control; Cl 18 = anticuerpo 18.
Figura 5 Inhibición de la unión de
I^{125}-IGF-I a las células HT29
por los anticuerpos 18 y 22 (valores CI_{50}).
Figura 6 Inhibición de la unión de
I^{125}-IGF-II a las células HT29
por el anticuerpo 18.
Figura 7 Inhibición de la unión de
I^{125}-IGF-II a las células HT29
por el anticuerpo \alphaIR3.
Figura 8 Bloqueo de la fosforilación inducida
por IGF-I tanto por IGF-IR como
Akt/PkB.
Figura 9 No inhibición de la unión de la
insulina-I^{125} a las células
3T3-IR por los anticuerpos
anti-hIGF-1R. (MAX sin Ab: unión
máxima de insulina-I^{125}; MIN: unión mínima tras
la competición con insulina 1 \mum)
Figura 10 Actividades no estimuladoras de AK18
sobre células 3T3 que sobreexpresan IGF-IR.
Figura 11 Actividades no estimuladoras de AK18
sobre células tumorales (HT29) humanas.
Figura 12 Regulación negativa del
IGF-IR expuesto en la superficie de células H322N
por el anticuerpo 18 in vitro.
Figura 13 Tratamiento con AK18, volumen del
tumor primario.
Figura 14 Tratamiento con AK18 con o sin
gemcitabina.
Figura 15 Tratamiento con AK18, volumen del
tumor primario.
Los hibridomas generados con HuMAb se cultivaron
en Hybridoma Express Medium (PAA Laboratories GmbH, Austria)
suplementeados con L-glutamina 2 mM (BioWhittaker) y
Origen Cloning Factor al 4% (Igen, Francia) a 37ºC y CO_{2} al
5%.
Diez ratones transgénicos HCo7 (4 machos y 6
hembras), cepa GG2201 (Medarex, San José, CA, USA) se inmunizaron
de forma alterna con 1x10^{6} células NIH 3T3, se transfectaron
con un vector de expresión para IGF-IR, y
20 \mug de dominio extracelular soluble de IGF-IR. Se realizaron seis inmunizaciones en total, tres inmunizaciones intraperitoneales (IP) con las células que expresan IGF-IR y tres inmunizaciones subcutáneas (SC) en la base de la cola con la proteína recombinante. Para la primera inmunización, 100 \mul de 1x10^{6} células NIH 3T3 que expresan IGF-IR se mezclaron con 100 \mul de adyuvante completo de Freunds (CFA; Difco Laboratories, Detroit, USA). Para el resto de inmunizaciones, se utilizaron 100 \mul de células en PBS o la proteína recombinante se mezcló con 100 \mul de adyuvante incompleto de Freunds (ICFA; Difco).
20 \mug de dominio extracelular soluble de IGF-IR. Se realizaron seis inmunizaciones en total, tres inmunizaciones intraperitoneales (IP) con las células que expresan IGF-IR y tres inmunizaciones subcutáneas (SC) en la base de la cola con la proteína recombinante. Para la primera inmunización, 100 \mul de 1x10^{6} células NIH 3T3 que expresan IGF-IR se mezclaron con 100 \mul de adyuvante completo de Freunds (CFA; Difco Laboratories, Detroit, USA). Para el resto de inmunizaciones, se utilizaron 100 \mul de células en PBS o la proteína recombinante se mezcló con 100 \mul de adyuvante incompleto de Freunds (ICFA; Difco).
Se determinó la titulación de
anti-IGF-IR en suero de los ratones
inmunizados mediante ELISA específico de antígeno. El dominio
extracelular soluble de IGF-IR a una concentración
de 1 \mug/ml en PBS se recubrió durante la noche a 4ºC, o durante
dos horas a 37ºC, en placas de 96 pocillos. Posteriormente, los
pocillos se bloquearon con PBSTC (PBS suplementado con Tween®-20 al
0,05% y suero de pollo al 2% (Gibco BRL)) durante 1 hora (h) a
temperatura ambiente. La primera extracción de suero se diluyó 1/50
en PBSTC, los sueros del resto de extracciones se
pre-diluyeron 1/100 en PBSTC y se diluyeron de forma
seriada hasta 1/6400. Los sueros diluidos se añadieron a los
pocillos y se incubaron durante 1 h a 37ºC. El suero preextracción
se utilizó como control negativo. Se utilizó como control positivo
200 ng/ml de anticuerpo de cabra
anti-IGF-IR humano (100 \mug/ml).
Posteriormente, las placas se lavaron dos veces con PBST y se
incubaron con F(ab')2 de rata anti-IgG humano
conjugado con peroxidasa de rábano picante (HRP) de (DAKO), diluido
1/2000 en PBSTC durante 1 h a 37ºC. Los pocillos se lavaron dos
veces con PBST y se realizaron los ensayos con solución ABTS® recién
preparada (1 mg/ml) (ABTS: 2,2'-azino bis (ácido
3-etilbenzotiazolina-6-sulfónico)
durante 30 minutos a temperatura ambiente (TA) en la oscuridad. Se
midió la absorbancia a 405 nm.
Además de la determinación mediante ELISA
específico de antígeno, se determinaron también las titulaciones de
anti-IGF-IR en suero de ratones
inmunizados mediante análisis por FACS. Se incubaron células NIH 3T3
IGF-IR y células NIH 3T3 IGF-IR no
transfectadas con suero diluido durante 30 minutos a 4ºC. El suero
preextracción se añadió como control negativo. Inicialmente, se
utilizó como control positivo 200 ng/ml de anticuerpo de cabra
anti-IGF-IR humano. Las células se
lavaron tres veces en PBS suplementado con suero de albúmina bovina
al 1% y azida al 0,01%. Posteriormente, se incubaron las células con
fragmentos de unión a antígeno (fragmentos F(ab')2) de rata
anti- IgG humano conjugadas con isotiocianato de fluoresceína (FITC)
diluidos 1/100 en tampón FACS, durante 30 minutos a 4ºC. Las células
se lavaron dos veces en tampón FACS y se analizaron las muestras en
un FACSCalibur (Becton Dickinson, Erembodegem- Aalst, Bélgica).
Cuando la titulación de los sueros de
anti-IGF-IR fueron suficientes, los
ratones se inyectaron adicionalmente dos veces con 15 \mug de
dominio extracelular de IGF-IR en 200 \mul de PBS
intravenoso (i.v.) 4 y 3 días antes de la fusión.
Los ratones se sacrificaron y se les extrajo el
bazo y los nodos linfáticos circundantes de la aorta abdominal y la
vena cava. La fusión de los esplenocitos y de las células de los
nodos linfáticos con las células pareja de fusión SP 2/0 se realizó
según los procedimientos operativos estándar.
Para determinar si los hibridomas que resultan
de la fusión, generan anticuerpos humanos, se realizó un
k-ELISA. Las placas de ELISA se recubrieron con
anticuerpo de rata anti-cadena ligera \kappa de
IgG humana (DAKO) diluido 1/10000 en PBS mediante incubación
durante la noche a 4ºC. Tras vaciar los pocillos, las placas se
bloquearon mediante la incubación con PBSTC durante 1 hora a
temperatura ambiente. Tras esto, los pocillos se incubaron con
sobrenadante de cultivo de hibridoma, diluido 1/2 en PBSTC. Se
utilizó medio de cultivo diluido 1/2 en PBSTC como control negativo
y se utilizó como control positivo el suero positivo de ratón de la
cadena ligera \kappa diluido 1/100 en PBSTC. Posteriormente, los
pocillos se lavaron tres veces y se incubaron con F(ab')2 de
rata anti-IgG humano conjugado con HRP de (DAKO),
diluido 1/2000 en PBSTC durante 1 h a 37ºC. Los pocillos se lavaron
tres veces y los ensayos se realizaron con solución ABTS® recién
preparada (1 mg/ml) durante 30 minutos a temperatura ambiente (TA)
en la oscuridad. Se midió la absorbancia a 405 nm en un lector de
placas de ELISA.
Se prepararon los anticuerpos monoclonales 18 y
22.
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Instrumento: BIACORE® 3000
Chip: CM5
Acoplamiento: acoplamiento de amina
Tampón: HBS (HEPES, NaCl), pH 7,4, 25ºC
Para las mediciones de afinidad de los
anticuerpos anti FC\gamma humano (de conejo) se acoplaron a la
superficie del chip para la presentación del anticuerpo frente a
IGF-IR. El dominio extracelular de
IGF-IR se añadió a varias concentraciones en
solución. La asociación se midió mediante una inyección de
IGF-IR de 3 minutos; la disociación se midió
mediante lavado de la superficie del chip con tampón durante 5
minutos. Los datos de afinidad para los anticuerpos 18 y 22 se
muestran en la Tabla 1.
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\vskip1.000000\baselineskip
Las células NCI H322M se cultivaron en medio
RPMI sobre cubreobjetos de vidrio de grado óptico a baja densidad o
superconfluente para estudiar los efectos sobre la expresión en
superficie de IGF-IR. En paralelo, el tejido de
xenoinjerto de H322M aislado del grupo control (ratones no tratados)
se congeló de forma instantánea en isopentano y se cortaron
criosecciones de un espesor de 5 \mum. El marcaje con
inmunofluorescencia se realizó utilizando un anticuerpo monoclonal
de ratón anti IGF-IR (\alphaIR3, 5 \mug/ml) o un
anticuerpo de acuerdo con la invención, seguido de un anticuerpo de
cabra anti-ratón o un anticuerpo de cabra
anti-ratón marcado con Cy3 (Amersham Biosciences,
GB) o Alexa Fluor® 488 (Molecular Probes, Inc., USA). Las muestras
se fotografiaron en un microscopio confocal Leica SP2 o se
analizaron mediante FACS.
Cuando las células H322M cultivadas a alta
densidad se fotografiaron mediante microscopía confocal, fue
evidente que el IGF-IR se agrupaba específicamente
en los lugares de contacto célula-célula. Cuando se
compara con el crecimiento de las células H322M in vivo, por
ejemplo, en tejido de xenotrasplante, existe una fuerte similitud
con los cultivos in vitro densamente empaquetados al menos en
lo que se refiere a la organización de los receptores de
IGF-I en superficie.
La regulación positiva del receptor de
IGF-I en superficie en cultivos superconfluentes de
las células H322M también se cuantificó mediante FACS. La expresión
del receptor de IGF-I en superficie aumentó más de
10 veces cuando las células se cultivaron bajo condiciones de alta
densidad en comparación con las condiciones de baja densidad sin
contactos célula-célula significativos.
Otras células tumorales como las HT29, MDA231 y
MCF-7 mostraron un comportamiento similar, indicando
que la regulación positiva de los receptores de
IGF-I en la superficie celular tras establecer los
lugares de contacto célula-célula no es una
característica única de las células H322M sino que parece ser una
propiedad general de una organización más similar a tejido que
también se encuentra in vivo (Fig. 1).
Las células H322M se cultivaron en medio
RPMI1640/FCS al 0,5% sobre placas cubiertas con
poli-HEMA
(poli(2-hidroxietilmetacrilato)) para
prevenir la adherencia a la superficie plástica. Bajo estas
condiciones, las células H322M forman esferoides densos que crecen
de forma tridimensional (una propiedad que se denomina independencia
de anclaje). Estos esferoides se parecen mucho a la
histoarquitectura tridimensional y a la organización de tumores
sólidos in situ. Los cultivos esferoides se incubaron durante
5 días en presencia de cantidades incrementales de anticuerpos entre
0-240 nM. El ensayo de conversión WST se utilizó
para medir la inhibición de crecimiento. Cuando los cultivos
esferoides de H322M se trataron con concentraciones diferentes de
anticuerpo 18 (1-240 nM), se pudieron observar una
inhibición dependiente de dosis en el crecimiento (Fig. 2).
Las células H322M se cultivaron en medio
RPMI1640/ NCS al 10% sobre placas cubiertas con
poli-HEMA para prevenir la adherencia a la
superficie plástica. Bajo estas condiciones, las células H322M
forman esferoides densos que crecen de forma tridimensional (una
propiedad que se denomina independencia de anclaje). Estos
esferoides representan la histoarquitectura tridimensional y la
organización de tumores sólidos in situ. Los cultivos
esferoides se incubaron durante 5-10 días en
presencia de cantidades incrementales de anticuerpos entre
0-7,5 \mug/ml. El anticuerpo monoclonal
<HBV> se utilizó como control negativo. Las colonias se
fotografiaron en un microscopio invertido (Zeiss Axiovert)
utilizando un contraste de fase y se contó utilizando un sistema de
captura de imágenes automatizado (MetaMorph). Cuando los cultivos de
esferoides de H322M se trataron con diferentes concentraciones
(0,5-7,5 \mug/ml) de anticuerpo 18, se pudo
observar una inhibición dependiente de dosis en el crecimiento,
mientras que el anticuerpo control <HBV> tuvo poco efecto o
ninguno. Tanto el número como el tamaño de las colonias se redujo
claramente en los cultivos tratados con 7,5 \mug/ml de anticuerpo
18 (Fig. 3).
El análisis cuantitativo de las colonias mayores
de 100 \mum de diámetro reveló que el número de colonias se redujo
en cerca de un 66% en los cultivos tratados con 0,5 \mug/ml de
anticuerpo 18 (Fig. 4).
Para poder determinar la capacidad del
anticuerpo de la invención para bloquear la unión de los ligandos
IGF-I e IGFII al receptor de IGF-I
(IGF-IR), se realizaron experimentos de competición
con péptidos ligando marcados radiactivamente.
Las células tumorales humanas (HT29, NCI H322M,
0,5 a 1 x 10^{5}/ml) se plaquearon en medio RPMI 1640 (PAA, Nº de
Cat. E15-039) suplementado con
L-Glutamina 2 mM, aminoácidos no esenciales 1x
(Gibco, Nº de Cat. 11140-035), piruvato sódico 1 mM
(Gibco, Nº de Cat. 11360-039) y FCS al 10%
inactivado con calor (PAA, Nº de Cat. A15-771). Se
inocularon seis botellas en el formato T175 con 20 ml de células en
los correspondientes medios para cada experimento y se cultivaron
durante dos días a 37ºC y CO_{2} al 5% para obtener monocapas de
células confluentes.
Para recoger células individuales, se añadieron
2 ml de 1x Tripsina/EDTA (Gibco, Nº de Cat.
25300-054) por frasco de T175 y la separación de las
células se monitorizó con un microscopio Zeiss Axiovert25. Las
células se recogieron y se añadió medio con FCS al 10% como se ha
descrito antes hasta un volumen total de 50 ml. Las células se
reaislaron mediante centrifugación durante 10 minutos a 1000 rpm
(Heraeus sepatech, Omnifuge 2,0 RS) y se resuspendieron en 50 ml de
tampón de unión (NaCl 120 mM, KCl 5 mM, MgSO_{4} 1,2 mM, EDTA 1
mM, D(+)glucosa 10 mM, NaAc 15 mM, Hepes 100 mM pH 7,6, BSA 1%). Las
células se contaron, se reaislaron mediante centrifugación y se
ajustó con tampón de unión hasta 1 x 10^{6} células/ml.
Los péptidos IGF-I y
IGF-II marcados con I^{125} (Amersham, \sim2000
Ci/mmol, Nº de Cat. IM172 y IM238), solubilizados en CH_{3}COOH al
0,1%, se diluyeron en tampón de unión hasta una actividad final de 4
x 10^{5} cuentas/(minuto x ml). Se añadieron 75 \mul de
anticuerpo en las concentraciones especificadas junto con 25 \mul
de péptido IGF-I o IGF-II marcados
con I^{125} prediluidos a 200 \mul de suspensión celular y se
incubaron durante 3,5 h a 4ºC. Las células se reaislaron mediante
centrifugación durante 5 minutos a 2000 rpm (Eppendorf, 5415C) y se
eliminó el sobrenadante. Tras lavar dos veces en 1 ml de tampón de
unión, las células se resuspendieron en 1 ml de tampón de unión y se
transfirieron a tubos de centelleo. La cantidad de péptido
radioactivo unido a los receptores de superficie celular se midió en
un contador de centelleo.
Las curvas de CI_{50} resultantes, que
demostraron la capacidad del anticuerpo para inhibir la unión de los
péptidos IGF-I e IGF-II al receptor
de IGF-I, se muestran en las Figs. 5 y 6. El valor
medio de CI_{50} para el anticuerpo 18 es 0,3 nM. Los resultados
para el anticuerpo \alphaIR3 se muestran en la Fig. 7. No pudo
observarse inhibición detectable para la unión de
IGF-II.
Para realizar un mapeo de epítopos de
anticuerpos monoclonales
anti-IGF-IR, se seleccionó un
formato similar al de la medición de afinidad (Ejemplo 2), pero el
IGF-IR se preincubó durante al menos 0,5 horas a TA
con el anticuerpo en solución. Esta mezcla se inyectó y se detectó
la unión de IGF-IR (o inhibición). Este ensayo
permite la medición de la actividad inhibidora recíproca de los
anticuerpos monoclonales para la unión al IGF-IR. Se
encontró que los anticuerpos de la invención compiten por la unión
al IGF-IR con \alphaIR3, que es un anticuerpo que
se sabe que se une a los aa 217-274 (Gustafson,
T.A., y Rutter, W.J., J. Biol. Chem. 265 (1990)
18663-18667).
Para poder determinar la capacidad del
anticuerpo de la invención de inhibir la activación y fosforilación
del receptor de IGF-I (IGF-IR), se
realizaron experimentos de competición con el péptido
IGF-I y el posterior análisis de Western blot con
anticuerpos específicos para la tirosina fosforilada.
Las células tumorales humanas (HT29, NCI H322M,
5 x 10^{4}/ml) se plaquearon en medio RPMI 1640 (PAA, Nº de Cat.
E15-039) suplementado con
L-Glutamina 2 mM, aminoácidos no esenciales 1x
(Gibco, Nº de Cat. 11140-035), piruvato sódico 1 mM
(Gibco, Nº de Cat. 11360-039) y FCS al 0,5%
inactivado por calor (PAA, Nº de Cat. A15-771). Para
la determinación de los valores de CI_{50}, se inocularon placas
de 12 pocillos con 1 ml de células en el medio correspondiente para
cada experimento y se cultivaron durante dos días a 37ºC y CO_{2}
al 5%.
Tras 48 horas de cultivo con medio bajo en
suero, el suero se eliminó cuidadosamente y se sustituyó por medio
con diferentes concentraciones de anticuerpo diluido. Tras 5 minutos
de incubación a 37ºC y CO_{2} al 5%, se añadió el péptido de
IGF-I a una concentración final de 2 nM y las
células se incubaron de nuevo durante 10 minutos bajo las
condiciones mencionadas anteriormente. El medio se eliminó
cuidadosamente mediante aspiración y se añadió 100 \mul de tampón
de lisis frío por pocillo (Hepes 50 mM pH 7,2, NaCl 150 mM, EGTA 1
mM, glicerol al 10%, Triton®-X100 al 1%, NaF 100 mM,
Na_{4}P_{2}O_{7} 10 mM, inhibidor de proteasa Complete®). Las
células se despegaron utilizando un raspador celular (Corning, Nº de
Cat. 3010) y el contenido de los pocillos se transfirió a tubos de
reacción Eppendorf. Los fragmentos celulares se eliminaron por
centrifugación durante 10 minutos a 13000 rpm y 4ºC y la mitad del
sobrenadante se añadió a tampón de muestras de Laemmli 2x en una
proporción 1:1 (v/v). Para la inmunoprecipitación de
IGF-IR, el resto de sobrenadante de los lisados
celulares se sometió a una centrifugación de clarificado (10
minutos a 13000 rpm y 4ºC) justo después se añadió 1 \mul de un
anticuerpo policlonal anti IGF-IRß
(C-20, Santa Cruz Biotechnologies) o un anticuerpo
monoclonal murino (IgG1) que reconoce un epítopo entre los
aminoácidos 440-586 del dominio extracelular (cadena
\alpha) del receptor humano de IGF de tipo 1 (mAb
24-55, GroPep). Tras 2 horas de incubación a 4ºC en
un tubo de reacción Eppendorf rotatorio, se añadió 25 \mul de
cuentas de Proteína G Sepharose® (Amersham Biosciences, Nº de Cat.
17-0618-01) seguido de otro paso de
incubación de 1 hora a 4ºC. Las cuentas con complejos de
anticuerpo-proteína unido se aislaron por
centrifugación (1 minuto a 2000 rpm y 4ºC) y se lavaron tres veces
con tampón de lavado (tampón de lisis con solo Triton®-X100 al
0,1%). Tras hervir las cuentas en tampón de muestras de Laemmli, las
proteínas celulares se separaron mediante SDS-PAGE y
se transfirieron a una membrana de nitrocellulosa (PROTRAN® BA 85,
Schleicher&Schuell) mediante Western blot semi seco.
Un anticuerpo específico de fosfotirosina
(Upstate, clon 4G10, Nº de Cat. 05-321) se utilizó
para determinar el estado de fosforilación del
IGF-IR inmunopurificado. Para la detección de
Akt/PKB fosforilado, se aplicó un anticuerpo con especificidad para
la Ser473 fosforilada (Cell Signalling, Nº de Cat. 9271).
El bloqueo de la fosforilación observado de
ambos IGF-IR y Akt/PKB inducido por
IGF-I se muestra en la Fig. 8.
Para poder detectar los efectos del anticuerpo
de la invención sobre la cantidad de receptores de
IGF-I (IGF-IR) en células tumorales,
se realizaron experimentos con seguimiento a lo largo del tiempo y
un posterior análisis por western blot con anticuerpos específicos
de IGF-IR.
Las células tumorales humanas (HT29, 5 x
10^{4} células/ml) se plaquearon en medio RPMI 1640 (PAA, Nº de
Cat. E15-039) suplementado con
L-Glutamina 2 mM, aminoácidos no esenciales 1x
(Gibco, Nº de Cat. 11140-035), piruvato sódico 1 mM
(Gibco, Nº de Cat. 11360-039) y FCS al 10%
inactivado por calor (PAA, Nº de Cat. A15-771). Para
cada periodo de incubación se inoculó una placa de 12 pocillos con 1
ml de células en el correspondiente medio para cada experimento y se
cultivó durante 24 horas a 37ºC y CO_{2} al 5%.
El medio se eliminó cuidadosamente y se
sustituyó por medio con diferentes concentraciones de anticuerpo
diluido. En dos pocillos control, el medio se sustituyó por medio
sin anticuerpo o medio con un anticuerpo control
(AB-1, Oncogene, Nº de Cat. GR11). Las células se
incubaron a 37ºC y CO_{2} al 5% y las placas individuales se
retiraron para un posterior procesado tras 15 minutos, 24 horas y 48
horas.
El medio se eliminó cuidadosamente por
aspiración y se añadió 100 \mul de tampón de lisis frío por
pocillo (Hepes
50 mM pH 7,2, NaCl 150 mM, EGTA 1 mM, glicerol 10%, Triton®-X100 1%, NaF 100 mM, 10 mM Na_{4}P_{2}O_{7}, inhibidor de proteasa Complete®). Las células se despegaron utilizando un raspador celular (Corning, Nº de Cat. 3010) y el contenido de los pocillos se transfirió a tubos de reacción Eppendorf. Los fragmentos celulares se eliminaron por centrifugación durante 10 minutos a 13000 rpm y 4ºC y el sobrenadante se añadió a tampón de muestras de Laemmli 2x en una proporción 1:1 (v/v). Las proteínas celulares se separaron mediante SDS PAGE y se transfirieron a una membrana de nitrocelulosa (PROTRAN® BA 85, Schleicher&Schuell, Nº de Cat. 10 401196) mediante western blot semi seco.
50 mM pH 7,2, NaCl 150 mM, EGTA 1 mM, glicerol 10%, Triton®-X100 1%, NaF 100 mM, 10 mM Na_{4}P_{2}O_{7}, inhibidor de proteasa Complete®). Las células se despegaron utilizando un raspador celular (Corning, Nº de Cat. 3010) y el contenido de los pocillos se transfirió a tubos de reacción Eppendorf. Los fragmentos celulares se eliminaron por centrifugación durante 10 minutos a 13000 rpm y 4ºC y el sobrenadante se añadió a tampón de muestras de Laemmli 2x en una proporción 1:1 (v/v). Las proteínas celulares se separaron mediante SDS PAGE y se transfirieron a una membrana de nitrocelulosa (PROTRAN® BA 85, Schleicher&Schuell, Nº de Cat. 10 401196) mediante western blot semi seco.
Se utilizó un anticuerpo específico para
IGF-IR (C-20, Santa Cruz
Biotechnologies, Nº de Cat. sc-713) para determinar
los niveles de proteína de IGF-IR.
Se observó una regulación negativa del
IGF-IR inducida por el anticuerpo de la invención
después de menos de 24 horas tras la adición del anticuerpo.
Para poder determinar si el anticuerpo de la
invención también bloquea la unión de la insulina al receptor de la
insulina (IR), se realizaron experimentos de competición con un
péptido ligando marcado radiactivamente.
Las células 3T3 (1 x 10^{5}/ml) que expresan
de forma recombinante un gran número (> 10^{5}) de IR humano se
plaquearon en medio MEM de Dulbecco (DMEM) con mucha glucosa (PAA,
Nº de Cat. E15-009) suplementado con
L-Glutamina 2 mM (Gibco, Nº de Cat.
25030-024) y FCS al 10% inactivado por calor (PAA,
Nº de Cat. A15-771). Se inocularon seis botellas en
el formato T175 con 20 ml de células en el medio correspondiente
para cada experimento y se cultivaron durante dos días a 37ºC y
CO_{2} al 5% para obtener monocapas celulares confluentes.
Para recoger células individuales, se añadieron
2 ml de 1x Tripsina/EDTA (Gibco, Nº de Cat.
25300-054) por frasco de T175 y el despegue de las
células se monitorizó con un microscopio. Las células se recogieron
y se añadió medio con FCS al 10% tal como se ha descrito antes en un
volumen total de 50 ml. Las células se reaislaron mediante
centrifugación durante 10 minutos a 1000 rpm y se resuspendieron en
50 ml de tampón de unión (NaCl 120 mM, KCl 5 mM, MgSO_{4} 1,2 mM,
EDTA 1 mM, D(+)glucosa 10 mM, NaAc 15 mM, Hepes 100 mM pH 7,6, BSA
al 1%). Las células se contaron, se reaislaron mediante
centrifugación y se ajustaron con tampón de unión a 1 x 10^{6}
células/ml.
El péptido de insulina marcado con I^{125}
(Amersham, Nº de Cat. IM166, \sim2000 Ci/mmol), solubilizado
en
CH_{3}COOH al 0,1%, se diluyó en tampón de unión hasta una actividad final de 4*10^{5} cuentas/(minuto*ml). Se añadieron 75 \mul de anticuerpo junto con 25 \mul de péptido de insulina marcado con I^{125} prediluido a 200 \mul de suspensión celular (concentración final de anticuerpo 200 nM) y se incubó durante 3,5 h a 4ºC. Las células se reaislaron mediante centrifugación durante 5 minutos a 2000 rpm y se eliminó el sobrenadante. Tras lavar dos veces en 1 ml de tampón de unión, las células se resuspendieron en 1 ml de tampón de unión y se transfirieron a tubos de centelleo. La cantidad de péptido radioactivo unido a los receptores de la superficie celular se midió en un contador de centelleo.
CH_{3}COOH al 0,1%, se diluyó en tampón de unión hasta una actividad final de 4*10^{5} cuentas/(minuto*ml). Se añadieron 75 \mul de anticuerpo junto con 25 \mul de péptido de insulina marcado con I^{125} prediluido a 200 \mul de suspensión celular (concentración final de anticuerpo 200 nM) y se incubó durante 3,5 h a 4ºC. Las células se reaislaron mediante centrifugación durante 5 minutos a 2000 rpm y se eliminó el sobrenadante. Tras lavar dos veces en 1 ml de tampón de unión, las células se resuspendieron en 1 ml de tampón de unión y se transfirieron a tubos de centelleo. La cantidad de péptido radioactivo unido a los receptores de la superficie celular se midió en un contador de centelleo.
Los resultados demuestran que el anticuerpo de
la invención no interfiere con la unión del ligando de insulina al
receptor de insulina (Fig. 9).
Para poder excluir las actividades estimuladoras
del anticuerpo de la invención sobre el IGF-IR, se
determinó la fosforilación del IGF-IR en ausencia
del ligando IGF-I pero en presencia del anticuerpo
de la invención y un anticuerpo de referencia (\alphaIR3,
Oncogene, Alemania). Esta se realizó mediante un análisis western
blot con anticuerpos específicos para el estado de fosforilación.
Las células 3T3 (ATCC CRL 1658) transfectadas con
IGF-IR (5*10^{4} células/ml, Pietrzkowski, Z.,
et al., cell Growth Differ. 4 (1992) 199-205)
se plaquearon en medio MEM de Dulbecco (DMEM) con mucha glucosa
(PAA, Nº de Cat. E15-009) suplementado con
L-Glutamina 2 mM (Gibco, Nº de Cat.
25030-024) y FCS al 0,5% inactivado por calor (PAA,
Nº de Cat. A15-771) o células tumorales humanas
(HT29, NCI H322M, 5*10^{4}/ml) en medio RPMI 1640 (PAA, Nº de Cat.
E15-039) suplementado con
L-Glutamina 2 mM, 1x aminoácidos no esenciales
(Gibco, Nº de Cat. 11140-035), piruvato sódico 1 mM
(Gibco, Nº de Cat. 11360-039) y FCS al 0,5%
inactivado por calor (PAA, Nº de Cat. A15-771). Para
la determinación de los valores de CI_{50}, se inocularon placas
de 12 pocillos con 1 ml de células en el correspondiente medio para
cada experimento y se cultivaron durante dos días a 37ºC y CO_{2}
al 5%.
Tras 48 horas de cultivación con medio bajo en
suero, el medio se eliminó cuidadosamente y se sustituyó por
diferentes concentraciones de anticuerpo diluido en el medio
correspondiente. Las células se incubaron durante 15 minutos bajo
las condiciones mencionadas anteriormente. El medio se eliminó
cuidadosamente por aspiración y se añadió 100 \mul de tampón de
lisis frío por cada pocillo (Hepes 50 mM pH 7,2, NaCl 150 mM, EGTA 1
mM, glicerol al 10%, Triton-X100 al 1%, NaF 100 mM,
Na_{4}P_{2}O_{7} 10 mM, inhibidor de proteasa
Complete^{TM}). Las células se despegaron utilizando un raspador
celular (Corning, Nº de Cat. 3010) y el contenido de los pocillos
se transfirió a tubos de reacción Eppendorf. Los fragmentos
celulares se eliminaron por centrifugación durante 10 minutos a
13000 rpm y 4ºC (centrífuga Eppendorf 5415R) y la mitad del
sobrenadante se añadió a tampón de muestras de Laemmli 2x en una
proporción 1:1 (v/v). Para la inmunoprecipitación de
IGF-IR, el resto de sobrenadante de los lisados
celulares se sometió a una centrifugación de clarificado (10 minutos
a 13000 rpm y 4ºC) justo después se añadió 1 \mul de un anticuerpo
anti IGF-IR (C-20, Santa Cruz
Biotechnologies, Nº de Cat. sc-713 o mAb
24-55, GroPep, Nº de Cat. MAD1). Tras 2 horas de
incubación a 4ºC en un tubo de reacción Eppendorf rotatorio, se
añadió 25 \mul de cuentas de Proteína G Sepharose® (Amersham
Biosciences, Nº de Cat. 17-0618-01)
seguido de otro paso de incubación de 1 hora a 4ºC. Las cuentas con
complejos de anticuerpo-proteína unido se aislaron
por centrifugación (1 minuto a 2000 rpm y 4ºC) y se lavaron tres
veces con tampón de lavado (tampón de lisis con solo Triton®-X100 al
0,1%). Tras hervir las cuentas en tampón de muestras de Laemmli, las
proteínas celulares se separaron mediante SDS-PAGE y
se transfirieron a una membrana de nitrocellulosa (PROTRAN® BA 85,
Schleicher&Schuell, Nº de Cat. 10 401196) mediante Western blot
semi seco.
Se utilizó un anticuerpo específico de
fosfotirosina (Upstate, clon 4G10, Nº de Cat.
05-321, que reconoce proteínas con la tirosina
fosforilada) para determinar el estado de fosforilación del
IGF-IR inmunopurificado. Para la detección de
Akt/PKB fosforilado, se aplicó un anticuerpo frente a Akt1 con
especificidad para la Ser473 fosforilada (Cell Signalling, Nº de
Cat. 9271).
Se observó que la quinasa Akt/PKB corriente
abajo en la ruta de señalización de IGF-IR estaba
significativamente activada por el anticuerpo de referencia a
concentraciones superiores a 5 nM pero no por el anticuerpo de la
invención a concentraciones hasta 10.000 nM. Los resultados se
muestran en las Figs. 10 y 11 (HM = medio bajo en suero con FCS al
0,5%, HM+IGFI = medio bajo en suero con FCS al 0,5% y
hIGF-I 10 nM).
Se indujeron tumores en ratones desnudos y se
trataron una vez con diferentes concentraciones de anticuerpo de la
invención. 24 horas después del tratamiento, se extrajeron los
tumores y se homogeneizaron bajo nitrógeno líquido. Se añadió tampón
de lisis frío (Hepes 50 mM pH 7,2, NaCl 150 mM, EGTA 1 mM, glicerol
al 10%, Triton-X100 al 1%, NaF 100 mM,
Na_{3}VO_{4} 1 mM, Na_{4}P_{2}O_{7} 10 mM, inhibidor de
proteasa Complete^{TM}, PMSF 1 mM) en una proporción de volumen de
tampón respecto al peso del tumor de 3:1 y se mezcló de forma
intensa con el homogenado del tumor descongelado. Tras solubilizar
el tejido durante 15 minutos en hielo, se eliminaron los fragmentos
insolubles mediante centrifugación durante 10 minutos a 13000 rpm y
4ºC (centrífuga Eppendorf 5415R). La concentración de proteína de
las muestras se determinó con los reactivos Micro BCA^{TM} de
(Pierce) y se añadió el tampón de lisis para ajustar a
concentraciones iguales. Parte del sobrenadante se añadió al tampón
de muestras 2x de Laemmli en una proporción 1:1 (v/v). Las proteínas
celulares se separaron mediante SDS-PAGE y se
transfirieron a una membrana de nitrocelulosa (PROTRAN BA 85,
Schleicher&Schuell, Nº de Cat. 10 401196) mediante western blot
semiseco. Se utilizó un anticuerpo específico de
IGF-IR (C-20, Santa Cruz
Biotechnologies, Nº de Cat. sc-713) para detectar
el
IGF-IR.
IGF-IR.
Tras el tratamiento con el anticuerpo de la
invención, se observó una concentración dependiente de la
disminución de los niveles de IGF-IR con una
CE_{50} estimada a 0,6 mg/kg (Figura 12).
\vskip1.000000\baselineskip
Para determinar la capacidad de los anticuerpos
de acuerdo con la invención de fijar C1q, se utilizó un ensayo de
ELISA. C1q es parte del sistema inmunitario adquirido y, tras la
unión a complejos inmunes, dispara la activación secuencial de
varios zimógenos. Las enzimas a su vez, provocan la escisión de
moléculas C3, que pueden resultar en la activación de reacciones
inflamatorias, opsonización de partículas extrañas o aberrantes y
lisis de las membranas celulares.
En principio, la placa de ELISA se recubre con
rangos de concentración del anticuerpo, al que se le añade C1q
humano. La unión de C1q se detecta mediante un anticuerpo dirigido
frente a C1q humano seguido del conjugado de peroxidasa marcado.
Los anticuerpos 18, 8 y 23 y los anticuerpos
control se probaron en concentraciones de 10, 5, 1 y 0,5 \mug/ml.
La Tabla 1 muestra las especificidades de las muestras probadas.
Como control negativo se utilizó un IgG4 humano (CLB, reserva de 0,5
\mug/ml), que se une a C1q de forma muy débil. La IgG1 humana se
incorporó como control positivo. Se utilizó la solución de reserva
del C1q humano con una concentración de 2 \mug/ml. Para la
detección de C1q se utilizó un anticuerpo de conejo dirigido contra
C1q (Dako) y un anticuerpo anti IgG de conejo, conjugado con
peroxidasa de rábano picante (Sigma).
Los cálculos referentes a la unión máxima (Bmax)
del HuMAb ensayado se determinó utilizando un ajuste de la curva de
regresión no lineal (unión de un sitio) utilizando un programa
Graphpad Prism.
Los anticuerpos de acuerdo con la invención
muestran una unión a la proteína C1q humana dependiente de la dosis.
La densidad óptica a 405 nm (DO 405 nm) se representó frente a las
concentraciones de HuMAb y las curvas se ajustaron utilizando una
regresión no lineal. Los valores con mejor ajuste a la unión máxima
(Bmax) se enumeran en la Tabla 2, así como el coeficiente de
correlación de la curva (R2) y la desviación estándar para cada
valor. El menor coeficiente de correlación presenta un valor de
0,950 (IgG4). Con una unión máxima de 0,279, el IgG4 humano
(control negativo) muestra la unión mínima de C1q. Los controles
positivos IgG1 y IgG3 se unen a C1q, como muestra su unión máxima de
1,729 y 2,223, respectivamente.
\vskip1.000000\baselineskip
El coeficiente de correlación (R2) y la
desviación estándar también se registran.
En comparación con la unión a C1q del IgG4
humano (control negativo, con una D.O. de 0,279), todos los
anticuerpos probados son igualmente capaces de fijarse a C1q.
\vskip1.000000\baselineskip
Para poder determinar la capacidad de los
anticuerpos HuMAb generados para discernir los mecanismos inmuno
efectores, se realizaron estudios de citotoxicidad dependiente de
complemento (CDC) y citotoxicidad celular dependiente de anticuerpo
(ADCC).
Para estudiar la CDC (National Cancer Institute,
se marcaron las líneas celulares de adenocarcinoma de pulmón),
H322M, H460 y células NIH 3T3 (2-6 x 10^{6}) con
100 \muCi de ^{51}Cr durante 45-120 minutos
(Amersham Pharmacia Biotech, UK, Cat CJS11). Tras marcar las
células, éstas se lavaron dos veces con 40 ml de PBS y se
centrifugaron durante 3 minutos a 1500 rpm. Las células se
plaquearon entonces a 5.000 por pocillo en una placa de fondo
redondeado, en un volumen de 50 \mul. Los anticuerpos se añadieron
a una concentración final en el rango de 25-0,1
\mug/ml en un volumen de 50 \mul de medio de cultivo celular a
50 \mul de suspensión celular y se incubaron durante
30-60 minutos. Tras la incubación, se eliminó el
exceso de anticuerpo mediante dos lavados con PBS. Se añadieron 100
\mul de suero reunido humano, de cobaya, conejo o ratón desnudo
activo o inactivo (30 minutos a 56ºC) diluido entre
1/3-1/30, y las células se incubaron durante 3
horas, tras las cuales las células se centrifugaron a 1500 rpm
durante 3 minutos. Se separó 100 \mul del sobrenadante, se
transfirió a tubos de polipropileno y se contó en un contador g.
Para estudiar los efectos de los anticuerpos en
la ADCC, se marcaron células H322M, H460 y NIH 3T3 u otras células
adecuada que expresan IGF-IR (2-6 x
10^{6}) con 100 \muCi ^{51}Cr durante 45-120
minutos (Amersham Pharmacia Biotech, UK, Cat CJS11), se lavaron dos
veces con 40 ml de PBS y se centrifugaron durante 3 minutos a 1500
rpm. Las células se plaquearon a 5.000 por pocillo en una placa de
fondo redondeado, en un volumen de 50 \mul. Los anticuerpos HuMAb
se añadieron a una concentración final en el rango de
25-0,1 \mug/ml en un volumen de 50 \mul de medio
de cultivo celular a 50 \mul de suspensión celular y se incubaron
durante 15 minutos. Posteriormente, se añadieron 50 \mul de
células efectoras, PBMC recién aislados o células efectoras
purificadas de la capa leucocitaria, en una proporción E:T en el
rango de 100:1 a 5:1. Las placas se centrifugaron durante 2 minutos
a 500-700 rpm, y se incubaron durante la noche a
37ºC. Tras la incubación las células se centrifugaron durante 3
minutos a 1500 rpm y se recogieron 100 \mul de sobrenadante, se
transfirieron a tubos de polipropileno y se contaron en un contador
g.
La magnitud de lisis celular mediante CDC o ADCC
se expresó como % de la liberación máxima de radioactividad de las
células diana lisadas por detergente corregido por la liberación
espontánea de radioactividad de las correspondientes células
diana.
Los efectos del anticuerpo 18 in vivo se
investigó mediante la inducción de tumores en ratones desnudos
atímicos de acuerdo con los métodos establecidos. Las células H322M
NSCLC humanas se coinyectaron junto con Matrigel por vía subcutánea
en ratones desnudos atímicos de 6-7 semanas de edad
(nu/nu). Para este propósito, se concentraron 5 x 10^{6} células
H322M en 100 \mul de medio de cultivo y se mezclaron con 100
\mul de Matrigel. Se inyectaron 200 \mul de esta mezcla en los
costados derechos de los ratones. Se calculó el volumen del tumor
mediante la medición de los diámetros de los tumores con
calibradores de Vernier dos veces a la semana de acuerdo con la
fórmula publicada por primera vez por Geran et al.
("Protocols for screening chemical agents and natural products
against animal tumors and other biological systems", Cancer
Chemother. Rep. 11,301, 1972) en la que el volumen del tumor [mg] =
(longitud x (amplitud)^{2}). El anticuerpo se administró
por vía intraperitoneal (i.p.) a 10 ml/ kg. El tratamiento empezó
con dobles dosis del anticuerpo administrado en volumen doble. Los
tumores se indujeron en ratones desnudos como se ha descrito antes.
Después de que los tumores crecieran en un volumen medio de 160 mg,
los ratones se trataron por vía intraperitoneal una vez a la semana
seis veces con 6, 0,6 y 0,06 mg/ kg del anticuerpo como dosis
consecutivas empezando con 12, 1,2 y 0,12 mg/ kg como dosis de
carga, dada una vez el primer día de tratamiento. La Figura 13
muestra los volúmenes del tumor medidos durante el tratamiento hasta
el día 67, cuando los animales se sacrificaron y el experimento
terminó. El experimento demuestra que el bloqueo del eje
IGF-IR mediante mAb 18 rhu
anti-IGF-IR resulta en eficacia
antitumoral cuando se administra como agente único a 6 y 0,6 mg/kg.
Por contra, a 0,06 mg/kg no presenta efectos sobre el crecimiento
tumoral.
De forma adicional, se probó el anticuerpo 18 en
combinación con gemcitabina en el mismo modelo. Los tumores se
indujeron como se ha descrito antes y el tratamiento se inició
cuando se establecieron los tumores y crecieron hasta una media de
170 mm^{3} en todos los grupos. El anticuerpo se administró una
vez a la semana i.p. a 6 y 0,6 mg/kg y en combinación con 62 mg/kg
de gemcitabina a 0,6 mg. Se administró un ciclo de gemcitabina, es
decir, cada tercer día hasta cuatro veces en total. De nuevo, el
tratamiento comenzó administrando dosis dobles del anticuerpo. La
Figura 14 muestra el tamaño del tumor en relación a los diferentes
tratamientos a lo largo del tiempo. El experimento demostró que el
tratamiento con anticuerpo 18 administrado una vez cada siete días
inhibe el crecimiento tumoral por sí mismo y aumenta la efectividad
de la gemcitabina, que es un compuesto antimetabólico conocido.
Los tumores se indujeron en ratones desnudos
esencialmente como se describe en el Ejemplo 15 excepto que se
usaron fibroblastos 3T3 murinos que sobreexpresan el
IGF-IR humano. Se trataron los ratones con tumores
establecidos de aproximadamente 180 mg por vía intraperitoneal una
vez a la semana siete veces con 18, 6 o 0,6 mg/kg de anticuerpo 18.
De nuevo, el tratamiento comenzó administrando dosis dobles del
anticuerpo administrando como dosis de carga (36, 12 y 1,2 mg/kg).
El experimento demuestra que mediante el tratamiento con el
anticuerpo, el crecimiento tumoral puede retrasarse cuando se
administra a 18 y 6 mg/kg una vez a la semana (Figura 15).
<110> F. Hoffmann-La
Roche
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Anticuerpos frente al receptor del
factor de crecimiento similar a la insulina I y utilización de los
mismos
\vskip0.400000\baselineskip
<130> 21695
\vskip0.400000\baselineskip
<150> PE 03015526
\vskip0.400000\baselineskip
<151>
2003-07-10
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn versión 3,2
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 118
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
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\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
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<210> 2
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<211> 108
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<212> PRT
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<213> Homo sapiens
\newpage
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<400> 2
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<210> 3
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<211> 118
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<212> PRT
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<213> Homo sapiens
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<400> 3
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<210> 4
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<211> 108
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<212> PRT
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<213> Homo sapiens
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<400> 4
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<210> 5
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<211> 990
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<212> DNA
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<213> Homo sapiens
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
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<222> (1)..(990)
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<400> 5
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<210> 6
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<211> 330
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<212> PRT
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<213> Homo sapiens
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<400> 6
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<210> 7
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<211> 321
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<221> CDS
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<222> (1)..(321)
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip1.000000\baselineskip
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<210> 8
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<212> PRT
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<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip1.000000\baselineskip
Claims (1)
1. Un método para la selección de un anticuerpo
frente a IGF-IR a partir de una diversidad de
anticuerpos frente a IGF-IR que se
caracteriza en que un ensayo de fosforilación celular
utilizando células 3T3 que proporcionan entre 400.000 y 600.000
moléculas de IGF-IR por célula en un medio que
contiene 0,5% de suero bovino fetal (FCS) inactivado por calor, se
realiza con dichos anticuerpos y que dicho anticuerpo se selecciona
si no muestra actividad estimuladora de IGF-IR que
se mide como fosforilación de PKB a una concentración de 10 \muM
cuando se compara con dicho ensayo sin dicho anticuerpo.
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