BRPI0813307B1 - composição imunogênica, vacina, e, processo para fabricar a vacina - Google Patents

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Abstract

composição imunogênica, vacina, e, processo para fabricar a vacina composição imunogênica a presente invenção divulga uma composição imunogênica que compreende conjugados de sacarídeo capsular de s. pneumoniae dos sorotipos 19a e 19f em que 19a é conjugado a um primeiro toxóide bacteriano e 19f é conjugado a um segundo toxóide bacteriano. vacinas, métodos de fabricar vacinas e usos das vacinas também são descritos.

Description

“COMPOSIÇÃO IMUNOGÊNICA, VACINA, E, PROCESSO PARA
FABRICAR A VACINA”
Campo da Invenção
A presente invenção diz respeito a uma vacina contra
Streptococcus pneumonia melhorada.
Fundamentos da Invenção
Crianças menores do que 2 anos de idade não montam uma resposta imune para a maioria das vacinas de polissacarídeo, assim tem sido necessário tomar os polissacarídeos imunogênicos pela conjugação química a um carreador de proteína. Ligar o polissacarídeo, um antígeno independente de T, a uma proteína, um antígeno dependente de T, confere ao polissacarídeo as propriedades de dependência de T incluindo a comutação de isótipo, maturação de afinidade e indução de memória.
Entretanto, pode haver problemas com a administração repetida de conjugados de polissacarídeo-proteína ou a combinação de conjugados de polissacarídeo-proteína para formar vacinas multivalentes. Por exemplo, foi relatado que uma vacina de polissacarídeo (PRP) tipo b de Haemophilus influenzae usando toxóide do tétano (TT) como o carreador de proteína foi testada em uma faixa de dosagem com imunização simultânea com TT (livre) e uma vacina conjugada de polissacarídeo pneumocócico-TT seguindo um programa infantil padrão. Como a dosagem da vacina pneumocócica foi aumentada, a resposta imune à porção de polissacarídeo de PRP da vacina conjugada com Hib foi diminuída, indicando interferência imune do polissacarídeo, possivelmente por intermédio do uso do mesmo carreador de proteína (Dagan et al., Infect Immun. (1998); 66:2093-2098).
O efeito da dosagem de carreador-proteína sobre a resposta humoral com a própria proteína também tem mostrado ser multifacetada. Em crianças humanas foi relatado que aumentar a dosagem de um conjugado do toxóide do tétano tetravalente resultou em uma resposta diminuída ao carreador de tétano (Dagan et al. supra). A análise clássica destes efeitos de vacinas de combinação foi descrita como supressão epitópica induzida por carreador, que não é totalmente entendida, mas acreditada resultar de uma quantidade em excesso de carreador de proteína (Fattom, Vaccine 17:126 (1999)). Isto parece resultar na competição para as células Th, pelas células B com o carreador de proteína e as células B para o polissacarídeo. Se as células B com o carreador de proteína predominam, não existe células Th suficientes disponíveis para fornecer a ajuda necessária para as células B específicas do polissacarídeo. Entretanto, os efeitos imunológicos observados foram incompatíveis, com a quantidade total de carreador de proteína em alguns casos aumentando a resposta imune e em outros casos diminuindo a resposta imune.
Consequentemente permanecem dificuldades técnicas na combinação de conjugados de polissacarídeo múltiplos em uma formulação de vacina única, eficaz.
Streptococcus pneumoniae é uma bactéria Gram positiva responsável por morbidez e mortalidade consideráveis (particularmente no jovem e no idoso), causando doenças invasivas tais como pneumonia, bacteremia e meningite e doenças associadas com a colonização, tais como Otite média aguda. A taxa de pneumonia pneumocócica nos US para pessoas acima de 60 anos de idade é estimadas ser de 3 a 8 por 100.000. Em 20% dos casos isto leva à bacteremia e outras manifestações tais como meningite, com uma taxa de mortalidade próxima aos 30% mesmo com tratamento antibiótico.
O pneumococo é encapsulado com um polissacarídeo quimicamente ligado que confere especificidade de sorotipo. Existem 90 sorotipos conhecidos de pneumococos e a cápsula é o componente determinante da virulência para os pneumococos, visto que a cápsula não apenas protege a superfície interna das bactérias de complemento, mas é ela própria deficientemente imunogênica. Os polissacarídeos são antígenos independentes de T e podem não ser processados ou apresentados nas moléculas MHC para interagir com as células T. Eles podem entretanto, estimular o sistema imune através de um mecanismo alternativo que envolve a reticulação de receptores de superfície nas células B.
Foi mostrado em vários experimentos que a proteção contra a doença pneumocócica invasiva está correlacionada mais fortemente com anticorpo específico para a cápsula e a proteção é específica de sorotipo.
Streptococcus pneumoniae é a causa mais comum de doença bacteriana invasiva e Otite média em bebês e crianças jovens. Do mesmo modo, o idoso monta respostas deficientes para as vacinas pneumocócicas [Roghmann et al., (1987), J. Gerontol. 42:265-270], consequentemente a incidência aumentada de pneumonia bacteriana nesta população [Verghese e Berk, (1983) Medicine (Baltimore) 62:271-285].
E assim um objetivo da presente invenção desenvolver uma formulação melhorada de uma vacina de conjugado de polissacarídeo de Streptococcus pneumoniae de sorotipo múltiplo.
Descrição Resumida das Figuras
Figura 1 Imunogenicidade de conjugado em macacos Rhesus idosos (níveis de IgG anti-PS pós-II) Diagrama de barras mostrando imunogenicidade de conjugado 11 valente em macacos Rhesus idosos. As barras mais claras representam a GMC depois de duas inoculações com conjugado 11 valente em adjuvante de fosfato de alumínio. As barras mais escuras representam a GMC depois de duas inoculações com conjugado 11 valente em adjuvante C.
Figura 2 Imunogenicidade de conjugado em macacos Rhesus idosos (frequências de célula B de memória pós-Π anti-PS3)
Diagrama de barras mostrando as células B de memória para PS3 depois da inoculação com o conjugado 11 valente em adjuvante C ou adjuvante de fosfato de alumínio.
Figura 3 Imunogenicidade de PS19F em camundongos Balb/c (níveis de IgG pós-ΙΠ) Diagrama de barras mostrando a imunogenicidade anti polissacarídeo 19F em camundongos Balb/C para os polissacarídeos 4-valentes puros e os conjugados de dPly 4-valentes.
Figura 4 Imunogenicidade de PS22F em camundongos Balb/C (níveis de IgG pós-ΠΙ) Diagrama de barras mostrando imunogenicidade anti polissacarídeo 22F em camundongos Balb/C para os polissacarídeos puros 4-valentes e os conjugados PhtD 4-valente.
Figura 5 Níveis de anticorpo IgG anti-PS Diagrama de barras mostrando a resposta de IgG anti-22F em camundongos Balb/C
Figura 6 Títulos de opsono-fagocitose anti-22F em camundongos Balb/C Diagrama de barras mostrando títulos de opsonofagocitose anti-22F em camundongos Balb/C.
Figura 7 Comparação de respostas de IgG induzidas em imunizações pós-ΙΠ em camundongos C57BI jovens com os novos adjuvantes ou A1PO4 Diagrama de barras comparando respostas de IgG induzidas em camundongos C57B1 jovens depois da imunização com vacina conjugada 13 Valente formulada em adjuvantes diferentes. As barras estão na mesma ordem indicada na coluna à direita.
Figura 8 Eficácia protetora da combinação de proteínas PhtD e dPly contra a colonização pulmonar tipo 19F em macacos Rhesus Diagrama de barras mostrando a eficácia protetora de combinações de vacina diferentes em um modelo de pneumonia de macaco. A categoria “morto” inclui macacos que poderíam ter morrido se não a administração de tratamento antibiótico.
Figura 9 Resposta de IgG anti-PhtD sérica Diagrama de barras mostrando respostas de IgG anti PhtD em camundongos Balb/C depois da imunização com conjugados 22F-PhtD ou 22F-AH-PhtD.
Figura 10 Proteção contra a inoculação pneumocócica tipo em camundongos Proteção contra a inoculação pneumocócica tipo 4 em camundongos depois da imunização com 22F-PhtD ou 22FAH-PhtD.
Figura 11 Proteção contra a inoculação letal com a cepa 3/43 de pneumoniae a seguir da imunização com PhtD e imunização passiva com anticorpos contra polissacarídeo sorotipo 3.
Figura 12 Proteção contra a inoculação letal com a cepa 1/57 de S. pneumoniae seguindo a imunização com PhtD e imunização passiva com anticorpos contra polissacarídeo sorotipo 1.
Figura 13 Títulos opsonofagocítico contra o sorotipo 19A em camundongos negros C57 velhos imunizados com vacinas conjugadas multivalentes.
Figura 14 Títulos opsonofagocíticos contra sorotipo 22F em camundongos negros C57 velhos imunizados com vacinas conjugadas multivalentes.
Figura 15 Títulos opsonofagocíticos contra sorotipo 19A em camundongos Balb/C imunizados com vacinas conjugadas multivalentes. Barra 2 - 11V + 19A-dPly gmbs + 22F-PhtD 0,1 μg/50 μΐ; barra 4 - 11V + 19A-dPly gmbs + 22F-PhtD-E 0,1 μg/50 μΐ; barra 6 2 - 11V + 19A-DT + 22F-PD 0,1 pg/50 μΐ
Figura 16 Títulos opsonofagocíticos contra sorotipo 22F em camundongos Balb/C imunizados com vacinas conjugadas multivalentes.
Figura 17 Títulos opsonofagocíticos contra sorotipo 19A em porquinhos da índia imunizados com vacinas conjugadas multivalentes.
Figura 18 Títulos opsonofagocíticos contra sorotipo 22F em porquinhos da índia imunizados com vacinas conjugadas multivalentes.
Figura 19 Títulos opsonofagocíticos contra sorotipo 19A em camundongos Balb/C imunizados com vacinas conjugadas multivalentes.
Figura 20 Títulos opsonofagocíticos contra sorotipo 22F em camundongos Balb/C imunizados com vacinas conjugadas multivalentes.
Figura 21 Títulos opsonofagocíticos contra sorotipo 19A em camundongos OF1 imunizados com vacinas conjugadas multivalentes.
Figura 22 Títulos opsonofagocíticos contra sorotipo 22F em camundongos OF1 imunizados com vacinas conjugadas multivalentes.
Descrição da invenção
A presente invenção fomece uma composição imunogênica que compreende conjugados de sacarídeo capsular de Streptococcus pneumoniae dos sorotipos 19A e 19F em que 19A é conjugado a um carreador de proteína que é um primeiro toxóide bacteriano e 19F é conjugado a um carreador de proteína que é um segundo toxóide bacteriano e 2 a 8 dos sacarídeos capsulares de S. pneumoniae são conjugados à proteína D.
O termo sacarídeo capsular inclui polissacarídeos capsulares e oligossacarídeos deriváveis do polissacarídeo capsular. Um oligossacarídeo contém pelo menos 4 resíduos de açúcar. Os termos conjugado e conjugado dizem respeito a um sacarídeo capsular covalentemente ligado a um carreador de proteína.
Para os propósitos desta invenção, “imunizar um hospedeiro humano contra exacerbações de COPD” ou “tratamento ou prevenção de exacerbações de COPD” ou “redução na severidade de exacerbações de COPD” refere-se a uma redução na incidência ou taxa de exacerbações de COPD (por exemplo uma redução na taxa de 0,1, 0,5, 1, 2, 5, 10, 20% ou mais), por exemplo dentro de um grupo de paciente imunizado com as composições ou vacinas da invenção.
O termo toxóide bacteriano inclui toxinas bacterianas que são inativadas pela mutação genética, pelo tratamento químico ou pela conjugação. Os toxóides bacterianos adequados incluem toxóide do tétano, toxóide da difteria, toxóide da coqueluche, citolisinas bacterianas ou pneumolisina. As mutações de pneumolisina (Ply) foram descritas que diminuem a toxicidade da pneumolisina (W090/06951, WO99/03884). Similarmente, as mutações genéticas da toxina da difteria que diminuem a sua toxicidade são conhecidas (ver abaixo). Os análogos geneticamente destoxificados da toxina da difteria incluem CRM197 e outros mutantes descritos na US 4.709.017, US 5.843.711, US 5.601.827 e US 5.917.017. CRM197 é uma forma não tóxica da toxina da difteria mas é imunologicamente indistinguível da toxina da difteria. CRM197 é produzida pela C. diphtheriae infectada pela fase não toxigênica β197ΐοχ criada pela mutagênese em nitrosoguanidina do carinefago b toxigênico (Uchida et al Nature New Biology (1971) 233; 8-11). A proteína CRM197 tem o mesmo peso molecular como a toxina da difteria mas difere da mesma por uma única mudança de base no gene estrutural. Isto leva a uma mudança de glicina para glutamina de aminoácido na posição 52 que toma o fragmento A incapaz de ligar NAD e portanto não tóxico (Pappenheimer 1977, Ann Rev, Biochem. 46; 69-94, Rappuoli Applied and Environmental Microbiology Set 1983 p560-564).
O primeiro e segundo toxóides bacterianos podem ser os mesmos ou diferentes. Onde o primeiro e segundo toxóides bacterianos são diferentes, é intencionado que eles tenham uma sequência de aminoácido diferente.
Por exemplo, 19A e 19F podem ser conjugados ao toxóide do tétano e toxóide do tétano; toxóide da difteria e toxóide da difteria; Crml97 e CRM197, pneumolisina e pneumolisina, toxóide do tétano e toxóide da difteria; toxóide do tétano e CRM197; toxóide do tétano e pneumolisina; toxóide da difteria e toxóide do tétano; toxóide da difteria e CRM197, toxóide da difteria e pneumolisina; CRM197 e toxóide do tétano, CRM197 e toxóide da difteria; CRM197 e pneumolisina; Pneumolisina e toxóide do tétano;
pneumolisina e toxóide da difteria; ou pneumolisina e CRM 197 respectivamente.
A composição imunogênica da invenção contém 2-8, 2-7, 2-6, 2-5, 3-5, 4-5, 2-4, 23, 3-4 ou 2, 3, 4, 5, 6, 7 ou 8 conjugados de sacarideo capsular em que proteína D é o carreador de proteína. Por exemplo, sacarideo from sorotipo 1, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19A, 19F, 22F ou 23F é conjugado à proteína D. Por exemplo, 2-8, 2-7, 2-6, 2-5, 3-5, 4-5, 2-4, 2-3, 34 ou 2, 3, 4, 5, 6, 7 ou 8 sacarídeos selecionados dos sorotipos 1, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19A, 19F, 22F e 23F são conjugados à proteína D.
Em uma forma de realização, sacarídeos pelo menos dos sorotipos 1 e 3, 1 e 4, 1 e 5, 1 e 6A, 1 e 6B, 1 e 7, 1 e 9V, 1 e 14, 1 e 22F, 1 e 23F, 3 e 4, 3 e 5, 3 e 6A, 3 e 6B, 3 e 7F, 3 e 9V, 3 e 14, 3 e 22F, 3 e 23F, 4 e 5, 4 e 6A, 4 e 6B, 4 e 7F, 4 e 9V, 4 e 14, 4 e 22F, 4 e 23F, 5 e 6A, 5 e 6B, 5 e 7F, 5 e 9V, 5 e 14, 5 e 22F, 5 e 23F, 6A e 6B, 6A e 7F, 6A e 9V, 6A e 14, 6A e 22F, 6A e 23F, 6B e 7F, 6B e 9V, 6B e 14, 6B e 22F, 6B e 23F, 7F e 9V, 7F e 14, 7F e 22F, 7F e 23F, 9V e 14, 9V e 22F, 9V e 23F, 14 e 22F, 14 e 23F ou 22F e 23F são conjugados à proteína D.
Em uma forma de realização, sacarídeos from pelo menos sorotipos 1, 3 e 4; 1, 3 e 5; 1, 3 e 6A; 1, 3 e 6B; 1, 3 e 7F; 1, 3 e 9V; 1, 3 e 14;
3, 4 e 7F; 3, 4 e 5; 3, 4 e 7F; 3, 4 e 9V; 3, 4 e 14; 4, 5 e 7F; 4, 5 e 9V; 4, 5 e 14; 5, 7F e 9V; 5, 7F e 14; 7F, 9V e 14; 1, 3, 4 e 5; 3, 4, 5 e 7F; 4, 5, 7F e 9V;
4, 5, 7F e 14; 4, 5, 9V e 14; 4, 7F, 9V e 14; 5, 7F, 9V e 14; ou 4, 5, 7F, 9V e 14 são conjugados à proteína D.
Em uma forma de realização, metade ou menos da metade ou uma minoria dos conjugados de sacarideo capsular presentes na composição imunogênica da invenção contêm proteína D como carreador de proteína. Por exemplo, em uma vacina contra a S. pneumoniae 10 valente, 2, 3, 4 ou 5 dos sacarídeos capsulares de sorotipos diferentes são conjugados à proteína D. Por exemplo, em uma vacina contra a S'. pneumoniae 11 valente, 2, 3, 4 ou 5 dos sacarídeos capsulares de sorotipos diferentes são conjugados à proteína D. Por exemplo, em uma vacina contra a S. pneumoniae 12 valente, 2, 3, 4, 5 ou 6 dos sacarídeos capsulares de sorotipos diferentes são conjugados à proteína D. Por exemplo, em uma vacina contra a S. pneumoniae 13 valente, 2, 3, 4, 5 ou 6 dos sacarídeos capsulares de sorotipos diferentes são conjugados à proteína D. Por exemplo, em uma vacina contra a S. pneumoniae 14 valente, 2, 3, 4, 5, 6 ou 7 dos sacarídeos capsulares de sorotipos diferentes são conjugados à proteína D. Por exemplo, em uma vacina contra a S. pneumoniae 15 valente, 2, 3, 4, 5, 6 ou 7 dos sacarídeos capsulares de sorotipos diferentes são conjugados à proteína D. Por exemplo, em uma vacina contra a S. pneumoniae 16 valente, 2, 3, 4, 5, 6, 7 ou 8 dos sacarídeos capsulares de sorotipos diferentes são conjugados à proteína D. Por exemplo, em uma vacina contra a S', pneumoniae 17 valente, 2, 3, 4, 5, 6, 7 ou 8 dos sacarídeos capsulares de sorotipos diferentes são conjugados à proteína D. Por exemplo, em uma vacina contra a S. pneumoniae 18 valente, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 ou 9 dos sacarídeos capsulares de sorotipos diferentes são conjugados à proteína D. Por exemplo, em uma vacina contra a S. pneumoniae 19 valente, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 ou 9 dos sacarídeos capsulares de sorotipos diferentes são conjugados à proteína D. Opcionalmente, os sorotipos conjugados à proteína D são selecionados dos grupos descritos acima.
Em uma forma de realização, além dos conjugados de sacarídeo da 5. pneumoniae de 19A e 19F, a composição imunogênica compreende ainda os conjugados de sacarídeos capsulares da S. pneumoniae 4, 6B, 9V, 14, 18Ce23F.
Em uma forma de realização, além dos conjugados de sacarídeo da S. pneumoniae de 19A e 19F, a composição imunogênica compreende ainda os conjugados de sacarídeos capsulares da S', pneumoniae 1, 4, 5, 6B, 7F, 9V, 14, 18C e 23F.
Em uma forma de realização, além dos conjugados de sacarídeo da S. pneumoniae de 19A e 19F, a composição imunogênica compreende ainda os conjugados de sacarídeos capsulares da ó. pneumoniae
1, 4, 5, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 22F e 23F.
Em uma forma de realização, além dos conjugados de sacarídeo da S. pneumoniae de 19A e 19F, a composição imunogênica compreende ainda os conjugados de sacarídeos capsulares da S', pneumoniae 1, 3, 4, 5, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 22F e 23F.
Em uma forma de realização, além dos conjugados de sacarídeo da S. pneumoniae de 19A e 19F, a composição imunogênica compreende ainda os conjugados de sacarídeos capsulares da S. pneumoniae 1, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 22F e 23F.
Tipicamente a vacina contra a Streptococcus pneumoniae da presente invenção compreenderá antígenos de sacarídeo capsular (opcionalmente conjugados), em que os sacarídeos são derivados de pelo menos dez sorotipos de S. pneumoniae. O número de sacarídeos capsulares da
S. pneumoniae podem variar de 10 sorotipos diferentes (ou “v”, valências) a 23 sorotipos diferentes (23v). Em uma forma de realização existem 10, 11, 12, 13, 14 ou 15 sorotipos diferentes. Em uma outra forma de realização da invenção, a vacina pode compreender sacarídeos de conjugados de S. pneumoniae e sacarídeos de S', pneumoniae não conjugados. Opcionalmente, o número total de sorotipos de sacarídeo é menor do que ou igual a 23. Por exemplo, a invenção pode compreender 10 sorotipos conjugados e 13 sacarídeos não conjugados. Em uma maneira similar, a vacina pode compreender 11, 12, 13, 14 ou 16 sacarídeos conjugados e 12, 11, 10, 9 ou 7 sacarídeos não conjugados, respectivamente.
Em uma forma de realização a vacina pneumocócica multivalente da invenção será selecionada dos seguintes sorotipos 1, 2, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 8, 9N, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15, 17F, 18C, 19A, 19F, 20, 22F, 23F e 33F, embora seja avaliado que um ou dois outros sorotipos podem ser substituídos dependendo da idade do receptor que recebe a vacina e a localização geográfica onde a vacina será administrada. Por exemplo, uma vacina 10-valente pode compreender polissacarídeos dos sorotipos 1, 4, 5, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19F e 23F. Uma vacina 11-valente também pode incluir sacarídeos do sorotipo 3 ou 19A. Uma vacina pediátrica (criança) 12 ou 13valente também pode incluir a formulação 11 valente (contendo sacarídeo do sorotipo 3) suplementada com sorotipos 6A e 19A ou 6A e 22F ou 19A e 22F ou 6A e 15 ou 19A e 15 ou 22F e 15, ao passo que uma vacina de idoso 13valente pode incluir a formulação 10 ou 11 valente suplementada com sorotipos 19A e 22F, 8 e 12F ou 8 e 15 ou 8 e 19A ou 8 e 22F ou 12F e 15 ou 12F e 19A ou 12F e 22F ou 15 e 19A ou 15 e 22F. Uma vacina pediátrica 14 valente pode incluir a formulação 10 valente descrita acima suplementada com sorotipos 3, 6A, 19A e 22F; sorotipos 6A, 8, 19A e 22F; sorotipos 6A, 12F, 19A e 22F; sorotipos 6A, 15, 19A e 22F; sorotipos 3, 8, 19A e 22F; sorotipos 3, 12F, 19A e 22F; sorotipos 3, 15, 19A e 22F; sorotipos 3, 6A, 8 e 22F; sorotipos 3, 6A, 12F e 22F; ou sorotipos 3, 6A, 15 e 22F.
A composição em uma forma de realização inclui sacarídeos capsulares derivados de sorotipos 1, 4, 5, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19F e 23F (opcionalmente conjugados). Em uma outra forma de realização da invenção pelo menos 11 antígenos de sacarídeo (opcionalmente conjugados) são incluídos, por exemplos sacarídeos capsulares derivados de sorotipos 1, 3, 4, 5, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19F e 23F. Em uma outra forma de realização da invenção, pelo menos 12 ou 13 antígenos de sacarídeo são incluídos, por exemplo uma vacina pode compreender sacarídeos capsulares derivados de sorotipos 1, 3, 4, 5, 6A, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19A, 19F e 23F ou sacarídeos capsulares derivados de sorotipos 1, 3, 4, 5, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19A, 19F, 22F e 23F, embora outros antígenos de sacarídeo, por exemplo 23 valente (tais como sorotipos 1, 2, 3, 4, 5, 6B, 7F, 8, 9N, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15, 17F, 18C, 19A, 19F, 20, 22F, 23F e 33F), também sejam considerados pela invenção.
A composição imunogênica da presente invenção compreende proteína D (PD) de Haemophilus influenzae (ver por exemplo a EP 0594610 Fig 9). Haemophilus influenzae é um organismo causativo chave da otite média e os presentes inventores têm mostrado que a inclusão desta proteína em uma vacina contra a Streptococcus pneumoniae fornecerá um nível de proteção contra otite média relacionada com a Haemophilus influenzae (Pirmula et al Lancet 367; 740-748 (2006)). Em um aspecto, a PD está presente como um carreador de proteína para um ou mais dos sacarídeos. Em um outro aspecto, a proteína D pode estar presente na composição de vacina como uma proteína livre. Em um outro aspecto, a proteína D está presente tanto como um carreador de proteína quanto como proteína livre. A Proteína D pode ser usada como uma proteína de tamanho natural ou como um fragmento (W00056360). Em um outro aspecto, a proteína D está presente como um carreador de proteína para a maioria dos sacarídeos, por exemplo 6, 7, 8, 9 ou mais dos sacarídeos podem estar conjugados à proteína D. Neste aspecto, a proteína D também pode estar presente como proteína livre.
A vacina da presente invenção compreende dois ou mais tipos diferentes de carreador de proteína. Cada tipo de carreador de proteína pode atuar como carreador para mais do que um sacarídeo, sacarídeos estes que podem ser os mesmos ou diferentes. Por exemplo, os sorotipos 3 e 4 podem estar conjugados ao mesmo carreador de proteína, à mesma molécula de carreador de proteína ou a moléculas diferentes do mesmo carreador de proteína. Em uma forma de realização, dois ou mais sacarídeos diferentes podem estar conjugados ao mesmo carreador de proteína, à mesma molécula de carreador de proteína ou a moléculas diferentes do mesmo carreador de proteína.
Quaisquer sacarídeos capsulares de Streptococcus pneumoniae presentes na composição imunogênica da invenção à parte de 19A e 19F podem ser conjugados a um carreador de proteína independentemente selecionado do grupo que consiste de TT, DT, CRM197, fragmento C de TT, PhtD, PhtBE ou fusões de PhtDE (particularmente aquelas descritas na WOO 1/98334 e W003/54007), pneumolisina destoxificada e proteína D. Uma lista mais completa de carreadores de proteína que podem ser usados nos conjugados da invenção é apresentada abaixo.
O carreador de proteína conjugado a um ou mais dos sacarídeos capsulares da S. pneumoniae nos conjugados presentes nas composições imunogênicas da invenção é opcionalmente um membro das proteínas da família da tríade da poliistidina (Pht), fragmentos ou proteínas de fusão destas. As proteínas PhtA, PhtB, PhtD ou PhtE podem ter uma seqüência de aminoácido compartilhando 80%, 85%, 90%, 95%, 98%, 99% ou 100% de identidade com uma sequência divulgada na WO00/37105 ou WOOO/39299 (por exemplo com as sequências de aminoácido 1-838 ou 21838 da SEQ ID NO:4 da WO00/37105 para PhtD). Por exemplo, as proteínas de fusão são compostas de tamanho natural ou fragmentos de 2, 3 ou 4 de PhtA, PhtB, PhtD, PhtE. Os exemplos de proteínas de fusão são PhtA/B, PhtA/D, PhtA/Ε, PhtB/A, PhtB/D, PhtB/Ε, PhtD/A, PhtD/B, PhtD/Ε, PhtE/A, PhtE/B e PhtE/D, em que as proteínas são ligadas com o primeiro mencionado no terminal N (ver por exemplo WOO1/98334).
Onde os fragmentos de proteínas Pht são usados (separadamente ou como parte de uma proteína de fusão), cada fragmento opcionalmente contém um ou mais motivos da tríade da histidina e/ou regiões de espiral espiralada de tais polipeptídeos. Um motivo da tríade da histidina é a porção de polipeptídeo que tem a sequência HxxHxH onde H é histidina e x é um aminoácido outro que não histidina. Uma região de espiral espiralada é uma região prognosticada pelo algoritmo “Coils” Lupus, A et al (1991) Science 252; 1162-1164. Em uma forma de realização o ou cada fragmento inclui um ou mais motivos da tríade de histidina assim como pelo menos uma região de espiral espiralada. Em uma forma de realização, o ou cada fragmento contém exatamente ou pelo menos 2, 3, 4 ou 5 motivos da tríade de histidina (opcionalmente, com native Pht sequências entre as 2 ou mais tríades ou sequência intra-tríade que é mais do que 50, 60, 70, 80, 90 ou 100% idêntica a uma sequência de Pht intra-tríade pneumocócica nativa - por exemplo a sequência intra-tríade mostrada na SEQ ID NO:4 da WO00/37105 para PhtD). Em uma forma de realização, o ou cada fragmento contém exatamente ou pelo menos 2, 3 ou 4 regiões de espiral espiralada. Em uma forma de realização uma proteína Pht aqui divulgada inclui a proteína de tamanho natural com a sequência de sinal ligada, a proteína de tamanho natural madura com o peptídeo de sinal (por exemplo 20 aminoácidos no terminal N) removido, as variantes que ocorrem naturalmente da proteína Pht e fragmentos imunogênico da proteína Pht (por exemplo fragmentos como descritos acima ou polipeptídeos que compreendem pelo menos 15 ou 20 aminoácidos contíguos de uma sequência de aminoácido na WO00/37105 (SEQ ID NOs 4, 6, 8 ou 10) ou WOOO/39299 (SEQ ID NOs 2, 4, 6, 8, 10 ou 14) em que o dito polipeptídeo é capaz de eliciar uma resposta imune específica para a dita sequência de aminoácido na WOOO/37105 ou WOOO/39299.
Em particular, o termo “PhtD” como aqui usado inclui a proteína de tamanho natural com a sequência de sinal ligada, a proteína de tamanho natural madura com o peptídeo de sinal (por exemplo 20 aminoácidos no terminal N) removido, variantes que ocorrem naturalmente de PhtD e fragmentos imunogênicos de PhtD (por exemplo fragmentos como descritos acima ou polipeptídeos que compreendem pelo menos 15 ou 20 aminoácidos contíguos de uma sequência de aminoácido de PhtD na WOOO/37105 ou WOOO/39299 em que o dito polipeptídeo é capaz de eliciar um resposta imune específica para a dita sequência de aminoácido de PhtD na WOOO/37105 ou WOOO/39299 (por exemplo a SEQ ID NO:4 da
WO00/37105 ou SEQ ID NO: 14 da WOOO/39299 para PhtD). Todas as formas de PhtD mencionadas acima podem ser usadas na presente invenção.
Se o carreador de proteína for o mesmo para 2 ou mais sacarídeos na composição, os sacarídeos podem ser conjugados à mesma molécula do carreador de proteína (moléculas carreadoras tendo 2 ou mais sacarídeos diferentes conjugados às mesmas) [ver por exemplo a W004/083251]. Altemativamente os sacarídeos podem ser cada um separadamente conjugados a moléculas diferentes do carreador de proteína (cada molécula de carreador de proteína tendo apenas um tipo de sacarídeo conjugado à mesma).
Os exemplos de proteínas carreadoras que podem ser usadas na presente invenção são DT (toxóide da difteria), TT (toxóide do tétano) ou fragmento C de TT, DT CRM197 (um mutante de DT) outros mutantes pontuais de DT, tais como CRM176, CRM228, CRM45 (Uchida et al J. Biol. Chem. 218; 3838-3844, 1973); CRM 9, CRM 45, CRM102, CRM 103 e CRM107 e outras mutações descritas por Nicholls e Youle em Genetically Engineered Toxins, Ed: Frankel, Maecel Dekker Inc, 1992; deleção ou mutação de Glu-148 para Asp, Gin ou Ser e/ou Ala 158 para Gly e outras mutações divulgadas na US 4709017 ou US 4950740; a mutação de pelo menos um ou mais resíduos Lys 516, Lys 526, Phe 530 e/ou Lys 534 e outras mutações divulgadas na US 5917017 ou US 6455673; ou fragmento divulgado na US 5843711, pneumolisina pneumocócica (Kuo et al (1995) Infect Immun 63; 2706-13) incluindo ply destoxificado de alguma maneira por exemplo dPLY-GMBS (W004081515, PCT/EP2005/010258) ou dPLYformol, PhtX, incluindo PhtA, PhtB, PhtD, PhtE e fusões de proteína Phts por exemplo fusões de PhtDE, fusões de PhtBE (WOO 1/98334 e W003/54007), (Pht A-E são descritos em mais detalhes abaixo) OMPC (proteína de membrana externa meningocócica - usualmente extraída da N. meningitidis sorogrupo B — EP0372501), PorB (da N. meningitidis), PD (proteína D de
Haemophilus influenzae — ver, por exemplo, EP 0 594 610 B) ou equivalentes destas imunologicamente funcionais, peptídeos sintéticos (EP03 78881, EP0427347), proteínas de choque térmico (WO93/17712, W094/03208), proteínas da coqueluche (WO98/58668, EP0471177), citocinas, linfocinas, fatores de crescimento ou hormônios (WO91/01146), proteínas artificiais que compreendem epítopos de célula T CD4+ humanos múltiplos de antígenos derivados de vários patógenos (Falugi et al (2001) Eur J Immunol 31; 38163824) tais como a proteína NI9 (Baraldoi et al (2004) Infect Immun 72; 4884-7) proteína de superfície pneumocócica PspA (W002/091998), proteínas de captação de ferro (WOOl/72337), toxina A ou B de C. difficile (WOOO/61761).
Nurkka et al Pediatric Infectious Disease Journal. 23(11):1008-14, Nov. de 2004 descreve uma vacina pneumocócica 11 valente com todos os sorotipos conjugados a PD. Entretanto, os presentes inventores têm mostrado que a atividade opsonofagocítica foi melhorada para os anticorpos induzidos com conjugados tendo 19F conjugado a DT comparado com 19F conjugado a PD. além disso, os presentes inventores têm mostrado que uma reatividade cruzada maior para 19A é observada com 19F conjugado a DT. E portanto uma característica da composição da presente invenção que o sorotipo 19F é conjugado a um toxóide bacteriano, por exemplo TT, pneumolisina, DT ou CRM 197. Em um aspecto, o sorotipo 19F é conjugado a DT. também é uma característica da invenção que o sorotipo 19A é conjugado a um toxóide bacteriano, por exemplo TT, pneumolisina, DT ou CRM 197. Os sorotipos de sacarídeo remanescentes da composição imunogênica podem ser todos conjugados a uma ou mais proteínas carreadoras que não são DT (isto é, apenas 19F é conjugada a DT) ou pode ser dividida entre uma ou mais proteínas carreadoras que não são DT e o próprio DT. Em uma forma de realização, 19F é conjugado a DT ou CRM 197 e os sorotipos remanescentes são dividido entre PD e TT ou DT ou CRM
197. Em uma outra forma de realização, 19F é conjugado a DT ou CRM 197 e não mais do que um sacarídeo é conjugado a TT. Em um aspecto desta forma de realização, o dito um sacarídeo é 18C ou 12F. Em uma outra forma de realização, 19F é conjugado a DT ou CRM 197 e não mais do que dois sacarídeos são conjugados a TT. Em uma outra forma de realização, 19F é conjugado a DT ou CRM 197 e os sorotipos remanescentes são divididos entre PD, TT e DT ou CRM 197. Em uma outra forma de realização, 19F é conjugado a DT ou CRM 197 e os sorotipos remanescentes são divididos entre PD, TT e pneumolisina. Em uma outra forma de realização, 19F é conjugado a DT ou CRM 197 e os sorotipos remanescentes são divididos entre PD, TT e CRM 197. Em uma outra forma de realização, 19F é conjugado a DT ou CRM 197 e os sorotipos remanescentes são divididos entre PD, TT, pneumolisina e opcionalmente PhtD ou proteína de fusão de PhtD/E. Em uma outra forma de realização, 19F é conjugado a DT ou CRM 197, 19A é conjugado à pneumolisina ou TT e os sorotipos remanescentes são divididos entre PD, TT, pneumolisina e opcionalmente PhtD ou proteína de fusão de PhtD/E. Em uma outra forma de realização, 19F é conjugado a DT ou CRM197, 19A é conjugado à pneumolisina ou TT, um outro sacarídeo é conjugado a TT, um outro sacarídeo é conjugado à PhtD ou PhtD/E e todos os outros sacarídeos são conjugados a PD. Em uma outra forma de realização 19F é conjugado a DT ou CRM197, 19A é conjugado à pneumolisina, um outro sacarídeo é conjugado à TT, um outro sacarídeo é conjugado à pneumolisina, 2 outros sacarídeos são conjugados a PhtD ou PhtD/E e todos os outros sacarídeos são conjugados a PD.
O termo “sacarídeo” por todo este relatório descritivo pode indicar polissacarídeo ou oligossacarídeo e inclui ambos. Os polissacarídeos são isolados de bactérias e podem ser dimensionados em algum grau pelos métodos conhecidos (ver por exemplo EP497524 e EP497525) e opcionalmente pela microfluidização. Os polissacarídeos podem ser dimensionados de modo a reduzir a viscosidade em amostras de polissacarídeo e/ou melhorar a filtrabilidade dos produtos conjugados. Os oligossacarídeos têm um número baixo de unidades de repetição (tipicamente a 30 unidades de repetição) e são tipicamente polissacarídeos hidrolisados.
Os polissacarídeos capsulares de Streptococcus pneumoniae compreendem unidades de oligossacarídeo de repetição que podem conter até 8 resíduos de açúcar. Para uma revisão das unidades de oligossacarídeo para os sorotipos de Streptococcus pneumoniae chave ver JONES, Christopher. Vaccines based on the cell surface carbohydrates of pathogenic bacteria. An. Acad. Bras. Ciênc., Junho de 2005, vol. 77, no. 2, p. 293-324. Tabela IIISSN 00013765. Em uma forma de realização, um antígeno de sacarideo capsular pode ser um polissacarídeo de tamanho natural, entretanto em outras o mesmo pode ser uma unidade de oligossacarídeo ou uma cadeia de sacarideo de comprimento mais curto do que a nativa de unidades de oligossacarídeo de repetição. Em uma forma de realização, todos os sacarídeos presentes na vacina são polissacarídeos. Os polissacarídeos de tamanho natural podem ser “dimensionados” isto é, o seu tamanho pode ser reduzido por vários métodos tais como tratamento com hidrólise ácida, tratamento com peróxido de hidrogênio, classificação por emulsiflex® seguido por um tratamento com peróxido de hidrogênio para gerar fragmentos de oligossacarídeo ou microfluidização.
Os inventores também mencionaram que o foco da técnica tem sido usar oligossacarídeos quanto a facilidade de produzir conjugado. Os inventores descobriram que pelo uso de conjugados de polissacarídeo nativos ou levemente dimensionados, uma ou mais das seguintes vantagens podem ser realizadas: 1) um conjugado tendo alta imunogenicidade que é filtrável, 2) a razão de polissacarídeo para proteína no conjugado pode ser alterada tal que a razão de polissacarídeo para proteína (p/p) no conjugado possa ser aumentada (que pode ter um efeito sobre o efeito de supressão de carreador),
3) conjugados imunogênico propensos à hidrólise podem ser estabilizados pelo uso de sacarídeos maiores para a conjugação. O uso de polissacarídeos maiores pode resultar em mais reticulação com o conjugado carreador e pode diminuir a liberação de sacarídeo livre do conjugado. As vacinas conjugadas descritas na técnica anterior tendem a despolimerizar os polissacarídeos antes da conjugação de modo a melhorar a conjugação. Os presentes inventores descobriram que as vacinas de conjugado de sacarídeo que retêm um tamanho grande de sacarídeo podem fornecer uma boa resposta imune contra a doença pneumocócica.
A composição imunogênica da invenção pode assim compreender um ou mais conjugados de sacarídeo em que o tamanho médio (peso molecular médio ponderado; Mw) de cada sacarídeo antes da conjugação está acima de 80kDa, lOOkDa, 200kDa, 300kDa, 400kDa, 500kDa ou lOOOkDa. Em uma forma de realização o conjugado pós conjugação deve ser facilmente filtrável através de um filtro de 0,2 micron tal que um rendimento de mais do que 50, 60, 70, 80, 90 ou 95% seja obtido após a filtração comparado com a amostra na pré filtração.
Para os propósitos da invenção, “polissacarídeo nativo” referese a um sacarídeo que não foi submetido a um processo, o propósito do qual é reduzir o tamanho do sacarídeo. Um polissacarídeo pode se tomar levemente reduzido no tamanho durante procedimentos de purificação normal. Um tal sacarídeo é ainda nativo. Apenas se o polissacarídeo fosse submetido às técnicas de classificação por tamanho o polissacarídeo não seria considerado nativo.
O tamanho de um polissacarídeo nativo está por exemplo entre 250kDa a 2.000kDa, 400 a 1.500kDa, 750kDa a 1.250kDa, 300kDa a 600kDa, 500 a l.OOOkDa ou 1.000 a 1.500kDa com sorotipos diferentes tendo tamanhos diferentes de polissacarídeo nativo como será avaliado pela pessoa habilitada.
Para os propósitos da invenção, “dimensionado por um fator de até x2” significa que o sacarídeo é submetido a um processo intencionado a reduzir o tamanho do sacarídeo mas para reter um tamanho maior do que a metade do tamanho do polissacarídeo nativo. x3, x4 etc. devem ser interpretados do mesmo modo isto é, o sacarídeo é submetido a um processo intencionado a reduzir o tamanho do polissacarídeo mas para reter um tamanho maior do que um terço, um quarto etc., do tamanho do polissacarídeo nativo.
Em um aspecto da invenção, a composição imunogênica compreende sacarídeos de Streptococcus pneumoniae de pelo menos 10 sorotipos conjugados a um carreador de proteína, em que pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou cada sacarídeo de S. pneumoniae é polissacarídeo nativo.
Em um aspecto da invenção, a composição imunogênica compreende sacarídeos de Streptococcus pneumoniae de pelo menos 10 sorotipos conjugados a um carreador de proteína, em que pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou cada sacarídeo de S', pneumoniae é dimensionado por um fator de até x2, x3, x4, x5, xó, x7, x8, x9 ou xlO. Em uma forma de realização deste aspecto, a maioria dos sacarídeos, por exemplo 6, 7, 8 ou mais dos sacarídeos são dimensionados por um fator de até x2, x3, x4, x5, xó, x7, x8, x9 ou xlO.
O peso molecular ou peso molecular médio de um sacarídeo aqui refere-se ao peso molecular médio ponderado (Mw) do sacarídeo medido antes da conjugação e é medido por MALLS.
A técnica MALLS é bem conhecida no ramo e é tipicamente realizada como descrito no exemplo 2. Para a análise de MALLS de sacarídeos pneumocócicos, duas colunas (TSKG6000 e 5000PWxl) podem ser usadas em combinação e os sacarídeos são eluídos em água. Os sacarídeos são detectados usando um detetor de dispersão de luz (por exemplo Wyatt Dawn DSP equipado com um laser de argônio de 10 mW a 488 nm) e um refratômetro inferométrico (por exemplo Wyatt Otilab DSP equipado com uma célula P100 e um filtro vermelho a 498 nm).
Em uma forma de realização os sacarídeos de S. pneumoniae são polissacarídeos nativos ou polissacarídeos nativos que foram reduzidos no tamanho durante um processo de extração normal.
Em uma forma de realização, os sacarídeos de S. pneumoniae são dimensionados pela divagem mecânica, por exemplo pela microfluidização ou sonificação. A microfluidização e sonificação têm a vantagem de diminuir o tamanho dos polissacarídeos nativos maiores suficientemente para fornecer um conjugado filtrável. A classificação por tamanho é por um fator de não mais do que x20, xlO, x8, x6, x5, x4, x3 ou x2.
Em uma forma de realização, a composição imunogênica compreende conjugados de S. pneumoniae que são fabricados a partir de uma mistura de polissacarídeos nativos e sacarídeos que são dimensionados por um fator de não mais do que x20. Em um aspecto desta forma de realização, a maioria dos sacarídeos, por exemplo 6, 7, 8 ou mais dos sacarídeos são dimensionados por um fator de até x2, x3, x4, x5 ou x6.
Em uma forma de realização, o sacarídeo de Streptococcus pneumoniae é conjugado à proteína carreadora por intermédio de um ligador, por exemplo um ligador bifuncional. O ligador é opcionalmente heterobifuncional ou homobifuncional, tendo por exemplo um grupo amino reativo e um grupo de ácido carboxílico, 2 grupos amino reativos ou dois grupos de ácido carboxílico. O ligador tem por exemplo entre 4 e 20, 4 e 12, 5 e 10 átomos de carbono. Um ligador possível é ADH. Outros ligadores incluem B-propionamido (WO00/10599), nitrofenil-etilamina (Geyer et al (1979) Med. Microbiol. Immunol. 165; 171-288), haletos de haloalquila (US4057685), ligações glicosídicas (US4673574, US4808700), hexano diamina e ácido 6-aminocapróico (US4459286). Em uma forma de realização, ADH é usado como um ligador para conjugar sacarídeo do sorotipo 18C.
Os conjugados de sacarídeo presentes nas composições imunogênicas da invenção podem ser preparadas por qualquer técnica de ligação conhecida. O método de conjugação pode contar com a ativação do sacarídeo com tetrafluoroborato de 1-ciano-4-dimetilamino piridínio (CDAP) para formar um éster de cianato. O sacarídeo ativado pode ser assim ligado diretamente ou por intermédio de um grupo espaçador (ligador) a um grupo amino na proteína carreadora. Por exemplo, o espaçador pode ser cistamina ou cisteamina para dar um polissacarídeo tiolado que pode ser ligado ao carreador por intermédio de uma ligação de tioéter obtida depois da reação com uma proteína carreadora ativada com maleimida (por exemplo usando GMBS) ou uma proteína carreadora haloacetilada (por exemplo usando iodoacetimida [por exemplo etil iodoacetimida HC1] ou bromoacetato de Nsuccinimidila ou STAB ou SIA ou SBAP). Opcionalmente, o éster de cianato (opcionalmente fabricado pela química de CDAP) é ligado com hexano diamina ou ADH e o sacarídeo derivado em amida é conjugado à proteína carreadora usando a química da carbodiimida (por exemplo EDAC ou EDC) por intermédio de um grupo carboxila na proteína carreadora. Tais conjugados são descritos no pedido publicado PCT WO93/15760 Uniformed Services University e WO95/08348 e WO96/29094.
Outras técnicas adequadas usam carbodiimides, carbimidas, hidrazidas, ésteres ativos, norborano, ácido p-nitrobenzóico, Nhidroxissuccinimida, S-NHS, EDC, TSTU. Muitas são descritas na WO98/42721. A conjugação pode envolver um ligador de carbonila que pode ser formado pela reação de um grupo hidroxila livre do sacarídeo com CDI (Bethel) et al J. Biol. Chem. 1979, 254; 2572 a 4, Heam et al J. Chromatogr. 1981, 218; 509-18) seguida pela reação com uma proteína para formar uma ligação de carbamato. Isto pode envolver a redução do terminal anomérico a um grupo hidroxila primário, a proteção/ desproteção opcional da reação do grupo hidroxila primário do grupo hidroxila primário com CDI para formar um intermediário de carbamato de CDI e ligar o intermediário de carbamato de CDI com um grupo amino em uma proteína.
Os conjugados também podem ser preparados pelos métodos de aminação redutiva direta como descritos na US 4365170 (Jennings) e US 4673574 (Anderson). Outros métodos são descritos na EP-0-161-188, EP208375 e EP-0-477508.
Um outro método envolve a ligação de um sacarídeo ativado com brometo de cianogênio (ou CDAP) derivado com diidrazida de ácido adípico (ADH) com a proteína carreadora pela condensação de carbodiimida (Chu C. et al Infect. Immunity, 1983 245 256), por exemplo usando EDAC.
Em uma forma de realização, um grupo hidroxila (opcionalmente um grupo hidroxila ativado por exemplo um grupo hidroxila ativado para compor um éster de cianato [por exemplo usando CDAP]) em um sacarídeo é ligado a um grupo amino ou carboxilico em uma proteína direta ou indiretamente (através de um ligador). Onde um ligador está presente, um grupo hidroxila em um sacarídeo é opcionalmente ligado a um grupo amino em um ligador, por exemplo pelo uso da conjugação de CDAP. Um outro grupo amino no ligador por exemplo ADH) pode estar conjugado a um grupo de ácido carboxilico em uma proteína, por exemplo pelo uso da química da carbodiimida, por exemplo usando-se EDAC. Em uma forma de realização, o(s) sacarídeo(s) capsular(es) pneumocócico(s) é(são) conjugado(s) ao primeiro ligador antes que o ligador seja conjugado à proteína carreadora. Alternativamente o ligador pode estar conjugado ao carreador antes da conjugação ao sacarídeo.
Uma combinação de técnicas também pode ser usada, com alguns conjugados de sacarídeo-proteína sendo preparados por CDAP e alguns pela aminação redutiva.
No geral os seguintes tipos de grupos químicos em uma proteína carreadora podem ser usados para a ligação / conjugação:
A) Carboxila (por exemplo por intermédio de ácido aspártico ou ácido glutâmico). Em uma forma de realização este grupo está ligado aos grupos de amino nos sacarídeos diretamente ou a um grupo amino em um ligador com a química da carbodiimida por exemplo com EDAC.
B) Grupo amino (por exemplo por intermédio de lisina). Em uma forma de realização este grupo está ligado aos grupos carboxila nos sacarídeos diretamente ou a um grupo carboxila em um ligador com a química da carbodiimida por exemplo com EDAC. Em uma outra forma de realização este grupo está ligado aos grupos hidroxila ativados com CD AP ou CNBr nos sacarídeos diretamente ou a tais grupos em um ligador; aos sacarídeos ou ligadores tendo um grupo aldeído; aos sacarídeos ou ligadores tendo um grupo de éster de succinimida.
C) Sulfidrila (por exemplo por intermédio de cisteína). Em uma forma de realização este grupo está ligado a um sacarídeo acetilado com bromo ou cloro ou ligador com a química da maleimida. Em uma forma de realização este grupo é ativado/modificado com bis diazobenzidina.
D) Grupo hidroxila (por exemplo por intermédio da tirosina). Em uma forma de realização este grupo é ativado/modificado com bis diazobenzidina.
E) Grupo Imidazolila (por exemplo por intermédio de histidina). Em uma forma de realização este grupo é ativado/modificado com bis diazobenzidina.
F) Grupo guanidila (por exemplo por intermédio de arginina).
G) Grupo indolila (por exemplo por intermédio de triptofano).
Em um sacarídeo, no geral os seguintes grupos podem ser usados para uma ligação: OH, COOH ou NH2. Grupos aldeído podem ser gerados depois de tratamentos diferentes conhecidos na técnica tais como: periodato, hidrólise ácida, peróxido de hidrogênio, etc.
Métodos de ligação direta:
Sacarídeo-OH + CNBr ou CD AP —> éster de cianato + NH2Prot —> conjugado
Sacarídeo-aldeído + NH2-Prot —> base de Schiff +
NaCNBH3 —> conjugado
Sacarídeo-COOH + NH2-Prot + EDAC —> conjugado
Sacarídeo-NH2 + COOH-Prot + EDAC —> conjugado
Métodos de ligação indireta por intermédio de espaçador (ligador):
Sacarídeo-OH + CNBr ou CD AP —> éster de cianato + ΝΉ2—NH2 —> sacarídeo—NH2 + COOH-Prot + EDAC —> conjugado
Sacarídeo-OH + CNBr ou CD AP —> éster de cianato + NH2—SH —> sacarídeo—SH + SH-Prot (Proteína nativa com uma cisteína exposta ou obtida depois da modificação de grupos amino da proteína por SPDP por exemplo) —> sacarídeo-S-S-Prot
Sacarídeo-OH + CNBr ou CD AP —> éster de cianato + NH2—SH —> sacarídeo—SH + maleimida-Prot (modificação de grupos amino) —> conjugado
Sacarídeo-OH + CNBr ou CD AP —> éster de cianato + NH2— -SH —> Sacarídeo-SH + haloacetilado-Prot —> conjugado
Sacarídeo-COOH + EDAC + NH2—ΝΉ2 —> sacarídeo—
NH2 + EDAC + COOH-Prot —> conjugado
Sacarídeo-COOH + EDAC+ ΝΉ2—SH —> sacarídeo—SH + SH-Prot (Proteína nativa com uma cisteína exposta ou obtida depois da modificação de grupos amino da proteína por SPDP por exemplo) —> sacarídeo-S-S-Prot
Sacarídeo-COOH + EDAC+ ΝΉ2—SH —> sacarídeo—SH + maleimida-Prot (modificação de grupos amino) —> conjugado
Sacarídeo-COOH + EDAC + NH2—SH —> Sacarídeo-SH + haloacetilado-Prot —> conjugado
Sacarídeo-Aldeído + NH2—NH2 —> sacarídeo—NH2 +
ED AC + COOH-Prot —> conjugado
Nota: ao invés de EDAC acima, qualquer carbodiimida adequada pode ser usada.
Em resumo, os tipos de grupo químico da proteína carreadora que pode ser no geral usado para a ligação com um sacarídeo são grupos amino (por exemplo nos resíduos de lisina), grupos COOH (por exemplo nos resíduos de ácido aspártico e glutâmico) e grupos SH (se acessíveis) (por exemplo nos resíduos de cisteína).
Opcionalmente a razão de proteína carreadora para Sacarídeo de S', pneumoniae está entre 1:5 e 5:1; 1:2 e 2,5:1; 1:1 e 2:1 (p/p). Em uma forma de realização, a maioria dos conjugados, por exemplo 6, 7, 8, 9 ou mais dos conjugados têm uma razão de proteína carreadora para sacarídeo que é maior do que 1:1, por exemplo 1,1:1, 1,2:1, 1,3:1, 1,4:1, 1,5:1 ou 1,6:1.
Em uma forma de realização, pelo menos um sacarídeo de S. pneumoniae é conjugado a uma proteína carreadora por intermédio de um ligador usando CD AP e EDAC. Por exemplo, 18C pode estar conjugado a uma proteína por intermédio de um ligador (por exemplo aqueles com dois grupos hidrazinos nas suas extremidades tais como ADH) usando CDAP e EDAC como descritos acima. Quando um ligador é usado, CDAP pode ser usado para conjugar o sacarídeo a um ligador e EDAC pode ser depois usado para conjugar o ligador a uma proteína ou, altemativamente EDAC pode ser usado primeiro para conjugar o ligador com a proteína, depois que CDAP pode ser usado para conjugar o ligador ao sacarídeo.
No geral, a composição imunogênica da invenção pode compreender uma dose de cada conjugado de sacarídeo entre 0,1 e 20 pg, 1 e 10 pg ou 1 e 3 pg de sacarídeo.
Em uma forma de realização, a composição imunogênica da invenção contém cada sacarídeo de S. pneumoniae capsular em uma dose entre 0,1 a 20 pm; 0,5 a 10 μιη; 0,5 a 5 μg ou 13 μg de sacarideo. Em uma forma de realização, sacarídeos capsulares podem estar presentes em dosagens diferentes, por exemplo alguns sacarídeos capsulares podem estar presentes em uma dose em tomo de ou exatamente 1 pg ou alguns sacarídeos capsulares podem estar presentes em uma dose em tomo de ou exatamente 3 pg. Em uma forma de realização, os sacarídeos dos sorotipos 3, 18C e 19F (ou 4, 18C e 19F) estão presentes em uma dose mais alta do que os outros sacarídeos. Em um aspecto desta forma de realização, os sorotipos 3, 18C e 19F (ou 4, 18C e 19F) estão presentes em uma dose em tomo de ou exatamente 3 pg enquanto que os outros sacarídeos na composição imunogênica estão presentes em uma dose em tomo de ou exatamente 1 pg.
“Em tomo de” ou “aproximadamente” são definidos como dentro de 10% mais ou menos da figura dada para os propósitos da invenção.
Em uma forma de realização, pelo menos um dos sacarídeos capsulares da S. pneumoniae é diretamente conjugado a uma proteína carreadora. Opcionalmente o pelo menos um dos sacarídeos capsulares da S. pneumoniae é diretamente conjugado por CDAP. Em uma forma de realização, a maioria dos sacarídeos capsulares por exemplo 5, 6, 7, 8, 9 ou mais são diretamente ligadas com a proteína carreadora por CDAP (ver a WO95/08348 e WO96/29094).
A composição imunogênica pode compreender proteínas de Streptococcus pneumoniae, aqui chamada de proteínas de Streptococcus pneumoniae da invenção. Tais proteínas podem ser usadas como proteínas carreadoras ou podem estar presentes como proteínas livres ou podem estar presentes tanto como proteínas carreadoras quanto como proteínas livres. As proteínas de Streptococcus pneumoniae da invenção são expostas na superfície, pelo menos durante parte do ciclo de vida dos pneumococos ou são proteínas que são secretadas ou liberadas pelos pneumococos. Opcionalmente as proteínas da invenção são selecionadas das seguintes categorias, tais como proteínas tendo um motivo de sequência de Sinal Tipo II de LXXC (onde X é qualquer aminoácido, por exemplo, a família da tríade da poliistidina (PhtX)), proteínas de ligação de colina (CbpX), proteínas tendo um motivo de sequência de Sinal Tipo I (por exemplo, SplOl), proteínas tendo um motivo LPXTG (onde X é qualquer aminoácido, por exemplo, Spl28, Spl30) e toxinas (por exemplo, Ply). Os exemplos dentro destas categorias (ou motivos) são as seguintes proteínas ou equivalentes imunologicamente funcionais destes.
Em uma forma de realização, a composição imunogênica da invenção compreende pelo menos 1 proteína selecionada do grupo que consiste da família da Tríade da Poli Histidina (PhtX), família da Proteína de Ligação de Colina (CbpX), truncados de CbpX, família LytX, truncados de LytX, proteínas quiméricas de truncado de CbpXtruncado de LytX (ou fusões), pneumolisina (Ply), PspA, PsaA, Spl28, SplOl, Spl30, Spl25 e Spl33. Em uma outra forma de realização, a composição imunogênica compreende 2 ou mais proteínas selecionadas do grupo que consiste da família da Tríade da Poli Histidina (PhtX), família da Proteína de Ligação de Colina (CbpX), truncados de CbpX, família LytX, truncados de LytX, proteínas quiméricas de truncado de CbpX-truncado de LytX (ou fusões), pneumolisina (Ply), PspA, PsaA e Spl28. Em mais uma forma de realização, a composição imunogênica compreende 2 ou mais proteínas selecionadas do grupo que consiste da família da Tríade da Poli Histidina (PhtX), família da Proteína de Ligação de Colina (CbpX), truncados de CbpX, família LytX, truncados de LytX, proteínas quiméricas de truncado de CbpX-truncado de LytX (ou fusões), pneumolisina (Ply) e Spl28.
A família Pht (Tríade de Poli Histidina) compreende as proteínas PhtA, PhtB, PhtD e PhtE. A família é caracterizada por uma sequência de lipidação, dois domínios separados por uma região rica em prolina e várias tríades de histidina, possivelmente envolvidas na ligação de metal ou nucleosídeo ou atividade enzimática, (3 a 5) regiões de espiral espiralada, um terminal N e um terminal C conservados heterogêneos. Ela está presente em todas as cepas de pneumococo testadas. As proteínas homólogas também foram descobertas em outros Estreptococos e Neisseria. Em uma forma de realização da invenção, a proteína Pht da invenção é PhtD. E entendido, entretanto, que os termos Pht A, B, D e E referem-se às proteínas tendo sequências divulgadas nas citações abaixo assim como as variantes que ocorrem naturalmente (e as fabricadas pelo ser humano) destas que têm uma homologia de sequência que é pelo menos 90% idêntica às proteínas aludidas. Opcionalmente, a mesma é pelo menos 95% idêntica ou pelo menos 97% idêntica.
Com respeito às proteínas PhtX, PhtA é divulgada na WO98/18930 e também é indicada Sp36. Como mencionado acima, a mesma é uma proteína da família da tríade da poliistidina e tem o motivo de sinal tipo II de LXXC. PhtD é divulgada na WO00/37105 e também é indicada SpO36D. Como mencionado acima, a mesma também é uma proteína da família da tríade da poliistidina e tem o motivo de sinal LXXC tipo II. PhtB é divulgada na WO00/37105 e também é indicada SpO36B. Um outro membro da família PhtB é o Polipeptídeo de Degradação C3, como divulgado na WOOO/17370. Esta proteína também é da família da tríade da poliistidina e tem o motivo de sinal tipo II LXXC. Por exemplo, um equivalente imunologicamente funcional é a proteína Sp42 divulgada na WO98/18930. Uma PhtB truncada (aproximadamente 79kD) é divulgada na WO99/15675 que também é considerada um membro da família PhtX. PhtE é divulgada na WO00/30299 e é indicada como BVH-3. Onde qualquer proteína Pht é aqui indicada, é intencionado que fragmentos imunogênicos ou fusões destes da proteína Pht podem ser usados. Por exemplo, uma referência a PhtX inclui fragmentos imunogênicos ou fusões destes de qualquer proteína Pht. Uma referência a PhtD ou PhtB também é uma referência às fusões PhtDE ou
PhtBE como encontrado, por exemplo, na WOO198334.
A pneumolisina é uma toxina multifuncional com atividades citolíticas (hemolíticas) e de ativação de complemento distintas (Rubins et al., Am. Respi. Cit Care Med, 153:1339-1346 (1996)). A toxina não é secretada pelos pneumococos, mas a mesma é liberada na lise de pneumococos sob a influência da autolisina. Os seus efeitos incluem por exemplo, a estimulação da produção de citocinas inflamatórias pelos monócitos humanos, a inibição da vibração de cílios no epitélio respiratório humano e a diminuição da atividade e migração bactericida de neutrófilos. O efeito mais óbvio da pneumolisina está na lise de células sanguíneas vermelhas, que envolve a ligação ao colesterol. Porque o mesmo é uma toxina, necessita ser destoxificado (isto é, não tóxico a um ser humano quando fornecido e uma dosagem adequada por proteção) antes que possa ser administrado in vivo. A expressão e clonagem de pneumolisina do tipo selvagem ou nativa são conhecidas na técnica. Ver, por exemplo, Walker et al. (Infect Immun, 55:1184-1189 (1987)), Mitchell et al. (Biochim Biophys Acta, 1007:67-72 (1989) e Mitchell et al (NAR, 18:4010 (1990)). A destoxificação de ply pode ser conduzida por meios químicos, por exemplo, submetida ao tratamento com formalina ou glutaraldeído ou uma combinação de ambos (W004081515, PCT/EP2005/010258). Tais métodos são bem conhecidos na técnica para várias toxinas. Altemativamente, ply pode ser geneticamente destoxificada. Assim, a invenção abrange derivados de proteínas pneumocócicas que podem ser, por exemplo, proteínas mutadas. O termo “mutado” é aqui usado para significar uma molécula que sofreu deleção, adição ou substituição de um ou mais aminoácidos usando técnicas bem conhecidas para a mutagênese direcionada ao sítio ou qualquer outro método convencional. Por exemplo, como descrito acima, uma proteína ply mutante pode ser alterada de modo que a mesma seja biologicamente inativa embora ainda mantenha seus epítopos imunogênicos, ver, por exemplo, a
W090/06951, Berry et al. (Infect Immun, 67:981-985 (1999)) e WO99/03884.
Como aqui usado, é entendido que o termo “Ply” refere-se à pneumolisina mutada ou destoxificada adequada para uso médico (isto é, não tóxico).
Com respeito à família da Proteína de Ligação de Colina (CbpX), membros desta família foram originalmente identificados como proteínas pneumocócicas que podem ser purificadas pela cromatografia de afinidade de colina. Todas as proteínas de ligação de colina são ligadas de modo não covalente às porções de fosforilcolina do ácido tecóico da parede celular e ácido lipotecóico associado à membrana. Estruturalmente, eles têm várias regiões em comum em relação à família inteira, embora a natureza exata das proteínas (sequência de aminoácido, comprimento, etc.) pode variar. No geral, as proteínas de ligação de colina compreendem uma região de terminal N (N), regiões de repetição conservadas (RI e/ou R2), uma região rica em prolina (P) e uma região de ligação de colina conservada (C), feita de repetições múltiplas, que compreendem aproximadamente uma metade da proteína. Como usado neste pedido, o termo “família da Proteína de Ligação de Colina (CbpX)” é selecionado do grupo que consiste das Proteínas de Ligação de Colina como identificadas na WO97/41151, PbcA, SpsA, PspC, CbpA, CbpD e CbpG. CbpA é divulgada na WO97/41151. CbpD e CbpG são divulgadas na WOOO/29434. PspC é divulgada na WO97/09994. A PbcA é divulgada na WO98/21337. A SpsA é uma proteína de ligação de colina divulgada na WO98/39450. Opcionalmente as Proteínas de Ligação de Colina são selecionadas do grupo que consiste de CbpA, PbcA, SpsA e PspC.
Uma forma de realização da invenção compreende CbpX truncada em que “CbpX” é definida acima e “truncada” refere-se às proteínas CbpX que carecem de 50% ou mais da região de ligação de colina (C). Opcionalmente tais proteínas carecem da região de ligação de colina inteira.
Opcionalmente, a tal proteína truncada carece (i) da região de ligação de colina e (ii) também uma porção da metade de terminal N da proteína, ainda retém pelo menos uma região de repetição (RI ou R2). Opcionalmente, o truncado tem 2 regiões de repetição (RI e R2). Os exemplos de tais formas de realização são NRlxR2 e RlxR2 como ilustradas na WO99/51266 ou WO99/51188, entretanto, outras proteínas de ligação de colina que carecem de uma região de ligação de colina similar também são consideradas dentro do escopo desta invenção.
A família de LytX é de proteínas associadas à membrana associadas com a lise de célula. O domínio de terminal N compreende domínio(s) de ligação de colina, entretanto a família LytX não tem todas as características encontradas na família CbpA mencionada acima e assim para a presente invenção, a família LytX é considerada distinta da família CbpX. Ao contrário com a família CbpX, o domínio de terminal C contém o domínio catalítico da família de proteína LytX. A família compreende LytA, B e C. Com respeito à família LytX, LytA é divulgada em Ronda et al., Eur J Biochem, 164:621-624 (1987). LytB é divulgada na WO98/18930 e também é indicada como Sp46. LytC também é divulgada em WO98/18930 e também é indicada como Sp91. Uma forma de realização da invenção compreende LytC.
Uma outra forma de realização compreende truncados de LytX em que “LytX” é definido acima e “truncados” refere-se às proteínas LytX que carecem de 50% ou mais da região de ligação de Colina. Opcionalmente tais proteínas carecem a região de ligação de colina inteira. Já uma outra forma de realização desta invenção compreende proteínas quiméricas de truncado de CbpX-truncado de LytX (ou fusões). Opcionalmente isto compreende NRlxR2 (ou RlxR2) de CbpX e a porção de terminal C (Cterm, isto é, que carecem dos domínios de ligação de colina) de LytX (por exemplo, LytCCterm ou Sp91 Cterm). Opcionalmente CbpX é selecionado do grupo que consiste de CbpA, PbcA, SpsA e PspC. Opcionalmente, a mesma é CbpA.
Opcionalmente, LytX é LytC (também indicada como Sp91). Uma outra forma de realização da presente invenção é uma PspA ou PsaA truncada que carece do domínio de ligação de colina (C) e expressada como uma proteína de fusão com LytX. Opcionalmente, LytX é LytC.
Com respeito a PsaA e PspA, ambas são conhecidas na técnica. Por exemplo, PsaA e suas variantes de deleção de transmembrana foram descritas por Berry & Paton, Infect Immun Dez de 1996; 64(12):525562. PspA e suas variantes de deleção de transmembrana foram divulgadas, por exemplo, naUS 5804193, WO92/14488 e WO99/53940.
Spl28 e Spl30 são divulgadas na WO00/76540. Spl25 é um exemplo de uma proteína de superfície pneumocócica com o motivo Ancorado na Parede Celular de LPXTG (onde X é qualquer aminoácido). Qualquer proteína dentro desta classe de proteína de superfície pneumocócica com seu motivo foram descoberto serem úteis dentro do contexto desta invenção e são portanto consideradas uma outra proteína da invenção. A própria Spl25 é divulgada na WO98/18930 e também é conhecida como ZmpB — uma metaloproteinase do zinco. A SplOl é divulgada na WO98/06734 (onde a mesma tem a referência # y85993). Ela é caracterizada por uma sequência de sinal Tipo I. a Spl33 é divulgada na WO98/06734 (onde a mesma tem referência # y85992). Ela também é caracterizada por uma sequência de sinal Tipo I.
Os exemplos de antígenos de proteína de Moraxella catarrhalis que podem ser incluídos em uma vacina de combinação (especialmente para a prevenção da otite média) são:OMP106 [WO97/41731 (Antex) & WO96/34960 (PMC)]; OMP21 ou fragmentos deste (W00018910); LbpA &/ou LbpB [WO98/55606 (PMC)]; TbpA &/ou TbpB [WO97/13785 & WO97/32980 (PMC)]; CopB [Helminen ME, et al. (1993) Infect. Immun. 61:2003-2010]; UspAl e/ou UspA2 [WO93/03761 (University of Texas)]; OmpCD; HasR (PCT/EP99/ 03824); PilQ (PCT/EP99/03823); OMP85 (PCT/EP00/01468); lipoOÓ (GB 9917977.2); lipolO (GB 9918208.1); lipoil (GB 9918302.2); lipol8 (GB 9918038.2); P6 (PCT/EP99/03038); D15 (PCT/EP99/ 03822); OmplAl (PCT/EP99/06781); Hly3 (PCT/EP99/03257); e OmpE. Os exemplos de antigenos da Haemophilus influenzae não tipáveis ou fragmentos destes que podem ser incluídos em uma vacina de combinação (especialmente para a prevenção da otite média) incluem:proteína de Fimbrina [(US 5766608 - Ohio State Research Foundation)] e fusões que compreende peptídeos desta [por exemplo, fusões de peptídeo LBl(f); US 5843464 (OSU) ou WO99/64067]; OMP26 [WO97/01638 (Cortecs)]; P6 [EP 281673 (State University of New York)]; TbpA e/ou TbpB; Hia; Hsf; Hin47; Hit Hmwl; Hmw2; Hmw3; Hmw4; Hap; D15 (WO94/12641); P2; e P5 (WO94/26304).
As proteínas da invenção também podem ser beneficamente combinadas. Por combinado é intencionado que a composição imunogênica compreende todas as proteínas de dentro das seguintes combinações, como proteínas carreadoras ou como proteínas livres ou uma mistura das duas. Por exemplo, em uma combinação de duas proteínas como demonstrado em seguida, ambas as proteínas podem ser usadas como proteínas carreadoras ou ambas as proteínas podem estar presentes como proteínas livres ou ambas podem estar presentes como proteína carreadora e como proteína livre ou uma pode estar presente como uma proteína carreadora e uma proteína livre enquanto que a outra está presente apenas como uma proteína carreadora ou apenas como uma proteína livre ou uma pode estar presente como uma proteína carreadora e a outra como uma proteína livre. Onde uma combinação destas três proteínas é dada, possibilidades similares existem. As combinações incluem, mas não são limitadas a, proteínas quiméricas ou de fusão PhtD + NRlxR2, PhtD + NRlxR2-Sp91Cterm, PhtD + Ply, PhtD + Spl28, PhtD + PsaA, PhtD + PspA, PhtA + NRlxR2, proteínas quiméricas ou de fusão PhtA + NRlxR2-Sp91Cterm, PhtA + Ply, PhtA + Spl28, PhtA + PsaA, PhtA + PspA, NRlxR2 + LytC, NRlxR2 + PspA, NRlxR2 + PsaA, NRlxR2 + Spl28, RlxR2 + LytC, RlxR2 + PspA, RlxR2 + PsaA, RlxR2 + Spl28, RlxR2 + PhtD, RlxR2 + PhtA. Opcionalmente, NRlxR2 (ou RlxR2) é de CbpA ou PspC. Opcionalmente a mesma é de CbpA. Outras combinações incluem 3 combinações de proteína tais como PhtD + NRlxR2 + Ply e PhtA + NRlxR2 + PhtD. Em uma forma de realização, a composição de vacina compreende pneumolisina destoxificada e PhtD ou PhtDE como proteínas carreadoras. Em uma outra forma de realização, a composição de vacina compreende pneumolisina destoxificada e PhtD ou PhtDE como proteínas livres.
Em um aspecto independente, a presente invenção fornece uma composição imunogênica que compreende pelo menos quatro conjugados de sacarídeo capsular de S. pneumoniae contendo sacarídeos de sorotipos de S. pneumoniae diferentes em que pelo menos um sacarídeo é conjugado à PhtD ou proteína de fusão desta e a composição imunogênica é capaz de eliciar uma resposta imune eficaz contra PhtD.
Um resposta imune eficaz contra PhtD ou proteína de fusão desta é medida por exemplo por um ensaio de proteção tal como aquele descrito no exemplo 15. Uma resposta imune eficaz fornece pelo menos 40%, 50%, 60%, 70%, 80% ou 90% de sobrevivência 7 dias depois da inoculação com uma cepa heteróloga. Dado que a cepa de inoculação é heteróloga, a proteção proporcionada é devida à resposta imune contra PhtD ou proteína de fusão desta.
Altemativamente, uma resposta imune eficaz contra PhtD é medida pelo ELISA como descrito no exemplo 14. Uma resposta imune eficaz dá uma resposta de IgG anti-PhtD de pelo menos 250, 300, 350, 400, 500, 550 ou 600 pg/ml de GMC.
Por exemplo, a composição imunogênica compreende pelo menos 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 sacarídeos capsulares da 5. pneumoniae de sorotipos diferentes conjugados a PhtD ou proteína de fusão desta. Por exemplo sorotipos 22F e 1, 2, 3, 4, 5, 6 ou 7 outros selecionados dos sorotipos 1, 2, 3, 4, 5, 6B, 7F, 8, 9N, 9V, 10A, 11A, 12F, 14, 15, 17F, 18C, 19A, 19F, 20, 23F e 33F são conjugados à PhtD. Em uma forma de realização dois ou três dos sorotipos 3, 6A e 22F são conjugados à PhtD ou proteína de fusão desta.
Em uma forma de realização, a composição imunogênica da invenção compreende pelo menos um sacarídeo de 5. pneumoniae capsular conjugado à PhtD ou proteína de fusão desta por intermédio de um ligador, por exemplo ADH. Em uma forma de realização, uma das químicas de conjugação listadas abaixo é usada.
Em uma forma de realização, a composição imunogênica da invenção compreende pelo menos um sacarídeo de S. pneumoniae capsular conjugado à PhtD ou proteína de fusão desta, em que a razão de PhtD para sacarídeo no conjugado está entre 6:1 e 1:5, 6:1 e 2:1, 6:1 e 2,5:1, 6:1 e 3:1, 6:1 e 3,5:1 (p/p) ou é maior do que (isto é, contém uma proporção maior de PhtD) 2,0:1,2,5:1,3,0:1,3,5:1 ou 4,0:1 (p/p).
Em uma forma de realização, a composição imunogênica da invenção compreende pneumolisina.
A presente invenção fomece ainda uma vacina contendo as composições imunogênicas da invenção e um excipiente farmaceuticamente aceitável.
As vacinas da presente invenção podem ser adjuvantadas, particularmente quando intencionadas para o uso em uma população idosa mas também para o uso em populações infantis. Os adjuvantes adequados incluem um sal de alumínio tal como gel de hidróxido de alumínio ou fosfato de alumínio ou alúmen, mas também podem ser outros sais metálicos tais como aqueles de cálcio, magnésio, ferro ou zinco ou pode ser uma suspensão insolúvel de tirosina acilada ou açúcares acilados, sacarídeos catiônica ou anionicamente derivados ou polifosfazenos.
O adjuvante é opcionalmente selecionado para ser um indutor preferencial de um tipo TH1 de resposta. Tais níveis altos de citocinas tipo Thl tendem a favorecer a indução de respostas imunes mediadas por célula a um dado antígeno, embora níveis altos de citocinas tipo Th2 tendam a favorecer a indução de respostas imunes humorais para o antígeno.
A distinção de resposta imune Thl e Th2 não é absoluta. Na realidade um indivíduo sustentará uma resposta imune que é descrita como sendo predominantemente Thl ou predominantemente Th2. Entretanto, é frequentemente conveniente considerar as famílias de citocinas em termos daquelas descritas em clones de célula T CD4 +ve de murine pela Mosmann e Coffman (Mosmann, T. R. e Coffman, R. L. (1989) ΤΉ1 and TH2 cells:different patterns of limphokine secretion lead to different functional properties. (Annual Review of Immunology, 7, pl45-173). Tradicionalmente, as respostas tipo Thl são associadas com a produção das citocinas INF-γ e IL2 pelos linfócitos T. Outras citocinas de modo frequente diretamente associadas com a indução de resposta imunes tipo Thl não são produzidas pelas células T, tais como IL-12. Ao contrário, as respostas tipo Th2 são associadas com a secreção de IL-4, IL-5, IL-6, IL-10. Os sistemas de adjuvante adequados que promovem uma resposta predominantemente Thl incluem: Monofosforil lipídeo A ou um derivado deste (ou lipídeo A destoxificado no geral — ver por exemplo a W02005107798), particularmente monofosforil lipídeo A 3-des-O-acilado (3D-MPL) (para a sua preparação ver a GB 2220211 A); e uma combinação de monofosforil lipídeo A, opcionalmente monofosforil lipídeo A 3-de-O-acilado, junto com um sal de alumínio (por exemplo fosfato de alumínio ou hidróxido de alumínio) ou uma emulsão de óleo em água. Em tais combinações, o antígeno e 3D-MPL estão contidos nas mesmas estruturas particuladas, possibilitando a liberação mais eficiente de sinais antigênicos e sinais imunoestimuladores. Os estudos têm mostrado que 3D-MPL é capaz de realçar ainda mais o realce adicional da imunogenicidade de um antígeno absorvido em alúmen [Thoelen et al.
Vaccine (1998) 16:708-14; EP 689454-B1],
Um sistema realçado envolve a combinação de um monofosforil lipídeo A e um derivado de saponina, particularmente a combinação de QS21 e 3D-MPL como divulgada na W094/00153 ou uma composição menos reatogênica onde a QS21 é extinta com colesterol como divulgado na WO96/33739. Uma formulação de adjuvante particularmente potente envolvendo QS21, 3D-MPL e tocoferol em uma emulsão de óleo em água é descrita na WO95/17210. Em uma forma de realização a composição imunogênica adicionalmente compreende uma saponina, que pode ser QS21. A formulação também pode compreender uma emulsão de óleo em água e tocoferol (WO95/17210). Oligonucleotídeos contendo CpG não metilado (WO96/02555) e outros oligonucleotídeos imunomodulatórios (WO0226757 e WO03507822) também são indutores preferenciais de uma resposta TH1 e são adequados para o uso na presente invenção.
Os adjuvantes particulares são aqueles selecionados do grupo de sais metálicos, emulsões de óleo em água, agonistas de receptores equivalentes a Toll, (em particular agonista 2 do receptor equivalente a Toll, agonista 3 do receptor equivalente a Toll, agonista 4 do receptor equivalente a Toll, agonista 7 do receptor equivalente a Toll, agonista 8 do receptor equivalente a Toll e agonista 9 do receptor equivalente a Toll), saponinas ou combinações destas.
Um adjuvante que pode ser usado com as composições de vacina da invenção são preparações de bolhas ou vesículas de membrana externa de cepas bacterianas Gram negativas tais como aquelas divulgadas pela W002/09746 - particularmente bolhas de N. meningitidis. As propriedades adjuvantes das bolhas podem ser melhoradas pela retenção de
LOS (lipooligossacarídeo) na sua superfície (por exemplo através da extração com concentrações baixas de detergente [por exemplo, de 0 a 0,1% de desoxicolato]). LOS pode ser destoxificado através das mutações msbB(-) ou htrB(-) debatidas na W002/09746. As propriedades adjuvantes também podem ser melhoradas pela retenção de PorB (e opcionalmente remoção de PorA) de bolhas meningocócicas. As propriedades adjuvantes também podem ser melhoradas truncando-se a estrutura de sacarídeo de núcleo externa de LOS em bolhas meningocócicas — por exemplo por intermédio da mutação IgtB(-) debatida na W02004/014417. Altemativamente, o LOS anteriormente mencionado (por exemplo isolado de uma cepa msbB(-) e/ou IgtB(-)) pode ser purificado e usado como um adjuvante nas composições da invenção.
Um outro adjuvante que pode ser usado com as composições da invenção pode ser selecionado do grupo: uma saponina, lipídeo A ou um derivado deste, um oligonucleotídeo imunoestimulador, um alquil glicosaminida fosfato, uma emulsão de óleo em água ou combinações destas. Um outro adjuvante que pode ser usado com as composições da invenção é um sal metálico em combinação com um outro adjuvante. Em uma forma de realização, o adjuvante é um agonista de receptor equivalente a Toll em particular um agonista de um receptor equivalente a Toll 2, 3, 4, 7, 8 ou 9 ou uma saponina, em particular Qs21. Em uma forma de realização, o sistema de adjuvante compreende dois ou mais adjuvantes da lista acima. Em particular as combinações opcionalmente contêm um adjuvante de saponina (em particular Qs21) e/ou um agonist 9 do receptor equivalente a Toll tal como um CpG contendo oligonucleotídeo imunoestimulador. Outras combinações compreendem uma saponina (em particular QS21) e um agonista 4 de receptor equivalente a Toll tal como monofosforil lipídeo A ou seu derivado 3 desacilado, 3 D - MPL ou uma saponina (em particular QS21) e um ligando 4 de receptor equivalente a Toll tal como um fosfato de alquil glicosaminida.
Em uma forma de realização, os adjuvantes são combinações de 3D-MPL e QS21 (EP 0 671 948 Bl), emulsões de óleo em água que compreendem 3D-MPL e QS21 (WO95/17210, WO98/56414) ou 3D-MPL formulado com outros carreadores (EP 0 689 454 Bl). Em uma forma de realização, sistemas de adjuvante compreendem uma combinação de 3DMPL, QS21 e um oligonucleotídeo de CpG como descrito na US6558670, US6544518.
Em uma forma de realização o adjuvante é um ligando 4 de receptor equivalente a Toll (TER), opcionalmente um agonista tal como um derivado de lipídeo A particularmente monofosforil lipideo A ou mais particularmente monofosforil lipideo A 3 Desacilado (3D-MPL).
3D-MPL é disponível da GlaxoSmithKline Biologicals North America e primariamente promove as respostas de célula T CD4+ com um fenótipo IFN-g (Thl). Este pode ser produzido de acordo com os métodos divulgados na GB 2 220 211 A. Quimicamente é uma mistura de monofosforil lipídeo A 3-desacilado com 3, 4, 5 ou 6 cadeias aciladas. Em uma forma de realização, as composições da presente invenção partículas pequenas de 3D-MPL são usadas. As partículas pequenas de 3D-MPL tem um tamanho de partícula tal que as mesmas possam ser filtradas estéril através de um filtro de 0,22 pm. Tais preparações são descritas no Pedido de Patente Internacional NQ WO94/21292. Os derivados sintéticos de lipídeo A são conhecidos e considerados serem agonistas de TLR4 incluindo, mas não limitado a:
OM174 (2-desóxi-6-o-[2-desóxi-2-[(R)-3-dodecanoiloxitetradecanoilamino]-4-o-fosfono-[3-D-glicopiranosil]-2-[(R)-3-hidroxitetradecanoilamino]-a-D-glicopiranosildiidrogenofosfato), (WO95/14026)
OM294 DP (3S,9R)-3-[(R)-dodecanoiloxitetradecanoilamino]4-ΟΧΟ-5 -aza-9(R)- [(R)-3 -hidroxitetradecanoilamino] decan-1,10-dio 1,1,10bis-(diidrogenofosfato) (WO99/64301 e WO00/0462)
OM197 MP-Ac DP (3S,9R)-3-[(R)41 dodecanoiloxitetradecanoilamino]-4-oxo-5-aza-9-[(R)-3hidroxitetradecanoilamino]decan-1,10-diol, 1 -diidrogenofosfato 10-(6aminoexanoato) (WOO 1/46127)
Outros ligandos de TLR4 que podem ser usados são fosfatos de alquil Glicosaminida (AGPs) tais como aqueles divulgados na WO9850399 ou US6303347 (processos para a preparação de AGPs também são divulgados) ou sais farmaceuticamente aceitáveis de AGPs como divulgados na US6764840. Alguns AGPs são agonistas de TLR4 e alguns são antagonistas de TLR4. Ambos são considerados serem úteis como adjuvantes.
Um outro imunoestimulante para o uso na presente invenção é Quil A e seus derivados. Quil A é uma preparação de saponina isolada da árvore da América do Sul Quilaja Saponaria Molina e foi primeiro descrita como tendo atividade adjuvante por Dalsgaard et al. em 1974 (“Saponin adjuvants”, Archiv. fur die gesamte Virusforschung, Vol. 44, Springer Verlag, Berlim, p243-254). Os fragmentos purificadas de Quil A foram isolados pela HPLC que retêm a atividade de adjuvante sem a toxicidade associada com a Quil A (EP 0 362 278), por exemplo QS7 e QS21 (também conhecidos como QA7 e QA21). QS-21 é um derivado de saponina natural da casca da Quillaja saponaria Molina que induz células T CD8+ citotóxicas (CTLs), células Thl e uma resposta de anticorpo de IgG2a predominante e é uma saponina no contexto da presente invenção.
As formulações particulares de QS21 foram descritas que são uma forma de realização da invenção, estas formulações compreendem ainda um esterol (WO96/33739). As saponinas que formam parte da presente invenção pode ser separada na forma de micelas, micelas misturadas (opcionalmente com sais biliares) ou podem estar na forma de matrizes ISCOM (EP 0 109 942 Bl), lipossomas ou relacionadas com as estruturas coloidais tais como complexos multiméricos como verme ou como anel ou estruturas lipídicas/em camada e lamelas quando formuladas com colesterol e lipídeo ou na forma de uma emulsão de óleo em água (por exemplo como na
WO95/17210). As saponinas podem estar associadas com um sal metálico, tal como hidróxido de alumínio ou fosfato de alumínio (WO98/15287).
Opcionalmente, a saponina é apresentada na forma de uma lipossoma, ISCOM ou uma emulsão de óleo em água.
Um sistema realçado envolve a combinação de um monofosforil lipídeo A (ou lipídeo A destoxificado) e um derivado de saponina, particularmente a combinação de QS21 e 3D-MPL como divulgado na W094/00153 ou uma composição menos reatogênica onde a QS21 é extinta com colesterol como divulgado na WO96/33739. Uma formulação adjuvante particularmente potente envolvendo tocoferol com ou sem QS21 e/ou 3D-MPL em uma emulsão de óleo em água é descrita na WO95/17210. Em uma forma de realização a composição imunogênica adicionalmente compreende uma saponina, que pode ser QS21.
Oligonucleotídeos imunoestimuladores ou qualquer outro agonista 9 de receptor equivalente a Toll (TLR) também podem ser usados. Os oligonucleotídeos para o uso em adjuvantes ou vacinas da presente invenção são opcionalmente oligonucleotídeos contendo CpG, opcionalmente contendo dois ou mais motivos CpG de dinucleotídeo separados por pelo menos três, opcionalmente pelo menos seis ou mais nucleotídeos. Um motivo CpG é um nucleotídeo de citosina seguido por um nucleotídeo de guanina. Os oligonucleotídeos de CpG da presente invenção são tipicamente desoxinucleotídeos. Em uma forma de realização o intemucleotídeo no oligonucleotídeo é fosforoditioato ou uma ligação de fosforotioato, embora o fosfodiéster e outras ligações de intemucleotídeo estejam dentro do escopo da invenção. Também incluídos dentro do escopo da invenção estão os oligonucleotídeos com ligações de intemucleotídeo misturadas. Os métodos para produzir oligonucleotídeos de fosforotioato ou fosforoditioato são descritos na US5.666.153, US5.278.302 e WO95/26204.
Os exemplos de oligonucleotídeos têm as seguintes sequências. As sequências opcionalmente contêm ligações intemucleotídicas modificadas por fosforotioato.
OLIGO 1 (SEQ ID NO:1):TCC ATG ACG TTC CTG ACG TT (CpG 1826) OLIGO 2 (SEQ ID NO:2):TCT CCC AGC GTG CGC CAT (CpG 1758) OLIGO 3 (SEQ ID NO:3):ACC GAT GAC GTC GCC GGT GAC GGC ACC ACG OLIGO 4 (SEQ ID NO:4):TCG TCG TTT TGT CGT TTT GTC GTT (CpG 2006) OLIGO 5 (SEQ ID NO:5):TCC ATG ACG TTC CTG ATG CT (CpG 1668) OLIGO 6 (SEQ ID NO:6):TCG ACG TTT TCG GCG CGC GCC G (CpG 5456)
Os oligonucleotídeos de CpG alternativos podem compreender as sequências acima em que elas têm deleções ou adições sem importância nelas.
Os oligonucleotídeos de CpG utilizados na presente invenção podem ser sintetizados por qualquer método conhecido na técnica (por exemplo ver a EP 468520). Convenientemente, tais oligonucleotídeos podem ser sintetizados utilizando um sintetizador automatizado.
O adjuvante pode ser uma emulsão de óleo em água ou pode compreender uma emulsão de óleo em água em combinação com outros adjuvantes. A fase de óleo do sistema de emulsão opcionalmente compreende um óleo metabolizável. O significado do termo óleo metabolizável é bem conhecido na técnica. Metabolizável pode ser definido como “sendo capaz de ser transformado pelo metabolismo” (Dorland’s Illustrated Medical Dictionary, W. B. Sanders Company, 25a edição (1974)). O óleo pode ser qualquer óleo vegetal, de peixe, óleo, óleo animal ou sintético, que não é tóxico para o receptor e é capaz de ser transformado pelo metabolismo. Nozes, sementes e grãos são fontes comuns de óleos vegetais. Óleos sintéticos também são parte desta invenção e podem incluir óleos comercialmente disponíveis tais como NEOBEE® e outros. Esqualeno (2,6,10,15,19,23Hexametil-2,6,10,14,18,22-tetracosaexaeno) é um óleo insaturado que é encontrado em quantidades grandes em óleo de fígado de tubarão e em quantidades menores em óleo de oliva, óleo de germe de trigo, óleo de farelo de arroz e levedura e é um óleo para o uso nesta invenção. O esqualeno é um óleo metabolizável em virtude do fato que é um intermediário na biossíntese de colesterol (índice Merck, 10a Edição, entrada n° 8619).
Tocóis (por exemplo vitamina E) também são frequentemente usados em adjuvantes de emulsões oleosas (EP 0 382 271 Bl; US5667784; WO95/17210). Os tocóis usados nas emulsões oleosas (opcionalmente emulsões de óleo em água) da invenção podem ser formuladas como descrito na EP 0 382 271 Bl, em que os tocóis podem ser dispersões de gotícuias de tocol, opcionalmente que compreendem um emulsificador, opcionalmente de menos do que 1 micron no diâmetro. Altemativamente, os tocóis podem ser usados em combinação com um outro óleo, para formar a fase oleosa de uma emulsão oleosa. Os exemplos de emulsões oleosas que podem ser usadas em combinação com o tocol são aqui descritos, tais como os óleos metabolizáveis descritos acima.
Os adjuvantes de emulsão de óleo em água por si foram sugeridos serem úteis como composições de adjuvante (EP 0 399 843B), também combinações de emulsões de óleo em água e outros agentes ativos foram descritos como adjuvantes para vacinas (WO95/17210; WO98/56414; WO99/12565; WO99/11241). Outros adjuvantes de emulsão oleosa foram descritos, tais como emulsões de água em óleo (US 5.422.109; EP 0 480 982 B2) e água em emulsões de óleo em água (US 5.424,067; EP 0 480 981 B). Todos os quais formam sistemas de emulsão oleosa (em particular quando da incorporação de tocóis) para formar adjuvantes e composições da presentes invenção.
Em uma forma de realização, a emulsão oleosa (por exemplo emulsões de óleo em água) compreendem ainda um emulsificador tal como TWEEN 80 e/ou um esterol tal como colesterol.
Em uma forma de realização, a emulsão oleosa (opcionalmente emulsão de óleo em água) compreende um óleo metabolizável, não tóxico, tal como esqualano, esqualeno ou um tocoferol tal como alfa tocoferol (e opcionalmente tanto esqualeno quanto alfa tocoferol) e opcionalmente um emulsificador (ou tensoativo) tal como Tween 80. Um esterol (por exemplo colesterol) também pode ser incluído.
O método de produzir emulsões de óleo em água é bem conhecido para o ser humano habilitado na técnica. Habitualmente, o método compreende misturar a fase oleosa contendo tocol com um tensoativo tal como uma solução de PBS/TWEEN80®, seguida pela homogeneização usando um homogeneizador, estaria evidente a uma pessoa habilitada na técnica que um método que compreende passar a mistura duas vezes através de uma agulha de seringa seria adequado para a homogeneização de pequenos volumes de líquido. Igualmente, o processo de emulsificação em microfluidizador (MilOS Microfluidics machine, máximo de 50 passadas, por um período de 2 minutos na entrada de pressão máxima de 6 bar (pressão de saída de cerca de 850 bar)) pode ser adaptado pela pessoa habilitada na técnica para produzir volumes menores ou maiores de emulsão. A adaptação pode ser obtida pela experimentação de rotina que compreende a medição da emulsão resultante até que uma preparação fosse obtida com gotículas de óleo do diâmetro requerido.
Em uma emulsão de óleo em água, o óleo e emulsificador devem estar em um carreador aquoso. O carreador aquoso pode ser, por exemplo, solução salina tamponada com fosfato.
O tamanho das gotículas de óleo encontradas dentro do óleo estável na emulsão aquosa são opcionalmente menores do que 1 micron, podem estar na faixa substancialmente de 30 a 600 nm, de modo opcionalmente substancial em tomo de 30 a 500 nm no diâmetro e de modo opcionalmente substancial de 150 a 500 nm no diâmetro e em particular de cerca de 150 nm no diâmetro como medido pela espectroscopia de correlação de fóton. A este respeito, 80% das gotículas de óleo em número devem estar dentro das faixas, opcionalmente mais do que 90% e opcionalmente mais do que 95% das gotículas de óleo em número estão dentro das faixas de tamanho definidas. As quantidades dos componentes presentes nas emulsões oleosas da presente invenção estão convencionalmente na faixa de 0,5 a 20% ou 2 a 10% de óleo (do volume de dose total), tal como esqualeno; e quando presentes, de 2 a 10% de alfa tocoferol; e de 0,3 a 3% de tensoativo, tais como monooleato de polioxietileno sorbitano. Opcionalmente a razão de óleo (por exemplo esqualeno) :tocol (por exemplo α-tocoferol) é igual ou menor do que 1 visto que isto fornece uma emulsão mais estável. Um emulsificador, tal como Tween80 ou Span 85 também pode estar presente em um nível de cerca de 1%. Em alguns casos pode ser vantajoso que as vacinas da presente invenção contenham ainda um estabilizador.
Os exemplos de sistemas de emulsão são descritos na WO95/17210, WO99/11241 e WO99/12565 que divulgam adjuvantes de emulsão com base no esqualeno, α-tocoferol e TWEEN 80, opcionalmente formulada com os imunoestimulantes QS21 e/ou 3D-MPL.
Assim em uma forma de realização da presente invenção, o adjuvante da invenção pode adicionalmente compreender outros imunoestimulantes, tais como LPS ou derivados destes, e/ou saponinas. Os exemplos de outros imunoestimulantes são aqui descritos e em “Vaccine Design - The Subunity and Adjuvant Approach” 1995, Pharmaceutical Biotechnology, Volume 6, Eds. Powell, M. F. e Newman, M. J., Plenum Press, Nova Iorque e Londres, ISBN 0-306-44867-X.
Em uma forma de realização, o adjuvante e as composições imunogênicas de acordo com a invenção compreendem uma saponina (por exemplo QS21) e/ou um derivado de LPS (por exemplo 3D-MPL) em um emulsão oleosa descrita acima, opcionalmente com um esterol (por exemplo colesterol). Adicionalmente a emulsão oleosa (opcionalmente emulsão de óleo em água) podem conter span 85 e/ou lecitina e/ou tricaprilina. Os adjuvantes que compreendem uma emulsão de óleo em água, um esterol e uma saponina são descritos na WO99/12565.
Tipicamente para a administração humana a saponina (por exemplo QS21) e/ou derivado de LPS (por exemplo 3D-MPL) estará presente em uma dose humana de composição imunogênica na faixa de 11 pg a 200 pg, tal como de 10 a 100 pg ou de 10 pg - 50 pg por dose. Tipicamente a emulsão oleosa (opcionalmente emulsão de óleo em água) compreenderá de 2 a 10% de óleo metabolizável. Opcionalmente a mesma compreenderá de 2 a 10% de esqualeno, de 2 a 10% de alfa tocoferol e de 0,3 a 3% (opcionalmente 0,4 a 2%) de emulsificador (opcionalmente tween 80 [monooleato de polioxietileno sorbitano]). Onde tanto esqualeno quanto alfa tocoferol estão presentes, opcionalmente a razão de esqualeno:alfa tocoferol é igual a ou menor do que 1 visto que fornece uma emulsão mais estável. Span 85 (Triolato de sorbitano) também podem estar presentes em um nível de 0,5 a 1% nas emulsões usadas na invenção. Em alguns casos pode ser vantajoso que as composições imunogênicas e vacinas da presente invenção conterão ainda um estabilizador, por exemplo outros emulsificadores/tensoativos, incluindo ácido caprílico (índice Merck 10a Edição, entrada n° 1739), por exemplo Tricaprilina.
Onde esqualeno e uma saponina (opcionalmente QS21) são incluídos, é de benefício também incluir um esterol (opcionalmente colesterol) à formulação visto que isto permite uma redução no nível total de óleo na emulsão. Isto leva a um custo reduzido de fabricação, melhora do conforto global da vacinação e também melhoras qualitativas e quantitativas das respostas imunes resultantes, tais como produção de EFN-7 melhorada. Consequentemente, o sistema de adjuvante da presente invenção tipicamente compreende uma razão de óleo metabolizável: saponina (p/p) na faixa de
200:1 a 300:1, também a presente invenção pode ser usada em uma forma de “óleo baixo” a faixa opcional da qual é de 1:1 a 200:1, opcionalmente de 20:1 a 100:1 ou substancialmente 48:1, esta vacina retém as propriedades de adjuvante benéficas de todos os componentes, com um perfil de reatogenicidade muito reduzido. Consequentemente, algumas formas de realização têm uma razão de esqualeno:QS21 (p/p) na faixa de 1:1 a 250:1 ou de 20:1 a 200:1 ou de 20:1 a 100:1 ou substancialmente 48:1. Opcionalmente um esterol (por exemplo colesterol) também é incluído presente a uma razão de saponina: esterol como aqui descrita.
Os sistemas de emulsão da presente invenção opcionalmente têm um tamanho de gotícula de óleo pequeno na faixa de sub-mícron. Opcionalmente os tamanhos de gotícula de óleo estará na faixa de 120 a 750 nm ou de 120 a 600 nm no diâmetro.
Uma formulação adjuvante particularmente potente (para a combinação final com A1PO4 nas composições imunogênicas da invenção) envolve uma saponina (por exemplo QS21), um derivado de LPS (por exemplo 3D-MPL) e uma emulsão oleosa (por exemplo esqualeno e alfa tocoferol em uma emulsão de óleo em água) como descrito na WO95/17210 ou na WO99/12565 (em particular formulação adjuvante 11 no Exemplo 2, Tabela 1).
Os exemplos de um agonista de TLR 2 incluem peptidoglicano ou lipoproteína. Imidazoquinolinas, tais como Imiquimod e Resiquimod são conhecido agonistas de TLR7. RNA de filamento único também é um agonista de TLR conhecido (TLR8 em seres humanos e TLR7 em camundongos), ao passo que RNA de filamento duplo e poli IC (ácido poliinosínico-policitidílico - um mimético sintético comercial de RNA viral) são exemplares de agonistas de TLR3. 3D-MPL é um exemplo de um agonista de TLR4 enquanto CPG é um exemplo de um agonista de TLR9.
A composição imunogênica pode compreender um antígeno e um imunoestimulante absorvido em um sal metálico. As formulações de vacina com base em alumínio em que o antígeno e o imunoestimulante monofosforil lipídeo A 3-des-O-acilado (3D-MPL), são absorvidos na mesma partícula são descritas na EP 0 576 478 Bl, EP 0 689 454 Bl e EP 0 633 784 Bl. Nestes casos então o antígeno é primeiro absorvido no sal de alumínio seguido pela absorção do imunoestimulante 3D-MPL nas mesmas partículas de sal de alumínio. Tais processos primeiro envolvem a suspensão de 3DMPL pela sonificação em um banho de água até que as partículas atinjam um tamanho entre 80 e 500 nm. O antígeno é tipicamente absorvido em sal de alumínio por uma hora na temperatura ambiente sob agitação. A suspensão de 3D-MPL é depois adicionado ao antígeno absorvido e a formulação é incubada na temperatura ambiente por 1 hora e depois mantida a 4°C até o uso.
Em um outro processo, o imunoestimulante e o antígeno estão em partículas metálicas separadas, como descrito na EP 1126876. O processo melhorado compreende a absorção de imunoestimulante, em uma partícula de sal metálico, seguida pela absorção do antígeno em uma outra partícula de sal metálico, seguida pela mistura das partículas metálicas discretas para formar uma vacina. O adjuvante para o uso na presente invenção pode ser uma composição adjuvante que compreenda um imunoestimulante, absorvido em uma partícula de sal metálico, caracterizada em que a partícula de sal metálico é substancialmente livre de outro antígeno. Além disso, as vacinas são fornecidas pela presente invenção e são caracterizadas em que o imunoestimulante é absorvido em partículas de sal metálico que são substancialmente livres de outro antígeno e em que as partículas de sal metálico que são absorvidas no antígeno são substancialmente livres de outros imunoestimulantes.
Consequentemente, a presente invenção fornece uma formulação adjuvante que compreende imunoestimulantes que foram absorvidos em uma partícula de um sal metálico, caracterizado em que a composição é substancialmente livre de outro antígeno. Além disso, esta formulação adjuvante pode ser um intermediário que, se um tal adjuvante é usado, é requerido para a fabricação de uma vacina. Consequentemente é fornecido um processo para a fabricação de uma vacina que compreende misturar uma composição adjuvante que é um ou mais imunoestimulantes absorvido em uma partícula metal com um antígeno. Opcionalmente, o antígeno foi pré-absorvido em um sal metálico. O dito sal metálico pode ser idêntico ou similar ao sal metálico que é absorvido sobre o imunoestimulante. Opcionalmente o sal metálico é um sal de alumínio, por exemplo fosfato de alumínio ou hidróxido de alumínio.
A presente invenção fornece ainda uma composição de vacina que compreende imunostimulante absorvido em uma primeira partícula de um sal metálico e antígeno absorvido em um sal metálico, caracterizada em que a primeira e segunda partículas de sal metálico são partículas separadas.
Derivados de LPS ou LOS ou mutações ou derivados de lipídeo A aqui descritos são planejados para serem menos tóxicos (por exemplo 3D-MPL) do que os lipopolissacarídeos nativos e são equivalentes intercambiáveis com respeito a qualquer uso destas porções aqui descritas.
Em uma forma de realização o adjuvante usado para as composições da invenção compreendem um carreador de lipossoma (fabricado por técnicas conhecidas a partir de um fosfolipídeo (tal como dioleoil fosfatidil colina [DOPC]) e opcionalmente um esterol [tal como colesterol]). Tais carreadores de lipossoma podem carregar derivados de lipídeo A [tais como 3D-MPL - ver acima] e/ou saponinas (tais como QS21 ver acima). Em uma forma de realização o adjuvante compreende (por dose de 0,5ml) de 0,1 a lOmg, 0,2 a 7, 0,3 a 5, 0,4 a 2 ou 0,5 a Img (por exemplo 0,4 a 0,6, 0,9 a 1,1, 0,5 ou Img) de fosfolipídeo (por exemplo DOPC), de 0,025 a 2,5, 0,05 a 1,5, 0,075 a 0,75, 0,1 a 0,3 ou 0,125 a 0,25mg (por exemplo de 0,2 a 0,3, 0,1 a 0,15, 0,25 ou 0,125mg) esterol (por exemplo colesterol), 5 a 60, 10 a 50 ou 20 a 30 pg (por exemplo de 5 a 15, 40 a 50, 10,
20, 30, 40 ou 50 pg) derivado de lipídeo A (por exemplo 3D-MPL) e 5 a 60, a 50 ou 20 a 30 pg (por exemplo 5 a 15, 40 a 50, 10, 20, 30, 40 ou 50 pg) de saponina (por exemplo QS21).
Este adjuvante é particularmente adequado para as formulações de vacina de idoso. Em uma forma de realização a composição de vacina que compreende este adjuvante compreende sacarídeos conjugados derivados de pelo menos todos os seguintes sorotipos:4, 6B, 9V, 14, 18C, 19F, 23F, 1, 5, 7F (e também pode compreender um ou mais dos sorotipos 3, 6A, 19A e 22F), em que o título de anticorpo GMC induzido contra um ou mais (ou todos) os componentes de vacina 4, 6B, 9V, 14, 18C, 19F e 23F não é significantemente inferior a aquele induzido pela vacina Prevnar® em vacinados humanos.
Em uma forma de realização o adjuvante usado para as composições da invenção compreende uma emulsão de óleo em água fabricada a partir de um óleo metabolizável (tal como esqualeno), um emulsificador (tal como Tween 80) e opcionalmente um tocol (tal como alfa tocoferol). Em uma forma de realização o adjuvante compreende (por dose de 0,5ml) 0,5 a 15, 1 a 13, 2 a 11, 4 a 8 ou 5 a 6mg (por exemplo 2 a 3, 5 a 6 ou 10 a llmg) de óleo metabolizável (tal como esqualeno), 0,1 a 10, 0,3 a 8, 0,6 a 6, 0,9 a 5, 1 a 4 ou 2 a 3mg (por exemplo 0,9 a 1,1,2 a 3 ou 4 a 5mg) de emulsificador (tal como Tween 80) e opcionalmente de 0,5 a 20, 1 a 15, 2 a 12, 4 a 10, 5 a 7mg (por exemplo 11 a 13, 5 a 6 ou 2 a 3mg) de tocol (tal como alfa tocoferol).
Este adjuvante pode opcionalmente ainda compreender 5 a 60, 10 a 50 ou 20 a 30 pg (por exemplo de 5 a 15, 40 a 50, 10, 20, 30, 40 ou 50mg) de derivado de lipídeo A (por exemplo 3D-MPL).
Estes adjuvantes são particularmente adequados para as formulações de vacina de criança ou idoso. Em uma forma de realização a composição de vacina que compreende este adjuvante compreende conjugados de sacarídeo derivados de pelo menos todos os seguintes sorotipos:4, 6B, 9V, 14, 18C, 19F, 23F, 1, 5, 7F (e também pode compreender um ou mais dos sorotipos 3, 6A, 19A e 22F), em que o título de anticorpo GMC induzido contra um ou mais (ou todos) os componentes de vacina 4, 6B, 9V, 14, 18C, 19F e 23F não é significantemente inferior a aquele induzida pela vacina Prevnar® em vacinados humanos.
Este adjuvante pode opcionalmente conter de 0,025 a 2,5, 0,05 a 1,5, 0,075 a 0,75, 0,1 a 0,3 ou 0,125 a 0,25mg (por exemplo 0,2 a 0,3, 0,1 a 0,15, 0,25 ou 0,125mg) de esterol (por exemplo colesterol), 5 a 60, 10 a 50 ou 20 a 30 pg (por exemplo 5 a 15,40 a 50, 10, 20, 30, 40 ou 50 pg) de derivado de lipídeo A (por exemplo, 3D-MPL) e 5 a 60, 10 a 50 ou 20 a 30 pg (por exemplo 5 a 15, 40 a 50, 10, 20, 30, 40 ou 50 [por exemplo, saponina (por exemplo QS21).
Este adjuvante é particularmente adequado para as formulações de vacina de idoso. Em uma forma de realização a composição de vacina que compreende este adjuvante compreende conjugados de sacarídeo derivados de pelo menos todos os seguintes sorotipos:4, 6B, 9V, 14, 18C, 19F, 23F, 1, 5, 7F (e também pode compreender um ou mais dos sorotipos 3, 6A, 19A e 22F), em que o título de anticorpo GMC induzido contra um ou mais (ou todos) os componentes de vacina 4, 6B, 9V, 14, 18C, 19F e 23 F não é significantemente inferior a aquele induzido pela vacina Prevnar® em vacinados humanos.
Em uma forma de realização o adjuvante usado para as composições da invenção compreendem fosfato de alumínio e um derivado de lipídeo A (tal como 3D-MPL). Este adjuvante pode compreender (por dose de 0,5ml) de 100-750, 200-500, 400-500 ou 300-400pg de Al como fosfato de alumínio e 5-60, 10-50 ou 20-30pg (por exemplo 5-15, 40-50, 10, 20, 30, 40 ou 50pg) de derivado de lipídeo A (por exemplo 3D-MPL).
Este adjuvante é particularmente adequado para formulações de vacina de idoso ou criança. Em uma forma de realização a composição de vacina que compreende este adjuvante compreende conjugados de sacarídeo derivados de pelo menos todos os seguintes sorotipos:4, 6B, 9V, 14, 18C, 19F, 23F, 1, 5, 7F (e também podem compreender um ou mais dos sorotipos 3, 6A, 19A e 22F), em que o título de anticorpo GMC induzido contra um ou mais (ou todos) os componentes de vacina 4, 6B, 9V, 14, 18C, 19F e 23F não é significantemente inferior a aquele induzido pela vacina Prevnar® em vacinados humanos.
As preparações de vacina contendo composições imunogênicas da presente invenção podem ser usadas para proteger ou tratar um mamífero suscetíveis à infecção, por meio da administração da dita vacina por intermédio da via sistêmica ou mucósica. Estas administrações podem incluir a injeção por intermédio das vias intramusculares (IM), intraperitoneais (IP), intradérmicas (ID) ou subcutâneas (SC); ou por intermédio da administração mucósica aos tratos oral/alimentar, respiratório, genitourinário. A administração intranasal (IN) das vacinas para o tratamento de pneumonia ou otite média é possível (visto que a portabilidade nasofaríngea de pneumococos pode ser mais eficazmente impedido, atenuando assim a infecção no seu estágio mais inicial). Embora a vacina da invenção possa ser administrada como uma dose única, seus componentes também podem ser co-administrados juntos ao mesmo tempo ou em tempos diferentes (por exemplo conjugados de sacarídeo pneumocócicos podem ser administrados separadamente, ao mesmo tempo ou 1 a 2 semanas depois da administração de qualquer componente de proteína bacteriana da vacina para a coordenação ótima das respostas imunes com respeito a cada um). Para a co-administração, o adjuvante Thl opcional pode estar presente em qualquer ou todas as administrações diferentes. Além de uma via única de administração, 2 vias diferentes de administração podem ser usadas. Por exemplo, sacarídeos ou conjugados de sacarídeo podem ser administrados IM (ou ID) e as proteínas bacterianas podem ser administradas IN (ou ED). Além disso, as vacinas da invenção podem ser administradas IM para as doses de preparação e IN para as doses de reforço.
O teor de antígenos de proteína na vacina tipicamente estará na faixa de 1 a 100 pg, opcionalmente de 5 a 50 pg, por exemplo na faixa de 5 a 25 pg. A seguir de uma vacinação inicial, os pacientes podem receber uma ou várias imunizações de reforço adequadamente espaçadas.
A preparação de vacina é no geral descrita em Vaccine Design (“The subunity and adjuvant approach” (eds Powell M. F. & Newman M. J.) (1995) Plenum Press Nova Iorque). A encapsulação dentro de lipossomas é descrita por Fullerton, Patente US 4.235.877.
As vacinas ou composições imunogênicas da presente invenção podem ser armazenadas em solução ou liofilizadas. Em uma forma de realização, a solução é liofilizada na presença de um açúcar que atua como um lioprotetor amorfo, tal como sacarose, trealose, glicose, manose, maltose ou lactose. Em uma forma de realização, a solução é liofilizada na presença de um açúcar que atua como um lioprotetor amorfo e um agente de volume que fornece estrutura de torta melhorada tal como glicina ou manitol. A presença de um agente de volume cristalino permite ciclos de secagem por congelamento mais curtos, na presença de concentração de sal alta. Os exemplos de tais misturas para o uso na liofilização das composições imunogênicas ou vacinas da invenção incluem sacarose/glicina, trealose/glicina, glicose/glicina, manose/glicina, maltose/glicina, sacarose/manitol/ trealose/manitol, glicose/manitol, manose/manitol e maltose/manitol. Tipicamente a razão molar dos dois constituintes é opcionalmente de 1:1, 1:2, 1:3, 1:4, 1:5 ou 1:6. As composições imunogênicas da invenção opcionalmente compreendem os reagentes de liofilização descritos acima.
Os agentes de estabilização acima e misturas de agentes de estabilização podem incluir ainda um polímero capaz de aumentar a temperatura de transição vítrea (Tg’) da formulação, tal como poli(vinilpirrolidona) (PVP), hidroxietil amido ou dextrano ou um polímero que atua como um agente de volume cristalino tal como polietileno glicol (PEG) por exemplo tendo um peso molecular entre 1500 e 6000 e dextrano.
As composições imunogênicas da invenção são opcionalmente liofilizadas e extemporaneamente reconstituídas antes do uso. A liofilização pode resultar em uma composição mais estável (vacina) e pode possivelmente levar a títulos de anticorpo mais altos na presença de 3D-MPL e na ausência de um adjuvante com base em alumínio.
Em um aspecto da invenção é fornecido um kit de vacina, que compreende um frasco contendo uma composição imunogênica da invenção, opcionalmente na forma liofilizada e compreende ainda um frasco contendo um adjuvante como aqui descrito. E previsto que neste aspecto da invenção, o adjuvante será usado para reconstituir a composição imunogênica liofilizada.
Embora as vacinas da presente invenção possam ser administradas por qualquer via, a administração das vacinas descritas na pele (ID) forma uma forma de realização da presente invenção. A pele humana compreende uma cutícula “córnea” externa, chamada de estrato córneo, que reveste a epiderme. Por debaixo desta epiderme está uma camada chamada derme, que por sua vez reveste o tecido subcutâneo. Pesquisadores têm mostrado que a injeção de uma vacina na pele e em particular na derme, estimula uma resposta imune, que também pode estar associada com várias vantagens adicionais. A vacinação intradérmica com as vacinas aqui descrita forma uma característica opcional da presente invenção.
A técnica convencional de injeção intradérmica, o “procedimento Mantoux”, compreende as etapas de limpar a pele e depois esticar com uma mão e com o chanfro de uma agulha de calibre estreito (calibre 26 a 31) voltando para cima a agulha é inserida em um ângulo entre 10 e 15°. Uma vez que o chanfro da agulha é inserido, o corpo da agulha é abaixado e avançado ainda mais enquanto se fornece uma leve pressão para elevá-la sob a pele. O líquido é depois injetado muito lentamente formando deste modo uma bolha ou inchação na superfície da pele, seguida pela retirada lenta da agulha.
Mais recentemente, os dispositivos que são especificamente planejados para administrar agentes líquidos na ou através da pele foram descritos, por exemplo os dispositivos descritos na WO99/34850 e EP 1092444, também os dispositivos de injeção de jato descritos por exemplo na WOOl/13977, US 5.480.381, US 5.599.302, US 5.334.144, US 5.993.412, US 5.649.912, US 5.569.189, US 5.704.911, US 5.383.851, US 5.893.397, US 5.466.220, US 5.339.163, US 5.312.335, US 5.503.627, US 5.064.413, US 5.520, 639, US 4.596.556, US 4.790.824, US 4.941.880, US 4.940.460, WO97/37705 e WO97/13537. Métodos alternativos de administração intradérmica das preparações de vacina podem incluir seringas e agulhas convencionais ou dispositivos planejados para a liberação balística de vacinas sólidas (WO99/27961) ou emplastros transdérmicos (WO97/48440; WO98/28037); ou aplicadas à superfície da pele (liberação transdérmica ou transcutânea WO98/20734; WO98/28037).
Quando as vacinas da presente invenção devam ser administradas à pele ou mais especificamente na derme, a vacina está em um volume de líquido baixo, particularmente um volume entre cerca de 0,05ml e 0,2ml.
O teor de antígenos nas vacinas na pele ou intradérmicas da presente invenção pode ser similar às doses convencionais como encontrado nas vacinas intramusculares (ver acima). Entretanto, é uma característica das vacinas na pele ou intradérmicas que as formulações podem ser de “dose baixa”. Consequentemente os antígenos de proteína em vacinas de “dose baixa” estão opcionalmente presentes em tão pouco quanto 0,1 a 10pg ou 0,1 a 5mg por dose; e os antígenos de sacarídeo (opcionalmente conjugados) podem estar presentes na faixa de 0,01 a 1 pg ou entre 0,01 e 0,5 pg de sacarídeo por dose.
Como aqui usado, o termo “liberação intradérmica” significa liberação da vacina à região da derme na pele. Entretanto, a vacina necessariamente não será localizada exclusivamente na derme. A derme é a camada na pele localizada entre cerca de 1,0 e cerca de 2,0 mm da superfície na pele humana, mas existe uma certa quantidade de variação entre os indivíduos e em partes diferentes do corpo. No geral, pode ser esperado atingir a derme indo-se 1,5 mm abaixo da superfície da pele, a derme está localizada entre o estrato córneo e a epiderme na superfície e na camada subçutânea abaixo. Dependendo do modo de liberação, a vacina pode por fim estar localizada única ou primariamente dentro da derme ou pode por fim ser distribuída dentro da epiderme e da derme.
A presente invenção fornece ainda uma vacina melhorada para a prevenção ou melhora da Otite média causada pela Haemophilus influenzae pela adição de proteínas da Haemophilus influenzae, por exemplo proteína D na forma conjugada. Além disso, a presente invenção fornece ainda uma vacina melhorada para a prevenção ou melhora da infecção pneumocócica em crianças (por exemplo, Otite média), contando-se com a adição de uma ou duas proteínas pneumocócicas como proteína livre ou conjugada às composições de conjugado de S. pneumoniae da invenção. As ditas proteínas pneumocócicas livres podem ser as mesmas ou diferentes a qualquer proteína de S', pneumoniae usada como proteínas carreadoras. Um ou mais antígenos de proteína de Moraxella catarrhalis também podem ser incluídos na vacina de combinação em uma forma livre ou conjugada. Assim, a presente invenção é um método melhorado para evocar uma resposta imune (protetora) contra a
Otite média em crianças.
Em uma outra forma de realização, a presente invenção é um método melhorado para evocar uma resposta imune (protetora) em crianças (definidas como de 0 a 2 anos de idade no contexto da presente invenção) pela administração de uma quantidade segura e eficaz da vacina da invenção [uma vacina pediátrica]. Outras formas de realização da presente invenção incluem o fornecimento das composições de conjugado de S. pneumoniae antigênicas da invenção para o uso na medicina e o uso dos conjugados de S. pneumoniae da invenção na fabricação de um medicamento para a prevenção (ou tratamento) de doença pneumocócica.
Em uma outra forma de realização, a presente invenção é um método melhorado para evocar uma resposta imune (protetora) na população idosa (no contexto da presente invenção um paciente é considerado idoso se ele têm 50 anos ou acima em idade, tipicamente acima de 55 anos e mais no geral acima de 60 anos) pela administração de uma quantidade segura e eficaz da vacina da invenção, opcionalmente em conjunção com uma ou das proteínas de S. pneumoniae presentes como proteína livre ou conjugada, proteínas de S'. pneumoniae livres estas que podem ser as mesmas ou diferentes como qualquer proteínas de S. pneumoniae usadas como proteínas carreadoras.
Um outro aspecto da invenção é um método para imunizar um hospedeiro humano contra a doença causada pela infecção pela S'. pneumoniae e opcionalmente Haemophilus influenzae que compreende administrar ao hospedeiro uma dose imunoprotetora da composição imunogênica ou vacina ou kit da invenção.
Um outro aspecto da invenção é uma composição imunogênica da invenção para o uso no tratamento ou prevenção de doença causada pela infecção pela S. pneumoniae e opcionalmente Haemophilus influenzae.
Um outro aspecto da invenção é o uso da composição imunogênica ou vacina ou kit da invenção na fabricação de um medicamento para o tratamento ou prevenção de doenças causadas pela infecção pela 5.
pneumoniae e opcionalmente Haemophilus influenzae.
Os termos “compreendendo”, “compreendem” e “compreende” são aqui intencionados pelos inventores a serem opcionalmente substituíveis com os termos “consistindo de”, “consistem de” e “consiste de”, respectivamente, em cada caso.
As formas de realização que aqui dizem respeito às “composições de vacina” da invenção também são aplicáveis às formas de realização que dizem respeito às “composições imunogênicas” da invenção e vice versa.
Todas as referências ou pedidos de patente citadas dentro deste relatório descritivo de patente são aqui incorporados por referência.
De modo que esta invenção possa ser melhor entendida, os seguintes exemplos são apresentados. Estes exemplos são apenas para os propósitos de ilustração e não devem ser interpretados como limitantes do escopo da invenção de nenhuma maneira.
Exemplos
Exemplo 1 :EXPRESSÃO DA PROTEÍNA D
Proteína D de Haemophilus influenzae
Construção genética para a expressão da proteína D
Materiais de partida
O DNA que codifica a proteína D
A Proteína D é altamente conservada entre H influenzae de todos os sorotipos e cepas não tipáveis. O vetor pHIC348 contendo a sequência de DNA que codifica o gene da proteína D inteiro foi obtido do Dr. A. Forsgren, Department of Medical Microbiology, University of Lund, Malmo General Hospital, Malmo, Suécia. A sequência de DNA da proteína D foi publicada por Janson et al. (1991) Infect. Immun. 59:119-125.
O vetor de expressão pMGl
O vetor de expressão pMGl é um derivado de pBR322 (Gross et al., 1985) em que os elementos de controle derivados do bacteriófago A para a transcrição e tradução de genes inseridos estranhos foram introduzidos (Shatzman et al., 1983). Além disso, o gene de resistência à Ampicilina foi trocado com o gene da resistência à Canamicina.
A cepa AR58 da E. coli
A cepa AR58 da E. coli foi gerada pela transdução de N99 com um estoque de fago PI previamente cultivada em um derivado de SA500 (galE::TN10, lambdaKil· cl857 AHI). N99 e SA500 são cepas K12 da£. coli derivada do laboratório do Dr. Martin Rosenberg no National Institute of Health.
O vetor de expressão pMGl
Para a produção de proteína D, o DNA que codifica a proteína foi clonado no vetor de expressão pMG 1. Este plasmídeo utiliza sinais de DNA de fago lambda para direcionar a transcrição e tradução de genes estranhos inseridos. O vetor contém o promotor PL, operador OL e dois sítios de utilização (NutL e NutR) para aliviar os efeitos de polaridade transcricional quando a proteína N é fornecida (Gross et al., 1985). Os vetores contendo o promotor PL, são introduzidos em um hospedeiro lisogênico da E. coli para estabilizar o DNA plasmídico. As cepas hospedeiras lisogênicas contêm DNA de fago lambda defeituoso na replicação integrado no genoma (Shatzman et al., 1983). O DNA de fago lambda cromossômico direciona a síntese da proteína repressora cl que se liga ao repressor OL do vetor e impede a ligação da RNA polimerase ao promotor PL e por meio deste a transcrição do gene inserido. O gene cl da cepa de expressão AR58 contém um mutante sensível à temperatura de modo que a transcrição direcionada a PL pode ser regulada pela mudança de temperatura, isto é, um aumento na temperatura da cultura inativa o repressor e a síntese da proteína estranha é iniciada. Este sistema de expressão permite a síntese controlada de proteínas estranhas especialmente daquelas que podem ser tóxicas para a célula (Shimataka & Rosenberg, 1981).
A cepa AR58 da E. coli
A cepa da E. coli AR58 lisogênica usada para a produção do carreador da proteína D é um derivado da NIH E. coli Kl2 cepa N99 padrão (F su galK2, lacZ’ thr). Ela contém um fago lambda lisogênico defeituoso (galE::TN10, lambdaKil' cl857 AH1). O fenótipo Kil’ impede a parada da síntese macromolecular do hospedeiro. A mutação cl857 confere uma lesão sensível à temperatura ao repressor cl. A deleção de 8.H1 remove o operon direito de fago lambda e os locais bio, uvr3 e chlA hospedeiros. A cepa AR58 foi gerada pela transdução de N99 com um estoque de fago PI previamente cultivado em um derivado de SA500 (galE::TN10, lambdaKil’ cl857 AHI). A introdução do lisogênio defeituoso em N99 foi selecionado com tetraciclina em virtude da presença de um transposon TN10 que codifica a resistência à tetraciclina no gene galE adjacente.
Construção de vetor pMGMDPPrD
O vetor pMG 1 que contém o gene que codifica a proteína SI não estrutural do vírus da influenza (pMGNSI) foi usado para construir pMGMDPPrD. O gene da proteína D foi amplificado pela PCR a partir do vetor pFHC348 (Janson et al. 1991 Infect. Immun. 59:119-125) com os preparadores da PCR contendo os sítios de restrição Ncol e Xbal nas extremidades 5’ e 3’, respectivamente. O fragmento Ncol/Xbal foi depois introduzido em pMGNSI entre Ncol e Xbal criando assim uma proteína de fusão contendo os 81 aminoácidos do terminal N da proteína NS1 seguida pela proteína PD. Este vetor foi rotulado pMGNS 1 PrD.
Com base na construção descrita acima a construção final para a expressão da proteína D foi gerada. Um fragmento BamHI/BamHI foi removido da pMGNSIPrD. Esta hidrólise de DNA remove a região codificadora NS1, exceto para os primeiros três resíduos de terminal N. Na religa do vetor um gene que codifica uma proteína de fusão com a sequência mostrada na WO07/71711, exemplo 1, página 44 é gerada.
A proteína D não contém um peptídeo líder ou a cisteína de terminal N à qual as cadeias de lipídeo são normalmente ligadas. A proteína portanto não é excretada nem no periplasma nem lipidada e permanece no citoplasma em uma forma solúvel.
A construção final pMG-MDPPrD foi introduzida na cepa hospdeira AR58 pelo choque térmico a 37°C. O plasmídeo contendo bactérias foi selecionado na presença de Canamicina. A presença do inserto de DNA que codifica a proteína D foi demonstrada pela digestão de DNA plasmídeo isolado com endonucleases selecionadas. A cepa da E. coli recombinante é indicada como ECD4.
A expressão da proteína D está sob o controle do promotor Pl lambda / Operador OL. A cepa hospedeira AR58 contém um gene cl sensível à temperatura no genoma que bloqueia a expressão de Pl lambda na temperatura baixa pela ligação a OL. Uma vez que a temperatura é elevada cl é liberado de OL e a proteína D é expressada.
Preparação em escala pequena
No final da fermentação as células são concentradas e congeladas.
A extração das células colhidas e a purificação da proteína D foi realizada como segue. A pelota da cultura de célula congelada é descongelada e recolocada em suspensão em uma solução de rompimento de célula (tampão de Citrato pH 6,0) a uma ODôso final — 60. A suspensão é passada duas vez através de um homogeneizador de alta pressão em P = 1000 barra. O homogenado de cultura de célula é clarificado pela centrifugação e os fragmentos de célula é removido pela filtração. Na primeira etapa de purificação o lisado filtrado é aplicado a uma coluna de cromatografia de troca de cation (SP Sepharose Fast Flow). PD liga-se à matriz de gel pela interação iônica e é eluído por um aumento escalonado da concentração iônica do tampão de eluição.
Em uma segunda etapa de purificação as impurezas são retidas em uma matriz de troca aniônica (Q Sepharose Fast Flow). PD não se liga no gel e pode ser coletado no fluxo.
Em ambas as etapas de cromatografia de coluna a coleta de fração é monitorada pela OD. O fluxo da cromatografia de troca aniônica contendo a proteína D purificada é concentrado pela ultrafiltração.
A proteína D contendo o retido da ultrafiltração é finalmente passada através de uma membrana de 0,2 pm.
Preparação em larga escala
A extração das células colhidas e a purificação da proteína D foi realizada como segue. O caldo de colheita é esfriado e diretamente passado duas vezes através de um homogeneizador de alta pressão a uma pressão em tomo de 800 bar.
Na primeira etapa de purificação o homogenado de cultura de célula é diluído e aplicado a uma coluna de cromatografia de troca de cátion (pérolas SP Sepharose Big). PD liga-se à matriz do gel pela interação iônica e é eluído por um aumento escalonado da concentração iônica do tampão de eluição e filtrado.
Em uma segunda etapa de purificação as impurezas são retidas em uma matriz de troca aniônica (Q Sepharose Fast Flow). PD não se liga no gel e pode ser coletado no fluxo.
Em ambas as etapas de cromatografia de coluna a coleta de fração é monitorada pela OD. O fluxo através da cromatografia de coluna de troca aniônica contendo a proteína D purificada é concentrada e diafiltrada pela ultrafiltração.
A proteína D contendo o retido da ultrafiltração é finalmente passada através de uma membrana de 0,2 pm.
Exemplo 1 b: EXPRESSÃO DE PhtD
A proteína PhtD é um membro da família de proteína da tríade da histidina pneumocócica (Pht) caracterizada pela presença de tríades de histidina (motivo HXXHXH). PhtD é uma molécula de 838 aminoácidos e carrega 5 tríades de histidina (ver Medlmmune WOOO/37105 SEQ ID NO:4 para a sequência de aminoácido e SEQ ID NO:5 para a sequência de DNA). PhtD também contém uma região rica em prolina no centro (posição de aminoácido 348-380). PhtD tem uma sequência de sinal de terminal N de 20 aminoácidos com um motivo LXXC.
Construção genética
A sequência de gene da proteína Medlmmune PhtD madura (do aminoácido 21 ao aminoácido 838) foi transferida recombinantemente para a E. coli usando o vetor pTCMP14 caseiro que carrega o promotor pX. A cepa hospedeira da E. coli é AR58, que carrega o repressor termossensível cI857, que permite a indução de calor do promotor.
A reação da cadeia da polimerase foi realizada para amplificar o gene phtD de um plasmídeo Medlmmune (que carrega o gene phtD da cepa Norway 4 de Streptococcus pneumoniae (sorotipo 4) - SEQ ID NO:5 como descrito na WOOO/37105). Os preparadores, específicos apenas para o gene phtD, foram usados para amplificar o gene phtD em dois fragmentos. Os preparadores carregam os sítios de restrição Ndel e Kpnl ou o Kpnl e Xbal. Estes preparadores não hibridizam com nenhum nucleotídeo do vetor mas apenas com sequências de gene específicas de phtD. Um códon de partida ATG artificial foi inserido usando o primeiro preparador que carrega o sítio de restrição Ndel. Os produtos de PCR gerados foram depois inseridos no vetor de clonagem pGEM-T (Promega) e a sequência de DNA foi confirmada. A subclonagem dos fragmentos no vetor de expressão TCMP14 foi depois realizado usando técnicas padrão e o vetor foi transformado na E. coli AR58.
Purificação de PhtD
A purificação de PhtD é obtido como segue:
° Cultivo de células de E. coli na presença de Canamicina:
cultivar 30 horas a 30°C depois da indução por 18 horas a 39,5°C ° Ruptura das células de E. coli da cultura inteira na OD ±115 na presença de EDTA 5mM e PMSF 2mM como inibidores da protease: Rannie, 2 passagens, 1000 bar.
° Captura de antígeno e remoção de fragmentos de células na cromatografia Streamline Q XL no modo de leito expandido na temperatura ambiente (20°C); a coluna é lavada com NaCl 150mM + Empigen 0,25% pH
6,5 e eluída com NaCl 400mM + Empigen 0,25% em tampão de fosfato de potássio 25mM pH 7,4.
D Filtração em cartucho Sartobran 150 (0,45 + 0,2 pm) » Ligação do antígeno na cromatografia de Sepharose FF IMAC de Quelação de Zn: ! no pH 7,4 na presença de 5mM de imidazol a 4°C; a coluna é lavada com Imidazol 5mM e Empigen 1% e eluída com 50mM de imidazol, ambos em tampão de fosfato de potássio a 258mM pH 8,0.
° Cromatografia de troca de ânion fraco no modo positivo em Fractogel EMD DEAE no pH 8,0 (fosfato de potássio 25mM) a 4°C; a coluna é lavada com 140mM de NaCl e eluída em 200mM de NaCl enquanto os contaminantes (proteínas e DNA) permanecem absorvidos no trocador.
° Concentração e ultrafiltração com 2mM de fosfato de Na/K pH 7,15 em membrana de 50kDa.
° Filtração de esterilização do grosso purificado em um cartucho de filtração de 0,2 pm Millipak-20.
Exemplo 1c: EXPRESSÃO DE PNEUMOLISINA
A pneumolisina pneumocócica foi preparada e destoxificada como descrito na W02004/081515 e W02006/032499.
Exemplo 2:
Preparação de conjugados
É bem conhecido na técnica como fabricar polissacarídeos pneumocócicos purificados. Para os propósitos destes exemplos os polissacarídeos foram fabricados essencialmente como descrito na EP072513 ou pelos métodos intimamente relacionados. Antes da conjugação os polissacarídeos podem ser dimensionados pela microfluidização como descrito abaixo.
As condições de ativação e ligação são específicas para cada polissacarídeo. Estas são dadas na Tabela 1. O polissacarídeo classificado (exceto para PS5, 6B e 23F) foi dissolvido em NaCl 2 M, NaCl 0,2 M ou em água para injeção (WFI). A concentração de polissacarídeo ótimo foi avaliada para todos os sorotipos. Todos os sorotipos exceto sorotipo 18C foram conjugados diretamente com a proteína carreadora como detalhado abaixo. Dois conjugados de sorotipo 22F alternativos foram fabricados; um diretamente conjugado, um através de um ligador ADH.
A partir de uma solução de estoque de 100mg/ml em acetonitrila ou solução de acetonitrila/água 50%/50%, CDAP (razão de CDAP/PS 0,5 a l,5mg/mg de PS) foi adicionado à solução de polissacarídeo.
1,5 minuto mais tarde, NaOH 0,2 M a 0,3 M foi adicionado para se obter o pH de ativação específico. A ativação do polissacarídeo foi realizada neste pH durante 3 minutos a 25°C. A proteína purificada (proteína D, PhtD, pneumolisina ou DT) (a quantidade depende da razão de PS inicial/proteína carreadora) foi adicionada ao polissacarídeo ativado e a reação de ligação foi realizada no pH específico por até 2 horas (dependendo do sorotipo) sob regulagem de pH. De modo a extinguir grupos de éster de cianato não reagidos, uma solução 2 M de glicina foi depois adicionada à mistura. O pH foi ajustado ao pH de extinção (pH 9,0). A solução foi agitada por 30 minutos a 25°C e depois durante a noite de 2 a 8°C com agitação lenta contínua.
Preparação de 18C:
18C foi ligada com a proteína carreadora por intermédio de um ligador - Diidrazida de Ácido Adípico (ADH). O polissacarídeo sorotipo 18C foi microfluidizado antes da conjugação.
Derivatização de toxóide do tétano com EDAC
Para a derivatização do toxóide do tétano, TT purificada foi diluída a 25mg/ml em NaCl 0,2 Meo espaçador ADH foi adicionado de modo a atingir uma concentração final de 0,2 M. Quando a dissolução do espaçador foi completa, o pH foi ajustado a 6,2. EDAC (l-etil-3-(3- dimetilaminopropil) carbodiimida) foi depois adicionado para atingir uma concentração final de 0,02 Mea mistura foi agitada por 1 hora sob regulagem de pH. A reação de condensação foi interrompida pelo aumento do pH até 9,0 por pelo menos 30 minutos a 25°C.
O TT derivado foi depois diafiltrado (membrana CO de lOkDa) de modo a remover ADH e reagente EDAC residuais.
O grosso de TTah foi finalmente filtrado estéril até a etapa de ligação e armazenado a -70°C.
Ligação química de TTah ao PS 18C
Os detalhes dos parâmetros de conjugação podem ser encontrados na Tabela 1.
gramas de PS microfluidizado foram diluídos na concentração definida em água e ajustado para NaCl 2 M pela adição de pó de NaCl.
A solução de CD AP (100mg/ml recém preparados em 50/50 v/v acetonitrila/WFI) foi adicionada para atingir a razão de CDAP/PS apropriada.
O pH foi elevado até a ativação no pH 9,0 pela adição de 0,3 M de NaOH e foi estabilizado neste pH até a adição de TTAH.
Depois de 3 minutos, TTah derivada (20mg/ml em NaCl 0,2
M) foi adicionada para atingir uma razão de TTah/PS de 2; o pH foi regulado para o pH de ligação de 9,0. A solução foi deixada uma hora sob a regulagem do pH.
Para extinguir, uma solução 2 M de glicina, foi adicionada à mistura de PS/TTAH/CDAP. O pH foi ajustado ao pH de extinção (pH 9,0).
A solução foi agitada por 30 min a 25°C e depois deixada durante a noite de 2 a 8°C com agitação lenta contínua.
Conjugado PS22Ew-PhtD
Em um segundo método de conjugação para este sacarídeo (o primeiro sendo o método de conjugação de PS22-PhtD direto mostrado na Tabela 1), 22F foi ligado com a proteína carreadora por intermédio de um ligador - Diidrazida de Ácido Adípico (ADH). O polissacarídeo sorotipo 22F foi microfluidizado antes da conjugação.
Derivatização de PS 22F
A ativação e ligação são realizadas a 25°C sob agitação contínua em um banho de água controlado na temperatura.
PS22F microfluidizado foi diluído para se obter uma concentração de PS final de 6mg/ml em NaCl 0,2 Mea solução foi ajustada ao pH 6,05 ± 0,2 com HC1 0,1 N.
A solução de CD AP (100mg/ml recém preparados em acetonitrila/WFI, 50/50) foi adicionada para atingir a razão de CDAP/PS apropriada (1,5/1 p/p).
O pH foi elevado até o pH de ativação de 9,00 ± 0,05 pela adição de NaOH 0,5 M e foi estabilizado neste pH até a adição de ADH.
Depois de 3 minutos, ADH foi adicionado para atingir a razão de ADH/PS apropriada (8,9/1 p/p); o pH foi regulado ao pH de ligação de 9,0. A solução foi deixada por 1 hora sob a regulagem do pH.
O derivado de PSah foi concentrado e diafiltrado.
Ligação
PhtD a 10mg/ml em NaCl 0,2 M foi adicionado ao derivado de PS22Fah de modo a atingir uma razão de PhtD/PS22FAH de 4/1 (p/p). O pH foi ajustado a 5,0 ± 0,05 com HC1. A solução de EDAC (20mg/ml em TrisHC1 0,1 M pH 7,5) foi adicionada manualmente em 10 min (250 μΐ / min) para atingir Img de EDAC/mg de PS22Fah. A solução resultante foi incubada por 150 min (embora 60 min também fosse usado) a 25°C sob agitação e regulagem do pH. A solução foi neutralizada pela adição de Tris-HCl 1 M pH
7,5 (1/10 do volume final) e deixado 30 min a 25°C.
Antes da eluição em Sephacril S400HR, o conjugado foi clarificado usando um filtro Minisart de 5 μπι.
O conjugado resultante tem uma razão de PhtD/PS final de 4,1 (p/p), um teor de PS livre abaixo de 1% e uma antigenicidade (α-PS/a-PS) de 36,3% e antigenicidade anti-PhtD de 7,4%. A razão de proteína e polissacarídeo foi medida usando os métodos de Lowry e Resorcinol e a antigenicidade foi determinada usando ELISA intercalado.
Purificação dos conjugados:
Os conjugados foram purificados pela filtração em gel usando uma coluna de filtração em gel Sephacril S400HR equilibrada com NaCl 0,15 M (S500HR para 18C) para remover moléculas pequenas (incluindo DMAP) e PS não conjugada e proteína. Com base nos tamanhos moleculares diferentes dos componentes de reação, os conjugados PS-PD, PS-TT, PSPhtD, PS-pneumolisina ou PS-DT são eluídos primeiro, seguidos pelo PS livre, depois pelo PD livre ou DT livre e finalmente DMAP e outros sais (NaCl, glicina).
As frações contendo conjugados são detectadas pela UV280 nm· As frações são reunidas de acordo com seu kD, filtrados estéril (0,22 pm) e armazenada a +2 a 8°C. As razões de PS/Proteína nas preparações de conjugado foram determinadas.
Condições de ativação/ligação/extinção específicas de conjugados de PS de S. pneumoniae-Proteinas D/TT/DT/PhtD/Ply
Onde “pfluid” aparece em um cabeçalho de coluna, o mesmo indica que o sacarídeo foi dimensionado pela microfluidização antes da conjugação. Os tamanhos de sacarídeos a seguir da microfluidização são 5 dados na tabela 2.
Tabela 1 Condições de ativação/ligação/extinção específicas de conjugados de PS de A pneumoniae-Proteínas D/TT/DT/PhtDZPly
Sorotipo 1 pfluído 4 pfluído 5 6A 6B 7F pfluído
PS conc.(mg/ml) 2,5 2,5 7,1 5,0 5,0 5,0
Dissolução de PS WFI WFI WFI NaCl 2M NaCl 2M NaCl 2M
PD conc.(mg/ml) 10,0 10,0 5,0 5,0 5,0 10,0
Razão de PD/PS inicial (p/p) 1,5/1 1,5/1 1/1 1/1 1,1/1 1,2/1
CDAP conc. (mg/mg PS) 0,50 0,50 0,79 0,83 0,83 0,75
pHa=pHc=pHq 9,0/9,0/9,0 9,5/9,5/9,0 9,0/9,0/9,0 9,5/9,5/9,0 9,5/9,5/9,0 9,5/9,5/9,0
Sorotipo 9V pfluído 14 pfluído 18C pfluído 19A pfluído 19F pfluído 22F pfluído 23F
PS conc.(mg/ml) 5,0 5,0 4,5 15,0 9,0 6,0 2,38
Dissolução de PS NaCl 2M NaCl 2M NaCl 2M NaCl 2M NaCl 2M NaCl 0,2M NaCl 2M
conc da proteína carreadora (mg/ml) 10,0 10,0 20,0 (TT) 10,0 (Ply) 20,0 (DT) 10,0 (PhtD) 5,0
Razão de proteína carreador/PS inicial (p/p) 1,2/1 1,2/1 2/1 2,5/1 1,5/1 3/1 1/1
conc. de CDAP (mg/mg PS) 0,50 0,75 0,75 1,5 1,5 1,5 0,79
pHa=pHc=pHq 9,5/9,5/9,0 9,5/9,5/9,0 9,0/9,0/9,0 9,0/9,0/9,0 9,0/9,0/9,0 9,0/9,0/9,0 9,5/9,5/9,0
Nota:pHa,c,q corresponde ao pH para ativação, ligação e extinção, respectivamente
Caracterização:
Cada conjugado foi caracterizado e atinge as especificações descritas na Tabela 2. O teor de polissacarídeo (pg/ml) foi medido pelo teste do Resorcinol e o teor de proteína (pg/ml) pelo teste de Lowry. A razão PS/PD final (p/p) é determinada pela razão das concentrações.
Teor de polissacarídeo livre (%):
O teor de polissacarídeo livre de conjugados mantidos a 4°C ou armazenados 7 dias a 37°C foi determinado no sobrenadante obtido depois da incubação com anticorpos da proteína carreadora a e sulfato de amônio saturado, seguida por uma centrifugação.
Um ELISA α-PS/a-PS foi usado para a quantificação de polissacarídeo livre no sobrenadante. A ausência de conjugado foi também controlada por um ELISA de proteína carreadora α/α-PS.
Antigenicidade:
The antigenicidade nos mesmos conjugados foi analisada em um ELISA tipo intercalado em que a captura e a detecção de anticorpos foram α-PS e a-Proteína respectivamente.
Teor de proteína livre (%):
A proteína carreadora não conjugada pode ser separada da conjugada durante a etapa de purificação. O teor de proteína residual livre foi determinado usando a cromatografia de exclusão de tamanho (TSK 5000PWXL) seguida pela detecção UV (214 nm). As condições de eluição permitiram separar a proteína carreadora livre e o conjugado. O teor de proteína livre nos volumes conjugados foi depois determinado versus uma curva de calibração (de 0 a 50 pg/ml de proteína carreadora). A proteína carreadora livre em % foi obtida como segue: % de carreador livre = (carreador livre (pg/ml)/ (Concentração total de proteína carreadora correspondente medida por Lowry (pg/ml) * 100%).
Estabilidade:
A distribuição de peso molecular (Kav) e estabilidade foram medidos em uma filtração em gel HPLC-SEC (TSK 5000-PWXL) para os conjugados mantidos a 4°C e armazenados por 7 dias a 37°C.
A caracterização 10/11/13/14-valentes é dada na Tabela 2 (ver comentário abaixo desta).
Os conjugados de proteína podem ser absorvidos em fosfato de alumínio e reunidos para formar a vacina final.
TABELA 2 - Características dos conjugados
Conjugados Tamanho de PS (DaxlO3) Razão carreador/PS PS livre (Elisa) Carreador Livre Antigenicidade de PS (Elisa) Tamanho de Conj.
PS1-PD 349-382* 1,5-1,6 1,O%-1,2% 3,9%-4,8% 87%-95% 1499- 1715
PS4-PD 93-100* 1,5-1,6 4,7-6,5% 3,2%-4,0% 90%-96% 1303 - 1606
PS5-PD*** 367-443 0,80 8,7-11,2% 2,2%-3,8% 93%-108% 1998-2352
PS6A-PD 1100-1540 0,61 4,5% ND 45,9% ND
PS6B-PD*** 1069-1391 0,7-0,8 1,3-1,6% <2,0% 68%-75% 4778-5235
PS7F-PD 255-264* 1,1-1,2 <1% <1,4% 58% 3907-4452
PS9V-PD 258-280* 1,3-1,5 <1% <1,3% 67%-69% 9073-9572
PS14-PD 232-241* 1,4 <1% <1,5% 70% 3430-3779
PS18C-TT 89-97* 2,2-2,4 1,5-2,2% <4% 46%-56% 5464-6133
PS19A-Ply* 151 3,2 <1% 29%
PS19F-DT 133-143* 1,4-1,5 4,l%-5,9% <1,2%- <1,3% 82%-88% 2059-2335.
PS22F-PhtD* 159-167 2,17 5,8 ND 37% ND
PS22FAHPhtD* 159-167 3,66-4,34 <1% ND 28-31% ND
PS23F-PD*** 914-980 0,5 1,4-1,9% 3,7%-4,9% 137%-154% 2933-3152
* tamanho do PS a seguir da microfluidização do PS nativo *** polissacarídeo não dimensionado
ND - não determinado
Uma vacina 10 valente foi fabricada misturando-se conjugados de sorotipo 1, 4, 5, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19F e 23F (por exemplo em uma 5 dose de 1, 3, 1, 1, 1, 1, 1, 3, 3, 1 pg de sacarídeo, respectivamente por dose humana). Uma vacina 11 valente foi fabricada pela adição adicional do conjugado de sorotipo 3 da Tabela 5 (por exemplo a 1 pg de sacarídeo por dose humana). Uma vacina 13 valente foi feita pela adição adicional dos conjugados de sorotipos 19A e 22F acima (com 22F diretamente ligado ao 10 PhtD ou alternativamente através de um ligador ADH) [por exemplo a uma dose de 3 pg cada um de sacarídeo por dose humana]. Uma vacina 14 valente pode ser feita pela adição adicional do conjugado de sorotipo 6A acima [por exemplo em uma dose de 1 pg de sacarídeo por dose humana.
Exemplo 3: Evidência de que a inclusão da proteína D de 15 Haemphilus influenzae em uma composição imunogênica da invenção pode fornecer proteção melhorada contra otite média aguda (AOM).
Planejamento de estudo.
O estudo usou uma vacina HPn-PD - que compreende sorotipos 1, 3, 4, 5, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19F e 23F cada uma conjugada à proteína D de H. influenzae (refere-se à Tabela 5 no Exemplo 4). Os pacientes foram randomizados em dois grupos para receber quatro doses da vacina llPn-PD ou Havrix em aproximadamente 3, 4, 5el2al5 meses de idade. Todos os pacientes receberam a vacina Infanrix-hexa (DTPa-HBV-IPV/Hib) da GSK Biologicals concomitantemente a 3, 4 e 5 meses de idade. A Infanrixhexa é uma combinação de Pediarix e Hib misturadas antes da administração. O seguimento da eficácia para a análise “De Acordo Com o Protocolo” começou 2 semanas depois da administração da terceira dose de vacina e continuou até 24 a 27 meses de idade. A portabilidade nasofaríngea de S. pneumoniae e H. influenzae foi avaliado em um subconjunto selecionado de pacientes.
Os pais foram alertados para consultarem o investigador se a sua criança estivesse doente, tivesse dor de ouvido, perfuração espontânea da membrana timpânica ou descarga de ouvido espontânea. Se o investigador suspeitasse de um episódio de AOM, a criança era imediatamente encaminhada a um especialista de Ouvido, Nariz e Garganta (ENT) para a confirmação do diagnóstico.
Um diagnóstico clínico de AOM foi com base no aspecto visual da membrana timpânica (isto é, vermelhidão, protuberante, perda de reflexo de luz) ou a presença de efusão de líquido do ouvido médio (como demonstrado pelo otoscópio simples ou pneumático ou pelo microscópio). Além disso, pelo menos dois dos seguintes sinais ou sintomas tiveram que estar presentes: dor de ouvido, descarga de ouvido, perda de audição, febre, letargia, irritabilidade, anorexia, vômito ou diarréia. Se o especialista de ENT confirmou o diagnóstico clínico, um espécime do fluído do ouvido médio foi coletado pela timpanocentese para os testes bacteriológicos.
Para pacientes com vistas doentes repetidas, um novo episódio de AOM foi considerado ter começado se mais do que 30 dias se passaram desde o começo do episódio anterior. Além disso, um episódio de AOM foi considerado ser um novo episódio bacteriano se a bactéria/sorotipo isolados diferiram do isolado anterior qualquer que seja o intervalo entre os dois episódios consecutivos.
Resultados de Teste
Um total de 4968 crianças foram alistadas, 2489 no grupo 1 lPn-PD e 2479 no grupo de controle. Não houve diferença maior nas características demográficas ou fatores de risco entre os dois grupos.
Episódios Clínicos e definição de caso AOM
Durante o período de seguimento por protocolo, um total de 333 episódios de AOM clínica foram registrados no grupo 1 lPn-PD e 499 no grupo de controle.
A Tabela 3 apresenta a eficácia protetora da vacina e ambas as vacinas 7-valentes anteriormente testadas na Finlândia (Eskola et al N Engl J Med 2001; 344:403 - 409 e Kilpi et al Clin Infect Dis 2003 37:1155-64) contra qualquer episódio de AOM e AOM causado pelos sorotipos pneumocócicos diferentes, H. influenzae, NTHi e M. catarrhalis.
Uma redução estatisticamente significante e clinicamente relevante em 33,6% da carga de doença de AOM global foi obtida com 1 IPnPD, independente da etiologia (tabela 3).
A eficácia global contra episódios de AOM devido a qualquer um dos sorotipos 11 pneumocócicos contidos na vacina HPn-PD foi de 57,6% (tabela 3).
Uma outra descoberta importante no estudo corrente é a proteção de 35,6% fornecida pela vacina 1 lPn-PD contra AOM causada pela
H. influenzae (e especificamente 35,3% de proteção fornecida por NTHi). Esta descoberta é de maior significância clínica, dada a importância aumentada da H. influenzae como uma causa maior de AOM na era da vacina de conjugado pneumocócico. Em linha com a proteção fornecida contra AOM, a vacina 1 lPn-PD também reduziu a portabilidade nasofaríngea da H.
influenzae a seguir da dose de reforço no segundo ano de vida. Estas descobertas estão em contraste com observações anteriores na Finlândia onde, para ambas as vacinas de conjugado pneumocócico 7-valente, um aumento nos episódios de AOM devido à H. influenzae foi observado, (Eskola et al e
Kilpi et al) como evidência de substituição etiológica.
Uma clara correlação entre a proteção contra episódios de AOM devido aos níveis de Hi e anticorpo contra a Proteína D carreadora não pôde ser estabelecida, visto que as concentrações de anticorpo de IgG anti-PD pós-primárias em vacinados com HPn-PD, que permaneceram livres de episódios Hi AOM, foram essencialmente as mesmas como os níveis de anticorpo de IgG anti-PD pós-primárias medidos em vacinados HPn-PD que desenvolveram pelo menos um episódio Hi AOM durante o período de acompanhamento de eficácia. Entretanto, embora nenhuma correlação pudesse ser estabelecida entre o impacto biológico da vacina e a imunogenicidade anti-PD de IgG pós-primária, é razoável assumir que a proteína carreadora PD, que é altamente conservada entre as cepas da H. influenzae, tenham contribuído em um grande grau na indução da proteção contra Hi.
O efeito sobre a doença de AOM foi acompanhada por um efeito sobre a portabilidade nasofaríngea que foi de magnitude similar para pneumococos e H. influenzae de sorotipo de vacina (Figura 1). Esta redução da portabilidade nasofaríngea de H. influenzae nos vacinados com PDconjugado sustenta a hipótese de um efeito protetor direto da vacina de PDconjugado contra H influenzae, mesmo se a eficácia protetora não pudesse ser correlacionada com as resposta imunes de IgG anti-PD como medidas pelo ELISA.
Em um experimento seguinte um modelo de otite média de chinchila foi usado com reuniões de soro de crianças imunizadas com a formulação 11 valente deste exemplo ou com a vacina 10 valente do Exemplo (ver também as Tabelas 1 e 2 e comentários sob elas). Ambas as reuniões induzem uma redução significante da porcentagem de animais com otite média versus a reunião de soro pré-imune. Não existe nenhuma diferença significante entre as reuniões imunes 10 e 11 valentes. Isto demonstra que 5 ambas as vacinas têm um potencial similar para induzir proteção contra otite média causada pela H. influenzae não tipável neste modelo.
TABELA 3
1 2 O ç OΞ O > LU CJ> _l 23 o Q b— < CO < O D V3 o c a> &0 -Q v S.i K L V} -r 2 £ ±: *- oJ O X C N P; n = número de episódios evnar e 7v-0MP = 7 sorotipos MEF = Fluido do ouvido médio
o* O _J _J CN CN t— CN D
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. CL O | 805 | xt σ co bCO c> 314 O UO CL Z | 444 |
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o m CD —» > T— CN NP σ»
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c Φ 2 Έ o O ’d σ> lO b xí Cl co c 5 N x± 250 798 | z cõ
7vCRM I 786 I uõ b CN x Z UO z σ> NP = Não publicada; N = número de pacientes no grupo de eficácia em AT] * Sorotipos de Vacina Pneumocócica: para 1 lPn-PD =11 sorotipos, para Pr
g > O xp Z> co c. ?’í ο σ> O CN 4- co CD to UO co”
© IO CD _j O < CN D CO co 41,4 CO to CN io
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11Pn- PD to LO xí CN co co 322 92 CD
o < .2 ‘C V α ω Ό C Η Z Qualquer AOM Qualquer AOM com MEr Cultura confirmada nnpiimnrnmc --------- Vacina pneumocócica «nrntinns* % 3 Ί5 o. o «d C Cu > ? g : ω > »5 ! - -S a
Exemplo 4:
Seleção de proteína carreadora para o sorotipo 19F
Ensaio de ELISA usado
O método de ELISA de inibição de 22F foi essencialmente fundamentado em um ensaio proposto em 2001 por Concepcion e Frasch e foi relatado por Henckaerts et al., 2006, Clinical and Vaccine Immunology 13:356360. Em resumo, polissacarídeos pneumocócicos purificados foram misturados com albumina sérica humana metilada e absorvidos em placas de microtítulo de ligação alta Nunc Maxisorp® (Roskilde, DK) durante a noite a 4°C. As placas foram bloqueadas com 10% de soro bovino fetal (FBS) em PBS por 1 hora na temperatura ambiente com agitação. As amostras séricas foram diluídas em PBS contendo 10% de FBS, 10 pg/ml de polissacarídeo de parede celular (SSI) e 2 pg/ml de polissacarídeo pneumocócico de sorotipo 22F (ATCC) e diluídos ainda mais nas placas de microtítulo com o mesmo tampão. Uma referência interna calibrada contra o soro padrão 89-SF usando as concentrações de IgG específica de sorotipo em 89-SF foi tratado do mesmo modo e incluídas em cada placa. Depois de lavar, os anticorpos ligados foram detectados usando anticorpo monoclonal de IgG anti-ser humano conjugado à peroxidase (Stratech Scientific Ltd., Soham, UK) diluído em 10% de FBS (em PBS) e incubados por 1 hora na temperatura ambiente com agitação. A cor foi desenvolvida usando kit de substrato de imunoensaio de tetrametilbenzidina peroxidase de componente único pronto para o uso (BioRad, Hercules, CA, US) no escuro na temperatura ambiente. A reação foi interrompida com H2SO4 0,18 M e a densidade óptica foi lida a 450 nm. As concentrações de IgG específicas de sorotipo (em pg/ml) nas amostras foram calculadas por referência aos pontos de densidade óptica dentro de limites definidos para a curva sérica de referência interna, que foi modelizada por uma equação de log logístico de 4 parâmetros calculada com o software SoftMax Pro® (Molecular Devices, Sunnyvale, CA). O corte para o ELISA foi de 0,05 pg/ml de IgG para todos os sorotipos levando-se em conta o limite de detecção e o limite de quantificação.
Ensaio de Opsonofagocitose
Na WHO consultation meeting em Junho de 2003, foi recomendado usar um ensaio de OPA como demonstrado em Romero-Steiner et al Clin Diagn Lab Immunol 2003 10 (6):ppl019-1024. Este protocolo foi usado para testar a atividade OPA dos sorotipos nos seguintes testes.
Preparação de conjugados
Nos estudos 1 lPn-PD&Di-001 e 1 lPn-PD&Di-007, três formulações de vacina 11-valente (Tabela 4) foram incluídas em que 3 μg do polissacarídeo 19F foi conjugado ao toxóide da difteria (19F-DT) ao invés 1 pg de polissacarídeo conjugado à proteína D (19F-PD). Os parâmetros de conjugação para os estudos HPn-PD, 1 lPn-PD&Di-001 e 1 lPnPD&Di-007 são divulgados nas Tabelas 5, 6 e 7 respectivamente.
As respostas de anticorpo anti-pneumocócica e atividade de OPA contra sorotipo 19F um mês a seguir da vacinação primária com estas formulações 19F-DT são mostradas na Tabela 8 e 9 respectivamente. A Tabela 10 mostra concentrações de anticorpo de 22F-ELISA e as porcentagens de pacientes que atingem o limiar de 0,2 pg/ml antes e depois da vacinação de reforço de polissacarídeo 23-valente simples.
A atividade opsonofagocítica foi mostrada ser claramente melhorada para os anticorpos induzidos com estas formulações de 19F-DT como demonstrado pelas taxas de soropositividade mais alta (títulos opsonofagocíticos 1:8) e GMTs de OPA um mês a seguir da vacinação primária (Tabela 9). Um mês depois da vacinação de reforço de polissacarídeo simples 23-valente, a atividade opsonofagocítica de anticorpos 19F permaneceram significantemente melhor para crianças preparadas com formulações de 19F-DT (Tabela 11).
A Tabela 12 apresenta os dados de imunogenicidade a seguir de uma dose de reforços de llPn-PD em crianças entre um e três anos previamente preparadas com conjugados 19F-DT ou 19F-PD comparadas com uma 4a dose consecutiva de Prevnar®. Dados os avanços de casos relatados depois da introdução de Prevnar® nos US, a atividade opsonofagocítico melhorada contra o sorotipo 19F quando conjugado à proteína carreadora DT pode ser uma vantagem para a vacina candidata.
A Tabela 13 fornece os dados de ELISA e OPA para o conjugado 19F-DT com respeito ao sorotipo 19a reativo cruzado. Foi descoberto que 19F-DT induz atividade OPA baixa mas significante contra 19A.
Tabela 4 Formulações de vacina conjugada a Pneumocócica usadas em 10 estudos clínicos.
Formulação gg de sorotipo pneumocócico/proteína carreadora Al3+ mg
1 3 4 5 6B 7F 9V 14 18C 19F 23F
1 lPn-PD 1/PD 1/PD 1/PD 1/PD 1/PD 1/PD 1/PD 1/PD 1/PD 1/PD 1/PD <0,8
19F-DT Forma 1 3/PD 3/PD 3/PD 3/PD 10/DT 3/PD 3/PD 3/PD 3/PD 3/DT 5/DT <0,35
19F-DT Forma 2 3/PD 2/PD 2/PD 3/PD 5/DT 3/PD 2/PD 2/PD 2/PD 3/DT 5/DT <0,35
19F-DT Forma 3 3/PD 3/PD 3/PD 3/PD 3/PD 3/PD 3/PD 3/PD 3/PD 3/DT 3/PD = 0,5
Tabela 5 Condições de ativação/ligação/extinção específicas de conjugados de PS S. pneumoniae-Proteínas D/TT/DT
Sorotipo 1 Nativo 3 pfluído 4 Nativo 5 Nativo 6B Nativo 7F Nativo
Concentração de PS (mg/ml) 1,5 2 2,0 7,5 5,5 3,0
Dissolução de PS NaCl 150mM NaCl 2M WFI WFI NaCl 2M NaCl 2M
Concentração de PD (mg/ml) 5,0 5,0 5,0 5,0 5,0 5,0
Razão de PS/PD inicial (p/p) 1/0,7 1/1 1/1 1/1 1/1 1/1
Conc. de CD AP (mg/mg PS) 0,75 0,75 0,75 0,75 0,75 0,75
pHa=pHc=pHa 9,0/9,0/9,0 9,5/9,5/9,0 8,8/8,8/9,0 9,0/9,0/9,0 9,5/9,5/9,0 9,0/9,0/9,0
Tempo de ligação 60 min 60 min 45 min 40 min 60 min 60 min
Sorotipo 9V Nativo 14 Nativo 18C Nativo 19F Nativo 23F Nativo
Concentração de PS (mg/ml) 1,75 2,5 1,75 4,0 2,5
Dissolução de PS NaCl 2M NaCl 2M WFI NaCl 2M NaCl 2M
PD conc.(mg/ml) 5,0 5,0 5,0 5,0 5,0
Razão de PS/PD inicial (p/p) 1/0,75 1/0,75 1/1,2 1/1 1/1
Conc. de CD AP (mg/mg PS) 0,75 0,75 0,75 0,75 0,75
pHa=pHc=pHq 8,5/8,5/9,0 9,0/9,0/9,0 9,0/9,0/9,0 9,5/9,5/9,0 9,5/9,5/9,0
Tempo de ligação 60 min 60 min 45 min 30 min 60 min
Tabela 6 Condições de ativação/ligação/extinção específicas de conjugados de PS S. pneumoniae-Proteínas D/DT para o estudo llPnPD&Di-OOl
Sorotipo 1 pfluído 3 pfluído 4 pfluído 5 pfluído 6B pfluído 7F Nativo
Concentração de PS (mg/ml) 4 2,0 2,5 7,5 10 3,0
Dissolução de PS NaCl 2M NaCl 2M NaCl 2M NaCl 2M NaCl 2M NaCl 2M
Concentração de PD (mg/ml) 10,0 5,0 5,0 5,0 NaCl 2M 20 (DT) NaCl 2M 5,0
Razão de PS/PD inicial (p/p) 1,2/1 1/1 1/1 1/1 1,5/1 1/1
Conc. de CD AP (mg/mg PS) 1,50 0,75 1,5 2 1,5 0,75
pHa=pHc=pH0 9,0/9,0/9,0 9,5/9,5/9,0 9,5/9,5/9,0 9,0/9,0/9,0 9,5/9,5/9,0 9/9/9
Tempo de ligação 60 min 60 min 60 min 60 min 60 min 60 min
Sorotipo 9V Nativo 14 Nativo 18C pfluído 19F pfluído 23F pfluído
Concentração de PS (mg/ml) 1,75 2,5 5,0 9,0 10
Dissolução de PS NaCl 2M NaCl 2M NaCl 2M NaCl 2M NaCl 2M
PD conc.(mg/ml) 5,0 5,0 5,0 20 (DT) 10 (DT)
Razão de PS/PD inicial (p/p) 0,75/1 0,75/1 1,2/1 1,5/1 1,5/1
Conc. de CDAP (mg/mg PS) 0,75 0,75 1,5 1,5 0,75
pHa=pHc=pHD 8,5/8,5/9,0 9,0/9,0/9,0 9,0/9,0/9,0 9,0/9,0/9,0 9,5/9,5/9,0
Tempo de ligação 60 min 60 min 30 min 60 min 60 min
Tabela 7 Condições de ativação/ligação/extinção específicas de conjugados de PS pneumoniae-Proteínas D/DT para o estudo HPnPD&DÍ-007
Sorotipo 1 Nativo 3 pfluído 4 Nativo 5 Nativo 6B Nativo 7F pfluído
Concentração de PS (mg/ml) 1,5 2,0 2 7,5 5,5 5,0
Dissolução de PS NaCl 150 mM NaCl 2M WFI WFI NaCl 2M NaCl 2M
Concentração de PD (mg/ml) 5,0 5,0 5,0 5,0 5 10
Razão de PS/PD inicial (p/p) 0,7/1 1/1 1 1/1 1/1 1,2/1
Conc. de CDAP (mg/mg PS) 0,75 0,75 0,75 0,75 0,75 0,75
pHa=pHc=pHa 9,0/9,0/9,0 9,5/9,5/9,0 8,8/8,8/9,0 9,0/9,0/9,0 9,5/9,5/9,0 9,5,/9,5/9
Tempo de ligação 60 min 60 min 45 min 40 min 60 min 60 min
Sorotipo 9V pfluído 14 pfluído 18C Nativo 19F pfluído 19F pfluído 23F pfluído
Concentração de PS (mg/ml) 5,0 5,0 1,75 9,0 10,0 9,5
Dissolução de PS NaCl 2M NaCl 2M WFI NaCl 2M NaCl 2M NaCl 2M
PD conc.(mg/ml) 10 10,0 5,0 20 (DT) 5,0 (PD) 10
Razão de PS/PD inicial (p/p) 1,2/1 1,2/1 1,2/1 1,5/1 1,2/1 1/1
Conc. de CDAP (mg/mg PS) 0,5 0,75 0,75 1,5 0,75 0,75
pHa=pHc=pHa 9,5/9,5/9,0 9,5/9,5/9,0 9,0/9,0/9,0 9,0/9,0/9,0 9,0/9,0/9,0 9,5/9,5/9,0
Tempo de ligação 60 min 60 min 45 min 120 min 120 min 60 min
Tabela 8 Porcentagem de pacientes com concentração de anticorpo 19F 0,20 pg/mL e concentrações de anticorpo médias geométricas do anticorpo 19F (GMCs com 95% de Cl; pg/ml) um mês a seguir da vacinação primária com 1 pg de 19F-PD, 3 pg de 19F-DT ou Prevnar (2 pg de 19F-CRM) (Grupo Total)
Grupo 1 lPn-PD&Di-001 (22F-ELISA) 1 lPn-PD&Di-007 (22F-ELISA)
N % > 0.20 pg/mL (95% Cl) GMC (pg/mL) (95% Cl) N % > 0.20 pg/mL (95% Cl) GMC (pg/mL) (95% Cl)
1 IPn-PD 152 98,7 (95,3-99,8) 1,93 (1,67-2,22) 50 100 (92,9-100) 2,78 (2,31-3,36)
19F-DT Forma l1 146 99,3 (96,2-100) 2,88 (2,45-3,38) - - -
19F-DT Forma 21 150 96,0 (91,5-98,5) 2,43 (2,01-2,94) - - -
19F-DT Forma 31 - - - 50 96,0 (86,3-99,5) 3,70 (2,58-5,30)
Prevnar 148 98,6 (95,2-99,8) 2,98 (2,60-3,41) 41 97,6 (87,1-99,9) 2,91 (2,15-3,94)
1 A composição das formulações diferentes é fornecida na tabela 4.
Tabela 9 Percentagem de pacientes com título de OPA de 19F 1:8 e GMTs de
OPA de 19F um mês a seguir da vacinação primária com 1 pg 19F-PD, 3 pg
19F-DT ou Prevnar (2 pg 19F-CRM) (Grupo Total)
Grupo 1 lPn-PD&Di-001 1 lPn-PD&Di-007
N > 1:8 (95% Cl) GMT (95% Cl) N > 1:8 (95% Cl) GMT (95% Cl)
llPn-PD 136 84,6 (77,4-90,2) 77,8 (58,1-104,4) 46 95,7 (85,2-99,5) 167,8 (118,1-238,6)
19F-DT Formal1 137 95,6 (90,7-98,4) 263,2 (209,4-330,7) - - -
19F-DT Forma 21 139 92,1 (86,3-96,0) 218,9 (166,5-287,9) - - -
19F-DT Forma 3‘ - - - 49 91,8 (80,4-97,7) 403,1 (225,7-719,9)
Prevnar 131 86,3 (79,2-91,6) 82,6 (61,1-111,6) 38 81,6 (65,7-92,3) 65,0 (37,7-112,2)
1 1 — f 1 » 11 111 »' * * ι·Γι I í 111
A composição das formulações diferentes é fornecida em Erro! Fonte de referência não encontrada.4.
Tabela 10 Porcentagem de pacientes com concentração de anticorpo 19F > 0,20 pg/ml e GMCs de anticorpo 19F (pg/ml) antes e um mês a seguir do reforço de polissacarídeo simples 23-valente em crianças preparadas com 1 pg de 19F-PD, 3 pg de 19F-DT ou Prevnar (2 pg de 19F-CRM) (Grupo Total)
Grupo primário 1 lPn-PD&Di-002 (22F ELISA)
Antes da vacina de reforço um mês após o reforço com PS 23-valente
N % > 0.20 pg/mL (95% Cl) GMC (pg/ml) (95% Cl) N % > 0.20 pg/mL (95% Cl) GMC (pg/ml) (95% Cl)
1 IPn-PD 70 77,1 (65,6-86,3) 0,67 (0,45-0,98) 67 94,0 (85,4-98,3) 11,50 (7,76-17,03)
19F-DT Forma l1 68 91,2 (81,8-96,7) 0,71 (0,54-0,94) 69 98,6 (92,2-100) 14,50 (10,47-20,07)
19F-DT Forma 21 74 81,1 (70,3-89,3) 0,59 (0,43-0,80) 72 95,8 (88,3-99,1) 9,90 (6,74-14,54)
Prevnar 65 64,6 (51,8-76.1) 0.40 (0,27-0,60) 67 100 (94,6-100) 9,40 (6,95-12,71)
1 A composição das formulações diferentes é fornecida em Erro! Fonte de Referência não encontrada.4.
Tabela 11 Porcentagem de pacientes com título de OPA de 19F 1:8 e GMTs de OPA de 19F antes e um mês a seguir do reforço de polissacarídeo simples
23-valente em crianças preparadas com 1 pg de 19F-PD, 3 pg de 19F-DT ou
Prevnar (2 pg de 19F-CRM) (Grupo total)
Grupo primário 1 lPn-PD&Di-002
Antes da vacina de reforço um mês após o reforço com PS 23-valente
N %> 1:8 (95% Cl) GMT (95% Cl) N %> 1:8 (95% Cl) GMT (95% Cl)
1 lPn-PD 29 27,6 (12,7-47,2) 10,9 (5,0-23,7) 28 82,1 (63,1-93,9) 408,0 (157,3-1058,3)
19F-DTForm lr 19 47,4 (24,4-71,1) 18,1 (7,2-45,7) 18 94,4 (72,7-99,9) 1063,8 (386,6-2927,5)
19F-DT Form 2r 27 33,3 (16,5-54,0) 8,5 (4,7-15,3) 28 100 (87,7-100) 957,6 (552,8-1659,0)
Prevnar 24 12,5 (2,7-32,4) 8,1 (3,4-19,6) 23 82,6 (61,2-95,0) 380,9 (133,2-1089,5)
*A composição das formulações diferentes é fornecida na Tabela 4.
Tabela 12 Porcentagem de pacientes com concentrações de anticorpo 0,2 pg/ml, OPA 1:8 e GMCs/GMTs contra 19F pneumococos um mês a seguir do reforço com llPn-PD ou Prevnar em crianças preparadas com 1 pg de 19FPD, 3 pg de 19F-DT ou Prevnar (2 pg de 19F-CRM) (Grupo total)
Grupo primário 1 lPn-PD&Di-002
Ensaio de 22F-ELISA Ensaio de OPA
N % > 0.20 pg/mL (95% Cl) GMC (pg/ml) (95% Cl) N %> 1:8 (95% Cl) GMT (95% Cl)
1 IPn-PD 70 100 (94,9-100) 4,52 (3,7-5,5) 21 100 (83,9-100) 255,6 (135,5-481,9)
19F-DT Forma lr 66 98,5 (91,8-100) 3,45 (2,8-4,3) 23 95,7 (78,1-99,9) 374,0 (192,6-726,2)
19F-DT Forma 2r 70 98,6 (92,3-100) 3,80 (2,9-4,9) 29 96,6 (82,2-99,9) 249,1 (144,7-428,7)
Prevnar 69 97,1 (89,9-99,6) 2,56 (2,0-3,3) 31 96,8 (83,3-99,9) 528,7 (319,4-875,2)
1 A composição das formulações diferentes é fornecida na Tabela 4.
Tabela 13 Porcentagem de pacientes com concentrações de anticorpo de 0,2 pg/ml, OPA 1:8 e GMCs/GMTs contra pneumococos 19A um mês a seguir da vacinação primária com 1 pg de 19F-PD, 3 pg de 19F-DT ou Prevnar (2 pg de 19F-CRM) (Grupo total)
Groupo 1 lPn-PD&Di-001
Ensaio de 22F-ELISA Ensaio de OPA
N %>0.20pg/mL (95% Cl) GMC (pg/mL) (95% Cl) N %> 1:8 (95% Cl) GMT (95% Cl)
1 IPn-PD 45 28.9 (16.4-44.3) 0.09 (0.07-0.11) 52 Ί.Ί (2.1-18.5) 5.2 (4.0-6.8)
19F-DT Forma 2r 51 29.4 (17.5-43.8) 0.11 (0.08-0.16) 59 27.1 (16.4-40.3) 12.4 (7.6-20.3)
Prevnar 55 18.2 (9.1-30.9) 0.10 (0.08-0.12) 61 3.3 (0.4-11.3) 4.6 (3.8-5.6)
1 A composição das formulações diferentes é fornecida na Tabela 4
Exemplo 5: Experimentos com adjuvante em modelos préclínicos: impacto na imunogenicidade de conjugados de polissacarídeo 11valente pneumocócico em macacos Rhesus idosos
Para otimizar a resposta eliciada para vacinas pneumocócicas conjugadas na população idosa, GSK formulou uma vacina conjugada de polissacarídeo (PS) 11-valente com um novo adjuvante, o Adjuvante C - ver abaixo.
Grupos de 5 macacos Rhesus idosos (14 a 28 anos de idade) foram imunizados intramuscularmente (IM) nos dias 0 e 28 com 500 μΐ de cada um dos conjugados de PS 11-valente absorvidos em 315 pg de AIPO4 ou conjugados de PS 11-valente misturados com Adjuvante C.
Em ambas as formulações de vacina, os conjugados de PS 11valente foram cada um compostos dos seguintes conjugados PS1-PD, PS3PD, PS4-PD, PS5-PD, PS7F-PD, PS9V-PD, PS 14- PD, PS18C-PD, PS19FPD, PS23F-DT e PS6B-DT. A vacina usada foi 1/5 da dose da dose humana da vacina (5 pg de cada sacarídeo por dose humana exceto para 6B [10 pg]) conjugado de acordo com as condições da Tabela 6 (Exemplo 4), exceto 19F foi feito de acordo com as seguintes condições de processo CDAP:sacarídeo dimensionado a 9mg/ml, PD a 5mg/ml, uma razão de PD/PS inicial de 1,2/1, uma concentração CDAP de 0,75mg/mg de PS, pHa=pHc=pHq 9,0/9,0/9,0 e um tempo de ligação de 60 min.
Os níveis de IgG de ELISA Anti-PS e os títulos de opsonofagocitose foram dosados em soros coletados no dia 42. As frequências de célula B de memória anti-PS3 foram medidas pelo Elispot a partir de células sanguíneas periféricas coletadas no dia 42.
De acordo com os resultados mostrados aqui abaixo, o Adjuvante C significantemente melhorou a imunogenicidade de conjugados de PS 11-valente versus conjugados com A1PO4 em macacos idosos. O novo adjuvante realçou as respostas de IgG para PS (Figura 1) e os títulos de anticorpo de opsono-fagocitose (Tabela 14). Houve também evidência sustentativa de que a frequência das células B de memória específicas de PS3 é aumentada pelo uso de Adjuvante C (Figura 2).
Tabela 14, Imunogenicidade de conjugado em macacos Rhesus idosos (títulos de opsono-fagocitose pós-III)
PSI PS3 PS4 PS5 PS6B PS7F PS9V PS14 PS18C PS19F PS23F
11-Valente A1PO4 Pré-imune <8 5 <8 5 <8 16 <8 <8 <8 <8 <8
dia 14 após Π 8 181 64 49 64 4096 42 37 169 64 <64
11 valente Adj-C Pré-imune 5 9 <8 5 8 37 <8 <8 <8 <8 <8
dia 14 após II 776 1351 891 676 6208 16384 111 161 7132 2048 <64
Elispot de Célula B
O princípio do ensaio conta com o fato de que as células B de memória maduras em células plasmáticas in vitro a seguir do cultivo com CpG por 5 dias. As células plasmáticas específicas de antígeno geradas in vitro podem ser facilmente detectados e portanto ser enumerados usando o ensaio de elispot de célula B. O número de células plasmáticas específicas refletem a frequência de células B de memória no início da cultura.
Em resumo, as células plasmáticas geradas in vitro são incubadas em placas de cultura revestidas com antígeno. As células plasmáticas específicas de antígeno formam manchas de anticorpo/ antígeno, que são detectadas pelo procedimento imunoenzimático convencional e enumeradas como células B de memória.
No presente estudo, os polissacarídeos foram usados para revestir placas de cultura de modo a enumerar as respectivas células B de memória. Os resultados são expressados como uma frequência de células B de memória específicas de PS dentro de um milhão de células B de memória.
Os estudos mostram que o Adjuvante C pode ser capaz de aliviar o problema conhecido de reforçabilidade de PS3 (ver 5a International Symposium on Pneumococci and Pneumococcal Diseases, 2 a 6 de abril de 2006, Alice Springs, Austrália Central.
As especificidades de respostas imunes contra um conjugado pneumocócico de sorotipo 3. Schuerman L, Prymula R, Poolman J. Abstract book p 245, PO10.06).
Exemplo 6: Eficácia de Pneumolisina destoxificada (dPly) como uma proteína carreadora para realçar a imunogenicidade de PS 19F em camundongos Balb/C jovens
Grupos de 40 camundongos Balb/C fêmeas (4 semanas de idade) foram imunizados IM nos dias 0, 14 e 28 com 50 μΐ de conjugado de PS simples 4-valente ou conjugado de PS dPly 4-valente, ambos misturados com Adjuvante C.
Ambas as formulações de vacina foram compostas de 0,1 pg (quantidade de sacarídeo) de cada um dos seguintes PS:PS8, PS12F, PS19F e PS22F.
Os níveis de IgG em ELISA Anti-PS foram dosados em soros coletados no dia 42.
A resposta anti-PS 19F, mostrada como um exemplo na Figura 3, foi fortemente realçada em camundongos administrados com conjugados de dPly 4-valente comparado com os camundongos imunizados com o PS simples. A mesma melhora foi observada para as respostas de IgG anti-PS8, 12F e 22F (dados não mostrados).
Exemplo 7: Eficácia de Proteína D da Tríade de Histidina Pneumocócica (PhtD) como uma proteína carreadora para realçar a imunogenicidade de PS 22F em camundongos Balb/C jovens
Grupos de 40 camundongos Balb/C fêmeas (4 semanas de idade) foram imunizados IM nos dias 0, 14 e 28 com 50 μΐ de PS simples 4valente ou PS conjugado a PhtD 4-valente, ambos misturados com Adjuvante C.
Ambas as formulações de vacina foram compostas de 0,1 pg (quantidade de sacarídeo) de cada um dos seguintes PS:PS8, PS12F, PS19F e
PS22F.
Os níveis de IgG em ELISA anti-PS foram dosados em soros coletados no dia 42.
A resposta anti-PS22F, mostrada como um exemplo na Figura 4, foi fortemente realçada em camundongos administrados com conjugados PhtD 4-valente e comparados com camundongos imunizados com o PS simples. A mesma melhora foi observada para as respostas de IgG anti-PS8, 12F e 19F (dados não mostrados).
Exemplo 8: Imunogenicidade em camundongos C57BI idoso de conjugados de PS 13-valente contendo 19A-dPly e 22F-PhtD
Grupos de 30 camundongos C57B1 velhos (> 69 semanas de idade) foram imunizados IM nos dias 0, 14 e 28 com 50 μΐ de conjugados de PS 11-valente ou conjugados de PS 13-valente, ambos misturados com Adjuvante C (ver abaixo).
A formulação de vacina 11-valente foi composta de 0,1 pg de sacarídeo de cada um dos seguintes conjugados:PSl-PD, PS3-PD, PS4-PD, PS5-PD, PS6B-PD, PS7F-PD, PS9VPD, PS14-PD, PS18C-TT, PS19F-DT e PS23F-PD (ver Tabela 1 e comentário sobre a vacina 11 valente debatido sob a Tabela 2). A formulação de vacina 13-valente conteve além de 0,1 pg de conjugados PS19A-dPly e PS22F-PhtD (ver Tabela 1 e comentário sobre a vacina 13 valente debatido sob a Tabela 2 [usando 22F diretamente conjugado]). Nos grupos 2 e 4 o carreador da pneumolisina foi destoxificado com tratamento de GMBS, nos grupos 3 e 5 isto foi feito com formaldeído (métodos descritos na WO04/81515). Nos grupos 2 e 3 PhtD foi usado para conjugar PS 22F, nos Grupos 4 e 5 uma fusão PhtD_E (a construção VP147 da W003/054007) foi usada. No Grupo 6 19A foi conjugado ao toxóide da difteria e 22F à proteína D.
Os níveis de IgG em ELISA Anti-PS19A e 22F foram avaliados em soros individuais coletados no dia 42 usando o seguinte procedimento. A resposta de IgG de ELISA gerada para o outro PS foi medida em soros reunidos.
Procedimentos sorológicos em Camundongo:
Os níveis de IgG em ELISA anti-PS 19A foram avaliados em soros coletados no dia 42 usando o procedimento aqui descrito abaixo:
As microplacas foram revestidas por 2 horas a 37°C com PS tipo 19A pneumocócico purificado (10 pg/ml) em tampão de PBS. As placas foram lavadas quatro vezes com NaCl 0,9%mM-Tween 20 0,05%. Os soros foram incubados por 1 hora a 37°C com 50 pg/ml de CPS (VA/) em PBS 0,05% de Tween 20. Os soros foram adicionados aos microreservatórios e diluídos em série (etapa de diluição de duas vezes) em PBSBSA 0,05% de Tween 0,05%. As placas foram incubadas sob agitação por 30 minutos na temperatura ambiente. As placas foram lavadas como acima e um conjugado de IgG anti-camundongo-peroxidase (diluído 1/2500) foi adicionado e as placas foram incubadas por 30 minutos na temperatura ambiente. Depois da lavagem, o substrato (4mg de OPDA em 10ml de citrato 0,1 M pH 4,5 e 5 μΐ de H2O2) foi adicionado a cada reservatório por 15 minutos. A reação foi interrompida pela adição de HC1 1 N. A absorbância foi lida de 490 a 620 nm usando um espectrofotômetro. A cor desenvolvida é diretamente proporcional à quantidade de anticorpo presente no soro.
O nível da IgG presente nas amostras de soros é determinada pela comparação com a curva de referência e expressada em pg/ml. Uma curva de referência foi gerada para cada resultado de placa de ELISA para a quantidade conhecida de soro adicionada.
Os níveis de IgG em ELISA anti-PS22F foram avaliados em soros coletados no dia 42 usando o procedimento descrito aqui abaixo:
As microplacas foram revestidas por 2 horas a 37°C com PS tipo 22F pneumocócico purificado (10 pg/ml) em tampão de PBS. As placas foram lavadas quatro vezes com NaCl 0,9%mM-Tween 20 0,05%. Os soros foram incubados por 1 hora a 37°C com 50 pg/ml de CPS (V/V) em PBS 0,05% de Tween 20. Os soros foram adicionados aos microreservatórios e diluídos em série (etapa de diluição de duas vezes) em PBSBSA 0,05% de Tween 0,05%. As placas foram incubadas sob agitação por 30 minutos na temperatura ambiente. As placas foram lavadas como acima e um conjugado de peroxidase de anticorpos de IgG anti-camundongo (diluído 1/2500) foi adicionado e as placas foram incubadas por 30 minutos na temperatura ambiente. Depois da lavagem, o substrato (4mg de OPDA em 10ml de citrato 0,1 M pH 4,5 e 5 μΐ de H2O2) foi adicionado a cada reservatório por 15 minutos. A reação foi interrompida pela adição de HC1 IN. A absorbância foi lida a de 490 a 620 nm usando um espectrofotômetro. A cor desenvolvida é diretamente proporcional à quantidade de anticorpo presente no soro.
O nível da IgG anti-PS22F presente nos soros desconhecidos é determinado pela comparação à curva de referência de soro adicionado em cada placa e expressada em pg/ml.
As respostas imunes direcionadas contra todos os outros sorotipos foram realizados de acordo com os mesmos procedimentos exceto que os soros de camundongos foram reunidos.
19A-dPly e 22F-PhtD administradas dentro da formulação de vacina conjugada 13-valente foram mostradas imunogênicas em camundongos C57BI velhos (Tabela 15). A resposta imune induzida contra outro PS não foi negativamente impactado em camundongos administrados com a formulação 13-valente comparados com aqueles imunizados com a formulação 11-valente.
Tabela 15. Imunogenicidade de PS em camundongos C57BI velhos (níveis de
IgG pós-III)
Camundongos negro C57 velhos
ELISA GRUPO 1 GRUPO 2 GRUPO 3 GRUPO 4 GRUPO 5 GRUPO 6
11V 0.1gg/50gl AdjC 11V 19A-dPly gmbs 22F-PhtD 0.1gg/50gl Adj C I1V 19A-dPly formol 22F-PhtD 0.1gg/50pl AdjC 11V 19A-dPly gmbs 22F-PhtD-E 0.1gg/50gl AdjC 11V 19A-dPly formol 22F-PhtD-E 0.1gg/50gl AdjC 11V 19A-DT 22F-PD 0.1μg/50μl AdjC
1 Reunião Média 19,30 20,20 24,40 12,80 12,10 13,60
3 Reunião Média 6,32 4,84 5,21 6,74 2,38 2,54
4 Reunião Média 60,9 67,1 51,4 47,4 45,5 41,1
5 Reunião Média 1,34 3,81 3,06 2,75 1,26 1,23
6B Reunião Média 4,41 4,12 5,88 1,58 2,31 5,64
7F Reunião Média 0,83 0,81 1,65 1,98 0,89 0,99
9V Reunião Média 13,8 23,7 20,0 13,1 15,5 9,6
14 Reunião Média 25,73 42,96 34,12 32,53 23,97 15,60
18C Reunião Média 13,4 20,1 11,9 9,1 8,3 8,4
19F Reunião Média 57,5 90,0 63,8 36,5 47,0 69,1
23F Reunião Média NR NR NR NR NR NR
19A GMC 0,06 0,09 0,25 0,08 0,23 0,19
IC 0,04-0,1 0,05-0,14 0,15-0,41 0,06-0,12 0,14-0,38 0,09-0,3
%sero 33% 47% 83% 53% 80% 73%
22F GMC IC NR 5,81 3,2-10,6 3,76 1,8-7,9 0,54 0,3-1,1 0,85 0,4-1,7 2,02 1,2-3,4
%sero 0% 97% 90% 77% 87% 97%
NR - nenhum resultado experimental determinado
Procedimento OPA em Camundongo:
As amostras de soro foram aquecidas por 45 min a 56°C para inativar qualquer complemento endógeno remanescente. Alíquotas de vinte e cinco microlitros de cada amostra de soro diluída 1:2 foram diluídas duas vezes em série em 25 μΐ de tampão OPA (HBSS-14,4% de FBS inativado) por reservatório de uma placa de microtítulo de fundo redondo de 96 reservatórios. Subsequentemente, 25 μΐ de uma mistura de células HL-60 ativado (1 x 107 células/ml), semente de trabalho pneumocócica recém descongelada e complemento de coelho bebê recém descongelado em uma razão por exemplo de 4/2/1 (v/v/v) foram adicionados aos soros diluídos para produzir um volume final de 50 μΐ. A placa de ensaio foi incubada por 2 h a 37°C com agitação orbital (210 rpm) para promover o processo fagocítico. A reação foi interrompida depositando-se a microplaca sobre gelo por pelo menos 1 min. Uma alíquota de 20 μΐ de cada reservatório da placa foi depois transferida no reservatório correspondente de uma microplaca de fundo chato de 96 reservatórios e 50 μΐ de Caldo de Todd-Hewitt - 0,9% de ágar foram adicionados a cada reservatório. Depois da incubação durante a noite a 37°C e 5% de CO2, as colônias pneumocócicas que aparecem no ágar foram contadas usando um sistema de análise de imagem automatizada (KS 400, Zeiss, Oberkochen, Alemanha). Oito reservatórios sem amostra de soro foram usados como controles bacterianos para determinar o número de pneumococos por reservatório. O número médio de CFU dos reservatórios de controle foi determinado e usado para o cálculo da atividade de morte para cada amostra de soro. O título de OPA para as amostras de soro foi determinado pela diluição recíproca de soro capaz de facilitar a morte de 50% dos pneumococos. O título opsonofagocítico foi calculado usando-se uma análise de ajuste de curva de 4 parâmetros.
Os resultados de ensaios de opsono-fagocitose são mostrados nas Figuras 13 e 14.
Exemplo 9: Imunogenicidade em camundongos Balb/C jovens de conjugados de PS 13-valente contendo 19A-dPly e 22F-PhtD
Grupos de 30 camundongos Balb/C jovens (4 semanas de idade) foram imunizados IM nos dias 0, 14 e 28 com 50 μΐ de conjugados de PS 11-valente ou conjugados de PS 13-valente, ambos misturados com Adjuvante C (ver abaixo).
A formulação de vacina 11-valente foi composta de 0,1 pg de sacarideo de cada um dos seguintes conjugados:PSl-PD, PS3-PD, PS4-PD, PS5-PD, PS6B-PD, PS7F-PD, PS9VPD, PS14-PD, PS18C-TT, PS19F-DT e PS23F-PD (ver Tabela 1 e comentários sobre vacina 11 valente debatida sob a Tabela 2). A formulação de vacina 13-valente conteve além de 0,1 pg de conjugados PS19A-dPly e PS22F-PhtD (ver a Tabela 1 e comentários sobre vacina 13 valente debatidos sob a Tabela 2 [usando 22F diretamente conjugado]). Nos grupos 2 e 4 o carreador de pneumolisina foi destoxificado com tratamento de GMBS, nos grupos 3 e 5 isto foi feito com formaldeído (métodos descritos na WO04/81515). Nos grupos 2 e 3 PhtD foi usado para conjugar PS 22F, nos grupos 4 e 5 uma fusão PhtD_E (a construção VP147 da W003/054007) foi usada. No grupo 6 19A foi conjugado ao toxóide da difteria e 22F à proteína D.
Os níveis de IgG de ELISA Anti-PS 19A e 22F foram dosados em soros individuais coletados no dia 42. A resposta de IgG em ELISA gerada para o outro PS foi medida em soros reunidos. 19A-dPly e 22F-PhtD administradas dentro da formulação de vacina conjugada com 13-valente foram mostradas imunogênicas em camundongos Balb/C jovens (Tabela 16). A resposta imune induzida contra outro PS não foi negativamente impactada em camundongos administrados com a formulação 13-valente comparados com aqueles imunizados com a formulação 11-valente.
ELISAa foram realizados como descrito no exemplo 8.
Tabela 16. Imunogenicidade de PS em camundongos Balb/C Jovens (níveis de IgG pós-III)
Camundongos negro C57 velhos
ELISA GRUPO 1 GRUPO 2 GRUPO 3 GRUPO 4 GRUPO 5 GRUPO 6
11V 0.1gg/50gl AdjC 11V 19A-dPly gmbs 22F-PhtD 0.1gg/50gl AdjC 11V 19A-dPly formol 22F-PhtD 0.1gg/50gl AdjC 11V 19A-dPly gmbs 22F-PhtD-E 0.1gg/50gl Adj C 11V 19A-dPly formol 22F-PhtD-E 0.1gg/50gl AdjC 11V 19A-DT 22F-PD 0.1gg/50gI AdjC
1 Reunião Média 131,70 101,20 83,00 82,40 67,90 85,50
3 Reunião Média 21,85 10,38 12,53 8,83 8,73 14,98
4 Reunião Média 147,4 127,0 104,4 95,0 113,6 114,2
5 Reunião Média 21,38 20,29 18,26 18,95 18,02 23,04
6B Reunião Média 1,97 4,76 3,72 2,35 1,43 1,05
7F Reunião Média 7,69 4,58 4,77 4,24 3,92 3,94
9V Reunião Média 30,1 30,7 26,5 21,4 23,4 28,3
14 Reunião Média 28,78 27,67 26,23 21,54 24,34 13,73
18C Reunião Média 53,4 52,37 46,5 57,8 47,8 75,8
19F Reunião Média 186,6 157,7 169,3 178,9 181,9 223,2
23F Reunião Média 4,98 3,9 5,11 0,57 3,13 4,57
19A GMC 0.4 32,8 25,1 21,6 18,9 23,5
IC 0,2-0,6 26,4-40,7 20,6-30,6 17,5-26,7 15,1-23,5 19,5-28,5
%sero 93% 100% 100% 100% 100% 100%
22F GMC IC NR 3,99 1,9-8,42 3,76 1,8-8 6,27 3,8-10,4 8,70 5,4-13,9 18,76 15,2-23,1
%sero 0% 93% 100% 100% 100% 100%
NR - nenhum resultado experimental determinado
Procedimento de OPA camundongo:
As amostras de soro foram aquecidas por 45 min a 56°C para inativar qualquer complemento endógeno remanescente. Alíquotas de vinte e cinco microlitros de cada amostra de soro diluída 1:2 foram diluídas duas vezes em série em 25 μΐ de tampão OPA (HBSS-14,4% de FBS inativado) por reservatório de uma placas de microtítulo de fundo redondo de 96 reservatórios. Subsequentemente, 25 μΐ de uma mistura de células HL-60 10 ativadas (1 x 10 células/ml), sementes de trabalho pneumocócicas recem descongeladas e complemento de bebê coelho recém descongelado em uma razão por exemplo de 4/2/1 (v/v/v) foram adicionados aos soros diluídos para produzir um volume final de 50 μΐ. A placa de ensaio foi incubada por 2 h a 37°C com agitação orbital (210 rpm) para promover o processo fagocítico. A reação foi interrompida pela deposição da microplaca em gelo por pelo menos 1 min. Uma alíquota de 20 μΐ de cada reservatório da placa foi depois transferida no reservatório correspondente de uma microplaca de fundo chato de 96 reservatórios e 50 μΐ de Caldo de Todd-Hewitt-0,9% de ágar foram adicionados a cada reservatório. Depois da incubação durante a noite a 37°C e 5% de CO2, as colônias pneumocócicas que aparecem no ágar foram contadas usando um sistema de análise de imagem automatizada (KS 400, Zeiss, Oberkochen, Alemanha). Oito reservatórios sem amostra de soro foram usados como controles bacterianos para determinar o número de pneumococos por reservatório. O número médio de CFU dos reservatórios de controle foi determinado e usado para o cálculo da atividade de morte para cada amostra de soro. O título de OPA para as amostras de soro foi determinada pela diluição recíproca de soro capaz de facilitar 50% de morte do pneumococo. O título opsonofagocítico foi calculado usando-se uma análise de ajuste de curva de 4 parâmetros.
Os resultados são mostrados nas Figuras 15 e 16.
Resultados em formulações de alúmen:
A imunogenicidade em camundongos Balb/C jovens de conjugados de PS 13-valentes contendo 19AdPly e 22F-PhtD
Grupos de 40 camundongos Balb/C jovens (4 semanas de idade) foram imunizados IM nos dias 0, 14 e 28 com 50 μΐ de conjugados de PS 11-valente ou conjugados de PS 13-valente, ambos absorvidos em A1PO4. Infanrix Hexa foi co-administrado.
A formulação de vacina 11-valente foi composta de 0,1 pg de sacarídeo de cada um dos seguintes conjugados:PSl-PD, PS3-PD, PS4-PD,
PS5-PD, PS6B-PD, PS7F-PD, PS9V-PD, PS14-PD, PS18C-TT, PS19F-DT e PS23F-PD (ver a Tabela 1 e comentários sobre a vacina 11 valente debatida sob a Tabela 2). A formulação de vacina 13-valente conteve além da adição de 0,1 pg de conjugados de PS19A-dPly e PS22F-PhtD (ver a Tabela 1 e os comentários sobre a vacina 13 valente debatidos sob a Tabela 2 [usando 22F diretamente conjugado]). Nos grupos 2 e 4 o carreador de pneumolisina foi destoxificados com tratamento de GMBS, nos grupos 3 e 5 isto foi feito com formaldeído. Nos grupos 2 e 3 PhtD foi usado para conjugar PS 22F, nos Grupos 4 e 5 uma fusão PhtD_E (a construção VP147 da W003/054007) foi usada. No grupo 6, 19A foi conjugado ao toxóide da difteria e 22F à proteína D.
Os níveis de IgG de ELISA Anti-PS 19A e 22F e títulos de opsono-fagocitose foram medidos em soros individuais coletados no dia 42. A resposta de IgG em ELISA gerada para o outro PS foi medida em soros reunidos.
19A-dPly e 22F-PhtD administradas dentro da formulação de vacina de conjugado 13-valente mostraram-se imunogênicas e induziram títulos opsono-fagocíticos em camundongos Balb/C jovens (Tabela 17 e figuras 19-20). A resposta imune induzida contra o outro PS não foi negativamente impactado em camundongos administrados com a formulação 13-valente comparados com aqueles imunizados com a formulação 11valente.
Os ensaios de opsonofagocitose foram usados para avaliar os soros e os resultados são mostrados nas Figuras 19 e 20.
Tabela 17. Imunogenicidade de PS em camundongos Balb/C jovens (níveis de IgG Pós-III)
Figure BRPI0813307B1_D0001
o
Ξ
E
E
O
Imunogenicidade em camundongos OF1 jovens de conjugados PS 13-valente contendo 19A-dPly e 22F-PhtD
Grupos de 40 camundongos OF1 jovens (4-semanas de idade) foram imunizados IM nos dias 0, 14 e 28 com 50 μΐ de conjugados de PS 11valente ou conjugados de PS 13-valente, ambos absorvidos em A1PO4. Infanrix Hexa foi co-administrada.
A formulação de vacina 11-valente foi composta de 0,1 pg de sacarídeo de cada um dos seguintes conjugados:PSl-PD, PS3-PD, PS4-PD, PS5PD, PS6B-PD, PS7F-PD, PS9VPD, PS14-PD, PS18C-TT, PS19F-DT e PS23FPD (ver a Tabela 1 e comentários sobre a vacina 11 valente debatidos sob a Tabela 2). A formulação de vacina 13-valente conteve além disso 0,1 pg de conjugados PS19A-dPly e PS22F-PhtD (ver a Tabela 1 e comentários sobre a vacina 13 valente debatidos sob a Tabela 2 [usando 22F diretamente conjugado]). Nos grupos 2 e 4 o carreador de pneumolisina foi destoxificado com tratamento de GMBS, nos grupos 3 e 5 isto foi feito com formaldeído (métodos descritos na WO04/81515). Nos grupos 2 e 3 PhtD foi usado para conjugar PS 22F, nos grupos 4 e 5 uma fusão PhtD_E (a construção VP147 da W003/054007) foi usada. No grupo 6,19A foi conjugado ao toxóide da difteria e 22F à proteína D.
Níveis de IgG anti-PS 19A e 22F e títulos de opsono-fagocitose foram medidos em soros individuais coletados no dia 42. A resposta de IgG em ELISA gerada para o outro PS foi medida em soros reunidos.
19A-dPly e 22F-PhtD administradas dentro da formulação de vacina de conjugado 13-valente foram mostradas imunogênicas e induziram títulos opsono-fagocíticos em camundongos OF1 jovens (Tabela 18 e figuras 21-22). A resposta imune induzida contra o outro PS não foi negativamente impactada em camundongos administrados com a formulação 13-valente comparados com aqueles imunizados com a formulação 11-valente.
Os soros também foram avaliados pelos ensaios de opsonofagocitose e os resultados são mostrados nas Figuras 21 e 22.
Tabela 18. Imunogenicidade de PS em camundongos OF1 jovens (níveis IgG Pós-III)
Figure BRPI0813307B1_D0002
Exemplo 10: Imunogenicidade em Porquinhos da índia de conjugados de PS 13-valente contendo 19A-dPly e 22F-PhtD
Os grupos de 20 Porquinhos da índia jovens (Cepa Hartley; 5 semanas de idade) foram imunizados IM nos dias 0, 14 e 28 com 125 μΐ de conjugados de PS 11-valente ou conjugados de PS 13-valente, ambos misturados com Adjuvante C (ver abaixo).
A formulação de vacina 11-valente foi composta de 0,25 pg de sacarídeo de cada um dos seguintes conjugados:PSl-PD, PS3-PD, PS4-PD, PS5-PD, PS6B-PD, PS7F-PD, PS9VPD, PS14-PD, PS18C-TT, PS19F-DT e PS23F-PD (ver a Tabela 1 e comentários sobre a vacina 11 valente debatidos sob a Tabela 2). A formulação de vacina 13-valente conteve além disso 0,1 pg de conjugados PS19A-dPly e PS22F-PhtD (ver a Tabela 1 e comentários sobre vacina 13 valente debatidos sob a Tabela 2 [usando 22F diretamente conjugado]). Nos grupos 2 e 4 o carreador de pneumolisina foi destoxificado com tratamento de GMBS, nos grupos 3 e 5 isto foi feito com formaldeído. Nos grupos 2 e 3 PhtD foi usado para conjugar PS 22F, nos grupos 4 e 5 uma fusão PhtD_E (a construção VP147 da W003/054007) foi usada. No grupo 6 19A foi conjugado ao toxóide da difteria e 22F à proteína D.
Os níveis de IgG em ELISA Anti-PS 19A e 22F foram avaliados em soros individuais coletados no dia 42 usando o seguinte protocolo. A resposta de IgG de ELISA gerada para o outro PS foi medida em soros reunidos.
Procedimentos de sorologia de Porquinho da índia:
Os níveis de IgG em ELISA anti-PS 19A foram avaliados em soros coletados no dia 42 usando o procedimento descrito aqui abaixo:
Microplacas foram revestidas por 2 horas a 37°C com PS tipo 19A pneumocócico purificado (10 pg/ml) em tampão de PBS. As placas foram lavadas quatro vezes com NaCl 0,9%mM-Tween 20 0,05%. Os soros foram incubados por 1 hora a 37°C com 50 μg/ml de CPS (V/V) em PBS
100
0,05% de Tween 20. Os soros foram adicionados aos micro-reservatórios e diluídos em série (etapa de diluição de duas vezes) em PBS-BSA 0,05% de Tween 0,05%. As placas foram incubadas sob agitação por 30 minutos na temperatura ambiente. As placas foram lavadas como acima e um conjugado de peroxidase IgG anti-porquinho da índia (diluído 1/1000) foi adicionado e as placas foram incubadas por 30 minutos na temperatura ambiente. Depois de lavar, o substrato (4mg de OPDA em lOml de citrato 0,1 M pH 4,5 e 5 μΐ de H2O2) foi adicionado a cada reservatório por 15 minutos. A reação foi interrompida pela adição de HC1 1 Ν. A absorbância foi lida de 490 a 620 nm usando um espectrofotômetro. A cor desenvolvida é diretamente proporcional à quantidade de anticorpo presente no soro.
O nível da IgG anti-PS 19A presente nos soros desconhecidos é determinado pela comparação com o soro da curva de referência adicionada em cada placa e expressada em pg/ml.
Os níveis de IgG em ELISA anti-PS22F foram dosados em soros coletados no dia 42 usando o procedimento descrito aqui abaixo:
Microplacas foram revestidas por 2 horas a 37°C com PS tipo 22F pneumocócico purificado (10 pg/ml) em tampão de PBS. As placas foram lavadas quatro vezes com NaCl 0,9%mM-Tween 20 0,05%. Os soros foram incubados 1 hora a 37°C com 50 pg/ml de CPS (V/V) em PBS 0,05% de Tween 20. Os soros foram adicionados aos micro-reservatórios e diluídos em série (etapa de diluição de duas vezes) em PBS-BSA 0,05% Tween 0,05%. As placas foram incubadas sob agitação por 30 minutos na temperatura ambiente. As placas foram lavadas como acima e um conjugado de peroxidase IgG anti-porquinho da índia (diluído 1/1000) foi adicionado e as placas foram incubadas por 30 minutos na temperatura ambiente. Depois da lavagem, o substrato (4mg de OPDA em 10ml de citrato 0,1 M de pH 4,5 e 5 pl de H2O2) foi adicionado a cada reservatório por 15 minutos. A reação foi interrompida pela adição de HC1 IN. A absorbância foi lida a 490-620 nm
101 usando um espectrofotômetro. A cor desenvolvida é diretamente proporcional à quantidade de anticorpo presente no soro.
O nível da IgG anti-PS22F presente nos soros desconhecidos é determinado pela comparação com a curva de referência do soro adicionado em cada placa e expressado em pg/ml.
As respostas imunes direcionadas contra todos os outros sorotipos foram realizadas de acordo com os mesmos procedimentos exceto que os soros de porquinhos da índia foram reunidos.
Tabela 19. Imunogenicidade de PS em Porquinhos da índia (níveis de IgG pós-IH)
Porquinhos da índia
ELISA GRUPO 1 GRUPO 2 GRUPO 3 GRUPO 4 GRUPO 5 GRUPO 6
11V 0,lpg/50pl Ad] C 11V 19A-dPly gmbs 22F-PhtD 0,lpg/50pl Adj C 11V 19A-dPly formol 22F-PhtD 0,lpg/50pl Adj C 11V 19A-dPly gmbs 22F-PhtD-E 0,lpg/50pl AdjC 11V 19A-dPly formol 22F-PhtD-E 0,lpg/50pl AdjC 11V 19A-DT 22F-PD 0,lpg/50pl Ad j C
1 Reunião média 78,00 77,21 76,15 68,77 68,59 81,04
3 Reunião média 7,75 9,31 12,73 7,94 4,75 9,59
4 Reunião média 130,7 94,4 132,6 166,8 85,0 101,3
5 Reunião média 109,10 117,10 110,70 158,40 74,10 100,40
6B Reunião média 3,14 4,26 14,4 7,63 6,3 7,52
7F Reunião média 154,2 216,0 240,0 181,0 142,0 179,1
9V Reunião média 90,69 105,45 98,20 93,45 54,12 73,05
14 Reunião média 71,19 77,18 46,53 59,67 38,47 53,69
18C Reunião média 109,4 122,3 137,1 79,9 73,7 83,1
19F Reunião média 73,9 102,5 112,2 75,5 62,3 72,1
23F Reunião média 19,19 30,74 29,44 31,52 19,13 24,94
19A GMC 0,4 25,58 41,49 14,25 27,49 6,74
IC 0,24-0,68 12-54,5 24,4-70,5 5,9-34,6 16,6-45,4 4-11,3
%sero 75% 100% 100% 100% 100% 100%
22F GMC 0,12 2,51 3,67 45,74 30,68 96,38
IC 0,09-0,16 0,94-6,73 1,59-8,42 29,3-71,4 17-53,3 73,5-126,4
%sero 10% 95% 95% 100% 100% 100%
102
Ensaios de opsonofagocitose também foram usados para testar os soros e os resultados são mostrados nas Figuras 17 e 18.
Exemplo 11 :Formulações que são feitas e testadas
a) As seguintes formulações são feitas (usando a vacina 13 valente da tabela 1 e sorotipo 3 da tabela 5 - ver comentários sobre a vacina 14 valente debatidos sob a Tabela 2 [usando 22F diretamente conjugado ou através de um ligador ADH]). Os sacarídeos são formulados com fosfato de alumínio e 3D-MPL como mostrado abaixo.
14V25 ugMPL Soma do teor de alumínio BAC -> FF Por Dose 14V 10 ue MPL Soma do teor de alumínio BAC -> FF Por Dose
PS carreador SMFS pg MPL razão PS/AI 1/x PgAI PS carreador 1MFS pg MPL razão PS/AI 1/x PgAI
PD 1 10 10 1 PD 1 10 10
3 PD 1 10 10 3 PD 1 10 10
4 PD 3 10 30 4 PD 3 10 30
5 PD 1 10 10 5 PD 1 10 10
6A PD 1 10 10 6A PD 1 10 10
6'B PD 1 10 10 615 PD 1 10 10
7F PD I 10 10 7F PD 1 10 10
9V PD 1 10 10 9V PD 1 10 10
14 PD 1 10 10 14 PD 1 10 10
1W ΤΤλη 3 15 45 1W TTah 3 15 45
19A dPly 3 10 30 19A dPly 3 10 30
193 DT 3 10 30 19F DT 3 10 30
22F PhtD 3 10 30 223 PhtD 3 10 30
23F PD 1 10 10 23F PD 1 10 10
BAC MPL 50/200 25 4 100 BAC MPL 50/200 10 4 40
Teor de alumínio FF SomA = 355 Teor de alumínio FF Soma = 295
b) A mesma formulação de sacarideo é adjuvantada com cada um dos seguindo adjuvantes:
- Na tabela aqui abaixo a concentração dos componentes de emulsão por dose de 500 μΐ é mostrada.
Adjuvante Al Adjuvante A2 Adjuvante A3
Ingredientes 250 μΐ óleo em água 125 μΐ óleo em água 50 μΐ óleo em água
emulsão emulsão emulsão
alfa ll,88mg 5,94mg 2,3 8mg
Tocoferol
Esqualeno 10,7mg 5,35mg 2,14mg
Tween 80 4,85mg 2,43 mg 0,97mg
Adjuvante A4 Adjuvante A5 Adjuvante A6 Adjuvante A7
Ingredientes 250 μΐ óleo em água 250 μΐ óleo em água 1250 μΐ óleo em 50μ1 óleo em água água
emulsão emulsão emulsão emulsão
alfa ll,88mg ll,88mg 5,94mg 2,3 8mg
Tocoferol Esqualeno 10,7mg 10,7mg 5,35mg 2,14mg
Tween 80 4,85mg 4,85mg 2,43mg 0,97mg
3D-MPL 50μg 25 μg 25 μg 10 pg
103
c) Os sacarídeos também são formulados com dois adjuvantes com base me lipossoma:
Composição de Adjuvante Bl
Qualitativo Quantitativo (por dose de 0,5ml)
Lipossomas:
- DOPC Img
- colesterol 0,25mg
3DMPL 5Ogg
QS21 50gg
KH2PO4 i 3,124mg
Tampão de Na2HPO4 i 0,290mg
Tampão de NaCl 2,922mg (lOOmM)
WFI q.s. ad 0,5ml de Solvente pH 6,1
1. concentração de PO4 Total = 50mM
Composição de Adjuvante B2
Qualitativo Quantitativo (por dose de 0,5ml)
Lipossomas:
- DOPC 0,5mg
- colesterol 0,125mg
3DMPL 25gg
QS21 25 gg
KH2PO4 i 3,124mg
Tampão de Na2HPO4 i 0,290mg
Tampão de NaCl 2,922mg (lOOmM)
WFI q.s. ad 0,5ml de Solvente pH 6,1
104
d) Os sacarídeos também são formulados com Adjuvante C (ver acima para outras composições onde este adjuvante foi usado):
Qualitativo Quantitativo (por dose de 0,5ml)
Emulsão de óleo em água: 50 μΐ
- esqualeno 2,136mg
- α-tocoferol 2,372mg
- Tween 80 0,97mg
- colesterol 0,1 mg
3DMPL 50pg
QS21 50pg
KH2PO4 i 0,470mg
Tampão de Na2HPO4 i 0,219mg
Tampão de NaCl 4,003mg (137mM)
KC10,101mg (2,7mM)
WFI q.s. ad 0,5ml de Solvente pH 6,8
Exemplo 12: Impacto da conjugação química sobre a imunogenicidade de conjugado 22F-PhtD em camundongos Balb/C
Grupos de 30 camundongos Balb/C fêmeas foram imunizados pela via intramuscular (IM) nos dias 0, 14 e 28 com formulações de PS 13valente contendo PS 1, 3, 4, 5, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19A, 19F, 22F e 23F (dose:0,3pg de sacarídeo / conjugado para PS 4, 18C, 19A, 19F e 22F e 0,1 gg de sacarídeo / conjugado para os outros PS).
O PS 18C foi conjugado ao Toxóide do Tétano, 19F ao Toxóide da
Difteria, 19A ao Ply destoxificado com formol, 22F à PhtD e os outros PS à PD.
Duas formulações, constituídas de 22F-PhtD preparado pela química direta de CDAP ou 22F-AH-PhtD (PS derivado por ADH), foram comparados. Ver o Exemplo 2, Tabela 1 e comentários sob a Tabela 2 quanto
105 as características da vacina 13 valente feita com 22F diretamente conjugado ou por intermédio de um espaçador de ADH. As formulações de vacina foram suplementadas com adjuvante C.
Os níveis de IgG de ELISA Anti-PS22F e os títulos de opsonofagocitose foram medidos em soros coletados no dia 42.
22F-AH-PhtD mostrou-se muito mais imunogênico do que 22F-PhtD em termos tanto dos níveis de IgG (figura 5) quanto dos títulos opsono-fagocíticos (figura 6).
Exemplo 13: impacto de novos adjuvantes sobre a imunogenicidade de conjugados de PS em cápsula de Streptoccoccus pneumoniae
Grupos de 40 camundongos C57B1 jovens foram imunizados pela via IM nos dias 0, 14 e 28 com formulações de PS 13-valente contendo PS 1, 3, 4, 5, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19A, 19F, 22F e 23F (dose:0,3pg / conjugado para PS 4, 18C, 19A, 19F e 22F e 0,1 pg / conjugado para os outros PS).
PS 18C foi conjugado ao Toxóide do Tétano, 19F ao Toxóide da Difteria, 19A à Ply destoxificada com formol, 22F à PhtD e os outros PS à PD. Ver o Exemplo 2, Tabela 1 e comentários sob a Tabela 2 quanto as características de vacina 13 valente feita com 22F diretamente conjugado.
Quatro formulações, suplementadas com AIPO4, adjuvante Al, adjuvante A4 ou adjuvante A5, foram comparadas.
Os níveis de IgG em ELISA Anti-PS, Ply, PhtD e PD foram medidos nos soros coletados no dia 42 e reunidos por grupo. A seguinte razão foi calculada para cada antígeno:Nível de IgG induzido com o novo adjuvante testado / nível de IgG induzido com AIPO4.
Todos os novos adjuvantes testados melhoraram pelo menos 2 vezes as respostas imunes aos conjugados de sorotipo 1, 3, 4, 5, 6B, 7F, 9V, 14, 18C, 19A, 19F e 22F comparados com a formulação com AIPO4 clássica (figura 7). Nenhuma resposta confiável foi obtida para sorotipo 23F neste experimento.
Exemplo 14: Eficácia protetora de um combo PhtD/Ply
106 destoxificada em um modelo de pneumonia de macaco pneumocócico
Grupos de 6 macacos Rhesus (3 a 8 anos de idade), selecionados como aqueles tendo os níveis de anticorpo anti-19F préexistentes mais baixos, foram imunizados intramuscularmente nos dias 0 e 28 com conjugados de PS 11-valente (isto é, Ipg de PS 1, 3, 5, 6B, 7F, 9V, 14 e 23F e 3pg de PS 4, 18C e 19F [de sacarídeo]) ou PhtD (10pg) + Ply destoxificado em formol (10pg) ou proteína de fusão PhtD/E (10 pg) e Ply destoxificado em formol (10 pg) ou o adjuvante sozinhos.
PS 18C foi conjugado ao Toxóide do Tétano, 19F ao Toxóide da Difteria e os outros PS à PD. Ver o Exemplo 2, Tabela 1 e comentários sob a Tabela 2 quanto as características de vacinai 1 valente. Todas as formulações foram suplementadas com adjuvante C.
Q
Pneumococos Tipo 19F (5,10 cfu) foram inoculados no pulmão direito no dia 42. As colônias foram contadas nas lavagens broncoalveolares coletadas nos dias 1, 3 e 7 após a inoculação. Os resultados foram expressados como o número de animais por grupo mortos, colonizados no pulmão ou reabilitado no dia 7 depois da inoculação.
Como mostrado na figura 8, uma boa proteção próxima à significância estatística (a despeito do número baixo de animais usados) foi obtido com conjugados 11-valentes e o combo PhtD + dPly (p < 0,12, teste Exato de Fisher) comparado com o grupo do adjuvante sozinho.
Exemplo 15: Impacto da conjugação química sobre as respostas de anticorpo anti-PhtD e a eficácia protetora contra uma inoculação tipo 4 induzida pelos conjugados 22F-PhtD
Grupos de 20 camundongos OF1 fêmeas foram imunizados pela via intramuscular nos dias 0 e 14 com 3pg de 22F-PhtD (preparados pela química direta de CDAP) ou 22F-AH-PhtD (PS derivado de ADH) ou o adjuvante sozinho. Ambos os conjugados 22F monovalentes foram fabricados pelos processos do Exemplo 2 (ver também a Tabela 1 e Tabela 2). Cada
107 formulação foi suplementada com adjuvante C.
Os níveis de IgG em ELISA Anti-PhtD foram medidos em soros coletados no dia 28.
Os camundongos foram inoculados intranasalmente com 5.106 cfu de pneumococos tipo 4 no dia 29 (isto é, um sorotipo pneumocócico não potencialmente abrangido pelos PS presentes na formulação de vacina testada). A mortalidade induzida foi monitorada até o dia 10 após a inoculação.
Os resultados mostrados na figura 9 demonstram que 22F-AHPhtD induziu uma resposta de IgG anti-PhtD significantemente mais alta comparada a 22F-PhtD. Isto foi refletida em melhor proteção contra a inoculação tipo 4 comparada com 22F-PhtD como mostrado na Figura 10.
Exemplo 16: Benefício de Combinar Polissacarídeo e Proteína na Geração de uma resposta imuno protetora.
A sinergia potencial entre as respostas imunes direcionadas contra PhtD e polissacarídeos capsulares foi avaliada no modelo de inoculação de S'. pneumoniae letal em camundongo. Os camundongos foram intramuscularmente imunizados três vezes (D0, 14 e 28) com PhtD. Uma hora antes da inoculação bacteriana, anticorpos anti-polissacarídeos foram passivamente transferidos para os camundongos (IP, 200 μΐ). A letalidade induzida pela S. pneumoniae foi seguida até 8 ou 11 dias depois da inoculação. A sinergia de proteção é apresentada aqui para duas cepas de S. pneumoniae (sorotipo 3 e sorotipo 1).
Modelo de inoculação da cepa 3/43 de S. pneumoniae'.
Neste experimento, camundongos OF1 foram imunizados com PhtD absorvidos em A1PO4 e l,25pg de anticorpos anti-PS3 de porquinho da índia foram passivamente transferidos 1 hora antes da inoculação com S. pneumoniae sorotipo 3 (Spn 3/43).
Os resultados são mostrados na Figura 11. 70% de letalidade foi observada nos camundongos que receberam apenas PBS. Uma proteção
108 moderada foi observada no grupo de camundongos que receberam anticorpos anti-PS3 ou camundongos imunizados com PhtD. Uma sinergia, levando a uma proteção quase completa, foi obtida nos camundongos que combinaram imunização ativa e passiva contra PhtD e PS3, respectivamente.
Modelo de inoculação de sorotipo 1/57 de S. pneumoniae:
Neste experimento, camundongos OF1 foram imunizados com PhtD adjuvantado com um adjuvante ΊΉ1 e anticorpos anti-PS 1 de porquinho da índia foram passivamente transferidos uma hora antes da inoculação com S. pneumoniae sorotipo 1 (Spn 1/57).
Os resultados são mostrados na Figura 12. Uma alta letalidade foi observada no grupo de controle em que os camundongos receberam adjuvante TH1 (imunização ativa) e apenas PBS (imunização passiva). Uma proteção moderada foi observada no grupo de camundongos que receberam anticorpos anti-PS 1 (55% de sobrevivência) ou camundongos imunizados com PhtD (25% de sobrevivência). Uma sinergia, levando a uma proteção quase completa, foi obtida em camundongos que combinaram imunização ativa e passiva contra PhtD e PS1, respectivamente.
Estes dados sustentam o efeito sinergístico das respostas imunes direcionadas contra uma proteína pneumocócica (isto é, PhtD) e polissacarídeos capsulares no mecanismo de proteção contra a infecção pela S. pneumoniae.
Exemplo 17 Impacto de conjugados PS-TT e PS-DT pneumocócicos sobre a resposta imune direcionada contra os conjugados PSPD pneumocócícos remanescentes em uma formulação 11-valente.
Uma formulação de contendo 11 conjugados de PS-PD foi comparada a uma formulação contendo 7 conjugados PS-PD, 2 PS-TT (PS 6B e 23F) e 2 PS-DT (PS 18C e 19F) tanto em modelos de imunogenicidade de camundongo quanto de porquinho da índia.
Os camundongos foram intramuscularmente imunizados três
109 vezes com 1/10 de uma dose humana das vacinas (0,1 pg de PS). As amostras de sangue foram coletadas no dia 42 e a resposta imune direcionada contra cada polissacarídeo foi medida pelo ELISA.
Porquinhos da índia foram intramuscularmente imunizados três vezes com 1/4 de uma dose humana das vacinas (0,25 pg de PS). Infanrix Hexa foi co-administrada de modo a imitar a situação humana. As amostras de sangue foram coletadas no dia 42 e a resposta imune direcionada contra cada polissacarídeo foi medida pelo ELISA.
Experimento N° SPN115 (pims 20040304) Experimento N° SPN116 (pims 20040308) Porquinho da índia
Camundongo
ELISA ELISA
Todos em PD ipg 69.TTAH Ipg 23F-TTAH ipg 18C-OTAN ipg 19F-DT lpg 1/4-PD lpg outros em PD ípg Todos em PD ipg 613-17AHlpg 23F-TTAH Ipg 18C-OTAN lflg 19F-DT Ipg 1/4-PD Ipg outros em PD ipg
1 GMC 95% Cl %seropos 6,148 4,54-8,33 100% 19,961* 14,73-27,05 100% 1 GMC 95% Cl %seropos 8244 4,745 -14324 100% 33479* 21,507 ,52,114 100%
3 GMC 95% Cl %seropos 1,763 1,223 - 2,542 100% 2,483 1,693 - 3,643 100% 3 GMC 95% Cl %seropos 2,348 1,42 - 3,89 100% 1,619 0,84-3,13 100%
4 GMC 95% Cl % seropos 3,643 2,498-5,311 100% 11,849* 8,909 - 15,759 100% 4 GMC 95% a %seropos 9,211 5,535- 15,238 100% 19,033 10,816-33,494 100%
5 GMC 95% Cl %seropos 2,291 1,575 - 3,332 100% 5,154* 3,829 - 6,939 100% 5 GMC 95% C/ %seropos 14,04 9,967 -19,776 100% 14,791 10,227-21,392 100%
6B GMC 95% Cl %seropos 0,048 0,031 -0,075 44% 0,537* 0,342-0,843 100% 6B GMC 95% Cl %seropos 0491 0,292 - 0,825 100% 1,667 0,746-3,726 100%
7F GMC 95% Cl %seropos 0,297 0,22-0,41 100% 0,774 0,48-1,25 100% 7F GMC 95% Cl %soropos 10,467 5,979- 18,324 100% 37,49* 21,944 - 64,051 100%
9V GMC 95% Cl % seropos 2,098 1,575-2,793 100% 8,098* 6,507-10,078 100% 9V GMC 95% Cl %seropos 5,459 3,106 - 9,589 100% 10,309 6,183-17,187 100%
14 GMC 95% Cl %seropos 4,983 3,742-6,634 100% 9,327* 7,669-11,344 100% 14 GMC 95% Cl %seropos 1,235 0,686-2,224 100% 4,358* 2,073-9,161 100%
18C GMC 95% Cl % seropos 0,469 0,32-0,69 100% 3,274* 2,67-4,01 100% 19F GMC 95% Cl %seropos 7,769 5,617-10,745 100% 15,933* 12,036-21,092 100%
19F GMC 95% Cl %soropos 3,052 2,14-4.35 100% 21,274* 16,54-27,37 100% 18C « c 95% Cl %seropos 2,373 1,297-4,341 100% 8,744* 5,128-14,908 100%
23F GMC 95% Cl %seropos 0,072 0,044 - 0,117 38% 1,209 9457 - 3,2 71% 23F GMC 95% Cl %soropos 5,621 3289 - 9,608 100% 33,791* 20,838 - 54,797 100%
Uma resposta imune aumentada direcionada contra a maioria
110 dos polissacarídeos conjugados ao PD foi observada tanto em camundongos quanto em porquinhos da índia na formulação contendo dois polissacarídeos conjugados à TT (PS 6B e 23F) e DT (PS 18C e 19F) quando comparada com a formulação 11-V PD. Estas diferenças foram estatisticamente significantes 5 contra PS 1, 4, 5, 9V e 14 assim como contra PS 1, 7F e 14 em camundongos e porquinhos da índia, respectivamente.

Claims (15)

1. Composição imunogênica, caracterizada pelo fato de que compreende pelo menos 12 conjugados de sacarídeo capsular de S. pneumoniae incluindo conjugados de sacarídeo capsular dos sorotipos 19A e 19F em que 19A é conjugado a um primeiro toxóide bacteriano e 19F é conjugado a um segundo toxóide bacteriano e os sacarídeos capsulares 2-8 de S. pneumoniae são conjugados à proteína D de Haemophilus influenzae.
2. Composição imunogênica de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o primeiro toxóide bacteriano é uma proteína diferente da segunda toxina bacteriana.
3. Composição imunogênica de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizada pelo fato de que o primeiro toxóide bacteriano é selecionado do grupo que consiste de toxóide do tétano, toxóide da difteria, CRM197, toxóide da coqueluche, uma citolisina e pneumolisina bacterianas.
4. Composição imunogênica de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 3, caracterizada pelo fato de que o segundo toxóide bacteriano é selecionado do grupo que consiste de toxóide do tétano, toxóide da difteria, CRM197, toxóide da coqueluche, uma citolisina e pneumolisina bacterianas.
5. Composição imunogênica de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 4, caracterizada pelo fato de que compreende conjugados de sacarídeo capsular sorotipos 4, 6B, 9V, 14, 18C e 23F de S. pneumoniae.
6. Composição imunogênica de acordo com as reivindicações de 1 a 5, caracterizada pelo fato de que compreende conjugados de sacarídeo capsular sorotipos 1, 5 e 7F de S. pneumoniae.
7. Composição imunogênica de acordo com as reivindicações de 1 a 6, caracterizada pelo fato de que compreende um conjugado sacarídeo capsular sorotipo 22F de S. pneumoniae.
Petição 870190117122, de 13/11/2019, pág. 6/10
8. Composição imunogênica de acordo com as reivindicações de 1 a 7, caracterizada pelo fato de que compreende um conjugado 3 de sacarídeo capsular de S. pneumoniae.
9. Composição imunogênica de acordo com as reivindicações de 1 a 8, caracterizada pelo fato de que compreende um conjugado 6A de sacarídeo capsular de S. pneumoniae.
10. Composição imunogênica de acordo com qualquer uma das reivindicações de 1 a 9, caracterizada pelo fato de que 4 proteínas carreadoras diferentes são separadamente conjugadas a pelo menos 4 sorotipos de sacarídeo capsular de S. pneumoniae diferentes.
11. Composição imunogênica de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizada pelo fato de que compreende uma ou mais proteínas de S. pneumoniae não conjugadas.
12. Composição imunogênica de acordo com a reivindicação
11, caracterizada pelo fato de que a dita uma ou mais proteínas de S. pneumoniae são selecionadas da família da Tríade de Poli Histidina (PhtX), família da Proteína de Ligação de Colina (CbpX), truncados de CbpX, família de LytX, truncados de LytX, proteínas quiméricas de truncado de CbpXtruncado de LytX, pneumolisina (Ply) destoxificada, PspA, PsaA, Sp128, Sp101, Sp130, Sp125 e Sp133.
13. Composição imunogênica de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12, caracterizada pelo fato de que compreende pneumolisina como proteína livre ou carreadora.
14. Composição imunogênica de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 13, caracterizada pelo fato de que compreende uma proteína PhtX como proteína livre ou carreadora.
15. Composição imunogênica de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 14, caracterizada pelo fato de que compreende ainda um adjuvante.
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