BRPI0721050A2 - Derivados de 6-alquoxialquil estradiol e métodos de uso - Google Patents

Description

I DERIVADOS E MÉTODOS DE USO DO ESTRADIOL 6-ALCOXIALQUIL

REFERÊNCIA CRUZADA A APLICAÇÕES RELACIONADAS

Esta aplicação reivindica os benefícios da aplicação Provisional norteamericana No. 60/867.980 depositada em 30 de novembro d§ 2006. Esta aplicação é também uma continuação em parte da aplicação e norte-americana No. 11/541.987 depositada em 30 de setembro de 2005. Os ensinamentos de tais aplicações são aqui incorporados na sua inteireza.

CAMPO DA INVENÇÃO A presente invenção relaciona-se a composto e métodos de produção de

compostos do Estradiol 6-alcoxialquil com a fórmula geral (I) em particular dos compostos (R ou S) 6 hidroximetil- ou (R ou S) 6-metiloximetil- (8 R ou S,9 S113 R ou S,14 S1 em 17 R ou S)-13-metil-7,8, 9,11,12,14,15,16,17- decahidrociclopenta [a] fenantreno-3,17-diol e seus sais farmaceuticamente 15 aceitáveis, ou prodroga dos mesmos. A presente invenção também diz respeito a compostos farmacêuticos que incluam tais componentes, tanto in vitro quanto in vivo, tanto para diagnósticos quanto para aplicações e tratamento de condições proliferativas, tais como o câncer.

20

Fórmula (I) ANTECEDENTES DA INVENÇÃO

Desordens celulares proliferativas tais como tumores e tumores primários malignos {inclusive, câncer(es)} em particular são problemáticos dada sua tendência de invadir tecidos adjacentes e metastizar para órgãos distantes no 5 corpo. Até hoje, os métodos mais freqüentes para tratamento da neoplasia, especialmente a neoplasia na forma tumores sólidos, incluem procedimentos cirúrgicos, terapia por radiação, quimioterapia, e suas combinações. Com milhões de casos de câncer sendo diagnosticados anualmente, e o câncer causando a morte de mais de um milhão de pessoas nos EUA a cada ano, há 10 uma necessidade cada vez maior de novas modalidades terapêuticas contra tais condições. Câncer de próstata, pulmão e colorretal são os casos mais comuns entre os homens; enquanto os cânceres de seio, colorretal e pulmão são os mais comuns entre as mulheres.

Nos anos recentes, houve um ganho significativo no gerenciamento 15 dessas condições. Ao menos uma das histórias de sucesso do gerenciamento clínico do câncer é o diagnóstico precoce e as opções de tratamento agora disponíveis para câncer primário do seio. A introdução de agentes antiestrogênio efetivos e não tóxicos que bloqueiam as ações do estrogênio mostraram-se efetivos.

Tamoxifeno é principalmente um dos primeiros receptores moduladores

seletivos do estrogênio que se tornaram uma terapia de primeira linha para terapia hormonal do câncer de seio, tanto para o tratamento adjuvante quanto para as terapias da doença metástica. Tamoxifeno é um inibidor competitivo da conexão do estradiol com o receptor estrogênio inibindo sua ligação com o 25 elemento de ligação do estrogênio no DNA. Além disso, tem havido um aumento de interesse no uso de inibidores de aromatase para bloquear especificamente a produção local de estrogênio que pode contribuir substancialmente para as doenças que respondem a hormônio tal como câncer do seio.

A aromatase (CYP19) é descrita como a principal enzima na conversão

de androgênios para estrogênios em mulheres tanto na pré quanto na pós menopausa. A privação de estrogênio pela inibição de aromatase é descrita como um tratamento efetivo e seletivo para algumas pacientes pós-menopausa com câncer de seio hormono-dependente. Exemestano (que é vendido como aromasin, é quimicamente descrito como 6-metilenandrosta-1,4-dieno-3,17- diona) e atua como um inativador esteroidal irreversível da aromatase. Acredita-se que ele atue como um substrato falso para a enzima aromatase, e que seja processado para um intermediário que se liga irreversivelmente ao local ativo da enzima causando a sua inativação. As patentes norte-americanas Nos. 4.808.616, e 4.904.650, cujos ensinamentos são aqui incorporados na sua inteireza, revelam derivados da 6-alquilidenandrosta-1,4-dieno-3,17-diona, tais com exemestano, e métodos de fabricá-los. A patente norte-americana No, 4.876.045 revela um método de preparação dos derivados 6-metileno da androsta-1,4-dieno-3,17-dionas. A patente norte-americana No. 4.990.635 revela um processo para a fabricação de derivados 6-metileno da androsta-1,4- dieno-3, 17-dionas.

A preparação de intermediários que possam ser úteis na preparação do exemestano é revelada na patente norte-americana No. 3.274.176. Na patente alemã DD 258820, a 6-1 hidroximetil-androsta-1,4-dieno-3,17-diona é preparada a partir da androsta-1,4-dieno-3,17-diona via 1,3-dipirrolidinandrosta3, 5 dieno-17-ona.

A aplicação internacional copendente No. PCT/US2005/001248 depositada em 14 janeiro de 2005 (Número de Publicação PCT WO 2005/070951) também descreve a preparação de intermediários que são úteis na preparação do exemestano, a aplicação é aqui incorporada por referência na sua inteireza. A estrutura do exemestano é mostrada abaixo. CH2 10

Schneider et al, em "Course of the reaction of steroidal 3,5-dienamines

with formaldehyde”, Helvetica Chimica Aeta (1973), 56(7), 2396-2404, revela os seguintes compostos:

onde o símbolo — representa uma ligação dupla, ele significa um grupo ceto e nenhum R6 está presente; e onde o símbolo ™ representa uma ligação simples R6 é hidrogênio (i.e., um grupo álcool). Ao contrário dos compostos da presente invenção, os compostos de Schneider não incluem variações do estrodial, testastrona, ou diidrotestastrona.

Um derivado tri-hidroxil substituído de estranos é revelado na patente norte-americana No. 3.377.363 concedida a Tadanier et. al, e o 3 hidróxi substituente no anel aromático dos compostos atuais não é revelada.

A patente norte-americana No. 5.914.324 concedida a De Funari et.al,

revela derivados 6 hidróxi e oxi androstano para hipertensão e parada

OR6

15

H

20 10

15

20

25

30

cardíaca. A patente norte-americana 6,384,250 concedida a Gobbini, et al., revela os substituentes hidroxil e cetona na posição 6 na preparação de (E, Z) 3- (2-aminoetoximino)-androstano-6,17-diona. Estes compostos foram orientados para o tratamento da parada cardíaca. Os efeitos da substituição de alquil hidroxil na posição seis não são revelados.

Tanenbaum, et. al, "Crystallographic comparison of the estrogen and progestone receptor's Iigand binding domains", Proc. Natl. Acad. Sei. USA, Biochemístry, Vol. 95, pp 5998- 6003, revela o mecanismo de receptores ER e nota que o estradiol como tendo um anel aromático com um substituente 3- hidróxi faz boa ligação com a região de ligação do ligando ER. É revelado que um grupo aromático plano sem o substituente 19 metil é favorecido, Dado o dito acima, ainda existe a necessidade de identificar novos e efetivos agentes para o tratamento do câncer.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO

À Iuz do acima exposto, a presente invenção é orientada a compostos quimioterápicos, composições e métodos para o seu uso e preparação, desta forma sobrepujando várias deficiências e insuficiências do estado anterior da técnica, inclusive os acima listados.

Um aspecto da dimensão atual diz respeito ao composto das Fórmulas I e

II.

OR5

ORs

R4

R7Qy

Fórmula (II)

em que R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7, Re e Rg são independentemente hidrogênio, alquil ou alquil substituído C1 a C6, halógeno, sulfato, ou metades glucoronida; e o símbolo representa uma ligação simples ou dupla e quando o símbolo — é uma ligação dupla e forma um grupo ceto na posição 3 ou 17, então nenhum R7 ou R6 está presente, respectivamente; o símbolo — representa a presença ou ausência de uma ligação na posição 10; e o símbolo ΛΛΛΛ representa qualquer tipo de ligação independentemente da estereoquímica. Os compostos também incluem os enantiômeros, outros isômeros estereoquímicos, hidratos, 5 solvatos, tautômeros e sais farmaceuticamente aceitáveis dos mesmos.

A invenção atual se relaciona com um método de tratar terapeuticamente o câncer em um sujeito mamífero (e.g., um paciente humano). Neste aspecto da invenção, são fornecidos métodos para a inibição do crescimento de tumores ou células cancerosas no interior do sujeito mamífero. Num tal 10 método, as células são expostas a ou postas em contato com os compostos das Fórmulas (I) ou (Il) ou enantiômeros farmaceuticamente aceitáveis, outros isômeros estereoquímicos, hidratos, solvatos, tautômeros, ou sais dos mesmos como aqui mostrado. Numa concretização específica, não Iimitante dos métodos da invenção atual, um composto das Fórmulas (I) ou (II) é usado para 15 tratar terapeuticamente um estado identificado de câncer como aqui descrito. Em outra concretização específica não Iimitante dos métodos da presente invenção, uma composição que inclui um composto das Fórmulas (I) ou (II) é usado para tratar terapeuticamente um estado identificado de câncer como aqui descrito.

Os compostos da presente invenção podem ser usados para tratar

qualquer tumor que possa ser direta ou indiretamente afetado por atividade hormonal e/ou relacionada a estrogênio, incluindo mas não de qualquer forma limitado a tumores sólidos associados com câncer do seio, pancreático, do pulmão, cólon, próstata, ovariano bem como do cérebro, fígado, baço, rim, 25 nódulos linfáticos, intestino delgado, células sanguíneas, ossos, estômago, endométrio, testicular, ovário, sistema nervoso central, pele, cabeça e pescoço, esôfago ou medula óssea; bem como cânceres hematológicos, tais como leucemia, leucemia promielocítica aguda, linfoma, mieloma múltiplo, mielodisplasia, doença mieloproliferativa, ou anemia refratária.

Os compostos da presente invenção podem também ser usados no

tratamento terapêutico combinado do câncer em um sujeito mamífero. Tais métodos podem incluir a administração de um composto das Fórmulas (I) ou (II) em combinação com outras terapias adjuntas de câncer, tais como quimioterapia, radioterapia, terapia genética, hormonoterapia, e outras terapias de câncer conhecidas na técnica.

Qualquer dos compostos da presente invenção pode ser contemplado

para administração ao sujeito mamífero na forma de uma droga, prodroga ou mesmo um metabólito ativo. Nos métodos de tratamento da presente invenção, o termo "administrar" deve abranger o tratamento das várias condições descritas com o composto especificamente revelado ou com um composto que 10 pode não ser especificamente revelado, mas que se converte ao composto especificado in vivo depois da administração ao paciente e exibe atividade terapêutica.

Outro aspecto da presente invenção é relativo a um método de inibição do crescimento das células de câncer que inclui fornecer a um paciente uma prodroga da Fórmula (III) em que R5 é um metil ou hidrogênio;

20

Vn

OR5

Fórmula (III)

e a formação de metabólitos das fórmula (IV), (V), (VI), (VII), e (VIII) em que qualquer dos R3, R4, R5, R7, R8 de seus equivalentes na Fórmula Il podem ser metil ou hidrogênio. Tais metabólitos podem incluir por exemplo as estruturas mostradas abaixo: 10

15

OMe

(V) A- NDC-1033

20

25

30

OCH3 (IV) B - NDC-1099

(VII)A-NDC-1066 OH

OH

5

HC

HC

OR5

Formula (VIII)-A

Formula (VIII)-B

Outros objetos, funcionalidades, benefícios e vantagens da presente

invenção ficarão aparentes deste sumário e das descrições a seguir de certas concretizações, e estarão claramente aparentes àqueles experimentados na técnica que e que tenham o conhecimento de vários compostos quimioterápicos, métodos e/ou modos de operação.

A Figura 2 - mostra uma trajetória metabólica predita para os compostos presentes.

A Figura 3 - mostra os efeitos de NDC-1011, NDC-1022, NDC-1033, NDC-1044, NDC-1055 and NDC-1066 na atividade do receptor beta do estrogênio (ER-β) como medida pela expressão da Iuciferase (RLU = unidade relativas de luz, na sigla em inglês). Células CV-1 foram transfectadas com dois constructos plasmídeos, o constructo repórter ERE-tk-luciferase e um constructo CMV-ER-β. Células transfectadas de controle (Ctrl) CV-1 não receberam qualquer tratamento enquanto células tratadas com estradiol (E2) receberam estradiol adicionado sozinho em 10'9 M (1 nM). No caso dos compostos NDC, cada composto foi respectivamente adicionado isoladamente * a 10'8 M (10 nM) (como evidenciado na coluna da esquerda para cada componente sob teste) ou a 10'8 M mais 10'9 M estradiol (E2) (como evidenciado na coluna da direita para cada componentes sob teste).

A figura 4 mostra efeito de NDC-1011, NDC-1033, NDC- 1055 e NDC

1066 na atividade do receptor alfa de estrogênio (ER-α) como medido pela

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

A Figura 1 - mostra a trajetória biossintética do Estradiol. expressão da Iuciferase (RLU = unidades relativa de luz, na sigla em um inglês). Células CV-1 foram transfectadas com dois constructos plasmídeos, o constructo repórter ERE-tk-luciferase e um constructo CMV-ER-α. Células de controle (Ctrl) CV-1 que não receberam qualquer tratamento enquanto o 5 estradiol (E2) foi adicionado isoladamente a 10~9 M (1 nM). No caso dos compostos NDC, cada composto foi respectivamente adicionado isoladamente a 10~8 M (10 nM) (como evidenciado na coluna da esquerda para cada componente sob teste) ou a 10~8 M mais 10~9 M estradiol (E2) (como evidenciado na coluna direita para cada composto sob teste).

A figura 5 exibe dados sobre inibição do crescimento de IC50 (em μΜ)

para NDC-1022 (colunas da esquerda), NDC-1033 (colunas do meio) e NDC1044 (colunas da direita) como determinado em cada linha das células. HT-29, SK-OV-3, NCI-H23, MCF-7, MDA-MB-231, OVCAR-3, CAPAN-1, CAPAN-2, SH-SY5Y, A-549 e PC-3.

A figura 6 mostra dados da inibição do crescimento da IC50 (in μΜ) para

NDC-1022, NDC-1033 e NDC-1044 como determinado em cada linha das células HT-29, SK-OV-3, NCI-H23, MCF-7, MDA- MB-231, OVCAR-3, CAPAN1, CAPAN-2, SH-SY5Y, A-549 and PC-3.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO A menos que definido de outra forma, todos os termos científicos e

técnicos aqui utilizados têm o mesmo significado como é comumente entendido por uma pessoa com experiência na técnica à qual esta invenção pertence e deve ser entendido como tendo os significados abaixo descrito. Todas as publicações e patentes aqui referidas são incorporadas por referência na sua 25 inteireza. A menos que de outra forma especificado, uma referência a um composto particular inclui todas suas formas isoméricas, inclusive as racêmicas ou mistura das mesmas. A menos que de outra forma especificado, uma referência a um composto particular também inclui iônicos, sal, solvato (e.g. hidrato), formas protegidas, prodrogas, e outros e estereoisômeros dos 30 mesmos, por exemplo, como aqui descrito. Pode ser conveniente ou desejável preparar, purificar, e/ou manipular um sal correspondente do composto ativo, por exemplo, um sal farmaceuticamente aceitável. Exemplo de sais famaceuticamente aceitáveis são discutidos em Berge et al., 1977, "Pharmaceutically Acceptable Salts," J. Pharm. Sci., Vol. 66, 5 pp. 1-19, e aqui discutidos.

Compostos antiproliferativos da presente invenção têm aplicação no tratamento do câncer, e assim a presente invenção fornece ainda agentes anticâncer. O termo "agente anticâncer" como aqui usado, refere-se a um composto que trata um câncer (i.e., um composto que é útil no tratamento de 10 um câncer). O efeito anticâncer pode advir de um mais mecanismos, incluindo mas não limitado a, regulação da proliferação de células, a inibição da angiogênese (a formação de novos vasos sanguíneos), a inibição da metástase (a disseminação de um tumor além a partir da sua origem), a inibição da invasão (a disseminação das células do tumor nas estruturas vizinhas 15 normais), ou a promoção de apoptose (morte programada da célula).

A invenção proporciona ainda componentes ativos para uso em um método de tratamento do corpo humano ou animal por terapia. Tal método inclui a administração a tal sujeito de uma quantidade terapeuticamente efetiva de um composto ativo, preferencialmente na forma de um composto farmacêutico como descrito mais tarde aqui.

Os termos "tratamento" ou "terapia" como aqui usado no contexto tratamento de uma condição, dizem geralmente respeito a tratamento e terapia de um sujeito mamífero, seja humano ou um animal não humano (e.g., aplicações em veterinária), no qual algum efeito terapêutico desejado é 25 conseguido, por exemplo, a inibição do progresso da condição, e inclui uma redução na velocidade do progresso, uma suspensão do andamento do progresso, uma melhoria da condição, e/ou cura da condição. Tratamento como uma medida profilática também está incluído. O tratamento inclui a combinação de tratamentos e terapias, em que dois ou mais tratamentos ou 30 terapias são combinados, por exemplo, seqüencialmente ou simultaneamente. Exemplos de tratamentos e terapias incluem, mas não estão limitados a, quimioterapia (administração de agentes ativos, incluindo, e.g., drogas, anticorpos (e.g., como em imunoterapia), prodrogas (e.g., empregando grupos de proteção que incluem derivados do ácido fosfórico e fosfinatos em posições apropriadas tais como as posições 3 ou 17, e outros compostos usados na 5 terapia fotodinâmica, GDEPT, ADEPT, etc.); cirurgia; terapia por radiação; e terapia genética.

O termo "Isômeros estereoquímico" como aqui usado, refere-se a isômeros que diferem um do outro apenas na forma como os átomos estão orientados no espaço. Os dois estereoisômeros particularmente importantes 10 nesta invenção são enantiômeros e diastereômeros independente de se ou não os dois isômeros são imagens especulares um do outro. Na concretização preferencial, a formulação reivindicada inclui tais compostos que são isolados, resolvidos e "substancialmente livres de outros isômeros".

O termo "quantidade terapeuticamente efetiva", como aqui usado, referese àquela quantidade de um composto ativo, ou um material, composição ou forma de dosagem que inclui um composto ativo, que é efetivo para produzir algum efeito terapêutico desejado, comensurável com uma razão razoável benefício/risco.

O termo "paciente" refere-se a animais, inclusive mamíferos, preferencialmente humanos.

O termo "região de um paciente" refere-se a uma área particular ou parte do paciente afetada por uma desordem proliferativa, câncer ou tumor em alguns casos a regiões por todo paciente. Ilustrativo de tais regiões são a região pulmonar, a região gastrointestinal, a região dos seios, a região renal 25 bem como outras regiões do corpo, tecidos, linfócitos, receptores, órgãos e similares, incluindo o sistema vascular e circulatório, tecidos cancerosos. A "região de um paciente" inclui, por exemplo, regiões a serem tratadas com os compostos e composições revelados. A "região de um paciente" é preferencialmente interna, embora possa ser externa.

O termo "tecido" refere-se geralmente a células especializadas que

podem realizar uma função específica. O termo "tecido" pode se referir a uma célula individual ou uma pluralidade ou agregado de células, por exemplo, membranas, sangue ou órgãos. O termo "tecido" também inclui referência a uma célula anormal ou a uma pluralidade de células anormais. Exemplos de tecido incluem tecidos do seio, inclusive células do seio, tecidos membranosos, 5 inclusive endotélio e epitélio, lâminas, tecido conectivo, inclusive tecidos intersticial, e tumores.

Compostos

A presente invenção é orientada a um composto terapêutico de uma das Fórmulas (I) - (II):

caracterizado por R1, R2, R3, R4, R5, R6, R7, Rs e Rg serem independentemente hidrogênio, alquil ou alquil substituído C1 ã C6, halógeno, 20 sulfato, ou metades glucoronida; e o símbolo ™ representar uma ligação simples ou dupla e quando o símbolo ™ for uma ligação dupla e formar um grupo ceto na posição 3 ou 17, então nenhum R7 ou Rg está presente, respectivamente; 0 símbolo — representar a presença ou ausência de uma ligação na posição 10; e 0 símbolo ΛΛΛΛ representar qualquer tipo de ligação 25 independentemente da estereoquímica. Os compostos também abrangem os enantiômeros, outros isômeros estereoquímicos, hidratos, solvatos, tautômeros e sais farmaceuticamente aceitáveis dos mesmos.

Em uma concretização da Fórmula I, R5, R6, R7, R9 são átomos de hidrogênio, metil ou Cl; R1, R2 é hidrogênio ou metil; R3, R4 é alquil ou alquil substituído C1 a cerca de C6, halógeno e ™ é uma ligação simples que corresponde ao grupo álcool. Em outra concretização a estereoquímica no carbono C-6 inclui um enantiômero S ou R ou diastereômeros.

Compostos de uma concretização da presente invenção podem ser usados numa composição farmacêutica. Tal composição pode incluir um mais 5 compostos selecionados daqueles discutidos acima, ilustrados abaixo ou de outra forma inferidos daqui, e combinações dos mesmos. Em certas concretizações, tal composição pode inclui um componente portador farmaceuticamente aceitável. Sem limitação, tal composição pode incluir uma mistura racêmica de compostos. Em certas concretizações, um tal composto 10 pode estar presente como o enantiômero SeR, preferencialmente na sua forma isolada e purificada que esteja substancialmente livre de outros isômeros, e R5, ou R7 podem ser selecionados de H, alquil ou alquil substituído C1 a C6, e um halógeno.

Os compostos da presente invenção podem ter centros assimétricos e 15 podem ocorrer como racematos, mistura racêmica, ou diastereômeros ou enantiômeros individuais tais como (S) 6-metiloximetil (8S, 9S, 13S, 14S, 17S) 13-metil- 7,8,9,11,12,14,15,16,17-decehidrocilopenta [a] fenantreno-3, 17-diol; (R) 6-metiloximetil (8S, 9S, 13S, 14S, 17R) -13-metil- 7,8,9,11,12,14,15,16,17 decehidrocilopenta [a] fenantreno-3, 17-diol; (R) 6- metiloximetil (8R, 9S, 13R, 20 14S, 17R)-13-metil-7,8,9,11,12,14,15,16,17-decehidrocilopenta [a] fenantreno3, 17-diol (NDC-1022); or (S) 6- metiloximetil (8R, 9S, 13R, 14S, 17R) -13-metil7,8,9,11,12,14,15,16,17-decehidrocilopenta [a] fenantreno-3, 17-diol (NDC1033).

Uma concretização da presente invenção refere-se à preparação dos 25 enantiômeros R ou S, diastereômeros R ou S de estradiois 6 substituídos. Métodos para a preparação (e.g., síntese assimétrica) e separação (e.g., cristalização fracionária e meios cromatográficos) de tais formas isoméricas são geralmente conhecidas no estado da técnica ou são facilmente obteníveis pelos métodos aqui ensinados. Um de tais métodos é descrito na aplicação 30 norte-americana copendente SN 11/541.987, cujos ensinamentos são aqui incorporados na sua inteireza. Outra concretização da presente invenção refere-se a um método de preparação de um derivado de estradiol 6-hidroximetil ou 6-metiloximetil. Um esquema de reação para a preparação de derivados do estradiol é mostrado abaixo, Esquema 1. Tal método inclui a reação de um derivado do estradiol t5 butildimetilsilil com LIDAKOR/THF/formaldeído para obter um composto 6- hidroxilado seguido por passos como: (i) hidrólise para obter o derivado do estradiol 6-hidroximetil, NDC-1066; e/ou (ii) tratamento com dimetilsulfato seguido por hidrólise para obter o derivativo do estradiol 6-metiloximetil, NDC1033. O NDC-1088 pode ser obtido por oxidação adicional do NDC-1033 na 10 posição hidroxil C-17.

Em uma abordagem alternativa, os composto da presente invenção podem ser preparados por um método que inclua passos como: (i) proteger um composto estrodial, (ii) acilar o composto estradiol protegido na 6-posição benzílica com LIDAKOR/Butil-Lítio/Diisopropilamina/tert-amilato de potássio, 15 (iii) reduzir a posição 6 aldeído com hidreto de lítio alumínio, (iv) desproteger as regiões protegidas do composto estrodial. Um esquema de reação para preparação de derivados do estradiol é mostrado abaixo no Esquema 2.

Os compostos da presente invenção podem ser sintetizados pelos seguintes métodos como ilustrado nos esquemas abaixo: 10

20

25

Esquema 1 - preparação dos compostos da presente invenção

THPO'

OTHP

Hidrólise

HO'

\

Separado Desejadc

i iTtotia ?

OH

Sulfato de Dimetila OTHP

xOH

NDC-1066

THPO'

OMe NDC-1033

OMe

NDC-1088

OTHP

THPO'

OH

Sulfato de Dimetila

Λτυη

OH NDC-1055

THPO'

OMe

OMe

NDC-1022

OMe NDC-1 099 Esquema 2 - Métodos alternativos para preparação dos compostos da invenção.

25

Vários derivados metiloxialquil, de acordo com esta invenção, são limitados apenas pela escolha do agente alquilnte, tais derivados como poderia ser entendido por aqueles hábeis na técnica e que tomam conhecimento desta invenção, quando disponível via procedimentos sintéticos do tipo descrito aqui 30 ou modificação direta dos mesmos, tais modificações como poderia ser entendido por aqueles hábeis na técnica. Portanto, sem limitação, vários reagentes alquil e alquil substituído C1 a C6 (e.g., alquil C1 a Ce linear, linear substituído, ramificado e ramificado substituído, tais substituentes como seriam entendidos na técnica) podem ser usados como aqui descritos para preparar os derivados metiloxialquil correspondentes.

A presente invenção se refere a métodos de tratamento do câncer em um

sujeito mamífero (e.g., um paciente humano). Neste aspecto da invenção, são proporcionados métodos para a inibição de tumores ou do crescimento canceroso de células. Em tais métodos, as células são expostas a ou colocadas em contato com um composto da Fórmula (I) ou sais farmaceuticamente aceitáveis ou hidratos dos mesmos:

caracterizada por R1, R2, R3, R4, Rs, Re- R7, e R9 serem independentemente hidrogênio, alquil ou alquil substituído C1 a C6, halógeno, sulfato, ou metades glucoronida; e 0 símbolo — representa uma ligação simples ou dupla e quando o símbolo ™ é uma ligação dupla e forma um grupo ceto na posição 3 ou 17, então nenhum R7 ou R6 está presente, respectivamente; 0 símbolo — 25 representa a presença ou ausência de uma ligação na posição 10; e o símbolo λλλλ representa qualquer tipo de ligação independente da estereoquímica. Os compostos também abrangem os enantiômeros, outros isômeros estereoquímicos, hidratos, solvatos, tautômeros e sais farmaceuticamente aceitáveis dos mesmos.

Estes métodos podem ser usados para tratar qualquer tumor que possa

ser direta ou indiretamente afetado do por atividade hormonal e/ou relacionada com estrogênio, incluindo mas não de qualquer maneira limitado a tumores sólidos associados a cânceres do seio, do pâncreas, do pulmão, do cólon, da

próstata, ovariano, bem como câncer do cérebro, fígado, baço, rim, nódulo

\

linfático, intestino delgado, células sanguíneas, ossos, estômago, endométrio, 5 testículo, ovário, sistema nervoso central, pele, cabeça e pescoço, esôfago, ou medula óssea; bem como cânceres hematológicos, tais como leucemia, leucemia aguda promielocítica, linfoma, mieloma múltiplo, mielodisplasia, doença mieloproliferativa, ou anemia refratária.

Além disso, a administração dos compostos da presente invenção para tratamento de vários estados do câncer podem incluir a administração de um composto da Fórmula (I) em combinação com outras terapias adjuntas de câncer, tais como quimioterapia, radioterapia, terapia genética, hormonoterapia e outras terapias de câncer conhecidas na técnica. Combinações dos compostos agora revelados com outros agentes anticâncer ou quimioterapêuticos pertencem ao escopo da invenção. Exemplos de tais agentes podem ser encontrados em Cancer Principies and Praetice of Oncology by V. T. Devita and S. Hellman (editores) 6a edição (15 de fevereiro de 2001), Lippincott Williams & Wilkins Publishers. Um médico, veterinário ou clínico habilitado na técnica seria capaz de discernir que combinações de agentes poderiam ser úteis com base nas características particulares das drogas e o câncer envolvido. Tais agentes anticâncer incluem os seguintes: moduladores do receptor de estrogênio, moduladores do receptor de androgênio, moduladores do receptor retinóide, agentes citotóxicos, agentes antiproliferativos, inibidores da transferase proteína prenil, inibidores da reductase HMG-CoA, inibidores da protease EHV, inibidores da transcriptase reversa, inibidores da aromatase, e inibidores da angiogênese.

Em ao menos um aspecto da invenção, os inventores ilustram os compostos da presente invenção na Tabela I abaixo: Tabela I

R1, R2, R3, R4: independentemente H1 alquil Ci-C6, alquil substituído, ou

halógeno

Rs, R7: H, alquil C1-C6, alquil substituído, sulfato, ou glucoronida

R6: H, alquil C1-C6, ou alquil substituído, sulfato, ou glucoronida, quando

— é uma ligação simples; não presente, quando é uma ligação dupla

15

Substituenfes Configuração Espacial Entrada R5 R6 R7 C-6 C-8 n C-13 C-14 C---17 I vo 1 H H H S S S S S S 2 H H H S R R R R R 3 H H H S S S S S ' R 4 H H H S R R R R S 5 H - H S S S S S O 11 O 6 H - H S R R R R O Il O 7 H H H R R R R R R 8 H H H R S S S S S 9 H H H R S S S S R 10 H H H R R R R R S 11 H - H R S S S S O Il O 12 H - H R R R R R O Il O 13 Me H H S S S S S S 14 Me H H S R R R R R I Me --H- -Hr- ----S--- ----R----- -----S----- --- R - --- -S- --- R l-f 1J 16 Me H H S R R R R S 17 Me - H S S S S S I O Il O 18 Me - H S R R R R C=O 19 Me H H R R R R R R Tabela I - continuação

R-ι, R2, R3, R4·' independentemente H, alquil CrC6, alquil substituído, ou halógeno R5, R7: H, alquil CrC6, alquil substituído, sulfato, ou glucoronida Rg: H, alquil C1-C6, ou alquil substituído, sulfato, ou glucoronida, quando — é uma ligação simples; não presente, quando — é uma ligação dupla

Substituentes Configuração Espacial Entrada R5 R6 Rv C-6 C-8 C-9 C-13 n C-17 I 20** Me H H R R S R S R 21 Me H H R S S S S R 22 Me H H R R R R R S 23 Me - H R S S S S C=O 24 Me - H R R R R R C=O 25 H H SO3H S S S S S S 26 H H SO3H S R R R R R 27 H H SO3H S S S S S R 28 H H SO3H S R R R R S 29 H - SO3H S S S S S O Il O 30 H - SO3H S R R R R O Il iO 31 H H SO3H R R R R R R 32 H H SO3H R S S S S S 33 H H SO3H R S S S S R 34 H H SO3H R R R R R S 35 H - SO3H R S S S S O Il O 36 H - SO3H R R R R R O lí O 37 Me H SO3H S S S S S S 38 Me H SO3H S R R R R R 39 Me H SO3H S S S S ---S--- R 40 Me H SO3H S R R R R S 41 Me - SO3H S S S S S Oi Il ; O 42 Me - SO3H S R R R R I O: 11 1 O1 43 Me H SO3H R R R R R R 44 Me H SO3H R S S S S S 45 Me H SO3H R S S S S R Tabela I - continuação

Ri, R2, R3, R4: independentemente H1 alquil CrC6, alquil substituído, ou halógeno Rô, R7: H1 alquil CrC6, alquil substituído, sulfato, ou glucoronida R6: H, alquil Ci-C6, ou alquil substituído, sulfato, ou glucoronida, quando — é uma ligação simples; não presente, quando — é uma ligação dupla

Substituentes Configuração Espacial Entrada R5 R6 R7 C-6 C-8 C-9 C-13 <3» C-17 H I O 46 Me H SO3H R R R R R S 47 Me - SO3H R S S S S O 11 O 48 Me - SO3H R R R R R C=O 49 H H glucoronida S S S S S S 50 H H glucoronida S R R R R R 51 H H glucoronida S S S S S R 52 H H glucoronida S R R R R S 53 H - glucoronida S S S S S C=O 54 H - glucoronida S R R R R C=O 55 H H glucoronida R R R R R R 56 H H glucoronida R S S S S S 57 H H glucoronida R S S S S R 58 H H glucoronida R R R R R S 59 H - glucoronida R S S S S C=O 60 H - glucoronida R R R R R C=O 61 Me H glucoronida S S S S S S 62 Me H glucoronida S R R R R R 63 Me H glucoronida S S S S S R 64 Me H glucoronida S R R R R S 65 Me - glucoronida S S S S S C=O 66 Me - glucoronida S R R R R ^ C=O 67 Me H glucoronida R R R R R R 68 Me H glucoronida R S S S S S 69 Me H glucoronida R S S S S R 70 Me H glucoronida R R R R R S 71 Me - glucoronida R S S S S C=O 72 Me - glucoronida R R R R R C=O *NDC-1033;

** NDC-1022 Os composto preferenciais na Tabela I incluir os compostos 15 e 20. Ao menos um aspecto da invenção atual está orientado para estes compostos preferenciais, seus métodos de uso e fabricação.

Em ou menos um outro aspecto da invenção, os inventores ilustram os compostos da presente invenção e na Tabela Il abaixo:

Tabela Il

Ri. R2, R3, R4: independentemente H, alquil C1-C6, alquil substituído, ou halógeno

R5: H, alquil C1-C6l alquil substituído, sulfato, ou glucoronida R6: H, alquil C1-C6, ou alquil substituído, sulfato, ou glucoronida R$: H, alquil C1-C6, ou alquil substituído,

quando ™ é uma ligação simples; não presente, quando ™ é uma

ligação dupla

Substituent Configuração Espacial ' Entrada R5 R6 Ω C-8 C-9 C-IO C-13 C-14 C-17 I σι 73 H H S S S R S S S 74 H H S R R R R R R 75 H H S S S R S S R 76 H H S R R R R R S 77 H - S S S R S S C=O 78 H - S R R R R R C=O 79 H H R R R R R R R 80 H H R S 1 S R S S S 81 H H R S S R S S R 82 H H R R R R R R S 83 H - R S S R S S 0 1! O 84 H - R R R R R R Il O 85 Me H S S S R S S S 86 Me H S R R R R R R 8 7 Me H S S S R S S R 88 Me H S R R R R R S CO Me - S R S R R S O * Il O 90** Me - R R S R ■■ R S O Il O 91 Me H R R R R R R R Tabela If

R-ι, R2, R3, R4: independentemente H, alquil CrC6, alquil substituído, ou halógeno

R5: H, alquil CrC6, alquil substituído, sulfato, ou glucoronida R6: H, alquil CrC6, ou alquil substituído, sulfato, ou glucoronida Rs: H, alquil CrC6, ou alquil substituído,

quando — é uma ligação simples; não presente, quando — é uma ligação dupla

Substituent Configuração Espaciaf Entrada R5 Re C-S OO C-9 C-10 C-13 C-14 C-17 I O 92 Me H S S S R S S S 93 Me H S R R R R R R 94 Me H S S S R S S R 95 Me H S R R R R R ' S 96 Me - R R S - R S O Il O 97 Me - S R R R R R C=O gg * * * Me H S R S R R S R 99 Me H R S S R S S S 100 Me H R S S S S S R 101 Me H R R R S R R S 102 Me - R S Q R S S C=O O 103 Me - R R R R R R C=O 104 H H 5 S S R S S S 105 H ' H S R R R R R R 106 H H S S S R S S R 107 H H S R R R R R S 108 H - S S S R S S n Il O 109 H - S R R R R R C=O 110 H H R R R R R R R 111 H H R S S R S S S 112 H H R S S R S S R 113 H H R R R R R R S 114 H - R S S R S S n Il 0 115 H - R R R R R R 0 Il O Tabela Il - continuação

Ri, R2, R3, R4: independentemente H, alquil C1-C6, alquil substituído, ou halógeno

R5: H, alquil C1-C6, alquil substituído, sulfato, ou glucoronida

R6: H, alquil C1-C6, ou alquil substituído, sulfato, ou glucoronida R8: H1 alquil CrC6l ou alquil substituído,

quando ™ é uma ligação simples; não presente, quando ™ é uma ligação dupla

Substituente Configuração Espacial Entrada R5 R6 C-6 C-8 C-9 C-10 C-13 C-14 C-17 116 Me H S S S R S S S 117 Me H S R R R R R R 118 Me H S S S R S S R 119 Me H S R R R R R S 120 Me - S S S S S S O 121 Me - S R R R R R C=O 122 Me H R R R R R R R 123 Me H R S S R S S S 124 Me H R S S S S S R 125 Me H R R R S R R S 126 Me - R S S R S S •O Il U 127 Me - R R R R R R O Il O 12 8**** Me H R R S R R S R * NDC-1077, quando R8 é um metil ; ** NDC-IO 11, quando R8 é um metil;

*** NDC-1110, quando R8 é um metil; **** NDC-1044, quando R8 é um metil.

Os compostos preferenciais na Tabela Il incluem os compostos 89, 90, 98, e 128. Em ao menos um aspecto a atual invenção é orientada para estes compostos preferenciais, seu método de uso e fabricação.

Um exemplo específico não Iimitante para tratamento de um estado de

câncer identificado como aqui descrito inclui o uso de um composto da Fórmula (I), que tem a Fórmula (IX) abaixo:

Outro exemplo específico não Iimitante para o tratamento de um estado

de câncer identificado como descrito aqui inclui o uso de um composto da Fórmula (I), que tem a Fórmula (X), abaixo:

Os compostos ativos acima podem também ser usados como parte de um ensaio in vitro, por exemplo, para determinar se um hospedeiro candidato é suscetível de se beneficiar de um tratamento com o composto em questão. Qualquer composto ativo da invenção atual pode ser usado como padrão, por 25 exemplo, num ensaio, para identificar outros compostos ativos, outros agentes antiproliferativos, outros agentes anti-inflamatórios, etc.

Ao menos em um aspecto da presente invenção, os compostos candidatos foram avaliados quanto à sua atividade antagonista ao receptor de estrogênio. A avaliação quanto a se um composto é um antagonista ao receptor de estrogênio pode ser realizada por várias metodologias conhecidas na técnica. Na presente aplicação, tal capacidade foi determinada pela condução do ensaio de ligação da Luciferase de acordo com os métodos de seleção aqui descritos.

Em uma concretização mais preferencial desse aspecto da invenção, a capacidade de ligação com o receptor de estrogênio foi avaliada pela 5 transfecção transitória de células CV-1 com a expressão do constructo para o ER(a) ou ER(P) mais um constructo repórter ERE-tk-luciferase. As células foram então divididas em grupos de controle e candidato caracterizados por os controles não receberem qualquer tratamento, ou terem sido tratados apenas com estradiol (1 nM) e os grupos candidatos receberam estradiol mais um 10 composto Endece em concentrações variadas. Depois de 16-24 horas as células foram colhidas e ensaiadas para a atividade da Iuciferase usando um kit ensaio comercialmente disponível.

Em ainda outro aspecto da presente invenção, o IC50 ou a metade da concentração inibitória máxima dos compostos candidatos foram determinadas 15 para avaliar a potência da droga e o regime de dosagem potencial para uso in vivo. Alguém com habilidade normal na técnica é capaz de prontamente verificar tal informação usando metodologias comuns conhecidas. Como já foi bem descrito na técnica, o IC50 representa e mede quanto de uma substância/molécula particular é necessária para inibir algum processo 20 biológico em 50 %. No caso presente, o IC50 dos compostos candidatos foi determinado como a concentração que levava a uma resposta de 50% comparada às células de controle do veículo.

Como aqui notado, os sais dos compostos desta invenção refere-se a "sais farmaceuticamente aceitáveis" não tóxicos. Outros sais podem, 25 entretanto, ser úteis na preparação dos compostos de acordo com a invenção ou de seus sais farmaceuticamente aceitáveis. Quando os compostos da presente invenção contêm um grupo básico, os sais englobados dentro do termo "sais farmaceuticamente aceitáveis" referem-se a sais não tóxicos que são geralmente preparados pela reação da base livre com um ácido orgânico 30 ou inorgânico apropriado. Sais típicos incluem qualquer sal conhecido na técnica. Quando compostos da presente invenção possuem uma metade ácida, sais farmaceuticamente aceitáveis apropriados dos mesmo podem incluir sais de metal alcalino, e.g., sais de sódio ou potássio; sais de metal alcalino-terroso, e.g., sais de cálcio ou magnésio; e sais formados com Iigandos orgânicos apropriados, e.g. sais de amônia quaternária.

5 Para tratar um sujeito mamífero, tal como paciente humano, uma

quantidade efetiva de um ou mais compostos da presente invenção, ou um sal farmaceuticamente aceitável dos mesmos, é administrado ao sujeito mamífero de modo a promover a exposição ou o contato das células do câncer ou do tumor crescente alvo. Formas de dosagem efetivas, modos de administração e 10 quantidades da dosagem podem ser determinadas empiricamente, e realizar tais determinações está ao alcance da habilidade da técnica. É entendido pelo médico, veterinário ou clínico com habilidade normal na técnica que a quantidade da dose variará com a atividade do composto particular empregado, curso e/ou progressão do estado da doença, a rota da administração, a taxa de 15 excreção do composto, função hepática e renal do paciente, a duração do tratamento, a identidade de qualquer uma das drogas sendo administradas ao sujeito, idade, tamanho e fatores similares bem conhecidos da técnica médica. Como aqui descrito, os compostos da presente invenção podem ser administrados em doses orais na forma de comprimidos, cápsulas (cada um 20 dos quais inclui formulações de liberação controlada ou liberação temporizada), pílulas, pós, composições micronizadas, grânulos, elixires, tinturas, suspensões, xaropes e emulsões. Da mesma forma, eles podem também ser ministrados de forma intravenosa (bolus ou infusão), intraperitonial, tópico (e.g., colírio), subcutânea, intramuscular or transdérmica (e.g., emplastro), todas as 25 formas utilizadas bem conhecidas daqueles com habilidade normal na técnica farmacêutica. Novamente, o médico, veterinário ou clínico com habilidade normal pode prontamente determinar e prescrever a quantidade efetiva da droga requerida para prevenir, proteger ou conter o progresso da condição.

Doses orais da presente invenção, quando usadas para os efeitos indicados, variarão entre cerca de 0,01 mg por kg de peso corporal por dia (mg/kg/dia) a cerca de 100 mg/kg/dia, preferencialmente 0,01 a 10 mg/kg/dia, e mais preferencialmente em 0,1 a 5,0 mg/kg/dia. Para administração oral, as composições são preferencialmente fornecidas na forma de comprimidos contendo 0,01, 0,05, 0,1, 0,5, 1,0, 2,5, 5,0, 10,0, 15,0, 25,0, 50,0, 100 e 500 milligramas do ingrediente ativo para o ajuste sintomático da dosagem ao 5 paciente a ser tratado. Um medicamento tipicamente contém de cerca de 0,01 mg a cerca de 500 mg do ingrediente ativo, preferencialmente, de cerca de 1 mg a cerca de 100 mg do ingrediente ativo. Para administração intravenosa, a dose mais preferencial variará de cerca de 0,1 a cerca de 10 mg/kg/minuto no decorrer de uma infusão a taxas constantes. Compostos da presente invenção 10 podem ser administrados em uma dose única diária, ou a dose total diária pode ser administrada dividida em duas, três ou quatro vezes por dia.

Como aqui notado, os compostos da presente invenção podem ser usados em combinação com outros agentes anticâncer ou outros agentes que melhorarão o regime de tratamento para o sujeito mamífero. Os componentes individuais de tais combinações podem ser administrados separadamente em momentos diferentes durante o curso da terapia ou concorrentemente na forma dividida ou em combinações simples aos pacientes ou regiões de tais pacientes que precisem de tal terapia. A invenção atual é portanto para ser entendida como abrangendo todos os regimes de tratamentos simultâneos ou alternantes e que o termo "administrar" deve ser interpretado em conformidade com este entendimento. Deve ser entendido que escopo de combinações dos compostos desta invenção com outros agentes úteis para tratar a condição do câncer alvo inclui em princípio qualquer combinação com qualquer composição farmacêutica útil para o tratamento de desordens relacionadas ao funcionamento do estrogênio.

Como aqui usado, o termo "composição" tem a intenção de abranger um produto que inclui os ingredientes especificados nas quantidade especificadas, bem como qualquer produto que possa resultar, direta ou indiretamente, da combinação dos ingredientes especificados nas quantidade especificadas.

Pode ser conveniente ou desejável preparar, purificar, e/ou manipular os

compostos ativos na forma de uma prodroga. O termo "prodroga" como usado aqui, refere-se a um composto que, quando metabolizado, resulta no composto ativo desejado ou em si mesmo se for o composto ativo. Isto inclui por exemplo adicionar uma metade éster do ácido fosfórico a posições adequadas tais como as posições 3, 6, 10 ou 17. Tipicamente, a prodroga é inativa, ou menos ativa 5 do que o composto ativo, mas pode propiciar manipulação, administração, ou propriedades metabólicas vantajosas. Por exemplo, algumas prodrogas são éteres do composto ativo; durante o metabolismo o grupo éter é clivado para resultar na droga ativa. Também, algumas prodrogas são ativadas enzimaticamente para resultar no composto ativo, ou num composto que, 10 depois de reações químicas adicionais, resulta num composto ativo. Assim, nos métodos de tratamento da presente invenção aqui revelados, o termo "administrar" deve abranger o tratamento das várias condições descritas com os compostos especificamente revelados ou com um composto que pode não ter sido especificamente revelado, mas que se converte ao composto 15 especificado in vivo depois da administração ao paciente. Metabólitos destes compostos incluem espécies ativas produzidas depois das introdução de compostos desta invenção no sujeito mamífero.

Composto da presente invenção podem ser prodrogas para agentes antiproliferativos potentes. Compostos que exibem atividade intrínseca baixa ou moderada podem atuar como prodrogas, e serem ativados metabolicamente (e.g., in vivo) para gerar compostos mais potentes. Isto é especialmente útil na terapia do câncer em que a ativação metabólica pode ser realizada por uma enzima que é expressada em tumores. Prodrogas, atuando como um substrato, podem ser metabolizadas por CYP19, 17p-HSD, HS- demetilase ou outra enzima esteroidal ligada para gerar um potente agente anticâncer. Os derivados de exemestano (R) ou (S)-6 -metiloxoalquil sugerem que ele pode ser ativo contra numerosas formas de câncer além do câncer do seio. Atividade para inibir o crescimento de células do tumor em linhas de células derivadas de cânceres do seio, pulmão, cólon, próstata, endométrio e ovariano foi observada para o enantiômero NDC-1011. Por exemplo, estudos in vitro do crescimento de células do tumor sugerem que ele é maior em de células que são positivas CYP19 (MDA-MB-213 e SK-OV-3) e reduzido naquelas linhas de células que são negativas CYP19 (MCF-7 e NIH:OVCAR-3) o que indica que o NDC-1011 pode atuar como uma prodroga. Vide as fórmulas (XI) e (XII) abaixo para as estruturas do NDC-1077 e NDC-1011.

Embora não limitado por qualquer teoria, por exemplo, se o NDC-1011 for uma prodroga, então qualquer quantidade de enzimas esteroidogênicas normais do corpo deve ser ativa para o composto NDC-1011 e portanto capaz de converter o NDC-1011 no(s) metabólito(s) ativo(s). Este aspecto da invenção pode ser aplicado da mesma forma a ambos diastereômeros S ou R.

Os compostos prodroga da invenção em pauta atuam de uma forma análoga à observada para androstenodiona endógena, o NDC-1011 é convertido para um anel aromático por hidroxilação no carbono C-3 do NDC1011 através do CYP19 para gerar o metabólito NDC-1099. Vide Figura 1 na trajetória biossintética do Estradiol em que a Androstenodiona é convertida para Estrona através da CYP19. A NDC-1099 poderia ser submetida hidroxilação adicional no carbono C-17 através da ação reversível da 17βdehidrogenase hidroxiesteróide (17P-HSD) resultando no composto diol NDC1022.

Assim como com o Estradiol, o composto diol NDC-1022 possui um anel aromático, mas difere do estradiol com relação ao substituentes metiloxialquil no carbono C-6. O metabolismo da NDC-1011 para o composto diol NDC-1022 pode ocorrer em qualquer ordem como mostrado na Figura 2. Por exemplo, o NDC-1044 formado pelo 17p-HSD é convertido para o diol NDC-1022 pela

OMe

(XI) NDC-1077

OMe

(XII) NDC-1011 atividade de aromatização do CYP19.

Sem estar atrelado a quaisquer teorias, foi reportado que o Estradiol se vincula ao receptor ao receptor ligando do receptáculo dos receptores de estrogênio (ambos ERa e ERp), pelo C17-OH (via His 524); e o C3-0H (via Arg 5 394 e Glu 353). Como com o Estradiol, a ligação do diol NDC-1022 no mesmo receptáculo ligando de ERaand ER3via ligações similares de aminoácido podem ocorrer. Adicionalmente, a presença de substituentes metiloxialquil no carbono C-6 do composto NDC-1022 pode alterar a conformação do receptor vínculo-ligando normal e resultar em atividade modificada devido à atividade é 10 antitumor observada.

Adicionalmente, a atividade da enzima demetilase direcionada ao grupo metil C-6 do NDC-1011 (ou um dos metabólito do NDC-1011), pode indicar a formação do metabólito triol NDC-1055. Com grupos álcool nos carbono anos C-3, C-6 e C-17, um tal metabólito triol NDC-1055 pode se ligar a um amplo 15 espectro de receptores esteróides numa variedade de tecidos envolvendo várias combinações dos álcoois C-3, C-6 e C-17. Um exemplo de tais metabólitos inclui os composto da Fórmula (VII)B abaixo mostrada:

Formulações farmacêuticas da presente invenção incluem aquelas apropriadas para administração oral, nasal, tópica (inclusive bucal e sublingual), retal, vaginal e/ou parenteral. Independentemente da rota de administração selecionada, o(s) ingrediente(s) ativo(s) é(são) formulado(s) na forma de dosagens farmaceuticamente aceitáveis por métodos convencionais

25

20

OH

(VII)B -NDC-1055 conhecidos daqueles versados na técnica.

A quantidade do(s) ingrediente(s) ativo(s) que será combinada com um material portador para produzir uma dose única variará dependendo do hospedeiro a ser tratado, do modo particular de administração e de todos os 5 outros fatores acima descritos. A quantidade do(s) ingrediente(s) ativo(s) que será combinada com um material portador para produzir uma dose única será geralmente aquela quantidade de ingrediente(s) ativo(s) que represente(m) a menor dose efetiva para produzir um efeito terapêutico.

Métodos de preparação das formulações ou composições farmacêuticas 10 incluem o passo de realizar associação do(s) ingrediente(s) ativo(s) com o portador e, opcionalmente, um ou mais ingredientes acessórios. Em geral, as formulações são preparadas realizando a associação uniforme e íntima do(s) ingrediente(s) ativo(s) com os portadores líquidos, ou portadores sólidos finamente divididos, ou ambos, então, se necessário, moldando o produto.

Formulações da invenção apropriadas para administração oral podem

estar na forma de cápsulas, pílulas, comprimidos, pastilha (usando uma base com sabor, usualmente sucrose e acácia ou goma adragante), pós, grânulos ou como uma solução ou suspensão em líquido aquoso ou não aquoso, ou como uma emulsão líquida de óleo-em-água ou água-em-óleo, ou como um elixir ou 20 xarope, ou como pastilhas (usando uma base inerte, tal como gelatina e glicerina, ou sucrose e acácia) e/ou colutórios ou similares, cada um contendo uma quantidade predeterminada do(s) ingrediente(s) ativo(s). O(s) ingrediente(s) ativo(s) pode(m) ser também administrado(s) como um bolus, eletuário ou pasta.

Na forma de dosagem sólida para administração oral da invenção

(cápsulas, comprimidos, pílulas, drágeas, pós, grânulos e similares), as prodroga(s), ingrediente(s) ativo(s) (na sua forma micronizada) é/são misturado(s) com um ou mais portadores farmaceuticamente aceitáveis, tais como citrato de sódio ou fosfato dicálcico, e/ou qualquer um dos seguintes: (1) 30 enchimentos ou aditivos, tais com amido, lactose, sucrose, glucose, manitol, e/ou ácido silícico; (2) aglutinantes, tais como, por exemplo, carboximetilcelulose, alginatos, gelatinas, polivinilpirrolidona, sucrose e/ou acácia; (3) umectantes, tais como glicerol; (4) agentes desintegrantes, tais como ágar-ágar, carbonato de cálcio, batata ou amido de tapioca, ácido algínico, alguns silicatos, e carbonato de sódio; (5) agentes de retardo de solução, tais como parafina; (6) aceleradores de absorção, tais como compostos de amônio quaternário; (7) agentes molhantes, tais como, por exemplo, álcool cetil e monoestearato de glicerol; (8) absorventes, tais como caulim e argila bentonita; (9) lubrificantes, tais como, estearato de cálcio, estearato de magnésio, propileno glicóis sólidos, Iauril sulfato de sódio, e mistura dos mesmos; (10) agentes corantes. No caso de cápsulas, tabletes e pílulas, a composição pode também incluir agentes tamponizantes. Composições sólidas de tipo similar podem também ser empregadas como enchimentos em cápsulas gelatinosas macias ou duras usando tais excipientes como Iactose ou açúcares de leite, bem como polietileno glicóis de alto peso molecular e similares.

Um comprimido pode ser produzido por compressão ou moldagem, opcionalmente com um ou mais ingredientes acessórios. Comprimidos prensados podem ser preparados usando aglutinante (por exemplo, gelatina ou hidroxipropilmetil celulose), lubrificante, diluente inerte, preservativo, 20 desintegrante (exemplo, amido glicolato de sódio ou carboximetilcelulose de sódio reticulada), agente tensoativo ou dispersante. Comprimidos moldados podem ser produzidos pela moldagem numa máquina adequada de uma mistura em pó do(s) ingrediente(s) ativo(s)umedecida com um diluente líquido inerte.

Os tabletes, e outras formas de dosagem sólida das composições

farmacêuticas da presente invenção, tais como drágeas, cápsulas, pílulas e grânulos, podem opcionalmente ser ranhurados ou preparados com revestimentos e envólucros, tais como revestimentos entéricos e outros revestimentos bem conhecidos na técnica de formulação farmacêutica. Eles 30 podem também ser formulados de modo a fornecer liberação lenta ou controlada do(s) ingrediente(s) ativo(s) usando, por exemplo, hidroxipropilmetilcelulose em proporções variáveis para fornecer o perfil de liberação desejado, outras matrizes polímeras, Iiposoma e/ou microesferas. Eles podem ser esterilizados por, por exemplo, filtração por um filtro que retenha bactérias. Estas composições podem também opcionalmente conter 5 agentes opacificantes e podem ser de uma composição que libere o(s) ingrediente(s) ativo(s) apenas, ou preferencialmente, numa certa porção do trato gastrointestinal, opcionalmente, de forma retardada. Exemplos de composições embutidas que podem ser usadas incluem substâncias poliméricas e ceras. 0(s) ingrediente(s) ativo(s) pode(m) também estar na 10 forma microencapsulada.

A forma de dosagem líquida para administração oral do(s) ingrediente(s) ativo(s) inclui emulsões, microemulsões, soluções, suspensões, xaropes e elixires farmaceuticamente aceitáveis. Além dos ingredientes ativos, a forma de dosagem líquida pode conter diluentes inertes comumente usados na técnica, 15 tais como, por exemplo, água ou outro solventes, agentes solubilizantes e emulsificadores, tais como álcool etílico, álcool isopropílico, etilacetato, álcool butil, benzoato de benzila, propileno glicol, glicol, óleos (em particular, óleos de semente de algodão, amendoim, milho, germe, oliva, castor e gergelim), glicerol, álcool amil, polietileno tetrahidrofuril glicóis e ésteres de ácidos graxos 20 de sorbitano, e mistura dos mesmos.

Além de diluentes inertes as composições orais podem também incluir adjuvantes tais como agentes molhantes, agentes emulsificadores e de suspensão, adoçantes, flavorizantes, corantes, perfumantes e preservativos. Suspensões podem, em adição ao(s) ingrediente(s) ativo(s), conter agentes de 25 suspensão como, por exemplo, álcoois etoxilados, sorbitol polioxietileno e ésteres de sorbitano, celulose mícrocristalína, metahidróxido de alumínio, bentonita, ágar-ágar e goma adragante, e mistura dos mesmos. Formulações das composições farmacêuticas da invenção para administração retal ou vaginal podem ser apresentadas como supositório, que pode ser preparado 30 pela mistura do(s) ingrediente(s) ativo(s) com um ou mais excipientes não irritantes apropriados ou portadores que incluam, por exemplo, manteiga de cacau, polietileno glicol, ceras ou salicilato e que seja sólido na temperatura ambiente, mas líquido na temperatura do corpo e, portanto, se derreterá no reto ou cavidade vaginal e liberará o(s) ingrediente(s) ativo(s). Formulações da presente invenção adequadas para administração vaginal também incluem 5 pessários, tampões, cremes, géis, pastas, espumas ou formulações de borrifador contendo tais portadores que sejam conhecidos na técnica como apropriados.

Formas de dosagem para administração tópicas ou transdérmica do(s) ingrediente(s) ativo(s) incluem pulverizadores, pomadas, pastas, cremes, 10 loções, géis, soluções, emplastros e inalantes. 0(s) ingrediente(s) ativo(s) podem ser misturados sob condições estéreis com portadores farmaceuticamente aceitáveis, tampões, ou propelentes que possam ser requeridos.

As pomadas, pastas, cremes e géis podem conter, além do(s) 15 ingrediente(s) ativo(s), excipientes, tais como gorduras animais e vegetais, óleos, ceras, parafinas, amido, goma adragante, derivados de celulose, polietileno glicóis, silicones, bentonitas, ácido silícico, talco e óxido de zinco ou mistura dos mesmos. Pós e borrifos podem conter, além do(s) ingrediente(s) ativo(s), excipientes tais como lactose, talco, ácido silícico, hidróxido de 20 alumínio, silicatos de cálcio e pó de políamida, ou mistura destas substâncias. Borrifos podem adicionalmente conter propelentes usuais tais como clorofluorhidrocarbonos, e hidrocarbonos voláteis não substituídos, tais como butano e propano.

Compostos da presente invenção podem ser administrados na forma 25 íntranasal pelo uso tópico de veículos intranasais apropriados, ou por rotas transdérmicas, usando aquelas formas de emplastros transdérmicos bem conhecidas daqueles com habilidade normal na técnica. Um sistema de entrega transdérmica proporciona administração contínua durante todo o regime de dosagem. Emplastros transdérmicos têm a vantagem adicional de 30 proporcionar a entrega controlada do(s) ingrediente(s) ativo(s) ao corpo. Tais formas de dosagem podem ser produzidas pela dissolução, dispersão ou de outra forma incorporação do(s) ingrediente(s) ativo(s) a um meio próprio, tal como um material de matriz de elastômero. Estimuladores de absorção podem também ser usados para aumentar o fluxo do(s) ingrediente(s) ativo(s) através da pele. A taxa de tal fluxo pode ser controlada tanto pela inclusão de uma 5 membrana de controle de fluxo quanto pela dispersão do(s) ingrediente(s) ativo(s) numa matriz de polímero or gel.

Os compostos da presente invenção podem também ser administrados na forma de sistemas de entrega de liposoma, tais como vesículas unilamelares pequenas, vesículas unilamelares grandes e vesículas multilamelares. Liposomas podem ser formados a partir de variedades de fosfolipídeo, tais como colesterol, estearilamina oufosfatidilcolina.

Outro modo de entrega dos compostos da presente invenção pode ser a entrega pelo uso de anticorpos monoclonais como portadores individuais aos quais as moléculas do composto são acopladas. Os compostos da presente 15 invenção podem também ser acoplados a polímeros solúveis como portadores direcionáveis de droga. Tais polímeros podem incluir polivinilpirrolidona, copolímero de pirano, polihidroxipropilmetacrilamida-fenol,

polihidroxietilaspartamida-fenol, ou polietilenoxido-polilisina substituída com resíduos de palmitoil. Ademais, os compostos da presente invenção podem ser acoplados a uma classe de polímeros biodegradáveis úteis para conseguir a liberação controlada de uma droga, por exemplo, ácido polilático, ácido poliglicólico, copolímeros de ácidos polilático e poliglicólico, poliépsilon caprolactona, ácido polihidroxi butírico, poliortoésteres, poliacetais, polidihidropiranos, policianoacrilatos e copolímeros em bloco ou hidrogéis com ligações transversais ou anfipáticas. Composições farmacêuticas desta invenção adequadas para administração parenteral incluem o(s) ingrediente(s) ativo(s) em combinação com uma ou mais solução de isotônicos aquosos ou não aquosos estéreis e farmaceuticamente aceitáveis, suspensões ou emulsões, ou pós estéreis que podem ser reconstituídos em soluções estéreis injetáveis ou dispersões imediatamente antes do uso, que podem conter antioxidantes, tampões, solutos que podem formar as formulações isotônicas com o sangue do recipiente alvo ou suspensão ou agentes espessantes.

Exemplos de portadores aquosos ou não aquosos que podem ser empregados nas composições farmacêuticas da invenção incluem água, etanol, polióis (tais como glicerol, propileno glicol, polietileno glicol, e similares), 5 e misturas adequadas dos mesmos, óleos vegetais, tais como azeite de oliva, e ésteres orgânicos injetáveis, tais como oleato de etila. Fluidez própria pode ser mantida, por exemplo, pelo uso de materiais de revestimento, tais como lecitina, pela manutenção do tamanho requerido de partícula e pelo uso de tensoativos.

Estas composições podem também conter adjuvantes tais como agentes

umectantes, agentes emulsificantes e agentes dispersantes. Pode também ser desejável incluir agentes isotônicos, tais como açúcares, cloreto de sódio, e similares nas composições. Ademais, absorção prolongada da forma farmacêutica injetável pode ser conseguida pela inclusão de agentes que retardam absorção tais como monoestearato de alumínio e gelatina.

Em alguns casos, para prolongar o efeito do(s) ingrediente(s) ativo(s), é desejável diminuir a absorção da droga em injeções subcutâneas ou intramusculares. Isto pode ser conseguido pelo uso de uma suspensão líquida de material cristalino ou amorfo com solubilidade pobre na água. A taxa 20 absorção do(s) ingrediente(s) ativo(s) então depende de sua taxa de dissolução, que por sua vez, pode depender do tamanho do cristal e da forma cristalina. Alternativamente, a absorção retardada do(s) ingrediente(s) ativo(s) administrado(s) parenteralmente é conseguida pela dissolução ou suspensão dos ingredientes ativos num veículo oleoso.

Formas de depósito injetáveis podem ser realizadas pela formação de

matrizes de. microcápsulas dos ingredientes ativos em polímeros biodegradáveis tais como polilactida-poliglicolida. Dependendo da proporção do(s) ingrediente(s) ativo(s) para o polímero, e da natureza do polímero particular empregado, a taxa de liberação do(s) ingrediente(s) ativo(s) pode ser 30 controlada. Exemplos de outros polímeros biodegradáveis incluem poli(ortoésteres) e poli(anidridos). Formulações de depósito injetáveis podem também ser preparadas pelo empacotamento do(s) ingrediente(s) ativo(s) em Iiposomas ou microemulsões que sejam compatíveis com o tecido do corpo. Os materiais injetáveis podem ser esterilizados por exemplo, por filtração através de um filtro retentor de bactérias.

5 As formulações podem ser apresentadas em invólucros selados de

dosagem unitária ou dosagens múltiplas, por exemplo, ampolas e frascos, que podem ser armazenadas numa condição Iiofilizada que requeira apenas a adição do portador estéril líquido, por exemplo água para injeção, imediatamente antes do uso. Soluções para injeções e suspensões 10 extemporâneas podem ser preparadas a partir de pós estéreis, grânulos e comprimidos do tipo acima descrito.

As composições farmacêuticas da presente invenção podem também ser usadas na forma de formulações veterinárias, incluindo aquelas adaptadas para o seguinte: (1) administração oral, por exemplo, pulverizações (soluções 15 ou suspensões aquosas ou não aquosas), comprimidos, boluses, pós, grânulos ou pastilhas para misturar com rações, pastas para a aplicação na língua; (2) administração parenteral, por ampola de injeção, subcutânea, intramuscular ou intravenosa, por exemplo, uma solução estéril ou suspensão, ou quando apropriado, por injeção intramamária em que a suspensão ou solução é 20 introduzida no úbere do animal através das suas tetas; (3) aplicação tópica, por exemplo, como um creme, pomada ou borrifo aplicado na pele; ou (4) intravaginalmente, por exemplo, com um pessário, creme ou espuma ou qualquer outro método adequado para aqueles experientes na técnica de administração a uma região de interesse.

Embora a presente invenção tenha sido descrita com referência a certas

concretizações, uma pessoa experiente na técnica apreciará que a presente invenção pode ser praticada por outras que não as concretizações descritas, que foram apresentadas com o propósito de ilustração e não de limitação. Portanto, o escopo das reivindicações anexas não deve ser limitado às descrições das concretizações aqui contidas.

Os métodos gerais da presente invenção fornecidos nos Esquemas 1 e 2 para a preparação dos compostos exemplificados nas Tabelas 1 e 2 acima são ainda melhor ilustrados nos exemplos que seguem. Especificamente os métodos fornecidos nos Esquemas 1 e 2 para a preparação de compostos Estradiol 6-alcoxialquif são ilustrados pelos exemplos 1-5 mostrados abaixo.

5 Um exemplo de avaliação da capacidade de ligação do receptor estrogênio está articulado no exemplo 4, e finalmente a avaliação do IC5o dos compostos preferenciais da presente invenção e sua eficácia comparativa é dada no exemplo 5. A menos que de outro modo especificado todo material inicial e reagentes são de grau de padrão comercial, e são usados sem maior 10 purificação, ou são facilmente preparados a partir de tais materiais por métodos rotineiros. Aqueles com experiência na técnica da síntese orgânica reconhecerão que os materiais iniciais e as condições das reações podem ser variadas para atingir o produto final desejado.

Exemplo 1

Métodos de Preparação da 6-hidroximetil-androsta-1,4-dieno-3,17 diona.

Num sistema de reação, quantidade suficiente de (+) androsta-1,4-dieno3,17-diona (ADD), 12,2 pirrolidina equivalentes, ácido aciético catalítico, etanol desnaturado (95/5 etanol/metanol) e 6-7% tetrahidrofurano (THF) foram aquecidos a uma temperatura entre 30 a 40 0C por um mínimo 16 horas para 20 formar 1,3-dipirrolidinoandrosta-3, 5-dieno-17ona. Quando o conteúdo de ADD atinge a menos de 3 % por área HPLC, ou se torna estático ou a dipirrolidinoandrostadieno resultante começa a reverter para ADD, a mistura de reação é resfriada a 5 + 5 °C. O composto resultante e então colhido e lavado com etanol desnaturado frio. Os rendimentos são de tipicamente 70-80 % 25 numa base seca com pureza tipicamente de 90-95 % por área HPLC porcento.

A 1,3-dipirrolidinoandrosta-3, 5 dieno~17ona resultante é então misturada numa quantidade de 1 equivalente, com 2,6 equivalentes de formalina (formaldeído) em 10 ml de diclorometano/g na temperatura ambiente. A mistura de reação é então acidificada a um pH de cerca de 2 com uma solução de 30 ácido sulfúrico a 2 %. Consequentemente, uma camada orgânica se forma, a qual é lavada com ácido sulfúrico a 2 % e 1:1 água/salmoura. É feita então a troca de solvente para tolueno (aproximadamente 10 ml/g) quando então o produto se cristaliza quando ocorre a troca por tolueno. O dito produto é colhido lavado e secado para proporcionar 6-hidroximetil-androsta 1,4-dieno~3,17 diona. Alguém com habilidade comum na técnica pode ainda modificar a 5 estereoquímica na posição 6, se assim desejar pelo emprego de técnicas conhecidas na área.

Exemplo 2

Um método de preparação dos compostos NDC-1022 e NDC-1033

Como esboçado no Esquema 2, derivados do estradiol NDC-1022 e NDC1033 foram sintetizados da seguinte forma.

O composto 2 do estradiol protegido é preparado pela reação do composto 1 com diidropirano em THF, usando o ácido toluenosulfônico ou ácido canforsulfônico como catalisador. Como alguém com habilidade comum na técnica pode apreciar esta reação é uma reação de equilíbrio e não 15 chegaria a se completar sobre tais condições. Assim, ambos estradiois monoprotegidos podem ser encontrados na mistura de reação. Tal mistura de reação crua poderia ser submetida a um passo de trituração com acetonitrila causando a cristalização do desejado estradiol bis-THP com aproximadamente 70% de rendimento.

Como mostrado no Esquema 2, o composto intermediário chave 3 é

obtido pela acilação na posição benzílica 6 com a mistura de base forte referida como LiDAKOR: butil lítio, diisopropilamina, e tert-amilato de potássio. Sob tais condições a -70 0C, alguém com habilidade normal na técnica pode apreciar a abstração de um próton na posição benzílica. O composto intermediário 3 é 25 então purificado por coluna de cromatografia para gerar um xarope com cerca de 50% de rendimento, contendo ainda impurezas menores e solventes da coluna. A redução do aldeído com um excesso de hidreto de lítio alumínio resulta em rendimentos altos para o estradiol hidroximetil racêmico composto 4 como uma espuma vítrea.

Para a finalidade preparação do NDC-1022 e do NDC 1033, o composto 7

intermediário metoximetil foi preparado por metilação do composto 4 com hidreto de sódio e iodeío de metil. O composto 7 foi purificado por coluna de cromatografia para proporcionar uma espuma vítrea. A desproteção do grupo protegido resultaria no composto 8 estradiol 6-metoximetil racêmico. A separação dos enantiômeros foi realizada usando preparativo quiral HPLC para 5 produzir os compostos NDC-1022 e NDC-1033. Para o composto NDC-1022, uma pureza quiral de > 95:5 R:S foi atingida. Para o composto NDC-1033, uma pureza quiral de 86:14 S:R foi atingida. Está bem dentro do nível de alguém com habilidade comum na técnica emprego de NMR para a determinação da estereoquímica absoluta da posição 6, onde os prótons 4- e 6- são diagnóstico.

Exemplo 3

Métodos de preparação de NDC-1055 e NDC-1066 Usando as mesmas metodologias descritas no Exemplo 2, o composto 4 é sintetizado. A desproteção do composto 4 é então conseguida com cloreto de hidrogênio em metanol catalítico, e o composto 5 racêmico foi separado com 15 um preparativo quiral HPLC para gerar 2 frações, uma enriquecida para NDC1055 e a outra enriquecida para NDC-1066. Para cada composto, para uma pureza quiral de > 95:5 R:S e S:R foi atingida respectivamente. A estereoquímica absoluta da posição 6 foi estabelecida por NMR, onde os prótons 4- e 6- são diagnóstico.

Exemplo 4

Métodos de determinação da capacidade de ligação do receptor estrogênio usando a atividade da Luciferase

O receptor-negativo de estrogênio de células CV-1 do rim foi mantido em meio Eagle modificado por Dulbecco com 4, 5 g/l de de glicose suplementada com 10 % de soro fetal bovino e 100 unidades/ml de penicilina-estreptomicina a 37 0C e uma atmosfera umidificada CO2 a 5 %.

As células foram então plaqueadas em pratos de 6 cavidades com uma densidade de 2 x 105 células por cavidade em meio Eagle modificado por Dulbecco livre de fenol vermelho contendo 10 % de soro fetal bovino despojado por carvão-dextrano. Células CV-1 foram transfectadas usando reagente Iipofectamina de acordo com o protocolo do fabricante. Transfecções contendo 1,5 pg de plasmídeos repórter (contendo ERE-tk-luciferase contendo um ERE simples clonado a montante da timidina quínase promotora e do gene luciferase) e 0, 5 pg do vetor de expressão ERa ou ER/À(contendo a seqüência de codificação de comprimento completa de CMV-ERa ou CMVER/Àrespectivamente). No próximo dia, as células não receberam nenhum tratamento (controles) ou foram tratadas apenas com estradiol mais um composto Endece (em concentrações variáveis). Depois de 16-24 horas, as células foram colhidas e ensaiadas para atividade luciferase. No início, as células monocamadas foram lavadas duas vezes com uma solução salina de fosfato-tampão na temperatura do gelo e incubadas por 15 minutos em 250 μΙ de 1X cultura de células Iise reagente (Promega, Madison, Wl). Extratos de células foram trasferidos para um tubo novo e ensaiadas usando o sistema de ensaio de luciferase (Promega). Para cada ensaio, 10 μΙ de extrato foi diluído com 90 μΙ de 1X cultura de células Iise reagente. A luminescência foi lida usando um luminômetro AutoLumat LB953.

Um composto ou um sal do mesmo, que é identificado pelo ensaio de ligação descrito aqui é um composto que inibe a ligação do estrodial no local de ligação do ligando dos receptores de estrogênio. Especificamente, é um composto ou um sal do mesmo que se imagina capaz de causar estase de 20 proliferação celular e conseqüentemente e exercer sua atividade farmacológica. Como indicado nas Figuras 3 e 4, os compostos NDC-1022, NDC-1033 exibem forte comportamento competitivo contra o estradiol na ligação a qualquer dos receptores estrogênios causando portanto a estase na atividade de proliferação das células.

Exemplo 5

Método de determinação dos valores IC50 dos compostos candidatos.

As linhas de células listadas foram mantidas a aproximadamente 5% CO2, 37 °C, 95% de umidade relativa no meio apropriado para a linha de célula. As células foram transplantadas a cada dois ou três dias e plaqueadas em placas com 96 cavidades e fundo transparente e uma densidade de 1 x 104 células/cavidade e incubadas a ca. 5% de CO2, 37 0C durante a noite antes do início do ensaio. Para começar o ensaio de viabilidade das células, o meio na placa de células (100 μΙ) foi substituído por um meio novo (100 μΙ). Os artigos de testes foram diluídos em série de 1:2 em meio novo em duplicata e adicionados às células (100 μΙ) na concentração final de amostras de 0,46,

5 1,37, 4,12, 12,35, 37,04, 111,1, 333,3 e 1000 μΜ (< 1% DMSO) um volume total de 200 μΙ. Cavidades que não continham células e cavidades contendo células Iisadas com 0,1 % de Triton-X foram usadas como linha de base de controle. Tamoxifeno foi usado com um controle conhecido para cada ensaio e DMSO será apenas executado como um veículo de controle. As amostras foram 10 incubadas a ca. 37 0C uma atmosfera umidificada a 5% CO2 por 72 horas. A placa foi monitorada uma vez por dia durante o período incubação, com especial atenção ao nível de confluência. Se a células aproximassem da confluência antes do fim do período de 72 horas de incubação o experimento era terminado naquele momento e a viabilidade das células medida como

descrito abaixo.

A viabilidade das células foi determinada usando um kit disponível comercialmente para terminar os níveis de ATP por luminescência. Sumariamente, a placa de células teve o meio removido e substituído por 100 μΙ de meio novo, e o tampão e o substrato Iiofilizado foram equilibrados para a 20 temperatura ambiente. O tampão foi usado para reconstituir o substrato diretamente antes da adição às cavidades da placa de células (100 μΙ por cavidade). As placas foram colocadas no leitor de placas Infinite M200, e foram deixadas em agitação por 10 minutos seguidos de 10 minutos de período de descanso, a placa foi lida usando um tempo de integração de 0, 5 segundos 25 sem atenuação.

A média da linha base de controle (cavidades com Triton X- 100 ou sem células) foi subtraída da luminescência total para resultar na luminescência líquida para aquela cavidade. Este resultado foi comparado apenas ao controle de DMSO. Um IC50 foi calculado com a concentração que conduzia uma resposta de 50% comparado ao veículo das células de controle.

As Figuras 5 e 6 exibem o resultado dos testes. Portanto, pessoas com habilidade normais na técnica podem apreciar que a configuração R da composição imediatamente reivindicado é superior ao dos outros estereoisômeros.

Claims (28)

1. Um composto com a seguinte estrutura: <formula>formula see original document page 47</formula> caracterizada por: R1 R2 R3 R4 R5 R6 R7 e Rs serem independentemente hidrogênio C1 a Cq alquila ou alquila substituído halógeno sulfato ou metades de glucuronida; o símbolo ™ representa tanto uma ligação simples quanto uma ligação dupla e quando o símbolo é uma ligação dupla e forma um grupo ceto na posição 3 ou 17 então nenhum R7 ou Rg está presente_ respectivamente; 0 símbolo — representa presença ou ausência de uma ligação na posição 10; e o símbolo ΛΛΛΛ representa qualquer tipo de ligação independente da estereoquímica; e os enantiômeros outros isômeros estereoquímicos hidratos solvatos tautômeros e sais farmaceuticamente aceitáveis dos ditos compostos

2. O composto da reivindicação 1 caracterizado por: R5 ser C1 a Cg alquila ou alquila substituído

3. O composto da reivindicação 1 caracterizado por: R5 é metila óu hidrogênio R1 R2 R3_ e R4 são hidrogênio e é uma ligação simples nas posições 3 e 17

4. O composto da reivindicação 3 caracterizado por: é R5 hidrogênio

5. O composto das reivindicações 3 ou 4 caracterizado por: o dito composto é o estereoisômero res

6. O composto da reivindicação 2 caracterizado por: R1, R2, R3i R4 Rg e R7 são independentemente hidrogênio metila ou etila

7. 0 composto da reivindicação 6 caracterizado por: o símbolo ΛΛΛΛ representar uma ligação formando um estereoisômero R ou S

8. Um composto tendo a seguinte estrutura: <formula>formula see original document page 48</formula> caracterizada por: Rl R2 R3 R4 são independentemente selecionados do grupo que consiste de H C1-Cg alquila alquila substituído e halógeno; e R5 Rgj R7 são independentemente selecionados do grupo que consiste de H C1-Cg alquila substituído sulfato e glucoronida e

9. O símbolo 22^ representa tanto uma ligação simples quanto uma dupla com a condição de que quando o símbolo é uma ligação dupla e forma um grupo ceto na posição 3 ou 17 então nenhum R7 ou Rg está respectivamente presente

10.O composto da reivindicação 8 caracterizado por: R5 é um C1 a Cg alquila ou alquila substituído

11.O composto da reivindicação 9 caracterizado por: Rg e R7 são independentemente selecionados de um grupo que consiste de metila hidrogênio ou um grupo HS03-

12.O composto da reivindicação 9 caracterizado por: R5 é metila ou hidrogênio e R1 R2( R3 R4_ é hidrogênio Um composto tendo a seguinte estrutura: <formula>formula see original document page 49</formula> caracterizada por:: R1 R2 R3i R4 Rg e Rg são independentemente selecionados do grupo que consiste de H C1-Cgalquila alquila substituído e halógeno R5 Rg R7 são independentemente selecionados do grupo que ConsistedeHiC1-CgaIquiIa alquila substituído sulfato ou glucoronida) e o símbolo representa tanto uma ligação simples quanto uma dupla com a condição de que quando o símbolo é uma ligação dupla e forma um grupo cèto na posição 3 ou 17 então nenhum R7 or Rg está respectivamente presente; o símbolo ΛΛΛΛ representa qualquer tipo de ligação e independentemente da estereoquímica; e o símbolo — representa a presença ou ausência de uma ligação na posição 10

13.O composto da reivindicação 12 caracterizado por: R5 é C1 a Cg alquila ou alquila substituído

14.O composto da reivindicação 13 caracterizado por: R5 é metila ou hidrogênio e R1 R2 R3 R4 é hidrogênio

15.Um composto tendo a seguinte estrutura: <formula>formula see original document page 50</formula> caracterizada por: R1 R3j R4 Rg são independentemente selecionados do grupo que consiste de H C1-Cg alquila alquila substituído e halógeno R5 R7 são independentemente selecionados do grupo que consiste de Hi C1-Cg alquila alquila substituído SuIfatOj ou glucoronida e ~ é uma ligação simples ou dupla

16. Uma composição farmacêutica incluindo os compostos da reivindicação 1 e um portador farmaceuticamente aceitável; caracterizado por: a dita composição incluir pelo menos um S enantiômero; R enantiômero; S diastereômero ou R diastereômero

17. Uma composição farmacêutica incluindo os compostos da reivindicação 8 e um portador farmaceuticamente aceitável; caracterizado por: a dita composição incluir pelo menos um S enantiômero; R enantiômero; S diastereômero ou R diastereômero

18. Uma composição farmacêutica incluindo os compostos da reivindicação 12 e um portador farmaceuticamente aceitável; caracterizado por: a dita composição incluir pelo menos um S enantiômero; R enantiômero; S diastereômero ou R diastereômero

19. O uma composição farmacêutica incluindo o composto da reivindicação15 e um portador farmaceuticamente aceitável caracterizado por: o dito composto incluir pelo menos um S enantiômero; R enantiômero; S diastereômero ou R diastereômero

20. Uma composição farmacêutica de acordo com qualquer das reivindicações 16 17 18 e 19 caracterizado por: o dito composto ser um diastereômero isolado S ou R nas posições3 e 17 e a composição é substancialmente livre de outros diastereômeros nas ditas posições

21. Um método de inibir o crescimento de células cancerígenas que compreende: fornecer uma célula de crescimento do câncer; e colocar em contacto com a dita célula do câncer um composto da reivindicação 1 8 12 e 15 o dito composto em uma quantidade ao menos parcialmente suficiente para inibir o o dito crescimento

22. O método da reivindicação 21 em que o dito composto ter a seguinte estrutura: <formula>formula see original document page 51</formula> caracterizada por: R1 R2i R3 R4 são independentemente selecionados do grupo que consiste de Hj C1-Cg alquila alquila SubStituidoi e halógeno R5 Rq e são independentemente selecionados do grupo que consiste de H C1-Cg alquila alquila substituído sulfato ou glucoronida e 0 símbolo — representa tanto ligação simples quanto uma ligação dupla com a condição de que quando o símbolo é uma ligação dupla e quando forma um grupo ceto na posição 17 então nenhum Rq está presente

23. O método da reivindicação 22 caracterizado por: a dita célula de crescimento do câncer incluir um tumor sólido selecionado do grupo de tumores sólidos que consistem de câncer dos SeioSj pancreático pulmão cólon próstata ovariano cérebro fígado baço rins nódulos linfáticos intestino delgado células sanguíneas osso estômago endométrio testicular ovário sistema nervoso central pele cabeça e pescoço esôfago e medula óssea

24. O método da reivindicação 23 caracterizado por: o dito composto e está na portador farmacêutico adequado

25. Um método de inibir o crescimento de células do câncer que compreende: administrar a umaregião do paciente necessitado em composto tendo a fórmula selecionada do grupo que consiste de: <formula>formula see original document page 52</formula> <formula>formula see original document page 53</formula>

26. Um método de inibir o crescimento de tumores sólidos em um mamífero hospedeiro que inclui a administração ao hospedeiro de uma quantidade terapeuticamente efetiva de um composto com uma seguinte estrutura: <formula>formula see original document page 54</formula> caracterizada por: Rl R2 R3 R4, R5 e Rg serem como acima descrito

27.O método da reivindicação 26 caracterizado por: o hospedeiro mamífero é um humano

28.O método da reivindicação 27 caracterizado por: o crescimento do tumor sólido representa um tumor sólido associado com um câncer selecionado do grupo que consiste de câncer dos seios pancreático pulmão cólon Prostataj ovariano cérebroj fígado baço rins nódulos linfáticos intestino delgadoj células sanguíneas osso estômago endométrio testicular ovário sistema nervoso central pele cabeça e pescoço esôfago e medula óssea