BRPI0911060B1

BRPI0911060B1 - Polipeptídeos de fator vii que são modificados e usos dos mesmos

Info

Publication number: BRPI0911060B1
Application number: BRPI0911060-7A
Authority: BR
Inventors: Christopher Thanos; Edwin L. Madison
Original assignee: Catalyst Biosciences, Inc
Priority date: 2008-04-11
Filing date: 2009-04-10
Publication date: 2022-04-05
Also published as: US9476037B2; IL208373A0; SI2281037T1; HK1194096A1; TWI538916B; EP2687596A2; ES2560236T3; US11203749B2; HK1154273A1; CN102083971B; JP5659312B1; SG190560A1; SG193779A1; EP3064580A1; AU2009234390B2; MY161581A; US20090291890A1; IL208373A; HUE026937T2; KR20110008084A

Abstract

POLIPEPTÍDEOS DE FATOR VII MODIFICADOS E USOS DOS MESMOS Polipeptídeos de fator VII modificados e seus usos são providos. Tais polipeptídeos de FVII modificados incluem o fator VIla e outras formas de fator VII. Entre polipeptídeos de FVII modificados providos estão aqueles possuem atividades alteradas, normalmente atividades pró-coagulantes alteradas, incluindo aumento da atividade pró-coagulante. Assim, tais polipeptídeos modificados são terapêuticos.

Description

Pedidos relacionados

Beneficio de prioridade é reivindicado para o pedido provisório US n° de série 61/124.021, de Edwin 5 Madison e Christopher Thanos, intitulado "Polipeptideos de fator VII que são modificados e seus usos", depositado em 11 de abril de 2008.

Este pedido está relacionado ao correspondente pedido US n° de série 12/384.915 de Edwin Madison e 10 Christopher Thanos, intitulado "Polipeptideos de fator VII que são modificados e seus usos", depositado em 10 de abril de 2009, que também reivindica prioridade para o pedido provisório US n° de série 61/124.021.

Onde for permitido, o assunto dos pedidos acima 15 referidos será incorporado por referência, na sua totalidade.

Onde for permitido, o assunto dos pedidos US n° de série 12/082.662, de Edwin Madison, Christopher Thanos, Sandra Waugh Ruggles e Shaun Coughlin, intitulado "Polipeptideos de fator VII modificados e seus usos", depositado em 11 de abril de 2008, e o pedido correspondente internacional n° PCT/US2008/04795 de Edwin Madison, Christopher Thanos, Sandra Waugh Ruggles e Shaun Coughlin, intitulado "Polipeptideos de fator VII 25 modificados e seus usos", depositado em 11 de abril de 2008, também será incorporado por referência, na sua totalidade.

Incorporação por referência de Listagem de Sequência fornecida em CD

Uma versão eletrônica em disco compacto (CD-R) da listagem de sequência é apresentado em anexo, em quatro exemplares (rotulado COPY 1, COPY 2, COPY 3 e CRF) , cujo conteúdo são incorporados por referência, na sua totalidade. 0 arquivo legivel por computador em cada um dos discos compactos mencionados acima, criado em 10 abril de 2009, é idêntico, 1200 kilobytes de tamanho, e intitulado 4919SEQ.PC1.TXT.

CAMPO DA INVENÇÃO

São fornecidas proteínas terapêuticas modificadas. Em particular, são fornecidos polipeptideos de fator VII modificados, que inclui o fator Vila e outras formas de Fator VII, e seus usos.

ANTECEDENTES

Hemostasia é o processo fisiológico complexo que leva à cessação do sangramento. As plaquetas, proteínas do plasma e os vasos sanguíneos e células endoteliais são os três componentes deste processo que cada um desempenha um papel importante nos eventos que se seguem imediatamente após a lesão tecidual e que, em circunstâncias normais, resulta na rápida formação de um coágulo. O principal disto é a cascata de coagulação, uma série de eventos proteolíticos em que determinadas proteínas plasmáticas (ou fatores de coagulação) são sequencialmente ativados em uma "cascata" por um outro fator de coagulação ativado anteriormente, levando a uma rápida geração de trombina. As grandes quantidades de trombina produzidas nesta cascata então funcionam para clivar o fibrinogênio em peptídeos de fibrina que são necessários para a formação de coágulos.

Os fatores de coagulação circulam como zimogénios inativos de cadeia simples, e são ativadas por clivagem em uma ou mais posições para gerar uma forma ativada de duas cadeias da proteína. Fator VII (FVII), uma proteína plasmática dependentes de vitamina K, inicialmente circula no sangue como um zimogênio. O zimogênio de FVII é ativado por clivagem proteolítica em um único local, Arg152-Ile153, resultando é uma protease de duas cadeias ligadas por uma única ligação dissulfeto (FVIIa). FVlIa liga seu cofator, o fator tecidual (TF), para formar um complexo no qual FVIIa pode eficientemente ativar o fator X (FX) para FXa, iniciando assim a série de eventos que resultam na formação de fibrina e hemostasia.

Enquanto hemostasia normal é alcançada na maioria dos casos, defeitos no processo podem levar a distúrbios de sangramento em que o tempo necessário para a formação do coágulo é prolongado. Esses distúrbios podem ser congênitos cu adquiridos. Por exemplo, a hemofilia A e B são doenças hereditárias caracterizadas pela deficiência do fator VIII (FVIII) e do fator IX (FIX), respectivamente. A terapia de substituição é o tratamento tradicional para a hemofilia A e E, e envolve â administração intravenosa de FVIII ou FIX, seja preparada a partir de plasma humano ou como proteínas recombinantes. Em muitos casos, entretanto, os pacientes desenvolvem anticorpos (também conhecidos como inibidores) contra as proteínas infundidas, o que reduz ou anula a eficácia do tratamento. FVIIa recombinante (NovoSeven® (Fator Vila de Coagulação (Recombinante))) foi aprovado para o tratamento de pacientes com hemofilia A ou B que possuem inibidores de FVIII ou FIX, e também é usado para interromper episódios de sangramento ou prevenir sangramento associado com trauma e/ou cirurgia. FVIIa recombinante também foi aprovado para o tratamento de doentes com deficiência congênita de FVII, e vem cada vez mais sendo utilizado em usos off-label (extra bula), como o tratamento de sangramento associado com outros distúrbios de sangramento congênitos ou adquiridos, trauma e cirurgia em pacientes não-hemofílicos.

O uso do FVIIa recombinante para promover a formação de coágulos frisa a sua importância crescente como um agente terapêutico. Terapia de FVIIa deixa necessidade médica não alcançada significativa. Por exemplo, com base em dados de ensaios clínicos, uma média de 3 doses de FVIIa por um período de tempo de 6 horas ou mais são necessárias para gerenciar episódios agudos de sangramento em pacientes com hemofilia. Variantes mais eficazes de FVIIa são necessárias para reduzir esses requisitos. Portanto, entre os objetos aqui, é um objeto prover polipeptideos de FVII modificados que são projetados para ter melhores propriedades terapêuticas.

RESUMO

Providos aqui estão polipeptideos de Fator VII (FVII) modificados. Em particular, providos aqui estão polipeptídeos de FVII modificados que exibem atividades pró-coagulantes. Os polipeptídeos de FVII são modificados na sequência primária comparado a um polipeptideo de FVII não modificado, e podem incluir inserções, exclusões e substituições de aminoácidos. Polipeptídeos de FVII modificados providos aqui incluem polipeptídeos de FVII que exibem aqueles que têm resistência aumentada aos inibidores tais como antitrombina III (AT-III) e inibidores da via do fator tecidual (TFPI), aqueles que têm resistência aumentada aos efeitos inibitórios de Zn2+, aqueles que têm atividade catalítica aumentada na presença e/ou ausência de TF, aqueles que têm propriedades farmacocinéticas aumentada, tais como meia-vida aumentada, aquelas que têm ligação e/ou afinidade aumentada com a superfície de plaquetas, aqueles que têm ligação e/ou afinidade aumentada de albumina no soro-, e aqueles que têm ligação e/ou afinidade aumentada por integrina plaquetária αIIbβ3. Os polipeptídeos de FVII modificados podem conter qualquer combinação de modificações providas aqui, pela qual uma ou mais atividades ou propriedades do polipeptideo são alterados em comparação com um polipeptideo de FVII não modificado. Normalmente, a polipeptideo de FVII modificado mantém atividade pró-coagulante. Também providos aqui estão moléculas de ácido nucléico, vetores e células que codificam/expressam polipeptídeos de FVII modificados. As composições farmacêuticas, artigos manufaturados, kits e métodos de tratamento também são providos aqui.

Polipeptídeos FVII incluem variantes de espécies e alélicas e polipeptídeos e outras variantes que possuem modificações que afetam outras atividades e/ou propriedades. Também estão incluídos os fragmentos ativos dos polipeptídeos de FVII que incluem uma modificação provida aqui. Exemplares de polipeptídeos de FVII são aqueles que incluem a sequência de aminoácidos definida em SEQ ID NO:3, bem como suas variantes com 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 88%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais identidade de sequência com a mesma.

Providos aqui estão polipeptídeos de fator VII (FVII) modificadas que contêm uma modificação em um polipeptídeo FVII na posição Q286 em um polipeptídeo FVII tendo uma sequência de aminoácidos definida em SEQ ID NO:3 ou nos resíduos correspondentes em um polipeptídeo FVII. A modificação pode ser uma substituição de aminoácido, inserção ou eliminação de aminoácidos, ou uma combinação dos mesmos. Nos casos em que a modificação é uma substituição de aminoácidos, a substituição pode ser feita por um aminoácido básico (por exemplo, Arg (R) , Lys (K) e His (H) ) ou um aminoácido selecionados entre Arg (R) , Lys (K) , His (H), Tyr (Y) , Gly (G) , Phe (F), Met (M) , He (I), Leu (L) , Val (V), Pro (P) , Glu (E) , Trp (W) , Asp (D) e Cys (C). Exemplares de tais substituições de aminoácidos incluem Q286R, Q286K, Q286H, Q286Y, Q286G, Q286F, Q286M, Q286I, Q286L, Q286V, Q286P, Q286E, Q286W, Q286D e Q286C. Tais modificações podem ser feitas em um polipeptídeo FVII não modificado contendo uma sequência definida em qualquer uma das SEQ ID NOS: 1-3, ou uma variante alélica ou de espécies da mesma, ou uma variante com pelo menos 60% de identidade de sequência com o FVII de qualquer SEQ ID NOS: 1-3, ou um fragmento ativo de um polipeptideo de FVII que compreende uma sequência de aminoácidos definida em qualquer SEQ ID NOS: 1-3, ou uma variante alélica ou de espécies da mesma, ou uma variante com pelo menos 60% de identidade de sequência com o FVII de qualquer uma das SEQ ID NOS: 1-3. Por exemplo, um polipeptideo de FVII modificado pode ser um fragmento ativo que contém a substituição na posição correspondente à posição Q286 em um polipeptideo de FVII.

Em alguns exemplos, os polipeptideos de FVII modificados providos aqui contêm uma substituição de aminoácido na posição correspondente à posição 286 em um polipeptideo de FVII possuindo a sequência de aminoácidos definida em SEQ ID NO:3 ou em um residuo correspondente em um polipeptideo de FVII, em que a modificação é a substituição na posição 286 por um aminoácido básico, que resulta em um polipeptideo de FVII modificado que apresenta atividade coagulante aumentada em relação ao polipeptideo de FVII que não sofreu modificação na posição 286. O aminoácido básico pode ser escolhido entre Arg (R), Lys (K) e His (H). Por exemplo, um polipeptideo de FVII modificado provido aqui pode conter uma substituição de Gin (Q) com Arg (R) na posição 286.

Em alguns exemplos, os polipeptideos de FVII modificados têm apenas a modificação única na posição 286. Em outros exemplos, os polipeptideos de FVII modificados também contêm uma ou mais modificações adicionais em outra posição no polipeptideo de FVII. A modificação adicional pode ser uma substituição, inserção ou exclusão de aminoácido. Por exemplo, a modificação adicional pode ser uma substituição de aminoácido em uma posição correspondente a uma posição selecionada entre A51, S52, P54, S60, Q66, Y68, K109, S119, A122, G124, T130, E132, V158, T239, K161, A175, D196, H257, Q286, L287, K197, R290, K199, R202, H216, S222, A292, A294, E296, M298, G237, L305, S314, G318, P321, K337 , K341, Q366, H373, F374, E394 , P395 e R396. Exemplares de tais modificações incluem D196K, D196R, D196A, D196Y, D196F, D196W, D196L, D196I, K197Y, K197A, K197E, K197D, K197L, K197M, K197I, K197V, K197F, K197W, K199A, K199D, K199E, G237W, G237T, G237I, G237V, T239A, R290A, R290E, R290D, R290N, R290Q, R290K, R290M, R290V, K341E, K341R K34 IQ, K341N, K341M, K341D, G237T238insA, G237T238insS, G237T238insV, G237T238insAS, G237T238insSA, D196K197insK, Dl96K197insR, D196K197insY, D196K197insW, D196K197insA, D196K197insM, K197I198insE, Kl 971198insY, K197I198insA, K197I198insS, T239S, T239N, T239Q, T239V, T239L, T239H, T239I, L287T, M298Q, P321K, P321E, P321Y, P321S, Q366D, Q366E, Q366N, Q366T, Q3 66S, Q366V, Q366I, Q366L, Q366M, H373D, H373E, H373S, H373L, H373I, H373F, H373A, K161S, K161A, K161V, H216S, H216A, H216K, H216R, S222A, S222K, S222V , S222N S222E, S222D, H257A,- H257S, Gla troca FIX, {Gla troca FIX/E40L}, {Gla troca FIX/K43I}, {Gla troca FIX/Q44S}, {Gla troca FIX/M19K}, (Gla troca FIX/M19K/E40L/K43I/Q44S}, Gla troca FX, Gia troca Prot C, Gia troca Prot S, Gia troca trombina, S52A, S60A, E394N, P395A, R396S, R202S, A292N, A294S, G318N, A175S, K109N, A122N, G124S, A51N, T130N, E132S, S52N, P54S, S119N, L121S, T128N, P129A, Q66N, Y68S, S103S1lldelinsQRLMEDICLPRWGCLWEDDF, Hl15S126delinsQRLMEDICLPRWGCLWEDDF, T128P134delinsQRLMEDICLPRWGCLWEDDF, S103SllldelinsIEDICLPRWGCLWE, H115S126delinsIEDICLPRWGCLWE, T128P134delinsIEDICLPRWGCLWE, S103SllldelinsDICLPRWGCLWED, H115S126delinsDICLPRWGCLWED, T128P134delinsDICLPRWGCLWED, P406insIEDICLPRWGCLW, P406insGGGSIEDICLPRWGCLW, P40βinsDICLPRWGCLWED, P406insGGGSDICLPRWGCLWED, S103SllldelinsSFGRGDIRNV, H115S126delinsSFGRGDIRNV, TÍ27P134delinsSFGRGDIRNV, P406insCSFGRGDIRNVC, P406insGGGSCSFGRGDIRNVC, V158T, V158D, L287T, E296V, M298K e M298Q. Exemplares dos polipeptídeos de FVII modificados providos aqui são aqueles que contêm as modificações Q286R/M298Q, Q286R/Gla Troca FIX, Q286R/H257A, Q286R/S222A, Q286R/S222A/H257A, Q286R/S222A/Gla Troca FIX, Q286R/H257A/Gla Troca FIX, Q286R/S222A/H257A/Gla troca FIX, Q286R/M298Q/K341Q, Q286R/M298Q/K199E, Q286R/M298Q/Gla troca FIX, Q286R/Q366V, Q286R/A292N/A294S/Q366V, A175S/Q286R/Q366V, S222A/Q286R/Q366V, H257S/Q286R, H257S/Q286R/Q366V, S222A/H257A/Q286R/Q366V, Q286R/H373A, S222A/H257A/Q286R/M158Q, Q286R/K341D, Q286R/Q366D, Q286R/Q366N, Q286R/M298Q/Q366D, Q286R/M298Q/Q366N, Q286R/H373F, Q286R/M298Q/H373F, (Gla troca FIX/E40L}/ Q286R/M298Q, {Gla troca FIX/K431}/Q286R/M298Q, {Gia troca FIX/Q44S)/Q286R/M298Q, {Gla troca FIX/M19K}/Q286R/M298Q, {Gla troca FIX/M19K/E40L/K43I/Q44S}/Q286R/M298Q, T128N/P129A/Q286R, T128N/P129A/Q286R/M298Q, T128N/P129A/Q286R/H373F VI58D/Q286R/E296V/M298Q, Gla troca FIX/T128N/P129A/S222A/Q286R, Gla Troca FIX/T128N/P129A/Q286R/M298Q, T128N/P129A/S222A/H257A/Q286R/M298Q, T128N/P129A/Q286R/M298Q/H373F, S52A/S60A/Q286R, Gla troca FIX/S52A/S60A/S222A/Q286R, S52A/S60A/Q286R/M298Q, Gla Troca FIX/S52A/S60A/Q286R/M298Q, S52A/S60A/S222A/H257A/Q286R/M298Q, S52A/S60A/Q286R/H373F, S52A/S60A/Q286R/M298Q/H373F, T239V/Q286R, Gla troca FIX/S222A/T239V/Q286R, T239V/Q286R/M298Q, S222A/T239V/H257A/Q286R/M298Q, Gla Troca FIX/T239V/Q286R/M298Q, T239V/Q286R/H373F, T239V/Q286R/M298Q/H373F, T239I/Q286R, Gla troca FIX/S222A/T239I/Q286R, T239I/Q286R/M298Q, S222A/T239I/H257A/Q286R/M298Q, Gla troca FIX/T239I/Q286R/M298Q, T2391/Q286R/H373F, T239I/Q286R/M298Q/H373F, Gla troca FIX/S222A/Q286R/H373F, Gla troca FIX/S222A/Q286R/M298Q, Gla troca FIX/S222A/Q286R/M298Q/H373F, V158D/Q286R/E296V/M298Q/H373F, H257A/Q286R/M298Q, H257S/Q286R/M298Q, Gla troca FIX/T128N/P129A/A175S/S222A/Q286R, Gla Troca FIX/A122N/G124S/A175S/S222A/Q286R, T128N/P129A/A175S/Q286R/M298Q, A122N/G124S/A175S/Q286R/M298Q, T128N/P129A/A175S/S222A/H257A/Q286R/M298Q, A122N/G124S/A175S/S222A/H257A/Q286R/M298Q, T128N/P129A/A175S/Q286R/M298Q/H373F, A122N/G124S/A175S/Q286R/M298Q/H373F, {Gla troca FIX/K43I}/ T128N/P129A/Q286R/M298Q, T128N/P129A/Q286R/M298Q/Q366N, {Gla troca FIX/K43I}/Q286R/M298Q/Q366N, {Gla troca FIX/K43I)/T128N/FI29A/Q286R/M298Q/Q366N, V158D/Q286R/E296V/M298Q, T128N/P129A/Q286R/M298Q/Q366N/H373F, T239V/Q286R/M298Q/Q366N, T239I/Q286R/M298Q/Q366N, T128N/P129A/T239V/Q286R/M298Q, T128N/P129A/S222A/T239V/H257A/Q286R/M298Q, T128N/P129A/T239V/Q286R/M298Q/H373F, T128N/P129A/T239I/Q286R/M298Q ou T128N/P129A/T239I/Q286R/M298Q/H373F.

Providos aqui estão polipeptídeos de FVII modificados contendo duas ou mais modificações em um polipeptideo de FVII, variantes de espécies ou alélicas dos mesmos ou fragmentos ativos do mesmo. Pelo menos uma das modificações em tais polipeptídeos está em uma posição correspondente à posição Q286 em um polipeptideo de FVII tendo uma sequência de aminoácidos definida na SEQ ID NO:3 ou nos resíduos correspondentes em um polipeptideo de FVII, desde que a modificação na posição Q286, isoladamente ou em combinação com qualquer outra modificação, não resulte na introdução de um novo sítio de glicosilação em comparação com o polipeptídeo de FVII não modificado. Tais modificações podem ser uma substituição, inserção ou exclusão de aminoácido. Por exemplo, a modificação na posição Q286 pode ser uma substituição por um aminoácido selecionados entre Arg (R) , Lys (K) His (H) , Tyr (Y) , Gly (G) , Phe (F), Met (M) , He (I), Leu (L) , Val (V), Pro (P) Glu, (E), Trp (W), Asp (D) e Cys (C). Em alguns exemplos, a modificação é Q286R. Uma ou mais outras modificações podem ser escolhidas entre D196K, D196R, D196A, D196Y, D196F, D196W, D196L, D196I, K197Y, K197A, K197E, K197D, K197L, K197M, K197I, K197V, K197F, K197W, K199A, K199D , K199E, G237W, G237T, G237I, G237V, T239A, R290A, R290E, R290D, R290N, R290Q, R290K, R290M, R290V, K341E, K341R, K341Q, K341N, K341M, K341D, G237T238insA, G237T238insS, G237T238insV, G237T238insAS, G237T238insSA , D196K197insK, D196K197insR, D196K197insY, D196K197insW, Dl96K197insA, D196K197insM, K197H98insE, K197I198insY, K197I198insA, K197I198insS, T239S, T239N, T239Q, T239V, T239L, T239H, T239I, L287T, P321K, P321E, P321Y, P321S, Q366D, Q366E, Q366N, Q366T, Q366S, Q366V, Q366I, Q366L, Q366M, H373D, H373E, H373S, H373F, H373A, K161S, K161A, K161V, H216S, H216A, H216K, H216R, S222A, S222K, S222V, S222N, S222E, S222D, H257A, H257S, Gla troca FIX, {Gla troca FIX/E40L}, {Gla troca FIX/K43I}, {Gla troca FIX/Q44S}, {Gla troca FIX/M19K}, {Gla troca FIX/M19K/E40L/K43I/Q44S) , Gla Troca FX, Gla Troca Prot C, Gla Troca Prot S, Gla Troca trombina 137459 S52A, S60A, E394N, P395A, R396S, R202S, A292N, A294S, G318N, A175S, K109N, A122N, G124S, A51N, T130N, E132S, S52N, P54S, S119N, L121S, T128N, P129A, Q66N, Y68S, S103SllldelinsQRLMEDICLPRWGCLWEDDF, H115S126delinsQRLMEDICLPRWGCLWEDDF, T128P134delinsQRLMEDICLPRWGCLWEDDF, S103SllldelinsIEDICLPRWGCLWE, H115S126delinsIEDICLPRWGCLWE, T128P134delinsIEDICLPRWGCLWE, S103SllldelinsDICLPRWGCLWED, Hl15S12βdelinsDICLPRWGCLWED, T128P134delinsDICLPRWGCLWED, P406insIEDICLPRWGCLW, P40βinsGGGSIEDICLPRWGCLW, P406insDICLPRWGCLWED, P406insGGGSDICLPRWGCLWED, S103SllldelinsSFGRGDIRNV, H115S12βdelinsSFGRGDIRNV, T127P134delinsSFGRGDIRNV, P4OδinsCSFGRGDIRNVC, P406insGGGSCSFGRGDIRNVC, V158T, V158D, L287T, E296V M298K e M298Q.

Em alguns exemplos, os polipeptideos de FVII modificados contêm uma modificação em uma posição correspondente P54, P66, L121, A122, P129 ou E132 em um polipeptideo de FVII tendo uma sequência de aminoácidos definida em SEQ ID NO:3 ou em residues correspondente em um polipeptideo de FVII. Modificações exemplares incluem P54S, Q66N, L121S, A122N, P129A e E132S. Em alguns exemplos, polipeptideos de FVII modificados contendo uma modificação em uma posição correspondente P54, P66, L121, A122, P129 ou E132 também contêm uma ou mais modificações adicionais, incluindo substituições, inserções ou exclusões de aminoácidos em outra posição no polipeptideo FVII. Tais modificações incluem P54S, S52N, Y58S, S119N, G124S, T128N, T130N, V158D, A175S, S222A, G241S, E296V, M298Q, E394N, P395A, R396S, G318N e Q366V. Assim, exemplares das modificações em combinação em um polipeptídeo de FVII providas aqui são S119N/L121S, T128N/P129A, A122N/G124S, A122N/G124S/A175S, A122N/G124S/E394N/P395A/R396S, A122N/G124S/E394N/P395A/R396S/G318N, A122N/G124S/E394N/P395A/R396S, S52N/P54S/A122N/G124S/E394N/P395A/R396S, S52N/P54S, Sil9N/L121S/A175S, T128N/P129A/A175S, T130N/E132S, Q66N/Y68S, T128N/P129A/V158D/E296V/M298Q, T128N/P129A/S222A, T128N/P129A/A175S/Q366V, A122N/G124S/A175S/Q366V, T128N/P129A/A175S/S222A, A122N/G124S/A175S/S222A, T128N/P129A/M298Q e T128N/P129A/M298Q/H373F.

Também providos aqui estão polipeptídeos de FVII modificados contendo uma modificação correspondente a T239S, T239Q, T239V, T239L, T239H, T239I, P321K, P321E, P321Y, P321S, Q366D, Q366N, Q366V, Q366I, Q366L, Q366M, H373D, H373E, H373S, H373F, H373A, K161S, K161V, H216S, H216K, H216R, S222A, S222K, S222V, S222D, S222N, S222E ou H257S em um polipeptídeo de FVII tendo uma sequência de aminoácidos definida em SEQ ID NO:3 ou nos residues correspondentes em um polipeptídeo de FVII. Além disso, tais polipeptídeos modificados de FVII também podem conter uma ou mais modificações adicionais em outra posição, como a posição de aminoácidos A51, S52, P54, S60, Q66, Y68, K109, S119, A122, G124, T130, E132, V158, K161, A175, D196, K197, K199, R202, H216, S222, G237, T239, H257, Q286, L287, R290, A292 , A294, E296, M298, L305, S314, G318, P321, K337, K341, Q366, H373, F374, E394 , P395 e R396.

Modificações exemplares nessas posições incluem Q286N, Q286E, Q286D, Q286S, Q286T, Q286R, Q286K, Q286A, Q286V, Q286M, Q286L, Q286Y, D196K, D196R, D196A, D196Y, D196F, D196W, D196L, D196I, K197Y, K197A, K197E, K197D, K197L, K197M, K197I, K197V, K197F, K197W, K199A, K199D, K199E, G237W, G237T, G237I, G237V, T239A, R290A, R290E, R290D, R290N, R290Q, R290K, R290M, R290V, K341E, K341R, K341Q, K341N, K341M, K341D, G237T238insA, G237T238insS, G237T238insV, G237T238insAS, G237T238insSA, D196K197insK D196K197insR, D196K197insY, D196K197insW, D196K197insA, D196K197insM, K197I198insE, K197ll98insY, K197I198insA, KI97I198insS, T239S, T239N, T239Q, T239V, T239L, T239H, T239I, L287T, P321K, P321E, P321Y, P321S, Q366D, Q366E, Q366N, Q366T, Q366S, Q366V, Q366I, Q366L, Q366M, H373D, H373E, H373S, H373F, H373A, K161S, K161A, K161V, H216S, H216A, H216K, H216R, S222A, S222K, S222V, S222N, S222E, S222D, H257A, H257S, Gla troca FIX, Gla troca FX, Gla Troca Prot C, Gla Troca Prot S, Gla troca trombina, Gla Troca FIX, {Gla Troca FIX/E40L}, {Gla Troca FIX/K43I), {Gla Troca FIX/Q44S}, {Gla Troca FIX/M19K}, {Gla Troca Fix/Ml9K/E40L/K431/Q44S} , S52A, S60A, E394N, P395A, R396S, R202S, A292N, A294S, G318N, A175S, K109N, A122N, G124S, A51N, T130N, E132S, S52N, P54S, S119N, L121S, T128N, P129A, Q66N, Y68S, S103SllldelinsQRLMEDICLPRWGCLWEDDF, H115S126delinsQRLMEDICLPRWGCLWEDDF, T128P134delinsQRLMEDICLPRWGCLWEDDF S103SllldelinsIEDICLPRWGCLWE, H115S126delinsIEDICLPRWGCLWE, T128P134delinsIEDICLPRWGCLWE, S103SllldelinsDICLPRWGCLWED, Hl15S12βdelinsDICLPRWGCLWED, T128P134delinsDICLPRWGCLWED, P406insIEDICLPRWGCLW, P406insGGGSIEDICLPRWGCLW, P40βinsDICLPRWGCLWED, P4OβinsGGGSDICLPRWGCLWED, S103SllldelinsSFGRGDIRNV, Hl15S12βdelinsSFGRGDIRNV, T127P134delinsSFGRGDIRNV, P406insCSFGRGDIRNVC, P40βinsGGGSCSFGRGDIRNVC, V158T, V158D, L287T, M298K e M298Q. As modificações em combinação resultantes podem incluir Q366D/H373E, Q366V/H373V, Q366V/H373L, Q366V/H373I, S222K/H257A, H216A/S222A, S222S/Gla Troca FIX, S222A/H257A/Gla Troca FIX, S222A/M298Q, S222A/H257A/M298Q, S222A/A292N/A294S/Q366V, A175S/S222A/Q366V, S222A/Q366V, H257S/Q366V, S222A/H373A, M298Q/H373F, S52A/S60A/S222A, S222A/T239V V158D/T239V/E296V/M298Q, S222A/T239I, V158D/E296V/M298Q/H373F, Gla troca FIX/Q366V, M298Q/Q366N/H373F, T239V/M298Q/H373F e T239I/M298Q/H373F.

Providos aqui estão polipeptideos de FVII modificados contendo duas ou mais modificações em um polipeptideo de FVII, variantes de espécie e alélicas dos mesmos ou fragmentos ativos dos mesmos, em que duas ou mais modificações de aminoácidos são selecionadas entre as modificações de aminoácidos correspondente a H216A, H257A, E394N, P395A, R396S, K109N, A292N, A175S, H257A e Gla troca FIX. Por exemplo, os polipeptideos de FVII modificados providos aqui incluem aqueles com modificações selecionadas entre H216A/H257A, E394N/P395A/R396S e K109N/A175S. Além disso, uma modificação correspondente a M298Q ou A294S também pode ser incluída. Assim, também providos aqui são polipeptídeos de FVII modificados contendo modificações selecionadas entre H216A/H257A, E394N/P395A/R396S e K109N/A175S. Em alguns exemplos, os polipeptídeos de FVII 5 modificados contêm também uma modificação correspondente a M298Q ou A294S. Isso pode resultar em, por exemplo, um polipeptídeo de FVII modificado contendo as modificações H257A/M298Q ou K109N/A292N/A294S. Também providos são polipeptídeos de FVII modificados contendo 10 modificações correspondentes a S52A/S60A/V158D/E296V/M298Q ou V158D/T239I/E296V/M298.

Em alguns exemplos, os polipeptídeos de FVII modificados providos aqui contêm uma sequência de ligação de albumina no soro, como uma sequência de aminoácidos 15 definida em qualquer uma das SEQ ID NOS: 103-109, ou uma porção suficiente para efetuar ligação de albumina no soro. Tais polipeptídeos de FVII modificados podem apresentar afinidade aumentada para ou ligação à albumina no soro comparado ao polipeptídeo de FVII não modificado. Por 20 exemplo, polipeptídeos de FVII modificados contendo uma sequência de ligação de albumina no soro pode apresentar pelo menos cerca de ou 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100%, 200%, 300%, 400%, 500% 25 ou mais afinidade aumentada para ou ligação à albumina no soro. A sequência de ligação de albumina no soro pode substituir uma sequência adjacente de resíduos de aminoácidos do polipeptídeo de FVII não modificado.

Polipeptídeos de FVII modificados contendo uma sequência de ligação de albumina no soro pode incluir uma modificação selecionada entre SI03S1lldelinsQRLMEDICLPRWGCLWEDDF, Hll5S126delinsQRLMEDICLPRWGCLWEDDF, T128P134delinsQRLMEDICLPRWGCLWEDDF, S103SllldelinsIEDICLPRWGCLWE, H115S126delinsIEDICLPRWGCLWE, T128P134delinsIEDICLPRWGCLWE, S103SllldelinsDICLPRWGCLWED, H115S126delinsDICLPRWGCLWED, T128P134delinsDICLPRWGCLWED, P406insIEDICLPRWGCLW, P40βinsGGGSIEDICLPRWGCLW, P40δinsDICLPRWGCLWED e P406insGGGSDICLPRWGCLWED.

Providos aqui estão polipeptídeos de FVII modificados contendo uma sequência de ligação de integrina plaquetária «ubβa- Tais polipeptídeos de FVII modificados podem apresentar afinidade aumentada para ou ligação de integrina plaquetária oiiibβs em comparação com o polipeptídeo de FVII não modificado. Por exemplo, polipeptídeos de FVII modificados contendo uma sequência de ligação de integrina plaquetária αnbβa podem apresentar pelo menos cerca de ou 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100%, 200%, 300%, 400%, 500% ou mais afinidade aumentada para ou ligação de integrina plaquetária αnbβa em comparação ao polipeptídeo de FVII não modificado. Exemplos de sequência de ligação de albumina no soro incluem aquelas sequência de aminoácidos definidas em qualquer uma das SEQ ID NOS: 110-112, ou uma porção suficiente da mesma para efetuar ligação de integrina plaquetária αiibβs ligação, que pode substituir uma sequência adjacente de resíduos de aminoácidos de polipeptideo de FVII não modificado. Polipeptídeos de FVII modificados contendo uma modificação selecionada entre S103SllldelinsSFGRGDIRNV, H115S126delinsSFGRGDIRNV, T127P134delinsSFGRGDIRNV, P4OβinsCSFGRGDIRNVC e P40βinsGGGSCSFGRGDIRNVC.

Os polipeptídeos de FVII modificados contendo uma sequência de ligação de albumina no soro ou integrina plaquetária otπbβs também podem conter uma ou mais modificações adicionais em outra posição no polipeptideo de FVII, como a substituição de aminoácido em uma posição correspondente a uma posição G237V. Assim, também providos aqui estão polipeptídeos de FVII modificados contendo uma modificação selecionada entre S103SllldelinsIEDICLPRWGCLWE/G237V, S103SllldelinsDICLPRWGCLWED/G237V, H115S126delinsQRLMEDICLPRWGCLWEDDF/G237V, H115S126delinsIEDICLPRWGCLWE/G237V, Hl15S126delínsDICLPRWGCLWED/G237V, T128P134delinsQRLMEDICLPRWGCLWEDDF/G237V, T128P134delinsIEDICLPRWGCLWE/G237V, S103SllldelínsQRLMEDICLPRWGCLWEDDF/G237V e T128P134delinsDICLPRWGCLWED/G237V.

Em alguns exemplos, os polipeptídeos de FVII modificados providos aqui contêm 2, 3, 4, 5, 6, 7 ou mais modificações. Em outros exemplos, os polipeptídeos de FVII modificados providos aqui contêm um domínio de Gla heterólogo, ou uma porção suficiente do mesmo para efetuar ligação de fosfolipideo. Tais polipeptideos podem apresentar afinidade aumentada para ou ligação aos fosfolipideos em comparação com o polipeptideo de FVII não modificado, tal como pelo menos cerca ou 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100%, 200%, 300%, 400%, 500% ou mais de afinidade aumentada para ou ligação a fosfolipidios. O dominio de Gla heterólogo pode ser selecionado entre um dominio de Gla no Fator IX (FIX), Fator X (FX), protrombina, proteina C, proteina S, osteocalcina, proteina de Gla matriz, proteina especifica de detenção de crescimento 6 (Gas6) e proteina Z e, em alguns exemplos, podem ter uma sequência de aminoácidos definida em qualquer uma das SEQ ID NOS: 83-91, 93 e 94, ou uma porção suficiente da mesma para efetuar ligação a fosfolipideo. Todo ou uma parte adjacente do dominio de Gla de FVII nativo, que pode incluir aminoácidos 1-45 em um polipeptideo de FVII tendo uma sequência de aminoácidos definida em SEQ ID NO:3, ou em residues correspondentes em um polipeptideo de FVII, pode ser removido e substituído pelo dominio Gla heterólogo, oü uma porção suficiente do mesmo para efetuar ligação a fosfolipideo.

Polipeptideos de FVII modificados providos aqui podem apresentar resistência aumentada à antitrombina III em comparação com o polipeptideo de FVII não modificado. Tal polipeptideo de FVII modificado pode apresentar pelo menos ou cerca de 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100%, 200%, 300%, 400%, 500% ou mais resistência à antitrombina III em comparação com o polipeptideo de FVII não modificado. Os polipeptideos de FVII modificados providos aqui também podem apresentar atividade catalítica ou coagulante aumentada em comparação com o polipeptideo de FVII não modificado, tal como um aumento de pelo menos cerca de 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100%, 200%, 300%, 400%, 500% ou mais, comparado a um polipeptideo de FVII não mdofiçado. Além disso, os polipeptideos de FVII modificados providos aqui podem apresentar resistência aumentada à TFPI em comparação com o polipeptideo de FVII não modificado. Tais polipeptideos de FVII modificados podem ser pelo menos ou cerca de 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50 %, 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100%, 200%, 300%, 400%, 500% ou mais resistentes à TFPI comparado a um polipeptideo de FVII não modificado. Polipeptideos de FVII modificados providos aqui também podem apresentar resitência aumentada aos efeitos inibidores de Zn2+ em comparação com o polipeptideo de FVII não modificado. Por exemplo, uma polipeptideo de FVII modificado pode ser pelo menos ou cerca de 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100%, 200%, 300%, 400%, 500% ou mais resistentes aos efeitos inibidores de Znz+ em comparação com um polipeptideo de FVII não modificado.

Em alguns exemplos, os polipeptídeos de FVII modificados providos aqui contêm uma ou mais modificações que introduzem e/ou eliminam um ou mais locais de glicosilação em relação ao polipeptídeo de FVII não modificado. Por exemplo, 1, 2, 3, 4, 5, 6 ou mais locais de glicosilação podem ser introduzidos ou eliminados. Locais de glicosilação que podem ser introduzidos ou eliminados incluem locais de N-glicosilação e locais de O- glicosilação. Os polipeptídeos de FVII modificados providos aqui podem conter uma ou mais modificações adicionais de aminoácido(s) que aumenta a resistência à antitrombina-III, aumenta a ligação e/ou afinidade aos fosfolipídios, aumenta a afinidade para o fator tecidual, aumenta a atividade intrínseca, aumenta a actividade dependente de TF, aumenta a atividade coagulante, altera a conformação do polipeptídeo para alterar zimogenicidade, aumenta a atividade catalítica ou coagulante deslocando o equilíbrio entre as conformações de FVIIa altamente ativa e menos ativa em favor das conformações altamente ativas, aumenta a resistência às proteases, diminui a glicosilação, aumenta a glicosilação, reduz a imunogenicidade, aumenta a estabilidade e/ou facilita a ligação do grupo químico. Em alguns exemplos, o zimogenicidade alterada confere uma forma mais semelhante a zimogênio ou uma forma menos semelhante a zimogênio.

Em alguns exemplos, os polipeptídeos de FVII modificados providos aqui contêm uma ou mais modificações adicionais de aminoácido(s) selecionados entre S279C/V302C, L280C/N301C, V281C/V302C, S282C/V299C, a inserção de uma tirosina na posição 4, F4s, F4T, P10Q, P10E, P10D, P10N, Q21N, R28F, R28E, I30C, I30D, I30E, K32D, K32Q, K32E, K32G, K32H, K32T, K32C, K32A, K32S, D33C, D33F, D33E, D33K, A34C, A34E, A34D, A34I, A34L, A34M, A34V, A34F, A34W, A34Y, R36D, R36E, T37C, T37D, T37E, K38C, K38E, K38T, K38D, K38L, K38G K38A, K38S, K38N, K38H, L39E, L39Q, L39H, W41N, W41C, W41E, W41D, I42R, I42N, I42S, I42A, I42Q, I42N, I42S, I42A, I42Q, I42K, S43Q, S43N, Y44K, Y44C, Y44D, Y44E, S45C, S45D, S45E, D46C, A51N, S53N, G58N, G59S, G59T, K62E, K62R, K62D, K62N, K62Q, K62T, L65Q, L65S, L65N, F71D, F71Y, F71E, F71Q, F71N, P74S, P74A, A75E, A75D, E77A, E82Q, E82N, E82S, E82T, T83K, N95s, N95T, G97S, G97T , Y101N, D104N, T106N, K109N, E116D, G117N, G124N, S126N, T128N, L141C, L141D, L141E, El 42 D, E142C, K143C, K143D, K143E, R144E, R144C, R144D, N145Y, N145G, N145F, N145M, N145S, N145I, N145L, N145T, N145V, N145P, N145K, N145H, N145Q, N145E, N145R, N145W, N145D, N145C, K157V, K157L, K157I, K157M, K157F, K157W, K157P, K157G, K157S, K157T, K157C, K157Y, K157N, K157E, K157R, K157H, K157D, K157Q, V158L, V158I, V158M, V158F, V158W, V158P, V158G, V158S, V158T, V158C, V158Y, V158N, V158E, V158R, V158K, V158H, V158D, V158Q, A175S, A175T, G179N, I186S, I186T, V188N, R202S, R202T, I205S, I205T, D212N, E220N, I230N, P231N, P236N, G237N, Q250C, V253N, E265N, T267N, E270N, A274M, A274L, A274K, A274R, A274D, A274V, A274I, A274F, A274W, A274P, A274G, A274T, A274C, A274Y, A274N, A274E, A274H, A274S, A274Q, F275H, R277N, F278S, F278A, F278N, F278Q, F278G, L280N, L288K, L288C, L288D, D289C, D289K, L288E, R290C, R290G, R290A, R290S, R290T, R290K, R290D, R290E, G291E, G291D, G291C, G291N, G291K, A292C, A292K, A292D, A292E, T293K, E296V, E296L, E296I, E296M, E296F, E296W, E296P, E296G, E296S, E296T, E296C, E296Y, E296N, E296K, E296R, E296H, E296D, E296Q, M298Q, M298V, M298L, M298I, M298F, M298W, M298P, M298G, M298S, M298T, M298C, M298Y, M298N, M298K, M298R, M298H, M298E, M298D, P303S, P303T/ R304Y, R304F, R304L, R304M, R304G, R304T, R304A, R304S R304N, L305V, L305Y, L305I, L305F, L305A, L305M, L3O5W, L305P, L305G, L305S, L305T, L305C, L305N, L305E, L305K, L305R, L305H, L305D, L305Q, M306D, M306N, D309S, D309T, Q312N, Q313K, Q313D, Q313E, S314A, S314V, S314I, S314M, S314F, S314W, S314P, S314G, S314L, S314T, S314C, S314Y, S314N, S314E, S314K, S314R, S314H, S314D, S314Q, R315K, R315G, R315A, R315S, R315T, R315Q, R315C, R315D, R315E, K316D, K316C, K316E, V317C, V317K, V317D, V317E, G318N, N322Y, N322G, N322F, N322M, N322S, N322I, N322L, N322T, N322V, N322P, N322K, N322H, N322Q, N322E, N322R, N322W, N322C, G331N, Y332S, Y332A, Y332N, Y332Q, Y332G, D334G, D334E, D334A, D334V, D334I, D334M, D334F, D334W, D334P, D334L, D334T, D334C, D334Y, D334N, D334K, D334R, D334H, D334S, D334Q, S336G, S336E, S336A, S336V, S336I, S336M, S336F, S336W, S336P, S336L, S336T, S336C, S336Y, S336N, S336K, S336R, S336H, S336D, S336Q, K337L, K337V, K337I, K337M, K337F, K337W, K337P, K337G, K337S, K337T, K337C, K337Y, K337N, K337E, K337R, K337H, K337D, K337Q, K341E, K341Q, K341G, K341T, K341A, K341S, G342N, H348N, R353N, Y357N, I361N, F374P, F374A, F374V, F374I, F374L, F374M, F374W, F374G, F374S, F374T, F374C, F374Y, F374N, F374E, F374K, F374R, F374H, F374D, F374Q, V376N, R379N, L390C, L390K, L390D, L390E, M391D, M391C, M391K, M391N, M391E, R392C, R392D, R392E, S393D, S393C, S393K, S393E, E394K, P395K, E394C, P395D, P395C, P395E, R396K, R396C, R396D, R396E, P397D, P397K, P397C, P397E, G398K, G398C, G398D, G398E, V399C, V399D, V399K, V399E, L400K, L401K, L401C, L401D, L401E, R402D, R402C, R402K, R402E, A403K, A403C, A403D, A403E, P404E, P404D, P404C, P404K, F405K, P406C, K32N/A34S , K32N/A34T, F31N/D33S, F31N/D33T, I30N/K32S, I30N/K32T, A34N/R36S, A34N/R36T, K38N/F40S, K38N/F40T, T37N/L39S, T37N/L39T, R36N/K38S, R36N/K38T, L39N/W41S, L39N/W41T, F40N/I42S, F40N/I42T, I42N/Y44S, I42N/Y44T, Y44N/D46S Y44N/D46T, D46N/D48S, D46N/D48T, G47N/Q49S, G47N/Q49T, K143N/N145S, P395N/P397T, R396N/G398S, R396N/G398T, P397N/V399S P397N/V399T, G398N/L400S, G398N/L400T, V399N/L401S, V399N/L401T, L400N/R402S, L400N/R402T, L401N/A403S, L401N/A403T, R402N/P404S, R402N/P404T, A403N/F405S, A403N/F405T, P404N/P406S e P404N/P406T. Em alguns exemplos, os polipeptideos de FVII modificados contêm também uma substituição de posições 300-322, 305-322, 300-312 ou 305- 312 com aminoácidos correspondentes de tripsina, trombina ou FX, ou a substituição de posições 310-329, 311-322 ou 233-329 com os aminoácidos correspondentes da tripsina.

Exemplares de polipeptideos de FVII modificados providos aqui são aqueles que têm uma sequência de aminoácidos definida em qualquer de SEQ ID NOS: 113-273. Em alguns exemplos, as modificações são feitas em um polipeptideo de FVII não modificado que é uma variante alélica ou de espécie do polipeptideo definido em SEQ ID NO:3. As variantes alélicas ou de espécie ou outra variante pode ter 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência para o polipeptideo definido em SEQ ID NO:3, excluindo a modificação de aminoácidos. Os polipeptideos de FVII modificados providos aqui podem ser um polipeptideo humano, um polipeptideo não-humanos e/ou um polipeptideo maduro. Em alguns exemplos, apenas a sequência principal é modificada. Em outros exemplos, uma modificação quimica ou uma modificação pós-translacional também está incluida. Por exemplo, os polipeptideos de FVII modificados podem ser glicosilados, carboxilados, hidroxilados, sulfatados, fosforilados, albuminados ou conjugados com uma fração de polietileno glicol (PEG).

Os polipeptídeos de FVII modificados aqui providos podem ser polipeptídeos de cadeia única, polipeptídeos de duas cadeias e/ou ativos ou ativados. A ativação pode ser feita por divagem proteolítica por autoativação, divagem pelo Fator IX (FIXa), divagem pelo Fator X (FXa) , divagem pelo Fator XII (FXIIa) ou divagem pela trombina.

Os polipeptídeos de FVII modificados providos aqui podem reter uma ou mais actividades do polipeptídeo de FVII não modificado. Por exemplo, os polipeptídeos de FVIImodifiçados pode conter modificações em 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 ou 60 posições de aminoácido tanto quanto o polipeptídeo retém pelo menos uma atividade de FVII do polipeptídeo de FVII não modificado. Tais polipeptídeos de FVII modificados pode reter pelo menos cerca de 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100%, 200%, 300%, 400%, 500% ou mais de uma atividade do polipeptídeo de FVII não modificado. Em alguns exemplos, uma ou mais atividades são selecionadas entre ligação de fator tecidual (TF) , ativação de fator X (FX) , ativação de Fator IX (FIX), ligação de fosfolipídios e atividade de coagulação. Além disso, atividades que são retidas podem aumentar ou diminuir em comparação com o polipeptídeo de FVII não modificado. Em alguns exemplos, a atividade de coagulação é aumentada comparada ao polipeptídeo de FVII não modificado, tal como pelo menos cerca de 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100%, 200%, 300%, 400%, 500% ou mais da atividade coagulante do polipeptideo de FVII não modificado. As atividades podem ser medidas in vitro, ex vivo ou in vivo.

Providos aqui estão moléculas de ácido nucléico contendo uma sequência de nucleotideos codificando polipeptídeos de FVII modificados providos aqui. Também são providos vetores contendo tais moléculas de ácido nucléico, incluindo vetores procarióticos, vetores virais ou vetores eucarióticos, como um vetor de mamiferos. Os vetores virais pode ser selecionado dentre um adenovirus, um virus adeno- associado., um retrovirus, um virus de herpes, um lentivirus, um poxvirus e citomegalovirus. Providas aqui estão células que contêm esses vetores, incluindo células eucarióticas, como células de mamiferos. Exemplares de células de mamiferos são células renais de hamster filhote (BHK-21) ou células 293 ou células CHO. Em alguns exemplos, as células expressam o polipeptideo de FVII modificado. Assim, também estão providos aqui polipeptídeos de FVII modificados que são produzidos por essas células.

Providas aqui estão composições farmacêuticas contendo uma concentração ou quantidade terapeuticamente eficaz de qualquer polipeptideo de FVII modificado, molécula de ácido nucléico, vetor ou célula providos aqui em um veiculo farmaceuticamente aceitável. Em alguns exemplos, a composição farmacêutica é formulada para administração local, sistêmica ou tópica, tais como administração oral, nasal, pulmonar, bucal, transdérmica, subcutânea, intraduodenal, enteral, parenteral, intravenosa ou intramuscular. As composições farmacêuticas também podem ser formuladas para liberação controlada e/ou administração de dose única.

Providos aqui estão métodos de tratar um indivíduo através da administração de uma composição farmacêutica provida aqui, em que o indivíduo tem uma doença ou condição que é tratada através da administração de FVII ou um pró-coagulantes, tais como pela administração de FVII (FVIIa) ativos. Em alguns exemplos, o tratamento com a composição farmacêutica melhora ou alivia os sintomas associados com a doença ou condição. Em outros exemplos, os métodos fornecidos aqui também incluir o acompanhamento do indivíduo na mudança nos sintomas associados com a doença ou condição que é tratada pela administração de FVII ou um pró-coagulante. A doença ou condição a ser tratada usando os métodos providos aqui podem ser selecionados entre distúrbios de coagulação sanguínea, doenças hematológicas, distúrbios hemorrágicos, hemofilia (tais como a hemofilia A ou hemofilia B ou hemofilia C, hemofilia congênita ou adquirida), deficiência de fator VII e distúrbios de sangramento, incluindo complicação de sangramento devido à cirurgia (como cirurgia cardíaca, angioplastia, cirurgia torácica, cirurgia abdominal, cirurgia da coluna, cirurgia cerebral, cirurgia vascular, cirurgia dentária ou cirurgia de transplante de órgãos) ou trauma. Em alguns exemplos, o sangramento é manifestado como hemartrose aguda, artropatia hemofílica crônica, hematomas, hematúria, sangramentos no sistema nervoso central, sangramentos gastrintestinais ou hemorragia cerebral. Em outros exemplos, o sangramento é devido à extração dentária. A cirurgia de transplante pode ser selecionada entre o transplante de medula óssea, coração, pulmão, pâncreas e fígado.

Em alguns exemplos, o método provido aqui pode ser usado para tratar um indivíduo que tem auto-anticorpos contra o fator VIII ou fator IX. Os métodos providos aqui também podem incluir administrar um ou mais fatores de coagulação adicionais, tais como fatores de coagulação de plasma purificado ou recombinante, pró-coagulantes, tais como a vitamina K, derivados de vitamina K e inibidores de proteína C, plasma, plaquetas, glóbulos vermelhos e corticosteróides ou tratamentos.

Providos aqui estão artigos de manufatura contendo material de embalagem e uma composição farmacêutica provida aqui contida no material de embalagem. Em alguns exemplos, o polipeptídeo de FVII modificado na composição farmacêutica é eficaz para o tratamento de uma doença ou distúrbio mediado por FVII, e o material de embalagem inclui um rótulo que indica que o polipeptídeo de FVII modificado é usado para tratamento de uma doença ou distúrbio mediado por FVII. Também providos aqui estão kits, compreendendo uma composição farmacêutica descrita aqui, um dispositivo para a administração da composição e, opcionalmente, instruções para a administração.

DESCRIÇÃO SUMÁRIA DAS FIGURAS

A Figura 1 mostra a cascata de coagulação. A figura mostra a via intrínseca e via extrínseca de coagulação para a produção independente de FXa e convergência das vias para uma via comum de geração de trombina e fibrina para a formação de um coágulo. Estas vias estão interligadas. A figura mostra a ordem das moléculas envolvidas na cascata de ativação na qual um zimogênio é convertido em uma protease ativada pela divagem de uma ou mais ligações peptídicas. A protease ativada funciona então como a protease que ativa para a próxima molécula de zimogênio na cascata, resultando finalmente na formação de coágulos.

A Figura 2 mostra o modelo com base em células de coagulação (ver por exemplo, Hoffman et al. (2001) Thromb Haemost 85:958-965). A figura mostra os eventos de coagulação, sendo dividido em três fases, em que a iniciação da coagulação é efetuada por meio da ativação de FX para FXa pelo complexo TF/FVIIa sobre a célula que carrega TF, resultando na geração de uma pequena quantidade de trombina após ativação por FXa/FVA. A amplificação ocorre quando a trombina se liga a e ativa as plaquetas, e inicia a ativação de quantidades suficientes de fatores da coagulação adequados para formar os complexos FVIIIa/FIXa e FVa/FXa. A propagação da coagulação ocorre na superfície de um grande número de plaquetas ativadas no local da lesão, resultando em uma explosão de geração de trombina que é suficientemente grande para gerar fibrina suficiente de fibrinogênio para estabelecer um coágulo no local da lesão.

A Figura 3 mostra os mecanismos pelos quais FVIIa pode iniciar a formação de trombina. A figura ilustra a via dependente de TF da geração de trombina de FVIIa, que atua na superficie de uma célula que carrega TF e envolve complexação do FVIIa com TF antes da ativação de FX para FXa. A figura também mostra a via independente de TF da geração de trombina de FVIIa, durante a qual FVIIa se liga a fosfolipidios na plaqueta ativada e ativa FX a FXa, que por sua vez forma complexos com FVa para clivar protrombina em trombina.

DESCRIÇÃO DETALHADA

Perfil A. Definições B. Resumo Hemostasia 1. Adesão e agregação plaquetária 2. Cascata de coagulação a. Iniciação b. Amplificação c. Propagação 3. Regulação da Coagulação C. Fator VII (FVII) 1. Estrutura e organização de FVII 2. Modificações pós-translacionais 3. Processamento de FVII 4. Ativação de FVII 5. Função de FVII a. Atividade de FVIIa dependente de fator tecidual b. Atividade de FVIIa independente de fator tecidual b. FVII como um produto biofarmacêutico D. Polipeptídeos de FVII modificados 1. Atividade catalítica aumentada a. Modificações exemplares para aumentar a atividade catalítica i. Substituições de aminoácido básicas na posição 286 ii. Outras mutações na posição 286 2. Resistência aumentada à AT-III Modificações exemplares para o efeito da resistência aumentada à AT-III 3. Resistência aumentada à inibição por Zn2+ Modificações exemplares para aumentar a resistência à inibição por Zn2+ 4. Glicosilação alterada Modificações exemplares para alterar glicosilação 5. Ligação aumentada à albumina no soro e/ou de integrina plaquetária «ubβa a. Polipeptídeos de FVII exemplares com sequências de ligação de albumina no soro b. Polipeptídeos de FVII exemplares com sequências de ligação de integrina plaquetária αIIbβ3 6. Modificação pela introdução de um domínio Gla heterólogo 7. Combinações e modificações adicionais a. Modificações que aumentam a resistência à TFPI b. Modificações que aumentam a atividade intrínseca c. Modificações que aumentam a resistência à proteases d. Modificações que aumentam a afinidade de fosfolipídeos e. Modificações que alteram a glicosilação f. Modificações para facilitar a ligação de grupo químico g. Mutações de combinação exemplare E. Produção de polipeptídeos de FVII 1. Vetores e células 2. Sistemas de expressão a. Expressão procariótica b. Fermento c. Insetos e células de inseto d. Células de mamíferos e. Plantas 3. Purificação 4. Proteínas de fusão 5. Modificações de polipeptideo 6. Sequências de nucleotídeos F. Avaliação de atividades de polipeptídeos de FVII modificados 1. Ensaios in vitro a. Modificações pós-translacionais b. Atividade proteolítica c. Atividade coagulante d. Ligação e/ou inibição por outras proteínas e. Ligação de fosfolipidio 2. Modelos de animais não humanos 5 3. Ensaios clínicos G. Formulação e administração 1. Formulações a. Dosagens b. Formas de dosagem 10 2. Administração de polipeptideos de FVII modificados 3. Administração de polipeptideos de FVII modificados que codificam ácidos nucléicos (Terapia genética) H. Usos Terapêuticos I. Distúrbios de sangramento congênitos 15 a. Hemofilia b. Deficiência de FVII c. Outros 2, Distúrbios de sangramento adquiridos a. Trombocitopenia adquirida por quimioterapia b. Outras coagulopatias c. Sangramento adquirido por transplante d. Sangramento induzido por terapia anticoagulante e. Hemofilia adquirida 3. Trauma e sangramento cirúrgico I. Terapias de combinação J. Artigos de manufatura e kits K. Exemplos

A. DEFINIÇÕES

A menos que definido de outra forma, todos os termos técnicos e científicos usados aqui têm o mesmo significado que é normalmente entendido por um especialista na arte a que a invenção pertence. Todas as patentes, pedidos de patentes, pedidos publicados e publicações, sequências de GenBank, banco de dados, websites e outros materiais publicados referidos ao longo da revelação inteira aqui, a menos que indicado em contrário, são incorporados por referência, na sua totalidade. No caso em que há uma pluralidade de definições para termos aqui, aqueles nesta seção prevalecem. Quando for feita referência a uma URL ou qualquer outro deste identificador ou endereço, entende-se que tais identificadores podem mudar e informações especificas na internet podem ir e vir, mas a informação equivalente pode ser encontrada através de pesquisa na internet. Referência a ela evidencia a disponibilidade e divulgação pública de tais informações.

Conforme utilizado aqui, cascata de coagulação ou via de coagulação se refere à série de eventos de ativação que leva à formação de um coágulo de fibrina insolúvel. Na cascata ou via de coagulação, uma proteína inativa de uma protease serina (também chamado de zimogênio) é convertida em uma protease ativa por divagem de uma ou mais ligações de peptídeos, que então servem como protease que ativa a próxima molécula de zimogênio na cascata. Na etapa proteolítica final da cascata, o fibrinogênio é proteoliticamente clivado pela trombina em fibrina, que é então reticulada no local da lesão para formar um coágulo.

Conforme utilizado aqui, "hemostasia" refere-se à suspensão do sangramento ou fluxo sanguíneo em um órgão ou parte do corpo. 0 termo hemostasia pode abranger todo o processo de coagulação do sangue para evitar a perda de sangue após uma lesão dos vasos sanguíneos à dissolução subsequente do coágulo de sangue após o reparo do tecido.

Como usado aqui, "coagulação" refere-se à formação de um coágulo de fibrina insolúvel, ou o processo pelo qual os fatores de coagulação do sangue interagem na cascata de coagulação, resultando finalmente na formação de um coágulo de fibrina insolúvel.

Conforme utilizado aqui, um "protease" é uma enzima que catalisa a hidrólise de ligações peptídicas covalentes. Estas designações incluir formas de zimogênio e formas activado de cadeia única, dupla ou múltipla dos mesmo. Para maior clareza, a referência a proteases refere- se a todas as formas. Proteases incluem, por exemplo, proteases de serina, cisteína proteases, proteases aspárticas, treonina e metalo-proteases, dependendo da atividade catalítica de seu sítio ativo e mecanismo de clivagem de ligações peptídicas de um substrato alvo.

Conforme utilizado aqui, proteases de serina ou endopeptidases de serina se refere a uma classe de peptidases, que se caracterizam pela presença de um resíduo de serina no sítio ativo da enzima. Serina proteases participam de uma ampla gama de funções no organismo, incluindo a inflamação e a coagulação do sangue, bem como funcionam como enzimas digestivas em procariotas e eucariotas. 0 mecanismo de clivagem por proteases de serina é baseado em ataque nucleofílico de uma ligação peptidica orientada por uma serina. Moléculas de cisteina, treonina ou água associada com aspartato ou metais também podem desempenhar esse papel. Cadeias laterais alinhadas de serina, histidina e aspartato formam uma triade catalítica comum a muitas de proteases de serina. O sitio ativo das proteases de serina é moldado como uma fissura onde o substrato de polipeptidio se liga.

Como usado aqui, o Fator VII (FVII, F7; também conhecido como Fator 7, fator de coagulação VII, fator VII do soro, acelerador de conversão de protrombina do soro, SPCA, proconvertina e alfa eptacog) refere-se a uma protease de serina que faz parte da cascata de coagulação. FVII inclui um dominio Gla, dois domínios EGF (EGF-I e EGF- 2), e um dominio de protease de serina (ou dominio peptidase Sl) que é altamente conservada entre todos os membros da familia de peptidase SI de proteases de serina, como, por exemplo, com quimotripsina. A sequência de um precursor exemplar de FVII tendo um peptideo sinal e propeptideo está definida em SEQ ID NO:1. Um polipeptideo de FVII maduro exemplar é definido em SEQ ID NO: 3. FVII ocorre corno uma única cadeia de zimogênio, um polipeptidio de cadeia dupla semelhante a zimogênio e uma forma de cadeia dupla totalmente ativada. A ativação completa, que ocorre após a mudança conformacional de uma forma semelhante a zimogênio, ocorre após a ligação ao co-fator é o fator tecidual. Além disso, as mutações podem ser introduzidas que resultam na mudança de conformação na ausência de fator tecidual. Assim, a referência ao FVII inclui formas de cadeia simples e de cadeia dupla dos mesmos, incluindo formas semelhantes a zimogênio e de duas cadeias totalmente ativadas.

Referência ao polipeptídeo de FVII também inclui polipeptídeos precursores e polipeptídeos de FVII maduros na forma de cadeia simples ou de cadeia dupla, formas truncadas dos mesmos que têm atividade, e inclui variantes alélicas e de espécies, variantes codificada por variantes de união, e outras variantes, incluindo polipeptídeos que têm pelo menos 40%, 45%, 50%, 55%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais identidade de sequência para o polipeptídeo precursor definido em SEQ ID NO:1 ou na forma madura do mesmo. Incluídos são polipeptídeos de FVII modificados, como os de SEQ ID NOS: 113 e 273 e suas variantes. Também estão incluídos aqueles que mantêm pelo menos uma atividade de FVII, como ligação de TF, ligação de fator X, ligação de fosfolipídeo, e/ou atividade de coagulante de um FVII. Ao manter a atividade, a atividade pode ser alterada, como reduzida ou aumentada, em comparação com um FVII do tipo selvagem, enquanto o nível de atividade mantido é suficiente para produzir um efeito detectável. Polipeptídeos de FVII incluem, mas não estão limitados a, isoformas específicas de tecido e variantes alélicas dos mesmos, moléculas sintéticas preparadas pela translação dos ácidos nucléicos, proteínas geradas por síntese química, como sínteses que incluem ligação de polipeptídeos menores, através de métodos recombinantes, proteínas isoladas a partir de tecidos e de células humanos e não humanos, polipeptídeos de FVII quiméricos e formas modificadas do mesmo. Polipeptídeos de FVII incluem também fragmentos ou partes de FVII que são de comprimento suficiente ou incluem regiões adequadas para reter pelo menos uma atividade (após a ativação, se necessário) de um polipeptideo maduro de comprimento completo. Polipeptídeos de FVII também incluem aqueles que contêm modificações químicas ou pós-translacionais e aqueles que não contêm modificações químicas ou pós- translacionais. Tais modificações incluem, mas não estão limitadas a, peguilação, albuminação, glicosilação, farnisilação, carboxilação, hidroxilação, fosforilação, e outras modificações de polipeptideo conhecidas na técnica.

Polipeptídeos de FVII exemplares são aqueles de mamíferos, incluindo de origem humana. Sequências de aminoácido exemplares de FVII de origem humana são as definidas nas SEQ ID NOS: 1, 2 e 3. Variantes exemplares de tais polipeptídeos de FVII de humano, incluir qualquer um dos precursores polipeptídeos definidos em SEQ ID NOS: 18- 74. Polipeptídeos de FVII também incluem qualquer de origem não humana, incluindo mas não limitado a, murina, canina, felina, leporina, de aves, bovina, ovina, suína, equina, piscina, ranina, e outros polipeptídeos de fator VII de primata. Polipeptídeos de FVII exemplares de origem não- humanos incluem, por exemplo, vaca (Bos taurus, SEQ ID NO:4), camundongo {Mus musculus, SEQ ID NO:5), chimpanzé pigmeu (Pan paniscus, SEQ ID NO:6), chimpanzé (Pan troglodytes, SEQ ID NO:7), coelho (Oryctolagus cuniculus, SEQ ID NO:8), camundongo (Rattus norvegicus, SEQ ID NO:9), macaco rhesus (Macaca mulata, SEQ ID NO:10), porco (Sus scrota, SEQ ID NO: 11), cão (Canis familiaris, SEQ ID NO:12), peixe-zebra (Brachydanio rerio, SEQ ID NO:13), baiacu japonês (Fugu rubripes, SEQ ID NO:14), frango (Gallus gallus, SEQ ID NO:15), orangotango (Pongo pygmaeus, SEQ ID NO:16) e gorila (Gorilla gorilla, SEQ ID NO:17).

Uma pessoa versada na técnica reconhece que as posições referenciadas do polipeptideo de fator VII maduro (SEQ ID NO:3) diferem por 60 residues de aminoácidos quando comparadas com isoforma a de um precursor de polipeptidio de FVII definida em SEQ ID NO:1, que é isoforma a de um polipeptideo de fator VII contendo o peptideo sinal e sequências propeptideo. Assim, o primeiro residue de aminoácido de SEQ ID NO: 3 "corresponde ao" sexagésimo primeiro (61°)residue de aminoácido de SEQ ID NO:1. Uma pessoa versada na técnica reconhece também que as posições referenciadas do polipeptideo de fator VII maduro (SEQ ID NO:3) diferem por 38 residues de aminoácidos quando comparadas com o polipeptideo de FVII precursor definido em SEQ ID NO:2, que é a isoforma b de polipeptideo de fator VII contendo o peptideo sinal e sequências de propeptideo. Assim, o primeiro residuo de aminoácido de SEQ ID NO: 3 "corresponde ao" trigésimo nono (39°) residuo de aminoácido de SEQ ID NO:2.

Conforme utilizado aqui, resíduos correspondentes referem-se aos resíduos que ocorrem em loci alinhados. Polipeptídeos relacionados ou variantes são alinhadas por qualquer método conhecido por aqueles versados na técnica. Tais métodos normalmente maximizar resultados e incluem métodos como o uso de alinhamentos manuais e pelo uso dos numerosos programas de alinhamento disponíveis (por exemplo, BLASTP) e outros conhecidos por aqueles versados na técnica. Ao alinhar as sequências de polipeptídeos, uma pessoa versada na técnica pode identificar os resíduos correspondentes, utilizando resíduos de aminoácido conservados e idênticos como guias. Por exemplo, através do alinhamento das sequências de polipeptídeos de fator VII, uma pessoa versada na técnica pode identificar os resíduos correspondentes, utilizando resíduos de aminoácidos conservados e idênticos como guias. Por exemplo, a alanina na posição 1 (Al)de um aminoácido de SEQ ID NO:3 (fator VII maduro) corresponde à alanina na posição 61 (A61) do aminoácido da SEQ ID NO:1, e alanina na posição 39 (A39) do aminoácido da SEQ ID NO:2. Em outros casos, as regiões correspondentes podem ser identificadas. Por exemplo, o domínio Gla corresponde a posições Al do aminoácido F45 de SEQ ID NO:3, as posições A61 de aminoácidos através de S105 de SEQ ID N0:l e a posições A39 de aminoácidos para S83 de SEQ ID NO:2. Uma pessoa versada na técnica também pode empregar resíduos de aminoácidos conservados como guias para encontrar resíduos de aminoácidos correspondents entre as sequências de humanos e não humanos. Por exemplo, resíduos de aminoácidos S43 e E163 da SEQ ID NO: 3 (humano) correspondem a S83 e E203 da SEQ ID NO:4 (bovinos). Posições correspondentes também podem ser baseadas em alinhamentos estruturais, por exemplo, usando alinhamentos de simulação por computador da estrutura da proteína. Em outros casos, as regiões correspondentes podem ser identificadas.

Conforme utilizado aqui, uma "pró-região", "propeptideo" ou "pró-sequência", refere-se a uma região ou um segmento que é clivado para produzir uma proteína madura. Isso pode incluir os segmentos que funcionam para suprimir a atividade proteolítica mascarando a máquina catalítica e, portanto, impedindo a formação de intermediário catalítico (isto é, estericamente ocluindo o local de ligação do substrato). A pró-região é uma sequência de aminoácidos posicionada no terminal amino de um polipeptideo biologicamente ativo maduro e pode ser tão pequena como alguns aminoácidos ou pode ser uma estrutura de vários domínios.

Como usado aqui, "fator VII maduro" refere-se a um polipeptideo de FVII que carece de uma sequência de sinal e uma sequência de propeptídeo. Normalmente, uma sequência de sinal orienta uma proteína para secreção através do retículo endoplasmático (RE) via-Golgi e é clivada após inserção no RE durante a translação. Uma sequência de propeptídeo normalmente funciona em modificaçõe pós-translaciona1 da proteína e é clivado antes da secreção da proteína da célula. Assim, um polipeptideo de FVII maduro normalmente é uma proteína secretada. Em um exemplo, um polipeptideo de FVII maduro humano é definido em SEQ ID NO:3. A sequência de aminoácidos definida em SEQ ID NO:3 difere da dos polipeptideos precursores definidos em SEQ ID NOS: 1 e 2, em que na SEQ ID NO: 3 falta a sequência de sinal, o que corresponde a resíduos de aminoácidos 1 - 20 de SEQ ID NOS: 1 e 2; e também não tem a sequência propeptideo, que corresponde a resíduos de aminoácidos 21-60 de SEQ ID NO:1 e resíduos de aminoácidos 21-38 de SEQ ID NO:2. Referência a um polipeptideo de FVII maduro engloba a forma de zimogênio de cadeia simples e a forma de cadeia dupla.

Como usado aqui, "selvagem" ou "nativo" com referência ao FVII refere-se a um polipeptideo de FVII codificado por um gene de FVII nativo ou de ocorrência natural, incluindo as variantes alélicas, que está presente em um organismo, incluindo um humanos e outros animais, na natureza. Referência ao fator VII de tipo selvagem sem referência a uma espécie se destina a abranger quaisquer espécies de um fator VII de tipo selvagem. Incluído entre os polipeptideos de FVII de tipo selvagem estão o polipeptideo precursor codificado, fragmentos do mesmo, e formas processadas do mesmo, como uma forma madura sem o peptideo sinal, assim como qualquer forma modificada ou processada pré- ou pós-translacionalmente do mesmo. Também estão incluídos entre os polipeptideos de FVII nativos aqueles que são modificados pós-translacionalmente, incluindo, mas não limitado a, modificação por glicosilação, carboxilação e hidroxilação. Polipeptídeos de FVII nativos também incluem formas de cadia simples e de cadeia dupla. Por exemplo, FVII nativo que expressam humanos. A sequência de aminoácidos de FVII humano de tipo selvagem exemplar são as definidas nas SEQ ID NOS: 1, 2, 3 e variantes alélicas definidas na SEQ ID NOS: 44-100 e as formas maduras da mesma. Outros animais produzem FVII nativo, incluindo, mas não limitado a, vaca {Bos taurus, SEQ ID NO:4), camundongo {Mus musculus, SEQ ID NO:5), chimpanzé pigmeu (Pan paniscus, SEQ ID NO:6), chimpanzé (Pan troglodytes, SEQ ID NO:7), coelho (Oryctolagus cuniculus, SEQ ID NO:8), camundongo {Rattus norvegicus, SEQ ID NO:9), macaco rhesus {Macaca mulatta, SEQ ID NO:10), porco {Sus scrofa, SEQ ID NO:11), cão {Canis familiaris, SEQ ID NO:12), peixe-zebra {Brachydanio rerio, SEQ ID NO:13) baiacu japonês {Fugu rubripes, SEQ ID NO:14), frango {Gallus gallus, SEQ ID NO:15), orangotango {Pongo pygmaeus, SEQ ID NO:16) e Gorila {Gorilla gorilla, SEQ ID NO:17).

Como aqui utilizadas, as variantes de espécies referem-se às variantes em polipeptídeos entre espécies diferentes, incluindo diferentes espécies de mamíferos, como camundongo e humano.

Conforme utilizado aqui, variantes alélicas referem-se a variações em proteínas entre os membros da mesma espécie.

Conforme utilizado aqui, uma variante de união refere-se a uma variante produzida por processamento diferencial de um transcrito primário do DNA genômico que resulta em mais de um tipo de mRNA.

Como usado aqui, um zimogênio refere-se a uma protease que é ativada por clivagem proteolitica, incluindo 5 a clivagem de maturação, tais como clivagem de ativação e/ou formação de complexos com outras proteina(s) e/ou co- fator(es). Um zimogênio é um precursor inativo de uma enzima proteolitica. Esses precursores são geralmente maiores, embora não necessariamente maior do que a forma 1C ativa. Com referência a proteases de serina, os zimogênios são convertidos em enzimas ativas por clivagem especifica, incluindo clivagem catalitica e autocatalitica, ou por ligação de um co-fator d ativação, que gera uma enzima ativa. Por exemplo, em geral, zimogênios estão presentes na 15 forma de cadeia única. Os zimogênios, geralmente, estão inativos e podem ser convertidos para amadurecer polipeptídeos ativos por clivagem catalitica ou autocatalitica em um ou mais sitios proteoliticas para gerar uma cadeia múltipla, como uma cadeia dupla, 20 polipeptideo. Um zimogênio, portanto, é uma proteina enzimaticamente inativa que é convertida em uma enzima proteolitica pela ação de um ativador. A clivagem pode ser efetuada por autoativação. Uma série de proteínas de coagulação são zimogênios; eles são inativos, mas tornam-se 25 clivados e ativados após o inicio do sistema de coagulação após lesão vascular. Com referência ao FVII, os polipeptídeos de FVII existem no plasma sanguíneo como zimogênios até clivagem pelas aproteases, como, por exemplo, fator IX ativado (FIXa), fator X ativado (FXa), fator XII ativado (FXIIa), trombina, ou por autoativação para produzir uma forma de cadeia dupla semelhante a zimogênio, que então requer uma modificação conformação adicional para atividade completa.

Conforme utilizado aqui, uma proteina ou polipeptideo "semelhante a zimogênio" refere-se a uma proteina que foi ativada por clivagem proteolitica, mas ainda exibe propriedades que são associadas com um zimogênio, como, por exemplo, atividade baixa ou nenhuma, ou uma conformação que se assemelha a conformação da forma zimogênio da proteina. Por exemplo, quando ele não está ligado ao fator de tecido, a forma ativada de cadeia dupla de FVII é uma proteina semelhante a zimogênio, que retém uma conformação similar a do zimogênio de FVII não clivado, e, portanto, apresenta atividade muito baixo. Após a ligação com o fator tecidual, a forma ativada de cadeia dupla de FVII sofre modificação conformacional e adquire sua atividade completa como um fator de coagulação.

Conforme utilizado aqui, uma sequência de ativação se refere a uma sequência de aminoácidos em um zimogênio que é o local necessário para clivagem de ativação ou clivagem de maturação para formar uma protease ativa. Clivagem de uma sequência de ativação pode ser autocataliticamente catalisada ou por parceiros de activação.

Como utilizado aqui, clivagem de ativação é um tipo de clivagem de maturação, que induz uma modificação conformacional que é necessária para o desenvolvimento da atividade enzimática completa. Esta é uma via de ativação clássica, por exemplo, para proteases de serina em que uma divagem gera um novo N-terminal que interage com as regiões conservadas da protease, como o Aspl94 em quimiotripsina, para induzir modificações conformacionais necessárias para a atividade. A ativação pode resultar na produção de formas de cadeias múltiplas de proteases. Em alguns casos, formas de cadeia única de protease podem apresentar atividade proteolitica.

Como utilizado aqui, "fator VII ativado" ou "FVIIa" refere-se a qualquer forma de cadeia dupla de um polipeptideo de FVII. Uma forma de cadeia dupla tipicamente resulta da divagem proteolitica, mas pode ser produzida sinteticamente. Fator VII ativado, portanto, inclui a forma de cadeia dupla semelhante a zimogênio com baixa atividade coagulante, uma forma totalmente ativada (cerca de 1000 vezes mais atividade) , que ocorre após a ligação ao fator de tecido, e formas mutantes que existem em uma forma de cadeia dupla totalmente ativada ou sofrer modificação de conformação para uma forma totalmente ativada. Por exemplo, uma forma de cadeia única de polipeptídeos de FVII (ver, por exemplo, SEQ ID NO:3) é proteoliticamente clivada entre os resíduos de aminoácidos R152 e 1153 do polipeptideo de FVII maduro. Os produtos de clivagem, FVII de cadeia pesada e FVII de cadeia leve, que são mantidos juntos por uma ligação dissulfeto (entre resíduos de aminoácidos C135 e C262 na FVII de SEQ ID NO:3), formam enzima de FVII ativada de cadeia dupla. Clivagem proteolitica pode ser realizada, por exemplo, por fator IX ativado (FIXa), fator X ativado (FXa), fator XII ativado (FXIIa), trombina ou por autoativação.

Conforme utilizado aqui, uma "propriedade" de um polipeptídeo de FVII se refere a uma propriedade fisica ou estrutural, como estrutura tridimensional, pi, meia-vida, conformação e outras características físicas.

Conforme utilizado aqui, uma "atividade" de um polipeptídeo de FVII refere-se a qualquer atividade exibida por um polipeptídeo de fator VII. Tais atividades podem ser testados in vitro e/ou in vivo e incluem, mas não estão limitadas a, coagulação ou atividade coagulante, atividade pró-coagulante, atividade proteolitica ou catalítica, tais como para efetuar a ativação do fator X (FX) ou a ativação do Fator IX (FIX); antigenicidade (capacidade de se ligar a ou competir com um polipeptídeo para a ligação com um anticorpo anti-FVII); capacidade de ligar fator de tecido, fator X ou fator IX; e/ou capacidade de se ligar aos fosfolipídios. A atividade pode ser avaliada in vitro ou in vivo utilizando ensaios reconhecidos, por exemplo, pela medição da coagulação in vitro ou in vivo. Os resultados desses ensaios indicam que um polipeptídeo apresenta uma atividade que pode ser correlacionada com a atividade do polipeptídeo in vivo, em que a atividade in vivo pode ser referida como atividade biológica. Ensaios para determinar a funcionalidade ou a atividade das formas modificadas de FVII são conhecidos por aqueles versados na técnica.

Ensaios exemplares para avaliar a atividade de um polipeptideo de FVII incluem ensaio de tempo de protromboplastina (PT) ou ensaio de tempo de tromboplastina parcial ativada (aPTT) para avaliar a atividade coagulante, ou ensaios cromogênicos utilizando substratos sintéticos, como descrito nos exemplos abaixo, para avaliar atividade catalitica ou proteolitica.

Gomo usado aqui, "exibe pelo menos uma atividade" ou "retém, pelo menos, uma atividade" refere-se à atividade exibida por um polipeptideo de FVII modificado em comparação a um polipeptideo de FVII não modificado da mesma forma e sob as mesmas condições. Por exemplo, um polipeptideo de FVII modificado em uma forma de cadeia dupla é comparado com um polipeptideo de FVII não modificado em uma forma de cadeia dupla, sob as mesmas condições experimentais, onde a única diferença entre os dois polipeptideos é a modificação sob estudo. Em outro exemplo, um polipeptideo de FVII modificada em uma forma de cadeia única é comparado com um polipeptideo deFVII não modificado em uma forma de cadeia única, sob as mesmas condições experimentais, onde a única diferença entre os dois polipeptideos é a modificação sob estudo. Normalmente, um polipeptideo de FVII modificado que retém ou apresenta pelo menos uma atividade de um polipeptideo de FVII não modificado da mesma forma retém uma quantidade suficiente de atividade de tal forma que, quando administrado in vivo, o polipeptideo de FVII modificado é terapeuticamente eficaz como um produto terapêutico pró-coagulante. Geralmente, para um polipeptideo de FVII modificado reter a eficácia terapêutica como um pró-coagulante, a quantidade de atividade que é retido é ou é cerca de 0,5%, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 200%, 300%, 400%, 500% ou mais da atividade de um polipeptideo de FVII não modificado da mesma forma que mostra eficácia terapêutica como um pró-coagulante. A quantidade de atividade que é necessária para manter a eficácia terapêutica como um pró-coagulante pode ser determinada empiricamente, se necessário. Normalmente, a retenção de 0,5% para 20%, 0,5% a 10%, 0,5% a 5% de uma atividade é suficiente para reter a eficácia terapêutica como um pró-coagulante in vivo.

Entende-se que a atividade que está sendo exibida ou retida por um polipeptideo de FVII modificado pode ser qualquer atividade, incluindo mas não limitado a, coagulação ou atividade coagulante, atividade pró- coagulante, atividade proteolitica ou catalitica, tais como para efetuas ativação do fator X (FX) ou ativação do Fator IX (FIX); antigenicidade (capacidade de se ligar a ou competir com um polipeptideo para ligação a um anticorpo anti-FVII), capacidade de ligar fator de tecido, fator X ou fator IX, e/ou capacidade de se ligar aos fosfolipídeos. Em alguns casos, um polipeptideo de FVII modificado pode reter uma atividade que é aumentada em comparação com um polipeptideo de FVII não modificado. Em alguns casos, um polipeptideo de FVII modificado pode reter uma atividade que é diminuída em comparação com um polipeptídeo de FVII não modificado. A atividade de um polipeptídeo de FVII modificado pode ser qualquer nível de porcentagem de atividade do polipeptídeo não modificado, onde ambos os 5 polipeptídeos são da mesma forma, incluindo mas não limitado a, 1% da atividade, 2%, 3%, 4%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100%, 200%, 300%, 400%, 500%, ou mais de atividade em comparação com o polipeptídeo que não contém a modificação em causa. Por exemplo, um polipeptídeo de FVII modificado podem apresentar aumento ou diminuição da atividade em comparação com o polipeptídeo de FVII não modificado na mesma forma. Por exemplo, pode reter pelo menos cerca de ou 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou, pelo menos 99% da atividade do polipeptídeo de FVII não modificado. Em outras modalidades, a modificação na atividade é de pelo menos cerca de 2 vezes, 3 vezes, 4 vezes, 5 vezes, 6 vezes, 7 vezes, 8 vezes, 9 vezes, 10 vezes, 20 vezes, 30 vezes, 40 vezes, 50 vezes, 60 vezes, 70 vezes, 80 vezes, 90 vezes, 100 vezes, 200 vezes, 300 vezes, 400 vezes, 500 vezes, 600 vezes, 700 vezes, 800 vezes, 900 vezes, 1000 vezes, ou mais vezes superior ao FVII não modificado. O nível particular a ser retido é uma função da utilização pretendida do polipeptídeo e pode ser determinada empiricamente. A atividade pode ser medida, por exemplo, utilizando ensaios in vitro ou in vivo, como as aqui descritas ou nos exemplos abaixo.

Como usado aqui, "atividade de coagulação" ou "atividade coagulante" ou "atividade pró-coagulante" refere-se a capacidade de um polipeptideo efetuar coagulação. Ensaios para avaliar a atividade coagulante são 5 conhecidos por aqueles versados na técnica, e incluem ensaio de tempo de protromboplastina (PT) ou ensaio de tempo de tromboplastina parcial ativada (aPTT).

Como usado neste documento, "atividade catalítica" ou "atividade proteolítica" com referência ao 10 FVII se refere à capacidade de uma proteína de FVII catalisar a clivagem proteolítica de um substrato, e são usados indistintamente. Ensaios para avaliar tais atividades são conhecidos na técnica. Por exemplo, a atividade proteolítica de FVII pode ser medida usando 15 substratos cromogênicos como espectrozima de FVIIa (CH3SO2-D-CHA-But-Arg-pNA), onde a clivagem do substrato é monitorada pela absorbância e a taxa de hidrólise do substrato determinada por regressão linear.

Como usado neste documento, "atividade 20 intrínseca" com referência ao FVII refere-se a atividade catalítica, proteolítica e/ou coagulante de uma proteína de FVII na ausência de fator tecidual.

Como usado aqui, o domínio (normalmente uma sequência de três ou mais, geralmente 5 ou 7 ou mais 25 aminoácidos) se refere a uma porção de uma molécula, como as proteínas ou os ácidos nucleicos de codificação, que é estrutural e/ou funcionalmente distinto de outras porções da molécula e é identificável. Por exemplo, os domínios incluem aquelas porções da cadeia polipeptidica que podem formar uma estrutura independente dobrada dentro uma proteina composta por um ou mais motivos estruturais e/ou que seja reconhecida por força de uma atividade funcional, como a atividade proteolitica- Uma proteina pode ter um, ou mais de um, domínios distintos. Por exemplo, um domínio pode ser identificado, definido e distinguido por homologia da sequência nele aos membros da família relacionados, como a homologia para motivos que definem um domínio de protease ou um domínio gla. Em outro exemplo, um domínio pode ser distinguido por sua função, como por atividade proteolitica, ou uma capacidade de interagir com uma biomolécula, como a ligação do DNA, ligação de ligante e dimerização. Um domínio pode apresentar independentemente uma função ou actividade biológica que o domínio independentemente ou fundido a outra molécula pode desempenhar uma atividade, como, por exemplo, a atividade proteolitica ou ligação de ligante. Um domínio pode ser uma sequência linear de aminoácidos ou uma sequência não linear de aminoácidos. Muitos polipeptídeos contêm uma pluralidade de domínios. Tais domínios são conhecidos, e podem ser identificados por aqueles versados na técnica. Para exemplificação neste documento, as definições são providas, mas entende-se que ele está bem dentro da habilidade na técnica reconhecer domínios particulares pelo nome. Se necessário software apropriado pode ser empregado para identificar domínios.

Conforme utilizado aqui, um dominio de protease é a porção cataliticamente ativa de uma protease. Referência a um dominio de protease de uma protease inclui as formas de cadeia única, dupla ou múltipla de qualquer uma destas proteinas. Um dominio de protease de uma proteina contém todas as propriedades indispensáveis das proteinas necessárias para a sua atividade proteolitica, como por exemplo, o centro catalítico. Em referência ao FVII, o dominio de protease de partilha homologia e característica estrutural com os domínios de protease da familia quimotripsina/tripsina, incluindo a triade catalítica. Por exemplo, no polipeptídeo de FVII maduro definido em SEQ ID NO:3, o dominio de protease corresponde às posições de aminoácidos 153 a 392.

Conforme utilizado aqui, um dominio de gama carboxiglutamato (Gla) se refere à porção de uma proteina, por exemplo, uma proteina dependente de vitamina K, que contém modificações pós-translacionais de residuos de glutamato, geralmente a maioria, mas nem todos os residuos de glutamato, por carboxilação dependente vitamina K para formar Gla. O dominio de Gla é responsável pela alta afinidade de ligação de ions de cálcio e de ligação aos fosfolipidios de carga negativa. Geralmente, o dominio de Gla inicia na extremidade N-terminal da forma madura de proteinas dependentes de vitamina K e termina com um residuo aromático protegido. Em um polipeptídeo de FVII maduro o dominio de Gla corresponde a posições de aminoácidos 1 a 45 do polipeptídeo exemplar definido em SEQ ID NO: 3. Domínios de Gla são bem conhecidos e seus locus podem ser identificados em polipeptideos particulares. Os domínios de Gla das várias proteínas dependentes de vitamina K partilham homologia de sequência, estrutural e funcional, incluindo o agrupamento de resíduos hidrofóbicos de N-terminal em uma emenda hidrofóbica que medeia a interação com fosfolipídios de carga negativa na membrana de superfície celular. Outras polipeptideos contendo Gla exemplares incluem, mas não estão limitados a, FIX, FX, protrombina, proteína C, proteína S, osteocalcina, proteína da matriz Gla, proteína específica de detenção de crescimento 6 (Gas6), e proteína Z. Os domínios de Gla destas e de outras proteínas exemplares estão definidos em qualquer uma das SEQ ID NOS: 83-94.

Como usado aqui, "nativo" ou "endógeno", com referência a um domínio de Gla se refere ao domínio de Gla de ocorrência natural associado com a todo ou uma parte de um polipeptideo tendo um domínio de Gla. Para fins do presente documento, um domínio de Gla nativo é com referência a um polipeptideo de FVII. Por exemplo, o domínio de Gla nativo de FVII, definido em SEQ ID NO:92, corresponde a 1-45 aminoácidos da sequência de aminoácidos definida em SEQ ID NO:3.

Conforme utilizado aqui, um domínio de Gla heterólogo se refere ao domínio de Gla de um polipeptideo, da mesma ou diferente espécie, que não é um domínio de Gla de FVII. Domínios de Gla heterólogos exemplares são os domínios de Gla de polipeptideos contendo Gla, incluindo mas não estão limitados a, FIX, FX, protrombina, proteina C, proteina S, osteocalcina, proteina de Gla matriz, proteina especifica de detenção de crescimento 6 (Gas6) e proteina Z. Os dominios de Gla destas e de outras proteinas exemplares estão definidos em qualquer uma das SEQ ID NOS: 83-91, 93 e 94.

Conforme utilizado aqui, uma porção contigua de um domínio GIA refere-se a pelo menos dois ou mais aminoácidos adjacentes, normalmente 2, 3, 4, 5, 6, 8, 10, 15, 20, 30, 40 ou mais até todos os aminoácidos que compõem um domínio de Gla.

Como usado neste documento, "uma porção suficiente de um domínio de Gla para efetuar ligação de fosfolipídio" inclui pelo menos um aminoácido, normalmente, 2, 3, 4, 5, 6, 8, 10, 15 ou mais aminoácidos do domínio, mas menos do que todos os aminoácidos que compõem o domínio, desde que o polipeptideo que contém a referida porção apresente ligação de fosfolipideo.

Como usado aqui, "substituir'" no que diz respeito a um domínio de Gla ou "troca de domínio de Gla" se refere ao processo pelo qual o domínio de Gla endógeno de uma proteína é substituído, usando métodos recombinantes sintéticos ou outros, pelo domínio de Gla de outra proteína. No contexto de uma "troca de domínio de Gla", um "domínio de Gla" é qualquer selecção de aminoácidos de um domínio de Gla e regiões adjacentes, que é suficiente para reter a atividade de ligação de fosfolipídeos. Normalmente,uma troca de domínio de Gla vai envolver a substituição de entre 40 e 50 aminoácidos da proteina endógena por entre 40 e 50 aminoácidos de uma outra proteina, mas pode envolver menos ou mais aminoácidos.

Conforme utilizado aqui, um fator de crescimento epidérmico (EGF) de dominio (EGF-1 ou EGF-2) se refere à porção de uma proteina que compartilha homologia de sequência com uma porção de 30 a 40 aminoácidos determinada da sequência de fator de crescimento epidérmico (EGF). O dominio de EGF inclui seis residuos de cisteina que foram mostrados (em EGF) estar envolvidos em ligações dissulfeto. A estrutura principal de um dominio de EGF é uma folha beta duplex seguida de um laço para uma folha duplex curta C- terminal. FVII contém dois dominios de EGF: EGF-I e EGF-2. Estes dominios correspondem a posições de aminoácidos 46-82 e 87-128, respectivamente, do polipeptideo de FVII maduro definido em SEQ ID NO:3.

Como usado neste documento, "polipeptideo não modificado" ou "FVII não modificado" e suas variações gramaticais referem-se a um polipeptideo de partida que é selecionado para a modificação conforme provido aqui. O polipeptideo de partida pode ser uma forma de ocorrência natural, tipo selvagem de um polipeptideo. Além disso, o polipeptideo de partida pode ser alterado ou transformado, de tal forma que é diferente de uma isoforma tipo selvagem nativa, mas não obstante aqui referido como um polipeptideo de partida não modificado em relação aos polipeptídeos modificada posteriormente produzidos aqui. Assim, as proteinas existentes conhecidas na técnica que foram modificadas para ter um desejado aumento ou diminuição de uma determinada atividade ou propriedade em comparação com uma proteina de referência não modificada pode ser selecionado e usado como o polipeptideo de partida não modificado. Por exemplo, uma proteina que foi modificada de sua forma nativa por uma ou mais modificações de aminoácidos simples e possui um aumento ou diminuição em uma propriedade desejada, como uma modificação em um residuo de aminoácido ou residues para alterar glicosilação, pode ser uma proteína-alvo, aqui referida como não modificada, para modificação adicional das mesmos ou diferentes propriedade. Polipeptideos de FVII modificados exemplares conhecidos na técnica incluem qualquer polipeptideo de FVII descrito, por exemplo, nas Patentes US NoS 5580560, 6017882, 6693075, 6762286 e 6806063, Publicações de Patente US NoS 20030100506 e 20040220106 e Publicações de Patente Internacional N°s WO 1988010295, WO 200183725, WO 2003093465, WO 200338162, WO 2004083361, WO 2004108763, WO 2004029090, WO 2004029091, WO 2004111242 e WO 2005123916.

Conforme utilizado aqui, "polipeptideos de fator VII modificados" e "fator VII modificados" referem-se a um polipeptideo de FVII que tem uma ou mais diferenças de aminoácidos em comparação a um polipeptideo de fator VII não modificado. Uma ou mais diferenças de aminoácidos podem ser mutações de aminoácidos, tais como uma ou mais substituições, inserções ou exclusões de aminoácidos, ou podem ser inserções ou exclusões de domínios inteiros, e quaisquer combinações dos mesmos. Normalmente, um polipeptideo de FVII modificado tem uma ou mais modificações na sequência primária em comparação com um polipeptideo de FVII não modificado. Por exemplo, um 5 polipeptideo de FVII modificado provido aqui pode ter 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 30, 40, 50 ou mais diferenças de aminoácidos em comparação com um polipeptideo de FVII não modificado. Qualquer modificação é contemplada, enquanto o polipeptideo 10 resultante exibir pelo menos uma atividade de FVII associada a um polipeptideo de FVII nativo, como, por exemplo, atividade catalitica, atividade proteolitica, capacidade de ligar TF ou capacidade de ligar plaquetas ativadas.

Como usado aqui, ’"inibidores de coagulação" referem-se às proteinas ou moléculas que agem para inibir ou evitar a coagulação ou formação de coágulo. A inibição ou prevenção de coagulação podem ser observadas in vivo ou in vitro, e podem ser testadas usando qualquer método 20 conhecido na técnica, incluindo mas não limitado a, ensaio de tempo de protromboplastina (PT) ou ensaio de tempo de tromboplastina parcial ativada (aPTT).

Conforme utilizado aqui, inibidor de via de fator tecidual (TFPI, também conhecido como TFPI-1) é um inibidor 25 do tipo Kunitz, que está envolvido na formação de um complexo inibidor quaternário TF/FVIla/TFPI/FXa em que a atividade de FVIIa é inibida. TFPI é expresso em duas formas de precursor diferentes seguindo união alternativa, precursores de TFPIα (SEQ ID NO:75) e TFPIβ (SEQ ID NO:77), que são clivados durante a secreção para gerar uma proteína madura de aminoácido 276 (SEQ ID NO:76) e de aminoácido 223 (SEQ ID NO:78), respectivamente. TFPI contém 3 domínios Kunitz, dos quais o domínio Kunitz-1 é responsável pela ligação e inibição de FVIIa.

Conforme utilizado aqui, TFPI-2 (também conhecida como proteína placentária 5 (PP5) e inibidor de protease da matriz associada à serina (MSPI)) refere-se a um homólogo de TFPI. A proteína TFPI-2 madura de aminoácido 213 (SEQ ID NO:79) contém três domínios do tipo Kunitz, que apresentam 43%, 35% e 53% identidade de sequência primária com o domínio tipo Kunitz TFPI-I 1, 2 e 3, respectivamente. TFPI- 2 desempenha um papel na regulação da digestão da matriz extracelular e remodelação, e não é pensado para ser um fator importante na via de coagulação.

Conforme utilizado aqui, antitrombina III (AT- III) é um inibidor de protease de serina (serpin). AT-III é sintetizada como uma proteína precursora contendo 464 resíduos de aminoácidos (SEQ ID NO:95) que é clivada durante a secreção para liberar uma antitrombina madura de aminoácido 432 (SEQ ID NO:96).

Conforme utilizado aqui, co-fatores referem-se a proteinas ou moléculas que se ligam a outras proteínas ou moléculas específicas para formar um complexo ativo. Em alguns exemplos, a ligação a um co-fator é necessária para a atividade proteolitica ideal. Por exemplo, o fator tecidual (TF) é um co-fator de FVIIa. A ligação do FVIIa a TF induz modificações conformacionais que resultam em aumento da atividade proteolítica do FVIIa para seus substratos, FX e FIX.

Conforme utilizado aqui, o fator tecidual (TF) refere-se a uma glicoproteina de transmembrana de aminoácido 263 (SEQ ID NO:97) que funciona como um co-fator para FVIIa. Ela é expressa constitutivamente pelas células musculares lisas e fibroblastos, e ajuda para iniciar a coagulação por ligação de FVII e FVIIa quando essas células entram em contato com a corrente sanguínea após uma lesão tecidual.

Conforme utilizado aqui, plaqueta ativada se refere a uma plaqueta que foi desencadeada pela ligação de moléculas como colágeno, tromboxano A2, ADP e trombina para se submeter a várias modificações na morfologia, fenótipo e função que em última análise, promove a coagulação. Por exemplo, uma plaqueta ativada muda na forma para uma forma mais amorfa com a projeção do "dedos". Plaquetas ativadas também passam por uma "tampa" da membrana celular de modo que fosfatidilserina e outros fosfolipídios carregados negativamente que estão normalmente presentes no foliolo interno da membrana celular são translocadas para a superfície exterior, orientada por plasma. Essas membranas das plaquetas ativadas fornecem a superfície na qual muitas das reações da cascata de coagulação são efetuadas. Plaquetas ativadas também secretam vesículas contendo tais fatores pró-coagulantes como vWF, FV, trombina, ADP e tromboxane A2, e aderem um ao outro para formar um tampão de plaquetas que é estabilizado pela fibrina para tornar-se um coágulo.

Como aqui utilizadas, ligação e/ou afinidade aumentada para plaquetas ativadas, e quaisquer variações gramaticais dos mesmos, refere-se a uma maior capacidade de um polipeptideo ou proteina, por exemplo, um polipeptideo de FVII, para se ligar à superfície de uma plaqueta ativada, em comparação com um polipeptideo ou proteina de referência. Por exemplo, a capacidade de um polipeptideo de FVII modificado para se ligar a plaquetas ativadas pode ser maior do que a capacidade do polipeptideo de FVII modificado para se ligar a plaquetas ativadas. A ligação e/ou afinidade de um polipeptideo por plaquetas ativadas pode ser aumentada em pelo menos cerca de 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 200%, 300%, 400%, 500% ou mais em relação à ligação e/ou afinidade de um polipeptideo não modificado. Ensaios para determinar a ligação e/ou afinidade de um polipeptideo para plaquetas ativadas são conhecidas na técnica. A ligação de um polipeptideo de FVII para plaquetas ativadas é mediada através da interação de aminoácidos no domínio de Gla do polipeptideo de FVII e fosfolipídios carregados negativamente, como a fosfatidilserina, na plaqueta ativada. Como tal, os métodos para ensaiar a ligação de polipeptídeos, tais como polipeptídeos de FVII, para plaquetas ativadas que utilizam membranas e vesículas que contêm fosfolipídios, como a fosfatidilserina. Por exemplo, a capacidade de um polipeptídeo se ligar a uma plaqueta ativada é refletida pela capacidade do polipeptídeo se ligar a vesículas de fosfolipídios, que pode ser medido por técnicas de espalhamento de luz.

Como aqui utilizadas, ligação e/ou afinidade aumentada para fosfolipídios e quaisquer variações gramaticais do mesmo, refere-se a uma maior capacidade de um polipeptídeo ou proteína se ligar a fosfolipídeos em comparação com um polipeptídeo ou proteína de referência. Fosfolipídios podem incluir qualquer fosfolipidios, mas principalmente incluem fosfatidilserina. A ligação e/ou afinidade de um polipeptídeo por fosfolipídios pode ser aumentada em pelo menos cerca de 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 200%, 300%, 400%, 500% ou mais em comparação com a ligação e/ou afinidade de um polipeptídeo não modificado. Ensaios para determinar a afinidade e/ou ligação de um polipeptídeo a fosfolipídios são conhecidas na técnica. Por exemplo, polipeptídeo de FVII que se ligam a vesículas de fosfolipídios pode ser determinado por espalhamento de luz relativa a 90° para a luz incidente. A intensidade do espalhamento da luz com as vesículas de fosfolipidios sozinhas e com as vesículas de f osfolipídeos com FVII é medida para determinar a constante de dissociação. Ressonância de plasma de superfície, como em um instrumento biossensor BIAcore, também pode ser usado para medir a afinidade de polipeptídeos de FVII para membranas fosfolipídicas.

Como usado aqui, aumento da resistência aos inibidores ou "aumento da resistência à AT-III" ou "aumento da resistência à TFPI" refere-se a qualquer quantidade de diminuição da sensibilidade de um polipeptideo para os efeitos inibitórios de um inibidor, como o AT-III ou TFPI, em comparação com um polipeptideo de referência, como um polipeptideo de FVII não modificado. Aumento da resistência a um inibidor, como a AT-III, pode ser analisado através da avaliação da ligação de um polipeptideo de FVII modificado para um inibidor. Aumento da resistência a um inibidor, como o AT-III, também pode ser analisado através da medição da atividade intrínseca ou atividade coagulante de um polipeptideo de FVII na presença de AT-III. Ensaios para determinar a ligação de um polipeptideo a um inibidor são conhecidas na técnica. Para inibidores covalentes, como, por exemplo, AT-III, uma constante de taxa de segunda ordem para a inibição pode ser medida. Para os inibidores não-covalente, como, por exemplo, o TFPI, um ki pode ser medido. Além disso, a ressonância de plasma de superfície, como num instrumento de biossensor BIAcore, também pode ser usado para medir a ligação de polipeptideos de FVII para AT-III ou outros inibidores. No entanto, para covalentes, tais como os AT- III, apenas um a taxa pode ser medida usando BIAcore. Ensaios para determinar o efeito inibidor de, por exemplo, AT-III sobre a atividade coagulante de FVII ou atividade intrínseca também são conhecidas na técnica. Por exemplo, a capacidade de um polipeptideo de FVII modificado clivar seu FX de substrato na presença ou ausência de AT-III pode ser medido, e o grau em que a AT-III inibe a reação de determinado. Isto pode ser comparado à capacidade de um polipeptideo de FVII não modificado decompor o seu substrato de FX na presença ou ausência de AT-III. Um polipeptideo modificado que apresenta maior resistência a um inibidor exibe, por exemplo, um aumento de 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100%, 200%, 300%, 400%, 500%, ou mais resistência aos efeitos de um inibidor em comparação com um polipeptideo não modificado.

Como usado neste documento, "aumento da resistência à inibição por Zn2+/', "aumento da resistência aos efeitos inibitórios de Zn24-" ou "aumento da resistência à Zn2*" refere-se a qualquer quantidade de diminuição da sensibilidade de um polipeptideo para os efeitos inibitórios do Zn2+ em comparação com um polipeptideo de referência, como um polipeptideo de FVII não modificado. Resistência aumentada à Zn2* pode ser analisada, por exemplo, medição da atividade intrínseca ou atividade coagulante de um polipeptideo de FVII na presença de Zn2+, como descrito no Exemplo 11. Resistência aumentada aos efeitos inibitórios de Zn2* pode ser o resultado da diminuição da ligação de Zn2+. Diminuição da ligação de Zn2* pode ser analisado através da medição da quantidade de Zn2* ligados por molécula de FVIIa ou medindo a afinidade da ligação de Zn para FVIIa ou medindo um IC50 para a inibição de uma actividade de FVIIa pelo zinco. Um polipeptideo modificado que apresenta maior resistência ao efeito inibidores do Zn2+ exibe, por exemplo, um aumento de 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100%, 200%, 300%, 400%, 500%, ou mais resistência aos efeitos do Zn2+ em comparação com um polipeptideo não modificado.

Conforme utilizado aqui, uma sequência de ligação de albumina no soro refere-se a uma sequência de residuos de aminoácido que podem efetuar ligação à albumina sérica. Assim, quando inserida em um polipeptideo de FVII, a sequência de ligação de albumina sérica pode aumentar a afinidade ou ligação à albumina sérica do polipeptídeo de FVII. A capacidade do polipeptídeo do FVII modificado contendo a albumina sérica ligando sequência pode, portanto, exibir maior ligação e/ou afinidade por albumina sérica. Um polipeptídeo modificado que apresenta maior ligação e/ou afinidade para albumina sérica, por exemplo, um aumento de 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100%, 200%, 300%, 400%, 500% ou mais em comparação com a ligação e/ou afinidade de um polipeptídeo não modificado. Tipicamente, as sequências de ligação de albumina sérica contêm pelo menos 10 ou mais aminoácidos, geralmente 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20, 30, 40 ou mais aminoácidos. Sequências de ligação de albumina sérica são aquelas definidas em SEQ ID NOS: 103-109.

Conforme utilizado aqui, uma sequência de ligação de integrina plaquetária α∑ibβa refere-se a uma sequência de resíduos de aminoácidos que podem efetuar a ligação de integrina palquetária αubβs. Assim, quando inserida em um polipeptideo de FVII, a sequência de ligação de integrina plaquetária αubβs pode aumentar a capacidade do polipeptideo de FVII para se ligar à integrina plaquetária αubβs θr portanto, às plaquetas, incluindo plaquetas ativadas. A capacidade do polipeptideo de FVII modificado contendo a sequência de ligação de integrina plaquetária Oinbβa pode, portanto, apresentar maior ligação e/ou afinidade com a integrina plaquetária «nbβa e/ou plaquetas. Um polipeptideo modificado que apresenta maior ligação e/ou afinidade com integrina plaquetária otubβa apresenta, por exemplo, um aumento de 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100%, 200%, 300%, 400%, 500% ou mais em relação à ligação e/ou afinidade de um polipeptideo não modificado. Normalmente, as sequências de ligação de integrina plaquetária otjibβa contêm pelo menos 5 ou mais aminoácidos, geralmente 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20, 30, 40 ou mais aminoácidos. Sequências de ligação de integrina plaquetária otiibβs são aquelas definidas na SEQ ID NOS: 110-112.

Como usado aqui, um sítio de glicosilação se refere a uma posição amino em um polipeptideo o qual uma fração de carboidcamundongo podem ser anexada. Normalmente,uma proteína glicosilada contém um ou mais resíduos de aminoácidos, como a asparagina ou serina, para a fixação das frações de carboidcamundongos.

Como usado aqui, um sitio de glicosilação nativo se refere a uma posição amino a que a fração de carboidcamundongo está ligada em um polipeptideo de tipo selvagem. Há quatro sítios de glicosilação nativos em FVII; dois sítios de N-glicosilação em N145 e N322, e dois sítios de O-glicosilação em S52 e S60, correspondentes às posições de aminoácidos no polipeptideo de FVII maduro definidos em SEQ ID NO:3.

Como usado aqui, um sítio de glicosilação não- nativo se refere a uma posição amino a que a fração de carboidcamundongo está ligada em um polipeptideo modificado que não está presente em um polipeptideo de tipo selvagem. Sítios de glicosilação não-nativos podem ser introduzidos em um polipeptideo de FVII pela substituição de aminoácidos. Sítios de O-glicosilação podem ser criados, por exemplo, pela substituição de aminoácidos de um resíduo nativo com uma serina ou treonina. Sítios de N-glicosilação podem ser criados, por exemplo, ao estabelecer o motivo Asn-Xaa-Ser/Thr/Cys, onde Xaa não é prolina. A criação dessa sequência de consenso através da modificação de aminoácidos pode envolver, por exemplo, uma substituição de um único aminoácido de um resíduo de aminoácido nativo com uma asparagina, uma substituição de um único aminoácido de um resíduo de aminoácido nativo com uma serina, treonina ou cisteína, ou uma substituição dupla de aminoácido envolvendo uma primeira substituição de aminoácido de um resíduo nativo com uma asparagina e uma segunda substituição de aminoácido de resíduo nativo com uma serina, treonina ou cisteína.

Como usado neste documento, "atividade biológica" se refere a atividades in vivo de um composto ou respostas fisiológicas que resultam em administração in vivo de um composto, composição ou mistura de outros. A atividade biológica, portanto, engloba os efeitos terapêuticos e atividade farmacêutica desses compostos, composições e misturas. Atividades biológicas podem ser observadas em sistemas in vitro projetados para testar ou usar tais atividades. Assim, para fins deste documento uma atividade biológica de um polipeptídeo de FVII engloba a atividade coagulante.

Conforme utilizado aqui o termo "avaliar", e as variações gramaticais do mesmo, destina-se a incluir a determinação quantitativa e qualitativa, no sentido de obter um valor absoluto para a atividade de um polipeptídeo, e também de obtenção de um índice, proporção, porcentagem, visual ou outro valor indicativo do nível de atividade. A avaliação pode ser direta ou indireta. Por exemplo, a detecção de clivagem de um substrato por um polipeptídeo pode ser por medição direta do produto, ou pode ser medida indiretamente pela determinação da atividade decorrente do substrato clivado.

Como usado aqui, "numeração de quimotripsina" refere-se à numeração de aminoácidos de um polipeptídeo de quimotripsina maduro de SEQ ID NO:80. Alinhamento de um domínio de protease de outra protease, como por exemplo o domínio de protease do fator VII, pode ser feito com quimotripsina. Em tal caso, aos aminoácidos do fator VII que correspondem aos aminoácidos de quimotripsina são dados a numeração dos aminoácidos de quimotripsina. As posições correspondentes podem ser determinadas por esse alinhamento por uma pessoa versada na técnica usando alinhamentos manuais ou usando vários programas de alinhamento disponíveis (por exemplo, BLASTP). As posições correspondentes também podem ser baseadas em alinhamentos estruturais, por exemplo, usando alinhamentos simulados por computador da estrutura da proteina. Recitação que os aminoácidos de um polipeptidio correspondem aos aminoácidos em uma sequência divulgada refere-se a aminoácidos identificados no alinhamento do polipeptideo com a sequência divulgada para maximizar identidade ou homologia (onde conservados aminoácidos são alinhados) usando um algoritmo de alinhamento padrão, como o algoritmo GAP. Os números de quimotripsina correspondentes das posições de aminoácidos 1-406 do polipeptideo de FVII definidos em SEQ ID NO: 3 são apresentadas na Tabela 1. As posições de aminoácidos em relação à sequência definida na SEQ ID NO:3 estão em fonte normal, os resíduos de aminoácidos nessas posições estão em negrito, e os números de quimotripsina correspondentes estão em itálico. Por exemplo, ao alinhamento do fator VII maduro (SEQ ID NO:3) com quimotripsina madura (SEQ ID NO:80), à isoleucina (I) na posição de aminoácido 153 em factor VII é dada a numeração de quimotripsina 116. Os aminoácidos subsequentes estão numerados de acordo. Em um exemplo, um ácido glutâmico (E) na posição de aminoácido 210 do fator VII maduro (SEQ ID N0:3) corresponde à posição de 5 aminoácido E70 com base na numeração de quimotripsina. Onde existe um resíduo em uma protease, mas não está presente em quimiotripsina, ao resíduo de aminoácido é dada uma notação letra. Por exemplo, os resíduos em quimotripsina que são 10 parte de um laço com aminoácido 60 com base na numeração de quimotripsina, mas estão inseridos na sequência do fator VII em comparação com quimiotripsina, são referidos por exemplo, como K60a, I60b, K60c ou N60d. Estes resíduos correspondem a K197, 1198, K199 e N200,respectivamente, pela numeração relativo à sequência de fator VII madura (SEQ ID NO:3).

Tabela 1. Numeração de quimotripsina do fator VII

Como aqui utilizadas, ácidos nucléicos incluem DNA, RNA e análogos dos mesmos, incluindo ácidos nucléicos de peptideo (PNA) e suas misturas. Os ácidos nucléicos podem ser simples ou dupla hélice. Ao referir-se a sondas ou primers, que são, opcionalmente marcados, como com uma marcação detectável, como uma radiomarcação ou marcação fluorescente, moléculas simples são contempladas. Tais moléculas são tipicamente de um comprimento em que seu alvo é estatisticamente único ou de baixo número de cópias (geralmente inferior a 5, geralmente inferior a 3), para sondar ou preparar uma biblioteca. Geralmente uma sonda ou primer contém pelo menos 14, 16 ou 30 nucleotídeos contíguos de sequência complementar ou idênticas a um gene de interesse. Sondas e primers podem ser 10, 20, 30, 50, 100 ou mais ácidos nucléicos de comprimento.

Conforme utilizado aqui, um peptideo se refere a um polipeptideo que é de 2 a 40 aminoácidos de comprimento.

Conforme utilizado aqui, os aminoácidos que ocorrem nas várias sequências de aminoácidos providas aqui são identificados de acordo com as suas conhecidas abreviaturas de três letras ou de uma letra (Tabela 2). Os nucleotideos que ocorrem nos vários fragmentos de ácido nucléico são designados com denominações de uma letra padrão usadas rotineiramente na técnica.

Conforme utilizado aqui, um "aminoácido" é um composto orgânico que contém um grupo amino e um grupo ácido carboxilico. Um polipeptideo contém dois ou mais aminoácidos. Para fins deste documento, aminoácidos incluem os vinte aminoácidos que ocorrem naturalmente, aminoácidos não-naturais e análogos de aminoácidos (por exemplo, 10 aminoácidos em que o carbono-a tem uma cadeia lateral).

De acordo com a nomenclatura de polipeptideo padrão descrita em J. Biol. Chem, 243:. 3552-3559 (1969) e adotada em 37 CFR, §§1,821-1,822, abreviações para os residues de aminoácidos estão apresentados na Tabela 2: Tabela 2 - Tabela de Correspondência

Deve ser notado que todas as sequências de resíduos de aminoácidos representadas aqui por fórmulas têm uma orientação da esquerda para a direita na direção convencionai do terminal amino para o terminal carboxila.

Além disso, a expressão "resíduos de aminoácidos" é definida de forma ampla para incluir os aminoácidos listados na Tabela de Correspondência (Tabela 2) e aminoácidos modificados e incomuns, tais como os referidos em 37 CFR. §§1, 821-1,822, e aqui incorporados por referência. Além disso, deve ser notado que um traço no início ou no final de uma sequência de resíduos de aminoácidos indica uma ligação de peptideo com uma sequência adicional de um ou mais resíduos de aminoácidos, a um grupo amino-terminal, como NH2 ou um grupo carboxila- terminal como COOH.

Como usado aqui^ um "aminoácido hidrofóbico" inclui qualquer um dos aminoácidos determinados a ser hidrofóbicos usando a escala de consenso de hidrofobicidade Eisenberg. Exemplares são os aminoácidos hidrofóbicos que ocorrem naturalmente, tais como isoleucina, fenilalanina, valina, leucina, triptofano, metionina, alanina, glicina, cisteina e tirosina (Eisenberg et al, (1982) Faraday Symp. Chem. Soc. 17:109-120). Aminoácidos hidrofóbicos de ocorrência não natural também estão incluidos.

Conforme utilizado aqui, um "aminoácido acídico" inclui entre os aminoácidos de ocorrência natural, residuos de ácido aspártico e ácido glutâmico. Aminoácidos acidicos de ocorrência não natural também são incluidos.

Como usado aqui, "aminoácidos de ocorrência natural" refere-se aos 20 L-aminoácidos que ocorrem em polipeptídeos.

Como usado aqui, "aminoácidos de ocorrência não natural" refere-se a um composto orgânico que contém um grupo amino e um grupo ácido carboxílico que não é um dos ácidos aminados que ocorrem naturalmente listados na Tabela 2. Aminoácidos de ocorrência não natural, portanto, incluem, por exemplo, aminoácidos ou análogos de aminoácidos que não sejam os 20 aminoácidos de ocorrência natural e incluem, mas não estão limitados a, D- isoestereômeros de aminoácidos. Aminoácidos de ocorrência não natural exemplares são conhecidos daqueles versados na técnica e podem ser incluídos em um polipeptídeo de fator VII modificado.

Conforme utilizado aqui, um construto de DNA é uma molécula de DNA simples ou dupla hélice, linear ou circular que contém segmentos de DNA combinado e justapostos de uma maneira não encontrada na natureza. Construtos de DNA existem como um resultado da manipulação humana, e incluem clones e outras cópias de moléculas manipuladas.

Conforme utilizado aqui, um segmento de DNA é uma porção de uma molécula de DNA maior tendo atributos especificados. Por exemplo, um segmento de DNA que codifica um polipeptideo especificado é uma porção de uma molécula de DNA mais comprida, como um fragmento de plasmídeo ou plasmideo, que, quando lidos a partir da direção 5' para 3', codifica a sequência de aminoácidos do polipeptideo especificado.

Como usado aqui, o termo polinucleotideo significa um polímero de desoxirribonucleotídeos ou bases de ribonucleotídeo simples ou dupla hélice lidos a partir da extremidade 5' para a extremidade 3'. Polinucleotídeos incluem RNA e DNA, e podem ser isoladas de fontes naturais, sintetizados in vitro, ou preparados de uma combinação de moléculas naturais e sintéticas. O comprimento de uma molécula de polinucleotideo é dado aqui em termos de nucleotideos (abreviado "nt") ou pares de base (abreviada "bp"). O termo nucleotideos termo é usado para moléculas simples e dupla hélice, onde o contexto permitir. Quando o termo é aplicado para moléculas dupla hélice é utilizado para designar comprimento total e ser entendido como equivalente ao termo pares de bases. Será reconhecido por aqueles versados na técnica que as duas hélices de um polinucleotideo dupla hélice podem diferir ligeiramente em comprimento e que as extremidades do mesmo podem ser deslocadas; sendo assim todos os nucleotideos numa molécula de polinucleotideo dupla hélice não podem ser emparelhados. Essas extremidades desemparelhadas, em geral, não serão superiores a 20 nucleotideos de comprimento.

Como usado aqui, "sequência principal" refere-se a sequência de residues de aminoácidos em um polipeptideo.

Como usado aqui, "semelhança" entre duas proteinas ou ácidos nucléicos se refere ao relacionamento entre a sequência de aminoácidos das proteinas ou sequências de nucleotideos dos ácidos nucléicos. Semelhança pode ser baseada no grau de identidade e/ou homologia das sequências de resíduos e os resíduos neles contidos. Métodos para avaliar o grau de semelhança entre as proteínas ou os ácidos nucléicos são conhecidos por aqueles versados na técnica. Por exemplo, em um método para avaliar a similaridade da sequência, dois aminoácidos ou sequências de nucleotideos são alinhados de maneira que produz um nível máximo de identidade entre as sequências. "Identidade" refere-se à medida em que os aminoácidos ou sequências de nucleotideos são invariáveis. O alinhamento das sequências de aminoácidos, e em alguma extensão sequências nucleotídicas, também pode levar em conta as diferenças conservadoras e/ou substituições frequentes em aminoácidos (ou nucleotideos). As diferenças conservadoras são aqueles que preservam as propriedades físico-químicas dos resíduos envolvidos. Os alinhamentos podem ser globais (alinhamento das sequências comparadas em relação ao comprimento total das sequências e incluindo todos os resíduos) ou local (o alinhamento de uma parte das sequências que inclui somente a região ou regiões mais similares).

Como usado aqui, os termos "homologia" e "identidade" são usados indistintamente, mas homologia para proteínas pode incluir mudanças de aminoácidos conservadoras. Em geral, para identificar as posições correspondentes as sequências de aminoácidos estão alinhadas de forma que a correspondência de maior ordem é obtida (ver, por exemplo: Computacional Molecular Biology, Lesk, AM, ed, Oxford University Press, New York, 1988; Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, DW, ed, Academic Press, New York, 1993; Computer Analyisis of Sequence Data. Parte I, Griffin, AM, e Griffin, HG, eds, Humana Press, New Jersey, 1994. Sequence Analysis in Molecular Biology, Heinje von, G. , Academic Press, 1987; e Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. e Devereux, J., eds, M Stockton Press, New York, 1991; Carrillo et al. (1988) SIAM J Applied Math 48:1073).

Como utilizado aqui, "identidade de sequência" se refere ao número de aminoácidos idênticos (ou bases de nucleotídeos) em uma comparação entre um teste e um polipeptídeo ou polinucleotídeo de referência. Polipeptídeos homólogos se referem a um número pré- determinado de resíduos de aminoácidos idênticos ou homólogos. Homologia inclui substituições conservadoras de aminoácidos e resíduos idênticos. A identidade de sequência pode ser determinada através de programas de algoritmo de alinhamento padrão usados com penalidades de lacuna padrão estabelecidas por cada fornecedor. Moléculas de ácido nucléico homólogas se referem a um número pré-determinado de nucleotideos idênticos ou homólogos. Homologia inclui substituições que não alteram o aminoácido codificado (isto é, "substituições silenciosas"), bem como resíduos idênticos. Moléculas de ácido nucléico substancialmente homólogas hibridizam normalmente na orientação moderada ou na orientação elevada ao longo do comprimento do ácido nucléico ou ao longo de pelo menos cerca de 70%, 80% ou 90% do comprimento total da molécula de ácido nucléico de interesse. Também estão contempladas as moléculas de ácido nucléico que contêm códons degenerados no lugar de códons na molécula de ácido nucléico que hibridiza. (Para a determinação de homologia de proteínas, aminoácidos conservadores podem ser alinhados, bem como aminoácidos idênticos, neste caso, o percentual de identidade e homologia percentual varia). Se quaisquer duas moléculas de ácido nucléico têm sequências de nucleotideos (ou quaisquer dois polipeptídeos têm sequências de aminoácidos) que são pelo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% "idênticos" pode ser determinado utilizando algoritmos de computador conhecidos como o programa "FAST A", usando, por exemplo, os parâmetros padrão como no Pearson et al. Proc.Natl. Acad. Sci. EUA 85: 2444 (1988) (outros programas incluem o pacote de programas GCG (Devereux, J., et al, Nucleic Acid Research 12 (1): 387 (1984)), BLASTP, BLASTN, FASTA (Atschul, SF, et . al, J. Molec. Biol. 215:403 (1990); Guide to Huge Computers Martin, J. Bispo, ed., Academic Press, San Diego (1994), e Carrillo et al. SIAM J Applied Math 48: 1073 (1988)). Por exemplo, a função BLAST do banco de dados do National Center for Biotechnology Information pode ser usado para determinar a identidade. Outros programas disponíveis comercialmente ou publicamente incluem DNAStar programa "MegAlign" (Madison,WI) e o programa " Gap" da Universidade de Wisconsin Genetics Computer Group (UWG) (Madison WI)). Percentual de homologia ou identidade de proteinas e/ou moléculas de ácido nucléico pode ser determinado, por exemplo, por comparação das informações de sequência usando um programa de computador GAP (por exemplo, Needleman et al. J. Mol. Biol. 48: 443 (1970), como revisto por Smith e Waterman (Adv. Appl. Math. 2: 482 (1981)). Resumidamente, um programa GAP define semelhança como o número de simbolos alinhados (ou seja, os nucleotideos ou aminoácidos) que são similares, dividido pelo número total de simbolos na menor das duas sequências. Os parâmetros padrão para o programa GAP podem incluir: (1) uma comparação unária matriz (que contém um valor de 1 identidades e 0 para não identidades) e a matriz de comparação ponderada de Gribskov et al. Nucl. Acids Res. 14: 6745 (1986), como descrito por Schwartz e Dayhoff, eds, Atlas of Protein Sequence and Structure, Fundação Nacional de Pesquisa Biomédica, pp 353-358 (1979); (2) uma penalização de 3,0 para cada lacuna e uma penalização adicional de 0,10 para cada simbolo em cada lacuna; e (3) nenhuma penalização para as lacunas de extremidade.

Portanto, como aqui utilizado, o termo "identidade" representa uma comparação entre um teste e um polipeptideo ou polinucleotideo de referência. Em um exemplo não-limitador, "pelo menos 90% idêntico ao" refere- se a identidades percentuais entre 90 e 100% em relação aos polipeptídeos de referência. Identidade em um nivel de 90% ou mais é indicativo do fato de que, supondo que para fins de exemplificação um teste e um comprimento de polinucleotideo de referência de 100 aminoácidos são comparados, não mais de 10% (ou seja, 10 dos 100) dos aminoácidos no polipeptideo de teste difere daquela dos polipeptídeos de referência. Comparações semelhantes podem ser feitas entre um teste e um polinucleotideo de referência. Tais diferenças podem ser representados como mutações pontuais distribuídas aleatoriamente por todo o comprimento de uma sequência de aminoácidos ou eles podem ser agrupados em um ou mais locais de comprimento variável até o máximo permitido, por exemplo, a diferença do ácido aminado 10/100 (cerca de 90% identidade). As diferenças são definidas como substituições, inserções ou exclusões de amino ácido ou ácido nucléico. Ao nivel das homologias ou identidades acima de cerca de 85-90%, o resultado deve ser independente do conjunto de parâmetros de programa e lacuna; tais níveis elevados de identidade podem ser facilmente avaliados, muitas vezes, sem depender de software.

Como usado aqui, também se entende que os termos "substancialmente idênticos" ou "similar" varia com o contexto de como é entendido por aqueles versados na técnica relevante, mas que aqueles de versados podem avaliar isso.

Conforme utilizado aqui, uma sequência alinhada se refere ao uso de homologia (semelhança e/ou identidade) para alinhar posições correspondentes em uma sequência de nucleotideos ou aminoácidos. Normalmente, duas ou mais sequências que são relacionados por 50% ou mais identidades estão alinhadas. Um conjunto de sequências alinhadas refere-se a duas ou mais sequências que são alinhadas em posições correspondentes, e podem incluir alinhar sequências derivadas de RNAs, como ESTs e outros cDNAs, alinhadas com as sequências de DNA genômico.

Como usado aqui, "especificamente hibridiza" refere-se ao emparelhamento, por pareamento de bases complementares, de uma molécula de ácido nucléico (por exemplo, um oligonucleotideo) a uma molécula de ácido nucléico alvo. Aqueles versados na técnica estão familiarizados com parâmetros in vitro e in vivo que afetam a hibridação específica, tais como comprimento e composição da molécula particular. Parâmetros particularmente relevantes para a hibridização in vitro incluem ainda o emparelhamento e temperatura de lavagem, composição do tampão e a concentração de sal. Condições de lavagem exemplares para a remoção moléculas de ácido nucléico não especificamente ligadas na orientação elevada são 0,1 x SSPE, 0,1% SDS, 65 °C, e na orientação média são de 0,2 x SSPE, 0,1% SDS, 50 °C. Condições de orientação equivalentes são conhecidas na técnica. A pessoa versada pode facilmente ajustar esses parâmetros para alcançar uma hibridização especifica de uma molécula de ácido nucléico para uma molécula de ácido nucléico alvo apropriados para uma aplicação particular.

Como aqui utilizado, polipeptideo ou proteina isolados ou purificados ou porção biologicamente ativa dos mesmos é praticamente isento de material celular ou de outras proteinas contaminantes a partir da célula do tecido a partir do qual a proteina é derivada, ou substancialmente livres de precursores quimicos ou outros produtos químicos quando sintetizados quimicamente. Preparações podem ser determinadas a ser substancialmente livre se elas aparecem livres impurezas facilmente detectáveis como determinado por métodos de análise padrão, tais como cromatografia em camada delgada (TLC), eletroforese em gel e cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC) , usados por aqueles versados na técnica para avaliar tal pureza, ou puro suficientemente tal que purificação adicional não alteraria de forma detectável as propriedades físicas e químicas, tais como atividades proteolítica e biológica da substância. Métodos de purificação dos compostos para produzir compostos substancialmente quimicamente puros são conhecidos por aqueles versados na técnica. Um composto substancialmente quimicamente puro, no entanto, pode ser uma mistura de estereoisômeros. Em tais casos, purificação adicional pode aumentar a atividade especifica do composto.

O termo substancialmente livre de material celular inclui preparações de proteinas em que a proteina é separada dos componentes celulares das células a partir da qual é isolado ou produzido de forma recombinante. Em uma modalidade, o termo substancialmente livre de material 10 celular inclui preparações de proteinas de protease tendo menos que cerca de 30% (em peso seco) de proteinas não- protease (também referida aqui como uma proteina contaminante), geralmente inferior a cerca de 20% proteinas não-protease ou 10% de proteinas não-protease ou menos que 15 cerca de 5% de proteinas não-protease. Quando a proteina de protease ou parte ativa da mesma é produzida de forma recombinante, também é substancialmente livre de meio de cultura, ou seja, meio de cultura representa menos de, aproximadamente, ou igual a 20%, 10% ou 5% do volume da 20 preparação da proteina de protease.

Como usado aqui, o termo praticamente isento de precursores quimicos ou outros produtos químicos inclui preparações de proteínas de protease em que a proteína é separada dos precursores químicos ou outros produtos 25 químicos que estão envolvidos na síntese da proteína. O termo inclui preparações de proteínas de protease com menos de 30% (em peso seco), 20%, 10%, 5% ou menos de precursors químicos ou produtos químicos ou componentes não-protease.

Como usado aqui, a produção por métodos recombinantes através de métodos de DNA recombinante se refere ao uso dos métodos bem conhecidos de biologia molecular para expressar proteinas codificadas pelo DNA clonado.

Conforme utilizado aqui, vetor (ou plasmideo) refere-se a elementos discretos que são utilizados para introduzir ácido nucléico heterólogos em células de expressão ou replicação do mesmo. Os vetores permanecem normalmente episomal, mas podem ser projetados para efetuar integração de um gene ou parte dele em um cromossomo do genoma. Também contempladas são vetores que são cromossomos artificiais, tais como cromossomos de bactérias artificiais, cromossomos artificiais de levedura e cromossomos artificiais de mamiferos. Seleção e utilização de tais veiculos são bem conhecidos daqueles versados na técnica.

Como usado aqui, expressão refere-se ao processo pelo qual o ácido nucléico é transcrito em mRNA e traduzido em peptideos, polipeptídeos ou proteinas. Se o ácido nucléico é derivado de DNA genômico, a expressão pode, se uma célula hospedeira eucariótica apropriada ou organismo for selecionado, incluir processamento, como emenda do mRNA.

Conforme utilizado aqui, um vetor de expressão inclui vetores capazes de expressar o DNA que está ligado operativamente com sequências regulatórias, tais como as regiões de promotor, que são capazes de efetuar a expressão de tais fragmentos de DNA. Tais segmentos adicionais podem incluir sequências de promotor e terminador, e, opcionalmente, pode incluir uma ou mais origens de replicação, um ou mais marcadores de seleção, um facilitador, um sinal de poliadenilação, e assim por diante. Vetores de expressão são geralmente derivados de DNA de plasmideo ou virus, ou pode conter elementos de ambas. Assim, um vetor de expressão se refere a um construto de DNA ou RNA recombinante, tal como um plasmideo, um fago, o virus recombinante ou outro vetor que, quando da introdução em uma célula hospedeira adequada, resulta na expressão do DNA clonado. Vetores de expressão adequados são bem conhecidos daqueles versados na técnica e incluem aqueles que são replicáveis em células eucarióticas e/ou células procarióticas e aqueles que permanecem episomal ou aqueles que integram no genoma da célula hospedeira.

Como usado aqui, vetor também inclui "vetores virais". Os vetores virais são virus projetados que são operativamente ligados a genes exógenos para a transferência (como veiculos ou lançadeiras) dos genes exógenos para dentro das células.

Conforme utilizado aqui, um adenovirus se refere a qualquer de um grupo de DNA contendo virus que causam conjuntivite e infecções do tcamundongo respiratório superior em humanos.

Conforme utilizado aqui, DNA nu refere-se ao DNA livre de histona que pode ser usado em vacinas e terapia gênica. DNA nu é o material genético que é passado de uma célula para outra durante uma transferência de genes processados chamada transformação ou transfecção. No processo de transformação ou de transfecção, DNA nu ou purificado que é absorvido pela célula receptora dará a célula receptora uma nova caracteristica ou fenótipo.

Como aqui utilizado, oprável ou ligados operacionalmente quando se refere a segmentos de DNA significa que os segmentos são dispostos de modo que funcionem em conjunto para a sua finalidade pretendida, por exemplo, inicia a transcrição no promotor e prossegue através do segmento de codificação para o terminador.

Conforme utilizado aqui, um agente que modula a atividade de uma proteina ou expressão de um gene ou do ácido nucléico diminui ou aumenta ou de outra forma altera a atividade da proteina, ou, de alguma forma, regula para cima ou para baixo ou de outra forma não altera a expressão de o ácido nucléico em uma célula.

Conforme utilizado aqui, uma "proteina quimérica" ou "proteina de fusão", refere-se a um polipeptideo operativamente ligado a um polipeptideo diferente. A proteina quimérica ou de fusão provida aqui pode incluir um ou mais polipeptídeos de FVII, ou parte dele, e um ou mais outros polipeptídeos para qualquer um ou mais de um sinais de controle de transcrição/translação, as sequências de sinais, uma marca para localização, uma marca para purificação, parte de um domínio de imunoglobulina G, e/ou um agente de direcionamento. Um polipeptideo quimérico de FVII inclui também aqueles que têm seus dominios ou regiões endógenos do polipeptideo trocado com outro polipeptideo. Essas proteinas quiméricas ou de fusão incluem aquelas produzidas por meio de recombinação como proteinas de fusão, aquelas produzidos por meios quimicos, como por acoplamento quimico, através, por exemplo, de acoplamento de grupos sulfidrila, e aquelas produzidas por qualquer outro método pelo qual pelo menos um polipeptideo (FVII, por exemplo), ou parte dele, é ligado, direta ou indirectamente através de vinculador (s) para outro polipeptideo.

Conforme utilizado aqui, operativamente ligadas ao se referir a uma proteina de fusão se refere a um polipeptideo de protease e um polipeptideo de não-protease que são fundidos em quadro um a outro. O polipeptideo de não-protease pode ser fundido ao terminal N ou terminal C do polipeptideo de protease.

Conforme utilizado aqui, um agente de direcionamento, é qualquer molécula, como uma proteina ou parte efetiva da mesma, que fornece ligação especifica a uma molécula de superfície celular, como um receptor da superfície celular, que em alguns casos, pode internalizar um conjugado ou parte do mesmo ligado. Um agente de direcionamento também pode ser um que promova ou facilite, por exemplo, isolamento por afinidade ou purificação do conjugado; ligação do conjugado a uma superfície; ou detecção do conjugado ou complexos contendo o conjugado.

Conforme utilizado aqui, derivado ou análogo de uma molécula refere-se a uma porção derivada ou uma versão modificada da molécula.

Conforme utilizado aqui, "doença ou distúrbio" refere-se a uma condição patológica em um organismo resultante da causa ou condição incluindo, mas não limitado a, infecções, condições adquiridas, condições genéticas, e caracterizada por sintomas identificáveis. Doenças e distúrbios de interesse aqui são os que envolvem coagulação, incluindo aqueles mediadas por proteinas de coagulação e aqueles em que as proteinas de coagulação desempenham um papel na etiologia ou patologia. Doenças e distúrbios incluem também aqueles que são causados pela ausência de uma proteina, como na hemofilia, e de especial interesse aqui são aqueles distúrbios onde a coagulação não ocorre devido a uma deficiência de defeito em uma proteina de coagulação.

Como usado aqui, "pró-coagulantes" refere-se a qualquer substância que promova a coagulação do sangue.

Como usado aqui, "anticoagulante" refere-se a qualquer substância que inibe a coagulação do sangue.

Como usado aqui, "hemofilia" refere-se a um distúrbio de sangramento causado por uma deficiência em fatores de coagulação sanguínea. A hemofilia pode ser o resultado, por exemplo, da ausência, diminuição da expressão, ou redução da função de um fator de coagulação. 0 tipo mais comum de hemofilia é hemofilia tipo A, que resulta de uma deficiência do fator VIII. O segundo tipo mais comum de hemofilia é hemofilia B, que resulta de uma deficiência do fator IX. Hemofilia C, também chamada deficiência FXI, é uma forma mais suave e menos comum de hemofila.

Conforme utilizado aqui, "hemofilia congênita" refere-se a tipos de hemofilia, que são herdados. Hemofilia congênita resulta da mutação, deleção, inserção ou outra modificação de um gene do fator de coagulação em que a produção do fator de coagulação está ausente, reduzida ou não funciona. Por exemplo, mutações hereditárias nos genes do fator de coagulação, tais como fator VIII e fator IX resultam na hemofilias congênitas, hemofilia A e B, respectivamente.

Como usado aqui, "hemofilia adquirida" refere-se a um tipo de hemofilia que se desenvolve na idade adulta a partir da produção de auto-anticorpos que inativam FVIII.

Como usado aqui, "distúrbios de sangramento" refere-se a uma condição na qual o indivíduo tem uma diminuição da capacidade de controlar o sangramento. Distúrbios do sangramento podem ser hereditários ou adquiridos, podendo resultar, por exemplo, de defeitos ou deficiências na via de coagulação, defeitos ou deficiências na atividade plaquetária, ou defeitos vasculares.

Conforme utilizado aqui, "distúrbio de sangramento adquirido" se refere a distúrbios de sangramento que resulta da deficiência de coagulação causada por condições como doenças do fígado, deficiência de vitamina K, ou cumafento (varfarina) ou outra terapia anti-coagulante.

Como usado aqui, "tratar" um individuo tendo uma doença ou condição significa que um polipeptideo, composição, ou outro produto provido aqui é administrada ao individuo.

Conforme utilizado aqui, um agente terapêutico, regime terapêutico, radioprotetor ou quimioterápico significa drogas convencionais e terapias com droga, incluindo vacinas, que são conhecidos por aqueles versados na técnica. Agentes radioterapêuticos são bem conhecidas na técnica.

Como usado aqui, tratamento significa qualquer maneira pela qual os sintomas de uma condição, distúrbio ou doença são aliviados ou de outra forma beneficamente alterado. Dai, tratamento abrange a profilaxia, terapia e/ou cura. O tratamento também inclui qualquer uso farmacêutico das composições deste documento. O tratamento também inclui qualquer uso farmacêutico de um FVII modificad e composições providas aqui.

Conforme utilizado aqui, a melhora dos sintomas de uma determinada doença ou distúrbio por um tratamento, como pela administração de uma composição farmacêutica ou de outros produtos terapêuticos, refere-se a qualquer redução, permanente ou temporária, duradoura ou transitória, dos sintomas que podem ser atribuídos ou associados à administração da composição ou ou produto terapêutico.

Conforme utilizado aqui, prevenção ou profilaxia se refere aos métodos em que o risco do desenvolvimento da doença ou condição é reduzido. A profilaxia inclui redução no risco de desenvolver uma doença ou condição e/ou prevenção de piora dos sintomas ou progressão de uma doença ou a redução do risco de agravamento dos sintomas ou progressão da doença.

Conforme utilizado aqui, uma quantidade eficaz de um composto ou composição para tratar uma doença em particular é uma quantidade que é suficiente para melhorar, ou de alguma maneira reduzir os sintomas associados à doença. Essa quantidade pode ser administrada como dose única ou pode ser administrada de acordo com um regime, segundo o qual é eficaz. A quantidade pode curar a doença, mas, normalmente, é administrada de forma a melhorar os sintomas da doença. Normalmente, a administração repetida é necessária para alcançar uma melhoria desejada dos sintomas.

Como usado aqui, "quantidade terapeuticamente eficaz" ou "dose terapeuticamente eficaz" refere-se a um agente, composto, material ou composição contendo um composto que é pelo menos suficiente para produzir um efeito terapêutico. Uma quantidade eficaz é a quantidade de um agente terapêutico necessária para a prevenção, cura, melhora, detenção ou detenão parcial de um sintoma de uma doença ou distúrbio.

Como usado aqui, "paciente" ou "individuo" a ser tratado inclui seres humanos ou animais não-humanos,incluindo mamíferos. Os mamíferos incluem primatas, como humanos, chimpanzés, gorilas e macacos; animais domesticados, como cães, cavalos, gatos, porcos, cabras, vacas; e roedores, como camundongos, camundongos, hamsters 5 e gerbos.

Conforme utilizado aqui, uma combinação refere-se a de qualquer associação entre dois ou mais itens. A associação pode ser espacial ou se refere ao uso de dois ou mais itens para um propósito comum.

Conforme utilizado aqui, uma composição refere-se a de qualquer mistura de dois ou mais produtos ou compostos (por exemplo, agentes, moduladores, reguladores, etc.). Pode ser uma solução, uma suspensão, líquido, pó, pasta, formulações aquosas ou não-aquosas ou qualquer combinação 15 dos mesmos.

Conforme utilizado aqui, um "artigo de manufatura" é um produto que é feito e vendido. Como utilizado ao longo deste pedido, o termo se destina a abranger polipeptídeos de protease modificados e ácidos 20 nucléicos contidos nos artigos de embalagem.

Como usado aqui, fluido se refere a qualquer composição que pode fluir. Fluidos, portanto, engloba composições que estão em forma de semi-sólidos, pastas, soluções, misturas aquosas, géis, loções, cremes e outras 25 tais composições.

Conforme utilizado aqui, um "kit" refere-se a uma combinação embalada, opcionalmente, incluindo reagentes e outros produtos e/ou componentes para a prática de métodos usando os elementos da combinação. Por exemplo, kits contendo um polipeptideo de protease modificado ou uma molécula de ácido nucléico providos aqui e outro item para uma finalidade, incluindo, mas não limitado a, administração, diagnóstico e avaliação da atividade biológica ou propriedades são providos. Kits opcionalmente incluir instruções de uso.

Como usado aqui, o anticorpo inclui fragmentos de anticorpos, tais como fragmentos Fab, que são compostos de uma cadeia leve e da região variável de uma cadeia pesada.

Conforme utilizado aqui, um receptor se refere a uma molécula que tem uma afinidade para um ligante especifico. Receptores podem ser de ocorrência natural ou moléculas sintéticas. Receptores também podem ser referidos na técnica como anti-ligantes.

Conforme utilizado aqui, animal inclui qualquer animal, tais como, mas não limitado a, primatas, incluindo humanos, gorilas e macacos; roedores, como camundongos e camundongos; aves, como galinhas; ruminantes, como cabras, vacas, veados, ovelhas; ovinos, como porcos e outros animais. Os animais não-humanos excluem os humanos como animal contemplado. As proteases providas aqui são de qualquer fonte, animal, vegetal, procariótica e fungos.

Conforme utilizado aqui, a terapia genética envolve a transferência de ácido nucléico heterólogo, tal como DNA, em determinadas células, células-alvo, de um mamifero, especialmente um ser humano, com um distúrbio ou condição para que essa terapia é procurada. O ácido nucléico, como o DNA, é introduzido nas células-alvo selecionadas, como diretamente ou em um vetor ou outros veiculos de entrega, de tal forma que o ácido nucléico heterólogo, tais como DNA, é expresso e um produto terapêutico codificado assim é produzido. Alternativamente, o ácido nucléico heterólogo, tal como DNA, pode de alguma maneira mediar a expressão de DNA que codifica o produto terapêutico, ou ele pode codificar um produto, como um peptideo ou RNA que, de alguns maneiras media, direta ou indiretamente, a expressão de um produto terapêutico. A terapia genética também pode ser usada para fornecer ácido nucléico que codifica um produto de gene que substitui um gene defeituoso ou suplementa um produto de gene produzido pelo mamifero ou pela célula na qual é introduzido. O ácido nucléico introduzido pode codificar um composto terapêutico, como uma protease ou protease modificado, que normalmente não é produzida no hospedeiro de mamifero ou que não é produzido em quantidades terapeuticamente eficazes ou em um tempo terapeuticamente útil. O ácido nucléico heterólogo, tal como o DNA, que codifica o produto terapêutico pode ser modificado antes da introdução nas células do hospedeiro afligido a fim de reforçar ou de outra forma alterar o produto ou a expressão das mesmas. A terapia genética também pode envolver a entrega de um inibidor ou repressor ou outro modulador de expressão de gene.

Conforme utilizado aqui, ácido nucléico heterólogo é o ácido nucléico que normalmente não é produzido in vivo pela célula em que se expressa ou que é produzida pela célula, mas está em um lugar diferente ou expressos de forma diferente ou que medeia ou codifica mediadores que alteram a expressão do ácido nucléico endógeno, como DNA, por afetar a transcrição, tradução, ou outros processos bioquímicos reguláveis. Ácido nucléico heterólogo, geralmente não é endógeno para a célula na qual é introduzido, mas foi obtido de outra célula ou preparado sinteticamente. Ácido nucléico heterólogo pode ser endógeno, mas é o ácido nucléico que se expressa a partir de um lugar diferente ou alterado em sua expressão. Geralmente, embora não necessariamente, tal ácido nucléico codifica o RNA e proteinas que normalmente não são produzidas pela célula ou da mesma forma na célula na qual é expressado. Ácido nucléico heterólogo, tal como DNA, também pode ser referido como ácido nucléico estrangeiro, como DNA. Assim, o ácido nucléico heterólogo ou o ácido nucléico estrangeiro inclui uma molécula de ácido nucléico que não está presente na orientação ou posição exata como a molécula de ácido nucléico de contrapartida, como DNA, é encontrado em um genoma. Também pode se referir a uma molécula de ácido nucléico de outro organismo ou espécie (isto é, exógena).

Qualquer ácido nucléico, como o DNA, que umapessoa versada na técnica iria reconhecer ou considerar como heterólogo ou estrangeiro para a célula na qual o ácido nucléico é expresso é englobado aqui pelo ácido nucléico heterólogo; ácido nucléico heterólogo inclui ácido nucléico adicionado exogenamente que também é expresso de forma endógena. Exemplos de ácido nucléico heterólogo incluem, mas não estão limitados a, ácido nucléico que codifica proteinas marcadoras rastreáveis, tal como uma proteina que confere resistência à droga, ácido nucléico que codifica substâncias terapeuticamente eficazes, tais como agentes, enzimas e hormônios anti-câncer, e ácido nucléico, tal como DNA, que codifica outros tipos de proteinas, como anticorpos. Anticorpos que são codificados pelo ácido nucléico heterólogo podem ser secretadas ou expressos na superfície da célula na qual o ácido nucléico heterólogo foi introduzido.

Conforme utilizado aqui, um produto terapeuticamente eficaz de terapia gênica é um produto que é codificado pelo ácido nucléico heterólogo, normalmente DNA, que, após a introdução do ácido nucléico em um hospedeiro, um produto é expresso que melhora ou elimina os sintomas, manifestações de uma doença hereditária ou adquirida, ou que a cura da doença. Também estão incluídos moléculas de ácido nucléico biologicamente ativas, como RNAi e anti-senso.

Como usado aqui, recitação que um polipeptideo "consiste essencialmente" de uma sequência de aminoácidos recitada significa que apenas a porção recitada, ou um fragmento da mesma, do polipeptideo de comprimento completo está presente. O polipeptideo pode, opcionalmente, e geralmente, incluir aminoácidos adicionais de outra fonte ou pode ser inserido em outro polipeptideo.

Como aqui utilizado, as formas singulares "um", "uma" e "o" inclui referências no plural a menos que o contexto claramente indique o contrário. Assim, por exemplo, a referência ao composto, compreendendo "um dominio extracelular" inclui compostos com um ou uma pluralidade de dominios extracelulares.

Como usado aqui, faixas e quantidades podem ser expressas como "aproximadamente" um valor ou faixa em particular. Aproximadamente inclui também o valor exato. Portanto, "aproximadamente 5 bases" significa "aproximadamente 5 bases" e também "5 bases".

Como usado aqui, "opcional" ou "opcionlamente" significa que o evento ou circunstância descritos subsequentemente ocorre ou não, e que a descrição inclui casos em que tal evento ou circunstância ocorre e casos em que não. Por exemplo, um grupo opcionalmente substituído significa que o grupo é não substituído ou é substituído.

Como aqui utilizado, as abreviaturas para qualquer grupo de proteção, aminoácidos e outros compostos, são, salvo indicação em contrário, de acordo com seu uso comum, abreviações reconhecidas, ou a Nomenclatura da Comissão de Bioquímica IUPAC-IUB (ver, (1972) Biochem. 11: 1726).

B. Resumo de Hemostasia

Providos aqui estão polipeptideos de Fator VII (FVII) modificados. Tais polipeptideos de FVII são projetados para ter atividade coagulante aumentada. Assim, estes polipeptideos tem uma variedade de usos e aplicações, por exemplo, como produtos terapêuticos para modular a hemostasia, e outros processos biológicos relacionados. Para apreciar as modificações providas aqui e o uso de tais moléculas de FVII modificadas, um entendimento do sistema hemostático e da cascata de coagulação do sangue é vantajoso. A discussão a seguir fornece tal base, preliminar a uma discussão sobre o fator VII, e suas modificações.

Hemostasia é o mecanismo fisiológico que origina o sangramento que resulta de uma lesão à vasculatura. Hemostasia normal depende dos componentes celulares e proteinas plasmáticas solúveis e envolve uma série de eventos sinalizadores que, em última análise, leva à formação de um coágulo de sangue. A coagulação é iniciada rapidamente após uma lesão ocorrer ao vaso sanguineo e as células endoteliais são danificadas. Na fase primária da coagulação, as plaquetas são ativadas para formar um tampão hemostático no local da lesão. A hemostasia secundária segue envolvendo fatores da coagulação do plasma, que atuam em uma cascata proteolitica, resultando na formação de fios de fibrina que fortalecem o tampão plaquetário.

Após a lesão do vaso, o fluxo de sangue para a área lesionada imediata é restringido por constrição vascular permitindo que as plaquetas aderem ao colágeno fibrilar recém-exposto sobre o tecido conjuntivo subendotelial. Esta adesão é dependente do fator von Willebrand (vWF), que se liga ao endotélio dentro de três segundos de lesão, facilitando assim a adesão e agregação plaquetária. A ativação das plaquetas agregadas resulta na secreção de uma variedade de fatores, incluindo a ADP, ATP tromboxano e serotonina. Moléculas de adesão, fibrinogênio, vWF,trombospondina e fibronectina também são liberados. Essa secreção promove uma aderência adicional e agregação das plaquetas, aumento da ativação plaquetária e constrição dos vasos sanguíneos, e exposição de fosfolipideos aniônicos na superfície da plaqueta, que servem como plataformas para a montagem de complexos enzimáticos da coagulação de sangue. As plaquetas mudam e forma levando à formação de pseudópodos, que facilita ainda mais a agregação de outras plaquetas resultando em um tampão plaquetário solto.

Uma cascata de coagulação de peptidases (a cascata de coagulação) é simultaneamente iniciada. A cascata de coagulação envolve uma série de eventos de ativação envolvendo clivagem proteolitica. Em tal cascata, uma proteína inativa de uma protease de serina (também chamada de zimogênio) é convertida em uma protease ativa por divagem de uma ou mais ligações peptídicas, que então servem como protease de ativação para a próxima molécula de zimogênio na cascata, resultando finalmente na formação do coágulo pela ligação cruzada da fibrina. Por exemplo, a cascata gera moléculas ativadas, tais como trombina (de divagem da protrombina), que ainda ativa as plaquetas, e também gera fibrina da divagem de fibrinogênio. A fibrina, em seguida, forma um polímero reticulado ao redor do tampão plaquetário para estabilizar o coágulo. Após a reparação da lesão, a fibrina é digerida pelo sistema fibrinolitico, os componentes principais são o plasminogênio e ativador de plasminogêncio tipo de tecido (tPA). Ambas essas proteinas são incorporadas na fibrina de polimerização, onde interagem com formação de plasmina, que, por sua vez, atua sobre a fibrina para dissolver o coágulo pré-formado. Durante a formação do coágulo, os inibidores de fator de coagulação também circulam através do sangue para evitar a formação de coágulos além do local da lesão.

A interação do sistema, da lesão para a formação de coágulo e fibrinólise subsequente, é descrito abaixo.

1. Adesão e agregação plaquetária

A coagulação do sangue é ativamente contornada em condições normais. 0 endotélio vascular suporta vasodilatação, inibe a adesão e ativação plaquetária, suprime a coagulação, aumenta a clivagem de fibrina e é anti-inflamatória em caráter. Células endoteliais vasculares secretam moléculas como óxido nitroso (NO) e prostacilina, que inibem a agregação plaquetária e dilatam os vasos sanguineos. A liberação dessas moléculas ativa os niveis de guanilato ciclase solúvel (sGC) e proteina quinase I dependente de cGMP (cGKI) e aumenta a guanosina monofosfato ciclica (cGMP), que causam o relaxamento do músculo liso na parede do vaso. Além disso, as células endoteliais expressas na superfície celular ADPases, como CD39, que controlam a ativação e agregação plaquetária, convertendo ADP liberado das plaquetas em inibidores plaquetários de adenina nucleotideos. 0 endotélio também desempenha um papel importante na regulação das enzimas na cascata fibrinolitica. As células endoteliais que promovem diretamente a geração de plasmina, através da expressão dos receptores de plasminogênio (anexina II) e uroquinase, bem como a secreção dos ativadores de uroquinase plasminogênio tipo tecido, todos promovem a desobstrução de coágulos. Em uma última camada de regulação pró-trombótica, células endoteliais desempenham um papel ativo na inibição da cascata de coagulação através da produção de sulfato de heparan, o que aumenta a cinética de inibição da antitrombina III da trombina e outros fatores de coagulação.

Sob trauma vascular agudo, porém, os mecanismos vasoconstritores predominam e o endotélio torna-se pró- trombótico, pró-coagulatório e pró-inflamatório por natureza. Isto é conseguido através da redução dos agentes de dilatação endotelial: adenosina, NO e prostaciclina; e da ação direta de ADP, serotonina e tromboxano em células musculares lisas vasculares para provocar sua contração (Becker, Heindl et al 2000) . O gatilho principal para a mudança na função endotelial que leva à formação de trombo hemostático é a perda da barreira de células endoteliais entre o sangue e os componentes da matriz extracelular (ECM) (Ruggeri (2002) Nat Med 8:1227-1234). Plaquetas circulantes identificam e discriminam áreas de lesões endoteliais e aderem ao sub endotélio exposto. Sua interação com os vários substratos trombogênicos e agonistas gerados ou liberados localmente rsultam na ativação plaquetária. Esse processo é descrito como possuindo duas etapas, 1) adesão: prender-se inicialmente a uma superficie, e 2) agregação: coesão plaqueta-plaqueta (Savage et al (2001) Curr Opin Hematol 8:270-276).

A adesão plaquetária é iniciada quando as plaquetas de circulação se ligam ao colágeno exposto através da interação com proteinas de ligação de colágeno na superficie celular, e através da interação com vWF, também presente no endotélio. A proteina de vWF é uma estrutura multimérica de tamanho variável, secretada em duas direções pelo endotélio; basolateralmente e na circulação sanguinea. vWF também se liga ao fator VIII, que é importante na estabilização do fator VIII e sua sobrevivência na circulação.

A adesão plaquetária e subsequente ativação é obtida quando se liga vWF através do seu dominio de Al para GPIb (parte do complexo receptor de glicoproteina plaquetária GPIb-IX-V). A interação entre vWF e GPIb é regulada por força de cisalhamento de tal forma que um aumento nos resultados da tensão de cisalhamento em um correspondente aumento na afinidade do vWF para GPIb. Integrina αlβ2, também conhecida em leucócitos como VLA-2, é o principal receptor do colágeno nas plaquetas, e acoplamento através deste receptor gera os sinais intracelulares que contribuem para a ativação plaquetária. A ligação através otlβ2 facilita o acoplamento do receptor de colágeno de menor afinidade, GP VI. Isso faz parte da superfamilia das imunoglobulinas e é o receptor que gera os sinais intracelulares mais potentes de ativação plaquetária. Resultados da ativação plaquetária na liberação de adenosina difosfato (ADP), que é convertido em tromboxano A2.

A ativação plaquetária também resulta na expressão superfície de receptores de glicoproteina Ilb- Illa plaquetária (GP Ilb-IIIa), também conhecidas como integrina plaquetária αIIbβ3. Os receptores GP Ilb-IIIa permitem a aderência das plaquetas entre si (ou seja, agregação), por força das moléculas de fibrinogênio ligando as plaquetas através desses receptores. Isso resulta na formação de um tampão plaquetário no local da lesão para ajudar a evitar mais perda de sangue, enquanto o tecido vascular danificado libera fatores que iniciam a cascata de coagulação e a formação de uma malha de fibrina estabilizada em torno do tampão plaquetário.

2 . Cascata de coagulação

A via de coagulação é uma via proteolítica onde cada enzima está presente no plasma como um zimogênio, ou forma inativa. A clivagem do zimogênio é regulada para liberar a forma ativa da molécula precursora. Os cofatores das proteases ativadas, tais como o glicoproteinas de FVIII e FV, também são ativados na reação da cascata e desempenham um papel na formação do coágulo. As funções da via como uma série de laços de retorno positivo e negativo que controlam o processo de ativação, onde o objetivo final é a produção de trombina, que pode converter o fibrinogênio solúvel em fibrina para formar um coágulo. Aos fatores na coagulação são tipicamente atribuídos um número romano, com uma minúscula "a" acrescentada para indicar uma forma ativada. A Tabela 3 abaixo apresenta uma lista exemplar de fatores, incluindo o seu nome comum, e seu papel na cascata de coagulação. Geralmente, estas 5 proteínas participam na coagulação do sangue através de uma ou mais das vias intrínseca, extrínseca e comum da coagulação (ver Figura 1). Como discutido ‘abaixo, essas vias estão interligadas, e coagulação do sangue acredita-se se dar através de um modelo baseado em células de ativação com o fator VII (FVII), sendo a principal 10 iniciador da coagulação.Tabela 3 - Fatores de Coagulação

*Tabela adaptada de M.W.King (2006) em med.unibs.it/-marchesi/blood.html

A geração de trombina tem sido historicamente dividida em três vias, vias intrínseca (sugerindo que todos 5 os componentes da via são intrínsecas ao plasma) e extrínsecas (sugerindo que um ou mais componentes da via são extrínsecos ao plasma) que fornecem rotas alternativas para a geração de fator X ativado (FXa), e a via final comum que resulta na formação de trombina (Figura 1). Estas 10 vias participam juntas de um processo interligado e interdependente para efetuar coagulação. Um modelo de coagulação baseado em células foi desenvolvido que descreve essas vias (Figura 2) (Hoffman et al (2001) Thromb Haemost 85:958-965). Neste modelo, as vias "extrínseca" e "intrínseca" são efetuadas em superfícies celulares diferentes, as células de suporte de fator tecidual (TF) e plaquetas, respectivamente. 0 processo de coagulação é dividido em fases distintas, iniciação, amplificação e propagação, durante a qual as vias extrínseca e intrínseca funcionam em vários estágios para produzir a grande explosão de trombina necessária para converter quantidades suficientes de fibrinogênio em fibrina para a formação de coágulos.

a. Iniciação

FVII é considerado o fator de coagulação responsável por iniciar a cascata de coagulação, que a iniciação é dependente de sua interação com TF. TF é uma glicoproteína de transmembrana expressa por uma variedade de células, como células de músculo liso, fibroblastos, monócitos, linfócitos, granulócitos, plaquetas e células endoteliais. Células mielóides e células endoteliais expressam apenas TF, quando elas são estimuladas, como por citocinas pró-inflamatórias. As células músculo liso e fibroblastos, porém, expressam constitutivamente TF. Assim, uma vez que estas células entram em contato com a corrente sanguínea após uma lesão tecidual, a cascata de coagulação é rapidamente iniciada pela ligação de TF com o fator VII ou FVIIa no plasma.

Como discutido abaixo, a maioria dos FVII no sangue está na forma de zimogênio com uma pequena quantidade, cerca de 1%, presente como FVIIa. Na ausência de ligação de TF, no entanto, mesmo FVIIa tem características semelhantes a zimogênio e não apresenta atividade significativa até que é complexado com TF. Assim, o FVII do plasma requer ativação por clivagem proteolitica e mudança conformacional adicionais através da interação com TF, para exercer atividade completa. Uma série de proteases, incluindo os fatores IXa, Xa, Xlla e trombina, demonstraram ser capazes de clivagem de FVII in vitro, um processo que é acelerado na presença de TF. FVIIa sozinho também pode ativar o FVII na presença do TF, um processo denominado autoativação. As pequenas quantidades de FVIIa no sangue são provavelmente devido à ativação por FXa e/ou FIXa (Wildgoose et al. (1992) Sangue 80:25-28, e Butenas et al. (1996) Bioquímica 35:1904-1910). Complexos de TF/FVIIa pode assim ser formado pela ligação direta do FVIIa ao TF, ou pela ligação de FVII ao TF e consequentemente a ativação de FVII a FVIIa por uma protease do plasma, tais como FXa, FIXa, FXIIa ou FVIIa sozinho. O complexo TF/FVIIa permanece ancorado à célula que carrega TF onde ativa pequenas quantidades FX em FXa no que é conhecido como a "via extrínseca" de coagulação.

O complexo de TF/FVIIa cliva também pequenas quantidades de FIX em FIXa. FXa se associa com seu cofator FVa para também formar um complexo na célula que carrega TF que pode assim converter protrombina em trombina. A pequena quantidade de trombina produzida é, no entanto, insuficiente para suportar a formação de fibrina necessária para a coagulação completa. Além disso, qualquer FXa e FIXa ativos são inibidos na circulação pela antitrombina III (AT-III) e outras serpinas, que são discutidos em mais detalhes abaixo. Isso normalmente impederis a formação de coágulo na circulação. Na presença de lesão, no entanto, os danos à vasculatura resultam na agregação e ativação 5 plaquetária neste local de formação de trombina, pelo que permite a amplificação do sinal de coagulação.

b. Amplificação

A amplificação ocorre quando a trombina se liga a e ativa as plaquetas. As plaquetas ativadas liberam FV de 10 seus grânulos alfa, que é ativado pela trombina para FVa. A trombina também libera e ativa FVIII do complexo de FVIII/vWF na membrana plaquetária, e cliva FXI em FXIa. Essas reações geram plaquetas ativadas que possuem FVa, FVIIIa e FIXa em sua superficie, que preparou o local para 15 uma grande explosão de geração de trombina durante a fase de propagação.

c. Propagação

A propagação da coagulação ocorre na superficie de um grande número de plaquetas no local da lesão. Como 20 descrito acima, as plaquetas ativadas têm FXIa, FVIIIa e FVa em sua superficie. É aqui que a via extrinseca é efetuada. FXIa ativa FIX para FIXa, que pode assim se ligar com FVIIIa. Este processo, além de pequenas quantidades de FIXa que é gerado pela divagem de FIX pelo complexo 25 TF/FVIIa sobre a célula que carrega TF, gera um grande número de complexos FXIa/FVIIIa que por sua vez pode ativar uma quantidade significativa de FX para FXa. As moléculas de FXa se ligam a FVa para gerar os protrombinase que ativam a protrombina a trombina. A trombina atua em um laço de retorno positivo para ativar ainda mais plaquetas e novamente iniciar os processos descritos para a fase de amplificação.

Muito resumido, existe um número suficiente de plaquetas ativadas com complexos adequados para gerar a explosão de trombina, que é grande o suficiente para gerar quantidades suficientes de fibrina do fibrinogênio para formar um coágulo de fibrina hemostática. 0 fibrinogênio é um dimero solúvel no plasma que, quando clivado pela trombina, libera fibrinopeptideo A e fibrimopeptideo B. O fibrinopeptideo B é então clivado pela trombina, e os monômeros de fibrina formados por esta segunda clivagem proteolítica espontaneamente formam um gel insolúvel. A fibrina polimerizada é presa em conjunto por forças eletrostáticas e não covalentes e é estabilizada pelo fator XHIa (FXIIIa) de enzima que transamida, produzida pela clivagem da FXIII pela trombina. A trombina também ativa TAFI, que inibe a fibrinólise pela redução da geração de plasmina na superfície do coágulo. Além disso, a trombina sozinha é incorporada à estrutura do coágulo para estabilização posterior. Estes agregados de fibrina insolúveis (coágulos), juntamente com plaquetas agregadas (trombos), bloqueiam os vasos sanguíneos danificados e previnem sangramento adicional.

3. Regulação da Coagulação

Durante a coagulação, a cascata é regulada por processos constitutivos e estimulados para inibir a formação adicional de coágulos. Há várias razões para tais mecanismos de regulação. Em primeiro lugar, a regulação é necessária para limitar a isquemia dos tecidos pela formação de coágulo de fibrina. Em segundo lugar, a regulação impede trombose generalizada pela localização da formação de coágulos apenas no local da lesão tecidual.

A regulação é obtida pelos cátions de várias moléculas inibidoras. Por exemplo, antitrombina III (AT-III) e inibidor de via de fator tecidual (TFPI) trabalham constitutivamente para inibir fatores na cascata de coagulação. AT-III inibe a trombina, FIXa e FXa, enquanto TFPI inibe FXa e o complexo FVIIa/TF. Um fator adicional, a proteina C, que é estimulada através da via de ativação plaquetária, regula a coagulação por clivagem proteolitica e inativação de FVa e FVTIIa. A proteina S aumenta a atividade da proteina C. Além disso, outro fator que contribui para a inibição da coagulação é a trombomodulina de proteina da membrana integral, que é produzida por células do endotélio vascular e serve como um receptor de trombina. A ligação da trombina com a trombomodulina inibe as atividades pró-coagulantes da trombina e também contribui para a ativação da proteina C.

Fibrinólise, a guebra do coágulo de fibrina, também fornece um mecanismo para regular a coagulação. Os multimeros de fibrina reticulada em um coágulo são quebrados em polipeptídeos solúveis pela plasmina, uma protease de serina. A plasmina pode ser gerada a partir do seu plasminogênio precursor inativo e recrutada para o local de um coágulo de fibrina de duas maneiras: através da interação com ativador do plasminogênio tecidual (tPA) na superfície de um coágulo de fibrina, e pela interação com ativador de plasminogênio uroquinase (uPA) em uma superfície da célula. O primeiro mecanismo parece ser o principal responsável pela dissolução de coágulos dentro dos vasos sanguíneos. O segundo, embora capaz de mediar a dissolução do coágulo, pode desempenhar um papel importante na remodelação do tecido, migração celular e inflamação.

A dissolução do coágulo também é regulada de duas maneiras. Primeiro, a ativação da plasmina eficiente e fibrinólise ocorrem somente em complexos formados na superfície do coágulo ou em uma membrana celular, enquanto que as proteínas livres no sangue são catalisadores ineficientes e são rapidamente inativadas. Segundo, ativadores de plasminogênio e da plasmina são inativados por moléculas como inibidor do ativador do plasminogênio tipo 1 (PAI-I) e PAI-2, que atuam sobre os ativadores de plasminogênio, e antiplasmina «2 e macroglobulina «2 que inativam a plasmina. Sob circunstâncias normais, o equilíbrio oportuno entre os resultados de coagulação e fibrinólise resulta na formação eficiente e limpeza de coágulos após lesão vascular e, simultaneamente previnem episódios trombóticos ou de sangramento indesejáveis.

Um resumo dos fatores de coagulação, cofatores e proteínas reguladoras exemplares, e suas atividades, são demonstrados na Tabela 4 abaixo.Tabela 4 - Zimogênios de Fator de Coagulação e Cofactores

*Tabela adaptada de M.W.King (2006) med.unibs. it/~marchesi/blood.html

C. Fator VII (FVII)

O fator VII é uma glicoproteína de protease de serina dependente de vitamina K que é sintetizada em animais, incluindo mamiferos, como um zimogênio de cadeia simples no fígado e secretada na corrente sanguínea. Como descrito acima, FVII é a protease de coagulação responsável por iniciar a cascata de eventos proteolíticos que levam à geração de trombina e deposição de fibrina. E parte da via extrínseca, embora os efeitos a jusante da sua atividade também impactam bastante a via intrínseca. Este papel essencial na formação do coágulo tem atraido grande interesse em FVII como um alvo para terapias clinicas anti- coagulante e hemostáticas. Por exemplo, FVII ativado recombinante (rFVIIa) foi desenvolvido como um agente hemostático para uso em indivíduos hemofílicos e indivíduos com outras condições de sangramento. Providos aqui estão polipeptídeos de FVII modificados que são projetados para ter atividade de coagulação aumentada após ativação, e que podem servir como produtos terapêuticos melhorados para tratar doenças e condições sensíveis à terapia com fator VII.

1. FVII estrutura e organização

O gene de FVII humano (F7) está localizado no cromossomo 13, em 13q34 e tem 12,8 kb de comprimento com 9 exons. 0 gene de FVII compartilha similaridade organizacional significativa com genes que codificam as outras proteinas dependentes vitamina K, como protrombina, fator IX, fator X e proteina C. O mRNA para o FVII sofre união alternativa para produzir duas transcrições: variante 1 (n° de acesso Genbank NM_000131, descrito em SEQ ID NO:81) e variante 2 (n° de acesso Genbank NM_019616, descrito em SEQ ID NO:82). A transcrição da variante 2, que é a forma mais abundante no fígado, não inclui exon 1b e, portanto, codifica um polipeptideo precursor menor de 444 aminoácidos (precursor de FVII de isoforma b; SEQ ID N0:2), em comparação com o polipeptideo precursor de 466 aminoácidos codificado por uma variante de transcrição 1 (um precursor de FVII de isoforma a; SEQ ID NO:1) . Os aminoácidos que não estão presentes no polipeptideo precursor de FVII de isoforma b correspondem às posições de aminoácidos 22 a 43 do precursor de FVII de isoforma a. Estes aminoácidos são parte da sequência de propeptideo, resultando em propeptideo de FVII de isoforma b truncado. Os polipeptideos precursores são compostos dos seguintes segmentos e dominios: um peptideo de sinal hidrofóbico (aa 1-20 de SEQ ID NO: 1 e 2), um propeptideo (aa 21-60 de SEQ ID NO:1, e aa 21-38 de SEQ ID NO:2), um dominio de Gla (aa 39-83 de SEQ ID NO:2, e aa 61-105 de SEQ ID N0:l), um tipo de dominio fator de crescimento epidérmico B (semelhante a EGF 1, aa 84-120 de SEQ ID NO:2, e aa 106-142 da SEQ ID NO:1), um tipo de dominio de fator de crescimento epidérmico A (semelhante a EGF 2, aa 125-166 da SEQ ID NO:2, e aa 147-188 de SEQ ID NO:1), e um dominio de protease de serina (aa 191-430 de SEQ ID N0:2, e aa 213-452 da SEQ ID NO:1).

A forma madura do aminoácido 406 do polipeptideo de FVII (SEQ ID NO:3) não tem as sequências do peptideo de sinal e propeptideo, e é idêntica em comprimento e sequência independentemente do precursor de isoforma a partir do qual se originou. Na forma madura do polipeptideo de FVII as posições correspondentes de aminoácidos para os dominios acima mencionados são as seguintes: dominio de Gla (aa 1-45 de SEQ ID N0:3), semelhante a EGF 1 (aa 46-82 de SEQ ID NO:3), semelhante a EGF 2 (aa 87-128 da SEQ ID NO:3), e o dominio protease de serina (aa 153-392 da SEQ ID NO:3).

O dominio de Gla de FVII é um motivo de ligação de membrana que, na presença de ions cálcio, interage com as membranas de fosfolipidios, que incluem fosfatidilserina. 0 dominio de Gla também desempenha um papel na ligação ao cofator de FVIIa, o fator tecidual (TF) . Complexado com TF, o dominio de Gla do FVIIa é carregado com sete ions Ca2+, projeta três cadeias laterais hidrofóbicas na direção da membrana celular para a interação com os fosfolipidios na superficie da célula, e tem contato significativo com o dominio C-terminal do TF. O dominio de Gla é conservado entre as proteinas dependentes de vitamina K, como protrombina, fatores de coagulação VII, IX e X, proteinas C, S e Z. Estas proteinas requerem vitamina K para a sintese pós-translacional de ácido y- carboxiglutámico, um aminoácido agrupado no dominio N- terminal de Gla destas proteinas. Todos os residuos glutâmicos presentes no dominio são sitios de carboxilação potenciais e muitos deles são, portanto, modificados por carboxilação.

Além do dominio de Gla, a proteina de FVII madura também contém dois dominios semelhantes a EGF. O primeiro dominio semelhante a EGF (semelhante a EGF 1 ou EGF1) é um dominio de EGF de ligação de cálcio, no qual seis cisteinas de núcleo conservado formam três pontes de dissulfeto. O dominio de EGF1 de FVII liga apenas um ion Ca2+, mas com afinidade significativamente superior à observada com o dominio de Gla (Banner et al. (1996) Nature 380:41-46). Este ion Ca2+ ligado promove a interação forte entre o dominio de EGF1 de FVII e TF (Osterlund et al. (2000) Eur J 5 Biochem 267:6204-6211). O segundo dominio semelhante a EGF (semelhante a EGF 2 ou EGF2) não é urn dominio de ligação de cálcio, mas também forma 3 pontes de dissulfeto. Como os outros dominios em FVII, o dominio de EGF2 interage com TF. Também é ligado por dissulfeto junto com o dominio de 10 protease, com o qual ele compartilha uma interface de contato grande.

Finalmente, o dominio de protease de serina de FVII é o dominio responsável pela atividade proteolitica do FVIIa. A sequência de aminoácidos de FVII em seu dominio 15 catalítico apresenta alta identidade de sequência e similaridade de estrutura terciária com outras proteases de serina, tais como tripsina e quimotripsina (Jin et al (2001) J Mol Biol, 307: 1503-1517). Por exemplo, essas proteases de serina partilham uma triade catalitica comum 20 H57, D102, S195, com base em numeração de quimotripsina. Ao contrário de outras proteases de serina, no entanto, a clivagem de FVIIa não é suficiente para concluir a conversão do zimogênio a uma enzima totalmente ativa. Em vez disso, como discutido abaixo, FVIIa é alostericamente 25 ativado em sua função catalitica através da ligação ao TF receptor da superficie celular, que induz uma mudança conformacional no dominio de protease de FVIIa trocando ele de um estado inativo como zimogênio para cataliticamente ativa. A região de laço em hélice entre o local de ligação de cofator e do sítio ativo (ou seja, as posições de resíduos de aminoácidos 305-321, correspondentes aos resíduos 163-1701 com base na numeração de quimotripsina) do FVIIa é importante para o alosterismo e zimogenicidade de FVIIa (Persson et al. (2004) Biochem J., 379: 497-503) . Esta região é composta de uma hélice Cf curta (posições de resíduos de aminoácidos 307 a 312), seguido por um laço. A porção N-terminal da hélice forma parte da interface entre o domínio de protease e TF, e contém uma série de resíduos que são importantes para a função proteolítica e ligação ideal para TF. Uma comparação da estrutura cristalina do FVIIa sozinho e FVIIa complexado com TF indica que a hélice α sofre mudança conformacional significativa quando FVIIa se liga ao TF. A hélice ot de FVIIa sozinho aparece distorcida, encurtada e orientada de forma diferente. Isso afeta as estruturas de laço adjacentes, movendo-os para longe do sítio ativo. Em contraste, a hélice ot de FVIIa quando complexada com TF é estabilizada, e os laços vizinhos estão posicionados mais próximos ao sítio ativo. Essa estabilização é realizada através de mecanismos que envolvem, pelo menos, a metionina na posição de aminoácido 306 (resíduo de aminoácido Met164 por numeração de quimotripsina) de FVII (Pike et al (1999) PNAS 8925-8930).

2 . Modificações pós-translacionais

O polipeptideo precursor de FVII (ou isoforma do gene do Fator VII) é direcionado para via secretora celular do peptideo de sinal hidrofóbico, que se insere no reticulo endoplasmático (RE) para iniciar a translocação através da membrana. Enquanto a proteina é translocada através da membrana do RE, o peptidio de sinal de 20 aminoácidos é clivado fora por uma peptidase de sinal dentro do lúmen do RE, após o qual o polipeptideo ainda sofre modificações pós-translacionais, incluindo N- e O-glicosilação, carboxilação dependente de vitamina K dos ácidos glutâmicos N-terminal aos ácidos y-carboxiglutâmicos, e hidroxilação do ácido aspártico a ácido p-hidroxiaspártico.

O propeptídeo fornece um local de ligação para uma carboxilase dependente de vitamina K que reconhece uma a-hélice anfifática de 10 residues no propeptídeo de FVII. Após a ligação, os 10 residues de ácido glutâmico de carboxilase y-carboxilatos dentro dominio de Gla do polipeptideo de FVII, produzindo resíduos y-carboxiglutamil em posições E66, E67, E74, E76, E79, E80, E85, E86, E89 e E95 em relação a sequência de aminoácidos de precursor de FVII definida em SEQ ID NO:2. Estas posições correspondem às posições E6, E7, E14, E19, E20, E25, E26, E29 e E35 do polipeptideo de FVII maduro definido em SEQ ID NO:3. Para a atividade ideal, a molécula de FVII requer cálcio, que liga o polipeptideo e facilita as mudanças conformacionais necessárias para a ligação do FVIIa com TF e lipídios. 0 dominio de Gla y-carboxilado liga sete ions Ca2+ com afinidade variável, que induz a mudança conformacional que permite o dominio de Gla interagir com o dominio C-terminal do TF, e também fosfatidilserinas ou outros fosfolipidios negativamente carregados sobre a membrana plaquetária.

A glicosilação N-ligada é realizada por transferência de Glc3Man9 (GlcNAc) para dois residuos de 5 asparagina no polipeptideo de FVII, em posições que correspondem aos residuos de aminoácido 145 e 322 da proteina madura (SEQ ID NO:3). A glicosilação O-ligada ocorre em residuos de aminoácidos 52 e 60 do polipeptideo maduro, e hidroxilação a um ácido p-hidroxiaspártico ocorre 10 no residue de ácido aspártico na posição 63. Estes residuos de serina O-glicosilados e residuo de ácido aspártico β- hidroxilado estão no dominio de EGF-1 do FVII. Essas modificações são realizadas no RE e no complexo de Golgi antes do processamento final do polipeptideo à sua forma 15 madura.

3. Processamento de FVII

O polipeptideo pró-FVII modificado é transportado através do lúmen de Golgi para o compartimento trans-Golgi onde o propeptideo é clivado por uma propeptidase pouco 20 antes da secreção da proteina da célula. PACE/furina (em que PACE é um acrônimo para enzima de divagem de aminoácidos básicos emparelhados) é uma endopeptidase localizada na membrana de Golgi que cliva muitas proteinas do lado carboxiterminal do motivo de sequência Arg- 25 [qualquer residuo]-(Lys ou Arg)-Arg. Esta propeptidase cliva glicoproteinas dependentes de vitamina K, como os polipeptídeos de pró-fator IX e pró-vWF (Himmelspach et al (2000) Thromb Investigação 97; 51-67), liberando propeptideo da proteina madura. A inclusão de um sitio de reconhecimento PACE/furina adequado em precursores de Fator VII recombinantes facilita o processamento correto e a secreção do polipeptideo recombinante (Margaritas et al (2004) Clin Invest 113 (7): 1025-1031). PACE/furina ou outra enzima de propeptidase semelhante a subtilisina, é provavelmente responsável pelo processamento proteolitico de pró-FVII a FVII. Ele pode reconhecer e se ligar ao motivo de consenso Arg-Arg-Arg-Arg nas posições de aminoácidos 35-38 da sequência definida na SEQ ID NO:1, e posições 57-60 da sequência definida na SEQ ID NO:2, clivando o propeptideo e liberando a proteina madura para a secreção.

4 . Ativação de FVII

A grande maioria de FVII no sangue está na forma de um zimogênio de cadeia simples desativado, embora uma pequena quantidade esteja presente em uma forma de duas cadeias ativado. A ativação de FVII ocorre após a clivagem proteolítica da ligação Arg152-Ile153 (posições em relação ao polipeptideo de FVII maduro, definidas na SEQ ID NO:3), dando origem a um polipeptideo de duas cadeia contendo uma cadeia leve de 152 aminoácidos (cerca de 20 kDa) ligadas por uma ponte de dissulfeto a uma cadeia pesada de 254 aminoácidos (cerca de 30 kDa). A cadeia leve de FVIIa contém o dominio de Gla e dominios semelhantes a EGF, enquanto a cadeia pesada contém a porção catalítica ou serina-protease da molécula. A conversão de FVII de cadeia simples em FVIIa de duas cadeias é mediada por clivagem por

FIXa, FXa, FXIIa, trombina, ou de uma forma autocatalitica por FVIIa endógeno (Butenas et al (1996) Biochem 35:1904- 1910; Nakagaki et al. (1991) Biochem 30:10819-10824). A quantidade de traços de FVIIa que ocorre na circulação provavelmente decorre da ação de FXa e FIXa.

Como discutido acima, a clivagem de FVII de sua forma de zimogênio para FVIIa não é suficiente para exercer atividade completa. FVIIa requer associação com TF para atividade completa (Higashi et al. (1996) J Biol Chem 271:26569-26574). Devido a esse requisito, FVIIa sozinho tem atribuído características semelhantes a zimogênio, exibindo dobramento e forma de zimogênio, e exibem atividade relativamente baixa. Esta característica semelhante a zimogênio do FVIIa na ausência de sua associação com TF torna ele relativamente resistente à antitrombina III (AT-III) e outras serpinas, que atuam de forma geral principalmente em formas ativas de proteases de serina em vez da forma de zimogênio. Além disso, o TFPI, o principal inibidor da atividade de TF/FVIIa, também não se liga eficientemente à forma "inativa" não complexada de FVIIa.

Após complexação com TF, FVIIa sofre uma mudança conformacional que permite a atividade completa da molécula. Todos os domínios de FVII estão envolvidos na interação com o TF, mas as mudanças conformacionais que ocorrem estão localizadas no domínio de protease do FVIIa. Por exemplo, as mudanças conformacionais que ocorrem na interação alostérica de FVIIa e TF incluem a criação de um exositio de ligação de substrato macromolecular estendido vinculativo. Este sitio de ligação estendido aumenta significativamente a ativação proteolitica mediada por FVII do fator X.

A atividade de FVIIa é adicionalmente aumentada (ou seja, mil vezes), quando a interação de FVIIa é com TF expresso na superficie celular. Isso ocorre porque as membranas fosfolipidicas contendo fosfolipídios negativamente carregados, como a fosfatidilserina, estão em 10 um sitio de interação de outros fatores de coagulação dependentes de vitamina K, como FIX e FX, que se ligam através de seus dominios de Gla. Assim, a concentração local destas proteinas dependentes de vitamina K é elevada na superficie da célula, promovendo a sua interação com o 15 complexo de TF/ FVIIa.

5. Função de FVII

Embora FVIIa exiba aumento da atividade após a ativação alostérica pelo TF, há evidências de que existem mecanismos em que FVIIa sozinho pode iniciar a coagulação. 20 Assim, FVII pode funcionar de uma forma dependente de TF e independente de TF. Esta última via pode desempenhar um papel muito menor na hemostasia normal, embora sua significância pudesse aumentar quando ela é considerada no contexto dos distúrbios de coagulação, e seu tratamento.

a. Atividade de FVIIa dependente de fator tecidual

FVII de circulação liga TF da superficie celular e é ativado por FIXa, FXa, trombina, ou de forma autocatalitica por FVIIa endógeno, como descrito acima. Alternativamente, a quantidade muito pequena de FVIIa de circulação diretamente pode ligar TF. O complexo TF/FVIIa liga então uma pequena fração de FX do plasma e o dominio catalitico de FVIIa cliva FX para produzir FXa. A trombina é assim formada através da via extrinseca na superficie da célula de marcação de TF, quando FXa complexa com FVa e ativa a protrombina em trombina (Figura 3). FIX também é ativado pelo complexo TF/FVIIa, fornecendo uma ligação para a via intrínseca, que opera na superficie da plaqueta ativada. Os sistemas de retorno positivo na cascata de coagulação acima descritos fornecem os meios pelos quais grandes quantidades de trombina são produzidas, que cliva o fibrinogênio em fibrina para formar um coágulo.

b. Atividade de FVIIa independente de fator tecidual

Além do mecanismo dependente de TF para a ativação de FX para FXa, há evidências de que FVIIa também pode ativar o FX na ausência de TF. Plaquetas ativadas translocam fosfatidilserinas e outros fosfolipidios negativamente carregados para a superficie exterior, orientada do plasma. (Hemker et al. (1983) Blood cells 9:303-317). Estes fornecem "receptores" alternativos através dos quais FVIIa pode ligar, mas com uma afinidade relativamente baixa, que é 1000 vezes menos do que a afinidade de ligação do FVIIa a TF (Monroe et al (1997) Br J Haematol 99:542-7). Essa interação é mediada pelos residues no dominio de Gla (Harvey et al. (2003) 278:8363- 8369) . FVIIa pode então converter FX a FXa e FIX a FIXa na superfície da plaqueta ativada (Hoffman et al (1998) Blood Coagul fibrinolysis 9:S61-S65). O FXa permanece associado com a superfície plaquetária, onde ele pode se ligar a FVa e gerar trombina suficiente de protrombina, enquanto o recém-formado FIXa se reúne com FVIIIa para catalisar a ativação de mais de FX a FXa (Figura 3) . Hemostasia na ausência de TF pode então ser alcançada pelo retorno positivo e mecanismos de propagação descrito acima. É notável, porém, que enquanto FVIIIa pode contribuir para o processo de coagulação nas plaquetas ativadas, a sua presença não é necessária para a geração de trombina no mecanismo de independente de TF (Figura 3). Assim, na ausência de FVIII, como em pacientes hemofílicos, há evidências de que FVIIa pode iniciar e/ou ampliar a geração de trombina através deste mecanismo secundário, e a efetuar a formação de coágulo.

6. FVII como um produto biofarmacêutico

FVII funciona para iniciar a coagulação do sangue. FVIIa recombinante (NovoSeven®; rFVIIa) é aprovado para o tratamento de episódios de sangramento ou prevenção de sangramento em procedimentos cirúrgicos ou invasivos em pacientes com hemofilia A ou B com inibidores de fator VIII ou IX Factor, e em doentes com deficiência congênita de factor VII. NovoSeven® é uma preparação geneticamente modificadas do fator Vila que é produzido em um sistema de expressão de mamífero usando células de rim de filhote de hamster (BHK). O agente é quase idêntico ao fator Vila derivado do plasma na sua estrutura e função (Ratko et al (2004), a P & T, 29: 712-720).

A administração de FVIIa recombinante (rFVIIa) mostrou promover a coagulação do sangue em pacientes que sofrem de hemofilia, e tratamento com doses de FVIIa foi revelado como sendo seguro e bem tolerado em indivíduos humanos. Normalmente, o uso do rFVIIa foi em pacientes que desenvolveram inibidores (ou seja, aloanticorpos) para fator VIII ou fator IX. O uso de rFVIIa como coagulante foi estendido para o tratamento de outros distúrbios de sangramento, por exemplo trombastenia de Glanzmann; outros eventos associados a sangramento extenso, como resultado de um trauma ou cirurgia, incluindo mas não limitado a, transplantes de fígado, cirurgia de próstata e trauma hemorrágico; coagulopatias neonatal, doença hepática grave; transplante de medula óssea, trombocitopenias e distúrbios da função plaquetária; reversão urgente da anticoagulação oral; deficiências congênitas dos fatores V, VII, X e XI; e doença de von Willebrand com inibidores de fator de von Willebrand.

Uma dose elevada de rFVII é necessária para alcançar um efeito terapêutico. A dose e o regime de dosagem necessários para a administração rFVII varia dependendo da indicação clínica. Por exemplo, a dose típica de rFVII para episódios hemorrágicos em pacientes com hemofilia A ou hemofilia B tendo aloanticorpos é de 90 μg/kg administrado por injecção intravenosa (IV). Uma vez que rFVII tem uma meia-vida de duas horas, a repetição da dose é necessária. Dose adicional pode ser administrada a cada duas horas até que a hemostasia é alcançada. A faixa de dosagem pode ser alterada dependendo da gravidade da doença. Por exemplo, doses variando de 35-120 μg/kg foram eficazes. Além disso, a dose e o regime de dosagem podem variar com outras indicações. Por exemplo, pacientes com hemofilia A ou hemofilia B submetidos à cirurgia podem ser administrado com uma dose inicial de 90 μg/kg imediatamente antes da cirurgia, com doses repetidas a cada duas horas durante e após a cirurgia. Dependendo da gravidade da cirurgia e do episódio de sangramento, a infusão IV em bolsa pode continuar a cada 2 a 6 horas até a cura ser alcançada. Em pacientes com deficiência congênita de FVII, rFVII é normalmente administrado para prevenir sangramento em cirurgias ou outros procedimentos invasivos em 15-30 μg/kg a cada 4-6 horas até que a hemostasia seja alcançada.

O mecanismo de ação da rFVIIa para iniciar hemostasia explica a exigência de alta dose. Pacientes com hemofilia têm uma fase de iniciação normal da coagulação, onde o complexo TF/FVIIa ativa FX a FXa e leva à produção de trombina no local da célula de marcação de TF. Posteriormente, no entanto, o processo de coagulação pára, pois aos pacientes de hemofilia falta FVIII (hemofilia A) ou FIX (hemofilia B) , e são, portanto, incapazes de formar complexos FVIIIa/FIXa na superficie da plaqueta ativada, que normalmente servem para ativar grandes quantidades de FX a FXa nas fases de amplificação e propagação descritos anteriormente. Devido à presença de inibidores, como TFPI e AT-III, o FXa que é produzido na célula de marcação de TF seguido por clivagem por TF/FVIIa é incapaz de ser facilmente difundida entre as superficies celulares. Como resultado, a geração de trombina em larga escala na superfície da plaqueta ativada não ocorre, e um coágulo não se forma.

Há evidências de que o efeito hemostático de altas doses de rFVIIa pode ser conseguido usando geração dependente de TF e/ou independente de TF de FXa por rFVIIa sobre as plaquetas ativadas (Figura 3). A geração de trombina dependente de TF pode ser maximizada muito rapidamente com a saturação das moléculas de TF com FVIIa e rFVIIa endógenos. Em alguns casos, o rFVIIa de dose elevada pode ligar plaquetas ativadas e converter FX a FXa. O FXa associado à superfície ativa FVa para gerar trombina suficiente para hemostasia. Uma vez que rFVII se liga à superfície da plaqueta com baixa afinidade, uma dose maior de rFVII pode ser necessária para a geração de trombina. A ativação FXa nas plaquetas ativadas garante que a hemostasia mediada por rFVIIa esteja localizada no local da lesão.

Um meio para atingir a dosagem reduzida de rFVII pode melhorar a sua utilidade e eficiência como uma droga. Providos aqui estão polipeptídeos de FVII modificados. Entre estes estão polipeptídeos de FVII modificados que apresentam maior resistência à AT-III e aumento da atividade catalítica na presença e/ou ausência de TF. Os polipeptídeos de FVII modificados providos aqui também podem apresentar maior resistência à TFPI, aumento da resistência aos efeitos inibidores de Zn2+, propriedades farmacocinéticas melhoradas, como aumento da meia vida sérica, aumento da ligação e/ou afinidade por plaquetas ativadas, ligação e/ou afinidade por albumina sérica aumentada, e/ou aumento da ligação e/ou afinidade por integrina plaquetária otubβs- Estes polipeptídeos de FVII modificados podem apresentar aumento da atividade coagulante. Os polipeptídeos de FVII providos aqui podem ser usados em tratamentos para iniciar hemostasia em um mecanismo dependente de TF e/ou independente de TF, de forma que FXa é produzido e trombina gerada.

D. Polipeptídeos de FVII modificados

Providos aqui estão polipeptídeos de FVII modificados. Os polipeptídeos de FVII exibem alterações em uma ou mais atividades ou propriedades em comparação com polipeptideo de FVII que não é assim modificado. As atividades ou propriedades que podem ser alteradas como resultado da modificação incluem, mas não estão limitadas a, atividade de coagulação ou coagulante; atividade pró- coagulante; atividade proteolitica ou catalítica, tais como para efetuar a ativação do fator X (FX) ou ativação do fator IX (FIX); antigenicidade (capacidade de se ligar ou competir com um polipeptideo para a ligação com um anticorpo anti-FVII); capacidade de ligar fator tecidual, fator X ou fator IX; capacidade de se ligar a fosfolipídeos; meia-vida; estrutura tridimensional; PI; e/ou conformação. Normalmente, os polipeptideos de FVII modificados apresentam atividade pró-coagulante. Providos aqui estão polipeptideos de FVII modificados que apresentam aumento da atividade coagulante após a ativação de sua forma de zimogênio de cadeia simples. Tais polipeptideos de FVII modificados podem ser usados no tratamento de distúrbios ou eventos de sangramento, tais como hemofilias ou lesão, onde os polipeptideos de FVII podem funcionar para promover a coagulação do sangue. Incluidos entre tais polipeptideos de FVII modificados estão aqueles que têm resistência aumentada aos inibidores, tais como antitrombina III (AT-III) e inibidores da via do fator tecidual (TFPI), aqueles que têm resistência aumentada aos efeitos inibidores de Zn2+, aqueles que têm atividade catalítica aumentada na presença e/ou ausência de TF, aqueles que têm propriedades farmacocinéticas melhoradas, como meia-vida aumentada, aqueles que têm ligação e/ou afinidade aumentada com a superficie de plaquetas, aqueles que têm ligação e/ou afinidade aumentada com a albumina sérica, e aqueles que têm ligação e/ou afinidade aumentada por integrina plaquetária oiubβa- Em particular, tais polipeptideos de FVII modificados podem ser utilizados em doenças ou condições para proporcionar uma atividade coagulante e, ao mesmo tempo, variar as exigências para FVIIIa e FIXa. Em um exemplo, polipeptideos de FVII modificados providos aqui podem ser utilizados em pacientes hemofílicos tendo autoanticorpos para FVIIIa e FIXa. Assim, os polipeptideos de FVII modificados providos aqui oferecem vantagens, incluindo uma diminuição na quantidade de FVII administrado que é necessária para manter uma concentração suficiente de FVII ativo no soro para a hemostasia. Isso pode levar, por exemplo, a doses e/ou frequência de dosagem menores necessárias para atingir efeitos biológicos comparáveis, maior conforto e aceitação pelos indivíduos, e atenuação de efeitos secundários.

As modificações em um polipeptideo de FVII podem ser feitas a qualquer forma de um polipeptideo de FVII, incluindo variantes alélicas ou de espécies, as variantes de união, as variantes conhecidas na técnica, ou moléculas de FVII hibridas ou quiméricas. Por exemplo, as modificações providas aqui podem ser feitas em um polipeptideo de FVII precursor definido em SEQ ID NOS: 1 ou 2, um polipeptideo de FVII maduro definido em SEQ ID NO:3, ou qualquer espécie, variantes alélicas ou modificadas e fragmentos ativos do mesmo, que tem 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequênica para qualquer um dos polipeptídeos de FVII definidos em SEQ ID NOS: 1-3. Variantes alélicas de FVII incluem, mas não se limitando a, qualquer um desses polipeptídeos precursores tendo uma sequência de aminoácidos definida em qualquer uma das SEQ ID NOS: 18-74. Variantes de espécies exemplares para modificação aqui, incluem, mas não estão limitados a, polipeptídeos humanos e não humanos, incluindo polipeptídeos FVII de vaca, camundongo, chimpanzé pigmeu, chimpanzé, coelho,camundongo, macaco rhesus, porco, cachorro, peixe-zebra, baiacu, frango, orangotango e gorila, cujas sequências estão definidas na SEQ ID NOS: 4-17, respectivamente. As modificações em um polipeptideo de FVII podem ser feitas para um polipeptideo de FVII que também contém outras modificações, como as descritas na técnica, incluindo modificações da sequência primária e modificações que não na sequência primária do polipeptideo.

A modificação dos polipeptídeos de FVII também incluem a modificação de polipeptídeos que são hibridos de polipeptídeos de FVII diferentes e também polipeptídeos de FVII sintéticos preparados recombinantemente ou sintetizados ou construídos por outros métodos conhecidos na técnica baseada na sequência de polipeptídeos conhecidos. Por exemplo, com base no alinhamento do FVII com outros membros da familia do fator de coagulação, como o fator IX (FIX) ou o fator X (FX), domínios homólogos entre os membros da familia são facilmente identificados. As variantes quiméricas de polipeptídeos de FVII podem ser construídas onde um ou mais aminoácidos ou domínios inteiros são substituídos na sequência de aminoácidos de FVII usando a sequência de aminoácidos do membro da familia correspondente. Além disso, polipeptídeos de FVII quiméricos incluem aqueles em que um ou mais aminoácidos ou domínios inteiros são substituídos na sequência de aminoácidos de FVII humano usando a sequência de aminoácidos de uma espécie diferente (ver, por exemplo, Williamson et al. (2005) J Thromb Haemost 3: 1250-6). Essas proteínas quiméricas podem ser usadas como polipeptideo de FVII não modificado de partida aqui.

As modificações providas aqui de um polipeptideo de referência não modificado de partida incluem substituição ou reposição de aminoácidos, adições ou supressões de aminoácidos, ou qualquer combinação das mesmas. Por exemplo, os polipeptideos de FVII modificados incluem aqueles com 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 30, 40, 50 ou mais posições modificadas. Também são providos aqui polipeptideos de FVII modificados com duas ou mais modificações em comparação com um polipeptideos de FVII de referência de partida. Os polipeptideos de FVII modificados incluem aqueles com 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 30, 40, 50 ou mais posições modificadas. Qualquer modificação provida aqui pode ser combinada com qualquer outra modificação conhecida por aqueles versados na técnica, desde que os polipeptideos de FVII modificados resultantes apresentem aumento da atividade de coagulação quando ele estiver em sua forma de cadeia dupla. Normalmente, os polipeptideos de FVII modificados exibem atividade coagulante aumentada. As atividades ou propriedades que podem ser alterados como resultado da modificação incluem, mas não estão limitadas a, atividade de coagulação ou coagulante; atividade pró-coagulante, atividade proteolítica ou catalítica, tais como para efetuar a ativação do fator X (FX) ou ativação do fator IX (FIX); antigenicidade (capacidade de se ligar ou competir com urn polipeptideo para a ligação com um anticorpo anti- FVII), capacidade de ligar o fator tecidual, fator inibidor de fator tecidual (TFPI), antitrombina III, fator X ou fator IX; capacidade de se ligar a fosfolipídios, albumina 5 sérica ou integrina plaquetária ciiibβa; meia-vida sérica;estrutura tridimensional; PI; e/ou conformação. Entre os polipeptídeos de FVII modificados providos aqui estão aqueles que têm resistência aumentada à antitrombina III (AT-III), atividade catalítica aumentada na presença e/ou 10 ausência de TF, resistência aumentada ao inibidor de via de fator tecidual (TFPI) , resistência aumentada aos efeitos inibidores de Zn2+, propriedades farmacocinéticas melhoradas, como aumento da meia vida sérica, aumento da atividade intrínseca, glicosilação alterada, aumento da 15 afinidade e/ou ligação para albumina sérica, aumento da afinidade e/ou ligação para integrina plaquetária o.nbp3 e/ou aumento de afinidade e/ou ligação para plaquetas ativadas.

Em alguns exemplos, uma modificação pode afetar 20 dois ou mais propriedades ou atividades de um polipeptídeo de FVII. Por exemplo, uma modificação pode resultar em aumento da resistência à AT-III e aumento da atividade catalítica do polipeptídeo de FVII modificado em comparação com um polipeptídeo de FVII não modificado. Os polipeptídeos de FVII modificados providos aqui podem ser avaliados para cada propriedade e atividade para identificar a faixa dos efeitos de uma modificação. Tais ensaios são conhecidos na técnica e descritos abaixo. Os polipeptídeos de FVII modificados providos aqui também incluem polipeptídeos de FVII que são adicionalmente modificados pela máquina celular e incluem, por exemplo, polipeptídeos glicosilados, y-carboxilados e β- hidroxilados.

As modificações providas aqui para um polipeptideo de FVII são feitas para aumentar a resistência à AT-III, aumentar a resistência a TFPI, aumentar a resistência aos efeitos inibidores de Zn2+, melhorar as propriedades farmacocinéticas, como aumentar a meia vida sérica, aumentar a atividade catalítica na presença e/ou ausência de TF, aumentar a ligação às plaquetas ativadas, alterar glicosilação, aumentar a afinidade e/ou ligação à integrina plaquetária αiibβs, aumentar a afinidade e/ou ligação à albumina sérica, e/ou aumentar a afinidade e/ou ligando para plaquetas ativadas. Por exemplo, um polipeptideo de FVII pode incluir modificações(s) que aumentam um ou ambos a atividade catalítica e ligação às plaquetas. Em outros exemplos, qualquer modificação provida aqui pode ser combinada Com qualquer outra modificação conhecida por aqueles versados na técnica, desde que o polipeptideo de FVII modificado resultante apresente atividade de coagulação aumentada quando ele estiver em sua forma de cadeia dupla. Normalmente, tal atividade de coagulação aumentada é devido ao aumento da resistência à AT-III, ao aumento da atividade catalítica, ao aumento da resistência ao efeito inibidor de Zn2+, as propriedades farmacocinéticas melhoradas, como aumento da meia vida sérica, aumento da resistência à TFPI, glicosilaçâo alterada, aumento de ligação e/ou afinidade por fosfolipidios, ligação e/ou afinidade aumentada para a albumina sérica, e/ou aumento da ligação e/ou afinidade com a integrina plaquetária αIIbβ3. Em alguns exemplos, as modificações que são introduzidas em um polipeptideo de FVII para alterar uma determinada atividade ou propriedade também, ou em vez disso, pode afetar uma outra atividade ou propriedade. Assim, as modificações providas aqui podem afetar a propriedade ou a atividade que eles foram projetados para afetar e uma ou mais outras propriedades ou atividades. Por exemplo, as modificações feitas em um polipeptideo de FVII para aumentar a atividade catalítica também pode aumentar a resistência à AT-III. Em alguns exemplos, a única modificação, tal como a substituição de um único aminoácido, altera 2, 3, 4 ou mais propriedades ou atividades de um polipeptideo de FVII. Os polipeptideos de FVII modificados providos aqui podem ser testadas para cada propriedade e atividade para identificar a extensão dos efeitos de uma modificação. Tais ensaios são conhecidos na técnica e descritos abaixo. Os polipeptideos de FVII modificados providos aqui também incluem polipeptideos de FVII que são adicionalmente modificados pela máquina celular e incluem, por exemplo, polipeptideos glicosilados, y-carboxilados e β-hidroxilados.

As modificações providas aqui podem ser feitas por técnicas de DNA recombinante padrão, como a rotina para uma pessoa versada na técnica. Qualquer método conhecido na técnica para efetuar mutação de um ou mais aminoácidos em uma proteina alvo pode ser empregado. Os métodos incluem a mutagênese sitio-dirigida padrão (usando, por exemplo, um kit, tal como o kit como QuikChange disponível em Stratagene) de moléculas de codificação de ácido nucléico, ou por métodos de sintese polipeptidica em fase sólida. Além disso, proteinas quiméricas modificadas providas aqui (ou seja, troca de dominio de Gla) podem ser geradam por técnicas de DNA recombinante de rotina. Por exemplo, os polipeptídeos quiméricos podem ser gerados usando enzimas de restrição e metodologias de clonagem para subclonagem de rotina dos componentes de polipeptideo quimérico desejados.

Outras modificações que estão ou não estão na sequência primária do polipeptideo também podem ser incluídas em um polipeptideo de FVII modificado, ou conjugado do mesmo incluindo, mas não limitado a, adição de uma molécula de carboidcamundongo, adição de uma molécula de polietileno glicol (PEG), adição de um dominio Fc, etc. Por exemplo, tais modificações adicionais podem ser feitas para aumentar a estabilidade ou a meia-vida da proteina.

Os polipeptídeos de FVII modificados resultantes incluem aqueles que são polipeptídeos de zimogênio de cadeia única ou aqueles que são polipeptídeos semelhantes a zimogênio de cadeia dupla. Por exemplo, qualquer polipeptideo modificado provido aqui que é um polipeptideo de cadeia única podem ser autoactivado ou ativado por outros fatores de coagulação para gerar um polipeptideo de FVII modificado que está na forma de cadeia dupla (ou seja, FVIIa). As atividades de urn polipeptideo de FVII modificado normalmente são exibidas em sua forma de cadeia dupla.

Os polipeptídeos de FVII modificados providos aqui podem apresentar maior resistência AT-III, atividade catalitica aumentada na presença e/ou ausência de TF, resistência aumentada ao efeito inibidor de Zn2+, resistência aumentada a TFPI, propriedades farmacocinéticas melhoradas, como meia-vida do soro aumentada, glicosilação alterada, maior ligação e/ou afinidade por fosfolipídios, maior ligação e/ou afinidade por albumina sérica, e/ou ligação e/ou afinidade aumentada por integrina plaquetária otiibβa. Geralmente, tais propriedades e/ou atividades dos polipeptídeos de FVII modificados providas aqui são feitas enquanto retém outras atividades ou propriedades, tais como, mas não limitado a, ligação a TF e/ou ligação e ativação de FX. Assim, os polipeptídeos de FVII modificados providos aqui retêm ligação de TF e/ou ligação e ativação de FX em comparação com um tipo selvagem ou uma forma de partida do polipeptideo de FVII. Normalmente, essa atividade é substancialmente inalterada (menos de 1%, 5% ou 10% mudaram) em comparação com um tipo selvagem ou proteína de partida. Em outros exemplos, a atividade de um polipeptideo de FVII modificado é aumentada ou é diminuída em comparação com um tipo selvagem ou polipeptideo de FVII de partida. A atividade pode ser avaliada in vitro ou in vivo e pode ser comparada ao polipeptideo de FVII não modificado, como por exemplo, o maduro, polipeptideo de FVII nativo de tipo selvagem (SEQ ID NO:3), polipeptideo de FVII precursor de tipo selvagem (SEQ ID NO: 1 ou 2) ou qualquer outro polipeptideo de FVII conhecido por uma pessoa versada na técnica que é utilizado como material de partida.

Assim, por força das modificações providas aqui, os polipeptídeos de FVII modificados podem apresentar aumento da atividade coagulante, aumento da duração da atividade coagulante e/ou um maior índice terapêutico. Isso pode ser observado em um modo dependente de TF e/ou independente de TF. Normalmente, a atividade coagulante aumentada, aumento da duração da atividade coagulante e/ou um maior índice terapêutico dos polipeptídeos de FVII modificados providos aqui podem ser observados in vitro ou ex vivo, em ensaios adequados, ou in vivo, tais como a administração a um indivíduo, como um indivíduo humano ou não humano. O aumento da atividade dos polipeptídeos de FVII modificados pode ser aumentada em pelo menos cerca de 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 110%, 120%, 130%, 140%, 150%, 160%, 170%, 180%, 190%, 200%, 300%, 400%, 500% ou mais em relação à atividade do polipeptídeo de FVIIa de partida ou não modificado.

1. Aumento da atividade catalitica

FVII contém um resíduo de serina (posição 195 em numeração de quimotripsina(ogênio) padrão) em seu centro ativo que age como um nucleófilo durante a reação de clivagem. A tríade catalítica de proteases de serina também inclui dois resíduos adicionais: H57 e D102 (numeração de quimotripsina). A triads catalítica do FVIIa humano corresponde a H193, D242 e S344 do polipeptideo de FVII maduro definido em SEQ ID NO:3. Estes três principais aminoácidos desempenham cada um, um papel essencial na atividade catalítica das proteases. Proteases de serina hidrolisam ligações peptídicas através da formação de estados de transição tetraédricos e intermediários acil- enzima. A via da reação começa com a ligação não-covalente do substrato em um sulco na superfície da protease (ou seja, a fenda de sítio ativo) que contém H57 e S195 para formar um "complexo de Michaelis-Menton". Progresso produtivo ao longo da via de reação requer ataque nucleofilico subsequente do resíduo de carbonila PI do substrato pelo O-gama da serina de sítio ativo (isto é, serina 195) da enzima para formar um estado de transição tetraédrico que rapidamente se converte em um intermediário acil-enzima. A estrutura dentro da fenda de sítio ativo, que inclui os resíduos de glicina 193 e serina 195 (correspondente a G342 e S344 do polipeptideo de FVII maduro definido em SEQ ID NO:3) e é conhecido como o buraco de oxiânion promove a catálise eficiente, estabilizando o estado de transição.

Especificamente, os hidrogénios de amido de cadeia principal desses dois resíduos formam ligações de hidrogênio de estabilização com o oxiânion (ou seja, o oxigênio da carbonila do resíduo Pl) que é criado no estado de transição tetraédrico. Além dessa estabilização, a ligação do substrato nos buracos de oxiânion posicionam as ligações cindiveis corretamente para as reações de acilaçâo e desacilação produtivas que resultam na clivagem de uma ligação. A importância do buraco de oxiânion na atividade de FVII é realçado pela constatação de que mutações na 5 posição de aminoácido 342 (correspondente a 193 por numeração de quimotripsina) pode resultar em deficiência de FVII (ver, por exemplo Bernardi et al. (1994) Br. J. Haematol. 86:610-618 e Bernardi et al. (1996) Humanos Mut. 8:108-115).

a. Modificações exemplares para aumentar a atividade catalitica

Providos aqui são polipeptídeos de FVII modificados que apresentam aumento da atividade coagulante. Tais polipeptídeos de FVII podem ser gerados pela 15 substituição de aminoácidos de um ou mais resíduos que podem afetar a conformação do buraco de oxiânion. A introdução de diferentes resíduos de aminoácidos em posições especificas (por exemplo, a posição 143 por numeração de quimotripsina, ou 28 6 por numeração de FVII 20 maduro) pode alterar a conformação do polipeptideo de FVII modificado de forma que o buraco de oxiânion é mais eficaz durante a catálise. Isso pode resultar em um polipeptideo de FVII modificado com atividade catalitica aumentada em comparação com um polipeptideo de FVII não modificado.

Modificações na atividade catalitica devido às mutações que afetam o buraco oxiânion podem se manifestar como o aumento da atividade coagulante. Aumentos na atividade catalitica e coagulante dos polipeptídeos de FVII modificados providos aqui podem ser observados na presença e/ou ausência de fator de tecido (ou seja, pode ser dependente de TF e/ou independentes de TF). Assim, quando avaliados em um adequado in vitro, in vivo ou ex vivo, como após a 5 administração a um individuo como uma terapia pró- coagulante, os polipeptídeos de FVII modificados podem mostrar aumento da atividade coagulante comparada com a dos polipeptídeos de FVII não modificados.

A conformação do buraco de oxiânion pode ser 10 alterada para induzir uma conformação mais eficaz através da modificação de um ou mais residuos de aminoácidos que estão envolvidos na formação, ou estão nas proximidades, do buraco oxiânion. Como provido aqui, exemplares de tais residuos de aminoácidos são Q286 (numeração correspondente 15 a um polipeptideo de FVII maduro definido em SEQ ID NO:3), o que corresponde a Q143 por numeração de quimotripsina. Q286 pode ser modificado por, por exemplo, substituição, eliminação ou inserção de aminoácidos. Quando a modificação é feita pela substituição de aminoácido, o residuo de 20 glutamina na posição 286 pode ser substituído por qualquer outro residuo de aminoácido.

Q286 está localizado adjacente a e em contato com os residuos que formam regiões de sitio ativo e fenda de sitio ativo do polipeptideo de FVII. Como tal, foi afirmado 25 que a modificação nessa posição deveria resultar em atividade catalitica reduzida (ver, por exemplo, Patente US n° 6806063) . Isto tem sido demonstrado em estudos anteriores (ver, por exemplo, a Pat. International Pub N WO2007031559) , onde o resíduo de glutamina foi substituído por uma alanina (Q286A). O polipeptideo de FVII modificado resultante exibe uma reduzida capacidade de ativar o fator X em relação ao polipeptideo de tipo selvagem. Em outros estudos, a mesma mutação não teve essencialmente nenhum efeito sobre a atividade catalítica do mutante de FVIIa para o Fator X (Dickinson et al. (1996) Proc. Nat. Acad. Sci. EUA. 93:14379-14384) ou um substrato sintético (Pat. International Pub. N° W02007031559).

Como demonstrado aqui (ver Exemplo 4 e abaixo) , porém, a modificação do polipeptideo de FVII na posição 286 (numeração correspondente a um polipeptideo de FVII maduro definido em SEQ ID NO:3, correspondente à posição 143 por numeração de quimotripsina), particularmente com um residuo básico, como arginina (Arg, R) , resulta em um polipeptideo de FVII modificado com atividade catalítica e coagulante aumentadas.

Assim, providos aqui são polipeptideos de FVII modificados que contêm uma modificação, como a substituição de aminoácido com um aminoácido básico, na posição do aminoácido correspondente à posição de aminoácido 286 de um polipeptideo de FVII maduro definido em SEQ ID NO:3 (posição de aminoácido 143 pela numeração de quimiotripsina). As modificações providas aqui na posição de aminoácido 286 podem ser feitas em qualquer polipeptideo de FVII, incluindo um polipeptideo de FVII precursor definido em SEQ ID NOS: 1 ou 2, um polipeptideo de FVII maduro definido em SEQ ID NO:3, ou qualquer espécie, variantes alélicas ou modificados e fragmentos ativos dos mesmos, que tem 4Q%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, ou 99% de identidade de sequência a qualquer um dos polipeptídeos de FVII definidos em SEQ ID NOS: 1-3.

A modificação de um. polipeptideo de FVII na posição de aminoácido 286 por numeração de FVII maduro (correspondendo aos aminoácidos 143 por numeração de quimotripsina) pode alterar a conformação do buraco de oxiânion para uma conformação que facilita a catálise mais eficaz de um substrato. 0 aumento da atividade catalítica de tais polipeptídeos de FVII modificados pode ser exibido na presença e/ou ausência de fator tecidual e pode ser avaliado através de ensaios in vitro, tais como aqueles descritos nos exemplos 4 e 7, abaixo. Além de exibir atividade catalítica aumentada, os polipeptídeos de FVII que foram modificados na posição de aminoácido 286 por numeração de FVII maduro também podem apresentar maior resistência a AT-III. Isto pode ser devido, por exemplo, ligação de polipeptideo de FVII modificado a AT-III reduzida sob condições específicas (por exemplo, após injeção em um paciente) ou uma taxa reduzida de inativação de ATUI (ou seja, uma constante de taxa de segunda ordem reduzida de inibição), que pode se manifestar como a atividade coagulante aumentada na presença de AT-III em comparação com um polipeptideo de FVII não modificado. Resistência a AT-III aumentada pode ser avaliada utilizando-se ensaios in vitro, como a descrita no Exemplo 5.

O residuo de aminoácido Q286 por numeração de FVII maduro (correspondente a Q143 por numeração de 5 quimotripsina) pode ser modificado pela exclusão, ou troca ou substituição de aminoácido por qualquer outro aminoácido. Alternativamente, um aminoácido pode ser inserido imediatamente antes ou depois de alterar a conformação nas proximidades do residuo de aminoácido Q286.

Além disso, um polipeptideo de FVII contendo uma modificação de Q286 também pode conter uma ou mais outras modificações, incluindo inserções supressões, substituições ou reposições, e modificações de aminoácidos, não na sequência primária do polipeptideo, como a adição de uma 15 molécula de carboidcamundongo, a adição de uma molécula de polietileno glicol (PEG), a adição de um dominio Fc, etc., ou qualquer combinação dos mesmos. Assim, um polipeptideo de FVII contendo uma modificação na posição de aminoácido 286 por numeração de FVII maduro pode conter 2, 3, 4, 5, 6, 20 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 30,40, 50 ou mais posições alteradas. Tais polipeptídeos retêm pelo menos uma atividade de um polipeptideo de FVII não modificado. Normalmente, os polipeptídeos de FVII modificados apresentam aumento da atividade coagulante.

Essas mudanças nas atividades podem se manifestar como o aumento da atividade coagulante, aumento da duração da atividade coagulante, aumento de inicio do beneficio terapêutico, aumento do inicio da atividade coagulante e/ou um maior índice terapêutico. Assim, providos aqui estão polipeptídeos de FVII modificados contendo uma modificação na posição de aminoácido 286 por numeração de FVII maduro que apresentam aumento da atividade de coagulação em comparação com um polipeptideo de FVII não modificado. Tais polipeptídeos de FVII modificados podem ser usados no tratamento de distúrbios ou eventos de sangramento, tais como hemofilias, cirurgia, trauma e lesão, onde os polipeptídeos de FVII podem funcionar para promover a coagulação do sangue. Devido a um aumento da atividade coagulante, os polipeptídeos de FVII modificados providos aqui contêm uma modificação na posição de aminoácido 286 por numeração de FVII maduro oferecem vantagens sobre o tratamento com polipeptideo de FVII tipo selvagem, como o Fator VII do NovoSeven®, incluindo uma diminuição na quantidade de FVII administrado que é necessário para manter uma concentração suficiente de FVII ativo no soro para a hemostasia. Isso pode levar, por exemplo, doses e/ou frequência de dosagem menores necessárias para atingir comparáveis efeitos biológicos, início mais rápido do benefício terapêutico, maior duração de ação, maior conforto e aceitação pelos indivíduos, e/ou atenuação de efeitos secundários indesejáveis.

i. Substituições do aminoácido básico na posição 286

Providos aqui estão polipeptídeos de FVII modificados em que a glutamina na posição 286 (numeração correspondente do polipeptideo de FVII maduro definido em SEQ ID NO; 3; correspondente à posição 143 por numeração de quimotripsina) é substituído por um residuo de aminoácido básico, como qualquer um de arginina (Arg, R) , histidina (His, H) ou lisina (Lys, K) . Em particular, providos aqui estão polipeptideos de FVII modificados em que a glutamina na posição 286 é substituída por uma arginina (ou seja, Q286R, correspondendo a Q143R por numeração de quimotripsina) . Estudos de modelagem indicam que a substituição da glutamina com resultados uma arginina resulta na perda de duas interações chave que estabilizam uma conformação inativa do buraco de oxiânion de FVIIa no FVII tipo selvagem ou não modificado. As interações de desestabilização no polipeptideo de FVII tipo selvagem ou não modificado incluem a interacção entre a cadeia lateral de Q286 (correspondendo a Q143 por numeração de quimotripsina) e da amida da cadeia principal do G342 (correspondendo a G193 por numeração de quimotripsina), e a interação entre a carbonila da cadeia principal de K341 (correspondendo a Kl por numeração de quimotripsina) e da amida da cadeia principal de S195 (correspondendo a S344 pela numeração de quimiotripsina). Ao substituir a glutamina de tipo selvagem com uma arginina na posição 286, no entanto, não são apenas estas interações perdidas, mas duas novas interações importantes são criadas. Estas incluem a criação de uma ponte de sal entre a cadeia lateral básica do aminoácido modificado R286 (R143 por numeração de quimotripsina) e a cadeia lateral ácida do D289 nativo (D146 por numeração de quimotripsina) interação da amida da cadeia principal do aminoácido modificado R286 e a carbonila da cadeia principal de K341 que estabiliza uma conformação ativa do polipeptideo de FVIIa modificado. Além disso, a nova ponte de sal entre o aminoácido modificado R286 e D289 deve alterar a conformação e/ou a flexibilidade do "laço de autólise", que faz parte da fissura do sítio ativo. O laço de autólise está envolvido na determinação do substrato macromolecular e especificidade do inibidor de proteases da coagulação. Assim, uma conformação alterada e/ou flexibilidade deste laço pode resultar, por exemplo, no aumento da atividade catalítica para o substrato (por exemplo, fator X e/ou factor IX) e aumento da resistência aos inibidores (por exemplo, TFPI e/ou AT-III). Assim, a modificação da glutamina na posição 286 com um aminoácido básico, como arginina (Arg, R) , histidina (His, H) e lisina (Lys, K) , pode resultar em aumento da atividade catalítica e coagulante comparado com o polipeptídeo de FVII tipo selvagem. Portanto, providos aqui estão polipeptídeos de FVII contendo uma mutação Q286R, Q286K ou Q286H por numeração de FVII maduro (correspondendo a Q143R, Q143K ou Q143H, respectivamente, pela numeração de quimotripsina). Exemplares de tais polipeptídeos são aqueles com Uma sequência de aminoácidos definida em SEQ ID NOS: 118, 119 e 129, respectivamente,

A substituição do aminoácido da glutamina (Gin, Q) com um resíduo de aminoácido básico, em especial, uma arginina (Arg, R) , na posição do aminoácido correspondente à posição de aminoácido 286 de um polipeptideo de FVII maduro definido em SEQ ID NO: 3 pode ser feita em qualquer polipeptideo de FVII, incluindo um polipeptideo de FVII precursor com uma sequência definida em SEQ ID NOS: 1 ou 2, um polipeptideo de FVII maduro definido em SEQ ID NO:3, ou qualquer outra espécie, variante alélica e modificada, como aqueles descritos na técnica, e fragmentos ativos dos mesmos, que tem 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência a qualquer um dos polipeptídeos de FVII definidos em SEQ ID NOS: 1-3. Por exemplo, a mutação Q286R pode ser incorporada em qualquer polipeptideo de FVII modificado descrito na técnica, incluindo qualquer um dos descritos aqui em outro local. Tais polipeptídeos de FVII modificados incluem, mas não limitado a, um polipeptideo de FVII modificado contendo a mutação M298Q (SEQ ID NO:158) Ver, por exemplo, Persson et al. (2001) Proc. Nat. Acad. Sei.EUA 98:13583-13588), E296V/M298Q (SEQ ID NO:343), V158E (SEQ ID NO:344), E296R/M298K (SEQ ID NO:345), K337A (SEQ ID NO:346) , V158D/E296V/M298Q (SEQ ID NO:98; NN1731, ver, por exemplo, Persson et al, (2007) Art. Thromb. Vase. Biol. 27 (3): 683-689), V158D/E296V/M298Q/K337A (SEQ ID NO:347, por exemplo, ver Lisman et al. (2003) J.Thromb. Haem. 1:2175-2178) V253N (SEQ ID NO:348, por exemplo, ver US 7427592), T106N (SEQ ID NO:349; ver, por exemplo US 7427592), T106N/V253N (SEQ ID NO:350; ver, por exemplo US 7427592), K143N/N145T (SEQ ID NO:351; US 7442524), R315N/V317T (SEQ ID NO:352; US 7442524) ou K143N/N145T/R315N/V317T (SEQ ID NO:353; US 7442524). A mutação Q286R também pode ser incorporada em polipeptideos de FVII quiméricos ou polipeptideos de FVII de fusão, ou polipeptideos de FVII que de outra forma foram modificados, como por glicoPEGuilação (ver, por exemplo, WO 2007022512, Ghosh et al. (2007) transcrição da apresentação em Am. Society. Hematol. Meeting, 10 de dezembro de 2007). Em um exemplo, a substituição de aminoácido da glutamina com uma arginina na posição de aminoácido correspondente à posição de aminoácido 286 de um polipeptideo de FVII maduro definido em SEQ ID NO:3 resulta em um polipeptideo de FVII com uma sequência de aminoácidos definida em SEQ ID NO:118.

Providos aqui estão polipeptideos de FVII modificados que contêm substituição de aminoácido Q286R por numeração de FVII maduro (correspondendo a Q143R pela numeração de quimotripsina), em que os polipeptideos de FVII modificados apresentam aumento da atividade coagulante. Tais polipeptideos de FVII modificados podem conter 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 30, 40, 50 ou mais posições modificadas, em que uma das posições modificadas é a posição de aminoácido 286. Assim, providos aqui estão polipeptideos de FVII modificados, contendo duas ou mais modificações, em que uma modificação é a substituição de aminoácido Q286R (por numeração de FVII maduro) e o polipeptideo de FVII modificado apresenta aumento da atividade coagulante em comparação com um polipeptideo de FVII não modificado. A mutação Q286R pode ser combinada com qualquer outra mutação aqui descrita ou conhecida na técnica. Normalmente, o polipeptideo modificado resultante apresenta aumento da atividade coagulante. Uma pessoa versada na técnica pode determinar a atividade coagulante de um polipeptideo de FVII contendo a modificação Q286R usando ensaios in vitro e in vivo, bem conhecidos na técnica e aqui descritos. Os polipeptídeos de FVII modificados providos aqui incluem aqueles que contêm a mutação Q286R e também contêm uma ou mais mutações que, por exemplo, aumentam a resistência à antitrombina-III, aumentam a ativação de FX, aumentam a ativação de FIX, aumentam a ligação e/ou afinidade com os fosfolipidios, aumentam a afinidade para o fator tecidual, aumentam a atividade intrínseca, aumentam a atividade dependente de TF, alteram a conformação de polipeptideo para alterar a zimogenicidade, aumentam a atividade catalítica ou coagulante, tais como, deslocando o equilíbrio entre as conformações altamente ativa e menos ativa de FVIIa em favor das conformações altamente ativas, aumentam a resistência à proteases, diminuem glicosilação, aumentam glicosilação, reduzem a imunogenicidade, aumentam a estabilidade e/ou facilitam a ligação de grupo químico.

O aumento da atividade coagulante de polipeptídeos de FVII modificados contendo a substituição Q286R de aminoácido pode ser resultado de um aumento na atividade catalítica. 0 aumento da atividade catalítica pode ser observado na presença e/ou ausência de fator tecidual (TF). Assim, o aumento da atividade catalítica pode ser dependente de TF e/ou independente de TF. A atividade catalítica de um polipeptideo de FVII modificado contendo a mutação Q286R pode ser avaliada utilizando ensaios in vitro, tais como os ensaios descritos nos exemplos 4 e 7. Tais ensaios podem determinar a atividade catalítica de um polipeptideo de FVII modificado para um substrato, como o fator X, na presença ou ausência do fator tecidual. Polipeptideos de FVII modificados contendo as mutações Q286R podem apresentar aumento da atividade catalítica de cerca de 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 200%, 300%, 400%, 500%, ou mais, na presença e/ou ausência de fator tecidual em comparação com a atividade catalítica do polipeptideo de FVII não modificado ou tipo selvagem, quer in vivo ou in vitro. Por exemplo, como demonstrado no exemplo 4, um polipeptideo de FVIIa contendo a mutação Q286R (Q143R por numeração de quimotripsina) como a única modificação pode apresentar atividade catalítica para a FX, na presença ou ausência de TF que é de aproximadamente 2 a 4 vezes maior que a atividade catalítica apresentada pelo FVII do tipo selvagem. Em outros exemplos, um polipeptideo de FVIIa contendo mutações Q286R e M298Q pode apresentar atividade catalítica para a FX, na presença de TF que é de aproximadamente 3 a 4 vezes maior do que a atividade catalítica apresentada por FVII do tipo selvagem, e pode apresentar atividade catalítica para FX na ausência de TF que é de aproximadamente 7 a 26 vezes maior que a atividade catalítica apresentada por FVII do tipo selvagem.

Exemplos não limitadores de polipeptídeos de FVII modificados contendo duas ou mais modificações, em que uma modificação é substituição de aminoácido Q286R (por numeração de FVII maduro) e o polipeptideo de FVII modificados apresenta aumento da atividade catalítica para FX, na presença e/ou ausência de fator tecidual em comparação a um polipeptideo de FVII não modificado, são definidos na Tabela 5 e no Exemplo 4, abaixo. O identificador de sequência (SEQ ID NO) é identificado na qual sequências de aminoácidos do polipeptideo de FVII modificado exemplares estão definidas. Como discutido em maiores detalhes na seção D. 6, abaixo, a modificação "Gla troca FIX" envolve supressão do domínio de Gla de FVII endógeno por exclusão dos resíduos de aminoácidos de Al para Y44 (resíduos correspondentes a um polipeptideo de FVII maduro definido em SEQ ID NO: 3) e inserção de 45 resíduos de aminoácidos que correspondem a resíduos de aminoácidos Y1 para Y45 do domínio de Gla de FIX definido em SEQ ID NO: 83. Em alguns exemplos, o domínio de Gla de FIX no polipeptideo de modificado por "Gla troca FIX" contém uma ou mais substituições de aminoácidos em posições de aminoácidos correspondente a M19, E40, K43 e/ ou Q44 do domínio de Gla de FIX definido em SEQ ID NO: 83. Essas substituições são denotados por chaves (por exemplo, {Gla troca FIX/Q44S}). Nos casos em que uma posição de aminoácido modificado não tem um número correspondente de quimotripsina (ou seja, não está nas posições de aminoácidos 153 a 406 correspondendo a um polipeptideo de FVII maduro definido em SEQ ID NO: 3, e não está definido Tabela 1, acima), a posição é indicado entre colchetes usando numeração de FVII maduro. Por exemplo, T158N não tem um número correspondente de quimotripsina e é definido como T[158]N quando se refere à numeração de quimotripsina.Tabela 5

Um polipeptideo de FVII contendo a mutação Q286R por numeração de FVII maduro também podem apresentar maior resistência a AT-III. 0 aumento da resistência à AT-III pode ser resultado de uma diminuição da taxa de inibição 5 por AT-III ou diminuição da ligação à AT-III em condições especificas, tais como após a injeção em um animal ou paciente. A resistência à AT-III pode ser demonstrada através da medição da constante de taxa de segunda ordem para inibição de polipeptídeos de FVIIa variante e tipo selvagem. Outros métodos in vitro, tais como ensaios BIAcore®, também podem ser usados. Os polipeptídeos de FVII modificados podem apresentar maior resistência aos efeitos inibidores da AT-III em comparação com um polipeptideo de FVII não modificado, o que pode ser avaliado em ensaios in vitro como os descritos no Exemplo 5. Polipeptídeos de FVII modificados contendo as mutações Q286R podem apresentar maior resistência à AT-III de cerca de 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 20%, 30%, 4 0%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 200%, 300%, 400%, 500% ou mais em comparação à restância de AT-III de polipeptideo de FVII não modificado ou tipo selvagem, quer in vivo ou in vitro. Por exemplo, como demonstrado no Exemplo 5 abaixo, um polipeptideo de FVIIa contendo a mutação Q286R (Q143R por numeração de quimotripsina) podem apresentar atividade catalitica para a FX na presença de AT-III e na ausência de TF que é 2 a 4 vezes ou mais superior à atividade catalitica apresentada pelo FVII do tipo selvagem. Assim, o polipeptideo de FVII Q286R modficado pode apresentar um aumento na resistência à AT-III de cerca de 200% a 400% do que de um polipeptideo de FVII não modificado.

O aumento da atividade catalitica e a resistência à AT-III aumentada podem se manifestar como o aumento da atividade coagulante na presença e/ou ausência de TF. Tais atividades podem ser avaliadas in vitro, ex vivo ou in vivo, como pela administração a um individuo humano ou animal. A atividade de coagulação dos polipeptídeos de FVII modificados contendo a mutação Q286R pode ser aumentada em pelo menos cerca de 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 5 10%, 20%, 30%, 4 0%, 50%, 60%, 7 0%, 80%, 90%, 100%, 2 00%,300%, 400%, 500% ou mais em comparação com a atividade de coagulação do polipeptideo de FVII não modificado ou tipo selvagem, quer in vivo ou in vitro. Por exemplo, o exemplo 6.B.2 demonstra que um polipeptideo de FVIIa contendo a mutação Q286R (Q143R por numeração de quimotripsina) apresenta atividade de coagulação em um modelo de sangramento de camundongo que é maior (cerca de 2 vezes) do que a atividade de coagulação apresentada por um polipeptideo de FVII do tipo selvagem (por exemplo, FVII da NovoSeven®). O polipeptideo de FVIIa contendo as mutações Q286R e M298Q (Q143R e M156Q, respectivamente, pela numeração de quimotripsina) apresentam atividade coagulante ainda maior.

ii. Outras mutações na posição 286

A glutamina na posição de aminoácido correspondente a posição 286 do polipeptideo de FVII definido em SEQ ID NO:3 pode ser substituído por um aminoácido que não seja um aminoácido básico (ou seja, outro que não arginina, histidina ou lisina) . Tais 25 substituições podem alterar a conformação do buraco de oxiânion, por exemplo, resultando em uma conformação que aumenta a atividade catalitica do polipeptideo de FVII modificado em comparação a um polipeptideo de FVII tipo selvagem. Os polipeptídeos de FVII modificados que têm uma conformação alterada do buraco de oxiânion podem apresentar aumento da atividade catalítica de cerca de 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 200%, 300%, 400%, 500% ou mais em comparação com a atividade catalítica de polipeptideo de FVII tipo selvagem ou não modificado quando medido utilizando ensaios tanto in vivo, ex vivo, quanto in vitro.

A Tabela 6 fornece exemplos não limitativos de substituições de aminoácidos exemplares em Q286, outras substituições que não com a arginina, correspondendo a posições de aminoácidos de um polipeptideo de FVII maduro conforme definido na SEQ ID NO: 3. Como se observa, tais polipeptídeos de FVII são projetados para alterar a conformação do buraco de oxiânion para uma conformação mais eficaz e, portanto, aumentar a atividade coagulante. Em referência a essas mutações, o primeiro aminoácido (abreviação de uma letra) corresponde ao aminoácido que que é substituído, o número corresponde à posição na sequência de polipeptideo de FVII maduro com referência ao SEQ ID NO:3, e o segundo aminoácido ácido (abreviação de uma letra) corresponde ao aminoácido selecionado que substitui o primeiro aminoácido nessa posição. As posições de aminoácidos para a mutação também são referidas pelo esquema de numeração de quimotripsina. Na Tabela 6 abaixo, o identificador de sequência (SEQ ID NO) é identificado no qual sequências de aminoácidos exemplares do polipeptideo de FVII modificado estão definidas. Tabela 6.

Os polipeptídeos de FVII modificados que têm uma conformação alterada de buraco de oxiânion podem apresentar 5 aumento da atividade catalítica de cerca de 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 200%, 300%, 400%, 500% ou mais em comparação com a atividade catalítica de polipeptídeo de FVII não modificado ou tipo selvagem, quando medido em ensaios tanto in vivo, ex vivo, quanto in vitro. Em alguns exemplos, os polipeptídeos de FVII modificados que têm uma conformação alterada de buraco de oxiânion também podem apresentar maior resistência aos inibidores de protease endógena (isto é, diminuição da taxa de inibição por ou diminuição da afinidade para inibidores) , tais como TFPI ou AT-III em cerca de 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 200%, 300%, 400%, 500% ou mais em comparação com a taxa de inibição por ou afinidade para inibidores endógenos apresentada por polipeptideo de FVII não modificado ou tipo selvagem, quer in vivo, ex vivo ou in vitro. O aumento da atividade catalitica e/ou resistência a inibidores endógenos, como resistência à AT-III de tais polipeptídeos de FVII modificados também pode se manifestada como uma atividade de coagulação aumentada, duração da atividade coagulante, inicio mais rápido da atividade coagulante e/ou indice terapêutico melhorado. Por exemplo, a atividade de coagulação dos polipeptídeos de FVII modificados pode ser aumentada em pelo menos cerca de 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 200%, 300%, 400%, 500% ou mais em comparação com a atividade coagulante do polipeptideo de FVII não modificado ou tipo selvagem, quer in vivo, ex vivo ou in vitro.

2. Aumento da resistência à AT-III

Atitrombina III (também conhecida como antitrombina ou AT-III) é uma serpina anticoagulante importante (inibidora de protease de serina). AT-III é sintetizada como uma proteína precursora contendo 464 resíduos de aminoácidos (SEQ ID NO:122). No curso de secreção de peptídeo sinal de residuo 32 é clivado para gerar uma antitrombina humana de aminoácido maduro 432 (SEQ ID NO:123). A glicoproteina de AT-III de 58 kDa circula no sangue e funciona como um inibidor de protease de serina (serpina) para inibir um grande número de proteases de serina do sistema de coagulação. Os principais alvos da AT- III são a trombina e o fator Xa, apesar de AT-III também ter sido mostrada para inibir as atividades de FIXa, FXIa, FXIIa e, em menor extensão, FVIIa. A ação da AT-III é bastante reforçada por glicosaminoglicanos, como o sulfato de heparan de ocorrência natural ou heparinas derivadas de vários tecidos que são amplamente utilizados como anticoagulantes na prática clinica. AT-III se liga de forma muito especifica a uma sequência de pentassacarideo única na heparina que induz uma mudança conformacional no laço central reativo. Em tal conformação, o laço central reativo da AT-III pode mais eficientemente interagir com o sitio reativo da protease de serina, e efetuar a inibição.

AT-III não é normalmente inibidora para FVIIa de plasma livre, mesmo na presença de heparina, provavelmente devido à conformação semelhante a zimogênio de FVIIa que impede a interação eficiente com AT-III. Os efeitos inibidores da AT-III aumentam, no entanto, uma vez que FVIIa complexa com TF. A ligação da AT-III ao complexo TF/FVIIa pode liberar FVIIa de TF e o mantém em um complexo inativo com a AT-III. O aumento da afinidade de AT-III para o FVIIa ligado a TF em comparação com FVIIa sozinho presumivelmente reflete a maturação do sitio ativo de FVIIa quando é complexado com TF, portanto, tornando passível a ligação de AT-III (Rao et al. (1993) Blood 81:2600-2607). Assim, o impacto da AT-III em FVIIa é proporcional à atividade intrínseca da molécula FVIIa sozinha, a menos que 5 mutações tenham sido adicionadas ao polipeptideo de FVIIa que media resistência a AT-III. Enquanto FVIIa mantém a sua conformação semelhante a zimogênio, AT-III tem pouco efeito. Se, no entanto, FVIIa muda a conformação para uma forma mais ativa, como por ligação a TF, ou por 10 modificações específicas in vitro, a inibição de AT-III aumenta significativamente. Polipeptideos de FVIIa que são modificados para ter maior atividade intrínseca frequentemente apresentam aumentos simultâneos na suscetibilidade à inibição da AT-III. Por exemplo, a 15 modificação de um ou mais aminoácidos no. bolso de ativação de FVIIa, como por substituições de aminoácidos correspondendo a K337A, L305V, M298Q, V158D e E296V (em relação à sequência de FVII maduro definido em SEQ ID NO:3), resulta em aumento da sensibilidade do polipeptideo 20 de FVIIa para AT-III, pela inibição da atividade de FVIIa em até 90% (Persson et al. (2001) PNAS 98:13583-13588). Em outro exemplo, a indução de uma conformação mais semelhante a zimogênio por modificações de aminoácidos envolvidos na a-hélice de FVIIa, enquanto aumenta a atividade da proteina 25 de FVIIa modificada, também aumenta a sua suscetibilidade a AT-III (Persson et al. (2004) Biochem J 379:497-503).

Modificações exemplares para efetuar resistência à AT-III aumentada

As modificações podem ser feitas para um polipeptideo de FVII que aumenta sua resistência à AT-III. Geralmente, tais polipeptídeos de FVII modificados retêm pelo menos uma atividade de um polipeptideo de FVII. Normalmente, essas modificações incluem uma ou mais substituições de aminoácidos em qualquer posição do polipeptideo de FVII que estão envolvidas na interação de FVIIa com AT-III. Tais modificações podem, por exemplo, resultar em redução da ligação do FVII modificado para AT- III. Os polipeptídeos de FVII modificados são, portanto, resistentes aos efeitos naturalmente inibidores da AT-III em relação ao inicio da coagulação. Quando avaliada em um ensaio adequado in vitro ou in vivo, como após a administração a um individuo como uma terapia pró- coagulante, os polipeptídeos de FVII modificados resistentes à AT-III exibem um aumento da atividade coagulante, em comparação com polipeptídeos de FVII não modificados.

Conforme descrito aqui abaixo, uma pessoa versada na técnica pode projetar de forma empírica ou racional polipeptídeos de FVII modificados que apresentam maior resistência à AT-III. Tais polipeptídeos de FVII modificados podem ser testadas em ensaios conhecidos por uma pessoa versada na técnica para determinar se tais polipeptídeos de FVII modificados apresentam maior resistência a AT-III. Por exemplo, tais polipeptídeos de FVII modificados podem ser testados para a ligação com AT- III. Geralmente, um polipeptideo de FVII modificado que possui uma resistência à AT-III aumentada apresentará diminuição da ligação e/ou diminuição da afinidade para o AT-III. Normalmente, tais ensaios são executadas em um forma de cadeia dupla de FVII, tais como a forma ativada do FVII (FVIIa). Além disso, os ensaios para determinar os efeitos de AT-III geralmente são realizados na presença de heparina e na presença de fator tecidual, embora tais ensaios também podem ser realizadas na ausência de um ou ambos os cofatores.

Providos aqui estão polipeptídeos de FVII modificados apresentando maior resistência à AT-III. Resistência à inibição por ATUI é relevante tanto na presença quanto na ausência de TF. variantes de polipeptídeos de FVII fornecidas neste documento foram modificadas em uma ou mais posições de aminoácidos 239, 931, 366 e 373 (correspondendo às posições de aminoácidos 99, 170i, 217 e 224, respectivamente, pela numeração de quimotripsina). Estes residuos de aminoácidos podem ser modificados, como por substituição ou supressão de aminoácido. Os residuos identificados podem ser substituídos por qualquer outro aminoácido. Alternativamente, as inserções de aminoácidos podem ser usadas para alterar a conformação de um residuo de aminoácido alvo ou a estrutura da proteína nas proximidades de um residuo de aminoácido alvo.

Qualquer residuo de aminoácido pode ser substituído pelo residuo de aminoácido endógeno nas posições identificadas. Normalmente, a substituição de aminoácido é escolhida de forma que ela interfira na interação entre FVII e AT-III. Em alguns exemplos, o residuo de treonina na posição 239 (correspondendo à posição 99 por numeração de quimotripsina) é substituído por uma serina (Ser, S) , asparagina (Asn, N) , glutamina (Gin, Q) , valina (Val, V) , leucina (Leu, L) , histidina (His, H) , ou isoleucina (lie, I). Em outros exemplos, a prolina na posição 321 (correspondendo à posição 170i por numeração de quimotripsina) é substituído por uma lisina (Lys, K) , ácido glutâmico (Glu, E) , serina (Ser, S) ou tirosina (Tyr, Y). Em outros exemplos, a glutamina na posição 366 (correspondendo à posição 217 por numeração de quimotripsina) é substituído por uma asparagina (Asn, N) , ácido aspártico (Asp, D) , ácido glutâmico (Glu, E), serina (Ser, S) , treonina (Thr, T) , lisina (Lys, K) ou valina (Val, V). Em outros exemplos, a histidina na posição 373 (correspondendo à posição 224 por numeração de quimotripsina) é substituído por um ácido aspártico (Asp, D), ácido glutâmico (Glu, E), serina (Ser, S), fenilalanina (Phe, F) ou alanina (Ala, A). Em uma modalidade adicional, uma combinação de mutantes pode ser gerada. Incluído entre tais combinação de mutantes estão aquelas que têm duas ou mais mutações dos resíduos T239, P321, Q366 e H373 (correspondendo a T99, P1701, Q217 e H224, respectivamente, por numeração de quimotripsina). Por exemplo, um polipeptideo de FVII modificado pode possuir substituições de aminoácidos nas posições identificadas 2, 3, 4 ou 5.

Assim, um polipeptideo modificado pode exibir 1, 2, 3, 4 ou mutações que podem resultar em aumento da resistência do polipeptideo de FVII modificado para os efeitos inibidores da AT-III. Por exemplo, um polipeptideo de FVII pode ser modificado na posição de aminoácido 366 e na posição de aminoácido 373. Em alguns exemplos, as posições são modificadas pela substituição de aminoácidos, como, por exemplo, a substituição da glutamina na posição 366 por um ácido aspártico, e substituição da histidina na posição 373 por um ácido glutâmico.

A Tabela 7 fornece exemplos não limitativos de substituições de aminoácidos exemplares nos resíduos identificados, correspondendo às posições de aminoácidos de um polipeptideo de FVII maduro, conforme definido em SEQ ID NO: 3. Incluídos entre estes estão combinações de mutações exemplares. Como se observa, tais polipeptídeos de FVII são projetados para aumentar a resistência à AT-III e, portanto, ter atividade coagulante aumentada. Em referência a essas mutações, o primeiro aminoácido (abreviação de uma letra) corresponde ao aminoácido que é substituído, o número corresponde à posição na sequência de polipeptideo de FVII maduro com referência a SEQ ID NO: 3, e o segundo aminoácido ácido (abreviação de uma letra) corresponde ao aminoácido selecionado que substitui o primeiro aminoácido nessa posição. As posições de aminoácidos para a mutação também são referidas pelo esquema de numeração de quimotripsina. Na Tabela 7 abaixo, o identificador de sequência (SEQ ID NO) é identificado no qual sequências de aminoácidos exemplares do polipeptideo de FVII modificado estão definidas.Tabela 7

Os polipeptídeos de FVII modificados que têm maior resistência para a AT-III podem apresentar uma redução na extensão da inibição sob condições específicas ou na constante de taxa de segunda ordem para a inibição por AT-III em pelo menos, cerca de 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 200%, 300%, 400%, 500% ou mais em comparação com a extensão da inibição ou a constante de taxa de segunda ordem de inibição do polipeptideo de FVII não modificado ou tipo selvagem, quer in vivo ou in vitro. Assim, os polipeptídeos de FVII modificados podem apresentar maior resistência a AT-III que é pelo menos cerca de 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 200%, 300%, 400%, 500% ou mais da resistência apresentad por um polipeptideo de FVII não modificado. Maior resistência a AT-III por tais polipeptídeos de FVII modificados também pode se manifestar como uma atividade de coagulação aumentada, duração da atividade coagulante e/ou índice terapêutico melhorado na presença de AT-III. A atividade de coagulação dos polipeptídeos de FVII modificados-AT-III pode ser aumentada em pelo menos cerca de 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 200%, 300%, 400%, 500% ou mais em comparação com a atividade de coagulação do polipeptideo de FVII não modificado ou tipo selvagem, quer in vivo ou in vitro.

3. Aumento da resistência à inibição por Zn2+

A atividade amidolitica de FVIIa é regulada por alterações alostéricas induzidas pela ligação dos ions cálcio e fator tecidual (TF). FVII livre normalmente existe em uma conformação inativa. Ligação a Ca2'1’ e TF induz uma modificação na conformação e atividade amidolitica aumentada (Pederson et al, (1990) J Biol Chem 265:16786- 16793) . Em contraste, a ligação de ions de zinco para o FVIIa tem demonstrado ter um efeito inibidor na atividade. A ligação do Zn2+ para FVIIa resulta em diminuição da atividade amidolitica e menor afinidade para TF. Estudos indicam que o Ca2 + e Zn2+ concorrem para a ligação com FVIIa, sendo que na presença de Ca2+, o efeito inibidor do Zn2+ é reduzido. Além disso, FVIIa ligado a TF é menos suscetível à inibição do zinco.

Além dos sitos de ligação de Zn2+ no dominio de Gla, a ligação do mesmo não afeta a atividade amidolitica de FVIIa, dois sitios de ligação de Zn2+ foram mapeados para o dominio da protease do FVII (Petersen et al (2000) Protein Sci. 9:859-866, Bajaj et al., (2006) J. Biol. Chem. 281:24873-24888). 0 mapeamento destes sítios de ligação no domínio da protease indica que o primeiro sítio de ligação de Zn2+ envolve as cadeias laterais dos resíduos de aminoácido H216, E220 e S222 (H76, E80 e S82 por numeração de quimotripsina), e o segundo sitio de ligação de Zn2+ envolve as cadeias laterais de residuos de aminoácidos H257, D219 e K161 (H117, D79 e K24 por numeração de quimotripsina).

Zn2+ poderia, portanto, ter um papel fisiológico na regulação da homeostase como um inibidor de FVII. Foi postulado que esses efeitos inibidores ocorrem como resultado de um aumento da concentração de Zn2+ no local do coágulo após a ativação plaquetária (Bajaj et al. (2006) J. Biol. Chem. 281:24873-24888). As plaquetas armazenam grandes quantidades de Zn2+ no citoplasma e a-grânulos, que são liberados após a ativação plaquetária. Isso poderia aumentar a concentração local de Zn2+, que por sua vez poderia inibir a atividade FVIIa e ligação de FVIIa a TF.

Modificações exemplares para aumentar a resistência à inibição por Zn2+

Providos aqui estão polipeptídeos de FVII modificados apresentando maior resistência aos efeitos inibidores de Zn2’1'. Isto pode ser conseguido, por exemplo, pela mutação de um ou mais resíduos de FVII envolvidos na interação e ligação com Zn2+ para reduzir ou impedir a tal ligação, tornando os polipeptídeos de FVII modificados resistentes aos efeitos inibidore de Zn2+ com relação a atividade catalítica e ligação de TF. Quando avaliada em ensaios apropriados in vitro ou in vivo, como após a administração a um indivíduo como uma terapia pró- coagulante, os polipeptídeos de FVII modificados podem mostrar aumento da atividade coagulante em comparação com polipeptideos de FVII não modificados.

Providos aqui estão polipeptideos de FVII modificados tendo uma ou mais mutações em residues que podem estar envolvidos na ligação Zn2+ no dominio da protease. Esses residues incluem, mas não estão limitados a, K161, H216, D219, E220, S222 e H257, com a numeração relativa às posições de aminoácidos de um polipeptideo de FVII maduro definido em SEQ ID NO:3 (correspondendo a K24, 10 H76, D79, E80, S82 e H117, respectivamente, por numeração de quimotripsina). Em alguns exemplos, um ou mais residues de aminoácidos H216, S222 e H257 (correspondendo a H76, S82 e H117, respectivamente, por numeração de quimotripsina) são modificados, como por substituição ou supressão de 15 aminoácidos. Qualquer residuo de aminoácido pode ser usado para substituir o residuo endógeno nas posições identificadas. Por exemplo, providos aqui estão polipeptideos de FVII modificados em que a histidina na posição de aminoácido 216 é substituída por um resíduo de 20 serina, alanina, lisina ou arginina. Em outro exemplo, a serina na posição de aminoácido 222 é substituída por um resíduo de alanina ou lisina, ou a histidina na posição 257 é substituída por um residuo de alanina ou serina. Em uma modalidade adicional, a lisina na posição 161 é substituída 25 por um resíduo de serina, alanina ou valina. As modificações também incluem inserções de aminoácidos em ou próximo das posições de aminoácidos identificados como estando envolvidas na ligação de Zn2+. Tais inserções podem romper o sítio de ligação de Zn2+, resultando em um polipeptideo de FVII modificado com diminuição da ligação de Zn2+.

Combinação de mutantes em que as substituições de 5 aminoácidos são feitas em mais de um dos resíduos acima identificados em um polipeptideo de FVII também pode ser gerada. Incluído entre as combinações de mutantes estão aquelas que têm duas ou mais mutações dos resíduos K161, H216, D219, E220, S222 e H257 (correspondendo a K24, H76, 10 D79, E80, S82 e H117, respectivamente, por numeração de quimotripsina). Por exemplo, um polipeptideo de FVII modificado pode possuir substituições de aminoácidos nas posições identificadas 2, 3, 4, 5 ou 6. Assim, um polipeptideo modificado pode apresentar 1, 2, 3, 4, 5 ou 6 15 mutações que podem resultar em uma capacidade reduzida do polipeptideo de FVII modificado para ligar Zn2+. Por exemplo, um polipeptideo de FVII pode ser modificado pela substituição de aminoácido da serina na posição 222 por uma lisina, e histidina na posição 257 com um resíduo de 20 alanina.

Os polipeptídeos de FVII modificados que têm maior resistência aos efeitos inibidores de Zn2+ podem apresentar um aumento de pelo menos cerca de 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 25 80%, 90%, 100%, 200%, 300%, 400%, 500% ou mais em comparação com a resistência do polipeptideo de FVII não modificados ou do tipo selvagem, quer in vivo ou in vitro. A redução na ligação de Zn2+ e, portanto, aumento da resistência contra os efeitos inibidores de Zn2+, por tais polipeptídeos de FVII modificados também pode se manifestar como uma atividade de coagulação aumentada na presença de Zn2+. A atividade de coagulação dos polipeptídeos de FVII modificados pode ser aumentada em pelo menos cerca de 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 200%, 300%, 400%, 500% ou mais em comparação com a atividade de coagulação do polipeptídeo de FVII não modificado ou do tipo selvagem, quer in vivo ou in vitro.

A Tabela 8 fornece exemplos não limitativos de substituições de aminoácidos exemplares em resíduos identificados, correspondendo às posições de aminoácidos de um polipeptídeo de FVII maduro, conforme definido em SEQ ID NO: 3. Incluídos entre estes estão combinações de mutações exemplares. Como se observa, tais polipeptídeos de FVII são projetados para apresentar reduzida capacidade de ligação de Zn2+ e, consequentemente, aumento da resistência contra os efeitos inibidores de Zn2+. Assim, o polipeptídeo de FVII modificado pode ter aumento da atividade coagulante. Em referência a essas mutações, o primeiro aminoácido (abreviação de uma letra) corresponde ao aminoácido que é substituído, o número corresponde à posição na sequência de polipeptídeo de FVII maduro com referência a SEQ ID NO:3, e o segundo aminoácido ácido (abreviação de uma letra) corresponde ao aminoácido selecionado que substitui o primeiro aminoácido nessa posição. As posições de aminoácidos para a mutação também são referidas pelo esquema de numeração de quimotripsina. Na Tabela 8 abaixo, o identificador de sequência (SEQ ID NO) é identificado na qual sequências de aminoácidos exemplares do polipeptideo de FVII modificado estão definidas. Tabela 8

4. Glicosilação modificada

As propriedades e as atividades de uma proteina podem ser modificadas através da modulação da extensão, nível e/ou tipo de glicosilação. Por exemplo, a glicosilação pode aumentar a meia-vida do soro de polipeptideos, aumentando a estabilidade, solubilidade e reduzindo a imunogenicidade de uma proteína. A glicosilação pode aumentar a estabilidade de proteínas através da redução da proteólise da proteína e pode proteger a proteína da degradação térmica, exposição a agentes desnaturantes, danos causados por radicais livres de oxigênio, e mudanças no pH. A glicosilação também pode permitir que a proteína alvo escape de mecanismos de depuração que podem envolver a ligação a outras proteínas, incluindo os receptores da superfície celular. Moléculas de carboidcamundongos que contêm ácido siálico podem afetar a solubilidade de uma proteína. As moléculas de ácido siálico são altamente hidrofílica e podem proteger resíduos hidrofóbicos da proteína alvo. Isso diminui agregação e precipitação da proteína alvo. Diminuição da agregação também auxilia na prevenção da resposta imune contra a proteína alvo. Os carboidcamundongos podem, além disso, proteger sequências imunogênicas do sistema imunológico. O volume de espaço ocupado pelas moléculas de carboidcamundongos pode reduzir a área da superfície disponível que é examinada pelo sistema imunológico. Essas propriedades levam à redução da imunogenicidade da proteína alvo.

Sítios de glicosilação fornecem um local para fixação de monossacarídeos e oligossacarídeos a um polipeptideo por meio de uma ligação glicosídica, de modo que quando o polipeptideo é produzido em uma célula eucariótica capaz de glicosilação, ele é glicosilado. Os dois principais tipos de glicosilação são glicosilação N- ligada, onde as unidades de açúcar estão ligadas através do nitrogênio da amida de um residuo de asparagina, e glicosilação O-ligada, onde as unidades de açúcar estão ligadas através do grupo hidroxila dos residuos de serina, treonina, hidroxilisina ou hidroxiprolina. Outras formas menores de ligações glicosidicas incluem ligação S para cisteína e ligação C para triptofano. A glicosilação N- ligada ocorre em asparagina no consenso de sequência-Asn- Xaa-Ser/Thr/Cis onde Xaa não é prolina. Não há nenhum motivo conhecido por O-glicosilação, embora O-glicosilação seja mais provável em sequências com uma alta proporção de residuos de serina, treonina e prolina. A presença de um sitio de glicosilação potencial não significa, no entanto, garantir que o site será glicosilado durante o processamento pós-translacional no RE. Além disso, o nivel de glicosilação pode variar em um determinado sitio, e um sitio pode ter muitas estruturas de glicano diferentes. Há quatro sítios de glicosilação de ocorrência natural no FVII, dois sítios de N-glicosilação em N145 e N322, e dois sítios de O-glicosilação em S52 e S60, correspondendo às posições de aminoácidos no polipeptídeo de FVII maduro definido em SEQ ID NO:3.

Modificações exemplares para alterar glicosilação

Providos aqui estão polipeptídeos de FVII que foram modificados, alterando o nível e/ou tipo de glicosilação em comparação com um polipeptideo de FVII não modificado. A glicosilação pode ser aumentada ou diminuída em comparação com o FVII não modificado. Em alguns casos, o nível de glicosilação é aumentado, resultando em um polipeptideo de FVII hiperglicosilado. Isto pode ser conseguido, por exemplo, pela incorporação de pelo menos um sítio de glicosilação não nativo não encontrado no polipeptideo de FVII não modificado para que uma molécula de carboidcamundongo está ligada. Os polipeptídeos de FVII hiperglicosilados também podem ser gerados por ligação de uma molécula de carboidcamundongo a pelo menos um sítio de glicosilação nativo encontrado, mas não glicosilado no polipeptideo de FVII não modificado. Em outros exemplos, o nível de glicosilação em um polipeptideo de FVII modificado é diminuído em comparação com um polipeptideo de FVII não modificado. Isto pode ser conseguido por eliminação de um ou mais sítios de glicosilação nativos, como pela substituição ou eliminação de aminoácidos. Um ou mais dos resíduos de aminoácidos nas posições de aminoácidos 52, 60, 145 e 322 correspondendo a um polipeptideo de FVII maduro definido em SEQ ID NO: 3 podem ser eliminados ou podem ser substituídos por um resíduo de aminoácido que não pode ser ligado às moléculas de carboidcamundongo. Por exemplo, os resíduos de serina nas posições 52 e/ou 60 podem ser substituídos com um resíduo de alanina, eliminando assim um ou de ambos os sítios de O-glicosilação nativos. Assim, os sítios de glicosilação em um polipeptideo de FVII podem ser introduzidos, modificados, eliminados ou rearranjados.

Um polipeptideo de FVII pode ser modificado em uma ou mais posições para alterar a glicosilação do polipeptideo. Os polipeptideos de FVII modificados providos aqui que alteraram glicosilação comparado a um polipeptideo de FVII não modificado podem não ter glicosilação, ter glicosilação O-ligada, glicosilação N-ligada, e/ou uma combinação dos dois. Em alguns exemplos, um polipeptideo de FVII modificado inclui 1, 2, 3, 4, 5 ou mais moléculas de carboidcamundongo, cada uma ligada a sítios diferentes de glicosilação. Os sítios de glicosilação podem ser um sítio de glicosilação nativo e/ou um sítio de glicosilação não nativo. Em alguns exemplos, o polipeptideo de FVII modificado é glicosilado em mais de um sítio de glicosilação não nativo. Por exemplo, um polipeptideo de FVII modificado pode ser modificado para introduzir 1, 2, 3, 4, 5 ou mais sítios de glicosilação não nativo.

Os sítios de glicosilação não nativos podem ser introduzidos por substituição de aminoácidos. Os sitio de O-glicosilação podem ser criados, por exemplo, por substituição de aminoácidos de um resíduo nativo por uma serina ou treonina. Os sítios de N-glicosilação podem ser criados, estabelecendo o motivo Asn-Xaa-Ser/Thr/Cys, onde Xaa não é prolina. A criação dessa sequência de consenso através da modificação de aminoácidos poderia envolver a substituição de um resíduo de ácido aminado nativo por uma asparagina, a substituição de um resíduo de aminoácido nativo por uma serina, treonina ou cisteína, ou a substituição de um resíduo de aminoácido nativo por uma asparagina e substituição de aminoácidos do residuo nativo por uma serina, treonina ou cisteina. Por exemplo, a lisina na posição 109 (com base na numeração de FVII maduro definida em SEQ ID NO: 3) pode ser substituída por uma asparagina para criar um motivo Asn-Xaa-Ser novo no domínio de EGF1 e um novo sitio de N-gl icosilação na posição aminoácido 109. Um outro exemplo, a alanina na posição 292 é substituída por uma asparagina e alanina na posição 294 é substituída por uma serina para criar um motivo Asn-Xaa-Ser novo e um sítio de N-glicosilação novo na posição de aminoácido 292. Em um exemplo adicional, a alanina na posição 175 é substituída por uma serina para criar um motivo Asn-Xaa-Ser novo nas posições de aminoácidos 173-175 com base na numeração de FVII maduro definida em SEQ ID NO: 3, e um sítio de N-glicosilação novo na posição de aminoácido 173. Os sítios de glicosilação não nativos podem ser criados em qualquer região do polipeptídeo de FVII. Por exemplo, um ou mais sítios de glicosilação podem ser introduzidos no domínio de EGF1, o que corresponde a posições de aminoácidos 46-82 da polipeptídeo de FVII maduro em SEQ ID NO:3. Em outros exemplos, sítios de glicosilação não nativos introduzidos na região de domínio da protease do polipeptídeo de FVII, ou em posições que podem se associar com a região de domínio da protease sobre dobramento de proteínas.

Os sítios de glicosilação nativos podem ser modificado para evitar glicosilação ou aumentar ou diminuir glicosilação, enquanto outras posições no polipeptídeo de FVII podem ser modificadas para introduzir sitios de glicosilação não nativos. Em alguns exemplos, o teor de carboidcamundongos do polipeptideo de FVII pode ser modificado. Por exemplo, a posição de número, resistência de ligação, estrutura e composição das ligações de carboidcamundongo (ou seja, a estrutura do carboidcamundongocom base na natureza das ligações glicosidicas ou ramos do carboidcamundongo) de moléculas de carboidcamundongo adicionadas ao polipeptideo de FVII podem ser modificados.

Os polipeptídeos de FVII modificados providos aqui que alteraram glicosilação retêm pelo menos uma atividade de FVII. Normalmente, os polipeptídeos de FVII modificados providos aqui que alteraram glicosilação apresentam aumento da atividade coagulante em comparação com um FVII não modificado. Em alguns exemplos, o. nivel de glicosilação de um polipeptideo de FVII é aumentado. 0 nível de glicosilação pode ser aumentado em pelo menos cerca de 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 200%, 300%, 400%, 500% ou mais em comparação com o nível de glicosilação do polipeptideo de FVII não modificado ou tipo selvagem. Em outros exemplos, o nível de glicosilação é diminuído. O nível de glicosilação pode ser diminuído em pelo menos cerca de 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 200%, 300%, 400%, 500% ou mais em comparação com o nível de glicosilação do polipeptideo de FVIIa não modificado ou do tipo selvagem. Os niveis de glicosilação alterados ou as modificações no tipo de glicosilação presente em um polipeptideo de FVII modificado em comparação com um polipeptideo de FVII não modificado podem ser manifestados 5 como atividade coagulante aumentada. A atividade de coagulação dos polipeptideos de FVII modificados com glicosilação alterada pode ser aumentada em pelo menos cerca de 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 200%, 300%, 400%, 500% 10 ou mais em comparação com a atividade de coagulação do polipeptideo de FVII não modificado ou do tipo selvagem, quer in vivo ou in vitro.

A Tabela 9 fornece exemplos não limitativos de substituições de aminoácidos exemplares, correspondendo a posições de aminoácidos de um polipeptideo de FVII maduro, conforme definido em SEQ ID NO:3, que estão incluidas em um polipeptideo de FVII modificado para alterar os niveis de glicosilação, adicionando ou eliminando sitios de glicosilação. As substituições de aminoácidos exemplares podem criar sitios de glicosilação não nativos ou eliminar sitios de glicosilação nativos. Em alguns casos, duas substituições de aminoácidos são necessárias para criar um novo sitio de glicosilação. Também estão incluidas na Tabela 9 combinações de mutações exemplares que criam mais de um sitio de glicosilação novo não nativo no polipeptideo de FVII. Como mencionado acima, alterações nos níveis de glicosilação podem, por exemplo, aumentar a meia-vida. Assim, os polipeptideos de FVII modificados podem ter aumento da atividade coagulante. Em referência a essas mutações, o primeiro aminoácido (abreviação de uma letra) corresponde ao aminoácido que é substituído, o número corresponde à posição na sequência de polipeptideo de FVII maduro com referência a SEQ ID NO:3, e o segundo aminoácido ácido (abreviação de uma letra) corresponde ao aminoácido selecionado que substitui o primeiro aminoácido nessa posição. As posições de aminoácidos para a mutação também são referidas pelo esquema de numeração de quimotripsina onde apropriado. Nos casos em que uma posição de aminoácido modificada não tem um número de quimotripsina correspondente (ou seja, não está nas posições de aminoácidos 153 a 406 correspondendo a um polipeptideo de FVII maduro definido em SEQ ID NO:3, e não está definido na Tabela 1, acima), a posição é indicada entre parênteses usando a numeração de FVII maduro. Por exemplo, A51N não tem um número de quimotripsina correspondente e é definido como A[51]N quando se refere a numeração de quimotripsina. Na Tabela 9 abaixo, o identificador de sequência (SEQ ID NO) é identificado na qual exemplares sequências de aminoácidos do polipeptideo de FVII modificado estão definidas. Foram também identificados na Tabela 9 estão qualquer sitio de glicosilação novo não nativo gerado pela modificação. Tabela 9

5. Ligação à albumina sérica e/ou integrina plaquetária αnbβ3

FVII não modificado recombinante tem uma meia- vida sérica de apenas 1,5-3 horas em seres humanos. 0 5 aumento da meia-vida sérica de um polipeptideo de FVII pode reduzir em quantidade e frequência das dosagens necessárias para o efeito terapêutico. Diversas estratégias podem ser empregadas para aumentar a meia-vida sérica incluindo, mas não limitado a, aumentando a glicosilação, aumentando a 10 resistência da protease, PEGuilação e conjugação ou fusão de proteinas maiores, como a albumina sérica e a porção Fc de IgG. Tais modificações podem resultar, por exemplo, em degradação reduzida do polipeptideo de FVII por proteases séricas, depuração renal reduzida, depuração hepática reduzida e neutralização reduzida ou depuração pelo o 5 sistema imunológico. Outra estratégia que pode ser empregada para aumentar a meia-vida sérica de um polipeptideo de FVII envolve o enxerto de sequências de ligação em um polipeptideo de FVII modificado para estabelecer interações proteina-proteina novas ou 10 melhoradas que não são observadas em um polipeptideo de FVII não modificado.

Sequências de ligação que são inseridas no polipeptídeo de FVII modificado podem conter cerca de 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20, 25, 30 ou mais resíduos de aminoácidos que facilitam a interação com outra proteína. As sequências de ligação podem corresponder a uma sequência de ligação naturalmente presente em uma proteína nativa, ou pode ser uma sequência sintética de ligação com pouca ou nenhuma correlação de sequência para sequências de 20 ligação naturalmente presentes em uma proteína nativa. As sequências de ligação usadas para modificar os polipeptídeos de FVII aqui especificamente interagem com um sitio de ligação em outra proteína, que estabelece uma interação proteína-proteína não-covalente. Em alguns 25 exemplos, a proteína para a qual a sequência de ligação é específica é uma proteína sérica, como, por exemplo, albumina sérica. Tais sequências são bem conhecidas na técnica (ver, por exemplo, US 20030069395, US 20040009534 e US 20070202045). Em outros exemplos, a proteína reconhecida pela sequência de ligação é um receptor ou ligante da superfície celular, como, por exemplo, integrina plaquetária de αIIbβ3 (Smith et al. (1995) J. Biol. Chem. 270:30486-30490). A afinidade com a qual o polipeptideo de FVII modificado se liga à proteína sérica ou receptor da superfície celular é normalmente caracterizado por uma constante de dissociação, Kd, de 1 μM, 100 nN, 10 nM, 1 nM, 100 pM, 10 pM, 1 pM ou menos. A ligação do polipeptideo de FVII modificado com a proteína sérica ou receptor da superfície celular através da sequência de ligação pode reduzir, por exemplo, depuração renal ou depuração hepática do polipeptideo de FVII modificado em comparação com um polipeptideo de FVII não modificado. Em alguns exemplos, a ligação do polipeptideo de FVII modificado para um receptor de superfície celular também pode direcionar o polipeptideo de FVII modificado para uma célula desejada ou tipo de tecido ou região do corpo, assim "concentrando" que o polipeptideo de FVII em um local específico, como, por exemplo, um coágulo de sangue. Assim, polipeptídeos de FVII modificados contendo sequências de ligação enxertadas podem apresentar um aumento de meia-vida comparado a um polipeptideo de FVII não modificado.

a. Polipeptídeos de FVII exemplares com sequências de ligação de albumina sérica

Providos aqui estão polipeptídeos de FVII modificados contendo sequências de ligação de albumina sérica. Os polipeptídeos de FVII modificados podem ligar albumina in vitro ou in vivo, resultando em um aumento da meia-vida. Assim, providos aqui estão polipeptídeos de FVII modificados com meia-vida aumentada comparado a um polipeptideo de FVII nâo modificado. Quando avaliada em um ensaio adequado in vitro ou in vivo, como após a administração a um individuo como uma terapia pró- coagulante, os polipeptídeos de FVII modificados podem mostrar aumento da atividade coagulante, em comparação com polipeptídeos de FVII não modificados.

Os polipeptídeos de FVII modificados providos aqui podem conter sequências de ligação de albumina sérica. As sequências de ligação de albumina sérica podem ser inserido dentro do polipeptídeo de FVII não modificado ou podem ser ligadas ao terminal C ou N do polipeptídeo de FVII. Por exemplo, a sequência de ligação de albumina sérica pode se estender a partir do resíduo de prolina na posição de aminoácido 406 no terminal C do polipeptídeo de FVII (correspondendo a um polipeptídeo de FVII maduro definido em SEQ ID NO:3). Se as sequências de ligação estão inseridas dentro do polipeptídeo de FVII, a inserção está em uma posição tal que o polipeptídeo de FVII modificada resultante retém pelo menos uma atividade de um polipeptídeo de FVII não modificado. A sequência de ligação pode ser inserida no polipeptídeo de FVII sem remover quaisquer resíduos de aminoácidos no polipeptídeo de FVII, ou podem substituir um ou mais resíduos de aminoácidos n.o polipeptídeo de FVII. Em alguns exemplos, uma sequência de ligação de albumina sérica substitui resíduos de aminoácidos S103 a Sill (correspondendo a um polipeptideo de FVII maduro definido em SEQ ID NO: 3) para gerar um polipeptideo de FVII modificado. Em outros exemplos, uma sequência de ligação de albumina sérica substitui resíduos de aminoácidos H115 para S126, ou T128 para P134 (correspondendo a um polipeptideo de FVII maduro definido em SEQ ID NO:3). Sequências de ligação de albumina sérica exemplares são as definidas nas SEQ ID NOS: 206-212.

A Tabela 10 fornece exemplos não limitativos de modificações exemplares que podem ser feitas em um polipeptideo de FVII para uma inserção de sequência de ligação de albumina sérica. Gomo mencionado acima, a inclusão de uma sequência de ligação de albumina sérica pode aumentar a meia-vida de um polipeptideo de FVII, Assim, os polipeptideos de FVII modificados podem ter atividade coagulante aumentada. Em relação às modificações listadas na Tabela 10, os resíduos de aminoácidos em que a sequência de ligação de albumina sérica está inserida no polipeptideo de FVII, e a sequência da sequência de ligação, são representadas na tabela. Por exemplo, S103SllldelinsQRLMEDICLPRWGCLWEDDF indica que os resíduos de aminoácidos S103 até Slll de numeração de comprimento completo de polipeptideo de FVII não modificado (resíduos correspondendo à sequência de polipeptideo de FVII maduro definida em SEQ ID NO:3) foram excluídas e substituídas por uma sequência de ligação de de albumina sérica com a sequência de aminoácido QRLMEDICLPRWGCLWEDDF (SEQ ID NO:206). A recitação de apenas um único resíduo de aminoácido, como P406, indica que a sequência de ligação de albumina sérica é inserida após o P406 e sem residues de aminoácidos têm sido excluidos do polipeptideo de FVII. As posições de aminoácidos para a mutação também são referidas 5 pelo esquema de numeração de quimotripsina onde apropriado.

Nos casos em que uma posição de aminoácido modificado não tem um número de quimotripsina correspondente (ou seja, não está nas posições de aminoácidos 153 a 406 correspondendo a um polipeptideo de FVII maduro definido em SEQ ID NO:3, e 10 não está definido na Tabela 1, acima), a posição é indicada entre colchetes usando numeração de FVII maduro. Por exemplo, S103 não tem um número de quimotripsina correspondente é apresentado como S[103] ao se referir à numeração de quimotripsina. Na Tabela 10 abaixo, o 15 identificador de sequência (SEQ ID NO) é identificado na qual sequências de aminoácidos exemplares do polipeptideo de FVII modificado estão definidas.Tabela 10

Polipeptídeos de FVII modificados contendo uma sequência de ligação de albumina sérica podem apresentar maior ligação à albumina sérica, que é pelo menos cerca de 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 200%, 300%, 400%, 500%, ou mais, em comparação com a ligação de polipeptídeo de FVII não modificado ou do tipo selvagem à albumina sérica quer in vivo ou in vitro. Os polipeptídeos de FVII modificados que podem se ligar à albumina sérica podem apresentar 10 aumente da meia-vida sérica de pelo menos cerca de 1%, 2%,3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 200%, 300%, 400%, 500% ou mais em comparação com a meia vida sérica de polipeptídeo de FVII não modificado ou tipo selvagem, quer in vivo ou in vitro. O aumento de ligação de albumina sérica e/ou aumento da meia-vida sérica de tais polipeptideos de FVII modificados também podem se manifestar como uma atividade de coagulação aumentada, duração da atividade coagulante e/ou índice terapêutico melhorado. A atividade de coagulação dos polipeptideos de FVII modificados pode ser aumentada em pelo menos cerca de 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 200%, 300%, 400%, 500% ou mais em comparação com a atividade de coagulação de polipeptideo de FVII não modificado ou do tipo selvagem quer in vivo ou in vitro.

b. Polipeptideos de FVII exemplares com sequências de ligação de integrina plaquetária ctubβa

Providos aqui estão polipeptideos de FVII modificados contendo sequências de ligação de integrina plaquetária αiibβa- A Integrina plaquetária «nbβa (também chamada glicoproteína (GP) Ilb/IIIa) é o receptor de adesão de plaquetas mais abundante. É um heterodímero dependente de cálcio, que serve como um receptor de proteínas incluindo, mas não limitado a, fibrinogênio, fibronectina, vitronectina, fator de von Willebrand e trombospondina. Ligação a ligantes de proteína "cognata" pode ativar αIIbβ3 e induzir a transdução de sinal no citoplasma através do domínio intracelular da proteína. Polipeptideos de FVII modificados contendo sequências de ligação de integrina plaquetária ctiibβs» portanto, podem ligar plaquetas. Os polipeptideos de FVII modificados podem ligar integrina plaquetária αIIbβ3 (a forma ativada e/ou nâo ativada) in vitro oü in vivo, resultando em um aumento da meia-vida. Essas variantes de FVIIa que se ligam seletivamente a otubβa ativado pode, portanto, ser orientadas para plaquetas ativadas e, assim, concentradas no local de um coágulo de sangue em evolução. O direcionamento seletivo do FVIIa a coágulos sanguíneos em evolução seria esperado para melhorar a utilidade terapêutica da variante, melhorando tanto a eficácia quanto o indice terapêutico. Assim, provido aqui estão polipeptideos de FVII modificados com meia-vida aumentada comparado a um polipeptideo de FVII não modificado e variantes que, além disso, se ligam seletivamente a plaquetas ativadas. Quando avaliada em ensaios adequados in vitro ou in vivo, como após a administração a um indivíduo como uma terapia pró- coagulante, os polipeptideos de FVII modificados podem mostrar aumento da atividade coagulante, em comparação com polipeptideos de FVII não modificados.

Os polipeptideos de FVII modificados providos aqui contêm sequências de ligação de integrina plaquetária oíubPs- As sequências de ligação de integrina plaquetária diibβs podem ser inseridas com o polipeptideo de FVII n] ao modificado ou podem ser ligadas ao terminal C ou N do polipeptideo de FVII. Por exemplo, as sequências de ligação ohibβa podem se estender a partir do resíduo de prolina na posição de aminoácido 406 no terminal C do polipeptideo de FVII (correspondente a um polipeptideo de FVII maduro definido em SEQ ID NO:3). Se as sequências de ligação estão inseridas dentro do polipeptideo de FVII, a inserção está em uma posição tal que o polipeptideo de FVII modificado retém pelo menos uma atividade de um polipeptideo de FVII não modificado. A sequência de ligação pode ser inserida no 5 polipeptideo de FVII sem remover quaisquer residues de aminoácidos no polipeptideo de FVII, ou podem substituir um ou mais residues de aminoácidos no polipeptideo de FVII. Em alguns exemplos, uma sequência de ligação de integrina plaquetária α∑ibβa substitui residues de aminoácidos 10 S103 a ' Slll (correspondendo a um polipeptideo de FVII maduro definido em SEQ ID NO:3) para gerar um polipeptideo de FVII modificado. Em outros exemplos, uma sequência de ligação αribβ3 substitui resíduos de aminoácidos H115 a S126, ou T128 a P134 (correspondendo a um polipeptideo de 15 FVII maduro definido em - SEQ ID NO: 3) . As sequências de ligação de integrina plaquetária otIIbβ3 são as definidas nas SEQ ID NOS: 213-215.

A Tabela 11 fornece exemplos não limitativos de modificações exemplares que podem ser feitas para um 20 polipeptideo de FVII para inserir uma sequência de ligação de integrina plaquetária oinbβs* Como mencionado acima, a inclusão de uma sequência de ligação de integrina plaquetária αnbβ3 pode aumentar a meia-vida sérica de um polipeptideo de FVII e/ou orinetar a proteina para um o 25 coágulo de sangue em evolução. Assim, os polipeptídeos de FVII modificados podem ter atividade coagulante aumentada. Em relação às modificações listadas na Tabela 11, os resíduos de aminoácidos em que a sequência de ligação de integrina plaquetária otubβa está inserida no polipeptideo de FVII, e a sequência da sequência de ligação, são ambas representados na tabela. Por exemplo, H115S126delins SFGRGDIRNV indica que os residuos de aminoácidos H115 a S126 de numeração de comprimento completa de polpipeptideo de FVII não modificado (residuos correspondendo à sequência de polipeptideo de FVII maduro definida em SEQ ID NO:3) foi excluido, e substituído por um sequência de ligação de otiibβs com a sequência de aminoácidos SFGRGDIRNV (SEQ ID NO:213). A recitação de apenas um único residuo de aminoácido, como P406, indica que a sequência de ligação de otiibβs é inserida após P406 e nenhum residuo de aminoácidos foi excluido do polipeptideo de FVII. As posições de aminoácido para a mutação também são referidas pelo esquema de numeração de quimotripsina onde apropriado. Nos casos em que uma posição aminoácido modificado não tem um número de quimotripsina correspondente (ou seja, não está nas posições de aminoácidos 153 a 406 correspondendo a um polipeptideo de FVII maduro definido em SEQ ID NO:3, e não está previsto na Tabela 1, acima), a posição é indicada entre colchetes usando numeração de FVII maduro. Por exemplo, S103 não tem um número de quimotripsina correspondente e é definido como S[103] quando se refere a numeração de quimotripsina. Na Tabela 11 abaixo, o identificador de sequência (SEQ ID NO) é identificado na qual sequências de aminoácidos exemplares do polipeptideo de FVII modificado estão definidas. Tabela 11

Os polipeptídeos de FVII modificados contendo uma sequência de ligação de integrina plaquetária otubβ? podem apresentar maior ligação à integrina plaquetária αnbβa que é pelo menos cerca de 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 200%, 300%, 400%, 500% ou mais em comparação com a ligação do polipeptideo de FVII não modificado ou tipo selvagem à integrina plaquetária αIIbβ3 iti vivo. Os polipeptídeos de FVII modificados que podem se ligar às plaquetas através de integrina plaquetária «TIbβ3 podem apresentar um aumento de meia-vida de pelo menos cerca de 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 200%, 300%, 400%, 500% ou mais em relação à meia-vida de polipeptideo de FVII não modificado ou tipo selvagem quer in vitro, in vivo ou ex vivo. Maior meia-vida de tais polipeptídeos de FVII modificados também pode se manifestar como uma atividade de coagulação aumentada, duração da atividade coagulante e/ou índice terapêutico melhorado. Por exemplo, a atividade de coagulação dos polipeptídeos de FVII modificados pode ser aumentada em pelo menos cerca de 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 200%, 300%, 400%, 500% ou mais em comparação com a atividade de coagulação de polipeptideo de FVII não modificado ou tipo selvagem, quer in vivo ou in vitro.

6. Modificação pela introdução de um dominio de Gla Heterólogo

A interação dos residues no dominio de Gla y- carboxilado de proteinas plasmáticas dependentes de vitamina K, tais como o FVII, FIX, FX, protrombina, proteína C e proteína S, e fosfolipídios carregados negativamente na superficie da membrana é importante para a hemostasia. Os domínios de Gla de proteínas plasmáticas dependentes de vitamina K geralmente contêm cerca de 45 aminoácidos, dos quais 9 a 12 resíduos de ácido glutâmico são modificados pós-traducionalmente por carboxilação dependente de vitamina K para formar y-carboxiglutamato (Gla). Os aminoácidos que formam o domínio de Gla estão posicionados imediatamente após os que formam o peptideo sinal e propeptideo das proteínas e, portanto, situados no terminal N seguindo processamento e clivagem dos polipeptideos precursores às proteínas maduras. Por exemplo, os aminoácidos que formam o domínio de Gla em FVII estão em posições 39-83 do polipeptideo precursor definido em SEQ ID N0:l, posições 61-105 do polipeptideo precursor definido em SEQ ID NO:2, e posições 1 a 45 do polipeptideo maduro definido em SEQ ID NO:3. Destes, os 10 resíduos de ácido glutâmico em posições E6, E7, E14, E19, E20, E25, E26, E29 e E35 do polipeptideo de FVII maduro definidos em SEQ ID NO: 3 são modificados por carboxilação para gerar residuos de y-carboxiglutamato (Gla).

Devido à sua afinidade de ligação relativamente baixa para plaquetas ativadas, o dominio de Gla de FVII é um alvo para modificação, com o objective de reforçar a interação entre o FVII modificado e a membrana fosfolipidica, aumentando assim a atividade coagulante. As modificações podem ser feitas pela substituição de aminoácidos específicos que estão envolvidos nessa interação (ver, por exemplo, Shah et al. PNAS 95:4429-4234, Harvey et al. (2003) J Biol Chem 278:8363-8369). Alternativamente, a modificação pode ser efetuada pela substituição do domínio de Gla inteiro com o domínio de Gla de outra proteína dependente de vitamina K, ou seja, troca de domínio de Gla. Este tipo de modificação resulta em uma proteína quimérica, como a que resultou quando o domínio de Gla da proteína C foi substituído com o domínio de Gla de FVII (Geng et al. (1997) Thromb Haemost 77:926-933).

Normalmente, essa modificação inclui a introdução, como por adição ou substituição, de um domínio de Gla heterólogo, ou uma porção suficiente do mesmo para efetuar ligação de fosfolipídios em uma região do polipeptídeo de FVII para gerar um polipeptídeo de FVII quimérico modificado. Geralmente, tal polipeptídeo de FVII quimérico retém pelo menos uma atividade de FVII. A ligação e/ou afinidade de polipeptídeos de FVII modificados-Gla para plaquetas ativadas pode ser aumentada em pelo menos cerca de 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 200%, 300%, 400%, 500% ou mais em comparação com a ligação e/ou afinidade dos polipeptideos de FVII não modificados ou tipo selvagem, quer in vivo ou in vitro. A ligação e/ou afinidade para plaquetas ativadas por polipeptideos de FVII modificados também pode se manifestar como uma atividade de coagulação aumentada. A atividade de coagulação do polipeptideos de FVII modificados-Gla pode ser aumentada em pelo menos cerca de 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 200%, 300%, 400%, 500% ou mais em comparação com a atividade de coagulação de polipeptideo de FVII não modificado ou tipo selvagem, quer in vivo ou in vitro.

Um dominio de Gla ou porção suficiente do mesmo para efetuar ligação de fosfolipidios, tal como 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais do dominio de Gla heterólogo,contidos em qualquer polipeptideo pode ser usado como uma fonte de um dominio de Gla heterólogo para introdução ou substituição de uma região de um polipeptideo de FVII. Normalmente, tal dominio de Gla heterólogo apresenta afinidade de ligação por fosfolipidios, por exemplo, os fosfolipidios presentes na superficie de plaquetas ativadas. Geralmente, a escolha de um dominio de Gla heterólogo é aquela que apresenta maior afinidade por fosfolipidios, em comparação com a afinidade do dominio de Gla de FVII. 0 dominio de Gla exato, ou porção suficiente do mesmo, usado como um dominio heterólogo para modificação de um polipeptideo de FVII pode ser racional ou empiricamente determinado. Exemplares de outros polipeptídeos contendo Gla incluem, mas não estão limitados a, FIX, FX, protrombina, proteina C, proteina S, osteocalcina, proteina de Gla matriz, proteina especifica de detenção de crescimento 6 (Gas6) e proteina Z. Os domínios de Gla destas proteinas exemplares são definidos em qualquer uma das SEQ ID NOS: 83-91. Por exemplo, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40 ou mais aminoácidos contíguos, ou o dominio de Gla inteiro, de um dominio de Gla heterólogo pode ser introduzido em um polipeptideo de FVII. Além disso, a introdução do dominio de Gla em um polipeptideo de FVII também pode incluir aminoácidos adicionais que não fazem parte do dominio de Gla do polipeptideo heterólogo, enquanto os aminoácidos adicionais não enfraquecem significativamente a capacidade de ligação de fosfolipídios do dominio de Gla introduzido.

Em alguns exemplos, a introdução é por adição do dominio de Gla para o polipeptideo de FVII tal que o dominio de Gla heterólogo é inserido no dominio de Gla endógeno ou em qualquer outra região ou dominio do polipeptideo de FVII, desde que o polipeptideo de FVII modificado retenha pelo menos uma atividade de FVII. Em tais exemplos, o dominio de Gla nativo do polipeptideo de FVII é retido no polipeptideo, embora em alguns casos, a sequência de aminoácido que compõe o dominio de Gla nativo é interrompido. Em outros exemplos, o dominio de Gla heterólogo, ou uma porção suficiente do mesmo, é inserido adjacente a, ou no terminal N ou C, do dominio de Gla nativo de modo que o dominio de Gla nativo não seja interrompido. Em exemplo adicional, o dominio de Gla heterólogo, ou uma porção suficiente do mesmo, é inserido em outro dominio do polipeptideo de FVII.

Também providos aqui estão polipeptídeos de FVII de dominio de Gla modificados onde todos ou uma parte contigua do domínio de Gla endógeno de FVII é removida e substituída por um domínio de Gla heterólogo, ou uma porção suficiente do mesmo para efetuar ligação de fosfolipídeo, enquanto o polipeptídeo de FVII modificado retém pelo menos uma atividade de FVII. Tal alteração também é referido como uma troca de domínio de Gla. Modificações de troca de Gla exemplares são aqueles em que o domínio de Gla endógeno é substituído por todos ou uma parte do domínio de Gla de qualquer um dos FIX (SEQ ID NO: 83), FX (SEQ ID NO: 84), trombina (SEQ ID NO:85), proteína C (SEQ ID NO:86) ou Proteína S (SEQ ID NO:87). Tais modificações são chamadas de "Gla troca FIX", "Gla troca FX", "Gla troca trombina", "Gla troca Prot C" e "Gla troca Prot S", respectivamente. Tais polipeptídeos de FVII modificados podem apresentar maior ligação às plaquetas ativadas, resultando em aumento da atividade coagulante. A modificação de "Gla troca FIX" envolve supressão do domínio de Gla endógeno de FVII, excluindo os resíduos de aminoácidos de Al a Y44 (resíduos correspondendo a um polipeptídeo de FVII maduro definido em SEQ ID NO: 3) e inserção de 45 resíduos de aminoácidos que correspondem a resíduos de aminoácidos Y1 a Y45 do dominio de Gla de FIX definido em SEQ ID NO: 83. A modificação de Gla troca FX envolve a modificação de eliminação de resíduos de aminoácidos de Al a Y44 (resíduos correspondendo a um polipeptideo de FVII maduro definido em SEQ ID NO: 3) e inserção de 44 resíduos de aminoácidos que correspondem a Al a Y44 do dominio de Gla de FX definido em SEQ ID NO:84. A modificação de Gla troca trombina envolve eliminação de resíduos de aminoácidos de Al a Y44 (resíduos correspondendo a um polipeptideo de FVII maduro definido em SEQ ID NO: 3) e inserção de 44 resíduos de aminoácidos que correspondem a resíduos de aminoácidos de Y1 a Y44 do dominio de Gla de trombina definido em SEQ ID NO: 85. A modificação de Gla troca Proteina C envolve eliminação de resíduos de aminoácidos de Al a Y44 (resíduos correspondendo a um polipeptideo de FVII maduro definido em SEQ ID NO: 3) e inserção de 44 resíduos de aminoácidos que correspondem a resíduos de aminoácidos de Al a H44 do dominio de Gla de Proteina C definido em SEQ ID NO: 86. A modificação de Gla troca Proteina S envolve eliminação de resíduos de aminoácidos de Al a Y44 (resíduos correspondendo a um polipeptideo de FVII maduro definido em SEQ ID NO: 3) e inserção de 44 resíduos de aminoácidos que correspondem a resíduos de aminoácidos de Y1 a Y44 do dominio de Gla de Proteina S definido em SEQ ID NO:87.

Em alguns exemplos, as modificações, incluindo, mas não limitados a, substituições, inserções e/ou supressões de aminoácidos são feitas para o dominio de Gla heterólogo que está sendo introduzido no polipeptideo de FVII. Tais modificações podem efetuar, por exemplo, maior ligação às plaquetas ativadas, devido à maior ligação de fosfolipídios, em comparação com a ligação observada com a forma tipo selvagem do dominio de Gla heterólogo. Por exemplo, se o dominio de Gla de Fator IX, ou de uma porção de ligação fosfolipidica do mesmo, é introduzido um polipeptideo de FVII modificado para gerar um polipeptideo de FVII modificado, o dominio de Gla de Fator IX pode conter mutações de aminoácidos que conferem maior ligação de fosfolipideo em relação ao dominio de Gla de Fator IX de tipo selvagem. O dominio de Gla heterólogo contendo os polipeptídeos de FVII modificados providos aqui pode conter 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou mais modificações, tais como substituições ou inserções e/ou exclusões de aminoácidos.

Em alguns exemplos, a modificação no dominio de Gla heterólogo aumenta a ligação de fosfolipideo. Em outros exemplos, o dominio de Gla heterólogo pode conter uma ou mais mutações em comparação com a forma tipo selvagem do dominio de Gla heterólogo, que confere funções semelhantes a F-VII ao dominio de Gla heterólogo. Por exemplo, como mencionado acima, R36 do dominio de GIA de FVII definido em SEQ ID NO:119 pode estar envolvido em interações com o FX. Assim, o dominio de Gla heterólogo pode conter modificações adicionais, como qualquer uma necessária para manter uma arginina na posição 36 do polipeptideo de FVII maduro, conforme definido em SEQ ID NO:3, ou quaisquer outras modificações necessárias para manter propriedades de ativação de FX do polipeptideo de FVIIa modificado (Ruf et al (1999). Biochem 38:1957-1966). Assim, em alguns exemplos, uma mutação correspondente ao R36 pode ser feita no dominio de Gla heterólogo. A posição correspondente pode ser determinada por uma pessoa versada na técnica, como pelo alinhamento das sequências de aminoácidos.

Providos aqui estão polipeptídeos de FVII modificados contendo uma modificação de troca de Gla onde o dominio de Gla heterólogo, ou parte de ligação de fosfolipideo do mesmo, contém uma ou mais mutações em comparação com o dominio de Gla heterólogo tipo selvagem, e é introduzido no polipeptídeo de FVII pela substituição de alguns ou todos os dominio de Gla endógenos de FVII. Em um exemplo, os polipeptídeos de FVII modificados providos aqui contêm uma modificação de "Gla troca FIX", que, como descrito acima, implica supressão do domínio de Gla de FVII endógeno, excluindo os resíduos de aminoácidos de Al a Y44 (resíduos correspondendo a um polipeptídeo de FVII maduro definido ern SEQ ID NO: 3) e inserção de 45 resíduos de aminoácidos que correspondem a resíduos de aminoácidos de Y1 a Y4 5 do domínio de Gla de FIX definido em SEQ ID NO: 83. 0 domínio de Gla de FIX utilizado na modificação de troca de Gla pode conter uma ou mais mutações em comparação com a forma tipo selvagem do domínio de Gla de FIX definido em SEQ ID NO: 83, como 1, 2, 3, 4, 5 ou mais mutações, tais como substituições , supressões ou inserções de aminoácidos. Por exemplo, o dominio de Gla de FIX heterólogo em um polipeptideo de FVII modificado de "Gla troca FIX" pode conter uma ou mais substituições de aminoácidos nas posições de aminoácidos correspondendo a M19, E40, K43 e/ou Q44 do dominio de Gla de FIX definido em SEQ ID NO:83.

Em um exemplo, o dominio de Gla de FIX contém uma substituição do ácido aminado M19K. Tal modificação é denotada por {Gla troca Fix/M19K}, ou seja, a metionina na posição de aminoácido correspondente à posição 19 do dominio de Gla de FIX definido em SEQ ID NO:83 é substituído por uma lisina. Em um exemplo adicional, dominio de Gla de FIX heterólogo modificado no polipeptideo de FVII modificado contém uma substituição de aminoácido E40L, denotado por {Gla troca FIX/E40L}, em que o ácido glutâmico na posição de aminoácido correspondente à posição de aminoácido 4 0 do dominio de Gla de FIX definido em SEQ ID NO:83 é substituído por uma leucina. Também provido aqui estão polipeptideos de FVII modificados que contêm uma substituição K43I (denotado por {Gla troca FIX/K43I}) em que a lisina na posição de aminoácido correspondente à posição de aminoácido 43 do dominio de Gla de FIX definido em SEQ ID NO:83 é substituído por uma isoleucina. Em outro exemplo, a dominio de Gla de FIX heterólogo modificado no polipeptideo de FVII modificado contém uma substituição de aminoácido Q44S, denotada por {Gla troca FIX/Q44S}, no qual a glutamina na posição de aminoácido correspondente à posição de aminoácido 44 do dominio de Gla de FIX definido em SEQ ID NO: 83 é substituído por uma serina. Em um exemplo, o dominio de Gla de FIX heterólogo contém substituições de aminoácidos Ml9K/E40L/K431/Q44S.

Os polipeptídeos de FVII modificados contendo um dominio de Gla heterólogo, como dominio de Gla heterólogo modificado, pode apresentar aumento da atividade coagulante em doses mais baixas em comparação com uma molécula de FVII do tipo selvagem, como NovoSeven®, devido à maior ligação e/ou afinidade por plaquetas ativadas. A atividade de coagulação dos polipeptídeos de FVII modificados-Gla pode ser aumentada em pelo menos cerca de 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 200%, 300%, 400%, 500% ou mais em comparação com a atividade de coagulação de polipeptideo de FVII não modificado ou tipo selvagem quer in vivo, ex vivo ou in vitro.

7. Combinações e modificações adicionais

Qualquer uma ou mais das modificações descritas acima podem ser combinadas com qualquer outra modificação descrita acima ou descritas em outras partes da técnica. Assim, além de polipeptídeos de FVII modificados terem maior resistência à AT-III, aumento da atividade catalítica, aumento da resistência à inibição por Zn2+, glicosilação alterada, propriedades farmacocinéticas melhoradas, como meia-vida aumentada, aumento da ligação e/ou afinidade com albumina, aumento da afinidade e/ou ligação aos fosfolipídios, ou aumento da ligação e/ou afinidade a integrina plaquetária αnbβ3f os polipeptídeos de FVII modificados providos aqui também incluem aqueles que apresentam mais de uma das propriedades acima referida. Normalmente, tais modificações adicionais são aquelas que resultam em um aumento da atividade coagulante do polipeptideo modificado e/ou aumento da estabilidade do polipeptideo. Consequentemente, os polipeptídeos de FVII modificados exibem um aumento da atividade coagulante. As modificações adicionais podem incluir, por exemplo, qualquer substituição, eliminação ou inserção de aminoácido conhecidas na técnica, normalmente qualquer uma que aumenta a atividade coagulante e/ou estabilidade do polipeptideo de FVII. Qualquer polipeptideo de FVII modificado provido aqui pode conter 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 ou mais modificações de aminoácidos adicionais, enquanto o polipeptideo de FVII modificado resultante retém uma atividade de FVII do tipo selvagem ou polipeptideo não modificado.

Em um exemplo, a modificação adicional pode ser feita com a sequência polipeptídica de FVII tal que a sua interação com outros fatores, moléculas e proteinas é modificada. Por exemplo, os residuos de aminoácidos que estão envolvidos na interação com o fator tecidual (TFPI) pode ser substituído de modo que a afinidade e/ou ligação do polipeptideo de FVII modificado a TF é diminuída. Outras modificações incluem, mas não estão limitados a, modificação de aminoácidos que estão envolvidos nas interações com o fator X, fator IX, fator tecidual (TF) e fosfolipidios. Em alguns exemplos, a modificação introduzida na sequência polipeptidica FVII inclui a inserção de aminoácidos que constituem uma sequência de ligação, como, por exemplo, uma sequência de ligação de albumina sérica ou sequência de ligação de glicoproteina Ilb-IIIa.

Modificações adicionais também podem ser feitas para um polipeptideo de FVII modificado provido aqui que alteram a conformação ou dobramento do polipeptideo. Estas incluem, por exemplo, a substituição de um ou mais aminoácidos com uma cisteina tal que uma ligação de dissulfeto nova é formada, ou modificações que estabilizam uma conformação a-hélice, pelo que transmite atividade aumentada para o polipeptideo de FVII modificado.

Modificações adicionais também podem ser feitas para o polipeptideo de FVII para efetuar modificações pós- translacionais. Por exemplo, o polipeptideo pode ser modificado para incluir sitios de glicosilação adicional tal que o polipeptideo de FVII não modificado tenha glicosilação aumentada comparado a um polipeptideo de FVII não modificado. As modificações também podem ser feitas para introduzir residuos de aminoácidos que podem posteriormente ser ligados a uma molécula quimica, tal como uma que aja para aumentar a estabilidade do polipeptideo de FVII modificado. A estabilidade de um polipeptideo de FVII também pode ser alterada, modificando os sitios proteoliticos potenciais, aumentando assim a resistência do polipeptideo de FVII modificado a proteases.

Além disso, as substituições, exclusões ou inserções de aminoácidos, podem ser feitas no dominio de Gla endógeno, que exibe o polipeptideo de FVII modificadao mostre ligação e/ou afinidade por membranas fosfolipidicas aumentada. Tais modificações podem incluir substituição , exclusões e/ou inserções de um único aminoácido, ou pode incluir a substituição, exclusão ou inserção de aminoácidos de vários aminoácidos. Por exemplo, todo ou parte do dominio de Gla endógeno pode ser substituído com todo ou parte de um dominio de Gla heterólogo. Em outros exemplos, os polipeptídeos de FVII modificados providos aqui podem exibir exclusões no dominio de Gla endógeno, ou substituições nas posições que normalmente são gama- carboxiladas (US 20070037746) .

As seções seguintes descrevem exemplos não limitativos de modificações exemplares descritas na técnica para efetuar estabilidade e/ou atividade coagulante aumentada de um polipeptideo de FVII. Como discutido acima, tais modificações também podem ser adicionalmente incluidas em qualquer polipeptideo de FVII modificado provido aqui. As posições de aminoácido relacionadas abaixo correspondem ao polipeptideo de FVII maduro tal como definido por diante em SEQ ID NO:3. Mutações correspondentes podem ser feitas em outros polipeptídeos de FVII, como variantes de alelos, de espécies ou de união do polipeptideo de FVII maduro definido em SEQ ID NO:3.

a. Modificações que aumentam a resistência à TFPI

Em um exemplo, modificações adicionais podem ser feitas para um polipeptideo de FVII modificado que contém uma modificação na posição aminoácido 286 por numeração de FVII maduro que resultam em aumento da resistência à TFPI. Essa resistência à TFPI pode ser alcançada, por exemplo, pela mutação de um ou mais resíduos em FVII envolvidos na interação e ligação com TFPI para reduzir ou evitar tal ligação, tornando os polipeptídeos de FVII modificados resistentes aos efeitos naturalmente inibidores de TFPI com relação ao inicio da coagulação. Por exemplo, as modificações podem ser feitas em resíduos de aminoácidos que são resíduos de contato FVII/TFPI ou resíduos nas proximidades da superfície de interação.

Exemplos de modificações adicionais que podem ser incluídas no polipeptídeos de FVII modificados providos aqui para aumentar a resistência à TFPI incluem, mas não estão limitados a, aqueles descritos na Publicação de Patente Internacional n° WO 2004/083361, Neuenschwander et al., (1995) Biochemistry 34:8701-8707, Chang et al., (1999) Biochemistry 38:10940-10948 e lakhiaev et al., (2001) Thromb. Haemost. 85:458-463, e Pedido US relacionado n° de série 12/082.662. Exemplos não limitativos de modificações de aminoácidos exemplares descritas na técnica que podem resultar em aumento da resistência à TFPI do polipeptídeo de FVII modificado incluem um ou mais de Q17 6, D196K, D196R, D196A, D196Y, D196F, D196W, D196L, D196I, K197Y, K197A, K197E, K197D, K197L, K197M, K197I, K197V, K197F, K197W, K199A, K199D, K199E, G237W, G237T, G237I, G237V, T239A, R290A, R290E, R290D, R290N, R290Q, R290K, R290M, R290V, K341E, K341R, K341Q, K341N, K341M, K341D, G237T238insA, G237T238insS, G237T238insV, G237T238insAS, G237T238insSA, D196K197insK, D196K197insR, D196K197insY, D196K197insW, D196K197insA, DI96K197insM, K197I198insE, K197I198insY, K197ll98insA e K197I198insS (onde, por exemplo, G237T238insAS denota uma modificação na qual uma alanina (A) e uma serina (S) foram inseridas entre a glicina na posição 237 (G237) e da treonina na posição 238) .

b. Modificações que aumentam a atividade intrínseca

Em um exemplo, modificações adicionais podem ser feitas para polipeptideo de fator VII modificado provido aqui, que resultam em aumento da atividade catalítica em direção fator X. Por exemplo, as modificações podem ser feitas para os aminoácidos que estão envolvidos na interação com seu cofator, TF, de modo que o polipeptideo de FVII modificado aumentou a afinidade para TF e, portanto, mostra aumento da atividade para FX. As modificações também podem ser feitas para o bolso de ativação do polipeptideo de FVII, de modo que a atividade intrínseca do polipeptideo de FVII modificado para FX é maior comparada com a atividade do polipeptideo não modificado. Outra estratégia de modificação que resulta em aumento da atividade envolve a modificação do polipeptideo de FVII de tal forma que a dobra e a conformação da proteína é alterada para uma forma mais ativa. Por exemplo, substituições de aminoácidos podem ser feitas de tal forma que a região de laço de a-hélice (correspondendo às posições 305-321 da sequência madura conforme definida na SEQ ID NO:3) do dominio de protease é estabilizada e dobrada mais firmemente para o corpo do dominio de protease para conferir uma forma mais semelhante a zimogênio no polipeptideo de FVII modificado. Um polipeptideo mais ativo também pode ser obtido através da modificação dos aminoácidos envolvidos na fitas β do polipeptideo de FVII. Por exemplo, substituições de aminoácidos podem ser feitas para introduzir novos pares de cisteina que podem formar novas pontes de dissulfeto, que podem funcionar para "travar" o polipeptideo de FVII modificado em uma forma mais ativa.

Exemplos de modificações adicionais que podem ser incluídas no polipeptídeos de FVII modificados providos aqui para aumentar a atividade intrínseca do polipeptideo de FVII modificados incluem, mas não estão limitados a, aquelas descritas em Persson et al. (2004) Biochem J. 379:497-503, Maun et al. (2005) Prot Sei. 14:1171-1180, Persson et al. (2001) PNAS 98:13583-13588, Persson et al. (2002) Eur J Biochem 269:5950-5955, Soejima et al. (2001) J Biol Chem 27 6:17229-17235, Soejima et al. (2002) J Biol Chem 277:49027-49035, WO 200183725, WO 2002022776, WO 2002038162, WO 2003027147, WO 200338162, WO 2004029090, WO 2004029091, WO 2004108763 e WO 2004111242. Exemplos não limitativos de modificações aminoácidos exemplars descritas na técnica que podem resultar em aumento da atividade intrínseca do polipeptídeo de FVII modificado incluem um ou mais de S279C/V302C, L280C/N301C, V281C/V302C, S282C/V299C, S314E, L39E, L39Q, L39H, I42R, S43Q, S53N, K62E, K62R, K62D, K62N, K62Q, K62T, L65Q, L65S, F71D, F71Y, F71E, F71Q, F71N, P74S, P74A, A75E, A75D, E77A, E82Q, E82N, T83K, E116[ ), K157V K157L , K157I, K157M, K157F, K157W, K157P, K157G, K157S, K157T, K157C, K157Y, K157N, K157E, K157R, K157H, K157D, K157Q, V158L, V158I, V158M, V158F, V158W, V158P, V158G, V158S, V158T, V158C, V158Y, V158N, V158E, V158R, V158K, V158H, V158D, V158Q, A274M, A274L, A274K, A274R, A274D, A274V, A274I, A274F, A274W, A274P, A274G, A274T, A274C, A274Y, A274N, A274E, A274H, A274S, A274Q, F275H, E296V, E296L, E296I, E296M, E296F, E296W, E296P, E296G, E296S, E296T, E296C, E296Y, E296N, E296K, E296R, E296H, E296D, E296Q, M298Q, M298V, M298L, M298I, M298F, M298W, M298P, M298G, M298S, M298T, M298C, M298Y, M298N, M298K, M298R, M298H, M298E, M298D, R304Y, R304F, R304L, R304M, L305V, L305Y, L305I, L305F, L305A, L305M, L305W, L3O5P, L305G, L305S, L305T, L305C, L305N, L305E, L305K, L305R, L305H, L305D, L3O5Q, M306D, M306N, D309S, D309T, S314A, S314V, S314I, S314M, S314F, S314W, S314P, S314G, S314L, S314T, S314C, S314Y, S314N, S314E, S314K, S314R, S314H, S314D, S314Q, D334G, D334E, D334A, D334V, D334I, D334M, D334F, D334W, D334P, D334L, D334T, D334C, D334Y, D334N, D334K, D334R, D334H, D334S, D334Q, S336G, S336E, S336A, S336V, S336I, S336M, S336F, S336W, S336P, S336L, S336T, S336C, S336Y, S336N, S336K, S336R, S336H, S336D, S336Q, K337L, K337V, K337I, K337M, K337F, K337W, K337P, K337G, K337S, K337T, K337C, K337Y, K337N, K337E, K337R, K337H, K337D, K337Q, F374P, F374A, F374V, F374I, F374L, F374M, F374W, F374G, F374S, F374T, F374C, F374Y, F374N, F374E, F374K, F374R, F374H, F374D, F374Q e 5 substituição de posições 300-322, 305-322, 300-312 ou 305- 312 com os aminoácidos correspondentes de tripsina, trombina ou FX, e a substituição de posições 310-329, 311- 322 ou 233-329 com aminoácidos correspondentes da tripsina.

c. Modificações que aumentam a resistência a 10 proteases

Os polipeptídeos de FVII modificados providos aqui também podem conter modificações adicionais que resultam em aumento da resistência do polipeptideo a proteases. Por exemplo, substituições de aminoácidos podem 15 ser feitas para remover um ou mais sitios de clivagem proteolitica potenciais. Os polipeptideos de FVII modificados podem assim ser mais resistentes a proteases, aumentando assim a estabilidade e a meia-vida do polipeptideo modificado.

Exemplos de modificações adicionais que podem ser incluidas no polipeptídeos de FVII modificados providos aqui para aumentar a resistência a proteases incluem, mas não estão limitados a, aqueles descritos na Patente norte- americana n° US 5580560 ou Pedidos Publicados Internacionais n°s WO 1988010295 e WO 2002038162. Exemplos não limitativos de modificações exemplares descritas na técnica que podem resultar em aumento da resistência do polipeptideo de FVII modificado para inibidores e/ou proteases incluem uma ou mais de K32Q, K32E, K32G, K32H, K32T, K32A, K32S, K38T, K38D, K38L, K38G, K38A, K38S, K38N, K38H, I42N, I42S, I42A, I42Q, Y44N, Y44S, Y44A, Y44Q, F278S, F278A, F278N, F278Q, F278G, R290G, R290A, R290S, R290T, R290K, R304G, R304T, R304A, R304S, R304N, R315G, R315A, R315S, R315T, R315Q, Y332S, Y332A, Y332N, Y332Q, Y332G, K341E, K341Q, K341G, K341T K341A e K341S.

d. Modificações que aumentam a afinidade de fosfolipidios

Os polipeptideos de FVII modificados providos aqui também podem conter uma ou várias modificações adicionais para aumentar a afinidade com os fosfolipideos. A atividade coagulante do FVII pode ser melhorada através do aumento da ligação e/ou afinidade do polipeptideo para fosfolipidios, como aqueles expressos na superfície das plaquetas ativadas. Isto pode ser conseguido, por exemplo, modificando o domínio de Gla de FVII endógeno. A modificação pode ser feita pela substituição de aminoácido em uma ou mais posições no domínio de Gla de um polipeptideo FVII que resulta em um polipeptideo de FVII modificado capacidade aumentada de ligar fosfatidilserina e outros fosfolipidios carregados negativamente. Exemplos de modificações adicionais para aumentar a ligação e/ou afinidade para fosfolipídio e que pode ser feito para um polipeptideo de FVII modificado provido aqui que contém um domínio de Gla de FVII endógeno, incluem, mas não estão limitados a, aqueles descrito em Harvey et al. (2003) J Biol Chem 278:8363-8369, US 20030100506, US 20040220106, US 20060240526, US 6017882, US 6693075, US 6762286, WO 200393465 e WO 2004111242. Exemplares de tais modificações incluem qualquer um ou mais de uma inserção de uma tirosina na posição 4, ou modificação de qualquer um ou mais dos P10Q, P10E, P10D, PION, R28F, R28E, K32E, K32D, D33F, D33E, D33K, A34E, A34D, A34I, A34L, A34M, A34V, A34F, A34W, A34Y, R36D, R36E, K38E e K38D.

e. Modificações que alteram a glicosilação

Alteração da amplitude, nivel e/ou tipo de glicosilação de uma proteina foi descrita na técnica como um meio para reduzir a imunogenicidade, aumentar a estabilidade, reduzir a frequência de administração e/ou reduzir os efeitos colaterais adversos, tais como inflamação. Normalmente, isso é efetuado pelo aumento dos niveis de glicosilação. O sitio de glicosilação fornece um local para fixação de uma molécula de carboidcamundongo sobre o polipeptideo, tal que, quando o polipeptideo é produzido em uma célula eucariótica capaz de glicosilação, ela é glicosilada.

Há quatro sitios de glicosilação nativos em FVII; dois sitios de N-glicosilação na N 145 e N322 e dois sitios de O-glicosilação na S52 e S60, correspondendo às posições de aminoácidos no polipeptideo de FVII maduro definidas em SEQ ID NO:3. Em uma modalidade, modificações adicionais podem ser feitas para um polipeptideo de FVII modificado provido aqui tal que a glicosilação nos locais acima é interrompido. Isso pode resultar em um polipeptideo de FVII modificado com atividade coagulante aumentada (ver, por exemplo, WO 2005123916). Exemplos não limitativos de modificações exemplares descritas na técnica que pode resultar em diminuição da glicosilação e aumento da atividade do polipeptideo de FVII modificado em comparação com um polipeptideo de FVII não modificado incluem, mas não estão limitados a S52A, S60A, N145Y, N145G, N145F, N145M, N145S, N145I, N145L, N145T, N145V, N145P, N145K, N145H, N145Q, N145E, N145R, N145W, N145D, N145C, N322Y, N322G, N322F, N322M, N322S, N322I, N322L, N322T, N322V, N322P, N322K, N322H, N322Q, N322E, N322R, N322W e N322C.

Em outra modalidade, modificações adicionais podem ser feitas para a sequência de aminoácidos dos polipeptideos de FVII modificados providos aqui de modo que sítios de glicosilação adicional são introduzidos, aumentando assim o nível de glicosilação do polipeptideo de FVII modificado em comparação com um polipeptideo de FVII não modificado. O sítio de glicosilação pode ser um sítio de glicosilação N-ligado ou O-ligado. Exemplos de modificações que podem ser feitas para um polipeptideo de FVII que introduz um ou mais sítios de glicosilação novos incluem, mas não estão limitados a, aqueles que são descritos em US 6806063 e WO 200393465. Exemplos não limitativos de modificações exemplares descritos na técnica que podem resultar em aumento de glicosilação do polipeptideo de FVII modificado em comparação com um polipeptideo de FVII n]ao alterado incluem, mas não estão limitados a, F4s, F4T, P10N, Q21N, W41N, S43N, A51N, G58N, L65N, G59S, G59T, E82S, E82T, N95s N95T, G97S, G97T, YlOlN, D104N , T106N, K109N, G117N, G124N, S126N, T128N, A175S, A175T, G179N, I186S, I186T, V188N, R202S, R202T, I205S, I205T, D212N, E220N, I230N, P231N, P236N, G237N, V253N, E265N, T267N, E270N, R277N, L280N, G291N, P303S, P303ST, L305N, Q312N, G318N, G331N, D334N, K337N, G342N, H348N, R353N, Y357N, I361N, V376N, R379N, M391N, K32N/A34S, K32N/A34T, F31N/D33S. , F31N/D33I, I30N/K32S, I30N/K32T, A34N/R36S A34N/R36T, K38N/F40S, K38N/F40T, T37N/L39S, T37N/L39T, R36N/K38S, R36N/K38T, L39N/W41S, L39N/W41T, F40N/I42S, F40N/I42T, I42N/Y44S, I42N/Y44T, Y44N/D46S, Y44N/D46T, D46N/D48S, D46N/D48T, G47N/Q49S, G47N/Q49T, S52N/P54S, Q66N/Y68S, S119N/L121S, A122N/G124S, T128N/P129A, T130N/E132S, K143N/N145S, K143N/N145T, E142N/R144S, E142N/R144T, L141N/K143S, L141N/K143T, I140N/E142S, I140N/E142T, R144N/A146S, R144N/A146T, A146N/K148S, A146N/K148T, S147N/P149S, S147N/P149T, R290N/A292S, R290N/A292T, A292N/A294S, D289N/G291S, D289N/G291T, L288N/R290S, L288N/R290T, L287N/D289S, L287N/D289T, A292N/A294S, A292N/A294T, T293N/L295S, T293N/L295T, R315N/V317S, R315N/V317T, S314N/K316S, S314N/K316T, Q313N/R315S, Q313N/R315T, K316N/G318S, K316N/G318T, V317N/D319S, V317N/D319T, K341N/D343S, K341N/D343T, S339N/K341S, S339N/K341T, D343N/G345S, D343N/G345T, R392N/E394S, R392N/E394T, L390N/R392S, L390N/R392T, K389N/M391S, K389N/M391T, S393N/P395S, S393N/P395T, E394N/R396S, E394N/R396T, E394N/P395A/R396S, P395N/P397S, P395N/P397T, . R396N/G398S, R396N/G398T, P397N/V399S, P397N/V399T, G398N/L400S G398N/L400T, V399N/L401S, V399N/L401T, L400N/R402S, L400N/R402T, L401N/A403S, L401N/A403T, R402N/P404S, R402N/P404T, A403N/F405S, A403N/F405T, P404N/P406S e P404N/P406T.

f. Modificações para facilitar ligação de grupo quimico

Modificações adicionais de um polipeptideo de FVII modificado provido aqui também podem ser feitas para facilitar a ligação posterior de um grupo quimico. Uma ou mais substituições ou inserções de aminoácidos podem ser feitas de tal forma que um grupo quimico pode ser ligado a um polipeptideo de FVII modificado através da substituição do ácido aminado. Por exemplo, uma cisteína pode ser introduzida em um polipeptideo de FVII modificado, ao qual uma molécula de polietileno glicol (PEG) pode ser ligada para conferir maior estabilidade e meia-vida sérica. Outros residues de ligação incluem residues de lisina, ácido aspártico e ácido glutâmico. Em algumas modalidades, os residues de aminoácidos são substituídos para reduzir o número de posições de ligação potencial. Por exemplo, o número de lisines pode ser reduzido. Exemplos de modificações que podem ser feitas com a sequência de aminoácidos de um polipeptideo de FVII que podem facilitar a ligação posterior com um grupo quimico incluem, mas não estão limitados a, aqueles que são descritos em US 20030096338, US 20060019336, US 6806063, WO 200158935 e WO 2002077218. Exemplos não limitativos de modificações exemplares de um polipeptideos de FVII que podem facilitar ligação posterior com um grupo quimico incluem, mas não estão limitados a, Q250C, R396C, P406C, I42K, Y44K, L288K, D289K, R290K, G291K, A292K, T293K, Q313K, S314K, R315K, V317K, L390K, M391K, R392K, S393K, E394K, P395K, R396K, P397K, G398K, V399K, L400K, L401K, R402K, A403K, P404K, F405K, I30C, K32C, D33C, A34C, T37C, K38C, W41C, Y44C, S45C, D46C, L141C, E142C, K143C, R144C, L288C, D289C, R290C, G291C, A292C, S314C, R315C, K316C, V317C, L390C, M391C, R392C, S393C, E394C, P395C, R396C, P397C, G398C, V399C, L401C, R402C, A403C, P404C, I30D, K32D, A34D, T37D, K38D, W41D, Y44D, S45D, D46C, L141D, E142D, K143D, R144D, L288D, R290D, G291D, A292D, Q313D, S314D, R315D, K316D, V317D, L390D, M391D, R392D, S393D, P395D, R396D, P397D, G398D, V399D, L401D, R402D, A403D, P404D, 130E, K32E, A34E, T37E, K38E, W41E, Y44E, S45E, D46C, L141E, E142E, K143E, R144E, L288E, R290E, G291E, A292E, Q313E, S314E, R315E, K316E, V317E, L390E, M391E, R392E, S393E, P395E, R396E, P397E, G398E, V399E, L401E, R402E, A403E, P404E, K18R, K32R, K38R, K62R, K85R, K109R, K137R, K143R, K148R, K157R, K161R, K197R, K199R, K316R, K337R, K341R, K389R, K18Q, K32Q, K38Q, K62Q, K85Q, K109Q, K137Q, K143Q, K148Q, K157Q, K161Q, K197Q, K199Q, K316Q, K337Q, K341Q, K389Q, K18N, K32N, K38N, K62N, K85N, K109N, K137N, K143N, K148N, K157N, K161N, K197N, K199N, K316N, K337N, K341N, K389N, K18H, K32H, K38H, K62H, K85H, K109H, K137H, K143H, K148H, K157H, K161H, K197H, K199H, K316H, K337H, K341H e K389H.

g. Combinação de mutações exemplares

Providos aqui estão polipeptideos de FVII modificados que têm duas ou mais modificações projetadas para afetar uma ou mais propriedades ou atividades de um polipeptideo de FVII não modificado. Em alguns exemplos, as duas ou mais modificações alteram duas ou mais propriedades ou atividades do polipeptideo de FVII. As modificações podem ser feitas para os polipeptideos de FVII tal que um ou mais dentre atividade catalítica, resistência à AT-III, resistência à TFPI, resistência à inibição por Zn2+, atividade intrínseca, atividade amidolitica, ligação e/ou afinidade a fosfolipidios, glicosilação, resistência a proteases, meia-vida e interação com outros fatores ou moléculas, como FX, FIX, albumina sérica e integrina plaquetária αIIbβ3, é alterada. Normalmente, duas ou mais modificações são combinadas de tal forma que o polipeptideo de FVII modificado resultante possui atividade coagulante aumentada, duração da atividade coagulante aumentada, e/ou indice terapêutico melhorado em comparação com um polipeptideo de FVII não modificado. As modificações podem incluir a substituição inserção ou exclusão de aminoácidos. O aumento da atividade coagulante, aumento da duração da atividade coagulante e/ou um indice terapêutico melhorado do polipeptideo de FVII modificado contendo duas ou mais modificações podem ser aumentados por pelo menos cerca de 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 110%, 120%, 130%, 140%, 150%, 160%, 170%, 180%, 190%, 200%, 300%, 400%, 500% ou mais em comparação com a atividade do polipeptideo de FVIIa de partida ou não modificado.

Providos aqui estão polipeptídeos de FVII modificados que contêm duas ou mais modificações que são introduzidas em um polipeptideo de FVII modificado para alterar duas ou mais atividades ou propriedades. Os polipeptídeos de FVII modificados pode conter 2, 3, 4, 5, 6 ou mais modificações. Além disso, cada modificação pode envolver um ou mais resíduos de aminoácidos. Por exemplo, um polipeptideo de FVII modificado pode conter duas modificações cada uma das quais é uma substituição de um único aminoácido. Em outro exemplo, uma polipeptideo de FVII modificado pode conter duas modificações, uma das quais é uma única substituição de aminoácido e a outra das quais envolve exclusão de mais de um residuo de aminoácido e, em seguida, a inserção de mais de um residuo de aminoácido. Por exemplo, um polipeptideo de FVII modificado provido aqui podem conter a substituição de aminoácido S222A (resíduos correspondendo a um polipeptideo de FVII maduro definido em SEQ ID NO:3) para interromper ligação de Zn2+ e modificação de Gla troca FIX, que envolve a exclusão de dominio de Gla de FVII endógeno, excluindo os residuos de aminoácidos de Al a Y44 (residuos correspondendo a um polipeptideo de FVII maduro definido em SEQ ID NO:3) e inserção de 45 residuos de aminoácidos que correspondem a residuos de aminoácidos de Y1 a Y45 do dominio de Gla de FIX definido em SEQ ID NO:83.

Os polipeptideos de FVII modificados providos aqui podem ter duas ou mais modificações selecionadas exclusivamente daquelas definidas nas Tabelas 5 a 13. Em outros exemplos, o polipeptideo de FVII modificado contém 5 duas ou mais modificações onde uma ou mais modificações são selecionadas daquelas definidas nas tabelas 5 a 13 e uma ou mais modificações são modificações adicionais que não estão definidas nas Tabelas 5 a 13, tais como, por exemplo, modificações descritas na técnica. Em alguns exemplos, uma 10 ou mais modificações adicionais podem ser selecionadas daquelas definidas na Seção D.6.a a e, acima. Por exemplo, um polipeptideo de FVII modificado pode conter uma modificação em um ou mais residues de aminoácidos D196, K197, K199, G237, R290 T239 ou K341 com base na numeração 15 de FVII maduro definido em SEQ ID NO: 3 (correspondedo a D60, K60a, K60c, G97, T99, R147 e K192, respectivamente, com base na numeração de quimotripsina) , que pode aumentar a resistência à TFPI, e uma modificação em um ou mais resíduos de aminoácidos que afeta a atividade intrínseca, 20 como, por exemplo, V158 e M298 (V21 e M156,respectivamente, com base na numeração de quimotripsina). Por exemplo, um polipeptideo de FVII modificado pode conter duas substituições de aminoácidos que aumentam a resistência à TFPI, como K197E e G237V, e uma substituição 25 de aminoácido que aumenta a atividade intrínseca, como M298Q, resultando em um polipeptideo de FVII com atividade coagulante aumentada.

Exemplares das modificações de combinação providas aqui são aqueles que incluem pelo menos a mutação Q286R (numeração correspondendo ao polipeptideo de FVII maduro definido em SEQ ID NO:3, correspondente à Q143R pela 5 numeração de quimotripsina). Os polipeptídeos de FVII modificados contendo a modificação Q286R pode conter 1, 2, 3, 4, 5, 6 ou mais modificações adicionais. Essas modificações adicionais podem ser incluídas, por exemplo, para alterar a atividade catalítica, resistência à AT-III, 10 resistência à TFPI, resistência à inibição por Zn2+, atividade intrínseca, atividade amidolitico, ligação e/ou afinidade de fosfolipidios, glicosilação, resistência a proteases, meia-vida e interação com outros fatores ou moléculas, como o FX, FIX, albumina sérica e integrina 15 plaquetária otiibβs- Tipicamente, os polipeptídeos de FVII modificados providos aqui que contêm duas ou mais modificações, na qual uma modificação é a substituição do aminoácido Q286R, apresentam aumento da atividade coagulante em comparação com o polipeptideo de FVII do tipo 20 selvagem.

Em alguns exemplos, os polipeptídeos de FVII modificados contendo duas ou mais modificações, em que uma é Q286R, apresentam maior atividade catalitica e coagulante em comparação com o polipeptideo de tipo selvagem, assim 25 como em comparação com um polipeptideo de FVII que contenha qualquer uma dos mutações sozinha. Por exemplo, providos aqui estão polipeptídeos de FVII modificados que contêm tanto substituições de aminoácido Q286R e M289Q (Q286R/M298Q com a numeração correspondendo ao polipeptideo de FVII maduro definido em SEQ ID NO:3, correspondendo à Q143R/M156Q pela numeração de quimotripsina). O mutante de FVII de combinação de Q286R/M298Q apresenta aumento da atividade catalítica de seu substrato, Fator X, em comparação com o FVII de tipo selvagem, o mutante único de Q286R e o mutante único de M298Q (ver, por exemplo, o Exemplo 4, abaixo). Por exemplo, em um estudo, o mutante M298Q apresentou uma atividade catalítica para FX, na presença de TF, que foi cerca de 1,8 a 2 vezes maior do que o polipeptideo de tipo selvagem, a atividade catalítica do mutante Q286R foi de aproximadamente 2,1 vezes maior do que o polipeptideo de FVII do tipo selvagem, e o mutante Q286R/M298Q apresentou uma atividade catalítica para a FX que foi de cerca de 3,6-4,4 vezes maior do que a atividade catalítica do polipeptideo de tipo selvagem para o FX (ver Tabela 15, abaixo).

Modificações de combinação exemplares não limitativas são providas na Tabela 12. Essas modificações de combinação exemplares incluem duas ou mais modificações que são projetadas para alterar duas ou mais atividades ou propriedades de um polipeptideo de FVII, incluindo mas não limitado a, resistência à TFPI, resistência à AT-III, atividade intrínseca, atividade amidolítica, atividade catalítica, ligação de Zn2+, ligação e/ou afinidade de fosfolipideo, glicosilação, resistência a proteases, meia- vida e interação com outros fatores ou moléculas, tais como FX e FIX. Os polipeptídeos de FVII modificados contendo modificações de combinação pode ter aumento da atividade coagulante, aumento da duração da atividade coagulante e/ou maior indice terapêutico. As modificações definidas na Tabela 12 abaixo usam a mesma nomenclatura e sistemas de numeração, como descrito nas tabelas 5 a 11, acima. Por exemplo, a modificação de "Gla troca FIX" implica exclusão do dominio de Gla de FVII endógeno, excluindo os residues de aminoácidos de Al a Y44 (residues correspondendo a um polipeptideo de FVII maduro definido em SEQ ID NO:3) e inserção de 45 residues de aminoácidos que correspondem a residues de aminoácidos de Y1 a Y45 do dominio de Gla de FIX definido em SEQ ID NO: 83, como descrito acima. Em alguns exemplos, a modificação de "Gla troca FIX" também contém uma ou mais substituições de aminoácidos na porção do dominio de Gla de FIX em comparação com um dominio de Gla de FIX de tipo selvagem, como discutido acima. Por exemplo, a modificação de Gla troca Fix também pode incluir uma substituição do aminoácido M19K (numeração correspondendo a posições de aminoácidos do dominio de Gla de FIX definido em SEQ ID NO: 83) . Esta modificação é denotado por (Gla troca Fix/M19K), ou seja, a modificação de polipeptideo de FVII contém um dominio de Gla de FIX heterólogo em que a metionina na posição correspondente à posição 19 do dominio de Gla de FIX definido em SEQ ID NO:83 é substituído por uma lisina. Assim, as modificações feitas às porções de dominio de Gla de FIX heterólogo são referenciados usando posições de aminoácidos correspondentes às posições de aminoácidos do polipeptideo de FIX de tipo selvagem maduro, ou dominio de Gla de FIX de tipo selvagem definido em SEQ ID NO:83. As modificações feitas a posições de aminoácidos no polipeptideo FVII são referenciados usando posições de aminoácidos correspondentes às posições de aminoácidos de um polipeptideo de FVII maduro conforme definido na SEQ ID NO: 3 e também são referidos pelo esquema de numeração de quimotripsina. Por exemplo, um polipeptideo de FVII modificado contendo a modificação Q286R (numeração correspondendo ao polipeptideo de FVII maduro definido em SEQ ID NO:3), e uma modificação de Gla troca FIX, em que o dominio de Gla de FIX contém a substituição de aminoácido M19K (numeração correspondendo a posições de aminoácidos do dominio de Gla de FIX definido em SEQ ID NO:83), é denotado por {Gla troca FIX/M19K}ZQ286R. Da mesma forma, a modificação {Gla troca FIX/Q44S}/Q286R/M298Q que o polipeptideo de FVII contém uma modificação de Gla troca FIX em que a glutamina na posição de aminoácido correspondente à posição 44 do ácido aminado do dominio de Gla de FIX definido em SEQ ID NO: 83 é substituído por uma serina, e também contém a substituições de aminoácido Q286R e M298Q, com a numeração correspondendo ao polipeptideo de FVII maduro definido em SEQ ID NO:3. Na Tabela 12 abaixo, o identificador de sequência (SEQ ID NO) é identificado na qual sequências de aminoácidos exemplares do polipeptideo de FVII modificado estão definidas.Tabela 12

E. Produção de polipeptideos de FVII

Polipeptideos de FVII, incluindo polipeptideos de FVII modificados, ou dominios dos mesmos de FVII ou outro polipeptideo de vitamina K, podem ser obtidos por métodos 5 bem conhecidos na técnica para a purificação de proteinas e expressão de proteínas recombinantes. Qualquer método conhecido por aqueles versados na técnica para a identificação de ácidos nucleicos que codificam genes desejados podem ser usados. Qualquer método disponível na técnica pode ser usado para obter um comprimento total (ou seja, abrangendo toda a região de codificação) ou um polipeptídeo de FVII ou outro polipetídeo de vitamia K que codifica o clone de DNA genômico ou cDNA, tal como a partir de uma fonte de célula ou tecido, como por exemplo a partir do fígado. Polipeptídeos de FVII modificados podem ser projetados como descrito aqui, como por mutagênese sítio- dirigida.

FVII pode ser clonado ou isolado usando quaisquer métodos disponíveis e conhecidas na técnica de clonagem e isolamento de moléculas de ácido nucléico. Tais métodos incluem amplificação PCR de ácidos nucleicos e seleção de bibliotecas, incluindo seleção de hibridização de ácido nucléico, seleção baseada em anticorpos e seleção baseada em atividades.

Métodos para a amplificação de ácidos nucléicos podem ser usados para isolar as moléculas de ácido nucléico que codificam um polipeptídeo de FVII, incluindo, por exemplo, métodos de reação em cadeia da polimerase (PCR). Um ácido nucléico contendo material pode ser usado como material de partida a partir da qual uma molécula de ácido nucléico que codifica FVII pode ser isolada. Por exemplo, preparações de DNA e mRNA, extcamundongos celulares, extcamundongos de tecidos (por exemplo, do fígado), amostras de fluido (por exemplo, sangue, soro, saliva),amostras de indivíduos saudáveis e/ou doentes podem ser usadas em métodos de amplificação. As bibliotecas de ácido nucléico também podem ser usadas como fonte de material de partida. Primers podem ser projetados para amplificar uma molécula que codifica FVII. Por exemplo, os primers podem ser projetadas com base em sequências expressas a partir da qual um FVII é gerado. Primers podem ser projetados com base na tradução de volta de uma sequência de aminoácido de FVII. As moléculas de ácido nucléico geradas por amplificação podem ser sequenciadas e confirmadas para codificar um polipeptideo de FVII.

Sequências de nucleotideos adicionais podem ser unidas a uma molécula de ácido nucléico que codifica FVII, incluindo sequências de ligante contendo sítios de endonuclease de restrição com o objetivo de clonar o gene sintético em um vetor, por exemplo, um vetor de expressão de proteína ou um vetor projetado para a ampliação da proteína do núcleo que codifica sequências de DNA. Além disso, sequências de nucleotideos adicionais especificando elementos funcionais de DNA podem ser operativamente ligadas a uma molécula de ácido nucléico que codifica FVII. Exemplos de tais sequências incluem, mas não estão limitadas a, sequências promotoras projetadas para facilitar a expressão da proteína intracelular, e sequências secretoras projetadas para facilitar a secreção de proteínas. Sequências de nucleotideos adicionais, tais como sequências especificando regiões ligação de proteínas também podem ser ligados a moléculas de ácido nucléico que limitadas a, sequências para facilitar a absorção de FVII em células-alvo especificas, ou de outra forma melhorar a farmacocinética do gene sintético.

Os ácidos nucléicos identificados e isolados podem então ser inseridos em um vetor de clonagem apropriado. Um grande número de sistemas hospedeiro-vetor conhecidos na técnica pode ser usado. Possiveis vetores incluem, mas não estão limitados a, plasmideos ou virus modificados, mas o sistema de vetor deve ser compatível com a célula hospedeira utilizada. Tais vetores incluem, mas não estão limitados a, bacteriófagos, tais como derivados lambda, ou plasmideos como derivados de plasmídeo pBR322 ou pUC ou o vetor BlueScript (Stratagene, La Jolla, CA). A inserção em um vetor de clonagem pode, por exemplo, ser realizada pela ligação do fragmento de DNA em um vetor de clonagem que tem terminais coesos complementares. A inserção pode ser efetuada através de vetores de clonagem TOPO (Invitrogen, Carlsbad, CA). Se os sítios de restrição complementares utilizados para fragmentar o DNA não estão presentes no vetor de clonagem, as extremidades das moléculas de DNA podem ser enzimaticamente modificadas. Alternativamente, qualquer sítio desejado pode ser produzido pela ligação de sequência de nucleotideos (ligantes) sobre os términos de DNA, esses ligantes ligados podem conter sequências de reconhecimento de endonuclease de restrição de codificação de oligonucleotídeos quimicamente sintetizados específicos. Em um método alternativo, o vetor clivado e gene de proteína de FVII podem ser modificados por terminação homopolimérica. Moléculas recombinantes podem ser introduzidas nas células hospedeiras através, por exemplo, da transformação, transfecção, infecção, eletroporação e sonoporação, de modo que várias cópias da sequência do gene são geradas.

Em modalidades especificas, a transformação das células hospedeiras com as moléculas de DNA recombinante que incorporam o gene de proteína de FVII isolado, cDNA, ou sequência de DNA sintetizada permite a geração de múltiplas cópias do gene. Assim, o gene pode ser obtido em grandes quantidades por transformantes de crescimento, isolando as moléculas de DNA recombinante dos transformantes e, quando necessário, a recuperação do gene inserido a partir do DNA recombinante isolado.

1. Vetores e células

Para a expressão recombinante de uma ou mais das proteínas FVII, o ácido nucléico contendo toda ou uma parte da sequência de nucleotideos que codifica a proteína de FVII pode ser inserida em um vetor de expressão adequado, ou seja, um vetor que contém os elementos necessários para a transcrição e tradução da sequência de codificação da proteína inserida. Exemplares de tal vetor é qualquer vetor de expressão em mamíferos, tais como, por exemplo, pCMV. Os sinais transcripcional e traducional necessários também podem ser fornecidos pelo promotor nativo de genes de FVII e/ou suas regiões flanqueadoras.

Também são providos vetores que contêm ácido nucléico que codifica o FVII ou FVII modificado. As células que contêm os vetores são também providas. As células incluem as células eucarióticas e procarióticas, e os vetores são qualquer um adequados para qualquer uso no presente documento.

As células procarióticas e eucarióticas, incluindo células endoteliais, contendo os vetores são providas. Essas células incluem as células de bactérias, células de leveduras, células de fungos, Archea, células vegetais, células de insetos e células de origem animal. As células são usadas para produzir um polipeptideo de FVII ou polipeptideo de FVII modificado da mesma pelo crescimento das células acima descritas nas condições em que a proteina de FVII codificada é expressa pela célula, e recuperando a proteina de FVII expressa. Para os fins deste documento, o FVII pode ser secretado para o meio.

Em uma modalidade, Os vetores contendo uma sequência de nucleotideos que codifica um polipeptideo que tem a atividade de FVII e contém todo ou uma parte do polipeptideo de FVII, ou várias cópias do mesmo, são providos. Os vetores podem ser selecionadas para a expressão do polipeptideo de FVII ou polipeptideo de FVII modificado do mesmo na célula ou de tal forma que a proteina de FVII é expressa como uma proteina secretada. Quando o FVII é expresso o ácido nucléico está ligado ao ácido nucléico que codifica um sinal de secreção, como a sequência de sinal de fator α-cruzamento de Saccharomyces cerevisiae ou parte da mesma, ou a sequência de sinal nativa.

Uma variedade de sistemas hospedeiro-vetor pode ser usada para expressar a sequência de codificação de proteína. Esses incluem, mas não estão limitados a, sistemas de células de mamíferos infectadas com vírus (por exemplo, vírus vaccinia, adenovirus e outros vírus); sistemas de células de inseto infectadas com vírus (baculovírus, por exemplo); microorganismos como leveduras contendo vetores de leveduras; ou bactéria transformada com bacteriófago, DNA, DNA plasmidial, ou DNA cosmídeo. Os elementos de expressão dos vetores variam em seus pontos fortes e suas especificidades. Dependendo do sistema hospedeiro-vetor usado, qualquer um de um número adequado de elementos de transcrição e tradução podem ser usados.

Quaisquer métodos conhecidos para aqueles versados na técnica para a inserção de fragmentos de DNA em um vetor pode ser usado para construção de vetores de expressão contendo um gene quimérico contendo sinais de controle transcricional/traducional apropriados e sequências que codificam proteínas. Esses métodos podem incluir DNA recombinante in vitro e técnicas sintéticas e recombinantes in vivo (recombinação genética). Expressão de sequências de ácido nucléico que codificam um polipeptideo de FVII ou polipeptideo de FVII modificado, ou domínios, derivados, fragmentos ou homólogos do mesmo, pode ser regulada por uma segunda sequência de ácido nucléico de modo que os genes ou fragmentos dele são expressos em um hospedeiro transformado com a molécula de DNA recombinante. Por exemplo, a expressão das proteínas pode ser controlada por qualquer promotor/melhorador conhecido na técnica. Em uma modalidade especifica, o promotor não é nativo para os genes de uma proteina de FVII. Os promotores que podem ser usados incluem mas não estão limitados ao promotor SV40 precoce (Bernoist e Chambon, Nature 290:304-310 (1981)), o promotor contido na repetição terminal 3' do comprimento do virus do sarcoma de Rous (Yamamoto et al Cell 22:781-791 (1980)), o promotor de quinase timidina de herpes (Wagner et al. Proc. Natl. Acad. Sei, EUA 75:1441-1445 (1981)), as sequências regulatórias do gene da metalotioneina (Brinster et al., Nature 296:39-42 (1982)); vetores de expressão procariótica, como o promotor de β-lactamase (Jay et al, (1981) Proc Natl Acad Sei EUA 78:5543) ou o promotor tac (DeBoer et al, Proc Natl Acad Sei EUA 80:21-25 (1983)), ver também "Useful Proteins from Recombinant Bacteria", em Scientific American 242:79-94 (1980)), vetores de expressão de plantas contendo o promotor sintetase nopalina (Herrar- Estrella et al, Nature 303:209-213 (1984).) ou o virus do mosaico couve-flor do promotor do RNA 35S (Garder et al, Nucleic Acids Res. 9:2871 (1981)), e o promotor de carboxilase bisfosfato ribulose de enzima fotossintética (Herrera-Estrella et al, Nature 310:115-120 (1984)); elementos de promotor de leveduras e outros fungos, como o promotor Gal4, o promotor de desidrogenase alcoólica, o promotor de quinase fosfoglicerol, o promotor de fosfatase alcalina, e as regiões de controle transcricional dos seguintes animais que apresentam especificidade de tecido e têm sido utilizados em animais transgênicos: região de controle de gene I de elastase que é ativa em células acinares pancreáticas (Swift et al, Cell 38:639-646 (1984); Ornitz et al, Cold Spring Harbor Symp Quant Biol 50:399-409 (1986); MacDonald, Hepatology 7:425-515 (1987)); região de controle do gene de insulina que está ativa em células beta pancreáticas (Hanahan et al, Nature 315:115-122 (1985)), região de controle do gene de imunoglobulina que está ativa em células linfóides (Grosschedl et al, Cell 38:647-658 (1984), Adams et al, Nature 318:533-538 (1985); Alexander et al, Mol. Cell Biol. 7:1436-1444 (1987)), região de controle do vírus de tumor mamário de camundongo que está ativa em células de testículo, peito, linfóides e mama (Leder et al, Cell 45:485-495 (1986)), região de controle do gene de albumina que está ativa no fígado (Pinckert et al, Genes e Devei. 1:268-276 (1987)), a região de controle do gene de alfa-f etoproteína que está presente no fígado (Krumlauf et al, Mol Cell Biol 5:1639-1648 (1985); Hammer et al, Science 235:53-58, 1987)), região de controle do gene de alfa-1 antitripsina que está ativa no fígado (Kelsey et al, Genes e Devei. 1:161-171 (1987)), região de controle do gene de beta-globina que está ativa em células mielóides (Mogram et al, Nature 315:338-340 (1985); Kollias et al, Cell 46:89-94 (1986)), região de controle do gene de proteína básica de mielina que é ativa em células oligodendrócitas do cérebro (Readhead et al, Cell 45:703- 712 (1987)), região de controle do gene de miosina de cadeia leve-2 que está tiva no músculo esquelético (Shani, Nature 374:283-286 (1985)) e região de controle do gene de liberação do hormônio gonadotrófico que está ativa em gonadotrofos do hipotálamo (Mason et al, Science 234:1372- 1378 (1986)).

Em uma modalidade especifica, um vetor é usado que contém um promotor operavelmente ligado a ácidos nucléicos que codificam um polipeptideo de FVII ou polipeptideo de FVII modificado, ou um dominio, fragmento, derivados ou homólogo do mesmo, uma ou mais origens de replicação e, opcionalmente, um ou mais marcadores selecionáveis (por exemplo, um gene de resistência a antibióticos). Vetores e sistemas para a expressão de polipeptideos de FVII incluem os vetores de Pichia bem conhecidos (disponível, por exemplo, da Invitrogen, San Diego, CA), particularmente aqueles projetados para a secreção das proteinas codificadas. Vetores de expressão de plasmideo exemplares em células de mamíferos incluem, por exemplo, pCMV. Vetores de plasmideo exemplares para a transformação de células de E. coli, incluem, por exemplo, os vetores de expressão pQE (disponível de Qiagen, Valencia, CA, ver também literatura publicada pela Qiagen descrevendo o sistema). Vetores pQE têm um fago promotor T5 (reconhecido pelo polimerase de RNA de E. coli) e um módulo de repressão operador lac duplo para fornecer rigorosamente regulada, expressão de alto nivel de proteinas recombinantes em E. coli, um local de ligação ribossomal sintético (RBS II) para tradução eficiente, uma sequência de codificação de marca 6XHis, terminadores de transcrição to e Tl, origem ColEl de replicação, e um gene de beta- lactamase que confere resistência a ampicilina. Os vetores pQE permitem a colocação de uma marca 6xHis em cada N- ou C-terminal da proteina recombinante. Tais plasmideos incluem pQE 32, pQE 30 e pQE31 que fornecem múltiplos sitios de clonagem para todos os três quadros de leitura e fornecem para a expressão das proteinas marcadas 6xHis N- terminal. Outros vetores de plasmideo exemplares para a transformação de células de E. coli, incluem, por exemplo, os vetores de expressão pET (ver, patente US 4.952.496; disponível de NOVAGEN, Madison, WI, ver, também literatura publicada pela Novagen descrevendo o sistema). Tais plasmideos incluem pET 11a, que contém o promotor T71ac, terminador T7, operador lac de E. coli induzível, e o gene repressor lac; pET 12a-c, que contém o promotor T7, terminator T7, e o sinal de secreção ompT de E. coli, e pET 15b e pET19b (Novagen, Madison, WI), que contêm uma sequência líder His-Tag™ para uso em purificação com coluna His e um local de clivagem da trombina, que permite a purificação seguida de clivagem sobre a coluna, a região do promotor T7-lac e do terminador T7.

2. Sistemas de Expressão

Polipeptídeos de FVII (modificados e não modificados) podem ser produzidos por qualquer método conhecido na técnica de produção de proteína, incluindo métodos in vitro e in vivo,' como, por exemplo, a introdução de moléculas de ácido nucléico que codificam FVII em uma célula hospedeira, animal hospedeiro e expressão de moléculas de ácido nucléico que codificam FVII in vitro.

FVII e polipeptideos de FVII modificados podem ser expressos em qualquer organismo adequado para produzir as quantidades necessárias e as formas de um polipeptideo de FVII necessárias à administração e tratamento. Hospedeiros de expressão incluem organismos procarióticos e eucarióticos, como E. coli, levedura, plantas, células de insetos, células de mamíferos, incluindo linhagens de células humanas e animais transgênicos. Hospedeiros de expressão podem diferir em seus niveis de produção de proteina, bem como os tipos de modificações pós- translacionais que estão presentes nas proteinas expressas. A escolha do hospedeiro de expressão pode ser feita com base nestes e em outros fatores, como as considerações de regulamentação e segurança, os custos de produção e a necessidade e métodos para a purificação.

Expressão em hospedeiros eucarióticos pode incluir a expressão em leveduras, como Saccharomyces cerevisiae e Pichia pastoria, células de insetos, como as células de Drosophila e células de lepidópteros, plantas e células vegetais, como tabaco, milho, arroz, algas e Lemna. Células eucarióticas para a expressão também incluem as linhas de células de mamiferos, como células de ovário de hamster chinês (CHO) ou dos rins do bebê hamster (BHK) . Hospedeiros de expressão eucariótica também inclui a produção de animais transgênicos, por exemplo, incluindo a produção em soro, leite e ovos. Os animais transgênicos para a produção de polipeptideos de FVII de de tipo selvagem são conhecidos na técnica (Patente US Publicação n°s 20020166130 e 20040133930) e pode ser adaptado para a produção de polipeptídeos de FVII modificados providos aqui .

Muitos vetores de expressão estão disponíveis e 5 são conhecidos por aqueles versados na técnica para a expressão de FVII. A escolha do vetor de expressão é influenciada pela escolha do sistema de expressão de hospedeiro. Essa seleção está bem dentro do nível de conhecimento do técnico versado na arte. Em geral, os 10 vetores de expressão podem incluir promotores de transcrição e opcionalmente melhoradores, sinais de translação, e os sinais de terminação da transcrição e translação. Vetores de expressão que são usados para a transformação estável geralmente têm um marcador de 15 selecção que permite a seleção e manutenção de células transformadas. Em alguns casos, uma origem de replicação pode ser usada para ampliar o número de cópias dos vetores nas células.

Polipeptídeos de FVII ou de FVII modificados 20 também podem ser utilizados ou expressos como fusões de proteínas. Por exemplo, uma fusão pode ser gerada para adicionar nova funcionalidade a um polipeptídeo. Exemplos de proteínas de fusão incluem, mas não estão limitados a, fusões de uma sequência de sinal, uma marca como, para 25 localização, por exemplo, uma marca hisg ou uma marca myc, ou uma marca para a purificação, por exemplo, uma fusão GST, e uma sequência para direcionar a secreção de proteínas e/ou associação de membrana.

Em uma modalidade, o polipeptideo de FVII ou polipeptídeos de FVII modificados podem ser expressos de forma ativa, em que a ativação é realizada por autoativação do polipeptideo seguida de secreção. Em outra modalidade, a protease é expressa em uma forma de zimogênio, inativa.

Métodos de produção de polipeptídeos de FVII podem incluir coexpressão de um ou mais polipeptídeos heterólogos adicionais que podem auxiliar na geração de polipeptídeos de FVII. Por exemplo, tais polipeptídeos podem contribuir para o processamento pós-tradução dos polipeptídeos de FVII. Polipeptídeos exemplares incluem, mas não estão limitados a, peptidases que ajudam a clivar sequências de precursor de FVII, como a sequência de propeptídeo, e enzimas que participam na modificação do polipeptideo de FVII, como por glicosilação, hidroxilação, carboxilação, ou fosforilação, por exemplo. Uma peptidase exemplar que pode ser coexpressada com FVII é PACE/furina (ou PACE-SOL), que auxilia na clivagem da sequência de propeptideo de FVII. Uma proteína exemplar que ajuda na carboxilação do polipeptideo de FVII é redutase de 2,3- epóxido de vitamina K de enzima sensível a varfarina (VKOR), que produz vitamina K reduzida para utilização como um cofactor pela y-carboxilase dependente de vitamina K (Wajih et al, J. Biol Chem 280 (36) 31603-31607). Uma subunidade desta enzima, VKORC1, pode ser coexpressada com o polipeptideo de FVII modificado para aumentar a y- carboxilação. Um ou mais polipeptídeos adicionais podem ser expressos a partir do mesmo vetor de expressão que o polipeptídeo de FVII ou de um vetor diferente.

a. expressão procariótica

Procariontes, especialmente E. coli, fornecem um sistema para produzir grandes quantidades de FVII (ver, por exemplo, Platis et al (2003) Proteina Exp Purif 31 (2):222- 30; e Khalilzadeh et al (2004) J. Ind Microbiol Biotechnol 31 (2):63-69).

Transformação de E. coli é uma técnica simples e rápida bem conhecida daqueles versados na técnica. Vetores de expressão de E. coli podem conter promotores induziveis que são úteis para induzir altos niveis de expressão de proteínas e expressão de proteínas que apresentam alguma toxicidade de para as células hospedeiras. Exemplos de promotores induziveis incluem o promotor lac, o promotor trp, o promotor tac híbrido, os promotores de RNA T7 e SP6 e o promotor A,PL de temperatura regulada.

FVII pode ser expresso no ambiente citoplasmático de E. coli. O citoplasma é um ambiente de redução e para algumas moléculas, isso pode resultar na formação de corpos de inclusão insolúveis. Os agentes redutores tais como ditiotreitol e β-mercaptoetanol e desnaturantes (por exemplo, como a guanidina-HCl e uréia) pode ser utilizado para dissolver as proteinas. Uma abordagem alternativa é a expressão de FVII no espaço periplásmico de bactérias que fornece um ambiente oxidante e semelhante a chaperonina e isomerases de dissulfeto conduzem à produção de proteína solúvel. Normalmente, uma sequência líder é fundida com a proteina a ser expressa, que direciona a proteina para o periplasma. O lider é então removido por peptidases de sinal dentro do periplasma. Exemplos de sequências lider de direção de periplasma incluem o lider pelB do gene de pectato liase e o lider derivado de gene da fosfatase alcalina. Em alguns casos, a expressão de periplasma permite a liberação da proteina expressa em meio de cultura. A secreção de proteinas permite a purificação rápida e simples a partir do sobrenadante da cultura. Proteinas que não são secretadas podem ser obtidas no periplasma por quebra osmótica. Semelhante à expressão citoplasmática, em alguns casos as proteinas podem se tornar insolúveis e desnaturantes e agentes redutores podem ser usados para facilitar a solubilização e renaturação. A temperatura de indução e crescimento também pode influenciar os niveis de expressão e solubilidade. Tipicamente, as temperaturas entre 25 °C e 37 °C são usadas. As mutações também podem ser usadas para aumentar a solubilidade de proteinas expressas. Normalmente, as bactérias produzem proteinas aglicosiladas. Dessa forma, se as proteinas exigem glicosilação para a função, a glicosilação pode ser adicionada in vitro após a purificação de células hospedeiras.

b. Levedura

As leveduras, como Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, Yarrowia lipolytica, Kluyveromyces lactis, e Pichia pastoris são hospedeiros expressão úteis para FVII (ver, por exemplo, Skoko et al. (2003) Biotechnol. Appl. Biochem 38(Pt3):257-65). A levedura pode ser transformada com vetores de replicação episomal ou pela integração cromossomal estável por recombinação homóloga. Normalmente, os promotores induziveis são usados para regular a expressão do gene. Exemplos de tais promotores incluem Gall, GAL7 e GAL5 e promotores de metalotioneina como CUP1. Vetores de expressão incluem frequentemente um marcador de seleção, tais como LEU2, TRP1, HIS3 e URA3 para a seleção e manutenção do DNA transformado. Proteinas expressas em levedura são frequentemente solúveis e coexpressão com chaperoninas, como Bip e isomerase dissulfeto de proteina, podem melhorar os niveis de expressão e solubilidade. Além disso, as proteinas expressas em levedura pode ser direcionadas para a secreção usando fusões de peptideo de sinal de secreção, como o sinal de secreção de fator tipo alfa de emparelhamento de Saccharomyces cerevisiae e fusões com as proteinas da superfície celular de leveduras, como o receptor de adesão de emparelhamento Aga2p ou glicoamilase de Arxula adeninivorans. Um sítio de clivagem da protease (por exemplo, o protease Kex-2) pode ser projetado para remover as sequências fundida de polipeptídeos quando elas saem da via de secreção. A levedura também é capaz de glicosilação em motivos Asn-X-Ser/Thr.

c. Insetos e células de inseto

Insetos e células de insetos, especialmente usando um sistema de expressão de baculovírus, são úteis para expressar polipeptídeos, tais como FVII ou formas modificadas do memso (ver, por exemplo, Muneta et al. (2003) J. Vet. Med. Sci. 65 (2) :219-23) . Células de inseto e larvas de insetos, incluindo a expressão na hemolinfa, expressam altos niveis de proteina e são capazes da maioria das modificações pós-translacionais usadas por eucariotos superiores. Baculovirus têm uma gama de hospedeiros restritivos que melhora a segurança e reduz preocupações regulatórias de expressão eucarióticas. Normalmente, os vetores de expressão usam um promotor como o promotor da poliedrina do baculovirus para a expressão de alto nivel. Sistemas de baculovirus' usados comumente incluem baculovirus como virus da poliedrose nuclear de Autographs californica (AcNPV), e o virus da poliedrose nuclear de Bombyx mori (BmNPV) e uma linhagem de células de inseto, como Sf9 derivado de Spodoptera frugiperda, Pseudaletia unipuncta (A7S) e Danaus plexippus (DpNl). Para a expressão de alto nivel, a sequência de nucleotideos da molécula a ser expressa é fundida imediatamente a jusante do códon de iniciação de poliedrina do virus. Sinais de secreção de mamíferos são cuidadosamente processados em células de inseto e podem ser usados para secretar a proteina expressa em meio de cultura. Além disso, as linhagens de células Pseudaletia unipuncta (A7S) e Danaus plexippus (DpNl), produzem proteinas com padrões de glicosilação semelhante aos sistemas de células de mamiferos.

Um sistema de expressão alternativo em células de inseto é a utilização de células estavelmente transformadas. As linhagens de célula, como o Schnieder 2 (S2) e células Kc {Drosophila melanogaster) e células C7 {Aedes albopictus) podem ser usadas para a expressão. 0 promotor de metalotioneina de Drosophila pode ser usado para induzir altos niveis de expressão na presença de indução de metal pesado com cádmio e cobre. Vetores de expressão são normalmente mantidos pelo uso de marcadores selecionáveis, tais como a neomicina e higromicina.

d. Células de mamíferos

Sistemas de expressão de mamífero podem ser usadas para expressar polipeptideos de FVII. Construtos de expressão podem ser transferidos para células de mamíferos por infecção viral, como o adenovirus ou por transferência direta de DNA, tais como lipossomas, fosfato de cálcio, DEAE-dextrano e por meios físicos, tais como eletroporação e microinjeção.

Vetores de expressão para células de mamíferos geralmente incluem um sítio de tampa de mRNA, uma caixa TATA, uma sequência de iniciação de translação (sequência de consenso Kozak) e elementos de poliadenilação. Tais vetores incluem frequentemente promotor-melhorador transcricional de expressão de alto nível, por exemplo, o promotor-melhorador SV40, o promotor de citomegalovírus humano(CMV) e a repetição longa de terminal do vírus do sarcoma de Rous (RSV). Estes promotor-melhoradors são ativos em vários tipos celulares. Regiões de melhorador e promotores tipo célula e tecido também podem ser usadas para a expressão. Regiões promotor/melhorador exemplares incluem, mas não estão limitadas a, aquelas a partir de genes, como elastase I, insulina, imunoglobulina, virus do tumor mamário de camundongo, albumina, alfa-fetoproteina, alfa 1-antitripsina, beta-globina, a proteina básica da mielina, a miosina de cadeia leve-2, e controle do gene do 5 hormônio de liberação gonadotrófico. Marcadores selecionáveis podem ser utilizados para seleccionar e manter as células com o construto de expressão. Exemplos de genes marcadores selecionáveis incluem, mas não estão limitados a, higromicina B, fosfotransferase, adenosina 10 deaminase, xantina-guanina fosforribosil transferase, fosfotransferase aminoglicosideos, dihidrofolato reductase e timidina quinase. Fusão com moléculas sinalizadoras da superficie celular como TCR-^ e FcεRI-y pode direcionar a expressão das proteinas em um estado ativo na superficie da 15 célula.

Muitas linhagens de células estão disponíveis para a expressão de mamiferos, incluindo células de camundongo, camundongo humano, macaco e frango e hamster. Linhagens de células exemplares incluem, mas não estão 20 limitados a, BHK (ou seja, células BHK-21), 293-F, CHO, BalB/3T3, HeLa, MT2, NSO de camundongo (não-secretores) e outras linhagens de células de mieloma, linhagens de células de hibridoma e heterohibridoma, linfócitos, fibroblastos, Sp2/0, células COS, NIH3T3, HEK293, 293S, 293T, 2B8 e HKB. As linhagens de células também estão disponíveis adaptadas aos meios livres de soro, o que facilita a purificação de proteinas secretadas a partir do meio de cultura celular. Um exemplo disto é a linhagem de células EBNA-1 livre de soro (Pham et al. (2003) Biotechnol Bioeng. 84:332-42). Expressão de polipeptídeos de FVII recombinantes exibindo estrutura semelhante e modificações pós-translacionais como FVII derivados do plasma são conhecidas na técnica (ver, por exemplo, Jurlander et al. (2003) Semin Throm Hemost). Métodos de otimização da expressão da proteína dependente de vitamina K são conhecidos. Por exemplo, a suplementação de vitamina K em meio de cultura ou coexpressão y-carboxylases dependentes de vitamina K (Wajih et al, J. Biol. Chem. 280 (36) 31603- 31607) pode auxiliar na modificação pós-traducional de proteínas dependentes de vitamina K, tais como polipeptídeos de FVII.

e. Plantas

Células de plantas transgênicas e plantas podem ser utilizadas para a expressão de FVII. Construtos de expressão são normalmente transferidos para plantas utilizando a transferência direta de DNA, como o bombardeio de microprojéteis e transferência mediada por PEG em protoplastos, e com a transformação mediada por Agrobacterium. Vetores de expressão podem incluir sequências de promotor e melhorador, elementos de terminação da transcrição, e elementos de controle de translação. Vetores dé expressão e técnicas de transformação são geralmente divididos entre hospedeiros de dicotiledôneas, como Arabidopsis e tabaco, e os hospedeiros de monocotiledôneas, como milho e arroz. Exemplos de promotores de plantas utilizados promotor do vírus do mosaico couve-flor, promotor da sintase nopalina, promotor carboxilase ribose bisfosfato e promotores de ubiquitina e UBQ3. Marcadores selecionáveis, tais como higromicina, isomerase fosfomanose e neomicina fosfotransferase são frequentemente utilizados para facilitar a seleção e manutenção de células transformadas. Células vegetais transformadas podem ser mantidas em cultura como células, agregados (tecido de caule) ou regeneradas em plantas inteiras. Como as plantas têm diferentes graus de glicosilação em relação a células de mamíferos, isso pode influenciar na escolha de produzir FVII nestes hospedeiros. Células de plantas transgênicas também podem incluir as algas projetadas para produzir proteínas (ver, por exemplo, Mayfield et al. (2003) PNAS 100:438-442). Como as plantas têm diferentes graus de glicosilação de células de mamíferos, isso pode influenciar na escolha de produzir FVII nestes hospedeiros.

2. Purificação

Métodos para purificação de polipeptideos de FVII de células de hospedeiro dependem da célula hospedeira escolhida e sistemas de expressão. Para moléculas secretadas, as proteínas são geralmente purificadas a partir do meio de cultura após a remoção das células. Para a expressão intracelular, as células podem ser rompidas e as proteínas purificadas a partir do extcamundongo. Quando os organismos transgênicos, como plantas e animais transgênicos são utilizados para a expressão, tecidos ou órgãos podem ser utilizados como material de partida para fazer um extcamundongo de célula rompida. Além disso, a produção de animais transgênicos que podem incluir a produção de polipeptideos no leite ou ovos, que podem ser recolhidos e, se necessário adicionalmente as proteinas 5 podem ser extraídas e posteriormente purificados utilizando métodos padronizados na técnica.

FVII pode ser purificado através de técnicas de purificação de proteina padrão conhecido na arte, incluindo mas não limitado a, SDS-PAGE, a fração de tamanho e 10 cromatografia por exclusão de tamanho, a precipitação de sulfato de amónio, cromatografia de quelato e cromatografia de troca iônica. Por exemplo, os polipeptideos de FVII podem ser purificados por cromatografia de troca aniônica. Exemplar de um método para purificar polipeptideos de FVII 15 é usando uma coluna de troca iônica que permita a ligação de qualquer polipeptideo que tem um dominio de Gla funcional, seguido pela eluição na presença de cálcio (Ver, por exemplo, Exemplo 2). Técnicas de purificação de afinidade também pode ser usadas para melhorar a eficiência 20 e pureza das preparações. Por exemplo, anticorpos, receptores e outras moléculas que se ligam a FVII podem ser usados na purificação de afinidade. Em outro exemplo, a purificação também pode ser melhorada usando uma coluna de afinidade TF solúvel (sTF) (Maun et al. (2005) Prot Sçi. 14:1171-1180). Construtos de expressão também podem ser projetados para adicionar uma marca de afinidade, como um epitopo myc, fusão GST ou His6 e purificado por afinidade com o anticorpo myc, resina de glutationa, e resina Ni, respectivamente, a uma proteína. Pureza pode ser avaliada por qualquer método conhecido na técnica como eletroforese em gel e técnicas de coloração e espectrofotométricas.

A protease de FVII pode ser expressa e purificada para a forma inativa (forma zimogênio) ou alternativamente, a protease expressa pode ser purificada em uma forma ativa, como por autocatálise. Por exemplo, os polipeptídeos de FVII que foram ativados através de clivagem proteolitica do Arg152-Ile153 podem ser preparados in vitro (isto é, FVIIa, forma de duas correntes) . Os polipeptídeos de FVII podem ser preparados por qualquer um dos métodos de produção aqui descritos, incluindo mas não limitados a, produção em células de mamíferos, seguida de purificação. A clivagem dos polipeptídeos de FVII na forma ativa de protease, FVIIa, pode ser realizada por vários meios. Por exemplo, autoativação durante a incubação com vesículas de fosfolipídios na presença de cálcio pode ser obtida em 45 minutos (Nelsestuen et al. (2001) J Biol Chem 276:39825-31) . Os polipeptídeos de FVII também podem ser ativados para a conclusão de incubação com o fator Xa, fator Xlla ou TF na presença de cálcio, com ou sem fosfolipídios (ver, por exemplo, Exemplo 2 e Broze et al (1980) J Biol Chem 255:1242-1247, Higashi et al. (1996) J Biol Chem 271:26569- 26574 Harvey et al. J Biol Chem 278:8363-8369).

3. Proteinas de Fusão

Proteínas de fusão contendo um polipeptideo de FVII modificado e um ou mais outros polipeptídeos também são providos. As composições farmacêuticas contendo tais proteínas de fusão formuladas para a administração por uma via adequada são providas. As proteínas de fusão são formadas por ligação em qualquer ordem de polipeptídeo de FVII modificado e um agente, tal como um anticorpo ou fragmento do mesmo, fator de crescimento, receptor, ligante e outros tais agente para efeitos de facilitar a purificação de um polipeptídeo de FVII, alterando as propriedades farmacodinâmicas de um polipeptídeo de FVII, orientando, por exemplo, o polipeptídeo para uma célula ou tecido alvo, e/ou aumentando a expressão ou secreção do polipeptídeo de FVII. Normalmente nenhuma proteína de fusão de FVII retém pelo menos cerca de 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ou 95% de atividade coagulante em relação a um polipeptídeo de FVII não fusão, incluindo 96%, 97%, 98%, 99% ou maior de atividade coagulante em comparação com um polipeptídeo não fusão.

Ligação de um polipeptídeo de FVII com outro polipeptídeo pode ser efetuada diretamente ou indiretamente através de um ligante. Em um exemplo, a ligação pode ser feita por ligação química, como através dos agentes heterobifuncionais ou ligações tiol ou outras ligações desse tipo. A fusão também pode ser efetuada por meio de recombinante. A fusão de um polipeptídeo de FVII a outro polipeptídeo pode ser no N- ou C-terminal do polipeptídeo de FVII. Exemplos não limitadores de polipeptídeos que podem ser usados em proteínas de fusão com um polipeptídeo de FVII aqui provido incluem, por exemplo, um polipeptídeo imunoglobulina G ou uma sequência de sinais heteróloga. As proteinas de fusão podem conter componentes adicionais, tais como maltose de Escherichia Coli ligando proteinas (MBP) que ajudam na absorção das proteinas pelas células {ver, pedido internacional PCT No. WO 01/32711).

Uma proteina de fusão pode ser produzida por técnicas padrão de recombinante. Por exemplo, fragmentos de DNA que codificam as sequências de polipeptideos diferentes podem ser ligados entre si no quadro, de acordo com as técnicas convencionais, por exemplo, através do emprego de términos franco-terminados ou escalonado-terminado para a ligação, a digestão com enzimas de restrição para prover términos adequados, preenchendo de terminações coesas conforme o caso, tratamento da fosfatase alcalina a fim de evitar indesejáveis ligações e ligações enzimáticas. Em outra modalidade, o gene de fusão pode ser sintetizado por técnicas convencionais, incluindo sintetizadores automáticos de DNA. Alternativamente, amplificação PCR de fragmentos de DNA pode ser realizada utilizando primers âncora que dão origem aos balanços de complementaridade entre dois fragmentos de genes consecutivos que podem ser posteriormente anelados e reamplifiçados para gerar uma sequência de genes quiméricos (ver, por exemplo, Ausubel et al. (Eds.) CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, John Wiley & Sons, 1992). Além disso, muitos vetores de expressão estão comercialmente disponíveis que já codificam uma molécula de fusão (por exemplo, um polipeptideo de GST) . Um FVII que codifica ácidos nucléicos pode ser clonado em um vetor de expressão de tal modo que a porção de fusão é vinculada no quadro à proteina protease.

4. Modificação de Polipeptideo

Polipeptídeos de FVII modificados podem ser preparados como cadeias polipeptídicas simples ou como um complexo. Para algumas aplicações, pode ser desejável para preparar FVII modificado de uma forma "simples" sem modificações pós-translacionais ou outras modificações químicas. Cadeias polipeptídicas simples podem ser preparadas em hospedeiros adequados, que não pós- traducionalmente modificam FVII. Tais polipeptídeos também podem ser preparados em sistemas in vitro e utilizando a síntese química de polipeptídeos. Para outras aplicações, modificações particulares podem ser desejadas incluindo peguilação, albuminação, glicosilação, carboxilação, hidroxilação, fosforilação ou outras modificações conhecidas. As modificações podem ser feitas in vitro ou, por exemplo, produzindo o FVII modificado em um hospedeiro adequado que produz tais modificações.

5. Sequências de nucleotideos

Moléculas de ácido nucléico que codificam polipeptídeos de FVII ou de FVII modificados são providas aqui. As moléculas de ácido nucléico incluem variantes alélicas ou variantes da tala de qualquer polipeptideo de FVII codificado. Exemplares de moléculas de ácido nucléico providas neste documento são as que codificam um polipeptideo de FVII modificado aqui provido, tal como qualquer codificação de um polipeptideo definido em qualquer uma das SEQ ID NOS: 113-273. Em uma modalidade, moléculas de ácido nucléico providas aqui possuem, pelo menos, 50, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95, ou 99% de identidade sequencial ou hibridizam em condições 5 de média ou elevada dureza ao longo de pelo menos 70% do comprimento total de qualquer ácido nucléico que codifica um polipeptideo de FVII provido aqui. Em outra modalidade, uma molécula de ácido nucléico pode incluir aqueles com sequências de códon degenerado que codificam quaiquer dos 10 polipeptídeos de FVII providos aqui.

F. Avaliação de atividades de polipeptídeos de FVII modificados

As atividades e propriedades de polipeptídeos de FVII podem ser avaliadas in vitro e/ou in vivo. Ensaios 15 para essa avaliação são conhecidos por aqueles versados na técnica e são conhecidos para correlacionar as atividades testadas e os resultados à terapêutica e nas atividades in vivo. Em um exemplo, as variantes de FVII podem ser avaliadas em comparação com FVII não modificado e/ou do 20 tipo selvagem. Em outro exemplo, a atividade de polipeptídeos de FVII modificados pode ser avaliada após exposição in vitro ou in vivo para AT-III e comparada com a de polipeptídeos de FVII modificados que não tenham sido expostos a AT-III. Tais ensaios podem ser realizados na presença ou ausência de TF. Ensaios in vitro incluem qualquer teste de laboratório conhecido por aqueles versados na técnica, como, por exemplo, testes baseados em células, incluindo ensaios de coagulação, ensaios de ligação, ensaios de proteina e ensaios de biologia molecular. Ensaios in vivo incluem ensaios de FVII em modelos animais, bem como administração em seres humanos. Em alguns casos, a atividade de FVII in vivo pode ser 5 determinada pela avaliação de sangue, soro ou outro fluido corporal para os determinantes do ensaio. Variantes de FVII também podem ser testados in vivo para avaliar uma atividade ou propriedade, como efeito terapêutico.

Normalmente, os ensaios descritos neste documento são com relação à forma ativada de duas cadeias de FVII, ou seja, FVIIa. Tais ensaios também podem ser realizados com a forma de cadeia simples, como para fornecer um controle negativo já que tal forma normalmente não contém atividade proteolítica ou catalitica necessária para a atividade coagulante do FVII. Além disso, tais ensaios também podem ser realizados na presença de cofatores, como TF, que em alguns casos, aumenta a atividade de FVII.

1. Ensaios in vitro

Ensaios in vitro exemplares incluem ensaios para 20 avaliar a modificação e atividade de polipeptideo. As modificações podem ser avaliadas através de ensaios in vitro para avaliar y—carboxilação e outras modificações pós-translacionais, ensaios de proteina e ensaios conformacionais conhecidos na técnica. Ensaios de atividade 25 incluem, mas não estão limitados a, medição da interação deFVII com outros fatores de coagulação, como FT, fator X e o fator IX, ensaios proteoliticos para determinar a atividade proteolítica de polipeptideos de FVII, os ensaios para determinar o bloqueio e/ou afinidade de polipeptídeos de FVII para fosfatidilserinas e outros fosfolipideos e ensaios baseados em células, para determinar o efeito de polipeptídeos de FVII na coagulação.

As concentrações de polipeptídeos de FVII modificados podem ser avaliadas por métodos bem conhecidos na técnica, incluindo mas não limitado a, métodos de ensaio de imunosorvente ligado à enzima (ELISA), SDS-PAGE, Bradford, Lowry, BCA; absorbância UV e outros métodos de rotulagem de proteinas quantificáveis, tais como, mas não limitado a, métodos imunológicos, radioativos e fluorescentes e métodos relacionados.

Avaliação dos produtos de clivagem das reações de proteólise, incluindo a clivagem de polipeptídeos de FVII ou produtos produzidos por atividade de protease de FVII, pode ser realizada através de métodos, incluindo mas não limitado a, a clivagem do substrato cromogênico, HPLC, análise de SDS-PAGE, ELISA, Western blot, imunohistoquimica, imunoprecipitaçâo, seqüenciamento de terminal-NHs e proteina de rotulagem.

Propriedades estruturais de polipeptídeos de FVII modificados também podem ser avaliadas. Por exemplo, cristalografia de raios-X, ressonância magnética nuclear (RMN) e microscopia de crioelétron (Cryo-EM) de polipeptídeos de FVII modificados podem ser realizadas para avaliar a estrutura tridimensional dos polipeptídeos de FVII e/ou outras propriedades de polipeptídeos de FVII, tais como Ca2+ ou cofator vinculativo.

Além disso, a presença e o grau de degradação do FVII podem ser medidos pelas técnicas convencionais, tais como eletroforese em gel de dodecil sulfato de poliacrilamida (SDS-PAGE) e Western blot de amostras contendo FVII eletroforadas. Os polipeptídeos de FVII que tenham sido expostos a proteases também podem ser submetidos a sequenciamento N-terminal para determinar a localização ou mudanças nos locais de divagem dos polipeptídeos de FVII modificados.

a. Modificações pós-translacionais

Polipeptídeos de FVII também podem ser avaliados para a presença de modificações pós-translacionais. Tais ensaios são conhecidos na técnica e incluem ensaios para medir a glicosilação, hidroxilação e carboxilação. Em um ensaio exemplar para a glicosilação, a análise de carboidcamundongos pode ser feita, por exemplo, com a análise SDS-PAGE de polipeptídeos de FVII expostos a hidrazinólise ou tratamento de endoglicosidase. Hidrazinólise libera glicanos N- e O-ligados a partir de glicoproteínas por incubação com hidrazina anidra, enquanto a liberação de endoglicosidase envolve PNGase F, que libera mais N-glicanos de glicoproteínas. Hidrazinólise ou tratamento de endoglicosidase de polipeptídeos de FVII gera um terminal redutor que pode ser marcado com um fluoróforo ou etiqueta cromóforo. Polipeptídeos de FVII marcados podem ser analisados por eletroforese de carboidcamundongos assistida por fluoróforo (FACE). A etiqueta fluorescente para glicanos também pode ser usada para a análise de monossacarídeos, perfis ou impressões digitais dos padrões de glicosilação de complexo por HPLC. Métodos de HPLC exemplares incluem cromatografia de interação hidrofílica, interação eletrônica, troca de tons, interação hidrofóbica, e cromatografia por exclusão de tamanho. Sondas de glicano exemplares incluem, mas não estão limitadas a, 3- (acetilamino)-6-aminoacridina (AA-Ac) e ácido 2- aminobenzóico (2-AA). Porções de carboidcamundongo também podem ser detectadas através da utilização de anticorpos específicos que reconhecem o polipeptideo de FVII glicosilado. Um ensaio exemplar para medir a p-hidroxilação compreende HPLC de fase reversa análise de polipeptideos de FVII que foram submetidos à hidrólise alcalina (Przysiecki et al. (1987) PNAS 84:7856-7860). Carboxilação e Ü-carboxilação de polipeptideos de FVII podem ser avaliadas através de espectrometria de massa com a matriz assistida por análise de tempo de vôo de ionização por dessorção a laser (MALDI-TOF), conforme descrito na técnica (ver, por exemplo, Harvey et al. J Biol Chem 278:8363-8369, Maun et al. Prot Sci 14:1171-1180). A interação de um polipeptideo de FVII contendo o propeptideo (pró-FVII) com a carboxilase responsável por modificações de D-carboxilato pós-translacional também pode ser avaliado. A constante de dissociação (K<j) , após incubação de carboxilase com polipeptideos de pró-FVII marcados com flourescina pode ser medido pela determinação da quantidade de carboxilase ligada por anisotropia (Lin et al (2004) J Biol Chem 279:6560-6566).

b. Atividade proteolitica

Polipeptídeos de FVII modificados podem ser testados para a atividade proteolitica. A atividade proteolitica do FVII pode ser medida usando substratos cromogênicos como Chromozym t-PA (MeSCb-D-Phe-Gly-Arg-pNA), S-2288 (H-D-Ile-Pro-Arg-pNA), S-2266 (H-D-Val-Leu-Arg-pNA), S-2765 (Z-D-Arg-Gly-Arg-pNA), Spectrozyme FXa e Spectrozyme FVIIa (CH3-SO2-D-CHA-But-Arg-pNA) . Polipeptídeos de FVII, sozinhos ou na presença de TF, sâo incubados com diferentes concentrações de substrato cromogênico. Clivagem do substrato pode ser monitorada pela absorbância de uma taxa de hidrólise do substrato determinada por regressão linear usando software prontamente disponível.

A ativação de substratos de fator de coagulação, como o FX, por polipeptídeos de FVII também pode ser avaliada. Polipeptídeos de FVII, com ou sem pré-incubação com TF, podem ser incubados com FX purificado (disponível comercialmente). A quantidade de FXa ativo produzido como consequência de incubação com polipeptídeos de FVII é medida como atividade de FXa para um substrato cromogênico, como o S-2222 ou Spectrafluor FXa (CH3SO2-D-CHA-Gly-Arg- AMC.AcOH), que é monitorado através de mudanças de absorbância (Harvey et al. J Biol Chem 278:8363-8369, ver também o exemplo 4 abaixo). Uma fonte de fosfolipídeos também pode ser incluída na incubação de FVII e FX (Nelsestuen et al. (2001) J Biol Chem 276:39825-31).

c. Atividade de coagulação

Polipeptídeos de FVII podem ser testados para a atividade de coagulação através de ensaios bem conhecidos na técnica. Por exemplo, alguns dos ensaios incluem, mas não estão limitados a, um ensaio de coagulação em duas etapas (Liebman et al, (1985) PNAS 82:3879-3883), o ensaio do tempo de protrombina (PT, que pode medir a atividade dependente de TF de FVIIa na via extrínseca); ensaios que são modificações do teste de PT, o tempo de tromboplastina parcial ativada (aPTT, que pode medir a atividade independente do TF do FVIIa), tempo de coagulação ativado (TCA); tempo de coagulação ativada reacalcifiçada, o tempo de coagulação Lee-White, ou tromboelastografia (TEG) (Pusateri et al (2005) Critical Care 9:S15-S24). Por exemplo, a atividade de coagulação de um polipeptídeo de FVII modificado pode ser determinada por um ensaio baseado em TP onde FVII é diluído no plasma deficiente em FVII, e misturado com o reagente de tempo de protrombina (TF recombinante com fosfolípideos e cálcio), como a que está disponível como Innovin™ da Dade Behring. A formação do coágulo é detectada opticamente e o tempo de coagulação é determinado e comparado com plasma deficiente em FVII sozinho.

d. Ligação e/ou inibição por outras proteínas e moléculas

Estudos de inibição podem ser usados para medir a resistência de polipeptídeos de FVII modificados aos inibidores de FVII, como, por exemplo, AT-III e TFPI, ou moléculas, tais como Zn2+. Avaliação da inibição de outros inibidores também pode ser testada e incluem, mas não estão limitados a, outros inibidores de serina protease e anticorpos de FVII especificos. A inibição pode ser avaliada através da incubação, por exemplo, a AT-III, TFPI ou Zn2+ com polipeptidios de FVII que tenham sido previamente incubados com e/ou sem TF. A atividade de FVII pode ser medida usando qualquer um ou mais dos ensaios de atividade ou de coagulação acima descritos, e inibição por AT-III, TFPI ou Zn2+ pode ser avaliada comparando a atividade de polipeptideos de FVII incubados com o inibidor, com a atividade de polipeptideos de FVII que não foram incubados com o inibidor.

Polipeptideos de FVII podem ser testados para ligação com outros fatores de coagulação e inibidores. Por exemplo, interações de FVII diretas e indiretas com cofatores, como a TF, substratos, como FX e FIX, e inibidores, tais como antitrombina III, TFPI e heparina podem ser avaliados através de qualquer ensaio de ligação conhecido na técnica, incluindo, mas não limitado a, imunoprecipitação, purificação em coluna, SDS-PAGE de não redução, ensaios BIAcore®, ressonância plasmon de superficie (SPR), transferência de energia de ressonância de fluorescência (FRET), polarização de fluorescência (FP), calorimetria de titulação isotérmica (ITC), dicroismo circular (CD), ensaios de complementação de fragmento de proteina (PCA), espectroscopia de Ressonância Magnética Nuclear (RMN), espalhamento de luz, equilíbrio de sedimentação, cromatografia de filtração em gel de zona pequena, atraso em gel, Far-Western blot, polarização de fluorescência, impressão digital de proteina de radical hidroxi, exposição do fago, e vários sistemas de dois híbridos. Em um exemplo, ligação de Zn2+ é avaliada através de análise de equilibrio (Petersen et al. (2000) Protein Science 9:859-866)

e. Afinidade de fosfolipideo

Ligação e/ou afinidade de polipeptideo de FVII modificado com fosfatidilserina (PS) e outros fosfolipideos pode ser determinada através de ensaios conhecidos na técnica. Fosfolipidios altamente puros (por exemplo, concentrações conhecidas de PS bovina e fosfatidilcolina de ovo (PC), que estão disponíveis comercialmente, como o da Sigma, em solvente orgânico podem ser utilizados para preparar pequenas vesículas fosfolipidicas unilamelares. Polipeptideo de FVII que se ligam a estas vesículas PS/PC pode ser determinado por espalhamento de luz relativa a 90° em relação à luz incidente. A intensidade da dispersão da luz com PC/PS sozinho e com PC/PS/FVII é medida para determinar a constante de dissociação (Harvey et ai. J Biol Chem 278:8363-8369). Ressonância de plasma superficial, como em um instrumento biossensor BIAcore, também pode ser usado para medir a afinidade de polipeptídeos de FVII para membranas fosfolipidicas (Sun et al. Blood 101:2277-228 4).

2. Modelos de animais não humanos

Modelos de animais não humanos podem ser usados para avaliar atividade, eficácia e segurança de polipeptídeos de FVII modificados. Por exemplo, os animais não humanos podem ser usados como modelos para uma doença ou condição. Os animais não humanos podem ser injetados com substâncias de doença e/ou fenótipo de indução antes da administração de variantes de FVII, como qualquer variante de FVII definida em qualquer uma das SEQ ID NOS: 113-273, para acompanhar os efeitos na progressão da doença. Modelos genéticos também são úteis. Os animais, como camundongos, podem ser gerados que imitam uma doença ou condição pela superexpressão, subexpressão ou knock-out de um ou mais genes, como, por exemplo, o camundongo de knock-out de fator VIII que exibem hemofilia A (Bi et al. (1995) Gen Nat 10:119-121). Esses animais podem ser gerados por técnicas de produção de animais transgênicos bem conhecidos na técnica ou a utilização cepas mutantes de ocorrência natural ou induzidas. Exemplos de modelos úteis de animal não humano de doenças associadas com FVII incluem, mas não estão limitados a, os modelos dos distúrbios hemorrágicos, hemofilia em particular, ou doença trombótica. Modelos de animais não humanos para lesão também podem ser usados para avaliar uma atividade, como a atividade de coagulação, de polipeptídeos de FVII. Esses modelos de animais não-humanos podem ser usados para monitorar a atividade de variantes de FVII em relação a um polipeptideo de FVII de tipo selvagem.

Os modelos de animais também podem ser usados para monitorar a estabilidade, a meia-vida e o afastamento de polipeptídeos de FVII modificados. Tais ensaios são úteis para comparar polipeptídeos de FVII modificados e para calcular doses e regimes de dosagem para testes em animais não humanos e humanos. Por exemplo, um polipeptideo de FVII modificado, como qualquer variante de FVII provida aqui, incluindo, por exemplo, qualquer uma definida em qualquer uma das SEQ ID NOS: 113-273, pode ser injetado na veia da cauda de camundongos. Amostras de sangue são então tomadas em pontos de tempo após a injeção (como minutos, horas e dias depois) e então o nivel de polipeptideos de FVII modificados em amostras corporais, incluindo, mas não limitado a, soro ou plasma pode ser monitorado em pontos de tempo específicos, por exemplo, por ELISA ou radioimunoensaio. Amostras de sangue de vários pontos de tempo após a injeção de polipeptideos de FVII também são testadas para a atividade de coagulação utilizando diferentes métodos, como é descrito no Exemplo 9. Estes tipos de estudos farmacocinéticos podem fornecer informações sobre a meia-vida, a depuração e a estabilidade dos polipeptideos de FVII, que podem auxiliar na determinação de dosagens adequadas para a administração como pró-coagulantes.

Polipeptideos de FVII modificados, como qualquer um definido em qualquer uma das SEQ ID NOS: 113-273, podem ser testados quanto à eficácia terapêutica em modelos animais para a hemofilia. Em um exemplo não limitativo, um modelo animal, como um camundongo pode ser usado. Os modelos de camundongo de hemofilia estão disponíveis na técnica e podem ser empregados para testar polipeptideos de FVII modificados. Por exemplo, um modelo de camundongo da hemofilia A, que é produzido pela injeção de anticorpos anti-FVIII pode ser usado para avaliar a atividade coagulante de polipeptídeos de FVII (ver, por exemplo, Exemplo 6 e Tranholm et al. Blood (2003) 102:3615-3620). Um modelo de camundongo da hemofilia B também pode ser usado 5 para testar polipeptídeos de FVII (Margaritis et al. (2004) J Clin Invest 113:1025-1031). Modelos sem camundongo de distúrbios hemorrágicos também existem. A atividade de polipeptídeo de FVII pode ser avaliada em camundongos com sangramento induzido por warfarin ou sangramento induzido 10 por melagatran (Diness et al. (1992) Thromb Res. 67:233-241, Elg et al. (2001) Thromb Res. 101 :145-157), e coelhos com sangramento induzido por heparina (Chan et al (2003) J Thromb Haemost 1:. 760-765). Cães de doença hemofilia A, hemofilia B e von Willebrand endogâmicos que apresentam 15 hemorragias graves também podem ser usados em estudos em animais não humanos com polipeptídeos de FVII (Brinkhous et al. (1989) PNAS86:1382-1386). A atividade de polipeptídeos de FVII também pode ser avaliada em um modelo de coelho de sangramento em que a trombocitopenia é induzida por uma 20 combinação de irradiação gama e do uso de anticorpos plaquetários (Tranholm et al. (2003) Thromb Res 109:217- 223) .

Além dos animais com distúrbios hemorrágicos generalizados, modelos de lesões e traumas também podem ser 25 usados para avaliar a atividade de polipeptídeos de FVII, e sua segurança e eficácia como coagulante terapêutico. Exemplos não limitadores de tais modelos incluem um modelo de estenose coronariana de coelho (Fatorutto et al. (2004) Can J Anaesth 51:672-679), um modelo de lesão hepática grau V em porcos (Lynn et al. (2002) J Trauma 52:703-707), um modelo de lesão hepática de grau V em porcos (Martinowitz et al. (2001) J Trauma 50:721-729) e um modelo de aortotomia em porcos (Sondeen et al. (2004) Shock 22:163- 168) .

3. Ensaios Clínicos

Muitos ensaios estão disponíveis para avaliar a atividade de FVII para uso clinico. Tais ensaios podem incluir a avaliação da coagulação, a estabilidade da proteína e a meia-vida in vivo, e ensaios fenotípicos. Ensaios fenotipicos e ensaios para avaliar o efeito terapêutico do tratamento de FVII incluem a avaliação dos níveis sanguíneos de FVII (por exemplo, medida de soro de FVII antes da administração e pontos de tempo de administração, incluindo, após a primeira administração, imediatamente após a última administração e pontos de tempo de pontos entre eles, a correção para o índice de massa corporal (IMC)), a avaliação da coagulação do sangue in vitro utilizando os métodos descritos acima após o tratamento com FVII (por exemplo, ensaio PT), e da resposta fenotípica ao tratamento de FVII, incluindo a melhora dos sintomas ao longo do tempo em comparação com indivíduos tratados com um FVII não modificado e/ou tipo selvagem ou placebo. Os pacientes tratados com polipeptídeos de FVII podem ser monitorados quanto à perda de sangue, necessidade de transfusão e hemoglobina. Os pacientes podem ser monitorados regularmente durante um período de tempo para as administrações de rotina ou de reincidência, ou após a administração em resposta a eventos agudos, tais como hemorragia, trauma ou procedimentos cirúrgicos.

G. Elaboração e Administração

Composições para uso no tratamento de distúrbios de sangramento são providas aqui. Essas composições contêm uma quantidade terapeuticamente eficaz de um polipeptideo de fator VII, conforme descrito neste documento. Concentrações eficazes de polipeptideos de FVII ou derivados farmaceuticamente aceitáveis dos mesmos são misturadas com um portador farmaceuticamente adequado ou veiculo para a administração sistêmica, tópica ou local. Os compostos são incluídos em uma quantidade eficaz para tratar a desordem selecionada. A concentração do composto ativo na composição dependerá das taxas de absorção, inativação, excreção do composto ativo, programa de dosagem e quantidade administrada, bem como outros fatores conhecidos por aqueles versados na técnina.

Carreadores ou veiculos farmaceuticamente adequados para a administração dos compostos providos aqui incluem quaisquer veiculos conhecidos por aqueles versados na técnica como sendo adequado para o modo de administração particular. As composições farmacêuticas que incluem uma quantidade terapeuticamente eficaz de um polipeptideo de FVII aqui descrito também podem ser fornecidas como um pó liofilizado que é reconstituído, como com água estéril, imediatamente antes da administração.

1. Formulações

Composições farmacêuticas contendo um FVII modificado podem ser formuladas de qualquer forma convencional através da mistura de uma quantidade selecionada de polipeptideo com uma ou mais veiculos ou excipientes fisiologicamente aceitáveis. Seleção do veiculo ou excipiente está dentro da habilidade do profissional que administra e pode depender de uma série de parâmetros. Estas incluem, por exemplo, o modo de administração (ou seja, sistêmico, oral, nasal, pulmonar, local, tópico ou qualquer outro modo) e transtorno tratados. As composições farmacêuticas providas aqui podem ser formuladas para administração de dose única (direta) ou para diluição ou outra modificação. A concentração dos compostos nas formulações são eficazes para a entrega de uma quantidade, sob administração, que é eficaz para o tratamento pretendido. Normalmente, as composições são formuladas para administração de doses individuais. Para formular uma composição, a fração em massa de um composto ou mistura dos mesmos é dissolvida, em suspensão, dispersa ou misturada em um veiculo selecionado em uma concentração eficaz de tal forma que a condição tratada é aliviada ou amenizada.

Os polipeptídeos de FVII modificados providos aqui podem ser formulados para a administração a um individuo como uma proteina de FVIIa de cadeia dupla. Os polipeptídeos de FVII modificados podem ser ativados por qualquer método conhecido no estado da técnica para a formulação. Por exemplo, FVII pode sofrer autoativação durante a purificação por cromatografia de troca iônica (Jurlander et al. (2001) Semin Thromb Hemost 27:373-384). Os polipeptídeos de FVII modificados também podem ser ativados por incubação com FXa imobilizado em esferas (Kemball-Cook et al. (1998) J Biol Chem 273:8516-8521), ou 5 quaisquer outros métodos conhecidos na técnica (ver também o exemplo 2 abaixo). A inclusão de cálcio nesses processos garante a completa ativação e correto enovelamento da proteína de FVIIa modificada. Os polipeptídeos de FVII modificados providos aqui também podem ser formulados para 10 a administração como uma proteína de cadeia única. Os polipeptídeos de FVII de cadeia única podem ser purificados de modo a evitar a clivagem (ver, por exemplo, US 6677440). Os polipeptídeos de FVII modificados providos aqui podem ser formulados de tal forma que as formas de 15 cadeia única e cadeia dupla estão contidas na composição farmacêutica, em qualquer relação, pela seleção adequada do meio para eliminar ou controlar autoativação.

O composto pode ser suspenso em uma forma micronizada ou outra forma adequada ou pode ser 20 derivatizado para produzir um produto mais solúvel ativo. A forma da mistura resultante depende de uma série de fatores, incluindo o modo de administração pretendido e a solubilidade do composto no veículo ou carreador escolhido. As misturas resultantes são soluções, suspensões, emulsões 25 e outras misturas, e podem ser formuladas como uma mistura não aquosas ou aquosas, cremes, géis, pomadas, emulsões, soluções, poções, loções, suspensões, tinturas, pastas, espumas, aerossóis, irrigações, sprays, supositórios ataduras ou qualquer outra formulação adequada para a administração sistêmica, tópica ou local. Para a administração interna local, tais como, administração intramuscular, parenteral ou intra-articular, os polipeptideos podem ser formulados como uma suspensão em solução num meio aquoso, como o soro fisiológico isotonicamente tamponado ou são combinados com um suporte biocompatível ou bioadesivo destinado para administração interna. A concentração eficaz é suficiente para melhorar a condição alvo e pode ser determinada empiricamente. Para formular uma composição, a fração de peso do composto é dissolvida, suspensa, dispersa ou misturada em um veiculo selecionado em uma concentração eficaz tal que a condição alvo é aliviada ou amenizada.

Geralmente, composições farmaceuticamente aceitáveis são preparadas tendo em vista as aprovações por uma agência regulatória ou outras preparadas de acordo com a farmacopéia geralmente reconhecida para uso em animais e em seres humanos. As composições farmacêuticas podem incluir carreadores, como um diluente, adjuvante, excipiente ou veículo com o qual uma isoforma é administrada. Esses veiculos farmacêuticos podem ser líquidos estéreis, como a água e óleos, incluindo os de origem de petróleo, animal, vegetal ou sintéticos, como o óleo de amendoim, óleo de soja, óleo mineral e óleo de gergelim. A água é um veículo típico quando a composição farmacêutica é administrada por via intravenosa. Soluções salinas e dextrose aquosa e soluções de glicerol também podem ser empregadas como veículos líquidos, especialmente para soluções injectáveis. As composições podem conter junto com um ingrediente ativo: um diluente como a lactose, sacarose, fosfato bicálcico ou carboximetilcelulose; um 5 lubrificante, tal como esteacamundongo de magnésio, esteacamundongo de cálcio e talco; e um aglutinante como o amido, gomas naturais, como goma acaciagelatin, glicose, melaço, polvinilpirrolidina, celulose e derivados das mesmas, povidona, crospovidonas e outros ligantes 10 conhecidos por aqueles versados na técnica. Excipientes farmacêuticos adequados incluem amido, glicose, lactose, sacarose, gelatina, arroz, malte, farinha, gesso, sílica gel, esteacamundongo de sódio, monoesteacamundongo de glicerol, talco, cloreto de sódio, leite desnatado em pó, 15 glicerol, propileno glicol, água e etanol. Uma composição, se desejado, também pode conter pequenas quantidades de umectantes ou agentes emulsificantes, ou agentes tamponantes do pH, por exemplo, acetato, citrato de sódio, derivados de ciclodextrina, monolaucamundongo de sorbitano, 20 trietanolamina, acetato de sódio, oleato de trietanolamina, e outros agentes. Estas composições podem tomar a forma de soluções, suspensões, emulsões, comprimidos, drágeas, cápsulas, pós e formulações de liberação sustentada. As cápsulas e cartuchos de, por exemplo, gelatina para uso em 25 um inalador ou insuflador, podem ser formuladas com uma mistura em pó de um composto terapêutico e uma base em pó adequada, tal como a lactose ou amido. A composição pode ser formulada como um supositório, com ligantes e veículos tradicionais, como triglicerídeos. Formulação oral pode incluir veículos padrão, tais como graus farmacêuticos de manitol, lactose, amido, esteacamundongo de magnésio, sacarina sódica, celulose, carbonato de magnésio e outros agentes. Preparações para administração oral também pode ser adequadamente formulada com inibidores de protease, como um inibidor Bowman-Birk, um inibidor Bowman-Birk conjugado, aprotinina e camostat. Exemplos de veículos farmacêuticos adequadas estão descritos em "Remington's Pharmaceutical Sciences" por E.W. Martin. Estas composições irão conter uma quantidade terapeuticamente eficaz do composto, geralmente em forma purificada, juntamente com uma quantidade adequada de veículo de modo a fornecer a forma para uma boa administração a um indivíduo ou paciente.

A formulação deve se adequar ao modo de administração. Por exemplo, o FVII modificado pode ser formulado para a administração parenteral por injeção (por exemplo, injeção em bolus ou infusão contínua) . As composições injetáveis podem assumir formas como suspensões, soluções ou emulsões em veículos aquosos ou oleosos. A preparação estéril injetável também pode ser uma solução ou suspensão estéril injetável em um diluente ou solvente não-tóxico parenteralmente aceitável, por exemplo, como uma solução em 1,4-butanodiol. Óleos fixos, estéreis são convencionalmente empregados como um meio solvente ou em suspensão. Para este efeito, qualquer óleo agradável fixo pode ser empregado, incluindo mas não limitado a, mono ou diglicerideos sintéticos, ácidos graxos (incluindo ácido oléico), óleos vegetais de ocorrência natural como óleo de sésamo, óleo de coco, óleo de amendoim, óleo de algodão, e outros óleos, ou veiculos graxos sintéticos como oleato de etila. Tampões, conservantes, antioxidantes e os ingredientes adequados podem ser incorporados conforme requerido, ou, alternativamente, podem incluir a formulação.

Os polipeptideos podem ser formulados como o único ingrediente farmaceuticamente ativo na composição ou podem ser combinados com outros ingredientes ativos. Os polipeptideos podem ser direcionados para a entrega, como pela conjugação de um agente de direcionamento, tal como um anticorpo. Suspensões lipossomais, incluindo lipossomas direcionados a tecido, também pode ser apropriadas como veiculos farmaceuticamente aceitáveis. Estes podem ser preparados de acordo com métodos conhecidos para aqueles versados na técnica. Por exemplo, as formulações de lipossomas podem ser preparadas como descrito na Patente dos n° US 4522811. Entrega liposomal também inclui formulações de liberação lenta, incluindo matrizes farmacêuticas, tais como géis de colágeno e lipossomas modificados com fibronectina (ver, por exemplo, Weiner et al (1985) J Pharm Sci 74 (9):922-5). As composições providas aqui ainda podem conter um ou mais adjuvantes que facilitem a liberação, tais como, mas não estão limitados a, veiculos inertes ou sistemas de dispersão coloidal.

Exemplos representantes e não-limitativos de tais veiculos inertes podem ser selecionados a partir de água, álcool isopropilico, fluorocarbonetos gasosos, álcool etilico, polivinil pirrolidona, propileno glicol, um material que produz gel, álcool estearilico, ácido esteárico, espermacete, monooleato sorbitano, metilcelulose, bem como combinações adequadas de dois ou mais produtos. O composto ativo é incluido no veiculo farmaceuticamente aceitável em uma quantidade suficiente para exercer um efeito terapêutico útil na ausência de efeitos colaterais indesejáveis no individuo tratado. A concentração terapeuticamente eficaz pode ser determinada empiricamente, testando os compostos conhecidos in vitro e em sistemas in vivo, tais como os ensaios providos aqui.

a. Dosagens

A quantidade ou dose exata do agente terapêutico administrado depende do polipeptideo de FVII particular, a via de administração, e outras considerações, tais como a gravidade da doença e do peso e estado geral do individuo. A administração local do agente terapêutico normalmente irá requerer uma dose menor do que qualquer modo de administração sistêmica, embora a concentração local do agente terapêutico possa, em alguns casos, ser maior após a administração local que pode ser alcançada com segurança sobre a administração sistêmica. Se necessário, uma dosagem particular e duração e protocolo de tratamento podem ser empiricamente determinados ou extrapolados. Por exemplo, doses exemplares de polipeptídeos recombinantes e FVII nativo podem ser usadas como ponto de partida para determinar as dosagens adequadas. Por exemplo, um polipeptídeo de FVII recombinante (rFVIIa) que foi ativado para rFVIIa, NovoSeven®, foi administrado a pacientes com hemofilia A ou hemofilia B, que estavam experimentando um episódio hemorrágico, na dose de 90 μg/kg por infusão em bolus por 2 a 5 minutos, atingindo um nível eficaz de circulação de pelo menos 2 μg/ml. A dose foi repetida a cada 2 horas até que a hemostasia foi alcançada. Os polipeptídeos de FVII modificados providos aqui podem ser eficazes em quantidades e/ou frequências de dosagem reduzidas em relação a esse FVII recombinante. Por exemplo, a polipeptídeos de FVII modificados procidos aqui pode ser administrado em uma dose de 80 μg/kg, 70 μg/kg, 60 μg/kg, 50 μg/kg, 40 μg/kg, 30 μg/kg, 20 μg/kg, 15 μg/kg ou menos. Em algumas modalidades, as doses podem ser maiores, como 100 μg/kg, 110 μg/kg, 120 μg/kg ou mais. A duração do tratamento e o intervalo entre injecções dependerá da gravidade do sangramento e da resposta do paciente ao tratamento, e pode ser ajustado em conformidade. Fatores como o nível de atividade e meia-vida do FVII modificado em comparação com o FVII não modificado podem ser levados em conta ao fazer determinações de dosagem. Dosagens e regimes específicos podem ser determinados empiricamente.

Em outro exemplo, um polipeptídeo de FVII recombinante (rFVIIa) que foi ativado para rFVIIa, NovoSeven® foi administrado a pacientes com deficiência congênita de FVII que estavam experimentando um episódio hemorrágico, na dose de 15 a 30 μg/kg por infusão em bolus por 2 a 5 minutos. A dose foi repetida a cada 4 a 6 horas, até hemostasia ser alcançada. Os polipeptídeos de FVII modificados providos aqui podem ser eficazes em quantidades e/ou frequência de dosagem reduzida em relação a esse FVII recombinante. Por exemplo, os polipeptídeos de FVII modificados providos aqui podem ser administrado na dose de 20 μg/kg, 15 μg/kg, 10 μg/kg, 5 μg/kg, 3 μg/kg ou menos. Em alguns exemplos, as doses podem ser maiores, como 35 μg/kg, 40 μg/kg, 45 μg/kg ou mais. A duração do tratamento e o intervalo entre injecções dependerá da gravidade do sangramento e da resposta do paciente ao tratamento, e pode ser ajustado em conformidade. Fatores como o nivel de atividade e meia-vida do FVII modificado em comparação com o FVII não modificado podem ser usados para fazer determinações de dosagem. Por exemplo, um polipeptideo de FVII modificado que apresenta uma meia-vida maior do que um polipeptideo de FVII não modificado pode ser administrado em doses menores e/ou com menos frequência do que o polipeptideo de FVII não modificado. Da mesma forma, as dosagens necessárias para o efeito terapêutico usando um polipeptideo de FVII modificado que mostra o aumento da atividade coagulante em comparação com um polipeptideo de FVII não modificado pode ser reduzido em frequência e quantidade. Dosagens e regimes específicos podem ser determinados empiricamente por uma pessoa versada na técnica.

b. Formas de dosagem

Compostos farmacêuticos terapeuticamente ativos e seus derivados são tipicamente formulados e administrados em formas de dosagem unitária ou formas de dosagem múltiplas. As formulações podem ser fornecidas para a administração a humanos e animais em formas de dosagem que incluem, mas não estão limitados a, comprimidos, cápsulas, pilulaas, pós, grânulos, soluções ou suspensões parenterais estéreis, soluções ou suspensões orais e emulsões de óleo em água contendo quantidades adequadas dos compostos ou derivados farmaceuticamente aceitáveis dos mesmos. Cada unidade de dose contém uma quantidade predeterminada de compostos terapeuticamente ativos suficientes para produzir o efeito terapêutico desejado, em associação com o veiculo, carreador ou diluente farmacêutico necessário. Exemplos de formas de dose unitária incluem seringas e ampolas e comprimidos ou cápsulas embalados individualmente. Em alguns exemplos, a dose unitária é fornecida como um pó liofilizado que é reconstituído antes da administração. Por exemplo, um polipeptideo de FVII pode ser fornecido como pó liofilizado que é reconstituído com uma solução adequada para gerar uma solução em dose única para injeção. Em algumas modalidades, o pó liofilizado pode conter o polipeptideo de FVII e componentes adicionais, tais como sais, tal que a reconstituição com água destilada estéril resulta em um polipeptideo de FVII em uma solução tamponada ou salina. Formas de dose unitária pode ser administradas em frações ou múltiplos da mesma. Uma forma de dose múltipla é uma pluralidade de formas de dosagem unitárias idênticas embaladas em um único recipiente a ser administrado de forma de dose unitária segregada. Exemplos de formas de dose múltipla incluem frascos, frascos de comprimidos ou cápsulas ou garrafas de litros ou galões. Assim, a forma de dose múltipla é um múltiplo de doses unitárias que não são segregados nas embalagens.

2. Administração de polipeptideos de FVII modificados

Os polipeptideos de FVII providos aqui (ou seja, compostos ativos) podem ser administrados in vitro, ex vivo ou in vivo por contato de uma mistura, como um fluido corporal ou fragmento de tecido, com um polipeptideo de FVII. Por exemplo, quando se administra um composto ex vivo, um fluido corporal ou amostra de tecido de um individuo pode ser contactado com os polipeptideos de FVII que são revestidos em um tubo ou filtro, como por exemplo, um tubo ou um filtro em uma máquina de circulação extracorpórea. Quando administrado in vivo, os compostos ativos podem ser administrados por qualquer via apropriada, por exemplo, por via oral, nasal, pulmonar, parenteral, intravenosa, intradérmica, subcutânea, intra-articular, intracisterna, intraocular, intraventricular, intratecal, intramuscular, intraperitoneal, intratraqueal ou tópica, bem como por qualquer combinação de quaisquer de duas ou mais das mesmas, em forma liquida, semi-liquida ou sólida e são formulados de uma forma adequada para cada via de administração. Os polipeptideos de FVII modificados podem ser administrados em uma ou mais de uma vez, como duas, três vezes, quatro vezes, ou qualquer número de vezes que são necessárias para alcançar um efeito terapêutico. Administrações múltiplas podem ser efetuadas através de qualquer rota ou combinação de rotas, e pode ser 5 administrada a cada hora, a cada 2 horas, a cada três horas, a cada quatro horas ou mais.

A rota mais adequada para a administração irá variar dependendo do estado da doença a ser tratada, por exemplo, a localização do distúrbio hemorrágico.

Geralmente, os polipeptídeos de FVII serão administrados por injeção de bolus intravenoso, com um tempo de administração (infusão) de aproximadamente 2 a 5 minutos. Em outros exemplos, os niveis sanguíneos desejáveis de FVII podem ser mantidos por uma infusão continua do agente ativo 15 conforme determinado por niveis plasmáticos. Deve-se notar que o médico saberia como e quando terminar, suspender ou ajustar a terapia para diminuir a dosagem devido à toxicidade, ou disfunções de medula óssea, figado ou renais. Por outro lado, o médico também saberia como e 20 quando ajustar o tratamento para niveis mais elevados se a resposta clinica não for adequada (excluindo efeitos colaterais tóxicos). Em outros exemplos, o local da disfunção de sangramento pode indicar que a formulação de FVII é administrada através de rotas alternativas. Por 25 exemplo, a administração local, incluindo a administração para o cérebro (por exemplo, intraventricular) pode ser realizada quando o paciente está sofrendo de sangramento forma, para o tratamento de hemorragias nas articulações, a administração local pela injeção do agente terapêutico na junta (ou seja, por via intra-articular, intravenosa ou subcutânea) pode ser empregada. Em outros exemplos, a administração tópica do agente terapêutico na pele, por exemplo, formulada como um creme, gel ou pomada, ou a administração nos pulmões por inalação ou via intratraqueal pode ser apropriado quando o sangramento é localizado nessas áreas.

Os casos em que os polipeptídeos de FVII modificados são formulados como uma preparação de depósito, as formulações de ação prolongada podem ser administradas por implantação (por exemplo, por via subcutânea ou intramuscular) ou por injecção intramuscular. Assim, por exemplo, os compostos terapêuticos podem ser formulados com materiais poliméricos ou hidrofóbicos adequados (por exemplo, como uma emulsão em um óleo aceitável) ou resinas de troca iônica, ou seus derivados moderadamente solúveis, por exemplo, como um sal moderadamente solúvel.

As composições, se desejado, podem ser apresentadas em um pacote, em um kit ou dispositivo distribuidor, que pode conter uma ou mais formas de dosagem unitária contendo o ingrediente ativo. O pacote, por exemplo, contém folha de metal ou plástico, como um blister. 0 dispositivo distribuidor ou embalagem pode ser acompanhado de instruções para a administração. As composições contendo os princípios ativos podem ser embaladas como artigos de manufatura contendo material de embalagem, um agente provido aqui, e uma etiqueta que indica a doença para a qual o agente é provido.

3. Administração de ácidos nucléicos que codificam polipeptideos de FVII modificados (terapia genética)

Também são providas composições de moléculas de ácido nucléico que codificam os polipeptideos de FVII modificados e vetores de expressão que as codificam que são adequados para terapia gênica. Ao invés de liberar as proteinas, os ácidos nucléicos podem ser administrados in vivo, tais como sistemicamente ou por outra rota, ou ex vivo, como pela remoção de células, incluindo linfócitos, a introdução de nucléicos nele, e reintrodução em um hospedeiro ou um dispositivo compatível.

Polipeptideos de FVII modificados podem ser entregues às células e tecidos através da expressão de moléculas de ácido nucléico. Polipeptideos de FVII modificados podem ser administrados como moléculas de ácido nucléico que codificam polipeptideos de FVII modificados, incluindo as técnicas ex vivo e expressão in vivo direta. Os ácidos nucléicos podem ser entregues às células e tecidos por qualquer método conhecido por aqueles versados na técnica. As sequências de ácidos nucléicos isoladas podem ser incorporadas em vetores para manipulação posterior. Conforme utilizado aqui, vetor (ou plasmideo) refere-se a elementos discretos que são utilizados para introduzir DNA heterólogo em células para expressão ou replicação do mesmo. Seleção e utilização de tais veiculos estão bem dentro da habilidade do técnico.

Métodos para administrar polipeptídeos de FVII modificados pela expressão de moléculas de ácido nucléico que codificam incluem a administração de vetores recombinantes. 0 vetor pode ser projetado para permanecer episomal, como pela inclusão de uma origem de replicação ou pode ser projetado para integrar um cromossomo na célula. Polipeptídeos de FVII modificados também podem ser usados em terapia de expressão gênica ex vivo através de vetores não-virais. Por exemplo, as células podem ser projetadas para expressar um polipeptideo de FVII modificado, tais como integrando um ácido nucléico que codifica polipeptídeos de FVII modificados em um local do genoma, ou operativamente ligado a sequências regulatórias ou tal que é colocado operativamente ligado a sequências regulatórias em local do genoma. Essas células, então podem ser administradas local ou sistemicamente a um indivíduo, como um paciente que precisa de tratamento.

Os vetores virais, incluem, por exemplo, adenovirus, vírus adeno-associado (AAV), poxvirus, vírus de herpes, retrovirus e outros projetados para a terapia gênica podem ser empregados. Os vetores podem permanecer episomais ou podem integrar os cromossomos do indivíduo tratado. O polipeptídeo de FVII modificado pode ser expresso por um vírus, que é administrado a um indivíduo que necessita de tratamento. Os vetores virais adequados para a terapia genética incluem adenovirus, vírus adeno- associado (AAV), retrovirus, lentivirus, virus vaccinia e outros mencionados acima. Por exemplo, a tecnologia de expressão de adenovirus é bem conhecido na técnica e produção e administração de adenovirus também são bem conhecidas. Sorotipos de adenovirus estão disponíveis, por exemplo, da American Type Culture Collection (ATCC, Rockville, MD) . Adenovirus pode ser usado ex vivo, por exemplo, as células são isoladas de um paciente que precisa de tratamento, e transformadas com um vetor de adenovirus que expressa polipeptídeos de FVII modificados. Após um periodo de cultura adequado, as células transferidas são administradas a um individuo, local e/ou sistemicamente. Alternativamente, partículas de adenovirus que expressa polipeptideo de FVII modificado são isoladas e formuladas em um veiculo farmaceuticamente aceitável para a entrega de uma quantidade terapeuticamente eficaz para prevenir, tratar ou amenizar uma doença ou condição de um individuo. Normalmente, as partículas de adenovirus são entregues em uma dose de partícula variando de 1 a IO14 partículas por quilograma de peso do individuo, geralmente entre de 106 ou 108 partículas a 1012 partículas por quilograma de peso do individuo. Em algumas situações é desejável para proporcionar uma fonte de ácidos nucléicos com um agente que direciona as células, tal como um anticorpo especifico para uma proteina da membrana da superficie celular ou uma célula alvo, ou um ligante para um receptor em uma célula alvo. FVII também podem ser direcionado para entrega em tipos específicos de células. Por exemplo, vetores adenovirais que codificam polipeptideos de FVII podem ser usados para a expressão estável em células que não se dividem, como células do figado (Margaritis et al. (2004) J Clin Invest 113:1025-1031). Em outro exemplo, vetores virais ou não virais que codificam polipeptideos de FVII podem ser transformados em células isoladas para posterior entrega. Tipos de células adicionais para expressão e entrega de FVII podem incluir, mas não estão limitados a, fibroblastos e células endoteliais.

As moléculas de ácido nucléico podem ser introduzidas em cromossomos artificiais e outros vetores não virais. Cromossomos artificiais, tais como ACES (ver, Lindenbaum et al (2004) Nucleic Acids Res 32(21):el72) podem ser projetados para codificar e expressar a isoforma. Resumidamente, cromossomos artificiais de mamiferos (SMAC) fornecem meios para introduzir grandes cargas de informação genética dentro da célula em uma replicação de forma autônoma, não integrando o formato. A única entre MACs, a Expressão de Cormossoma Artificial (ACE) baseada em DNA satélite de mamiferos pode ser reproduzivelmente gerada de novo em linhagens celulares de diferentes espécies e prontamente purificada a partir de cromossomos das células hospedeiras. ACEs purificada de mamiferos podem então ser re-introduzidas em uma variedade de destinatário linhas linhagens celulares receptoras que tenham sido mantidas de forma estável por longos periodos na ausência de pressão seletiva, utilizando um sistema ACE. Usando essa abordagem, a carga específica de um ou dois genes alvo foi alcançada células LMTK(-) e CHO.

Outro método para a introdução de ácidos nucléicos que codificam polipeptídeos de FVII modificados é uma técnica de substituição de genes de duas etapas em levedura, começando com um genoma completo do adenovirus (Ad2; Ketner et al. (1994) PNAS 91:6186-6190) clonados em um cromossomo artificial de levedura (YAC) e um plasmídeo contendo sequências de adenovirus para direcionar uma região específica no clone de YAC, um cassete de expressão para o gene de interesse e um marcador selecionável positivo e negativo. YACs são de especial interesse, pois permite a incorporação de genes maiores. Essa abordagem pode ser usada para construção de vetores baseados em adenovirus sustentando ácidos nucléicos que codificam qualquer um dos polipeptídeos de FVII modificados descritos para transferência gênica para células de mamíferos ou animais inteiros.

Os ácidos nucléicos podem ser encapsulados em um veículo, tais como lipossomas, ou introduzidos em células, como uma célula bacteriana, especíalmente uma bactéria atenuada ou introduzido em um vetor virai. Por exemplo, quando os lipossomas são empregados, as proteínas que se ligam a uma proteína de membrana de superfície celular associada com endocitose podem ser utilizadas para a direcionamento e/ou para facilitar a absorção, por exemplo, proteínas do capsídeo ou fragmentos do memso para um tipo de célula em particular, os anticorpos para proteínas que se submetem a internalização no ciclismo, e as proteinas que direcionam a localização intracelular e aumentam a meia-vida intracelular.

Para métodos ex vivo e in vivo, moléculas de ácido nucléico que codificam os polipeptídeos de FVII modificados são introduzidas em células que são de um doador ou individuo a ser tratado apropriado. Células em que um ácido nucléico pode ser introduzido para fins de terapia incluem, por exemplo, qualquer desejada, tipo de 1Q célula adequado disponível para a doença ou condição a ser tratada, incluindo mas não limitado às células epiteliais, células endoteliais, queratinócitos, fibroblastos, células musculares, hepatócitos; células do sangue, como linfócitos T, linfócitos B, monócitos, macrófagos, neutrófilos, 15 eosinófilos, megacariócitos, granulócitos; várias células tronco ou progenitoras, em particular células tronco ou progenitoras hematopoiéticas, por exemplo, como células tronco obtidas da medula óssea, sangue de cordão umbilical, sangue periférico, fígado fetal, e outras fontes da mesma.

Para o tratamento ex vivo, as células de um doador compatível com o indivíduo a ser tratado ou as células o indivíduo a ser tratado são removidas, o ácido nucléico é introduzido nessas células isoladas e as células modificadas são administradas ao indivíduo. 0 tratamento 25 inclui a administração direta, como, por exemplo, encapsulado dentro de membranas porosas, que são implantadas no paciente (ver, por exemplo, Patentes US N°s 4.892.538 e 5.283.187 cada uma das quais é aqui incorporada por referência, na sua totalidade). Técnicas adequadas para a transferência de ácidos nucléicos em células de mamiferos in vitro incluem o uso de lipossomas e lipidios catiônicos (por exemplo, DOTMA, DOPE e DC-Chol) eletroporação, microinjeção, fusão celular, DEAE-dextrano, e métodos de precipitação de fosfato de cálcio. Métodos de entrega de DNA podem ser usados para expressar polipeptideos de FVII modificados in vivo. Tais métodos incluem entrega de lipossomas de ácidos nucléicos e de entrega de DNA livre, incluindo a entrega no local e sistêmica, tais como eletroporação ultrassonografia, e entrega de fosfato de cálcio. Outras técnicas incluem a microinjeção, fusão celular, transferência de genes mediada por cromossomo, transferência de genes mediada por microcélula e fusão de esferoplastos.

A expressão in vivo de um polipeptideo de FVII modificado pode ser ligada a expressão de moléculas adicionais. Por exemplo, a expressão de um polipeptideo de FVII modificado pode estar relacionada com a expressão de um produto citotóxico, como em um virus projetado ou expressa em um virus citotóxico. Tais virus podem ser direcionados a um tipo particular de célula que é alvo de um efeito terapêutico. O polipeptideo de FVII modificado expresso pode ser usado para aumentar a citotoxicidade do virus.

A expressão in vivo de um polipeptideo de FVII modificado pode incluir ligar operativamente molécula de ácido nucléico que codifica polipeptideo de FVII modificado a sequências regulatórias especificas como um promotor especifico de células ou especifico de tecidos. Polipeptídeos de FVII modificados também podem ser expressos de vetores que especificamente infectam e/ou reproduzem em tipos de células e/ou tecidos alvo. Promotores induziveis podem ser usados para, seletivamente, regular a expressão de polipeptídeos de FVII modificados. Um sistema de expressão exemplar regulável é o sistema de expressão do gene induzivel por doxiciclina, que tem sido usado para regular a expressão de FVII recombinante (Srour et al (2003) Thromb Haemost 90(3):398-405).

Moléculas de ácido nucléico, como ácidos nucleicos livres ou em vetores, cromossomos artificiais, lipossomas e outros veiculos podem ser administradas ao indivíduo por administração sistêmica, tópica, local e outras vias de administração. Quando sistêmica e in vivo, a molécula de ácido nucléico ou um veiculo contendo a molécula de ácido nucléico pode ser direcionada a uma célula.

A administração também pode ser direta, como pela administração de um vetor ou células que geralmente direcionam uma célula ou tecido. Por exemplo, células tumorais e proliferação podem ser direcionadas para a expressão in vivo de polipeptídeos de FVII modificados. As células utilizadas na expressão in vivo de um polipeptideo de FVII modificado incluem também as células autólogas para o paciente. Essas células podem ser removidas de um paciente, ácidos nucléicos para a expressão de um polipeptideo de FVII modificado introduzidos, e então administrado a um paciente, como por injeção ou enxerto.

H. Usos Terapêuticos

Os polipeptídeos de FVII modificados providos 5 neste documento podem ser usados para o tratamento de qualquer condição para que FVII recombinante é empregado. Normalmente, esses tratamentos incluem aqueles onde um aumento da coagulação, como aumento da resposta hemostática, é desejada. Polipeptídeos de FVII modificados 10 têm atividade terapêutica isoladamente ou em combinação com outros agentes. Os polipeptídeos modificados providos aqui são projetados para manter a atividade terapêutica, mas apresentam propriedades alteradas, nomeadamente aumento da resistência à AT-III e aumento da atividade catalítica. Os 15 polipeptídeos modificados providos aqui também podem apresentar maior resistência à TFPI, aumento da resistência aos efeitos inibitórios de Zn2+, melhora nas propriedades farmacocinéticas, como a meia-vida sérica, aumento da ligação e/ou afinidade por plaquetas ativadas, maior 20 ligação e/ou afinidade por albumina sérica, e/ou aumento de ligação e/ou afinidade por integrina plaquetária ocubβa. Tais propriedades alteradas, por exemplo, pode melhorar a eficácia terapêutica dos polipeptídeos devido ao aumento da atividade coagulante do polipeptídeos de FVII modificados.

Esta seção fornece usos exemplares e métodos de administração. Estes tratamentos descritos são exemplares e não limitam as aplicações de polipeptídeos de FVII modificados.

Os polipeptideos de FVII modificados providos neste documento podem ser utilizados em diversos métodos terapêuticos, bem como métodos de diagnóstico, no qual FVII é empregado. Tais métodos incluem, mas não estão limitados a, métodos de tratamento de condições fisiológicas e medicinais descritas e listadas abaixo. Polipeptideos de FVII modificados providos neste documento podem exibir melhoria das atividades in vivo e efeitos terapêuticos em comparação com FVII do tipo selvagem, incluindo uma menor dosagem para atingir o mesmo efeito, e outras melhorias na administração e no tratamento, como menos e/ou menos frequentes administrações, diminuição efeitos colateriais e aumento dos efeitos terapêuticos. Embora seja entendido que os polipeptideos de FVII modificados podem ser administrados como um zimogênio de FVII (isto é, forma de cadeia única), normalmente os polipeptideos de FVII modificados providos aqui são administrados em uma forma de duas cadeias ativada seguindo, para exemplo, autoativação ou ativação por outros fatores de coagulação, como durante a purificação.

Em particular, polipeptideos de FVII modificados são destinados ao uso de métodos terapêuticos em que FVII foi usado para o tratamento. Tais métodos incluem, mas não estão limitados a, métodos de tratamento de doenças e distúrbios, tais como, mas não limitado a, distúrbios de coagulação do sangue, doenças hematológicas, distúrbios hemorrágicos, hemofilias, como hemofilia A, hemofilia B,deficiência de fator VII, e doenças do sangue adquiridas, como deficiência do fator VII adquirida causada por doença hepática. Polipeptídeos de FVII modificados também podem ser usados no tratamento de doenças e distúrbios de sangramento adicional, tais como, mas não limitado a, 5 trombocitopenia (por exemplo, como devido a regimes de quimioterapia) , doença de Von Willebrand, distúrbios das plaquetas hereditários (por exemplo, doença de reserva como sindromes de Chediak-Higashi e Hermansky-Pudlak, disfunção de tromboxano A2, trombastenia de Glanzmann e sindrome de Bernard-Soulier) , sindrome hemolitico-urêmica,Telangiectsasia Hemorrágica Hereditária, também conhecida como doença de Rendu-Osler-Weber, púrpura alérgica (púrpura de Henoch Schonlein) e coagulação intravascular disseminada.

Em algumas modalidades, os sangramentos para ser tratados por polipeptideos de FVII ocorrem em órgãos como o cérebro, região interna da orelha, olhos, fígado, pulmão, tecido tumoral, tcamundongo gastrointestinal. Em outras modalidades, o sangramento é difuso, como na gastrite hemorrágica e sangramento uterino profuso. Pacientes com distúrbios hemorrágicos, como por exemplo, hemofilia A e B, muitas vezes correm o risco de complicações hemorrágicas durante a cirurgia ou trauma. Tal sangramento pode ser manifestado como hemartroses agudas (sangramentos nas articulações), a artropatia hemofílica crônica, hematomas (por exemplo, muscular, retroperitoneal, sublingual e retrofaríngeo), hematúria (sangramento do tcamundongo renal), hemorragias no sistema nervoso central, hemorragias gastrintestinais (por exemplo, sangramentos UGI) e hemorragia cerebral, o que também pode ser tratado com polipeptídeos de FVII modificados. Além disso, qualquer sangramento associado com cirurgia (por exemplo, hepatectomia) , ou extração dentária pode ser tratado com polipeptídeos de FVII modificados. Em uma modalidade, os polipeptídeos de FVII modificados podem ser usados para tratar episódios de sangramento por trauma ou cirurgia, ou contagem ou atividade de plaquetas baixa, em um individuo. Métodos exemplares para os pacientes submetidos a cirurgia incluem tratamentos para prevenir a hemorragia e tratamentos antes, durante ou após cirurgias, tais como, mas não limitado a, cirurgia cardíaca, angioplastia, cirurgia torácica, cirurgia abdominal, cirurgia da coluna, cirurgia cerebral, cirurgia vascular, cirurgia dentária ou cirurgia de transplante de órgãos, incluindo o transplante de medula óssea, coração, pulmão, pâncreas ou fígado.

Tratamento de doenças e condições com polipeptídeos de FVII modificados pode ser efetuado por qualquer via de administração adequada utilizando formulações adequadas como descrito aqui incluindo, mas não limitado a, injeção, administração pulmonar, oral e transdérmica. 0 tratamento geralmente é realizado por administração de bolus intravenoso.

Se necessário, uma determinada dosagem e duração e protocolo de tratamento podem ser empiricamente determinados ou extrapolados. Por exemplo, doses exemplars de polipeptídeos de FVII recombinantes e nativos podem ser usadas como ponto de partida para determinar as dosagens adequadas. Por exemplo, um polipeptideo de FVII recombinante (rFVIIa), que foi ativado para rFVIIa, NovoSeven®, foi administrado a pacientes com hemofilia A ou hemofilia B, que estavam experimentando um episódio hemorrágico, na dose de 90 μg/kg por infusão em bolus por 2 a 5 minutos, atingindo um nivel eficaz de circulação de pelo menos 2 μg/ml, com uma meia-vida média de 2,7 horas. A dose foi repetida a cada 2 horas até que a hemostasia foi alcançada. Polipeptideos de FVII modificados que têm uma atividade coagulante aumentada, devido, por exemplo, ao aumento da resistência à AT-III, ao aumento da atividade catalítica, ao aumento da resistência ao efeito inibitório do Zn2+, ao aumento da resistência à TFPI, à melhora das propriedades farmacocinéticas, como aumento meia-vida sérica, aumento da afinidade e/ou ligação plaquetas ativadas, aumento da ligação e/ou afinidade para a albumina sérica, e/ou aumento da ligação e/ou afinidade por integrina plaquetária ctubβa, pode ser eficaz em quantidades de dosagem e/ou frequênciareduzidas comparado ao FVII recombinante. As dosagens de polipeptideos de FVII tipo selvagem ou não modificado podem ser usadas como orientação para determinar dosagens para polipeptideos de FVII modificados. Fatores como o nivel de atividade e meia- vida do FVII modificado em comparação com o FVII não modificado podem ser usados na tomada de tais determinações. Dosagens e regimes específicos podem ser determinados empiricamente.

Os níveis de dosagem e os regimes podem ser determinados com base em dosagens e regimes conhecidos, e, se necessário, podem ser extrapolados com base na alteração das propriedades dos polipeptídeos modificados e/ou podem ser determinados empiricamente com base em uma variedade de fatores. Tais fatores incluem o peso corporal do indivíduo, saúde geral, idade, atividade do composto específico utilizado, sexo, dieta, tempo de administração, taxa de excreção, combinação de drogas, gravidade e curso da doença, e disposição do paciente para da doença e julgamento do médico assistente. O ingrediente ativo, o polipeptideo, normalmente é combinado com um veículo farmaceuticamente eficaz. A quantidade de ingrediente ativo que pode ser combinado com materiais de suporte para produzir uma forma de dosagem única ou forma de dosagem múltipla pode variar dependendo do hospedeiro tratado e do modo de administração em particular.

O efeito dos polipeptídeos de FVII sobre o tempo de coagulação do sangue pode ser monitorado usando qualquer um dos testes de coagulação conhecidos na técnica incluindo, mas não limitado à, tempo de protrombina no sangue total (PT), tempo de tromboplastina parcial ativada (aPTT), tempo de coagulação ativada (ACT), tempo de coagulação ativada recalcifada, ou tempo de coagulação de Lee-White.

Após a melhoria da condição de um paciente, uma dose de manutenção de um composto ou composições pode ser administrada, se necessário; e a dosagem, forma de deosagem ou frequência de administração, ou uma combinação dos mesmos podem ser modificadas. Em alguns casos, um individuo pode necessitar de tratamento intermitente a longo prazo com base em qualquer ocorrência de sintomas da doença, ou baseado em dosagens programadas. Em outros casos, administrações adicionais podem ser necessárias em resposta a eventos agudos, tais como hemorragia, trauma ou procedimentos cirúrgicos.

A seguir estão algumas condições exemplares para o qual FVII (administrado como FVIIa) tem sido usado como agente de tratamento isolado ou em combinação com outros agentes.

1. Disgunções de sangramento congênito a. Hemofilia

Hemofilia congênita é uma doença do sangue recessiva em que há diminuição dos niveis de fatores de coagulação no plasma, levando à interrupção da cascata de coagulação e aumento do tempo de coagulação da mancha. Hemofilia A, que responde por aproximadamente 85% de todos os casos de hemofilia, resulta das mutações no gene do fator VIII no cromossomo X, levando a uma deficiência ou disfunção da proteina FVIII. A hemofilia B é causada por uma deficiência ou disfunção do fator de coagulação, FIX, geralmente resultante de mutações ou deleções de pontuais no gene FIX no cromossomo X. A incidência mundial da hemofilia A é de aproximadamente 1 caso por 5000 indivíduos do sexo masculino, e 1 caso por 25 mil homens para ahemofilia B. Hemofilia A e B são ainda classificadas como leve, moderada ou grave. Um nivel plasmático de 5% a 25% do fator VIII ou IX de funcionamento normal é classificado como leve, 1% a 5% é moderado, e menos que 1% é grave. Hemofilia C, muitas vezes referida como a deficiência FIX, é uma doença relativamente leve e rara, afetando aproximadamente 1 em 100.000 pessoas de uma forma autossômica recessiva.

Hemofilia A e B se manifesta clinicamente de diversas formas. Pequenos cortes e abrasões não irão resultar em sangramento excessivo, mas traumas e cirurgias irão. O paciente também terá vários sangramentos articulares e musculares e machucados fáceis. Hemartrose ou hemorragia nas articulações é uma das principais complicações na hemofilia, e pode ocorrer espontaneamente ou em resposta a trauma. As juntas de articulação, como o joelho, cotovelo e tornozelo, são afetadas com mais frequência. O quadril e o ombro são afetados muito menos frequentemente como a junta articulada tem mais musculatura ao seu redor, protegendo-as mais de uma lesão. O sangramento pode causar dor aguda grave, restringir o movimento e levar a complicações secundárias, incluindo a hipertrofia sinovial. Além disso, o sangramento recorrente nas articulações pode causar sinovite crônica, que pode causar lesões articulares, destruição da cartilagem sinovial e óssea. Hemorragias com risco de vida, tais como hemorragia intracraniana e sangramento no sistema nervoso central, também aflige indivíduos hemofílicos. Hemorragia intracraniana ocorre em aproximadamente 10% dos pacientes com hemofilia severa, resultando em uma taxa de mortalidade de 30%. Em contraste, hemofilia C é mais leve. Sangramentos espontâneos são raramente vistos e sangramento nas articulações, tecidos moles e músculos também é incomum. O sangramento é geralmente tratado com transfusão de plasma fresco congelado (PFC), terapia de reposição de FXI, ou, para o tratamento tópico, como tratamento de ferimentos externos ou extrações dentárias, cola de fibrina.

O tratamento mais comum para a hemofilia A ou B é a terapia de substituição, em que ao paciente é administrado FVIII ou FIX. As formulações estão disponíveis comercialmente como produtos derivados do plasma ou recombinante, com proteinas recombinantes agora sendo o tratamento de escolha em pacientes não tratados previamente. Embora essas terapias possam ser muito bem sucedidas, as complicações surgem quando o paciente desenvolve inibidores do fator VIII ou fator IX recém- administrado. Os inibidores são anticorpos IgG, principalmente da subclasse IgG4, que reagem com FVIII ou FIX e interferem com a função de pró-coagulante. Inibidores afetam cerca de 1 em cada 5 pacientes com hemofilia A grave. A maioria dos indivíduos desenvolve esses inibidores logo após a administração das primeiras infusões de fator VIII, que é muitas vezes na infância, embora os indivíduos os desenvolva mais tarde na vida. Inibidores também afetam cerca de 1 em 15 pessoas com hemofilia A leve ou moderada. Estes inibidores geralmente se desenvolvem durante a vida adulta e não apenas destroem FVIII exógeno administrado, mas também destroem FVIII endógeno. Como resultado, os hemofílicos leves e moderados se tornam graves. Clinicamente, pacientes com hemofilia A com inibidores são classificados em respondedores altos e baixos de acordo com a força da resposta anamnéstica que experimentam quando são re-expostos ao FVIII. Inibidores afetam cerca de 1 em 100 pacientes com hemofilia B. Na maioria dos casos, os inibidores se desenvolvem após a primeira infusão de fator IX terapêutico e podem ser acompanhados por reações alérgicas.

Os polipeptídeos de FVII modificados providos aqui podem ser usados para tratar pacientes com hemofilia, particularmente doentes hemofílicos com inibidores. Um produto FVIIa recombinante (NovoSeven, Novo Nordisk), foi aprovado e licenciado para o tratamento de episódios hemorrágicos em hemofilia A ou B para pacientes com inibidores de FVIII ou FIX e para a prevenção de hemorragias em intervenções cirúrgicas ou procedimentos invasivos em pacientes com hemofilia A ou B com inibidores de FVIII ou FIX. O tratamento com rFVIIa aumenta a geração de trombina, enquanto evita a exigência de FVIIIa e/ou FIXa. A coagulação é iniciada no local da lesão, pela interação de rFVIIa com TF, resultando na ativação inicial de FX, geração de trombina e ativação das plaquetas. A coagulação completa por rFVIIa pode ser efetuada através dos mecanismos dependentes de TF e independentes de TF, onde algumas das trombinas geradas podem resultar da ativação direta do FX em plaquetas ativados por rFVIIa sozinho, que se liga a plaquetas ativadas por meio de interações de baixa afinidade com membranas de fosfolipidios.

Os polipeptideos de FVII modificados providos neste documento podem ser usados em terapias para hemofilia, incluindo o tratamento de episódios hemorrágicos e na prevenção de hemorragias em intervenções cirúrgicas ou procedimentos invasivos. Os polipeptideos de FVII modificados aqui podem fornecer maior resistência a AT-III, aumento da atividade catalítica, aumento da resistência ao efeito inibitório do Zn2+, aumento da resistência à TFPI, melhora das propriedades farmacocinéticas, como a meia vida sérica, aumento da ligação e/ou afinidade de plaquetas, maior ligação e/ou de afinidade para a albumina sérica e/ou aumento da ligação e/ou afinidade por integrina plaquetária otubβa. Os polipeptideos de FVII podem, portanto, mostrar maior atividade coagulante de forma dependente de TF (como o aumento da resistência à TFPI), e/ou de forma independente de TF (como através de uma maior ligação e/ou afinidade com plaquetas) . Assim, os polipeptideos de FVII modificados podem ser usados para fornecer terapias mais ativas para a hemofilia. Exemplos de melhoramentos terapêuticos usando polipeptideos de FVII modificados incluem, por exemplo, mas não estão limitados a, dosagens mais baixas, menos e/ou menos frequentes administrações, diminuição de efeitos colaterais e aumento dos efeitos terapêuticos.

Os polipeptídeos de FVII modificados normalmente são administrados como polipeptídeos de FVII ativados (FVIIa). Polipeptídeos de FVII modificados podem ser testados quanto à eficácia terapêutica, por exemplo, usando modelos animais. Por exemplo, camundongos hemofílicos induzidos por anticorpos, ou qualquer outro modelo de doença conhecido para a hemofilia, pode ser tratado com polipeptídeos de FVII modificados. A progressão dos sintomas da doença e fenótipos são monitorados para avaliar os efeitos dos polipeptídeos de FVII modificados. Polipeptídeos de FVII modificados também podem ser administrados a indivíduos, como nos ensaios clínicos para avaliar a eficácia in vivo em comparação aos controles de placebo e/ou controles usando FVII não modificado.

b. Deficiência de FVII

A deficiência de fator VII é um distúrbio hemorrágico autossomal recessivo que afeta aproximadamente 1 em 500.000 pessoas. A deficiência de FVII pode ser clinicamente leve, moderada ou severa, com deficiência leve a moderada, caracterizada por um aumento de hemorragia após a cirurgia e trauma. Pacientes com deficiência de FVII grave (menos de 1% da atividade FVII) apresentam sintomas semelhantes à hemofilia. Por exemplo, indivíduos com deficiência de FVII são propensos a hemorragias nas articulações, sangramento nasal espontâneo, hemorragia digestiva, sangramento do tcamundongo urinário. Sangramento intracerebral e hemorragia muscular também foram notificados, enquanto as mulheres podem experimentar menorragia grave (sangramento menstrual abundante). 0 tratamento pode ser efetuado pela terapia de reposição. Um produto de FVIIa recombinante (NovoSeven®, Novo Nordisk), foi aprovado e licenciado para o tratamento de episódios hemorrágicos em doentes com deficiência congênita de FVII e para a prevenção de hemorragias em intervenções cirúrgicas ou procedimentos invasivos em pacientes com deficiência congênita de FVII. Assim, os polipeptideos de FVII modificados providos aqui podem ser igualmente utilizados. Os polipeptideos de FVII modificados providos neste documento podem ser usados no tratamento de episódios hemorrágicos e na prevenção de hemorragias em intervenções cirúrgicas ou procedimentos invasivos em pacientes com deficiência de FVII. Por exemplo, a um paciente neonatal que apresenta com deficiência de FVII grave, com hemorragia intracraniana pode ser administrado polipeptideos de FVII modificados por bolus intravenoso para efeituar coagulação e manter a hemostasia. Geralmente os polipeptideos de FVII modificados são administrados como polipeptideos de FVII ativado (FVIIa).

c. Outros

Outros distúrbios hemorrágicos podem ser tratados com os polipeptideos de FVII providos aqui para promover a coagulação. Deficiências congênitas dos fatores V e X também apresentam aumento do tempo de coagulação do sangue e podem, potencialmente, ser tratados com a administração de doses terapêuticas de FVII. Por exemplo, a um paciente com deficiência de fator X pode ser administrado rFVIIa para controlar o sangramento associado com esplenectomia (Boggio et al. (2001) Br J Haematol 112:1074-1075). Episódios de sangramento espontâneo e associado à cirurgia associados com doença de von Willebrand (vWD) também podem ser tratados com o polipeptideos de FVII modificados providos aqui. VWD é uma doença hemorrágica causada por um defeito ou deficiência da proteina de coagulação do sangue, fator de von Willebrand (vWF), e é estimada para ocorrer em 1% a 2% da população. Indivíduos com contusão de vWD têm facilmente hemorragias nasais recorrentes, sangramento após extração dentária, tonsilectomia ou outra cirurgia, e as pacientes mulheres podem ter aumento do sangramento menstrual. Polipeptideos de FVII modificados podem ser usados para melhorar hemorragia espontânea e sangramento associado a cirurgias em pacientes com vWD (von Depka et al. (2006) Blood Coagul Fibrin 17:311-316). Outros distúrbios hemorrágicos relacionados a plaquetas, como por exemplo, trombastenia de Glanzmann e sindrome Hermansky- Pudlak também estão associados à atividade endógena reduzida de coagulação. O excesso de sangramento espontâneo ou sangramento associado a cirurgias em pacientes com distúrbios de sangramento relacionados a plaquetas também pode ser controlado por doses terapêuticas dos polipeptideos de FVII modificados. Por exemplo, um paciente submetido à cirurgia com trombastenia de Glanzmann pode ser tratado antes, durante e/ou após a cirurgia com os polipeptideos de FVII modificados para evitar importante perda de sangue (van Buuren et al. (2002) Dig Dis Sci 47:2134-2136). Geralmente, os polipeptídeos de FVII modificados são administrados como polipeptídeos de FVII ativado (FVIIa).

2. Distúrbios hemorrágicos adquiridos a. Trombocitopenia adquirida com quimioterapia

Distúrbios de sangramento também podem ser adquiridos, além de congênitos. Por exemplo, o tratamento de quimioterapia, tais como para leucemia e outros cânceres, pode resultar em trombocitopenia. Isto é provavelmente devido a uma perda de produção de plaquetas na medula óssea dos pacientes submetidos à quimioterapia e, normalmente, ocorre 6 a 10 dias após a medicação. O tratamento da trombocitopenia adquirida é geralmente por transfusão de plaquetas, glóbulos vermelhos ou plasma, que serve para evitar qualquer sangramento anormal espontâneo, que pode resultar da deficiência de plaquetas. Sangramento em pacientes com trombocitopenia induzida por quimioterapia, ou qualquer outra trombocitopenia congênita ou adquirida, também podem ser controlado pela administração de quantidades terapêuticas dos polipeptídeos de FVII modificados providos aqui. Por exemplo, a um paciente trombocitopênico com hemorragia descontrolada, como no tcamundongo gastrintestinal, pode ser administrada uma injecção de bólus intravenoso de uma quantidade terapêutica de polipeptideo de FVII para parar a hemorragia (Gerotziafas et al (2002) Am J Hematol 69:219-222). Geralmente, os polipeptídeos de FVII modificados são administrados como polipeptídeos de FVII ativados (FVIIa).

b. Outras coagulopatias

Outras coagulopatias adquiridas podem ser tratadas usando os polipeptideos de FVII modificados apresentados aqui. Coaguiopatia pode resultar de condições incluindo, mas não limitado a, insuficiência hepática fulminante (FHF, tais como causada por drogas hepatotóxicas, toxinas, doenças metabólicas, doenças infecciosas e isquemia), outras doenças hepáticas, incluindo cirrose e doenças associadas com a doença de Wilson, deficiência de vitamina de K (como a causado pelo tratamento com antibióticos ou dieta), sindrome urêmica hemolitica, trombocitopenia trombótica (TTC) e coaguiopatia intravascular disseminada (DIC). 0 tratamento convencional é geralmente através de transfusão com plasma, glóbulos vermelhos (RBC), ou plaquetas, mas pode não ter sucesso. Em uma modalidade, os polipeptideos de FVII modificados podem ser administrados a um paciente com FHF submetido a procedimentos invasivos para prevenir hemorragias. O tratamento convencional com plasma fresco congelado (FFP) é frequentemente mal sucedido e pode exigir grandes quantidades de plasma, produzindo sobrecarga de volume e anasarca (uma infiltração generalizada de fluido de edema no tecido conjuntivo subcutâneo). O tratamento com quantidades terapêuticas de polipeptideos de FVII modificados por bolus intravenoso, durante, antes e/ou após a cirurgia invasiva, como, por exemplo, biópsia do figado ou transplante hepático, pode impedir o sangramento e estabelecer hemostasia em pacientes com FHF. O paciente pode ser monitorado pelo PT do sangue para determinar a eficácia do tratamento (Placeboi et al. (2003) Liver Transpl 9:138-143). Em outra modalidade, FVII pode ser administrado a um paciente com hemorragia grave associada à coagulopatia, como, por exemplo, hemorragia pós-cesárea intra-abdominal grave associada à disfunção hepática e DIC, que não respondem a infusões de transfusões convencionais (Moscardo et al. (2001) Br J Haematol 113:174-176). Além disso, os polipeptideos de FVII modificados podem ser usados para tratar coagulopatias em pacientes neonatais e pediátricos. Em uma modalidade particular, os pacientes neonatais e pediátricos não respondem ao tratamento convencional, como RBC e infusão de plaquetas. Por exemplo, aos recém-nascidos com hemorragia pulmonar grave associada a PTs aumentados que não respondem a RBC e transfusão de plaquetas pode ser administrado polipeptideos de FVII modificados para diminuir PT e estabelecer hemostasia (Olomu et al. (2002) J Perinatol 22:672-674). Os polipeptideos de FVII modificados providos aqui exibem atividade de coagulação aprimorada em comparação com polipeptideos de FVII não modificados, podendo ser administrado, por exemplo, em doses menores, com menor frequência e com menos reações adversas. Geralmente os polipeptideos de FVII modificados são administrados como polipeptideos de FVII ativados (FVIIa).

c. Transplante adquirida sangramento

Hemorragia grave após transplante de medula óssea (TMO) e transplante de células tronco (SCT) é uma complicação relativamente comum e com risco de vida associados a estes processos, devido à redução das plaquetas. Por exemplo, hemorragia alveolar difusa (DAH) é uma complicação pulmonar de TMO com uma incidência estimada de 1 a 21% na população de transplante, e uma taxa de mortalidade de 6 a 100%. O tratamento convencional de tais episódios de sangramento inclui o tratamento com corticosteróides e transfusão de plasma, plaquetas e/ou glóbulos vermelhos, embora estes sejam muito mal sucedidos com uma taxa de mortalidade global de cerca de 50% (Hicks et al. (2002) Bone Marrow Transpl 30:975-978). Administração de FVII por bolus intravenoso, com ou sem tratamento concomitante com corticosterioids e/ou infusão de plaquetas pode ser realizada para tratar DAH e estabelecer hemostasia (Hicks et al. (2002) Bone Marrow Transpl 30:975-978). Os polipeptideos de FVII modificados providos aqui exibem atividade de coagulação aprimorada em comparação com polipeptideos de FVII não modificados, e pode, portanto, ser administrado, por exemplo, em doses menores, menos frequentemente, ao longo de um menor tempo de tratamento, e com menos reações adversas para a mesma actividade biológica e eficácia. Geralmente os polipeptideos de FVII modificados são administrados como polipeptideos de FVII ativados (FVIIa).

d. Anticoagulant te terapia hemorragia induzida

Pacientes submetidos a terapias anticoagulantes para o tratamento de doenças, como o tromboembolismo, podem apresentar episódios de hemorragia após a administração aguda de anticoagulantes, como varfarina, heparina e fondaparinux, ou desenvolver distúrbios hemorrágicos como resultado uso a longo prazo desse tipo de terapia. Tratamentos para episódios hemorrágicos geralmente incluem a administração de pró-coagulantes, tais como a vitamina K, plasma, FIX exógeno, e protaminas para neutralizar a heparina. Administração de FVII exógeno também pode ser realizada para neutralizar o efeito dos anticoagulantes, aumentar PT, aPTT, e/ou outros marcadores de coagulação e estabelecer hemostasia (Deveras et al. (2002) Ann Inten Med 137:884-888). Os polipeptídeos de FVII modificados providos neste documento podem ser usados em tratamentos para controle de episódios hemorrágicos em doentes com distúrbios hemorrágicos adquiridos devido a tratamentos com anticoagulantes. Geralmente os polipeptídeos de FVII modificados são administrados como polipeptídeos de FVII ativados (FVIIa).

e. Hemofilia adquirida

Inibidores do factor VIII podem se desenvolver espontaneamente em indivíduos saudáveis, resultando em uma condição conhecida como "hemofilia adquirida". A hemofilia adquirida é uma condição rara, com uma incidência anual de 0,2 a 1,0 por milhão de habitantes. Os auto-anticorpos são principalmente anticorpos IgG4, que, quando acoplados ao FVIII, inibem a atividade de FVIII, interferindo com clivagem da trombina, a interação de fator de von Willebrand e/ou ligação de fosfolipídeos. Isso resulta em hemorragias fatais em aproximadamente 87% dos pacientes acometidos. Os lugares mais comuns de sangramento são a pele, mucosas, músculos e retroperitônio, em contraste com pacientes com hemofilia hereditária que sangram predominantemente nas articulações e músculos. A hemofilia adquirida pode ser tratada com um concentrado de complexo de protrombina ativada ou fator VII ativado recombinante (NovoSeven®, Novo Nordisk) para controlar os episódios de sangramento. Os polipeptideos de FVII modificados providos aqui exibem atividade de coagulação aprimorada em comparação com polipeptideos de FVII não modificados, podendo ser administrado, por exemplo, em doses menores, menos frequentemente, ao longo de um menor tempo de tratamento, e com menos reações adversas para a mesma actividade biológica e eficácia. Geralmente os polipeptideos de FVII modificados são administrados como polipeptideos de FVII ativados (FVIIa).

3. Sangramentos por trauma e cirúrgicos

Polipeptideos de FVII podem ser usados como terapia para tratar o sangramento associado à perda sanguinea peri-operatória e traumática em indivíduos com sistemas de coagulação normal. Por exemplo, os polipeptideos de FVII podem ser administrados a um paciente para promover a coagulação e reduzir a perda de sangue associados com a cirurgia e, ainda, reduzir a necessidade de transfusão de sangue. Em uma modalidade, polipeptideos de FVII podem ser administrados em indivíduos submetidos à prostatectomia retropúbica. POrostatectomia retropúbica é frequentemente associada com a perda de sangue maior e uma posterior necessidade de transfusão. A indivíduos submetidos à cirurgia ou similar pode ser dada um bolus intravenoso de uma quantidade terapêutica de FVII na primeira fase operatória para reduzir a perda sanguínea peri-operatória através da melhora de coagulação no local da cirurgia. Redução no resultado de perda de sangue na eliminação da necessidade de transfusão de sangue nesses pacientes (Friedrich et al. (2003) Lancet 361:201-205). Polipeptídeos de FVII podem ser administrados a pacientes com fatores de coagulação normais submetidos a outros tipos de cirurgia para efetuar de hemostasia rápida e evitar a perda de sangue. Exemplos não limitativos de procedimentos cirúrgicos em que FVII, geralmente administrado sob a forma ativada (ou seja, FVIIa), pode ser usada uma terapia para reduzir o sangramento peri-operatório incluem, mas não estão limitados a, cirurgia de válvula cardíaca (Al Douri et al (2000). Blood Coag Fibrinol 11:S121-S127), substituição da valva aórtica (Kastrup et al. (2002) Ann Thorac Surg 74:910-912), ressecção de hemangiopericitoma recidivante (Gerlach et al (2002). J Neurosurg 96:946-948), cirurgia de câncer (Sajdak et al (2002). Eur J Gynaecol Oncol 23:325-326), e cirurgia nas úlceras duodenais (Vlot et al. (2000) Am J Med. 108:421-423). O tratamento com FVII pode promover a hemostasia no local da cirurgia e reduzir ou evitar a perda de sangue, reduzindo ou suprimindo a necessidade de transfusão. Os polipeptídeos de FVII modificados providos aqui são projetados para que a actividade de coagulação aprimorada em comparação com polipeptídeos de FVII não modificados, e pode ser portanto, administrado, por exemplo, em doses menores, com menor frequência e com menos reações adversas. Geralmente os polipeptídeos de FVII modificados são administrados como polipeptídeos de FVII ativados (FVIIa).

Polipeptídeos de fator VII também podem ser usados para promover a coagulação e evitar a perda de sangue em pacientes com lesão traumática. Trauma é definido como uma lesão de tecidos vivos por um agente extrínseco, e é a quarta principal causa de morte nos Estados Unidos. 0 trauma é classificado como trauma contuso (resultando em compressão interna, lesões de órgãos e hemorragia interna) ou trauma penetrante (consequência de um agente penetrando no corpo e destruindo tecidos, vasos e órgãos, resultando em hemorragia externa). Trauma pode ser causado por vários eventos incluindo, mas não limitado a, acidentes de veículo (causando trauma contuso e/ou penetrante), ferimentos por arma de fogo (causando trauma penetrante), feridas por faca (causando trauma penetrante), acidentes com máquinas (causando trauma contuso e/ou penetrante), e quedas de alturas significativas (causando trauma contuso e/ou penetrante). Hemorragia descontrolada como resultado de um trauma é responsável pela maior parte da mortalidade associada. Coagulopatia difusa é uma complicação relativamente comum associada com pacientes vitimas de trauma, ocorrendo em até 25 a 36% dos indivíduos. Coagulopatia pode se desenvolver logo após a lesão,resultando de uma variedade de fatores, como diluição e consumo de fatores de coagulação e plaquetas, fibrinólise, acidose e hipotermia. Gestão convencional envolve a terapia de reposição através de transfusão com plaquetas de plasma fresco congelado (PFC), hemácias e/ou crioprecipitado, corrigindo a acidez, e tratando a hipotermia. Essas etapas muitas vezes são insuficientes para parar o sangramento e prevenir a morte. O tratamento através da administração de quantidades terapêuticas de FVII pode promover a coagulação e reduzir a perda de sangue em pacientes com trauma. Por exemplo, a um paciente com uma lesão de tiro apresentando sangue maciço, além da intervenção cirúrgica, é administrado FVII para controlar o sangramento por coagulopatia (Kenet et al. (1999) Lancet 354:1879), Terapia coagulante com FVII pode efetivamente reduzir a perda de sangue e hemorragia em pacientes com trauma contuso e penetrante (Rizoli et al (2006) Grit Care 10:R178). Os polipeptideos de FVII modificados providos aqui são projetados para exibir a atividade de coagulação aprimorada em comparação com polipeptideos de FVII não modificaos, e podem ser administrados, por exemplo, em doses menores, com menor frequência e com menos reações adversas. Geralmente os polipeptideos de FVII modificados são administrados como polipeptideos de FVII ativados (FVIIa).

I. Terapias de Combinação

Qualquer um dos polipeptideos de FVII modificados aqui descritos pode ser administrado em combinação com, antes, de forma intermitente com ou subsequente a outros agentes terapêuticos ou procedimentos, incluindo mas não limitado a, outros produtos biológicos, compostos de moléculas pequenas e cirurgia. Para qualquer doença ou condição, incluindo todas as exemplificadas acima, para o qual FVII (incluindo FVIIa e rFVIIa) é indicado ou que tenha sido utilizado e para que outros agentes e tratamentos estão disponíveis, FVII pode ser usado em combinação com ela. Assim, os polipeptídeos de FVII modificados providos aqui de forma semelhante podem ser usados. Dependendo da doença ou condição a ser tratada, combinações exemplares incluem, mas não estão limitadas a, combinação com outros fatores de coagulação de plasma purificado ou recombinante, pró-coagulantes, tais como a vitamina K, derivados de vitamina K e inibidores de proteina C, plasma, plaquetas, glóbulos vermelhos e corticosteróides.

J. Artigos de manufatura e kits

Compostos farmacêuticos de polipeptídeos de FVII modificados ou ácidos nucléicos que codificam polipeptídeos de FVII modificados, ou um derivado ou uma porção biologicamente ativa do mesmo podem ser empacotados como artigos de manufatura contendo material de embalagem, uma composição farmacêutica que é eficaz para tratar uma doença ou distúrbio hemostático, e uma etiqueta que indica que o polipeptideo de FVII modificado ou uma molécula de ácido nucléico é para ser usado para tratar a doença ou distúrbio hemostático.

Os artigos de manufatura providos neste documento contêm materiais de embalagem. Materiais de embalagens para uso em embalagens de produtos farmacêuticos são bem conhecidos por aqueles versados na técnica. Veja, por exemplo, Patentes dos US N°s 5.323.907, 5.052.558 e 5.033.352, cada uma das quais estâ incorporada neste documento em sua totalidade. Exemplos de materiais de embalagens farmacêuticas incluem, mas não estão limitados a, bolhas laminadas, garrafas, tubos, inaladores, bombas, sacolas, frascos, recipientes, seringas, garrafas e qualquer material de embalagem adequada para uma formulação selecionada e modo pretendido de administração e tratamento. Uma grande variedade de formulações dos compostos e composições providos aqui é considerada como uma variedade de tratamentos para qualquer doença ou distúrbio hemostático.

Polipeptídeos de FVII modificados e moléculas de ácido nucléico também podem ser fornecidos como kits. Kits podem incluir uma composição farmacêutica aqui descrita e um item para a administração. Por exemplo, um FVII modificado pode ser fornecido com um dispositivo de administração, tal como uma seringa, um inalador, um copo de dosagem, um conta- gotas ou um aplicador. O kit pode, opcionalmente, incluir instruções para aplicação, incluindo dosagens, posologias e instruções para os modos de administração. Kits também podem incluir uma composição farmacêutica aqui descrita e um item para diagnóstico. Por exemplo, esses kits podem incluir um item para medir a concentração, quantidade ou atividade de FVII ou um sistema de regulado de FVII de um indivíduo.

Os exemplos a seguir são incluídos para fins ilustrativos apenas e não se destinam a limitar o escopo da invenção.

K. Exemplos Exemplo 1 Clonagem e expressão de FVII A. Clonagem de FVII

Os nucleotideos que codificam o polipeptideo precursor de isoforma de FVII humano de 466 aminoácidos (P08709; definido em SEQ ID NO:1) foram clonados no vetor de expressão de mamifero, pCMV Script (Stratagene; SEQ ID NO:99), que contém um promotor de citomegalovirus (CMV). Resumidamente, os oligonucleotideos CBO-125 (SEQ ID NO:100) e CBO-126 (SEQ ID NO:101) foram utilizados como primers de frente e verso, respectivamente, para amplificar a sequência de FVII por PCR usando cDNA de FVII humano (Invitrogen) conforme o modelo. O primer CBO-125 continha um sitio de restrição BamHI (em negrito), uma sequência de Kozak (duplo sublinhado), seguido por 18 nucleotideos com homologia na extremidade 5' da sequência de cDNA de FVII (sublinhado), incluindo o códon de iniciação ATG. O primer CBO-126 continha um sitio de restrição EcoRI (em negrito), um códon de parada (duplo sublinhado) e 21 nucleotideos com homologia na extremidade 3' da sequência de cDNA de FVII (sublinhado). Primer de frente CBO-125 5' gcatcatgacgtgacggatccgccaccatggtctcccaggccctc 3' Primer de verso CBO-126 5' gatcgtacgatacgtgaattcctagggaaatggggctcgcaggag 3' Condições padrão de reação da PCR e termociclagem foram utilizadas em conjunto com o kit de PCR KoD HiFi (EMD Biosciences), conforme recomendado pelo fabricante. O produto de PCR foi digerido com BamH I e enzimas de restrição EcoR I e ligado no BamH I e sitios de restrição EcoR I do vetor pCMV Script usando técnicas moleculares padrão. O vetor foi então transformado em Escherichia coli. Colônias selecionadas foram cultivadas e colhidas células bacterianas para a purificação do plasmideo utilizando técnicas de biologia molecular de rotina.

B. Geração de variantes de FVII

Variantes de FVII foram geradas usando o kit QuikChange II XL de mutagênese sitio dirigida (Stratagene) de acordo com as instruções do fabricante, com oligonucleotideos especificamente projetados que serviram de primers, que incorporou uma determinada mutação no DNA recém sintetizado. 0 método QuikChange envolve amplificação linear de DNA matriz por Pfuültra polimerase de DNA de alta fidelidade. Primers complementares que incluem a mutação desejada foram estendidos durante a ciclagem utilizando vetor Script pCMV super espiralados de duplex purificados, que continha a sequência do cDNA de FVII clonado como um modelo. Extensão dos primers resultou na incorporação da mutação de interesse no filamento recém-sintetizado, e resultou em um plasmideo mutante com entalhes escalonados. Após a amplificação, o ácido nucléico foi tratado com Dpn I, que digere os filamentos parentais metilados do vetor Script pCMV derivado de E. coli. Isso resultou na "seleção" dos plasmideos mutantes recém-sintetizados, que não foram metiladas. O vetor de DNA contendo a mutação desejada foi transformado em células de E. coli ultracompetentes XL10- Gold, onde ligase bacteriana reparou os entalhes e permitiu que a replicação normal ocorresse.

A Tabela 13 abaixo apresenta as variantes de FVII que foram geradas. Em alguns casos, as variantes de FVII foram geradas em que uma sequência de ligação para integrina plaquetária αirbβ3 foi inserida em várias regiões do polipeptideo de FVII. Uma das três sequências de ligação de integrina αIIt,β3 diferentesforam inseridas: SFGRGDIRNV (SEQ ID N0:110); CSFGRGDIRNVC (SEQ ID N0:lll) ou GGGSCSFGRGDIRNVC (SEQ ID NO: 112). As sequências de ligação de integrina αut>β3 foram inseridas no C-terminal do polipeptideo de FVII depois de residuos de aminoácidos P406 por numeração de FVII maduros, ou inseridos pela exclusão e substituição de residuos do aminoácido de FVII S103 a Sill, H115 a S126 ou T127 a P134 pela numeração de FVII maduro. Outras variantes de FVII em que uma sequência de ligação de albumina sérica foi inserida também foram geradas. Essas variantes de FVII continham uma das sete sequências diferentes de sequência de ligação de albumina sérica: QRLMEDICLPRWGCLWEDDF (SEQ ID NO:103), IEDICLPRWGCLWE (SEQ ID NO:104), DICLPRWGCLWED (SEQ ID NO:105), IEDICLPRWGCLW (SEQ ID NO:106), GGGSIEDICLPRWGCLW (SEQ ID NO:107), DICLPRWGCLWED (SEQ ID NO:108) ou GGGSDICLPRWGCLWED (SEQ ID NO:109). As sequências de ligação de albumina sérica foram inseridas no C-terminal do polipeptideo de FVII depois de residuos de aminoácidos P406 por numeração de FVII maduros, ou inseridos pela exclusão e substituição de residuos de aminoácido de FVII S103 a Sill, H115 a S126 ou T128 a P134 por numeração de FVII maduro. As variantes de FVII "Gla troca FIX" (ou seja, um polipeptideo de FVII em que o dominio de Gla endógeno foi substituído pelo dominio da Gla de FIX) contém residuos de aminoácidos Y1 a Y45 da SEQ ID NO: 83 no N-terminal. Em alguns exemplos, as variantes de "Gla troca FIX" contêm um ou mais substituições de aminoácido na porção de dominio FIX Gla. Mutações que estão na parte de domínio FIX Gla são colocadas entre colchetes 5 e são referenciadas usando posições de aminoácidos correspondentes às posições de aminoácidos de um polipeptideo de FIX maduro do tipo selvagem, ou o domínio FIX Gla tipo selvagem definido em SEQ ID NO:83. Por exemplo, {Gla troca Fix/M19K} denota que o polipeptideo de FVII modificado contém um domínio FIX Gla heterólogo em que a 10 metionina na posição 19 do domínio FIX Gla definido em SEQ ID NO: 83 é substituído por uma lisina. Na Tabela 13 abaixo, os resíduos de aminoácidos na qual a integrina plaquetária otIIbβ3 ou sequência de ligação de albumina sérica está inserida no polipeptideo de FVII, e a sequência de aminoácidos da sequência de ligação, são ambos 15 representados. Por exemplo, H115S126delinsQRLMEDICLPRWGCLWEDDF indica que os resíduos de aminoácidos H115 a S126 foram eliminados e substituídos por uma sequência de ligação de albumina sérica com a sequência de aminoácidos QRLMEDICLPRWGCLWEDDF (SEQ ID NO:103).Tabela 13. Variantes de Fator VII

C. Expressão de polipeptideos de FVII

Para a análise da expressão inicial por ELISA e Western Blot, polipeptideos de FVII foram expressos em células BHK-21. Para os ensaios bioquímicos, como os descritos abaixo, os polipeptideos de FVII foram expressos em células Freestyle™ 293-F (Invitrogen).

O polipeptídeo de fator VII de tipo selvagem (SEQ ID NO:3) e polipeptídeos de FVII variantes foram inicialmente expressos na linhagem celular de rim de hamster filhote BHK-21 (ATCC CRL 1632). Células BHK-21 foram cultivadas em meio essencial mínimo de Eagle (Emem, Invitrogen), com 10% de soro bovino fetal (FCS) em placas de cultura de 100 milímetros em 37 °C e 5% de CO2. Depois de um crescimento de confluência de aproximadamente 90%, as células foram transfectadas com 24 μg de DNA plasmidial de FVII utilizando o kit de Lipofectamine 2000 (Invitrogen) conforme as instruções do fabricante. O meio foi substituído 6 horas após transfecção com EMEM sem soro, contendo 1 μg/ml de vitamina Kl (Sigma) e as células foram 5 incubadas por mais 72 horas. Expressão de FVII nos meios de cultura de células foi determinada por ELISA ou Western Blot.

Para as análises posteriores por testes bioquímicos, o polipeptideo de fator VII do tipo selvagem 10 (SEQ ID NO:3) e polipeptídeos de FVII variante foram expressos em células Freestyle™ F-293 (Invitrogen). As células foram cultivadas em meio Freestyle™ 293 (Invitrogen) a 37 °C e 8% de CO2 em frascos de Erlenmeyer com tampas ventiladas. As células foram transfectadas com 15 protocolo sugerido pelo fabricante. Resumidamente, após um crescimento de 1 x 106 células/ml, as células foram centrifugadas e o meio foi trocado. As células foram então transf ectadas com 240 μg de DNA plasmidial de FVII para cada 240 ml de células usando 293fectin (Invitrogen). Além 20 disso, 50 μl de 1 mg/ml de caldo de vitamina Kl (Sigma) em etanol foi adicionado para cada 240 ml de células. As células foram cultivadas por cinco dias, em seguida, o sobrenadante da cultura foi colhido. Expressão de FVII nos meios de cultura de células foi analisada por ELISA.

Em alguns exemplos, polipeptídeos de FVII tipo selvagem e variantes foram expressos em células CHO-Express (CHOX) (Excellgene). Células CHO Express (CHOX) foram mantidas em meio completo DM202 (SAFC BioSciences) e usada para inocular culturas de produção de sementes. Culturas de sementes foram cultivadas a 5 x 106 células viáveis/ml e aproximadamente 60 ml foram usados para inocular cerca de 0,6 1 de meio completo de DM202 (densidade de inoculação é 5 de 0,4 xlO6 vc/ml) para gerar uma cultura de produção.

Esta cultura de produção foi cultivada por quatro dias para chegar a 8 a 12 x 106 vc/ml no dia da transfecção. Um complexo de transfecção foi formado por DNA de plasmideo de Fator VII (6 mg) e 23,1 mg de polietilenimina (PEI). O 10 complexo de transfecção foi então diluido em 0,5 1 de meio de transfecção livre de soro Opti-MEM (Invitrogen), que foi adicionado à 0,6 1 de cultura de produção. Após cinco horas de transfecção a cultura foi então diluida com cerca de 1 1 de meio ProCH05 (Lonza) suplementado com 8 mM de L- 15 glutamina e 4 mg/1 de vitamina Kl. 2,2 1 de cultura do frasco de agitação foi permitida se expressar por 5 a 7 dias antes da colheita do Fator VII cru. Sobrenadantes de cultura foram então colhidos através de filtração e FVII foi purificado.

Expressão de uma das variantes de FVII (Q286R/M298Q) foi realizada em uma linhagem celular estável. Esta linhagem foi gerada em Excellgene (Monthey, Vaiais, Suiça) por transfecção de células CHOX. Resumidamente, as células foram cultivadas na presença de 25 metotrexato, em seguida, banhadas por diluição limitante em 1 célula por poço em 96placas de poços. Clones produzindo os mais altos niveis de FVII variante foram determinados por ELISA. Um clone (clone 52) foi adicionalmente subclonado por uma segunda diluição limitante e plaqueado em 96 placas de poços. As colônias foram cultivadas a 37 °C em meio DM204A (SAFC Biosciences), suplementado com 8 mM de L-glutamina, 1 mM de cisteina, 1 mg/1 de vitamina Kl. Vinte e quatro clones foram encontrados para ter niveis mais elevados de expressão de Q286R/M298Q, através da análise de ELISA, que o clone original 52. Estes 24 clones foram adicionalmente ampliados em 6 pcamundongos de poço por 6 dias de crescimento, seguido de crescimento em 40 ml de frascos agitados por quatro dias. Cada etapa de crescimento foi então feita a 37 °C em meio DM204A, suplementado como acima. Após quatro dias de crescimento, os clones foram congeladas a 1 x 107 células viáveis/ml. Os niveis de Q286R/M298Q produzidos por cada clone foram determinados por ELISA. O clone 5F7 foi o maior produtor, gerando normalmente 25 a 35 mg/1 de Q286R/M298Q.

1. ELISA

O imunoensaio foi utilizado para quantificar a quantidade de FVII e FVIIa humano em uma amostra. Anticorpos policlonais para FVII humanos foram usados para capturar e detectar a protease na solução. O imunoensaio pode ser usado para determinar a concentração de proteinas no meio condicionado ou um estoque purificado ou para determinar a concentração de FVII em outra amostra, por exemplo, uma amostra de plasma humano ou de camundongo. A concentração inicial de FVII no sangue humano é de aproximadamente 50 nM e a forma FVIIa, é de aproximadamente 1 nM.

Para determinar a quantidade de proteinas de FVII ou FVIIa humano em amostras urn sanduiche ELISA foi realizado. Noventa e seis placas imuno Maxisorp de fundo bem piano (Nunc) foram revestidas com 100 μl/pogo de 5 ng/μl de avidina (NeutrAvidin, Pierce Biotech.). As placas foram cobertas e incubadas com agitação por 1 hora à temperatura ambiente (RT), seguido de quatro lavagens em PBS com 0,01% de Tween-20 (PBST). As placas foram bloqueadas por um periodo minimo de 1 hora em temperatura ambiente com agitação por incubação com albumina de soro bovino a 1% (BSA) (p/v) em PBS adicionado a cada poço a 200 μl/pogo. As placas foram bloqueadas em seguida, armazenadas a 40 °C até o uso (até 2 semanas).

Antes de usar, as placas foram lavadas quatro vezes em PBST para remover a BSA, e 100 μl/pogo de 1 ng/μl de solução de anticorpo anti-Factor bionitilado (R&D Systems) foi adicionado a cada poço e a placa foi incubada a temperatura ambiente por 45 minutos com agitação para permitir a complexação com avidina revestida. Excesso de anticorpo não ligado foi removido por lavagem da placa com PBST (quatro vezes).

Diluições duplas em série de um padrão de FVII (American Diagnostica; diluído em PBST), variando de 50 ng/μl a 0,8 ng/μl, foram adicionados à placa de 100 μl/pogo. Um poço contendo PBST sem qualquer FVII também foi incluído como um tampão apenas controle. Para analisar as amostras purificadas (antes e após a ativação, consulte o Exemplo 3) de FVII e FVIIa, a amostra foi primeiro diluída a 1:25 em PBST, em seguida, diluições duas vezes foram feitas para que diluições de 25 vezes, 50 vezes, 100 vezes e 200 vezes fossem testadas. As amostras diluídas foram adicionadas aos poços em duplicado a 100 pl/poço. Para analisar as amostras de plasma contendo FVII e FVIIa, a amostra de plasma foi diluída 1:100 e 1:400 em PBST e adicionada aos poços em duplicata a 100 μl/popo. Uma amostra de plasma sem FVII e FVIIa também foi incluída para determinar os níveis de fundo. As placas foram então incubadas por 30 minutos em temperatura ambiente com agitação para permitir qualquer FVII e FVIIa na amostra complexasse com o anticorpo anti-FVII.

Após a incubação com a amostra, as placas foram lavadas 4 vezes com PBST. Um anticorpo secundário, FVII equino anti-humano ou FVII monoclonal anti-humano (American Diagnostica), foi diluído a 1:5000 em PBST e adicionado a cada poço em um volume de 100 μl. As placas foram incubadas por 30 minutos em temperatura ambiente com agitação para permitir que o anticorpo adicionado se ligasse aos complexos de FVII ou FVII ou na placa. Para remover o excesso de anticorpo secundário, as placas foram lavadas com PBST (4 vezes) . Para detectar a ligação do anticorpo secundário, 100 μl de conjugado de cabra anti-equino HRP a 1:5000 de diluição em PBST, ou 100 μl de conjugado de cabra anti-camundongo HRP a 1:20.000 de diluição em PBST foi adicionado a cada poço. Após a incubação por 30 minutos em temperatura ambiente com agitação, as placas foram lavadas quatro vezes com PBST e 100 μl/popo de uma solução contendo uma mistura 1:1 de substrato TMB e solução de peróxido de hidrogênio (Pierce Biotech) foi adicionado. As placas foram agitadas por aproximadamente 1 minuto à temperatura ambiente antes da adição de 100 pl/poço de H2SO4 2M para parar a reação. A densidade óptica a 450 nm foi medida utilizando um leitor de placa de dispositivo molecular M5 e o valor do fundo para a placa (medido com PBST sozinho) foi subtraído do valor medido de cada poço. Uma curva padrão foi gerada através da plotagem da concentração dos padrões de FVII versus absorbância. Uma grande curva padrão de cerca de 0,2 a 50 ng/ml foi tipicamente gerada nas condições de ELISA acima. A concentração de cada amostra foi então determinada através da curva padrão e multiplicando pelo fator de diluição, e uma média e desvio padrão foi relatados.

2. Western Blot

Expressão de FVII em meios de cultura celular também foi analisada pelo Western blot. Alíquotas contendo a amostra não diluída, ou duas diluições duas vezes em PBS, do meio de cultura celular de células transfectadas com FVII (células BHK-21 ou CHOX) foram marcadas Cone. 1 (não diluído), Cone. 2 (diluição de 2 vezes) e do Cone. 3 (diluição de 4 vezes). As amostras foram carregados em gel SDS page próxima a 10, 25 e 50 nanogramas de plasma de controle purificado rFVII (American Diagnostica). Proteina de FVII produzida por células BHK-21 ou CHOX foi detectada por Western blot utilizando um anticorpo anti-FVII de equino policlonal primário (American Diagnostica, utilizado na concentração sugerida pelo fabricante) e um anticorpo secundário IgG anti-equino conjugado com HRP (1:2000 de diluição de solução de 1 mg/ml de Zymed Labocamundongories) . Em alguns exemplos, o FVII foi detectado por Wester blot usando um anticorpo de fator Vila anti-humano de coelho primário (Hematologic Technologies) e um anticorpo secundário IgG anti-coelho conjugado com HRP (Invitrogen). Comparação dos niveis de expressão foi feita com o plasma controle purificado rFVII. Os resultados mostram que as concentrações que variam de aproximadamente 20 ng para mais de 50 ng de FVII esteve presente nas aliquotas de cultura celular.

Exemplo 2 Purificação e ativação de polipeptideos FVTI

Polipeptideos de FVII foram purificados usando um Q-Sepharose Fast Flow ou coluna CaptoQ (GE Healthcare), ao qual polipeptideos de FVII com dominios funcionais de Gla irão se fixar, seguido por uma etapa de eluição de cálcio. Normalmente, sobrenadante da cultura a partir do de transfectado foi diluida duas vezes com uma solução contendo 20 nM de Tris pH 8,0 e 0,01% de Tween 20 e, em seguida 500 mM de EDTA pH 8,0 foi adicionado à amostra diluida para uma concentração final de 1,5 mM. As amostras foram filtradas antes de serem carregadas no Q Sepharose Fast Flow ou coluna de CaptoQ, que havia sido pré- equilibrada primeiro com tampão B (20 mM de Tris pH 8,0, NaCl 1 M, 0,01% de Tween 20), em seguida, um tampão A (20 mM de Tris pH 8,0, NaC10,15 M, 0,01% de Tween 20). Após ser carregada, a coluna foi lavada com tampão A até a absorção de fluxo em 280 nm alcançou uma linha de base. Tampão A foi substituído por tampão C (20 mM de Tris pH 8,0, NaC10,15 M, 0,01% de Tween 20, 5 mM de CaClg) e uma lavagem com bomba foi realizada para substituir completamente o tampão nas linhagens. Após o término da lavagem com bomba, tampão C foi aplicado à coluna de 8 ml/min para eluir os polipeptideos de FVII, que foram coletados em frações. Após a eluição, a coluna foi lavada com tampão B, enquanto ainda está coletando frações, até o pigmento rosa (a partir do meio de cultura) foi lavada fora da coluna. A coluna foi então lavada com tampão A para requilibrá-la para sua reutilização.

As frações eluídas foram posteriormente purificadas utilizando um Mono Q ou ou coluna QHiTrap (GE Healthcare), que foi pré-equilibrada inicialmente com tampão B e depois com tampão A. As frações coletadas com tampão C acima, que continham FVII, foram misturadas e diluídas duas vezes com tampão A, antes EDTA, pH 8,0, foi adicionado a uma concentração final de 40 mM. Pequenas alíquotas (por exemplo, 100 μl) opcionalmente foram tomadas neste momento de análise, como por ELISA. A amostra combinada foi carregada na coluna Mono Q (ou QHiTrap), em seguida, lavada com tampão A. Para eluir os polipeptideos de FVII ligados, um gradiente de 0% a 30% de tampão B foi executado através da coluna e as frações foram coletadas. A coluna foi lavada com tampão B seguido por um tampão A para requilibrá-la para reutilização.

Em alguns exemplos, depois da primeira coluna Q Capto, frações combinadas foram trocadas em tampão por diafiltraçào para tampão D (20 mM de MES, pH 6,0, 10 mM de CaCl2, NaC10,l M, 0,01% de Tween 20) então carregados em uma coluna SP-HP que havia sido pré-equilibrada com tampão D. Após a lavagem com tampão D, um gradiente de NaCl 0,1 M para NaCll,0 M foi aplicado à coluna e as frações foram coletadas. Frações contendo FVII foram ajustadas para pH 8,0 e diluídas 2 vezes em Tampão E (20 mM de Tris, pH 8,0, 10 mM de CaCl2, 0,01% de Tween 20) e aplicada a uma coluna Q H-HP, que tinha sido pré-equilibrada com tampão E. Esta coluna foi então lavada com tampão E e o FVII foi eluido com um gradiente de 0 a 1 M de NaCl em tampão E.

Polipeptídeos de FVII purificados foram ativados para FVIIa usando Factor Xa biotinilado a partir de Kit de remoção e clivagem de restrição deprotease de fator Xa (Roche). Normalmente, sete frações da purificação Mono Q foram agrupadas em um tubo clonical de 15 ml e 388 μl de 500 mM de CaCl2, 38,9 μl de de BSA 10% em água destilada e 3,2 μg de Factor Xa de biotina foram adicionados. Após a incubação por 14 a 16 horas a 37 °C, 250 μl de avidina imobilizada (Pierce) foi adicionada e a amostra foi misturada a 4 °C por 30 minutos. A solução resultante foi então filtrada através de uma coluna Econo-pak (Bio-Rad), e o filtrado foi misturado com outra avidina imobilizada de 250 μl por mais 30 minutos. A solução foi filtrada novamente e o filtrado foi concentrado a cerca de 300 a 500 μl utilizando um filtro centrífugo Amicon Ultra-4 kDa (Millipore) . A concentração de FVIIa foi então analisada por ELISA (como descrito no exemplo l.C.l) e o nivel de ativação do fator VII foi monitorado por Western blot. Western blot foi realizado essencialmente como descrita no exemplo 1.C.2, mas ao invés de usar anticorpo de. Fator Vila anti-humando de coelho (Haematologic Technologies, Inc.) em 1:2000 por 1 hora como o anticorpo primário, seguido pela IgG anti-coelho de cabra com HRP (H+L) (Invitrogen) a 1:5000 durante 30 minutos.

Exemplo 3 Determinação da concentração de protease cataliticamente viável em uma solução

A concentração de FVIIa cataliticamente viável em uma solução de estoque foi determinada por titulação de um complexo de fator Vila e fator tecidual solúvel (sTF) com um inibidor de peptideo irreversível de FVIIa, Phe-Phe-Arg- Glorometilcetona (FFR-CMK). O inibidor liga-se a FVIIa mas não a FVII. Incubação prolongada de uma alta concentração de FVIIa (50 nM) assegura a titulação completa da protease. A atividade residual do complexo FVIIa/TF após incubação com FFR-CMK foi medida para determinar a concentração de FVIIa cataliticamente viável na solução de estoque original.

Uma placa de ensaio de meia área bem clara (Nunc) foi pré-tratada pela adição de 150 μl/popo de 1 x tampão de placa (100 mM de Tris pH 8,4, 100 mM de NaCl, 0,01% de BSA, 0,01% de Tween-20) a cada poço e incubar a placa a 37 °C por um período mínimo de 1 hora. O tampão foi completamente removido por borra em uma toalha de papel e centrifugar a placa de cabeça para baixo para remover qualquer tampão restante, e a placa foi seca ao ar por 1 hora e armazenada coberto em temperatura ambiente (RT)-

Para preparar a mistura de reação FVIIa/sTF/FFR- CMK, um estoque de FVIIa (American Diagnostica, diluído a 5 μM de glicerol a 50% (v/v) e armazenado a frio em alíquotas a -20 °C) ou uma variante de FVIIa foi diluída a 500 nM em um tampão de ensaio direto 1 x (100 mM de Tris pH 8,4, 100 mM de NaCl, 5 mM de CaCl2, 0,01% de BSA) . A mistura de FVIIa/STF foi então feita misturando 90 μl de água destilada com 36 μl de tampão de ensaio direto 5 x, 18 μl de 500 nM de FVIIa, e 18 μl de 5 μm de STF (fator de coagulação III humano recombinante/fator de tecido solúvel, R&D Systems, a solução estoque utilizada foi de 19,6 μM de glicerol a 50% e foi diluída para 5 μM em tampão de ensaio direto 1 x e armazenada por até duas semanas a 4 °C) . Os componentes foram então deixados complexar por 5 minutos em temperatura ambiente.

Uma solução estoque de 10 mM de FFR-CMK (Bachem) em DMSO (armazenada a -20 °C) foi diluída em água a 3,5 μM. Usando uma linha de uma placa de armazenamento de polipropileno opaca (Costar), duas diluições em série em água do CMK-FFR foram feitas em 11 poços de uma placa de 96 poços opaca, com o último poço da linha contendo apenas água como um controle. Esta é a solução em série de inibidor FFR-CMK de 10 x. Em cada poço de uma linha de 96 placas de ensaio de meia área bem limpa pré-tratad, 10,8 μl da mistura FVIIa/sTF foi adicionada, seguido por 1,2 μl da série de inibidor FFR-CMK 10 x. As soluções foram bem misturadas e a placa foi centrifugada a < 3.000 rpm por 5 minutos para remover pingos nos poços. A placa foi coberta e incubada por 8 horas a 37 °C.

Para analisar a atividade residual do complexo FVIIa/TF, uma mistura do substrato Spectrozyme FVIIa (American Diagnostica, #217L; estoque reconstituído de frasco de 50 μmole em 5 mL de água destilada a 10 mm e armazenado a 4 °C) e tampão direto 5 x (500 mM de Tris pH 8,4, 500 mM de NaCl, 25 mM de CaCl2 e 0,05% de BSA) foi preparada misturando 360 μl de tampão de ensaio direto 5 x com 180 μl de uma solução de 10 mM de Spectrozyme FVIIa e 1080 μl de água. Para cada poço da placa de ensaio, 108 μL de solução de substrato preparada foi adicionada. Os poços foram misturados e a placa foi incubada a 37 °C. O aumento na absorbância a 405 nm foi medido a cada 30 segundos durante uma hora a 30 °C em um leitor de placas Spectramax Gemini M5 da Molecular Devices.

Usando o software SoftMax Pro (Molecular Devices), as taxas de absorção foram medidas e a atividade fracionai de proteases incubadas com um inibidor foi determinada dividindo-se a taxa medida pela taxa de protease não inibida. A atividade fracionada foi representada graficamente em função da concentração de FFR- CMK, e os pontos que foram > 90% ou < 10% da atividade não inibida foram descartados. Uma linha foi, então, traçada através dos pontos restantes para determinar a intersecção de x, que representa a concentração de protease ativa na solução. Os valores de múltiplos ensaios foram medidos e a média e o desvio-padrão foram determinados.

Exemplo 4 Determinação da atividade catalítica de FYIIa de seu substrato, o Fator X

A atividade catalítica das variantes de FVIIa de seu substrato, o Fator X (FX), foi avaliada indiretamente em um ensaio fluorogênico analisando a atividade de FXa, gerada depois da ativação por FVIIa, sobre o substrato sintético Spectrafluor FXa.

A. Atividade catalítica dependente de TF de FVIIa do tipo selvagem para o seu substrato, o Fator X

Atividade catalítica dependente de TF de FVIIa do tipo selvagem foi avaliada em um ensaio fluorogênico em que uma forma lipidada do fator tecidual purificado (TF) foi incluída para prover a atividade ótima da FVIIa. Atividade das enzimas de FXa para Spectrafluor FXa (CH3SO2-D-CHA-Gly- Arg-AMC.AcOH) foi determinada medindo o aumento da absorbância do fluoróforo livre gerado, AMC (7-amino-4- metilcumarina), em função de tempo.

Resumidamente, o polipeptideo de FVIIa de tipo selvagem foi inicialmente diluído a 0,5 μM em tampão de ensaio 1 x (100 mM de Tris pH 8,4, 100 mM de NaCl, 5 mM de CaCl2, e 0,01% de BSA), então adicionalmente diluído a 0,1 nM em tampão de ensaio. TF de comprimento completo lipidado (Innovin, Dade Behring) foi reconstituído em 20 ml de água para fazer uma solução de 3 nM e diluído a 0,2 nM em um tampão de ensaio 1 x. 400 μl de FVIIa 0,1 nM foram misturados com 400 μl de TF 0,2 nM e incubados em temperatura ambiente por 5 minutos. A solução foi diluida em dois, duas vezes de diluições em um tampão de ensaio 1 x contendo 0,2 nM de TF para obter um total de três diluições de FVIIa de 0,05 nM, 0,025 nM, ou 0,0125 nM de FVIIa cada um contendo 0,2 nM de TF (soluções FVIIa/TF).

O substrato, Fator X (FX; American Diagnostica, 80 μg) foi reconstituído em 135,6 μl de água destilada para dar um estoque 10 mM e armazenado em alíquotas a -80 °C. As alíquotas não foram congeladas e descongeladas mais de uma vez. 0 estoque foi diluida para FX 800 nM em tampão de ensaio direto, em seguida, diluidas em série duas vezes para obter soluções de FX variando de 800 nM a 50 nM.

Spectrofluor Xa (American Diagnostica, 10 μmoles) foi reconstituído em água destilada a 5 mM e armazenado a 4 °C. Para 96 placas de ensaio de meia área bem. preta (Costar), 5 mM de Spectrofluor Xa (American Diagnostica) foi adicionado a cada poço. Em seguida, 25 ml de solução de FX foram adicionados a cada poço. Para a última linha de poços da placa, um controle negativo no qual não foi adicionado FX também foi incluído no ensaio. Em duplicata, as três concentrações de soluções de TF/FVIIa foram adicionadas a 20 μl a poços das respectivas colunas da placa de modo que cada diluição de TF/FVIIa foi testada contra cada diluição de FX, com um conjunto de colunas que não continham TF/FVIIa adicionado (ou seja, só FX) . As placas foram misturadas por agitação. A fluorescência foi medida ao longo do tempo com um conjunto de espectrafluorômetro para ler cada 30 segundos durante 1 hora a 37 °C (Ex: 380 nm, EM: 450 nm, Cut-off: 435 nm) , e o tempo foi relatado em unidades de tempo ao quadrado. Após o 5 ensaio, uma curva padrão de fluorescência de AMC no mesmo leitor de placa foi gerada para cobrir a partir de unidades de fluorescência para uM substrato lançado no ensaio. 1 mM de AMC em DMSO (Invitrogen) foi diluida para 0,02 mM em tampão de ensaio 1 x. Seis diluições em série duas vezes de 10 AMC foram feitas variando de 20 nM a 0,625 nM em tampão de ensaio 1 x. A fluorescência de AMC foi medida utilizando as condições de ensaio idênticas às descritas acima e um gráfico de fluorescência em função da concentração da AMC foi plotado. A inclinação da linha foi calculada, que 15 serviu de fator de conversão para a RFU a μM em cálculos posteriores.

As constantes cinéticas de ativação FVIIa de FX foram calculadas por análise de regressão linear para realizar o inverso da concentração do substrato versus o 20 inverso da velocidade de clivagem do substrato (em unidades de segundos2) , com Vmax; calculadorviia como o inverso da interseção y, Km,rviia como o declive na interseção y, e Vmax/Km,Fviia como o inverso do coeficiente angular. 0 valor kcat foi então calculado por meio da equação:2 5 kcat / km, FVIIa Vmax /Km,FVIIa X 1/(0,5 x k2 x [FVIIa em μM] x (RFU/fator de conversão em μM)) onde, k2 = ([S] x kcat,Fxa) / (Km.rxa + [S] ) , onde kcat,Fxa e Km,rxa são as constantes para clivagem de Fxa de SpectrofluorXa determinadas experimentalmente utilizando padrões de FXa como kcat,Fxa =117 s-1, e Km,FXa = 164 μM.

Usando as condições de ensaio acima, a constante cinética K2 foi determinada como sendo 88,1 s'1. Km e kcat para cada uma das variantes de FVIIa foram determinadas para avaliar a atividade catalítica, kcat/km (M":s’') de cada um para seu substrato, FX (Tabela 14) . A protease de FVIIa de tipo selvagem foi avaliada e foi encontrada para exibir uma atividade de 1,8 x 107 M‘1s"1. Ativação de fator Vila de Fator X,conforme medida pelo Krishnaswamy, et al. (J. Biol. Chem. (1998) 273:8 4378-86) é de 2,9 X 107 M’V1.

B. Análise da atividade catalítica de variantes de FVIIa para o substrato, o Fator X

A atividade catalítica das variantes de FVIIa para o substrato, o Fator X (FX), foi avaliada indiretamente em dois tipos de ensaios cromogênicos analisando a atividade de FXa, gerada depois da ativação por FVIIa, sobre o substrato sintético Spectrafluor FXa. Os 20 dois testes foram realizados na presença ou ausência de fator tecidual lipidado, para avaliar tanto a atividade dependente de TF e quanto a independente de TF. As variantes de FVII foram expressas, purificadas e ativadas para FVIIa conforme descrito acima, exemplos 1 e 2. Embora 25 a maioria das variantes de FVII fossem expressas somente nas células Freestyle™ 293-F, algumas também foram expressas em células BHK-21.

Ensaio indireto dependente de fator tecidual lipidado

A atividade catalítica das variantes de FVIIa na presença do fator tecidual foi avaliada através do ensaio descrito na seção A do Exemplo 4, acima, com pequenas modificações. Uma das modificações foi o uso de uma protease de substrato de fator X, que tinham sido tratada com ERG-CMK e FFR-CMK para reduzir a atividade de fundo (Molecular Innovations). Dois tipos de análise de dados foram realizadas utilizando dois ensaios separados, um ensaio de análise de intervalo linear e um ensaio de análise de intervalo hiperbólico. O ensaio de análise de intervalo linear utilizou uma gama de concentrações de Fator X entre 0 e 150 nM, para garantir a medida exata das constantes cinéticas no intervalo linear da curva de dose. Em contraste, o ensaio de análise de intervalo hiperbólico utilizou um intervalo de concentrações de Fator X entre 0 e 1,44 μM para garantir a medida exata das constantes cinéticas com uma curva de dose de saturação (hiperbólica).

O ensaio indireto de fator de tecido lipidado com análise de dados de intervalo linear foi realizado essencialmente como descrito na seção A do Exemplo 4, acima, com as seguintes modificações. As soluções de variante de FVIIa/TF foram preparadas como soluções de 0,1 nM de FVIIa/0.4 nM de TF e incubadas por 30 minutos antes de serem diluídas duas vezes em 0,4 nM de TF para baixo a uma solução contendo 1,5625 pM de FVIla/0,4 nM de TF. 25 μl de solução de FVIIa/TF foram misturados com 25 μl de uma solução de substrato que continha 1,0 mM de Spectrofluor FXa (American Diagnostica) e uma de 300 nM, 200 nM, 133,3 nM, 88,9 nM, 59,3 nM, 39,5 nM, 36,3 nM ou 0 nM do Fator X (Molecular Innovations). Assim, as concentrações finais para o ensaio foram 0,8 pM de FVIIa, 0,2 nM de TF, 0,5 mM de Spectrofluor FXa e 150 nM, 100 nM, 66,7 nM, 44,4 nM, 29,6 nM, 19,8 nM, 13,2 nM ou 0 nM do Fator X (Molecular Innovations) em 50 pl/poço. A curva padrão de AMC, que serviu de fator de conversão para a RFU em μM em cálculos posteriores, foi expandido para incluir um intervalo de dose que cobriu de 0 a 100 μM de AMC.

O ensaio indireto de fator de tecido lipidado análise dos dados do intervalo hiperbólico foi realizado essencialmente como descrito na seção A do Exemplo 4, acima, com as seguintes modificações. As soluções de variante de FVIIa/TF foram preparadas em soluções de 0,1 nM de FVIIa/0,4 nM de TF e incubadas por 30 minutos antes de serem diluida duas vezes em 0,4 nM de TF para baixo a 1,5625 pM (ou 0,78 pM de proteases deverá ter alta atividade) de FVIIa/0,4 nM de TF. 25 μl de solução de FVIIa/TF foram misturados com 25 ul de uma solução de substrato que continha 1,0 mM de Spectrofluor FXa (American Diagnostica) e uma de 1440 nM, 720 nM, 360 nM, 180 nM, 90 nM, 45 nM, 22,5 nM ou 0 nM do Fator X (Molecular Innovations). Assim, as concentrações finais para o ensaio foram de 0,8 (ou 0,39) pM de FVIIa, 0,2 nM de TF, 0,5 mM de Spectrofluor FXa e 7 nM, 720 nM, 360 nM, 180 nM, 90 nM, 45 nM, 22,5 nM, 11,25 nM ou 0 nM do Fator X (Molecular Innovations) em 50 μl/poço. Os parâmetros kcat θ km são calculados utilizando a equação hiperbólica Menton da forma (Vmax/ (1 + (km/x) ) ) . A curva padrão de AMC, que serviu de fator de conversão para a RFU em μM em cálculos posteriores, foi expandida para incluir um intervalo de dose que cobriu de 0 a 100 μM de AMC.

Para determinar as constantes de taxa cinética para ativação FVIIa ou variante de FVIIa de FX, os dados brutos coletados com a aplicação de SoftMax Pro (Molecular Devices) foram exportados como arquivos .XML. Outros dados análises lineares e não lineares foram realizados com XLfit4, um pacote de software para a análise estatística e preenchimento de curva automatizada dentro do ambiente de planilha eletrônica Microsoft Excel (IDBS Software).

Para os dados coletados através da análise de intervalo linear, o kcat/kra (M-1s-1) as constantes cinéticas são calculados diretamente a partir da inclinação das análises de regressão linear da concentração FX versus a velocidade de clivagem do substrato fluorogênico (em μM/s2) onde kcat/km = inclinação/[FVIIa] x 0,5 x k^. O fator de correção k∑ foi determinado como 45 utilizando o método descrito na seção A do Exemplo 4 e constantes cinéticas para clivagem de Fxa de Spectrofluor Fxa de kcatfEXa = 56 s-1 e Km,rxa = 126 nM,determinada experimentalmente com FX ativado (FXa) que titulado de sitio ativo anteriormente com AT-III/heparin. Excluindo os pontos de dados que resultaram em valores de R2 inferior a 0,98 assegurou a linearidade do conjunto de dados utilizado na rotina de montagem.

As análises dos dados coletados através do ensaio de intervalo hiperbólico foram calculadas a partir de análises de regressão não-linear da concentração de FX versus a velocidade de clivagem do substrato fluorogênico (em μM/s2) . Os parâmetros kcat e km individuais são calculados como parâmetros de ajuste utilizando a equação hiperbólica de Michaelis Menton da forma (V^/fl + (kra/x) ) ) onde kcat = Vmax/[FVIIa] x 0,5 x k2- A constante cinética kcat/KM foi calculada a partir dos parâmetros preenchidos de kcat e Km individuais.

Ensaio indireto independente de fator tecidual

Atividade catalítica das variantes de FVIIa na presença do fator tecidual foi avaliada em um ensaio indireto semelhante ao descrito acima, exceto que o fator tecidual não foi incluído no ensaio. Assim, o ensaio para avaliar a atividade independente de TF foi feito essencialmente como descrito acima, com as seguintes modificações. As variantes de FVIIa foram diluídas a 50 nm (ou 5 nM para variantes deverá ter atividade elevada independente de TF) . 25 μl de cada solução de FVIIa foram misturados com 25 μl de uma solução de substrato que continha 1,0 mM de Spectrofluor FXa (American Diagnostica) e um de 1050 nM, 700 nM, 466,7 nM, 311,1 nM, 207,4 nM, 138,3 nM, 92,2 nM ou 0 nM do Fator X (Molecular Innovations). Assim, as concentrações finais para o ensaio foram 25 nM de FVIIa (ou 2,5 nM para as variantes de atividade elevada), 0,5 mM de Spectrofluor FXa e 525 nM, 350 nM, 233,3 nM, 155,6 nM, 103,7 nM, 69,1 nM, 46,1 nM ou 0 nM do Fator X (Molecular Innovations) em 50 μl/popo. As análises de dados foram conforme descrito para o ensaio de intervalo linear, acima sem modificações.

A tabela 14 apresenta a atividade catalítica de variantes de FVIIa medida em Ensaio indireto dependente de TF utilizando polipeptídeos de FVIIa expressos de células F-293 e células BHK-21, e a atividade catalítica conforme medida em um ensaio indireto independente de TF usando polipetideos de FVIIa expressos a partir de células F-293 e/ou células BHK-21. Os resultados são apresentados como a constante cinética para a atividade catalítica, kcat/Kn (M‘ 5 xs-1), e também expressa como uma porcentagem da atividade do FVIIa do tipo selvagem, em que a atividade é atividade catalítica, kcat/km (M^s-1) de cada variante de FVIIa de seu substrato, FX. 0 uso da análise de dados de intervalo linear ou hiperbólico também é indicado para os valores apresentados nas tabelas. Nem todas as 10 variantes de FVIIa foram analisadas em cada ensaio. Muitas variantes de FVIIa apresentaram maior atividade catalítica em comparação com a molécula de FVIIa do tipo selvagem. Por exemplo, o polipeptídeo de FVIIa contendo apenas a mutação Q286R (Q286R-FVIIa), tem uma atividade catalítica de entre 2 e 3 vezes maior do que FVIIa do tipo 15 selvagem, e o polipeptídeo de FVIIa contendo as mutações Q286R e M298Q (Q286R/M298Q-FVIIa), tem uma atividade catalítica de mais de 3 vezes a do FVIIa do tipo selvagem.Tabela 14. Atividade catalítica de variantes de FVIIa

Em um outro conjunto de experimentos, a atividade catalítica de polipeptideos de FVIIa produzidos em células BHK-21 foi analisada por meio de ensaios indiretos 5 independentes de TF e dependentes de TF descritos acima, com pequenas modificações. Diversas variantes foram produzidas em células CHOX além de células BHK-21, ou exclusivamente em células CHOX. As variantes foram analisadas em condições idênticas, independentemente da 10 linhagem celular usada. Para o ensaio catalítico dependente TF (através da análise linear), os polipeptideos de FVIIa foram primeiro titulados em sitio ativo com o 4- metilumbeliferil p'-guanidinobenzoato (MUGB) para determinar a concentração de FVIIa, conforme descrito no exemplo 12, abaixo. Para maximizar o número de pontos de dados na faixa linear, a concentração máxima de FX no ensaio foi definida para 25 nM (ou seja, 0 a 25 nM em vez de 0 a 150 nM) . O FX utilizado no ensaio foi ativado (ou 5 seja, FXa) e titulado com fluoresceina-mono-p'- guanidinobenzoato (FMGB), conforme descrito no Exemplo 15, abaixo. As constantes cinéticas para a clivagem de substrato de Spectrafluor FXa foram determinadas sobre este Fxa titulado em sito ativo e demonstrou ser: Km de 190,2 μM 10 e kcat de 340 s-1 A principal diferença sendo em kcat e principalmente devido à melhoria nas determinações de sitio ativo. Esses parâmetros dão um valor do fator de correção de k2 revisado de 246,4 que é utilizado na análise linear para determinar a atividade catalítica dos polipeptideos de 15 FVIIa na presença de TF.

Para o ensaio catalitico independente de TF, os polipeptideos de FVIIa foram primeiro titulada em sitio ativo com o 4-metilumbeliferil p'-guanidinobenzoato (MUGB) para determinar a concentração de FVIIa, conforme descrito 20 no exemplo 12, abaixo. O FX utilizado no ensaio foi ativado (ou seja, FXa) e titulado com fluoresceina-mono-p'- guanidinobenzoato (FMGB), conforme descrito no Exemplo 15. As constantes cinéticas para a clivagem de substrato de Spectrafluor FXa foram determinadas sobre este Fxa titulado 25 em sitio ativo e demonstraram ser: Km de 190,2 μM e uma Kcat de 340 s*1. Esses parâmetros dão um valor do fator de correção k2 revisado de 246,4 que é usado na análise para determinar a atividade catalitica dos polipeptídeos de FVIIa na ausência de TF.

Tabela 15 apresenta a atividade catalitica de cada uma das variantes de polipeptídeos de FVIIa ensaiadas. Os resultados são apresentados como a constante cinética para a atividade catalitica, kcat/Km (M"1s*1) , e também expressa como uma porcentagem da atividade do FVIIa do tipo selvagem, onde a atividade é atividade catalitica, kcat/km (M-1s'1) de cada variante de FVIIa para seu substrato, FX. O desvio padrão (SD), coeficiente de variação (em percentagem; %CV) e o número de ensaios realizados (n) também são fornecidos. Algumas das variantes indicaram claramente o aumento da atividade catalitica em comparação com o polipeptideo de FVII tipo selvagem. Por exemplo, a variante Gla troca FIX/Q286R/M298Q apresentou uma atividade catalitica dependente de TF 6 vezes maior do que o polipeptideo de FVII tipo selvagem. 0 aumento da atividade catalitica das variantes de FVIIa foi mais pronunciado no ensaio independente de TF. Por exemplo, variantes Gla troca FIX/Q366V tinham 9 vezes mais atividade catalitica do que FVIIa do tipo selvagem, variantes Gla troca FIX/Q286R/M298Q, {Gla troca FIX/E40L}/Q286R/M298Q, {Gla troca FIX/K43I}/Q286R/M298Q e {Gla troca FIX/Q44S}/Q286R/M298Q tinham 70 a 80 vezes mais atividade catalitica do que FVIIa do tipo selvagem, e a variante S52A/S60A/V158D/E296V/M1298Q tinha 220 vezes mais catalisadores atividade que FVIIa do tipo selvagem. Quadro 15. Atividade catalítica de variants FVIIa

Exemplo 5 Determinação da inibição de EVIIa/TF ou FVIIa por AT-IIl/heparina

A potência da interação entre o complexo AT-III/heparin e FVIIa na presença ou ausência de fator de tecido solúvel (sTF), ou seja, dependente de TF ou independente de TF, foi avaliada através da medição do nivel de inibição de diferentes concentrações de AT- III sobre a atividade catalítica de FVIIa/sTF contra um substrato, mesila-FPR-ACC. 0 valor Ko,s foi determinado para cada variante de FVIIa testada, que corresponde à concentração molar de AT-III que foi requerida para 50% de inibição (IC50) da variante de FVIIa em um ensaio de 30 minutos em temperatura ambiente (~ 25°).

Dois ensaios foram preparadas em separado, um com sTF e outro sem sTF. Uma solução de 2μM de AT-III/heparina (final 5 μM de 5 heparina) foi preparada pela mistura de 26,4 μl de AT-III 151,7 μM (AT-III de plasma humano purificado; Molecular Innovations) com 50 μl de heparina 0,2 mM LMW (Calbiochem), 400 μL de tampão de ensaio 5 x (100 mM de Hepes, 750 mM de NaCl, 25 mM de CaCl2, 0,05% de BSA, 0,5% PEG 8000, pH 7,4) e 1,523 ml de água grau reagente. Esta 10 solução foi para o uso como a maior concentração no ensaio dependente de TF. Uma solução contendo 4 μM de AT-III/heparina (final 5 μM de heparina) foi preparada para uso no ensaio independente de TF através da mistura de 52,8 μl de de AT-III 151,7 μM (Molecular Innovations) com 50 μl de heparina 0,2 mM LMW (Calbiochem), 400 μL de tampão de ensaio 5 x e 1,497 ml de água grau reagente. As soluções de AT-III/heparina foram incubadas por 5 a 10 minutos em temperatura ambiente e em seguida diluída duas vezes para baixo em 96 placas de polipropileno de poço fundo com um volume final de 1 ml contendo 5 μM de heparina, resultando em diluições de 20 2000, 1000, 500, 250, 125, 62,5, 31,25 e 0 nM, ou 4000, 2000, 1000,500, 250, 125, 62,5 e 0 nM. As variantes de FVIIa e FVIIa do tipo selvagem foram diluidas a 250 nM em um tampão de ensaio 1 x (20 mM de Hepes, 150 mM de NaCl, 5 mM deCaCl2, 0,01% de BSA, 0,1% de PEG 8000, pH 7,4). Para o ensaio dependente de TF, 5 nM de FVIIa/50 nM 2 5 de complexos de sTF foram formados pela mistura de 20 μl de FVIIa com 10 μl de sTF 5 μM (fator III de coagulação humano R&D Systems: #2339-PA), 200 μl de tampão de ensaio 5 x e 770 μL de água grau reagente e incubação das soluções por 10 a 15 minutos em terapetatura ambiente. Para o ensaio independente de TF, 100 μl de FVIIa foi misturado com 200 μl de tampão de ensaio 5 x e 700 μL de água grau reagente para produzir soluções de 25 nM de FVIIa. Para iniciar o teste, 25 μL de soluções de FVIIa/TF ou FVIIa sozinho foram 5 misturadas separadamente com 25 μl de cada diluição de AT-Ill/heparina em poços de 96 placas de ensaio de meia área bem preta (Nunc). As condições do ensaio final para o ensaio dependente de TF foram de 2,5 nM de FVIIa/25 nM de sTF e concentrações de AT- III/heparina que variam de 1000 nM a 0 nM. Para o ensaio 10 independente de TF, as concentrações de FVIIa foram de 12,5 nM de FVIIa e as concentrações de AT-III/heparina variaram entre 2000 nM a 0 nM. As placas foram incubadas por 30 minutos com agitação à temperatura ambiente (~ 25 °C).

Uma solução estoque de substrato de FVIIa (mesila-FPR- 15 ACC) foi preparada pela dissolução do substrato em DMSO a 20 mM, em seguida, preparando uma solução de trabalho de 0,5 mM em um tampão de ensaio 1 x. Após a incubação da placa de ensaio acima, 50 μl do substrato de FVIIa foi adicionado a cada poço da placa de ensaio. As reações foram mistas e a atividade residual do FVIIa foi avaliada 20 seguindo as taxas iniciais de clivagem do substrato por 15 minutos em um leitor de fluorescência definido para 30 °C.

Para determinar o grau de inibição por AT-III/heparina para FVIIa ou variantes de FVIIa, os dados brutos coletados com a aplicação SoftMax Pro (Molecular Devices) foram exportados como 25 arquivos .XML. Outras' análises de dados não-lineares foram realizadas com XLfit4, um pacote de software para a análise de instalação e estatística da curva automatizada dentro do ambiente de planilha eletrônica Microsoft Excel (IDBS Software). O modelo de planilha eletrônica foi utilizado para calcular a série de diluição de AT-III, a relação de AT-III para FVIIa, e a relação de Vi/Vo para cada FVIIa replicado em cada concentração de AT-III experimental. Análises de regressão não-linear da atividade de FVIIa residual (expresso em Vi/Vo) versus concentração de AT-III foram processadas utilizando XLfit4 e uma equação de inibição hiperbólica da forma ((C+ (amp* (1-(X/ (KQ,5+X) )))); onde C = offset (fixado em 0 para permitir uma extrapolação dos conjuntos de dados que não atingem 100% de inibição no decurso do ensaio), amp = amplitude do ajuste e KQ,5, que corresponde à concentração de AT-III requerida para a inibição meio máxima nas condições do ensaio. Para diversas variantes de FVIIa, AT-III inibiu menos de 20 a 25% da atividade da protease total na maior concentração testada de AT-III, o que representa um 1 .imite superior de detecção para o ensaio. Às variantes com menos de 20 a 25% de inibição máxima foi, portanto, atribuido um limite de valor de KOÍ5 inferior (5 μM para dependente de TF e 10 μM para independente de TF) e na maioria dos casos espera-se ter resistências a AT-III maiores do que o valor reportado.

As Tabelas 16 e 17 fornecem os resultados dos testes que foram realizados utilizando variantes de FVIIa expressa em células Freestyle TM 293-F e/ou células BHK-21, na presença e ausência de TF, respectivamente. Os resultados são apresentados tanto como o parâmetro KQ,5 montado e como uma representação do grau de resistência à AT-III para cada variante em relação ao FVIIa de tipo selvagem expresso como uma razão de seus valores KQ,S montados (KQ,5 variante/Ko,5 do tipo selvagem). Diversas variantes de FVIIa apresentaram maior resistência à AT-III em comparação com FVIIa do tipo selvagem. Por exemplo, Q286R-EVIIa (ou seja, FVIIa contendo a mutação Q286R), Q286R/S222A-FVIIa, Q286R/S222A/Gla troca ETX-EVIIa, A175S/Q286R/Q366V-FVIIa, Q286M-FVHa, Q286L-EVIIa e Q286Y-FVIIa estão entre o grupo que apresentou resistência à AT-III na ausência de TF que 5 foi mais de 4 vezes maior que a do FVIIa do tipo selvagem.Tabela. 16. Inibição de variantes de FVIIa por AT-Hl/baparina na presença de TF

Tabela 17 . Iníbíção de varíantes de FVlla por ATIll/heparína na ausêneía de TF

On conjunto de experimentos adicional foi realizados para avaliar a inibição de variantes de FVIIa por fíT-HI/heparina na ausência de TF utilizando o mesno ensaio, coro descrito acirra, cem pequenas modificações.

Heparina não fracionada de enrprirnento ccrrpleto (Calbiochem) foi usada an vez de heparira. da baixo peso molecular (IMü-heparina) para aumentar a taxa da reação de inibição (ver, por exerrplo, Olson et al (2004) Ihrcrrb Haemost 92 (5), 929- 939). 0 terpo de incubação de ensaio foi aumentado para 60 minutos, e a concentração do substrato de mesila-FER-ACC utilizado para veri ficar a atividade 5 residual foi aumentada para urna concentração final de 0,5 πM.

A Tabela 18 fornece os resultados dos ensaios que foram realizados na ausência de TF utilizando variantes de FVIIa expressas an células BHK-21 e células CHOX. Qs resultados são apresentados tanto raro o parâmetro KQ,5 montado e caro uma representação do grau de resistência à AT-III para cada variante em 10 relação ao FVIIa tipo selvagem expresso coro urra taxa de seu valor Ko,5 montado (KQ,5 nutante/Kb,5 tipo selvagsn). O desvio padrão (SD) e o numero de ensaios (n) tarrbán são mostrados. Tabela 18. Inibição da variantes de FVIIa por AT-m/h^arina na ausâicia de TF

Exemplo 6 A avaliação in vivo de atividade pró-coagulante de polipeptideo de FVIIa

Modelos de camundongos de hemofilia A foram estabelecidos para avaliar a atividade pró-coagulante de polipeptideos de FVIIa. A hemofilia A foi induzida em camundongo CD-I por administração intraperitoneal de anticorpos anti-FVIII, seguido pela remoção cirúrgica das pontas das caudas para 10 iniciar o sangramento. Camundongos deficientes em FVIII (camundongos EVIII-/_) também foram utilizados, mas não foram tratados com anticorpos anti-FVIII. Os camundongos foram tratados com polipeptideos de FVIIa e a quantidade de sangue perdido em 20 minutos foi medida para determinar a atividade 15 pró-coagulante dos polipeptideos de FVIIa.

A. Avaliação in vivo da atividade pró-coagulante de FVIIa do tipo selvagem

Um modelo de camundongo de hemofilia A foi establecido para avaliar a atividade pró-coagulante de polipeptídeos de FVIIa. A hemofilia A foi induzida em camundongos CD-I pela administração de anticorpos anti-FVIII, seguido pela remoção cirúrgica das pontas das caudas para iniciar o sangramento. Os camundongos foram tratados com polipeptideo de FVIIa e o tempo necessário para parar a hemorragia, e a quantidade de sangue perdido durante este tempo, foi medido para determinar a atividade pró-coagulante dos polipeptídeos de FVIIa.

Camundongos machos CD-I foram anestesiados pela administração intraperitoneal de ambos sódio tiobarbital a 100 mg/kg e quetamina a 100 mg/kg. A lidocaina foi administrada por injeção subcutânea na região ventral do pescoço para reduzir a sensibilidade. A traquéia e a artéria carótida foram canuladas através de uma pequena incisão na pele do pescoço para facilitar a respiração e irrestrita e a administração de anticorpos anti- fator VIII fator Vila recombinante humano (rhFVIIa) e/ou polipeptídeos de FVII modificados.

A camundongos canulados foram administrados 3,76 mg de anticorpos de ovelha anti-humano-FVIII (Affinity Biologicals, lote IG129R4, 612 camundongo BU/ml) em 40 microlitro. Esta dose foi determinada através da realização de um experimento de resposta de dose inicial com o anticorpo (utilizando 0,376, 0,94, 1,88 e 3,76 mg de anti-humano-FVIII), e avaliar a perda sanguinea, tempo de sangramento. Após 20 minutos, as caudas dos camundongos foram colocadas em tubos de 15 ml contendo solução salina de fosfato tamponado a 39 °C (PBS) por um periodo de 10 minutos. Aos 30 minutos, as caudas foram rapidamente removidas da solução de PBS e os últimos 5 mm da cauda foram cortados para iniciar o sangramento. 0 momento em que começou o sangramento foi anotado. As caudas, então, retornaram para o tubo contendo PBS a 39 °C e permitidas a sangrar durante 5 minutos (pré-sangria) para garantir que os camundongos tivessem respondido ao anticorpo anti-FVIII. Após a pré-sangria, aos camundongos foram administrados polipeptideos de FVIIa ou o veiculo no qual as proteinas de FVIIa foram preparadas e entregues. Os polipeptideos de FVIIa foram diluidos em PBS ou um tampão composto por 52 mM de cloreto de sódio, 10,2 mM de cloreto de cálcio desidratado, 9,84 mM de glicilglicina, 0,01% de polissorbato 80 e 165 mM de manitol. As preparações de FVIIa foram administradas a 1, 3 ou 10 mg/kg, em um volume equivalente a 3 ml/kg, através de cânulas de carótida, e as caudas foram colocadas em tubos frescos contendo PBS a 39 °C. O sangramento foi monitorado por um periodo de 20 minutos e os momentos em que o sangramento parou foram anotados. 0 tempo de hemorragia total foi calculado como a soma da duração do sangramento durante a pré-sangria, e duração do sangramento após a administração de polipeptideos de FVIIa ou PBS ou tampão.

Para determinar a quantidade de sangue perdido durante os episódios de sangramento, os conteúdos dos tubos de 15 ml foram ensaiados para conteúdo de hemoglobina. Triton X-100 foi diluido 1 em 4 em água destilada e 100 μl foi adicionado ao 1 ml de amostras de causar hemólise. A absorbância das amostras foi medida em um comprimento de onda de 546 nm. Para calcular a quantidade de sangue perdido, a absorbância foi lida em uma curva padrão gerada pela medição da absorbância a 54 6 nm de volumes conhecidos de sangue murina, diluido em PBS e hemolisadas como acima com Triton X 100.

Um experimento foi conduzido comparando rhFVIIa gerado conforme descrito acima com FVIIa recombinante humano comercialmente disponível (NovoSeven®, Novo Nordisk) e perda de sangue foi avaliada após a administração de 3 mg/kg de cada proteina. A perda de sangue no grupo de veiculo (tampão, n = 15) foi de 671,9 ± 57,89 μl, no periodo de 20 minutos. Este valor foi reduzido por rhFVIIa produzido pela Catalyst Biosciences de 264,1 ± 56,59 μl e NovoSeven® para 273,7 ± 53,93 microlitro (n = 14) . Este experimento demonstrou equivalência entre as duas proteinas.

B. Análise da atividade coagulante de variantes de FVIIa em camundongos CD-I com hemofilia A induzida

Os experimentos iniciais foram realizados para determinar a dose necessária e tempo e duração do efeito de anticorpos anti-FVIII humano quando administrados por via intraperitoneal para induzir a hemofilia em camundongos CD-I. Para o primeiro lote do anti-FVIII (lote 1; Affinity Biologicals, lote IG129R4), esta foi baseada inicialmente na dose utilizada para os experimentos de canulação, descrito acima. A dose determinada a provocar um estado hemofílico (sangramento descontrolado durante um periodo de ensaio de 20 minutos) foi de 7,54 mg/camundongo (80 μl de uma solução de estoque de 94,25 mg/ml). Este lote teve uma atividade neutralizante de 612 camundongos BU/ml. Para o segundo lote de FVIII anti-humano (lote 2; Affinity Biologicals, lote IG1577R2, atividade neutralizante de 474 camundongos BU/ml), a dose utilizada foi 11,98 mg/camundongo (120 μl de 99,8 mg/ml de solução concentrada) e foi administrado em 6 horas antes do corte da cauda.

Para induzir a hemofilia, os camundongos machos CD-I (25 a 35 g) foram tratados intraperitonealmente com o lote 1 ou o lote 2 de anticorpos anti-FVIII antes do experimento. Camundongos machos CD-I e FVIIl"/_ foram anestesiados pela administração intraperitoneal de coquetel de cetamina/xilazina (45 mg/ml e 3,6 mg/ml, respectivamente, em solução salina) e colocado sobre uma plataforma aquecida (39 °C) para garantir que não tivesse nenhuma queda na temperatura corporal. 0 quarto de processo foi mantido em uma temperatura de 82 °F. Dez minutos antes de cortar a cauda a cauda estava imersa em 10 ml de PBS pré-aquecido (tubo de centrifugação de 15 ml; 39 °C). Oito a dez camundongos foram injetados com FVIIa recombinante humano (NovoSeven®, Novo Nordisk) ou polipeptídeos de FVII modificados diluido em um tampão composto por 52 mM de cloreto de sódio, 10,2 mM de cloreto de cálcio desidratado, 9,84 mM de glicilglicina, 0,01% de polissorbato 80 e 165 mM de manitol através da veia da cauda em uma única injeção. Veiculo apenas também foi injetado em um grupo de camundongos como controle. Se a injecção fosse perdida, o animal era excluido do estudo. Injeção com polipeptideo de FVIIa ou veiculo foi feita 5 minutos antes de cortar a cauda. Um corte de cauda foi feito utilizando uma lâmina de barbear de 5 milímetros a partir da extremidade da cauda e o sangue foi coletado em PBS por um período de 20 minutos. No final do período de coleta, perda de sangue total foi avaliada. Os tubos de coleta foram misturados e uma alíquota de 1 ml de cada amostra foi colhida e analisada para teor de hemoglobina. Triton X-100 foi diluído 1 em 4 em água destilada e 100 μl foi adicionado às amostras para 1 ml para causar hemólise. A absorbância das amostras foi então medida no comprimento de onda de 546 nm. Para calcular a quantidade de sangue perdida, a absorbância foi lida em uma curva padrão gerada pela absorbância a 546 nm de volumes conhecidos de sangue murina, diluído em PBS e hemolisado como acima com Triton X 100.

1. Estudo de resposta de dose avaliando a atividade coagulante do FVIIa tipo selvagem

Um estudo de resposta de dose em que 0,3, 1 ou 3 mg/kg de FVIIa do tipo selvagem foi avaliado também foi realizado. Camundongos que receberam o veículo perderam 1002,3 ± 60,71 μl no ensaio de 20 minutos. Este valor foi reduzido de forma significativa nos camundongos que foram administrados 3 mg/kg de FVIIa do tipo selvagem, de 415,5 ± 90,85 microlitro (p < 0,05 utilizando Kruskal-Wallis seguido pelo pós-teste de Dunn). Reduzir a dose de 1 mg/kg resultou em perda de sangue de 679,57 + 83,95 μl e uma dose menor de 0,3 mg/kg resultou em perda de sangue de 852,42 ± 94,46 microlitro.

2. Análise inicial da atividade coagulante de variante de FVIIa

A injeção do veículo apenas foi usada como controle. Camundongos que receberam o veículo apenas perderam 915,2 ± 105,6 μl no ensaio de 20 minutos, que foi reduzido para 352 ± 99,86 μl (média ± S.E.M) se aos camundongos fosse administrado FVIIa recombinante humano. A quantidade de sangue perdido foi ainda mais reduzida para 165,8 ± 48,41 μl se aos camundongos fossem administrados Q286R-FVIIa (ou seja, FVIIa contendo a mutação Q286R), para 141,3 ± 43,77 μl com Q286R/M298Q-FVIIa ou para 129,5 ± 36,64 μl com V158D/E296V/M298Q-FVIIa. Camundongos administrados com S222A-EVIIa também apresentaram menor perda de sangue (para 225,7 ± 62,75 μl) em comparação aos camundongos administrados FVIIa tipo selvagem. Administração da Gla troca FIX-FVIIa, Q366V-FVIIa ou A122N/G124S- FVIIa resultou em aproximadamente a mesma quantidade de perda de sangue como observada em camundongos que receberam FVIIa recombinante humano (334,6 ± 54,95 μl, 321,7 + 102, 6 μl e 329,8 ± 83,91 μl respectivamente), enquanto os camundongos que foram administrados H257A-FVIIa, S222A/Q286R-FVIIa ou H257A- FVIIa pareceram ter perda de sangue um pouco maior (390 ± 107 microlitro, 447,3 ± 127,7 μl e 443,7 ± 139,5 μl, respectivamente).

3. Resposta de dose avaliando atividade coagulante de variante de FVIIa

Um estudo de resposta de dose em que 0,1, 0,3, 1 ou 3 mg/kg de Q286R-FVIIa, S222A-FVIIa, Q286R/M298Q-FVIIa ou V158D/E296V/M298Q-FVIIa foram administrados aos camundongos. Camundongos que receberam o veículo apenas perderam 915,2 ± 105,6 μl de sangue no teste de 20 minutos. Este valor foi reduzido de forma significativa nos camundongos que foram administrados 3 mg/kg de qualquer uma das Q286R-FVIIa (141,3 ± 43,77 μl), S222A-FVIIa (225,7 ± 62,75 μl) ou Q286R/M298Q-EVIIa (129,5 ± 36,64 μl) (p < 0,05 Kruskal-Wallis seguido pelo pos-tes te de Dunn) . Reduzir a dose de 1 mg/kg resultou em perda de sangue de 641 ± 96,48 μl em camundongos que receberam Q286R- FVIIa e 487,92 + 92,07 μl em camundongos que receberam S222A- FVIIa. Doses mais baixas desta variante de FVIIa resultou em aproximadamente a mesma perda de sangue (817,71 ± 107,94 μl e 900,34 ± 115,77 μl para Q286R-FVIIa e S222A-FVIIa, respectivamente) , como observado nos camundongos que receberam o controle de veiculo. Em contraste, os camundongos que receberam 1 mg/kg de Q286R/M298Q-FVIIa tiveram a perda de sangue significativamente reduzida (69,36 ± 15,55 μl) em relação aos camundongos de controle de veiculo apenas. Em doses baixas de 0,3 mg/kg e 0,1 mg/kg, a perda de sangue foi 538,3 + 94,04 μl e 664 ± 121,6 μl, respectivamente. Camundongos que receberam 0,3, 1 e 3 mg/kg de V158D/E296V/M298Q-FVIIa tiveram perda de sangue de 754,49 ± 121,6 μl, 481,95 ± 114,22 μl e 133,25 + 50,09 μl, respectivamente.

Estudos de resposta de dose adicionais foram realizados para Q286R-FVIIa, Q286R/M298Q-FVIIa e V158D/E296V/M298Q-FVIIa e os dados combinados com os acima. Nos experimentos avaliando o efeito da Q286R-FVIIa, o grupo que recebeu o veiculo perdeu 833,61 ± 73,95 μl de sangue. Este foi significativamente reduzido para 196,71 ± 49,18 μl em camundongos que foram tratados com 3 mg/kg de Q286R-FVIIa. Reduzir a dose de 1 mg/kg resultou em perda de sangue de 577,78 ± 66,29 microlitro. Quando camundongos foram dosados com 0,1 e 0,3 mg/kg de Q286R-FVIIa a perda de sangue foi produzida foi semelhante ao valor de controle de veiculo (739,58 ± 104,28 μl e 806,63 ± 65,17 microlitro, respectivamente). Nos experimentos avaliando o efeito de Q286R/M298Q-FVIIa, o grupo de veiculo produziu perda de sangue de 902,42 ± 88,04 microlitro, que foi significativamente reduzido pelo tratamento com 1 e 3 mg/kg de 5 Q286R/M298Q-FVIIa para 145,17 ± 38,89 μl e 140,76 ± 33,36 μl da perda de sangue. Reduzir a dose para 0,1 e 0,3 mg/kg resultou em valores de perda de sangue de 664,03 ± 121,62 μl e 551,94 ± 67,60 μl, respectivamente. Nos experimentos de avaliação de V158D/E296V/M298Q-FVIIa o grupo de controle de veículo 10 demonstrou a perda de sangue de 966,64 ± 57,97 μl, que foi significativamente reduzida pelo tratamento com VI 58D/E296V/M298Q-FVIIa a 3 mg/kg para 128,19 ± 27,73 microlitro. Reduzir a dose para 1 mg/kg, levou à perda de sangue de 565,50 ± 65,78 μl e reduzindo mais a dose de 0,3 e 0,1 mg/kg a perda de 15 sangue produzido, que foi semelhante ao do grupo controle (811,16 ± 71,87 μl e 893,62 ± 106,73 μl) . A análise estatística foi feita por Kruskal Wallis seguido pelo pós-teste de Dunn e significância foi aceita quando p < 0,05.

4. Atividade coagulante de H216A-FVIIa, H373F- 20 FVIIa, Q366D-EVIIa e Q366N-FVIIa na dose de 3 mg/kg

Um conjunto de experimentos testou H216A-FVIIa, H373F-FVIIa, Q366D-FVIIa e Q366N-FVIIa na dose de 3 mg/kg. A injeção de veículo apenas foi usada como controle. Camundongos que receberam o veículo perderam 915,2 ± 105,6 μl no ensaio de 20 minutos. Este valor foi reduzido ainda mais para 211,1 ± 67,70 μl se os camundongos fossem tratados com H373F-FVIIa. A perda de sangue foi menos afetada após tratamento com H216A- FVIIa, Q366D-FVIIa e Q366N-FVIIa, com valores de 558,6 ± 66,22, 577,1 ± 151,4 e 477,1 ± 112,6 μl, respectivamente.

5. Atividade coagulante de Q286R/M298Q/Gla troca FIX-FVIIa, S222A/H257A/Q286R/M158Q-FVTIa, Q286R/ M298Q/K341D- FVIIa e Q286R/M298Q/H373F-FVIIa na dose de 3 mg/kg.

A atividade coagulante de Q286R/M298Q/Gla troca FIX- FVIIa, S222A/H257A/Q286R/M158Q-FVIIa, Q286R/M298Q/ K341D-FVIIa e Q286R/M298Q/H373F-FVIIa na dose de 3 mg/kg foi avaliada no modelo de camundongo de hemofilia CD-I. A injeção de veículo apenas foi usada como controle. Os camundongos que receberam o veículo perderam 803 ± 92,18 μl no ensaio de 20 minutos. Este valor foi reduzido pelo tratamento com S222A/H257A/Q286R/M158Q- FVIIa para 118,6 ± 63,27 microlitro. 0 tratamento com Q286R/M298Q/Gla troca FIX-FVIIa a 3 mg/kg reduziu a perda de sangue em relação ao grupo de veiculo de 888,89 ± 104,76 μl para 171,83 ± 62,06 μl. Nos experimentos de avaliação Q286R/M298Q/K341D-FVIIa e Q286R/M298Q/H373F-FVI Ia a perda de sangue do grupo de veículo foi 813,1 ± 82,66 microlitro. Este valor foi reduzido para 39,42 ± 5,53 μl perda de sangue após o tratamento com Q286R/M298Q/H373F-FVIIa. Q286R/M298Q/K341D-FVIIa parecia ser menos eficaz no ensaio, resultando em perda de sangue de 636,7 ± 121,6 microlitro.

6. Estudo de resposta de dose para avaliar a atividade coagulante de S222A/H257A/Q286R/M158Q-FVIIa e Q286R/M2 98Q/H373F-FVIIa

A resposta de dose para S222A/H257A/Q286R/M158Q-EVIIa de 0,3, 0,5, 1 e 3 mg/kg foi avaliada. Camundongos que receberam o veículo perderam 832,48 ± 71,70 μl no ensaio de 20 minutos.

Este valor foi reduzido de forma significativa nos camundongos que foram administrados 3 mg/kg de S222A/H257A/Q286R/M158Q- FVIIa, para 118,63 ± 63,27 microlitro (p < 0,05 utilizando Kruskal-Wallis seguido pelo pós-teste de Dunn). Reduzir a dose 5 para 1 e 0,5 mg/kg resultou em uma redução significativa da perda de sangue (202,69 ± 77,60 μl e 366,52 ± 106,21 μl) e uma menor dose de 0,3 mg/kg resultou em perda de sangue comparando mais com os niveis de veiculo (742,04 ± 112 μl). Uma resposta de dose para Q286R/M298Q/H373F-FVIIa de 0,1, 0,3, 1 e 3 mg/kg 10 também foi avaliada e, neste experimento os camundongos que receberam o veiculo tiveram perda de sangue de 813,15 ± 82,66 microlitro. Este valor foi reduzido de forma significativa nos camundongos que foram tratados com 3 mg/kg de Q286R/M298Q/H373F- FVIIa, para 39,42 ± 5,52 microlitro (p < 0,05 Kruskal-Wallis 15 seguido pelo pós-teste de Dunn). Reduzir a dose para 1 e 0,3 mg/kg levou a valores de perda de sangue de 208,10 ± 105,12 μl e 508,9 ± 155,8 μl, respectivamente. A menor dose testada de 0,1 mg/kg a produziu perda de sangue que se aproximava dos niveis de controle de veiculos (733,5 ± 152,88 μl).

C. Análise de atividade coagulante de FVIIa em camundongos FVIII"'-

Um modelo de camundongo de hemofilia A usando camundongos deficientes em FVIII (camundongos FVIII-7-), também foi usado para avaliar a atividade coagulante de polipeptídeos 25 de FVIIa, usando os mesmos protocolos como descrito acima, exceto que os camundongos não foram tratados com anticorpos anti-FVIII.

1. Estudo de resposta de dose avaliando a atividade coagulante de EVIIa tipo selvagem

Estudos de resposta de dose para avaliar a atividade coagulante do NovoSeven® e rhFVIIa tipo selvagem em camundongos FVIII-/- em 0,3, 1, 3 e 6 mg/kg foram realizados. No experimento de NovoSeven®, a perda de sangue no grupo de veículo foi 912,79 ± 38,32 μl, que foi significativamente reduzida no tratamento de NovoSeven® com 6 e 3 mg/kg (para 361,74 ± 55,28 μl e 586,98 ± 60,56 μl, p < 0,05 utilizando Kruskal-Wallis seguido pelo pós-teste de Dunn). Reduzir a dose para 1 mg/kg resultou em perda de sangue de 674,84 ± 46,88 μl e na menor dose testada o valor foi de 801,08 ± 41,39 microlitro. No experimento de rhFVIIa tipo selvagem, o grupo de controle de veículo produziu perda de sangue de 904,08 ± 15,38 μl. Este valor foi reduzido significativamente (p < 0,05 utilizando Kruskal-Wallis seguido pelo pós-teste de Dunn) por rhFVIIa tipo selvagem em 6 mg/kg para 4 51,04 ± 74,17 microlitro. Reduzir a dose para 3 mg/kg produziu um valor de perda de sangue de 695,75 ± 60,50 μl, enquanto a diminuição da dose adicional para 1 e 0,3 mg/kg resultou em valores de perda de sangue perto e em níveis de controle de veículo (846,08 ± 34,17 μl e 936,43 ± 31,39 microlitro, respectivamente).

2. Resposta de dose avaliando atividade coagulante de Q143R-FVIIa, S222A-FVIIa, Q286R/M298Q-FVIIa e V158D/E296V/M298Q-FVIIa

O primeiro conjunto de experimentos testou FVIIa recombinante humano (NovoSeven®, Novo Nordisk), V158D/E296V/M298Q-FVIIa, Q286R-FVIIa e S222A-FVIIa a 3 mg/kg. A injeção de veículo apenas foi usada como controle. Camundongos que receberam apenas veiculo tiveram perda de sangue de 942,9 ± 27,37 μl no ensaio de 20 minutos. O tratamento com FVII NovoSeven®, V158D/E296V/M298Q-FVIIa, Q143R-FVIIa e S222A-FVIIa reduziu a perda de sangue para 468 ± 55,9 μl, 302,38 ± 73,12 microlitro, 697,26 ± 92,22 μl e 675,07 ± 35,29 μl, respectivamente. Q143R-FVIIa, quando testado novamente em camundongos FVIII-/- em 3 mg/kg, demonstrou uma perda de sangue reduzida de 754,84 ± 60,96 μl comparado ao grupo de controle de veículo (935,54 ± 51,96 μl) . Quando avaliado em 5 mg/kg, Q143R- FVIIa produziu uma redução na perda de sangue para 445,87 ± 79,62 μl comparado ao grupo de controle de veículo (960,42 ± 24,5 μl).

O segundo conjunto de experimentos foi estudos de resposta de dose em que V158D/E296V/M298Q-FVIIa e Q286R/M298Q- FVIIa foram avaliados em 0,3, 1 e 3 mg/kg. O tratamento com V158D/E296V/M298Q-FVIIa a 3 mg/kg resultou em redução significativa da perda de sangue (375,62 ± 74,22 μl) em comparação com o controle de veículo (960,42 ± 24,5 μl, p < 0,05 utilizando Kruskal-Wallis seguido pelo pós-teste de Dunn). Reduzir a dose para 1 e 0,3 mg/kg, levou a valores de perda de sangue mais perto dos níveis de controle, de 834,76 ± 54,38 μl e 841,62 ± 68,99 μl, respectivamente. Um segundo experimento que avaliou um lote diferente da V158D/E296V/M298Q-FVIIa produziu um valor de perda de sangue de veículo de controle de 912,79 ± 38,32 μl, que foi inibido em 3 e 1 mg/kg (247,24 ± 35,17 μl e 628,30 ± 37,36 μl, p < 0,05 utilizando Kruskal-Wallis seguido pelo pós-teste de Dunn) . O tratamento com uma dose mais baixa de V158D/E296V/M298Q-FVIIa produziu perda de sangue que estava se aproximando dos valores de controle (841, 85 ± 19,32 μL) . No experimento avaliar o efeito de Q286R/M298Q-FVIIa em camundongos FVIII“/_ o grupo de veiculo produziu perda de sangue de 941,39 ± 35,18 microlitro. Esta foi inibida na dose de 3 mg/kg, resultando em perda de sangue de 258,92 ± 59,82 microlitro. Em doses baixas, de 1 e 0,3 mg/kg, os niveis de perda de sangue produzidos foram 616,82 ± 78,43 μl e 924,9 ± 38,01 microlitro, respectivamente.

D. Análise da atividade coagulante de variantes de FVIIa adicionais utilizando o modelo de Hemofilia induzida

A atividade coagulante das diversas variantes de FVIIa foi avaliada utilizando o modelo de Hemofilia induzida (IHM) com camundongos CD-I descrito no exemplo 6.B, acima. O protocolo foi o mesmo descrito acima, exceto para a avaliação da variante T128N/P129A-FVIIa e a variante M156Q/H224F-FVIIa, em que diferentes lotes (terceiro e quarto, respectivamente) do anti-FVIII humano foram utilizados. Para o terceiro lote de anti-FVIII humano (lote 3; Affinity Biologicals, lote IG1603R1, atividade neutralizante de 418 camundogo BU/ml), a dose usada foi de 12,17 mg/camundongo (120 μl de solução de estoque de 101,4 mg/ml), a qual foi administrada 18 horas antes do corte da cauda. Para o quarto lote de anti-FVIII humano (lote 4; Affinity Biologicals, lote IG1639R1, atividade neutralizante de 875 camundongo BU/ml) a dose utilizada foi de 8,04 mg/camundongo (80 μl de solução de estoque de 100,45 mg/ml). A perda de sangue foi medida como descrito acima, e apresentada na Tabela 19, como o percentual de inibição (calculado utilizando os valores médios para a variante de interesse e dividindo-se pelo grupo de veiculo), e o valor ED50 (determinado através da análise de regressão não linear (usando GraphPad Prism®, GraphPad Software, Inc.), que limitam a parte superior e inferior da curva de resposta com a perda de sangue observada com os animais controle normais e tratados com o veiculo, respectivamente.Tabela 19.

E. Anál ise da atividade coagulante de variantes de FVIIa adicionais ut.i 1 i zando o modelo de Hemofilia A induzida

A atividade coagulante das diversas variantes de FVIIa foi avaliada através do Modelo de Hemofilia Induzida (IHM) com camundongos CD- I descrito no exαnplo 6.B, acima. O protocolo foi o mesmo descrito acima, exceto que para estes experimentos lotes 4 a 6 de anticorpos anti-EVIII foram usados. Os detalhes para estes lotes foram os seguintes: lote 4 (detalhado acima), para o quinto lote (lote 5; Affinity Biologicals, lote IG1593R2, atividade neutralizante de 255 camundongo BU/ml), a dose utilizada foi 12,25 mg/mouse (120 μl de 102,1 mg/ml de solução concentrada), que foi administrada 6 horas antes do corte da cauda. Para o sexto lote (lote 6; Affinity Biologicals, lote IG1703R2, atividade neutralizante de 685 camundongo BU/ml) a dose utilizada foi de 8,02 mg/camundongo (80 μl de 100,2 mg/ml de solução concentrada), que foi administrada às 16 horas do dia anterior ao experimento. A perda sanguínea foi medida cano descrito acima, e apresentada na Tabela 20 ccmo a porcentagem de inibição (calculada utilizando os valores nédios para a variante de interesse e dividindo pelo grupo de veículo), em cada caso, todas as doses são apresentadas can os correspondentes valores de inibição abaixo, e o valor ED50 (determinado através da análise de regressão não linear (usando o software GraphPad Prisn®, GraphPad Software, Inc.), que limitam a parte superior e inferior da curva de resposta can a perda de sangue observada can os animais controle norrrais e os tratados can o veículo, respectivamente. O 'n/grupo' refere-se a quantidade de camundongos por grupo enquanto que o 'n' na referência ao cálculo do ED50 se refere à quantidade de exper.imentos realizados com a variante. Tabela 20.

Exemplo 7 Determinação da constante cinética de Michaelis Menten da atividade amidolitica de FVIIa sobre um substrato de 5 molécula pequena

A atividade amidolitica das variantes de FVII pode ser avaliada através da medição da constante cinética de Michaelis Menten do polipeptideo de FVIIa no substrato peptidil Spectrozyme FVIIa (CH3SO2-D-CHA-But- 10 Arg-pNA.AcOH). O referido ensaio pode ser realizado da seguinte forma.

Fator tecidual purificado humano lipidado (Innovin, Dade Behring, VWR Cat#68100-390) é incluído no ensaio para prover a atividade ótima do FVIIa. O complexo 15 TF-FVIIa cliva Spectrozyme FVIIa como um substrato cromogênico altamente específico liberando um cromóforo- paranitroaniline (pNA), que pode ser monitorado através da medição de absorção em 405 nm. A atividade da enzima é determinada através do monitoramento da absorbância a 405 nm do pNA livre gerado como uma função do tempo.

As reações são realizadas em três diferentes concentrações de enzimas. Para a reação, as variantes de FVIIa são primeiro diluidas a 40 nM em um tampão de ensaio direto 1 x (100 mM de Tris pH 8,4, 100 mM de NaCl, 5 mM de CaC12, 0,01% de BSA) em um tubo de 1,7 ml (tubos de microfuga de baixa adesão da ISC Bioexpress) . FVIIa é adicionalmente diluido na presença de TF (Innovin, Dade Behring) , diluindo a 2 nM em um reservatório de polipropileno de 12 poços (Axygen) da seguinte forma: 720 μl de tampão direto 5x (500 mM de Tris pH 8,4, 500 mM de NaCl, 25 mM de CaCl2, 0,05% de BSA), 180 μl de FVIIa 40 nM, e 2700 μl de TF 2x (6 nM de solução de estoque reconstituída em 10 ml de água). A protease diluída é incubada por 5 minutos em temperatura ambiente. 2 nM de estoque de FVIIa é adicionalmente diluído em duas diluições em série para dar 1 nM e 0,5 nM de estoque de protease, respectivamente, também na presença de TF. As reações de diluição em série são as seguintes: em primeiro lugar, 1800 μl de 2 nM de estoque de FVIIa/TF acima diluídos em 360 μl de tampão direto 5x, 900 μl de TF 2x, e 540 μl de água. Este estoque diluído é diluído novamente 1:1 em 1800 μl de TF lx no buffer direto.

Uma placa de diluição do substrato Spectrozyme FVIIa (American Diagnostica) é feita. A solução de estoque de Spectrozyme FVIIa é feita pela reconstituição de 50 μmoles do frasco: em água destilada a 10 mM e armazenados a 4 °C. Oitenta microlitro (10 mM de Spectrozyme FVIIa) e 60 μl + 20 μl de água (7,5 mM de Spectrozyme FVIIa) das 10 mM de Spectrozyme FVIIa são 5 adicionados aos poços em duas colunas adjacentes de uma placa de ensaio de polipropileno de 96 poços (Costar). Os dois poços são diluidos em série duas vezes para baixo cada um dos 8 poços da respectiva coluna para fazer uma série de concentrações de substrato 10x variando de 10 mM 10 a 78 mM de substrato para baixo dos poços da primeira coluna e de 7,5 mM a 58,6 mM de substrato para baixo dos poços da segunda coluna.

Cinco μl de cada diluição de substrato Spectrozyme FVIIa é adicionado a uma placa de ensaio de 15 metade da área de 96 poços claros (Costar) . Quarenta e cinco μl de cada das três diluições de FVII/TF são adicionados em três grupos de colunas das diluições em série do substrato. Durante esta etapa, cuidado é tomado para evitar a introdução de bolhas nos poços do teste. Se 20 as bolhas são introduzidos, elas podem ser removidas através da punção com uma agulha limpa antes do inicio de cada teste. As placas são então misturados por agitação. Antes do inicio do ensaio, a extensão de caminho do poços de teste é medida usando um espectrofotômetro leitor de 25 placas Spectramax Gemini M5 (Molecular Devices), tendo um terminal de leitura e usando o recurso do software SoftMax Pro (Molecular Devices). 0 aumento da absorbância a 405 nm é medido a cada 30 segundos durante uma hora a 37 °C.

O software SoftMax Pro é usado para converter a taxa de absorção (miliunidades/s) em concentração de pNA liberado (μM/s) usando a extensão de caminho e o coeficiente de extinção do grupo de liberação de pNA a 405 nm, 9600 M-1cm-1. A equação de conversão é a seguinte: Taxa x (1/60 x 1000) x (1/9600 x extensão de caminho) x 100000. Os resultados para cada concentração de protease são grafados usando o software Graph Pad Prism com a concentração de substrato sobre o eixo X e as taxas em μM/s determinada sobre o eixo Y. Usando o software Graph Pad Prism 4 Km e Ymax é determinado pelo ajuste dos dados a uma equação de Michaelis Menten como segue:5 Y = ( (KcatKm/1000000) x X x [E])/(l + (X + kra) onde: X é a concentração de substrato (μM) Y é a atividade da enzima (μM/s) kcatKm é a constante de especificidade (M-1sec-1) Km é a constante de Michaelis (μM) E é a concentração da enzima (μM)

Os valores iniciais de E = 1, km = X em 0, 5 x Ymax e KcatKra = 1000 foram definidos.

Exemplo 8 Avaliação da potência de interação entre as variantes de FVIIa e TFPI

A potência da interação entre os polipeptídeos de FVIIa, this como as providas aqui, e TFPI, pode ser avaliada através de um ou mais ensaios. Em um exemplo, a potência de interação entre TFPI e o complexo FVIIa/TF é avaliada através da medição do nivel de inibição de diferentes concentrações de TFPI sobre a atividade catalítica de FVIIa/TF contra um substrato, Spectrazyme Vila. Em outro exemplo, um ensaio de ressonância de plasma de alta capacidade de superficie (SPR) pode ser utilizado.

A. Determinação do IC50 para a inibição de TFPI de FVIIa/TF

A potência da interação entre o TFPI e o complexo FVIIa/TF foi avaliada através da medição do nível de inibição de diferentes concentrações de TFPI sobre a atividade catalítica de FVIIa/TF contra um substrato, Spectrazyme Vila. A concentração de TFPI que era necessária para a inibição de 50% (IC50) foi calculada para cada variante de FVII e um padrão de FVIIa.

Uma placa de ensaio de meia área de 96 poços claros (Nunc) foi pré-tratada pela adição de 150 pl/poço de tampão de placa 1 x (100 mM de Tris pH 8,4, 100 mM de NaCl, 0,01% de BSA, 0,01% de Tween-20) para cada poço e incubação da placa a 37 °C por um período mínimo de 1 hora. O tampão foi removido completamente por agitação e secagem das placas e centrifugação da placa de cabeça para baixo para remover o tampão restante. A placa foi seca ao ar por 1 hora, e armazenada em temperatura ambiente (RT).

Em um microtubo de 1,7 ml (tubo de microfuga de baixa adesão da ISC Bioexpress), uma mistura de FVIIa/TF foi preparada em um volume total de 450 μl, misturando 9 μl de FVIIa 250 nM (American Diagnostica, FVIIa do tipo selvagem ou respectivas variantes a serem testadas) foi misturado com 337,5 μl de TF 2x (Innovin, Dade Behring, produto liofilizado ressuspenso em 10 ml de água destilada para gerar TF 2x, o que equivale a aproximadamente 7 nM de TF lipidado) , 90 μl de tampão de ensaio 5x (500 mM de Tris pH 8,4, 500 mM de NaCl, 25 mM de CaCla, 0,05% de BSA) e 13,5 μl de água, resultando em uma solução contendo 5 nM de FVIIa e 5,2 nM de TF. A mistura foi incubada a temperatura ambiente por 5 minutos para permitir que os componentes complexassem. Em cada poço de 2 colunas na placa de ensaio de meia área de 96 poços claros, 25 μl da respectiva mistura de FVIIa/sTF foi adicionada e a placa foi coberta para evitar a evaporação.

TFPI recombinante humano (R&D Systems) foi inicialmente dissolvido em 33 μl de glicerol 50% (v/v) para fazer um estoque de 10 μM para armazenamento a -20 °C. O estoque de TFPI foi diluído a 1,5 mM em um tampão final lx (100 mM de Tris pH 8,4, 100 mM de NaCl, 5 mM de CaClz, 0,01% de BSA) em uma placa de armazenamento de polipropileno da seguinte forma: para cada protease testada, 87,5 μl de uma solução 1,5 mM de TFPI foi feita através da mistura de 13,1 μl de 10 mM TFPI com 17,5 μl de tampão de ensaio 5x e 56,9 μl de água destilada. Três diluições em série da solução de TFPI foram feitas em um tampão de ensaio lx, misturando 27,5 μl de TFPI em 55 μl de tampão de ensaio lx, de tai forma que soluções contendo 750 nM, 250 nM, 83,3 nM, 27,8 nM, 9,26 nM, 3,1 nM e 1,03 nM de TFPI foram geradas. O poço final da série continha apenas buffer lx como controle.

Vinte e cinco μl de cada diluição de TFPI foram adicionados em 2 poços (ou seja, em duplicata) de 2 colunas da placa de ensaio de meia área de 96 poços claros que contém a mistura de FVIIa/TF, de modo que a mistura de protease foi analisada em duplicata com cada diluição de TFPI. Uma solução de um tampão de ensaio lx sem TFPI também foi adicionada em 2 poços contendo a mistura de FVIIa/TF como controle negativo. A placa foi brevemente agitada e, em seguida, centrifugada a 3000 rpm por 5 minutos antes de incubação a 37 °C durante 1,5 horas.

Uma solução de estoque de Spectrazyme Vila (American Diagnostica) foi preparada pela reconstituição de 50 μmoles em 5 ml de água destilada a 10 mM e armazenada a -40 °C até o uso. Imediatamente antes de usar, a solução foi diluida a 600 mM em água destilada.

Após a incubação da placa de ensaio acima, 10 μl de Spectrazyme Vila diluido foi adicionado a cada poço da placa de ensaio. As reações foram misturadas e a placa foi incubada a 37 °C. O aumento da absorbância a 405 nm foi medido a cada 30 segundos durante uma hora a 37 °C, e a taxa de absorbância foi calculada usando o software SoftMax Pro (Molecular Devices).

Para determinar o grau de inibição pelo TFPI, as taxas de absorbância de reações de protease contendo TFPI foram inicialmente divididas pela taxa de absorbância de reações que não continham TFPI (a amostra de controle) para obter a atividade fracionária, e o log10 de cada concentração de TFPI foi determinado. Usando o software GraphPad Prism, o logio [TFPI] foi plotado contra a atividade fracionária para cada protease, e uma curva de resposta de dose foi gerada com um ajuste de curva que assumiu o topo e a base dos dados de atividade são fixados em 1 e 0, respectivamente. O software foi utilizado para determinar a inibição de TFPI tanto como valor de log IC5.o (pIC50) , e o IC50 absoluto (inibição de TFPI em nM) para cada protease, e sua média e desvio padrão foram determinados.

O nivel de inibição de TFPI de cada uma das variantes de FVIIa no complexo com TF lipidado (Innovin, Dade Behring) foi determinado e expresso como o aumento da resistência de TFPI comparado ao FVIIa do tipo selvagem (Tabela 21).Tabela 21. Inibição de variantes de FVIIa por TFPI

B. Triagem de ressonância de de plasma de superfície (SPR) de variantes de FVIIa para resistência a TFPI

A resistência relativa das várias variantes de FVIIa à inibição por TFPI recombinante humano solúvel, foi avaliada por meio de ensaio de ressonância de plasma de alta capacidade de superfície (SPR) com o instrumento T100 Biacore. A resistência relativa das variantes de FVIIa à inibição por TFPI foi avaliada pela medida da quantidade relativa da variante de FVIIa ligada a TFPI solúvel imobilizado em chip sensor Biacore CM5 em comparação com a quantidade de FVIIa tipo selvagem ligado subsequente a um tempo de injeção padronizado e concentração de protease.

Para cada experimento, TFPI solúvel (R&D Systems) foi imobilizado com um novo chip sensor Biacore CM 5 série S de 4 células de fluxo (GE Healthcare) utilizando o protocolo de ligação de amina disponível no software de controle Biacore T-100 (GE Healthcare) e os reagentes fornecidos com o kit de acoplamento Amine (GE Healthcare). Todas as quatro células de fluxo disponíveis foram utilizadas para a imobilização de duas diferentes densidades de TFPI e albumina bovina (BSA), que serviu como um agente de bloqueio das células de referência. BSA foi diluído a 5 mg/ml de acetato de sódio (pH 4,0) e imobilizado em células de fluxo 1 e 3 em 1000 e 2000 unidades de resposta (RU) , respectivamente. Para imobilização de TFPI, TFPI solúvel liofilizado (10 g) foi ressuspenso em 100 μl de tampão de acoplamento lx (30 mM de Hepes, 135 mM de NaCl, ImM de EDTA, 0,01% de Tween-20, pH 7,4) a uma concentração de 0,1 mg/ml. Um total de 20 μL de 0,1 mg/ml de TFPI diluído a 10 mg/ml de acetato de sódio pH 4,0 para a imobilização de células de fluxo 2 e 4 em 1000 e 2000 RU, respectivamente. Tampão de ligação foi utilizado como tampão de corrida durante as etapas de imobilização.

Cada amostra de FVIIa foi preparada em uma concentração final de 320 nM no tampão de corrida lx (20 mM de Hepes, 150 mM de NaCl, 5 mM de CaCl2, 0,1% de PEG 8000, 0,1% de BSA, 0,01% de Tween-20, pH 7,4) contendo 620 nM de sTF (Fator de Coagulação Humana III; R&D Systems). Geralmente, cada variante de FVIIa foi diluída 10 vezes em tampão de corrida lx antes da diluição final de 320 nM. Complexos de FVIIa/sTF foram preparadas em um volume final de 120 μl duas vezes permitindo até 48 variantes de FVIIa únicas para serem carregadas em uma placa de armazenamento de 96 poços e avaliada com injeções duplicadas em uma única corrida. 0 complexo FVIIa/sTF foi incubado à temperatura ambiente por 10 a 15 minutos antes do início da primeira injeção de amostra. '

Um método de análise de ligação padronizada foi criado no âmbito do Software de controle Biacore (GE Healthcare), no qual cada FVIIa replicado é injetado por 180 segundos de associação de tempo seguido por um curto de 60 segundos de dissociação, com uma taxa de fluxo de 10 μl/min. Regeneração do chip sensor seguida da fase de dissociação por 30 segundos com 10 mM de glicina, 500 mM de NaCl, pH 3,0 e, em seguida, um período de 60 segundos de período de estabilização com tampão de corrida IX na mesma taxa de fluso 10 μl/min. Dois pontos de referência do ensaio foram registrados para cada corrida e posterior análise de dados, 5 segundoa antes da conclusão da fase de associação (ligação) e um segundo relato 5 segundos antes da conclusão da fase de dissociação (dissociação). Antes de iniciar uma análise completa, o chip sensor foi testado com uma única injecção de 320 nM de FVIIa/sTF tipo selvagem para 180 segundos, que devem dar uma resposta de cerca de 400 a 450 RU e 750-850 RU para a ligação às células de fluxo 2 (1000 RU) e 4 (RU 200) , respectivamente.

A análise dos dados foi realizada primeiramente com o Software de avaliação Biacore T100 (GE Healthcare) para inspecionar os parâmetros de validação do ensaio, que incluem a verificação de que a ligação com a célula de referência é minima, um minimo de base para a ligação de injeções de controle em branco (tampão de corrida). Tabelas de dados foram geradas dentro deste aplicativo que indica a quantidade de variante de FVIIa ligada (RU), tanto no ponto relatato de ligação e no ponto relatado de dissociação. As tabelas de dados foram posteriormente exportadas para análise dentro do ambiente de planilha eletrônica Microsoft Excel. Os pontos de dados brutos (RU vinculados) foram corrigidos para o controle de ligação para o chip sensor e, em seguida, a razão entre a quantidade de FVIIa tipo selvagem ligado (RU) para a quantidade de variantes de FVIIa ligadas (RU) foi tomada para cada parâmetro e descrita como sendo ligação (wt/variante) e dissociação (wt/variante). A Tabela 22 apresenta os resultados do estudo. Resistência à inibição de TFPI é refletida como um aumento na proporção de um ou de ambos os parâmetros avaliados. Por exemplo, uma ligação (wt/variante) ou dissociação (wt/variante) de valor 20 para uma variante de FVIIa particular indica que essa variante é 20 vezes mais resistente à inibição de TFPI que FVIIa do tipo selvagem. Diversas variantes apresentaram maior resistência à inibição de TFPI. Por exemplo, as variantes com a mutação K341D (numeração de FVII maduro), como Q286R/M298Q/K341D-FVIIa, Q286R/K341D-FVIIa e M298Q/K341D-FVIIa, têm proporções indicando uma resistência significativa a TFPI (maior que 40 a 150 vezes) . Em alguns casos, a taxa de dissociação foi mais afetada do que a taxa de associação.Tabela 22. Resistência de variantes de FVIIa para ninibição por TFPI

Exemplo 9 Análise farmacocinética de polipeptídeos de FVIIa

As propriedades farmacocinéticas de polipeptídeos de FVIIa foram avaliadas através da medição da quantidade de 5 Fator Vila humano no plasma de camundongo. Dois ensaios podem ser utilizados para quantificar FVIIa no plasma. Um teste ELISA pode ser utilizado para quantificar proteina de FVIIa total em plasma de camundongo e um ensaio de coagulação dependente de FVIIa (FVIIa:C) utilizado para quantificar a 10 atividade coagulante dos polipeptídeos de FVIIa no plasma.

A. Administração de polipeptídeos de FVIIa a camundongo s

Polipeptídeos modificados de FVIIa proteína de FVIIa humana recombinante não modificado (rhFVIIa) 15 (NovoSeven®, Novo Nordisk) foram avaliados em estudos farmacocinéticos. Para cada estudo, a 18 camundongos machos CD-I foram injetados com uma dose de bolus intravenosa (0,1 a 3,0 mg/kg, dependendo do estudo) de rFVIIa. Aos 5, 15, 30, 60, 120 e 24 0 minutos pós-injeção, três camundongos de cada 20 protocolo de injeção foram sacrificados usando asfixia de CO2 e, aproximadamente, 1,0 ml de sangue foi retirado com uma seringa de 1,0 ml por meio de uma punção percutânea cardíaca. Cada seringa foi pré-carregada com o citrato de sódio suficiente para alcançar uma concentração final de 3,2% no 1 25 ml de sangue. As amostras de sangue foram centrifugadas a 9000 rpm por 8 min a 4 °C. O plasma foi removido para tubos de 1,5 ml individuais rotulados (Eppendorf), snap congelado em nitrogênio líquido e armazenado a -80 °C. Além disso, 1 camundongo por experimento foi injetado com veiculo sozinho (placebo) e plasma deste camundongo foi utilizado para determinação da atividade de FVIIa de fundo.

B. Ensaio ELISA

Um kit comercialmente disponível, Fator VII ELISA IMUBIND® (American Diagnostica) foi utilizado para detectar proteínas de FVII no soro por ELISA. Este kit utiliza uma placa pré-revestida com um anticorpo anti-FVIl/FVIIa para capturar a proteína, e um anticorpo anti-FVII biotinilado para a detecção através de uma peroxidase de steptavidina rotulada. O kit foi usado de acordo com orientação do fabricante, com as seguintes exceções: em primeiro lugar, a curva padrão foi reduzida para garantir uma faixa linear no intervalo de concentração e se estende por toda a concentração de 0,88 ng/ml a 10 ng/ml; em segundo lugar, a variante de FVIIa purificada sozinha foi utilizada para a curva padrão em vez do padrão de FVII fornecido com o kit, devido a diferenças na afinidade de anticorpos. Experimentos indicaram que o complexo de FVIIa com anti-trombina III (ATUI), um inibidor potencial de plasma de FVIIa, é detectado em 75% do nível da protease livre, para que o ensaio pudesse detectar o FVIIa total da amostra de plasma tanto nas formas ativas quanto inativas.

Resumidamente, as amostras de plasma foram descongeladas em temperatura ambiente e diluídas 10 vezes em tampão de amostra (PBS + 0,1% de Triton X-100 + 1,0% de BSA), em seguida, diluídas seriadamente 5,5 vezes por quatro diluições. As quatro amostras diluídas foram diluídas duas vezes sobre a placa de ELISA para diluições da amostra final de 20, 110, 605 e 3327,5 vezes. Estas quatro diluições do plasma do camundongo abrangiam uma ampla gama de concentrações de protease de 33.000 ng/ml a 20 ng/ml. Cada amostra foi medida em duas placas de ensaio diferentes, e as medidas dentro dos limites da curva padrão foram utilizadas para calcular a. concentração da variante de FVIIa no plasma da amostra.

C. Ensaio de coagulação

Um kit disponível comercialmente (STACLOT FVIIa- RTF, Diagnostica Stago, Parsippany, NJ) foi utilizado como ensaio de coagulação. Para determinar a atividade coagulante dos polipeptídeos de FVIIa ativos, as amostras de plasma foram analisadas utilizando um método de coagulação dependente de FVIIa (FVIIa:C). O ensaio foi realizado com os reagentes e as instruções fornecidas em um kit comercial e o tempo de coagulação medido através de um instrumento de detecção do coágulo eletromecânico (STArt4, Diagnostica Stago, Parsippany, NJ). O kit foi usado de acordo com orientação do fabricante, com as seguintes exceções: em primeiro lugar, a variante de FVIIa purificada sozinha foi utilizada para a curva padrão em vez do padrão rhFVIIa fornecido com o kit, em segundo lugar, os seguintes reagentes comerciais em granel foram utilizados para os estudos de rastreio farmacocinético de rotina e deu resultados comparáveis aos reagentes: fator de tecido solúvel (Calbiochem, La Jolla, CA) e mistura sintética de fosfolipídios (Avanti Polar Lipids, Alabastro, AL) , TBSA tampão (Tris-NaCl, pH 7,5 com 1% de BSA; DiaPharma, West Chester, Ohio) , e 25 μM de solução de cloreto de cálcio (Diagnostica Stago, Parsippany, NJ).

O ensaio de coagulação foi realizado da seguinte forma. Amostras de plasma congeladas foram descongeladas em temperatura ambiente por aproximadamente 45 minutos e depois diluidas a 1:5000 em tampão. 50 μl do plasma diluido é combinado com 50 μl de plasma humano deficiente em Fator VII e 50 μl do fator tecidual relipidado e pré-incubado por 180 segundos. Após pré-incubação, 50 μL de solução de cloreto de cálcio (25 μM) foi adicionado para iniciar a coagulação. O tempo de coagulação foi determinado utilizando a detecção eletromecânica de coágulo. Cada amostra de plasma foi analisada em duplicata. O sistema foi calibrado pela construção de uma curva padrão, utilizando o tempo de coagulação de uma série de diluições tampão contendo uma quantidade conhecida da variante de FVIIa especifica que está sendo analisada. Concentrações de FVIIa em amostras de plasma de camundongo foram calculadas a partir da porção linear da curva de FVIIa versus a log da curva padrão de tempo coagulação. A capacidade de amostras de plasma para induzir a coagulação em plasma deficiente de Fator VII foi relatada como ng de FVIIa/ml de plasma seguindo a subtração de fundo de FVIIa tipo selvagem endógeno no plasma de camundongos tratados com placebo.

A meia-vida de cada proteina de FVII era rotineiramente determinada fazendo um ajuste convencional do log natural da atividade a uma linha reta, medindo o tempo necessário para a atividade das proteinas de FVIIa ser reduzido pela metade. Para proteinas de FVII com decaimento multi exponencial, a meia-vida foi determinada a partir da porção terminal de log plasma vs. perfil de tempo. Parâmetros farmacocinéticos adicionais foram calculados da seguinte forma: Plasma AUCo-inr/Dose (calculada como [AUCjo-ti + Ct/(ln2/Ti/2) ] i onde t é o último ponto com concentração plasmática mensurável de polipeptideo de FVIIa dividido pela dose IV (mg/kg) ) ; meia-vida (a meia vida do polipeptideo de FVIIa durante a fase terminal do perfil de tempo versus concentração plasmática de FVIIa; TI/2 é calculado como -ln2 dividido pela inclinação negativa durante a fase terminal da trama log-linear da curva de concentração plasmática de FVIIa versus tempo) ; MRTo-úitimo (tempo médio do polipeptideo de FVIIa reside no corpo, calculado como o AUMCo-úitimo/AUCo-úitimo, onde AUMCo-úitimo θ a área total sob a curva primeiro momento versus tempo (concentração de FVIIa • tempo versus curva de tempo), e é calculado pela regra linear trapezoidal); Cl (depuração sistêmica; calculada como dose/AUCo-inf) , e Va (volume de distribuição baseada na eliminação terminal e constante (β), calculado como [Cl/(ln2/Ti/2) ] ) •

D. Propriedades farmacocinéticas de variantes de FVIIa

Usando o protocolo de FVIIa:C descrito acima, as propriedades farmacocinéticas de FVIIa do tipo selvagem e variantes de FVIIa foram avaliadas com base na atividade de coagulação em plasma. Os resultados constam na Tabela 23. Diversas variantes de FVIIa apresentaram melhora em comparação com os parâmetros farmacocinéticos de FVIIa do tipo selvagem.Quadro 23. Parâmetros farmacocinéticos de camundongo de variantes de FVIIa

β = rreia-vida beta, πedindo rreia-vida de eliminação

A Tabela 24 apresenta os resultados do estudo utilizando os seguintes parâmetros faumcccinétioos: % de Recuperação (in vivo) (a concentração plasmática medida de FVIIa a 5 minutos pós-dose (primeiro momento), dividido pela 5 concentração plasmática máxima teórica de FVIIa (administrada erm. base at massa de FVIIa e o volume de sangue total teórioo) vezes 100%);% de recuperação (in vitro) (a concentração medida de FVIIa no plasma fortificada can ara quantidade oonhecida de FVIIa dividida pela concentração plasmática de FVIIa teórica (ccm base na quantidade de massa de FVIIa cravada en um volume plasrrátioo ccnhecido)0 vezes 100%); AJ2V\tividade/Dose (ckqoendente de TF) (ALC plasmática/Cose multiplicado pelo atividade indireta dependente de TF (ver Tabela 15, acima); melhoria da atividade de exposição scbre o FVIIa NovcSever® (dependente de TF) (calculado pela AXdAtivicbde/Dose (cteperrfente de TF)ttulfes®vnV/AX*A.tivicb.de/Dose (dependente de TF?^ !itCrtE) 7 ALC*Ativicbde/Eose (irxdqoendente de TF) (AUC de plasra/Bose multiplicado pela atividade indireta independente de TF (ver Tabela 15, acirre); melhoria da atividade de exposição maior FVIIa NovoSeven® (ind^enctente de TF) (calculado pela AJC*Atividade/Dose (independente de TF)ana W7^fe^AJC*Atividada/Eose (independente de TFhvnamtete) -Tabela 24.

Exemplo 10 Determinação da ligação do Fator Vila a fator tecidual solúvel

A capacidade das variantes de FVIIa expressas de HEK 293 ou células BHK para vincular fator tecidual solúvel (STF) foi avaliada por da ressonância de plasma de superficie Biacore. As variantes de FVIIa são avaliadas através da medição do perfil de ligação a três concentrações de protease 10 em dois experimentos em duplicata, utilizando dois niveis diferentes de sTF vinculado a um chip CM5 Biacore.

Um novo chip sensor CM5 Série S (GE Healthcare Cat#BR1006-1068) foi acoplado com albumina 15 de soro bovino e fator de tecido solúvel, utili zando um instrumento Biacore T100. A ligação foi realizada através de um tampão de acoplamento Biacore (30 mM de Na HEPES pH 7,4, 135 mM de NaCl, 1 mM de EDTA, 0,01% de Tween-20) com um kit de acoplamento Amine (GE 20 Healthcare cat#BR-1000-50) e do protocolo da assistente no software Biacore T100. Para a imobilização, as quatro células do chip foram utilizadas. Células 1 e 3 foram acopladas com 500 unidades de resposta (RU) de proteina de referência 25 de albumina de soro bovino diluida em tampão de acetato, pH 4,0 e as células 2 e 4 foram acopladas com 500 e 250 RU do sTF (R&D Systems) diluida em tampão de acetato, pH 4,5.

Cada variante de FVIIa e protease de FVIIa do tipo selvagem foi testada em três concentrações e em duplicata. As proteases foram diluidas para 60 nm, 30 nm e 15 nm em 100 μl de tampão de ensaio Biacore (20 mM de Na Hepes, pH 7,4, 150 mM de NaCl, 5 mM de CaCl2, 0,1% de PEG 8000, 0,1% de BSA, 0,01% de Tween- 20) em uma placa de ensaio de 96 poços. Cada amostra foi analisada no instrumento Biacore T100 com 120 segundos de tempo de contato seguido por 180 segundos de tempo de dissociação em uma taxa de fluxo de 10 μl/min. Um tampão em branco também foi analisado. O chip foi regenerado com 50 mM de EDTA, pH 7,0 por 60 segundos e depois 30 segundos. O ensaio para medir a ligação do FVIIa do tipo selvagem a sTF deveria resultar em três conjuntos de curvas que dão um Kd de aproximadamente 8 nM.

Software de avaliação Biacore T100 foi utilizado para analisar os dados. Especificamente, a análise de ligação 1:1 da Cinética/Afinidade, que ajusta os dados para a isoterma de Langmuir, foi utilizada e os dados foram individualmente encaixados para duas repetições de cada variante, dois encaixes de resposta das unidades. Os quatro valores de encaixe Kd foram calculados e são apresentados na Tabela 25. Variantes de FVIIa contendo a mutação M298Q tenderam a apresentar resultados inferiores de Kd e, portanto, ligar-se mais fortemente ao sTF.Tabela 25. Ligação de variantes de FVIIa a TF solúvel

Un outro conjunto de experimentes foi realizado para avaliar a associação de variantes de FVIIa a TF solúvel, utilizando o mesmo ensaio, cano descrito acima, mas can ura modificação do intervalo de dose de FVIIa a 30 rM, 15 nM e 7,5 rM e análise dos dados de tal forrra que modelo de dois estados foi utilizado para ajustar os dados de SPR. Esta análise do modelo de dois estados foi fornecida no suite de software Avaliação Biacore T100 e reproduzido abaixo.

Tabela 26. Ligação de variantes de FVIIa a TF solúveis

Exemplo 11 Inibição de variantes de FVIIa por Zn2+

Variantes de FVIIa, expressas de HEK 293 ou células BHK, foram testadas para a resistência à inibição por Zn2 + na presença ou ausência de fator de tecido solúvel. Resumidamente, ZnCl2 (Aldrich) foi diluído a 20 mM de dH2O depois, a 4 mM em tampão de ensaio lx (50 mM de Na Hepes, pH 7,5, 100 mM de NaCl, 1,5 mM de CaCl2, 0,01% de Tween-20 e 0,01% de PEG- 8000) . Duas diluições em série foram feitas para gerar onze concentrações de zinco, até 3.9 μM, através de uma placa de 96 poços. O último poço na linha continha tampão sem zinco para medir atividade proteolítica de FVIIa não inibido. As variantes de FVIIa, e da protease do tipo selvagem, foram diluídas para 500 nM, em seguida, novamente 10 vezes para 50 nM. Esta solução estoque de 50 nM foi utilizada para os ensaios sem utilização do fator tecidual solúvel (sTF, R&D Systems) . Para os ensaios com fator de tecido solúvel, a protease foi diluída novamente em tampão de ensaio IX com sTF para concentrações finais de 12,5 nM e 125 nM, respectivamente. As soluções foram previamente incubadas por pelo menos 5 minutos em temperatura ambiente.

Para iniciar a reação de inibição, 20 μl de FVIIa/sTF ou solução de FVIIa foi misturada com 60 μl da série de zinco para cada linha de dez concentrações. Para as reações de inibição com FVIIa sozinho, as misturas foram iniciadas com 2 mM de ZnCl2 e para FVIIa/sTF, foram iniciados com 4 mM ZnCl2. A placa foi incubada por 30 minutos em temperatura ambiente. Para o ensaio de inibição de Zn2+, 20 μl do substrato de FVIIa (mesilato-dFPR-ACC, dissolvido a 20 mM em DMSO e diluido em tampão de ensaio) foi adicionado aos poços para uma concentração final de 90 mM. As concentrações de zinco e sTF foram mantidas no ensaio, adicionando-as de forma adequada à solução do substrato. O aumento de fluorescência (Ex: 380 nm, Em: 460 nm) foi medido durante 60 minutos a 30 °C em um leitor de placas Spectramax Gemini M5 (Molecular Devices). A atividade proteolítica residual foi calculada em cada concentração de zinco dividindo a taxa inibida pela taxa de protease não inibida. A concentração de Zn2+ necessária para inibir a metade da atividade proteolítica (Ko,s), foi calculada plotando a concentração de zinco versus a atividade residual, e o encaixe com uma equação hiperbólica XLFit4 usando software (IDBS). Cada protease foi analisada duas vezes em duas ocasiões distintas para obter um valor médio para o Ko,s.

Os resultados são fornecidos na Tabela 27. As mutações H257 e H216 aumentaram a resistência em cerca de 3 vezes. As mutações M268Q também aumentaram a resistência ao zinco por 3 vezes. Em todos os casos, o efeito era mantido em graus diferentes quando combinado com mutações adicionais. As variantes mais resistentes foram combinações de mutações acima: H216A/H257A-FVIIa e H257A/M298Q- FVIIa.Tabela 27. Inibição de variantes de FVIIa por Zn2+

Exemplo 12 Determinação da Concentração de protease cataliticamente ativa usando 4-metiluiribeliferil p' -guanidinobenzoato titulante de sitio ativo (MUGB)

Em alguns casos, a concentração de FVIIa cataliticamente ativos em uma solução de estoque foi determinada por titulação de um complexo FVIIa e fator de tecido solúvel (sTF) com 4-metilumbeliferil p' -guanidinobenzoato (MUGB), um éster de substrato fluorogênico desenvolvido como um centro ativo de tripsina serinoproteases. O ensaio foi realizado essencialmente como descrito por Payne et al. (Bioquímica (1996) 35:7100-7106) com algumas pequenas modificações. MUGB prontamente reage com FVIIa, mas não com protease de FVII ou inativa, para formar um intermediário de acil-enzima eficaz estável, sob condições em que a concentração de MUGB está saturando e a desacilação é especialmente lenta e limita a taxa de catálise. Sob essas condições, a protease de FVIIa sofre um volume catalítico único para liberar o fluoróforo de 4-metilumbeliferona (4-MU). Quando a explosão inicial de fluorescência é calibrada para uma curva padrão de concentração externa de fluorescência de 4-MU, a concentração de sítios ativos pode ser calculada.

Os ensaios foram realizados com 1 ml ou 2 ml de volume de reação em uma cubetas de quartzo de 0,4 cmx 1 cm ou 1 cmx 1 cm, respectivamente, sob agitação continua. Cada reação continha 0,5 μM de sTF (R&D Systems Human) em um tampão de ensaio contendo 50 mM de Hepes, 100 mM de NaCl, 5 mM de CaClz e 0,1% de PEG 8000, pH 7,6. A solução de 4-MU padrão foi preparada em uma concentração de estoque de 0,5 M em DMSO e a concentração confirmada por espectroscopia de absorção a 360 nm usando um coeficiente de extinção de 19.000 M’1cm-1 em 50 mM tampão de Tris, pH 9.0. MUGB foi preparada em uma concentração de estoque de 0,04 M em DMSO com base no peso seco. Os ensaios foram iniciados pela adição de 4 μl de 4 mM de MUGB (para a reação de 2,0 ml) ou 2 mM de MUGB (para a reação de 1,0 ml) (em cada caso, uma concentração final de 8 μM) para uma solução de 0,5 μM de sTF (20,2 μl ou 10,1 μl de 49,4 μM de sTF) em tampão de ensaio lx e primeira medição da hidrólise de fundo para MUGB - 150 a 200 segundos antes da adição da variante de FVIIa ou FVIIa para uma concentração final de 100 a 200 nM basedo em ELISA inicial (Exemplo 1C.1) ou a titulação de sitio ativo com o FFR-CMK (Exemplo 3) . A liberação de fluorescência de 4-MU na fase inicial de reação foi seguida por um periodo adicional 1000 a 1200 segundos. Uma curva padrão de 4-MU livre foi preparada pela titulação de 4-MU de absorvância calibrada em um tampão de ensaio lx contendo 0,5 μM de sTF em etapas de 20 nM para uma concentração final de 260 a 300 nM.

Para análise dos dados, traços de reação foram importados para o pacote de software GraphPad Prism e a contribuição da hidrólise de fundo foi subtraida da curva por extrapolação da taxa inicial da medida de hidrólise de MUGB espontânea, que foi tipicamente menor que 5% da fluorescência de ruptura total. A curva corrigida estava encaixada a uma equação exponencial simples com uma componente linear (para dar conta do ritmo lento de desacilação) da forma AFluorescência = Amp(l-e'kL) + Bt, onde Amp = amplitude da fase de explosão sob condições de ensaio de saturação esboçado acima, k é a constante de taxa de primeira ordem observada para a formação de acil-enzima e B é uma constante de taxa de volume associada volume total da MUGB. A concentração de protease de FVIIa ativa é calculada através da comparação do parâmetro para amplitude da curva padrão de 4-MU. Os valores dos ensaios múltiplos foram medidos, a média e o desvio- padrão determinados.

Exemplo 13 Atividade especifica de polipeptideos de variante de FVIIa para mesila-dFPR-ACC

Para avaliar a actividade das variantes de FVIIa, a atividade (atividade/mol) de polipeptideos de FVIIa para a clivagem de um substrato ACC de tripeptideo (mesilato-dFPR-ACC) sob um conjunto de condições de ensaio padrão foi determinada. O ensaio envolveu uma pré-incubação de polipeptideos de FVIIa com uma quantidade de saturação de sTF, antes da diluição no substrato de mesila-dFPR-ACC. As taxas iniciais de clivagem do substrato foram então seguidas para avaliar o aumento na fluorescência do ACC. Taxas iniciais de liberação de fluorescência foram normalizados para uma curva de ACC padrão interno e os dados foram relatados como μmol/s/μmol de FVIIa.

Para preparar as reações, cada amostra de FVIIa a ser testada foi diluida em uma placa de armazenamento de polipropileno para 200 nm em um tampão de ensaio lx (20 mM de Hepes, 150 mM de NaCl, 5 mM de CaCl2, 0,1% de BSA, 0,1% de PEG-8000, pH 7,5). Onde necessário, uma diluição de FVIIa de estoque foi preparada para que o volume mínimo foi de pipetados fosse de 5 microlitro. A diluição de fator de tecido solúvel (sTF) de estoque (R&D Systems) foi preparada a uma concentração final de 1,0 μM com um volume adequado de tampão de ensaio IX necessário para dar conta da triagem de 8 a 32 proteases/placa. Por exemplo, quando se examina 8 proteases, 1,0 ml de 1,0 μM de sTF foi necessário/placa, enquanto que para avaliar 32 proteases, 2,5 ml de sTF foi necessário/placa. As amostras de FVIIa foram complexadas com sTF em uma concentração final de 100 nM de FVIIa/500 nM de sTF em 50 μl de volume de ensaio por mistura de 25 μl de 200 nM de variante de FVIIa com 25 μl de 1,0 μM de sTF na placa de armazenamento de polipropileno. As reações do complexo de FVIIa/sTF foram incubadas em temperatura ambiente por 15 minutos para alcançar o equilíbrio. Após o período de equilíbrio, 10 μl de cada reação de complexo de FVIIa/sTF foi dispensads para a linha correspondente de uma placa de ensaio de meia área preta de 96 poços (Costar). As variantes de FVIIa e controles foram analisados em triplicata. O substrato de mesila-dFPR-ACC foi preparado a uma concentração final de 1,1X de 0,09 mM para explicar a diluição de 1:10 do polipeptideo de FVIIa em substrato. Para uma placa de meia área de 96 poços completa, 20 ml de 0,1 mM de substrato de mesila-dFPR-ACC foi preparado em tampão de ensaio IX pela diluição de substratod de estoque armazenado em DMSO seco.

O ensaio foi executado em uma estação de trabalho automática BioMek® de FX (Beckman Coulter) , equipada com uma cabeça de ponta 96 (PAM BioRobotix ART® 130 μl de dicas) . A placa de ensaio (pré-dispensada com 10 μL de reações de FVIIa/sTF) foi colocada na plataforma da estação de trabalho com um reservatório de um canal preenchido com a solução de mesila-dFPR-ACC 1,1XX. A temperatura do leitor da placa foi fixada a 37 °C. A estação de trabalho BioMek® de FX iniciou o ensaio, transferindo 90 μl do reservatório de um canal preenchido com substrato de mesila-dFPR- ACC 1, IX em cada poço da placa de ensaio preta contendo 10 μL de EVIIa/sTF. A concentração final de variantes de FVIIa, sTF e concentração de mesila-dFPR-ACC no ensaio foram de 10 nM, 50 nM e 0,09 mM, respectivamente. A estação de trabalho então misturou 70 μl da amostra de 100 μl duas vezes. A placa de ensaio em preto foi transferida para um leitor de placas Spectramax Gemini (Molecular Devices) e as taxas de reação inicial foram seguidas por 10 min a 37 °C.

Após a conclusão do ensaio, uma placa contendo uma curva padrão de ACC livre (100 μl/popo) foi lida no mesmo leitor de placas Spectramax Gemini e usada para fornecer uma conversão precisa de RFU/seg para μM/seg. A placa padrão foi preparada como segue. Em todos os "pares" de poços (ou seja, a cada segundo poço) da linha superior de uma placa de ensaio de meia área preta de 96 poços, 1 mM de amostra de ACC foi diluida em 25 nm de Tampão de Ensaio IX para um. volume final de. 200 microlitro (5 μl de 1 mM de ACC de tampão de ensaio lx) . 100 μl de tampão de ensaio IX foram pipetados em todos os poços restantes de "pares" de colunas. O substrato de ACC foi diluido em série 1:1 para baixo das colunas até mesmo para gerar mais 6 concentrações de ACC. A última linha ficou com apenas 100 μl de tampão de ensaio IX (ou seja, sem ACC) . A fluorescência foi medida usando uma versão de leitura de ponto final das condições de ensaio e um gráfico de fluorescência em função da concentração de ACC foi traçado. A inclinação da linha através desses pontos deu o fator de conversão de RFU para μM.

O software SoftMax Pro (Molecular Devices) foi utilizado para analisar os dados para a leitura de chapa, bem como a curva padrão. 0 arquivo contendo os dados foram salvos e exportados como um arquivo de texto ASCII, que foi importado para o programa Microsoft Excel, processados e analisados usando um modelo criado no Microsoft Excel. Ao importar os dados para o modelo do Microsoft Excel, a média de RFU/μM de conversão foi calculada a partir da inclinação da curva de ACC padrão e utilizada para fornecer um fator de conversão que alterou os dados da placa da RFü/seg para a medida da atividade em μM/seg. Todos os valores foram avaliados em triplicado para outliers, que foram excluidos, se necessário. A atividade especifica de cada variante de FVIIa e controle do tipo selvagem foi expressa em unidades de μmol/seg/μmol, e calculada pelas seguintes expressões:Média de dados (RFU/s)*fator de conversão (RFU/μM) = Atividade (em μM/s) Atividade especifica (em μmol/s/μmol) = [(μM/s)*(100 μl)*(1/1000000 )]/[( 10 nM)*(100 μl)*(1/1000000)*(1/1000)]

A Tabela 28 apresenta a atividade especifica de variantes de FVIIa que foram analisadas, incluindo a atividade relativa ao FVIIa do tipo selvagem. Também estão incluídos o desvio-padrão (DP) e coeficiente de variação (em percentagem; CV%) . Diversas variantes de FVIIa apresentaram maior atividade específica para a clivagem de mesila-dFPR-ACC em relação ao polipeptideo de FVIIa do tipo selvagem. Por exemplo, Q366V-FVIIa apresentou atividade especifica para a clivagem de mesila-dFPR- ACC, que foi quatro vezes maior que a observada com a variação de FVIIa do tipo selvagem. Variantes de FVIIa contendo a mutação H373F também tendem a apresentar maior atividade especifica para a clivagem de mesila-dFPR-ACC em relação ao polipeptideo de FVIIa do tipo selvagem.Tabela 28. Atív-í clarim especifica de polipeptídeos de FVIIa para mesila-dFPR-ACC

Exemplo 15 Ativação de FX e Determinação da concentração de protease cataliticamente ativa usando fluoresceina-mono-p'- guanidinobenzoato (FMGB)titulante de sitio ativo

A concentração do Fator X (FX), que é capaz de se tornar cataliticamente ativo, em uma solução estoque do zimogênio foi determinada pela ativação de amostras de FX com Viper Venom de Russell (RVV-ase), seguido por titulação do Fator X ativo (FXa) com fluoresceina-mono-p'- guanidinobenzoato (FMGB), um éster de substrato fluorogênico desenvolvido como uma solução necessária para o sítio ativo de proteases de serino tripsina. Após a ativação, o ensaio de titulação de sitio ativo foi realizado essencialmente como descrito por Bock et al. (Archives of Biochemistry and Biophysics (1989), 273:375388), com algumas pequenas modificações. FMGB prontamente reage com FXa, mas não com protease de FX ou inativa, para formar um intermediário de acil-enzima eficaz estável, sob condições em que a concentração de FMGB está saturando e a desacilação é especialmente lenta e limita a taxa de catálise. Sob essas condições, a protease de FXa sofre um volume catallítico único para liberar o fluoróforo de fluoresceína. Quando a explosão inicial de fluorescência é calibrada para uma curva de concentração do padrão de fluorescência externa da fluoresceína, a concentração de sítios ativos pode ser calculada.

Reações de ativação de FXa foram preparadas em uma concentração final de 10 μM de FX (com base na absorbância A2go e um coeficiente de extinção de 1,16) em um volume final de 50 a 100 μl de tampão de reação contendo 100 mM de Tris, 50 mM de NaCl, 5 mM de CaCl2, 0,1% de PEG 8000, pH 8,1, A ativação foi iniciada pela adição de RVV- ase a uma concentração final de 5 μg/mL (5 μl de 98 μg/ml de diluição por 100 μl de reação ou 2,5 μl por reação 50 μl) a 37 °C por 45 a 60 do tempo de ativação (previamente determinado para representar a ativação completa através do recolhimento de amostras a cada 15 minutos e testando o aumento da divagem do substrato

Spectrafluor FXa fluorogênico). As reações foram temperadas com 1/10 do volume de tampão de de temperação contendo 100 mM de Tris, 50 mM de NaCl, 5 mM, 100 mM de EDTA, 0,1% de PEG 8000, pH 8,1.

Os ensaios foram realizados com um volume de reação de 1 ml em cubeta de quartzo de 0,4 centimetro x 1 centimetro sob agitação continua. Reações contidas em 100 a 4 00 nM de FXa recentemente activado e 5 mM de FMGB em um tampão de ensaio contendo 30 mM de Hepes, 135 mM de NaCl, 1 mM de EDTA e 0,1% de PEG 8000, pH 7,4. A solução de fluoresceina padrão foi preparada em uma concentração de estoque de 7 0 mM em DMF e a concentração confirmada por espectroscopia de absorção em condições padrão em 496 nm, utilizando um coeficiente de extinção de 89.125 M"1cm'1 em NaOH 0,1 N. FMGB foi preparada em uma concentração de estoque de 0,01 M em DMF com base no peso seco e a concentração confirmada por espectroscopia de absorção em 452 nm, utilizando um coeficiente de extinção de 19.498 em tampão de fosfato salino (PBS), pH 7,2. Os ensaios foram iniciados pela adição de 5 μl de 1 mM de FMGB (5 mM de concentração final) para um tampão de ensaio lx e a primeira medida a partir da hidrólise de fundo para FMGB -150 a 200 segundos antes da adição de FXa para uma concentração final de -100 a 400 nM com base na concentração inicial determinada pela absorbância antes da ativação por RVV-ase (veja acima). A liberação da fluorescência da fluoresceina na fase de explosão da reação foi seguida por um periodo adicional de 3600 segundos. Uma curva padrão de fluoresceina livre foi preparada pela titulação da absorbância padrão de fluoresceína calibrada em tampão de ensaio lx em etapas de 20 nM a uma concentração final de 260 a 300 nM.

Para análise dos dados, traços de reação foram importados para o pacote de software GraphPad Prism e a contribuição da hidrólise de fundo foi subtraida da curva por extrapolação da taxa inicial de medida de hidrólise de FMGB espontânea, que foi tipicamente menor que 5% da fluorescência de ruptura total. A curva corrigida estava encaixada em uma equação exponencial simples com um componente linear (para dar conta do ritmo lento de desacilação) de forma AFluorescência = Amp (l-e”kt) 1 Bt, onde Amp = amplitude da fase de explosão sob condições de ensaio saturado esboçado acima, k é a constante de taxa de primeira ordem observada para a formação de acil-enzima e B é uma taxa constante, associada com maior volume de total de FMGB. A concentração de protease de FXa ativa foi calculada através da comparação do parâmetro adequado para a amplitude da curva padrão de fluoresceina. Os valores dos ensaios múltiplos foram medidos, a média e o desvio-padrão determinados. A quantidade de FXa ativo na preparação, portanto, representa diretamente a concentração de FX em uma preparação de massa, que pode ser ativado por FVIIa. Este valor de sitio ativo titulado é utilizado no cálculo da concentração de FX para ser usado em um ensaio indireto, tal como os ensaios dependentes de TF e independentes de TF, descritos no Exemplo 4.

Uma vez que as modificações serão aparentes para aqueles versados na técnia, pretende-se que esta invenção seja limitada apenas pelo escopo das reivindicações em anexo.

Claims

1. Polipeptídeo de fator VII (FVII) modificado, compreendendo modificações em um polipeptídeo de FVII, caracterizado pelo fato de que: as modificações são em posições correspondentes à posição 286 e à posição 298 em um polipeptídeo de FVII possuindo a sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO:3; a modificação na posição 286 é uma substituição de aminoácido por uma arginina (Arg, R); a modificação na posição 298 é uma substituição de aminoácido por uma glutamina (Gln, Q); e o polipeptídeo de FVII modificado exibe atividade coagulante aumentada comparada ao polipeptídeo de FVII da SEQ ID NO:3.

2. Polipeptídeo de FVII modificado, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a modificação na posição 286 é substituição de Gln (Q) por Arg (R).

3. Polipeptídeo de FVII modificado, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a modificação na posição 298 é substituição de Met (M) por Gln (Q).

4. Polipeptídeo de FVII modificado, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de compreender as modificações Q286R e M298Q.

5. Polipeptídeo de FVII modificado, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que compreende a modificação selecionada dentre A51N, S52A, S52N, P54S, S60A, Q66N, Y68S, K109N, S119N, A122N, G124S, T130N, E132S, V158D, V158T, K161S, K161A, K161V, A175S, D196K, D196R, D196A, D196Y, D196F, D196W, D196L, D196I, K197Y, K197A, K197E, K197D, K197L, K197M, K197I, K197V, K197F, K197W, K199E, K199D, K199E, R202S, H216S, H216A, H216K, H216R S222A, S222K, S222V, S222D, S222N, S222E, G237W, G237T, G237I, G237V, T239S, T239N, T239Q, T239V, T239L, T239H, T239I, T239A, H257A, H257S, L287T, R290A, R290E, R290D, R290N, R290Q, R290K, R290M, R290V, A292N, A294S, E296V, L305V, L305Y, L305I, L305F, L305A, L305M, L305W, L305P, L305G, L305S, L305T, L305C, L305N, L305E, L305K, L305R, L305H, L305D, L305Q, S314A, S314V, S314I, S314M, S314F, S314W, S314P, S314G, S314L, S314T, S314C, S314Y, S314N, S314E, S314K, S314R, S314H, S314D, S314Q, G318N, P321K, P321E, P321Y, P321S, K337L, K337V, K337I, K337M, K337F, K337W, K337P, K337G, K337S, K337T, K337C, K337Y, K337N, K337E, K337R, K337H, K337D, K337Q, K341Q, K341E, K341R, K341N, K341M, K341D K341D, Q366D, Q366E, Q366N, Q366T, Q366S, Q366V, Q366I, Q366L, Q366M, H373A, H373F, H373D, H373E, H373S, H373V, H373L, H373I, H373A, F374P, F374A, F374V, F374I, F374L, F374M, F374W, F374G, F374S, F374T, F374C, F374Y, F374N, F374E, F374K, F374R, F374H, F374D, F374Q, E394N, P395A e R396S.

6. Polipeptídeo de FVII modificado, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo fato de que compreende uma modificação de aminoácido adicional que é selecionada dentre D196K, D196R, D196A, D196Y, D196F, D196W, D196L, D196I, K197Y, K197A, K197E, K197D, K197L, K197M, K197I, K197V, K197F, K197W, K199A, K199D, K199E, G237W, G237T, G237I, G237V, T239A, R290A, R290E, R290D, R290N, R290Q, R290K, R290M, R290V, K341E, K341R, K341Q, K341N, K341M, K341D, G237T23 8insA, G237T2 38insS, G237T238insV, G237T238insAS, G237T2 38insSA, D196K1 97insK, D196K197insR, D196K197insY, D196K197insW, D196K1 97insA, D196K197insM, K197I198insE, K197I198insY, K197I1 98insA, K197I198insS, T239S, T239N, T239Q, T239V, T239L, T239H, T239I, L287T, P321K, P321E, P321Y, P321S, Q366D, Q366E, Q366N, Q366T, Q366S, Q366V, Q366I, Q366L, Q366M, H373D, H373E, H373S, H373L, H373I, H373F, H373A, K161S, K161A, K161V, H216S, H216A, H216K, H216R, S222A, S222K, S222V, S222N, S222E, S222D, H257A, H257S, Gla Troca FIX , {Gla Troca FIX/E40L}, {Gla Troca FIX/K43I}, {Gla Troca FIX/Q44S}, {Gla Troca FIX/M19K}, {Gla Troca FIX/M19K/E40L/K43I/Q44S}, Gla Troca FX , Gla Troca Prot C, Gla Troca Prot S, Gla Troca Trombina, S52A, S60A, E394N, P395A, R396S, R202S, A292N, A294S, G318N, A175S, K109N, A122N, G124S, A51N, T130N, E132S, S52N, P54S, S119N, L121S, T128N, P129A, Q66N, Y68S, S103S111delinsQRLMEDICLPRWGCLWEDDF, H115S126delinsQRLMEDICLPRWGCLWEDDF, T128P134delinsQRLMEDICLPRWGCLWEDDF, S103S111delinsIEDICLPRWGCLWE, H115S126delinsIEDICLPRWGCLWE, T128P134delinsIEDICLPRWGCLWE, S103S111delinsDICLPRWGCLWED, H115S126delinsDICLPRWGCLWED, T128P134delinsDICLPRWGCLWED, P406insIEDICLPRWGCLW, P406insGGGSIEDICLPRWGCLW, P406insDICLPRWGCLWED, P406insGGGSDICLPRWGCLWED, S103S111delinsSFGRGDIRNV, H115S126delinsSFGRGDIRNV, T127P134delinsSFGRGDIRNV, P406insCSFGRGDIRNVC, P406insGGGSCSFGRGDIRNVC, V158T, V158D, L287T e E296V.

7. Polipeptídeo de FVII modificado, de acordo com qualquer uma das reivindicações 4 a 6, caracterizado pelo fato de que compreende modificações selecionadas entre Q286R/M298Q/K341Q, Q286R/M298Q/K199E, Q286R/M298Q/Gla Troca FIX, Q286R/M298Q/Q366D, Q286R/M298Q/Q366N, Q286R/M298Q/H373F, {Gla Troca FIX/E40L}/Q286R/M298Q, {Gla Troca FIX/K43I}/Q286R/M298Q, {Gla Troca FIX/Q44S}/Q286R/M298Q, {Gla Troca FIX/M19K}/Q286R/M298Q, {Gla Troca FIX/M19K/E40L/K43I/Q44S}/Q286R/M298Q, T128N/P129A/Q286R/M298Q, V158D/Q286R/E296V/M298Q, Gla Troca FIX/T128N/P129A/Q286R/M298Q, T128N/P129A/S222A/H257A/Q286R/M298Q, T128N/P129A/Q286R/M298Q/H373F, S52A/S60A/Q286R/M298Q, Gla Troca FIX/S52A/S60A/Q286R/M298Q, S52A/S60A/S222A/H257A/Q286R/M298Q, S52A/S60A/Q286R/M298Q/H373F, T239V/Q286R/M298Q, S222A/T239V/H257A/Q286R/M298Q, Gla Troca FIX/T239V/Q286R/M298Q, T239V/Q286R/M298Q/H373F, T239I/Q286R/M298Q, S222A/T239I/H257A/Q286R/M298Q, Gla Troca FIX/T239I/Q286R/M298Q, T239I/Q286R/M298Q/H373F, Gla Troca FIX/S222A/Q286R/M298Q, Gla Troca FIX/S222A/Q286R/M298Q/H373F, V158D/Q286R/E296V/M298Q/H373F, H257A/Q286R/M298Q, H257S/Q286R/M298Q, S222A/H257S/Q286R/M298Q, H257S/Q286R/M298Q/H373F, S222A/Q286R/M298Q/H373F, S222A/Q286R/M298Q, T128N/P129A/A175S/Q286R/M298Q, A122N/G124S/A175S/Q286R/M298Q, T128N/P129A/A175S/S222A/H257A/Q286R/M298Q, A122N/G124S/A175S/S222A/H257A/Q286R/M298Q, T128N/P129A/A175S/Q286R/M298Q/H373F, A122N/G124S/A175S/Q286R/M298Q/H373F, {Gla Troca FIX /K43I}/T128N/P129A/Q286R/M298Q, T128N/P129A/Q286R/M298Q/Q366N, {Gla Troca FIX /K43I}/Q286R/M298Q/Q366N, {Gla Troca FIX /K43I}/ T128N/P129A/Q286R/M298Q/Q366N, V158D/Q286R/E296V/M298Q, T128N/P129A/Q286R/M298Q/Q366N/H373F, T239V/Q286R/M298Q/Q366N, T239I/Q286R/M298Q/Q366N, T128N/P129A/T239V/Q286R/M298Q, T128N/P129A/S222A/T239V/H257A/Q286R/M298Q, T128N/P129A/T239V/Q286R/M298Q/H373F, T128N/P129A/T239I/Q286R/M298Q e T128N/P129A/T239I/Q286R/M298Q/H373F.

8. Polipeptídeo de FVII modificado, de acordo com qualquer uma das reivindicações 4 a 7, caracterizado pelo fato de compreender modificações selecionadas entre T128N/P129A/Q286R/M298Q, T2391/Q286R/M298Q/Q366N, T239V/Q286R/M298Q/Q366N, T128N/P129A/Q286R/M298Q/Q366N/H373F, V158D/Q286R/E296V/M298Q/H373F, A122N/G124S/A175S/Q286R/M298Q/H373F, T128N/P129A/A175S/Q286R/M298Q/H373F, A122N/G124S/A175S/S222A/H257A/Q286R/M298Q, T128N/P129A/A175S/S222A/H257A/Q286R/M298Q, A122N/G124S/ A175S/Q286R/M298Q, T128N/P129A/A175S/Q286R/M298Q, H257A/Q286R/M298Q, Gla Troca FIX/S222A/Q286R/M298Q, S222A/Q286R/M298Q, Gla Troca FIX/ S222A/Q286R/M298Q/H373F, S222A/Q286R/M298Q/H373F, S222A/H257S/Q286R/M298Q, T2391/Q286R/M298Q/H373F, S222A/T239I/H257A/Q286R/M298Q, T128N/P129A/T239I/Q286R/M298Q, Gla Troca FIX/T239I/Q286R/M298Q, T239I/Q286R/M298Q, T128N/P129A/S222A/T239V/H257A/Q286R/M298Q, S222A/T239V/H257A/Q286R/M298Q, T128N/P129A/T239V/Q286R/M298Q, Gla Troca FIX/T239V/Q286R/M298Q, V158D/Q286R/E296V/M298Q, T128N/P129A/Q286R/M298Q/H373F, Q286R/M298Q/H373F, {Gla Troca FIX K[43]I}/T128N/P129A/Q286R/M298Q/Q366N, {Gla Troca FIX K[43]I}/Q286R/M298Q/Q366N, Q286R/M298Q/Q366N, S52A/S60A/S222A/H257A/Q286R/M298Q, T128N/P129A/S222A/H257A/Q286R/M298Q, S222A/H257A/Q286R/M298Q, {Gla Troca FIX/K[43]I}/T128N/P129A/Q286R/M298Q, Gla Troca FIX/S52A/S60A/ Q286R/M298Q, S52A/S60A/Q286R/M298Q, {Gla Troca FIX/M[19]K}/ Q286R/M298Q, {Gla Troca FIX/Q[44]S}/ Q286R/M298Q, {Gla Troca FIX/K[43]I}/Q286R/M298Q, {Gla Troca FIX/E[40]L}/Q286R/M298Q e Gla Troca FIX/T128N/P129A/Q286R/M298Q.

9. Polipeptídeo de FVII modificado, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, caracterizado pelo fato de que contém um domínio Gla heterólogo.

10. Polipeptídeo de FVII modificado, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizado pelo fato de que compreende uma sequência de aminoácidos estabelecida em qualquer uma das SEQ ID NOS: 138 a 141, 150, 154, 155, 157, 274 a 278, 280, 282, 286 a 288, 293 a 295, 297, 302 a 304, 306, 311 a 313, 317, 318, 321, 322, 324 a 326, 328, 337 a 342, 355 a 358, 360 ou 364 a 371.

11. Polipeptídeo de FVII modificado, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizado pelo fato de que é ativo ou ativado.

12. Polipeptídeo de FVII modificado, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, caracterizado pelo fato de que compreende as modificações T128N, P129A, Q286R, e M298Q.

13. Polipeptídeo de FVII modificado, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que o domínio de Gla heterólogo é selecionado entre um domínio de Gla no Fator IX (FIX), Fator X (FX), protrombina, proteína C, proteína S, osteocalcina, proteína Gla de matriz, proteína específica de parada do crescimento (Gas6) e proteína Z.

14. Polipeptídeo de FVII modificado, de acordo com qualquer uma das reivindicações 9 e 13, caracterizado pelo fato de que o domínio de Gla heterólogo tem uma sequência de aminoácidos estabelecida em qualquer uma das SEQ ID NOS: 83 a 91, 93 e 94.

15. Polipeptídeo de FVII modificado, de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que o domínio de Gla de FVII nativo inclui aminoácidos 1 a 45 em um polipeptídeo de FVII tendo uma sequência de aminoácidos estabelecida em SEQ ID NO:3, ou em resíduos correspondentes em um polipeptídeo de FVII.

16. Polipeptídeo de FVII modificado, de acordo com qualquer uma das reivindicações 9 a 15, caracterizado pelo fato de que: o domínio de Gla heterólogo é um domínio de Gla de FIX; e compreende a modificação M19K, E40L, K43I ou Q44S do domínio de Gla de FIX definido na SEQ ID NO:83.

17. Polipeptídeo de FVII modificado, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 16, caracterizado pelo fato de que a modificação é M19K/E40L/K43I/Q44S.

18. Polipeptídeo de FVII modificado, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 16, caracterizado pelo fato de que compreende modificações selecionadas dentre Q286R/M298Q/Gla Troca FIX, {Gla Troca FIX/E40L}/Q286R/M298Q, {Gla Troca FIX/K43I}/Q286R/M298Q, {Gla Troca FIX/Q44S}/Q286R/M298Q, {Gla Troca FIX/M19K}/Q286R/M298Q, {Gla Troca FIX/M19K/E40L/K43I/Q44S}/Q286R/M298Q, Gla Troca FIX/T128N/P129A/Q286R/M298Q, Gla Troca FIX/S52A/S60A/Q286R/M298Q, Gla Troca FIX/T239V/Q286R/M298Q, Gla Troca FIX/T239I/Q286R/M298Q, Gla Troca FIX/S222A/Q286R/M298Q, Gla Troca FIX/S222A/Q286R/M298Q/H373F, {Gla Troca FIX/K43I}/T128N/P129A/Q286R/M298Q, {Gla Troca FIX /K43I}/Q286R/M298Q/Q366N e {Gla Troca FIX /K43I}/ T128N/P129A/Q286R/M298Q/Q366N.

19. Polipeptídeo de FVII modificado, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 18 , caracterizado pelo fato de que aumenta a resistência à antitrombina-III, aumenta a ligação e/ou afinidade aos fosfolipídios, aumenta a afinidade para o fator tecidual, aumenta a atividade intrínseca, aumenta a atividade dependente de TF, aumenta a atividade coagulante, altera a conformação do polipeptídeo para alterar zimogenicidade, aumenta a atividade catalítica ou coagulante deslocando o equilíbrio entre as conformações altamente ativas e menos ativas de FVIIa em favor das conformações altamente ativas, aumenta a resistência às proteases, diminui a glicosilação, aumenta a glicosilação, reduz a imunogenicidade, aumenta a estabilidade e/ou facilita a ligação de grupo químico.

20. Polipeptídeo de FVII modificado, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 19, caracterizado pelo fato de que compreendende uma ou mais modificações adicionais de aminoácidos selecionadas dentre S279C/V302C, L280C/N301C, V281C/V302C, S282C/V299C, inserção de tirosina G97S, G97T, Y101N, D104N, T106N, K109N, E116D, G117N, V158G, V158S, V158T, V158C, V158Y, V158N, V158E, V158R, V158K, V158H, V158D, V158Q, A175S, A175T, G179N, I186S, I186T, V188N, R202S, R202T, I205S, I205T, D212N, E220N, I230N, P231N, P236N, G237N, Q250C, V253N, E265N, T267N, E270N, A274M, A274L, A274K, A274R, A274D, A274V, A274I, A274F, A274W, A274P, A274G, A274T, A274C, A274Y, A274N, A274E, A274H, A274S, A274Q, F275H, R277N, F278S, F278A. F278N, F278Q, F278G, L280N, L288K, L288C, L288D, D289C, D289K, L288E, R290C, R290G, R290A, R290S, R290T, R290K, R290D, R290E, G291E, G291D, G291C, G291N, G291K, A292C, A292K, A292D, A292E, T293K, E296V, E296L, E296I, E296M, E296F, E296W, E296P, E296G, E296S, E296T, E296C, E296Y, E296N, E296K, E296R, E296H, E296D, E296Q, M298V, M298L, M298I, M298F, M298W, M298P, M298G, M298S, M298T, M298C, M298Y, M298N, M298K, M298R, M298H, M298E, M298D, P303S, P303T, R304Y, R304F, R304L, R304M, R304G, R304T, R304A, R304S, R304N, L305V, L305Y, L305I, L305F, L305A, L305M, L305W, L305P, L305G, L305S, L305T, L305C, L305N, L305E, L305K, L305R, L305H, L305D, L305Q, M306D, M306N, D309S, D309T, Q312N, Q313K, Q313D, Q313E, S314A, S314V, S314I, S314M, S314F, S314W, S314P, S314G, S314L, S314T, S314C, S314Y, S314N, S314E, S314K, S314R, S314H, S314D, S314Q, R315K, R315G, R315A, R315S, R315T, R315Q, R315C, R315D, R315E, K316D, K316C, K316E, V317C, V317K, V317D, V317E, G318N, N322Y, N322G, N322F, N322M, N322S, N3221, N322L, N322T, N322V, N322P, N322K, N322H, N322Q, N322E, N322R, N322W, N322C, G331N, Y332S, Y332A, Y332N, Y332Q, Y332G, D334G, D334E, D334A, D334V, D334I, D334M, D334F, D334W, D334P, D334L, D334T, D334C, D334Y, D334N, D334K, D334R, D334H, D334S, D334Q, S336G, S336E, S336A, S336V, S336I, S336M, S336F, S336W, S336P, S336L, S336T, S336C, S336Y, S336N, S336K, S336R, S336H, S336D, S336Q, K337L, K337V, K337I, K337M, K337F, K337W, K337P, K337G, K337S, K337T, P406C, K32N/A34S, K32N/A34T, F31N/D33S, F31N/D33T, R315S, Q313N/ R315T, K316N/G318S, K316N/G318T, V317N/D319S, V317N/D319T, K341N/ D343S, K341N/ D343T, S339N/K341S, S339N/K341T, D343N/G345S, D343N/G345T, R392N/E394S, R392N/E394T, L390N/ R392S, L390N/ R392T, K389N/M391S, K389N/M391T, S393N/P395S, S393N/P395T, E394N/R396S, E394N/R396T, P395N/P397S, P395N/P397T, R396N/G398S, R396N/G398T, P397N/V399S, P397N/V399T, G398N/L,400S, G398N/L400T, V399N/L401S, V399N/L401T, L400N/R402S, L400N/R402T, L401N/A403S, L401N/A403T, R402N/P404S, R402N/P404T, A403N/F405S, A403N/F405T, P404N/P406S e P404N/P406T.

21. Polipeptídeo de FVII modificado, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende as modificações T128N/P129A/Q286R/M298Q.

22. Polipeptídeo de FVII modificado, de acordo com a reivindicação 21, caracterizado pelo fato de que a sequência de aminoácidos consiste na sequência estabelecida na SEQ ID NO: 280.

23. Polipeptídeo de FVII modificado, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 21, caracterizado pelo fato de que é um polieptídeo de cadeia simples ou um polipeptídeo de cadeia dupla.

24. Polipeptídeo de FVII modificiado, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 23, caracterizado pelo fato de ser para o uso no tratamento de uma doença ou condição que é tratada pela administração de FVII ou um pró-coagulante.

25. Polipeptídeo de FVII modificiado, de acordo com a reivindicação 24, caracterizado pelo fato de que a doença ou condição é tratada pela administração de um zimogênio ou forma ativa de FVII.

26. Polipeptídeo de FVII modificado, de acordo com a reivindicação 24 ou 25, caracterizado pelo fato de que a doença ou condição a ser tratada é selecionada dentre os distúrbios de coagulação do sangue, distúrbios hematológicos, distúrbios hemorrágicos, hemofilias, deficiência de fator VII, distúrbios de sangramento cirúrgico ou sangramento decorrente de trauma.

27. Polipeptídeo de FVII modificado, de acordo com a reivindicação 26, caracterizado pelo fato de que a doença ou condição é hemofilia e a hemofilia é hemofilia A ou hemofilia B ou hemofilia C.

28. Polipeptídeo de FVII modificado, de acordo com a reivindicação 22, caracterizado pelo fato de ser a forma ativada do polipeptídeo de cadeia dupla resultante da clivagem entre os aminoácidos Arg152 e Ile153, a primeira e a segunda cadeias consistindo respectivamente nos aminoácidos 1 a 152 e 153 a 406 da SEQ ID NO: 280 ligados entre si por meio de uma ligação dissulfeto.

29. Polipeptídeo de FVII modificado, de acordo com a reivindicação 28, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo de FVII é do tipo zimogênio.

30. Polipeptídeo de FVII modificado, de acordo com a reivindicação 28, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo de FVII é ativado.

31. Polipeptídeo de FVII modificado, de acordo com a reivindicação 28, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo de FVII inclui pelo menos uma modificação pós- tradução selecionada entre glicosilação do tipo O, glicosilação do tipo N, carboxilação de ácido glutâmico em ácido Y-carboxiglutâmico e hidroxilação de ácido aspártico em ácido e-hidroxiaspártico.

32. Composição farmacêutica caracterizada pelo fato de que compreende a forma ativada do polipeptídeo modificado de cadeia dupla, conforme definido na reivindicação 28, e um veículo farmaceuticamente aceitável.

33. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 32, caracterizada pelo fato de que é formulada para administração intravenosa, parenteral, intramuscular ou subcutânea.

34. Composição farmacêutica, de acordo com a reivindicação 32, caracterizada pelo fato de que é 5 liofilizada.

35. Polipeptídeo de FVII modificado, de acordo com qualquer uma das reivindicações 28 a 31, caracterizado pelo fato de ser na forma ativada de cadeia dupla e ser para o uso no tratamento de um paciente com Hemofilia A com inibidores ou Hemofilia B com inibidores.

36. Composição farmacêutica caracterizada pelo fato de que compreende uma concentração ou quantidade terapeuticamente eficaz de um polipeptídeo de FVII modificado, conforme defindo em qualquer uma das 15 reivindicações 1 a 31, em um veículo farmaceuticamente aceitável.