BRPI0907100A2 - Célula vegetal, planta ou parte da planta, semente transgênica e método para controlar lepidoptera - Google Patents

Abstract

métodos para obtenção de uma célula vegetal, para obtenção de uma planta ou parte de planta e para controlar lepidoptera. são fornecidos métodos e composições os quais empregam um elemento de silenciamento que, quando ingerido por uma praga, como uma praga da ordem lepidoptera, são capazes de diminuir a expressão de uma sequência alvo na praga. em concretizações específicas, a diminuição na expressão da sequência alvo controla a praga e, assim, os métodos e composições são capazes de limitar os danos a uma planta. a presente invenção proporciona polinucleotídeos alvo codificando polipeptídeos de famílias de proteínas específicas e vários polinucleotídeos alvo estabelecidos nas seq id nos: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48 , 49 ou 50 ou variantes e fragmentos das mesmas, onde uma diminuição na expressão de uma ou mais sequências na praga-alvo controla a praga (ou seja, tem atividade inseticida). ainda são fornecidos elementos de silenciamento que, quando ingeridos pela praga diminuem o nível do polipeptídeo alvo e, assim, controlam a praga. na concretização específica, a praga é spodoptera frugiperda. também são fornecidas plantas, parte das plantas, bactérias e outras células hospedeiras compreendendo os elementos de silenciamento ou uma variante ativa ou fragmento do mesmo, da invenção.

Description

1/139 — MÉTODOS PARA OBTENÇÃO DE UMA CÉLULA VEGETAL, PARA OBTENÇÃO DE

UMA PLANTA OU PARTE DE PLANTA E PARA CONTROLAR LEPIDOPTERA

CAMPO DA INVENÇÃO A presente invenção refere-se geralmente aos métodos de biologia molecular e silenciamento de genes para controle de pragas.

FUNDAMENTOS DA INVENÇÃO Insetos pragas são um problema sério na agricultura. Eles destroem milhões de hectares de culturas alimentares como milho, soja, ervilha e algodão. Anualmente, essas pragas causam mais de 100 bilhões de dólares em danos às culturas somente nos Estados Unidos. Numa batalha sazonal contínua, os agricultores devem aplicar bilhões de litros de pesticidas sintéticos para combater essas pragas. Outros métodos utilizados no passado distribuíam atividade inseticida por microrganismos ou genes derivados de microrganismos presentes em plantas transgênicas. Por exemplo, certas espécies de microrganismos do gênero Bacillus são conhecidas por possuírem atividade pesticida contra uma ampla gama de insetos pragas incluindo Lepidoptera, Diptera, Coleoptera, Hemiptera, entre outros. Na verdade, pesticidas microbianos, particularmente aqueles obtidos a partir de cepas de Bacillus, têm desempenhado um importante papel na agricultura como alternativa ao controle químico de pragas. Cientistas agrícolas têm desenvolvido plantas cultivadas com resistência melhorada a insetos pela engenharia genética de plantas cultivadas para a produção de proteínas inseticidas de Bacillus. Por exemplo, plantas de milho e algodão geneticamente modificadas para produzir toxinas Cry (ver, por exemplo, Aronson (2002) Cell Mol. Life Sci. 59(3):

417-425; Schnepf et al. (1998) Microbiol. Mol. Biol. Rev. 62 (3): 775-806) são hoje amplamente utilizadas na agricultura americana e tem provido o agricultor com uma alternativa aos métodos tradicionais de controle de insetos. No entanto, estas proteínas inseticidas Bt apenas protegem as plantas de uma variedade relativamente limitada de pragas. Além disso, essas concretizações de atividade inseticida fornecem diferentes níveis de especificidade e, em alquns casos, causam significativo impacto ambiental. Assim, há uma necessidade oe 10 imediata de métodos alternativos para o controle de pragas.

BREVE RESUMO DA INVENÇÃO Métodos e composições são fornecidos que empregam um elemento de silenciamento que, quando ingerido por uma praga, tal como uma praga da ordem Lepidoptera, é capaz de diminuir a expressão de uma sequência alvo na praga. Em concretizações específicas, a diminuição na expressão da sequência alvo controla a praga e, assim, os métodos e as composições são capazes de limitar os danos de uma planta. A presente invenção proporciona polinucleotídeos alvo codificando diferentes o polipeptídeos de famílias específicas divulgadas aqui e em vários outros polinucleotídeos alvo estabelecidos nas SEQ ID NOS: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 ou 50 ou variantes ativas ou fragmentos dos mesmos, em que uma diminuição na expressão de uma ou mais sequências nas pragas- alvo controla a praga (ou seja, tem atividade inseticida). Além disso, são fornecidos elementos de silenciamento, que quando ingeridos pela praga, diminuem o nível de expressão de um ou mais polinucleotídeos-alvo. Em concretizações específicas, o

RSRSRS aa isa AN AA AAA NA Nasa dada 3/139 — elemento de silenciamento compreende pelo menos 15, 20 ou 22 nucleotídeos consecutivos de qualquer uma das SEQ ID NO:1-50. Em concretizações específicas, a praga que é controlada é Spodoptera frugiperda. São também fornecidas plantas, partes de plantas, células de plantas, bactérias e outras células hospedeiras compreendendo os elementos de silenciamento ou uma variante ativa ou fragmento dos mesmos.

Em algumas concretizações, são providos métodos para obtenção de uma célula vegetal compreendendo transformar uma célula vegetal com um polinucleotídeo da invenção e cultivar a referida célula vegetal sob condições de crescimento de célula vegetal. Métodos de obtenção de plantas ou partes de plantas compreendem O método acima e, adicionalmente, a etapa de regenerar uma planta ou parte de planta.

Em outra concretização, é fornecido um método para controlar uma praga, como uma praga da ordem Lepidoptera. O método inclui a alimentação de uma praga com uma composição que inclui um elemento de silenciamento, no qual o elemento de silenciamento, quando ingerido pela praga, reduz o nível de uma sequência alvo na praga e, assim, controla a praga. São fornecidos métodos adicionais para proteger uma planta de uma praga. Esses métodos compreendem a introdução, na planta ou parte da planta, de um elemento de silenciamento da invenção. Quando a planta expressando o elemento de silenciamento é ingerida pela praga, o nível da sequência alvo é diminuído e as pragas são controladas.

DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO A presente invenção agora será descrita mais detalhadamente a seguir, com referência aos desenhos que a acompanham, em que algumas, mas não todas as concretizações da invenção são mostradas. Na verdade, essas invenções podem ser incorporadas em muitas formas diferentes e não devem ser interpretadas como limitadas às concretizações aqui enunciadas, mas sim, estas concretizações são fornecidas para que essa divulgação satisfaça os requisitos legais aplicáveis. Números são referidos como elementos-chave.

Muitas alterações e outras concretizações das invenções aqui estabelecidas virão à mente de um técnico no assunto para que essas invenções "pertençam tendo o beneficio dos ensinamentos apresentados nas descrições anteriores e nos desenhos associados.

Portanto, é preciso entender que as invenções não estão limitadas às concretizações específicas divulgadas e que modificações e outras concretizações estão destinadas a serem incluídas no âmbito das reivindicações anexadas.

Apesar de termos específicos serem utilizados aqui, o 10 são usados em um sentido genérico, descritivo e não apenas para efeitos de limitação.

IT.

Resumo ! Métodos e composições são fornecidos para empregar um elemento de silenciamento que, quando ingerido por uma praga, | como uma praga da ordem Lepidoptera, é capaz de diminuir a | expressão de uma sequência alvo na praga.

Em concretizações específicas, a diminuição na expressão da sequência alvo controla a praga e, assim, os métodos e as composições são capazes de limitar os danos de uma planta ou parte da planta.

A À presente invenção "proporciona polinucleotídeos alvo que codificam polipeptídeos de uma variedade de classes de | proteínas incluindo, por exemplo, um polipeptídeo do hormônio juvenil, um polipeptídeo vacuolar, um polipeptídeo caderina, um polipeptídeo de cutícula, um fator de iniciação de tradução, um polipeptídeo SARI1, um fator de alongamento, um fosfooligosacarídeo, um polipeptídeo miosina, um transportador de aminoácido do canal de potássio, um polipeptídeo purificador de potássio internamente, um transportador de aminoácidos, um polipeptídeo tubulina, um polipeptídeo ubiquitina, e uma pequena ribonucleoproteína nuclear.

Em outras concretizações os polinucleotídeos alvo são os estabelecidos nas SEQ ID NOS: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 ou 50 Ou variantes ativas e fragmentos dos mesmos. Elementos de silenciamento concebidos tendo em conta estes polinucleotídeos alvo são fornecidos que, quando ingeridos pela praga, diminuem a expressão de uma nu mais sequências alvo e, assim, controlam as pragas (ou seja, tem atividade inseticida). Veja, por o 10 exemplo, SEQ ID NOS: 51-465.

Como usado aqui, por “controlar uma praga” ou “controle de uma praga” entende-se qualquer efeito sobre uma praga que resulta em limitar os danos que às pragas causam. Controlar uma praga inclui, mas não está limitado a, matar a praga, inibir o desenvolvimento da praga, alterar a fertilidade ou o crescimento da praga de tal forma que à praga proporcione menos danos à planta, diminuindo o número de descendentes produzidos, produzindo pragas menos aptas, produzindo pragas mais suscetíveis ao ataque de predadores, ou inibindo as pragas de comer a planta.

o Por "resistência à doença” entende-se que as plantas | evitam os sintomas da doença que são o resultado de interações patógeno-planta. Ou seja, patógenos são impedidos de causar doenças nas plantas e os sintomas associados às doenças, ou, alternativamente, os sintomas da doença causada pelo patógeno são minimizados ou reduzidos.

A redução do nível de expressão do polinucleotídeo-alvo ou do polipeptídeo codificado assimy na praga, resulta na repressão, controle e/ou morte do organismo patogênico invasor.

Reduzindo o nível de expressão da sequência-alvo da praga irá reduzir os sintomas da doença resultantes da provocação do patógeno, em pelo menos, cerca de 2% a pelo menos cerca de 6%, de pelo menos cerca de 5% a cerca de 50%, de pelo menos cerca de 10% a cerca de 60%, de pelo menos, cerca de 30% a cerca de

70%, de pelo menos cerca de 40% a cerca de 80%, ou, de pelo | menos, cerca de 50% a cerca de 90% ou mais.

Assim, os métodos da invenção podem ser utilizados para proteger plantas de doenças, particularmente estas doenças que são causadas por pragas da ordem Lepidoptera

Ensaios que medem o controle de uma praga são comumente o 10 conhecidos na arte, como os métodos para quantificar a resistência a doenças em plantas após a infecção do patógeno.

Veja, por exemplo, Patente US No. 5.614.395, aqui incorporada por referência.

Tais técnicas incluem medir por mais tempo O diâmetro médio da lesão, a biomassa do patógeno, bem como oO percentual global de tecidos vegetais deteriorados.

Veja, por exemplo, Thomma et al. (1998) Plant Biology 95:15107-15111, aqui incorporado por referência.

Ver também os exemplos abaixo.

A invenção é designada para composições e métodos para proteger as plantas de uma praga vegetal, tais como as pragas da ordem Lepidoptera ou induzir resistência em uma planta à uma o praga de planta, tais como as pragas da ordem Lepidoptera.

Lagartas e as formas relacionadas de insetos lepidópteros constituem um importante grupo de pragas agrícolas comedoras de plantas, especialmente durante a fase de crescimento de larvas.

Métodos de alimentação de larvas de Lepidoptera tipicamente | incluem plantas de mascar ou partes de plantas.

Como usado | aqui, o termo “Lepidoptera” é usado para se referir a qualquer membro da ordem Lepidoptera.

Em concretizações particulares, composições e métodos da invenção de controle de larvas de Lepidoptera (i.e. lagartas). Assim, as composições e métodos também são úteis para proteger as plantas contra qualquer

Po 7/139 Lepidoptera, incluindo, por exemplo, Pieris rapae, Pectinophora | gossypiella, Synanthedon exitiosa, Melittia cucurbitae, Cydia | pomonella, Grapholita molesta, Ostrinia nubilalis, Plodia interpunctella, Galleria mellonella, Manduca sexta, Manduca quinquemaculata, Lymantria dispar, Euproctis chrysorrhoea, Trichoplusia ni, Mamestra brassicae, Agrotis ipsilon, Plutella xylostella, Anticarsia gemmatalis, Psuedoplusia includens, Epinotia aporema, Hel icoverna 7ea, Heliothis virescens, Heliothis armigera, Spodoptera exigua, Scirpophaga incertulus, o 10 Sesamia Spp., Buseola fusca, Cnaphalocrocis medinalis, Chilo suppressalis, ou Spodoptera littoralis. Em concretizações particulares, métodos de controle de Spodoptera frugiperda.

II. Sequências alvo Como usado aqui, uma “sequência-alvo” ou “polinucleotídeo alvo” compreende qualquer sequência na praga que se deseja reduzir o nível de expressão. Em concretizações específicas, diminuindo o nível da sequência alvo no controle de pragas da praga. Por exemplo, a sequência alvo pode ser essencial para o crescimento e desenvolvimento. Embora a sequência do alvo possa o ser expressa em qualquer tecido da praga, em concretizações específicas da invenção, as sequências alvo para repressão em pragas são expressas em células do tecido de vísceras da praga, células do intestino das pragas, e células que revestem o lúmen intestinal ou o intestino. Sequências alvo deste tipo podem estar envolvidas no metabolismo, crescimento ou diferenciação da célula intestinal.

Em uma concretização da invenção a sequência alvo é composta por um polipeptídeo pertencente a uma ou mais classes de enzimas, como um polipeptídeo do hormônio juvenil, um polipeptídeo vacuolar, um polipeptídeo caderina, um polipeptídeo de cutícula, um fator de iniciação de tradução, um polipeptídeo SAR1, um fator de alongamento, um fosfooligosacarídeo, um polipeptídeo miosina, um transportador de aminoácidos do canal de potássio, um retificador de potássio internamente, um transportador de aminoácidos, um polipeptídeo tubulina, um polipeptídeo ubiquitina, e uma ribonucleoproteína nuclear pequena.

Exemplos não limitantes de semâncias alvo da invenção incluem um polinucleotídeo estabelecido na SEQ ID NO: 1, 2, 3, o 10 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 Ou 50. Como exemplificado aqui, diminuindo o nível de expressão dessas sequências alvo ou membros das classes de enzimas citadas em Lepidoptera controla a praga.

III.

Elementos de Silenciamento Por “elemento de silenciamento” entende-se um polinucleotídeo que, quando ingerido por uma praga, é capaz de eliminar ou reduzir o nível ou a expressão de um o polinucleotídeo alvo ou do polipeptídeo codificado assim.

O | elemento de silenciamento empregado pode reduzir ou eliminar o nível de expressão da sequência alvo pela influência do nível do RNA alvo transcrito ou, alternativamente, pela influência de tradução, afetando assim o nível do polipeptídeo codificado.

Métodos de ensaio para elementos de silenciamento funcionais que são capazes de eliminar ou reduzir o nível de uma sequência de interesse são divulgados no presente documento.

Um polinucleotídeo único empregado nos métodos da invenção pode compreender um ou mais elementos de silenciamento para os mesmos ou diferentes polinucleotídeos alvo.

Em concretizações específicas, a sequência alvo não é um gene endógeno vegetal. Em outras concretizações, enquanto os elementos de silenciamento controlam pragas, de preferência, o elemento de silenciamento não tem efeito sobre à planta normal ou parte da planta.

Como discutido em detalhe mais adiante, elementos de silenciamento podem incluir, mas não estão limitados a, um elemento de supressão senso, um elemento de supreccão antisenso, uma fita dupla de RNA, um miRNA, ou um elemento de oe 10 supressão de grampo. Exemplos não limitantes de elementos de silenciamento que podem ser empregados para diminuir a expressão dessas sequências alvo de Lepidoptera compreendem fragmentos e variantes de sequência senso ou antisenso ou consistem de sequência senso ou antisenso estabelecida SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49, 50, 51, 54, 57, 60, 63, 66, 69, 72, 75, 78, 81, 84, 87, 90, 93, 96, 99, 102, 105, 108, 111, 114, 117, 120, 123, 126, 129, 132, 135, 138, 141, 144, 147, 150, 153, 156, 159, 162, 165, 168, o 171, 174, 177, 180, 183, 186, 189, 192, 195, 198, 201, 204, 207, 210, 213, 216, 219, 222, 225, 228, 231, 234, 237, 240, 243, 246, 249, 252, 255, 258, 261, 264, 267, 270, 273, 276, 279, 282, 285, 288, 291, 294, 297, 300, 303, 306, 309, 312, 315, 318, 321, 324, 327, 330, 333, 336, 339, 342, 345, 348, 351, 354, 357, 360, 363, 366, 369, 372, 375, 378, 381, 384, 387, 390, 393, 396, 399, 402, 405, 408, 411, 415, 418, 421, 424, 427, 430, 433, 436, 439, 442, 457, 460, e/ou 463 ou uma variante biologicamente ativa ou fragmento da mesma. Em concretizações específicas, o elemento de silenciamento compreende ou consiste de pelo menos uma das sequências definidas em qualquer uma das SEQ ID NOS: 51-465. Em outras concretizações, os elementos de silenciamento podem incluir, pelo menos, um resíduo de timina na extremidade 3'. Isto pode ajudar na estabilização.

Assim, os elementos de silenciamento podem ter pelo menos 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou mais resíduos de timina na extremidade 3'. Em outras concretizações, o elemento de silenciamento compreende SEQ TP NO: 52 e 53, 55 e 56, 58 e 59, 61 c 62, S4 e 65, 67 e 68, 70 e 71, 73 e 74, 76 e 77, 79 e 80, 82 e 83, 85 e o 10 86, 88 e 89, 91 e 92, 94 e 95, 97 e 98, 100 e 101, 103 e 104, 106 e 107, 109 e 110, 112 e 113, 115 e 116; 118 e 119, 121 e 122, 124 e 125, 127 e 128, 130 e 131, 133 e 134, 136 e 137, 139 | e 140, 142 e 143, 145 e 146, 148 e 149, 151 e 152, 154 e 155, | 157 e 158, 160 e 161, 163 e 164, 166 e 167, 169 e 170, 172 e | | 15 173, 175 e 176, 178 e 179, 181 e 182, 184 e 185, 187 e 188, 190 e 191; 193 e 194, 196 e 197, 199 e 200, 202 e 203, 205 e 206, | 208 e 209, 211 e 212, 214 e 215, 217 e 218, 220 e 221, 223 e 224, 226 e 227, 229 e 230, 232 e 233, 235 e 236, 238 e 239, 241 e 242, 244 e 245, 247 e 248, 250 e 251, 253 e 254, 256 e 257, 259 e 260, 262 e 263, 265 e 266; 268 e 269, 271 e 272, 274 e o 275, 277 e 278, 280 e 281, 283 e 284, 286 e 287, 289 e 290, 292 e 293, 295 e 296, 298 e 299, 301 e 302, 304 e 305, 307 e 308, 310 e 311, 313 e 314, 316 e 317, 139 e 320, 322 e 323, 325 e 326, 328 e 329, 331 e 332, 334 e 335, 337 e 338, 340 e 341; 343 e 344, 346 e 347, 349 e 350, 352 e 353, 355 e 356, 358 e 359, 361 e 362, 364 e 365, 367 e 368, 370 e 371, 373 e 374, 376 e 377, 379 e 380, 382 e 383, 385 e 386, 388 e 389, 391 e 392, 394 e 395, 397 e 398, 400 e 401, 403 e 404, 406 e 407, 409 e 410, 412 e 413, 416 e 417; 419 e 420, 422 e 423, 425 e 426, 428 e 429, 431 e 432, 434 e 435, 437 e 438, 440 e 441, 443 e 444, 458 e 459, 461 e 462, e/ou 464 e 465.

Por “redução” ou “reduzir” o nível de expressão de um polinucleotídeo ou um polipeptídeo codificado, assim, entende- se como significado que, o nível de polinucleotídeo Ou | polipeptídeo da sequência alvo é significativamente menor do que o nível de polinucleotídeo ou nível do polipeptídeo da mesma sequência alvo em uma praga controle adequada que não seja exposta ao (ou seja, não tenha ingerido), elemento de silenciamento.

Em concretizações particulares da invenção, reduzindo o nível de polinucleotídeo e/ou o nível de oe 10 polipeptídeo da sequência alvo em uma praga de acordo com a invenção resulta em menos de 95%, menos de 90%, menos de 80%, ' menos de 70%, menos de 60%, menos de 50%, menos de 40%, menos de 30%, menos de 20%, menos de 10%, ou menos de 5% do nível de polinucleotídeo, ou do nível do polipeptídeo assim codificado, da mesma sequência alvo em uma praga controle adequada.

Métodos de ensaio para o nível da transcrição do RNA, o nível do polipeptídeo codificado, ou a atividade do polinucleotídeo ou polipeptídeo são discutidos em outro lugar deste documento. i.

Elementos de Supressão Senso oe Como usado aqui, um “elemento de supressão senso” compreende um polinucleotídeo projetado para expressar uma molécula de RNA correspondente a pelo menos uma parte de um RNA mensageiro alvo, em uma orientação “senso”. Expressão da molécula de RNA compreendendo o elemento de supressão senso reduz ou elimina o nível do polinucleotídeo-alvo ou do polipeptídeo assim codificado.

O polinucleotídeo compreendendo o elemento de supressão senso pode corresponder à totalidade ou parte da sequência do polinucleotídeo-alvo, a totalidade ou parte da região não traduzida 5' e/ou 3' do polinucleotídeo alvo, a totalidade ou parte da sequência de codificação do polinucleotídeo-alvo, ou a totalidade ou parte de ambas as sequências de codificação e as regiões não traduzidas do polinucleotídeo alvo. Normalmente, um elemento de supressão senso tem identidade de sequência substancial para o polinucleotídeo-alvo, normalmente superior a cerca de 65% de identidade de sequência, maior do que cerca de 85% de identidade de sequência, cerca de 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95% , 96%, 907%, 98% ou 99% de identidade de sequência. Veja, Patentes US nos. 5.283.184 e e 10 5.034.323; aqui incorporadas por referência. O elemento de supressão senso pode ser de qualquer tamanho, desde que permita a supressão da sequência alvo. O elemento de supressão senso pode ser, por exemplo, 15, 20, 22, 25, 30, 50, 100, 150, 200, 250, 300, 350, 400, 450, 500, 600, 700, 900 ou maior.

ii. Elementos de Supressão Anti-Senso Como usado aqui, um “elemento de supressão antisenso” compreende um polinucleotídeo que visa expressar uma molécula de RNA complementar a totalidade ou parte de um RNA mensageiro alvo. Expressão do elemento de supressão de RNA antisenso reduz [ ou elimina o nível de polinucleotídeo alvo. O polinucleotídeo para uso na supressão antisenso pode corresponder a totalidade ou parte do complemento da sequência de codificação do polinucleotídeo-alvo, a totalidade ou parte do complemento da região não traduzida 5' e/ou 3' do polinucleotídeo-alvo, a | totalidade ou parte do complemento da sequência de codificação do polinucleotídeo-alvo, ou a totalidade ou parte do complemento de ambas as sequência de codificação e as regiões não traduzidas do polinucleotídeo alvo. Além disso, o elemento de supressão antisenso pode ser totalmente complementar (ou seja, 100% idêntico ao complemento da sequência alvo) ou parcialmente complementar (isto é, menos de 100% idêntico ao complemento da sequência alvo) ao polinucleotídeo-alvo. Em concretizações específicas, o elemento de supressão antisenso compreende pelo menos 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de complementaridade de sequência ao polinucleotídeo alvo. Supressão antisenso pode ser utilizada para inibir a expressão de múltiplas proteínas na mesma planta. Veja, por exemplo, Patente TIS No. 5.942.657. Além disso, O elemento de supressão antisenso pode ser complementar a uma e 10 porção do polinucleotídeo alvo. Geralmente, sequências de pelo menos 15, 20, 22, 25, 50, 100, 200, 300, 400, 450 nucleotídeos ou mais podem ser utilizadas. Métodos para usar a supressão antisenso para inibir a expressão de genes endógenos em plantas são descritos, por exemplo, em Liu et al (2002) Plant Physiol 129:1732-1743 e Patentes US Nº s 5.759.829 e 5.942.657, cada um dos quais é aqui incorporado por referência.

iii. Elemento de Supressão de RNA de dupla fita Um “elemento de silenciamento de RNA de dupla fita” ou “dsRNA” inclui pelo menos um transcrito que é capaz de formar o um dsRNA antes ou após a ingestão pela praga. Assim, um “elemento de silenciamento de dsRNA” inclui um dsRNA, um transcrito ou polirribonucleotídeo capaz de formar um dsRNA ou mais de um transcrito ou polirribonucleotídeo capaz de formar um dsRNA. “RNA de dupla fita”, ou “dsRNA” refere-se à uma estrutura de polirribonucleotídeo formada por uma única molécula de RNA complementar a ela mesma ou uma estrutura de polirribonucleotídeo formada pela expressão de pelo menos duas fitas distintas de RNA. A(s) molécula(s) de dsRNA empregada(s) nos métodos e composições da invenção media a redução da expressão de uma sequência alvo, por exemplo, mediando "“RNAi”

de interferência de RNA ou silenciamento gênico em um modo específico de sequência . No contexto da presente invenção, oO dsRNA é capaz de eliminar ou reduzir o nível ou a expressão de um polinucleotídeo alvo ou do polipeptídeo assim codificado em uma praga.

O dASRNA pode reduzir ou eliminar o nível de expressão da sequência alvo, influenciando o nível de transcrição do RNA- alvo, influenciando a tradução, e afetando assim o nível do polipeptídeo codificado, ou influenciando a expressão do nível e 10 pré-transcricional (i.e., através da modulação da estrutura da cromatina, padrão de metilação, etc, para alterar a expressão de genes). Veja, por exemplo, Verdel et al. (2004) Science 303:672-676; Pal-Bhadra et al. (2004) Science 303:669 -672; Allshire (2002) Science 297:1818-1819; Volpe et al. (2002) Science 297:1833-1837; Jenuwein (2002), Science 297:2215-2218 e Hall et al. (2002), Science 297: 2232-2237. Métodos de ensaio para iRNA funcional que são capazes de eliminar ou reduzir o nível de uma sequência de interesse são divulgados em outros lugares deste documento. Assim, como aqui utilizado, o termo “"dsRNA” se destina a abranger outros termos usados para o descrever moléculas de ácidos nucléicos que são capazes de mediar a interferência de RNA ou silenciamento de genes, incluindo, por exemplo, RNA de interferência curta (siRNA), RNA de dupla fita (dsRNA), micro-RNA (miRNA), RNA grampo, RNA grampo curto (ShRNA), RNA de silenciamento de gene pós- transcricional (ptgsRNA), e outros.

Em concretizações específicas, pelo menos, uma fita do duplex ou região de dupla fita do dsRNA mostra identidade de sequência ou complementaridade de sequência suficiente com o polinucleotídeo alvo para permitir o dsRNA reduzir o nível de expressão da sequência alvo. Como usado aqui, a fita que é complementar ao polinucleotídeo alvo é a “fita antisenso”" e a fita homóloga ao polinucleotídeo alvo é a “fita senso”. Em uma concretização, o dsRNA compreende um RNA grampo.

Um RNA grampo é composto por uma molécula de RNA que é capaz de dobrar de volta para si para formar uma estrutura de cadeia dupla.

Estruturas múltiplas podem ser utilizadas como elementos grampo.

Em concretizações específicas, o elemento de supressão | de dsRNA compreende um elemento grampo que inclui na seguinte ordem, um primeiro segmento, um segundo segmento, e um terceiro e 10 segmento, onde o primeiro e o terceiro segmento mostram complementaridade suficiente para permitir que o RNA transcrito forme uma estrutura de filamento haste-alça de dupla fita.

O “segundo segmento” do grampo compreende uma “alça” ou uma "região de alça”. Esses termos são usados como sinônimos neste documento e devem ser interpretados amplamente para incluir qualquer sequência de nucleotídeos que confere flexibilidade suficiente para permitir o auto-emparelhamento para ocorrer entre regiões complementares de um polinucleotídeo (ou seja, segmentos 1 e 3 que formam à haste do grampo). Por exemplo, em algumas concretizações, a região de alça pode ser e substancialmente de fita simples e age como um espaçador entre as regiões auto-complementares do grampo haste-alça.

Em algumas concretizações, a região de alça pode incluir uma sequência de nucleotídeos não-senso ou aleatória e, portanto, não mostra identidade de sequência para um polinucleotídeo alvo.

Em outras concretizações, a região de alça compreende uma sequência senso | ou antisenso de RNA ou seu fragmento que mostra identidade com um polinucleotídeo alvo.

Ver, por exemplo, a Publicação International de Patente No.

WO 02/00904, aqui incorporada por referência.

Em concretizações específicas, a região de alça pode ser otimizada para ser tão curta quanto possível, enquanto ainda fornece flexibilidade intramolecular suficiente para permitir a formação das regiões de haste de bases pareadas.

Assim, a sequência de alça é geralmente inferior a 1000, 900, 800, 700, 600, 500, 400, 300, 200, 100, 50, 25, 20, 15, 10 nucleotídeos ou menos.

O “primeiro” e o “terceiro” segmento da molécula de RNA grampo compõem a haste pareada da estrutura de grampo.

O primeiro e o terceiro segmentos são repetições invertidas um do outro e compartilham complementaridade suficiente para permitir oe 10 a formação da região de haste de bases pareadas.

Em concretizações específicas, o primeiro e o terceiro segmentos são totalmente complementares um ao outro.

Alternativamente, o primeiro e o terceiro segmentos podem ser parcialmente complementares uns aos outros, enquanto eles são capazes de 15 hibridização entre si para formar uma região de haste de bases pareadas.

A quantidade de complementaridade entre o primeiro e o terceiro segmentos pode ser calculada como uma porcentagem do segmento inteiro.

Assim, o primeiro e o terceiro segmentos do RNA grampo geralmente compartilham pelo menos 50%, 60%, 70%, 20 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, até e e inclusive 100% de complementaridade.

O primeiro e o terceiro segmentos tem, pelo menos, cerca de 1000, 500, 400, 300, 200, 100, 50, 40, 30, 25, 22, 20, 15 ou nucleotídeos de comprimento.

Em concretizações específicas, | 25 o comprimento do primeiro e/ou do terceiro segmento é de cerca | de 10-100 nucleotídeos, cerca de 10 a cerca de 75 nucleotídeos, cerca de 10 a cerca de 50 nucleotídeos, cerca de 10 a cerca de | 40 nucleotídeos, cerca de 10 a cerca de 35 nucleotídeos, cerca de 10 a cerca de 30 nucleotídeos, cerca de 10 a cerca de 25 nucleotídeos, cerca de 10 a cerca de 20 nucleotídeos.

Em outras concretizações, o comprimento do primeiro e/ou do terceiro | | a segmento é composto por pelo menos 10-20 nucleotídeos, 20-35 nucleotídeos, 30-45 nucleotídeos, 40-50 nucleotídeos, 50-100 nucleotídeos, ou 100-300 nucleotídeos.

Ver, por exemplo, a Publicação International No.

WO 0200904. Em concretizações específicas, o primeiro e o terceiro segmento compreendem pelo menos 20 nucleotídeos tendo pelo menos 85% de complementariedade ao primeiro segmento.

Ainda em outras concretizações, Oo primeiro e n terceiro segmentos que formam à | estrutura haste-alça do grampo compreendem regiões 3' ou 5º | e 10 salientadas tendo resíduos de nucleotídeos pareados.

Em concretizações específicas, as sequências utilizadas no | primeiro, no segundo e/ou no terceiro segmentos compreendem | domínios que são projetados para ter uma identidade de sequência suficiente para um polinucleotídeo alvo de interesse e assim ter a capacidade de diminuir o nível de expressão do polinucleotídeo alvo.

A especificidade dos transcritos de RNA inibidores é, portanto, conferida geralmente por esses domínios do elemento de silenciamento.

Assim, em algumas concretizações da invenção, o primeiro, segundo e/ou terceiro segmentos do elemento de silenciamento compreendem um domínio de pelo menos oe 10, pelo menos 15, pelo menos 19, pelo menos 20, pelo menos 21, pelo menos 22, pelo menos 23, pelo menos 24, pelo menos 25, | pelo menos 30, pelo menos 40, pelo menos 50, pelo menos 100, pelo menos 200, pelo menos 300, pelo menos 500, pelo menos 1000, ou mais de 1000 nucleotídeos que compartilham identidade de sequência suficiente para o polinucleotídeo alvo para permitir uma diminuição nos níveis de expressão do polinucleotídeo alvo quando expresso em uma célula apropriada.

Em outras concretizações, o domínio é entre cerca de 15 a 50 nucleotídeos, cerca de 20-35 nucleotídeos, cerca de 25-50 | | L—— ——- —=——

nucleotídeos, cerca de 20 a 75 nucleotídeos, cerca de 40-90 nucleotídeos cerca de 15-100 nucleotídeos.

Em concretizações específicas, o domínio do primeiro, do segundo e/ou do terceiro segmento tem 100% de identidade de sequência para o polinucleotídeo alvo.

Em outras concretizações, o domínio do primeiro, segundo e/ou terceiro segmento tendo homologia com o polipeptídeo alvo de, pelo | menos, 50%. 60%, 70%, RN%, R5%, 090%, 91%, 92%, 93%, 904%, O5%, ' 96%, 97%, 98%, 99% , de identidade de sequência com uma região e 10 do polinucleotídeo alvo.

A identidade de sequência dos domínios do primeiro, segundo e/ou terceiro segmentos do polinucleotídeo alvo apenas necessita ser suficiente para diminuir a expressão do polinucleotídeo alvo de interesse.

Ver, por exemplo, Chuang e Meyerowitz (2000) Proc.

Natl.

Acad.

Sci.

USA 97;:4985-4990; Stoutjesdijk et al. (2002) Plant Physiol. 129:1723-1731; Waterhouse e Helliwell (2003) Nat.

Rev.

Genet. 4:29-38; Pandolfini et al.

BMC Biotechnology 3:7, e Publicação de Patente US No. 20030175965, cada um dos quais é aqui incorporado por referência.

Um ensaio transiente para a eficiência de construções de hpRNA para expressão de gene de oe silenciamento in vivo tem sido descrito por Panstruga et al. (2003) Mol.

Biol.

Rep. 30:135-140, aqui incorporado por referência.

A quantidade de complementaridade compartilhada entre o primeiro, segundo e/ou terceiro segmento e o polinucleotídeo- alvo ou a quantidade de complementaridade partilhada entre o primeiro segmento e o terceiro segmento (isto é, a haste da | estrutura de grampo) pode variar dependendo do organismo em que a expressão do gene é controlada.

Alguns tipos de células ou organismos podem exigir o emparelhamento exato ou identidade de 100%, enquanto que outros organismos ou tipos de células podem tolerar algumas inadequações. Em algumas células, por exemplo, uma incompatibilidade de um único nucleotídeo na sequência alvo revoga a capacidade de suprimir a expressão gênica. Nessas células, os cassetes de supressão da invenção podem ser usados para objetivar a supressão de genes mutantes, por exemplo, oncogenes cujos transcritos incluem mutações pontuais e, portanto, podem ser direcionados especificamente com os métodos e composições da invenção sem alterar a expressão do alclo tipo selvagem restante.

oe 10 Qualquer região do polinucleotídeo alvo pode ser usada para projetar o domínio do elemento de silenciamento que mostra identidade de sequência suficiente para permitir a expressão do transcrito grampo para diminuir o nível de polinucleotídeo alvo. Por exemplo, o domínio pode ser projetado para mostrar identidade de sequência com a região não traduzida 5' do polinucleotídeo(s)-alvo, a região não traduzida 3º do | polinucleotídeo(s)-alvo, regiões exônicas ão | polinucleotídeo(s)-alvo, regiões intrônicas do | | polinucleotídeo(s)-alvo, e qualquer combinação dos mesmos. Em concretizações específicas, um domínio do elemento —de e silenciamento mostra homologia suficiente para, pelo menos, cerca de 15, 20, 22, 25 ou 30 nucleotídeos consecutivos a partir de cerca de nucleotídeos 10-50, 50-100, 100-150, 150- 200, 200-250, 250-300, 300-350, 350-400, 400-450, 450-500, 550- 600, 600-650, 650-700, 750-800, 850-900, 950-1000, 1000-1050, 1050-1100, 1100-1200, 1200-1300, 1300-1400, 1400-1500, 1500- | 1600, 1600-1700, 1700-1800, 1800-1900, 1900-2000 da sequência alvo. Em alguns casos, para otimizar sequências de siRNA empregadas no grampo, o método H de oligodeoxirribonucleotídeo sintético/RNAse pode ser usado para determinar sítios no mRNA alvo que estão em uma conformação que é suscetível ao o a RS A a E E A o a o A a Na 20/139 | silenciamento de RNA. Ver, por exemplo, Vickers et al. (2003) | J. Biol. Chem 278:7108-7118 e Yang et al. (2002) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99:9442-9447, aqui incorporados por referência. Esses estudos indicam que existe uma correlação significativa entre os sítios H-sensíveis ao RNase e sítios que promovem degradação de mRNA siRNA-dirigido eficiente.

O elemento de silenciamento de grampo também pode ser concebido de modo qe a sequência senso ou à Sequência antisenso não correspondem a um polinucleotídeo alvo. Nesta oe 10 concretização, a sequência senso e antisenso flanqueiam uma sequência de alça que compreende uma sequência de nucleotídeos correspondente à totalidade ou parte do polinucleotídeo alvo. Assim, é a região de alça que determina a especificidade da interferência do RNA. Veja, por exemplo, WO 02/00904, aqui incorporado por referência. Em concretizações específicas, o elemento de silenciamento compreendendo o grampo compreende sequências selecionadas do grupo consistindo de SEQ ID NO: 52 e 53, 55 e 56, 58 e 59, 61 e 62, 64 e 65, 67 e 68, 70 e 71; 73 e 74, 76 e 77, 79 e 80, 82 e 83, 85 e 86, 88 e 89, 91 e 92, 94 e 95, 97 e 98, 100 e 101, 103 e e 104, 106 e 107, 109 e 110, 112 e 113, 115 e 116, 118 e 119, 121 e 122, 124 e 125, 127 e 128, 130 e 131, 133 e 134, 136 e 137, 139 e 140, 142 e 143, 145 e 146; 148 e 149, 151 e 152, 154 e 155, 157 e 158, 160 e 161, 163 e 164, 166 e 167, 169 e 170, 172 e 173, 175 e 176, 178 e 179, 181 e 182, 184 e 185, 187 e 188, 190 e 191, 193 e 194, 196 e 197, 199 e 200, 202 e 203, 205 e 206, 208 e 209, 211 e 212, 214 e 215, 217 e 218, 220 e 221; 223 e 224, 226 e 227, 229 e 230, 232 e 233, 235 e 236, 238 e 239, 241 e 242, 244 e 245, 247 e 248, 250 e 251, 253 e 254, 256 e257, 259 e 260, 262 e 263, 265 e 266, 268 e 269, 271 e 272, 274 e 275, 277 e 278, 280 e 281, 283 e 284, 286 e 287, 289 e

290, 292 e 293, 295 e 296; 298 e 299, 301 e 302, 304 e 305, 307 e 308, 310 e 311, 313 e 314, 316 e 317, 139 e 320, 322 e 323, 325 e 326, 328 e 329, 331 e 332, 334 e 335, 337 e 338, 340 e 341, 343 e 344, 346 e 347, 349 e 350, 352 e 353, 355 e 356, 358 e3359, 361 e 362, 364 e 365, 367 e 368, 370 e 371; 373 e 374, 376 e 377, 379 e 380, 382 e 383, 385 e 386, 388 e 389, 391 e 392, 394 e 395, 397 e 398, 400 e 401, 403 e 404, 406 e 407, 409 e 410, 412 e 413, 416 e 417, 419 e 420, 422 e 423, 425 c 426, 428 e 429, 431 e 432, 434 e 435, 437 e 438, 440 e 441, 443 e 6 10 444, 458 e 459; 461 e 462, e/ou 464 e 465.

Além disso, silenciamento do gene transcricional (TGS) pode ser obtido através da utilização de um elemento de supressão de grampo, onde a repetição invertida do grampo mostra identidade de sequência com a região promotora de um polinucleotídeo alvo a ser silenciado. Veja, por exemplo, Aufsatz et al. (2002), PNAS 99 (Supl. 4): 16499-16506 e Mette et al. (2000) EMBO J 19 (19): 5194-5201.

Em outras concretizações, o dsRNA pode incluir um pequeno RNA (SRNA). SRNAS podem incluir tanto RNA micro (miRNA) e RNA de interferência curta (SiRNA) (Meister e Tuschl (2004) Nature ) 431:343-349 e Bonetta et al. (2004) Nature Methods 1:79-86). miRNAS são agentes de regulação compreendendo cerca de 19 ribonucleotídeos que são altamente eficazes na inibição da | expressão de polinucleotídeos alvo. Ver, por exemplo, Javier et al. (2003) Nature 425: 257-263, aqui incorporado por | referência. Para interferência de miRNA, o elemento de silenciamento pode ser projetado para expressar uma molécula de dsRNA que forma uma estrutura de grampo contendo uma sequência de 19 nucleotídeos que é complementar ao polinucleotídeo alvo de interesse. O miRNA pode ser feito de forma sintética, Ou transcrito como um RNA mais longo que é posteriormente clivado para produzir o miRNA ativo.

Especificamente, o miRNA pode incluir 19 nucleotídeos da sequência com homologia a um polinucleotídeo-alvo, na orientação senso e 19 nucleotídeos de uma sequência antisenso correspondente, que é complementar à sequência senso.

Ao expressar um miRNA, reconhece-se que várias formas de um miRNA podem ser transcritas, incluindo, por exemplo, o transcrito primário (chamado de “pri miRNA”), que é processado através de várias etapas nucleolíticas a um precursor menor de o 10 miRNA (denominado “pré-miRNA”), o pré-miRNA, ou o miRNA final (maduro) está presente em um duplex, as duas fitas sendo referidas como O miRNA (a fita que irá eventualmente parear a base com o alvo) e miRNA*. O pre-miRNA é um substrato para uma forma de dicer que remove O miRNA/MiRNA* duplex a partir do precursor, após o que, à semelhança dos siRNAS, o duplex pode ser levado ao complexo RISC.

Demonstrou-se que os miRNAS podem ser expressos transgenicamente e são eficazes através da expressão de uma forma precursora, ao invés da forma primária inteira (Parizotto et al. (2004) Genes & Development 18 :2237- 2242 e Guo et al. (2005) Plant Cell 17:1376-1386). oe Os métodos e composições da invenção empregam elementos de silenciamento que quando transcritos “formam” uma molécula de | dsRNA.

Assim, o polinucleotídeo heteróloga sendo expresso não precisa formar o dsRNA por si só, mas pode interagir com outras sequências na célula vegetal ou no intestino de pragas após a ingestão para permitir a formação do dsRNA.

Por exemplo, um polinucleotídeo quimérico que pode seletivamente silenciar o polinucleotídeo alvo pode ser gerado por expressar uma construção quimérica que compreende a sequência alvo para miRNA ou siRNA à uma sequência correspondente à totalidade ou parte do gene ou genes a serem silenciados.

Nesta concretização, O dsSsRNA é “formado”, quando o alvo para o miRNA ou sSiRNA interage com o miRNA presente na célula.

O dsRNA resultante pode então reduzir o nível de expressão do gene ou genes a serem silenciados.

Veja, por exemplo, Pedido provisório US nº 60/691,613, depositado em 17 de junho de 2005, intitulada “Métodos e composições para Silenciamento de Gene”, aqui incorporada por referência.

A construção pode ser projetada para ter um alvo para um miRNA endógeno ou, altornativamente, um alvo para um miRNA heterólogo e/ou sintético pode ser oe 10 empregado na construção.

Se um miRNA heterólogo e/ou sintético é empregado, ele pode ser introduzido na célula na mesma construção de nucleotídeo como o polinucleotídeo quimérico ou em uma construção separada.

Conforme já discutido aqui, qualquer método pode ser usado para introduzir a construção compreendendo o miRNA heterólogo.

IV.

Variantes e Fragmentos Por “fragmento” entende-se uma porção do polinucleotídeo ou uma porção da sequência de aminoácidos e, consequentemente, a proteína codificada por ela.

Fragmentos de um polinucleotídeo oe podem codificar fragmentos de proteínas que mantêm a atividade biológica da proteína nativa.

Alternativamente, os fragmentos de um polinucleotídeo que são úteis como elementos de silenciamento não precisam codificar fragmentos de proteínas que retem atividade biológica.

Assim, fragmentos de uma sequência de nucleotídeos podem variar de pelo menos cerca de 10, cerca de 15, cerca de 20 nucleotídeos, cerca de 22 nucleotídeos, cerca de 50 nucleotídeos, cerca de 75 nucleotídeos, cerca de 100 nucleotídeos, 200 nucleotídeos, 300 nucleotídeos, 400 nucleotídeos, 500 nucleotídeos, 600 nucleotídeos, 700 nucleotídeos e até mais polinucleotídeos de comprimento total empregados na invenção. Métodos de ensaio para a atividade de um elemento de silenciamento desejado ou um elemento potenciador supressor são descritos no presente documento.

Por “variantes” entende-se a média de sequências substancialmente similares. Para polinucleotídeos, uma variante compreende uma deleção e/ou adição de um ou mais nucleotídeos em um ou mais sítios internos dentro do polinuclcotídeo nativo e/ou substituição de um ou mais nucleotídeos em um ou mais | o 10 sítios no polinucleotídeo nativo. Tal como aqui utilizado, um | polinucleotídeo “nativo” ou polipeptídeo compreende uma sequência de nucleotídeos que ocorre naturalmente ou sequência | de aminoácidos, respectivamente. Para polinucleotídeos, variantes conservadoras incluem aquelas sequências que, devido à degeneração do código genético, codificam a sequência de aminoácidos de um dos polipeptídeos empregados na invenção. Polinucleotídeos — variantes também "incluem derivados de polinucleotídeo sinteticamente, como os gerados, por exemplo, usando mutagênese sítio-dirigida, mas continuam a manter a atividade desejada. Geralmente, variantes de um polinucleotídeo e particular da invenção (ou seja, um elemento de silenciamento) terão pelo menos cerca de 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85 %, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais de identidade de sequência para que um polinucleotídeo particular, como determinado por programas de alinhamento de sequência e parâmetros descritos no presente documento.

Variantes de um polinucleotídeo particular da invenção (i.e., o polinucleotídeo de referência) também podem ser avaliadas através da comparação do percentual de identidade de sequência entre o polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo variante e o polipeptídeo codificado pelo polinucleotídeo de referência.

Percentual de identidade de sequência entre quaisquer dois polipeptídeos pode ser calculado usando programas de alinhamento de sequência e parâmetros descritos no presente documento.

Quando um determinado par de polinucleotídeos empregados na invenção é avaliado através da comparação do percentual da identidade de sequência compartilhada pelos dois polipentídeos que eles codificam, o percentual de identidade de sequência entre os dois oe 10 polipeptídeos codificados é de pelo menos cerca de 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais de sequência de identidade.

Proteína “variante” destina-se a significar uma proteína derivada da proteína nativa pela supressão ou adição de um ou mais aminoácidos em um ou mais sítios internos na proteína nativa e/ou substituição de um ou mais aminoácidos em um ou mais sítios na proteína nativa.

Proteínas variantes abrangidas pela presente invenção são biologicamente ativas, isto é, elas continuam a possuir a atividade biológica desejada da proteína oe nativa, como discutido em outro lugar aqui.

Tais variações podem resultar, por exemplo, do polimorfismo genético ou de manipulação humana.

Variantes biologicamente ativas de uma proteína nativa terão pelo menos cerca de 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais de identidade de sequência com a sequência de aminoácidos para a proteína nativa, como determinado pelos programas de alinhamento de sequência e parâmetros “descritos no presente documento.

Uma variante biologicamente ativa de uma proteína da invenção pode ser diferente da proteína por somente 1-15 resíduos de aminoácidos,

somente 1-10, tais como 6-10, somente 5, somente 4, 3, 2 , Ou mesmo 1 resíduo de aminoácido.

Os seguintes termos são usados para descrever as relações | de sequência entre dois ou mais polinucleotídeos e polipeptídeos: (a) “sequência de referência”, (b) “janela de comparação”, (c) “identidade de sequência” e (d) “percentual de identidade de sequência”. (a) Como usado aqui. “sequência de referência” é uma sequência definida utilizada como base para oe 10 comparação de sequência.

Uma sequência de referência pode ser um subconjunto ou a totalidade de uma sequência específica, por exemplo, como um segmento de cDNA de comprimento total ou sequência do gene, ou o CcDNA completo ou sequência do gene. (b) Como usado aqui, uma “janela de comparação" faz referência a um segmento determinado e contíguo de uma sequência de polinucleotídeo, onde a sequência de polinucleotídeo na janela de comparação pode incluir acréscimos Ou supressões (ou seja, lacunas) em relação à sequência de referência (que oe não inclui acréscimos Ou Ssupressões) para o alinhamento ideal dos dois polinucleotídeos.

Geralmente, a janela de comparação é de pelo menos 20 nucleotídeos contíguos de comprimento e, opcionalmente, pode ser de 30, 40, 50, 100, ou mais.

Aqueles versados na técnica entendem que, para evitar uma alta similaridade de uma sequência de referência, devido à inclusão das lacunas na sequência de polinucleotídeo uma lacuna é normalmente introduzida e é subtraída do número de combinações.

Salvo disposição em contrário, valores de identidade de sequência/similaridade aqui fornecidos referem-se ao valor obtido com GAP versão 10 usando os seguintes parâmetros: % de identidade e % de similaridade para uma sequência de nucleotídeos utilizando peso de GAP de 50 e Peso de Comprimento de 3, e a matriz de pontuação nwsgapdna.cmp; % de identidade e % de semelhança para uma sequência de aminoácidos com peso de | GAP de 8 e Peso de Comprimento de 2, e a matriz de pontuação | BLOSUM62, ou qualquer outro programa equivalente. Por “programa oe 10 equivalente” entende-se qualquer programa de comparação de sequências que, para quaisquer duas sequências em questão, gera um alinhamento tendo nucleotídeos idênticos ou combinações de resíduos de aminoácido encontradas e um percentual de identidade de sequência idêntico, quando comparado com oO alinhamento correspondente gerado por GAP versão 10.

(c) Quando usados neste documento, “identidade de sequência” ou “identidade” no contexto de duas sequências de polipeptídeos ou polinucleotídeos fazem referência aos resíduos nas duas sequências que são os mesmos quando alinhados para o correspondência .— máxima sobre uma janela de comparação especificada. Quando o percentual de identidade de sequência é usado em referência às proteínas, é reconhecido que as posições de resíduos que não são idênticas, muitas vezes diferem pelas substituições de aminoácidos conservadoras, onde os resíduos de aminoácidos são substituídos por outros resíduos de aminoácidos com propriedades químicas similares (por exemplo, carga ou hidrofobicidade) e, portanto, não alteram as propriedades funcionais da molécula. Quando as

Ph PEA o A oi ai | 28/139 sequências diferem em substituições conservadoras, o percentual de identidade de sequência pode ser ajustado para corrigir a natureza conservadora da substituição.

Sequências que diferem por tais substituições conservadoras são ditas como tendo “similaridade de sequência” ou “similaridade”. Meios para fazer este ajuste são bem conhecidos para os técnicos na arte.

Normalmente, isso envolve marcar uma substituição conservadora como oe 10 parcial, em vez de uma incompatibilidade total, aumentando assim o percentual de identidade de sequência.

Assim, por exemplo, onde a um aminoácido idêntico é dada uma pontuação de l e a uma substituição não conservadora é dada uma pontuação de zero, à uma substituição conservadora é atribuída uma pontuação entre zero e 1. A pontuação das substituições conservadoras é calculada, por exemplo, tal como aplicada no programa PC/GENE (IntelliGenetics, Mountain View, | 20 Califórnia). o (d) Como usado aqui, “percentagem de identidade de sequência” significa o valor determinado pela comparação de duas sequências alinhadas de forma ótima em uma janela de comparação, onde a porção da sequência de polinucleotídeo na janela de comparação pode incluir acréscimos Ou supressões (ou seja, lacunas) em comparação com a sequência de referência (que não inclui acréscimos Ou supressões) para o alinhamento ideal das duas sequências.

O percentual é calculado através da determinação do número de posições em que o ácido nucleico base idêntico ou resíduo de aminoácido ocorre em ambas as sequências para gerar O número de posições correspondentes, dividindo o número de posições correspondentes pelo número total de posições na janela de comparação e multiplicando o resultado por 100 para produzir o percentual de identidade de sequência.

V. Construções de DNA o 10 O uso do termo “polinucleotídeo” não se destina a limitar a presente invenção de polinucleotídeos compreendendo DNA. Aqueles de habilidade ordinária na técnica reconhecem que polinucleotídeos podem incluir ribonucleotídeos e combinações de ribonucleotídeos e desoxirribonucleotídeos. Tais desoxirribonucleotídeos e ribonucleotídeos incluem ambas moléculas de ocorrência natural e análogas sintéticas. Os polinucleotídeos da invenção também abrangem todas as formas de sequências, incluindo, mas não limitado a, formas de fita simples, formas de dupla fita, grampos, estruturas haste-e-alça (stem-and-loop), e assim por diante.

o O polinucleotídeo codificando o elemento de silenciamento ou em concretizações específicas utilizadas nos métodos e composições da invenção pode ser fornecido em cassetes de expressão para expressão em uma planta ou organismo de interesse. Reconhece-se que vários elementos, incluindo vários elementos de silenciamento idênticos, elementos de silenciamento múltiplos objetivando diferentes regiões da sequência alvo, ou elementos de silenciamento múltiplos para sequências-alvo diferentes podem ser usados. Nesta concretização, é reconhecido que cada elemento de silenciamento pode estar contido em um cassete único ou separado, construção de DNA, ou vetor. Como discutido qualquer meio para fornecer o elemento de silenciamento é contemplado. Uma planta ou célula vegetal pode ser transformada com um cassete único compreendendo “DNA codificando um ou mais elementos de silenciamento ou cassetes separados compreendendo cada elemento de silenciamento pode ser usado para transformar uma planta ou célula vegetal ou célula hospedeira. Da mesma forma, uma planta transformada com vm componente pode ser postoriormente transformada com o segundo elemento. Um ou mais elementos de oe 10 silenciamento também podem ser reunidos através do cruzamento sexual. Ou seja, uma primeira planta compreendendo um componente é cruzada com uma segunda planta compreendendo o segundo componente. Plantas descendentes do cruzamento compreenderão ambos os componentes.

[o] cassete de expressão pode incluir sequências regulatórias 5º e 3º operacionalmente ligadas ao polinucleotídeo da invenção. “Operacionalmente ligado” é destinado a significar uma ligação funcional entre dois ou mais elementos. Por exemplo, uma ligação operacional entre um polinucleotídeo da invenção e uma sequência regulatória (ou oe seja, um promotor) é uma ligação funcional que permite a | expressão do polinucleotídeo da invenção. Elementos ligados operacionalmente podem ser contíguos ou não contíguos. Quando usado para se referir à união de duas regiões codificadoras de proteínas, por operacionalmente ligado entende-se que as regiões codificadoras estão no mesmo quadro de leitura. O cassete pode ainda conter pelo menos um polinucleotídeo adicional a ser cotransformado no organismo. Alternativamente, o polipeptídeo(s) adicional pode ser fornecido em múltiplos cassetes de expressão. Cassetes de expressão podem ser fornecidos com uma pluralidade de sítios de restrição e/ou sítios de recombinação para inserção do polinucleotídeo a estar sob a regulação da transcrição das regiões reguladoras. O cassete de expressão pode ainda conter genes marcadores selecionáveis.

O cassete de expressão inclui na direção de transcrição 5'-3', uma região de iniciação de tradução e transcrição (ou seja, um promotor), um polinucleotídeo compreendendo o elemento de silenciamento empregado nos métodos c composições da invenção, e uma região de terminação de transcrição e tradução o 10 (i.e., região de terminação) funcional em plantas. Regiões | reguladoras (ie, promotores, regiões reguladoras da transcrição, e regiões de terminação traducional) e/ou polinucleotídeos empregados na invenção podem ser nativos/análogos à célula hospedeira ou a outras.

Alternativamente, as regiões reguladoras e/ou polinucleotídeos empregados na invenção podem ser heterólogos para a célula hospedeira ou uns aos outros. Como usado aqui, “heterólogas”, em referência a uma sequência é uma sequência que se origina de uma espécie estrangeira, ou, se da mesma espécie, é substancialmente modificada da sua forma nativa em composição oe e/ou locus do genoma por intervenção humana intencional. Por exemplo, um promotor operacionalmente ligado a um polinucleotídeo heterólogo é de uma espécie diferente da espécie da qual o polinucleotídeo foi derivado, ou, se da mesma/ espécie análoga, um ou ambos são substancialmente modificados de sua forma original e/ou locus genômico, Ou O promotor não é o promotor natural para o polinucleotídeo operacionalmente ligado. Como usado aqui, um gene quimérico compreende uma sequência de codificação operacionalmente ligada a uma região de iniciação de transcrição que é heteróloga a sequência de codificação.

A região de terminação pode ser nativa da região de início da transcrição, pode ser nativa com o polinucieotídeo operacionalmente ligado que codifica o elemento de silenciamento, pode ser nativa com a planta hospedeira, ou pode ser derivada de outra fonte (ou seja, estrangeira Ou heteróloga) ao promotor, o polinucleotídeo compreendendo o elemento de silenciamento, a planta hospedeira, ou qualquer combinação dos dois. Regiões de terminação convenientes cstão disponíveis a partir do plasmídeo Ti de A. tumefaciens, como à o 10 octopina sintase e regiões de terminação da nopalina sintase. Veja também Guerineau et al. (1991) Mol. Gen. Genet. 262:141- 144; Proudfoot (1991) Cell 64:671-674; Sanfacon et al. (1991) Genes Dev. 5:141-149; Mogen et al. (1990) Plant Cell 2:1261- 1272; Munroe et al. (1990) Gene 91:151-158; Ballas et al.

(1989) Nucleic Acids Res. 17:7891-7903; e Joshi et al. (1987) Nucleic Acids Res. 15:9627-9639.

Modificações de sequências adicionais são conhecidas por aumentar a expressão do gene em uma célula hospedeira. Estes incluem a eliminação de sequências de codificação de sinais de poliadenilação espúrios, sinais de sítio de ligação intron- oe exon, repetições tipo transposon, e outras sequências bem caracterizadas que podem ser prejudiciais à expressão do gene.

O conteúdo GC da sequência pode ser ajustado a níveis médios para determinados hospedeiros celulares, como calculado por referência a genes conhecidos expressos na célula hospedeira. Sempre que possível, a sequência é modificada para evitar estruturas de secundárias de mRNA de grampos previstos.

Na elaboração do cassete de expressão, os fragmentos de DNA diferentes podem ser manipulados de modo a fornecer as sequências de DNA na orientação correta e, quando apropriado, no quadro de leitura adequado. Para este fim, adaptadores ou ligadores podem ser empregados para juntar os fragmentos de DNA ou outras manipulações que possam estar envolvidas no fornecimento para sítios de restrição convenientes, remoção de DNA supérfluo, a remoção de sítios de restrição, ou coisa parecida. Para este propósito, em mutagênese in vitro, reparo primário, restrição, anelamento, re-substituições, por exemplo, transições e transversões, podem estar envolvidos.

Um certo número de promotores pode ser utilizado na prática da invenção. O polinucleotídeo que codifica o elemento | o 10 de silenciamento pode ser combinado com outros promotores constitutivos, tecido-preferidos para expressão em plantas. Tais promotores constitutivos incluem, por exemplo, O núcleo promotor do promotor Rsyn7 e outros promotores constitutivos divulgados no Wo 99/43838 e na Patente US No.

6.072.050, o núcleo promotor CaMV 35S (Odell et al. (1985) Nature 313:810 - 812), actina de arroz (McElroy et al. (1990), Plant Cell 2:163-171); ubiquitina (Christensen et al. (1989) Plant Mol. Biol 12:619-632. e Christensen et al. (1992) Plant Mol. Biol. 18:675-689); pEMU (Last et al. (1991) Theor. Appl.

Genet. 81:581-588), MAS (Velten et al. (1984) EMBO J. 3:2723- o 2730 ); promotor ALS (Patente US No. 5.659.026), e assim por diante. Outros promotores constitutivos incluem, por exemplo, Patentes US nºs 5.608.149, 5.608.144, 5.604.121, 5.569.597,

5.466.785, 5.399.680, 5.268.463, 5.608.142 e 6.177.611.

Um promotor induzível, por exemplo, um promotor induzível por patógeno também pode ser empregado. Tais promotores incluem aqueles relacionados com proteínas patogênicas (proteínas PR), que são induzidas após a infecção por um patógeno, por exemplo, proteínas PR, proteínas SAR, beta-l,3-glucanase, quitinase, etc. Veja, por exemplo, Redolfi et al. (1983) Neth. JJ. Plant Pathol. 89:245-254; Uknes et al. (1992) Plant Cell 4:645-656; e

Van Loon (1985) Mol Plant.

Virol. 4:111-116. Veja também WO 99/43819, aqui incorporado por referência.

De interesse são os promotores que são expressos localmente ou perto do sítio de infecção pelo patógeno.

Veja, por exemplo, Marineau et al. (1987) Plant Mol.

Biol. 9:335-342; | Matton et al. (1989) Molecular Plant-Microbe Interactions 2:325-331; Somsisch et al. (1986) Proc.

Natl.

Acad.

Sci.

USA 83:2427-2430; Somsisch et al. (1988) Mol.

Gen.

Conct. 2:93-98; e Yang (1996) Proc.

Natl.

Acad.

Sci.

USA 93:14972-14977. Veja o 10 também, Chen et al. (1996) J.

Plant 10:955-966, Zhang et al. (1994) Proc.

Natl.

Acad.

Sci.

USA 91:2507-2511; Warner et al. (1993) Plant J. 3:191-201; Siebertz et al. (1989) Plant Cell 1:961-968; Patente US No. 5.750.386 (nematodeo-induzível); e as referências citadas nele.

De particular interesse é o promotor induzível para o gene PRms do milho, cuja expressão é induzida pelo patógeno Fusarium moniliforme (ver, por exemplo, Cordero et al. (1992) Physiol.

Mol.

Path Plant. 41:189 -200). Além disso, como patógenos encontram entrada em plantas através de feridas ou danos produzidos por insetos, um promotor induzível por ferida pode ser utilizado nas construções da o invenção.

Tais promotores induzíveis por ferida incluem o gene inibidor da protease de batata (pin II) (Ryan (1990) Ann.

Rev.

Phytopath. 28:425-449, Duan et al. (1996) Nature Biotechnology 14:494-498); wunl e wun2, Patente US No. 5428148, e winl win2 (Stanford et al. (1989) Mol.

Gen . Genet. 215:200-208); systemin (McGurl et al. (1992), Science 225:1570-1573); WIPl (Rohmeier et al. (1993) Plant Mol.

Biol. 22:783-792; Eckelkamp et al . (1993) FEBS Letters 323:73-76); gene MPI (Corderok et al. (1994) J.

Plant 6 (2) :141-150), e assim por diante, aqui incorporados por referência.

Promotores regulados quimicamente podem ser usados para modular a expressão de um gene em uma planta através da aplicação de um regulador químico exógeno. Dependendo do objetivo, o promotor pode ser um promotor induzível por agentes químicos, onde a aplicação do produto químico induz a expressão gênica, ou um promotor repressível por química, onde a aplicação do produto químico reprime a expressão do gene.

Promotores indvzíveis quimicamente cão conheciãos no estado da técnica e incluem, mas não estão limitados a, promotor do milho o 10 I1In2-2, que é ativado por agentes de proteção herbicida benzenosulfonamida, o promotor GST do milho, que é ativado por compostos eletrofílicos hidrofóbicos que são utilizados como herbicidas pré-emergentes, e o promotor PR-la do tabaco, que é ativado pelo ácido salicílico. Outros promotores regulados quimicamente de interesse incluem promotores esteróides- responsivos (ver, por exemplo, o promotor induzível por glicocorticóides em Schena et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci.

E.U.A. 88:10421-10425 e McNellis et al. (1998) J Plant. 14 (2) : 247-257) e promotores induzíveis por tetraciclina e repressíveis por tetraciclina (ver, por exemplo, Gatz et al.

o (1991) Mol. Gen. Genet. 227:229-237, e Patentes US nºs

5.814.618 e 5.789.156), aqui incorporados por referência.

Promotores preferenciais de tecido podem ser utilizados para direcionar uma maior expressão dentro de um tecido de uma planta particular. Promotores preferidos de tecido incluem Yamamoto et al. (1997) Plant J. 12(2): 255-265; Kawamata et al.

(1997) Plant Cell Physiol. 38(7): 792-803; Hansen et al. (1997) Mol. Gen Genet. 254(3):337-343; Russell et al. (1997) Transgenic Res. 6(2):157-168; Rinehart et al . (1996) Plant Physiol. 112(3):1331-1341; Van Camp et al. (1996) Plant Physiol. 112(2):525-535; Canevascini et al . (1996) Plant

Physiol. 112(2):513-524; Yamamoto et al. (1994) Plant Cell Physiol. 35(5):773-778; Lam (1994) Results Probl. Cell Differ. 20:181-196; Orozco et al. (1993) Plant Mol Biol. 23(6):1129- 1138; Matsuoka et al. (1993) Proc Natl. Acad. Sci. USA 90(20):9586-9590; e Guevara-Garcia et al. (1993) Plant JU. 4(3) :495-505. Promotores deste tipo podem ser modificados, se necessário, para a fraca expressão. Promotores preferenciais de folhas são conhecidos na arte. Ver, por exemplo, Yamamoto et al. (1997) Plant J. 12 (2): 255- oe 10 265, Kwon et al. (1994) Plant Physiol. 105:357-67; Yamamoto et al. (1994) Plant Cell Physiol. 35(5):773-778; Gotor et al . (1993) Plant J. 3:509-18; Orozco et al. (1993) Plant Mol. Biol. 23(6):1129-1138; e Matsuoka et al. (1993) Proc. Natl. Acad.

Sci. USA 90(20):9586-9590.

| 15 Promotores preferenciais de raiz são conhecidos e podem ser selecionados entre os muitos disponíveis na literatura ou isolados de novo à partir de várias espécies compatíveis. Ver, por exemplo, Hire et al. (1992) Plant Mol. Biol. 20(2):207-218 (gene glutamina sintetase específico de raiz de soja), Keller e Baumgartner (1991), Plant Cell 3 (10) :1051-1061 (elemento o controle específico de raiz no gene GRP 1,8 do feijão francês); Sanger et al. (1990) Mol Plant. Biol. 14(3):433-443 (promotor específico de raiz do gene manopina Ssintase (MAS) de Agrobacterium tumefaciens) e Miao et al. (1991) Plant Cell 3(1):11-22 (clone de cDNA de comprimento total codificando glutamina sintetase citosólica (GS), que se expressa nas raízes e nódulos de raiz de soja). Veja também Bogusz et al. (1990), Plant Cell 2 (7) :633-641, onde dois promotores específicos de raiz isolados dos genes da hemoglobina a partir de não legumes fixadores de nitrogênio Parasponia andersonii e os respectivos não legumes não fixadores de nitrogênio Trema tomentosa são descritos. Os promotores destes genes foram ligados a um gene repórter fB-glucuronidase e introduzidos em ambos não legume Nicotiana tabacun e da leguminosa Lotus corniculatus, e em ambas a atividade do promotor específico de raiz foi preservada. Leach e Aoyagi (1991) descrevem sua análise dos promotores dos genes de indução de raiz de Agrobacterium rhizogenes altamente expressos rolC e rolD (ver Plant Science | (Limerick) 79 (1) :69-76). Eles concluíram que potenciadores E | determinantes de DNA preferenciais de tecido são dissociados o 10 nestes promotores. Teeri et al. (1989) utilizou fusão do gene lacZ para mostrar que o gene T-DNA de Agrobacterium codificando octopina sintetase é especialmente ativo na epiderme da ponta da raiz e que o gene TR2' é específico da raiz na planta intacta e estimulado por ferimentos no tecido foliar, uma combinação especialmente desejável de características para uso com um gene inseticida ou larvicida (ver EMBO J. 8 (2) :343- 350). O gene TR1I', fundido à nptII (neomicina fosfotransferase II) apresentou características semelhantes. Promotores raiz preferidos adicionais incluem o gene promotor VÍfENOD-GRP3 (Kuster et al. (1995) Plant Mol. Biol. 29 (4) :759-772), e oe promotor rolB (Capana et al. (1994) Plant Mol. Biol. 25 (4): 681-691. Veja também Patentes US nº s 5.837.876, 5.750.386,

5.633.363, 5.459.252, 5.401.836, 5.110.732 e 5.023.179.

Em uma concretização desta invenção, o promotor expressado | 25 por plantas é um promotor específico vascular como um promotor específico de floema. Um promotor “vascular específico”, como utilizado aqui, é um promotor que é, no mínimo, expresso em células vasculares, ou um promotor que é preferencialmente expresso em células vasculares. Expressão de um promotor específico vascular não precisa ser exclusivamente nas células vasculares, expressão em outros tipos de células ou tecidos é possível.

Um “promotor específico de floema”, como aqui utilizado, é um promotor expressável pela planta que é, no mínimo, expresso em células do floema, ou um promotor que é preferencialmente expresso em células de floema.

Expressão de um promotor específico de floema não precisa ser exclusivamente em células de floema, a expressão em outros tipos de células ou tecidos, por exemplo, o tecido do xilema, é possível.

Em uma concretização desta invenção, um promotor específico de floema é um promotor expressável pela planta e o 10 pelo menos expresso nas células do floema, onde à expressão em células de não floema é mais limitada (ou ausente) em comparação com a expressão em células de floema.

Exemplos de | promotores “adequados específico vascular ou específico de floema, de acordo com esta invenção incluem, mas não estão limitados aos promotores selecionados do grupo consistindo em: promotores SCSV3, SCSV4, SCSV5 e SCSV7 (Schunmann et al. (2003) Plant Functional Biology 30:453-60, promotor do gene rolC de Agrobacterium rhizogenes (Kiyokawa et al. ( 1994), Plant Physiology 104:801-02; Pandolfini et al. (2003) Biomedcentral | 20 (BMC) Biotechnology 03:07 (www.biomedcentral.com/1472- | eo 6750/3/7), Graham et al. (1997) Plant Mol.

Biol. 33:729-35; Guivarc'h et al. (1996); Almon et al. (1997) Plant Physiol. 115:1599-607, o promotor do gene rolA de Agrobacterium rhizogenes (Dehio et al. (1993) Plant Mol.

Biol. 23:1199-210), o promotor do gene 5 T-DNA de Agrobacterium tumefaciens (Korber et al. (1991) 10:3983-91 JJ.

EMBO), Oo promotor do gene RSs1l sacarose sintase de arroz (Shi et al. (1994) J.

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Bot. 45:623-31), o promotor Badnavirus de manchas amarelas Commelina ou CoYMV (Medberry et al. (1992), Plant Cell 4:185-92; Zhou et al. (1998) Chin.

J.

Biotechnol. 14:9-16), o promotor CFDV ou vírus da decadência foliar de coco (Rohde et al. (1994) Plant

Mol.

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Genes marcadores selecionáveis são utilizados para a seleção de células ou tecidos transformados.

Genco marcadores incluem genes que codificam resistência aos antibióticos, como as de o 10 codificação da neomicina fosfotransferase II (NEO) e higromicina fosfotransferase (HPT), bem como os genes que conferem resistência a compostos herbicidas, como o glufosinato de amônio, bromoxinil, imidazolinonas, e 2,4- diclorofenoxiacetato (2,4-D). Marcadores selecionáveis adicionais incluem marcadores fenotípicos, tais como B- | galactosidase e as proteínas fluorescentes, como a proteína | verde fluorescente (GFP) (Su et al. (2004) Biotechnol Bioeng 85: 610-9 e Fetter et al. (2004) Plant Cell 16: 215-28), proteína fluorescente ciano (CYP) (Bolte et al. (2004) J.

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A lista acima de genes marcadores de seleção não pretende ser uma limitação.

Qualquer gene marcador selecionável pode ser utilizado na presente invenção.

VI.

Composições compreendendo Elementos de Silenciamento o Um ou mais dos polinucleotídeos compreendendo o elemento de silenciamento podem ser fornecidos como uma composição externa, como um spray ou pó para a planta, parte da planta, semente, uma praga, ou uma área de cultivo.

Em outro exemplo, uma planta é transformada com uma construção de DNA ou cassete de expressão para expressão de pelo menos um elemento de silenciamento.

Em ambas as composições, o elemento de silenciamento, quando ingerido por um inseto, pode reduzir o nível de uma sequência alvo da praga e, assim, controlar a praga (ou seja, qualquer praga da ordem Lepidoptera, como Spodoptera frugiperda). É reconhecido que a composição pode compreender uma célula (como célula vegetal ou uma célula bacteriana), em que um polinucleotídeo que codifica o elemento de silenciamento é estavelmente incorporado no genoma e operacionalmente ligado aos promotores ativos na célula.

Composições que compreendem uma mistura de células, algumas células que expressam pelo menos um elemento de silenciamento também são abrangidas. Em outras concretizações, composições compreendendo os elementos de silenciamento não cstão contidas na célula. Em tais concretizações, a composição pode ser o 10 aplicada a uma área habitada por uma praga. Em uma concretização, à composição é aplicada externamente à uma planta (ou seja, por pulverização de um campo ou área de | cultivo) para proteger a planta da praga.

Em uma concretização, a composição que compreende o elemento de silenciamento que controla uma praga da ordem Lepidoptera, não constitui um oligopeptídeo catiônico heterólogo para facilitar a absorção do RNAi em células de | inseto. Por conseguinte, em tais concretizações, atividade | inseticida ocorre nas composições da invenção (ou seja, a planta, parte da planta, células vegetais, ou micróbios), na o ausência de um oligopeptídeos catiônico que é heterólogo para a planta, parte da planta ou micróbio. O oligopeptídeo catiônico é alvo não-específico e interage não especificamente com o RNA via interações eletrostáticas e neutralização de carga para penetrar as membranas e perder uma atividade específica que promove uma interação específica com uma membrana da célula.

A composição da invenção pode ainda ser formulada como isca. Nesta concretização, as composições compreendem uma substância alimentar ou um atrativo que reforça a atratividade da composição à praga.

A composição que compreende o elemento de silenciamento pode ser formulada em um veículo agriculturalmente adequado e/ou ambientalmente aceitável.

Esses veículos podem ser de qualquer material animal ou vegetal, ou o ambiente a ser tratado pode tolerar.

Além disso, o veículo deve ser tal que à composição permanece eficaz no controle de uma praga.

Exemplos | desses veículos incluem água, soro fisiológico, solução de Ringer, dextrose ou outras soluções de açúcar, solução de Hank, e outras soluções aquosas de sal fisiologicamente equilibradas, o 10 tampão fosfato, tampão bicarbonato e tampão Tris.

Adicionalmente, a composição pode incluir compostos que aumentam a meia-vida de uma composição.

É reconhecido que os polinucleotídeos compreendendo sequências que codificam o elemento de silenciamento podem ser usados para transformar organismos para fornecer ao organismo hospedeiro a produção desses componentes, e posterior aplicação do organismo hospedeiro no ambiente da praga(s) alvo.

Tais organismos hospedeiros incluem baculovírus, bactérias, etc.

Desta forma, a combinação de polinucleotídeos codificando o elemento de silenciamento pode ser introduzida através de um o vetor adequado em um hospedeiro microbiano, e o dito hospedeiro aplicado ao meio ambiente, ou às plantas ou animais. | O termo “introduzido” no contexto da inserção de um ácido | nucléico em uma célula significa “transfecção” ou | 25 “transformação” ou *“transdução” e inclui uma referência à incorporação de um ácido nucléico em uma célula eucariótica ou procariótica, onde o ácido nucléico pode ser estavelmente incorporado no genoma da célula (por exemplo, cromossomo, plasmídeo, plastídeo, ou DNA mitocondrial), convertido em um replicon autônomo ou transitoriamente expresso (por exemplo, MRNA transfectado).

Hospedeiros microbianos que são conhecidos para ocupar a “fitosfera” (filoplano, filosfera, rizosfera e/ou rizoplana) de uma ou mais culturas de interesse podem ser selecionados.

Estes microrganismos são selecionados de modo a serem capazes de competir com sucesso no ambiente específico com os microorganismos do tipo selvagem, prever a manutenção estável e a expressão das sequências de codificação do elemento de silenciamento, e deseiavelmente, proporcionar uma melhor proteção dos componentes da degradação ambiental e inativação. e 10 Tais microorganismos incluem bactérias, algas e fungos.

De particular interesse são os microorganismos como bactérias, por exemplo, Pseudomonas, Erwinia, Serratia, Klebsiella, Xanthomonas, Streptomyces, Rhizobium, Rhodopseudomonas, Methylius, Agrobacterium, Acetobacter, Lactobacillus, Arthrobacter, Azotobacter, Leuconostoc e Alcaligenes, fungos, especialmente leveduras, por exemplo, Saccharomyces, Cryptococcus, Kluyveromyces, Sporobolomyces, Rhodotorula e Aureobasidium.

De particular interesse são tais espécies de bactérias da fitosfera como Pseudomonas syringae, Pseudomonas fluorescens, Serratia marcescens, Acetobacter xylinum, o Agrobacteria, Rhodopseudomonas spheroides, Xanthomonas campestris, Rhizobium melioti, Alcaligenes entrophus, | Clavibacter xyli e Azotobacter vinlandir, e espécies de leveduras da fitosfera como Rhodotorula rubra, R. glutinis, R. marina, R. aurantiaca, Cryptococcus albidus, C. diffluens, C. laurentii, Saccharomyces rosei, S. pretoriensis, S. cerevisiae, Sporobolomyces rosues, S. odorus, Kluyveromyces veronae, &€e Aureobasidium pollulans.

De particular interesse são os microrganismos pigmentados.

Uma série de métodos está disponível para a introdução do polinucleotídeo compreendendo o elemento de silenciamento no

PP o o EE A 3 E A JDTEE A ADOTE EEE EERJ AEE AI 3 EEE 3 EEE A3DIEO E EEE AJ A» AR 45/139 hospedeiro microbiano em condições que permitam a manutenção estável e a expressão de tais nucleotídeos codificando sequências. Por exemplo, cassetes de expressão podem ser construídos, que incluem as construções de nucleotídeo de interesse operacionalmente ligadas com os sinais regulatórios de tradução e transcrição para expressão das construções de nucleotídeo, e uma sequência de nucleotídeos homóloga com uma sequência no organismo hospedeiro, sendo que à integração irá ocorrer, e/ou um sistema de replicação que é funcional no e 10 hospedeiro, em que ou a manutenção estável ou a integração irá ocorrer. Sinais regulatórios transcricionais e traducionais incluem, mas não estão limitados a, promotores, sítios de início da iniciação transcricional, operadores, ativadores, melhoradores, outros elementos regulatórios, sítios de ligação ribossomal, códon de iniciação, sinais de terminação, e assim por diante. Ver, por exemplo, Patentes US nº s 5.039.523 e

4.853.331; EPO 0480762A2; Sambrook et al. (2000); Molecular Cloning: A Laboratory Manual (3 * ed.; Cold Spring Harbor Laboratory Press, Plainview, NY); Davis et al. (1980) Advanced e Bacterial Genetics (Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY), e as referências citadas nele. Células hospedeiras adequadas incluem os procariontes e eucariontes inferiores, tais como fungos. Procariontes ilustrativos, ambos Gram-negativos e Gram-positivos, incluem Enterobacteriaceae, tais como Escherichia, Erwinia, Shigella, Salmonella e Proteus; Bacillaceae; Rhizobiceae, como Rhizobium; | Spirillaceae, como fotobacteria, Zymomonas, Serratia, | Aeromonas, Vibrio, Desulfovibrio, Spirillum; Lactobacillaceae; Pseudomonadaceae, tais como — Pseudomonas e Acetobacter; Azotobacteraceae e Nitrobacteraceae. Entre os eucariontes estão os fungos, como Phycomycetes e Ascomycetes, que incluem leveduras, como Saccharomyces e Schizosaccharomyces; e leveduras Basidiomicetas, tais como Rhodotorula, Aureobasidium, Sporobolomyces, e assim por diante.

Características de interesse particular na seleção de uma célula hospedeira para fins da invenção incluem a facilidade de introdução da sequência de codificação no hospedeiro, a disponibilidade de sistemas de expressão, a eficiência de expressão, a estabilidade no hospedeiro, e a presença de o 10 recursos genéticos auxiliares. Características de interesse para uso, como uma microcápsula pesticida, incluem qualidades protetoras, tais como paredes celulares espessas, pigmentação e acondicionamento "intracelular ou formação de corpos de inclusão; afinidade foliar, ausência de toxicidade em mamíferos; atratividade para as pragas ingerirem, e assim por diante. Outras considerações incluem a facilidade de formulação e manipulação, economia, estabilidade de armazenamento, e assim por diante.

Organismos hospedeiros de interesse particular incluem leveduras, como Rhodotorula Spp., Aureobasidium Spp., e Saccharomyces Spp., e Sporobolomyces Spp., organismos filoplanos como Pseudomonas Spp., Erwinia spp. e Flavobacterium Spp., e outros organismos, incluindo Pseudomonas aeruginosa, | Pseudomonas fluorescens, Saccharomyces cerevisiae, Bacillus thuringiensis, Escherichia coli, Bacillus subtilis, e assim por diante.

As sequências que codificam os elementos de silenciamento abrangidos pela invenção podem ser introduzidas em microrganismos que se multiplicam nas plantas (epífitas) para fornecer esses componentes às pragas-alvo potenciais. Epífitas,

por exemplo, podem ser bactérias gram-positivas Ou gram- negativas.

O elemento de silenciamento pode ser fermentado em uma bactéria hospedeira e as bactérias resultantes processadas e usadas como um spray microbiano da mesma forma que as cepas de | Bacillus thuringiensis têm sido usados como sprays inseticidas.

Qualquer microorganismo adequado pode ser usado para essa finalidade.

Pseudomonas tem sido usadas para EXPpressar | endotoxinas de Bacillus thuringiensis como proteínas [À 10 encapsuladas e as células resultantes processadas e pulverizadas como um inseticida Gaertner et al. (1993), em Advanced Engineered Pesticides, ed.

L.

Kim (Marcel Decker, Inc.). Alternativamente, os componentes da invenção são produzidos pela introdução de genes heterólogos em células hospedeiras.

Expressão de sequências heterólogas resultam, direta ou indiretamente, na produção intracelular do elemento de silenciamento.

Essas composições podem ser formuladas de acordo com técnicas convencionais para aplicação no ambiente hospedando uma praga alvo, por exemplo, solo, água e folhagem o das plantas.

Ver, por exemplo, EPA 0192319, e as referências citadas nela.

Na presente invenção, um microorganismo transformado pode ser formulado com um veículo aceitável separado ou em conjunto com composições que são, por exemplo, uma Suspensão, uma solução, uma emulsão, um talco, um granulado dispersível, um pó molhável, e uma emulsão concentrada, um aerossol, um grânulo impregnado, um adjuvante, uma pasta revestida, e também encapsulações em, por exemplo, substâncias poliméricas.

Tais composições divulgadas acima podem ser obtidas pela adição de um agente ativo de superfície, um veículo inerte, um conservante, um umectante, um estimulante de alimentação, um atrativo, um agente encapsulante, um aglutinante, um emulsificante, um corante, um protetor UV, um tampão, um agente de fluxo ou fertilizante, doadores de micronutrientes, Ou outras preparações que influenciam o crescimento das plantas.

Um Ou mais agroquímicos, incluindo, mas não limitado a, herbicidas, inseticidas, fungicidas, bactericidas, nematicidas, | moluscicidas, acaracidas, reguladores de crescimento vogetal, | auxiliadores de colheita e adubos, podem ser combinados com o 10 veículos, surfactantes ou adjuvantes habitualmente utilizados na técnica de formulação ou outros componentes para facilitar o manuseio do produto e aplicação para pragas-alvo específicas.

Veículos apropriados e adjuvantes podem ser sólidos ou líquidos e corresponden a substâncias normalmente empregadas em tecnologia da formulação, por exemplo, natural ou substâncias minerais regeneradas, solventes, dispersantes, agentes umectantes, unificadores, ligadores, ou fertilizantes. Os ingredientes ativos da presente invenção (ou seja, pelo menos um elemento de silenciamento) são normalmente aplicados na forma de composições e podem ser aplicados na área de lavoura, o planta ou semente a ser tratada. Por exemplo, as composições podem ser aplicadas ao grão em preparação ou durante o | armazenamento em uma caixa de grãos ou silo, etc. As composições podem ser aplicadas simultaneamente ou em sucessão | 25 com outros compostos. Métodos de aplicação de um ingrediente ativo ou uma composição que contém pelo menos um elemento de silenciamento incluem, mas não estão limitados a, aplicação foliar, revestimento de sementes e aplicação no solo. O número de aplicações e a taxa de aplicação dependem da intensidade de infestação pela praga correspondente.

Agentes tensoativos apropriados incluem, mas não estão limitados a, compostos aniônicos como um carboxilato de, por exemplo, um metal; carboxilato de uma cadeia longa de ácidos

| graxos, um N-acilsarcosinato, mono- ou di-ésteres de ácido

| 5 fosfórico com etoxilatos de álcool graxo ou sais de ésteres de tal; sulfatos de álcoois graxos, tais como dodecil sulfato de

| sódio, octadecil sulfato de sódio, ou cetil sulfato de sódio;

sulfato de álcool graxo etoxilado: sulfatos alquilfenóis

| etoxilados, sulfonatos de lignina; sulfonatos de petróleo;

o 10 alquil aril sulfonato como alquil-benzeno sulfonatos Ou alquilnaftalenos sulfonatos inferiores, por exemplo, butil

| naftaleno sulfonato, sais de naftaleno formaldeído sulfonato condensados; sais de fenol-formaldeído sulfonatos condensados,

| sulfonatos mais complexos, como amido sulfonatos, por exemplo, o produto da condensação sulfonatada de ácido oléico e N-metil | taurina; ou os dialquil sulfosuccinatos, por exemplo, O sulfonato de sódio ou dioctil succinato.

Agentes não-iônicos incluem produtos de condensação de ésteres de ácidos graxos,

álcoois graxos, amidos de ácidos graxos ou alquil-graxo ou fenóis substituídos por alquenil com óxido de etileno, ésteres o graxos de éteres de álcool poliídrico, por exemplo, ésteres de ácidos graxos sorbitana, produtos da condensação de tais ésteres com óxido de etileno, por exemplo, ésteres de ácidos graxos polioxietileno de sorbitana, copolímeros em bloco de óxido de etileno e óxido de propileno, glicóis acetilênicos como 2,4,7,9-tetraetila-5S-decin-4,7-diol, ou etoxilados glicóis acetilênicos.

Exemplos de um agente ativo de superfície catiônica incluem, por exemplo, um alifático mono-, di- ou poliaminas, tais como acetato, naftaleno ou oleato, ou amina contendo oxigênio como um óxido de amina de polioxietileno alquilamina, uma amina ligada a amida preparada pela condensação de um ácido carboxílico com uma di- ou poliamina, ou um sal de amônio quaternário.

Exemplos de materiais inertes incluem, mas não estão limitados a, minerais inorgânicos tais como caulim, filossilicatos, carbonatos, sulfatos, fosfatos, ou materiais | botânicos como cortiça, sabugo de milho em pó, casca de | amendoim, casca de arroz e cascas de nozes.

As composições compreendendo o elemento de silenciâmento podem ser uma forma adequada para aplicação direta ou como um o 10 concentrado da composição primária que requer diluição com uma quantidade adequada de água ou outro diluente antes da aplicação.

As composições (incluindo os microorganismos transformados) podem ser aplicadas no ambiente de uma praga de inseto (como uma praga da ordem Lepidoptera) por, por exemplo, pulverização, atomização, sovação, dispersão, revestimento Ou vazamento, introduzindo dentro ou no solo, introduzindo na água de irrigação, por tratamento de sementes ou aplicação geral ou pó no momento em que à praga começou a aparecer ou antes do aparecimento de pragas como uma medida de proteção.

Por o exemplo, a composição(s) e/ou microorganismo(s) transformado podem ser misturados com os grãos para proteger o grão durante o armazenamento.

Geralmente, é importante obter um bom controle de pragas nos estágios iniciais de crescimento da planta, pois este é o momento em que à planta pode ser mais severamente danificada.

As composições podem convenientemente conter outro inseticida se este for considerado necessário.

Em uma concretização da invenção, a composição(s) é aplicada diretamente ao solo, em uma época de plantio, na forma granular de uma composição de um veículo e células mortas de uma cepa de Bacillus ou microorganismo transformado da invenção.

Outra concretização é uma forma granular de uma composição que compreende um agroquímico, como, por exemplo, um herbicida, um inseticida, um adubo, em um veículo inerte, e células mortas de uma cepa de Bacillus ou microorganismo transformado da invenção.

VII. Plantas, partes das plantas, e métodos de introdução de sequências em Plantas Em uma concretização, os métodos da invenção envolvem a o 10 introdução de um polipeptídeo ou polinucleotídeo em uma planta. “Introdução” destina-se a significar a apresentação da planta ao polinucleotídeo ou polipeptídeo de tal forma que à sequência ganhe acesso ao interior de uma célula da planta. Os métodos da invenção não dependem de um método especial para a introdução de uma sequência em uma planta, só que o polinucleotídeo ou polipeptídeo ganhe acesso ao interior de, pelo menos, uma célula da planta. Métodos para a introdução de polinucleotídeo ou polipeptídeos em plantas são conhecidos na arte, incluindo, | mas não limitado a métodos de transformação estável, métodos de transformação transitória, e métodos mediados por vírus.

o “Transformação estável” destina-se a significar que a construção de nucleotídeo introduzida em uma planta integra no genoma da planta e é capaz de ser herdada pelos descendentes da mesma. “Transformação transitória” destina-se a significar que um polinucleotídeo é introduzido na planta e não se integra no genoma da planta ou um polipeptídeo é introduzido em uma planta.

Protocolos de transformação, bem como protocolos para a introdução de polipeptídeos ou sequências polinucleotídicas em plantas podem variar dependendo do tipo de planta ou célula de planta, ou seja, monocotiledônea ou dicotiledônea, orientada para a transformação. Métodos adequados de introdução de polipeptídeos e polinucleotídeos em células vegetais incluem microinjeção (Crossway et al. (1986) Biotechniques 4:320-334), eletroporação (Riggs et al. (1986) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 83:5602-5606, transformação mediada por Agrobacterium (Patente US No. 5.563.055 e Patente US No. 5.981.840), transferência direta do gene (Paszkowski et al. (1984) EMBO J. 3:2717-2722) e aceleração de partículas balísticas (ver, por cxempio, Fáleuile US nºs 4.945.050; Patente US No. 5.879.918; Patente US Nos.

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Em concretizações específicas, as coquências de elemento de silenciamento da invenção podem ser fornecidas a uma planta o 10 usando uma variedade de métodos de transformação transiente.

Tais métodos transientes incluem, mas não estão limitados a, introdução das proteínas ou variantes e fragmentos desses | diretamente na planta ou a introdução do transcrito na planta.

Tais métodos incluem, por exemplo, microinjeção ou bombardeamento de partículas.

Veja, por exemplo, Crossway et al. (1986) Mol Gen.

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Alternativamente, polinucleotídeos podem ser o transitoriamente transformados em plantas, utilizando técnicas conhecidas na arte.

Essas técnicas incluem o sistema de vetor viral e a precipitação do polinucleotídeo de uma forma que se opõe a posterior liberação do DNA.

Assim, a transcrição do DNA ligado à partícula pode ocorrer, mas a frequência com que é liberado para se integrar ao genoma é bastante reduzida.

Tais métodos incluem o uso de partículas revestidas com polietilimina (PEI; Sigma * P3143). Em outras concretizações, o polinucleotídeo da invenção pode ser introduzido em plantas colocando as plantas em contato com um vírus ou ácidos nucleicos virais.

Geralmente, esses métodos envolvem incorporação de uma construção de nucleotídeo da invenção dentro de um DNA viral ou uma molécula de RNA. Além disso, é reconhecido que os promotores da invenção abrangem também os promotores utilizados para a transcrição pelas RNA polimerase virais. Métodos para a introdução de polinucleotídeos em plantas e expressão de uma proteína codificada nele, envolvendo DNA viral ou moléculas de RNA, são conhecidos na arte, Veja, por exomplo, Fatentes US nº s.

5.889.191, 5.889.190, 5.866.785, 5.589.367, 5.316.931 e Porta e 10 et al. (1996), Molecular Biotechnology 5:209-221, aqui incorporados por referência. | Métodos são conhecidos no estado da técnica para a inserção de um polinucleotídeo alvo em um local específico no | genoma da planta. Em uma concretização, a inserção do polinucleotídeo em um local genômico desejado é conseguida através de um sistema de recombinação sítio específico. Ver, por exemplo, WO99/25821, WO99/25854, WO99/25840, WO99/25855 e WO99/25853, os quais são aqui incorporados por referência. Resumidamente, o polinucleotídeo da invenção pode estar contido no cassete de transferência ladeado por dois sítios de oe recombinação não recombinagênicos. O cassete de transferência é introduzido em uma planta tendo incorporado de forma estável no seu gench.a um sítio alvo que é ladeado por dois sítios de recombinação não recombinagênicos que correspondem aos sítios do cassete de transferência. Uma recombinase adequada é fornecida e o cassete de transferência é integrado no local de destino. O polinucleotídeo de interesse é, assim, integrado em uma posição cromossômica específica no genoma da planta. As células que foram transformadas podem ser cultivadas em plantas de acordo com métodos convencionais. Veja, por exemplo, McCormick et al. (1986) Plant Cell Reports 5:81-84. Essas plantas podem ser cultivadas, e polinizadas com à mesma cepa transformada ou cepas diferentes, e os descendentes resultantes tendo expressão constitutiva da característica fenotípica desejada identificada.

Duas ou mais gerações podem ser cultivadas para garantir que a expressão da característica fenotípica desejada seja mantida de forma estável e herdada e, em seguida, as sementes colhidas para garantir que a expressão da característica fenotípica desejada coja alcançada.

Desta forma, a presente invenção fornece sementes transformadas e 10 (também "conhecidas como “sementes transgênicas”) com um polinucleotídeo da invenção, por exemplo, um cassete de | expressão da invenção, estavelmente incorporado ao seu genoma.

Como usado aqui, o termo planta inclui células vegetais, protoplastos vegetais, cultura de células do tecido vegetal a partir da qual as plantas podem ser regeneradas, calos de plantas, pedaços de plantas e células vegetais que são intactas nas plantas ou partes de plantas, tais como embriões, pólen, óvulos, sementes, folhas, flores, galhos, frutos, sementes, grãos, espigas, cascas, caules, raízes, pontas de raízes, anteras e assim por diante.

Grãos destinam-se a significar a oe semente madura produzida por agricultores comerciais para fins de crescimento ou reprodução das espécies.

Descendentes, variantes, e mutantes das plantas regeneradas também estão incluídos no âmbito da invenção, desde que essas partes contenham os polinucleotídeos introduzidos.

A presente invenção pode ser utilizada para transformação de qualquer espécie vegetal, incluindo, mas não limitada a, monocotiledôneas e dicotiledôneas.

Exemplos de espécies de plantas de interesse incluem, mas não estão limitados a, milho (Zea mays), Brassica sp. (por exemplo, B. napus, B. rapa, B. juncea), em particular as espécies de Brassica úteis como fontes de óleo de semente, alfafa (Medicago sativa), arroz (Oryza sativa), centeio (Secale cereale), sorgo (Sorghum bicolor, Sorghum vulgare), milho (ex.: milheto (Pennisetum glaucum), milheto proso (Panicum miliaceum), milheto foxtail (Setaria italica), capim (Eleusine coracana), girassol (Helianthus annuus), cártamo (Carthamus tinctorius), trigo (Triticum aestivum), soja (Glycine max), tabaco (Nicotiana tabacum), batata (Solanum tuberosum), amendoim (Arachis hypogaea), algodão (Gossypium barbadense, Gossypium hirsutum), [ 10 batata-doce (Ipomoea batatus), mandioca (Manihot esculenta) , café (Coffea spp.) coco (Cocos nucifera), abacaxi (Ananas comosus), citros (Citrus spp.), cacau (Theobroma cacao), chá (Camellia sinensis), banana (Musa spp.), abacate (Persea americana), figo (Ficus casica ), guava (Psidium guajava), mango (Mangifera indica), oliva (Olea europaea), papaia (Carica papaya), caju (Anacardium occidentale), macadâmia (Macadamia integrifolia), nozes (Prunus —amygdalus), beterraba (Beta vulgaris), cana (Saccharum Spp.), aveia, cevada, legumes, plantas ornamentais, e coníferas.

Vegetais incluem tomates (Lycopersicon esculentum), alface eo (por exemplo, Lactuca sativa), feijão (Phaseolus vulgaris), feijão Lima (Phaseolus limensis), ervilhas (Lathyrus SPpp.), e membros do gênero Cucumis, como pepino (C. sativus), melão (C. cantalupensis) e melão cantaloupe (C. melo). Ornamentais incluem Azaléia (Rhododendron spp.), hortênsia (Hydrangea macrophylla), hibisco (Hibiscus rosasanensis), rosas (Rosa Spp.), tulipas (Tulipa spp.), narcisos (Narcissus Spp.), petúnias (Petunia hybrida), cravos (Dianthus caryophyllus), poinsétia (Euphorbia pulcherrima) e crisântemo.

Coníferas que podem ser empregadas na prática da presente invenção incluem, por exemplo, pinheiros, como mudas de pinus

(Pinus taeda), corte de pinus (Pinus elliotti), pinheiro ponderosa (Pinus ponderosa), pinheiro lodgepole (Pinus contorta), e o pinheiro de Monterey (Pinus radiata), Douglas- fir (Pseudotsuga menziesii); cicuta ocidental (Tsuga canadensis); Sitka spruce (Picea glauca); sequóia (Sequoia sempervirens), abetos verdadeiros, tais como abeto prata (Abies amabilis) e abeto balsâmico (Abies balsamea); e cedros, como cedro vermelho ocidental (Thuja plicata) e cedro-âmareio do Alaska (C hamaecyparis nootkatensis). Em concretizações o 10 específicas, as plantas da presente invenção são plantas de cultivo (por exemplo, milho, alfafa, girassol, Brassica, soja, algodão, cártamo, amendoim, sorgo, trigo, milho, tabaco, etc). Em outras concretizações, as plantas de milho e soja são ótimas, e ainda outras plantas de milho das concretizações são ótimas.

Outras plantas de interesse incluem plantas de grão que fornecem sementes de interesse, plantas, sementes oleaginosas e leguminosas. Sementes de interesse incluem sementes de grãos, como milho, trigo, cevada, arroz, sorgo, centeio, etc. Plantas de óleo de sementes incluem algodão, soja, cártamo, girassol, e Brassica, milho, alfafa, palma, coco, etc. Plantas leguminosas incluem feijão e ervilhas. Feijões incluem guar, alfarroba, feno-grego, soja, feijão de jardim, feijão fradinho, feijão-da- china, feijão lima, feijão fava, lentilhas, grão de bico, etc VIII. Métodos de uso Os métodos da invenção incluem métodos para controlar uma praga (ou seja, praga da ordem Lepidoptera, como Spodoptera frugiperda). O método inclui a alimentação de uma composição a uma praga que inclui um elemento de silenciamento da invenção, em que o dito elemento de silenciamento, quando ingerido por uma praga (ou seja, pragas da ordem Lepidoptera, como Spodoptera frugiperda), reduz o nível de um polinucleotídeo- alvo da praga e, assim, controla a praga.

A praga pode ser alimentada com o elemento de silenciamento numa variedade de maneiras.

Por exemplo, em uma concretização, o polinucleotídeo compreendendo o elemento de silenciamento é introduzido em uma planta.

Como à Lepidoptera se alimenta na planta ou parte dela expressando estas sequências, o clomento de silenciamento éÉ entregue à praga.

Quando o elemento de silenciamento é entregue e 10 a planta dessa forma, reconhece-se que o elemento de silenciamento pode ser expresso constitutivamente ou, alternativamente, pode ser produzido em uma forma de fase específica, utilizando os vários promotores induzíveis Ou tecido preferidos ou desenvolvidamente regulados que são discutidos no presente documento.

Em concretizações específicas, o elemento de silenciamento expresso nas raízes, caule ou haste, folha incluindo pedúnculo, xilema e floema, frutos ou tecidos reprodutivos, seda, flores e todas as partes dela ou em qualquer combinação.

Em outro método, uma composição que compreende pelo menos eo um elemento de silenciamento da invenção é aplicada à uma planta.

Em tais concretizações, o elemento de silenciamento pode ser formulado em um veículo agronomicamente adequado e/ou | ambientalmente aceitável, que é de preferência, adequado para a dispersão em campos.

Além disso, o veículo pode incluir também os compostos que aumentam à meia vida da composição.

Em concretizações específicas, a composição que compreende oO elemento de silenciamento é formulada de modo tal que persiste no meio ambiente por um período de tempo suficiente para permitir que ela seja entregue à uma praga.

Em tais concretizações, a composição pode ser aplicada a uma área habitada por uma praga. Em uma concretização, a composição é aplicada externamente em uma planta (ou seja, pulverizando um campo) para proteger à planta de pragas. Em certas concretizações, as construções da presente invenção podem ser empilhadas com qualquer combinação de | sequências de polinucleotídeo de interesse a fim de criar plantas com uma característica desejada. Uma característica, como aqui utilizada, refere-se ao fenótipo derivado de uma sequência particular ou grupos de sequências. o 10 Por exemplo, os polinucleotídeos da presente invenção podem ser empilhados com quaisquer polinucleotídeos codificando polipeptídeos tendo atividade pesticida e/ou inseticida, tais como outras proteínas tóxicas de Bacillus thuringiensis (descritas nas Patentes US nºs 5.366.892, 5.747.450, 5.737.514,

5.723.756; 5.593.881, e Geiser et al. (1986) Gene 48:109), lectinas (Van Damme et al. (1994) Plant Mol. Biol. 24:825, pentina (descrita na Patente US No. 5.981.722), e assim por diante. As combinações geradas também podem incluir várias cópias de qualquer um dos polinucleotídeos de interesse. Os polinucleotídeos da presente invenção também podem ser | e guardados em qualquer outro gene ou combinação de genes para produzir plantas com uma variedade de combinações de características desejadas, incluindo mas não limitada a, características desejáveis para alimentação animal, tais como genes de óleo superior (por exemplo, Patente US No. 6.232.529); aminoácidos equilibrados (por exemplo, ácidos, hordotioninas (Patentes US nºs 5.990.389, 5.885.801, 5.885.802 e 5.703.409); lisina superior de cevada (Williamson et al. (1987) Eur. JJ. Biochem 165:99-106.; e WO 98/20122) e proteínas superiores de | 30 metionina (Pedersen et al. (1986) J. Biol. Chem. 261:6279; | Kirihara et al. (1988), Gene 71:359; e Musumura et al. (1989)

Plant Mol. Biol. 12:123)); digestibilidade aumentada (por exemplo, modificação de proteínas de armazenamento (Pedido US No. de Série 10/053,410, depositado em 7 de novembro de 2001) e tioredoxinas; (Pedido US No. de Série 10/005, 429, depositado em 03 de dezembro de 2001)), a divulgação que estão aqui incorporadas por referência.

Os polinucleotídeos da presente invenção também podem ser empilhados com características decejáveis para a doença uu a | resistência a herbicidas (por exemplo, genes de desintoxicação | oe 10 da fumonisina (Patente US No. 5.792.931); avirulência e genes de resistência a doença (Jones et al. (1994) Science 266:789; Martin et al. (1993), Science 262:1432; Mindrinos et al. (1994) Cell 78:1089); mutantes de acetolactato sintase (ALS) que levam à resistência a herbicidas, como mutações S4 e/ou Hra; inibidores da glutamina sintetase como fosfinotricina ou basta (por exemplo, gene bar); e resistência ao glifosato (gene EPSPS)), e características desejáveis para processamento ou transformação de produtos como óleo superior (por exemplo, Patente US No. 6.232.529), óleos modificados (por exemplo, genes desaturase de ácidos graxos (Patentes US No. 5.952.544; [ O) WO 94/11516)); amidos modificados (por exemplo, pirofosforilases ADPG (AGPase), sintases de amido (SS), enzimas de ramificação de amido (SBE), e enzimas desramificadoras de | amido (SDBE)) e polímeros ou bioplásticos (por exemplo, Patente | 25 US No. 5.602,321 beta-cetotiolase, polihidroxibutirato-sintase, e acetoacetil-CoA redutase (Schubert et al. (1988) 4&.

Bacteriol. 170:5837-5847) facilitam a expressão de polihidroxialcanoatos (PHAS)), a divulgação é aqui incorporada por referência. Poderíamos também combinar os polinucleotídeos da presente invenção com polinucleotídeos fornecendo características agronômicas, tais como esterilidade masculina

(por exemplo, ver Patente US No. 5.583.210), robustez do caule, tempo de florescimento ou características de tecnologias de transformação, tais como regulação do ciclo celular ou gene alvo (por exemplo, WO 99/61619, WO 00/17364 e WO 99/25821), as divulgações que estão aqui incorporadas por referência.

Essas combinações empilhadas podem ser criadas por qualquer método, incluindo, mas não limitado a, plantas de polinização cruzada por qualquer metodologia convencional OU topcrosses, ou transformação genética. Se as sequências são o 10 empilhadas por transformar geneticamente as plantas, as sequências de polinucleotídeo de interesse podem ser combinadas | em qualquer momento e em qualquer ordem. Por exemplo, uma | planta transgênica que compreende uma ou mais características | desejadas pode ser usada como alvo para introduzir novas | características de transformação subsequente. As características podem ser introduzidas simultaneamente em um protocolo de co-transformação, com os polinucleotídeos de interesse previstos por qualquer combinação de cassetes de transformação. Por exemplo, se duas sequências serão introduzidas, as duas sequências podem estar contidas em e cassetes de transformação separados (trans) ou contidos no mesmo cassete de transformação (cis). Expressão das sequências pode ser dirigida pelo mesmo promotor ou por promotores diferentes. Em certos casos, pode ser desejável introduzir um cassete de transformação que irá suprimir a expressão do polinucleotídeo de interesse. Isto pode ser combinado com qualquer combinação de outros cassetes de supressão ou cassetes de superexpressão para gerar a combinação desejada de características da planta. É igualmente reconhecido que as sequências de polinucleotídeo podem ser empilhadas em um genoma local desejado através de um sistema de recombinação sítio-

específico.

Veja, por exemplo, WO99/25821, WO99/25854, WO99/25840, WO99/25855, e MW099/25853, os quais são aqui incorporados por referência.

Métodos e composições são ainda fornecidos para permitir um aumento de RNAi produzido a partir do elemento de silenciamento.

Em tais concretizações, os métodos e composições utilizam um primeiro polinucleotídeo compreendendo um elemento de silenciamento de uma sequência-alvo da praga operacionalmente ligado a um promotor ativo na célula vegetal o 10 e, um segundo polinucleotídeo compreendendo um elemento melhorador de supressão compreendendo a sequência-alvo da praga, ou uma variante ativa Ou fragmento do mesmo operacionalmente ligado a um promotor ativo nas células | vegetais.

A expressão combinada do elemento de silenciamento com um elemento potenciador supressor leva a um aumento do RNA inibitório produzido a partir do elemento de silenciamento alcançável apenas com à expressão do elemento de silenciamento sozinho.

Além do aumento crescente das espécies determinadas de | RNAi em si, os métodos e as composições permitem ainda a produção de uma população diversificada de espécies de RNAi que e podem aumentar a eficácia de interrupção da expressão do gene alvo.

Como tal, quando o elemento potenciador supressor é expresso em uma célula vegetal, em combinação com o elemento de silenciamento, os métodos e a composição podem permitir a produção sistêmica de RNAi em toda a planta; a produção de | maiores quantidades de RNAi que seria observada apenas com a | construção do elemento de silenciamento sozinho, e, a carga melhorada de RNAi para o floema da planta, proporcionando assim um melhor controle da alimentação de floema pelos insetos através de um RNAi.

Assim, os vários métodos e composições proporcionam métodos melhores para a entrega de RNA inibidores | | ao organismo alvo.

Veja, por exemplo, Pedido Provisório US nº 61/021,676, “Compositions and Methods for the Suppression of Target Polynucleotides”, depositado em 17 de janeiro de 2008 e aqui incorporada por referência, na sua totalidade.

Como usado aqui, um *“elemento potenciador supressor” compreende um polinucleotídeo compreendendo a sequência alvo a ser suprimida ou um fragmento ativo ou uma variante da mesma.

É reconhecido que o elemento potenciador supressor não precisa ser idêntico à sequência alvo, mas sim, o supressor elemento o 10 potenciador pode incluir uma variante da sequência alvo, enquanto o elemento potenciador supressor tem identidade de sequência suficiente para a sequência alvo para permitir um aumento do nível do RNAi produzido pelo elemento de silenciamento viavelmente apenas com a expressão do elemento de | silenciamento.

Da mesma forma, o elemento potenciador supressor pode incluir um fragmento da sequência alvo, onde o fragmento é de comprimento suficiente para permitir um aumento do nível do RNAi produzido pelo elemento de silenciamento viavelmente apenas com a expressão do elemento de silenciamento.

Assim, em concretizações específicas, o elemento potenciador Supressor ) compreende um fragmento ou uma variante de um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo do hormônio juvenil, um polipeptídeo vacuolar, um polipeptídeo caderina, um polipeptídeo de cutícula, um fator de iniciação da tradução, um polipeptídeo SARI1, um fator de alongamento, um fosfooligosacarídeo, um polipeptídeo miosina, um transportador de aminoácidos do canal de potássio, um polipeptídeo retificador de potássio internamente, um transportador de aminoácidos, um polipeptídeo tubulina, um polipeptídeo ubiquitina, ribonucleoproteina nuclear de pequeno porte, Ou qualquer outro polinucleotídeo de interesse divulgado aqui.

Ainda em outras concretizações, o elemento —.potenciador Ssupressor compreende um polinucleotídeo estabelecido na SEQ ID NO: 10-50 ou uma variante ativa ou fragmento do mesmo.

Reconhece-se que vários elementos potenciadores —supressores da mesma sequência alvo ou a partir de sequências- alvo diferentes, ou de diferentes regiões da mesma sequência alvo podem ser empregados.

Por exemplo, os elementos potenciadores supressores empregados podem incluir fragmentos da sequência-alvo derivada de diferentes regiões da sequência e 10 alvo (ou seja, a partir de 3 'UTR, sequência de codificação, intron, e/ou 5'UTR). Além disso, o elemento potenciador supressor pode estar contido em um cassete de expressão, conforme já descrito aqui, e em concretizações específicas, o elemento potenciador supressor é no mesmo ou em um vetor de DNA diferente ou constructo como elemento de silenciamento.

O elemento potenciador supressor pode ser operacionalmente ligado a um promotor como divulgado aqui.

Reconhece-se que o elemento potenciador supressor pode ser expresso constitutivamente ou alternativamente, pode ser produzido em uma forma de fase específica empregando os vários promotores induzíveis ou o tecido-preferidos ou desenvolvidamente regulados que são discutidos no presente documento.

Em concretizações específicas, empregando "tanto um elemento de silenciamento e o elemento potenciador supressor a produção sistêmica de RNAi ocorre através da planta inteira.

Em outras concretizações, as plantas ou partes das plantas da invenção têm uma carga melhorada de RNAi no floema da planta que seria observada com a expressão da construção do elemento de silenciamento sozinho e, assim, proporcionando um melhor controle de floema de alimentação dos insetos através de um RNAi.

Em concretizações específicas, as plantas, partes de plantas e células vegetais da invenção podem ainda ser caracterizadas como uma permissão para à produção de uma diversidade de espécies de RNAi que pode aumentar à eficácia de interrupção da expressão do gene alvo.

Em concretizações específicas, a expressão combinada do elemento de silenciamento e o elemento potenciador supressor aumenta a concentração de RNA inibitório na célula vegetal, planta, parte da planta, tecido de planta ou floema em relação ao nível que é atingido quando o elemento de silenciamento é o 10 expresso por si só.

Como usado aqui, um “aumento do nível de RNA inibidor” compreende qualquer aumento estatisticamente significativo no nível de RNAi produzido em uma planta tendo à expressão | combinada quando comparada com uma planta controle adequada. | 15 Por exemplo, um aumento no nível do RNAi na planta, parte da planta ou célula vegetal pode incluir pelo menos cerca de 1%, cerca de 1% -5%, cerca de 5% -10%, cerca de 10% -20%, cerca de 20% -30%, cerca de 30% -40%, cerca de 40% -50%, cerca de 50% - 60%, cerca de 60-70%, cerca de 70% -80%, cerca de 80% -90%, cerca de 90% -100% ou mais de aumento no nível do RNAi na oe planta, parte da planta, células vegetais, ou floema, quando comparado a um controle adequado. Em outras concretizações, O aumento do nível do RNAi na planta, parte da planta, células vegetais, ou floema pode comportar pelo menos cerca de 1 vez, cerca de 5 vezes, cerca de 5 vezes -10 vezes, cerca de 10 vezes -20 vezes, cerca de 20 vezes -30 vezes, cerca de 30 vezes -40 vezes, cerca de 40 vezes -50 vezes, cerca de 50 vezes -60 vezes, cerca de 60 vezes -70 vezes, cerca de 70 vezes -80 vezes, cerca de 80 vezes -90 vezes, cerca de 90 vezes -100 vezes ou mais de aumento do RNAi na planta, parte da planta, célula vegetal ou floema, quando comparado a um controle apropriado. Métodos de ensaio de controle do nível para um aumento do nível de RNAi são discutidos em outro lugar neste documento. Os exemplos a seguir são oferecidos a título de ilustração, e não por meio de limitação.

EXPERIMENTAL Exemplo 1. Genes-alvo específicos e elementos de silenciamento | que causam atividade inseticida contra Spodoptera frugiperda. | oe 10 Perturbação da função do gene do inseto através do RNAi pode produzir atividade específica contra os insetos-alvo. Esta especificidade é reforçada mediante a entrega dos dsRNAs através de plantas transgênicas. Identificação da função do gene em insetos através de RNAi tem sido largamente limitada a injeção de dsRNAS. Na verdade, as experiências passadas indicam que os insetos não são capazes de uma resposta sistêmica ao RNAi com base na exposição de dsRNAs. Conforme descrito abaixo, nós demonstramos atividade aguda de vários pares de dsRNA através de experimentos de injeção e, adicionalmente, temos demonstrado antagonismo ao inseto através o da ingestão de dsRNAs. Esta evidência identifica várias combinações de genes/pares de primers com claras propriedades inseticidas. O uso de dsRNAs em plantas transgênicas também aborda a complicação potencial de expressão de proteínas heterólogas e os possíveis riscos de reação alérgica, atividade não-alvo e bioacumulação ou acumulação ambiental. Os dados apresentados a seguir representam o primeiro teste de ruptura destes genes particulares, resultando em atividade inseticida em organismos inteiros e os primeiros relatórios da atividade inseticida de dsRNASs contra Spodoptera frugiperda.

A invenção descreve genes-alvo específicos e sequências de dsRNA “causando atividade inseticida contra Lepidópteros

Spodoptera frugiperda por interferência de RNA na expressão do gene alvo.

O rompimento dos genes alvo pelas sequências de dsRNA pode ser amplamente inseticida em numerosas espécies.

AS sequências específicas de dsRNA mostram atividade inseticida sobre a ingestão e podem ser utilizadas com um modo de entrega de plantas transgênicas, A Tabela 1 apresenta o polinucieotideo de exemplos não-limitantes da sequência alvo de Spodoptera oe 10 frugiperda, uma breve descrição da função da proteína | codificada pela sequência alvo, e uma SEQ ID NO.

A Tabela 2 | apresenta um resumo dos primers usados para suprimir os polinucleótidos alvo. | o

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Ensaio de alimentação gotículas para avaliação das propriedades inseticidas de 21mer dsRNA contra a lagarta-do- cartucho Spodoptera frugiperda Quantidades de 10 nanoMole de primers 21mer desalgados foram adquiridas da Proligo (Sigma Aldrich, St.

Louis, MS). A amostra liofilizada é solúvel em água livre de nuclease, na concentração de 100uMolar.

A solução estoque foi então diluída em 20% de sacarose contendo corante de alimentos azul McCormick.

Gotas de 0.5 ul desta solução foram dispensadas em um círculo em uma placa de petri de 65 mm selada com o parafilme.

Sacarose branca foi usada como controle.

Entre 20 e 30 lagartas-do-cartucho neonatas foram adicionadas ao meio do círculo de gotas e as placas de petri seladas com parafilme.

Depois de duas horas, as neonatas com trato digestivo azul foram retiradas e colocadas em dieta padrão de insetos lepidópteros multiespecíficos.

Insetos foram avaliados em 48, 72 e 96 horas após o desafio para mortalidade e inibição do crescimento.

Ensaios de diluição serial começando com uma dose elevada de 20uM e incluindo as concentrações 10, 5, 2,5, 1,25, 0,6 e O uMolar também foram realizados dessa maneira. o Tabela 3. RR vv A Repni | Rep2 [ | Média de Média Primer Insetos | Peso | Insetos | de Peso Média ' É tratados | 72H |tratados| 72H combinada Hormônio juvenidiolkimase | —9 | fo [| mM [ mm | m ) | —g3 | Hormônio juvenidiolkinase | 15 | 1º | TE [er TT 3) [ or vATPasesubundadeA — [ 14 | ta | 1 | 15 | 4 Proteína hipotética conservada 16 Sequência nova (proteína 107 | cuticular?) 14 15 14 Fator de iniciação 115 | eucariótica 4A 16 14 Protemaputatvasart — | 16 | 18 | 16 [| 17 | 76

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Lagartas recém-eclodidas foram alimentadas com 25 uMolar de dsRNASs.

Insetos tratados foram pesados em massa em 72 horas e comparados com os controles de sacarose. 2 repetições do o experimento foram calculadas.

Ensaio de alimentação por injeção para avaliação das propriedades inseticidas de 21mer dsRNA contra a lagarta-do- cartucho Spodoptera frugiperda Lagartas de segundo ínstar foram injetadas com um micromanipulador e agulhas de microinjeção puxadas em um instrumento de Sutter (Novato, CA) extrator de agulha horizontal P-2000. A agulha estava de volta carregada com uma solução de dsRNA.

Experimentos iniciais de injeção utilizaram uma concentração de 2ug/ul (ver Tabela X). Esta taxa produziu elevada taxa de mortalidade em todos os primers testados. o Ensaios posteriores foram realizados com concentrações mais baixas.

Corante alimentar azul de McCormick foi incluído na solução de dsRNA para visualizar melhor o processo de injeção.

Antes da injeção, os insetos foram afixados a um slide microscópico usando um bastão de cola (Office Depot, Delray Beach, FL). A agulha da injeção foi conectada a uma seringa hipodérmica de 20mL através de um tubo de Teflon.

A agulha da injeção foi então montada em um micromanipulador Leitz.

A solução de dsRNA foi dispensada da agulha de microinjeção pela pressão do êmbolo da seringa de 20mL.

Volumes de injeção foram variáveis, mas em média cerca de 250nL (baseada na injeção de cerca de 20 insetos injetados a partir de um volume de 5ul carregado na agulha). Após a injecção, os insetos foram removidos da lâmina de microscópio, com o auxílio de um pincel de pêlos de camelo fino umedecido.

Os insetos foram então colocados em uma dieta multiespecífica e foram avaliados para mortalidade em 24 e 48 horas.

Injeções de água foram utilizadas como controle.

Controle Negativo Silencer6 t* 1, 2 e Primers de controle de siRNA 3 da Ambion (Austin , TX) também foram incluídos como controles negativos.

Tabela 4 oe Primer Gene alvo No. injetados) Vivos | Mortos | 75 Homóônio junevil dio! kinase | 6 [Po q go 83/Homônio junevil diol kinase 6 fo | 6 | 91/V-ATPase subunidade À | 8 pç 99 Sequência hipotética conservada | 8 Po go 107 Nova sequência (proteína cuticular) | 8 Ea 115]Fator de iniciação Eucariótica 4A 8 8 123|Proteína putativa sar1 j 8 pag 131 [Oligossacari transferase subunidade 48 kKDa Ba goi Proteína do canal de K+ retificando Í 147 internamente | 8 7 Microinjeção de dsRNAs [2ug/ul]. Tabela 5 Microinjeção de dsRNAs [07ug/Wl] em larvas neonatas FAW : cam 2] o [aca] 22 |. Gene alvo tHinjetados mortos |Injetados| mortos | mortos | esamenouentádainee a ni io e | eos 83|Homóôrio juvenil dol quinase 2 DN 10 | e |] e [OS | —— 91/VATPase subunidade À a a za | — sslProteína Nipotéticaconsenada 1 A Ba ont —2 t+ 2 | | — o7/Nova sequência(proteina cuticular?) ea a A | +t15/Fator de Iniciação da Eucariátfio 44 A a e | Ttaslpotemaputativasart o E a a ag UU USE TIS E h Pod ih o 131 Oigossacar ransierase auburidade dada | E O DO | — 1sofProteina miosina O a aq o 4 pa 147linternamente e A A | — 55 Cadeia de afa Lbulina sta a a DR A geo | — Primer de controle Anrbion 1 6 o | JPrimerde contrate Ambiona a Bo o [ lPrimerdecontroleAmbions e A

Ensaio de microinjeção usando doses de 0.7ug/ul de dsRNA 21mers. Nota; Em algumas ocasiões, a mortalidade foi menor em 48 horas que em 24 horas. Isto é devido a insetos moribundos recuperados em pontos mais tarde.

Ensaio de dieta tópica para avaliação das propriedades inseticidas de 21mer dsRNA contra a lagarta-do-cartucho Spodoptera frugiperda O termo “ensaio de dieta tópica” refere-se a ensaios onde as dietas artificiais são pipetadas em placas de poliestireno e e solução de dsRNA é dispensada na superfície da dieta. Nos experimentos de dsRNA, 100 ul da dieta foram dispensados por poço. A superfície do poço foi então tratada com 10 ul de uma solução de dsRNA de concentrações variadas. As placas foram então infestadas com uma lagarta-do-cartucho recém-nascida por placa e seladas com mylar. O selo mylar foi perfurado com um pequeno pino de inseto para permitir a troca de ar. AS placas foram então armazenadas em uma câmara de crescimento a 28C e O ensaio foi marcado para o nanismo ou mortalidade em 4 dias. As Tabelas 6-12 representam vários experimentos usando este método. A Tabela 13 apresenta um resumo dos dados.

o No ensaio tópico * 1, os primers, que anteriormente apresentaram atividade em ensaios de injeção foram testados em um ensaio de dieta tópica FAW. Estes resultados são apresentados na Tabela 6. A solução de 5OuMolar (0.66ug/ul) | foi usada como concentração de ensaio. 5 ul dessa amostra foi carregado para o topo de 100ul da dieta produzindo uma concentração final de 2.5uMolar ou 30 ppm. Em adição a A1-A1l1 (Al12 é um controle negativo), as demais amostras são aquelas com nenhum humano ortólogo conhecido. A placa foi infestado com aprox. 5 neonatos/placa. A contagem do período foi de 72 horas.

No ensaio tópico * 2, primers foram testados em um ensaio de dieta tópica FAW, e os resultados são mostrados na tabela

7. Neste experimento, um estoque de 2,7 ug/ul foi diluído para uma concentração inicial de 0.67ug/ul. 2 diluições seriais foram realizadas para a produção de estoques de 0.32ug/ul e

0.16ug/ul. 5 ul desses estoques foram adicionados à dieta de 100ul para produzir concentrações finais de 30, 15 e 8 ppm na dieta. A contagem do período foi de 72 horas. No ensaio tópico * 3, primers foram testados em um ensaio de dieta tópica FAW, e os resultados são mostrados na tabela oe 8. Neste experimento, um estoque de 2,7 ug /ul foi diluído para uma concentração inicial de 0.67ug/ul. 2 diluições seriais foram realizadas para a produção de estoques de

0.32ug/ul e 0.16ug/ul. 5ul desses estoques foram adicionados à dieta de 100ul para produzir concentrações finais de 30, 15 e 8 ppm na dieta. Esta é uma repetição da experiência anterior. A contagem do período foi de 72 horas. No ensaio tópico H* 4, primers foram testados em um ensaio de dieta tópica FAW, e os resultados são mostrados na tabela

9. Neste experimento, o estoque de 2,7 ug /ul foi diluído para uma concentração inicial de 0.67ug/ul. 2 diluições seriais | eo foram realizadas para a produção de estoques de 0.32ug/ul e

0.16ug/ul. 5 ul desses estoques foram adicionados à dieta de 100ul produzindo concentrações finais de 30, 15 e 8 ppm na dieta. A contagem do período foi de 72 horas. Um resumo dos dados do ensaio tópico apresentados nas tabelas 6-9 aparece na Tabela 10. No ensaio tópico t 5, primers foram testados em um ensaio de dieta tópica FAW e os resultados são apresentados na Tabela

11. 50ul de 0.16ug/ul de primers foram misturados com 50 ul de água e, em seguida, diluídos em série. 10ul da amostra, em seguida, foi adicionada ao poços. Assim a primeira concentração foi 10ul x 0.08ug/ul = 0,8 ug de dsRNA o AN MN | 98/139 total/dieta de 100ul = 8 ppm. Esta foi metade da taxa de experimentos anteriores (ensaios %* 1-4), onde 5 ul de 0,32 apresentaram atividade. A contagem do período foi de 72 horas. A pontuação do “S” indica desnutrição clara em relação aos controles. A pontuação de “ss” indica insetos vivos, mas apresentando desnutrição severa definida como pouco ou nenhum crescimento para além do tamanho do corpo do recém-eclodido. No ensaio tópico * 6, primers foram testados em um ensaio de dieta tópica FAW e os resultados são apresentados na Tabela |

12. A primeira taxa é 10 ul de 0,16 ug/ul do estoque de oe primer. De lá, 50ul de 0.16ug/ul de primer misturado com 50 ul de água e, em seguida, diluído em série. 10ul da amostra foi então adicionado aos poços. Por conseguinte a primeira concentração foi 10ul x 0.16ug/ul = 1.6ug de dsRNA total/dieta de 100ul = 16 ppm. A contagem do período foi de 72 horas. o

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Exemplo 2. Transformação de Milho Embriões imaturos de milho de plantas doadoras de casa de estufa são bombardeados com um plasmídio contendo o elemento de silenciamento da invenção operacionalmente ligado a qualquer tecido determinado, tecido seletivo, ou promotor constitutivo e o gene marcador selecionável PAT (Wohlleben et al. (1988), Gene 70: 25-37), que confere resistência ao herbicida Bialaphos. Em uma concretização, | as construções terão dois segmentos idênticos 2-300bp do | 10 gene alvo em orientações opostas com um segmento “intron” entre elas agindo como uma alça de grampo. Essa construção o pode ser ligada ao promotor DMMB. Alternativamente, O gene marcador de seleção está previsto em um plasmídeo separado. A transformação é realizada da forma que se segue. Receitas dos meios seguem abaixo. Preparação do tecido alvo As espigas são descascadas e desinfestadas em água sanitária Clorox 30% mais 0,5% de Micro detergente por 20 minutos, e lavadas duas vezes com água estéril. Os embriões imaturos são retirados e colocados com o lado do eixo embrionário para baixo (lado do escutelo para cima), 25 embriões por placa, em meio 560Y por quatro horas e, em o seguida, alinhados dentro de 2,5 centímetros da zona alvo, em preparação para o bombardeamento.

Um vetor de plasmídeo que inclui o elemento de silenciamento de interesse operacionalmente ligado a qualquer tecido específico, tecido seletivo, ou promotor constitutivo é feito. Este plasmideo de DNA mais o plasmídeo de DNA contendo um marcador selecionável PAT é precipitado em 1,1 um (diâmetro médio) de pellets de tungstênio usando um procedimento de precipitação de CaCl 2 como segue: 100 ul de partículas de tungstênio preparadas em água, 10 ul (1 pg) de DNA em tampão Tris EDTA (um DNA total de 1 ug), 100 ul 2,5 M de CaCcl 2 e, 10 pl de espermidina a 0,1 M.

Cada reagente é adicionado sequencialmente para a suspensão de partículas de tungstênio, enquanto mantidos no vortexer Multitubo.

A mistura final é sonicada rapidamente e permitida a incubar no vórtice constante por 10 minutos.

Após o período de precipitação, os tubos são centrifugados brevemente, o líquido retirado, lavado com 500 mL de etanol 100%, e centrifugado por 30 segundos.

Novamente o líquido é removido, e 105 pl de etanol a 100% é adicionado ao | sedimento de partículas de tungstênio final.

Para ! e bombardeio de arma de partículas, as partículas de DNA/tungstênio são brevemente sonicadas e 10 uyL manchadas no centro de cada macrotransportador e secas por cerca de 2 minutos antes do bombardeamento.

As placas de amostra são bombardeadas no nível * 4 em uma arma de partículas.

Todas as amostras recebem um tiro de 650 PSI, com um total de dez alíquotas retiradas de cada tubo de partículas preparadas/DNA.

Após o bombardeamento, os embriões são mantidos em meio 560Y por dois dias, em seguida, transferidos para meio de seleção 560R contendo 3 mg/litro de Bialaphos e o subcultivados a cada duas semanas.

Após aproximadamente 10 semanas de seleção, clones de calos resistentes a seleção são transferidos para meio 288] para iniciar a regeneração de plantas.

Após a maturação de embriões somáticos (2-4 semanas), embriões — somáticos bem desenvolvidos são transferidos para o meio para a germinação e transferidos para a sala de cultura iluminada.

Aproximadamente 7-10 dias depois, plântulas em desenvolvimento são transferidas para meio livre de hormônio 272V em tubos por 7-10 dias até as mudas estarem bem estabelecidas.

AS plantas são então transferidas para inserções em vasos (equivalentes a vaso de 2,5"), contendo solo de cultivo e cultivadas por uma semana em uma câmara de crescimento, e posteriormente cultivadas por 1-2 semanas adicionais em casa de vegetação, em seguida, transferidas para vasos 600 clássicos (1,6 galão; 6,06 litros) e cultivadas para a maturidade.

Plantas são monitoradas e marcadas para o marcador adequado, como o controle de lepidópteros e têm atividade inseticida. Por exemplo, um ensaio de alimentação FAW pode ser pré-formado. Em tais ensaios, discos de folhas das plantas transgênicas são retirados com uma broca de um centímetro de cortiça ou folha. Seis discos de folhas são preparados para cada planta. As folhas são colocadas em uma e placa de microtitulação 24 em cima de 500 ul de 0,8% de ágar. Cada disco foliar é infestado com 2 lagartas-do- cartucho recém-eclodidas e, em seguida, a placa é selada com mylar. Um pequeno buraco de ventilação é feito para cada poço e as placas são então armazenadas em câmara de crescimento 28C. O ensaio é pontuado para mortalidade, desnutrição e consumo foliar em 96 horas.

Meio de bombardeamento (560Y) compreende 4,0 g/L de sais basais N6 (SIGMA C-1416), 1,0 mL/L de Mix de vitamina Eriksson (1000X SIGMA-1511), 0,5 mg/L de tiamina HCl, 120,0 g/L de sacarose, 1,0 mg/L 2,4-D, e 2,88 g/L L-prolina o (trazido o volume com DI H 2 O de ajuste após o pH 5,8 com KOH), 2,0 g/L de Gelrite (adicionado depois de levar o | 25 volume com DI H 2 O) e 8.5 mg/L de nitrato de prata (adicionados após a esterilização do meio e resfriamento a temperatura ambiente). Meios de seleção (560R) compreendem 4,0 g/L de sais basais N6 (SIGMA C-1416), 1,0 mL/L de Mix de vitamina Eriksson (1000X SIGMA-1511), 0,5 mg/L de tiamina HCl, 30,0 g/L de sacarose e 2,0 mg/L 2,4-D (trazido o volume com DI H 2 O de ajuste após o pH 5,8 com KOH), 3,0 g/L de Gelrite (adicionado depois de levar o volume com DI H 2 O) e 0,85 mg/L de nitrato de prata e 3,0 mg/L de bialaphos (ambos adicionados após a esterilização do meio e resfriamento a temperatura ambiente). Meio de regeneração vegetal (288]7) compreende 4,3 g/L de sais MS (GIBCO 11117-074), 5,0 mL/L de solução de vitaminas MS (0,100 g de ácido nicotínico, 0,02 g/L de tiamina HCL, 0,10 g/L de piridoxina HCl e 0,40 g/L de glicina trazidao ao volume com DI H 2 O polido) (Murashige e Skoog (1962) Physiol.

Plant. 15:473), 100 mg/L de mio- inositol, 0,5 mg/ L de zeatina, 60 g/L de sacarose, e 1,0 mL/L de 0,1 mM de ácido abscísico (trazido ao volume com DI | H 2 O polido, após ajuste de pH 5,6), 3,0 g/L de Gelrite e (adicionado depois de levar ao volume com DI H 2 O) e 1,0 mg/L de ácido indolacético e 3,0 mg/L de bialaphos (adicionados após a esterilização do meio e resfriamento a 60 ? C). Meio livre de hormônio (272V) compreende 4,3 g/L de sais MS (GIBCO 11117-074), 5,0 mL/L de solução de vitaminas MS (0,100 g/L de ácido nicotínico, 0,02 g/L de tiamina HCL, 0,10 g/L de piridoxina HCl e 0,40 g/L de glicina trazida ao volume com DI H 2 O polido), 0,1 g/L de mio-inositol, e 40,0 g/L de sacarose (trazido ao volume com DI H 2 O polido, após ajuste de pH para 5,6) e 6 g/L de Bacto-agar (adicionado depois de levar ao volume com DI H 2 o O polido), esterilizado e resfriado a 60 º C.

Exemplo 3 Transformação de Milho mediada por Agrobacterium Para a transformação de milho mediada por Agrobacterium com um elemento de silenciamento da invenção, o método de Zhao é empregado (Patente US No. 5.981.840, e Publicação de Patente PCT WO98/32326, o conteúdo das quais são incorporadas por referência). Tal como uma construção pode incluir dois segmentos de 2-300bp idênticos ao gene alvo em orientações opostas com um segmento “intron” entre eles agindo como uma alça de grampo.

Essa construção pode ser ligada ao promotor dMMB.

Resumidamente, embriões imaturos são isolados de milho e os embriões são postos em contato com uma suspensão de Agrobacterium, onde as bactérias são capazes de transferir o polinucleotídeo compreendendo o elemento de silenciamento a pelo menos uma célula de pelo menos um dos embriões imaturos (etapa 1: a etapa de infecção). Nesta etapa, os embriões imaturos são imersos em uma suspensão de Agrobacterium para o início da inoculação.

Os embriões são co-cultivados por um tempo com a Agrobacterium (etapa 2: a etapa de co-cultivo). Os embriões imaturos são cultivados em meio sólido após a etapa de infecção.

Após este período de co-cultivo uma e etapa opcional de “repouso” é contemplada.

Nesta etapa de repouso, os embriões são incubados na presença de pelo menos um antibiótico que inibe o crescimento de Agrobacterium, sem a adição de um agente seletivo de plantas transformantes (etapa 3: etapa de repouso). Os embriões imaturos são cultivados em meio sólido com antibiótico, mas sem um agente de seleção, para a eliminação de Agrobacterium e por uma fase de repouso para as células infectadas.

Em seguida, os embriões inoculados são cultivados em meio contendo um agente seletivo e o calo transformado crescido é recuperado (etapa 4: a etapa de o seleção). Os embriões imaturos são cultivados em meio sólido com um agente seletivo resultando no crescimento seletivo de células transformadas.

O calo é então regenerado em plantas (etapa 5: a etapa de regeneração), e os calos cultivados em meio seletivo são cultivados em meio sólido para regenerar as plantas.

Exemplo 4: Transformação de embriões de soja Condições de Cultura Culturas em suspensão embriogênica de soja (cv.

Jack) são mantidas em 35 mL de meio líquido SB196 (veja receitas abaixo) em agitador rotativo, a 150 rpm, 26 ºC com luz fluorescente branca fria em um fotoperíodo de 16:8 hr dia/noite na intensidade da luz de 60-85 u“pE/m2/s. As culturas são repicadas a cada 7 dias por duas semanas pela inoculação de aproximadamente 35 mg de tecido em 35 mL de líquido fresco SB196 (o intervalo de subcultura preferido é a cada 7 dias).

Culturas em suspensão embriogênica de soja são transformadas com os plasmídeos e fragmentos de DNA descritos nos exemplos acima pelo método de bombardeamento por arma de partículas (Klein et al. (1987) Nature, 327:70). o Iniciação da Cultura de Suspensões Embriogênicas de Soja Culturas de soja são iniciadas duas vezes por mês, com 5-7 dias entre cada início. | Vagens com sementes imaturas de plantas de soja | disponíveis 45-55 dias após o plantio são escolhidas, retiradas de suas conchas e colocadas em uma caixa magenta esterilizada. As sementes de soja são esterilizadas agitando-as durante 15 minutos em uma solução de Clorox a 5% com uma gota de sabonete Ivory (95 mL de água destilada autoclavada mais 5 mL de Clorox e 1 gota de sabão). Misture o bem. Sementes são lavadas com 2 garrafas de 1 litro de água destilada estéril e aquelas com menos de 4 mm são colocadas em lâminas de microscopia individual. A pequena extremidade das sementes é cortada e os cotilédones pressionados para fora do tegumento. Os cotilédones são transferidos para placas contendo meio SBl (25-30 cotilédones por placa). Placas são embaladas com fita de fibra e armazenadas por oito semanas. Após este tempo embriões secundários são cortados e colocados em meio líquido SB196 por 7 dias.

Preparação do DNA para o bombardeamento Ou um plasmídeo intacto ou um fragmento de plasmídeo de DNA contendo os genes de interesse e o gene marcador de seleção são usados para o bombardeamento. DNAS plasmidiais para bombardeamento são rotineiramente preparados e purificados utilizando o método descrito no Promega TM Protocols and Applications Guide, Segunda Edição (página 106). Fragmentos dos plasmídeos carregando o elemento de silenciamento de interesse são obtidos pelo isolamento de gel dos dois plasmídeos digeridos. Em cada caso, 100 ug de DNA plasmidial é digerido em 0,5 mL da mistura de enzima o específica que é apropriada para o plasmídeo de interesse. Os fragmentos de DNA resultantes são separados por eletroforese em gel em 1% de agarose GTG SeaPlaque (Molecular BioWhitaker Applications) e os fragmentos de DNA que contêm o elemento de silenciamento de interesse são cortados do gel de agarose. DNA é purificado a partir da agarose usando a enzima digestiva GELase seguindo oO protocolo do fabricante.

Uma alíquota de 50 upL de água destilada estéril, contendo 3 mg de partículas de ouro (3 mg de ouro) é adicionada a 5 pl de 1 ug/yvLl de solução de DNA (ou o plasmídeo intacto ou fragmento de DNA preparado como descrito acima), 50 pL 2.5M CaCl 2 e 20 pl a 0,1 M de espermidina. A mistura é agitada por 3 min no nível 3 de um agitador vortex e girada por 10 segundos em uma microcentrífuga de bancada. Depois de uma lavagem com 400 uL de etanol a 100% o sedimento é suspenso por ultra-som em 40 uL de etanol a 100%. Cinco pL de suspensão de DNA são dispensados a cada disco voador do instrumento de disco Biolistic PDS1000/HE. Cada alíquota de 5 yunL contém aproximadamente 0,375 mg de ouro por bombardeamento (ou seja, por disco).

Preparação do tecido e bombardeamento com DNA Cerca de 150-200 mg de 7 dias de idade de culturas em suspensão embrionárias são colocados em uma placa de petri vazia, estéril de 60 x 15 mm e à placa coberta com tela de plástico. Tecido é bombardeado com um ou dois tiros por placa com pressão de ruptura da membrana fixada em 1100 PSI e a câmara evacuada a um vácuo de 27-28 polegadas de mercúrio. O tecido é colocado em cerca de 3,5 centímetros da tela de retenção/parada.

Seleção de embriões transformados | oe Embriões transformados foram selecionados utilizando higromicina (quando a higromicina fosfotransferase, HPT, O gene foi usado como marcador de seleção) ou clorsulfuron (quando a acetolactato sintase, ALS, o gene foi utilizado como marcador selecionável). Seleção de Higromicina (HPT) Após o bombardeamento, o tecido é colocado em um meio novo SB1I96 e cultivado como descrito acima. Seis dias após o bombardeamento, o SB1I96 é trocado com SB1l96 fresco contendo um agente de seleção de 30 mg/L de higromicina. O o meio de seleção é atualizado semanalmente. Quatro a seis | semanas após a seleção, o tecido verde, transformado pode ser observado crescendo a partir dos clusters embriogênicos necróticos, não transformados. Tecido verde, isolado, é removido e inoculado em placas de microtitulação para gerar novas culturas em suspensão embriogênicas transformadas, clonalmente propagadas.

Seleção de Clorsulfuron (ALS) Após o bombardeamento, o tecido é dividido entre dois frascos com meio fresco SB196 e cultivados como descrito acima. Seis a sete dias pós-bombardeamento, o SBl96 é trocado com SB196 fresco contendo agente de seleção de 100 ng/mbL de clorsulfuron. O meio de seleção é atualizado semanalmente. Quatro a seis semanas após a seleção, tecido transformado, verde, pode ser observado crescendo a partir de clusters embriogênicos necróticos não transformados. Tecido verde, isolado, é removido e inoculado em placas multipoços contendo SB196 para gerar novas culturas em suspensão embriogênicas transformadas, clonalmente propagadas.

Regeneração de embriões somáticos de soja em plantas o A fim de obter plantas inteiras a partir de culturas embriogênicas em suspensão, o tecido deve ser regenerado. Maturação do Embrião e. Os. embriões são cultivados por 4-6 semanas a 26 º C em SB196 sob iluminação fluorescente branca fria (branca fria Phillips Econowatt F40/CW/RS/EW) e lâmpadas Agro (Phillips F40 Agro) (40 watts) em um fotoperíodo de 16:8 hr com intensidade de luz de 90-120 uE/m2s. Após este tempo clusters de embriões são removidos de um meio de agar sólido, SBl66, por 1-2 semanas. Clusters são então e repicados para meio SBl03 por três semanas. Durante este período, embriões individuais podem ser retirados dos clusters e selecionados para o marcador adequado ou para a capacidade da planta, quando injetados com os elementos de silenciamento, para controlar a Lepidoptera. Dessecação e Germinação do embrião Embriões individuais maduros são dessecados, colocando-os em uma placa de Petri vazio, pequena (35 x 10 mm) por cerca de 4-7 dias. As placas são vedadas com fita de fibra (criando uma pequena câmara de umidade). Embriões dessecados são plantados em meio SB71-4, onde foram deixados para germinar sob as mesmas condições de cultura descritas acima. Plântulas germinadas são removidas do meio de germinação e lavadas cuidadosamente com água e em seguida plantadas em Redi-Terra em uma bandeja de 24 células, coberta com cúpula de plástico transparente. Após 2 semanas, a cúpula é removida e as plantas endurecidas por fora por uma semana adicional. Se as plântulas são observadas endurecidas elas são transplantadas para pote de Redi-terra de 10” com até três plântulas por vaso.

Receitas de Meios o SB 196 — Meio de proliferação líquido FN Lite (por litro) - MS FeEDTA - 100x Estoque 1 10mL MS Sulfato - 100x Estoque 2 10mL FN Lite Halides - 100x Estoque 3 10 mL FN Lite P,B,Mo - 100x Estoque 4 10 mL vitaminas B5 (ImL/L) 10mL 2,4-D (10mg/L de concentração final) 1.0mL KNO3 2.83 gm (NH4 )2 SO 4 0.463 gm Asparagina 1.0 gm Sacarose (1%) 10 gm pH 5.8 eo 25 FNLite Soluções Estoque Estoque t 1000mL 500mL 1 MS Fe EDTA 100x Estoque Na? EDTA 3.724 g 1.862 g FeSO4 - 7H90 2.784 g 1.392 g * Adicionado primeiro, dissolvido em um frasco escuro enquanto é agitado 2 MS Sulfato 100x Estoque MgSO4 - 7H20 37.0g 185g MnSO4 - HO 1.69 g 0.845 g ZnSO4 - THO 0.86 g 043g CuSO4 - 5SH9O 0.0025 g 0.00125 g

3 FN Lite Halides 100x Estoque CaCl7 - 2H90 30.0g 15.08 KI 0.083 g 0.0715g CoCl7 - 6HÃO 0.0025 g 0.00125 g

5. 4 FN Lite P,B,Mo 100x Estoque KH75PO, 1858 9.258 H3BO3 0.62 g 031g Na?MoO4 - 2H90 0.025 g 0.0125 g | 10 Meio sólido SB1 (por litro) compreende: 1 pkg. de sais MS (Gibco/ BRL - CatH 11117-066); 1 mL de vitaminas B5 1000X estoque; 31.5 g de sacarose; 2 mL de 2,4-D (20mg/ L oe de concentração final); pH 5.7; e, 8 g de agar TC. Meio sólido SB 166 (por litro) compreende: 1 pkg. de sais MS (Gibco/ BRL - Cat 11117-066); 1 mL de vitaminas B5 | 1000X estoque; 60 g de maltose; 750 mg de MgCl2 hexahidrato; 5 g de carvão vegetal ativado; pH 5.7; e, 29 | de gelrite. Meio sólido SB 103 (por litro) compreende: 1 pkg. de sais MS (Gibco/BRL - Cat 11117-066); 1 mL de vitaminas B5 1000X estoque; 60 g de maltose; 750 mg de MgCl2 hexahidrato; pH 5.7; e, 2 g de gelrite. Meio sólido SB 71-4 (por litro) compreende: 1 garrafa e de sais B5 de Gamborg w/ sacarose (Gibco/BRL - Cattt 21153- 036); pH 5.7; e, 5 g de agar TC. Estoque 2,4-D é obtido de Phytotech catt D 295 - concentração é 1 mg/mL. Estoque de Vitaminas B5 (por 100 mL) que é armazenado em alíquotas de -20C compreende: 10 g de mio-inositol; 100 mg de ácido nicotínico; 100 mg de piridoxina HCl; e, 1 g de tiamina. Se a solução não dissolve o suficiente rapidamente, é aplicado um baixo nível de calor através da placa quente. Estoque de Clorsulfuron compreende Img/mL em

0.01 N de Hidróxido de amônio.

NS) DERA o o o DA Roe a DO E O a Ns 139/139 Os artigos “a” e “um” são aqui utilizados para se referir à um ou mais de um (ou seja, pelo menos um) do objeto gramatical do artigo. A título de exemplo, “um elemento” significa um ou mais elementos.

Todas as publicações e pedidos de patentes mencionados na especificação são indicativos do nível daqueles versados na técnica a que se dirige esta invenção. Todas as publicações e pedidos de patente são aqui incorporados por referência, na mesma medida, como se cada publicação individual ou pedido de patente fosse especificamente e individualmente, indicado para ser incorporado por e referência. Embora a invenção anterior tenha sido descrita com algum pormenor a título de ilustração e exemplo para fins de clareza de entendimento, será evidente que algumas alterações e modificações podem ser praticadas no âmbito das reivindicações anexas.

| | o |

Claims (1)

1. ' 1/10 REIVINDICAÇÕES — a, Método para obtenção de uma célula vegetal caracterizado por compreender: a) transformar uma célula vegetal com um polinucleotídeo heterólogo compreendendo um elemento de silenciamento, onde o dito elemento de silenciamento compreende um fragmento de pelo menos 20 nucleotídeos consecutivos da SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 Ou 50, sendo que o dito elemento de silenciamento, quando ingerido por uma praga da ordem Lepidoptera, reduz o nível de uma sequência alvo na referida praga e, assim, controla a praga da ordem Lepidoptera; e b) cultivar a referida célula vegetal sob condições de crescimento de célula vegetal.

   2. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a dita praga compreende Spodoptera frugiperda.

   3. Método de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o dito elemento de silenciamento compreende a) um polinucleotídeo compreendendo a sequência senso ou antisenso da sequência estabelecida na SEQ ID NO: 51, 54, 57, 60, 63, 66, 69, 72, 75, 78, 81, 84, 87, 90, 93, 96, 99, 102, 105, 108, 111, 114, 117, 120, 123, 126, 129, 132, 135, 138, 141, 144, 147, 150, 153, 156, 159, 162, 165, 168, 171, 174, 177, 180, 183, 186, 189, 192, 195, 198, 201, 204, 207, 210, 213, 216, 219, 222, 225, * 228, 231, 234, 237, 240, 243, 246, 249, 252, 255, 258, 261, 264, 267, 270, 273, 276, 279, 282, 285, 288, 291,

   FENDA DEAN AN SCANS ' 2/10 294, 297, 300, 303, 306, 309, 312, 315, 318, 321, 324, 327, 330, 333, 336, 339, 342, 345, 348, 351, 354, 357, 360, 363, 366, 369, 372, 375, 378, 381, 384, 387, 390, 393, 396, 399, 402, 405, 408, 411, 415 ou 418;

   b) um polinucleotídeo compreendendo a sequência senso ou antisenso de uma sequência tendo, pelo menos, 95% de identidade de sequência com a sequência estabelecida na SEQ ID NO: 51, 54, 57, 60, 63, 66, 69, 72, 75, 78, 81, 84, 87, 90, 93, 96, 99, 102, 105, 108, 111, 114, 117,

   120, 123, 126, 129, 132, 135, 138, 141, 144, 147, 150, 153, 156, 159, 162, 165, 168, 171, 174, 177, 180, 183, 186, 189, 192, 195, 198, 201, 204, 207, 210, 213, 216, 219, 222, 225, 228, 231, 234, 237, 240, 243, 246, 249, 252, 255, 258, 261, 264, 267, 270, 273, 276, 279, 282,

   285, 288, 291, 294, 297, 300, 303, 306, 309, 312, 315, 318, 321, 324, 327, 330, 333, 336, 339, 342, 345, 348, 351, 354, 357, 360, 363, 366, 369, 372, 375, 378, 381, 384, 387, 390, 393, 396, 399, 402, 405, 408, 411, 415 ou 418;

   c) um polinucleotídeo compreendendo a sequência estabelecida na SEQ ID NO: 52, 53, 55, 56, 58, 59, 61, 62, 64, 65, 67, 68, 70, 71, 73, 74, 76, 77, 79, 80, 82, 83, 85, 86, 88, 89, 91, 92, 94, 95, 97, 98, 100, 101, 103, 104, 106, 107, 109, 110, 112, 113, 115, 116, 118,

   119, 121, 122, 124, 125, 127, 128, 130, 131, 133, 134, 136, 137, 139, 140, 142, 143, 145, 146, 148, 149, 151, 152, 154, 155, 157, 158, 160, 161, 163, 164, 166, 167, 169, 170, 172, 173, 175, 176, 178, 179, 181, 182, 184, 185, 187, 188, 190, 191, 193, 194, 196, 197, 199, 200,

   202, 203, 205, 206, 208, 209, 211, 212, 214, 215, 217, 218, 220, 221, 223, 224, 226, 227, 229, 230, 232, 233, 235, 236, 238, 239, 241, 242, 244, 245, 247, 248, 250, 251, 253, 254, 256, 257, 259, 260, 262, 263, 265, 266,

   ' 3/10 268, 269, 271, 272, 274, 275, 277, 278, 280, 281, 283, — 284, 286, 287, 289, 290, 292, 293, 295, 296, 298, 299, 301, 302, 304, 305, 307, 308, 310, 311, 313, 314, 316, 317, 319, 320, 322, 323, 325, 326, 328, 329, 331, 332, 334, 335, 337, 338, 340, 341, 343, 344, 346, 347, 349, 350, 352, 353, 355, 356, 358, 359, 361, 362, 364, 365, 367, 368, 370, 371, 373, 374, 376, 377, 379, 380, 382, 383, 385, 386, 388, 389, 391, 392, 394, 395, 397, 398, 400, 401, 403, 404, 406, 407, 409, 410, 412, 413, 416, 417, 419, ou 420; à) um polinucleotídeo compreendendo uma sequência de nucleotídeos tendo, pelo menos, 95% de identidade de sequência na SEQ ID NO: 52, 53, 55, 56, 58, 59, 61, 62, 64, 65, 67, 68, 70, 71, 73, 74, 76, 77, 79, 80, 82, 83, 85, 86, 88, 89, 91, 92, 94, 95, 97, 98, 100, 101, 103, 104, 106, 107, 109, 110, 112, 113, 115, 116, 118, 119, 121, 122; 124, 125, 127, 128, 130, 131, 133, 134, 136, 137, 139, 140, 142, 143, 145, 146, 148, 149, 151, 152, 154, 155, 157, 158, 160, 161, 163, 164, 166, 167, 169, 170, 172, 173, 175, 176, 178, 179, 181, 182, 184, 185, 187, 188, 190, 191, 193, 194, 196, 197, 199, 200, 202, 203, 205, 206, 208, 209, 211, 212, 214, 215, 217, 218, 220, 221, 223, 224, 226, 227, 229, 230, 232, 233, 235, 236, 238, 239, 241, 242, 244, 245, 247, 248, 250, 251, 253, 254, 256, 257, 259, 260, 262, 263, 265, 266, 268, 269, 271, 272, 274, 275, 277, 278, 280, 281, 283, 284, 286, 287, 289, 290, 292, 293, 295, 296, 298, 299, 301, 302, 304, 305, 307, 308, 310, 311, 313, 314, 316, 317, 319, 320, 322, 323, 325, 326, 328, 329, 331, 332, 334, 335, 337, 338, 340, 341, 343, 344, 346, 347, 349, 350, 352, 353, 355, 356, 358, 359, 361, 362, 364, 365, 367, 368, 370, 371, 373, 374, 376, 377, 379, 380, 382, 383, 385, 386, 388, 389, 391, 392, 394, 395, 397, 398, 400,

   . 4/10 401, 403, 404, 406, 407, 409, 410, 412, 413, 416, 417, -— 419, ou 420.

   4. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1, 2 ou 3, caracterizado pelo fato de que o dito elemento de silenciamento inclui um grampo de RNA.

   5. Método de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que o dito polinucleotídeo compreendendo o elemento de silenciamento compreende, na ordem a seguir, um primeiro segmento, um segundo segmento, e um terceiro segmento, onde a) o dito primeiro segmento compreende pelo menos cerca de 20 nucleotídeos tendo pelo menos 90% de complementaridade de sequência a uma sequência alvo estabelecida na SEQ ID NOS: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 , 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36 , 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 OU 50; b) o dito segundo segmento compreende uma alça de comprimento suficiente para permitir que o elemento de silenciamento seja transcrito como um RNA grampo; e c) o dito terceiro segmento compreende pelo menos cerca de 20 nucleotídeos tendo pelo menos 85% de complementaridade com o primeiro segmento.

   6. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que o dito elemento de silenciamento é operacionalmente ligado a um promotor heterólogo.

   7. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de a referida célula vegetal ter

   . 5/10 estavelmente incorporada em seu genoma um segundo polinucleotídeo que compreende um elemento potenciador de supressão compreendendo a sequência-alvo da praga, Ou uma variante ativa ou fragmento da mesma, onde a expressão combinada do elemento de silenciamento e o elemento potenciador de supressão aumenta a concentração de um RNAi inibidor específico para a sequência alvo de pragas na dita célula vegetal.

   8. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de a referida célula vegetal ser de uma monocotiledônea.

   9. Método de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que a dita monocotiledônea é milho, cevada, painço, trigo ou arroz.

   10. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de a referida célula vegetal ser de uma dicotiledônea.

   11. Método de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que a dita dicotiledônea é soja, canola, alfafa, girassol, cártamo, tabaco, Arabidopsis ou algodão.

   12. Método para obtenção de planta ou parte de planta caracterizado por compreender o método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11 e compreender, adicionalmente: c) regenerar uma planta ou parte de planta.

   13. Método de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que a expressão combinada do dito elemento de silenciamento e o elemento potenciador supressor aumenta a f 6/10 concentração de um RNA inibidor específico para a sequência alvo de pragas no floema da referida planta ou parte da planta.

   14. Método para controlar Lepidoptera caracterizado por compreender alimentar uma Lepidoptera com uma composição que compreende um elemento de silenciamento, onde o dito elemento de silenciamento, quando ingerido pela dita Lepidoptera, reduz o nível da sequência alvo da Lepidoptera e, assim, controla a Lepidoptera e o dito elemento de silenciamento compreende um fragmento de pelo menos 20 nucleotídeos consecutivos da SEQ ID NO: 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 , 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39, 40, 41, 42, 43, 44, 45, 46, 47, 48, 49 ou 50.

   15. Método de acordo com a reivindicação 14, caracterizado pelo fato de que a dita composição compreende planta ou parte da planta tendo incorporado estavelmente em seu genoma um polinucleotídeo compreendendo o dito elemento de silenciamento.

   17. Método de acordo com a reivindicação 14 ou 15, caracterizado pelo fato de que a dita praga compreende Spodoptera frugiperda.

   18. Método de acordo com as reivindicações 14, 15 ou 16, caracterizado pelo fato de que o dito elemento de silenciamento inclui a) um polinucleotídeo compreendendo a sequência senso ou antisenso da sequência estabelecida em SEQ ID NO: 51, 54, 57, 60, 63, 66, 69, 72, 75, 78, 81, 84, 87, 90, 93, 96, 99, 102, 105, 108, 111, 114, 117, 120, 123, 126,

   ' 7/10 129, 132, 135, 138, 141, 144, 147, 150, 153, 156, 1597 162, 165, 168, 171, 174, 177, 180, 183, 186, 189, 192, 195, 198, 201, 204, 207, 210, 213, 216, 219, 222, 225, 228, 231, 234, 237, 240, 243, 246, 249, 252, 255, 258,

   261, 264, 267, 270, 273, 276, 279, 282, 285, 288, 291, 294, 297, 300, 303, 306, 309, 312, 315, 318, 321, 324, 327, 330, 333, 336, 339, 342, 345, 348, 351, 354, 357, 360, 363, 366, 369, 372, 375, 378, 381, 384, 387, 390, 393, 396, 399, 402, 405, 408, 411, 415 ou 418;

   b) um polinucleotídeo compreendendo a sequência senso ou antisenso de uma sequência tendo, pelo menos, 95% de identidade de sequência com a sequência estabelecida na SEQ ID NO: 51, 54, 57, 60, 63, 66, 69, 72, 75, 78, 81, 84, 87, 90, 93, 96, 99, 102, 105, 108, 111, 114, 117

   120, 123, 126, 129, 132, 135, 138, 141, 144, 147, 150, 153, 156, 159, 162, 165, 168, 171, 174, 177, 180, 183, 186, 189, 192, 195, 198, 201, 204, 207, 210, 213, 216, 219, 222, 225, 228, 231, 234, 237, 240, 243, 246, 249, 252, 255, 258, 261, 264, 267, 270, 273, 276, 279, 282,

   285, 288, 291, 294, 297, 300, 303, 306, 309, 312, 315, 318, 321, 324, 327, 330, 333, 336, 339, 342, 345, 348, 351, 354, 357, 360, 363, 366, 369, 372, 375, 378, 381, 384, 387, 390, 393, 396, 399, 402, 405, 408, 411, 415 ou 418;

   c) um polinucleotídeo compreendendo a sequência estabelecida na SEQ ID NO: 52, 53, 55, 56, 58, 59, 61, 62, 64, 65, 67, 68, 70, 71, 73, 74, 76, 77, 79, 80, 82, 83, 85, 86, 88, 89, 91, 92, 94, 95, 97, 98, 100, 101, 103, 104, 106, 107, 109, 110, 112, 113, 115, 116, 118,

   119, 121, 122, 124, 125, 127, 128, 130, 131, 133, 134, 136, 137, 139, 140, 142, 143, 145, 146, 148, 149, 151, 152, 154, 155, 157, 158, 160, 161, 163, 164, 166, 167, 169, 170, 172, 173, 175, 176, 178, 179, 181, 182, 184,

   ' 8/10

   185, 187, 188, 190, 191, 193, 194, 196, 197, 199, 200,

   202, 203, 205, 206, 208, 209, 211, 212, 214, 215, 217,

   218, 220, 221, 223, 224, 226, 227, 229, 230, 232, 233,

   235, 236, 238, 239, 241, 242, 244, 245, 247, 248, 250,

   251, 253, 254, 256, 257, 259, 260, 262, 263, 265, 266, 268, 269, 271, 272, 274, 275, 277, 278, 280, 281, 283,

   284, 286, 287, 289, 290, 292, 293, 295, 296, 298, 299,

   301, 302, 304, 305, 307, 308, 310, 311, 313, 314, 316,

   317, 319, 320, 322, 323, 325, 326, 328, 329, 331, 332,

   334, 335, 337, 338, 340, 341, 343, 344, 346, 347, 349, 350, 352, 353, 355, 356, 358, 359, 361, 362, 364, 365,

   367, 368, 370, 371, 373, 374, 376, 377, 379, 380, 382,

   383, 385, 386, 388, 389, 391, 392, 394, 395, 397, 398,

   400, 401, 403, 404, 406, 407, 409, 410, 412, 413, 416,

   417, 419, ou 420;

   àd) um polinucleotídeo compreendendo a sequência estabelecida na SEQ ID NO: 52, 53, 55, 56, 58, 59, 61

   62, 64, 65, 67, 68, 70, 71, 73, 74, 76, 77, 79, 80, 82,

   83, 85, 86, 88, 89, 91, 92, 94, 95, 97, 98, 100, 101,

   103, 104, 106, 107, 109, 110, 112, 113, 115, 116, 118, 119, 121, 122, 124, 125, 127, 128, 130, 131, 133, 134,

   136, 137, 139, 140, 142, 143, 145, 146, 148, 149, 151,

   152, 154, 155, 157, 158, 160, 161, 163, 164, 166, 167,

   169, 170, 172, 173, 175, 176, 178, 179, 181, 182, 184,

   185, 187, 188, 190, 191, 193, 194, 196, 197, 199, 200, 202, 203, 205, 206, 208, 209, 211, 212, 214, 215, 217,

   218, 220, 221, 223, 224, 226, 227, 229, 230, 232, 233, 235, 236, 238, 239, 241, 242, 244, 245, 247, 248, 250, 251, 253, 254, 256, 257, 259, 260, 262, 263, 265, 266, 268, 269, 271, 272, 274, 275, 277, 278, 280, 281, 283, 284, 286, 287, 289, 290, 292, 293, 295, 296, 298, 299, 301, 302, 304, 305, 307, 308, 310, 311, 313, 314, 316, 317, 319, 320, 322, 323, 325, 326, 328, 329, 331, 332,

   ' 9/10 334, 335, 337, 338, 340, 341, 343, 344, 346, 347, 349, 350, 352, 353, 355, 356, 358, 359, 361, 362, 364, 365, 367, 368, 370, 371, 373, 374, 376, 377, 379, 380, 382, 383, 385, 386, 388, 389, 391, 392, 394, 395, 397, 398, 400, 401, 403, 404, 406, 407, 409, 410, 412, 413, 416, 417, 419, ou 420.

   18. Método de acordo com as reivindicações 14, 15, 16 ou 17, caracterizado — pelo fato de que o dito elemento de silenciamento inclui um RNA grampo.

   19. Método de acordo com a reivindicação 18, caracterizado pelo fato de que o dito polinucleotídeo compreendendo O elemento de silenciamento compreende, na ordem à seguir, um primeiro segmento, um segundo segmento, e um terceiro segmento, onde a) o dito primeiro segmento compreende pelo menos cerca de nucleotídeos tendo, pelo menos, 90% de complementaridade de sequência com o polinucleotídeo 20 alvo; b) o dito Segundo segmento "compreende uma alça de comprimento suficiente para permitir que o elemento de silenciamento seja transcrito como um RNA grampo; e c) o dito terceiro segmento compreende pelo menos cerca de 20 nucleotídeos tendo, pelo menos, 85% de complementaridade com o primeiro segmento.

   20. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 14 a 19, caracterizado pelo fato de que o dito elemento de silenciamento é operacionalmente ligado a um promotor heterólogo.

   h 10/10

   21. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 15 a 20, caracterizado pelo fato de que à dita planta ou parte da planta tem estavelmente incorporado no seu genoma um segundo polinucleotídeo compreendendo um elemento potenciador de supressão compreendendo a sequência-alvo da praga, Ou uma variante ativa ou fragmento da mesma, onde a expressão combinada do elemento de silenciamento &e O elemento potenciador supressor aumenta a concentração de um RNAi inibidor específico para a sequência alvo da praga na dita célula vegetal.

   22. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 14 a 21, caracterizado pelo fato de que à dita planta é uma monocotiledônea.

   23. Método de acordo com a reivindicação 22, caracterizado pelo fato de que a dita monocotiledônea é milho, cevada, painço, trigo ou arroz.

   24. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 14 a 21, caracterizado pelo fato de que a dita planta é uma dicotiledônea.

   25. Método de acordo com a reivindicação 24, caracterizado pelo fato de que a dita planta é soja, canola, alfafa, girassol, cártamo, tabaco, Arabidopsis, ou algodão.