PT2281037E - Polipéptidos de fator vii que são modificados e seus usos - Google Patents
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Description
DESCRIÇÃO "Polipéptidos de fator VII que são modificados e seus usos"
CAMPO DA INVENÇÃO
Proporcionam-se proteínas terapêuticas modificadas. Em particular proporcionam-se polipéptidos de fator VII modificados, que incluem fator Vila e outras formas de fator VII e seus usos.
ANTECEDENTES A hemóstase é o processo fisiológico complexo que leva à terminação de sangramento. As plaquetas, proteínas plasmáticas e vasos sanguíneos e células endoteliais são os três componentes deste processo e cada um deles desempenha um papel importante nos eventos que se seguem imediatamente a uma lesão de tecido e que, em circunstâncias normais, resultam na formação rápida de um coágulo. É para tal essencial a cascata de coagulação, uma série de eventos proteolíticos nos quais determinadas proteínas plasmáticas (ou fatores de coagulação) são ativadas sequencialmente numa "cascata" através de outro fator de coagulação ativado previamente, levando à geração rápida de trombina. As elevadas quantidades de trombina produzidas nesta cascata funcionam então para clivar fibrinogénio formando péptidos de fibrina que são necessários para formação de coágulo.
Os fatores de coagulação circulam como zimogénios em cadeia única inativos que são ativados por clivagem numa ou mais posições para gerar uma forma da proteína ativada com duas cadeias. 0 fator VII (FVII), uma proteína plasmática dependente de vitamina K, circula inicialmente no sangue como um zimogénio. 0 zimogénio FVII é ativado por clivagem proteolítica num único local, Arg152-Ile153, resultando numa protease com duas cadeias ligada por uma única ligação dissulfureto (FVIIa). FVIIa liga-se ao seu cofator, fator tecidular (TF), para formar um complexo no qual FVIIa pode ativar eficazmente fator X (FX) a FXa, iniciando assim a série de eventos que resultam na formação de fibrina e hemóstase.
Embora na maioria dos casos se atinja hemóstase normal, a existência de defeitos no processo pode levar a doenças hemorrágicas nas quais o tempo para formação de coágulo é prolongado. Tais doenças podem ser congénitas ou adquiridas. Por exemplo, a hemofilia A e B são doenças hereditárias caracterizadas por deficiências em fator VIII (FVIII) e fator IX (FIX), respetivamente. A terapia de substituição é o tratamento tradicional para hemofilia A e B e envolve administração intravenosa de FVIII ou FIX, cada uma das quais preparada a partir de plasma humano ou como proteínas recombinantes. Em muitos casos, contudo, os doentes desenvolvem anticorpos (também denominados inibidores) contra as proteínas infundidas, o que reduz ou anula a eficácia do tratamento. FVIIa recombinante (Novoseven® (fator de coagulação Vila (recombinante))) foi aprovado para o tratamento de doentes de hemofilia A ou B que têm inibidores para FVIII ou FIX e também é usado para parar episódios de hemorragia ou evitar hemorragia associada a traumatismo e/ou cirurgia. FVIIa recombinante também foi aprovado para o tratamento de doentes com deficiência congénita de FVII e está a ser mais frequentemente utilizado em usos para os quais não foi indicado, tal como para o tratamento de hemorragia associada a outras doenças hemorrágicas congénitas ou adquiridas, traumatismo e cirurgia em doentes não hemofílicos. 0 uso de FVIIa recombinante para promover a formação de coágulo sublinha a sua importância crescente como um agente terapêutico. A terapia com FVIIa não responde a necessidades médicas significativas. Por exemplo, com base em dados de ensaios clínicos, é necessária uma média de 3 doses de FVIIa durante um período de 6 ou mais horas para controlar episódios hemorrágicos agudos em doentes de hemofilia. São necessárias variantes de FVIIa mais eficazes para reduzir estes requisitos. Assim, entre outros objetos aqui, constitui um objeto proporcionar polipéptidos de FVII modificados que são concebidos para apresentar propriedades terapêuticas melhoradas.
Bjelke et al. (A loop of coagulation factor Vila influencing macromolecular substrate specificity. FEBS LETTERS, 2007, vol. 581, n2 1. páginas 71-76) divulga um polipéptido de fator VII modificado, FVIIaFXLOOP, no qual a ansa Gly283-Met298 de FVII é substituída pela ansa correspondente de fator X (FX) de modo a introduzir uma lisina na posição correspondente a 298. A ansa introduz 12 substituições de aminoácidos. Bjelke et al. descrevem que o polipéptido quimérico FVIIa-FX contém mutações de reparação adicionais fora da ansa trocada nas posições 158, 176 e 341, respetivamente, para compensar as interações desfavoráveis, provocadas pela introdução de resíduos na ansa de FX. Bjelke et al. descrevem especificamente que a introdução da mutação Q286R como parte da ansa de FX é prejudicial e descrevem que a mutação na posição 341 foi introduzida para compensar a mutação prejudicial. O pedido de patente internacional W02007/031559, que também divulga polipéptidos de fator VII modificados, lista 40 posições que podem ser substituídas e indica que cada posição listada pode ser substituída por qualquer aminoácido. Assim, W02007/031559 proporciona milhares de possíveis modificações. O único polipéptido de FVII com uma substituição em 286 que é divulgado em W02007/031559 é um polipéptido com a substituição Q286A, que W02007/031559 descreve como não desejável. Dickinson et al. (Identification of surface residues mediating tissue factor binding and catalytic function of the serine protease factor Vila. PNAS, 1996, vol. 93. páginas 14379-14384) descreve um rastreio de alanina de polipéptido de fator VII; Q286A está entre os resíduos substituídos.
SUMÁRIO A presente invenção refere-se a um polipéptido de fator VII (FVII) modificado, compreendendo modificações num polipéptido de FVII, em que: as modificações são nas posições correspondentes à posição 286 e posição 298 num polipéptido de FVII com a sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO:3 ou nas posições correspondentes em locais alinhados num polipéptido de FVII; a modificação na posição 286 é uma substituição de aminoácido por uma arginina (Arg, R); a modificação na posição 298 é uma substituição de aminoácido por uma glutamina (Gin, Q); e o polipéptido de FVII modificado apresenta atividade coagulante aumentada comparativamente a um polipéptido de FVII não modificado que não tem as modificações nas posições 286 e 298 .
Proporcionam-se aqui polipéptidos de fator VII (FVII) modificados de acordo com as presentes reivindicações. Em particular, proporcionam-se aqui polipéptidos de FVII modificados que apresentam atividades pró-coagulantes. Os polipéptidos de FVII de acordo com as presentes reivindicações são modificados na sequência primária comparativamente a um polipéptido de FVII não modificado e podem incluir inserções, deleções e substituições de aminoácidos. Descrevem-se aqui adicionalmente polipéptidos de FVII modificados incluindo polipéptidos de FVII que apresentam os que têm resistência aumentada a inibidores, tal como antitrombina III (AT-III) e inibidor da via de fator tecidular (TFPI), os que têm resistência aumentada aos efeitos de inibição de Zn2+, os que têm atividade catalítica aumentada na presença e/ou ausência de TF, os que têm propriedades farmacocinéticas melhoradas, tal como semivida aumentada, os que têm ligação e/ou afinidade aumentada para a superfície de plaquetas, os que têm ligação e/ou afinidade aumentada para albumina de soro e os que têm ligação e/ou afinidade aumentada para integrina nb 3 de plaquetas. Os polipéptidos de FVII modificados podem conter qualquer combinação de modificações aqui descritas, em que uma ou mais atividades ou propriedades do polipéptido são alteradas comparativamente a um polipéptido de FVII não modificado. Tipicamente, o polipéptido de FVII modificado mantém atividade pró-coagulante. Também se proporcionam aqui moléculas de ácido nucleico, vetores e células que codificam/expressam polipéptidos de FVII modificados de acordo com as presentes reivindicações. Também se proporcionam aqui composições farmacêuticas e polipéptidos de VII modificados de acordo com as reivindicações para uso em métodos de tratamento. Os polipéptidos de FVII incluem variantes alélicas e de espécie e polipéptidos e outras variantes que têm modificações que afetam outras atividades e/ou propriedades. Também se descrevem fragmentos ativos dos polipéptidos de FVII que incluem uma modificação aqui proporcionada. Os exemplos de polipéptidos de FVII são os que incluem as sequências de aminoácidos apresentadas em SEQ ID NO: 3, bem como as suas variantes com 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 88%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais de identidade de sequência com esta.
Proporcionam-se aqui polipéptidos modificados de fator VII (FVII) que contêm uma modificação num polipéptido de FVII na posição Q286 num polipéptido de FVII com uma sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 3 ou em resíduos correspondentes num polipéptido de FVII. A modificação é uma substituição de aminoácido, Arg (R), Q286R. Tal modificação pode ser efetuada num polipéptido de FVII não modificado contendo uma sequência apresentada em qualquer de SEQ ID NOS: 1-3 ou uma variante com pelo menos 60% de identidade de sequência com o FVII de qualquer de SEQ ID NOS: 1-3.
Os polipéptidos de FVII modificados aqui proporcionados contêm uma substituição de aminoácido numa posição correspondente à posição 286 num polipéptido de FVII com a sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 3 ou num resíduo correspondente num polipéptido de FVII, em que a modificação é substituição da posição 286 pelo aminoácido básico Arg (R) que resulta num polipéptido de FVII modificado que apresenta atividade coagulante aumentada comparativamente ao polipéptido de FVII que não contém a modificação na posição 286. Por exemplo, um polipéptido de FVII modificado aqui proporcionado pode conter uma substituição de Gin (Q) por Arg (R) na posição 286.
Em alguns exemplos, os polipéptidos de FVII modificados também contêm uma ou mais modificações adicionais noutra posição do polipéptido de FVII. A modificação adicional pode ser uma substituição, inserção ou deleção de aminoácido. Por exemplo, a modificação adicional pode ser uma substituição de aminoácido numa posição correspondente a uma posição selecionada entre A51, S52, P54, S60, Q66, Y68, K109, S119, A122, G124, T130, E132, V158, K161, A175, D196, K197, K199, R202, H216, S222, G237, T239, H257, L287, R290 A292, A294, E296, L305, S314, G318, P321, K337, K341, Q366, H373, F374, E394, P395 e R396. Os exemplos de tais modificações incluem D196K, D196R, D196A, D196Y, D196F, D196W, D196L, D196I, K197Y, K197A, K197E, K197D, K197L, K197M, K197I, K197V, K197F, K197W, K199A, K199D, K199E, G237W, G237T, G237I, G237V, T239A, R290A, R290E, R290D, R290N, R290Q, R290K, R290M, R290V, K341E, K341R, K341Q, K341N, K341M, K341D, G237T238insA, G237T238insS, G237T238insV, G237T238insAS, G237T238insSA, Dl 96K197insK, Dl 9 6K197insR, Dl 96K197insY, Dl96K197insW, Dl 96K197insA, Dl 9 6K197insM, K197I198insE, K197I198insY, K197I198insA, Kl 97119 8 insS, T239S, T239N, T239Q, T239V, T239L, T239H, T239I, L287T, P321K, P321E, P321Y, P321S, Q366D, Q366E, Q366N, Q366T, Q366S, Q366V, Q366I, Q366L, Q366M, H373D, H373E, H373S, H373L, H373I, H373F, H373A, K161S, K161A, K161V, H216S, H216A, H216K, H216R, S222A, S222K, S222V, S222N, S222E, S222D, H257A, H257S, Gla Swap FIX, {Gla Swap FIX/E40L}, {Gla Swap FIX/K43I}, {Gla Swap FIX/Q44S}, {Gla Swap FIX/M19K}, {Gla Swap FIX/M19K/E40L/K431/Q44S}, Gla Swap FX , Gla Swap Prot C, Gla Swap Prot S, Gla Swap Trombina, S52A, S60A, E394N, P395A, R396S, R202S, A292N, A294S, G318N, A175S, K109N, A122N, G124S, A51N, T130N, E132S, S52N, P54S, S119N, L121S, T128N, P129A, Q66N, Y68S, S103SllldelinsQRLMEDICLPRWGCLWEDDF, Hl15S12 6delinsQRLMEDICLPRWGCLWEDDF, T12 8P134delinsQRLMEDICLPRWGCLWEDDF, S103SllldelinsIEDICLPRWGCLWE, H 115S 126delinsIEDICLPRWGCLWE, T128P134delinsIEDICLPRWGCLWE, S103SllldelinsDICLPRWGCLWED, Hl15S12 6delinsDICLPRWGCLWED, T12 8P134delinsDICLPRWGCLWED, P4 0 6insIEDICLPRWGCLW, P406insGGGSIEDICLPRWGCLW, P4 0 6insDICLPRWGCLWED, P406insGGSDICLPRWGCLWED, S103S111de1i n s S F GRGDIRNV, Hl15S126delinsSFGRGDIRNV, T127P134 de1i n s S F GRGDIRNV, P406insCSFGRGDIRNVC, P4 0 6insGGGSCSFGRGDIRNVC, V158T, V158D, L287T e E296V.
Os exemplos dos polipéptidos de FVII modificados aqui proporcionados são os que contêm modificações Q286R/M298Q, Q2 8 6R/Gla Swap FIX, Q286R/H257A, Q286R/S222A, Q286R/S222A/H257A, Q286R/S222A/Gla Swap FIX, Q286R/H257A/Gla Swap FIX, Q286R/S222A/H257A/Gla Swap FIX, Q286R/M298Q/K341Q, Q2 8 6R/M2 98Q/K199E, Q286R/M298Q/Gla Swap FIX, Q286R/Q366V, Q286R/A292N/A294S/Q366V, A175S/Q286R/Q366V, S222A/Q286R/Q366V, H257S/Q286R, H257S/Q286R/Q366V, S222A/H257A/Q286R/Q366V, Q286R/H373A, S222A/H257A/Q286R/M158Q, Q286R/K341D, Q286R/Q366D, Q286R/Q366N, Q286R/M298Q/Q366D, Q2 8 6R/M2 98Q/Q36 6N, Q286R/H373F, Q286R/M298Q/H373F, {Gla Swap FIX/E40L}/Q286R/M298Q, {Gla Swap FIX/K431}/Q286R/M298Q, {Gla Swap FIX/Q44S}/Q286R/M298Q, {Gla Swap FIX/M19K}/Q286R1M298Q, {Gla Swap FIX/M19K/E40L/K43I/Q44S} /Q286R/M298Q, T128N/P129A/Q286R, T128N/P129A/Q286R/M298Q, T128N/P129A/Q286R/H373F, VI58D/Q286R/E296V/M298Q, Gla Swap FIX/T128N/P129A/S222A/Q286R, Gla Swap FIX/T128N/P12 9A/Q28 6R/M2 98Q, T128N/P129A/S222A/H257A/Q286R/M298Q, T128N/P12 9A/Q28 6R/M2 98Q/H373F, S52A/S60A/Q286R, Gla Swap FIX/S52A/S60A/S222A/Q286R, S52A/S60A/Q286R/M298Q, Gla Swap FIX/S52A/S60A/Q28 6R/M2 98Q, S52A1S6OA/S222A/H257A/Q286R/M298Q, S52A/S60A/Q286R/H373F/, S52A/S60A/Q286R/M298Q/H373F, T239V/Q286R, Gla Swap FIX/S222A/T239V/Q286R, T23 9V/Q28 6R/M2 98Q, S222A/T239V/H257A/Q286R/M298Q, Gla Swap FIX/T239V/Q286R/M298Q, T239V/Q286R/H373F, T23 9V/Q28 6R/M2 98Q/H373F, T239I/Q286R, Gla Swap FIX/S222A/T239I/Q286R, T239I/Q286R/M298Q, S222A/T239I/H257A/Q286R/M298Q, Gla Swap FIX/T239I/Q286R/M298Q, T239I/Q286R/H373F, T239I/Q28 6R/M2 98Q/H373F, Gla Swap FIX/S222A/Q286R/H373F, Gla Swap FIX/S222A/Q286R/M298Q, Gla Swap FIX/S222A/Q28 6R/M2 98Q/H373F, V158D/Q286R/E296V/M298Q/H373F, H257A/Q286R/M298Q, H257S/Q28 6R/M2 9 8Q, Gla Swap FIX/S222A/H257S/Q286R/, S222A/H257S/Q286R/M298Q, H257S/Q286R/M298Q/H373F, S222A/Q28 6R/M2 98Q/H373F, S222A/Q286R/M298Q, T128N/P129A/A175S/Q286R, A122N/G124S/A175S/Q286R, Gla Swap
FIX/T128N/P129A/A175S/S222A/Q286R, Gla Swap FIX/A 122N/G124S/A175S/S222A/Q286R, T128N/P129A/A175S/Q286R/M298Q, A122N/G124S/A175S/Q28 6R/M298Q, T128N/P129A/A175S/S222A/H257A/Q286R/M298Q, A122N/G124S/A175S/S222A/H257A/Q286R/M298Q, T128N/P12 9A/A175S/Q28 6R/M298Q/H373F,
A122N/G124S/A175S/Q28 6R/M2 98Q/H373F, {Gla Swap FIX /K431}/T28N/P12 9A/Q28 6R/M298Q, T128N/P129A/Q286R/M298Q/Q366N, {Gla Swap FIX /K43I}/Q286R/M298Q/Q366N, {Gla Swap FIX /K43I}/ T128N/P129A/Q286R/M298Q/Q366N, V158D/Q286R/E296V/M298Q, T128N/P12 9A/Q28 6R/M2 98Q/Q36 6N/H373F, T239V/Q286R/M298Q/Q366N, T239I/Q28 6R/M2 98Q/Q36 6N, T128N/P129A/T239V/Q286R/M298Q, T128N/P129A/S222A/T239V/H257A/Q286R/M298Q, T128N/P12 9A/T23 9V/Q28 6R/M298Q/H373F, T128N/P129A/T239I/Q286R/M298Q ou T128N/P12 9A/T239I/Q28 6R/M298Q/H373F.
Proporcionam-se aqui polipéptidos de FVII modificados de acordo com as presentes reivindicações contendo duas ou mais modificações num polipéptido de FVII. Pelo menos uma das modificações em tais polipéptidos é numa posição correspondente à posição Q286 num polipéptido de FVII com uma sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO:3, ou em resíduos correspondentes num polipéptido de FVII, desde que a modificação na posição Q286, sozinha ou em combinação com qualquer outra modificação, não resulte na introdução de um novo local de qlicosilação comparativamente ao polipéptido de FVII não modificado. A modificação é Q286R. As outras modificações podem ser selecionadas entre D196K, D196R, D196A, D196Y, D 196F, D196W, D196L, D196I, K197Y, K197A, K197E, K197D, K197L, K197M, K197I, K197V, K197F, K197W, K199A, K199D, K199E, G237W, G237T, G237I, G237V, T239A, R290A, R290E, R290D, R290N, R290Q, R290K, R290M, R290V, K341E, K341R, K341Q, K341N, K341M, K341D, G237T238insA, G237T238insS, G237T238insV, G237T238insAS, G237T238insSA, Dl96K197insK, Dl 96K197insR,
Dl 9 6K197insY, Dl 96K197insW, Dl96K197insA, Dl 96K197insM,
Kl 971198insE, Kl 971198insY, Kl 971198insA, Kl 971198insS, T239S, T239N, T239Q, T239V, T239L, T239H, T239I, L287T, P321K, P321E, P321Y, P321S, Q366D, Q366E, Q366N, Q366T, Q366S, Q366V, Q366I, Q366L, Q366M, H373D, H373E, H373S, H373F, H373A, K161S, K161A,
Kl 6IV, H216S, H216A, H216K, H216R, S222A, S222K, S222V, S222N, S222E, S222D, H257A, H257S, Gla Swap FIX, {Gla Swap FIX/E40L}, {permuta por Gla de FIX/K43I}, {Gla Swap FIX/Q44S}, {Gla Swap FLX/M19K}, {Gla Swap FIX/M19K/E40L/K43I/Q44S}, Gla Swap FX , Gla Swap Prot C, Gla Swap Prot S, Gla Swap Trombina, S52A, S60A, E394N, P395A, R396S, R202S, A292N, A294S, G318N, A175S, K109N, A122N, G124S, A51N, T130N, E132S, S52N, P54S, S119N, L121S, T128N, P129A, Q66N, Y68S, S103SllldelinsQRLMEDICLPRWGCLWEDDF,
Hl15S12 6delinsQRLMEDICLPRWGCLWEDDF, T12 8P134delinsQRLMEDICLPRWGCLWEDDF, S103SllldelinsIEDICLPRWGCLWE, Hl15S126delinsIEDICLPRWGCLWE, T128P134delinsIEDICLPRWGCLWE, S103SllldelinsDICLPRWGCLWED,
Hl15S12 6delinsDICLPRWGCLWED, T12 8P134delinsDICLPRWGCLWED, P4 0 6insIEDICLPRWGCLW, P406insGGGSIEDICLPRWGCLW, P4 0 6insDICLPRWGCLWED, P4 0 6insGGGSDICLPRWGCLWED, S103S111de1i n s S F GRGDIRNV, Hl15S126delinsSFGRGDIRNV, T127P134de1insSFGRGDIRNV, P4 0 6insCSFGRGDIRNVC, P4 0 6insGGGSCSFGRGDIRNVC, V158T, V158D, L287T e E296V.
Em alguns exemplos aqui descritos, os polipéptidos de FVII modificados contêm uma modificação numa posição correspondente a P54, Q66, L121, A122, P129 ou E132 num polipéptido de FVII com uma sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 3, ou em resíduos correspondentes num polipéptido de FVII. Os exemplos de modificações incluem P54S, Q66N, L121S, A122N, P129A e E132S. Em alguns exemplos, os polipéptidos de FVII modificados contendo uma modificação numa posição correspondente a P54, Q66, L121, A122, P129 ou E132 também contêm uma ou mais modificações adicionais, incluindo substituições, inserções ou deleções de aminoácidos noutra posição no polipéptido de FVII. Tais modificações incluem P54S, S52N, Y58S, S119N, G124S, T128N, T130N, V158D, A175S, S222A, G241S, E296V, M298Q, E394N, P395A, R396S, G318N e Q366V. Assim, os exemplos da combinação de modificações num polipéptido de FVII aqui descrito são S119N/L121S, T128N/P129A, A122N/G124S, A122N/G124S/A175S, A122N/G1245/E394N/P395A/R396S, A122N/G124S/E394N/P395A/R396S/G318N, A122N/G124S/E394N/P395A/R396S, S52N/P54S/A122N/G124S/E394N/P395A/R396S, S52N/P54S, S119N/L121S/A175S, T128N/P129A/A175S, T130N/E132S, Q66N/Y68S, T128N/P129A/V158D/E296V/M298Q, T128N/P129A/S222A, T128N/P129A/A175S/Q366V, A122N/G124S/A175S/Q366V, T128N/P129A/A175S/S222A, A122N/G124S/A175S/S222A, T128N/P12 9A/M2 98Q e T128N/P129A/M298Q/H373F.
Também se descrevem aqui polipéptidos de FVII modificados contendo uma modificação correspondente a T239S, T239Q, T239V, T239L, T239H, T239I, P321K, P321E, P321Y, P321S, Q366D, Q366N, Q366V, Q366I, Q366L, Q366M, H373D, H373E, H373S, H373F, H373A,
Kl 61S, Kl 6IV, H216S, H216K, H216R, S222A, S222K, S222V, S222D, S222N, S222E ou H257S num polipéptido de FVII com uma sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO:3, ou em resíduos correspondentes num polipéptido de FVII. Adicionalmente, tais polipéptidos de FVII modificados podem também conter uma ou mais modificações adicionais noutra posição, tais como as posições de aminoácidos A51, S52, P54, S60, Q66, Y68, K109, S119, A122, G124, T130, E132, V158, K161, AI7 5, Dl 9 6, K197, K199, R202, H216, S222, G237, T239, H257, Q286, L287, R290 A292, A294, E296, M298, L305, S314, G318, P321, K337, K341, Q366, H373, F374, E394, P395 e R396. Os exemplos de modificações nestas posições incluem Q286N, Q286E, Q286D, Q286S, Q286T, Q286R, Q286K, Q286A, Q286V, Q286M, Q286L, Q286Y, D196K, D196R, D196A, D196Y, D196F, D196W, D196L, D196I, K197Y, K197A, K197E, K197D, K197L, K197M, K197I, K197V, K197F, K197W, K199A, K199D, K199E, G237W, G237T, G237I, G237V, T239A, R290A, R290E, R290D, R290N, R290Q, R290K, R290M, R290V, K341E, K341R, K341Q, K341N, K341M, K341D, G237T238insA, G237T238insS, G237T238insV, G237T238insAS, G237T238insSA, D196K197insK, Dl 9 6K197insR, Dl 96K197insY, Dl96K197insW, Dl 96K197insA, Dl 9 6K197insM, Kl 971198insE, Kl 971198insY, Kl 971198insA, Kl 97119 8 insS, T239S, T239N, T239Q, T239V, T239L, T239H, T239I, L287T, P321K, P321E, P321Y, P321S, Q366D, Q366E, Q366N, Q366T, Q366S, Q366V, Q366I, Q366L, Q366M, H373D, H373E, H373S, H373F, H373A, Kl 61S, K161A, K161V, H216S, H216A, H216K, H216R, S222A, S222K, S222V, S222N, S222E, S222D, H257A, H257S, Gla Swap FIX, Gla swap FX , Gla Swap Prot C, Gla Swap Prot S, Gla swap Trombina, Gla Swap FIX , {Gla Swap FIX/E40L}, {Gla Swap FIX/K43I}, {Gla Swap FIX/Q44S}, {Gla Swap FIX/M19K}, {Gla Swap FIX/M19K/E40L/K43I/Q44S}, S52A, S60A, E394N, P395A, R396S, R202S, A292N, A294S, G318N, A175S, K109N, A122N, G124S, A51N, T130N, E132S, S52N, P54S, S119N, L121S, T128N, P129A, Q66N, Y68S, S10 3S11IdelinsQRLMEDICLPRWGCLWEDDF, Hl15S12 6delinsQRLMEDICLPRWGCLWEDDF, T12 8P134delinsQRLMEDICLPRWGCLWEDDF, S103SllldelinsIEDICLPRWGCLWE, Hl15S126delinsIEDICLPRWGCLWE, T128P134delinsIEDICLPRWGCLWE, S103SllldelinsDICLPRWGCLWED, Hl15S12 6delinsDICLPRWGCLWED, T12 8P134delinsDICLPRWGCLWED, P4 0 6insIEDICLPRWGCLW, P406insGGGSIEDICLPRWGCLW, P4 0 6insDICLPRWGCLWED, P4 0 6insGGGSDICLPRWGCLWED, S103S111de1i n s S F GRGDIRNV, Hl15S126delinsSFGRGDIRNV, T127P134 de1i n s S F GRGDIRNV, P406insCSFGRGDIRNVC, P4 0 6insGGGSCSFGRGDIRNVC, V158T, V158D, L287T, M298K e M298Q. A combinação de modificações resultante pode incluir Q366D/H373E, Q366V/H373V, Q366V/H373L, Q366V/H373I, S222K/H257A, H216A/S222A, S222S/Gla Swap FIX, S222A/H257A/Gla Swap FIX, S222A/M298Q, S222A/H257A/M298Q, S222A/A2 92N/A2 94S/Q36 6V, A175S/S222A/Q366V, S222A/Q366V, H257S/Q366V, S222A/H373A, M298Q/H373F, S52A/S60A/S222A, S222A/T239V, VI58D/T239V/E296V/M298Q, S222A/T239I, V158D/E29 6V/M2 98Q/H373F, Gla Swap FIX/Q366V, M298Q/Q366N/H373F, T239V/M298Q/H373F e T2391/M298Q/H373F.
Descrevem-se aqui polipéptidos de FVII modificados contendo duas ou mais modificações num polipéptido de FVII, suas variantes alélicas e de espécie ou seus fragmentos ativos, em que se selecionam duas ou mais modificações de aminoácidos dentro das modificações de aminoácidos correspondentes a H216A, H257A, E394N, P395A, R396S, K109N, A292N, A175S, H257A e permuta por Gla de FIX. Por exemplo, os polipéptidos de FVII modificados aqui descritos incluem os com modificações selecionadas entre H216A/H257A, E394N/P395A/R396S e K109N/A175S. Adicionalmente, também pode ser incluída uma modificação correspondente a M298Q ou A294S. Assim, também são aqui descritos polipéptidos de FVII modificados contendo modificações selecionadas entre H216A/H257A, E394N/P395A/R396S e K109N1A175S. Em alguns exemplos, os polipéptidos de FVII modificados também contêm uma modificação correspondente a M298Q ou A294S. Tal pode resultar, por exemplo, num polipéptido de FVII modificado contendo as modificações H257A/M298Q ou Kl09N/A292N/A294S. Também se descrevem polipéptidos de FVII modificados contendo modificações correspondentes a S52A/S60A/V158D/E296V/M298Q ou V158D/T239I/E29 6V/M2 9 8.
Em alguns exemplos, os polipéptidos de FVII modificados aqui descritos contêm uma sequência de ligação de albumina de soro, tal como uma sequência de aminoácidos apresentada em qualquer de SEQ ID NOS: 103-109 ou uma sua parte suficiente para efetuar ligação a albumina de soro. Tais polipéptidos de FVII modificados podem apresentar afinidade ou ligação aumentadas para ligação a albumina de soro comparativamente ao polipéptido de FVII não modificado. Por exemplo, os polipéptidos de FVII modificados contendo uma sequência de ligação de albumina de soro podem apresentar pelo menos cerca de 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100%, 200%, 300%, 400%, 500% ou mais de afinidade ou ligação aumentada para ligação a albumina de soro. A sequência de ligação a albumina de soro pode substituir os resíduos de uma sequência de aminoácidos contígua do polipéptido de FVII não modificado. Os polipéptidos de FVII modificados contendo uma sequência de ligação a albumina de soro podem conter uma modificação selecionada entre S103SllldelinsQRLMEDICLPRWGCLWEDDF,
Hl15S12 6delinsQRLMEDICLPRWGCLWEDDF, T12 8P134delinsQRLMEDICLPRWGCLWEDDF, S1035111delinsIEDICLPRWGCLWE, Hl15S126delinsIEDICLPRWGCLWE, T128P134delinsIEDICLPRWGCLWE, S103SllldelinsDICLPRWGCLWED,
Hl15S12 6delinsDICLPRWGCLWED, T12 8P134delinsDICLPRWGCLWED, P4 0 6insIEDICLPRWGCLW, P406insGGGSIEDICLPRWGCLW,
P4 0 6insDICLPRWGCLWED e P4 0 6insGGGSDICLPRWGCLWED
Também aqui se descrevem polipéptidos de FVII modificados contendo uma sequência de ligação a integrina nb 3 de plaquetas. Tais polipéptidos de FVII modificados podem apresentar afinidade ou ligação aumentada para ligação a integrina nb 3 de plaquetas comparativamente ao polipéptido de FVII não modificado. Por exemplo, os polipéptidos de FVII modificados contendo uma sequência de ligação a integrina iib 3 de plaquetas podem apresentar pelo menos cerca de 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100%, 200%, 300%, 400%, 500% ou mais de aumento de afinidade ou de ligação para ligação a integrina nb 3 de plaquetas comparativamente ao polipéptido de FVII não modificado. Os exemplos de sequências de ligação a albumina de soro incluem as sequência de aminoácidos apresentadas em qualquer de SEQ ID NOS: 110-112 ou uma sua parte suficiente para efetuar ligação a integrina nb 3 de plaquetas, que pode substituir resíduos de sequências de aminoácidos contíguos do polipéptido de FVII não modificado. Os polipéptidos de FVII modificados contêm uma modificação selecionada entre S103SllldelinsSFGRGDIRNV, Hl15S12 6delinsSFGRGDIRNV, T12 7P134delinsSFGRGDIRNV, P4 0 6insCSFGRGDIRNVC e P4 0 6insGGGSCSFGRGDIRNVC.
Os polipéptidos de FVII modificados contendo uma sequência de ligação a albumina de soro ou a integrina nb 3 de plaquetas podem também conter uma ou mais modificações adicionais noutra posição no polipéptido de FVII, tal como uma substituição de aminoácido numa posição correspondente à posição G237V. Assim também aqui se descrevem polipéptidos de FVII modificados contendo uma modificação selecionada entre S1035111delinsIEDICLPRWGCLWE/G237V, S103SllldelinsDICLPRWGCLWED/G237V,
Hl15S12 6delinsQRLMEDICLPRWGCLWEDDF/G237V,
Hl15S12 6delinsIEDICLPRWGCLWE/G237V,
Hl15S12 6delinsDICLPRWGCLWED/G237V, T128P134delinsQRLMEDICLPRWGCLWEDDF/G237V, T128P134delinsIEDICLPRWGCLWE/G237V, S103SllldelinsQRLMEDICLPRWGCLWEDDF/G237V e
T12 8P134delinsDICLPRWGCLWED/G2 37V
Em alguns exemplos, os polipéptidos de FVII modificados aqui proporcionados contêm 2, 3, 4, 5, 6, 7 ou mais modificações. Em exemplos adicionais, os polipéptidos de FVII modificados aqui proporcionados contêm um domínio Gla heterólogo ou uma sua parte suficiente para efetuar ligação a fosfolípidos. Tais polipéptidos podem apresentar afinidade ou ligação aumentada para ligação a fosfolípidos comparativamente ao polipéptido de FVII não modificado, tal como pelo menos cerca de 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100%, 200%, 300%, 400%, 500% ou mais de afinidade ou ligação aumentada para ligação a fosfolípidos. O domínio Gla heterólogo pode ser selecionado entre um domínio Gla de Fator IX (FIX), Fator X (FX), protrombina, proteína C, proteína S, osteocalcina, proteína Gla de matriz, proteína 6 específica de paragem de crescimento (Gas6) e proteína Z e, em alguns exemplos, pode ter uma sequência de aminoácidos apresentada em qualquer de SEQ ID NOS: 83-91, 93 e 94 ou uma sua parte suficiente para efetuar ligação a fosfolípidos. Pode remover-se todo o domínio Gla nativo de FVII ou uma sua parte contígua, que pode incluir os aminoácidos 1-45 num polipéptido de FVII com uma sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO:3 ou em resíduos correspondentes num polipéptido de FVII e substituir-se por um domínio Gla heterólogo ou uma sua parte suficiente para efetuar ligação a fosfolípidos.
Os polipéptidos de FVII modificados aqui proporcionados podem apresentar resistência aumentada a antitrombina III comparativamente ao polipéptido de FVII não modificado. Tal polipéptido de FVII modificado pode apresentar pelo menos ou cerca de 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100%, 200%, 300%, 400%, 500% ou mais de resistência a antitrombina III comparativamente ao polipéptido de FVII não modificado. Os polipéptidos de FVII modificados aqui proporcionados também apresentam atividade catalítica ou coagulante aumentadas comparativamente ao polipéptido de FVII não modificado, tal como um aumento de pelo menos cerca de 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100%, 200%, 300%, 400%, 500% ou mais comparativamente a um polipéptido de FVII não modificado. Adicionalmente, os polipéptidos de FVII modificados aqui proporcionados podem apresentar resistência aumentada a TFPI comparativamente ao polipéptido de FVII não modificado. Tais polipéptidos de FVII modificados podem ser pelo menos ou cerca de 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100%, 200%, 300%, 400%, 500% ou mais resistentes a TFPI comparativamente a um polipéptido de FVII não modificado. Os polipéptidos de FVII modificados aqui proporcionados podem também apresentar resistência aumentada aos efeitos de inibição de Zn2+ comparativamente ao polipéptido de FVII não modificado. Por exemplo, um polipéptido de FVII modificado pode ser pelo menos ou cerca de 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100%, 200%, 300%, 400%, 500% ou mais resistente aos efeitos de inibição de Zn2+ comparativamente a um polipéptido de FVII não modificado.
Em alguns exemplos, os polipéptidos de FVII modificados aqui proporcionados contêm uma ou mais modificações que introduzem e/ou eliminam um ou mais locais de glicosilação comparativamente ao polipéptido de FVII não modificado. Por exemplo, podem introduzir-se ou eliminar-se 1, 2, 3, 4, 5, 6, ou mais locais de glicosilação. Os locais de glicosilação que podem ser introduzidos ou eliminados incluem locais de glicosilação em N e locais de glicosilação em O. Os polipéptidos de FVII modificados aqui proporcionados podem conter uma ou mais modificações de aminoácidos adicionais que aumentam a resistência a antitrombina-111, aumentam a ligação e/ou afinidade a fosfolípidos, aumentam a afinidade para fator tecidular, aumentam a atividade intrínseca, aumentam a atividade dependente de TF, aumentam a atividade coagulante, alteram a conformação do polipéptido para alterar zimogenicidade, aumentam a atividade catalítica ou coagulante por deslocamento do equilíbrio entre conformações de FVIIa altamente ativas e menos ativas em favor de conformações altamente ativas, aumentam a resistência a proteases, diminuem a glicosilação, aumentam a glicosilação, reduzem imunogenicidade, aumentam a estabilidade e/ou facilitam a ligação de um grupo químico. Em alguns exemplos, a zimogenicidade alterada confere uma forma mais do tipo zimogénio ou uma forma menos do tipo zimogénio.
Em alguns exemplos, os polipéptidos de FVII modificados aqui proporcionados contêm uma ou mais modificações adicionais de aminoácidos selecionadas entre S279C/V302C, L280C/N301C, V281C/V302C, S282C/V299C, inserção de uma tirosina na posição 4, F4S, F4T, P10Q, P10E, P10D, P10N, Q21N, R28F, R28E, 130C, I30D, I30E, K32D, K32Q, K32E, K32G, K32H, K32T, K32C, K32A, K32S, D33C, D33F, D33E, D33K, A34C, A34E, A34D, A341, A34L, A34M, A34V, A34F, A34W, A34Y, R36D, R36E, T37C, T37D, T37E, K38C, K38E, K38T, K38D, K38L, K38G, K38A, K38S, K38N, K38H, L39E, L39Q, L39H, W41N, W41C, W41E, W41D, I42R, I42N, I42S, I42A, I42Q, I42N, I42S, I42A, I42Q, I42K, S43Q, S43N, Y44K, Y44C, Y44D, Y44E, S45C, S45D, S45E, D46C, A51N, S53N, G58N, G59S, G59T, K62E, K62R, K62D, K62N, K62Q, K62T, L65Q, L65S, L65N, F71D, F71Y, F71E, F71Q, F71N, P74S, P74A, A75E, A75D, E77A, E82Q, E82N, E82S, E82T T83K, N95S, N95T, G97S, G97T, Y101N, D104N, T106N, K109N, E116D, G117N, G124N, S126N, T128N, LI 41C, L141D, L141E, E142D, E142C, K143C, K143D, K143E, R144E, R144C, R144D, N145Y, N145G, N145F, N145M, N145S, N145I, N145L, N145T, N145V, N145P, N145K, N145H, N145Q, N145E, N145R, N145W, N145D, N145C, K157V, K157L, K157I, K157M, K157F, K157W, K157P, K157G, K157S, K157T, K157C, K157Y, K157N, K157E, K157R, K157H, K157D, K157Q, V158L, V158I, V158M, V158F, V158W, V158P, V158G, VI5 8 S, V158T, V158C, V158Y, V158N, V158E, V158R, V158K, V158H, V158D, V158Q, A175S, A175T, G179N, I186S, I186T, V188N, R202S, R202T, I205S, I205T, D212N, E220N, I230N, P231N, P236N, G237N, Q250C, V253N, E265N, T267N, E270N, A274M, A274L, A274K, A274R, A274D, A274V, A274I, A274F, A274W, A274P, A274G, A274T, A274C, A274Y, A274N, A274E, A274H, A274S, A274Q, F275H, R277N, F278S, F278A. F278N, F278Q, F278G, L280N, L288K, L288C, L288D, D289C, D289K, L288E, R290C, R290G, R290A, R290S, R290T, R290K, R290D, R290E, G291E, G291D, G291C, G291N, G291K, A292C, A292K, A292D, A292E, T293K, E296V, E296L, E296I, E296M, E296F, E296W, E296P, E296G, E296S, E296T, E296C, E296Y, E296N, E296K, E296R, E296H, E296D, E296Q, M298Q, M298V, M298L, M298I, M298F, M298W, M298P, M298G, M298S, M298T, M298C, M298Y, M298N, M298K, M298R, M298H, M298E, M298D, P303S, P303T, R304Y, R304F, R304L, R304M, R304G, R304T, R304A, R304S, R304N, L305V, L305Y, L305I, L305F, L305A, L305M, L305W, L305P, L305G, L305S, L305T, L305C, L305N, L305E, L305K, L305R, L305H, L305D, L305Q, M306D, M306N, D309S, D309T, Q312N, Q313K, Q313D, Q313E, S314A, S314V, S3141, S314M, S314F, S314W, S314P, S314G, S314L, S314T, S314C, S314Y, S314N, S314E, S314K, S314R, S314H, S314D, S314Q, R315K, R315G, R315A, R315S, R315T, R315Q, R315C, R315D, R315E, K316D, K316C, K316E, V317C, V317K, V317D, V317E, G318N, N322Y, N322G, N322F, N322M, N322S, N322I, N322L, N322T, N322V, N322P, N322K, N322H, N322Q, N322E, N322R, N322W, N322C, G331N, Y332S, Y332A, Y332N, Y332Q, Y332G, D334G, D334E, D334A, D334V, D334I, D334M, D334F, D334W, D334P, D334L, D334T, D334C, D334Y, D334N, D334K, D334R, D334H, D334S, D334Q, S336G, S336E, S336A, S336V, S336I, S336M, S336F, S336W, S336P, S336L, S336T, S336C, S336Y, S336N, S336K, S336R, S336H, S336D, S336Q, K337L, K337V, K337I, K337M, K337F, K337W, K337P, K337G, K337S, K337T, K337C, K337Y, K337N, K337E, K337R, K337H, K337D, K337Q, K341E, K341Q, K341G, K341T, K341A, K341S, G342N, H348N, R353N, Y357N, I361N, F374P, F374A, F374V, F374I, F374L, F374M, F374W, F374G, F374S, F374T, F374C, F374Y, F374N, F374E, F374K, F374R, F374H, F374D, F374Q, V376N, R379N, L390C, L390K, L390D, L390E, M391D, M391C, M391K, M391N, M391E, R392C, R392D, R392E, S393D, S393C, S393K, S393E, E394K, P395K, E394C, P395D, P395C, P395E, R396K, R396C, R396D, R396E, P397D, P397K, P397C, P397E, G398K, G398C, G398D, G398E, V399C, V399D, V399K, V399E, L400K, L401K, L401C, L401D, L401E, R402D, R402C, R402K, R402E, A403K, A403C, A403D, A403E, P404E, P404D, P404C, P404K, F405K, P406C, K32N/A34S, K32N/A34T, F31N/D33S, F31N/D33T, I30N/K32S, I30N/K32T, A34N/R36S, A34N/R36T, K38N/F40S, K38N/F40T, T37N/L39S, T37N/L39T, R36N/K38S, R36N/K38T, L39N/W41S, L39N/W41T, F40N/142S, F40N/I42T, I42N/Y44S, I42N/Y44T, Y44N/D46S, Y44N/D46T, D46N/D48S, D46N/D48T, G47N/Q49S, G47N/Q49T, K143N/N145S, K143N/N145T, E142N/R144S, E142N/R144T, L141N/K143S, L141N/K143T, I140N/E1425, I140N/E142T, R144N/A146S, R144N/A146T, A146N/K148S, A146N/K148T, S147N/P14 9 S/, S147N/P149T, R290N/A292S, R290N/A292T, D289N/G291S, D289N/G291T, L288N/R290S, L288N/R290T, L287N/D289S, L287N/D289T, A292N/A294S, A292N/A294T, T293N/L295S, T293N/L295T, R315N/V317S, R315N/V317T, S314N/ K316S, S314N/ K316T, Q313N/ R315S, Q313N/ R315T, K316N/G318S, K316N/G318T, V317N/D319S, V317N/D319T, K341N/ D343S, K341N/ D343T, S339N/K341S, S339N/K341T, D343N/G345S, D343N/G345T, R392N/E394S, R392N/E394T, L390N/ R392S, L390N/ R392T, K389N/M391S, K389N/M391T, S393N/P395S, S393N/P395T, E394N/R396S, E394N/R396T, P395N/P397S, P395N/P397T, R396N/G398S, R396N/G398T, P397N/V399S, P397N/V399T, G398N/L400S, G398N/L400T, V399N/L401S, V399N/L401T, L400N/R402S, L400N/R402T, L401N/A403S, L401N/A403T, R402N/P404S, R402N/P404T, A403N/F405S, A403N/F405T, P404N/P406S e P404N/P406T. Em alguns exemplos, os polipéptidos de FVII modificados também contêm uma substituição de posições 300-322, 305-322, 300-312 ou 305-312 com os aminoácidos correspondentes de tripsina, trombina ou FX, ou substituição das posições 310-329, 311-322 ou 233-329 pelos aminoácidos correspondentes de tripsina.
Os exemplos de polipéptidos de FVII modificados aqui descritos são os que têm uma sequência de aminoácidos apresentada em qualquer de SEQ ID NOS: 113-273. Em alguns exemplos, são efetuadas modificações num polipéptido de FVII não modificado que é uma variante alélica ou de espécie do polipéptido apresentado em SEQ ID NO:3. As variantes alélicas ou de espécie ou outras podem ter 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência com o polipéptido apresentado em SEQ ID NO: 3, excluindo as modificações de aminoácidos. O polipéptido de FVII modificado aqui descrito pode ser um polipéptido humano, um polipéptido não humano e/ou um polipéptido maduro. Em alguns exemplos, apenas se modifica a sequência primária. Noutros exemplos, inclui-se também uma modificação química ou uma modificação pós-tradução. Por exemplo, o polipéptido de FVII modificado pode ser glicosilado, carboxilado, hidroxilado, sulfatado, fosforilado, albuminado ou conjugado a uma parte de polietilenoglicol (PEG) .
Os polipéptidos de FVII modificados aqui proporcionados podem ser polipéptidos em cadeia única, polipéptidos com duas cadeias e/ou ativos ou ativados. A ativação pode ser efetuada por clivagem proteolítica por auto-ativação, clivagem por fator IX (FIXa), clivagem por fator X (FXa), clivagem por fator XII (FXIIa) ou clivagem por trombina. Os polipéptidos de FVII modificados aqui descritos podem manter uma ou mais atividades do polipéptido de FVII não modificado. Por exemplo, os polipéptidos de FVII modificados podem ter modificações em 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 ou 60 posições de aminoácidos, desde que o polipéptido mantenha pelo menos uma atividade de FVII do polipéptido de FVII não modificado. Tais polipéptidos de FVII modificados podem manter pelo menos cerca de 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100%, 200%, 300%, 400%, 500% ou mais de uma atividade do polipéptido de FVII não modificado. Em alguns exemplos, são selecionadas uma ou mais atividades de entre ligação a fator tecidular (TF), ativação de fator X (FX), ativação de fator IX (FIX), ligação a fosfolípido e atividade de coagulação. Adicionalmente, as atividades que são mantidas são aumentadas ou diminuídas comparativamente ao polipéptido de FVII não modificado. Em alguns exemplos, a atividade de coagulação é aumentada comparativamente ao polipéptido de FVII não modificado, tal como em pelo menos cerca de 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100%, 200%, 300%, 400%, 500% ou mais da atividade de coagulação do polipéptido de FVII não modificado. As atividades podem ser medidas in vitro, ex vivo ou in vivo.
Proporcionam-se aqui moléculas de ácido nucleico contendo uma sequência de nucleótidos que codificam polipéptidos de FVII modificados aqui proporcionados. Também se proporcionam vetores contendo tais moléculas de ácido nucleico, incluindo vetores procarióticos, vetores víricos ou vetores eucarióticos, tal como um vetor de mamífero. Os vetores víricos podem ser selecionados de um adenovirus, um vírus adenoassociado, um retrovirus, um vírus de herpes, um
lentivírus, um vírus de varíola e um citomegalovírus. Proporcionam-se aqui células contendo estes vetores, incluindo células eucarióticas, tais como células de mamífero. Os exemplos de células de mamífero são células de rim de hamster bebé (BHK-21) ou células 293 ou células CHO. Em alguns exemplos, as células expressam o polipéptido de FVII modificado. Assim, também se proporcionam aqui polipéptidos de FVII modificados que são produzidos por estas células.
Proporcionam-se aqui composições farmacêuticas contendo uma concentração ou quantidade terapeuticamente eficaz de qualquer polipéptido de FVII modificado de acordo com as presentes reivindicações, ou molécula de ácido nucleico, vetor ou célula aqui proporcionados, num veiculo farmaceuticamente aceitável. Em alguns exemplos, a composição farmacêutica é formulada para administração local, sistémica ou tópica, tal como administração oral, nasal, pulmonar, bucal, transdérmica, subcutânea, intraduodenal, entérica, parentérica, intravenosa ou intramuscular. As composições farmacêuticas também podem ser formuladas para libertação controlada e/ou administração em dosagem única.
Proporcionam-se aqui polipéptidos de FVII modificados de acordo com as presentes reivindicações para uso em métodos para tratar um indivíduo por administração de uma composição farmacêutica aqui proporcionada, em que o indivíduo tem uma doença ou condição que é tratada por administração de FVII ou de um pró-coagulante, tal como por administração de FVII ativo (FVIIa). Em alguns exemplos, o tratamento com a composição farmacêutica melhora ou alivia os sintomas associadas à doença ou condição. Em exemplos adicionais, os métodos aqui descritos também incluem monitorização de um indivíduo para alterações nos sintomas associados à doença ou condição que é tratada por administração de FVII ou de um pró-coagulante. A doença ou condição a ser tratada usando os métodos aqui descritos pode ser selecionada de entre doenças de coagulação sanguínea, doenças hematológicas, doenças hemorrágicas, hemofilia (tal como hemofilia A ou hemofilia B ou hemofilia C, hemofilia congénita ou adquirida), deficiência de fator VII e doenças hemorrágicas, incluindo complicação por hemorragia devida a cirurgia (tal como cirurgia cardíaca, angioplastia, cirurgia pulmonar, cirurgia abdominal, cirurgia espinal, cirurgia cerebral, cirurgia vascular, cirurgia dentária ou cirurgia de transplante de órgão) ou traumatismo. Em alguns exemplos, a hemorragia é manifestada como hemartroses agudas, artropatia hemofílica crónica, hematomas, hematúria, hemorragias do sistema nervoso central, hemorragias gastrointestinais ou hemorragia cerebral. Em exemplos adicionais, a hemorragia é devida a extração dentária. A cirurgia de transplante pode ser selecionada entre transplante de medula óssea, coração, pulmão, pâncreas e figado.
Em alguns exemplos, o método aqui descrito pode ser usado para tratar um indivíduo que tem auto-anticorpos contas fator VIII ou fator IX. Os métodos aqui descritos podem também incluir administração de um ou mais fatores de coagulação adicionais, tal como plasma purificado ou fatores de coagulação recombinantes, pró-coagulantes, tal como vitamina K, derivado de vitamina K e inibidores de proteína C, plasma, plaquetas, eritrócitos e corticosteróides ou tratamentos.
Também são aqui descritos artigos de fabrico contendo material de embalagem e uma composição farmacêutica aqui proporcionada contida no material de embalagem. Em alguns exemplos, o polipéptido de FVII modificado na composição farmacêutica é eficaz para tratamento de uma doença ou distúrbio mediados por FVII e o material de embalagem inclui uma etiqueta que indica que o polipéptido de FVII modificado é usado para tratamento de uma doença ou distúrbio mediados por FVII. Também aqui se descrevem kits, compreendendo uma composição farmacêutica aqui descrita, um dispositivo para administração da composição e, opcionalmente, instruções para administração.
DESCRIÇÃO SUCINTA DAS FIGURAS A figura 1 representa a cascata de coagulação. A figura mostra a via intrínseca e a via extrínseca de coagulação para a produção independente de FXa e convergência das vias para uma via comum para gerar trombina e fibrina para a formação de um coágulo. Estas vias estão interligadas. A figura representa a ordem das moléculas envolvidas na cascata de ativação na qual se converte um zimogénio a uma protease ativada, por clivagem de uma ou mais ligações peptídicas. A protease ativada serve seguidamente como a protease de ativação para a molécula de zimogénio seguinte na cascata, resultando finalmente na formação de coágulo. A figura 2 representa o modelo de coagulação baseado em células (consultar e.g. Hoffman et al. (2001) Thromb Haemost 85:958-965) . A figura representa os eventos de coagulação separados em três fases, em que o início da coagulação é efetuado pela ativação de FX a FXa pelo complexo TF/FVIIa nas células que apresentam TF, resultando na geração de uma pequena quantidade de trombina após ativação por FXa/FVa. A amplificação ocorre quando a trombina se liga às plaquetas e as ativa, iniciando a ativação de quantidades suficientes dos fatores de coagulação adequados para formar os complexos FVIIIa/FIXa e FVa/FXa. A propagação da coagulação ocorre na superfície de elevados números de plaquetas ativadas no local de lesão, resultando numa explosão de geração de trombina que é suficientemente elevada para gerar fibrina suficiente a partir de fibrinogénio, para estabelecer um coágulo no local de lesão. A figura 3 representa os mecanismos pelos quais FVIIa pode iniciar a formação de trombina. A figura ilustra a via de geração de trombina de FVIIa dependente de TF, que atua na superfície de células que apresentam TF e envolve complexação de FVIIa a TF antes de ativação de FX a FXa. A figura também representa a via de geração de trombina de FVIIa independente de TF, durante a qual FVIIa se liga a fosfolípidos na plaqueta ativada e ativa FX a FXa, que por seu lado complexa com FVa para clivar protrombina a trombina.
DESCRIÇÃO DETALHADA índice A. Definições B. Revisão sobre hemóstase 1. Adesão e aglutinação de plaquetas 2. Cascata de coagulação a. Inicio b. Amplificação c. Propagação 3. Regulação da coagulação C. Fator VII (FVII)
1. Estrutura e organização de FVII 2. Modificações pós-tradução
3. Processamento de FVII
4. Ativação de FVII
5. Função de FVII a. Atividade de FVIIa dependente de fator tecidular b. Atividade de FVIIa independente de fator tecidular 6. FVII como um biofármaco D. Polipéptidos de FVII modificados 1. Atividade catalítica aumentada a. Exemplos de modificações para aumentar a atividade catalítica i. Substituições por aminoácidos básicos na posição 2S6 ii. Outras mutações na posição 286
2. Resistência aumentada a AT-III
Exemplos de modificações para aumentar a
resistência a AT-III 3. Aumento da resistência à inibição por Zn2+
Exemplos de modificações para aumentar a resistência à inibição por Zn2+ 4. Glicosilação alterada
Exemplos de modificações para alterar glicosilação 5. Ligação aumentada a albumina de soro e/ou a integrina nb 3 de plaquetas a. Exemplos de polipéptidos de FVII com sequências de ligação a albumina de soro b. Exemplos de polipéptidos de FVII com sequências de ligação a integrina nb 3 de plaquetas 6. Modificação por introdução de um domínio Gla heterólogo 7. Combinações e modificações adicionais
a. Modificações que aumentam a resistência a TFPI b. Modificações que aumentam a atividade intrínseca c. Modificações que aumentam a resistência a proteases d. Modificações que aumentam a afinidade para fosfolípidos e. Modificações que alteram a glicosilação f. Modificações que facilitam a ligação de grupos químicos g. Exemplos de combinações de mutações
E. Produção de polipéptidos de FVII 1. Vetores e células 2. Sistemas de expressão a. Expressão procariótica b. Leveduras c. Insetos e células de inseto d. Células de mamifero e. Plantas 2. Purificação 3. Proteínas de fusão 4. Modificação de polipéptido 5. Sequências de nucleótidos F. Avaliação das atividades de polipéptido de FVII modificado 1. Ensaios in vitro a. Modificação pós-tradução b. Atividade proteolítica c. Atividade de coagulação d. Ligação e/ou inibição por outras proteínas e moléculas e. Afinidade para fosfolípidos 2. Modelos animais não humanos 3. Ensaios clínicos G. Formulação e administração 1. Formulações a. Dosagens b. Formas de dosagem 2. Administração de polipéptidos de FVII modificados 3. Administração de ácidos nucleicos que codificam polipéptidos de FVII modificados (terapia génica) H. Usos terapêuticos 1. Doenças hemorrágicas congénitas a. Hemofilia
b. Deficiência em FVII c. Outras 2. Doenças hemorrágicas adquiridas a. Trombocitopenia adquirida por quimioterapia b. Outras coagulopatias c. Hemorragia adquirida por transplante d. Hemorragia induzida por terapia anticoagulante e. Hemofilia adquirida 3. Hemorragia por traumatismo e cirurgia I. Terapias de combinação J. Artigos de fabrico e kits K. Exemplos
A. DEFINIÇÕES
Salvo definição em contrário, todas as expressões técnicas e científicas aqui usadas têm o mesmo significado usualmente entendido pelos peritos na especialidade a que a invenção ou invenções pertençam. Caso exista mais do que uma definição para as expressões aqui, prevalecem as desta secção. Quando se faz referência a um URL ou outro tal identificador ou endereço, deve entender-se que tais identificadores podem mudar e a informação específica na internet pode aparecer e desaparecer, mas pode encontrar-se informação equivalente por busca da internet. Tal referência evidencia a disponibilidade e disseminação pública de tal informação.
Tal como aqui usado, via de coagulação ou cascata de coagulação refere-se à série de eventos de ativação que leva à formação de um coágulo de fibrina insolúvel. Na cascata ou via de coagulação, uma proteína inativa de uma serina protease (também denominada um zimogénio) é convertida a uma protease ativa, por clivagem de uma ou mais ligações peptídicas, que serve então como a protease de ativação para a molécula de zimogénio seguinte na cascata. Na etapa proteolítica final da cascata, o fibrinogénio é clivado proteoliticamente por trombina a fibrina, que é então reticulada no local de lesão para formar um coágulo.
Tal como aqui usado, "hemóstase" refere-se à paragem de hemorragia ou fluxo de sangue num órgão ou parte do corpo. A expressão hemóstase pode abranger o processo completo de coagulação de sangue para evitar a perda de sangue após lesão de vaso sanguíneo até à dissolução subsequente do coágulo sanguíneo que se segue à reparação de tecidos.
Tal como aqui usado, "coagulação" refere-se à formação de um coágulo de fibrina insolúvel ou ao processo pelo qual os fatores de coagulação do sangue interatuam na cascata de coagulação, resultando finalmente na formação de um coágulo de fibrina insolúvel.
Tal como aqui usado, uma "protease" é uma enzima que catalisa a hidrólise de ligações peptídicas covalentes. Estas designações incluem formas de zimogénio e suas formas ativadas em cadeia única, de duas cadeias e de múltiplas cadeias. Por razões de clareza, a referência a proteases refere-se a todas as formas. As proteases incluem, por exemplo, serina proteases, cisteína proteases, aspártico proteases, treonina e metal-proteases, dependendo da atividade catalítica do seu local ativo e do mecanismo de clivagem das ligações peptídicas de um substrato alvo.
Tal como aqui usado, as serina proteases ou serina endopeptidases refere-se a uma classe de peptidases, que são caracterizadas pela presença de um resíduo de serina no local ativo da enzima. As serina proteases participam numa vasta gama de funções no corpo, incluindo coagulação sanguínea e inflamação, bem como funcionam como enzimas digestivas em procariotas e eucariotas. 0 mecanismo de clivagem por serina proteases baseia-se no ataque nucleofílico de uma ligação peptídica alvo por uma serina. A cisteína, treonina ou moléculas de água associadas a aspartato ou metais também podem desempenhar este papel. As cadeias laterais alinhadas de serina, histidina e aspartato formam uma tríade catalítica comum à maior parte das serina proteases. 0 local ativo de serina proteases tem a forma de uma fenda onde o substrato polipeptídico se liga.
Tal como aqui usado, fator VII (FVII, F7; também denominado fator 7, fator de coagulação VII, fator sérico VII, acelerador de conversão de protrombina do soro, SPCA, pró-convertina e eptacog alfa) refere-se a uma serina protease que faz parte da cascata de coagulação. FVII inclui um domínio Gla, dois domínios EGF (EGF-1 e EGF-2) e um domínio de serina protease (ou domínio de peptidase Sl) que é altamente conservado entre todos os membros da família de peptidases Sl de serina proteases, tal como por exemplo em quimiotripsina. A sequência de um exemplo de precursor de FVII contendo um péptido de sinalização e pró-péptido é apresentada em SEQ ID NO: 1. Um exemplo de polipéptido de FVII maduro é apresentado em SEQ ID NO:3. FVII ocorre como um zimogénio em cadeia única, um polipéptido tipo zimogénio com duas cadeias e uma forma com duas cadeias completamente ativada. A ativação completa, que ocorre por alteração conformacional de uma forma do tipo zimogénio, ocorre por ligação ao seu cofator, fator tecidular. Igualmente, podem introduzir-se mutações que resultam na alteração de conformação na ausência de fator tecidular. Assim, a referência FVII inclui as suas formas em cadeia única e com duas cadeias, incluindo as formas com duas cadeias do tipo zimogénico e completamente ativadas. A referência a polipéptido de FVII também inclui polipéptidos precursores e polipéptidos de FVII maduros em formas de cadeia única ou com duas cadeias, suas formas truncadas que têm atividade e inclui variantes alélicas e variantes de espécie, variantes codificadas por variantes de splicing e outras variantes, incluindo polipéptidos que têm pelo menos 40%, 45%, 50%, 55%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais de identidade de sequência com o polipéptido precursor apresentado em SEQ ID NO: 1 ou a sua forma madura. Incluem-se polipéptidos de FVII modificados, tais como os de SEQ ID NOS: 113 e 273 e suas variantes. Também se incluem os que mantêm pelo menos uma atividade de um FVII, tal como ligação a TF, ligação a fator X, ligação a fosfolípido e/ou atividade coagulante de um FVII. Na retenção de atividade, a atividade pode ser alterada, tal como diminuída ou aumentada, comparativamente a um FVII de tipo selvagem, desde que o nível de atividade mantido seja suficiente para obter um efeito detetável. Os polipéptidos de FVII incluem isoformas específicas de tecido e suas variantes alélicas, moléculas sintéticas preparadas por tradução de ácidos nucleicos, proteínas geradas por síntese química, tais como sínteses que incluem ligação de polipéptidos mais curtos, através de métodos recombinantes, proteínas isoladas de tecidos e células humanas e não humanas, polipéptidos de FVII quiméricos e suas formas modificadas, não se lhes limitando. Os polipéptidos de FVII também incluem fragmentos ou partes de FVII que são suficientemente compridas ou incluem regiões adequadas para manter pelo menos uma atividade (caso necessário, após ativação) de um polipéptido maduro completo. Os polipéptidos de FVII também incluem os que contêm modificações químicas ou pós-tradução e os que não contêm modificações químicas ou pós-tradução. Tais modificações incluem peguilação, albuminação, glicosilação, farnesilação, carboxilação, hidroxilação, fosforilação e outras modificações de polipéptido conhecidas na especialidade, não se lhes limitando.
Os exemplos de polipéptidos de FVII são os de origem de mamífero, incluindo humana. Os exemplos de sequências de aminoácidos de FVII de origem humana são apresentados em SEQ ID NOS: 1, 2 e 3. Os exemplos de variantes de tal polipéptido de FVII humano incluem qualquer dos polipéptidos precursores apresentados em SEQ ID NOS: 18-74. Os polipéptidos de FVII também incluem qualquer de origem não humana incluindo murinos, caninos, felinos, leporinos, aviários, bovinos, ovinos, porcinos, equinos, písceos, de rã e outros polipéptidos de fator VII de primatas, não se lhes limitando. Os exemplos de polipéptidos de FVII de origem não humana incluem, por exemplo, de vaca (Bos taurus, SEQ ID N0:4), ratinho (Mus musculus, SEQ ID N0:5), chimpanzé-pigmeu (Pan paniscus, SEQ ID NO:6), chimpanzé (Pan troglodytes, SEQ ID NO:7), coelho (Oryctolagus cuniculus, SEQ ID NO:8), rato (Rattus norveglcus, SEQ ID NO: 9), macaco Rhesus (Macaca mulatta, SEQ ID NO: 10), porco (Sus scrofa, SEQ ID NO: 11), cão (Canis familiaris, SEQ ID NO:12), peixe-zebra (Brachydanio rerio, SEQ ID NO:13), baiacu japonês (Fugu rubripes, SEQ ID NO:14), galinha (Gallus gallus, SEQ ID NO:15), orangotango (Pongo pygmaeus, SEQ ID NO: 16) e gorila (Gorilla gorilla, SEQ ID NO:17).
Um perito na especialidade reconhece que as posições referenciadas do polipéptido de fator VII maduro (SEQ ID NO: 3) diferem em 60 resíduos de aminoácidos comparativamente à isoforma de polipéptido de FVII precursora apresentada em SEQ ID NO: 1, que é a isoforma de polipéptido de fator VII contendo o péptido de sinalização e sequências de pró-péptido. Assim, o primeiro resíduo de aminoácido de SEQ ID NO: 3 "corresponde" ao sexagésimo primeiro (61 -) resíduo de aminoácido de SEQ ID NO: 1. Um perito na especialidade também
reconhece que as posições referenciadas do polipéptido de fator VII maduro (SEQ ID NO: 3) diferem em 38 resíduos de aminoácidos comparativamente ao polipéptido precursor de FVII apresentado em SEQ ID NO:2, que é a isoforma b de polipéptido de fator VII contendo o péptido de sinalização e sequências de pró-péptido. Assim, o primeiro resíduo de aminoácido de SEQ ID NO: 3 "corresponde" ao trigésimo nono (39-) resíduo de aminoácido de SEQ ID NO:2.
Tal como aqui usado, resíduos correspondentes refere-se a resíduos que ocorrem em locais alinhados. Alinham-se polipéptidos relacionados ou variantes por qualquer método conhecido dos peritos na especialidade. Tipicamente, tais método maximizam as correspondências e incluem métodos tais como usando alinhamentos manuais e usando os numerosos programas disponíveis (por exemplo, BLASTP) e outros conhecidos dos peritos na especialidade. Por alinhamento das sequências de polipéptidos, um perito na especialidade pode identificar resíduos correspondentes, usando como guias resíduos de aminoácidos conservados e idênticos. Por exemplo, por alinhamento das sequências de polipéptidos de fator VII, um perito na especialidade pode identificar resíduos correspondentes, usando como guias resíduos de aminoácidos conservados e idênticos. Por exemplo, a alanina na posição de aminoácidos 1 (Al) de SEQ ID NO: 3 (fator VII maduro) corresponde à alanina na posição de aminoácidos 61 (A61) de SEQ ID N0:1 e à alanina na posição de aminoácidos 39 (A39) de SEQ ID N0:2. Noutros casos podem identificar-se regiões correspondentes. Por exemplo, o domínio Gla corresponde às posições de aminoácidos Al a F45 de SEQ ID NO: 3, às posições de aminoácidos A61 até S105 de SEQ ID N0:1 e às posições de aminoácidos A39 a S83 de SEQ ID N0:2. Um perito na especialidade também pode usar resíduos de aminoácidos conservados como guias para encontrar resíduos de aminoácidos correspondentes entre sequências humanas e não humanas. Por exemplo, os resíduos de aminoácidos S43 e E163 de SEQ ID NO: 3 (humano) correspondem a S83 e E203 de SEQ ID NO: 4 (bovino) . As posições correspondentes também se podem basear em alinhamentos estruturais, por exemplo usando alinhamentos da estrutura proteica simulados em computador. Noutros casos podem identificar-se regiões correspondentes.
Tal como aqui usado, uma "pró-região", "pró-péptido" ou "pró-sequência" refere-se a uma região ou um segmento que é clivado para produzir uma proteína madura. Tal pode incluir segmentos que funcionam para suprimir atividade proteolítica mascarando a maquinaria catalítica e evitando assim a formação do intermediário catalítico (i.e., obstruindo estericamente o local de ligação de substrato). Uma pró-região é uma sequência de aminoácidos posicionada no terminal amino de um polipéptido maduro ativo biologicamente e pode conter apenas alguns aminoácidos ou pode ser uma estrutura multidomínio.
Tal como aqui usado, "fator VII maduro" refere-se a um polipéptido de FVII que não contém uma sequência de sinalização e um sequência pró-péptido. Tipicamente, uma sequência de sinalização tem como alvo uma proteína para excreção através da via de retículo endoplasmático (ER)-golgi e é clivada após inserção no ER durante a tradução. Uma sequência pró-péptido funciona tipicamente na modificação pós-tradução da proteína e é clivada antes da excreção da proteína da célula. Assim, um polipéptido de FVII maduro é tipicamente uma proteína excretada. Num exemplo, um polipéptido de FVII humano maduro é apresentado em SEQ ID NO:3. A sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO:3 difere da sequência dos polipéptidos precursores apresentada em SEQ ID NOS:1 e 2 porque a SEQ ID NO: 3 não contém a sequência de sinalização, que corresponde aos resíduos de aminoácidos 1-20 de SEQ ID NOS:1 e 2; e também não contém a sequência de pró-péptido, que corresponde aos resíduos de aminoácidos 21-60 de SEQ ID NO:l e resíduos de aminoácidos 21-38 de SEQ ID NO:2. A referência ao polipéptido de FVII maduro abrange a forma de zimogénio de cadeia única e a forma com duas cadeias.
Tal como aqui usado, "de tipo selvagem" ou "nativo" com referência a FVII refere-se a um polipéptido de FVII codificado por um gene de FVII nativo ou de ocorrência natural, incluindo variantes alélicas, que está presente num organismo, incluindo um humano e outros animais, na natureza. Pretende-se que a referência a factor VII de tipo selvagem sem referência a uma espécie abranja qualquer espécie de um fator VII de tipo selvagem. Entre os polipéptidos de FVII de tipo selvagem incluem-se os polipéptidos precursores codificados, seus fragmentos e suas formas processadas, tal como uma forma madura sem o péptido de sinalização, bem como quaisquer suas formas processadas ou modificadas pré-tradução ou pós-tradução. Também se incluem nos polipéptidos de FVII nativos aqueles que são modificados pós-tradução, incluindo modificação por glicosilação, carboxilação e hidroxilação, não se lhes limitando. Os polipéptidos de FVII nativos também incluem formas em cadeia única e com duas cadeias. Por exemplo, os humanos expressam FVII nativo. A sequência de aminoácidos de exemplos de FVII humano de tipo selvagem é apresentada em SEQ ID NOS: 1, 2, 3 e as variantes alélicas são apresentadas em SEQ ID NOS :44-100 e nas suas formas maduras. Outros animais produzem FVII nativo, incluindo vaca (Bos Taurus, SEQ ID NO:4), ratinho (Mus musculus, SEQ ID NO:5), chimpanzé-pigmeu (Pan paniscus, SEQ ID NO:6), chimpanzé (Pan troglodytes, SEQ ID NO:7), coelho (Oryctolagus cuniculus, SEQ ID NO:8), rato (Rattus norvegicus, SEQ ID NO: 9), macaco Rhesus (Macaca mulatta, SEQ ID NO:10), porco (Sus scrofa, SEQ ID NO:ll), cão (Canis familiaris, SEQ ID NO:12), peixe-zebra (Brachydanio rerio, SEQ ID NO:13) baiacu japonês (Fugu rubripes, SEQ ID NO:14), galinha (Gallus gallus, SEQ ID NO:15), orangotango (Pongo pygmaeus, SEQ ID NO:16) e gorila (Gorilla gorilla, SEQ ID NO:17), não se lhes limitando.
Tal como aqui usado, variantes de espécie refere-se a variantes em polipéptidos entre espécies diferentes, incluindo espécies de mamíferos diferentes, tais como ratinho e humano.
Tal como aqui usado, variantes alélicas refere-se a variações em proteínas entre membros da mesma espécie.
Tal como aqui usado, uma variante de splicing refere-se a uma variante produzida por processamento diferencial de um produto de transcrição primário de ADN genómico que resulta em mais do que um tipo de ARNm.
Tal como aqui usado, um zimogénio refere-se a uma protease que é ativada por clivagem proteolítica, incluindo clivagem por maturação, tal como clivagem por ativação e/ou formação de complexo com outra (s) proteína(s) e/ou cofator (es) . Um zimogénio é um precursor inativo de uma enzima proteolítica. Tais precursores são geralmente maiores, embora não necessariamente maiores, do que a forma ativa. Com referência a serina proteases, os zimogénios são convertidos a enzimas ativas por clivagem específica, incluindo clivagem catalítica e autocatalítica ou por ligação a um cofator de ativação que gera uma enzima ativa. Por exemplo, em geral os zimogénios estão presentes numa forma em cadeia única. Os zimogénios são em geral inativos e podem ser convertidos a polipéptidos maduros ativos por clivagem catalítica ou autocatalítica, num ou mais locais proteolíticos, para gerar um polipéptido em com múltiplas cadeias, tal como com duas cadeias. Assim, um zimogénio é uma proteína inativa enzimaticamente que é convertida numa enzima proteolítica pela ação de um ativador. A clivagem pode ser efetuada por auto-ativação. Várias proteínas de coagulação são zimogénios; elas são inativas, mas tornam-se clivadas e ativadas por início do sistema de coagulação que se segue a dano vascular. Com referência a FVII, os polipéptidos de FVII existem no plasma sanguíneo como zimogénios até clivagem por proteases, tais como, por exemplo, fator IX ativado (FIXa), fator X ativado (FXa), fator XII ativado (FXIIa), trombina ou por auto-ativação para produzir uma forma com duas cadeias do tipo zimogénio, que seguidamente requer adicionalmente uma alteração conformacional para atividade completa.
Tal como aqui usado, uma proteína ou polipéptido "do tipo zimogénio" refere-se a uma proteína que foi ativada por clivagem proteolítica, mas ainda apresenta propriedades que estão associadas com um zimogénio, tal como por exemplo, atividade baixa ou nula ou uma conformação que se assemelha à conformação da forma de zimogénio da proteína. Por exemplo, quando não está ligada a fator tecidular, a forma ativada com duas cadeias de FVII é uma proteína do tipo zimogénio; mantém uma conformação semelhante à do zimogénio FVII não clivado e portanto apresenta muito baixa atividade. Por ligação a fator tecidular, a forma ativada com duas cadeias de FVII sofre uma alteração conformacional e adquire a sua atividade completa como um fator de coagulação.
Tal como aqui usado, uma sequência de ativação refere-se a uma sequência de aminoácidos num zimogénio que é o local necessário para clivagem para ativação ou clivagem para maturação, para formar uma protease ativa. A clivagem de uma sequência de ativação pode ser catalisada auto-cataliticamente ou por parceiros de ativação.
Tal como aqui usado, clivagem para ativação é um tipo de clivagem para maturação que induz uma alteração conformacional que é necessária para o desenvolvimento de atividade enzimática completa. Esta é uma via de ativação clássica, por exemplo, para serina proteases, nas quais uma clivagem gera um novo terminal N que interatua com as regiões conservadas da protease, tal como Aspl94 em quimiotripsina, para induzir alterações conformacionais necessárias para atividade. A ativação pode resultar na produção de formas multicadeia das proteases. Em alguns casos, as formas em cadeia única da protease podem apresentar atividade proteolítica.
Tal como aqui usado, "fator VII ativado" ou "FVIIa" refere-se a qualquer forma com duas cadeias de um polipéptido de FVII. A forma com duas cadeias tipicamente resulta de clivagem proteolítica, mas pode ser produzida sinteticamente. 0 fator VII ativado inclui então a forma com duas cadeias do tipo zimogénio, com baixa atividade coagulante, uma forma completamente ativada (cerca de 1000 mais ativa), que ocorre por ligação a fator tecidular, e formas mutadas que existem numa forma com duas cadeias completamente ativada ou que sofrem uma alteração conformacional para uma forma completamente ativada. Por exemplo, uma forma em cadeia única de polipéptido de FVII (consultar, e.g., SEQ ID NO:3) é clivada proteolíticamente entre os resíduos de aminoácidos R152 e 1153 do polipéptido de FVII maduro. Os produtos de clivagem, cadeia pesada de FVII e cadeia leve de FVII, que se mantêm juntos através de uma ponte dissulfureto (entre os resíduos de aminoácidos C135 e C262 no FVII de SEQ ID NO:3), formam a enzima FVII com duas cadeias ativada. A clivagem proteolítica pode ser efetuada, por exemplo, por fator IX ativado (FIXa) , fator X ativado (FXa), fator XII ativado (FXIIa), trombina ou por auto-ativação.
Tal como aqui usado, uma "propriedade" de um polipéptido de FVII refere-se a uma propriedade física ou estrutural, tal como estrutura tridimensional, pi, semivida, conformação e outras tais características físicas.
Tal como aqui usado, uma "atividade" de um polipéptido de FVII refere-se a qualquer atividade apresentada por um polipéptido de fator VII. Tais atividades podem ser ensaiadas in vitro e/ou in vivo e incluem atividade de coagulação ou coagulante, atividade pró-coagulante, atividade proteolítica ou catalítica, tal como efetuar ativação de fator X (FX) ou ativação de fator IX (FIX); antigenicidade (capacidade de se ligar ou competir com um polipéptido para ligação a um anticorpo anti-FVII); capacidade de se ligar a fator tecidular, fator X ou fator IX; e/ou capacidade de se ligar a fosfolípidos, não se lhes limitando. A atividade pode ser avaliada in vitro ou in vivo usando ensaios reconhecidos, por exemplo, por medição da coagulação in vitro ou in vivo. Os resultados de tais ensaios indicam se um polipéptido apresenta uma atividade que pode ser relacionada com a atividade do polipéptido in vivo, nos quais a atividade in vivo pode ser denominada atividade biológica. Os ensaios para determinar a funcionalidade ou atividade de formas modificadas de FVII são conhecidos dos peritos na especialidade. Os exemplos de ensaios para avaliar a atividade de um polipéptido de FVII incluem o ensaio de tempo de pró-tromboplastina (PT) ou o ensaio de tempo de tromboplastina parcialmente ativada (aPTT) para avaliar a atividade coagulante ou ensaios cromogénicos usando substratos sintéticos, tal como descrito nos exemplos seguidamente, para avaliar atividade catalítica ou proteolítica.
Tal como aqui usado, "apresenta pelo menos uma atividade" ou "mantém pelo menos uma atividade" refere-se à atividade apresentada por um polipéptido de FVII modificado comparativamente a um polipéptido de FVII não modificado, da mesma forma e nas mesmas condições. Por exemplo, um polipéptido de FVII modificado numa forma com duas cadeias é comparado a um polipéptido de FVII não modificado numa forma com duas cadeias, nas mesmas condições experimentais, em que a única diferença entre os dois polipéptidos é a modificação em estudo. Noutro exemplo, um polipéptido de FVII modificado numa forma em cadeia única é comparado a um polipéptido de FVII não modificado numa forma em cadeia única, nas mesmas condições experimentais, em que a única diferença entre os dois polipéptidos é a modificação em estudo. Tipicamente, um polipéptido de FVII modificado que mantém ou apresenta pelo menos uma atividade de um polipéptido de FVII não modificado, da mesma forma mantém uma quantidade suficiente da atividade de modo que, quando administrado in vivo, o polipéptido de FVII modificado é terapeuticamente eficaz como um agente terapêutico pró-coagulante. Em geral, para um polipéptido de FVII modificado manter eficácia terapêutica como um pró-coagulante, a quantidade de atividade que é mantida é ou é cerca de 0,5%, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 11%, 12%, 13%, 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 200%, 300%, 400%, 500% ou mais da atividade de um polipéptido de FVII não modificado da mesma forma, que apresenta eficácia terapêutica como um pró-coagulante. Caso necessário, a quantidade de atividade que é necessária para manter a eficácia terapêutica como um pró-coagulante pode ser determinada empiricamente. Tipicamente, é suficiente a retenção de 0,5% a 20%, 0,5% a 10%, 0,5% a 5% de uma atividade para manter eficácia terapêutica como um pró-coagulante in vivo.
Deve entender-se que a atividade a ser apresentada ou mantida por um polipéptido de FVII modificado pode ser qualquer atividade, incluindo atividade de coagulação ou coagulante, atividade pró-coagulante; atividade proteolítica ou catalítica, tal como efetuar ativação de fator X (FX) ou ativação de fator IX (FIX); antigenicidade (capacidade de se ligar ou competir com um polipéptido para ligação a um anticorpo anti-FVII); capacidade de se ligar a fator tecidular, fator X ou fator IX; e/ou capacidade de se ligar a fosfolípidos, não se lhes limitando. Em alguns casos, um polipéptido de FVII modificado pode manter uma atividade que é aumentada comparativamente a um polipéptido de FVII não modificado. Em alguns casos, um polipéptido de FVII modificado pode manter uma atividade que é diminuída comparativamente a um polipéptido de FVII não modificado. A atividade de um polipéptido de FVII modificado pode ser qualquer nível de percentagem de atividade do polipéptido não modificado, em que ambos os polipéptidos estão na mesma forma, incluindo 1% da atividade, 2%, 3%, 4%, 5%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100%, 200%, 300%, 400%, 500% ou mais, não se lhes limitando, da atividade comparativamente ao polipéptido que não contém a modificação em causa. Por exemplo, um polipéptido de FVII modificado pode apresentar atividade aumentada ou diminuída comparativamente ao polipéptido de FVII não modificado na mesma forma. Por exemplo, pode manter pelo menos cerca de 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou pelo menos 99% da atividade do polipéptido de FVII não modificado. Noutras concretizações, a alteração na atividade é de pelo menos cerca de 2 vezes, 3 vezes, 4 vezes, 5 vezes, 6 vezes, 7 vezes, 8 vezes, 9 vezes, 10 vezes, 20 vezes, 30 vezes, 40 vezes, 50 vezes, 60 vezes, 70 vezes, 80 vezes, 90 vezes, 100 vezes, 200 vezes, 300 vezes, 400 vezes, 500 vezes, 600 vezes, 700 vezes, 800 vezes, 900 vezes, 1000 vezes ou mais vezes superior à do FVII não modificado. O nível específico a ser mantido depende do uso pretendido do polipéptido e pode ser determinado empiricamente. A atividade pode ser medida, por exemplo, usando ensaios in vitro ou in vivo, tais como os aqui descritos ou nos exemplos seguintes.
Tal como aqui usado, "atividade de coagulação" ou "atividade coagulante" ou "atividade pró-coagulante" refere-se à capacidade de um polipéptido efetuar coagulação. Os ensaios para avaliar atividade coagulante são conhecidos dos peritos na especialidade e incluem ensaio de tempo de pró-tromboplastina (PT) ou o ensaio de tempo de tromboplastina parcial ativada (aPTT).
Tal como aqui usado, "atividade catalítica" ou "atividade proteolítica" com referência a FVII refere-se à capacidade de uma proteína FVII catalisar a clivagem proteolítica de um substrato e são usadas indiferentemente. Os ensaios para avaliar tais atividades são conhecidos na especialidade. Por exemplo, a atividade proteolítica de FVII pode ser medida usando substratos cromogénicos, tais como Spectrozyme FVIIa (CH3S02-D-CHA-But-Arg-pNA) , em que a clivagem do substrato é monitorizada por absorvância e a velocidade de hidrólise de substrato é determinada por regressão linear.
Tal como aqui usado, "atividade intrínseca" com referência a FVII refere-se à atividade catalítica, proteolítica e/ou coagulante de uma proteína FVII na ausência de fator tecidular.
Tal como aqui usado, domínio (tipicamente uma sequência de três ou mais, geralmente 5 ou 7 ou mais aminoácidos) refere-se a uma parte de uma molécula, tais como proteínas ou aos ácidos nucleicos que as codificam, que são distintas estrutural e/ou funcionalmente de outras partes da molécula e que são identificáveis. Por exemplo, os domínios incluem as partes de uma cadeia de polipéptido que podem formar uma estrutura dobrada independentemente dentro de uma proteína constituída por um ou mais motivos estruturais e/ou que é reconhecida devido à sua atividade funcional, tal como uma atividade proteolítica. Uma proteína pode ter um ou mais do que um domínios distintos. Por exemplo, um domínio pode ser identificado, definido ou distinguido por homologia da sua sequência com membros da família relacionados, tal como homologia com motivos que definem um motivo de protease ou um domínio gla. Noutro exemplo, pode distinguir-se um domínio pela sua função, tal como por atividade proteolítica ou uma capacidade para interatuar com uma biomolécula, tal como ligação a ADN, ligação a ligando e dimerização. Um domínio pode apresentar independentemente uma função ou atividade biológica de modo que o domínio, independentemente ou fundido a outra molécula, pode exercer uma atividade tal como, por exemplo, atividade proteolítica ou ligação de ligando. Um domínio pode ser uma sequência de aminoácidos linear ou uma sequência de aminoácidos não linear. Muitos polipéptidos contêm vários domínios. Tais domínios são conhecidos e podem ser identificados pelos peritos na especialidade. Para exemplificação aqui, apresentam-se definições, mas deve ser entendido que os peritos na especialidade reconhecem facilmente domínios específicos pelo nome. Caso necessário podem usar-se utilitários de computador adequados para identificar domínios.
Tal como aqui usado, um domínio de protease é a parte ativa cataliticamente de uma protease. A referência a um domínio de protease de uma protease inclui as formas em cadeia única, em duas cadeias e multicadeia de qualquer destas proteínas. Um domínio de protease de uma proteína contém todas as propriedades necessárias dessa proteína necessárias para a sua atividade proteolítica, tal como por exemplo, o centro catalítico. Em referência a FVII, o domínio de protease partilha homologia e características estruturais com os domínios de protease da família de quimiotripsina/tripsina, incluindo a tríade catalítica. Por exemplo, no polipéptido de FVII maduro apresentado em SEQ ID NO:3, o domínio de protease corresponde às posições de aminoácidos 153 a 392.
Tal como aqui usado, um domínio de gama-carboxiglutamato (Gla) refere-se à parte de uma proteína, por exemplo uma proteína dependente de vitamina K, que contém modificações pós-tradução de resíduos de glutamato, em geral a maioria mas nem todos os resíduos de glutamato, por carboxilação dependente de vitamina K, para formar Gla. 0 domínio Gla é responsável pela elevada afinidade de ligação para iões cálcio e ligação a fosfolípidos carregados negativamente. Tipicamente, o domínio Gla tem início na extremidade N-terminal da forma madura de proteínas dependentes de vitamina K e termina com um resíduo aromático conservado. Num polipéptido de FVII maduro, o domínio Gla corresponde às posições de aminoácidos 1 a 45 do exemplo de polipéptido apresentado em SEQ ID NO:3. Os domínios Gla são bem conhecidos e o seu local pode ser identificado em determinados polipéptidos. Os domínios Gla das várias proteínas dependentes de vitamina K partilham homologia de sequência, estrutural e funcional, incluindo a agregação de resíduos hidrofóbicos N-terminais numa zona hidrofóbica que medeia a interação com fosfolípidos carregados negativamente na membrana de superfície celular. Os exemplos de outros polipéptidos contendo Gla incluem FIX, FX, protrombina, proteína C, proteína S, osteocalcina, proteína Gla de matriz, proteína 6 específica de paragem de crescimento (Gas6) e proteína Z, não se lhes limitando. Os domínios Gla destas e de outros exemplos de proteínas apresentam-se em qualquer das SEQ ID NOS: 83-94.
Tal como aqui usado, "nativo" ou "endógeno", com referência a um domínio Gla, refere-se ao domínio Gla de ocorrência natural associado a todo ou parte de um polipéptido com um domínio Gla. Para os presentes objetivos, um domínio Gla nativo refere-se a um polipéptido de FVII. Por exemplo, o domínio Gla nativo de FVII, apresentado em SEQ ID NO:92, corresponde aos aminoácidos 1-45 da sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO:3.
Tal como aqui usado, um domínio Gla heterólogo refere-se ao domínio Gla de um polipéptido, da mesma espécie ou de uma espécie diferente, que não é um domínio Gla de FVII. Os exemplos de domínios Gla heterólogos são os domínios Gla de polipéptidos contendo Gla, incluindo FIX, FX, protrombina, proteína C, proteína S, osteocalcina, proteína Gla de matriz, proteína 6 específica de paragem de crescimento (Gas6) e proteína Z, não se lhes limitando. Os domínios Gla destas proteínas e de outros exemplos de proteínas apresentam-se em qualquer de SEQ ID NOS: 83-91, 93 e 94.
Tal como aqui usado, uma parte contígua de um domínio Gla refere-se a pelo menos dois ou mais aminoácidos adjacentes, tipicamente 2, 3, 4, 5, 6, 8, 10, 15, 20, 30, 40 ou mais até todos os aminoácidos que constituem um domínio Gla.
Tal como aqui usado, "uma parte suficiente de um domínio Gla para efetuar ligação a fosfolípido" inclui pelo menos um aminoácido, tipicamente, 2, 3, 4, 5, 6, 8, 10, 15 ou mais aminoácidos do domínio, mas menos do que todos os aminoácidos que constituem o domínio, desde que o polipéptido que contém tal parte apresente ligação a fosfolípido.
Tal como aqui usado, "substituir" relativamente a um domínio Gla ou "permuta de domínio Gla" refere-se ao processo pelo qual o domínio Gla endógeno de uma proteína é substituído, usando métodos recombinantes, sintéticos ou outros, pelo domínio Gla de outra proteína. No contexto de uma "permuta de domínio Gla", um "domínio Gla" é qualquer seleção de aminoácidos de um domínio Gla e regiões adjacentes que é suficiente para manter a atividade de ligação a fosfolípido. Tipicamente, uma permuta de domínio Gla envolverá a substituição de entre 40 e 50 aminoácidos da proteína endógena por entre 40 e 50 aminoácidos de outra proteína, mas pode envolver menos ou mais aminoácidos.
Tal como aqui usado, um domínio de fator de crescimento epidérmico (EGF) (EGF-1 ou EGF-2) refere-se à parte de uma proteína que partilha homologia de sequência com uma parte específica de 30 a 40 aminoácidos da sequência de fator de crescimento epidérmico (EGF). O domínio EGF inclui seis resíduos de cisteína que se demonstrou (em EGF) estarem envolvidos em ligações dissulfureto. A estrutura principal de um domínio de EGF é uma folha beta de duas cadeias seguida por uma ansa para uma folha com duas cadeias pequenas no terminal C. FVII contém dois domínios EGF: EGF-1 e EGF-2. Estes domínios correspondem às posições de aminoácidos 46-82 e 87-128, respetivamente, do polipéptido de FVII maduro apresentado em SEQ ID NO:3.
Tal como aqui usado, "polipéptido não modificado" ou "FVII não modificado" e suas variações gramaticais referem-se a um polipéptido de partida que é selecionado para modificação, tal como aqui proporcionado. 0 polipéptido de partida pode ser de ocorrência natural, a forma de tipo selvagem de um polipéptido. Além disso, o polipéptido de partida pode ser alterado ou mutado, de modo a diferir de uma isoforma nativa de tipo selvagem, mas contudo é aqui denominado polipéptido de partida não modificado relativamente aos polipéptidos modificados subsequentemente aqui produzidos. Assim, as proteínas existentes conhecidas na especialidade que foram modificadas para apresentar um aumento ou diminuição pretendidas de uma determinada atividade ou propriedade comparativamente a uma proteína de referência não modificada, podem ser selecionadas e usadas como o polipéptido de partida não modificado. Por exemplo, uma proteína que foi modificada relativamente à sua forma nativa através de uma ou mais alterações de um único aminoácido e apresenta um aumento ou uma diminuição de uma propriedade pretendida, tal como uma alteração num resíduo ou resíduos de aminoácidos que alteram a glicosilação, pode ser uma proteína alvo, aqui denominada como não modificada, para modificação adicional da mesma propriedade ou de uma propriedade diferente. Os exemplos de polipéptidos de FVII modificados conhecidos na especialidade incluem qualquer polipéptido de FVII descrito em, por exemplo, patentes U.S. N2 5580560, 6017882, 6693075, 6762286 e 6806063, publicações de patente U.S. N2 20030100506 e 20040220106 e publicações de patente internacional N2 WO1988010295, WO200183725, W02003093465, WO200338162, W02004083361, W020041087 63, W02004029090, W02004029091, W02004111242 e W02 005123916.
Tal como aqui usado, "polipéptidos de fator VII modificados" e "fator VII modificado" refere-se a um polipéptido de FVII que tem um ou mais aminoácidos diferentes comparativamente a um polipéptido de fator VII não modificado. As diferenças num ou mais aminoácidos podem ser mutações de aminoácidos, tal como uma ou mais permuta (substituições), inserções ou deleções de aminoácidos ou podem ser inserções ou deleções de domínios completos e quaisquer suas combinações. Tipicamente, um polipéptido de FVII modificado tem uma ou mais modificações na sequência primária comparativamente a um polipéptido de FVII não modificado. Por exemplo, proporciona-se aqui um polipéptido de FVII modificado que pode ter 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 30, 40, 50 ou mais aminoácidos diferentes comparativamente a um polipéptido de FVII não modificado. Abrange-se qualquer modificação, desde que o polipéptido resultante apresente pelo menos uma atividade de FVII associada a um polipéptido de FVII nativo, tal como, por exemplo, atividade catalítica, atividade proteolítica, capacidade de se ligar a TF ou capacidade de se ligar a plaquetas ativadas.
Tal como aqui usado, "inibidores de coagulação" refere-se a proteínas ou moléculas que atuam para inibir ou evitar coagulação ou formação de coágulo. A inibição ou prevenção de coagulação pode ser verificada in vivo ou in vitro e pode ser ensaiada usando qualquer método conhecido na especialidade, incluindo ensaio de tempo de pró-tromboplastina (PT) ou o ensaio de tempo de tromboplastina parcial ativada (aPTT), não se lhes limitando.
Tal como aqui usado, inibidor de via de fator tecidular (TFPI, também denominado TFPI-1) é um inibidor do tipo Kunitz que está envolvido na formação de um complexo de inibição quaternário TF/FVIIa/TFPI/FXa no qual a atividade de FVIIa é inibida. TFPI é expresso como duas formas precursoras diferentes após splicing alternativo, os precursores TFPla (SEQ ID NO:7 5) e TFPI (SEQ ID NO:77), que são clivados durante a excreção para gerar uma proteína de 276 aminoácidos (SEQ ID NO: 76) e uma proteína madura de 223 aminoácidos (SEQ ID NO:78), respetivamente. TFPI contém 3 domínios Kunitz, dos quais o domínio Kunitz-1 é responsável pela ligação e inibição de FVIIa.
Tal como aqui usado, TFPI-2 (também denominado proteína 5 de placenta (PP5) e inibidor de serina protease associada a matriz (MSPI)) refere-se a um homólogo de TFPI. A proteína TFPI-2 madura de 213 aminoácidos (SEQ ID NO:79) contém três domínios do tipo Kunitz que apresentam 43%, 35% e 53% de identidade de sequência primária com os domínios 1, 2 e 3 do tipo Kunitz de TFPI-1, respetivamente. TFPI-2 desempenha um papel na regulação da digestão e remodelação da matriz extracelular e pensa-se que não é um fator importante na via de coagulação.
Tal como aqui usado, antitrombina III (AT-III) é um inibidor de serina protease (serpina). AT-III é sintetizada como uma proteína precursora contendo 464 resíduos de aminoácidos (SEQ ID NO:95) que é clivada durante excreção para libertar uma antitrombina madura de 432 aminoácidos (SEQ ID NO: 9 6) .
Tal como aqui usado, cofatores refere-se a proteínas ou moléculas que se ligam a outras proteínas ou moléculas específicas para formar um complexo ativo. Em alguns exemplos é necessária a ligação a um cofator para atividade proteolítica ótima. Por exemplo, o fator tecidular (TF) é um cofator de FVIIa. A ligação de FVIIa a TF induz alterações conformacionais que resultam numa atividade proteolítica de FVIIa aumentada para os seus substratos, FX e FIX.
Tal como aqui usado, fator tecidular (TF) refere-se a uma glicoproteína transmembranar de 263 aminoácidos (SEQ ID NO:97) que funciona como um cofator para FVIIa. É expressa constitutivamente por células de músculo-liso e fibroblastos e ajuda a iniciar a coagulação por ligação a FVII e FVIIa, quando estas células entram em contacto com o fluxo sanguíneo após lesão dos tecidos.
Tal como aqui usado, plaqueta ativada refere-se a uma plaqueta que foi estimulada pela ligação de moléculas tais como colagénio, tromboxano A2, ADP e trombinha, para sofrer várias alterações na morfologia, fenótipo e função, que finalmente promove, coagulação. Por exemplo, uma plaqueta ativada muda a sua forma para uma forma mais amorfa com dedos protuberantes. As plaquetas ativadas também podem sofrer uma "viragem" da membrana celular de modo que a fosfatidilserina e outros fosfolípidos carregados negativamente, que estão normalmente presentes na camada interior da membrana celular, são translocados para a superfície exterior orientada para o plasma. Estas membranas das plaquetas ativadas proporcionam a superfície na qual ocorrem muitas das reações da cascata de coagulação. As plaquetas ativadas também excretam vesículas contendo fatores pró-coagulantes, tais como vWF, FV, trombina, ADP e tromboxano A2, e aderem umas às outras para formar um tampão de plaquetas que é estabilizado por fibrina para se tornar um coágulo.
Tal como aqui usado, ligação e/ou afinidade aumentada para plaquetas ativadas e quaisquer suas variações gramaticais refere-se a uma capacidade aumentada de um polipéptido ou proteína, por exemplo um polipéptido de FVII, se ligar à superfície de uma plaqueta ativada, comparativamente ao polipéptido ou proteína de referência. Por exemplo, a capacidade de um polipéptido de FVII modificado se ligar a plaquetas ativadas pode ser maior do que a capacidade do polipéptido de FVII não modificado se ligar a plaquetas ativadas. A ligação e/ou afinidade de um polipéptido para plaquetas ativadas pode ser aumentada pelo menos cerca de 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 200%, 300%, 400%, 500% ou mais comparativamente à ligação e/ou afinidade de um polipéptido não modificado. Os ensaios para determinar a ligação e/ou afinidade de um polipéptido para plaquetas ativadas são conhecidos na especialidade. A ligação de um polipéptido de FVII a plaquetas ativadas é mediada através da interação de aminoácidos no domínio Gla do polipéptido de FVII e fosfolípidos carregados negativamente, tal como fosfatidilserina, na plaqueta ativada. Como tal, os métodos para ensaiar a ligação de polipéptidos, tal como polipéptidos de FVII, a plaquetas ativadas usam membranas e vesículas que contêm fosfolípidos, tal como fosfatidilserina. Por exemplo, a capacidade de um polipéptido se ligar a uma plaqueta ativada é refletida pela capacidade do polipéptido se ligar a vesículas de fosfolípidos, que pode ser medida por técnicas de dispersão de luz.
Tal como aqui usado, ligação e/ou afinidade aumentada para fosfolípidos e quaisquer suas variações gramaticais, refere-se a uma capacidade melhorada de um polipéptido ou proteína se ligar a fosfolípidos, comparativamente a um polipéptido ou proteína de referência. Os fosfolípidos podem incluir quaisquer fosfolípidos, mas incluem especificamente fosfatidilserina. A ligação e/ou afinidade de um polipéptido para fosfolípidos pode ser aumentada pelo menos cerca de 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 200%, 300%, 400%, 500% ou mais comparativamente à ligação e/ou afinidade de um polipéptido não modificado. Os ensaios para determinar a afinidade e/ou ligação de um polipéptido a fosfolípidos são conhecidos na especialidade. Por exemplo, a ligação de polipéptido de FVII a vesículas de fosfolípidos pode ser determinada pela dispersão de luz relativa a 90° da luz incidente. Mede-se a intensidade de dispersão de luz das vesículas de fosfolípidos sozinhas e das vesículas de fosfolípidos com FVII, para determinar a constante de dissociação. Também se pode usar ressonância plasmónica de superfície, tal como um instrumento de biossensor BIAcore para medir a afinidade de polipéptidos de FVII para membranas de fosfolípidos.
Tal como aqui usado, resistência aumentada a inibidores ou "resistência aumentada a AT-III" ou "resistência aumentada a TFPI" refere-se a qualquer quantidade de sensibilidade diminuída de um polipéptido aos efeitos de inibição de um inibidor, tal como AT-III ou TFPI, comparativamente a um polipéptido de referência, tal como um polipéptido de FVII não modificado. A resistência aumentada a um inibidor, tal como AT-III, pode ser ensaiada por avaliação da ligação de um polipéptido de FVII modificado a um inibidor. A resistência aumentada a um inibidor, tal como AT-III, também pode ser ensaiada por medição da atividade intrínseca ou atividade coagulante de um polipéptido de FVII na presença de AT-III. Os ensaios para determinar a ligação de um polipéptido a um inibidor são conhecidos na especialidade. Para inibidores covalentes, tal como por exemplo AT-III, pode medir-se uma constante de velocidade de segunda ordem. Para inibidores não covalentes, tal como por exemplo TFPI, pode medir-se um k±. Além disso, também se pode usar ressonância plasmónica de superfície, tal como num instrumento de biossensor BIAcore, para medir a ligação de polipéptidos de FVII a AT-III ou outros inibidores. Contudo, para inibidores covalentes, tal como AT-III, apenas se pode medir uma velocidade de ligação usando BIAcore. Os ensaios para determinar o efeito de inibição de, por exemplo, AT-III na atividade coagulante ou atividade intrínseca de FVII são também conhecidos na especialidade. Por exemplo, pode medir-se a capacidade de um polipéptido de FVII modificado clivar o seu substrato FX na presença ou na ausência de AT-III e determinar-se o grau em que AT-III inibe a reação. Tal pode ser comparado à capacidade de um polipéptido de FVII não modificado clivar o seu substrato FX na presença ou ausência de AT-III. Um polipéptido modificado que apresenta resistência aumentada a um inibidor apresenta, por exemplo, um aumento de 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100%, 200%, 300%, 400%, 500% ou mais de resistência aos efeitos de um inibidor comparativamente a um polipéptido não modificado.
Tal como aqui usado, "resistência aumentada a inibição por Zn2+", "resistência aumentada aos efeitos de inibição de Zn2+" ou "resistência aumentada a Zn2+" refere-se a qualquer quantidade de diminuição de sensibilidade de um polipéptido aos efeitos de inibição de Zn2+, comparativamente a um polipéptido de referência, tal como um polipéptido de FVII não modificado. A resistência aumentada a Zn2+ pode ser ensaiada, por exemplo, por medição da atividade intrínseca ou atividade coagulante de um polipéptido de FVII na presença de Zn2+, tal como descrito no exemplo 11. A resistência aumentada aos efeitos de inibição de Zn2+ pode resultar de ligação diminuída a Zn2+. A ligação diminuída a Zn2+ pode ser ensaiada por medição da quantidade de Zn2+ ligado por molécula de FVIIa ou por medição da afinidade de ligação de Zn2+ a FVIIa ou por medição de um IC50 para inibição de uma atividade de FVIIa por zinco. Um polipéptido modificado que apresenta resistência aumentada aos efeitos de inibição de Zn2+ apresenta, por exemplo, um aumento de 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 91 %, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100%, 200%, 300%, 400%, 500% ou mais de resistência aos efeitos de Zn2+, comparativamente a um polipéptido não modificado.
Tal como aqui usado, uma sequência de ligação a albumina de soro refere-se a uma sequência de resíduos de aminoácidos que pode efetuar ligação a albumina de soro. Assim, quando inserida num polipéptido de FVII, a sequência de ligação a albumina de soro pode melhorar a afinidade ou ligação a albumina de soro do polipéptido de FVII. A capacidade do polipéptido de FVII modificado contendo a sequência de ligação a albumina de soro pode portanto apresentar ligação e/ou afinidade aumentada para albumina de soro. Um polipéptido modificado que apresenta ligação e/ou afinidade aumentada para albumina de soro apresenta, por exemplo, um aumento de 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 91 %, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100%, 200%, 300%, 400%, 500% ou mais comparativamente à ligação e/ou afinidade de um polipéptido não modificado. Tipicamente, as sequências de ligação a albumina de soro contêm pelo menos 10 ou mais aminoácidos, tipicamente 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20, 30, 40 ou mais aminoácidos. Os exemplos de sequências de ligação a albumina de soro são as apresentadas em SEQ ID NOS:103-109.
Tal como aqui usado, uma sequência de ligação a integrina iib 3 de plaquetas refere-se a uma sequência de residuos de aminoácidos que pode efetuar ligação a uma integrina nb 3 de plaquetas. Assim, quando inserida num polipéptido de FVII, a sequência de ligação a integrina nb 3 de plaquetas pode
melhorar a capacidade do polipéptido de FVII se ligar a integrina nb 3 de plaquetas e portanto a plaquetas incluindo plaquetas ativadas. A capacidade do polipéptido de FVII modificado contendo a sequência de ligação a integrina nb 3 de plaquetas pode então apresentar ligação e/ou afinidade aumentada para integrina nb 3 de plaquetas e/ou a plaquetas.
Um polipéptido modificado que apresenta ligação e/ou afinidade aumentada para integrina nb 3 de plaquetas apresenta, por exemplo, um aumento de 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 91 %, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100%, 200%, 300%, 400%, 500% ou mais comparativamente à ligação e/ou afinidade de um polipéptido não modificado. Tipicamente, as sequências de ligação a integrina nb 3 de plaquetas contêm pelo menos 5 ou mais aminoácidos, tipicamente 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20, 30, 40 ou mais aminoácidos. Os exemplos de sequências de ligação a integrina ia 3 de plaquetas são os apresentados em SEQ ID NOS:110-112.
Tal como aqui usado, um local de glicosilação refere-se a uma posição amino num polipéptido à qual se pode ligar uma parte de hidrato de carbono. Tipicamente, uma proteína glicosilada contém um ou mais resíduos de aminoácidos, tal como asparagina ou serina, para a ligação de partes de hidratos de carbono.
Tal como aqui usado, um local de glicosilação nativo refere-se a uma posição amino à qual se liga uma parte de hidrato de carbono num polipéptido de tipo selvagem. Existem quatro locais de glicosilação nativos em FVII; dois locais de glicosilação em N, em N145 e N322 e dois locais de glicosilação em 0, em S52 e S60, correspondente a posições de aminoácidos no polipéptido de FVII maduro apresentado em SEQ ID NO:3.
Tal como aqui usado, um local de glicosilação não nativo refere-se a uma posição amino à qual se liga uma parte de hidrato de carbono num polipéptido modificado que não se encontra presente num polipéptido de tipo selvagem. Podem introduzir-se locais de glicosilação não nativos num polipéptido de FVII por substituição de aminoácido. Os locais de glicosilação em 0 podem ser criados, por exemplo, por substituição de aminoácido de um resíduo nativo por uma serina ou treonina. Os locais de glicosilação em N podem ser criados, por exemplo, estabelecendo o motivo Asn-Xaa-Ser/Thr/Cys, em que Xaa não é prolina. A criação desta sequência consensual por modificação de aminoácidos pode envolver, por exemplo, uma única substituição de aminoácido de um resíduo de aminoácido nativo por uma asparagina, uma única substituição de aminoácido de um resíduo de aminoácido nativo por uma serina, treonina ou cisteína ou por uma substituição dupla de aminoácido envolvendo uma primeira substituição de aminoácido de um resíduo nativo por uma asparagina e uma segunda substituição de aminoácido do resíduo nativo por uma serina, treonina ou cisteína.
Tal como aqui usado, "atividade biológica" refere-se às atividades in vivo de um composto ou respostas fisiológicas que resultam da administração in vivo de um composto, composição ou outra mistura. Assim, atividade biológica abrange efeitos terapêuticos e atividade farmacêutica de tais compostos, composições e misturas. As atividade biológicas podem ser verificadas em sistemas in vitro concebidos para ensaiar ou usar tais atividades. Assim, para os objetivos aqui, uma atividade biológica de um polipéptido de FVII abrange a atividade coagulante.
Tal como aqui usada pretende-se que a expressão "avaliar", e suas variações gramaticais, incluam determinação quantitativa e qualitativa, no sentido de obter um valor absoluto da atividade de um polipéptido e também de obter um índice, razão, percentagem, visualização ou outro valor indicativo do nível da atividade. A avaliação pode ser direta ou indireta. Por exemplo, a detecção de clivagem de um substrato por um polipéptido pode ser por medida direta do produto ou pode ser medida indiretamente por determinação da atividade resultante do substrato clivado.
Tal como aqui usado, "numeração de quimiotripsina" refere-se à numeração de aminoácidos de um polipéptido de quimiotripsina madura de SEQ ID NO:80. Pode efetuar-se alinhamento de um domínio de protease de outra protease, tal como por exemplo do domínio de protease de fator VII, com quimiotripsina. Em tal circunstância, os aminoácidos de fator VII que correspondem a aminoácidos de quimiotripsina são indicados pela numeração dos aminoácidos de quimiotripsina. As posições correspondentes podem ser determinadas por tal alinhamento por um perito na especialidade usando alinhamentos manuais ou usando os numerosos programas de alinhamento disponíveis (por exemplo, BLASTP). As posições correspondentes também se podem basear em alinhamentos estruturais, por exemplo usando alinhamentos da estrutura proteica simulados computacionalmente. A citação de quais aminoácidos de um polipéptido correspondem a aminoácidos numa sequência divulgada, refere-se a aminoácidos identificados por alinhamento do polipéptido com a sequência divulgada, para maximizar identidade ou homologia (em que os aminoácidos conservados estão alinhados) usando uma algoritmo de alinhamento padrão, tal como o algoritmo GAP. Apresentam-se na tabela 1 os números correspondentes a quimiotripsina de posições de aminoácidos 1 a 406 do polipéptido de FVII apresentado em SEQ ID NO:3. As posições de aminoácidos relativas à sequência apresentada em SEQ ID NO:3 estão em tipo de letra normal, os resíduos de aminoácidos nessas posições estão em negrito e os números de quimiotripsina correspondentes estão em itálico. Por exemplo, por alinhamento do fator VII maduro (SEQ ID NO:3) com quimiotripsina madura (SEQ ID NO:80), à isoleucina (I) na posição de aminoácidos 153 em fator VII é atribuída a numeração de quimiotripsina de 116.
Os aminoácidos subsequentes são numerados em conformidade. Num exemplo, um ácido glutâmico (E) na posição de aminoácidos 210 do fator VII maduro (SEQ ID NO:3) corresponde à posição de aminoácidos E70 com base na numeração de quimiotripsina. Quando existe um resíduo numa protease, mas não se encontra presente em quimiotripsina, atribui-se uma notação de letra ao resíduo de aminoácido. Por exemplo, os resíduos na quimiotripsina que são parte de uma ansa com o aminoácido 60 com base na numeração de quimiotripsina, mas que são inseridos na sequência de fator VII comparativamente a quimiotripsina, denominam-se, por exemplo, K60a, 160b, K60c ou N60d. Estes resíduos correspondem a K197, 1198, K199 e N200, respetivamente, pela numeração relativa à sequência de fator VII maduro (SEQ ID NO:3).
Tal como aqui usado, ácidos nucleicos incluem ADN, ARN e seus análogos, incluindo ácidos nucleicos peptídicos (PNA) e suas misturas. Os ácidos nucleicos podem ser em cadeia simples ou em cadeia dupla. Em referência a sondas ou iniciadores, que podem ser marcados opcionalmente, tal como com um marcador detetável, tal como um marcador fluorescente ou radioquímico, abrangem-se moléculas em cadeia simples. Tais moléculas têm tipicamente um comprimento tal, que o seu alvo é estatisticamente único ou de baixo número de cópias (tipicamente menos de 5, em geral menos de 3) para sondar ou iniciar uma biblioteca. Em geral uma sonda ou iniciador contém pelo menos 14, 16 ou 30 nucleótidos contíguos de sequência complementar ou idêntica à de um gene de interesse. As sondas e iniciadores podem ter 10, 20, 30, 50, 100 ou mais ácidos nucleicos de comprimento.
Tal como aqui usado, um péptido refere-se a um polipéptido que tem de 2 a 40 aminoácidos de comprimento.
Tal como aqui usado, os aminoácidos que ocorrem nas várias sequências de aminoácidos aqui proporcionadas são identificados de acordo com as suas abreviaturas conhecidas de três letras ou de uma letra (tabela 2) . Os nucleótidos que ocorrem no vários fragmentos de ácido nucleico são denominados pelas denominações padrão de uma letra usadas rotineiramente na especialidade.
Tal como aqui usado, um "aminoácido" é um composto orgânico contendo um grupo amino e um grupo de ácido carboxílico. Um polipéptido contém dois ou mais aminoácidos. Para os objetivos aqui, os aminoácidos incluem os vinte aminoácidos de ocorrência natural, aminoácidos não naturais e análogos de aminoácidos (i.e., aminoácidos em que o carbono tem uma cadeia lateral).
De acordo com a nomenclatura de polipéptidos padrão descrita em J. Biol. Chem., 243: 3552-3559 (1969) e adotada em 37 C.F.R..§§ 1.821-1.822, as abreviaturas para os resíduos de aminoácidos apresentam-se na tabela 2:
Deve salientar-se que todos os resíduos de sequências de aminoácidos aqui representados pelas fórmulas têm uma orientação da esquerda para a direita na direção convencional do terminal amino para o terminal carboxilo. Adicionalmente, a expressão "resíduo de aminoácido" é definida largamente para incluir os aminoácidos listados na tabela de correspondências (tabela 2) e aminoácidos modificados e pouco usuais, tal como os referidos em 37 C.F.R. §§ 1.821-1.822 e aqui incorporados por referência. Adicionalmente, deve salientar-se que um traço no início ou no fim de um resíduo de sequência de aminoácidos indica uma ligação peptídica a uma sequência adicional de um ou mais resíduos de aminoácidos, a um grupo terminal amino, tal como NH2, ou a um grupo terminal carboxilo, tal como COOH.
Tal como aqui usado, um "aminoácido hidrofóbico" inclui qualquer um dos aminoácidos que são classificados como hidrofóbicos usando a escala consensual de hidrofobicidade de Eisenberg. Os exemplos são os aminoácidos hidrofóbicos de ocorrência natural, tal como isoleucina, fenilalanina, valina, leucina, triptofano, metionina, alanina, glicina, cisteína e tirosina (Eisenberg et al. , (1982) Faraday Symp. Chem. Soc. 17:109-120). Incluem-se também os aminoácidos hidrofóbicos de ocorrência não natural.
Tal como aqui usado, um "aminoácido ácido" inclui, de entre os aminoácidos de ocorrência natural, os resíduos de ácido aspártico e de ácido glutâmico. Também se incluem aminoácidos ácidos de ocorrência não natural.
Tal como aqui usado, "aminoácidos de ocorrência natural" refere-se aos 20 L-aminoácidos que ocorrem em polipéptidos.
Tal como aqui usado, "aminoácido não natural" refere-se a um composto orgânico contendo um grupo amino e um grupo carboxílico, que não é um dos aminoácidos de ocorrência natural listados na tabela 2. Os aminoácidos de ocorrência não natural incluem assim, por exemplo, aminoácidos ou análogos de aminoácidos diferentes dos 20 aminoácidos de ocorrência natural e incluem os isoestereómeros D de aminoácidos, não se lhes limitando. Os exemplos de aminoácidos não naturais são conhecidos dos peritos na especialidade e podem ser incluídos num polipéptido de fator VII modificado.
Tal como aqui usado, uma construção de ADN é uma molécula de ADN em cadeia simples ou dupla, linear ou circular, que contém segmentos de ADN combinados e justapostos de uma forma que não se encontra na natureza. As construções de ADN existem em resultado de manipulação humana e incluem clones e outras cópias de moléculas manipuladas.
Tal como aqui usado, um segmento de ADN é uma parte de uma molécula de ADN maior com características específicas. Por exemplo, um segmento de ADN que codifica um determinado polipéptido é uma parte de uma molécula de ADN mais comprida, tal como um plasmídeo ou fragmento de plasmídeo que, quando é lido no sentido 5' para 3' , codifica a sequência de aminoácidos do polipéptido especifico.
Tal como aqui usada, a expressão polinucleótido significa um polímero de bases de desoxirribonucleótidos ou de ribonucleótidos em cadeia simples ou dupla, lido da extremidade 5' para a 3' .Os polinucleótidos incluem ARN e ADN e podem ser isolados de fontes naturais, sintetizados in vitro ou preparados a partir de uma combinação de moléculas naturais e sintéticas. 0 comprimento de uma molécula de polinucleótido é aqui apresentado em termos de nucleótidos (abreviatura "nt") ou pares de bases (abreviatura "pb"). A expressão nucleótidos é usada para moléculas em cadeia simples e em cadeia dupla, quando o contexto assim o permite. Quando a expressão é aplicada a moléculas em cadeia dupla, é usada para referir comprimento completo e deve ser interpretada com sendo equivalente à expressão pares de bases. Será reconhecido pelos peritos na especialidade que as duas cadeias de um polinucleótido em cadeia dupla podem diferir ligeiramente no comprimento e que portanto as suas extremidades podem estar em zigzag; assim nem todos os nucleótidos dentro de uma molécula de polinucleótido em cadeia dupla têm de estar emparelhados. Tais extremidades não emparelhadas em geral não ultrapassam 20 nucleótidos de comprimento.
Tal como aqui usado, "sequência primária" refere-se à sequência de resíduos de aminoácidos num polipéptido.
Tal como aqui usado, "similaridade" entre duas proteínas ou ácidos nucleicos refere-se à semelhança entre as sequências de aminoácidos das proteínas ou entre as sequências de nucleótidos dos ácidos nucleicos. A similaridade pode basear-se no grau de identidade e/ou homologia de sequências de resíduos e nos resíduos nelas contidos. Os métodos para avaliar o grau de similaridade entre proteínas ou ácidos nucleicos são conhecidos dos peritos na especialidade. Por exemplo, num método de avaliar similaridade de sequência, alinham-se duas sequências de aminoácidos ou de nucleótidos de maneira a obter um nível máximo de identidade entre as sequências. A "identidade" refere-se à extensão na qual as sequências de aminoácidos ou de nucleótidos são invariantes. 0 alinhamento de sequências de aminoácidos e, em alguns casos, de sequências de nucleótidos, também pode ter em consideração diferenças conservativas e/ou substituições de aminoácidos (ou de nucleótidos) frequentes. As diferenças conservativas são as que preservam as propriedades fisico-quimicas dos resíduos envolvidos. Os alinhamentos podem ser globais (alinhamento das sequências comparadas ao longo de todo o comprimento das sequências e incluindo todos os resíduos) ou locais (o alinhamento de uma parte das sequências que apenas inclui a região ou regiões mais similares).
Tal como aqui usadas, as expressões "homologia" e "identidade"" são usadas indiferentemente, mas homologia para proteínas pode incluir alterações de aminoácidos conservativas. Em geral para identificar posições correspondentes, alinham-se as sequências de aminoácidos de modo a obter a maior ordem de correspondência (consultar, e.g.: Computational Molecular Biology, Lesk, A.M., ed., Oxford University Press, New York, 1988; Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D.W., ed., Academic Press, New York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Part I, Griffin, A.M. e Griffin, H.G., ed., Humana Press, New Jersey, 1994; Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press, 1987; e Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. e Devereux, J., ed., M Stockton Press, New York, 1991; Carillo et al. (1988) SIAM J Applied Math 48:1073).
Tal como aqui usado, "identidade de sequência" refere-se ao número de aminoácidos (ou bases de nucleótidos) idênticos numa comparação entre um polipéptido ou polinucleótido de ensaio e um de referência. Os polipéptidos homólogos referem-se a um número predeterminado de resíduos de aminoácidos idênticos ou homólogos. A homologia inclui substituições de aminoácidos conservativas, bem como resíduos idênticos. A identidade de sequência pode ser determinada por programas de algoritmos de alinhamento padrão usados com as penalizações por falhas por omissão estabelecidas por cada fornecedor. As moléculas de ácido nucleico homólogas referem-se a um número predeterminado de nucleótidos idênticos ou homólogos. A homologia inclui substituições que não alteram o aminoácido codificado (i.e., "substituições silenciosas"), bem como resíduos idênticos. As moléculas de ácido nucleico substancialmente homólogas hibridam tipicamente em condições de rigor moderado ou de elevado rigor em todo o comprimento do ácido nucleico ou ao longo de pelo menos 70%, 80% ou 90% da molécula de ácido nucleico completa de interesse. Também se abrangem moléculas de ácido nucleico que contêm codões degenerados, em vez dos codões na molécula de ácido nucleico com que hibridam. (Para determinação de homologia de proteínas, os aminoácidos conservatives podem ser alinhados, bem como aminoácidos idênticos; neste caso a percentagem de identidade e percentagem de homologia são diferentes). Se quaisquer duas moléculas de ácido nucleico têm sequências de nucleótidos (ou quaisquer dois polipéptidos têm sequências de aminoácidos) que são pelo menos 80%, 85%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% "idênticas" pode ser determinado usando algoritmos de computador conhecidos, tais como o programa "FAST A", usando por exemplo, os parâmetros por omissão como em Pearson et al. Proc. Natl. Acad. Sei. USA 85: 2444 (1988) (outros programas incluem o pacote de programas GCG (Devereux, J., et al., Nucleic Acids Research 12(1): 387 (1984)), BLASTP, BLASTN, FASTA (Atschul, S.F., et al., J. Molec. Biol. 215:403 (1990); Guide to Huge Computers, Martin J. Bishop, ed., Academic Press, San Diego (1994) e Carillo et al. SIAM J Applied Math 48: 1073 (1988)) . Por exemplo, pode usar-se a função BLAST da base de dados de National Center for Biotechnology Information para determinar a identidade. Outros programas disponíveis comercial ou publicamente incluem o programa DNAStar "MegAlign" (Madison, WI) e o programa "Gap" de University of Wisconsin Genetics Computer Group (UWG) (Madison WI)) . A percentagem de homologia ou de identidade de proteínas e/ou moléculas de ácido nucleico pode ser determinada, por exemplo, por comparação da informação de sequência, usando um programa de computador GAP (e.g., Needleman et al. J. Mol. Biol. 48: 443 (1970), tal como revisto por Smith e Waterman (Adv. Appl. Math. 2: 482 (1981)) . Sucintamente, um programa GAP define similaridade como o número de símbolos alinhados (i.e., nucleótidos ou aminoácidos) que são similares, dividido pelo número total de símbolos na mais curta das duas sequências. Os parâmetros por omissão para o programa GAP podem incluir: (1) uma matriz de comparação unária (contendo um valor de 1 para identidades e 0 para não identidades) e a matriz de comparação ponderada de
Gribskov et al. Nucl. Acids Res. 14: 6745 (1986), tal como descrita por Schwartz e Dayhoff, ed., Atlas of Protein Sequence and Structure, National Biomedical Research Foundation, p. 353-358 (1979); (2) uma penalização de 3,0 para cada falha e uma penalização adicional de 0,10 para cada símbolo em cada falha; e (3) nenhuma penalização para falhas nas extremidades.
Assim, tal como aqui usada, a expressão "identidade" representa uma comparação entre um polipéptido ou polinucleótido de ensaio e um de referência. Num exemplo não limitativo, "pelo menos 90% idêntico a" refere-se a uma percentagem de identidade de 90 a 100% relativamente aos polipéptidos de referência. A identidade a um nível de 90% ou mais é indicativa do facto de, assumindo para propósitos de exemplificação um comprimento de 100 aminoácidos para o polinucleótido de ensaio e de referência a serem comparados, não mais de 10% (i.e., 10 em 100) dos aminoácidos no polipéptido de ensaio difere do polipéptido de referência. Podem efetuar-se comparações semelhantes entre polinucleótidos de ensaio e de referência. Tais diferenças podem ser representadas como mutações pontuais distribuídas aleatoriamente ao longo do comprimento total de uma sequência de aminoácidos ou podem estar agregadas numa ou mais localizações de comprimento variável, até um máximo permissível, e.g., diferença de 10/100 aminoácidos (aproximadamente 90% de identidade). As diferenças são definidas como substituições, inserções ou deleções de ácidos nucleicos ou de aminoácidos. Ao nível de homologias ou identidades superiores a cerca de 85-90%, o resultado deveria ser independente do programa e do conjunto de parâmetros de falha; tais níveis elevados de identidade podem ser avaliados facilmente, frequentemente sem recorrer a utilitários de computador.
Tal como aqui usado, deve também entender-se que as expressões "substancialmente idênticas" ou "similares" variam com o contexto, tal como será entendido pelos peritos na especialidade relevante, mas esses peritos podem avaliar tal facto.
Tal como aqui usado, uma sequência alinhada refere-se ao uso de homologia (similaridade e/ou identidade) para alinhar posições correspondentes numa sequência de nucleótidos ou aminoácidos. Tipicamente, duas ou mais sequências que são relacionadas por 50% ou mais de identidade estão alinhadas. Um conjunto de sequências alinhadas refere-se a 2 ou mais sequências que estão alinhadas nas posições correspondentes e podem incluir alinhamento de sequências derivadas de ARN, tal como EST e outros ADNc, alinhados com sequências de ADN genómico.
Tal como aqui usado, "híbrida especificamente" refere-se a hibridação, por emparelhamento de bases complementares, de uma molécula de ácido nucleico (e.g. um oligonucleótido) a uma molécula de ácido nucleico alvo. Os peritos na especialidade estão familiarizados com os parâmetros in vitro e in vivo que afetam a hibridação específica, tal como comprimento e composição da molécula específica. Os parâmetros particularmente relevantes para hibridação in vitro incluem adicionalmente temperatura de hibridação e lavagem, composição de tampão e concentração de sal. São exemplos de condições de lavagem para remover moléculas de ácido nucleico que não estão ligadas especificamente com rigor elevado 0,1 x SSPE, SDS a 0,1%, 65 °C e de rigor moderado 0,2 x SSPE, SDS a 0,1%, 50 °C. São conhecidas na especialidade condições de rigor equivalentes. O perito na especialidade pode ajustar facilmente estes parâmetros para conseguir hibridação específica de uma molécula de ácido nucleico a uma molécula de ácido nucleico alvo adequada para uma determinada aplicação.
Tal como aqui usado, polipéptido ou proteína isolada ou purificada ou sua parte ativa biologicamente encontra-se substancialmente isenta de material celular ou outras proteínas contaminantes da célula ou do tecido do qual a proteína é derivada ou substancialmente isenta de precursores químicos ou outras substâncias químicas, no caso de ser sintetizada quimicamente. Pode determinar-se se as preparações estão substancialmente isentas, caso pareçam isentas de impurezas facilmente detetáveis, tal como determinado por métodos de análise padrão, tal como cromatografia em camada fina (TLC) , electroforese em gel e cromatografia líquida de elevado desempenho (HPLC), usados pelos peritos na especialidade para avaliar tal pureza, ou suficientemente pura de modo que a purificação adicional não altere detectavelmente as propriedades físicas e químicas, tais como atividades proteolítica e biológica da substância. Os métodos para purificação de compostos para produzir compostos substancialmente puros quimicamente são conhecidos dos peritos na especialidade. No entanto, um composto substancialmente puro quimicamente pode ser uma mistura de estereoisómeros. Em tais casos, a purificação adicional pode aumentar a atividade específica do composto. A expressão substancialmente isento de material celular inclui preparações de proteínas nas quais a proteína está separada de componentes celulares das células das quais foi isolada ou produzida recombinantemente. Numa concretização, a expressão substancialmente isento de material celular inclui preparações de proteínas proteases com menos do que cerca de 30% (em peso seco) de proteínas não proteases (também aqui denominadas proteínas contaminantes), em geral menos do que cerca de 20% de proteínas não proteases ou 10% de proteínas não proteases ou menos do que cerca de 5% de proteínas não proteases. Quando a proteína protease ou sua parte ativa é produzida recombinantemente, também se encontra substancialmente isenta de meio de cultura, i.e. o meio de cultura representa menos ou cerca de ou igual a 20%, 10% ou 5% do volume da preparação da proteína protease.
Tal como aqui usada, a expressão substancialmente isenta de precursores químicos ou de outras substâncias químicas inclui preparações de proteínas proteases nas quais a proteína está separada de precursores químicos ou de outras substâncias químicas que estão envolvidas na síntese da proteína. A expressão inclui preparações de proteínas proteases com menos do que cerca de 30% (em peso seco), 20%, 10%, 5% ou menos de precursores químicos ou de substâncias químicas ou componentes não protease.
Tal como aqui usado, a produção por métodos recombinantes por uso de métodos de ADN recombinante refere-se ao uso de métodos bem conhecidos de biologia molecular para expressar proteínas codificadas pelo ADN clonado.
Tal como aqui usado, vetor (ou plasmídeo) refere-se a elementos discretos que são usados para introduzir ácido nucleico heterólogo em células, para a sua expressão ou replicação. Os vetores tipicamente permanecem epissómicos, mas podem ser concebidos para efetuar integração de um gene ou de uma sua parte no cromossoma do genoma. Também se abrangem vetores que são cromossomas artificiais, tais como cromossomas artificiais bacterianos, cromossomas artificiais de levedura e cromossomas artificiais de mamífero. A seleção e uso de tais veículos é bem conhecida dos peritos na especialidade.
Tal como aqui usada, a expressão refere-se ao processo pelo qual o ácido nucleico é transcrito para ARNm e traduzido para péptidos, polipéptidos ou proteínas. Caso o ácido nucleico seja derivado de ADN genómico e caso se selecione uma célula ou organismo hospedeiro eucariótico adequado, a expressão pode incluir processamento, tal como splicing do ARNm.
Tal como aqui usado, um vetor de expressão inclui vetores capazes de expressar ADN que está ligado operacionalmente a sequências de regulação, tais como regiões de promotor, que são capazes de efetuar expressão de tais fragmentos de ADN. Tais segmentos adicionais podem incluir sequências de promotor e de terminação e opcionalmente podem incluir uma ou mais origens de replicação, um ou mais marcadores selecionáveis, um facilitador, um sinal de poliadenilação e semelhantes. Os vetores de expressão são derivados geralmente de um ADN de plasmídeo ou vírico ou podem conter elementos de ambos. Assim, um vetor de expressão refere-se a uma construção de ADN ou ARN recombinante, tal como um plasmídeo, um fago, vírus recombinante ou outro vetor que, por introdução numa célula hospedeira adequada, resulta na expressão do ADN clonado. Os vetores de expressão adequados são bem conhecidos dos peritos na especialidade e incluem os que são replicáveis em células eucarióticas e/ou células procarióticas e os que permanecem epissómicos ou os que se integram no genoma da célula hospedeira.
Tal como aqui usado, o vetor também inclui "vetores de vírus" ou "vetores víricos". Tais vetores víricos são vírus modificados por engenharia genética que são ligados operacionalmente a genes exógenos para transferir (como veículos ou transportadores) os genes exógenos para células.
Tal como aqui usado, um adenovirus refere-se a qualquer elemento do grupo de virus que contêm ADN que causam conjuntivite e infeções do trato respiratório superior em humanos.
Tal como aqui usado, o ADN nu refere-se a ADN isento de histona, que pode ser usado para vacinas e terapia génica. 0 ADN nu é o material genético que é passado de célula a célula durante um processo de transferência génica denominado transformação ou transfeção. Na transformação ou transfeção, o ADN purificado ou nu que é absorvido pela célula recebedora proporcionará uma nova característica ou fenótipo à célula recebedora.
Tal como aqui usado, ligado operacional ou funcionalmente, relativamente a segmentos de ADN, significa que os segmentos estão arranjados de forma a funcionarem concertadamente para os objetivos pretendidos, e.g., a transcrição tem início no promotor e procede através do segmento de codificação até ao terminador.
Tal como aqui usado, um agente que modula a atividade de uma proteína ou expressão de um gene ou ácido nucleico diminui ou aumenta ou altera de outra forma a atividade da proteína ou de alguma forma regula positiva ou negativamente ou altera de outra forma a expressão do ácido nucleico numa célula.
Tal como aqui usado, uma "proteína quimérica" ou "proteína de fusão" refere-se a um polipéptido ligado operacionalmente a um polipéptido diferente. Uma proteína quimérica ou de fusão aqui proporcionada pode incluir um ou mais polipéptidos de FVII ou uma sua parte e um ou mais outros polipéptidos para qualquer um ou mais sinais de controlo de transcrição/tradução, sequências de sinalização, um marcador para localização, um marcador para purificação, parte de um domínio de uma imunoglobulina G e/ou de um agente de direção ao alvo. Um polipéptido de FVII quimérico também inclui os que têm os seus domínios endógenos ou regiões do polipéptido permutados por outro polipéptido. Estas proteínas quiméricas ou de fusão incluem as produzidas por meios recombinantes como proteínas de fusão, as produzidos por meios químicos, tal como por acoplamento químico através, por exemplo, de acoplamento de grupos sulfidrilo e as produzidas por qualquer outro método em que pelo menos um polipéptido (i.e. FVII) ou uma sua parte está ligada, direta ou indiretamente através de ligante(s) a outro polipéptido.
Tal como aqui usado, ligada operacionalmente, quando relativo a uma proteína de fusão refere-se a um polipéptido protease e um polipéptido não protease que estão fundidos em quadro um com o outro. 0 polipéptido não protease pode ser fundido no terminal N ou no terminal C do polipéptido protease.
Tal como aqui usado, um agente de direção ao alvo é qualquer parte, tal como uma proteína ou sua parte eficaz, que proporciona ligação específica a uma molécula de superfície celular, tal como um receptor de superfície celular, que em alguns casos pode internalizar um conjugado ligado ou sua parte. Um agente de direção ao alvo pode também ser um que promove ou facilita, por exemplo, isolamento por afinidade ou purificação do conjugado; ligação do conjugado à superfície; ou detecção do conjugado ou complexos contendo o conjugado.
Tal como aqui usado, derivado ou análogo de uma molécula refere-se a uma parte derivada da molécula ou uma sua versão modificada.
Tal como aqui usado, "doença ou distúrbio" refere-se a uma condição patológica num organismo resultando de causa ou condição incluindo infeções, condições adquiridas, condições genéticas, não se lhes limitando, e caracterizadas por sintomas identificáveis. As doenças e distúrbios de interesse aqui são as que envolvem coagulação, incluindo as mediadas por proteínas de coagulação e aquelas em que as proteínas de coagulação desempenham um papel na etiologia ou patologia. As doenças e distúrbios também incluem as que são causadas pela ausência de uma proteína, tal como em hemofilia, e de particular interesse aqui são as doenças em que não ocorre coagulação devido a uma deficiência por defeito numa proteína de coagulação.
Tal como aqui usado, "pró-coagulante" refere-se a qualquer substância que promove a coagulação sanguínea.
Tal como aqui usado, "anticoagulante" refere-se a qualquer substância que inibe a coagulação sanguínea.
Tal como aqui usado, "hemofilia" refere-se a uma doença hemorrágica causada por uma deficiência em fatores de coagulação sanguínea. A hemofilia pode ser o resultado, por exemplo, de ausência, expressão reduzida ou função reduzida de um fator de coagulação. 0 tipo mais comum de hemofilia é a hemofilia A, que resulta de uma deficiência em fator VIII. 0 segundo tipo mais comum de hemofilia é hemofilia B, que resulta de uma deficiência em fator IX. A hemofilia C, também denominada deficiência em FXI, é uma forma mais branda e menos comum de hemofilia.
Tal como aqui usado, "hemofilia congénita" refere-se a tipos de hemofilia que são herdadas. A hemofilia congénita resulta de mutação, deleção, inserção ou outra modificação de um gene de fator de coagulação, no qual a produção de fator de coagulação está ausente, reduzida ou não funcional. Por exemplo, as mutações hereditárias de genes de fator de coagulação, tal como fator VIII e fator IX resultam nas hemofilias congénitas, hemofilia A e B, respetivamente.
Tal como aqui usado, "hemofilia adquirida" refere-se a um tipo de hemofilia que se desenvolve na idade adulta pela produção de auto-anticorpos que inativam FVIII.
Tal como aqui usado, "doença hemorrágica" refere-se a uma condição na qual o indivíduo tem uma capacidade diminuída para controlar hemorragia. As doenças hemorrágicas podem ser herdadas ou adquiridas e podem resultar, por exemplo, de defeitos ou deficiências na via de coagulação, defeitos ou deficiências na atividade de plaquetas ou defeitos vasculares.
Tal como aqui usado, "doença hemorrágica adquirida" refere-se a doenças hemorrágicas que resultam de deficiências na coagulação causadas por condições tais como doença hepática, deficiência em vitamina K ou terapia com coumadina (varfarina) ou outra terapia anticoagulante.
Tal como aqui usado, "tratar" um indivíduo com uma doença ou condição significa que se administra ao indivíduo um polipéptido, composição ou outro produto aqui proporcionado.
Tal como aqui usado, um agente terapêutico, regime terapêutico, radioprotetor ou quimioterapêutico significa fármacos convencionais e terapias com fármacos, incluindo vacinas que são conhecidas dos peritos na especialidade. Os agentes radioterapêuticos são bem conhecidos na especialidade.
Tal como aqui usado, tratamento significa qualquer maneira pela qual os sintomas de uma condição, distúrbio ou doença são melhorados ou alterados beneficamente de outra forma. Assim, tratamento abrange profilaxia, terapia e/ou cura. Tratamento também abrange qualquer uso farmacêutico das composições aqui. Tratamento também abrange qualquer uso farmacêutico de um FVII modificado e composições aqui proporcionadas.
Tal como aqui usado, a melhoria dos sintomas de uma determinada doença ou distúrbio através de um tratamento, tal como por administração de uma composição farmacêutica ou outro agente terapêutico, refere-se a qualquer diminuição, permanente ou temporária, duradoura ou transitória, dos sintomas que podem ser atribuídos ou associados à administração da composição ou agente terapêutico.
Tal como aqui usado, prevenção ou profilaxia refere-se a métodos nos quais se reduz o risco de desenvolver uma doença ou condição. A profilaxia inclui redução do risco de desenvolver uma doença ou condição e/ou a prevenção de agravamento dos sintomas ou progressão de uma doença ou redução do risco de agravamento de sintomas ou progressão de uma doença.
Tal como aqui usado, uma quantidade eficaz de um composto ou composição para tratar uma determinada doença é uma quantidade que é suficiente para melhorar ou de alguma forma reduzir os sintomas associados à doença. Tal quantidade pode ser administrada como uma dose única ou pode ser administrada de acordo com um regime pelo qual é eficaz. A quantidade pode curar a doença, mas tipicamente é administrada de modo a melhorar os sintomas da doença. Tipicamente, é necessário administração repetida para conseguir a melhoria desejada dos sintomas .
Tal como aqui usado, "quantidade terapeuticamente eficaz" ou "dose terapeuticamente eficaz" refere-se a um agente, material composto ou composição contendo um composto que é pelo menos suficiente para produzir um efeito terapêutico. Uma quantidade eficaz é a quantidade necessária de um agente terapêutico para prevenir, curar, melhorar, parar ou parar parcialmente um sintoma de uma doença ou distúrbio.
Tal como aqui usado, "doente" ou "indivíduo" a ser tratado inclui humanos e ou animais não humanos, incluindo mamíferos. Os mamíferos incluem primatas, tal como humanos, chimpanzés, gorilas e macacos; animais domésticos, tais como cães, cavalos, gatos, porcos, cabras, vacas; e roedores tais como ratinhos, ratos, hamsters e gerbos.
Tal como aqui usado, uma combinação refere-se a qualquer associação entre dois ou mais itens. A associação pode ser espacial ou referir-se ao uso de dois ou mais itens para um objetivo comum.
Tal como aqui usado, uma composição refere-se a qualquer mistura de dois ou mais produtos ou compostos (e.g., agentes, moduladores, reguladores, etc.). Pode ser uma solução, uma suspensão, líquido, pó, uma pasta, formulações aquosas ou não aquosas ou qualquer sua combinação.
Tal como aqui usado, um "artigo de fabrico" é um produto que é produzido e vendido. Tal como usado ao longo deste pedido, pretende-se que a expressão abranja polipéptidos e ácidos nucleicos de protease modificados, contidos em artigos de embalagem.
Tal como aqui usado, fluido refere-se a qualquer composição que pode fluir. Os fluidos abrangem assim composições que estão sob a forma de semissólidos, pastas, soluções, misturas aquosas, géis, loções, cremes e outras tais composições.
Tal como aqui usado, um "kit" refere-se a uma combinação empacotada, incluindo opcionalmente reagentes e outros produtos e/ou componentes para pôr em prática métodos usando os elementos da combinação. Por exemplo, proporcionam-se kits contendo um polipéptido de protease modificado ou molécula de ácido nucleico aqui proporcionados e outro item para um objetivo incluindo administração, diagnóstico e avaliação de uma atividade ou propriedade biológica, não se lhes limitando. Os kits incluem opcionalmente instruções para uso.
Tal como aqui usado, anticorpo inclui fragmentos de anticorpo, tal como fragmentos Fab, que são compostos por uma cadeia leve e a região variável de uma cadeia pesada.
Tal como aqui usado, um receptor refere-se a uma molécula que tem uma afinidade para um ligando em particular. Os receptores podem ser moléculas de ocorrência natural ou sintéticas. Os receptores também se podem denominar na especialidade como anti-ligandos.
Tal como aqui usado, animal inclui qualquer animal, tal como: primatas incluindo humanos, gorilas e macacos; roedores, tais como ratinhos e ratos; aves, tais como galinhas; ruminantes, tais como cabras, vacas, veados, ovelhas; ovinos, tais como porcos e outros animais, não se lhes limitando. Os animais não humanos excluem humanos como o animal contemplado. As proteases aqui proporcionadas são de qualquer fonte, animal, vegetal, procariótica e fúngica.
Tal como aqui usado, terapia génica envolve a transferência de ácido nucleico heterólogo, tal como ADN, para determinadas células, células alvo, de um mamífero, em particular de um humano, com uma doença ou condição para a qual se pretende tal terapia. 0 ácido nucleico, tal como ADN, é introduzido nas células alvo selecionadas, tal como diretamente ou num vetor ou noutro veículo de entrega, de uma forma tal que o ácido nucleico heterólogo, tal como ADN, é expresso e um produto terapêutico por ele codificado é produzido. Alternativamente, o ácido nucleico heterólogo, tal como ADN, pode de alguma forma mediar a expressão de ADN que codifica o produto terapêutico ou pode codificar um produto, tal como um péptido ou ARN que de alguma forma medeia, direta ou indiretamente, a expressão de um produto terapêutico. A terapia génica também pode ser usada para entregar um ácido nucleico que codifica um produto génico que substitui um gene deficiente ou suplementa um produto génico produzido pelo mamífero ou pela célula na qual é introduzido. 0 ácido nucleico introduzido pode codificar um composto terapêutico, tal como uma protease ou protease modificada, que não é normalmente produzido no hospedeiro de mamífero ou que não é produzido em quantidades terapeuticamente eficazes ou numa altura terapeuticamente útil. 0 ácido nucleico heterólogo, tal como ADN, que codifica o produto terapêutico, pode ser modificado antes da introdução nas células do hospedeiro atingido de modo a melhorar ou alterar de outra forma o seu produto ou a sua expressão. A terapia génica pode envolver entrega de um inibidor ou repressor ou outro modulador de expressão génica.
Tal como aqui usado, ácido nucleico heterólogo é um ácido nucleico que não é normalmente produzido in vivo pela célula no qual é expresso ou que é produzido pela célula mas num local diferente ou expresso de forma diferente ou que medeia ou codifica mediadores que alteram a expressão de ácido nucleico endógeno, tal como ADN, afetando a transcrição, tradução ou outros processos bioquímicos reguláveis. 0 ácido nucleico heterólogo geralmente não é endógeno à célula na qual é introduzido, mas foi obtido de outra célula ou preparado sinteticamente. 0 ácido nucleico heterólogo pode ser endógeno, mas é ácido nucleico que é expresso num local diferente ou a sua expressão é alterada. Embora não sendo necessário, geralmente tal ácido nucleico codifica ARN e proteínas que não são normalmente produzidos pela célula ou da mesma forma na célula no qual é expresso. 0 ácido nucleico, tal como ADN, heterólogo também pode ser denominado ácido nucleico, tal como ADN, exógeno. Assim, o ácido nucleico heterólogo ou ácido nucleico exógeno inclui uma molécula de ácido nucleico que não está presente na orientação ou posição exata da molécula de ácido nucleico, tal como ADN, equivalente encontrada no genoma. Também se pode referir como uma molécula de ácido nucleico de outro organismo ou espécie (i.e., exógeno).
Qualquer ácido nucleico, tal como ADN, que um perito na especialidade reconheça ou considere heterólogo ou exógeno à célula no qual o ácido nucleico é expresso é aqui abrangido por ácido nucleico heterólogo; ácido nucleico heterólogo inclui ácido nucleico adicionado exogenamente que também é expresso endogenamente. Os exemplos de ácido nucleico heterólogo incluam ácido nucleico que codifica proteínas marcadoras rastreáveis, tal como uma proteína que confere resistência a fármaco, ácido nucleico que codifica substâncias terapeuticamente eficazes, tais como agentes anticancro, enzimas e hormonas, e ácido nucleico, tal como ADN, que codifica outros tipos de proteínas, tais como anticorpos, não se lhes limitando. Os anticorpos que são codificados por ácido nucleico heterólogo podem ser excretados ou expressos na superfície da célula na qual se introduziu o ácido nucleico heterólogo.
Tal como aqui usado, um produto terapeuticamente eficaz para terapia génica é um produto que é codificado por ácido nucleico heterólogo, tipicamente ADN, que após introdução do ácido nucleico num hospedeiro expressa um produto que melhora ou elimina os sintomas, manifestações de uma doença hereditária ou adquirida ou que cura a doença. Também se incluem moléculas de ácido nucleico biologicamente ativas, tal como ARNi e antissentido.
Tal como aqui usada, a afirmação que um polipéptido "consiste essencialmente" de uma sequência de aminoácidos apresentada, significa que apenas está presente a parte apresentada, ou um seu fragmento, do polipéptido completo. 0 polipéptido pode opcionalmente incluir, e geralmente incluirá, aminoácidos adicionais de outra fonte ou pode ser inserido noutro polipéptido.
Tal como aqui usadas, as formas singulares "um", "uma" e "o", "a" incluem referências no plural salvo se o contexto indica claramente o contrário. Assim, por exemplo, referência a um composto compreendendo "um domínio extracelular" inclui compostos com um ou vários domínios extracelulares.
Tal como aqui usado, as gamas e quantidades podem ser expressas como "cerca de" um determinado valor ou gama. "Cerca de" também inclui a quantidade exata. Assim "cerca de 5 bases" significa "cerca de 5 bases" e também "5 bases".
Tal como aqui usado, "opcional" ou "opcionalmente" significa que o evento ou circunstância descrito subsequentemente ocorre ou não ocorre e que a descrição inclui casos em que o referido evento ou circunstância ocorre e casos em que não ocorre. Por exemplo, um grupo opcionalmente substituído significa que o grupo não é substituído ou é substituído.
Tal como aqui usado, as abreviaturas para quaisquer grupos protetores, aminoácidos e outros compostos são, salvo indicação em contrário, de acordo com o seu uso comum, abreviaturas reconhecidas ou a nomenclatura da Comissão de Bioquímica da IUPAC-IUB (consultar, (1972) Biochem. 11:1726). B. Revisão sobre hemóstase
Proporcionam-se aqui polipéptidos modificados de fator VII (FVII). Tais polipéptidos de FVIII são concebidos para ter atividade coagulante aumentada. Assim, estes polipéptidos têm uma variedade de usos e aplicações, por exemplo, como agentes terapêuticos para modular hemóstase e outros processos biológicos relacionados. Para avaliar as modificações aqui proporcionadas e o uso de tais moléculas de FVII modificadas é vantajoso entender o sistema hemostático e a cascata de coagulação do sangue. A discussão seguinte proporciona tal enquadramento como introdução a uma discussão sobre fator VII e suas modificações. A hemóstase é o mecanismo fisiológico que estanca a hemorragia que resulta de lesão à vasculatura. A hemóstase normal depende de componentes celulares e proteínas plasmáticas solúveis e envolve uma série de eventos de sinalização que levam finalmente à formação de um coágulo sanguíneo. A coagulação é iniciada rapidamente após ocorrência de lesão ao vaso sanguíneo e danificação de células endoteliais. Na fase primária de coagulação, as plaquetas são ativadas para formar um tampão hemostático no local de lesão.
Segue-se hemóstase secundária que envolve fatores de coagulação plasmáticos, que atuam numa cascata proteolítica que resulta na formação de fibras de fibrina que fortalecem o tampão de plaquetas.
Após lesão do vaso, o fluxo sanguíneo na área adjacente à lesão é restringido por constrição vascular, o que permite que as plaquetas adiram ao colagénio fibrilar recém-exposto no tecido conjuntivo subendotelial. Esta adesão depende do fator de von Willebrand (vWF), que se liga ao endotélio no intervalo de 3 segundos após lesão, facilitando assim adesão e aglutinação das plaquetas. A ativação das plaquetas agregadas resulta na excreção de vários fatores, incluindo ADP, ATP, tromboxano e serotonina. São também libertadas moléculas de adesão, fibrinogénio, vWF, trombospondina e fibronectina. Tal excreção promove adesão adicional e aglutinação de plaquetas, ativação de plaquetas aumentada e vasoconstrição e exposição de fosfolipidos aniónicos na superfície das plaquetas, que servem como plataforma para a montagem de complexos enzimáticos de coagulação sanguínea. As plaquetas alteram a forma levando à formação de pseudópodes, o que adicionalmente facilita a aglutinação a outras plaquetas resultando num tampão plaquetário frouxo.
Simultaneamente inicia-se uma cascata de peptidases de coagulação (a cascata de coagulação). A cascata de coagulação envolve uma série de eventos de ativação que envolvem clivagem proteolítica. Em tal cascata, uma proteína inativa de uma serina protease (também denominada zimogénio) é convertida a uma protease ativa por clivagem de uma ou mais ligações peptidicas, que é usada então como a protease ativadora para a molécula de zimogénio seguinte na cascata, resultando finalmente na formação de coágulo pela reticulação de fibrina. Por exemplo, a cascata gera moléculas ativadas, tal como trombina (a partir da clivagem de protrombina), que ativa adicionalmente plaquetas e também gera fibrina a partir da clivagem de fibrinogénio. A fibrina seguidamente forma um polímero reticulado à volta do tampão plaquetário, estabilizando o coágulo. Após reparação da lesão, a fibrina é digerida pelo sistema fibrinolitico, cujos principais componentes são plasminogénio e ativador de plasminogénio do tipo tecido (tPA). Ambas estas proteínas são incorporadas na fibra em polimerização, onde interatuam para gerar plasmina, que por seu lado atua na fibrina para dissolver o coágulo preformado. Durante a formação de coágulo, também circulam no sangue inibidores de fator de coagulação para evitar a formação de coágulo fora do local da lesão.
Descreve-se seguidamente a interação do sistema, desde a lesão à formação de coágulo e subsequente fibrinólise. 1. Adesão e aglutinação de plaquetas A coagulação do sangue é evitada ativamente em condições normais. 0 endotélio vascular suporta vasodilatação, inibe a adesão e ativação de plaquetas, suprime a coagulação, aumenta a clivagem de fibrina e tem um carácter anti-inflamatório. As células endoteliais vasculares excretam moléculas, tais como óxido nitroso (NO) e prostacilina, que inibem a aglutinação de plaquetas e dilatam os vasos sanguíneos. A libertação destas moléculas ativa guanilato ciclases solúveis (sGC) e proteína cinase I dependente de cGMP (cGKI) e aumenta os níveis de guanosina monofosfato cíclico (cGMP), o que causa relaxamento do músculo liso na parede dos vasos. Adicionalmente, as células endoteliais expressam ADPases de superfície celular, tal como CD39, que controlam a ativação e aglutinação de plaquetas por conversão de ADP libertado das plaquetas em inibidores de adenina nucleótidos de plaquetas. 0 endotélio também desempenha um papel importante na regulação das enzimas na cascata fibrinolitica. As células endoteliais promovem diretamente a geração de plasmina através da expressão de receptores de plasminogénio (anexina II) e urocinase, bem como da excreção de ativadores de tipo tecido e de urocinase de plasminogénio, todos promovendo a depuração do coágulo. Numa camada final da regulação pró-trombótica, as células endoteliais desempenham um papel ativo na inibição da cascata de coagulação, produzindo sulfato de heparano, que aumenta a cinética de inibição de trombina e outros fatores de coagulação por antitrombina III.
Contudo, em traumatismo vascular agudo, predominam os mecanismos vasoconstritores e o endotélio assume uma natureza pró-trombótica, pró-coagulatória e pró-inflamatória. Tal é conseguido por uma redução dos agentes dilatadores endoteliais: adenosina, NO e prostaciclina; e a ação direta de ADP, serotonina e tromboxana nas células de músculo liso vascular para desencadear a sua contração (Becker, Heindl et al. . 2000) . 0 principal desencadeador para a alteração na função endotelial que leva à formação de trombos hemostáticos é a perda da barreira celular endotelial entre o sangue e os componentes de matriz extracelular (ECM) (Ruggeri (2002) Nat Med 8:1227-1234) . As plaquetas em circulação identificam e discriminam áreas de lesões endoteliais e aderem ao subendotélio exposto. A sua interação com os vários substratos trombogénicos e agonistas gerados ou libertados localmente resulta na ativação das plaquetas. Este processo é descrito como possuindo dois estágios, 1) adesão: a ligação inicial a uma superfície e 2) aglutinação: a coesão plaqueta-plaqueta (Savage et al. (2001) Curr Opin Hematol 8:270-276). A adesão plaquetária é iniciada quando as plaquetas em circulação se ligam a colagénio exposto, através da interação com proteínas de ligação de colagénio na superfície celular e através da interação com vWF, também presente no endotélio. A proteína vWF tem uma estrutura multimérica de tamanho variável, excretada em duas direções pelo endotélio; basolateralmente e para o fluxo sanguíneo. vWF também se liga a fator VIII, o que é importante na estabilização de fator VIII e na sua sobrevivência na circulação.
Consegue-se adesão de plaquetas e subsequente ativação quando vWF se liga através do seu domínio Al a GPIb (parte do complexo receptor GPIb-IX-V de glicoproteína de plaquetas). A interação entre vWF e GPIb é regulada pela tensão tangencial de modo que um aumento no stress tangencial resulta num aumento correspondente na afinidade de vWF para GPIb. A integrina 1 2, também conhecida nos leucócitos como VLA-2, é o principal receptor de colagénio em plaquetas e o envolvimento através deste receptor gera os sinais intracelulares que contribuem para ativação de plaquetas. A ligação através de 12 facilita o envolvimento do receptor de colagénio de afinidade mais baixa, GP VI. Este faz parte da superfamília de imunoglobulinas e é o receptor que gera os sinais intracelulares mais potentes para ativação de plaquetas. A ativação de plaquetas resulta na libertação de adenosina difosfato (ADP), que é convertido a tromboxano A2. A ativação de plaquetas também resulta na expressão superficial de receptores Ilb-IIIa (GP Ilb-IIIa) de glicoproteina de plaquetas, também denominados integrinas iib 3 de plaquetas. Os receptores GP Ilb-IIIa permitem a aderência de plaquetas entre si (i.e. aglutinação) através de moléculas de fibrinogénio que ligam as plaquetas através destes receptores. Tal resulta na formação de um tampão plaquetário no local de lesão, para ajudar adicionalmente a evitar perda de sangue, enquanto o tecido vascular danificado liberta fatores que iniciam a cascata de coagulação e a formação de uma rede de fibrina estabilizadora em torno do tampão plaquetário. 2. Cascata de coagulação A via de coagulação é uma via proteolítica em que cada enzima se encontra presente no plasma como um zimogénio ou forma inativa. A clivagem do zimogénio é regulada para libertar a forma ativa a partir da molécula precursora. Os cofatores das proteases ativadas, tais como as glicoproteínas FVIII e FV, também são ativadas na reação em cascata e desempenham um papel na formação de coágulo. A via funciona como uma série de circuitos de retroação positiva e negativa que controlam o processo de ativação, em que o objetivo final é produzir trombina, que pode então converter fibrinogénio solúvel em fibrina, para formar um coágulo. Os fatores na coagulação são tipicamente representados com um número em numeração romana, com um "a" minúsculo anexado para indicar a forma ativa. A tabela 3 seguidamente apresenta uma lista de exemplos destes fatores, incluindo o seu nome comum e o seu papel na cascata de coagulação. Em geral, estas proteínas participam na coagulação sanguínea através de uma ou mais das vias de coagulação intrínseca, extrínseca ou comum (consultar a figura 1). Tal como discutido seguidamente, estas vias estão interligadas e pensa-se que a coagulação sanguínea ocorre através de um modelo de ativação baseado em células, em que o fator VII (FVII) é o principal iniciador de coagulação.
*Tabela adaptada de M. W. King (2006) em med.unibs.it/~marchesi/blood.html A geração de trombina tem sido dividida historicamente em três vias, a via intrínseca (que sugere que todos os componentes da via são intrínsecos ao plasma) e extrínseca (que sugere que um ou mais componentes da via são extrínsecos ao plasma) que proporcionam vias alternativas para a geração de fator X ativado (FXa) e a via comum final, que resulta na formação de trombina (figura 1). Estas vias participam conjuntamente num processo interligado e interdependente para efetuar coagulação. Desenvolveu-se um modelo de coagulação baseado em célula que descreve estas vias (figura 2) (Hoffman et al. (2001) Thromb Haemost 85:958-965) . Neste modelo, as vias "extrínseca" e "intrínseca" são efetuadas em diferentes superfícies celulares, as células que apresentam fator tecidular (TF) e as plaquetas, respetivamente. O processo de coagulação é separado em fases distintas, iniciação, amplificação e propagação, durante as quais as vias extrínseca e intrínseca funcionam em vários estágios para produzir o grande aumento súbito de trombina necessário para converter quantidades suficientes de fibrinogénio a fibrina para formação de coágulo. a. Início
Considera-se que FVII é o fator de coagulação responsável pelo início da cascata de coagulação, início esse que é dependente da sua interação com TF. TF é uma glicoproteína transmembranar expressa por uma variedade de células, tais como células de músculo-liso, fibroblastos, monócitos, linfócitos, granulócitos, plaquetas e células endoteliais. As células mielóides e as células endoteliais apenas expressam TF quando são estimuladas, tal como através de citocinas pró-inflamatórias. Contudo, as células de músculo-liso e os fibroblastos expressam TF constitutivamente. Assim, uma vez que estas células entrem em contacto com a corrente sanguínea após lesão de tecidos, a cascata de coagulação é iniciada rapidamente pela ligação de TF a fator VII ou FVIIa no plasma.
Tal como discutido seguidamente, a maior parte do FVII no sangue está na forma de zimogénio, com uma pequena quantidade, aproximadamente 1%, presente como FVIIa. No entanto, na ausência de ligação de TF, mesmo FVIIa tem caracteristicas do tipo zimogénio e não apresenta atividade significativa até estar complexado a TF. Assim, para atividade completa é necessária a ativação de FVII plasmático por clivagem proteolítica e alteração conformacional adicional através da interação com TF. Demonstrou-se que uma gama de proteases, incluindo fatores IXa, Xa, Xlla e trombina, são capazes de clivagem de FVII in vitro, um processo que é acelerado na presença de TF. FVIIa pode ele próprio ativar FVII na presença de TF, um processo denominado auto-ativação. As pequenas quantidades de FVIIa no sangue são provavelmente devidas a ativação por FXa e/ou FIXa (Wildgoose et ai. (1992) Blood 80:25-28 e Butenas et ai. (1996) Biochemistry 35:1904-1910) . Podem assim formar-se complexos TF/FVIIa pela ligação direta de FVIIa a TF ou pela ligação de FVII a TF e seguidamente ativação subsequente de FVII a FVIIa por uma protease plasmática, tal como FXa, FIXa, FXIIa ou o próprio FVIIa. O complexo TF/FVIIa permanece ancorado à célula que apresenta TF, onde ativa pequenas quantidades de FX a FXa, no que é conhecido como a "via extrínseca" de coagulação. O complexo TF/FVIIa também cliva pequenas quantidades de FIX para FIXa. FXa associa-se ao seu cofator FVa para também formar um complexo na célula que apresenta TF, que pode então converter protrombina a trombina. Contudo, a pequena quantidade de trombina produzida é inadequada para sustentar a necessária formação de fibrina para completar a coagulação. Adicionalmente, qualquer FXa e FIXa ativos são inibidos na circulação por antitrombina III (AT-III) e outras serpinas, que são discutidas mais detalhadamente em seguida. Tal evita normalmente a formação de coágulo em circulação. Contudo, na presença de lesão, a danificação da vasculatura resulta em aglutinação e ativação de plaquetas neste local de formação de trombina, permitindo assim a amplificação do sinal de coagulação. b. Amplificação A amplificação ocorre quando a trombina se liga às plaquetas, ativando-as. As plaquetas ativadas libertam FV dos seus grânulos alfa, que é ativado por trombina a FVa. A trombina também liberta e ativa FVIII do complexo FVIII/vWF na membrana das plaquetas e cliva FXI a FXIa. Estas reações geram plaquetas ativadas que têm FVa, FVIIIa e FIXa na sua superfície, que preparam um grande aumento súbito de trombina durante o estágio de propagação. c. Propagação A propagação de coagulação ocorre na superfície de elevado número de plaquetas no local de lesão. Tal como descrito anteriormente, as plaquetas ativadas têm FXIa, FVIIIa e FVa à sua superfície. E aqui que se efetua a via extrínseca. FXIa ativa FIX a FIXa, que pode então ligar-se a FVIIIa. Este processo, além da pequena quantidade de FIXa que é gerada pela clivagem de FIX pelo complexo TF/FVIIa nas células que apresentam TF, gera um elevado número de complexos FXIa/FVIIIa que por seu lado podem ativar quantidades significativas de FX a FXa. As moléculas de FXa ligam-se a FVa para gerar os complexos pró-trombinase que ativam protrombina a trombina. A trombina atua como um circuito de retroação positiva para ativar ainda mais plaquetas e iniciar novamente os processos descritos para a fase de amplificação.
Passado muito pouco tempo, existem números suficientes de plaquetas ativadas com os complexos adequados para gerar a formação súbita de trombina que é suficientemente elevada para gerar quantidades suficientes de fibrina a partir de fibrinogénio, para formar um tampão hemostático de fibrina. 0 fibrinogénio é um dímero solúvel no plasma que, quando clivado por trombina, liberta fibrinopéptido A e fibrinopéptido B. 0 fibrinopéptido B é então clivado por trombina e os monómeros de fibrina formados por esta segunda clivagem proteolítica forma espontaneamente um gel insolúvel. A fibrina polimerizada mantém-se ligada por forças não covalentes e electrostáticas e é estabilizada pela enzima de transamidação fator XlIIa (FXIIIa), produzida pela clivagem de FXIII por trombina. A trombina também ativa TAFI, que inibe fibrinólise por diminuição da geração de plasmina à superfície do coágulo. Adicionalmente, a própria trombina é incorporada na estrutura do coágulo para estabilização adicional. Estes agregados de fibrina insolúveis (coágulos), conjuntamente com plaquetas aglutinadas (trombos), bloqueiam o vaso sanguíneo danificado e previnem hemorragia adicional. 3. Regulação da coagulação
Durante a coagulação, a cascata é regulada pelos processos constitutivos e estimulados para inibir adicionalmente formação de coágulo. Existem várias razões para tais mecanismos de regulação. Primeiramente, a regulação é necessária para limitar a isquemia de tecidos por formação de coágulos de fibrina. Em segundo lugar, a regulação evita trombose alargada, através de localização da formação de coágulo apenas no local de lesão de tecido.
Consegue-se regulação pelos catiões de várias moléculas inibidoras. Por exemplo, a antitrombina III (AT-III) e o inibidor da via de fator tecidular (TFPI) trabalham constitutivamente para inibir fatores na cascata de coagulação. AT-III inibe trombina, FIXa e FXa, enquanto TFPI inibe FXa e o complexo FVIIa/TF. Um fator adicional, proteína C, que é estimulado através da ativação de plaquetas, regula a coagulação por clivagem proteolítica e inativação de FVa e FVIIIa. A proteína S melhora a atividade da proteína C. Adicionalmente, outro fator que contribui para a inibição de coagulação é a proteína integral de membrana trombomodulina, que é produzida pelas células endoteliais vasculares e que serve como um receptor para trombina. A ligação de trombina a trombomodulina inibe as atividades pró-coagulantes de trombina e também contribui para a ativação de proteína C. A fibrinólise, a quebra do coágulo de fibrina, também proporciona um mecanismo para regular a coagulação. Os multímeros de fibrina reticulados num coágulo são quebrados em polipéptidos solúveis por plasmina, uma serina protease. A plasmina pode ser gerada a partir do seu precursor inativo plasminogénio e recrutada para o local de um coágulo de fibrina por duas formas: por interação com ativador de plasminogénio de tecido (tPA) na superfície de um coágulo de fibrina e pela interação com ativador de plasminogénio de urocinase (uPA) numa superfície celular. 0 primeiro mecanismo parece ser o principal responsável pela dissolução de coágulos no interior dos vasos sanguíneos. 0 segundo, embora capaz de mediar a dissolução de coágulo, pode desempenhar um papel principal na remodelação de tecidos, migração celular e inflamação. A dissolução de coágulo também é regulada de duas formas. Primeiramente, ocorre ativação de plasmina eficaz e fibinólise apenas em complexos formados na superfície do coágulo ou numa membrana celular, enquanto as proteínas livres no sangue são catalisadores ineficazes e são rapidamente inativados. Em segundo lugar, os ativadores de plasminogénio e a plasmina são inativados por moléculas, tais como inibidor de ativador de plasminogénio de tipo 1 (PAI-1) e PAI-2 que atuam nos ativadores de plasminogénio e 2-antiplasmina e 2- macroglobulina que inativam plasmina. Em circunstâncias normais, o balanço temporal entre coagulação e fibrinólise resulta na formação e desaparecimento eficaz de coágulos após lesão vascular, enquanto simultaneamente há prevenção de episódios trombóticos ou de hemorragia indesejáveis.
Apresenta-se na tabela 4, seguidamente, um resumo de exemplos de fatores de coagulação, cofatores e proteínas de regulação e das suas atividades.
Tabela adaptada de M. W. King (2006) med.unibs.it/~marchesi/blood.html C. Fator VII (FVII) 0 fator VII é uma glicoproteína serina protease dependente de vitamina K, que é sintetizada em animais, incluindo mamíferos, como um zimogénio de cadeia única, no fígado e excretada para a corrente sanguínea. Tal como descrito anteriormente, FVII é a protease de coagulação responsável por iniciar a cascata de eventos proteolíticos que levam à geração de trombina e deposição de fibrina. Faz parte da via extrínseca, embora os efeitos a jusante da sua atividade também tenham um grande impacto na via intrínseca. Este papel integral na formação de coágulo tem atraído um elevado interesse para FVII como um alvo para terapias clínicas anticoagulante e hemostática. Por exemplo, desenvolveu-se FVII ativado recombinante (rFVIIa) como um agente hemostático para uso em indivíduos hemofílicos e indivíduos com outras condições hemorrágicas. Proporcionam-se aqui polipéptidos de FVII modificados que são concebidos para, por ativação, apresentarem atividade de coagulação aumentada e que podem servir como agentes terapêuticos melhorados para tratar doenças e condições sensíveis a terapia com fator VII.
1. Estrutura e organização de FVII 0 gene de FVII humano (F7) localiza-se no cromossoma 13 em 13q34 e tem 12,8 kb de comprimento, com 9 exões. 0 gene de FVII partilha similaridade organizacional significativa com genes que codificam para outras proteínas dependentes de vitamina K, tal como protrombina, fator IX, fator X e proteína C. 0 ARNm de FVII sofre splicing alternativo para produzir dois produtos de transcrição: variante 1 (N2 de acesso de Genbank NM_000131, apresentada em SEQ ID NO: 81) e variante 2 (N2 de acesso de Genbank NM_019616, apresentada em SEQ ID NO: 82). A variante de transcrição 2, que é a forma mais abundante no fígado, não inclui o exão lb e assim codifica um polipéptido precursor mais curto de 444 aminoácidos (precursor de FVII de isoforma b; SEQ ID N0:2), comparativamente ao polipéptido precursor de 466 aminoácidos codificado pela variante de transcrição 1 (precursor de FVII de isoforma a; SEQ ID N0:1) . Os aminoácidos que não estão presentes na isoforma b de polipéptido precursor de FVII correspondem às posições de aminoácidos 22 a 43 da isoforma a de precursor de FVII. Estes aminoácidos fazem parte da sequência pró-péptido, resultando no pró-péptido de FVII truncado de isoforma b. Os polipéptidos precursores são constituídos pelos seguintes segmentos e domínios: um péptido de sinalização hidrofóbico (aa 1-20 de SEQ ID NO:l e 2), um pró-péptido (aa 21-60 de SEQ ID NO: 1 e aa 21-38 de SEQ ID NO:2), um domínio Gla (aa 39-83 de SEQ ID NO:2 e aa 61-105 de SEQ ID NO: 1), um domínio de fator de crescimento epidérmico de tipo B (do tipo EGF 1, aa 84-120 de SEQ ID NO: 2 e aa 106-142 de SEQ ID NO: 1), um domínio de fator de crescimento epidérmico de tipo A (do tipo EGF 2, aa 125-166 de SEQ ID NO: 2; e aa 147-188 de SEQ ID NO: 1) e um domínio de serina protease (aa 191-430 de SEQ ID NO: 2 e aa 213-452 de SEQ ID NO: 1). A forma madura de 406 aminoácidos do polipéptido de FVII (SEQ ID NO: 3) não contém o péptido de sinalização e sequências pró-péptido e é idêntica em comprimento e sequência independentemente da isoforma de precursor da qual é originária. Na forma madura do polipéptido de FVII as posições de aminoácidos correspondentes aos domínios acima mencionados são as seguintes: domínio Gla (aa 1-45 de SEQ ID NO: 3), tipo EGF 1 (aa 46-82 de SEQ ID NO: 3), tipo EGF 2 (aa 87-128 de SEQ ID NO: 3) e domínio de serina protease (aa 153-392 de SEQ ID NO: 3). O domínio Gla de FVII é um motivo de ligação à membrana que, na presença de iões cálcio, interatua com membranas de fosfolípido que incluem fosfatidilserina. 0 domínio Gla também desempenha um papel na ligação ao cofator de FVIIa, fator tecidular (TF) . Quando complexado com TF, o domínio Gla de FVIIa está carregado com sete iões Ca2+, projeta três cadeias laterais hidrofóbicas na direção da membrana celular, para interação com fosfolípidos na superfície celular, e tem contacto significativo com o domínio C terminal de TF. 0 domínio Gla é conservado entre as proteínas dependentes de vitamina K, tais como protrombina, fatores de coagulação VII, IX e X, proteínas C, S e Z. Estas proteínas necessitam de vitamina K para a síntese pós-tradução de ácido γ-carboxiglutâmico, um aminoácido agrupado no domínio Gla N terminal destas proteínas. Todos os resíduos glutâmicos presentes no domínio são locais potenciais para carboxilação e muitos deles são assim modificados por carboxilação.
Além do domínio Gla, a proteína de FVII madura também contém dois domínios do tipo EGF. 0 primeiro domínio do tipo EGF (tipo EGF 1 ou EGF1) é um domínio EGF de ligação de cálcio, no qual seis cisteínas centrais conservadas formam três pontes dissulfureto. 0 domínio EGF1 de FVII liga-se apenas a um ião Ca2+, mas com uma afinidade significativamente mais elevada do que a verificada para o domínio Gla (Banner et al. (1996) Nature 380:41-46). Este ião Ca2+ ligado promove a interação forte entre o domínio EGF1 de FVII e TF (Osterlund et al. (2000) Eur J Biochem 267:6204-6211) . O segundo domínio do tipo EGF (tipo EGF 2 ou EGF2) não é um domínio de ligação de cálcio, mas também forma 3 pontes dissulfureto. Tal como outros domínios em FVII, o domínio EGF2 interatua com TF. Também está ligado através de uma ponte dissulfureto com o domínio de protease, com o qual partilha uma grande interface de contacto.
Finalmente, o domínio de serina protease de FVII é o domínio responsável pela atividade proteolítica de FVIIa. A sequência de aminoácidos de FVII no seu domínio catalítico apresenta elevada de identidade de sequência e similaridade de estrutura terciária com outras serina proteases, tais como tripsina e quimiotripsina (Jin et ai. (2001) J Mol Biol, 307: 1503-1517). Por exemplo, estas serina proteases partilham uma tríade catalítica comum H57, D102, S195, com base na numeração de quimiotripsina. No entanto, contrariamente a outras serina proteases, a clivagem de FVIIa não é suficiente para completar a conversão do zimogénio para uma enzima completamente ativa.
Em vez disso, tal como discutido seguidamente, FVIIa é ativado alostericamente na sua função catalítica por ligação ao receptor TF de superfície celular, que induz uma alteração conformacional no domínio de protease de FVIIa transformando-o de um estado inativo do tipo zimogénio numa enzima cataliticamente ativa. Uma região de hélice e ansa entre o local de ligação de cofator e o local ativo (i.e. posições de resíduos de aminoácidos 305-321, correspondente aos resíduos 163-170Í com base na numeração de quimiotripsina) de FVIIa é importante para a alosteria e zimogenicidade de FVIIa (Persson et al. (2004) Biochem J., 379: 497-503) . Esta região é composta por uma hélice curta (posições de resíduos de aminoácidos 307 a 312) seguida por uma ansa. A parte N terminal da hélice faz parte da interface entre o domínio de protease e TF e contém vários resíduos que são importantes para a função proteolítica e ligação ótima a TF. Uma comparação da estrutura cristalina de FVIIa sozinho e de FVIIa complexado com TF indica que uma hélice sofre uma alteração conformacional significativa quando FVIIa se liga a TF. A hélice de FVIIa sozinho parece distorcida, encurtada e numa orientação diferente. Tal afeta as estruturas em ansa adjacentes, movendo-as para longe do local ativo.
Contrariamente, a hélice de FVIIa quando complexado a TF é estabilizada e as ansas vizinhas estão posicionadas mais perto do local ativo. Esta estabilização é efetuada através de mecanismos que envolvem pelo menos a metionina na posição de aminoácidos 306 (resíduo de aminoácido Met164 pela numeração de quimiotripsina) de FVII (Pike et al. (1999) PNAS 8925-8930). 2. Modificações pós-tradução 0 polipéptido precursor de FVII (qualquer das isoformas do gene de fator VII) tem como alvo a via de excreção celular através do péptido de sinalização hidrofóbico, que se insere no retículo endoplasmático (ER) para iniciar translocação através da membrana. Enquanto a proteína é translocada através da membrana do ER, o péptido de sinalização de 20 aminoácidos é clivado por uma peptidase de sinalização no interior do lúmen do ER, após o que o polipéptido sofre modificações pós-tradução adicionais, incluindo glicosilação em N e em O, carboxilação dependente de vitamina K dos ácidos glutâmicos do terminal N a ácidos -carboxiglutâmicos e hidroxilação de ácido aspártico a ácido -hidroxiaspártico. O pró-péptido proporciona um local de ligação para uma carboxilase dependente de vitamina K, que reconhece uma hélice anfipática de 10 resíduos no pró-péptido de FVII. Após ligação, a carboxilase carboxila em 10 resíduos de ácido glutâmico no interior do domínio Gla do polipéptido de FVII, produzindo resíduos -carboxiglutamilo nas posições E66, E67, E74, E76, E79, E80, E85, E86, E89 e E95 relativamente à sequência de aminoácidos do precursor de FVII apresentada em SEQ ID NO: 2. Estas posições correspondem às posições E6, E7, E14, E19, E20, E25, E26, E29 e E35 do polipéptido maduro de FVII apresentado em SEQ ID NO: 3. Para atividade ótima, a molécula de FVII necessita de cálcio, que se liga ao polipéptido e facilita as alterações conformacionais necessárias para ligação de FVIIa a TF e a lípidos. O domínio Gla -carboxilado liga sete iões Ga com afinidade variável, que induzem a alteração conformacional que permite que o domínio Gla interatue com o domínio de terminal C de TF e também com fosfatidilserinas ou outros fosfolípidos carregados negativamente na membrana das plaquetas. A glicosilação ligada a N é efetuada por transferência de GlC3Man9 (GlcNAc) para dois resíduos de asparagina no polipéptido de FVII, nas posições que correspondem aos resíduos de aminoácidos 145 e 322 da proteína madura (SEQ ID NO: 3) . A glicosilação ligada a O ocorre nos resíduos de aminoácidos 52 e 60 do polipéptido maduro e a hidroxilação a um ácido -hidroxiaspártico ocorre no resíduo de ácido aspártico na posição 63. Estes resíduos de serina glicosilados em 0 e a hidroxilação do resíduo de ácido aspártico encontram-se no domínio EGF-1 de FVII. Estas modificações são efetuadas no ER e no complexo de Golgi antes do processamento final do polipéptido para a sua forma madura.
3. Processamento de FVII 0 pró-polipéptido de FVII modificado é transportado através do lúmen de Golgi para o compartimento trans-Golgi onde o pró-péptido é clivado por uma propeptidase, imediatamente antes da excreção da proteína da célula. PACE/furina (em que PACE é um acrónimo para enzima de clivagem de aminoácido básico emparelhado) é uma endopeptidase localizada na membrana de Golgi que cliva muitas proteínas no lado carboxiterminal do motivo de sequência Arg-[qualquer resíduo]-(Lys ou Arg)-Arg. Esta propeptidase cliva glicoproteínas dependentes de vitamina K, tais como os polipéptidos de profator IX e pro-vWF (Himmelspach et al. (2000) Thromb Research 97; 51-67), libertando o pró-péptido da proteína madura. A inclusão de um local de reconhecimento de PACE/furina adequado nos precursores de fator VII recombinante facilita o processamento correto e a excreção do polipéptido recombinante (Margaritas et al. (2004) Clin Invest 113(7) : 1025-1031). PACE/furina ou outra enzima propeptidase do tipo subtilisina é provavelmente responsável pelo processamento proteolítico de pro-FVII a FVII. Pode reconhecer e ligar o motivo consensual -Arg-Arg-Arg-Arg- nas posições de aminoácidos 35-38 das sequências apresentadas em SEQ ID NO:l e posições 57-60 da sequência apresentada em SEQ ID NO:2, clivando o pró-péptido e libertando a proteína madura para excreção.
4. Ativação de FVII A grande maioria de FVII no sangue está sob a forma de um zimogénio inativado em cadeia única, embora uma pequena parte esteja presente numa forma ativada com duas cadeias. A ativação de FVII ocorre por clivagem proteolítica da ligação Arg152-Ile153 (posições relativas ao polipéptido maduro de FVII, apresentado em SEQ ID NO:3), dando origem a um polipéptido com duas cadeias contendo uma cadeia leve de 152 aminoácidos (aproximadamente 20 kDa) ligada por uma ponte dissulfureto a uma cadeia pesada de 254 aminoácidos (aproximadamente 30 kDa). A cadeia leve de FVIIa contém o domínio Gla e os domínios do tipo EGF, enquanto a cadeia pesada contém a parte catalítica ou de serina protease da molécula. A conversão do FVII em cadeia simples para o FVIIa com duas cadeias é mediada por clivagem por FIXa, FXa, FXIIa, trombina ou de uma forma autocatalítica por FVIIa endógeno (Butenas et al. (1996) Biochem 35:1904-1910; Nakagaki et al. (1991) Biochem 30:10819-10824). As quantidades vestigiais de FVIIa que ocorrem em circulação, aparecem provavelmente pela ação de FXa e FIXa.
Tal como discutido anteriormente, a clivagem de FVII da sua forma de zimogénio para FVIIa não é suficiente para atividade completa. É necessário associação de FVIIa com TF para atividade completa (Higashi et al. (1996) J Biol Chem 271:26569-26574). Devido a este requisito, classificou-se FVIIa sozinho como tendo características do tipo zimogénio, apresentando enrolamento e forma de zimogénio e apresentando atividade relativamente baixa. Esta característica de FVIIa do tipo zimogénio, na ausência da sua associação com TF, torna-o relativamente resistente a antitrombina III (AT-III) e outras serpinas, que geralmente atuam principalmente nas formas ativas de serina proteases em vez da forma de zimogénio. Adicionalmente, TFPI, o principal inibidor de atividade TF/FVIIa, também não se liga eficazmente à forma não complexada "inativa" de FVIIa.
Por complexação com TF, FVIIa sofre uma alteração conformacional que permite atividade completa da molécula. Todos os domínios de FVII estão envolvidos na interação com TF, mas as alterações conformacionais que ocorrem estão localizadas no domínio de protease de FVIIa. Por exemplo, as alterações conformacionais que ocorrem por interação alostérica de FVIIa e TF incluem a criação de um exolocal extenso de ligação de substrato macromolecular. Este local de ligação extenso melhora grandemente a ativação proteolítica de fator X mediada por FVII. A atividade de FVIIa é aumentada adicionalmente (i.e. mil vezes) quando a interação de FVIIa é com TF expresso à superfície celular. Tal é devido ao facto das membranas de fosfolípidos, contendo fosfolípidos carregados negativamente, tal como fosfatidilserina, serem o local de interação de outros fatores de coagulação dependentes de vitamina K, tais como FIX e FX, que se ligam através dos seus domínios Gla. Assim, a concentração local destas proteínas dependentes de vitamina K é elevada à superfície celular, promovendo a sua interação com o complexo TF/FVIIa.
5. Função de FVII
Embora FVIIa apresenta atividade aumentada após ativação alostérica por TF, existem evidências da existência de mecanismos nos quais FVIIa sozinho pode iniciar coagulação. Assim, FVII pode funcionar de uma forma dependente de TF e independente de TF. Esta última via pode desempenhar um papel muito menor em hemóstase normal, embora o seu significado possa aumentar quando se considera no contexto de doenças hemorrágicas e no seu tratamento. a. Atividade de FVIIa dependente de fator tecidular 0 FVII em circulação liga-se a TF de superfície celular e é ativado por FIXa, FXa, trombina ou, de uma forma autocatalítica, por FVIIa endógeno, tal como descrito anteriormente. Alternativamente, a muito pequena quantidade de FVIIa em circulação pode ligar-se diretamente a TF. 0 complexo TF/FVIIa seguidamente liga-se a uma pequena fração de FX plasmático e o domínio catalítico de FVIIa cliva FX para produzir FXa. A trombina é assim formada através da via extrínseca na superfície de células que apresentam TF, quando FXa se complexa a FVa e ativa protrombina a trombina (figura 3). FIX também é ativado pelo complexo TF/FVIIa, proporcionando uma ligação à via intrínseca que opera na superfície da plaqueta ativada. Os sistemas de retroação positiva na cascata de coagulação descritos anteriormente proporcionam o modo pelo qual são produzidas elevadas quantidades de trombina, que cliva fibrinogénio a fibrina para formar um coágulo. b. Atividade de FVIIa independente de fator tecidular
Além do mecanismo dependente de TF para a ativação de FX a FXa, existem evidências que FVIIa também pode ativar FX na ausência de TF. As plaquetas ativadas translocam fosfatidilserinas e outros fosfolípidos carregados negativamente para a superfície externa, orientada para o plasma. (Hemker et al. (1983) Blood Cells 9:303-317) . Estas proporcionam "receptores" alternativos, através dos quais se pode ligar FVIIa, apesar da afinidade relativamente baixa, que é 1000 vezes inferior à afinidade de ligação de FVIIa a TF (Monroe et al. (1997) Br J Haematol 99:542-7) . Esta interação é mediada através de resíduos no domínio Gla (Harvey et al. (2003) 278:8363-8369). FVIIa pode então converter FX a FXa e FIX a FIXa na superfície de plaquetas ativadas (Hoffman et al. (1998) Blood Coagul Fibrinolysis 9:S61-S65). O FXa permanece associado à superfície da plaqueta, onde se pode ligar a FVa e gerar trombina suficiente a partir de protrombina, enquanto o FIXa formado de novo agrega a FVIIIa para catalisar a ativação de mais FX a FXa (figura 3) . A hemóstase na ausência de TF pode então conseguir-se por retroação positiva e mecanismos de propagação descritos anteriormente. No entanto, é notável que embora FVIIIa possa contribuir para o processo de coagulação na plaqueta ativada, a sua presença não é necessária para geração de trombina no mecanismo independente de TF (figura 3) . Assim, na ausência de FVIII, tal como em doentes de hemofilia, existem evidências que FVIIa pode iniciar e/ou amplificar a geração de trombina através deste mecanismo secundário e efetuar formação de coágulo. 6. FVII como um biofármaco FVII funciona para iniciar coagulação sanguínea. FVIIa recombinante (NovoSeven®; rFVIIa) está aprovado para tratamento de episódios de hemorragia ou prevenção de hemorragia em procedimentos cirúrgicos ou invasivos em doentes com hemofilia A ou B com inibidores para fator VIII ou fator IX e em doentes com deficiência congénita em fator VII. Novoseven® é uma preparação obtida por engenharia genética de fator Vila que é produzido num sistema de expressão de mamífero usando células de rim de hamster bebé (BHK). O agente é praticamente idêntico a fator Vila derivado de plasma na sua estrutura e função (Ratko et al. (2004), P & T, 29: 712-720).
Mostrou-se que a administração de FVIIa recombinante (rFVIIa) promove coagulação sanguínea em doentes que sofrem de hemofilia e verificou-se que o tratamento com doses de FVIIa é seguro e bem tolerado em indivíduos humanos. Tipicamente, o uso de rFVIIa tem sido em doentes que desenvolveram inibidores (i.e. aloanticorpos) para fator VIII ou para fator IX. O uso de rFVIIa como um coagulante foi estendido ao tratamento de outras doenças hemorrágicas, por exemplo trombastenia de Glanzmann; outros eventos associados a hemorragia extensa, tal como em resultado de traumatismo ou cirurgia incluindo transplantes de fígado, cirurgia à próstata e traumatismo hemorrágico; coagulopatias neonatais, doença hepática grave; transplantes de medula óssea, trombocitopenias e doenças de função de plaquetas; inversão urgente de anticoagulação oral; deficiências congénitas em fatores V, VII, X e XII; e doença de von Willebrand com inibidores para o fator de von Willebrand, não se lhes limitando. É necessária uma dose elevada de rFVII para conseguir um efeito terapêutico. A dose e regime de dosagem necessários para administração de rFVII varia dependendo da indicação clínica. Por exemplo, a dosagem típica de rFVII para episódios hemorrágicos em doentes com hemofilia A ou hemofilia B com aloanticorpos é de 90 pg/kg administrada por injeção intravenosa (IV) . Dado que rFVII tem uma semivida de 2 horas, é necessário repetir a dose. Pode administrar-se uma dose adicional de duas em duas horas até se conseguir hemóstase. A gama de dose pode ser alterada dependendo da gravidade da condição. Por exemplo, têm sido eficazes doses na gama de 35 -120 pg/kg. Igualmente, a dose e regime de dosagem podem variar com outras indicações. Por exemplo, a doentes de hemofilia A ou hemofilia B que são submetidos a cirurgia pode administrar-se uma dose inicial de 90 pg/kg imediatamente antes da cirurgia, com repetição das doses de duas em duas horas durante e após cirurgia. Dependendo da gravidade da cirurgia e do episódio de hemorragia, a infusão de bolus IV pode continuar de duas em duas horas até de seis em seis horas, até se atingir cicatrização. Em doentes com deficiência congénita em FVII, rFVII é tipicamente administrado para prevenir hemorragia em cirurgia ou outros procedimentos invasivos a 15 - 30 pg/kg em ciclos de 4-6 horas, até se atingir hemóstase. O mecanismo de ação de rFVIIa para iniciar hemóstase explica o requisito de dose elevada. Os doentes de hemofilia têm um fase de iniciação de coagulação normal, em que o complexo TF/FVIIa ativa FX a FXa e leva à produção de trombina no local da célula que apresenta TF. Seguidamente, contudo, o processo de coagulação falha, já que os doentes de hemofilia não têm FVIII (hemofilia A) ou FIX (hemofilia B) e portanto são incapazes de formar os complexos FVIIIa/FIXa na superfície da plaqueta ativada, que normalmente serve para ativar elevadas quantidades de FX a FXa, nas fases de amplificação e propagação descritas anteriormente. Devido à presença de inibidores, tal como TFPI e AT-III, o FXa que é produzido na célula que apresenta TF após clivagem por TF/FVIIa é incapaz de difundir facilmente entre as superfícies celulares. Em resultado, não ocorre geração de trombina em larga escala na superfície das plaquetas ativadas e não se forma um coágulo.
Existem evidências que o efeito hemostático de doses elevadas de rFVIIa pode conseguir-se usando geração de FXa por rFVIIa dependente de TF e/ou independente de TF nas plaquetas ativadas (figura 3) . A geração de trombina dependente de TF pode ser maximizada muito rapidamente com a saturação de moléculas de TF com FVIIa e rFVIIa endógeno. Em alguns casos, a elevada dose de rFVIIa pode ligar-se a plaquetas ativadas e converter FX a FXa. O FXa associado à superfície ativa FVa para gerar trombina suficiente para hemóstase. Dado que rFVII se liga à superfície de plaquetas com baixa afinidade, pode ser necessária uma dose mais elevada de rFVII para geração de trombina. A ativação de FXa em plaquetas ativadas assegura que a hemóstase mediada por rFVIIa fica localizada no local de lesão.
Uma forma de conseguir uma dosagem reduzida de rFVII pode melhorar a sua utilidade e eficácia como um fármaco. Proporcionam-se aqui polipéptidos de FVII modificados. Entre estes encontram-se polipéptidos de FVII modificados que apresentam resistência aumentada a AT-III e atividade catalítica aumentada na presença e/ou ausência de TF. Os polipéptidos de FVII modificados aqui proporcionados podem também apresentar resistência aumentada a TFPI, resistência aumentada aos efeitos de inibição de Zn2+, propriedades farmacocinéticas melhoradas, tal como semivida sérica aumentada, ligação e/ou afinidade aumentada para plaquetas ativadas, ligação e/ou afinidade aumentada para albumina de soro e/ou ligação e/ou afinidade aumentada para integrina nb 3 de plaquetas. Estes polipéptidos de FVII modificados podem apresentar atividade coagulante aumentada. Os polipéptidos de FVII aqui proporcionados podem ser usados em tratamentos para iniciar hemóstase num mecanismo dependente de TF e/ou independente de TF, de modo a produzir-se FXa e gerar-se trombina. D. Polipéptidos de FVII modificados
Proporcionam-se aqui polipéptidos de FVII modificados de acordo com as presentes reivindicações. Os polipéptidos de FVII apresentam alterações numa ou mais atividades ou propriedades comparativamente a polipéptido de FVII que não foi assim modificado. As atividades ou propriedades que podem ser alteradas em resultado da modificação incluem atividade de coagulação ou coagulante; atividade pró-coagulante; atividade proteolitica ou catalítica, tal como para efetuar ativação de fator X (FX) ou ativação de fator IX (FIX) ; antigenicidade (capacidade de se ligar ou de competir com um polipéptido para ligação a um anticorpo anti-FVII); capacidade para se ligar a fator tecidular, fator X ou fator IX; capacidade para se ligar a fosfolípidos; semivida; estrutura tridimensional; pi; e/ou conformação, não se lhes limitando. Tipicamente, os polipéptidos de FVII modificados apresentam atividade pró-coagulante. Os polipéptidos de FVII modificados da presente invenção apresentam atividade coagulante aumentada por ativação a partir da sua forma de zimogénio em cadeia única. Tais polipéptidos de FVII modificados podem ser usados no tratamento de doenças ou eventos hemorrágicos, tal como hemofilias ou lesão, em que os polipéptidos de FVII podem funcionar para promover coagulação sanguínea. Incluem-se em tais polipéptidos de FVII modificados, os que têm resistência aumentada a inibidores, tais como antitrombina III (AT-III) e inibidor da via de fator tecidular (TFPI), os que têm resistência aumentada aos efeitos de inibição de Zn2+, os que têm atividade catalítica aumentada na presença e/ou ausência de TF, os que têm propriedades farmacocinéticas melhoradas, tal como semivida aumentada, os que têm ligação e/ou afinidade aumentada para a superfície de plaquetas, os que têm ligação e/ou afinidade aumentada para albumina de soro e os que têm ligação e/ou afinidade aumentada para integrina nb 3 de plaquetas. Em particular, tais polipéptidos de FVII modificados podem ser usados em doenças ou condições para proporcionar atividade coagulante, enquanto ao mesmo tempo evitam os requisitos para FVIIIa e FIXa. Num exemplo, podem usar-se polipéptidos de FVII modificados aqui proporcionados em doentes hemofílicos com autoanticorpos contra FVIIIa e FIXa. Assim, os polipéptidos de FVII modificados aqui proporcionados apresentam vantagens, incluindo uma diminuição da quantidade de FVII administrado que é necessária para manter uma concentração suficiente de FVII ativo no soro para hemóstase. Tal pode levar, por exemplo, a doses e/ou frequências de dosagem necessárias mais baixas para conseguir efeitos biológicos comparáveis, maior conforto e aceitação pelos indivíduos e atenuação de efeitos secundários.
Podem fazer-se modificações num polipéptido de FVII em qualquer forma de um polipéptido de FVII, incluindo variantes alélicas e de espécie, variantes de splicing, variantes conhecidas na especialidade ou moléculas de FVII híbridas ou quiméricas. Por exemplo, podem fazer-se as modificações aqui proporcionadas num polipéptido precursor de FVII apresentado em SEQ ID NOS:1 ou 2, um polipéptido de FVII maduro apresentado em SEQ ID NO: 3 ou quaisquer variantes de espécie, alélicas ou modificadas e seus fragmentos ativos, que tenham 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência com qualquer dos polipéptidos de FVII apresentados em SEQ ID NOS: 1-3. As variantes alélicas de FVII incluem qualquer dos polipéptidos precursores com uma das sequências de aminoácidos apresentadas em qualquer de SEQ ID NOS: 18-74, não se lhes limitando. Podem fazer-se modificações num polipéptido de FVII a um polipéptido de FVII que também contém outras modificações, tais como as descritas na especialidade, incluindo modificações da sequência primária e modificações que não são na sequência primária do polipéptido. A modificação de polipéptidos de FVII também inclui modificação de polipéptidos que são híbridos de diferentes polipéptidos de FVII e também polipéptidos de FVII sintéticos, preparados recombinantemente ou sintetizados ou construídos por outros métodos conhecidos na especialidade, baseados na sequência de polipéptidos conhecidos. Por exemplo, com base no alinhamento de FVII com outros membros da família de fatores de coagulação, tal como fator IX (FIX) ou fator X (FX) , são facilmente identificados domínios homólogos entre membros da família. Podem construir-se variantes quiméricas de polipéptidos de FVII em que um ou mais aminoácidos ou domínios completos são substituídos na sequência de aminoácidos de FVII, usando a sequência de aminoácidos do membro da família correspondente. Adicionalmente, os polipéptidos de FVII quiméricos incluem aqueles em que um ou mais aminoácidos ou domínios completos na sequência de aminoácidos de FVII humano são substituídos usando a sequência de aminoácidos de uma espécie diferente (consultar, e.g. Williamson et al. (2005) J Thromb Haemost 3:1250-6). Tais proteínas quiméricas podem ser aqui usadas como o polipéptido de FVII inicial não modificado.
As modificações aqui descritas de um polipéptido não modificado inicial de referência incluem permutas ou substituições de aminoácidos, adições ou deleções de aminoácidos ou quaisquer suas combinações. Por exemplo, os polipéptidos de FVII modificados incluem os com 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 30, 40, 50 ou mais posições modificadas. Proporcionam-se aqui polipéptidos de FVII modificados com duas ou mais modificações comparativamente a um polipéptido de FVII inicial de referência. Os polipéptidos de FVII modificados incluem os com 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 30, 40, 50 ou mais posições modificadas. Qualquer modificação aqui descrita pode ser combinada com qualquer outra modificação conhecida dos peritos na especialidade, desde que o polipéptido de FVII modificado resultante apresente atividade de coagulação aumentada quando está na sua forma com duas cadeias. Os polipéptidos de FVII modificados aqui proporcionados apresentam atividade coagulante aumentada. As atividades ou propriedades que podem ser alteradas em resultado da modificação incluem atividade de coagulação ou coagulante; atividade pró-coagulante; atividade proteolítica ou catalítica tal como efetuar ativação de fator X (FX) ou ativação de fator IX (FIX); antigenicidade (capacidade de se ligar ou de competir com um polipéptido para ligação a um anticorpo anti-FVII); capacidade de se ligar a fator tecidular, fator inibidor de fator tecidular (TFPI), antitrombina III, fator X ou fator IX; capacidade de se ligar a fosfolípidos, albumina de soro ou integrina nb 3 de plaquetas; semivida sérica; estrutura tridimensional; pi; e/ou conformação, não se lhes limitando. Incluem-se entre os polipéptidos de FVII modificados aqui proporcionados os que têm resistência aumentada a antitrombina III (AT-III), atividade catalítica aumentada na presença e/ou ausência de TF, resistência aumentada a inibidor de via de fator tecidular (TFPI), resistência aumentada aos efeitos de inibição de Zn2+, propriedades farmacocinéticas melhoradas, tal como semivida sérica aumentada, atividade intrínseca aumentada, glicosilação alterada, afinidade e/ou ligação para albumina de soro aumentada, afinidade e/ou ligação para integrina nb 3 de plaquetas aumentada e/ou afinidade e/ou ligação para plaquetas ativadas aumentada.
Em alguns exemplos, uma modificação pode afetar duas ou mais propriedades ou atividades de um polipéptido de FVII. Por exemplo, uma modificação pode resultar em resistência aumentada a AT-III e atividade catalítica aumentada do polipéptido de FVII modificado comparativamente a um polipéptido de FVII não modificado. Os polipéptidos modificados de FVII aqui proporcionados podem ser ensaiados para cada propriedade e atividade para identificar a gama de efeitos de uma modificação. Tais ensaios são conhecidos na especialidade e descritos seguidamente. Os polipéptidos modificados de FVII aqui proporcionados também incluem polipéptidos de FVII que são modificados adicionalmente pela maquinaria celular e incluem, por exemplo, polipéptidos glicosilados, -carboxilados e -hidroxilados.
As modificações aqui proporcionadas a um polipéptido de FVII de acordo com as presentes reivindicações são efetuadas para aumentar a resistência a AT-III, aumentar a resistência a TFPI, aumentar a resistência aos efeitos de inibição de Zn2+, melhorar as propriedades farmacocinéticas, tal como aumentar a semivida sérica, aumentar a atividade catalítica na presença e/ou ausência de TF, aumentar a ligação a plaquetas ativadas, alterar a glicosilação, aumentar a afinidade e/ou ligação a integrina nb 3 de plaquetas, aumentar a afinidade e/ou ligação a albumina de soro e/ou aumentar a afinidade e/ou ligação a plaquetas ativadas. Por exemplo, um polipéptido de FVII pode incluir modificação(ões) que aumenta(m) uma ou ambas de atividade catalítica e ligação a plaquetas. Noutros exemplos, podem combinar-se quaisquer modificações aqui descritas com qualquer outra modificação conhecida do perito na especialidade, desde que o polipéptido de FVII modificado resultante apresente atividade de coagulação aumentada quando está na sua forma com duas cadeias. Tipicamente, tal atividade de coagulação aumentada é devida a resistência aumentada a ATUI, atividade catalítica aumentada, resistência aumentada aos efeitos de inibição de Zn2+, propriedades farmacocinéticas melhoradas, tal como semivida sérica aumentada, resistência aumentada a TFPI, glicosilação alterada, ligação e/ou afinidade a fosfolípidos aumentada, ligação e/ou afinidade para albumina de soro aumentada e/ou ligação e/ou afinidade para integrina nb 3 de plaquetas aumentada. Em alguns exemplos, as modificações que são introduzidas num polipéptido de FVII para alterar uma atividade ou propriedade específica podem também, ou alternativamente, afetar outra atividade ou propriedade. Assim, as modificações aqui descritas podem afetar a propriedade ou atividade para as quais foram concebidas e uma ou mais outras propriedades ou atividades. Por exemplo, as modificações efetuadas a um polipéptido de FVII para aumentar a atividade catalítica podem também aumentar a resistência a AT-III. Em alguns exemplos, uma única modificação, tal como a substituição de um único aminoácido altera 2, 3, 4 ou mais propriedades ou atividades de um polipéptido de FVII. Os polipéptidos modificados de FVII aqui proporcionados podem ser ensaiados para cada propriedade e atividade para identificar a gama de efeitos de uma modificação. Tais ensaios são conhecidos na especialidade e descritos seguidamente. Os polipéptidos de FVII modificados aqui proporcionados também incluem polipéptidos de FVII que são modificados adicionalmente pela maquinaria celular e incluem, por exemplo, polipéptidos glicosilados, carboxilados e -hidroxilados.
As modificações aqui descritas podem ser efetuadas por técnicas padrão de ADN recombinante, tais como são rotineiras para os peritos na especialidade. Pode utilizar-se qualquer método conhecido na especialidade para efetuar a mutação de qualquer um ou mais aminoácidos numa proteína alvo. Os métodos incluem mutagénese padrão dirigida ao local (usando e.g., um kit, tal como kit de QuikChange disponível de Stratagene) de moléculas de ácido nucleico codificante ou por métodos de síntese de polipéptidos em fase sólida. Adicionalmente, podem gerar-se proteínas quiméricas modificadas aqui proporcionadas (i.e. permuta de domínio Gla) por técnicas de rotina de ADN recombinante. Por exemplo, podem gerar-se polipéptidos quiméricos usando enzimas de restrição e metodologias de clonagem, para subclonagem de rotina dos componentes do polipéptido quimérico pretendido.
Também se podem incluir outras modificações que são ou não na sequência primária num polipéptido de FVII modificado, ou seu conjugado, incluindo a adição de uma parte de hidrato de carbono, a adição de uma parte de polietilenoglicol (PEG), a adição de um domínio Fc, etc, não se lhes limitando. Por exemplo, podem efetuar-se tais modificações adicionais para aumentar a estabilidade ou semivida da proteína.
Os polipéptidos de FVII modificados resultantes incluem os que são polipéptidos zimogénio em cadeia única ou os que são polipéptidos do tipo zimogénio com duas cadeias. Por exemplo, qualquer polipéptido modificado aqui proporcionado que é um polipéptido em cadeia única pode ser autoativado ou ativado por outros fatores de coagulação para gerar um FVII modificado que está numa forma com duas cadeias (i.e. FVIIa). As atividades de um polipéptido de FVII modificado são tipicamente apresentadas na sua forma com duas cadeias.
Os polipéptidos de FVII modificados aqui proporcionados podem apresentar resistência a AT-III aumentada, atividade catalítica aumentada na presença e/ou ausência de TF, resistência aumentada aos efeitos de inibição de Zn2+, resistência aumentada a TFPI, propriedades farmacocinéticas melhoradas, tal como semivida sérica aumentada, glicosilação alterada, ligação e/ou afinidade aumentada para fosfolípidos, ligação e/ou afinidade aumentada para albumina de soro e/ou ligação e/ou afinidade aumentada para integrina hb 3 de plaquetas. Tipicamente, tais propriedades e/ou atividades dos polipéptidos de FVII modificados aqui proporcionados são efetuadas mantendo outras atividades ou propriedades de FVII, tais como ligação a TF e/ou ligação e ativação de FX, não se lhes limitando. Assim, os polipéptidos de FVII modificados aqui proporcionados mantêm ligação a TF e/ou ligação e ativação de FX, comparativamente a um polipéptido de FVII de tipo selvagem ou à sua forma inicial. Tipicamente, tal atividade é substancialmente inalterada (alteração inferior a 1%, 5% ou 10%) comparativamente à proteína de tipo selvagem ou de partida. Noutros exemplos, a atividade de um polipéptido de FVII modificado é aumentada ou é diminuída comparativamente à de polipéptido de FVII de tipo selvagem ou de partida. A atividade pode ser avaliada in vitro ou in vivo e pode ser comparada ao do polipéptido de FVII não modificado, tal como por exemplo, o polipéptido de FVII maduro, nativo de tipo selvagem (SEQ ID NO: 3), o polipéptido precursor de FVII de tipo selvagem (SEQ ID NO: 1 ou 2) ou qualquer outro polipéptido de FVII conhecido na especialidade que é usado como o material de partida.
Assim, em consequência das modificações aqui descritas, os polipéptidos de FVII modificados podem apresentar atividade coagulante aumentada, duração aumentada da atividade coagulante e/ou um índice terapêutico aumentado. Tal pode ser verificado de uma forma dependente de TF e/ou independente de TF. Tipicamente, a atividade coagulante aumentada, duração aumentada da atividade coagulante e/ou um índice terapêutico aumentado dos polipéptidos de FVII modificados aqui proporcionados pode ser observada in vitro ou ex vivo em ensaios adequados ou in vivo, tal como por administração a um indivíduo, tal como um indivíduo humano ou não humano. A atividade aumentada dos polipéptidos de FVII modificados pode ser aumentada pelo menos cerca de 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 110%, 120%, 130%, 140%, 150%, 160%, 170%, 180%, 190%, 200%, 300%, 400%, 500% ou mais comparativamente à atividade do polipéptido FVIIa de partida ou não modificado. 1. Atividade catalítica aumentada FVII contém um resíduo de serina (posição 195 na numeração padrão de quimiotripsina (quimiotripsinogénio) ) no seu centro ativo que atua como um nucleófilo durante a reação de clivagem. A tríade catalítica de serina proteases também inclui dois resíduos adicionais: H57 e D102 (numeração de quimiotripsina). A tríade catalítica de FVIIa humano corresponde a H193, D242 e S344 do polipéptido de FVII maduro apresentado em SEQ ID NO:3. Cada um destes três aminoácidos chave desempenha um papel essencial na atividade catalítica das proteases. As serina proteases hidrolisam ligações peptídicas através da formação de estados de transição tetraédricos e intermediários acil-enzima. A via reacional inicia-se com a ligação não covalente do substrato numa fenda na superfície da protease (i.e., a fenda do local ativo) que contém H57 e S195, para formar um "complexo de Michaelis-Menton". 0 progresso da produção ao longo da via reacional requer ataque nucleofílico subsequente do resíduo carbonilo PI do substrato pelo O-gama da serina do local ativo (i.e., serina 195) da enzima, para formar um estado de transição tetraédrico que rapidamente se converte num intermediário acil-enzima. Uma estrutura no interior da fenda do local ativo que inclui os resíduos glicina 193 e serina 195 (correspondente a G342 e S344 do polipéptido de FVII maduro apresentado em SEQ ID NO: 3) e que é conhecida como a cavidade de oxianião, promove catálise eficaz por estabilização do estado de transição. Especificamente, os hidrogénios amida da cadeia principal destes dois resíduos formam ligações de hidrogénio estabilizantes com o oxianião (i.e., o oxigénio carbonilo do resíduo Pl) que é criado no estado de transição tetraédrico. Além desta estabilização, a ligação do substrato na cavidade do oxianião posiciona a ligação a quebrar adequadamente para as reações produtivas de acilação e desacilação que resultam na clivagem da ligação. A importância da cavidade de oxianião na atividade de FVII é salientada pela observação de que as mutações na posição de aminoácido 342 (correspondente a 193 pela numeração de quimiotripsina) podem resultar em deficiência de FVII (consultar e.g. Bernardi et al. , (1994) Br. J. Haematol. 86:610-618 e Bernardi et al. , (1996) Human Mut. 8:108-115). a. Exemplos de modificações para aumentar a atividade catalítica
Proporcionam-se aqui polipéptidos de FVII modificados que apresentam atividade coagulante aumentada. Tais polipéptidos de FVII podem ser gerados pela substituição de aminoácidos de um ou mais resíduos que podem afetar a conformação da cavidade do oxianião. A introdução de resíduos de aminoácidos diferentes em determinadas posições (e.g., posição 143 pela numeração de quimiotripsina ou 286 pela numeração de FVII maduro) pode alterar a conformação do polipéptido de FVII modificado, de modo que a cavidade do oxianião seja mais eficaz durante a catálise. Tal pode resultar num polipéptido de FVII modificado com atividade catalítica aumentada comparativamente a um polipéptido de FVII não modificado. As alterações na atividade catalítica devidas a mutações que afetam a cavidade do oxianião podem manifestar-se como atividade coagulante aumentada. Os aumentos nas atividades catalítica e coagulante dos polipéptidos de FVII modificados aqui proporcionados podem ser observadas na presença e/ou ausência de fator tecidular (i.e. podem ser dependentes de TF e/ou independentes de TF). Assim, quando avaliados num ensaio adequado in vitro, in vivo, ou ex vivo, tal como após administração a um indivíduo como um agente terapêutico pró-coagulante, os polipéptidos de FVII modificados podem apresentar atividade coagulante aumentada comparativamente à dos polipéptidos de FVII não modificados. A conformação da cavidade do oxianião pode ser alterada para induzir uma conformação mais eficaz, por modificação de um ou mais resíduos de aminoácidos que estão envolvidos na formação da cavidade do oxianião ou que estão na sua proximidade. Tal como aqui proporcionados, um exemplo de tais resíduos de aminoácidos é Q286 (numeração correspondente ao polipéptido de FVII maduro apresentado em SEQ ID N0:3), que corresponde a Q143 pela numeração de quimiotripsina. Q286 pode ser modificado, por exemplo, por substituição, deteção ou inserção de aminoácido. Quando a modificação é efetuada por substituição de aminoácido, o resíduo de glutamina na posição 286 pode ser substituído por qualquer outro resíduo de aminoácido. Q286 está localizado adjacente e em contato com resíduos que formam regiões do local ativo e da fenda do local ativo do polipéptido de FVII. Como tal, afirmou-se que a modificação nesta posição deveria resultar em atividade catalítica diminuída (consultar e.g., patente U.S. No. 6806063). Tal foi demonstrado em estudos anteriores (consultar, e.g., publicação de patente internacional No. W02007031559), em que o resíduo de glutamina foi substituído por uma alanina (Q286A). O polipéptido FVIIa modificado resultante apresenta uma capacidade reduzida de ativar fator X, comparativamente ao polipéptido de tipo selvagem. Noutros estudos, a mesma mutação não teve essencialmente qualquer efeito na atividade catalítica do mutante de FVIIa para fator X (Dickinson et al., (1996) Proc. Nat. Acad. Sei. USA. 93:1437 9-14384) ou um substrato sintético (publicação de patente internacional No. W02 007031559) .
No entanto, tal como aqui demonstrado (consultar exemplo 4 e seguidamente) , a modificação do polipéptido de FVII na posição 286 (numeração correspondente ao polipéptido de FVII maduro apresentado em SEQ ID NO:3; correspondente à posição 143 pela numeração de quimiotripsina), particularmente com um resíduo básico, tal como arginina (Arg, R), resulta num polipéptido de FVII modificado com atividades catalítica e coagulante aumentadas.
Assim, proporcionam-se aqui polipéptidos de FVII modificados que contêm uma substituição de aminoácido na posição de aminoácido correspondente à posição de aminoácidos 286 de um polipéptido de FVII maduro apresentado em SEQ ID NO:3 (posição de aminoácidos 143 por numeração de quimiotripsina). A modificação aqui proporcionada na posição de aminoácidos 286 pode ser feita em qualquer polipéptido de FVII, incluindo um precursor de polipéptido de FVII apresentado em SEQ ID NOS: 1 ou 2, um polipéptido de FVII maduro apresentado em SEQ ID NO:3, ou quaisquer variantes de espécie, alélicas ou modificadas e seus fragmentos ativos, que tem 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência com qualquer um dos polipéptidos de FVII apresentados em SEQ ID NOS: 1-3. A modificação de um polipéptido de FVII na posição de aminoácidos 286 pela numeração de FVII maduro (correspondente ao aminoácido 143 pela numeração de quimiotripsina) pode alterar a conformação da cavidade do oxianião para uma conformação que facilita uma catálise mais eficaz de um substrato. A atividade catalítica aumentada de tais polipéptidos de FVII modificados pode ser apresentada na presença e/ou na ausência de fator tecidular e pode ser avaliada usando ensaios in vitro, tais como os descritos nos exemplos 4 e 7, seguidamente. Além de apresentar atividade catalítica aumentada, os polipéptidos de FVII que foram modificados na posição de aminoácidos 286 pela numeração de FVII maduro também podem apresentar resistência aumentada a AT-III. Tal pode ser devido, por exemplo, a ligação diminuída do polipéptido de FVII modificado a AT-III em condições especificadas (e.g., após injeção a um doente) ou uma velocidade de inativação por ATUI diminuída (i.e., uma constante de velocidade de segunda ordem diminuída para inibição), que pode manifestar-se como atividade coagulante aumentada na presença de AT-III, comparativamente a um polipéptido de FVII não modificado. A resistência aumentada a AT-III pode ser avaliada usando ensaios in vitro, tais como os descritos no exemplo 5. 0 resíduo de aminoácido Q286 pela numeração de FVII maduro (correspondente a Q143 pela numeração de quimiotripsina) pode ser modificado por deleção ou permuta de aminoácido ou substituição por qualquer outro aminoácido. Alternativamente, pode inserir-se um aminoácido imediatamente antes ou a seguir para alterar a conformação na vizinhança do resíduo de aminoácido Q286. Adicionalmente, um polipéptido de FVII contendo uma modificação de Q286 também pode conter uma ou mais outras modificações, incluindo inserções, deleções substituições ou permutas de aminoácidos e modificações que não são na sequência primária do polipéptido, tal como a adição de uma parte de hidrato de carbono, a adição de uma parte de polietilenoglicol (PEG) , a adição de um domínio Fc, etc., ou qualquer sua combinação. Assim, um polipéptido de FVII contendo uma modificação na posição de aminoácidos 286 pela numeração de FVII maduro pode conter 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 30, 40, 50 ou mais posições modificadas. Tais polipéptidos retêm pelo menos uma atividade de um polipéptido de FVII não modificado. Tipicamente, o polipéptido de FVII modificado apresenta atividade coagulante aumentada.
Estas alterações nas atividades podem manifestar-se como atividade coagulante aumentada, duração de atividade coagulante aumentada, inicio mais rápido do beneficio terapêutico, inicio mais rápido de atividade coagulante e/ou um indice terapêutico melhorado. Assim, proporcionam-se aqui polipéptidos de FVII modificados contendo uma modificação na posição de aminoácidos 286 pela numeração de FVII maduro ,que apresentam atividade de coagulação aumentada comparativamente a um polipéptido de FVII não modificado. Tais polipéptidos de FVII modificados podem ser usados no tratamento de doenças ou eventos hemorrágicos, tais como hemofilias, cirurgia, traumatismo e lesão, em que os polipéptidos de FVII podem funcionar para promover a coagulação sanguínea. Devido a uma atividade coagulante aumentada, os polipéptidos de FVII modificados aqui proporcionados que contêm uma modificação na posição de aminoácidos 286, pela numeração de FVII maduro, apresentam vantagens relativamente a tratamento com um polipéptido de FVII de tipo selvagem, tal como NovoSeven® fator VII, incluindo uma diminuição da quantidade de FVII administrado que é necessária para manter uma concentração de FVII ativo suficiente no soro para hemóstase. Tal pode levar, por exemplo, a menor doses e/ou menor frequência de dosagem necessárias para atingir efeitos biológicos comparáveis, início mais rápido do benefício terapêutico, duração de ação mais prolongada, melhor conforto e aceitação pelos indivíduos e/ou atenuação de efeitos secundários indesejáveis. i. Substituições por aminoácidos básicos na posição 286
Proporcionam-se polipéptidos de FVII modificados nos quais a glutamina na posição 286 (numeração correspondente ao polipéptido de FVII maduro apresentado em SEQ ID NO:3; correspondente à posição 143 pela numeração de quimiotripsina) é substituída por arginina (Arg, R) , (i.e. Q286R, correspondente a Q143R pela numeração de quimiotripsina). Os estudos de modelação indicam que a substituição da glutamina por uma arginina resulta na perda de duas interações chave que estabilizam uma conformação inativa da cavidade do oxianião de FVIIa de tipo selvagem ou FVII não modificado. As interações de desestabilização no polipéptido de FVII de tipo selvagem ou não modificado incluem a interação entre a cadeia lateral de Q286 (correspondente a Q143 pela numeração de quimiotripsina) e a amida da cadeia principal de G342 (correspondente a G193 pela numeração de quimiotripsina) e a interação entre o carbonilo da cadeia principal de K341 (correspondente a K192 pela numeração de quimiotripsina) e a amida da cadeia principal de S195 (correspondente a S344 pela numeração de quimiotripsina). No entanto, por substituição da glutamina de tipo selvagem por uma arginina na posição 286, não só se perdem estas interações como se criam duas novas interações importantes. Estas incluem a criação de uma ponte salina entre a cadeia lateral básica do aminoácido R286 modificado (R143 pela numeração de quimiotripsina) e a cadeia lateral ácida do D289 nativo (D146 pela numeração de quimiotripsina) e uma interação da amida da cadeia principal do aminoácido R286 modificado e o carbonilo de cadeia principal de K341 que estabilizam uma conformação ativa do polipéptido FVIIa modificado. Adicionalmente, espera-se que a nova ponte salina entre o aminoácido R286 modificado e D289 altere a conformação e/ou flexibilidade da "ansa de autólise", que faz parte da fenda do local ativo. A ansa de autólise está envolvida na determinação da especificidade do substrato macromolecular e de inibidor de proteases de coagulação. Assim, uma conformação e/ou flexibilidade desta ansa alterada pode resultar, por exemplo, em atividade catalítica aumentada para o substrato (e.g. fator X e/ou fator IX) e resistência aumentada a inibidores (e.g. TFPI e/ou AT-III) . Assim, a modificação da glutamina na posição 286 por um aminoácido básico, tal como arginina (Arg, R) , pode resultar em atividade catalítica e coagulante aumentadas comparativamente ao polipéptido de FVII de tipo selvagem. Assim, proporcionam-se aqui polipéptidos de FVII contendo uma mutação Q286R pela numeração de FVII maduro (correspondente a Q143R, respetivamente, pela numeração de quimiotripsina) . Um exemplo de tal polipéptido é o de uma sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO:118. A substituição de aminoácido da glutamina (Gin, Q) por uma arginina (Arg, R) na posição de aminoácidos correspondente à posição de aminoácidos 286 de um polipéptido de FVII maduro apresentado em SEQ ID NO: 3 pode ser efetuada em qualquer polipéptido de FVII, incluindo um polipéptido precursor de FVII com uma sequência apresentada em SEQ ID NOS: 1 ou 2, um polipéptido de FVII maduro apresentado em SEQ ID NO: 3 ou qualquer variante de espécie, alélica e modificada, tais como os descritos na especialidade e seus fragmentos ativos, que tem 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98% ou 99% de identidade de sequência com qualquer um dos polipéptidos de FVII apresentados em SEQ ID NOS: 1-3. Por exemplo, a mutação Q286R pode ser incorporada em qualquer polipéptido de FVII modificado descrito na especialidade, incluindo qualquer um dos aqui descritos noutro local. Tais polipéptidos de FVII modificados incluem um polipéptido de FVII modificado contendo a(s) mutação(ões) M298Q (SEQ ID NO: 158) consultar e.g. Persson et ai., (2001) Proc. Nat. Acad. Sei. USA 98:13583-13588), E296V/M298Q (SEQ ID NO:343), V158E (SEQ ID NO: 344) , E296R/M298K (SEQ ID NO:345), K337A (SEQ ID NO:34 6) , VI58D/E296V/M298Q (SEQ ID NO:98; NN1731; consultar e.g., Persson et ai., (2007) Art. Thromb. Vase. Biol. 27(3): 683-689), V158D/E2 9 6V/M2 98Q/K337A (SEQ ID NO:347; consultar e.g. Lisman et ai., (2003) J. Thromb. Haem. 1:2175-2178), V253N (SEQ ID NO:348; consultar e.g. US7427592), T106N (SEQ ID NO:349; consultar e.g. US7427592), T106N/V253N (SEQ ID NO:350; consultar e.g. US7427592), K143N/N145T (SEQ ID NO:351; US7442524) , R315NN317T (SEQ ID NO:352;US7442524) ou Kl43N/N145T/R315N/V317T (SEQ ID NO:353;US7442524), não se lhes limitando. A mutação Q286R também pode ser incorporada em polipéptidos de FVII quiméricos ou polipéptidos FVII de fusão ou polipéptidos de FVII que foram modificados de outra forma, tal como por glicoPEGuilação (consultar e.g. W02007022512, Ghosh et ai., (2007) produto de transcrição da apresentação em Am. Society. Hematol. Meeting, 10 de Dezembro de 2007) . Num exemplo, a substituição de aminoácido da glutamina por uma arginina na posição de aminoácidos correspondente à posição de aminoácidos 286 de um polipéptido de FVII maduro apresentado em SEQ ID NO: 3 resulta num polipéptido de FVII com uma sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO:118.
Proporcionam-se aqui polipéptidos de FVII modificados de acordo com as presentes reivindicações que contêm a substituição de aminoácido Q286R pela numeração de FVII maduro (correspondente a Q143R pela numeração de quimiotripsina), em que os polipéptidos de FVII modificados apresentam atividade coagulante aumentada. Tais polipéptidos de FVII modificados podem conter 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 30, 40, 50 ou mais posições modificadas, em que uma das posições modificadas é a posição de aminoácidos 286. Assim, proporcionam-se aqui polipéptidos de FVII modificados de acordo com as presentes reivindicações contendo duas ou mais modificações, em que uma modificação é a substituição de aminoácido Q286R (pela numeração de FVII maduro) e o polipéptido de FVII modificado apresenta atividade coagulante aumentada comparativamente a um polipéptido de FVII não modificado. A mutação Q286R pode ser combinada com qualquer outra mutação aqui descrita ou conhecida na especialidade. Tipicamente, o polipéptido modificado resultante apresenta atividade coagulante aumentada. Um perito na especialidade pode determinar a atividade coagulante de um polipéptido de FVII contendo a modificação Q286R usando ensaios in vitro e in vivo bem conhecidos na especialidade e aqui descritos. Os polipéptidos de FVII modificados aqui proporcionados incluem os que contêm a mutação Q286R e também contêm uma ou mais mutações que, por exemplo, aumentam a resistência a antitrombina-III, aumentam a ativação de FX, aumentam a ativação de FIX, aumentam a ligação e/ou afinidade para fosfolipidos, aumentam a afinidade para fator tecidular, aumentam a atividade intrínseca, aumentam a atividade dependente de TF, alteram a conformação do polipéptido para alterar a zimogenicidade, aumentam a atividade catalítica ou coagulante, tal como deslocamento do equilíbrio entre as conformações de FVIIa altamente ativa e menos ativa no sentido das conformações altamente ativas, aumentam a resistência a proteases, diminuem a glicosilação, aumentam a glicosilação, reduzem a imunogenicidade, aumentam a estabilidade e/ou facilitam a ligação de grupos químicos. A atividade coagulante aumentada dos polipéptidos de FVII modificados contendo a substituição de aminoácido Q286R pode ser um resultado de um aumento da atividade catalítica. A atividade catalítica aumentada pode ser verificada na presença e/ou ausência de fator tecidular (TF) . Assim, a atividade catalítica aumentada pode ser dependente de TF e/ou independente de TF. A atividade catalítica de um polipéptido de FVII modificado contendo a mutação Q286R pode ser avaliada usando ensaios in vitro, tais como os ensaios descritos nos exemplos 4 e 7. Tais ensaios podem determinar a atividade catalítica de um polipéptido de FVII modificado para um substrato, tal como fator X, na presença ou ausência de fator tecidular. Os polipéptidos de FVII modificados contendo a mutação Q286R podem apresentar atividade catalítica aumentada de cerca de 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 200%, 300%, 400%, 500% ou mais na presença e/ou ausência de fator tecidular, comparativamente à atividade catalítica de polipéptido de FVII não modificado ou de tipo selvagem, quer in vivo, quer in vitro. Por exemplo, tal como demonstrado no exemplo 4, um polipéptido FVIIa contendo a mutação Q286R (Q143R pela numeração de quimiotripsina) como a única modificação pode apresentar atividade catalítica para FX, na presença ou ausência de TF, que é aproximadamente duas a quatro vezes maior do que a atividade catalítica apresentada pelo FVII de tipo selvagem. Noutros exemplos, um polipéptido FVIIa contendo as mutações Q286R e M298Q pode apresentar atividade catalítica para FX na presença de TF que é aproximadamente três a quatro vezes maior do que a atividade catalítica apresentada pelo FVII de tipo selvagem e pode apresentar atividade catalítica para FX na ausência de TF que é aproximadamente sete a vinte e seis vezes maior do que a atividade catalítica apresentada pelo FVII de tipo selvagem.
Os exemplos não limitantes de polipéptidos de FVII modificados contendo duas ou mais modificações, nos quais uma modificação é uma substituição de aminoácido Q286R (pela numeração de FVII maduro) e o polipéptido de FVII modificado apresenta atividade catalítica aumentada para FX, na presença e/ou ausência de fator tecidular, comparativamente a um polipéptido de FVII não modificado, são apresentados na tabela 5 e no exemplo 4, seguidamente. O identificador de sequência (SEQ ID NO) é identificado no quais se apresentam exemplos de sequências de aminoácidos do polipéptido de FVII modificado. Tal como discutido mais detalhadamente na secção D. 6, seguidamente, a modificação "Gla swap FIX" envolve deleção do domínio Gla endógeno de FVII por deleção dos resíduos de aminoácidos Al a Y44 (resíduos correspondentes a um polipéptido de FVII maduro apresentado em SEQ ID NO:3) e inserção de 45 resíduos de aminoácidos que correspondem aos resíduos de aminoácidos Y1 a Y45 do domínio Gla de FIX apresentado em SEQ ID NO :83. Em alguns exemplos, o domínio Gla heterólogo de FIX no polipéptido de FVII modificado com "Gla swap FIX" contém uma ou mais substituições de aminoácidos nas posições de aminoácidos correspondentes a M19, E40, K43 e/ou Q44 do domínio Gla de FIX apresentado em SEQ ID NO: 83. Tais substituições são indicadas pelas chavetas (e.g. {Gla swap FIX/Q44S}). Nos casos em que uma posição de aminoácidos modificada não tem um número correspondente em quimiotripsina (i.e. não se encontra entre as posições de aminoácidos 153 a 406 correspondentes a um polipéptido de FVII maduro apresentado em SEQ ID NO: 3 e não é apresentada na tabela 1, anteriormente), a posição é indicada entre parêntesis usando a numeração de FVII maduro. Por exemplo, T158N não tem um número correspondente em quimiotripsina e é apresentado como T[158]N quando se refere a numeração de quimiotripsina.
Um polipéptido de FVII contendo a mutação Q286R, pela numeração de FVII maduro, também pode apresentar resistência aumentada a AT-III. A resistência aumentada a AT-III pode ser um resultado de uma velocidade de inibição por AT-III diminuída ou ligação diminuída a AT-III, em condições especificadas, tal como após injeção num animal ou doente. A resistência a AT-III pode ser demonstrada por medição de uma constante de velocidade de segunda ordem para inibição de polipéptidos FVII de tipo selvagem e variantes. Também se podem usar outros métodos in vitro, tal como ensaios BIAcore®. Os polipéptidos de FVII modificados podem apresentar resistência aumentada aos efeitos de inibição de AT-III, comparativamente a um polipéptido de FVII não modificado, que pode ser avaliada em ensaios in vitro, tais como os descritos no exemplo 5. Os polipéptidos de FVII modificados contendo as mutações Q286R podem apresentar resistência aumentada a AT-III de cerca de 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 200%, 300%, 400%, 500% ou mais comparativamente à resistência a AT-III de polipéptido de FVII não modificado ou de tipo selvagem, quer in vivo, quer in vitro. Por exemplo, tal como demonstrado no exemplo 5 seguidamente, um polipéptido FVIIa contendo a mutação Q286R (Q143R por numeração de quimiotripsina) pode apresentar atividade catalítica para FX na presença de AT-III e na ausência de TF que é duas a quatro vezes maior do que a atividade catalítica apresentada por FVII de tipo selvagem. Assim, o polipéptido de FVII modificado Q286R pode apresentar um aumento de resistência a AT-III de cerca de 200% a 400% da do polipéptido de FVII não modificado. A atividade catalítica aumentada e resistência aumentada a AT-III podem manifestar-se como atividade coagulante aumentada na presença e/ou na ausência de TF. Tais atividades podem ser avaliadas in vitro, ex vivo ou in vivo, tal como por administração a um indivíduo humano ou animal. A atividade de coagulação dos polipéptidos de FVII modificados contendo a mutação Q286R pode ser aumentada pelo menos cerca de 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 200%, 300%, 400%, 500% ou mais comparativamente à atividade de coagulação de polipéptido de FVII não modificado ou de tipo selvagem, quer in vivo, quer in vitro. Por exemplo, o exemplo 6.B.2 demonstra que um polipéptido de FVIIa contendo a mutação Q286R (Q143R pela numeração de quimiotripsina) apresenta atividade de coagulação num modelo de hemorragia em ratinho que é maior (aproximadamente 2 vezes) do que a atividade de coagulação apresentada por um polipéptido de FVII de tipo selvagem (e.g. NovoSeven® FVII). 0 polipéptido FVIIa contendo as mutações Q286R e M298Q (Q143R e M156Q, respetivamente, pela numeração de quimiotripsina) apresenta atividade de coagulação ainda maior. ii. Outras mutações na posição 286
Tal como aqui descrito, a glutamina na posição de aminoácidos correspondente à posição 286 do polipéptido de FVII apresentado em SEQ ID NO: 3, pode ser substituída por um aminoácido diferente de um aminoácido básico (i.e. diferente de arginina, histidina ou lisina). Tais substituições podem alterar a conformação da cavidade do oxianião, por exemplo, resultando numa conformação que aumenta a atividade catalítica do polipéptido de FVII modificado, comparativamente a um polipéptido de FVII de tipo selvagem. Os polipéptidos de FVII modificados que têm uma conformação da cavidade do oxianião alterada podem apresentar atividade catalítica aumentada de cerca de 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 200%, 300%, 400%, 500% ou mais comparativamente à atividade catalítica do polipéptido de FVII não modificado ou de tipo selvagem, quando medida usando ensaios in vivo, ex vivo ou in vitro. A tabela 6 proporciona exemplos não limitativos de exemplos de substituições de aminoácidos em Q286 diferentes da substituição por arginina, correspondente à posição de aminoácido de um polipéptido de FVII maduro, tal como apresentado em SEQ ID NO: 3. Tal como referido, tais polipéptidos de FVII são concebidos para modificar a conformação da cavidade do oxianião para uma conformação mais eficaz e portanto terem atividade coagulante aumentada. Em referência a tais mutações, o primeiro aminoácido (abreviatura de uma letra) corresponde ao aminoácido que é substituído, o número corresponde à posição na sequência de polipéptido de FVII maduro com referência a SEQ ID NO: 3 e o segundo aminoácido (abreviatura de uma letra) corresponde ao aminoácido selecionado que substitui o primeiro aminoácido nessa posição. As posições de aminoácidos para mutação também se denominam pela numeração do esquema de quimiotripsina. Na seguinte tabela 6, o identificador de sequência (SEQ ID NO) é identificado, nas quais se apresentam os exemplos de sequências de aminoácidos do polipéptido de FVII modificado.
Os polipéptidos de FVII modificados que têm uma conformação de cavidade do oxianião alterada podem apresentar atividade catalítica aumentada de cerca de 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 200%, 300%, 400%, 500% ou mais comparativamente à atividade catalítica do polipéptido de FVII não modificado ou de tipo selvagem, quando medida usando ensaios in vivo, ex vivo ou in vitro. Em alguns exemplos, os polipéptidos de FVII modificados que têm uma conformação de cavidade do oxianião alterada podem também apresentar resistência aumentada a inibidores de protease endógenos (i.e., velocidade de inibição diminuída ou afinidade para inibidores diminuída) tal como TFPI ou AT-III em cerca de 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 200%, 300%, 400%, 500% ou mais comparativamente à velocidade de inibição ou afinidade para inibidores endógenos apresentada pelo polipéptido de FVII não modificado ou de tipo selvagem in vivo, ex vivo ou in vitro. A atividade catalítica aumentada e/ou resistência a inibidores endógenos, tal como resistência a AT-III, de tais polipéptidos de FVII modificados também se pode manifestar como atividade de coagulação aumentada, duração de atividade coagulante aumentada, início de atividade coagulante mais rápido e/ou índice terapêutico melhorado. Por exemplo, a atividade de coagulação dos polipéptidos de FVII modificados pode ser aumentada pelo menos cerca de 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 200%, 300%, 400%, 500% ou mais comparativamente à atividade de coagulação de polipéptido de FVII não modificado ou de tipo selvagem, in vivo, ex vivo ou in vitro.
2. Resistência aumentada a AT-III A antitrombina III (também denominada antitrombina ou AT-III) é uma serpina (inibidor de serina protease)anticoagulante importante. AT-III é sintetizada como uma proteína precursora contendo 464 resíduos de aminoácidos (SEQ ID NO:122) . No decurso da excreção, um péptido de sinalização de 32 resíduos é clivado para gerar uma antitrombina humana madura de 432 aminoácidos (SEQ ID NO:123) . A glicoproteína AT-III de 58 kDa circula no sangue e funciona como um inibidor de serina protease (serpina) para inibir um elevado número de serina proteases do sistema de coagulação. Os principais alvos de AT-III são trombina e fator Xa, embora também se tenha demonstrado que AT-III inibe as atividades de FIXa, FXIa, FXIIa e, em menor extensão, FVIIa. A ação de AT-III é muito aumentada por glicosaminoglicanos, tal como o sulfato de heparano de ocorrência natural ou as várias heparinas derivadas de tecido que são vastamente usadas como anticoagulantes na prática clínica. AT-III liga-se de uma forma altamente específica a uma sequência de pentassacárido única na heparina que induz uma alteração conformacional na ansa do centro reativo. Em tal conformação, a ansa do centro reativo de AT-III pode interatuar mais eficazmente com o local reativo da serina protease e efetuar inibição. AT-III não é normalmente inibidora para FVIIa livre no plasma, mesmo na presença de heparina, provavelmente devido à conformação do tipo zimogénio de FVIIa que evita interação eficaz com AT-III. No entanto, os efeitos de inibição de AT-III aumentam quando FVIIa complexa com TF. A ligação de AT-III ao complexo TF/FVIIa pode libertar FVIIa de TF e mantê-lo como um complexo inativo com AT-III. A afinidade aumentada de AT-III para FVIIa ligado a TF comparativamente a FVIIa sozinho reflete presumivelmente a maturação do local ativo de FVIIa quando está complexado a TF, tornando-o assim mais acessível para ligação a AT-III (Rao et al. (1993) Blood 81:2600-2607). Assim, o impacto de AT-III em FVIIa é proporcional à atividade intrínseca da própria molécula de FVIIa, salvo quando se adicionam mutações ao polipéptido FVIIa que medeiam resistência a AT-III. Enquanto FVIIa mantém a sua conformação do tipo zimogénio, AT-III tem um pequeno efeito. Contudo, quando FVIIa muda de conformação para uma forma mais ativa, tal como por ligação a TF ou por modificações específicas in vitro, a inibição por AT-III aumenta significativamente. Os polipéptidos FVIIa que foram modificados para apresentar atividade intrínseca aumentada apresentam simultaneamente um aumento da susceptibilidade a inibição por AT-III. Por exemplo, a modificação de um ou mais aminoácidos no bolso de ativação de FVIIa, tal como pelas substituições de aminoácidos correspondentes às substituições K337A, L305V, M298Q, V158D e E296V (relativamente à sequência de FVII maduro apresentada em SEQ ID NO:3), resulta num aumento de sensibilidade do polipéptido de FVIIa a AT-III, inibindo assim a atividade de FVIIa até 90% (Persson et al. (2001) PNAS 98:13583-13588). Noutro exemplo, a indução de uma conformação mais do tipo zimogénio por modificação de aminoácidos envolvidos na hélice de FVIIa, aumentando a atividade da proteína FVIIa modificada, também aumenta a sua susceptibilidade a AT-III (Persson et al. (2004) Biochem J 379:497-503).
Exemplos de modificações para aumentar a resistência a AT—III
Podem fazer-se modificações a um polipéptido de FVII que aumentam a sua resistência a AT-III. Em geral, tais polipéptidos de FVII modificados mantêm pelo menos uma atividade de um polipéptido de FVII. Tipicamente, tais modificações incluem uma ou mais substituições de aminoácidos em qualquer posição do polipéptido de FVII que estão envolvidas na interação de FVIIa com AT-III. Tais modificações podem, por exemplo, resultar em ligação diminuída do FVII modificado a AT-III. Os polipéptidos de FVII modificados são assim resistentes aos efeitos de inibição naturais de AT-III relativamente ao início de coagulação. Quando avaliados num ensaio in vitro adequado ou in vivo, tal como após administração a um indivíduo como um agente terapêutico pró-coagulante, os polipéptidos de FVII modificados resistentes a AT-III apresentam atividade coagulante aumentada comparativamente a polipéptidos de FVII não modificados.
Tal como aqui descrito seguidamente, um perito na especialidade pode conceber empírica ou racionalmente polipéptidos de FVII modificados que apresentem resistência aumentada a AT-III. Tais polipéptidos de FVII modificados podem ser ensaiados em ensaios conhecidos na especialidade para determinar se tais polipéptidos de FVII modificados apresentam resistência aumentada a AT-III. Por exemplo, tais polipéptidos AT-III modificados podem ser ensaiados para ligação a AT-III. Em geral, um polipéptido de FVII modificado que tem resistência aumentada a AT-III, apresentará ligação diminuída e/ou afinidade diminuída para AT-III. Tipicamente, tais ensaios são efetuados numa forma com duas cadeias de FVII, tal como a forma ativada de FVII (FVIIa). Adicionalmente, os ensaios para determinar os efeitos de AT-III são geralmente efetuados na presença de heparina e na presença de fator tecidular, embora tais ensaios também possam ser efetuados na ausência de um ou de ambos os cofatores.
Proporcionam-se aqui polipéptidos de FVII modificados que apresentam resistência aumentada a AT-III. A resistência a inibição por ATUI é relevante tanto na presença, como na ausência de TF. As variantes de polipéptido de FVII aqui proporcionadas foram modificadas em uma ou mais posições das aminoácidos 239, 931, 366 e 373 (correspondente às posições de aminoácidos 99, 170i, 217 e 224, respetivamente, pela numeração de quimiotripsina). Estes resíduos de aminoácidos podem ser modificados, tal como por permuta, deleção ou substituição de aminoácido. Os resíduos identificados podem ser permutados ou substituídos por qualquer outro aminoácido. Alternativamente, podem usar-se inserções de aminoácidos para alterar a conformação de um resíduo de aminoácido alvo ou da estrutura da proteína na vizinhança de um resíduo de aminoácido alvo.
Pode substituir-se o resíduo de aminoácido endógeno por qualquer resíduo de aminoácido nas posições identificadas. Tipicamente, a substituição de aminoácido é selecionada de modo a interferir com a interação entre FVII e AT-III. Em alguns exemplos, o resíduo de treonina na posição 239 (correspondente à posição 99 pela numeração de quimiotripsina) é substituído por uma serina (Ser, S) , asparagina (Asn, N) , glutamina (Gin, Q), valina (Vai, V), leucina (Leu, L), histidina (His, H) ou isoleucina (lie, I). Noutros exemplos, a prolina na posição 321 (correspondente à posição 170i pela numeração de quimiotripsina) é substituída por uma lisina (Lys, K), ácido glutâmico (Glu, E), serina (Ser, S) ou tirosina (Tyr, Y) . Em exemplos adicionais, a glutamina na posição 366 (correspondente à posição 217 pela numeração de quimiotripsina) é substituída por uma asparagina (Asn, N) , ácido aspártico (Asp, D) , ácido glutâmico (Glu, E) , serina (Ser, S) , treonina (Thr, T) , lisina (Lys, K) ou valina (Vai, V). Noutros exemplos, a histidina na posição 373 (correspondente à posição 224 pela numeração de quimiotripsina) é substituída por um ácido aspártico (Asp, D), ácido glutâmico (Glu, E), serina (Ser, S), fenilalanina (Phe, F) ou alanina (Ala, A) . Num exemplo adicional, podem gerar-se mutantes de combinação. Entre tais mutantes de combinação incluem-se os que têm duas ou mais mutações dos resíduos T239, P321, Q366 e H373 (correspondente a T99, P170i, Q217 e H224, respetivamente, pela numeração de quimiotripsina). Por exemplo, um polipéptido de FVII modificado pode ter substituições de aminoácidos em 2, 3, 4 ou 5 das posições identificadas. Assim, um polipéptido modificado pode apresentar 1, 2, 3, 4 ou 5 mutações que podem resultar em resistência aumentada do polipéptido de FVII modificado aos efeitos de inibição de AT-III. Por exemplo, um polipéptido de FVII pode ser modificado na posição de aminoácidos 366 e posição de aminoácidos 373. Em algum exemplo, as posições são modificadas por permuta de aminoácido, tal como, por exemplo, permuta da glutamina na posição 366 por um ácido aspártico e permuta da histidina na posição 373 por um ácido glutâmico. A tabela 7 proporciona exemplos não limitantes de exemplos de substituições de aminoácidos em resíduos identificados, correspondentes às posições de aminoácidos de um polipéptido de FVII maduro, tal como apresentado em SEQ ID NO:3. Incluem-se entre estes, exemplos de mutações de combinação. Tal como referido, tais polipéptidos de FVII são concebidos para aumentar resistência a AT-III e portanto têm atividade coagulante aumentada. Relativamente a tais mutações, o primeiro aminoácido (abreviatura de uma letra) corresponde ao aminoácido que é substituído, o número corresponde à posição na sequência do polipéptido de FVII maduro com referência a SEQ ID NO: 3 e o segundo aminoácido (abreviatura de uma letra) corresponde ao aminoácido selecionado que substitui o primeiro aminoácido nessa posição. As posições de aminoácidos para mutação também são referidas pelo esquema de numeração de quimiotripsina. Na seguinte tabela 7, o identificador de sequência (SEQ ID NO) é identificado no qual os exemplos de sequências de aminoácidos do polipéptido de FVII modificado são apresentadas.
Os polipéptidos modificados de FVII que têm resistência aumentada a AT-III podem apresentar uma diminuição da extensão de inibição em condições especificadas ou na constante de velocidade de segunda ordem para inibição por AT-III em pelo menos cerca de 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 200%, 300%, 400%, 500% ou mais comparativamente à extensão de inibição ou à constante de velocidade de segunda ordem para inibição do polipéptido de FVII não modificado ou de tipo selvagem, in vivo ou in vitro. Assim, os polipéptidos de FVII modificados podem apresentar resistência aumentada a AT-III que é pelo menos cerca de 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 200%, 300%, 400%, 500% ou mais da resistência apresentada por um polipéptido de FVII não modificado. A resistência aumentada a AT-III por tais polipéptidos de FVII modificados também pode ser manifestada como um aumento da atividade de coagulação, duração da atividade de coagulação e/ou indice terapêutico melhorado na presença de AT-III. A atividade de coagulação dos polipéptido de FVII modificados para AT-III pode ser aumentada pelo menos cerca de 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 200%, 300%, 400%, 500% ou mais comparativamente à atividade de coagulação de polipéptido de FVII não modificado ou de tipo selvagem, in vivo ou in vitro. 3. Aumento da resistência a inibição por Zn2+ A atividade amidolitica de FVIIa é regulada por alterações alostéricas induzidas por ligação de iões cálcio e fator tecidular (TF). FVII livre tipicamente existe numa conformação inativa. A ligação de Ca2+ e TF induz uma alteração na conformação e atividade amidolitica aumentada (Pederson et al. , (1990) J Biol. Chem. 2 65:16786-16793). Contrariamente, demonstrou-se que a ligação de iões zinco a FVIIa tem um efeito inibidor na atividade. A ligação de Zn2+ a FVIIa resulta em atividade amidolitica diminuída e afinidade para TF reduzida. Os estudos indicam que Ca2+ e Zn2+ competem para ligação a FVIIa, de modo que na presença de Ca2+, o efeito inibidor de Zn2+ é diminuído. Adicionalmente, FVIIa ligado a TF é menos susceptível a inibição por zinco.
Além dos locais de ligação de Zn2+ no domínio Gla, cuja ligação não afeta a atividade amidolitica de FVIIa, mapearam-se dois locais de ligação de Zn2+ no domínio de protease de FVII (Petersen et al., (2000) Protein Sei. 9:859-866, Bajaj et al. , (2006) J. Biol. Chem. 281:24873-24888) . O mapeamento destes locais de ligação no domínio de protease indica que o primeiro local de ligação de Zn2+ envolve as cadeias laterais dos resíduos de aminoácidos H216, E220 e S222 (H76, E80 e S82 pela numeração de quimiotripsina) e o segundo local de ligação de Zn2+ envolve as cadeias laterais dos resíduos de aminoácidos H257, D219 e K161 (H117, D79 e K24 pela numeração de quimiotripsina).
Assim, Zn2+ poderia ter um papel fisiológico na regulação de homeostasia como um inibidor de FVII. Foi postulado que estes efeitos de inibição ocorrem como resultado de um aumento da concentração de Zn2+ no local do coágulo, após ativação de plaquetas (Bajaj et al. , (2006) J. Biol. Chem. 281:24873- 24888) . As plaquetas armazenam elevadas quantidades de Zn2+ no citoplasma e grânulos , que é libertado após ativação das plaquetas. Tal poderia aumentar a concentração local de Zn2+, que por seu lado inibiria a atividade de FVIIa e a ligação de FVIIa a TF.
Exemplos de modificações para aumentar a resistência a inibição por Zn2+
Proporcionam-se aqui polipéptidos de FVII modificados que apresentam resistência aumentada aos efeitos de inibição de Zn2+. Tal pode ser conseguido, por exemplo, por mutação de um ou mais resíduos em FVII envolvidos na interação e ligação de Zn2+, para reduzir ou evitar tal ligação, tornando assim os polipéptidos de FVII modificados resistentes aos efeitos de inibição de Zn2+ relativamente à atividade catalítica e ligação a TF. Quando avaliado num ensaio adequado in vitro ou in vivo, tal como após administração a um indivíduo como um agente terapêutico pró-coagulante, os polipéptidos de FVII modificados podem apresentar atividade coagulante aumentada comparativamente a polipéptidos de FVII não modificados.
Proporcionam-se aqui polipéptidos de FVII modificados com uma ou mais mutações em resíduos que podem estar envolvidos em ligação de Zn2+ no domínio de protease. Tais resíduos incluem K161, H216, D219, E220, S222 e H257, com a numeração relativa às posições de aminoácidos de um polipéptido de FVII maduro apresentado em SEQ ID NO: 3 (correspondente a K24, H76, D79, E80, S82 e H117, respetivamente, pela numeração de quimiotripsina), não se lhes limitando. Em alguns exemplos, modifica-se um ou mais dos resíduos de aminoácidos H216, S222 e H257 (correspondentes a H76, S82 e H117, respetivamente, pela numeração de quimiotripsina), tal como por substituição ou deleção de aminoácido. Pode usar-se qualquer resíduo de aminoácido para substituir o resíduo endógeno nas posições identificadas. Por exemplo, proporcionam-se aqui polipéptidos de FVII modificados nos quais a histidina na posição de aminoácidos 216 é substituída por um resíduo de serina, alanina, lisina ou arginina. Noutro exemplo, a serina na posição de aminoácidos 222 é substituída por um resíduo de alanina ou lisina, ou a histidina na posição 257 é substituída por um resíduo de alanina ou serina. Num exemplo adicional, a lisina na posição 161 é substituída por um resíduo de serina, alanina ou valina. As modificações também incluem inserções de aminoácidos nas posições de aminoácidos identificadas como estando envolvidas na ligação de Zn2+ ou perto delas. Tais inserções podem destruir o local de ligação de Zn2+, resultando num polipéptido de FVII modificado com ligação diminuída a Zn2+.
Também se podem gerar mutantes de combinação nos quais se fazem substituições de aminoácidos em mais do que um dos resíduos identificados anteriormente num polipéptido de FVII. Incluem-se entre tais mutantes de combinação os que têm duas ou mais mutações dos resíduos K161, H216, D219, E220, S222 e H257 (correspondentes a K24, H76, D79, E80, S82 e H117, respetivamente, pela numeração de quimiotripsina). Por exemplo, um polipéptido de FVII modificado pode ter substituições de aminoácidos em 2, 3, 4, 5 ou 6 das posições identificadas. Assim, um polipéptido modificado pode apresentar 1, 2, 3, 4, 5 ou 6 mutações que podem resultar numa capacidade diminuída do polipéptido de FVII modificado se ligar a Zn2+. Por exemplo, um polipéptido de FVII pode ser modificado pela permuta de aminoácido da serina na posição 222 por uma lisina e da histidina na posição 257 por um resíduo de alanina.
Os polipéptidos de FVII modificados que têm resistência aumentada aos efeitos de inibição de Zn2+ podem apresentar um aumento de pelo menos cerca de 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 200%, 300%, 400%, 500% ou mais comparativamente à resistência de polipéptido de FVII não modificado ou de tipo selvagem, in vivo ou in vitro. Uma diminuição da ligação a Zn2+ e portanto resistência aumentada aos efeitos de inibição de Zn2+ por tais polipéptidos de FVII modificados também se pode manifestar como atividade de coagulação aumentada na presença de Zn2+. A atividade de coagulação dos polipéptidos de FVII modificados pode ser aumentada pelo menos cerca de 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 200%, 300%, 400%, 500% ou mais comparativamente à atividade de coagulação de polipéptido de FVII não modificado ou de tipo selvagem, in vivo ou in vitro. A tabela 8 proporciona exemplos não limitativos de exemplos de permutas de aminoácidos nos resíduos identificados, correspondentes a posições de aminoácidos de um polipéptido de FVII maduro tal como apresentado em SEQ ID NO: 3. Incluem-se entre estes, exemplos de mutações de combinação. Tal como referido, tais polipéptidos de FVII são concebidos para apresentar capacidade de ligarem Zn2+ reduzida e portanto resistência aumentada aos efeitos de inibição de Zn2+. Assim, o polipéptido de FVII modificado pode ter atividade coagulante aumentada. Relativamente a tais mutações, o primeiro aminoácido (abreviatura de uma letra) corresponde ao aminoácido que é substituído, o número corresponde à posição na sequência de polipéptido de FVII maduro com referência a SEQ ID NO: 3 e o segundo aminoácido (abreviatura de uma letra) corresponde ao aminoácido selecionado para substituir o primeiro aminoácido nessa posição. As posições de aminoácidos para mutação também se denominam pelo esquema de numeração de quimiotripsina. Na seguinte tabela 8, o identificador de sequência (SEQ ID NO) é identificado no qual é apresentado um exemplo de sequência de aminoácidos do polipéptido de FVII modificado.
4. Glicosilação alterada
As propriedades e atividades de uma proteína podem ser alteradas por modulação da extensão, nível e/ou tipo de glicosilação. Por exemplo, a glicosilação pode aumentar a semivida sérica de polipéptidos, por aumento da estabilidade, solubilidade e diminuição da imunogenicidade de uma proteína. A glicosilação pode aumentar a estabilidade de proteínas por redução da proteólise da proteína e pode proteger a proteína de degradação térmica, exposição a agentes desnaturantes, danos por radicais livres de oxigénio e alterações de pH. A glicosilação pode também permitir que a proteína alvo evite os mecanismos de depuração que podem envolver ligação a outras proteínas, incluindo receptores de superfície celular. As partes de hidrato de carbono que contêm ácido siálico podem afetar a solubilidade de uma proteína. As partes de ácido siálico são altamente hidrofílicas e podem proteger resíduos hidrofóbicos da proteína alvo. Tal diminui a aglutinação e precipitação da proteína alvo. A aglutinação reduzida também ajuda a prevenir a resposta imunitária contra a proteína alvo. Os hidratos de carbono podem adicionalmente proteger sequências imunogénicas do sistema imunitário. 0 volume de espaço ocupado pelas partes de hidrato de carbono pode diminuir a área superficial disponível que é rastreada pelo sistema imunitário. Estas propriedades levam à diminuição da imunogenicidade da proteína alvo.
Os locais de glicosilação proporcionam um local para ligação de monossacáridos e oligossacáridos a um polipéptido, através de uma ligação glicosídica, de modo que o polipéptido é glicosilado quando é produzido numa célula eucariótica capaz de glicosilação. Os dois tipos principais de glicosilação são glicosilação ligada a N, em que as unidades de açúcar são ligadas através do azoto amida de um resíduo de asparagina, e glicosilação ligada a 0, em que as unidades de açúcar são ligadas através do grupo hidroxilo de resíduos de serina, treonina, hidroxilisina ou hidroxiprolina. Outras formas menos relevantes de ligações glicosídicas incluem ligação a S de cisteína e ligação a C de triptofano. A glicosilação ligada a N ocorre em asparaginas na sequência consensual -Asn-Xaa-Ser/Thr/Cys em que Xaa não é prolina. Não se conhece nenhum padrão para glicosilação em 0, embora a glicosilação em 0 seja mais provável em sequências com uma elevada proporção de resíduos de serina, treonina e prolina. No entanto, a presença de um potencial local de glicosilação não é garantia que o local seja glicosilado durante o processamento pós-tradução no ER. Adicionalmente, o nível de glicosilação pode variar num determinado local e um local pode ter muitas estruturas de glicano diferentes. Existem quatro locais de glicosilação de ocorrência natural em FVII; dois locais de glicosilação em N, em N145 e N322, e dois locais de glicosilação em 0, em S52 e S60, correspondentes a posições de aminoácidos no polipéptido de FVII maduro apresentado em SEQ ID NO:3.
Exemplos de modificações para alterar glicosilação
Proporcionam-se aqui polipéptidos de FVII que foram modificados por alteração do nivel e/ou tipo de glicosilação comparativamente a um polipéptido de FVII não modificado. A glicosilação pode ser aumentada ou diminuída comparativamente ao FVII não modificado. Em alguns casos, o nível de glicosilação é aumentado, resultando num polipéptido de FVII hiperglicosilado. Tal pode ser conseguido, por exemplo, por incorporação de pelo menos um local de glicosilação não nativo que não é existe no polipéptido de FVII não modificado, ao qual se liga uma parte de hidrato de carbono. Também se podem gerar polipéptidos de FVII hiperglicosilados por ligação de uma parte de hidrato de carbono a pelo menos um local de glicosilação nativo presente no polipéptido de FVII não modificado mas que não está glicosilado. Noutros exemplos, o nível de glicosilação num polipéptido de FVII modificado é reduzido comparativamente a um polipéptido de FVII não modificado. Tal pode ser conseguido por eliminação de um ou mais locais de glicosilação nativos, tal como por permuta ou deleção de aminoácido. Um ou mais dos resíduos de aminoácidos nas posições de aminoácidos 52, 60, 145 e 322 correspondentes a um polipéptido de FVII maduro apresentado em SEQ ID NO: 3 podem ser deletados ou podem ser substituídos por um resíduo de aminoácido que não pode ser ligado a partes de hidrato de carbono. Por exemplo, os resíduos de serina nas posições 52 e/ou 60 podem ser substituídos por um resíduo de alanina, eliminando assim um ou ambos os locais de glicosilação em O nativos. Assim, podem introduzir-se, alterar-se, eliminar-se ou rearranjar-se os locais de glicosilação num polipéptido de FVII.
Um polipéptido de FVII pode ser modificado numa ou mais posições para alterar a glicosilação do polipéptido. Os polipéptidos de FVII modificados aqui proporcionados que têm glicosilação alterada comparativamente a um polipéptido de FVII não modificado podem não ter glicosilação, ter glicosilação ligada a O, glicosilação ligada a N e/ou uma sua combinação. Em alguns exemplos, um polipéptido de FVII modificado inclui 1, 2, 3, 4, 5 ou mais partes de hidrato de carbono, cada uma delas ligada a locais de glicosilação diferentes. Os locais de glicosilação podem ser um local de glicosilação nativo e/ou um local de glicosilação não nativo. Em alguns exemplos, o polipéptido de FVII modificado é glicosilado em mais do que um local de glicosilação não nativo. Por exemplo, um polipéptido de FVII modificado pode ser modificado para introduzir 1, 2, 3, 4, 5 ou mais locais de glicosilação não nativos.
Os locais de glicosilação não nativos podem ser introduzidos por substituição de aminoácido. Podem criar-se locais de glicosilação em 0, por exemplo, por substituição de aminoácido de um resíduo nativo por uma serina ou treonina. Os locais de glicosilação em N podem ser criados estabelecendo o motivo Asn-Xaa-Ser/Thr/Cys, em que Xaa não é prolina. A criação desta sequência consensual por modificação de aminoácidos poderia envolver substituição de um resíduo de aminoácido nativo por uma asparagina, substituição de um resíduo de aminoácido nativo por uma serina, treonina ou cisteína ou substituição de um resíduo de aminoácido nativo por uma asparagina e substituição de um resíduo de aminoácido nativo por uma serina, treonina ou cisteína. Por exemplo, a lisina na posição 109 (com base na numeração de um FVII maduro apresentado em SEQ ID NO: 3) pode ser substituída por uma asparagina para criar um novo motivo Asn-Xaa-Ser no domínio de EGF1 e um novo local de glicosilação em N na posição de aminoácidos 109. Noutro exemplo, a alanina da posição 292 é substituída por uma asparagina e a alanina da posição 294 é substituída por uma serina, para criar um novo motivo Asn-Xaa-Ser e um novo local de glicosilação em N na posição de aminoácidos 292. Num exemplo adicional, a alanina da posição 175 é substituída por uma serina, para criar um novo motivo Asn-Xaa-Ser nas posições de aminoácidos 173-175 com base na numeração de um FVII maduro apresentado em SEQ ID NO: 3 e um novo local de glicosilação em N na posição de aminoácidos 173. Podem criar-se locais de glicosilação não nativos em qualquer região no polipéptido de FVII. Por exemplo, podem introduzir-se um ou mais locais de glicosilação no domínio de EGF1, que corresponde às posições de aminoácidos 46-82 do polipéptido de FVII maduro em SEQ ID NO: 3. Noutros exemplos, introduzem-se locais de glicosilação não nativos na região do domínio de protease do polipéptido de FVII ou em posições que se podem associar com a região do domínio de protease por enrolamento da proteína.
Os locais de glicosilação nativos podem ser modificados para evitar glicosilação ou melhorar ou diminuir glicosilação, enquanto outras posições no polipéptido de FVII podem ser modificadas para introduzir locais de glicosilação não nativos. Em alguns exemplos, pode modificar-se o teor em hidratos de carbono do polipéptido de FVII. Por exemplo, pode alterar-se o número da posição, força da ligação, estrutura e composição das ligações de hidrato de carbono (i.e., estrutura do hidrato de carbono com base na natureza das ligações glicosídicas ou ramificações do hidrato de carbono) das partes de hidrato de carbono adicionadas ao polipéptido de FVII.
Os polipéptidos de FVII modificados aqui proporcionados que têm glicosilação alterada mantêm pelo menos uma atividade de FVII. Tipicamente, os polipéptidos de FVII modificados aqui proporcionados que têm glicosilação alterada apresentam atividade coagulante aumentada comparativamente a um FVII não modificado. Em alguns exemplos, o nível de glicosilação de um polipéptido de FVII é aumentado. 0 nível de glicosilação pode ser aumentado em pelo menos cerca de 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 200%, 300%, 400%, 500% ou mais comparativamente ao nível de glicosilação de polipéptido de FVII não modificado ou de tipo selvagem. Noutros exemplos, o nível de glicosilação é diminuído. O nível de glicosilação pode ser diminuído em pelo menos cerca de 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 200%, 300%, 400%, 500% ou mais comparativamente ao nível de glicosilação do polipéptido de FVII não modificado ou de tipo selvagem. Os níveis de glicosilação alterados ou alterações no tipo de glicosilação presente num polipéptido de FVII modificado, comparativamente a um polipéptido de FVII não modificado, podem manifestar-se como atividade de coagulação aumentada. A atividade de coagulação dos polipéptidos de FVII modificados com glicosilação alterada pode ser aumentada em pelo menos ou cerca de 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 200%, 300%, 400%, 500% ou mais comparativamente à atividade de coagulação de polipéptido de FVII não modificado ou de tipo selvagem, in vivo ou in vitro. A tabela 9 proporciona exemplos não limitativos de exemplos de permutas de aminoácidos, correspondentes a posições de aminoácidos de um polipéptido de FVII maduro tal como apresentado em SEQ ID NO:3, que são incluídas no polipéptido de FVII modificado para alterar os níveis de glicosilação por adição ou eliminação de locais de glicosilação. Os exemplos de substituições de aminoácidos podem criar locais de glicosilação não nativos ou eliminar locais de glicosilação nativos. Em alguns casos, são necessárias duas substituições de aminoácidos para criar um novo local de glicosilação. Também se incluem na tabela 9 exemplos de mutações de combinação que criam mais do que um novo local de glicosilação não nativo no polipéptido de FVII. Tal como mencionado anteriormente, as alterações nos níveis de glicosilação podem, por exemplo, aumentar a semivida. Assim, os polipéptidos de FVII modificados podem ter atividade coagulante aumentada. Relativamente a tais mutações, o primeiro aminoácido (abreviatura de uma letra) corresponde ao aminoácido que é substituído, o número corresponde à posição na sequência do polipéptido de FVII maduro por referência a SEQ ID NO: 3 e o segundo aminoácido (abreviatura de uma letra) corresponde ao aminoácido selecionado que substitui o primeiro aminoácido nessa posição. As posições de aminoácidos para mutação também se denominam pelo esquema de numeração de quimiotripsina quando adequado. Em circunstâncias em que uma posição de aminoácidos modificada não tem um número de quimiotripsina correspondente (i.e. não está entre as posições de aminoácidos 153 a 406 correspondente a um polipéptido de FVII maduro apresentado em SEQ ID NO:3 e não é apresentada na tabela 1, anteriormente), a posição apresenta-se entre parêntesis usando a numeração de FVII maduro. Por exemplo, A51N não tem um número de quimiotripsina correspondente e é apresentado como A[51]N quando se refere à numeração de quimiotripsina. Na seguinte tabela 9, o identificador de sequência (SEQ ID NO) é identificado nos caso em que se apresentam exemplos de sequências de aminoácidos do polipéptido de FVII modificado. Também se identificam na tabela 9 quaisquer novos locais de glicosilação não nativos gerados pela(s) modificação(ões).
5. Ligação aumentada a albumina de soro e/ou a integrina nb 3 de plaquetas 0 FVII recombinante não modificado tem uma semivida sérica de apenas 1,5-3 horas em humanos. 0 aumento da semivida sérica de um polipéptido de FVII pode reduzir em quantidade e frequência as dosagens necessárias para efeito terapêutico. Podem usar-se várias estratégias para aumentar a semivida sérica, incluindo aumento da glicosilação, aumento da resistência a protease, PEGuilação e conjugação ou fusão a proteínas maiores, tal como albumina de soro e a parte Fc de IgG, não se lhes limitando. Tais modificações podem resultar, por exemplo, em redução da degradação do polipéptido de FVII por proteases séricas, redução da depuração renal, redução da depuração hepática e redução da neutralização ou depuração pelo sistema imunitário. Outra estratégia que pode ser utilizada para aumentar a semivida sérica de um polipéptido de FVII envolve o enxerto de sequências de ligação num polipéptido de FVII não modificado, para estabelecer novas interações proteína-proteína ou interações proteína-proteína melhoradas que não se verificam num polipéptido de FVIII não modificado.
As sequências de ligação que são inseridas no polipéptido de FVII não modificado podem conter cerca de 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20, 25, 30 ou mais resíduos de aminoácidos que facilitam a interação com outra proteína. As sequências de ligação podem corresponder a uma sequência de ligação presente naturalmente numa proteína nativa ou podem ser uma sequência de ligação sintética com pouca ou nenhuma correlação de sequência com as sequências de ligação presentes naturalmente numa proteína nativa. As sequências de ligação usadas para modificar os polipéptidos de FVII aqui interatuam especificamente com um local de ligação numa outra proteína, estabelecendo uma interação proteína-proteína não covalente. Em alguns exemplos, a proteína para a qual a sequência de ligação é específica é uma proteína sérica, tal como, por exemplo, albumina de soro. Tais sequências são bem conhecidas na especialidade (consultar e.g. US20030069395, US20040009534, e US20070202045). Noutros exemplos, a proteína reconhecida pela sequência de ligação é um receptor ou ligando de superfície celular, tal como, por exemplo, integrina nb 3 de plaquetas (Smith et al. (1995) J. Biol. Chem. 270:30486- 30490). A afinidade com a qual o polipéptido de FVII modificado se liga à proteína sérica ou receptor de superfície celular é tipicamente caracterizada por uma constante de dissociação, Kd, de 1 μΜ, 100 nM, 10 nM, 1 nM, 100 pM, 10 pM, 1 pM ou menor. A ligação do polipéptido de FVII modificado à proteína sérica ou receptor de superfície celular através da sequência de ligação pode reduzir, por exemplo, a depuração renal ou a depuração hepática do polipéptido de FVII modificado, comparativamente a um polipéptido de FVII não modificado. Em alguns exemplos, a ligação do polipéptido de FVII modificado a um receptor de superfície celular também pode ter como alvo a ligação do polipéptido de FVII modificado a um tipo de célula ou de tecido ou região pretendida no corpo, "concentrando" assim esse polipéptido de FVII num local especifico, tal como, por exemplo, um coágulo sanguíneo. Assim, os polipéptidos de FVII modificados contendo sequências de ligação enxertadas podem apresentar semivida aumentada comparativamente a um polipéptido de FVII não modificado. a. Exemplos de polipéptidos de FVII com sequências de ligação a albumina de soro
Descrevem-se aqui polipéptidos de FVII modificados contendo sequências de ligação a albumina de soro. Os polipéptidos de FVII modificados podem ligar-se a albumina de soro in vitro ou in vivo, resultando numa semivida aumentada. Assim, descrevem-se aqui polipéptidos de FVII modificados com semivida aumentada comparativamente a um polipéptido de FVII não modificado. Quando avaliado por um ensaio adequado in vitro ou in vivo, tal como após administração a um indivíduo como um agente terapêutico pró-coagulante, os polipéptidos de FVII modificados podem apresentar atividade coagulante aumentada comparativamente a polipéptidos de FVII não modificados.
Os polipéptidos de FVII modificados aqui descritos podem conter sequências de ligação a albumina de soro. As sequências de ligação a albumina de soro podem ser inseridas no polipéptido de FVII não modificado ou podem ser ligadas ao terminal C ou N do polipéptido de FVII. Por exemplo, a sequência de ligação a albumina de soro pode estender-se desde o resíduo de prolina na posição de aminoácidos 406 no terminal C do polipéptido de FVII (correspondente a um polipéptido de FVII maduro apresentado em SEQ ID NO:3). Caso as sequências de ligação sejam inseridas no polipéptido de FVII, a inserção é numa posição de modo que o polipéptido de FVII modificado resultante mantenha pelo menos uma atividade de um polipéptido de FVII não modificado. A sequência de ligação pode ser inserida no polipéptido de FVII sem remover quaisquer resíduos de aminoácidos no polipéptido de FVII ou pode substituir um ou mais resíduos de aminoácidos no polipéptido de FVII. Em alguns exemplos, uma sequência de ligação a albumina de soro substitui os resíduos de aminoácidos S103 a Slll (correspondente a um polipéptido de FVII maduro apresentado em SEQ ID NO:3) para gerar um polipéptido de FVII modificado.
Noutros exemplos, uma sequência de ligação a albumina de soro substitui os resíduos de aminoácidos H115 a S126, ou T128 a P134 (correspondente a um polipéptido de FVII maduro apresentado em SEQ ID NO:3). Apresentam-se exemplos de sequências de ligação a albumina de soro em SEQ ID NOS: 206-212 . A tabela 10 proporciona exemplos não limitativos de exemplos de modificações que podem ser efetuadas numa inserção de sequência de ligação a albumina de soro no polipéptido de FVII. Tal como referido anteriormente, a inclusão de uma sequência de ligação a albumina de soro pode aumentar a semivida de um polipéptido de FVII. Assim, os polipéptidos de FVII modificados podem ter atividade coagulante aumentada. Relativamente às modificações listadas na tabela 10, os resíduos de aminoácidos nos quais a sequência de ligação a albumina de soro é inserida no polipéptido de FVII e a sequência da sequência de ligação são ambas representadas na tabela. Por exemplo, S103SllldelinsQRLMEDICLPRWGCLWEDDF indica que os resíduos de aminoácidos S103 a Slll da numeração de um polipéptido de FVII não modificado completo (resíduos correspondentes à sequência de polipéptido de FVII maduro apresentada em SEQ ID NO: 3) foram deletadas e substituídas por uma sequência de ligação a albumina de soro com a sequência de aminoácidos QRLMEDICLPRWGCLWEDDF (SEQ ID NO:206). A indicação de um único resíduo de aminoácido, tal como P406, indica que a sequência de ligação a albumina de soro é inserida após P406 e sem deleção de quaisquer resíduos de aminoácidos do polipéptido de FVII. As posições de aminoácidos para mutação também são indicadas pelo esquema de numeração de quimiotripsina quando adequado. Em circunstâncias em que uma posição de aminoácidos modificada não tem um número de quimiotripsina correspondente (i.e. que não está nas posições de aminoácidos 153 a 406 correspondente a um polipéptido de FVII maduro apresentado em SEQ ID NO:3 e não é apresentada na tabela 1, anteriormente), a posição é indicada entre parêntesis usando a numeração de FVII maduro. Por exemplo, S103 não tem um número correspondente na numeração de quimiotripsina e é apresentada como S [103] quando se refere a numeração de quimiotripsina na tabela 10 seguidamente. O identificador de sequência (SEQ ID NO) é identificado nos casos em que se apresentam exemplos de sequências de aminoácidos do polipéptido de FVII modificado.
Os polipéptidos modificados de FVII, contendo uma sequência de ligação a albumina de soro, podem apresentar ligação aumentada a albumina de soro que é pelo menos ou cerca de 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 20%. 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 200%, 300%, 400%, 500% ou mais comparativamente à ligação de polipéptido de FVII não modificado ou de tipo selvagem a albumina de soro, quer in vivo, quer in vitro. Os polipéptidos modificados de FVII que se podem ligar a albumina de soro podem apresentar semivida sérica aumentada pelo menos cerca de 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 200%, 300%, 400%, 500% ou mais comparativamente à semivida sérica de polipéptido de FVII não modificado ou de tipo selvagem, in vivo ou in vitro. A ligação aumentada a albumina de soro e/ou semivida sérica aumentada de tais polipéptidos de FVII modificados também se pode manifestar como um aumento da atividade de coagulação, duração de atividade coagulante aumentada e/ou índice terapêutico melhorado. A atividade de coagulação dos polipéptidos de FVII modificados pode ser aumentada em pelo menos cerca de 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 200%, 300%, 400%, 500% ou mais comparativamente à atividade de coagulação de polipéptido de FVII não modificado ou de tipo selvagem, in vivo ou in vitro. b. Exemplos de polipéptidos de FVII com sequências de ligação a integrina nb 3 de plaquetas
Descrevem-se aqui polipéptidos de FVII modificados contendo sequências de ligação a integrina nb 3 de plaquetas. A integrina nb 3 de plaquetas (também denominada glicoproteína (GP) Ilb/IIIa) é o receptor de adesão de plaquetas mais abundante. É um heterodímero dependente de cálcio que serve como um receptor para proteínas, incluindo fibrinogénio, fibronectina, vitronectina, fator de von Willebrand e trombospondina, não se lhes limitando. A ligação de ligandos de proteína "cognatos" pode ativar ia 3 e induzir transdução de sinal no citoplasma através do domínio intercelular da proteína. Assim, os polipéptidos modificados de FVII contendo sequências de ligação a integrina nb 3 de plaquetas podem ligar-se a plaquetas. Os polipéptidos de FVII modificados podem ligar-se a integrina nb 3 de plaquetas (a forma ativada e/ou inativada), in vitro ou in vivo, resultando numa semivida aumentada. Assim, essas variantes de FVIIa que se ligam seletivamente a nb 3 ativada podem ter como alvo plaquetas ativadas e assim concentrarem-se no local de um coágulo sanguíneo em desenvolvimento. Espera-se que a direção seletiva de FVIIa a coágulos sanguíneos em desenvolvimento melhore a utilidade terapêutica da variante, melhorando tanto a eficácia, como o índice terapêutico. Assim, descrevem-se aqui polipéptidos de FVII modificados com semivida aumentada comparativamente a um polipéptido de FVII não modificado e variantes que adicionalmente ligam-se seletivamente a plaquetas ativadas. Quando avaliados num ensaio adequado in vitro ou in vivo, tal como após administração a um indivíduo como um agente terapêutico pró-coagulante, os polipéptidos de FVII modificados podem apresentar atividade coagulante aumentada comparativamente a polipéptidos de FVII não modificados.
Os polipéptidos de FVII modificados aqui descritos contêm sequências de ligação a integrina nb 3 de plaquetas. As sequências de ligação a integrina nb 3 de plaquetas podem ser inseridas no interior do polipéptido de FVII não modificado ou podem ser ligadas ao terminal C ou N do polipéptido de FVII. Por exemplo, as sequências de ligação de nb 3 podem estender-se do resíduo de prolina na posição de aminoácidos 406 no terminal C do polipéptido de FVII (correspondente a um polipéptido de FVII maduro apresentado em SEQ ID NO: 3) . Caso as sequências de ligação sejam inserida no interior do polipéptido de FVII, a inserção é numa posição tal que o polipéptido de FVII modificado resultante mantém pelo menos uma atividade de um polipéptido de FVII não modificado. A sequência de ligação pode ser inserida no polipéptido de FVII sem remover quaisquer resíduos de aminoácidos no polipéptido de FVII ou pode substituir um ou mais resíduos de aminoácidos no polipéptido de FVII. Em alguns exemplos, a sequência de ligação de integrina nb 3 de plaquetas substitui os resíduos de aminoácidos S103 a Slll (correspondente a um polipéptido de FVII maduro apresentado em SEQ ID NO:3) para gerar um polipéptido de FVII modificado. Noutros exemplos, uma sequência de ligação de nb 3 substitui os resíduos de aminoácidos H115 a S126 ou T128 a P134 (correspondente a um polipéptido de FVII maduro apresentado em SEQ ID NO: 3) . Os exemplos de sequências de ligação de integrina nb 3 de plaquetas são apresentados em SEQ ID NOS: 213-215. A tabela 11 apresenta exemplos não limitantes de exemplos de modificações que podem ser feitas a um polipéptido de FVII, para inserir uma sequência de ligação a integrina nb 3 de plaquetas. Tal como referido anteriormente, a inclusão de uma sequência de ligação a integrina nb 3 de plaquetas pode aumentar a semivida sérica de um polipéptido de FVII e/ou dirigir a proteína a um alvo de coágulo sanguíneo em evolução. Assim, os polipéptidos de FVII modificados podem ter atividade coagulante aumentada. Relativamente às modificações listadas na tabela 11, são representados na tabela os resíduos de aminoácidos nos quais a sequência de ligação a integrina nb 3 de plaquetas no polipéptido de FVII, assim como a sequência da sequência de ligação. Por exemplo, H1115S126delins SFGRGDIRNV indica que os resíduos de aminoácidos H115 a S126 da numeração de um polipéptido de FVII não modificado completo (resíduos correspondentes à sequência de polipéptido de FVII maduro apresentada em SEQ ID NO: 3) foram deletados e substituídos por uma sequência de ligação a nb 3 com a sequência de aminoácidos SFGRGDIRNV (SEQ ID NO :213) . A apresentação de apenas um único resíduo de aminoácido, tal como P406, indica que a sequência de ligação a nb 3 é inserida após P406 e que não foram deletados quaisquer resíduos de aminoácidos do polipéptido de FVII. As posições de aminoácidos para mutação também são referidas pelo esquema de numeração de quimiotripsina quando adequado. Nos casos em que uma posição de aminoácidos modificada não tem um número de quimiotripsina correspondente (i.e. não está nas posições de aminoácidos 153 a 406 correspondente a um polipéptido de FVII maduro apresentado em SEQ ID NO: 3 e não é apresentada na tabela 1, anteriormente), a posição é representada entre parêntesis usando uma numeração de FVII maduro. Por exemplo, S103 não tem uma número de quimiotripsina correspondente e é representado como S [10 3] quando se refere a numeração de quimiotripsina. Na tabela 11 seguinte, o identificador de sequência (SEQ ID NO) é identificado nos casos em que se apresentam exemplos de sequências de aminoácidos do polipéptido de FVII modificado.
Os polipéptidos de FVII modificados contendo uma sequência de ligação a integrina nb 3 de plaquetas podem apresentar ligação aumentada a integrina nb 3 de plaquetas que é pelo menos ou cerca de 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 200%, 300%, 400%, 500% ou mais comparativamente à ligação de polipéptido de FVII não modificado ou de tipo selvagem a integrina nb 3 de plaquetas in vivo. Os polipéptidos modificados de FVII que se ligam a plaquetas através de integrina nb 3 de plaquetas podem apresentar semivida aumentada em pelo menos cerca de 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 200%, 300%, 400%, 500% ou mais comparativamente à semivida de polipéptido FVII não modificado ou de tipo selvagem, in vitro, in vivo ou ex vivo. A semivida aumentada de tais polipéptidos de FVII modificados também se pode manifestar como atividade de coagulação aumentada, maior duração de atividade coagulante e/ou indice terapêutico melhorado. Por exemplo, a atividade de coagulação dos polipéptidos de FVII modificados pode ser aumentada em pelo menos cerca de 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 200%, 300%, 400%, 500% ou mais comparativamente à atividade de coagulação de polipéptido de FVII não modificado ou de tipo selvagem, in vivo ou in vitro. 6. Modificação por introdução de um domínio Gla heterólogo A interação de resíduos do domínio Gla -carboxilado de proteínas plasmáticas dependentes de vitamina K, tais como FVII, FIX, FX, protrombina, proteína C e proteína S, e fosfolípidos carregados negativamente na membrana superficial é importante para hemóstase. Os domínios Gla de proteínas plasmáticas dependentes de vitamina K contêm tipicamente aproximadamente 45 aminoácidos, dos quais 9 a 12 resíduos de ácido glutâmico são modificados após tradução por carboxilação dependente de vitamina K, para formar -carboxiglutamato (Gla) . Os aminoácidos que formam o domínio Gla estão posicionados imediatamente após os que formam o péptido de sinalização e pró-péptido das proteínas e estão portanto situados no terminal N, após processamento e clivagem dos polipéptidos precursores para as proteínas maduras. Por exemplo, os aminoácidos que formam o domínio Gla em FVII estão nas posições 39-83 do polipéptido precursor apresentado em SEQ ID N0:1, posições 61-105 do polipéptido precursor apresentado em SEQ ID NO: 2 e posições 1 a 45 do polipéptido maduro apresentado em SEQ ID NO: 3. Destes, os 10 resíduos de ácido glutâmico nas posições E6, E7, E14, E19, E20, E25, E26, E29 e E35 do polipéptido de FVII maduro apresentado em SEQ ID NO: 3 são modificados por carboxilação para gerar resíduos carboxiglutamato (Gla).
Devido à sua relativamente baixa afinidade de ligação para plaquetas ativadas, o domínio Gla de FVII é um alvo para modificação, com o objetivo de melhorar a interação entre o FVII modificado e a membrana de fosfolípido, aumentando assim a atividade de coagulação. A modificação pode ser efetuada por substituição de aminoácidos específicos que estão envolvidos nesta interação (consultar, e.g., Shah et al. PNAS 95: 4429- 4234, Harvey et al. (2003) J Biol Chem 278:8363-8369). Alternativamente, a modificação pode ser efetuada por substituição do domínio Gla completo por um domínio Gla de outra proteína dependente de vitamina K, i.e. permuta de domínio Gla. Este tipo de modificação resulta numa proteína quimérica, tal como a que resultou da substituição do domínio Gla de FVII por um domínio Gla de proteína C (Geng et al. (1997) Thromb Haemost 77:926-933) .
Tipicamente, tal modificação inclui introdução, tal como por adição ou substituição, de um domínio Gla heterólogo ou de uma sua parte suficiente para efetuar ligação a fosfolípidos numa região do polipéptido de FVII, para gerar um polipéptido de FVII modificado quimérico. Em geral, tal polipéptido de FVII quimérico mantém pelo menos uma atividade de FVIII. A ligação e/ou afinidade de polipéptidos de FVII modificados com Gla a plaquetas ativadas pode ser aumentada em pelo menos cerca de 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 200%, 300%, 400%, 500% ou mais comparativamente à ligação e/ou afinidade de polipéptido de FVII não modificado ou de tipo selvagem, in vivo ou in vitro. A ligação e/ou afinidade para plaquetas ativadas por polipéptidos de FVII modificados também pode ser manifestada como atividade de coagulação aumentada. A atividade de coagulação dos polipéptidos de FVII modificados com Gla pode ser aumentada pelo menos ou cerca de 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 200%, 300%, 400%, 500% ou mais comparativamente à atividade de coagulação do polipéptido de FVII não modificado ou de tipo selvagem, in vivo ou in vitro.
Pode usar-se um domínio Gla ou uma sua parte suficiente para efetuar ligação a fosfolípido, tal como 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou mais do domínio Gla heterólogo, contido no interior de qualquer polipéptido como uma fonte de um domínio Gla heterólogo para introdução ou substituição de uma região de um polipéptido de FVII. Tipicamente, tal domínio Gla heterólogo apresenta afinidade de ligação a fosfolípidos, por exemplo, fosfolípidos presentes na superfície de uma plaqueta ativada. Em geral, a seleção de um domínio Gla heterólogo é tal que apresenta maior afinidade para fosfolípidos comparativamente à afinidade do domínio Gla de FVII. O domínio Gla exato, ou sua parte suficiente, usado como um domínio heterólogo para modificação de um polipéptido de FVII pode ser determinado racional ou empiricamente. Os exemplos de outros polipéptidos contendo Gla incluem FIX, FX, protrombina, proteína C, proteína S, osteocalcina, proteína Gla de matriz, proteína 6 específica de paragem de crescimento (Gas6) e proteína Z, não se lhes limitando. Os domínios Gla destes exemplos de proteínas são apresentados em quaisquer de SEQ ID NOS: 83-91.
Por exemplo, podem introduzir-se 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40 ou mais aminoácidos contíguos ou o domínio Gla completo de um domínio Gla heterólogo num polipéptido de FVII. Adicionalmente, a introdução do domínio Gla num polipéptido de FVII também pode incluir aminoácidos adicionais que não fazem parte do domínio Gla do polipéptido heterólogo, desde que os aminoácidos adicionais não enfraqueçam significativamente a capacidade de ligação a fosfolípido do domínio Gla introduzido.
Em alguns exemplos, a introdução é por adição do domínio Gla ao polipéptido de FVII, de modo que o domínio Gla heterólogo seja inserido no domínio Gla endógeno ou noutra região ou domínio do polipéptido de FVII, desde que o polipéptido de FVII modificado mantenha pelo menos uma atividade de FVII. Em tais exemplos, o domínio Gla nativo do polipéptido de FVII é mantido no polipéptido, embora em alguns casos a sequência de aminoácidos que forma o domínio Gla nativo seja interrompida. Noutros exemplos, o domínio Gla heterólogo ou uma sua parte suficiente é inserido adjacente ao domínio Gla nativo, quer no terminal N, quer no terminal C, de modo que o domínio Gla nativo não seja interrompido. Num exemplo adicional, o domínio Gla heterólogo ou uma sua parte suficiente é inserido noutro domínio do polipéptido de FVII.
Também se descrevem aqui polipéptidos de FVII com domínio Gla modificado, em que todo ou uma parte contígua do domínio Gla endógeno de FVII é removido e é substituído por um domínio Gla heterólogo ou uma sua parte suficiente para efetuar ligação a fosfolípido, desde que o polipéptido de FVII modificado mantenha pelo menos uma atividade de FVII. Tal modificação também é denominada permuta de um domínio Gla. Os exemplos de modificações de permuta de Gla são aqueles em que o domínio Gla endógeno é substituído por todo ou uma parte do domínio Gla de qualquer uma de FIX (SEQ ID NO:83), FX (SEQ ID NO:84), trombina (SEQ ID NO:85), Proteína C (SEQ ID NO:86) ou Proteína S (SEQ ID NO:87). Tais modificações são denominadas "Gla swap FIX", "Gla swap FX", "Gla swap Trombina", "Gla swap Prot C" e "Gla swap Prot S," respetivamente. Tais polipéptidos de FVII modificados podem apresentar ligação aumentada a plaquetas ativadas, resultando em atividade coagulante aumentada. A modificação "Gla swap FIX" envolve deleção do domínio Gla endógeno de FVII por deleção de resíduos de aminoácidos Al a Y44 (resíduos correspondentes a um polipéptido de FVII maduro apresentado em SEQ ID NO:3) e inserção de 45 resíduos de aminoácidos que correspondem aos resíduos de aminoácidos Y1 a Y45 do domínio Gla de FIX, apresentado em SEQ ID NO :83. A modificação de permuta por Gla de FX envolve deleção dos resíduos de aminoácidos Al a Y44 (resíduos correspondentes a um polipéptido de FVII maduro apresentado em SEQ ID NO: 3) e inserção de 44 resíduos de aminoácidos que correspondem a Al a Y44 do domínio Gla de FX. apresentado em SEQ ID NO:84. A modificação de permuta por domínio Gla de trombina envolve deleção dos resíduos de aminoácidos Al a Y44 (resíduos correspondentes a um polipéptido de FVII maduro apresentado em SEQ ID NO:3) e inserção de 44 resíduos de aminoácidos que correspondem a resíduos de aminoácidos Y1 a Y44 do domínio de Gla de trombina, apresentado em SEQ ID NO :85. A modificação de permuta por domínio Gla de proteína C envolve deleção dos resíduos de aminoácidos Al a Y44 (resíduos correspondentes a um polipéptido de FVII maduro apresentado em SEQ ID NO:3) e inserção de 44 resíduos de aminoácidos que correspondem a resíduos de aminoácidos Al a H44 do domínio de Gla de proteína C, apresentado em SEQ ID NO: 86. A modificação de permuta por domínio Gla de proteína S envolve deleção dos resíduos de aminoácidos Al a Y44 (resíduos correspondentes a um polipéptido de FVII maduro apresentado em SEQ ID NO:3) e inserção de 44 resíduos de aminoácidos que correspondem a resíduos de aminoácidos Y1 a Y44 do domínio de Gla de proteína S, apresentado em SEQ ID NO:87.
Em alguns exemplos fazem-se modificações, incluindo substituições ou permutas, inserções e/ou deleções de aminoácidos, não se lhes limitando, ao domínio Gla heterólogo que é introduzido no polipéptido de FVII. Tais modificações podem provocar, por exemplo, ligação aumentada a plaquetas ativadas, devido a ligação aumentada a fosfolípidos, comparativamente à ligação verificada na forma de tipo selvagem do domínio Gla heterólogo. Por exemplo, caso se introduza o domínio Gla de fator IX ou uma sua parte de ligação a fosfolípido num polipéptido de FVII para gerar um polipéptido de FVII modificado, o domínio Gla de fator IX pode conter mutações de aminoácidos que conferem ligação a fosfolípido aumentada comparativamente ao domínio Gla de fator IX de tipo selvagem. 0 domínio Gla heterólogo contido nos polipéptidos de FVII modificados aqui proporcionados pode conter 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou mais modificações, tal como substituições ou permutas, inserções e/ou deleções de aminoácidos.
Em alguns exemplos, a(s) modificação(ões) no domínio Gla heterólogo aumentam a ligação a fosfolípido. Noutros exemplos, o domínio Gla heterólogo pode conter uma ou mais mutações comparativamente à forma de tipo selvagem do domínio Gla heterólogo, que conferem funções do tipo FVII ao domínio Gla heterólogo. Por exemplo, tal como referido anteriormente, R36 do domínio Gla de FVII apresentado em SEQ ID NO: 119 pode estar envolvido em interações com FX. Assim, o domínio Gla heterólogo pode conter modificações adicionais, tal como quaisquer necessárias para manter uma arginina na posição 36 do polipéptido de FVII maduro, tal como apresentado em SEQ ID NO:3, ou quaisquer outras modificações necessárias para manter propriedades de ativação de FX do polipéptido FVIIa modificado (Ruf et al. (1999) Biochem 38:1957-1966) . Assim, em alguns exemplos, pode efetuar-se uma mutação correspondente para R36 no domínio Gla heterólogo. A posição correspondente pode ser determinada por um perito na especialidade, tal como por alinhamento das sequências de aminoácidos.
Descrevem-se aqui polipéptidos de FVII modificados contendo uma modificação de permuta de Gla, em que o domínio Gla heterólogo, ou sua parte de ligação de fosfolípido, contém uma ou mais mutações comparativamente ao domínio Gla heterólogo de tipo selvagem e é introduzido no polipéptido de FVII por substituição de alguns ou todos os domínios Gla de FVII endógenos. Num exemplo, os polipéptidos de FVII modificados aqui proporcionados contêm uma modificação de "Gla swap FIX" que, tal como descrito anteriormente, envolve deleção do domínio Gla de FVII endógeno, por deleção dos resíduos de aminoácidos Al a Y44 (resíduos correspondentes a um polipéptido de FVII maduro apresentado em SEQ ID NO:3) e inserção de 45 resíduos de aminoácidos que correspondem aos resíduos de aminoácidos Y1 a Y45 do domínio Gla de FIX, apresentado em SEQ ID NO :83. O domínio Gla de FIX usado na modificação por permuta de Gla pode conter uma ou mais mutações comparativamente à forma de tipo selvagem do domínio Gla de FIX, apresentada em SEQ ID NO:83, tal como 1, 2, 3, 4, 5 ou mais mutações, tais como substituições, deleções ou inserções de aminoácidos. Por exemplo, o domínio Gla heterólogo de FIX no polipéptido de FVII modificado por "Gla swap FIX" pode conter uma ou mais substituições de aminoácidos nas posições de aminoácidos correspondentes a M19, E40, K43 e/ou Q44 do domínio Gla de FIX apresentado em SEQ ID NO:83.
Num exemplo, o domínio Gla de FIX contém uma substituição de aminoácido M19K. Tal modificação é indicada por {Gla swap FIX/M19K} i.e. a metionina na posição de aminoácidos correspondente à posição de aminoácidos 19 do domínio Gla de FIX, apresentado em SEQ ID NO: 83, é substituída por uma lisina. Num exemplo adicional, o domínio Gla heterólogo de FIX modificado no polipéptido de FVII modificado contém uma substituição de aminoácido E40L, indicada por {FIX Gla swap/E40L}, em que o ácido glutâmico na posição de aminoácidos correspondente à posição de aminoácidos 40 do domínio Gla de FIX, apresentado em SEQ ID NO: 83, é substituído por uma leucina. Também aqui se descrevem polipéptidos de FVII modificados que contêm uma substituição K43I (indicada por { Gla swap FIX/K43I}) em que a lisina na posição de aminoácidos correspondente à posição de aminoácidos 43 do domínio Gla de FIX, apresentado em SEQ ID NO: 83m é substituída por uma isoleucina. Noutro exemplo, o domínio Gla heterólogo de FIX modificado no polipéptido de FVII modificado contém uma substituição de aminoácido Q44S, indicada por {FIX Gla swap/Q44S}, em que a glutamina na posição de aminoácidos correspondente à posição de aminoácidos 44 do domínio Gla de FIX, apresentada em SEQ ID NO: 83, é substituída por uma serina. Num exemplo, o domínio Gla heterólogo de FIX contém as substituições de aminoácidos Ml9K/E40L/K43I/Q44S.
Os polipéptidos modificados de FVII contendo um domínio Gla heterólogo, tal como domínio Gla heterólogo modificado, podem apresentar atividade coagulante aumentada a menores dosagens, comparativamente a uma molécula de FVII de tipo selvagem, tal como NovoSeven®, devido a ligação e/ou afinidade aumentada para plaquetas ativadas. A atividade de coagulação dos polipéptidos de FVII modificados com Gla pode ser aumentada em pelo menos ou cerca de 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 200%, 300%, 400%, 500% ou mais comparativamente à atividade de coagulação do polipéptido de FVII não modificado ou de tipo selvagem, in vivo, ex vivo ou in vitro. 7. Combinações e modificações adicionais
Qualquer uma ou mais das modificações descritas anteriormente pode ser combinadas com qualquer (quaisquer) outra(s) modificação(ões) descrita(s) anteriormente ou descritas na especialidade noutro local. Assim, além da modificação de polipéptidos de FVII para ter resistência aumentada a AT-III, atividade catalítica aumentada, resistência aumentada a inibição por Zn2+, glicosilação alterada, propriedades farmacocinéticas melhoradas, tal como semivida aumentada, ligação e/ou afinidade a albumina de soro aumentada, ligação e/ou afinidade a fosfolípidos aumentada ou ligação e/ou afinidade para integrina nb 3 de plaquetas aumentada, os polipéptidos de FVII modificados aqui descritos também incluem os que apresentam mais do que uma das propriedades referidas anteriormente. Tipicamente, tais modificações adicionais são as que resultam por si só numa atividade coagulante aumentada do polipéptido modificado e/ou estabilidade do polipéptido aumentada. Assim, os polipéptidos de FVII modificados resultantes apresentam uma atividade coagulante aumentada. As modificações adicionais podem incluir, por exemplo, qualquer substituição, deleção ou inserção de aminoácido conhecida na especialidade, tipicamente qualquer que aumente a atividade coagulante e/ou estabilidade do polipéptido de FVII. Qualquer polipéptido de FVII modificado aqui descrito pode conter 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 ou mais modificações de aminoácidos adicionais, desde que o polipéptido de FVII modificado resultante mantenha uma atividade de FVII do polipéptido de tipo selvagem ou não modificado.
Num exemplo, pode fazer-se uma modificação adicional da sequência do polipéptido de FVII, de modo a alterar a sua interação com outros fatores, moléculas e proteínas. Por exemplo, os resíduos de aminoácidos que estão envolvidos na interação com inibidor de via de fator tecidular (TFPI) podem ser substituídos, de modo que a afinidade e/ou ligação do polipéptido de FVII modificado a TF seja diminuída. Outras modificações incluem modificação de aminoácidos que estão envolvidos em interações com fator X, fator IX, fator tecidular (TF) e fosfolípidos, não se lhes limitando. Em alguns exemplos, a modificação efetuada na sequência de polipéptido de FVII inclui inserção de aminoácidos que constituem uma sequência de ligação, tal como, por exemplo, uma sequência de ligação a albumina de soro ou uma sequência de ligação a glicoproteína Ilb-IIIa.
Também se podem fazer modificações adicionais a um polipéptido de FVII modificado aqui descrito que alteram a conformação ou enrolamento do polipéptido. Tais incluem, por exemplo, a substituição de um ou mais aminoácidos por uma cisteína, de modo a formar uma nova ponte de dissulfureto ou modificações que estabilizam uma conformação em hélice , conferindo assim atividade aumentada ao polipéptido de FVII modificado.
Também se podem fazer modificações adicionais ao polipéptido de FVII para efetuar modificações pós-tradução. Por exemplo, o polipéptido pode ser modificado para incluir locais de glicosilação adicionais, de modo que o polipéptido de FVII modificado resultante tenha glicosilação aumentada comparativamente a um polipéptido de FVII não modificado. As modificações também podem ser feitas para introduzir resíduos de aminoácidos que podem ser ligados subsequentemente a uma parte química, tal como uma que atua para aumentar a estabilidade do polipéptido de FVII modificado. A estabilidade de um polipéptido de FVII também pode ser alterada por modificação dos potenciais locais proteolíticos, aumentando assim a resistência do polipéptido de FVII modificado a proteases.
Adicionalmente, podem fazer-se substituições, deleções ou inserções de aminoácidos no domínio Gla endógeno de modo que o polipéptido de FVII modificado apresente ligação e/ou afinidade aumentada para membranas de fosfolípido. Tais modificações podem incluir substituição, deleção e/ou inserção de um único aminoácido ou podem incluir substituição, deleção ou inserção de aminoácidos de vários aminoácidos. Por exemplo, todo ou parte do domínio Gla endógeno pode ser substituído por todo ou parte de um domínio Gla heterólogo. Noutros exemplos, os polipéptidos de FVII modificados aqui descritos podem apresentar deleções no domínio Gla endógeno ou substituições nas posições que normalmente são carboxiladas em gama (US20070037746) .
As seguintes secções descrevem exemplos não limitativos de exemplos de modificações descritas na especialidade para provocar estabilidade e/ou atividade coagulante aumentada de um polipéptido de FVII. Tal como discutido anteriormente, tais modificações também podem ser incluídas adicionalmente em qualquer polipéptido de FVII modificado aqui proporcionado. As posições de aminoácidos referenciadas seguidamente correspondem ao polipéptido de FVII maduro, tal como apresentado em SEQ ID NO:3. Podem fazer-se mutações correspondentes noutros polipéptidos de FVII, tal como variantes alélicas, de espécie ou de splicing do polipéptido de FVII maduro, apresentado em SEQ ID NO:3.
a. Modificações que aumentam a resistência a TFPI
Num exemplo, podem fazer-se modificações adicionais a um polipéptido de FVII modificado que contém uma modificação na posição de aminoácidos 286, pela numeração de FVII maduro, que resulta em resistência aumentada a TFPI. Tal resistência a TFPI pode ser conseguida, por exemplo, por mutação de um ou mais resíduos em FVII envolvidos na interação e ligação a TFPI, para reduzir ou prevenir tal ligação, tornando assim os polipéptidos de FVII modificados resistentes aos efeitos naturais de inibição de TFPI relativamente à iniciação de coagulação. Por exemplo, podem fazer-se modificações em resíduos de aminoácidos que são resíduos de contacto FVII/TFPI ou resíduos muito próximos da superfície de interação.
Proporcionam-se aqui exemplos de modificações adicionais que podem ser incluídas nos polipéptidos de FVII modificados para aumentar a resistência a TFPI, incluindo os descritos em publicação de patente internacional N2 W02004/083361, Neuenschwander et ai., (1995) Biochemistry 34:8701-8707, Chang et ai., (1999) Biochemistry 38:10940-1094, e Iakhiaev et ai., (2001) Thromb. Haemost. 85:458-463 e pedido U.S. relacionado n2 de série 12/082 662, não se lhes limitando. Os exemplos não limitativos de exemplos de modificações de aminoácidos descritas na especialidade que podem resultar em resistência aumentada a TFPI do polipéptido de FVII modificado incluem qualquer uma ou mais de Q176, D196K, D196R, D196A, D196Y, D196F, D196W, D196L, D196I, K197Y, K197A, K197E, K197D, K197L, K197M, Kl 971, K197V, K197F, K197W, K199A, K199D, K199E, G237W, G237T, G237I, G237V, T239A, R290A, R290E, R290D, R290N, R290Q, R290K, R290M, R290V, K341E, K341R, K341Q, K341N, K341M, K341D, G237T238insA, G237T238insS, G237T238insV, G237T238insAS, G237T238insSA, D196K197insK, Dl96K197insR, D196K197insY,
Dl 9 6K197insW, Dl 96K197insA, Dl96K197insM, Kl 971198insE, K197I198insY, K197I198insA e K197I198insS (em que, por exemplo, G237T238insAS indica uma modificação na qual se inseriu uma alanina (A) e uma serina (S) entre a glicina na posição 237 (G237) e a treonina na posição 238). b. Modificações que aumentam a atividade intrínseca
Num exemplo, podem fazer-se modificações adicionais a um polipéptido de fator VII modificado aqui proporcionado, que resultam em atividade catalítica aumentada para fator X. Por exemplo, podem fazer-se modificações aos aminoácidos que estão envolvidos na interação com o seu cofator, TF, de modo que o polipéptido de FVII modificado resultante tenha afinidade para TF aumentada e portanto apresente aumento de atividade para TF. Também se podem fazer modificações ao bolso de ativação do polipéptido de FVII, de modo que a atividade intrínseca do polipéptido de FVII modificado para FX seja aumentada comparativamente à atividade do polipéptido não modificado. Outra estratégia de modificação que resulta em atividade aumentada envolve modificação do polipéptido de FVII de modo que o enrolamento e conformação da proteína seja alterada para uma forma mais ativa. Por exemplo, podem fazer-se substituições de aminoácidos de modo que a região de ansa da hélice (correspondente às posições 305 a 321 da sequência madura, tal como apresentada em SEQ ID NO: 3) do domínio de protease seja estabilizada e enrolada de forma mais apertada ao corpo do domínio de protease, para conferir uma forma mais do tipo zimogénio ao polipéptido de FVII modificado. Também se pode conseguir um polipéptido mais ativo por modificação dos aminoácidos envolvidos nas folhas do polipéptido de FVII.
Por exemplo, podem fazer-se substituições de aminoácidos para introduzir novos pares de cisteínas que possam formar novas pontes dissulfureto, que podem funcionar para "prender" o polipéptido de FVII modificado numa forma mais ativa.
Os exemplos de modificações adicionais que podem ser incluídos nos polipéptidos de FVII modificados aqui proporcionados, para aumentar a atividade intrínseca do polipéptido de FVII modificado, incluem as descritas em Persson et al. (2004) Biochem J. 379:497-503, Maun et al. (2005) Prot Sei 14:1171-1180, Persson et al. (2001) PNAS 98:13583-13588, Persson et al. (2002) Eur J Biochem 269:5950-5955, Soejima et al. (2001) J Biol Chem 27 6:1722 9-17235, Soejima et al. (2002) J Biol Chem 277:49027-49035, WO200183725, W02002022776, W02002038162, W02003027147, W02 00338162, W02004029090, W02004029091, W02004108763 e W02004111242, não se lhes limitando. Os exemplos não limitativos de exemplos de modificações de aminoácidos descritas na especialidade que podem resultar em atividade intrínseca aumentada do polipéptido de FVII modificado incluem qualquer uma ou mais de S279C/V302C, L280C/N301C, V281C/V302C, S282C/V299C, S314E, L39E, L39Q, L39H, I42R, S43Q, S53N, K62E, K62R, K62D, K62N, K62Q, K62T, L65Q, L65S, F71D, F71Y, F71E, F71Q, F71N, P74S, P74A, A75E, A75D, E77A, E82Q, E82N, T83K, E116D, K157V, K157L, K157I, K157M, K157F, K157W, K157P, K157G, K157S, K157T, K157C, K157Y, K157N, K157E, K157R, K157H, K157D, K157Q, V158L, V158I, V158M, V158F, V158W, V158P, V158G, V158S, V158T, V158C, V158Y, V158N, V158E, V158R, V158K, V158H, V158D, V158Q, A274M, A274L, A274K, A274R, A274D, A274V, A274I, A274F, A274W, A274P, A274G, A274T, A274C, A274Y, A274N, A274E, A274H, A274S, A274Q, F275H, E296V, E296L, E296I, E296M, E296F, E296W, E296P, E296G, E296S, E296T, E296C, E296Y, E296N, E296K, E296R, E296H, E296D, E296Q, M298Q, M298V, M298L, M298I, M298F, M298W, M298P, M298G, M298S, M298T, M298C, M298Y, M298N, M298K, M298R, M298H, M298E, M298D, R304Y, R304F, R304L, R304M, L305V, L305Y, L305I, L305F, L305A, L305M, L305W, L305P, L305G, L305S, L305T, L305C, L305N, L305E, L305K, L305R, L305H, L305D, L305Q, M306D, M306N, D309S, D309T, S314A, S314V, S314I, S314M, S314F, S314W, S314P, S314G, S314L, S314T, S314C, S314Y, S314N, S314E, S314K, S314R, S314H, S314D, S314Q, D334G, D334E, D334A, D334V, D334I, D334M, D334F, D334W, D334P, D334L, D334T, D334C, D334Y, D334N, D334K, D334R, D334H, D334S, D334Q, S336G, S336E, S336A, S336V, S336I, S336M, S336F, S336W, S336P, S336L, S336T, S336C, S336Y, S336N, S336K, S336R, S336H, S336D, S336Q, K337L, K337V, K337I, K337M, K337F, K337W, K337P, K337G, K337S, K337T, K337C, K337Y, K337N, K337E, K337R, K337H, K337D, K337Q, F374P, F374A, F374V, F374I, F374L, F374M, F374W, F374G, F374S, F374T, F374C, F374Y, F374N, F374E, F374K, F374R, F374H, F374D, F374Q e substituição das posições 300-322, 305-322, 300-312 ou 305-312 pelos aminoácidos correspondentes de tripsina, trombina ou FX e substituição das posições 310-329, 311-322 ou 233-329 pelos aminoácidos correspondentes de tripsina. c. Modificações que aumentam a resistência a proteases
Os polipéptidos modificados de FVII aqui proporcionados também podem conter modificações adicionais que resultam em resistência aumentada do polipéptido a proteases. Por exemplo, podem efetuar-se substituições de aminoácidos para remover um ou mais potenciais locais de clivagem proteolitica. Os polipéptidos FVIII modificados podem assim tornar-se mais resistentes a proteases, aumentado assim a estabilidade e semivida do polipéptido modificado.
Os exemplos de modificações adicionais que podem ser incluídas nos polipéptidos de FVII modificados aqui proporcionados para aumentar resistência a proteases incluem as descritas em patente dos Estados Unidos N2 US5580560 ou pedidos internacionais publicados N2 WO1988010295 e W02002038162, não se lhes limitando. Os exemplos não limitativos de exemplos de modificações descritas na especialidade que podem resultar em resistência aumentada do polipéptido de FVII modificado a inibidores e/ou proteases incluem qualquer um ou mais de K32Q, K32E, K32G, K32H, K32T, K32A, K32S, K38T, K38D, K38L, K38G, K38A, K38S, K38N, K38H, I42N, I42S, I42A, I42Q, Y44N, Y44S, Y44A, Y44Q, F278S, F278A, F278N, F278Q, F278G, R290G, R290A, R290S, R290T, R290K, R304G, R304T, R304A, R304S, R304N, R315G, R315A, R315S, R315T, R315Q, Y332S, Y332A, Y332N, Y332Q, Y332G, K341E, K341Q, K341G, K341T, K341A e K341S. d. Modificações que aumentam a afinidade para fosfolipidos 0 polipéptido de FVII modificado aqui proporcionado também pode conter uma ou mais modificações adicionais para aumentar a afinidade para fosfolipidos. A atividade coagulante de FVII pode ser melhorada por aumento da ligação e/ou afinidade do polipéptido para fosfolipidos, tal como os expressos na superfície de plaquetas ativadas. Tal pode ser conseguido, por exemplo, por modificação do domínio Gla endógeno de FVII. A modificação pode ser efetuada por substituição de aminoácido numa ou mais posições no domínio Gla de um polipéptido de FVII, que resulta num polipéptido de FVII modificado com capacidade aumentada para se ligar a fosfatidilserina e outros fosfolipidos carregados negativamente. Os exemplos de modificações adicionais para aumentar ligação e/ou afinidade para fosfolípido e que podem ser efetuadas num polipéptido de FVII modificado aqui proporcionado que contém um domínio Gla endógeno de FVII, incluem as descritas em Harvey et ai. (2003) J Biol Chem 278:8363-8369, US20030100506, US20040220106, US20060240526, US6017882, US6693075, US6762286, WO200393465 e W02004111242, não se lhes limitando. Os exemplos de tais modificações incluem qualquer uma ou mais de uma inserção de uma tirosina na posição 4 ou modificação de qualquer um ou mais de P10Q, P10E, P10D, P10N, R28F, R28E, K32E, K32D, D33F, D33E, D33K A34E, A34D, A34I, A34L, A34M, A34V, A34F, A34W, A34Y, R36D, R36E, K38E e K38D. e. Modificações que alteram a glicosilação A alteração da extensão, nível e/ou tipo de glicosilação de uma proteína foi descrita na especialidade como um meio para reduzir imunogenicidade, aumentar estabilidade, reduzir a frequência de administração e/ou reduzir efeitos secundários adversos, tais como inflamação. Normalmente, tal é efetuado por aumento dos níveis de glicosilação. 0(s) local(is) de glicosilação proporcionam um local para ligação de uma parte de hidrato de carbono no polipéptido, de modo que é glicosilado quando o polipéptido é produzido numa célula eucariótica capaz de glicosilação.
Existem quatro locais de glicosilação nativos em FVII; dois locais de glicosilação em N, em N145 e N322, e dois locais de glicosilação em 0, em S52 e S60, correspondente a posições de aminoácidos no polipéptido de FVII maduro apresentado em SEQ ID NO:3. Numa concretização, pode efetuar-se modificações adicionais a um polipéptido de FVII modificado aqui proporcionado, de modo a impedir a glicosilação nos locais mencionados anteriormente. Tal pode resultar num polipéptido de FVII modificado com atividade coagulante aumentada (consultar, e.g., WO2005123916). Os exemplos não limitativos de exemplos de modificações descritas na especialidade que podem resultar em glicosilação diminuída e atividade aumentada do polipéptido de FVII modificado, comparativamente a um polipéptido de FVII não modificado, incluem S52A, S60A, N145Y, N145G, N145F, N145M, N145S, N145I, N145L, N145T, N145V, N145P, N145K, N145H, N145Q, N145E, N145R, N145W, N145D, N145C, N322Y, N322G, N322F, N322M, N322S, N322I, N322L, N322T, N322V, N322P, N322K, N322H, N322Q, N322E, N322R, N322W e N322C, não se lhes limitando.
Noutro exemplo, podem efetuar-se modificações adicionais à sequência de aminoácidos dos polipéptidos de FVII modificados aqui proporcionados, de modo a introduzir locais de glicosilação adicionais, aumentando assim o nível de glicosilação do polipéptido de FVII modificado comparativamente a um polipéptido de FVII não modificado. 0 local de glicosilação pode ser um local de glicosilação ligado a N ou ligado a 0. Os exemplos de modificações que podem ser efetuadas a um polipéptido de FVII que introduzem um ou mais novos locais de glicosilação incluem os descritos em US6806063 e WO200393465, não se lhes limitando. Os exemplos não limitativos de exemplos de modificações descritas na especialidade que podem resultar em glicosilação aumentada do polipéptido de FVII modificado, comparativamente a um polipéptido de FVII não modificado, incluem F4S, F4T, P10N, Q21N, W41N, S43N, AS1N, G58N, L65N, G59S, G59T, E82S, E82T, N95S, N95T, G97S, G97T, Y101N, D104N, T106N, K109N, G117N, G124N, S126N, T128N, A175S, A175T, G179N, I186S, I186T, V188N, R202S, R202T, I205S, I205T, D212N, E220N, I230N, P231N, P236N, G237N, V253N, E265N, T267N, E270N, R277N, L280N, G291N, P303S, P303ST, L305N, Q312N, G318N, G331N, D334N, K337N, G342N, H348N, R353N, Y357N, I361N, V376N, R379N, M391N, K32N/A34S, K32N/A34T, F31N/D33S, F31N/D33T, I30N/K32S, I30N/K32T, A34N/R36S, A34N/R36T, K38N/F40S, K38N/F40T, T37N/L39S, T37N/L39T, R36N/K38S, R36N/K38T, L39N/W41S, L39N/W41T, F40N/I42S, F40N/I42T, I42N/ Y44S, I42N/ Y44T, Y44N/ D46S, Y44N/ D46T, D46N/D48S, D46N/D48T, G47N/Q49S, G47N/Q49T, S52N/P54S, Q66N/Y68S, S119N/L121S, A122N/G124S, T128N/P129A, T130N/E132S, K143N/ N145S, K143N/ N145T, E142N/R144S, E142N/R144T, L141N/K143S, L141N/K143T, I140N/E142S/, I140N/E142T, R144N/A146S, R144N/A146T, A146N/K148S, A146N/K148T, S147N/P149S/, S147N/P149T, R290N/A292S, R290N/A292T, A292N/A294S, D289N/G291S, D289N/G291T, L288N/R290S, L288N/R290T, L287N/D289S, L287N/D289T, A292N/A294S, A292N/A294T, T293N/L295S, T293N/L295T, R315N/V317S, R315N/V317T, S314N/K316S, S314N/ K316T, Q313N/ R315S, Q313N/ R315T, K316N/G318S, K316N/G318T, V317N/D319S, V317N/D319T, K341N/ D343S, K341N/ D343T, S339N/K341S, S339N/K341T, D343N/G345S, D343N/G345T, R392N/E394S, R392N/E394T, L390N/ R392S, L390N/ R392T, K389N/M391S, K389N/M391T, S393N/P395S, S393N/P395T, E394N/R396S, E394N/R396T, E394N/P395A/R396S, P395N/P397S, P395N/P397T, R396N/G398S, R396N/G398T, P397N/V399S, P397N/V399T, G398N/L400S, G398N/L400T, V399N/L401S, V399N/L401T, L400N/R402S, L400N/R402T, L401N/A403S, L401N/A403T, R402N/P404S, R402N/P404T, A403N/F405S, A403N/F405T, P404N/P406S e P404N/P406T, não se lhes limitando. f. Modificações que facilitam a ligação de grupos químicos
Também se podem efetuar modificações adicionais de um polipéptido de FVII modificado aqui proporcionado para facilitar ligação subsequente a um grupo químico. Podem efetuar-se uma ou mais substituições ou inserções de aminoácidos, de modo a poder ligar um grupo químico a um polipéptido de FVII modificado, através do aminoácido de substituição. Por exemplo, pode introduzir-se uma cisteína num polipéptido de FVII modificado, à qual se pode ligar uma parte de polietilenoglicol (PEG) para conferir um aumento da estabilidade e semivida sérica. Outros resíduos de ligação incluem resíduos de lisina, ácido aspártico e ácido glutâmico. Em algumas concretizações, substituem-se resíduos de aminoácidos para diminuir o número de potenciais posições de ligação. Por exemplo, pode diminuir-se o número de lisinas. Os exemplos de modificações que podem ser efetuadas à sequência de aminoácidos de um polipéptido de FVII que podem facilitar ligação subsequente a um grupo químico incluem as descritas em US20030096338, US20060019336, US6806063, WO200158935 e W02002077218, não se lhes limitando. Os exemplos não limitativos de exemplos de modificações de polipéptidos de FVII que podem facilitar a ligação subsequente a um grupo químico incluem Q250C, R396C, P406C, I42K, Y44K, L288K, D289K, R290K, G291K, A292K, T293K, Q313K, S314K, R315K, V317K, L390K, M391K, R392K, S393K, E394K, P395K, R396K, P397K, G398K, V399K, L400K, L401K, R402K, A403K, P404K, F405K, I30C, K32C, D33C, A34C, T37C, K38C, W41C, Y44C, S45C, D46C, L141C, E142C, K143C, R144C, L288C, D289C, R290C, G291C, A292C, S314C, R315C, K316C, V317C, L390C, M391C, R392C, S393C, E394C, P395C, R396C, P397C, G398C, V399C, L401C, R402C, A403C, P404C, I30D, K32D, A34D, T37D, K38D, W41D, Y44D, S45D, D46C, L141D, E142D, K143D, R144D, L288D, R290D, G291D, A292D, Q313D, S314D, R315D, K316D, V317D, L390D, M391D, R392D, S393D, P395D, R396D, P397D, G398D, V399D, L401D, R402D, A403D, P404D, 130E, K32E, A34E, T37E, K38E, W41E, Y44E, S45E, D46C, L141E, E142E, K143E, R144E, L288E, R290E, G291E, A292E, Q313E, S314E, R315E, K316E, V317E, L390E, M391E, R392E, S393E, P395E, R396E, P397E, G398E, V399E, L401E, R402E, A403E, P404E, K18R, K32R, K38R, K62R, K85R, K109R, K137R, K143R, K148R, K157R, K161R, K197R, K199R, K316R, K337R, K341R, K389R, K18Q, K32Q, K38Q, K62Q, K85Q, K109Q, K137Q, K143Q, K148Q, K157Q, K161Q, K197Q, K199Q, K316Q, K337Q, K341Q, K389Q, K18N, K32N, K38N, K62N, K85N, K109N, K137N, K143N, K148N, K157N, K161N, K197N, K199N, K316N, K337N, K341N, K389N, K18H, K32H, K38H, K62H, K85H, K109H, K137H, K143H, K148H, K157H, K161H, K197H, K199H, K316H, K337H, K341H e K389H, não se lhes limitando. g. Exemplos de combinações de mutações
Proporcionam-se aqui polipéptidos de FVII modificados que têm duas ou mais modificações concebidas para afetar uma ou mais propriedades ou atividades de um polipéptido de FVII não modificado. Em alguns exemplos, as duas ou mais modificações alteram duas ou mais propriedades ou atividades do polipéptido de FVII. Podem fazer-se modificações aos polipéptidos de FVII de modo a alterar uma ou mais de atividade catalítica, resistência a AT-III, resistência a TFPI, resistência a inibição por Zn2+, atividade intrínseca, atividade amidolítica, ligação e/ou afinidade para fosfolípido, glicosilação, resistência a proteases, semivida e interação com outros fatores ou moléculas, tal como FX, FIX, albumina de soro e integrina nb 3 de plaquetas. Tipicamente, as duas ou mais modificações são combinadas de modo que o polipéptido de FVII modificado resultante tenha atividade coagulante aumentada, duração de atividade coagulante aumentada e/ou um indice terapêutico aumentado comparativamente a um polipéptido de FVI I não modificado. As modificações podem incluir substituição, inserção ou deleção de aminoácido. A atividade coagulante aumentada, duração de atividade coagulante aumentada e/ou melhoria do índice terapêutico do polipéptido de FVII modificado contendo duas ou mais modificações pode ser aumentada em pelo menos ou cerca de 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 110%, 120%, 130%, 140%, 150%, 160%, 170%, 180%, 190%, 200%, 300%, 400%, 500% ou mais comparativamente à atividade do polipéptido FVIIa inicial ou não modificado.
Proporcionam-se aqui polipéptidos de FVII modificados que contêm duas ou mais modificações, que são introduzidas num polipéptido de FVII não modificado, para alterar duas ou mais atividades ou propriedades. Os polipéptidos de FVII modificados podem conter 2, 3, 4, 5, 6 ou mais modificações. Adicionalmente, cada modificação pode envolver um ou mais resíduos de aminoácidos. Por exemplo, um polipéptido de FVII modificado pode conter duas modificações, em que cada uma das quais é uma substituição de um único aminoácido. Noutro exemplo, um polipéptido de FVII modificado pode conter duas modificações, uma das quais é uma substituição de um único aminoácido e a outra envolve deleção de mais do que um resíduo de aminoácido e seguidamente inserção de mais do que um resíduo de aminoácido. Por exemplo, um polipéptido de FVII modificado pode conter uma substituição de aminoácido S222A (resíduos correspondentes a um polipéptido de FVII maduro apresentado em SEQ ID NO: 3) para impedir a ligação a Zn2+ e uma modificação de permuta por Gla de FIX, que envolve deleção do domínio Gla endógeno de FVII, por deleção dos resíduos de aminoácidos Al a Y44 (resíduos correspondentes a um polipéptido de FVII maduro apresentado em SEQ ID NO:3) e inserção de 45 resíduos de aminoácidos que correspondem aos resíduos de aminoácidos Y1 a Y45 do domínio Gla de FIX, apresentado em SEQ ID NO :83.
Os polipéptidos de FVII modificados podem ter duas ou mais modificações selecionadas apenas das apresentadas nas tabelas 5 a 13. Noutros exemplos, o polipéptido de FVII modificado contém duas ou mais modificações em que uma ou mais modificações são selecionadas das apresentadas nas tabelas 5 a 13 e uma ou mais modificações são modificações adicionais que não são apresentadas nas tabelas 5 a 13, tais como, por exemplo, modificações descritas na especialidade. Em alguns exemplos, a uma ou mais modificações adicionais podem ser selecionadas das apresentadas nas secções D.6.a-e, anteriormente. Por exemplo, um polipéptido de FVII modificado pode conter uma modificação em um ou mais dos residuos de aminoácidos D196, K197, K199, G237, T239, R290 ou K341, com base na numeração de um FVII maduro apresentado em SEQ ID NO:3 (correspondente a D60, K60a, K60c, G97, T99, R147 e K192, respetivamente, com base na numeração de quimiotripsina), que pode aumentar a resistência a TFPI e uma modificação num ou mais residuos de aminoácidos que afeta a atividade intrínseca, tal como, por exemplo, V158 e M298, (V21 e M156, respetivamente, com base na numeração de quimiotripsina). Por exemplo, um polipéptido de FVII modificado pode conter duas substituições de aminoácidos que aumentam resistência a TFPI, tais como K197E e G237V, e uma substituição de aminoácido que aumenta a atividade intrínseca, tal como M298Q, resultando num polipéptido de FVII com atividade coagulante aumentada.
Os exemplos de combinações de modificações aqui descritas são os que incluem pelo menos a mutação Q286R (numeração correspondente ao polipéptido de FVII maduro apresentado em SEQ ID NO:3; correspondente a Q143R pela numeração de quimiotripsina) . Os polipéptidos de FVII modificados contendo a modificação Q286R podem conter 1, 2, 3, 4, 5, 6 ou mais modificações adicionais. Estas modificações adicionais podem ser incluídas, por exemplo, para alterar a atividade catalítica, resistência a AT-III, resistência a TFPI, resistência a inibição por Zn2+, atividade intrínseca, atividade amidolítica, ligação e/ou afinidade para fosfolípido, glicosilação, resistência a proteases, semivida e interação com outros fatores ou moléculas, tal como FX, FIX, albumina de soro e integrina nb 3 de plaquetas. Os polipéptidos de FVII modificados aqui proporcionados que contêm duas ou mais modificações, em que uma modificação é uma substituição de aminoácido Q286R, apresentam atividade coagulante aumentada comparativamente ao polipéptido de FVII de tipo selvagem.
Em alguns exemplos, os polipéptidos de FVII modificados contendo duas ou mais modificações, em que uma é Q286R, apresentam atividade catalítica e coagulante aumentada comparativamente ao polipéptido de tipo selvagem, bem como comparativamente a um polipéptido de FVII contendo apenas uma só das mutações. Proporcionam-se aqui polipéptidos de FVII modificados que contêm ambas as substituições de aminoácidos Q286R e M289Q (Q286R/M298Q com a numeração correspondente ao polipéptido de FVII maduro apresentado em SEQ ID NO:3; correspondente a Q143R/M156Q pela numeração de quimiotripsina) . 0 mutante de FVII com a combinação Q286R/M298Q apresenta atividade catalítica aumentada para o seu substrato, fator X, comparativamente a FVII de tipo selvagem, o mutante único Q286R e o mutante único M298Q (consultar e.g. exemplo 4, seguidamente). Por exemplo, num estudo, o mutante M298Q apresentou uma atividade catalítica para FX, na presença de TF, que foi cerca de 1,8 a 2 vezes maior do que a do polipéptido de tipo selvagem, a atividade catalítica do mutante Q286R foi aproximadamente 2,1 vezes maior do que a do polipéptido de FVII de tipo selvagem e o mutante Q286R/M298Q apresentou uma atividade catalítica para FX que foi aproximadamente 3,6-4,4 vezes a atividade catalítica do polipéptido de tipo selvagem para FX (consultar a tabela 15, seguidamente).
Apresentam-se na tabela 12 exemplos não limitativos de combinações de modificações. Estes exemplos de combinações de modificações incluem duas ou mais modificações que foram concebidas para alterar duas ou mais atividades ou propriedades de um polipéptido de FVII, incluindo resistência a TFPI, resistência a AT-III, atividade intrínseca, atividade amidolítica, atividade catalítica, ligação a Zn2+, ligação e/ou afinidade para fosfolípido, glicosilação, resistência a proteases, semivida e interação com outros fatores ou moléculas, tal como FX e FIX, não se lhes limitando. Os polipéptidos de FVII modificados contendo tais combinações de modificações podem ter atividade coagulante aumentada, duração de atividade coagulante aumentada e/ou um índice terapêutico melhorado. As modificações apresentadas na seguinte tabela 12 usam a mesma nomenclatura e sistemas de numeração descritos na tabelas 5 a 11, anteriormente. Por exemplo, a modificação de "Gla swap FIX" envolve deleção do domínio Gla endógeno de FVII por deleção dos resíduos de aminoácidos Al a Y44 (resíduos correspondentes a um polipéptido de FVII maduro apresentado em SEQ ID NO: 3) e inserção de 45 resíduos de aminoácidos que correspondem aos resíduos de aminoácidos Y1 a Y45 do domínio Gla de FIX, apresentado em SEQ ID NO: 83, tal como descrito anteriormente. Em alguns exemplos, a modificação de "Gla swap FIX" também contém uma ou mais substituições de aminoácidos na parte do domínio Gla de FIX, comparativamente a um domínio Gla de FIX de tipo selvagem, tal como discutido anteriormente. Por exemplo, a modificação de permuta por Gla de FIX também pode incluir uma substituição de aminoácido M19K (numeração correspondente a posições de aminoácidos do domínio Gla de FIX apresentado em SEQ ID NO:83). Tal modificação é indicada por { Gla swap FIX/M19K}, i.e. o polipéptido de FVII modificado contém um domínio Gla heterólogo de FIX, no qual a metionina na posição correspondente à posição 19 do domínio Gla de FIX, apresentado em SEQ ID NO:83, é substituída por uma lisina. Assim, as modificações efetuadas às partes de domínio Gla heterólogo de FIX são referidas usando as posições de aminoácidos correspondentes a posições de aminoácidos do polipéptido FXI maduro de tipo selvagem ou do domínio Gla de FIX de tipo selvagem apresentado em SEQ ID NO :83. As modificações efetuadas nas posições de aminoácidos no polipéptido de FVII são referidas usando as posições de aminoácidos correspondentes a posições de aminoácidos de um polipéptido de FVII maduro, tal como apresentado em SEQ ID NO:3 e também são referidas pelo esquema de numeração de quimiotripsina. Por exemplo, um polipéptido de FVII modificado contendo a modificação Q286R (numeração correspondente ao polipéptido de FVII maduro, apresentado em SEQ ID NO:3) e uma modificação de permuta por Gla de FIX, em que o domínio Gla de FIX contém a substituição de aminoácido M19K (numeração correspondente às posições de aminoácidos do domínio Gla de FIX, apresentado em SEQ ID NO: 83) é indicado por {Gla swap FIX/M19K}/Q286R. De igual modo, a modificação {Gla swap FIX/Q44S}/Q286R/M298Q indica que o polipéptido de FVII contém uma modificação de permuta por Gla de FIX, em que a glutamina na posição de aminoácidos correspondente à posição de aminoácidos 44 do domínio Gla de FIX, apresentado em SEQ ID NO:83, é substituída por uma serina e também contém as substituições de aminoácidos Q286R e M298Q, com numeração correspondente ao polipéptido de FVII maduro, apresentado em SEQ ID NO:3. Na seguinte tabela 12, o identificador de sequência (SEQ ID NO) é identificado nos casos em que se apresentam exemplos de sequências de aminoácidos do polipéptido de FVII modificado.
E. Produção de polipéptidos de FVII
Podem obter-se polipéptidos de FVII, incluindo polipéptidos de FVII modificados ou seus domínios de FVII ou outro polipéptido de vitamina K por métodos bem conhecidos na especialidade para purificação de proteínas e expressão de proteínas recombinantes. Pode usar-se qualquer método conhecido dos peritos na especialidade para identificação de ácidos nucleicos que codificam os genes pretendidos. Pode usar-se qualquer método disponível na especialidade para obter um clone completo de ADNc ou de ADN genómico (i.e., abrangendo a região de codificação completa) que codifica um polipéptido de FVII ou outro polipéptido de vitamina K, tal como a partir de uma fonte de célula ou tecido, tal como por exemplo do fígado. Podem conceber-se racionalmente polipéptidos de FVII modificados tal como aqui descritos, tal como por mutagénese dirigida ao local.
Pode clonar-se ou isolar-se FVII usando quaisquer métodos disponíveis conhecidos na especialidade para clonar e isolar moléculas de ácido nucleico. Tais métodos incluem amplificação de ácidos nucleicos por PCR e rastreio de bibliotecas, incluindo rastreio por hibridação de ácido nucleico, rastreio baseado em anticorpos e rastreio baseado em atividade.
Podem usar-se métodos para amplificação de ácidos nucleicos para isolar moléculas de ácido nucleico que codificam para um polipéptido de FVII, incluindo por exemplo, métodos de reação de polimerização em cadeia (PCR). Pode usar-se como um material de partida, material contendo ácido nucleico a partir do qual se podem isolar moléculas de ácido nucleico que codificam para FVII. Por exemplo, podem usar-se nos métodos de amplificação preparações de ADN e ARNm, extratos celulares, extratos de tecidos (e.g. de fígado), amostras de fluidos (e.g. sangue, soro, saliva), amostras de indivíduos saudáveis e/ou doentes. Podem também usar-se bibliotecas de ácidos nucleicos como uma fonte de material de partida. Podem conceber-se iniciadores para amplificar moléculas que codificam para FVII. Por exemplo, podem conceber-se iniciadores com base nas sequências expressas a partir das quais se gera um FVII. Podem conceber-se iniciadores com base na retroversão de uma sequência de aminoácidos de FVII. As moléculas de ácido nucleico geradas pela amplificação podem ser sequenciadas e confirmar-se que codificam para um polipéptido de FVII.
Podem juntar-se sequências de nucleótido adicionais às moléculas de ácido nucleico que codificam para FVII, incluindo sequências ligantes contendo locais de endonucleases de restrição com o objetivo de clonar o gene sintético num vetor, por exemplo, um vetor de expressão de proteína ou um vetor concebido para a amplificação das sequências de ADN essenciais para codificação da proteína. Adicionalmente, podem ligar-se operacionalmente sequências de nucleótidos adicionais que especificam para elementos funcionais de ADN a uma molécula de ácido nucleico que codifica para FVII. Os exemplos de tais sequências incluem sequências de promotor concebidas para facilitar expressão de proteína intracelular e sequências de excreção concebidas para facilitar excreção de proteína, não se lhes limitando. Também se podem ligar sequências de nucleótidos adicionais tais como sequências que especificam regiões de ligação de proteína a moléculas de ácido nucleico que codificam para FVII. Tais regiões incluem sequências para facilitar a absorção de FVII para células alvo específicas ou que aumentam de outro modo a f armacocinética do gene sintético, não se lhes limitando.
Podem então inserir-se os ácidos nucleicos identificados e isolados num vetor de clonagem apropriado. Pode usar-se um grande número de sistemas de vetor-hospedeiro conhecidos na especialidade. Os vetores possíveis incluem plasmídeos ou vírus modificados, não se lhes limitando, mas o sistema de vetor deve ser compatível com a célula hospedeira utilizada. Tais vetores incluem bacteriófagos tais como derivados de lambda ou plasmídeos tais como plasmídeos derivados de pBR322 ou pUC ou o vetor Bluescript (Stratagene, La Jolla, CA) , não se lhes limitando. A inserção num vetor de clonagem pode conseguir-se, por exemplo, pela ligação do fragmento de ADN num vetor de clonagem que tem terminais coesivos complementares. Pode efetuar-se a inserção usando vetores de clonagem de TOPO (Invitrogen, Carlsbad, CA). Caso os locais de restrição complementares usados para fragmentar o ADN não estejam presentes no vetor de clonagem, as extremidades das moléculas de ADN podem ser modificadas enzimaticamente. Alternativamente, pode produzir-se qualquer local pretendido por ligação de sequências de nucleótido (ligantes) nos terminais do ADN; estes ligantes ligados podem conter oligonucleótidos específicos sintetizados quimicamente que codificam sequências de reconhecimento de endonucleases de restrição. Num método alternativo, podem modificar-se o vetor clivado e o gene da proteína de FVII por introdução de cauda homopolimérica. Podem introduzir-se moléculas recombinantes em células hospedeiras através de por exemplo, transformação, transfeção, infeção, eletroporação e sonoporação, de modo a gerar muitas cópias da sequência génica.
Em exemplos específicos, a transformação de células hospedeiras com moléculas de ADN recombinante que incorporam o gene das proteína de FVII isolado, ADNc ou a sequência de ADN sintetizado permite a geração de cópias múltiplas do gene. Assim, pode obter-se o gene em grandes quantidades cultivando produtos de transformação, isolando as moléculas de ADN recombinante a partir dos produtos de transformação e quando necessário, recuperando o gene inserido do ADN recombinante isolado. 1. Vetores e células
Para expressão recombinante de uma ou mais das proteínas de FVII, pode inserir-se um ácido nucleico contendo toda ou parte da sequência de nucleótidos que codifica para a proteína de FVII num vetor de expressão apropriado, i.e., um vetor que contém os elementos necessários para a transcrição e tradução da sequência de codificação de proteína inserida. Um exemplo de tal vetor é qualquer vetor de expressão de mamífero tal como, por exemplo, pCMV. Os sinais necessários para transcrição e tradução podem também ser proporcionados pelo promotor nativo para genes de FVII e/ou pelas suas regiões flanqueadoras.
Também se proporcionam vetores que contêm ácido nucleico que codifica para FVII ou para FVII modificado. Também se proporcionam células contendo os vetores. As células incluem células eucarióticas e procarióticas e os vetores são quaisquer adequados para uso aqui.
Proporcionam-se células procarióticas e eucarióticas, incluindo células endoteliais, contendo os vetores. Tais células incluem células bacterianas, células de levedura, células fúngicas, arquebactérias, células vegetais, células de inseto e células animais. Usam-se as células para produzir um polipéptido de FVII ou seu polipéptido de FVII modificado por cultura das células descritas anteriormente em condições nas quais a proteína de FVII codificada é expressa pela célula e recuperar a proteína de FVII expressa. Para os objetivos aqui o FVII pode ser excretado para o meio.
Numa concretização, proporcionam-se vetores contendo uma sequência de nucleótidos que codifica para um polipéptido que tem atividade de FVII e contém toda ou uma parte do polipéptido de FVII ou suas cópias múltiplas. Os vetores podem ser selecionados para expressão do polipéptido de FVII ou seu polipéptido de FVII modificado na célula ou de modo a que a proteína de FVII seja expressa como uma proteína excretada. Quando o FVII é expresso, o ácido nucleico é ligado ao ácido nucleico que codifica para um sinal de excreção, tal como a sequência de sinalização do fator de acasalamento de
Saccharomyces cerevisiae ou uma sua parte ou a sequência de sinalização nativa.
Podem usar-se vários sistemas de hospedeiro-vetor para expressar a sequência de codificação da proteína. Estes incluem sistemas de células de mamífero infetados com vírus (e.g. vírus de vaccinia, adenovirus e outros vírus); sistemas de células de inseto infetadas com vírus (e.g. baculovírus); microrganismos tal como levedura contendo vetores de levedura; ou bactérias transformadas com bacteriófagos, ADN, plasmídeo de ADN ou cosmídeo de ADN, não se lhes limitando. Os elementos de expressão dos vetores variam nas suas intensidades e especificidades. Dependendo do sistema de hospedeiro-vetor usado, pode usar-se qualquer um de entre vários elementos de transcrição e tradução adequados.
Podem usar-se quaisquer métodos conhecidos dos peritos na especialidade para a inserção de fragmentos de ADN num vetor para construir vetores de expressão contendo um gene quimérico contendo sinais de controlo de transcrição/tradução e sequências de codificação de proteína apropriadas. Estes métodos podem incluir técnicas de ADN recombinante e sintético in vitro e recombinantes (recombinação genética) in vivo. A expressão de sequências de ácido nucleico que codificam um polipéptido de FVII ou polipéptido de FVII modificado ou seus domínios, derivados, fragmentos ou homólogos, pode ser regulada por uma segunda sequência de ácido nucleico de modo a que os seus genes ou fragmentos sejam expressos num hospedeiro transformado com a(s) moléculas(s) de ADN recombinante. Por exemplo, pode controlar-se a expressão de proteínas por qualquer promotor/facilitador conhecido na especialidade. Num exemplo específico, o promotor não é nativo aos genes para a proteína de FVII. Os promotores que podem ser usados incluem o promotor precoce de SV40 (Bernoist e Chambon, Nature 290:304-310 (1981)), o promotor contido na repetição terminal longa a 3' do virus do sarcoma de Rous (Yamamoto et al. Cell 22:787-797 (1980)), o promotor de timidina cinase de herpes (Wagner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78:1441-1445 (1981)), as sequências de regulação do gene de metalotioneina (Brinster et al., Nature 296:39-42 (1982)); vetores de expressão procarióticos tal como o promotor de -lactamase (Jay et al., (1981) Proc. Natl. Acad Sci. USA 78:5543) ou o promotor tac (DeBoer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:21-25 (1983)); consultar igualmente "Useful Proteins from Recombinant Bacteria": em Scientific American 242:79-94 (1980)); vetores expressão de plantas contendo o promotor de nopalina sintetase (Herrar-Estrella et al., Nature 303:209-213 (1984)) ou o promotor do ARN 35S do vírus do mosaico da couve-flor (Garder et al., Nucleic Acids Res. 9:2871 (1981)) e o promotor da enzima fotossintética ribulose bisfosfato carboxilase (Herrera-Estrella et al., Nature 310:115-120 (1984)); elementos de promotor de levedura e de outros fungos tal como o promotor de Gal4, o promotor de álcool desidrogenase, o promotor de fosfoglicerol cinase, o promotor de fosfatase alcalina e as regiões de controlo de transcrição animal seguintes que apresentam especificidade de tecido e têm sido usadas em animais transgénicos: região de controlo do gene de elastase I que é ativa em células acinares pancreáticas (Swift et al., Cell 38: 639-646 (1984); Ornitz et al., Cold Spring Harbour Symp. Quant. Biol. 50:399-409 (1986); MacDonald, Hepatology 7:425-515 (1987)); região de controlo do gene da insulina que é ativa em células beta pancreáticas (Hanahan et al., Nature 315:115-122 (1985)), região de controlo do gene da imunoglobulina que é ativo em células linfoides (Grosschedl et al., Cell 28:647-658 (1984); Adams et al., Nature 318:533-538 (1985); Alexander et al., Mol. Cell Biol. 7:1436-1444 (1987)), região de controlo do vírus de tumor de mama de ratinho que é ativa em células de testículo, de mama, linfoides e em mastócitos (Leder et al., Cell 45:485-495 (1986)), região de controlo do gene de albumina que é ativo no fígado (Pinckert et al.. Genes and Devei. 1:268-276 (1987)), região de controlo do gene de alfa-fetoproteína que é ativo no fígado (Krumlauf et al., Mol. Cell. Biol. 5:1639-1648 (1985); Hammer et al., Science 235:53-58 1987)), região de controlo do gene de alfa-1 antitripsina que é ativo no fígado (Kelsey et al., Genes and Devei. 1:161-171 (1987)), região de controlo do gene de beta globina que é ativo em células mielóides (Mogram et al.,
Nature 315:338-340 (1985); Kollias et al., Cell 46:89-94 (1986)), região de controlo do gene de proteína básica de mielina que é ativo em células de oligodendrócitos no cérebro (Readhead et al., Cell 45:703-712 (1987)), região de controlo do gene da cadeia leve 2 de miosina que é ativo em músculo esquelético (Shani, Nature 314:283-286 (1985)) e região de controlo do gene da hormona libertadora de gonadotrofinas que é ativo em gonadotrofos do hipotálamo (Mason et al., Science 234:1372-1378 (1986)), não se lhes limitando.
Num exemplo específico, usa-se um vetor que contém um promotor ligado operacionalmente a ácidos nucleicos que codificam um polipéptido de FVII ou polipéptido de FVII modificado ou seu domínio, fragmento, derivado ou homólogo, uma ou mais origens de replicação e opcionalmente um ou mais marcadores de seleção (e.g., um gene de resistência a antibiótico) . Os vetores e sistemas para expressão de polipéptidos de FVII incluem os vetores bem conhecidos de Pichia (disponíveis, por exemplo, de Invitrogen, San Diego, CA), nomeadamente aqueles que são concebidos para excreção das proteínas codificadas. Os exemplos de vetores de plasmídeo para expressão em células de mamífero incluem, por exemplo, pCMV. Os exemplos de vetores de plasmídeo para transformação de células de E.coli, incluem, por exemplo, os vetores de expressão de pQE (disponível de Qiagen, Valencia, CA; consultar igualmente literatura publicada por Qiagen descrevendo o sistema) . Os vetores de pQE têm um promotor de fago T5 (reconhecido pela ARN polimerase de E. coli) e um módulo de repressor de um operão de lac duplo para proporcionar expressão de proteínas recombinantes rigorosamente regulada e a níveis elevados em E. coli, um local de ligação de ribossoma sintético (RBS II) para tradução eficiente, uma sequência de codificação de marcador de 6XHis, terminadores de transcrição to e Tl, origem de replicação ColEl e um gene de beta-lactamase para conferir resistência à ampicilina. Os vetores pQE permitem colocar um marcador de 6xHis no terminal N ou no terminal C da proteína recombinante. Tais plasmídeos incluem pQE 32, pQE 30 e pQE 31 que proporcionam múltiplos locais de clonagem para todos os três quadros de leitura e permitem a expressão de proteínas com marcação de 6xHis no terminal N. Outros exemplos de vetores de plasmídeo para transformação de células de E. coli incluem, por exemplo, os vetores de expressão pET (consultar, patente U.S. 4 952 496; disponível de NOVAGEN, Madison, WI; consultar, também a literatura publicada por Novagen descrevendo o sistema). Tais plasmídeos incluem pET 11a, que contém o promotor T71ac, o terminador T7, o operador indutível lac de E. coli e o gene repressor de lac; pET 12a-c, que contém o promotor T7, o terminador T7 e o sinal de excreção ompT de E. coli; e pET 15b e pET19b (NOVAGEN, Madison, WI), que contêm uma sequência de líder His-Tag™ para uso em purificação com uma coluna de His e um local de clivagem de trombina que permite clivagem após purificação através da coluna, a região de promotor T7-lac e o terminador T7. 2. Sistemas de expressão
Podem produzir-se polipéptidos de FVII (modificados e não modificados) por quaisquer métodos conhecidos na especialidade para produção de proteína incluindo métodos in vitro e in vivo tal como, por exemplo, a introdução de moléculas de ácido nucleico que codificam para FVII numa célula hospedeira, animal hospedeiro e expressão a partir de moléculas de ácido nucleico que codificam para FVII in vitro. Podem expressar-se FVII e polipéptidos de FVII modificados em qualquer organismo adequado para produzir as quantidades e formas adequadas de um polipéptido de FVII necessárias para administração e tratamento. Os hospedeiros de expressão incluem organismos procarióticos e eucarióticos tais como E. coli, leveduras, plantas, células de inseto, células de mamífero, incluindo linhas celulares humanas e animais transgénicos. Os hospedeiros de expressão podem diferir nos seus níveis de produção de proteína assim como nos tipos de modificações pós-tradução que estão presentes nas proteínas expressas. A escolha de hospedeiro de expressão pode fazer-se com base nestes e noutros fatores tais como considerações a nível legal e de segurança, custos de produção e a necessidade e métodos para purificação. A expressão em hospedeiros eucarióticos pode incluir expressão em leveduras tais como Saccharomyces cerevisiae e Pichia pastoria, células de insetos tais como células de Drosophila e células de lepidopteran, plantas e células vegetais tais como tabaco, milho, arroz, algas e lemna. As células eucarióticas para expressão também incluem linhas celulares de mamífero tais como células de ovário de hamster chinês (CHO) ou células de rim de hamster bebé (BHK) . Os hospedeiros de expressão eucarióticos também incluem produção em animais transgénicos, por exemplo, incluindo produção em soro, leite e ovos. Os animais transgénicos para a produção de polipéptidos de FVII de tipo selvagem são conhecidos na especialidade (publicações de patente U.S. n2 20020166130 e 20040133930) e podem adaptar-se para produção de polipéptidos de FVII modificados aqui proporcionados.
Estão disponíveis muitos vetores de expressão para a expressão de FVII e são conhecidos dos peritos na especialidade. A escolha do vetor de expressão é influenciada pela escolha do sistema de expressão hospedeiro. Tal seleção está abrangida pelo nível de especialidade do perito. De um modo geral, os vetores de expressão podem incluir promotores de transcrição e opcionalmente facilitadores, sinais de tradução e sinais de terminação de transcrição e de tradução. Os vetores de expressão que se usam para transformação estável têm tipicamente um marcador de seleção que permite seleção e manutenção das células transformadas. Em alguns casos, pode usar-se uma origem de replicação para amplificar o número de cópias dos vetores nas células.
Podem também utilizar-se FVII ou polipéptidos de FVII modificados ou expressos como fusões de proteínas. Por exemplo, pode gerar-se uma fusão para adicionar funcionalidade adicional a um polipéptido. Os exemplos de proteínas de fusão incluem fusões de uma sequência de sinalização, de um marcador tal como para localização, e.g. um marcador his6 ou um marcador myc ou um marcador tag para purificação, por exemplo, uma fusão de GST e uma sequência para dirigir excreção de proteína e/ou associação a membrana, não se lhes limitando.
Numa concretização, podem expressar-se o polipéptido de FVII ou polipéptidos de FVII modificados numa forma ativa, em que assim se obtém ativação por autoativação do polipéptido após excreção. Noutra concretização a protease é expressa numa forma inativa de zimogénio.
Os métodos de produção de polipéptidos de FVII podem incluir coexpressão de um ou mais polipéptidos heterólogos adicionais que podem auxiliar na geração de polipéptidos de FVII. Por exemplo, tais polipéptidos podem contribuir para o processamento pós-tradução dos polipéptidos de FVII. Os exemplos de polipéptidos incluem peptidases que ajudam a clivar as sequências precursoras de FVII, tal como as sequências de pró-péptidos e enzimas que participam na modificação do polipéptido de FVII tal como por glicosilação, hidroxilação, carboxilação ou fosforilação, por exemplo, não se lhes limitando. Um exemplo de peptidase que pode ser coexpressa com FVII é PACE/furina (ou PACE-SOL) , que ajuda na clivagem da sequência do pró-péptido de FVII. Um exemplo de proteína que ajuda na carboxilação do polipéptido de FVII é a enzima sensível a varfarina, vitamina K 2,3-epóxido redutase (VKOR), que produz vitamina K reduzida para utilização como um cofator pela -carboxilase dependente de vitamina K (Wajitet al., J. Biol. Chem. 280(36)31603-31607). Uma subunidade desta enzima, VKORC1, pode ser coexpressa com o polipéptido de FVII modificado para aumentar a -carboxilação. 0(s) polipéptido(s) adicionais podem ser expressos a partir do mesmo vetor de expressão do polipéptido de FVII ou de um vetor diferente. a. Expressão procariótica
Os procariotas, especialmente E. coli, proporcionam um sistema para produzir grandes quantidades de FVII (consultar, por exemplo, Platis et al. (2003) Protein Exp. Purif. 31(2) : 222-30; e Khalilzadeh et al. (2004) J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 31 (2) : 63-69) . A transformação de E. coll é uma
técnica simples e rápida bem conhecida dos peritos na especialidade. Os vetores de expressão para E. coli podem conter promotores indutíveis que são úteis para induzir altos níveis de expressão de proteína e para expressar proteínas que apresentam alguma toxicidade para s células hospedeiras. Os exemplos de promotores indutíveis incluem o promotor lac, o promotor trp, o promotor híbrido tac, os promotores de ARN T7 e SP6 e o promotor regulado pela temperatura lP
Pode expressar-se FVII no ambiente citoplasmático de E. coli. O citoplasma é um ambiente redutor e para algumas moléculas tal pode resultar na formação de corpos de inclusão insolúveis. Podem usar-se agentes de redução tal como ditiotreitol e -mercaptoetanol e desnaturantes e(g., tal como guanidina-HCl e ureia) para ressolubilizar as proteínas. Uma abordagem alternativa é a expressão de FVII no espaço periplásmico de bactérias que proporciona um ambiente de oxidação e isomerases de dissulfureto do tipo chaperonina levando à produção de proteína solúvel. Tipicamente, funde-se uma sequência de líder à proteína a ser expressa que dirige a proteína ao periplasma. Remove-se então o líder por peptidases de sinalização dentro do periplasma. Os exemplos de sequências de líder que têm como alvo o periplasma incluem o líder pelB do gene de pectato liase e o líder derivado do gene da fosfatase alcalina. Em alguns casos, a expressão no periplasma permite vazamento da proteína expressa para o meio de cultura. A excreção de proteínas permite uma purificação rápida e simples a partir do sobrenadante de cultura. As proteínas que não são excretadas podem obter-se a partir do periplasma por lise osmótica. Tal como na expressão no citoplasma, em alguns casos as proteínas podem tornar-se insolúveis e podem usar-se desnaturantes e agentes redutores para facilitar a solubilização e o re-enrolamento. A temperatura de indução e crescimento também pode influenciar os níveis de expressão e solubilidade. Tipicamente, usam-se as temperaturas entre 25 °C e 37 °C. Podem também usar-se mutações para aumentar a solubilidade das proteínas expressas. Tipicamente as bactérias produzem proteínas aglicosiladas. Assim, se as proteínas necessitam de glicosilação para funcionar, pode adicionar-se glicosilação in vitro após purificação a partir de células hospedeiras. b. Leveduras
As leveduras tais como Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, Yarrowia lipolytica, Kluyveromyces lactis e Pichia pastoris são hospedeiros de expressão úteis para FVII (consultar por exemplo, Skoko et ai. (2003) Biotechnol. Appl. Biochem. 38 (Pt3) :257-65) . As leveduras podem ser transformadas com vetores de replicação epissómicos ou através de integração cromossómica estável por recombinação homóloga. Tipicamente usam-se promotores indutíveis para regular expressão génica. Os exemplos de tais promotores incluem GAL1, GAL7 e GAL5 e promotores de metalotioneína tal como CUP1. Os vetores de expressão incluem muitas vezes um marcador selecionável tal como LEU2, TRP1, HIS3 e URA3 para seleção e manutenção do ADN transformado. As proteínas expressas em levedura são muitas vezes solúveis e a coexpressão com chaperoninas tais como Bip e a proteína dissulfureto isomerase, pode melhorar os níveis de expressão e solubilidade. Adicionalmente, as proteínas expressas em levedura podem ser dirigidas para excreção usando fusões de péptido de excreção e de sinalização tal como o sinal de excreção do tipo fator alfa de acasalamento de levedura de Saccharomyces cerevisiae e fusões com proteínas de superfície de célula de levedura tal como o receptor de adesão de acasalamento Aga2p ou a glucoamilase de Arxula adeninivorans. Pode conceber-se racionalmente um local de clivagem de protease (e.g., a protease de Kex-2) para remover as sequências fundidas nos polipéptidos à medida que saem da via de excreção. A levedura é também capaz de glicosilação nos motivos Asn-X-Ser/Thr. c. Insetos e células de inseto
Os insetos e as células de inseto, especialmente usando um sistema de expressão de baculovirus, são úteis para expressar polipéptidos tais como FVII ou suas formas modificadas (consultar, por exemplo, Muneta et ai. (2003) J. Vet. Med. Sei. 65(2) :219-23) . As células de inseto e as larvas de inseto, incluindo expressão na hemolinfa, expressam níveis elevados de proteína e são capazes de efetuar a maioria das modificações pós-tradução usadas por eucariotas superiores. Os baculovirus têm uma gama de hospedeiros restritiva que melhora a segurança e reduz as preocupações legais relativas à expressão em eucariotas. Tipicamente, os vetores de expressão usam um promotor tal como o promotor de poliedrina de baculovirus para expressão a niveis elevados. Os sistemas de baculovirus comummente usados incluem baculovirus tais como o virus da poliedrose nuclear de Autographa californica (AcNPV) e virus da poliedrose nuclear de Bombyx mori (BmNPV) e uma linha celular de inseto tal como Sf9 derivada de Spodoptera frugiperda, Pseudaletia unipuncta (A7S) e Danaus plexippus (DpNl). Para expressão a niveis elevados, funde-se a sequência de nucleótidos da molécula a expressar imediatamente a jusante do codão de iniciação de poliedrina do virus. Os sinais de excreção de mamífero são processados corretamente em células de inseto e podem usar-se para excretar a proteína expressa para o meio de cultura. Além disso, as linhas celulares de Pseudaletia unipuncta (A7S) e Danaus plexippus (DpNl) produzem proteínas com padrões de glicosilação semelhantes a sistemas de células de mamífero.
Um sistema de expressão alternativo em células de inseto é o uso de células com transformação estável. Podem usar-se para expressão linhas celulares tais como as células como Schnieder 2 (S2) e Kc (Drosophila melanogaster) e Cl (Aedes albopictus) . Pode usar-se o promotor de metalotioneína de Drosophila para induzir níveis de expressão elevados na presença de indução por metais pesados como cádmio ou cobre. Mantêm-se tipicamente os vetores de expressão por uso de marcadores selecionáveis tais como neomicina e higromicina. d. Células de mamífero
Podem usar-se sistemas de expressão de mamífero para expressar polipéptidos de FVII. Podem transferir-se as construções de expressão para células de mamífero por infeção vírica tal como por adenovirus ou por transferência direta de ADN tal como lipossomas, fosfato de cálcio, DEAE-dextrano e por meios físicos tais como eletroporação e microinjeção. Os vetores de expressão para células de mamífero tipicamente incluem um local de inserção de capuz no ARNm, uma caixa TATA, uma sequência de iniciação de tradução (sequência consensual de Kozak) e elementos de poliadenilação. Tais vetores incluem frequentemente promotores-facilitadores de transcrição para níveis de expressão elevados, por exemplo o promotor-facilitador de SV40, o promotor de citomegalovírus (CMV) humano e a repetição terminal longa do vírus do sarcoma de Rous (RSV). Estes promotores-facilitadores são ativos em muitos tipos de células. As regiões de promotor e de facilitador de tecido e de tipo de célula podem também ser usadas para expressão. Os exemplos de regiões de promotor-facilitador incluem aquelas provenientes de genes tais como elastase I, insulina, imunoglobulina, vírus de tumor de mama de ratinho, albumina, alfafetoproteína, alfa 1-antitripsina, beta-globina, proteína básica de mielina, cadeia leve-2 de miosina e controlo génico da hormona de libertação de gonadotrofina, não se lhes limitando. Podem usar-se marcadores selecionáveis para selecionar e manter células com a construção de expressão. Os exemplos de genes de marcadores de seleção incluem higromicina B fosfotransferase, adenosina desaminase, xantina-guanina fosforribosil transferase, aminoglicosídeo fosfotransferase, di-hidrofolato redutase e timidina cinase, não se lhes limitando. A fusão com moléculas de sinalização da superfície celular tais como TCR- e Efèl-pode dirigir a expressão das proteínas num estado ativo à superfície da célula.
Estão disponíveis muitas linhas celulares para expressão de mamíferos incluindo células de ratinho, rato, humano, macaco e galinha e hamster. Os exemplos de linhas celulares incluem BHK (i.e. células BHK-21), 293-F, CHO, Balb/3T3, HeLa, MT2, NSO de ratinho (não excretoras) e outras linhas celulares de mieloma, linhas celulares de hibridoma e hetero-hibridoma, linfócitos, fibroblastos, Sp2/0, COS, NIH3T3, HEK293, 293S, 293T, 2B8 e células HKB, não se lhes limitando. Estão também disponíveis linhas celulares adaptadas a meio isento de soro que facilitam a purificação de proteínas excretadas a partir do meio de cultura celular. Um de tais exemplos é a linha celular isenta de soro EBNA-1 (Pham et al., (2003) Biotechnol.
Bioeng. 84:332-42). É conhecida na especialidade a expressão de polipéptidos de FVII recombinantes apresentando estrutura e modificações pós-tradução semelhantes às de FVII derivado de plasma (consultar, e.g., Jurlander et al. (2003) Semin Throm
Hemost). São conhecidos métodos para otimizar a expressão de proteínas dependente de vitamina K. Por exemplo, a suplementação com vitamina K do meio de cultura ou a co-expressão de -carboxilases dependentes de vitamina K (Wajih el al., J. Biol. Chem. 280(36)31603-31607) podem ajudar na modificação pós-tradução das proteínas dependentes de vitamina K, tal como os polipéptidos de FVII. e. Plantas
Podem usar-se células vegetais e plantas transgénicas para a expressão de FVII. As construções de expressão são tipicamente transferidas para plantas usando transferência direta de ADN tal como bombardeamento com microprojéteis e transferência para protoplastos mediada por PEG e com transformação mediada por agrobactérias. Os vetores de expressão podem incluir sequências de promotor e de facilitador, elementos de terminação de transcrição e elementos de controlo de tradução. Os vetores de expressão e as técnicas de transformação dividem-se habitualmente entre hospedeiros dicotiledóneas, tais como Arabidopsis e tabaco e hospedeiros monocotiledóneas, tais como milho e arroz. Os exemplos de promotores de plantas usados para expressão incluem o promotor do virus do mosaico da couve-flor, o promotor de nopalina sintase, o promotor de ribose bisfosfato carboxilase e os promotores de ubiquitina e de UBQ3. Usam-se muitas vezes marcadores selecionáveis tais como higromicina, fosfomanose isomerase e neomicina fosfotransferase para facilitar seleção e manutenção das células transformadas. As células de planta transformadas podem ser mantidas em cultura como células, agregados (tecido de calo) ou regeneradas para plantas completas. Dado que as plantas têm padrões de glicosilação diferentes das células de mamífero, tal pode influenciar a escolha para produzir FVII nestes hospedeiros. As células de plantas transgénicas podem também incluir algas concebidas racionalmente para produzir proteínas (consultar, por exemplo, Mayfield et al. (2003) PNAS 100:438-442) . Dado que as plantas têm padrões de glicosilação diferentes das células de mamífero, tal pode influenciar a escolha para produzir FVII nestes hospedeiros. 2. Purificação
Os métodos para purificação dos polipéptidos de FVII a partir de células hospedeiras dependem das células hospedeiras e sistemas de expressão escolhidos. Para moléculas excretadas, as proteínas são geralmente purificadas a partir do meio de cultura após remoção das células. Para expressão intracelular, podem lisar-se as células e purificam-se as proteínas do extrato. Quando se usam para expressão organismos transgénicos tais como plantas e animais transgénicos, podem usar-se tecidos ou órgãos como material de partida para preparar um extrato de células lisadas. Adicionalmente, a produção de animais transgénicos pode incluir a produção de polipéptidos em leite ou ovos, que podem ser recolhidos e caso necessário as proteínas podem ser extraídas e adicionalmente purificadas usando métodos padrão na especialidade.
Pode purificar-se FVII usando técnicas padrão de purificação de proteínas conhecidas na especialidade incluindo SDS-PAGE, cromatografia de fracionamento de tamanho e de exclusão de tamanho, precipitação com sulfato de amónio, cromatografia de quelato e cromatografia de permuta iónica, não se lhes limitando. Por exemplo, podem purificar-se polipéptidos de FVII por cromatografia de permuta aniónica. Um exemplo de um método para purificar polipéptidos de FVII é por utilização de uma coluna de permuta iónica que permite a ligação de qualquer polipéptido que tenha um domínio Gla funcional, seguido por eluição na presença de cálcio (consultar e.g., exemplo 2) . As técnicas de purificação por afinidade também podem ser usadas para melhorar a eficácia e pureza das preparações. Por exemplo, podem usar-se anticorpos, receptores e outras moléculas que ligam FVII para purificação por afinidade. Noutro exemplo, pode também melhorar-se a purificação usando uma coluna de afinidade com TF solúvel (sTF) (Maun et al. (2005) Prot Sei 14:1171-1180). Podem também conceber-se construções de expressão para adicionar um marcador de afinidade tal como um epítopo de myc, fusão de GST ou His6 e purificar-se por afinidade com anticorpo contra myc, resina de glutationa e resina de Ni, respetivamente, para uma proteína. Pode avaliar-se a pureza por qualquer método conhecido na especialidade incluindo eletroforese em gel e técnicas de coloração e espetrofotométricas.
Pode expressar-se e purificar-se protease de FVII para estar numa forma inativa (forma de zimogénio) ou alternativamente pode purificar-se a protease expressa numa forma ativa, tal como por autocatálise. Por exemplo, podem preparar-se in vitro polipéptidos de FVII que foram ativados através de clivagem proteolítica de Arg152-Ile153 (i.e. FVIIa; forma em duas cadeias) . Os polipéptidos de FVII podem ser inicialmente preparados por qualquer um dos métodos de produção aqui descritos, incluindo produção em células de mamífero seguido por purificação, não se lhes limitando. A clivagem dos polipéptidos de FVII para a forma de protease ativa, FVIIa, pode conseguir-se de vários modos. Por exemplo, pode obter-se autoativação durante incubação com vesículas de fosfolípidos na presença de cálcio em 45 minutos (Nelsestuen et al. (2001) J Biol Chem 276:39825-31) . Os polipéptidos de FVII podem também ser completamente ativados por incubação com fator Xa, fator Xlla ou TF na presença de cálcio, com ou sem fosfolípidos (consultar e.g., exemplo 2 e Broze et al. (1980) J Biol Chem 255:1242-1247, Higashi et al. (1996) J Biol Chem 271:26569-26574, Harvey et al. J Biol Chem 278:8363-8369) . 3. Proteínas de fusão
Descrevem-se também proteínas de fusão contendo um polipéptido de FVII modificado e um ou mais outros polipéptidos. Descrevem-se composições farmacêuticas contendo tais proteínas de fusão formuladas para administração por uma via adequada. As proteínas de fusão formam-se por ligação em qualquer ordem do polipéptido de FVII modificado e de um agente, tal como um anticorpo ou seu fragmento, fator de crescimento, receptor, ligando e outro tal agente para os objetivos de facilitar a purificação de um polipéptido de FVII, alterar as propriedades farmacodinâmicas de um polipéptido de FVII por direção ao alvo, por exemplo, dirigindo o polipéptido a uma célula ou tecido alvos e/ou aumentar a expressão ou excreção do polipéptido de FVII. Tipicamente qualquer proteína de fusão de FVII retém pelo menos cerca de 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90% ou 95% da atividade coagulante comparativamente a um polipéptido de FVII que não é de fusão, incluindo 96%, 97%, 98%, 99% ou mais de atividade coagulante comparativamente a um polipéptido que não é de fusão. A ligação de um polipéptido de FVII a outro polipéptido pode efetuar-se direta ou indiretamente através de um ligante. Num exemplo, a ligação pode ser ligação química, tal como através de agentes heterobifuncionais ou ligações de tiol ou outras de tais ligações. Pode também efetuar-se fusão por meios recombinantes. A fusão de um polipéptido de FVII a outro polipéptido pode ser ao terminal N ou ao terminal C do polipéptido de FVII. Os exemplos não limitativos de polipéptidos que podem ser usados em proteínas de fusão com um polipéptido de FVII aqui proporcionado incluem, por exemplo, um polipéptido de GST (glutationa S-transferase), o domínio de Fc de uma imunoglobulina G ou uma sequência de sinalização heteróloga. As proteínas de fusão podem conter componentes adicionais, tal como proteína de ligação de maltose (MBP) de E. coli que auxiliam na absorção da proteína pelas células (consultar, pedido de patente internacional PCT n2 WO 01/32711) .
Pode produzir-se uma proteína de fusão por técnicas recombinantes padrão. Por exemplo, os fragmentos de ADN que codificam para as diferentes sequências de polipéptido podem ligar-se conjuntamente em quadro de leitura de acordo com técnicas convencionais, e.g., usando terminais planos ou em ziguezague para ligação, digestão com enzimas de restrição para proporcionar terminais adequados, preenchimento tal como apropriado das extremidades coesivas, tratamento com fosfatase alcalina para evitar ligações não pretendidas e ligação enzimática. Noutro exemplo, pode sintetizar-se o gene de fusão por técnicas convencionais incluindo sintetizadores automatizados de ADN. Alternativamente, pode efetuar-se a amplificação por PCR de fragmentos génicos usando iniciadores de ancoragem que podem dar origem a sobreposições complementares entre dois fragmentos génicos consecutivos que podem subsequentemente ser hibridados e reamplifiçados para gerar uma sequência de gene quimérico (consultar, e.g., Ausubel et al. (ed.) CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGY, John Wiley & Sons, 1992). Além disso, estão disponíveis comercialmente muitos vetores de expressão que já codificam uma parte de fusão (e.g., um polipéptido de GST). Pode clonar-se um ácido nucleico que codifica para FVII em tal vetor de expressão de modo a que a parte de fusão esteja ligada em quadro de leitura com a proteína protease. 4. Modificação de polipéptido
Podem preparar-se polipéptidos de FVII modificados como cadeias de polipéptido nu ou como um complexo. Para algumas aplicações, pode pretender-se preparar FVII modificado ou numa forma "nua" sem modificações pós-tradução ou outras modificações químicas. Podem preparar-se cadeias de polipéptido nuas em hospedeiros adequados que não modifiquem FVII após a tradução. Tais polipéptidos podem também ser preparados em sistemas in vitro e usando síntese química de polipéptidos. Para outras aplicações, podem pretender-se modificações específicas incluindo peguilação, albuminação, glicosilação, carboxilação, hidroxilação, fosforilação ou outras modificações conhecidas. Podem efetuar-se modificações in vitro ou por exemplo, por produção do FVII modificado num hospedeiro adequado que produz tais modificações. 5. Sequências de nucleótidos
Proporcionam-se aqui moléculas de ácido nucleico que codificam FVII ou polipéptidos de FVII modificados. As moléculas de ácido nucleico incluem variantes alélicas ou variantes de splicing de qualquer polipéptido de FVII codificado. Os exemplos de moléculas de ácido nucleico aqui proporcionadas são quaisquer que codifiquem um polipéptido de FVII modificado aqui proporcionado, tal como qualquer que codifique um polipéptido apresentado em qualquer uma de SEQ ID NOS: 113-273. Num exemplo, proporcionam-se aqui moléculas de ácido nucleico que têm pelo menos 50, 60, 65, 70, 75, 80, 85, 90, 91, 92, 93, 94, 95 ou 99% de identidade de sequência ou hibridam em condições de rigor médio ou elevado conjuntamente com pelo menos 70% do comprimento completo de qualquer ácido nucleico que codifica para um polipéptido de FVII aqui proporcionado. Noutro exemplo, as moléculas de ácido nucleico podem incluir aquelas com sequências de codão degeneradas que codificam qualquer dos polipéptidos de FVII aqui proporcionados. F. Avaliação das atividades de polipéptido de FVII modificado
As atividades e propriedades dos polipéptidos de FVII podem ser avaliadas in vitro e/ou in vivo. Os ensaios para tal avaliação são conhecidos dos peritos na especialidade e sabe-se que correlacionam as atividades ensaiadas e os resultados com as atividades terapêuticas e in vivo. Num exemplo, podem avaliar-se variantes de FVII em comparação com FVII não modificado e/ou de tipo selvagem. Noutro exemplo, podem avaliar-se as atividades de polipéptidos de FVII modificados após exposição in vitro ou in vivo a AT-III e comparar-se com a de polipéptidos de FVII modificados que não foram expostos a AT-III. Tais ensaios podem efetuar-se na presença ou na ausência de TF. Os ensaios in vitro incluem qualquer ensaio laboratorial conhecido do perito na especialidade, tal como por exemplo, ensaios baseados em células incluindo ensaios de coagulação, ensaios de ligação, ensaios de proteína e ensaios de biologia molecular. Os ensaios in vivo incluem ensaios de FVII em modelos animais assim como administração a humanos. Em alguns casos, pode determinar-se a atividade de FVII in vivo por avaliação de sangue, soro ou outro fluido corporal para determinantes de ensaio. Podem também ensaiar-se as variantes de FVII in vivo para avaliar uma atividade ou propriedade, tal como o efeito terapêutico.
Tipicamente, os ensaios aqui descritos referem-se à forma ativada de FVII com duas cadeias, i.e. FVIIa. Tais ensaios podem também ser efetuados com a forma de cadeia única, tal como para proporcionar um controlo negativo dado que tal forma não contém tipicamente a atividade proteolítica ou catalítica necessária para a atividade coagulante de FVII. Além disso, tais ensaios podem também ser efetuados na presença de cofactores, tal como TF, o que em alguns casos aumenta a atividade de FVII. 1. Ensaios in vitro
Os exemplos de ensaios in vitro incluem ensaios para avaliar modificação e atividade de polipéptidos. As modificações podem ser avaliadas usando ensaios in vitro que avaliam a -carboxilação e outras modificações pós-tradução, ensaios de proteína e ensaios de conformação conhecidos na especialidade. Os ensaios para atividade incluem medição de interação de FVII com outros fatores de coagulação, tais como TF, fator X e fator IX, ensaios proteoliticos para determinar a atividade proteolítica dos polipéptidos de FVII, ensaios para determinar a ligação e/ou afinidade dos polipéptidos de FVII para fosfatidilserinas e outros fosfolípidos e ensaios baseados em células para determinar o efeito dos polipéptidos de FVII na coagulação, não se lhes limitando.
Podem avaliar-se as concentrações dos polipéptidos de FVII modificados por métodos bem conhecidos na especialidade incluindo ensaios de imunoadsorção enzimática (ELISA), SDS-PAGE; métodos de Bradford, Lowry, BCA, não se lhes limitando; absorvância de UV e outros métodos de marcação de proteína que permitam quantificação, tais como métodos imunológicos, radioativos e fluorescentes e métodos relacionados, não se lhes limitando. A avaliação dos produtos de clivagem das reações de proteólise, incluindo clivagem dos polipéptidos de FVII ou produtos produzidos por atividade de protease de FVII, pode efetuar-se usando métodos incluindo clivagem de substrato cromogénico, HPLC, análise de SDS-PAGE, ELISA, transferência "Western", imuno-histoquímica, imunoprecipitação, sequenciação do terminal NH2 e marcação de proteína, não se lhes limitando.
Podem também avaliar-se as propriedades estruturais dos polipéptidos de FVII modificados. Por exemplo, podem efetuar-se cristalografia de raios-X, ressonância magnética nuclear (RMN) e criomicroscopia electrónica (crio-EM) dos polipéptidos de FVII modificados para avaliar a estrutura tridimensional dos polipéptidos de FVII e/ou outras propriedades dos polipéptidos de FVII, tal como ligação de Ca2+ ou de cofator.
Adicionalmente, pode medir-se a presença e extensão da degradação de FVII por técnicas padrão tais como eletroforese em gel de poliacrilamida e dodecilsulfato de sódio (SDS-PAGE) e transferência "Western" das amostras contendo FVII e submetidas a eletroforese. Os polipéptidos de FVII que foram expostos a proteases podem também ser submetidos a sequenciação do terminal N para determinar a localização ou alterações nos locais de clivagem dos polipéptidos de FVII modificados. a. Modificação pós-tradução
Podem também avaliar-se os polipéptidos de FVII relativamente à presença de modificações pós-tradução. Tais ensaios são conhecidos na especialidade e incluem ensaios para medir glicosilação, hidroxilação e carboxilação. Num exemplo de ensaio para glicosilação, pode efetuar-se análise de hidratos de carbono, por exemplo, com análise de SDS PAGE dos polipéptidos de FVII expostos a tratamento com hidrazinólise ou endoglicosidase. A hidrazinólise liberta glicanos ligados por N ou ligados por 0 a partir de glicoproteínas por incubação com hidrazina anidra, enquanto a libertação de endoglicosidase envolve PNGase F, que liberta a maioria dos N- glicanos das glicoproteinas. 0 tratamento por hidrazinólise ou com endoglicosidase dos polipéptidos de FVII gera um terminal redutor que pode ser marcado com um marcador fluoróforo ou cromóforo. Podem analisar-se os polipéptidos de FVII marcados por eletroforese de hidratos de carbono assistida por fluoróforo (FACE). 0 marcador fluorescente para glicanos pode também ser usado para análise de monossacáridos, obtenção do perfil ou da impressão digital de padrões de glicosilação complexos por HPLC. Os exemplos de métodos de HPLC incluem cromatografia de interação hidrofílica, interação electrónica, permuta iónica, interação hidrofóbica e cromatografia de exclusão de tamanho. Os exemplos de sondas de glicanos incluem 3- (acetilamino)-6-aminoacridina (AA-Ac) e ácido 2-aminobenzóico (2-AA), não se lhes limitando. As partes de hidrato de carbono podem também ser detetadas através do uso de anticorpos específicos que reconhecem polipéptido de FVII glicosilados. Um exemplo de ensaio para medir -hidroxilação compreende análise de HPLC em fase reversa de polipéptidos de FVII que foram submetidos a hidrólise alcalina (Przysiecki et al. (1987) PNAS 84:7856-7860). Pode avaliar-se a carboxilação e a -carboxilação de polipéptidos de FVII usando espectrometria de massa de tempo de voo de dessorção/ionização por laser assistida por matriz (MALDI-TOF) , tal como descrito na especialidade (consultar, e.g. Harvey et al. J Biol Chem 278:8363-8369, Maun et al. Prot Sei 14:1171-1180). Pode também avaliar-se a interação de um polipéptido de FVII contendo o pró-péptido (pro-FVII) com a carboxilase responsável pela modificação pós-tradução de -carboxilato. Pode medir-se a constante de dissociação (Kd) após incubação da carboxilase com propolipéptidos de FVII marcados com fluoresceína, por determinação da quantidade de carboxilase ligada por anisotropia (Lin et al. (2004) J Biol Chem 27 9:65 60-65 6 6) . b. Atividade proteolitica
Podem testar-se os polipéptidos modificados de FVII para atividade proteolitica. A atividade proteolitica de FVII pode medir-se usando substratos cromogénicos tais como Chromozym t-PA (MeS02-D-Phe-Giy-Arg-pNA), S-2288 (H-D-Ile-Pro-Arg-pNA), S- 2266 (H-D-Val-Leu-Arg-pNA) , S-2765 (Z-D-Arg-Gly-Arg-pNA) ,
Spectrozyme FXa e Spectrozyme FVIIa (CH3SC>2-D-CHA-But-Arg-pNA). Incubam-se os polipéptidos de FVII sozinhos ou na presença de TF, com concentrações variáveis de substrato cromogénico. A clivagem do substrato pode ser monitorizada por absorvância e a velocidade de hidrólise de substrato pode determinar-se por regressão linear usando um utilitário facilmente disponível.
Pode também avaliar-se a ativação de substratos do fator de coagulação, tal como FX, pelos polipéptidos de FVII. Podem incubar-se os polipéptidos de FVII, com ou sem pré-incubação com TF, com FX purificado (disponível comercialmente). Mede-se a quantidade de FXa ativo produzido em consequência da incubação com polipéptidos de FVII como atividade de FXa para um substrato cromogénico, tal como S-2222 ou Spectrafluou FXa (ClhSCh-D-CHA-Gly-Arg-AMC.AcOH) , que é monitorizada através de alterações de absorvância (Harvey et al. J Biol Chem 278:8363-8369, consultar igualmente o exemplo 4 seguidamente). Pode também incluir-se uma fonte de fosfolípido na incubação de FVII e FX (Nelsestuen et al. (2001) J Biol Chem 276:39825-31). c. Atividade de coagulação
Podem ensaiar-se os polipéptidos de FVII para atividade de coagulação usando ensaios bem conhecidos na especialidade. Por exemplo, alguns dos ensaios incluem um ensaio de coagulação em duas etapas (Liebman et al., (1985) PNAS 82:3879-3883); o ensaio de tempo de protrombina (PT, que pode medir atividade dependente de TF de FVIIa na via extrínseca) ; ensaios que são modificações do ensaio de PT; tempo de tromboplastina parcial ativada (aPTT, que pode medir atividade independente de TF de FVIIa); tempo de coagulação ativada (ACT), tempo de coagulação ativada recalcifiçado ou tempo de coagulação de Lee-White; ou tromboelastografia (TEG) (Pusateri et al. (2005) Critical Care 9:S15-S24), não se lhes limitando. Por exemplo, a atividade de coagulação de um polipéptido de FVII modificado pode ser determinada por um ensaio baseado em PT no qual se dilui FVII em plasma deficiente em FVII e mistura-se com reagente de tempo de protrombina (TF recombinante com fosfolípidos e cálcio), tal como o disponível como Innovin™ de Dade Behring. Deteta-se a formação de coágulo oticamente e determina-se o tempo até coagulação e compara-se relativamente a plasma deficiente em FVII sozinho. d. Ligação e/ou inibição por outras proteínas e moléculas
Podem usar-se os ensaios de inibição para medir resistência dos polipéptidos de FVII modificados a inibidores de FVII, tal como, por exemplo, AT-III e TFPI ou moléculas tal como Zn2+. A avaliação da inibição a outros inibidores pode também ser testada e inclui outros inibidores de proteases de serina e anticorpos específicos de FVII, não se lhes limitando. Pode avaliar-se a inibição por incubação de, por exemplo, AT-III, TFPI ou Zn2+ com polipéptidos de FVII que foram pré-incubados na presença e/ou na ausência de TF. Pode então medir-se a atividade de FVII usando qualquer um ou mais do que um dos ensaios de atividade ou coagulação anteriormente descritos e pode avaliar-se a inibição por AT-III, TFPI ou Zn2+ por comparação da atividade dos polipéptidos de FVII incubados com o inibidor, com a atividade dos polipéptidos de FVII que não foram incubados com o inibidor.
Podem testar-se os polipéptidos de FVII para ligação a outros fatores de coagulação e inibidores. Por exemplo, podem avaliar-se as interações diretas e indiretas de FVII com cofatores tal como TF, substratos tal como FX e FIX e inibidores tais como antitrombina III, TFPI e heparina usando qualquer ensaio de ligação conhecido na especialidade, incluindo imunoprecipitação, purificação em coluna, SDS-PAGE não redutor, ensaios de BIAcore®, ressonância plasmónica de superfície (SPR), transferência de energia por ressonância de fluorescência (FRET), polarização de fluorescência (FP), calorimetria de titulação isotérmica (ITC), dicroísmo circular (CD) , ensaios de complementação de fragmentos de proteína (PCA), espectroscopia de Ressonância Magnética Nuclear (RMN), dispersão de luz, equilíbrio de sedimentação, cromatografia de filtração em gel em zona pequena, atraso em gel, transferência "Western" longínqua, polarização de fluorescência, pegadas de proteína com radical hidroxilo, exposição em fagos e vários sistemas de dois híbridos, não se lhes limitando. Num exemplo, avalia-se a ligação de Zn2+ usando análise de equilíbrio (Petersen et ai., (2000) Protein Science 9:859-866) e. Afinidade para fosfolipidos
Pode determinar-se a ligação e/ou a afinidade do polipéptido modificado de FVII para fosfatidilserina (PS) e outros fosfolipidos usando ensaios bem conhecidos na especialidade. Podem usar-se fosfolipidos altamente puros (por exemplo, podem usar-se concentrações conhecidas de PS de bovino e fosfatidilcolina (PC) de ovo, que estão disponíveis comercialmente, tal como de Sigma, num solvente orgânico para preparar vesículas de fosfolipidos unilamelares pequenas. Pode determinar-se a ligação de polipéptido de FVII a estas vesículas de PS/PC por dispersão de luz a 90° relativamente à luz incidente. Mede-se a intensidade da dispersão de luz com PC/PS sozinhos e com PC/PS/FVII para determinar a constante de dissociação (Harvey et al. J Biol Chem 278:8363-8369) . Também se pode usar a ressonância plasmónica de superfície, tal como num instrumento biossensor BIAcore, para medir a afinidade dos polipéptidos de FVII para membranas de fosfolípido (Sun et ai. Blood 101:2277-2284) . 2. Modelos animais não humanos
Podem usar-se modelos animais não humanos para avaliar a atividade, eficácia e segurança de polipéptidos de FVII modificados. Por exemplo, podem usar-se animais não humanos como modelos para uma doença ou condição. Podem injetar-se animais não humanos com substâncias indutoras de doença e/ou indutoras de fenótipo antes da administração de variantes de FVII, tal como qualquer variante de FVII apresentada em qualquer das SEQ ID NOS: 113-273, para monitorizar os efeitos na progressão da doença. Os modelos genéticos são também úteis. Podem gerar-se animais, tais como ratinhos, que mimetizam uma doença ou condição através da sobrexpressão, subexpressão ou knockout de um ou mais genes, tal como, por exemplo, ratinhos knockout para fator VIII que apresentam hemofilia A (Bi et al. (1995) Nat Gen 10:119-121) . Podem gerar-se tais animais por técnicas de produção de animais transgénicos bem conhecidas na especialidade ou usando estirpes de ocorrência natural ou estirpes mutantes induzidas. Os exemplos de modelos úteis de animais não humanos de doenças associadas a FVII incluem modelos de doenças hemorrágicas, em particular hemofilia ou doença trombótica, não se lhes limitando. Os modelos animais não humanos para lesão podem também ser usados para avaliar uma atividade, tal como a atividade de coagulação dos polipéptidos de FVII. Podem usar-se estes modelos animais não humanos para monitorizar a atividade de variantes de FVII comparativamente com polipéptido de FVII de tipo selvagem.
Podem também usar-se modelos animais para monitorizar estabilidade, semivida e depuração de polipéptidos de FVII modificados. Tais ensaios são úteis para comparar polipéptidos de FVII modificados e para calcular doses e regimes de dosagens para animais não humanos adicionais e ensaios humanos. Por exemplo, um polipéptido de FVII modificado, tal como qualquer variante de FVII aqui proporcionada incluindo, por exemplo, qualquer das apresentadas em qualquer de SEQ ID NOS: 113-273, pode ser injetada na veia da cauda de ratinhos. Retiram-se então amostras de sangue a pontos temporais após injeção (tal como minutos, horas e dias depois) e seguidamente pode monitorizar-se o nível dos polipéptidos de FVII modificados em amostras do corpo incluindo soro ou plasma, não se lhes limitando, a pontos temporais específicos por exemplo por ELISA ou radioimunoensaio. As amostras de sangue a vários pontos temporais após injeção dos polipéptidos de FVII podem também ser ensaiadas para atividade de coagulação usando vários métodos, tal como se descreve no exemplo 9. Estes tipos de estudos de farmacocinética podem proporcionar informação relativa à semivida, depuração e estabilidade dos polipéptidos de FVII, que pode auxiliar na determinação de dosagens adequadas para administração como um pró-coagulante.
Podem testar-se os polipéptido modificados de FVII, tal como qualquer dos apresentados em qualquer de SEQ ID NOS: 113-273, para eficácia terapêutica usando modelos animais para hemofilia. Num exemplo não limitativo, pode usar-se um modelo animal tal como um ratinho. Os modelos de ratinho de hemofilia estão disponíveis na especialidade e podem ser utilizados para ensaiar polipéptidos de FVII modificados. Por exemplo, pode usar-se um modelo de ratinho de hemofilia A que é produzido por injeção com anticorpos anti-FVIII para avaliar a atividade coagulante dos polipéptidos de FVII (consultar e.g. exemplo 6, e Tranholm et al. Blood (2003) 102:3615-3620). Pode também usar-se um modelo de ratinho de hemofilia B para ensaiar polipéptidos de FVII (Margaritis et al. (2004) J Clin Invest 113:1025-1031). Também existem modelos que não são de ratinho de doenças hemorrágicas. Pode avaliar-se a atividade do polipéptido de FVII em ratos com hemorragia induzida por varfarina ou hemorragia induzida por melagatran (Diness et al. (1992) Thromb Res 67:233-241, Elg et ai. (2001) Thromb Res 101:145-157) e coelhos com hemorragia induzida com heparina (Chan et al. (2003) J Thromb Haemost 1:760-765). Podem também usar-se cães com doença consanguínea de hemofilia A, hemofilia B e von Willebrand que apresentam hemorragia grave em estudos de animais não humanos com polipéptidos de FVII (Brinkhous et al. (1989) PNAS 86:1382-1386). A atividade dos polipéptidos de FVII pode também avaliar-se num modelo de coelho de hemorragia no qual se induz trombocitopenia por uma combinação de irradiação gama e o uso de anticorpos contra plaquetas (Tranholm et al. (2003) Thromb Res 109:217-223).
Além de animais com doenças hemorrágicas generalizadas, podem também usar-se modelos de lesão e traumatismo para avaliar a atividade dos polipéptidos de FVII e a sua segurança e eficácia como um agente terapêutico coagulante. Os exemplos não limitativos de tais modelos incluem um modelo de estenose de coronária de coelho (Fatorutto et al. (2004) Can J Anaesth 51:672-679), um modelo de lesão de fígado de grau V em porcos (Lynn et al. (2002) J Trauma 52:703-707), um modelo de lesão de fígado de grau V em porcos (Martinowitz et al. (2001) J Trauma 50:721-729) e um modelo de aortotomia de porco (Sondeen et al. (2004) Shock 22:163-168). 3. Ensaios clinicos
Estão disponíveis muito ensaios para avaliar a atividade de FVII para uso clínico. Tais ensaios podem incluir avaliação da coagulação, estabilidade de proteína e semivida in vivo e ensaios fenotípicos. Os ensaios fenotípicos e os ensaios para avaliar o efeito terapêutico do tratamento com FVII incluem avaliação dos níveis sanguíneos de FVII (e.g. medição de FVII sérico antes da administração e pontos temporais após administrações incluindo, após a primeira administração, imediatamente após a última administração e pontos temporais intermédios, corrigindo para o índice de massa corporal (BMI)), avaliação da coagulação sanguínea in vitro usando os métodos descritos anteriormente após tratamento com FVII (e.g. ensaio de PT) e resposta fenotípica ao tratamento com FVII incluindo melhoria de sintomas ao longo do tempo comparativamente a indivíduos tratados com um FVII não modificado e/ou de tipo selvagem ou placebo. Os doentes tratados com os polipéptidos de FVII podem ser monitorizados para perda de sangue, necessidades transfusionais e hemoglobina. Os doentes podem ser monitorizados regularmente ao longo de um período de tempo para administrações de rotina ou repetidas ou após administração em resposta a eventos agudos tais como hemorragia, traumatismo ou procedimentos cirúrgicos. G. Formulação e administração
Proporcionam-se aqui composições para uso no tratamento de doenças hemorrágicas. Tais composições contêm uma quantidade terapeuticamente eficaz de polipéptidos de fator VII tal como aqui descritos. Misturam-se as concentrações eficazes dos polipéptidos de FVII ou seus derivados farmaceuticamente aceitáveis com um transportador ou veículo farmacêutico adequados para administração sistémica, tópica ou local. Incluem-se os compostos numa quantidade eficaz para tratar a doença selecionada. A concentração do composto ativo na composição dependerá da absorção, inativação, taxas de excreção do composto ativo e calendário de dosagem e quantidade administrada assim como outros fatores conhecidos dos peritos na especialidade.
Os transportadores ou veículos farmacêuticos adequados para administração dos compostos aqui proporcionados incluem quaisquer de tais transportadores conhecidos dos peritos na especialidade como sendo adequados para o modo de administração específico. As composições farmacêuticas que incluem uma quantidade terapeuticamente eficaz de um polipéptido de FVII aqui descrito são também proporcionados como um pó liofilizado que é reconstituído, tal como com água estéril, imediatamente antes da administração. 1. Formulações
Podem formular-se composições farmacêuticas contendo um FVII modificado de qualquer forma convencional por mistura de uma quantidade selecionada do polipéptido com um ou mais transportadores ou excipientes fisiologicamente aceitáveis. A seleção do transportador ou excipiente está no âmbito da profissão de administração do perito na especialidade e pode depender de vários parâmetros. Estes incluem, por exemplo, o modo de administração (i.e., sistémica, oral, nasal, pulmonar, local, tópica ou qualquer outro modo) e a doença a tratar. As composições farmacêuticas aqui proporcionadas podem ser formuladas para administração em dosagem simples (direta) ou para diluição ou outra modificação. As concentrações dos compostos nas formulações são eficazes para entrega de uma quantidade, após administração, que é eficaz para o tratamento pretendido. Tipicamente, formulam-se as composições para administração em dosagem simples. Para formular uma composição, a fração em peso de um composto ou uma sua mistura é dissolvida, suspensa, dispersa ou misturada de outro modo num veículo selecionado a uma concentração eficaz de modo que a condição tratada seja aliviada ou melhorada.
Os polipéptidos de FVII modificados aqui proporcionados podem ser formulados para administração a um indivíduo como uma proteína de FVIIa com duas cadeias. Os polipéptidos de FVII modificados podem ser ativados por qualquer método conhecido na especialidade antes da formulação. Por exemplo, FVII pode sofrer autoativação durante a purificação por cromatografia de permuta iónica (Jurlander et al. (2001) Semin Thromb Hemost 27:373-384). Os polipéptidos de FVII modificados podem também ser ativados por incubação com FXa imobilizado em pérolas (Kemball-Cook et al. (1998) J Biol Chem 273:8516-8521) ou quaisquer outros métodos conhecidos na especialidade (consultar também o exemplo 2 seguidamente). A inclusão de cálcio nestes processos assegura ativação completa e enrolamento correto da proteína de FVIIa modificada. Os polipéptidos de FVII modificados aqui proporcionados podem também ser formulados para administração como uma proteína de cadeia única. Os polipéptidos de FVII de cadeia única podem ser purificadas de modo a evitar clivagem (consultar, e.g., US6677440). Os polipéptidos de FVII modificados aqui proporcionados podem ser formulados de modo a que as formas em cadeia única e em duas cadeias estejam contidas na composição farmacêutica, em qualquer razão por seleção adequada do meio para eliminar ou controlar a auto-ativação.
Pode suspender-se o composto sob forma micronizada ou outra forma adequada ou pode derivatizar-se para produzir um produto ativo mais solúvel. A forma da mistura resultante depende de vários fatores, incluindo o modo de administração pretendido e a solubilidade do composto no transportador ou veiculo selecionados. As misturas resultantes são soluções, suspensões, emulsões e outras de tais misturas e podem ser formuladas como uma mistura não aquosa ou aquosa, cremes, géis, unguentos, emulsões, soluções, elixires, loções, suspensões, tinturas, pastas, espumas, aerossóis, irrigações, nebulizados, supositórios, ligaduras ou outra formulação adequadas para administração sistémica, tópica ou local. Para administração interna local, tal como administração intramuscular, parentérica ou intra-articular, podem formular-se polipéptidos como uma suspensão em solução num meio de base aquosa, tal como soro fisiológico tamponado isotonicamente ou combinam-se com uma base ou bioadesivo biocompativel pretendido para administração interna. A concentração eficaz é suficiente para melhorar a condição pretendida e pode ser determinada empiricamente. Para formular uma composição, dissolve-se, suspende-se, dispersa-se ou mistura-se de outro modo a fração em peso do composto num veiculo selecionado a uma concentração eficaz de modo a que a condição pretendida seja aliviada ou melhorada.
De um modo geral, preparam-se composições farmaceuticamente aceitáveis com vista à aprovação pela agência reguladora ou outra preparada de acordo com uma farmacopeia reconhecida na generalidade para uso em animais e em humanos. As composições farmacêuticas podem incluir transportadores tais como um diluente, adjuvante, excipiente ou veiculo com o qual se administra uma isoforma. Tais transportadores farmacêuticos podem ser líquidos estéreis, tais como água e óleos, incluindo os de origem de petróleo, animal, vegetal ou sintética, tal como óleo de amendoim, óleo de soja, óleo mineral e óleo de sésamo. A água é um transportador típico quando a composição farmacêutica é administrada intravenosamente. Podem também utilizar-se soluções salinas e soluções aquosas de dextrose e glicerol como transportadores líquidos, particularmente para soluções injetáveis. As composições podem conter conjuntamente com um ingrediente ativo: um diluente tal como lactose, sacarose, fosfato dicálcico ou carboximetilcelulose; um lubrificante, tal como estearato de magnésio, estearato de cálcio e talco; e um agente aglutinante tal como amido, gomas naturais, tais como gelatina de goma arábica, glucose, melaços, polivinilpirrolidona, celuloses e seus derivados, povidona, crospovidonas e outros agentes aglutinantes conhecidos dos peritos na especialidade. Os excipientes farmaceuticamente adequados incluem amido, glucose, lactose, sacarose, gelatina, malte, arroz, farinha, giz, sílica-gel, estearato de sódio, monoestearato de glicerol, talco, cloreto de sódio, leite magro em pó, glicerol, propileno, glicol, água e etanol. Uma composição, caso pretendido, pode também conter pequenas quantidades de agentes molhantes ou emulsionantes ou agentes de tamponamento de pH, por exemplo, acetato, citrato de sódio, derivados de ciclodextrina, monolaurato de sorbitano, acetato de sódio de trietanolamina, oleato de trietanolamina e outros de tais agentes. Estas composições podem tomar a forma de soluções, suspensões, emulsões, comprimidos, pílulas, cápsulas, pós e formulações de libertação controlada. Podem formular-se cápsulas e cartuchos de e.g., gelatina para uso num inalador ou insuflador contendo uma mistura de pó de um composto terapêutico e uma base em pó adequada tal como lactose ou amido. Pode formular-se uma composição como um supositório, com agentes aglutinantes e transportadores tradicionais tais como triglicéridos. A formulação oral pode incluir transportadores padrão tais como manitol, lactose, amido, estearato de magnésio, sacarina de sódio, celulose, carbonato de magnésio e outros de tais agentes de graus farmacêuticos. As preparações para administração oral podem também ser adequadamente formuladas com inibidores de protease, tal como um inibidor de Bowman-Birk, um inibidor de Bowman-Birk conjugado, aprotinina e camostat. Descrevem-se exemplos de transportadores farmacêuticos adequados em "Remington' s Pharmaceutical Sciences" por E. W. Martin. Tais composições conterão uma quantidade terapeuticamente eficaz do composto, geralmente na forma purificada, conjuntamente com uma quantidade adequada de transportador de modo a proporcionar a forma para administração adequada a um indivíduo ou doente. A formulação deve ser adequada ao modo de administração. Por exemplo, pode formular-se o FVII modificado para administração parentérica por injeção (e.g., por injeção de bolus ou infusão continua). As composições injetáveis podem assumir formas tais como suspensões, soluções ou emulsões em veículos oleosos ou aquosos. A preparação injetável estéril pode também ser uma solução ou suspensão injetável estéril num diluente ou solvente parentericamente aceitável e não tóxico, por exemplo, como uma solução de 1,4-butanodiol. Os óleos fixos estéreis são utilizados convencionalmente como um solvente ou meio de suspensão. Para este objetivo pode utilizar-se qualquer óleo fixo suave incluindo, monoglicéridos ou diglicéridos sintéticos, ácidos gordos (incluindo ácido oleico), óleos vegetais de ocorrência natural tais como óleo de sésamo, óleo de coco, óleo de amendoim, óleo de algodão e outros óleos ou veículos gordos sintéticos tais como etiloleato, não se lhes limitando. Podem incorporar-se tal como necessário ou alternativamente a formulação pode compreender tampões, conservantes, antioxidantes e os ingredientes adequados.
Podem formular-se os polipéptidos como o único ingrediente farmaceuticamente ativo na composição ou podem combinar-se com outros ingredientes ativos. Os polipéptidos podem ser marcados para entrega, tal como por conjugação com um agente de direção ao alvo, tal como um anticorpo. As suspensões de lipossomas, incluindo lipossomas que têm como alvo tecidos, podem também ser adequadas como transportadores farmaceuticamente aceitáveis. Estes podem ser preparados de acordo com métodos conhecidos dos peritos na especialidade. Por exemplo, podem preparar-se formulações de lipossomas tal como descrito em patente U.S. n2 4 522 811. A entrega com lipossomas pode também incluir formulações de libertação lenta, incluindo matrizes farmacêuticas tais como géis e colagénio e lipossomas modificados com fibronectina (consultar, por exemplo, Weiner et al. (1985) J Pharm Sei. 74(9): 922-5). As composições aqui proporcionadas podem conter adicionalmente um ou mais adjuvantes que facilitam a entrega, tais como transportadores inertes ou sistemas de dispersão coloidal, não se lhes limitando. Podem selecionar-se exemplos representativos e não limitativos de tais transportadores inertes a partir de água, álcool isopropílico, fluorocarbonetos gasosos, álcool etílico, polivinilpirrolidona, propilenoglicol, um material produtor de gel, álcool estearílico, ácido esteárico, espermacete, monoleato de sorbitano, metilcelulose assim como combinações adequadas de dois ou mais destes. Inclui-se o composto ativo no transportador farmaceuticamente aceitável numa quantidade suficiente para exercer um efeito terapeuticamente útil na ausência de efeito secundários indesejáveis no indivíduo tratado. A concentração terapeuticamente eficaz pode ser determinada empiricamente por ensaio dos compostos em sistemas in vitro e in vivo conhecidos, tal como os ensaios aqui proporcionados. a. Dosagens A quantidade ou dose exatas do agente terapêutico administrado depende do polipéptido de FVII específico, da via de administração e outras considerações, tal como a gravidade da doença e o peso e estado geral do indivíduo. A administração local do agente terapêutico necessitará tipicamente uma dosagem menor do que qualquer modo de administração sistémica, apesar da concentração local do agente terapêutico poder, em alguns casos, ser superior após administração local que pode ser obtida com segurança por administração sistémica. Caso necessário, pode determinar-se empiricamente ou extrapolar-se uma dosagem específica e duração e protocolo de tratamento. Por exemplo, podem usar-se exemplos de doses de polipéptidos de FVII recombinantes e nativos como um ponto de partida para determinar dosagens adequadas. Por exemplo, administrou-se um polipéptido de FVII recombinante (rFVIIa) que foi ativado a rFVIIa, Novoseven®, a doentes com hemofilia A ou hemofilia B, que estão a sofrer um episódio de hemorragia, a uma dosagem de 90 pg/kg por infusão de bolus ao longo de 2 a 5 minutos, atingindo-se um nível efetivo em circulação de pelo menos 2 pg/ml. Repete-se a dose de 2 em 2 horas até se atingir hemóstase. Os polipéptidos de FVII modificados aqui proporcionados podem ser eficazes a quantidades de dosagem e/ou frequências reduzidas comparativamente com tal FVII recombinante. Por exemplo, os polipéptidos de FVII modificados aqui proporcionados podem ser administrados a uma dosagem de 80 pg/kg, 70 pg/kg, 60 pg/kg, 50 pg/kg, 40 pg/kg, 30 pg/kg, 20 pg/kg, 15 pg/kg ou menos. Em algumas concretizações, as dosagens podem ser mais elevadas, tal como 100 pg/kg, 110 pg/kg, 120 pg/kg ou superiores. A duração do tratamento e o intervalo entre injeções variará com a gravidade do sangramento e a resposta do doente ao tratamento e pode ajustar-se adequadamente. Podem ter-se em consideração fatores tais como o nivel de atividade e a semivida de FVII modificado em comparação com FVII não modificado quando se fazem determinações de dosagem. As dosagens e regimes específicos podem ser determinados empiricamente.
Noutro exemplo, administrou-se um polipéptido de FVII recombinante (rFVIIa) que foi ativado a rFVIIa, Novoseven®, a doentes com deficiência congénita em FVII que estão a sofrer um episódio de hemorragia a uma dosagem de 15-30 pg/kg por infusão de bolus ao longo de 2 a 5 minutos. Repete-se a dose a cada 4-6 horas até se atingir hemóstase. Os polipéptidos de FVII modificados aqui proporcionados podem ser eficazes a quantidades de dosagem e/ou frequências reduzidas comparativamente a tal FVII recombinante. Por exemplo, podem administrar-se os polipéptidos de FVII modificados aqui proporcionados a uma dosagem de 20 pg/kg, 15 pg/kg, 10 pg/kg, 5 pg/kg, 3 pg/kg ou inferior. Em alguns exemplos, as dosagens podem ser superiores, tais como 35 pg/kg, 40 pg/kg, 45 pg/kg ou superiores. A duração do tratamento e o intervalo entre injeções variará com a gravidade do sangramento e a resposta do doente ao tratamento e pode ajustar-se adequadamente. Podem ter-se em consideração fatores tais como o nível de atividade e a semivida de FVII modificado em comparação com FVII não modificado quando se fazem determinações de dosagem. Por exemplo, pode administrar-se um polipéptido de FVII modificado que apresenta uma semivida mais longa do que um polipéptido de FVII não modificado a menores dosagens e/ou com menor frequência do que o polipéptido de FVII não modificado. De igual modo, podem reduzir-se a frequência e quantidade das dosagens necessárias para o efeito terapêutico usando um polipéptido de FVII modificado que apresenta uma atividade coagulante aumentada comparativamente a um polipéptido de FVII não modificado. As dosagens e regimes específicos podem ser determinados empiricamente pelo perito na especialidade. b. Formas de dosagem
Os compostos farmacêuticos ativos terapeuticamente e seus derivados são formulados tipicamente e administrados em formas de dosagem unitária ou formas de dosagem múltipla. Podem proporcionar-se formulações para administração a humanos e animais em formas de dosagem que incluem, comprimidos, cápsulas, pílulas, pós, grânulos, soluções ou suspensões parentéricas estéreis, soluções ou suspensões orais e emulsões de óleo em água, não se lhes limitando, contendo quantidades adequadas dos compostos ou seus derivados farmaceuticamente aceitáveis. Cada dose unitária contém uma quantidade predeterminada de compostos ativos terapeuticamente suficientes para produzir o efeito terapêutica pretendido, em associação com o transportador, veículo ou diluente farmacêuticos necessários. Os exemplos de formas de dosagem unitária incluem ampolas e seringas e comprimidos ou cápsulas empacotados individualmente. Em alguns exemplos, proporciona-se a dose unitária como um pó liofilizado que é reconstituído antes da administração. Por exemplo, pode proporcionar-se um polipéptido de FVII como um pó liofilizado que é reconstituído com uma solução adequada para gerar uma solução para injeção em dose única. Em alguns exemplos, o pó liofilizado pode conter o polipéptido de FVII e componentes adicionais, tal como sais, de modo a que a reconstituição com água destilada estéril resulte num polipéptido de FVII numa solução tamponada ou salina. Podem administrar-se formas de dosagem unitária em frações ou seus múltiplos. Uma forma de dosagem múltipla é uma pluralidade de formas de dosagem unitária idênticas empacotadas num único recipiente a ser administrado numa forma de dosagem unitária independente. Os exemplos de formas de dosagem múltipla incluem frasquinhos, frascos de comprimidos ou cápsulas ou garrafas de pintos ou galões. Assim, a forma de dosagem múltipla é um múltiplo de doses unitárias que não se encontram empacotadas independentemente. 2. Administração de polipéptidos de FVII modificados
Os polipéptidos de FVII aqui proporcionados (i.e. compostos ativos) podem administrar-se in vitro, ex vivo ou in vivo, pondo em contacto uma mistura, tal como um fluido corporal ou outra amostra de tecido, com um polipéptido de FVII. Por exemplo, quando se administra um composto ex vivo, pode pôr-se em contacto um fluido corporal ou amostra de tecido de um indivíduo com os polipéptidos de FVII que revestem um tubo ou filtro, tal como por exemplo um tubo ou filtro num dispositivo de derivação. Quando administrado in vivo, podem administrar-se os compostos ativos por qualquer via apropriada, por exemplo, oralmente, nasalmente, pulmonarmente, parentericamente, intravenosamente, intradermicamente, subcutaneamente, intra-articularmente, intracisternicamente, intra-ocularmente, intraventricularmente, intratecalmente, intramuscularmente, intraperitonealmente, intratraqueia ou topicamente, assim como por qualquer combinação de quaisquer dois ou mais destes, na forma líquida, semilíquida ou sólida e formulam-se de um modo adequado para cada via de administração. Podem administrar-se polipéptidos de FVII modificados uma vez ou mais que uma vez, tal como duas vezes, três vezes, quatro vezes ou qualquer número de vezes que sejam necessárias para atingir um efeito terapêutico. Podem efetuar-se administrações múltiplas através de qualquer via ou combinação de vias e podem administrar-se hora a hora, de 2 em 2 horas, de três em três horas ou de quatro em quatro horas ou mais. A via de administração mais adequada variará dependendo do estado de doença a tratar, por exemplo a localização do distúrbio hemorrágico. De um modo geral, administrar-se-ão os polipéptidos de FVII por injeção de bolus intravenoso, com um tempo de administração (infusão) de aproximadamente 2-5 minutos. Noutros exemplos, podem manter-se níveis sanguíneos pretendidos de FVII por infusão contínua de um agente ativo tal como avaliado pelos níveis plasmáticos. Deve considerar-se que o médico assistente saberá como e quando terminar, interromper ou ajustar a terapia a dosagens menores devido à toxicidade ou a disfunções da medula óssea, fígado ou rins. Contrariamente, o médico assistente saberá também como e quando ajustar o tratamento a níveis mais elevados se a resposta clínica não for adequada (excetuando efeitos secundário tóxicos). Noutros exemplos, a localização do distúrbio hemorrágico pode indicar que a formulação de FVII seja administrada através de vias alternativas. Por exemplo, pode efetuar-se administração local, incluindo administração no cérebro (e.g., intraventricularmente) quando o doente está a sofrer hemorragia nesta região. De igual modo, para tratamento de hemorragia nas articulações, pode utilizar-se administração local por injeção do agente terapêutico na articulação (i.e., intra-articularmente ou pelas vias intravenosa ou subcutânea). Noutros exemplos, pode ser adequada a administração tópica do agente terapêutico na pele, por exemplo formulado como um creme, gel ou unguento ou administração nos pulmões por inalação ou intratraqueia, quando a hemorragia se localiza nestas áreas.
As situações nas quais os polipéptidos de FVII modificados são formulados como uma preparação depot, podem administrar-se formulações de atuação prolongada por implante (por exemplo, subcutânea ou intramuscularmente) ou por injeção intramuscular. Assim, por exemplo, podem formular-se os compostos terapêuticos com materiais poliméricos ou hidrofóbicos adequados (por exemplo como uma emulsão num óleo aceitável) ou resinas de permuta iónica ou como derivados fracamente solúveis, por exemplo, como um sal fracamente solúvel.
Caso pretendido, as composições podem apresentar-se numa embalagem, num kit ou num dispositivo dispensador que pode conter uma ou mais formas de dosagem unitária contendo o ingrediente ativo. A embalagem, por exemplo, contém filme metálico ou plástico, tal como uma embalagem de blister. 0 dispositivo de embalagem ou dispensador pode ser acompanhado de instruções para administração. As composições contendo os agentes ativos podem ser embalados como artigos de fabrico contendo material de embalagem, um agente aqui proporcionado e uma etiqueta que indica o distúrbio para o qual se proporciona o agente. 3. Administração de ácidos nucleicos que codificam polipéptidos de FVII modificados (terapia génica)
Também se proporcionam composições de moléculas de ácido nucleico que codificam para polipéptidos de FVII modificados e vetores de expressão que os codificam que são adequados para terapia génica. Em vez de administrar a proteína, pode administrar-se ácido nucleico in vivo, tal como por via sistémica ou outra via ou ex vivo, tal como por remoção de células, incluindo linfócitos, introdução do ácido nucleico nestas e reintrodução no hospedeiro ou num recebedor compatível.
Podem entregar-se polipéptidos de FVII modificados a células e tecidos por expressão de moléculas de ácido nucleico. Podem administrar-se os polipéptidos de FVII modificados como moléculas de ácido nucleico que codificam polipéptidos de FVII modificados, incluindo técnicas ex vivo e expressão in vivo direta. Podem administrar-se os ácidos nucleicos a células e tecidos por qualquer método conhecido dos peritos na especialidade. Podem incorporar-se as sequências de ácido nucleico isoladas em vetores para manipulação adicional. Tal como aqui usado, vetor (ou plasmídeo) refere-se a elementos discretos que se usam para introduzir ADN heterólogo nas células para sua expressão ou replicação. A seleção e uso de tais veículos está abrangida pelas capacidades dos peritos na especialidade.
Os métodos para administrar os polipéptidos de FVII modificados por expressão das moléculas de ácido nucleico codificantes incluem administração de vetores recombinantes. Pode conceber-se o vetor para que permaneça epissómico, tal como por inclusão de uma origem de replicação ou pode conceber-se para se integrar num cromossoma na célula. Podem também usar-se os polipéptidos de FVII modificados em terapia génica ex vivo usando para tal vetores não víricos. Por exemplo, podem conceber-se racionalmente células para expressar um polipéptido de FVII modificado, tal como por integração de ácido nucleico que codifica para um polipéptido de FVII modificado numa localização genómica, quer ligado operacionalmente a sequências de regulação ou de modo a estar colocado ligado operacionalmente a sequências de regulação numa localização genómica. Tais células podem então ser administradas local ou sistemicamente a um indivíduo, tal como um doente com necessidade de tratamento.
Podem utilizar-se vetores víricos, incluindo, por exemplo adenovirus, vírus adeno-associados (AAV), vírus de varíola, vírus de herpes, retrovirus e outros concebidos para terapia génica. Os vetores podem permanecer epissómicos ou podem integrar-se nos cromossomas do indivíduo tratado. Um polipéptido de FVII modificado pode ser expresso por um vírus, que é administrado a um indivíduo que necessita de tratamento. Os vetores víricos adequados para terapia génica incluem adenovirus, vírus adeno-associados (AAV), retrovirus, lentivírus, vírus de vaccinia e outros mencionados anteriormente. Por exemplo, a tecnologia de expressão de adenovirus é bem conhecida na especialidade e os métodos de produção e administração de adenovirus também são bem conhecidos. Estão disponíveis serotipos de adenovirus, por exemplo, de American Type Culture Collection (ATCC, Rockville, MD). Podem usar-se adenovirus ex vivo, por exemplo, isolam-se células de um doente que necessite de tratamento e transduzem-se com um vetor de adenovirus que expressa um polipéptido de FVII modificado. Após um período de cultura adequado, administram-se as células transfetadas a um indivíduo, local e/ou sistemicamente. Alternativamente, isolam-se partículas de adenovirus que expressam o polipéptido de FVII modificado e formulam-se num transportador farmaceuticamente aceitável para entrega de uma quantidade terapeuticamente eficaz para prevenir, tratar ou melhorar uma doença ou condição de um indivíduo. Tipicamente, entregam-se as partículas de adenovirus a uma dose entre 1 partícula e 1014 partículas por quilograma de peso do indivíduo, geralmente entre 106 ou 108 partículas a 1012 partículas por quilograma de peso do indivíduo. Em algumas situações pretende-se proporcionar uma fonte de ácido nucleico com um agente que tem como alvo células, tal como um anticorpo específico para uma proteína de superfície da membrana celular ou para uma célula alvo ou de um ligando para um receptor numa célula alvo. Pode também direcionar-se FVII para entrega a tipos específicos de células. Por exemplo, podem usar-se vetores adenovíricos que codificam para polipéptidos de FVII para expressão estável em células que não se dividam, tais como células de fígado (Margaritis et al. (2004) J Clin Invest 113:1025-1031) . Noutro exemplo, podem transduzir-se vetores víricos ou não víricos que codificam para polipéptidos de FVII para células isoladas para entrega subsequente. Os tipos de células adicionais para expressão e entrega de FVII podem incluir fibroblastos e células endoteliais, não se lhes limitando.
Podem introduzir-se as moléculas de ácido nucleico em cromossomas artificiais e outros vetores não viricos. Os cromossomas artificiais tal como ACES (consultar, Lindenbaum et al. (2004) Nucleic Acids Res. 32(21) :el72) podem ser concebidos racionalmente para codificar e expressar a isoforma. Sucintamente, os cromossomas artificiais de mamífero (MAC) proporcionam um meio de introduzir cargas elevadas de informação genética na célula num formato que não se integra e que tem replicação autónoma. A expressão de cromossomas artificiais baseada em ADN (ACE), um fenómeno especifico dos MAC, pode ser gerado de novo e de forma reprodutível em linhas celulares de espécies diferentes e facilmente purificado a partir de cromossomas das células hospedeiros. Os ACE de mamífero purificados podem então ser reintroduzidos em várias das linhas celulares recebedoras nas quais têm sido mantidos de forma estável durante períodos prolongados na ausência de pressão seletiva usando um sistema de ACE. Usando esta abordagem, obteve-se o carregamento específico de um ou dois alvos génicos em células LMTK(-) e CHO.
Outro método para introduzir ácidos nucleicos que codificam para polipéptidos de FVII modificados é uma técnica de substituição génica em duas etapas em levedura, começando com um genoma de adenovirus completo (Ad2; Ketner et al. (1994) PNAS 91: 6186-6190) clonado num cromossoma artificial de levedura (YAC) e um plasmídeo contendo sequências de adenovirus que têm como alvo uma região específica no clone de YAC, uma cassete de expressão para o gene de interesse e um marcador de seleção positivo e negativo. Os YAC são especialmente interessantes porque permitem a incorporação de genes maiores. Pode usar-se esta abordagem para construir vetores baseados em adenovirus apresentando ácidos nucleicos que codificam para quaisquer dos polipéptidos de FVII modificados descritos para transferência génica para células de mamífero ou animais completos.
Podem encapsular-se os ácidos nucleicos num veículo, tal como um lipossoma ou introduzir-se em células, tal como uma célula bacteriana, especialmente uma bactéria atenuada ou podem ser introduzidos num vetor vírico. Por exemplo, quando se usam lipossomas, podem usar-se proteínas que se ligam a uma proteína da superfície da membrana celular associada a endocitose para dirigir e/ou facilitar a absorção, e.g. proteínas de cápside ou seus fragmentos trópicos para um tipo de célula específico, anticorpos para proteínas que sofrem internalização em ciclo e proteínas que têm como alvo a localização intracelular e que aumentam a semivida intracelular.
Para métodos ex vivo e in vivo, introduzem-se moléculas de ácido nucleico que codificam para o polipéptido de FVII modificado em células que são de um dador adequado ou do indivíduo a ser tratado. As células nas quais se pode introduzir um ácido nucleico com objetivos de terapia incluem, por exemplo, qualquer tipo de célula pretendido e disponível, apropriado para a doença ou condição a tratar, incluindo células epiteliais, células endoteliais, queratinócitos, fibroblastos, células de músculo, hepatócitos; células de sangue tais como linfócitos T, linfócitos B, monócitos, macrófagos, neutrófilos, eosinófilos, megacariócitos, granulócitos; várias células estaminais ou progenitoras, em particular células estaminais ou progenitoras hematopoiéticas, e.g., tal como células estaminais obtidas de medula óssea, sangue de cordão umbilical, sangue periférico, fígado fetal e outras fontes destas, não se lhes limitando.
Para tratamento ex vivo, removem-se células de um dador compatível com o indivíduo a tratar ou do próprio indivíduo a tratar, introduz-se o ácido nucleico nestas células isoladas e administram-se as células modificadas ao indivíduo. 0 tratamento inclui administração direta, tal como, por exemplo, encapsuladas no interior de membranas porosas, que são implantadas no doente (consultar, e.g., patente U.S. n2 4 892 538 e 5 283 187 sendo cada um aqui incorporado por referência na sua globalidade). As técnicas adequadas para a transferência de ácido nucleico para células de mamífero in vitro incluem o uso de lipossomas e lípidos catiónicos (e.g., DOTMA, DOPE e DC-Col) e métodos de eletroporação, microinjeção, fusão celular, DEAE-dextrano e precipitação com fosfato de cálcio. Podem usar-se métodos de entrega de ADN para expressar polipéptidos de FVII modificados in vivo. Tais métodos incluem entrega de ácidos nucleicos por lipossomas e entrega de ADN nu, incluindo entrega local e sistémica tal como usando entrega por electroporação, ultrassons e fosfato de cálcio. Outras técnicas incluem microinjeção, fusão celular, transferência génica mediada por cromossoma, transferência génica mediada por microcélulas e fusão de esferoplastos. A expressão in vivo de um polipéptido de FVII modificado pode ligar-se à expressão de moléculas adicionais. Por exemplo, pode ligar-se a expressão de um polipéptido de FVII modificado com a expressão de um produto citotóxico tal como num vírus concebido racionalmente ou expresso num vírus citotóxico. Tal vírus pode dirigir-se a um tipo de célula específico que é um alvo para se obter um efeito terapêutico. Pode usar-se o polipéptido de FVII modificado expresso para aumentar a citotoxicidade do vírus. A expressão in vivo de um polipéptido de FVII modificado pode incluir a ligação operacional de uma molécula de ácido nucleico que codifica para um polipéptido de FVII modificado com sequências de regulação específicas tal como um promotor específico de célula ou específico de tecido. Os polipéptidos de FVII modificados podem também ser expressos a partir de vetores que infetam especificamente e/ou se replicam em tipos de células e/ou tecidos alvo. Podem usar-se promotores indutíveis para regular seletivamente a expressão do polipéptido de FVII modificados. Um exemplo de sistema de expressão regulável é o sistema de expressão génica indutível por doxiciclina, que tem sido usado para regular a expressão de FVII recombinante (Srour et al. (2003) Thromb Haemost. 90 (3) : 398-405) .
Podem administrar-se moléculas de ácido nucleico, como ácidos nucleicos nus ou em vetores, cromossomas artificiais, lipossomas e outros veículos ao indivíduo por administração sistémica, tópica, local e outras vias de administração. Quando a administração é sistémica e in vivo, a molécula de ácido nucleico ou veículo contendo a molécula de ácido nucleico podem ser dirigidos para uma célula. A administração pode também ser direta, tal como por administração de um vetor ou células que têm tipicamente como alvos uma célula ou tecido. Por exemplo, as células de tumor e células em proliferação podem ser células alvo para expressão in vivo de polipéptidos de FVII modificados. As células usadas para expressão in vivo de um polipéptido de FVII modificado também incluem células autólogas ao doente. Tais células podem remover-se de um doente, introduzem-se ácidos nucleicos para expressão de um polipéptido de FVII modificado e seguidamente administram-se a um doente tal como por injeção ou enxerto. H. Usos terapêuticos
Os polipéptidos de FVII modificados aqui proporcionados podem ser usados para tratamento de qualquer condição para a qual se usa FVII recombinante. Tipicamente, tais tratamentos incluem aqueles nos quais se pretende aumento da coagulação, tais como respostas hemostáticas aumentadas. Os polipéptidos de FVII modificados têm atividade terapêutica sozinhos ou em combinação com outros agentes. Os polipéptidos modificados aqui proporcionados são concebidos para manter a atividade terapêutica mas apresentam propriedades modificadas, nomeadamente resistência aumentada a AT-III e atividade catalítica aumentada. Os polipéptidos modificados aqui proporcionados podem também apresentar resistência aumentada a TFPI, resistência aumentada aos efeitos de inibição de Zn2+, propriedades farmacocinéticas melhoradas, tais como semivida sérica aumentada, ligação e/ou afinidade para plaqueta ativadas aumentadas, ligação e/ou afinidade para albumina de soro aumentada e/ou ligação e/ou afinidade para integrina nb 3 de plaquetas aumentada. Tais propriedades modificadas, por exemplo, podem melhorar a eficácia terapêutica dos polipéptidos devido ao aumento da atividade coagulante dos polipéptido de FVII modificados. Esta secção proporciona exemplos dos seus usos e de métodos de administração. Estas terapias descritas são exemplos e não limitam as aplicações dos polipéptidos de FVII modificados.
Os polipéptidos modificados aqui proporcionados podem usar-se em vários métodos terapêuticos assim como diagnósticos nos quais se usa FVII. Tais métodos incluem, métodos de tratamento de condições fisiológicas e médicas descritas e listadas seguidamente, não se lhes limitando. Os polipéptidos de FVII modificados aqui proporcionados podem apresentar melhoria das atividades e dos efeitos terapêuticos in vivo comparativamente a FVII de tipo selvagem, incluindo menores dosagens para atingir o mesmo efeito e outras melhorias na administração e tratamento tal como menos administrações e/ou administrações menos frequentes, diminuição de efeitos secundários e melhoria dos efeitos terapêuticos. Apesar de se considerar que os polipéptidos de FVII modificados podem ser administrados como um zimogénio de FVII (i.e. forma em cadeia simples), tipicamente administram-se os polipéptidos de FVII modificados aqui proporcionados na forma ativada em duas cadeias após, por exemplo, autoativação ou ativação por outros fatores de coagulação, tal como durante a purificação.
Nomeadamente, pretende-se que os polipéptidos de FVII modificados sejam para uso em métodos terapêuticos nos quais se usou FVII para tratamento. Tais métodos incluem métodos de tratamento de doenças e distúrbios tais como, distúrbios de coagulação sanguínea, distúrbios hematológicos, distúrbios hemorrágicos, hemofilias, tal como hemofilia A, hemofilia B e deficiência em fator VII e distúrbios do sangue adquiridos, tais como deficiência adquirida em fator VII causada por doença hepática, não se lhes limitando. Os polipéptidos de FVII modificados podem também ser usados no tratamento de doenças e distúrbios de hemorragia adicionais, tais como trombocitopenia (e.g., tal como devida a regimes de quimioterapia), doença de Von Willebrand, distúrbios hereditários de plaquetas (e.g., doença de reservas de armazenamento tais como as síndromes de Chediak-Higashi e Hermansky-Pudlak, disfunção de tromboxano A2, trombastenia de Glanzmann e sindrome de Bernard-Soulier), sindrome hemolítica-urémica, telangiectsasia hemorrágica hereditária, também denominados sindrome de Rendu-Osler-Weber, púrpura alérgica (púrpura de Henoch Schonlein) e coagulação intravascular disseminada, não se lhes limitando.
Em alguns exemplos, as hemorragias a tratar com os polipéptidos de FVII ocorrem em órgãos tais como o cérebro, a região do ouvido interno, olhos, fígado, pulmão, tecido tumoral, trato gastrointestinal. Noutros exemplos, a hemorragia é difusa, tal como na gastrite hemorrágica e na hemorragia uterina profusa. Os doentes com doenças hemorrágicas, tais como por exemplo, hemofilia A e B, estão muitas vezes em risco de complicações derivadas de hemorragias durante cirurgia ou traumatismo. Tais hemorragias podem manifestar-se como hemartroses agudas (hemorragias nas articulações) , artropatia hemofílica crónica, hematomas, (e.g., muscular, retroperitoneal, sublingual e retrofaríngeo), hematúria (hemorragia do trato renal), hemorragias do sistema nervoso central, hemorragias gastrointestinais (e.g., sangramentos UGI) e hemorragia cerebral, que também podem ser tratados com os polipéptidos de FVII modificados. Adicionalmente, qualquer hemorragia associada com cirurgia (e.g., hepatectomia) ou extração dentária pode ser tratada com polipéptidos de FVII modificados. Num exemplo, os polipéptidos de FVII modificados podem usar-se para tratar episódios de hemorragia devida a traumatismo ou cirurgia ou diminuição da contagem ou da atividade de plaquetas num indivíduo. Os exemplos de métodos para doentes submetidos a cirurgia incluem tratamentos para prevenir hemorragia e tratamentos antes, durante ou após cirurgias tais como cirurgia cardíaca, angioplastia, cirurgia do pulmão, cirurgia abdominal, cirurgia espinal, cirurgia cerebral, cirurgia vascular, cirurgia dentária ou cirurgia de transplante de órgãos incluindo transplante de medula óssea, coração, pulmão, pâncreas ou fígado, não se lhes limitando. 0 tratamento de doenças e condições com polipéptidos de FVII modificados pode efetuar-se por qualquer via de administração adequada usando formulações adequadas tal como aqui descrito incluindo administração por injeção, pulmonar, oral e transdérmica, não se lhes limitando. 0 tratamento é tipicamente efetuado por administração intravenosa de bolus.
Caso necessário, podem determinar-se empiricamente ou extrapolar-se uma duração e dosagem e protocolo de tratamento específicos. Por exemplo, podem usar-se exemplos de doses de polipéptidos de FVII recombinantes e nativos como um ponto de partida para determinar dosagens apropriadas. Por exemplo, administrou-se um polipéptido de FVII recombinante (rFVIIa) que foi ativado para rFVIIa, Novoseven®, a doentes com hemofilia A ou hemofilia B, que estão a sofrer um episódio de hemorragia a uma dosagem de 90 pg/kg por infusão de bolus ao longo de 2 a 5 minutos, atingido um nível em circulação efetivo de pelo menos 2 pg/ml, com uma semivida média de 2,7 horas. Repete-se a dose de 2 em 2 horas até se atingir a hemóstase. Os polipéptidos de FVII modificados que têm uma atividade coagulante aumentada, devido a por exemplo, resistência aumentada a AT-III, atividade catalítica aumentada, resistência aumentada aos efeitos de inibição de Zn2+, resistência aumentada a TFPI, propriedades farmacocinéticas melhoradas, tais como semivida sérica aumentada, ligação e/ou afinidade para plaguetas ativadas aumentada, ligação e/ou afinidade para albumina de soro aumentada e/ou ligação e/ou afinidade para integrina nb 3 de plaguetas aumentada, podem ser eficazes a reduzir as guantidades de dosagem e/ou freguências comparativamente a tal FVII recombinante. Podem ser usadas como orientação as dosagens para polipéptidos de FVII de tipo selvagem ou não modificados para determinar dosagens para polipéptidos de FVII modificados. Podem usar-se factores tais como o nível de atividade e semivida de FVII modificado em comparação com FVII não modificado para fazer tais determinações. Podem determinar-se empiricamente dosagens e regimes específicos.
Podem determinar-se níveis de dosagem e regimes com base em dosagens e regimes conhecidos e caso necessário podem extrapolar-se com base nas variações de propriedades dos polipéptidos modificados e/ou pode determinar-se empiricamente com base numa variedade de fatores. Tais fatores incluem o peso corporal do indivíduo, saúde geral, idade, a atividade do composto específico utilizado, género, dieta, tempos da administração, velocidade de excreção, combinação de fármacos, gravidade e decurso da doença e a disposição do doente para a doença e a opinião do médico assistente. Tipicamente combina-se o ingrediente ativo, o polipéptido, com um transportador farmaceuticamente eficaz. A guantidade de ingrediente ativo gue pode ser combinada com os materiais transportadores para produzir uma forma de dosagem única ou uma forma de dosagem múltipla pode variar dependendo do hospedeiro tratado e do modo de administração específico.
Pode monitorizar-se o efeito dos polipéptidos de FVII no tempo de coagulação do sangue usando gualguer dos ensaios de coagulação conhecidos na especialidade incluindo tempo de protrombina (PT) de sangue total, tempo de tromboplastina parcial ativada (aPTT), tempo de coagulação ativada (ACT), tempo de coagulação ativada recalcifiçado ou tempo de coagulação de Lee-White, não se lhes limitando.
Quando a condição do doente melhora, pode administrar-se uma dose de manutenção de um composto ou de composições, caso necessário; e podem modificar-se a dosagem, a forma de dosagem ou a frequência da administração ou uma sua combinação. Em alguns casos, um indivíduo pode necessitar de tratamento intermitente numa base a longo prazo caso haja qualquer recorrência dos sintomas da doença ou com base nas dosagens programadas. Noutros casos, podem ser necessárias administrações adicionais em resposta a eventos agudos tais como hemorragia, traumatismo ou procedimentos cirúrgicos.
Seguidamente descrevem-se exemplos de algumas condições para as quais se usou FVII (administrado como FVIIa) como um agente de tratamento sozinho ou em combinação com outros agentes. 1. Doenças hemorrágicas congénitas a. Hemofilia A hemofilia congénita é uma doença recessiva do sangue na qual se observam níveis reduzidos de fatores de coagulação no plasma, levando a uma disrupção da cascata de coagulação e aumento do tempo de coagulação do sangue. A hemofilia A, que representa aproximadamente 85% de todos os casos de hemofilia, resulta de uma ou mais mutações no gene do fator VIII no cromossoma X, levando a uma deficiência ou disfunção da proteína de FVIII. A hemofilia B é causada por uma deficiência ou disfunção do fator de coagulação, FIX, resultante geralmente de mutações pontuais ou deleções no gene FIX do cromossoma X. A incidência mundial de hemofilia A é de aproximadamente 1 caso por 5000 homens e 1 caso por 25000 homens para hemofilia B. As hemofilias A e B são classificadas adicionalmente como ligeira, moderada ou grave. Um nível plasmático de 5%-25% de fator VIII ou IX funcionando normalmente classifica-se como ligeira, l%-5% é moderada e menor que 1% é grave. A hemofilia C, muitas vezes referidas como uma deficiência de FIX, é uma doença relativamente ligeira e rara, que afeta cerca de 1 em cada 100 000 pessoas de uma forma autossómica recessiva.
As hemofilias A e B manifestam-se clinicamente de muitas formas. Os pequenos cortes e arranhões não resultarão em hemorragia excessiva, ao contrário de traumatismos e cirurgias. 0 doente também sofrerá numerosas hemorragias das articulações e dos músculos e facilmente terá pisaduras. A hemartrose ou hemorragia das articulações é uma das principais complicações da hemofilia e pode ocorrer espontaneamente ou em resposta a traumatismo. Os ginglimos, tais como o joelho, cotovelo e tornozelo, são os mais frequentemente afetados. A anca e o ombro são afetados com muito menor frequência dado que as articulações de esfera e soquete têm mais musculatura a rodeá-las, protegendo-as assim mais contra lesões. A hemorragia pode causar dores agudas intensas, restrição de movimentos e levar a complicações secundárias incluindo hipertrofia sinovial. Adicionalmente, a hemorragia recorrente das articulações pode causar sinovite crónica que pode causar danos das articulações, destruição do sinóvio, cartilagem e osso. As hemorragias letais, tais como hemorragia intracraniana e hemorragia no sistema nervoso central, também afetam os indivíduos hemofílicos. A hemorragia intracraniana ocorre em aproximadamente 10% dos doentes com hemofilia grave, resultando numa taxa de mortalidade de 30%. Contrariamente, a hemofilia C é mais ligeira. Os sangramentos espontâneos são raramente observados e a hemorragia nas articulações, tecidos moles e músculos também são pouco comuns. A hemorragia é geralmente tratada com transfusão de plasma congelado fresco (FFP), terapia de substituição de FXI ou para tratamento tópico, tal como tratamento de feridas externas ou extrações dentárias com cola de fibrina. O tratamento mais comum para hemofilia A ou B é a terapia de substituição, na qual se administra ao doente FVIII ou FIX. As formulações estão disponíveis comercialmente como produtos derivados de plasma ou recombinantes, sendo presentemente as proteínas recombinantes o tratamento de eleição para doentes que anteriormente não eram tratados. Embora estas terapias possam ser muitos bem sucedidas, podem desenvolver-se complicações se o doente desenvolver inibidores do fator VIII ou fator IX recentemente administrados. Os inibidores são anticorpos IgG, na sua maioria da subclasse IgG4, que reagem com FVIII ou FIX e interferem com a função pró-coagulante. Os inibidores afetam cerca de 1 em cada 5 doentes com hemofilia A grave. A maioria dos indivíduos desenvolve estes inibidores rapidamente após a administração das primeiras infusões de fator VIII, o que é muitas vezes na primeira infância, apesar de alguns indivíduos os desenvolverem mais tarde na vida. Os inibidores também afetam cerca de 1 em 15 pessoas com hemofilia A ligeira ou moderada. Estes inibidores habitualmente desenvolvem-se durante a vida adulta e não apenas destroem o FVIII exógeno administrado, mas também destroem FVIII endógeno. Em resultado, os hemofílicos ligeiros ou moderados tornam-se graves. Clinicamente, os doentes de hemofilia A com inibidores classificam-se em muito sensíveis ou pouco sensíveis de acordo com a intensidade da resposta anamnéstica que experienciam quando são reexpostos a FVIII. Os inibidores podem afetar cerca de 1 em 100 doentes com hemofilia B. Na maioria dos casos, os inibidores desenvolvem-se após as primeiras infusões de fator IX terapêutico e podem ser acompanhados por reações alérgicas.
Os polipéptidos de FVII modificados aqui apresentados podem ser usados para tratar doentes com hemofilia, especialmente doentes de hemofilia com inibidores. Foi aprovado um produto de FVIIa recombinante (NovoSeven, Novo Nordisk) e licenciado para o tratamento de episódios de hemorragia em doentes de hemofilia A ou B com inibidores de FVIII ou FIX e para a prevenção de hemorragia em intervenções cirúrgicas ou procedimentos invasivos em doentes de hemofilia A ou B com inibidores de FVIII ou FIX. O tratamento com rFVIIa melhora a geração de trombina ao mesmo tempo que evita o requisito de FVIIIa e/ou FIXa. Inicia-se a coagulação no local da lesão pela interação de rFVIIa com TF, resultando em ativação inicial de FX, geração de trombina e ativação de plaquetas. A coagulação completa por rFVIIa pode ser efetuada por mecanismos dependentes de TF e independentes de TF, em que alguma da trombina gerada pode resultar de ativação direta de FX em plaquetas ativadas apenas por rFVIIa, que por sua vez liga plaquetas ativadas através de interações de baixa afinidade com as membranas de fosfolípidos.
Os polipéptidos de FVII modificados aqui proporcionados podem ser usados em terapias para hemofilia, incluindo o tratamento de episódicos de hemorragia e a prevenção de hemorragia em intervenções cirúrgicas ou procedimentos invasivos. Os polipéptido de FVII modificados aqui podem proporcionar resistência aumentada a AT-III, atividade catalítica aumentada, resistência aumentada a efeitos de inibição de Zn2+, resistência aumentada a TFPI, propriedades farmacocinéticas melhoradas, tais como semivida sérica aumentada, ligação e/ou afinidade para plaquetas ativadas aumentada, ligação e/ou afinidade para albumina de soro aumentada e/ou ligação e/ou afinidade para integrina nb 3 de plaquetas aumentada. Os polipéptidos de FVII podem portanto apresentar atividade coagulante mais elevada de uma forma dependente de TF (tal como através de resistência aumentada a TFPI) e/ou de uma forma independente de TF (tal como através de ligação e/ou afinidade para plaquetas ativadas aumentada). Assim, podem usar-se polipéptidos de FVII modificados para proporcionar terapias mais ativas para hemofilia. Os exemplos de melhorias terapêuticas usando polipéptidos de FVII modificados incluem por exemplo, menores dosagens, menos administrações e/ou administrações menos frequentes, redução de efeitos secundários e efeitos terapêuticos aumentados, não se lhes limitando.
Os polipéptido de FVII modificados são tipicamente administrados como polipéptidos de FVII ativados (FVIIa). Podem testar-se polipéptidos de FVII modificados relativamente a eficácia terapêutica, por exemplo, usando modelos animais. Por exemplo, podem tratar-se ratinhos hemofílicos induzidos por anticorpos ou qualquer outro modelo de doença conhecido para hemofilia, com polipéptidos de FVII modificados. A progressão dos sintomas e fenótipos da doença é monitorizada para avaliar os efeitos dos polipéptidos de FVII modificados. Podem também administrar-se os polipéptidos de FVII modificados a indivíduos tal como em ensaios clínicos para avaliar a eficácia in vivo comparativamente a controlos de placebo e/ou controlos usando FVII não modificado.
b. Deficiência em FVII A deficiência em fator VII é uma doença hemorrágica autossómica recessiva que afeta aproximadamente 1 em 500 000 pessoas. A deficiência em FVII pode ser clinicamente ligeira, moderada ou grave, sendo as deficiências ligeiras a moderadas caracterizadas por hemorragia aumentada após cirurgia e traumatismo. Os doentes com deficiência em FVII grave (menos de 1% de atividade de FVII) experienciam sintomas semelhantes à hemofilia. Por exemplo, os indivíduos deficientes em FVII têm tendência para sangramento nas articulações, hemorragias nasais espontâneas, hemorragia gastrointestinal, hemorragia do trato urinário. Também se relataram hemorragias intracerebrais e sangramentos musculares, enquanto as mulheres podem experienciar menorragia grave (hemorragia menstrual intensa). 0 tratamento por efetuar-se por terapia de substituição. Foi aprovado um produto de FVIIa recombinante (NovoSeven®, Novo Nordisk) e licenciado para o tratamento de episódios de hemorragia em doentes com deficiência congénita em FVII e para a prevenção de hemorragia em intervenções cirúrgicas ou procedimentos invasivos em doentes com deficiência congénita em FVII. Portanto, os polipéptido de FVII modificados aqui podem ser usados de igual modo. Os polipéptidos de FVII modificados aqui proporcionados podem ser usados no tratamento de episódios de hemorragia e a prevenção de hemorragia em intervenções cirúrgicas ou procedimentos invasivos em doentes deficientes em FVII. Por exemplo, a um doente recém-nascido que apresente deficiência grave em FVII com hemorragia intracraniana podem administrar-se polipéptidos de FVII modificados em bolus intravenoso para efetuar coagulação e manter a hemóstase. Geralmente administram-se os polipéptidos de FVII modificados como polipéptidos de FVII ativados (FVIIa). c. Outras
Podem tratar-se outras doenças hemorrágicas com os polipéptidos de FVII aqui proporcionados para promover coagulação. As deficiências congénitas em fatores V e X também apresentam um aumento dos tempos de coagulação sanguínea e podem ser potencialmente tratados com a administração de doses terapêuticas de FVII. Por exemplo, pode administrar-se rFVIIa a um doente com deficiência em fator X para controlar a hemorragia associada à esplenectomia (Boggio et al. (2001) Br J Haematol 112:1074-1075) . Os episódios de hemorragia espontânea e associados a cirurgia e associados à doença de von Willebrand (vWD) podem também ser tratados usando os polipéptidos de FVII modificados aqui proporcionados. A VWD é um distúrbio hemorrágico causado por um defeito ou deficiência da proteína de coagulação de sangue, fator de von Willebrand (vWF) e estima-se que ocorra em 1% a 2% da população. Os indivíduos com vWD ficam com pisaduras facilmente, têm sangramentos nasais recorrentes, sangram após extrações dentárias, amigdalectomia ou outra cirurgia e as doentes podem apresentar aumento da hemorragia menstrual. Podem usar-se os polipéptidos de FVII modificados para melhorar hemorragias espontâneas e associadas a cirurgias em doentes com vWD (von Depka et al. (2006) Blood Coagul Fibrin 17:311-316) . Outras doenças hemorrágicas relacionadas com plaquetas, tal como por exemplo, trombastenia de Glanzmann e síndrome de Hermansky-
Pudlak estão também associadas a atividade de coagulação endógena reduzida. Pode também controlar-se a hemorragia espontânea em excesso ou associado a cirurgia em doentes com doenças hemorrágicas relacionadas com plaquetas através de doses terapêuticas dos polipéptidos de FVII modificados. Por exemplo, um doente com trombastenia de Glanzmann submetido a cirurgia pode ser tratado antes, durante e/ou após a cirurgia com os polipéptidos de FVII modificados para evitar perdas de sangue importantes (van Buuren et al. (2002) Dig Dis Sei 47:2134-2136). Geralmente, administram-se os polipéptidos de FVII modificados como polipéptidos FVII ativados (FVIIa). 2. Doenças hemorrágicas adquiridas a. Trombocitopenia adquirida por quimioterapia
As doenças hemorrágicas podem também ser adquiridas e não congénitas. Por exemplo, o tratamento com quimioterapia, tal como para leucemia e outros cancros, pode resultar em trombocitopenia. Tal deve-se provavelmente a uma perda de produção de plaquetas na medula óssea de doentes que recebem quimioterapia e ocorrem tipicamente 6-10 dias após medicação. O tratamento da trombocitopenia adquirida é habitualmente por transfusão de plaquetas, eritrócitos ou plasma, que serve para prevenir qualquer hemorragia espontânea anómala que possa resultar de deficiência em plaquetas. A hemorragia em doentes com trombocitopenia induzida por quimioterapia ou qualquer outra trombocitopenia adquirida ou congénita, também pode ser controlada pela administração de quantidades terapêuticas dos polipéptidos de FVII modificados aqui proporcionados. Por exemplo, pode administrar-se a um doente com trombocitopenia com hemorragia descontrolada, tal como no trato gastrointestinal, uma injeção de bolus intravenoso de uma quantidade terapêutica do polipéptido de FVII para parar a hemorragia (Gerotziafas et al. (2002) Am J Hematol 6 9:219 — 222). De um modo geral, administram-se os polipéptidos de FVII modificados como polipéptidos de FVII ativados (FVIIa). b. Outras coagulopatias
Podem tratar-se outras coagulapatias adquiridas usando os polipéptidos de FVII modificados aqui apresentados. As coagulapatias podem resultar de condições incluindo insuficiência hepática fulminante (FHF; tal como causada por fármacos hepatotóxicos, toxinas, doenças metabólicas, doenças infeciosas e isquemia), outra doença do figado, incluindo cirrose e doença associada a doença de Wilson, deficiência em vitamina K (tal como causada por tratamento com antibiótico ou dieta), sindrome urémico hemolitico, trombocitopenia trombótica (TTC) e coagulopatia intravascular disseminada (DIC), não se lhes limitando. O tratamento convencional é geralmente por transfusão com plasma, eritrócitos ou plaquetas, mas pode não ser bem sucedido. Numa concretização, podem administrar-se os polipéptidos de FVII modificados a um doente com FHF que foi submetido a procedimentos invasivos para evitar hemorragia. O tratamento convencional com plasma congelado fresco (FFP) não é muitas vezes bem sucedido e podem ser necessárias grandes quantidades de plasma, produzindo sobrecarga de volume e anassarca (uma infiltração generalizada de fluido de edema para o tecido conjuntivo subcutâneo). O tratamento com quantidades terapêuticas de polipéptidos de FVII modificados por bolus intravenoso durante, antes e/ou após cirurgia invasiva, tal como por exemplo, biopsia do figado ou transplante de figado, pode evitar hemorragia e estabelecer hemóstase em doentes de FHF. O doente pode ser monitorizado seguindo a PT do sangue para determinar a eficácia do tratamento (Shami et al. (2003) Liver Transpl 9:138-143). Noutro exemplo, pode administrar-se FVII a um doente com hemorragia grave associada a coagulopatia, tal como por exemplo, hemorragia intra-abdominal grave pós-cesariana associada a disfunção do figado e DIC, que não respondeu a infusões de transfusões convencionais (Moscardo et al. (2001) Br J Haematol 113:174-176). Adicionalmente, podem usar-se os polipéptidos de FVII modificados para tratar coagulopatia em doentes recém-nascidos e pediátricos. Num exemplo especifico, os doentes recém-nascidos e pediátricos não respondem a tratamento convencional, tal como infusão de eritrócitos e de plaquetas. Por exemplo, aos neonatos com hemorragia pulmonar grave associada a PT aumentadas que não responderam a transfusão de plaquetas e eritrócitos podem administrar-se polipéptidos de FVII modificados para diminuir a PT e estabelecer hemóstase (Olomu et al. (2002) J Perinatol 22:672-674) . Os polipéptidos de FVII modificados aqui proporcionados apresentam atividade de coagulação melhorada comparativamente a polipéptidos de FVII não modificados e podem consequentemente ser administrados, por exemplo, a doses menores, com menor frequência e com menos efeitos adversos. De um modo geral, administram-se os polipéptidos de FVII modificados como polipéptidos de FVII ativados (FVIIa). c. Hemorragia adquirida por transplante A hemorragia grave após transplante de medula óssea (BMT) e transplante de células estaminais (SCT) é uma complicação relativamente comum e potencialmente fatal associada com estes procedimentos devido à redução de plaquetas. Por exemplo, a hemorragia alveolar difusa (DAH) é uma complicação pulmonar de BMT com uma incidência estimada de 1-21% na população transplantada e uma taxa de mortalidade de 60-100%. O tratamento convencional de tais episódios de hemorragia inclui tratamento com corticosteróides e transfusão com plasma, plaquetas e/ou eritrócitos, apesar destes tratamento não terem maioritariamente sucesso com uma taxa de mortalidade global de aproximadamente 50% (Hicks et al. (2002) Bone Marrow Transpl 30:975-978). A administração de FVII por bolus intravenoso, com ou sem tratamento simultâneo com corticosteróides e/ou infusão de plaquetas, pode efetuar-se para tratar DAH e estabelecer hemóstase (Hicks et al. (2002) Bone Marrow Transpl 30:975-978). Os polipéptidos de FVII modificados aqui proporcionados apresentam atividade de coagulação melhorada comparativamente com polipéptidos de FVII não modificados e podem portanto ser administrados, por exemplo, a doses menores, com menor frequência, ao longo de uma duração mais curta para o tratamento e com menos reações adversas para a mesma atividade biológica e eficácia. De um modo geral, administram-se os polipéptidos de FVII modificados como polipéptidos de FVII ativados (FVIIa). d. Hemorragia induzida por terapia anticoagulante
Os doentes submetidos a terapia anticoagulante para o tratamento de condições, tal como tromboembolismo, podem apresentar episódios de hemorragia após administração aguda de anticoagulantes, tais como varfarina, heparina e fondaparinux ou desenvolvem doenças hemorrágica em resultado da utilização de tais terapias a longo prazo. Os tratamentos para os episódios de hemorragia incluem tipicamente a administração de pró-coagulantes, tais como vitamina K, plasma, FIX exógeno e protaminas para neutralizar heparina. A administração de FVII exógeno pode também ser efetuada para neutralizar o efeito dos anticoagulantes, aumentar PT, aPTT e/ou outros marcadores de coagulação e para estabelecer hemóstase (Deveras et al. (2002)
Ann Inten Med 137:884-888) . Os polipéptidos de FVII modificados aqui proporcionados podem usar-se nos tratamentos para controlar episódios de hemorragia em doentes com doenças hemorrágicas adquiridas devido a tratamentos com anticoagulantes. De um modo geral administram-se os polipéptidos de FVII modificados como polipéptidos de FVII ativados (FVIIa). e. Hemofilia adquirida
Podem desenvolver-se inibidores de fator VIII espontaneamente em indivíduos de outro modo saudáveis, resultando numa condição conhecida como "hemofilia adquirida". A hemofilia adquirida é uma condição rara com uma incidência anual de 0,2-1,0 por milhão de habitantes. Os autoanticorpos são principalmente anticorpos IgG4 que, quando ligados a FVIII, inibem a atividade de FVIII por interferência com clivagem de trombina, interação com fator de von Willebrand e/ou ligação de fosfolípido. Tal resulta numa hemorragia potencialmente fatal em aproximadamente 87% dos doentes afetados. Os locais comuns de hemorragia são a pele, mucosa, músculos e retroperitônio, contrariamente a doentes com hemofilia hereditária que sangram predominantemente nas articulações e músculos. A hemofilia adquirida pode ser tratada com um complexo de protrombina ativada concentrado ou fator VII recombinante ativado (NovoSeven®, Novo Nordisk) para controlar episódios de hemorragia. Os polipéptido de FVII modificados aqui proporcionados apresentam atividade de coagulação melhorada comparativamente com polipéptidos de FVII não modificados e podem portanto ser administrados, por exemplo, a doses menores, com menor frequência, ao longo de uma duração mais curta para o tratamento e com menos reações adversas para a mesma atividade biológica e eficácia. De um modo geral, administram-se os polipéptidos de FVII modificados como polipéptidos de FVII ativados (FVIIa). 3. Hemorragia por traumatismo e cirurgia
Podem usar-se os polipéptido de FVII como terapia para tratar hemorragia associada a perdas de sangue perioperatórias e perdas de sangue por traumatismo em indivíduos com sistemas de coagulação normais. Por exemplo, podem administrar-se polipéptidos de FVII a um doente para promover coagulação e reduzir perda de sangue associada a cirurgia e adicionalmente, reduzir a necessidade de transfusão de sangue. Num exemplo, podem administrar-se os polipéptidos de FVII a indivíduos submetidos a prostatectomia retropúbica. A prostatectomia retropúbica está muitas vezes associada a perda de sangue importantes e a uma necessidade de transfusão subsequente. Aos indivíduos submetidos a tal cirurgia ou a uma cirurgia semelhante, pode administrar-se um bolus intravenoso de uma quantidade terapêutica de FVII na fase operatória precoce para reduzir perda de sangue perioperatória por melhoria da coagulação no local da cirurgia. A redução da perda de sangue resulta na eliminação da necessidade de efetuar transfusão sanguínea nestes doentes (Friederich et al. (2003) Lancet 361:201-205). Podem administrar-se os polipéptidos de FVII a doentes com coagulação normal submetidos a outros tipos de cirurgia para efetuar hemóstase rápida e evitar perda de sangue. Os exemplos não limitativos de procedimentos cirúrgicos nos quais o FVII, administrado tipicamente na forma ativada (i.e. FVIIa), pode ser usado como uma terapia para reduzir hemorragia perioperatória incluem, cirurgia da válvula cardíaca (Al Douri et al. (2000) Blood Coag Fibrinol 11:S121-S127), substituição da válvula aórtica (Kastrup et al. (2002) Ann Thorac Surg 74:910-912), resseção de hemangiopericitoma recorrente (Gerlach et al. (2002) J Neurosurg 96:946-948), cirurgia de cancro (Sajdak et al. (2002) Eur J Gynaecol Oncol 23:325-326) e cirurgia de úlceras do duodeno (Vlot et al. (2000) Am J Med 108:421-423), não se lhes limitando. O tratamento com FVII pode promover hemóstase no local da cirurgia e reduz ou evita perda de sangue, reduzindo ou eliminando assim a necessidade de transfusão. Os polipéptidos de FVII modificados aqui proporcionados são concebidos para apresentar atividade de coagulação melhorada comparativamente a polipéptidos de FVII não modificados e podem portanto ser administrados, por exemplo, a doses menores, com menor frequência e com menos reações adversas. De um modo geral, administram-se os polipéptidos de FVII modificados como polipéptidos de FVII ativados (FVIIa).
Podem também usar-se os polipéptidos de fator VII para promover coagulação e evitar perda de sangue em indivíduos com lesões traumáticas. O traumatismo define-se como uma lesão a tecido vivo por um agente extrínseco e é a quarta causa de morte nos Estados Unidos. O traumatismo classifica-se como traumatismo de contusão (resultando em compressão interna, danos de órgãos e hemorragia interna) ou traumatismo com penetração (em consequência da penetração de um agente no corpo que destrói tecido, vasos e órgãos, resultando em hemorragia externa). O traumatismo pode ser causado por vários eventos incluindo acidentes de viação (que causam traumatismo de contusão e/ou com penetração), feridas com armas de fogo (que causam traumatismo com penetração), feridas de esfaqueamento (que causam traumatismo com penetração), acidentes com máquinas (que causam traumatismo com penetração e/ou de contusão) e quedas de alturas significativas (que causam traumatismo com penetração e/ou de contusão), não se lhes limitando. A hemorragia descontrolada em resultado de traumatismo é responsável pela maioria da mortalidade associada. A coagulopatia difusa é uma complicação relativamente comum associada aos doentes com traumatismo, que ocorre em 25-36% dos indivíduos. A coagulopatia pode desenvolver-se logo a seguir à lesão, em resultado de uma variedade de fatores tais como diluição e consumo de fatores de coagulação e plaquetas, fibrinólise, acidose e hipotermia. A gestão convencional envolve terapia de substituição por transfusão com plasma congelado fresco (FFP), plaquetas, eritrócitos e/ou crioprecipitado, corrigindo a acidose e tratando a hipotermia. Estas etapas são muitas vezes insuficientes para parar a hemorragia e evitar a morte. 0 tratamento por administração de quantidades terapêuticas de FVII pode promover a coagulação e reduzir a perda de sangue em doentes de traumatismo. Por exemplo, um doente com uma lesão de arma de fogo que apresente grandes quantidades de sangue, além da intervenção cirúrgica, deve receber a administração de FVII para controlar hemorragia de coagulopatia (Kenet et al. (1999) Lancet 354:1879) . A terapia coagulante com FVII pode reduzir efetivamente a perda de sangue e a hemorragia em doentes com traumatismo de contusão ou com penetração (Rizoli et al. (2006) Crit Care 10:R178) . Os polipéptidos de FVII modificados aqui proporcionados são concebidos para apresentar atividade de coagulação aumentada comparativamente a polipéptidos de FVII não modificados e podem portanto ser administrados, por exemplo, a doses menores, com menor frequência e com menos reações adversas. De um modo geral, administram-se os polipéptidos de FVII modificados como polipéptidos de FVII ativados (FVIIa). I. Terapias de combinação
Quaisquer dos polipéptidos de FVII modificados aqui descritos podem administrar-se em combinação, antes, intercalados ou após outros agentes terapêuticos ou procedimentos incluindo outros compostos biológicos, compostos de moléculas pequenas e cirurgia, não se lhes limitando. Para qualquer doença ou condição, incluindo todas as anteriormente exemplificadas para as quais se indica ou se usou FVII (incluindo FVIIa e rFVIIa) e para as quais estão disponíveis outros agentes e tratamentos, pode usar-se FVII em combinação com estes. Portanto, os polipéptidos de FVII modificados aqui proporcionados podem ser usados de igual modo. Dependendo da doença ou condição a tratar, os exemplos de combinações incluem combinação com outros fatores de coagulação purificados de plasma ou recombinantes, pró-coagulantes tais como vitamina K, derivados de vitamina K e inibidores de proteína C, plasma, plaquetas, eritrócitos e corticosteróides, não se lhes limitando. J. Artigos de fabrico e kits
As composições farmacêuticas de polipéptidos de FVII modificados ou ácidos nucleicos que codificam polipéptidos de FVII modificados ou um derivado ou uma sua parte biologicamente ativa, podem empacotar-se como artigos de fabrico contendo material de embalagem, uma composição farmacêutica que é eficaz para tratar uma doença ou distúrbio hemostáticos e um etiqueta que indica que o polipéptido de FVII modificado ou molécula de ácido nucleico deve ser usado para tratar doenças ou distúrbios hemostáticos.
Os artigos de fabrico aqui descritos contêm materiais de embalagem. Os materiais de embalagem para uso no empacotamento de produtos farmacêuticos são bem conhecidos dos peritos na especialidade. Consultar, por exemplo, patentes U.S. n2 5 323 907, 5 052 558 e 5 033 352. Os exemplos de materiais de embalagem farmacêuticos incluem, pacotes de blister, frascos, tubos, inaladores, bombas, sacos, garrafinhas, recipientes, seringas, frascos, não se lhes limitando e qualquer material de embalagem adequado para a formulação selecionada e modo de administração e tratamento pretendidos. Abrange-se uma vasta gama de formulações dos compostos e composições aqui proporcionados assim como uma variedade de tratamentos para qualquer doença ou distúrbio hemostático.
Os polipéptidos de FVII modificados e moléculas de ácido nucleico podem também proporcionar-se como kits. Os kits podem incluir uma composição farmacêutica aqui descrita e um item para administração. Por exemplo pode fornecer-se FVII modificado com um dispositivo para administração, tal como uma seringa, um inalador, um copo de dosagem, um conta-gotas ou um aplicador. O kit pode incluir opcionalmente instruções para aplicação incluindo dosagens, regimes de dosagem e instruções para modos de administração. Os kits também podem incluir uma composição farmacêutica aqui descrita e um item para diagnóstico. Por exemplo, tais kits podem incluir um item para medir a concentração, quantidade ou atividade de FVII ou um sistema regulado por FVII de um indivíduo.
Incluem-se os seguintes exemplos apenas com propósitos ilustrativos e não se pretende que limitem o âmbito da invenção. K. Exemplos
Exemplo 1
Clonagem e expressão de FVII
A. Clonagem de FVII
Clonaram-se os nucleótidos que codificam o polipéptido precursor da isoforma de FVII humano com 466 aminoácidos (P08709; apresentado em SEQ ID N0:1) para o vetor de expressão de mamífero, pCMV Script (Stratagene; SEQ ID NO: 99), que contém um promotor de citomegalovírus (CMV). Sucintamente, usaram-se os oligonucleótidos CBO-125 (SEQ ID NO:100) e CBO-126 (SEQ ID NO:101) como iniciadores direto e inverso, respetivamente, para amplificar a sequência de FVII por PCR usando ADNc de FVII humano (Invitrogen) como molde. O iniciador CBO-125 continha um local de restrição BamHI (a negrito), uma sequência Kozak (sublinhado duplo), seguido de 18 nucleótidos com homologia com o terminal 5' da sequência de ADNc de FVII (sublinhado), incluindo o codão de iniciação ATG. O iniciador CBO-126 continha um local de restrição EcoRI (a negrito), um codão de paragem (sublinhado duplo) e 21 nucleótidos com homologia com o terminal 3' da sequência de ADNc de FVII (sublinhado). CBO-125 iniciador direto 5' gcatcatgacgtgacggatccgccaccatggtctcccaggccctc 3' CBO-126 iniciador inverso 5' gatcgtacgatacgtgaattcctagggaaatggggctcgcaggag 3'
Usaram-se a reação de PCR padrão e as condições de ciclos térmicos em conjunção com o kit de PCR KoD HiFi (EMD Biosciences), tal como recomendado pelo fabricante. Digeriu-se o produto de PCR com as enzimas de restrição BamH I e EcoR I e ligou-se nos locais de restrição de BamH I e EcoR I do vetor pCMV Script usando técnicas moleculares padrão. Transformou-se então o vetor para Escherichia coli. Cultivaram-se colónias selecionadas e recolheram-se células bacterianas para purificação do plasmídeo usando técnicas de biologia molecular de rotina.
B. Geração de variantes de FVII
Geraram-se variantes de FVII usando o kit de mutagénese dirigida ao local QuikChange II XL (Stratagene) de acordo com as instruções do fabricante, com oligonucleótidos concebidos especificamente que serviram como iniciadores e que incorporaram uma mutação especifica no ADN recém-sintetizado. 0 método QuikChange envolve amplificação linear de molde de ADN pela polimerase de ADN com elevada fidelidade PfuUltra. Estenderam-se durante a ciclização iniciadores complementares que incluem a mutação pretendida, usando como molde o vetor pCMV Script purificado, em cadeia dupla e superenrolado que continha a sequência de ADNc de FVII clonada. A extensão dos iniciadores resultou na incorporação da mutação de interesse nas cadeias recém-sintetizadas e resultou num plasmídeo mutado com quebras em ziguezague. Após amplificação, tratou-se o ácido nucleico com Dpn I, que digere as cadeias parentais metiladas pela dam metilase do vetor pCMV Script derivado de E. coli. Tal resultou na "seleção" dos plasmídeos mutados recém-sintetizados, que não foram metilados. Transformou-se o vetor de ADN contendo uma ou mais das mutações pretendidas para células ultracompetentes de E. coli XLIO-Gold, nas quais uma ligase bacteriana reparou as quebras e permitiu que ocorresse replicação normal. A tabela 13 seguidamente apresenta as variantes de FVII que foram geradas. Em algumas situações, geraram-se variantes de FVII nas quais se inseriu uma sequência de ligação de integrina nb 3 de plaquetas em várias regiões do polipéptido de FVII. Inseriu-se uma de três sequências diferentes de ligação de integrina nb 3: SFGRGDIRNV (SEQ ID NO: 110); CSFGRGDIRNVC (SEQ ID NO: 111); ou GGGSCSFGRGDIRNVC (SEQ ID NO: 112). Inseriram-se as sequências de ligação de integrina nb 3 no terminal C do polipéptido de FVII após o resíduo de aminoácido P406 segundo a numeração de FVII maduro ou inseriram-se por deleção e substituição dos resíduos de aminoácidos de FVII de S103 a Sill, H115 a S126 ou T127 a P134 segundo a numeração de FVII maduro. Geraram-se também outras variantes de FVII nas quais se inseriu uma sequência de ligação de albumina sérica. Estas variantes de FVII continham uma de sete sequências de ligação de albumina sérica diferentes: QRLMEDICLPRWGCLWEDDF (SEQ ID NO: 103), IEDICLPRWGCLWE (SEQ ID NO: 104), DICLPRWGCLWED (SEQ ID NO: 105), IEDICLPRWGCLW (SEQ ID NO: 106), GGGSIEDICLPRWGCLW (SEQ ID NO: 107), DICLPRWGCLWED (SEQ ID NO: 108) ou GGGSDICLPRWGCLWED (SEQ ID NO:109). Inseriram-se as sequência de ligação de albumina sérica no terminal C do polipéptido de FVII após o resíduo de aminoácido P406 segundo a numeração de FVII maduro ou inseriram-se por deleção e substituição dos resíduos de aminoácidos de FVII de S103 a Sill, H115 a S126 ou T128 a P134 segundo a numeração de FVII maduro. As variantes de FVII "Gla Swap FIX" (i.e. um polipéptido de FVII no qual o domínio de Gla endógeno foi substituído pelo domínio de Gla de FIX) contém os resíduos de aminoácidos Y1 para Y45 de SEQ ID NO: 83 no terminal N. Em alguns exemplos, as variantes "Gla Swap FIX" contêm uma ou mais substituições de aminoácidos na parte do domínio de Gla de FIX. As mutações que estão na parte do domínio de Gla de FIX incluem-se em chavetas e referenciam-se usando posições de aminoácidos correspondentes às posições de aminoácidos do polipéptido de FIX de tipo selvagem maduro ou do domínio de Gla de FIX de tipo selvagem apresentado em SEQ ID NO: 83. Por exemplo, {Gla Swap FIX/M19K} denota que o polipéptido de FVII modificado contém um domínio de Gla de FIX heterólogo no qual a metionina na posição 19 do domínio de Gla de FIX apresentado em SEQ ID NO: 83 foi substituída por uma lisina. Na tabela 13 seguinte, apresentam-se os resíduos de aminoácidos nos quais se inseriu a sequência de ligação de integrina nb 3 de plaquetas ou de albumina sérica no polipéptido de FVII, assim como a sequência de aminoácidos da sequência de ligação. Por exemplo, H115S126delinsQRLMEDICLPRWGCLWEDDF indica que os resíduos de aminoácidos H115 até S126 foram deletados e substituídos por uma sequência de ligação de albumina sérica com a sequência de aminoácidos QRLMEDICLPRWGCLWEDDF (SEQ ID NQ:103).
C. Expressão dos polipéptidos de FVII
Para análise de expressão inicial por ELISA e transferência "Western", expressaram-se polipéptidos de FVII em células BHK-21. Para ensaios bioquímicos, tal como os descritos seguidamente, expressaram-se os polipéptidos de FVII em células Freestyle™ 293-F (Invitrogen). 0 polipéptido de fator VII de tipo selvagem (SEQ ID NO: 3) e polipéptidos de FVII variantes foram inicialmente expressos na linha celular de rim de hamster bebé BHK-21 (ATCC CRL 1632). Cultivaram-se células BHK-21 em meio mínimo essencial de Eagle (EMEM, Invitrogen) com soro fetal de vitelo (FCS) a 10% em placas de cultura de 100 mm a 37 °C e CO2 a 5%. Após crescimento até aproximadamente 90% de confluência, transfetaram-se as células com 24 pg de plasmídeo de ADN de FVII usando o kit Lipofectamine 2000 (Invitrogen) segundo as instruções do fabricante. Substituíu-se o meio 6 horas após transfeção com EMEM sem soro contendo vitamina Kl (Sigma) a 1 pg/ml e incubaram-se as células durante 72 horas adicionais. Ensaiou-se a expressão de FVII no meio de cultura celular por ELISA ou transferência "Western".
Para análises subsequentes usando ensaios bioquímicos, expressaram-se polipéptido de fator VII de tipo selvagem (SEQ ID NO:3) e polipéptidos de FVII variantes em células Freestyle™ 293-F (Invitrogen). Cultivaram-se células em meio Freestyle™ 293 (Invitrogen) a 37 °C e CO2 a 8% em balões de Erlenmeyer com tampas ventiladas. Transfetaram-se células usando o protocolo sugerido pelo fabricante. Sucintamente, após crescimento até lxlO6 células/ml, centrifugaram-se as células e trocou-se o meio. Transfetaram-se então as células com 240 pg de ADN plasmídico de FVII para cada 240 ml de células usando 293fectin (Invitrogen). Além disso, adicionou-se 50 μΐ de uma solução-mãe de vitamina Ki (Sigma) a 1 mg/ml em etanol para cada 240 ml de células. Cultivaram-se as células durante 5 dias e seguidamente recolheu-se o sobrenadante da cultura. A expressão de FVII no meio de cultura celular foi ensaiada por ELISA.
Em alguns exemplos, expressaram-se polipéptido de FVII de tipo selvagem e variantes em células CHO-Express (CHOX) (Excellgene). Mantiveram-se as células CHO Express (CHOX) em meio completo de DM202 (SAFC BioSciences) e usaram-se para inocular culturas de inoculo para produção. Cultivaram-se as culturas de inoculo até 5 x 105 células viáveis/mL e usou-se aproximadamente 60 mL para inocular aproximadamente 0,6 L de meio completo de DM202 (a densidade de inoculação é 0,4 x 106 células viáveis/mL) para gerar uma cultura de produção. Cultivou-se esta cultura de produção durante 4 dias até se atingir 8-12 x 106 células viáveis/mL no dia da transfeção. Formou-se um complexo de transfeção usando ADN plasmídico de fator VII (6 mg) e 23,1 mg de polietilenimina (PEI). Diluiu-se então o complexo de transfeção em 0,5 L de meio de transfeção isento de soro Opti-MEM (Invitrogen), que foi adicionado aos 0,6 L de cultura de produção. Após 5 horas de transfeção diluiu-se adicionalmente a cultura com ~1 L de meio ProCH05 (Lonza) suplementado com L-glutamina 8 mM e vitamina Kl a 4 mg/L. Deixou-se a cultura em frascos de agitação de 2,2 L expressar durante 5-7 dias antes da recolha do fator VII em bruto. Recolheram-se então os sobrenadantes de cultura por filtração e purificou-se o FVII.
Efetuou-se expressão de uma das variantes de FVII (Q286R/M298Q) numa linha celular estável. Esta linha foi gerada por Excellgene (Monthey, Vaiais, Suíça) por transfeção de células CHOX. Sucintamente, cultivaram-se células na presença de metotrexato e seguidamente plaquearam-se por diluição limitativa a 1 célula por poço em placas de 96 poços. Determinaram-se por ELISA os clones produtores dos níveis mais elevados de variante de FVII. Um clone (clone 52) foi subclonado adicionalmente por uma segunda diluição limitativa e plaqueado em placas de 96 poços. Cultivaram-se as colónias a 37 °C em meio de DM204A (SAFC BioSciences), suplementado com L-glutamina 8 mM, cisteína 1 mM, vitamina Kl a 1 mg/L.
Verificou-se que vinte e quatro clones apresentavam niveis mais elevados de expressão de Q286R/M298Q, por análise de ELISA, do que o clone 52 original. Estes 24 clones foram expandidos adicionalmente em placas de 6 poços durante 6 dias de cultura, seguido por crescimento em frascos de agitação de 40 mL durante quatro dias. Efetuou-se cada etapa de cultura a 37 °C em meio DM204A, suplementado como anteriormente. Após os quatro dias de crescimento, congelaram-se os clones a 1 x 107 células viáveis/mL. Determinaram-se por ELISA os niveis de Q286R/M298Q produzidos por cada clone. O clone 5F7 foi o maior produtor, gerando tipicamente 25 - 35 mg/L Q286R/M298Q.
1. ELISA
Usou-se um imunoensaio para quantificar a quantidade de FVII e FVIIa humanos numa amostra. Usaram-se anticorpos policlonais contra FVII humano para capturar e detetar a protease na solução. Pode usar-se o imunoensaio para determinar a concentração de proteína do meio condicionado ou de uma solução-mãe purificada ou para determinar a concentração de FVII noutra amostra, por exemplo, uma amostra de plasma humano ou de ratinho. A concentração basal de FVII no sangue humano é de aproximadamente 50 nM e da forma enzimaticamente ativa, FVIIa, é de aproximadamente 1 nM.
Para determinar a quantidade de proteína de FVII ou FVIIa humana em amostras efetuou-se um ELISA em sanduíche. Revestiram-se imunoplacas Maxisorp de 96 poços com fundo plano (Nunc) com avidina (NeutrAvidin, Pierce Biotech.) a 100 μΐ/poço e avidina a 5 ng/μΐ. Cobriram-se as placas e incubaram-se com agitação durante 1 hora à temperatura ambiente seguido por lavagem quatro vezes em PBS com Tween-20 a 0,01% (PBST). Bloquearam-se as placas durante um mínimo de 1 hora à temperatura ambiente com agitação por incubação com albumina de soro bovino (BSA) a 1% (p/v) em PBS adicionada a cada poço a 200 μΐ/poço. Armazenaram-se então as placas bloqueadas a 4 °C até utilização (até 2 semanas).
Antes da utilização, lavaram-se as placas quatro vezes em PBST para remover a BSA e adicionou-se a cada poço 100 μΐ/poço de uma solução de anticorpo anti-fator VII biotinilado (R&D Systems) a 1 ng/μΐ e incubou-se a placa à temperatura ambiente durante 45 minutos com agitação para permitir complexação com a avidina do revestimento. Removeu-se o excesso de anticorpo não ligado por lavagem da placa com PBST (quatro vezes).
Adicionaram-se à placa diluições em série de duas vezes de um padrão de FVII (American Diagnostica; diluído em PBST) na gama de 50 ng/μΐ a 0,8 ng/μΐ, a 100 μΐ/poço. Incluiu-se também um poço contendo PBST sem qualquer FVII como controlo de tampão sozinho. Para ensaiar as amostras purificadas (antes e após ativação, ver exemplo 3) de FVII ou FVIIa, a amostra foi primeiramente diluída 1:25 em PBST e seguidamente efetuaram-se diluições em série de 2 vezes de modo a testar diluições de 25 vezes, 50 vezes, 100 vezes e 200 vezes. Adicionaram-se as amostras diluídas aos poços em duplicado a 100 μΐ/poço. Para ensaiar as amostras de plasma contendo FVII ou FVIIa, diluiu-se a amostra de plasma 1:100 e 1:400 em PBST e adicionou-se aos poços em duplicado a 100 μΐ/poço. Incluiu-se também uma amostra de plasma sem FVII ou FVIIa para determinar os níveis basais. Incubaram-se então as placas durante 30 minutos à temperatura ambiente com agitação para permitir que qualquer FVII ou FVIIa da amostra formasse complexos com o anticorpo anti-FVII.
Após incubação com amostra, lavaram-se as placas 4 vezes com PBST. Diluiu-se um anticorpo secundário, equino anti-FVII humano ou monoclonal murino anti-FVII humano (American Diagnostica), 1:5000 em PBST e adicionou-se a cada poço a um volume de 100 μΐ. Incubaram-se as placas durante 30 minutos à temperatura ambiente com agitação para permitir que o anticorpo adicionado se ligasse aos complexos de FVII ou FVII na placa. Para remover o excesso de anticorpo secundário, lavaram-se as placas com PBST (4 vezes) . Para detetar o anticorpo secundário ligado, adicionou-se a cada poço 100 μΐ de cabra anti-equino conjugado com HRP a uma diluição de 1:5000 em PBST ou 100 μΐ de cabra anti-ratinho conjugado com HRP a uma diluição de 1:20 000 em PBST. Após incubação durante 30 minutos à temperatura ambiente com agitação, lavaram-se as placas quatro vezes com PBST e adicionaram-se 100 μΐ/poço de uma solução contendo uma mistura 1:1 de substrato de TMB e solução de peróxido de hidrogénio (Pierce Biotech.). Agitaram-se as placas durante aproximadamente 1 minuto à temperatura ambiente antes da adição de H2SO4 2 M a 100 μΐ/poço para parar a reação. Mediu-se a densidade ótica a 450 nm usando um leitor de placas Molecular Device M5 e subtraiu-se o valor de ruido de fundo para a placa (medido com PBST sozinho) do valor medido para cada poço. Gerou-se uma curva padrão representando a concentração dos padrões de FVII em função da absorvância. Gerou-se tipicamente uma reta padrão na gama de cerca de 0,2 -50 ng/ml nas condições de ELISA anteriores. Determinou-se então a concentração de cada amostra usando a reta de calibração e multiplicando pelo fator de diluição e relatou-se um valor médio e um desvio padrão. 2. Transferência "Western" A expressão de FVII em meio de cultura celular também foi ensaiada por transferência "Western". Marcaram-se aliquotas contendo a amostra não diluída ou duas diluições em série de 2 vezes em PBS do meio de cultura celular de células transfetadas com FVII (células BHK-21 ou CHOX) como Cone. 1 (não diluído), Cone. 2 (diluição de 2 vezes) e Cone. 3 (diluição de 4 vezes) . Carregaram-se num gel de SDS page as amostras com perto de 10, 25 e 50 nanogramas de rFVII purificado em plasma de controlo (American Diagnostica). A proteína de FVII produzida por células BHK-21 ou CHOX foi detetada por transferência "Western" usando um anticorpo primário anti-FVII policlonal equino (American Diagnostica; usado à concentração sugerida pelo fabricante) e um anticorpo secundário IgG anti-equino conjugado com HRP (uma diluição 1:2000 de solução 1 mg/ml de Zymed Laboratories). Em alguns exemplos, detetou-se FVII por transferência "Western" usando anticorpo primário de coelho anti-fator Vila humano (Hematologic Technologies) e um anticorpo secundário IgG anti-coelho conjugado com HRP (Invitrogen). Efetuou-se comparação dos níveis de expressão com o rFVII purificado em plasma de controlo. Os resultados mostram que estavam presentes concentrações na gama entre cerca de 20 ng até mais de 50 ng de FVII nas aliquotas de cultura celular.
Exemplo 2
Purificação e ativação de polipéptidos de FVII
Purificaram-se polipéptidos de FVII usando uma coluna de Q Sepharose Fast Flow ou CaptoQ (GE Healthcare) , à qual adsorverão polipéptidos de FVII com domínios funcionais de Gla, seguido de uma etapa de eluição com cálcio. Tipicamente, diluiu-se 2 vezes o sobrenadante de cultura do produto de transfeção com uma solução contendo Tris 20 mM pH 8,0 e Tween 20 a 0,01% e seguidamente adicionou-se EDTA 500 mM pH 8,0 à amostra diluída para uma concentração final de 1,5 mM. Filtraram-se as amostras antes de carregar na coluna de Q Sepharose Fast Flow ou CaptoQ, que tinha sido pré-equilibrada primeiro com tampão B (Tris 20 mM pH 8,0, NaCl 1 M, Tween 20 a 0,01%) e seguidamente tampão A (Tris 20 mM pH 8,0, NaCl 0,15 M, Tween 20 a 0,01%) . Após carga, lavou-se a coluna com tampão A até que a absorvância do eluído a 280 nm atingisse um valor de linha de base. Substituiu-se tampão A por tampão C (Tris 20 mM pH 8,0, NaCl 0,15 M, Tween 20 a 0,01%, CaCÍ2 5 mM) e efetuou-se uma lavagem com bomba para substituir completamente o tampão nas tubagens. Após finalização da lavagem com bomba, aplicou-se tampão C à coluna a 8 ml/min para eluir os polipéptidos de FVII, que foram recolhidos em frações. Após eluição, lavou-se a coluna com tampão B enquanto se manteve a recolha de frações, até que o pigmento cor-de-rosa (proveniente do meio de cultura) fosse lavado da coluna. Lavou-se então a coluna com tampão A para a reequilibrar para reutilização.
Purificaram-se adicionalmente as frações eluidas usando uma coluna Mono Q ou QHiTrap (GE Healthcare), que foi inicialmente pré-equilibrada com tampão B e seguidamente com tampão A. As frações recolhidas com tampão C anteriores, que continham FVII, foram recolhidas conjuntamente e diluídas 2 vezes com tampão A, antes da adição de EDTA, pH 8,0 para uma concentração final de 40 mM. Nesta altura, retiraram-se opcionalmente pequenas alíquotas (e.g. 100 μΐ) para análise,
tal como por ELISA. Carregou-se então a amostra combinada numa coluna de Mono Q (ou QHiTrap) e seguidamente lavou-se com tampão A. Para eluir os polipéptidos de FVII ligados, correu-se através da coluna um gradiente desde 0% até 30% de tampão B e recolheram-se frações. Lavou-se então a coluna com tampão B seguido de tampão A para a reequilibrar para reutilização.
Em alguns exemplos, após a primeira coluna de Capto Q, efetuou-se permuta de tampão em algumas frações recolhidas conjuntamente por diafiltração para tampão D (MES 20 mM, pH 6,0, CaC12 10 mM, NaCl 0,1 M, Tween 20 a 0,01%) e seguidamente carregou-se numa coluna de SP-HP que tinha sido pré-equilibrada com tampão D. Após lavagem com tampão D, aplicou-se à coluna um gradiente desde NaCl 0,1 M a NaCl 1,0 Me recolheram-se frações. Ajustaram-se então frações contendo FVII para pH 8,0 e diluíram-se 2 vezes em tampão E (Tris 20 mM, pH 8,0, CaC12 10 mM, Tween 20 a 0,01%) e aplicou-se a uma coluna de Q H-HP que tinha sido pré-equilibrada com tampão E. Lavou-se então esta coluna com tampão E e eluiu-se o FVII com um gradiente de NaCl 0 - 1 M em tampão E.
Os polipéptidos de FVII purificados foram ativados para FVIIa usando fator Xa biotinilado do kit de clivagem e remoção de fator Xa por protease de restrição (Roche). Tipicamente, recolheram-se conjuntamente 7 frações da purificação com Mono Q num tubo cónico de 15 ml e adicionaram-se 388 μΐ de CaCl2 500 mM, 38,9 μΐ de BSA a 10% em água destilada e 3,2 pg de fator Xa biotinilado. Após incubação durante 14-16 horas a 37 °C, adicionou-se 250 μΐ de avidina imobilizada (Pierce) e agitou-se a amostra a 4 °C durante 30 minutos. Filtrou-se então a solução resultante através de uma coluna Econo-pak (Bio-Rad) e misturou-se o filtrado com outros 250 μΐ de avidina imobilizada durante 30 minutos adicionais. Filtrou-se novamente a solução e concentrou-se o filtrado até aproximadamente 300-500 μΐ usando um filtro de centrifugação Amicon Ultra-4 lOkDa (Millipore). Analisou-se então a concentração de FVIIa por ELISA (tal como descrito no exemplo l.C.l) e monitorizou-se o nível de ativação de fator VII por transferência "Western". Efetuou-se a transferência "Western" essencialmente tal como descrito no exemplo 1.C.2, mas usando anticorpo de coelho anti-fator Vila humano (Haematologic Technologies, Inc.) a 1:2000 durante 1 h como anticorpo primário, seguido por IgG (H+L) anti-coelho HRP-cabra (Invitrogen) a 1:5000 durante 30 minutos.
Exemplo 3
Determinação da concentração em solução de protease cataliticamente viável
Determinou-se a concentração de FVIIa cataliticamente viável numa solução-mãe através da titulação de um complexo de fator Vila e fator solúvel de tecido (sTF) com um inibidor peptidico irreversível de FVIIa, Phe-Phe-Arg-clorometilcetona (FFR-CMK). 0 inibidor liga-se a FVIIa mas não a FVII. A incubação prolongada a uma concentração elevada de FVIIa (50 nM) assegura a titulação completa da protease. Mediu-se a atividade residual do complexo de FVIIa/TF após incubação com FFR-CMK para determinar a concentração de FVIIa cataliticamente viável na solução-mãe original.
Pré-tratou-se uma placa de ensaio de 96 poços com meia área transparente (Nunc) por adição de 150 μΐ/poço de 1 χ tampão de placa (Tris 100 mM pH 8,4, NaCl 100 mM, BSA a 0,01%, Tween-20 a 0,01%) a cada poço e incubação da placa a 37 °C durante um minimo de 1 hora. Removeu-se completamente o tampão por secagem com um toalhete de papel e centrifugação da placa em posição invertida para remover qualquer tampão remanescente e secou-se a placa ao ar durante 1 hora e armazenou-se coberta e à temperatura ambiente.
Para preparar a mistura reacional de FVIIa/sTF/FFR-CMK, diluiu-se primeiramente uma solução-mãe de FVIIa (American Diagnostica; diluída a 5 μΜ em glicerol a 50% (v/v) e armazenada no frio em alíquotas a -20 °C) ou de variante de FVIIa até 500 nM em 1 χ tampão de ensaio direto (Tris 100 mM pH 8,4, NaCl 100 mM, CaCÍ2 5 mM, BSA a 0,01%) . Preparou-se então a mistura de FVIIa/sTF por mistura de 90 μΐ de água destilada com 36 μΐ de 5 χ tampão de ensaio direto, 18 μΐ de FVIIa 500 nM e 18 μΐ de sTF 5 pm (fator III de coagulação humano recombinante/fator tecidular solúvel; R&D Systems; a solução-mãe usada foi 19,6 μΜ em glicerol a 50% e diluiu-se até 5 μΜ in 1 χ tampão de ensaio direto e armazenou-se até duas semanas a 4 °C). Deixaram-se então os componentes formar um complexo durante 5 minutos à temperatura ambiente.
Diluíu-se uma solução-mãe de FFR-CMK (BaChem) 10 mM em DMSO (armazenada a -20 °C) em água até 3,5 μΜ. Usando uma linha de um placa de armazenamento opaca de polipropileno (Costar), fizeram-se diluições em série de duas vezes em água do FFR-CMK ao longo de 11 poços de uma placa opaca de 96 poços, o último poço da linha contendo apenas água como controlo. Esta é a solução da série de 10* inibidor de FFR-CMK. Adicionou-se a cada poço de uma linha de uma placa de ensaio de 96 poços com meia área transparente pré-tratada, 10,8 μΐ da mistura de FVIIa/sTF, seguido de 1,2 μΐ da série de 10x inibidor de FFR-CMK. Misturaram-se as soluções completamente e centrifugou-se a placa a <3000 rpm durante 5 minutos para remover pingos nos poços. Cobriu-se a placa e incubou-se durante 8 horas a 37 °C.
Para ensaiar a atividade residual do complexo de FVIIa/TF, preparou-se inicialmente uma mistura do substrato Spectrozyme FVIIa (American Diagnostica, n2 217L; solução-mãe reconstituída de um frasquinho com 50 pmole em 5 mL de água destilada para 10 mM e armazenado a 4 °C) e 5X tampão direto (Tris 500 mM pH 8,4, NaCl 500 mM, CaCl2 25 mM e BSA a 0,05%) por mistura de 360 μΐ de 5 χ tampão de ensaio direto com 180 μΐ de uma solução de Spectrozyme FVIIa 10 mM e 1080 μΐ de água. A cada poço da placa de ensaio, adicionaram-se 108 μΐ da solução de substrato preparada. Misturaram-se então os poços e incubou-se a placa a 37 °C. Mediu-se o aumento de absorvância a 405 nm em cada 30 segundos durante uma hora a 37 °C num leitor de placas Spectramax Gemini M5 de Molecular Devices.
Usando o utilitário SoftMax Pro (Molecular Devices), mediram-se as taxas de variação de absorvância e determinou-se a atividade fraccional de proteases incubadas com um inibidor por divisão da taxa de variação medida pela taxa de variação da protease não inibida. Representou-se graficamente a atividade fraccional em função da concentração de FFR-CMK e rejeitaram-se pontos que eram >90% ou <10% da atividade não inibida. Traçou-se então uma linha através dos pontos remanescentes para determinar a interseção no eixo dos xx que representa a concentração de protease ativa na solução. Mediram-se os valores de ensaios múltiplos e determinou-se a média e o desvio padrão.
Exemplo 4
Determinação da atividade catalítica de FVIIa para o seu
substrato, fator X
Avaliou-se indiretamente a atividade catalítica das variantes de FVIIa para o seu substrato, fator X (FX), num ensaio fluorogénico por ensaio da atividade de FXa gerado após ativação por FVIIa sobre o substrato sintético Spectrafluor FXa.
A. Atividade catalítica dependente de TF de FVIIa de tipo selvagem para o seu substrato, fator X
Avaliou-se a atividade catalítica dependente de TF de FVIIa de tipo selvagem num ensaio fluorogénico no qual se incluiu uma forma lipidada do fator tecidular (TF) purificado para proporcionar a atividade ótima de FVIIa. Determinou-se a atividade enzimática de FXa por Spectrafluor FXa (CH3SO2-D-CHA-Gly-Arg-AMC.AcOH) por medição do aumento de absorvância do fluoróforo livre gerado, AMC (7-amino-4-metilcoumarina) , em função do tempo.
Sucintamente, diluiu-se inicialmente o polipéptido de FVIIa de tipo selvagem para 0,5 μΜ em lx tampão de ensaio (Tris 100 mM pH 8,4, NaCl 100 mM, CaCÍ2 5 mM e BSA a 0,01%) e seguidamente diluiu-se para 0,1 nM em tampão de ensaio. Reconstituiu-se TF completo lipidado (Innovin; Dade Behring) em 20 mL de água para proporcionar uma solução 3 nM e diluiu-se para 0,2 nM em lx tampão de ensaio. Misturaram-se quatrocentos μΐ de FVIIa 0,1 nM com 400 μΐ de TF 0,2 nM e incubou-se à temperatura ambiente durante 5 minutos. Diluiu-se a solução adicionalmente por duas diluições de 2 vezes em lx tampão de ensaio contendo TF 0,2 nM para obter um total de três diluições de FVIIa de FVIIa 0,05 nM, 0,025 nM ou 0,0125 nM contendo cada TF 0,2 nM (soluções de FVIIa/TF).
Reconstituiu-se o substrato, fator X (FX; American Diagnostica; 80 yg) em 135,6 μΐ de água destilada para proporcionar uma solução-mãe 10 μΜ e armazenou-se em alíquotas a -80 °C. Não se congelaram nem se descongelaram-se as alíquotas mais que uma vez. Diluiu-se a solução-mãe de FX para 800 nM em tampão de ensaio direto e diluiu-se em série 2 vezes para obter soluções de FX na gama de 800 nM a 50 nM.
Reconstituiu-se Spectrofluor Xa (American Diagnostica; 10 pmoles) em água destilada para 5 mM e armazenou-se a 4 °C. Adicionou-se a cada poço de uma placa de ensaio de 96 poços com meia área negra (Costar), 5 μΐ de Spectrofluor Xa (American Diagnostica). Seguidamente, adicionou-se a cada poço 25 μΐ da solução de FX. Incluiu-se também no ensaio, na última fila dos poços da placa, um controlo negativo ao qual não se adicionou qualquer FX. Em duplicado, adicionaram-se as três concentrações das soluções de TF/FVIIa a 20 μΐ aos poços das colunas respetivas da placa de modo a que cada diluição de TF/FVIIa fosse ensaiada relativamente a cada diluição de FX, com um conjunto de colunas sem adição de qualquer TF/FVIIa (i.e. FX sozinho). Misturaram-se as placas por agitação. Mediu-se a fluorescência ao longo do tempo com um espetrofluorimetro programado para ler de 30 em 30 segundos durante 1 hora a 37 °C (Ex: 380 nm, EM: 450 nm, corte: 435 nm) e reportou-se o tempo em unidades de tempo ao quadrado. Após o ensaio, gerou-se uma reta de calibração de fluorescência de AMC no mesmo leitor de placas para converter as unidades de fluorescência para uM de substrato libertado no ensaio. Diluiu-se AMC 1 mM em DMSO (Invitrogen) para 0,02 mM em lx tampão de ensaio. Efetuaram-se seis diluições em série de duas vezes de AMC na gama de 20 nM a 0, 625 nM em lx tampão de ensaio. Mediu-se a fluorescência de AMC usando as mesmas condições de ensaio descritas anteriormente e representou-se graficamente a fluorescência em relação à concentração de AMC. Calculou-se o declive da reta que serviu como fator de conversão de RFU para μΜ em cálculos subsequentes.
Calcularam-se as constantes cinética de ativação de FX por FVIIa efetuando análise de regressão linear do inverso da concentração de substrato relativamente ao inverso da velocidade de clivagem de substrato (em unidades de segundo2) , com cálculo de Vmax, Fviia como o inverso da interseção no eixo dos yy, Km, fviih como o declive na interseção no eixo dos yy e Vmax/Km,Fvna como o inverso do declive. Derivou-se então o valor de kcat usando a equação; kcat/Km,FVIIa — Vmax / Km, FVI Ia X 1/ (0,5 X k2 X [FVIIa ΘΙΪ1 |1M] X (fator de conversão de RFU/μΜ)) em que k2 = ( [S] x kcat, FXa)/(Km,Fxa + [S] ) , em que kcat, fx3 e
Km, Fxa são as constantes para clivagem de FXa de Spectrofluor Xa determinado experimentalmente usando como padrões de FXa kcat, FXa = 117 S^1 e Km, Fxa = 164 μΜ .
Usando as condições de ensaio anteriores, determinou-se a constante cinética k2 como sendo 88,1 s~7.
Determinaram-se Km e kcat para cada um das variantes de FVIIa para avaliar a atividade catalítica, kCat/Km (M_1s_1) de cada uma para o seu substrato, FX (tabela 14) . Avaliou-se a protease FVIIa de tipo selvagem e verificou-se que apresentava uma atividade de 1,8 χ 107 M_1s_1. A ativação do fator X pelo fator Vila, tal como medida por Krishnaswamy, et al. (J. Biol.
Chem. (1998) 273:8 4378-86) é 2,9 X 107 M^s-1.
B. Análise da atividade catalítica de variantes de FVIIa para o substrato, fator X
Avaliou-se indiretamente a atividade catalítica das variantes de FVIIa para o substrato, fator X (FX) , em dois tipos de ensaios cromogénicos por ensaio da atividade de FXa, gerado após ativação por FVIIa, no substrato sintético Spectrafluor FXa. Efetuaram-se os dois ensaios na presença ou na ausência de fator tecidular lipidado para avaliar a atividade tanto dependente de TF como independente de TF. Expressaram-se, purificaram-se e ativaram-se para FVIIa as variantes de FVII tal como descrito anteriormente nos exemplos 1 e 2. Apesar da maioria das variantes de FVII serem expressas apenas em células Freestyle™293-F, algumas foram também expressas em células BHK-21.
Ensaio indireto dependente de fator tecidular lipidado
Avaliou-se a atividade catalítica das variantes de FVIIa na presença de fator tecidular usando o ensaio descrito na secção A do exemplo 4, anteriormente, com pequenas modificações. Uma de tais modificações foi a utilização de uma protease substrato de fator X que foi tratada com ERG-CMK e FFR-CMK para reduzir a atividade basal (Molecular Innovations). Efetuaram-se dois tipos de análise de dados usando dois ensaios independentes; um ensaio de gama linear e um ensaio de análise de gama hiperbólica. 0 ensaio de gama linear usou uma gama de concentrações de fator X entre 0 e 150 nM para assegurar medição precisa das constantes cinéticas na gama linear da curva de dose. Contrariamente, o ensaio de análise de gama hiperbólica usou uma gama de concentrações de fator X entre 0 e 1,44 μΜ para assegurar medição precisa das constantes cinéticas com uma curva de dose de saturação (hiperbólica).
Efetuou-se a análise de dados de gama linear do ensaio indireto de fator tecidular lipidado essencialmente tal como descrito na secção A do exemplo 4, anteriormente, com as seguintes modificações. Prepararam-se as soluções de variante de FVIIa/TF como soluções de FVIIa 0,1 nM/TF 0,4 nM e incubaram-se durante 30 minutos antes de diluir duas vezes em TF 0,4 nM até uma solução contendo FVIIa 1,5625 pM/TF 0,4 nM. Misturaram-se vinte e cinco pL da solução FVIIa/TF com 25 pL de uma solução de substrato que continha Spectrofluor FXa (American Diagnostica) 1,0 mM e fator X (Molecular Innovations) a uma concentração de 300 nM, 200 nM, 133,3 nM, 88,9 nM, 59,3, 39,5 nM, 36,3 nM ou 0 nM. Assim, as concentrações finais para o ensaio foram FVIIa 0,8 pM, TF 0,2 nM, Spectrofluor FXa 0,5 mM e fator X (Molecular Innovations) 150 nM, 100 nM, 66,7 nM, 44,4 nM, 29,6 nM, 19,8 nM, 13,2 nM ou 0 nM a 50 pL/poço. A reta padrão de AMC, que serviu como fator de conversão de RFU para μΜ nos cálculos subsequentes, foi expandida para incluir uma gama de dose de AMC abrangendo desde 0 μΜ a 100 μΜ.
Efetuou-se a análise de dados de gama hiperbólica do ensaio indireto de fator tecidular lipidado essencialmente tal como descrito na secção A do exemplo 4, anteriormente, com as seguintes modificações. Prepararam-se as soluções de variante FVIIa/TF como soluções FVIIa 0,1 nM/TF 0,4 nM e incubaram-se durante 30 minutos antes de diluir duas vezes em TF 0,4 nM até FVIIa 1,5625 pM (ou 0,78 pM para as proteases que se espera que apresentem atividade elevada)/TF 0,4 nM. Misturaram-se vinte e cinco pL da solução FVIIa/TF com 25 pL de uma solução de substrato que continha Spectrofluor FXa (American
Diagnostica) 1,0 mM e fator X (Molecular Innovations) a uma concentração de 1440 nM, 720 nM, 360 nM, 180 nM, 90 nM, 45 nM, 22,5 nM ou 0 nM. Assim, as concentrações finais para o ensaio foram FVIIa 0,8 (ou 0,39) pM, TF 0,2 nM, Spectrofluor FXa 0,5 mM e fator X (Molecular Innovations) 7 nM, 720 nM, 360 nM, 180 nM, 90 nM, 45 nM, 22,5 nM, 11,25 nM ou 0 nM em 50 pL/poço. Calcularam-se os parâmetros kcat e Km usando a equação hiperbólica de Michaelis Menton na forma (Vmax/ (l+(Km/x))) . A reta padrão de AMC, que serviu como fator de conversão de RFU para μΜ nos cálculos subsequentes, foi expandida para incluir uma gama de doses de AMC abrangendo desde 0 μΜ a 100 μΜ.
Para determinar as constantes cinéticas de velocidade para a ativação de FX por FVIIa ou variantes de FVIIa, exportaram-se os dados em bruto com o utilitário SoftMax Pro (Molecular Devices) como ficheiros .XML. Efetuaram-se adicionalmente análises lineares e não lineares com XLfit4, um pacote de utilitários para ajuste automático de curvas e análise estatística no ambiente da folha de cálculo Microsoft Excel (IDBS Software).
Para dados recolhidos usando o ensaio de gama linear, calcularam-se as constantes cinéticas kcat/Km (M_1s_1) diretamente a partir do declive das análises de regressão linear da concentração de FX relativamente à velocidade de clivagem do substrato fluorogénico (em μΜ/s2) em que kcat/Km = declive/[FVIIa]x0,5xk2. Determinou-se o fator de correção k2 como sendo 45 usando o método descrito na secção A do exemplo 4 e as constantes cinéticas para clivagem de FXa de FXa Spectrofluor de kcat,Fxa = 56 s~2 e Km,Fxa = 126 nM, determinadas experimentalmente com FX Ativado (FXa) cujo local ativo foi previamente titulado com AT-III/heparina. A exclusão dos pontos experimentais que resultaram em valores de R2 inferiores a 0,98 assegurou a linearidade dos conjuntos de dados usando na rotina de ajuste.
Calcularam-se as análises dos dados recolhidos usando o ensaio de gama hiperbólica a partir de análises de regressão não linear da concentração de FX relativamente à velocidade de clivagem do substrato fluorogénico (em μΜ/s2) . Calcularam-se os parâmetros individuais kcat e Km como parâmetros do ajuste usando a equação hiperbólica de Michaelis Menton sob a forma (Vmax (1+(Km/x) ) ) em que kcat = Vmax / [ F VII a ] x 0,5 x k2. Calculou-se a constante cinética, kCat/KM a partir dos parâmetros ajustados kcat e Km individuais.
Ensaio indireto independente de fator tecidular
Avaliou-se a atividade catalítica das variantes de FVIIa na presença de fator tecidular num ensaio indireto semelhante ao descrito anteriormente exceto que não se incluiu fator tecidular no ensaio. Assim, efetuou-se o ensaio para avaliar a atividade independente de TF essencialmente tal como descrito anteriormente, com as seguinte modificações. Diluiram-se as soluções de variantes de FVIIa até 50 nM (ou 5 nM para variantes que se espera apresentarem uma elevada atividade independente de TF) . Misturou-se vinte e cinco pL de cada solução de FVIIa com 25 pL de uma solução de substrato que continha Spectrofluor FXa (American Diagnostica) 1,0 mM e fator X (Molecular Innovations) a uma concentração de 1050 nM, 700 nM, 466,7 nM, 311,1 nM, 207,4 nM, 138,3 nM, 92,2 nM ou 0 nM. Assim, as concentrações finais para o ensaio foram FVIIa 25 nM (ou 2,5 nM para variantes de elevada atividade), Spectrofluor FXa 0,5 mM e fator X (Molecular Innovations) a 525 nM, 350 nM, 233,3 nM, 155,6 nM, 103,7 nM, 69,1 nM, 46,1 nM ou 0 nM em 50 pL/poço. Efetuaram-se as análises de dados tal como descrito para o ensaio de gama linear, tal como anteriormente e sem modificações. A tabela 14 apresenta a atividade catalítica de variantes de FVIIa tal como medida por um ensaio indireto dependente de TF usando polipéptidos de FVIIa expressos a partir de células 293-F e células BHK-21 e a atividade catalítica tal como medida por um ensaio indireto independente de TF usando polipéptidos de FVIIa expressos a partir de células 293-F e células BHK-21. Apresentam-se os resultados como as constantes cinéticas para atividade catalítica, kcat/Km (M_1s_1) e também expressos como uma percentagem da atividade de FVIIa de tipo selvagem, em que a atividade é atividade catalítica, kCat/Km (M_1s_1) de cada variante de FVIIa para o seu substrato, FX. Indica-se também o uso da análise de dados de gama linear ou hiperbólica para os valores apresentados nas tabelas. Não se ensaiaram todas as variantes de FVIIa em cada ensaio. Várias variantes de FVIIa apresentaram atividade catalítica aumentada comparativamente à molécula de FVIIa de tipo selvagem. Por exemplo, o polipéptido de FVIIa contendo apenas a mutação Q286R (Q286R-FVIIa), tem uma atividade catalítica que é de cerca de 2 a 3 vezes a de FVIIa de tipo selvagem e o polipéptido FVIIa contendo as mutações Q286R e M298Q (Q286R/M298Q-FVIIa), tem uma atividade catalítica superior a 3 vezes a de FVIIa de tipo selvagem.
Num conjunto adicional de experiências, analisou-se a atividade catalítica de polipéptidos de FVIIa produzidos em células BHK-21 usando os ensaios indiretos independentes de TF e dependentes de TF descritos anteriormente com pequenas modificações. Produziram-se vários variantes em células CHOX além das células BHK-21 ou exclusivamente em células CHOX. Ensaiaram-se as variantes em condições idênticas independentemente da linha celular utilizada. Para o ensaio catalítico dependente de TF (usando regressão linear), titularam-se inicialmente os locais ativos dos polipéptidos de FVIIa com 4-metilumbeliferil-p' -guanidinobenzoato (MUGB) para determinar a concentração de FVIIa, tal como descrito no exemplo 12, seguidamente. Para maximizar o número de pontos experimentais na gama linear, estabeleceu-se a concentração máxima de FX no ensaio a 25 nM (i.e. 0-25 nM em vez de 0-150 nM) . Ativou-se o FX usado no ensaio (i.e. FXa) e titulou-se com fluoresceína-mono-p' -guanidinobenzoato (FMGB), tal como descrito no exemplo 15, seguidamente. Determinaram-se as constantes cinéticas para clivagem do substrato Spectrafluor FXa para este FXa com local ativo titulado e demonstrou-se que eram: Km de 190,2 μΜ e um kcat de 340 s_1. A principal diferença foi no kcat e principalmente devida às determinações melhoradas do local ativo. Estes parâmetros proporcionaram um valor corrigido de 246,4 para o fator de correção de k2 que é usado na análise linear para determinar a atividade catalítica dos polipéptidos de FVIIa na presença de TF.
Para o ensaio catalítico independente de TF, titulou-se primeiro os locais ativos dos polipéptidos de FVIIa com 4-metilumbeliferil-p' -guanidinobenzoato (MUGB) para determinar a concentração de FVIIa, tal como descrito no exemplo 12, seguidamente. Ativou-se o FX usado no ensaio (i.e. FXa) e titulou-se com fluoresceína-mono-p' -guanidinobenzoato (FMGB), tal como descrito no exemplo 15. Determinaram-se as constantes cinéticas para clivagem do substrato Spectrafluor FXa para este FXa com local ativo titulado e demonstrou-se que eram: Km de 190,2 μΜ e um kcat de 340 s_1. Estes parâmetros proporcionaram um valor corrigido de 246,4 para o fator de correção de k2 que é usado na análise linear para determinar a atividade catalítica dos polipéptidos de FVIIa na ausência de TF. A tabela 15 apresenta a atividade catalítica de cada uma das variantes de polipéptidos de FVIIa ensaiados. Apresentam-se os resultados como as constantes cinéticas para atividade catalítica, kcat/Km (M_1s_1) e também se expressam como uma percentagem da atividade de FVIIa de tipo selvagem, em que a atividade é a atividade catalítica, kcat/Km (M_1s_1) de cada variante de FVIIa para o seu substrato, FX. Apresentam-se igualmente o desvio padrão (DP), o coeficiente de variação (como uma percentagem; %CV) e o número de ensaios efetuados (n) . Algumas das variantes apresentaram um aumento acentuado da atividade catalítica comparativamente ao polipéptido de FVII de tipo selvagem. Por exemplo, a variante Gla swap FIX/ Q286R/M298Q apresentou uma atividade catalítica dependente de TF mais de 6 vezes superior à apresentada pelo polipéptido de FVII de tipo selvagem. 0 aumento da atividade catalítica das variantes de FVIIa foi mais pronunciada no ensaio independente de TF. Por exemplo, as variantes Gla swap FIX/Q366V apresentaram uma atividade catalítica mais de 9 vezes superior a FVIIa de tipo selvagem, as variantes Gla swap FIX/ Q286R/M298Q, {Gla swap FIX/E4OL}/Q286R/M298Q, {Gla swap FIX/K43I}/Q286R/M298Q e {Gla swap FIX/Q44S}/Q286R/M298Q apresentaram cerca de 70-80 vezes mais atividade catalítica do que FVIIa de tipo selvagem e a variante S52A/S60A/V158D/E296V/M1298Q apresentava mais de 220 vezes mais atividade catalítica do que FVIIa de tipo selvagem.
t produzida em células CHOX § produzida na linha celular de CHOX estável clone 52-5F7
Exemplo 5
Determinação da inibição de FVIIa/TF ou FVIIa por AT- III/heparina
Avaliou-se a potência da interação entre o complexo AT-III/heparina e FVIIa na presença ou ausência de fator tecidular solúvel (sTF), i.e. dependente de TF ou independente de TF, por medição do nível de inibição de várias concentrações de AT-III sobre a atividade catalítica de FVIIa/sTF relativamente a um substrato, mesil-FPR-ACC. Determinou-se o valor de Ko,s para cada variante de FVIIa ensaiado, que corresponde à concentração molar de AT-III que foi necessária para obter 50% de inibição (IC50) da variante de FVIIa num ensaio de 30 minutos à temperatura ambiente (-25°).
Prepararam-se dois ensaios independentes, um com sTF e outro sem sTF. Preparou-se uma solução 2 μΜ de AT-III/heparina (heparina final a 5 μΜ) por mistura de 26,4 pL de AT-III (AT-III humana purificada de plasma; Molecular Innovations) 151,7 μΜ com 50 pL de heparina LMW (CalBiochem) 0,2 mM, 400 pL de 5* tampão de ensaio (Hepes 100 mM, NaCl 750 mM, CaCÍ2 25 mM, BSA a 0,05%, PEG 8000 a 0,5%, pH 7,4) e 1,523 mL de água de grau de reagente. Esta solução foi para uso como a concentração mais elevada no ensaio dependente de TF. Preparou-se uma solução contendo AT-III/heparina (heparina final a 5 μΜ) 4 μΜ para uso no ensaio independente de TF por mistura de 52,8 pL de AT-III (Molecular Innovations) 151,7 μΜ com 50 pL de heparina LMW (CalBiochem) 0,2 mM, 400 pL de 5* tampão de ensaio e 1,497 mL de água de grau de reagente. Incubaram-se as soluções de AT-III/heparina durante 5-10 minutos à temperatura ambiente e seguidamente diluíram-se duas vezes para uma placa de polipropileno de 96 poços fundos para um volume final de 1 mL contendo heparina 5 pM, resultando em diluições de 2000, 1000, 500, 250, 125, 62,5, 31,25 e 0 nM ou 4000, 2000, 1000, 500, 250, 125, 62,5 e 0 nM. Diluiram-se as variantes de FVIIa
e FVIIa de tipo selvagem até 250 nM em lx tampão de ensaio (Hepes 20 mM, NaCl 150 mM, CaCl2 5 mM, BSA a 0,01%, PEG 8000 a 0,1%, pH 7,4) . Para o ensaio dependente de TF, formaram-se complexos de FVIIa 5 nM/sTF 50 nM por mistura de 20 pL de FVIIa com 10 pL de sTF (fator III de coagulação humano de R&D
Systems: n2 2339-PA) 5 μΜ, 200 pL de 5* tampão de ensaio e 770 pL de água de grau de reagente e incubaram-se as soluções durante 10-15 minutos à temperatura ambiente. Para o ensaio independente de TF, misturou-se 100 pL de FVIIa com 200 pL de 5* tampão de ensaio e 700 pL de água de grau de reagente para produzir soluções 25 nM de FVIIa. Para iniciar o ensaio, misturaram-se separadamente 25 pL das soluções de FVIIa/TF ou FVIIa sozinho com 25 pL de cada diluição de AT-III/heparina em poços de uma placa de ensaio de 96 poços com meia área transparente (Nunc). As condições finais de ensaio para o ensaio dependente de TF foram FVIIa 2,5 nM/sTF 25 nM e concentrações de AT-III/heparina na gama entre 1000 nM e 0 nM. Para o ensaio independente de TF, as concentrações de FVIIa foram FVIIa 12,5 nM e concentrações de AT-III/heparina na gama entre 2000 nM e 0 nM. Incubaram-se as placas durante 30 minutos com agitação à temperatura ambiente (—25 °C).
Preparou-se uma solução-mãe de substrato de FVIIa (mesil-FPR-ACC) por dissolução do substrato em DMSO a 20 mM seguido de preparação de uma solução de trabalho 0,5 mM em lx tampão de ensaio. Após incubação da placa de ensaio anterior, adicionou-se 50 μΐ do substrato de FVIIa a cada poço da placa de ensaio. Misturaram-se as reações e avaliou-se a atividade residual de FVIIa seguindo as velocidades iniciais de clivagem de substrato durante 15 minutos num conjunto de leitor de fluorescência a 30 °C.
Para determinar o grau de inibição por AT-III/heparina para FVIIa ou variante de FVIIa, exportaram-se os dados em bruto recolhidos com o utilitário SoftMax Pro (Molecular Devices) como ficheiros .XML. Efetuaram-se adicionalmente análises não lineares com XLfit4, um pacote de utilitários para ajuste automático de curvas e análise estatística no ambiente da folha de cálculo Microsoft Excel (IDBS Software). Usou-se o molde da folha de cálculo para calcular a série de diluições de AT-III, razão de AT-III para FVIIa e as razões Vi/Vo para cada replicado de FVIIa a cada concentração experimental de AT-III. As análises de regressão não linear da atividade residual de FVIIa (expressa como Vi/Vo) relativamente à concentração de AT-III foram processadas usando XLfit4 e uma equação de inibição hiperbólica na forma ( (C+(Amp* (1-(X/(Ko,5+X) ) ) ) ) ; em que C = desvio (fixado a 0 para permitir extrapolação dos conjuntos de dados que não atingem 100% de inibição durante o decorrer do ensaio), Amp = amplitude do ajuste e Ko,s, que corresponde à concentração de AT-III necessária para metade da inibição máxima nas condições de ensaio. Para várias variantes de FVIIa, AT-III inibiu menos do que 20-25% da atividade de protease total à concentração de AT-III mais elevada que foi testada, representando um limite de detecção superior para o ensaio. Atribuiram-se então às variantes com menos de 20-25% da inibição máxima um limite inferior de valor de Ko,s (5 μΜ para dependente de TF e 10 μΜ para independente de TF) e na maioria dos casos espera-se que tenham resistências a AT-III maiores do que o valor relatado.
As tabelas 16 e 17 proporcionam os resultados dos ensaios que foram efetuados usando variantes de FVIIa expressas em células Freestyle TM 293-F e/ou células BHK-21, na presença e ausência de TF, respetivamente. Apresentam-se os resultados como ajustes ao parâmetro Ko,5 ou como uma representação da extensão de resistência a AT-III para cada variante comparativamente a FVIIa de tipo selvagem expresso como uma razão dos seus valores ajustados de Ko,s (Ko,s variante/Ko,5 de tipo selvagem). Várias variantes de FVIIa apresentaram aumento de resistência a AT-III comparativamente a FVIIa de tipo selvagem. Por exemplo, Q286R-FVIIa (i.e. FVIIa contendo a mutação Q286R), Q286R/S222A-FVIIa, Q286R/S222A/Gla Swap FIX-FVIIa, A175S/Q286R/Q36 6V-FVIIa, Q286M-FVIIa, Q286L-FVIIa e Q286Y-FVIIa pertencem ao grupo que apresenta resistência a AT-III na ausência de TF que foi mais de 4 vezes superior à de FVIIa de tipo selvagem.
Efetuou-se um conjunto adicional de experiências para avaliar a inibição das variantes de FVIIa por AT-III/heparina na ausência de TF usando o mesmo ensaio descrito anteriormente com pequenas modificações. Usou-se heparina completa e não fracionada (Calbiochem) em vez de heparina de baixo peso molecular (heparina LMW) para aumentar a velocidade da reação de inibição (consultar e.g., Olson et ai. (2004) Thromb Haemost 92(5), 929-939) . O tempo de incubação do ensaio aumentou para 60 minutos e a concentração de substrato mesil-FPR-ACC usada para avaliar a atividade residual foi aumentada para uma concentração final de 0,5 mM. A tabela 18 apresenta os resultados dos ensaios que se efetuaram na ausência de TF usando variantes de FVIIa expressas em células BHK-21 e em células CHOX. Apresentam-se os resultados como o parâmetro Ko,s ajustado e como uma representação da extensão de resistência a AT-III para cada variante comparativamente a FVIIa de tipo selvagem expressa como uma razão dos seus valores de Ko,5 ajustados (Ko,5 mutante/Ko,5 de tipo selvagem). Apresentam-se também o desvio padrão (DP) e o número de ensaios (n).
t produzido em células CHOX § produzido na linha celular estável CHOX clone 52-5F7
Exemplo 6
Avaliação in vivo da atividade pró-coagulante do polipéptido de FVIIa
Estabeleceram-se modelos de ratinho de hemofilia A para avaliar a atividade pró-coagulante dos polipéptidos de FVIIa. Induziu-se hemofilia A em ratinhos CD-I por administração intraperitoneal de anticorpos anti-FVIII, seguido de remoção cirúrgica das extremidades das caudas para iniciar o sangramento. Foram também usados ratinhos deficientes em FVIII (ratinhos FVIII_/_) mas não forma tratados com anticorpos anti-FVIII. Trataram-se então os ratinhos com polipéptido de FVIIa e mediu-se a quantidade de sangue perdido em 20 minutos para determinar a atividade pró-coagulante dos polipéptidos de FVIIa. A. Avaliação in vivo da atividade pró-coagulante de FVIIa de tipo selvagem
Estabeleceu-se um modelo de ratinho de hemofilia A para avaliar a atividade pró-coagulante dos polipéptidos de FVIIa. Induziu-se hemofilia A em ratinhos CD-I por administração de anticorpos anti-FVIII, seguido de remoção cirúrgica das extremidades das caudas para iniciar o sangramento. Trataram- se então os ratinhos com polipéptido de FVIIa e mediu-se o tempo decorrido até paragem do sangramento e a quantidade de sangue perdido durante este período de tempo para determinar a atividade pró-coagulante dos polipéptidos de FVIIa.
Anestesiaram-se ratinhos CD-I macho por administração intraperitoneal de tiobarbital de sódio a 100 mg/kg e cetamina a 100 mg/kg. Administrou-se lidocaína por injeção subcutânea na parte ventral do pescoço para reduzir a sensibilidade. Inseriram-se cânulas na traqueia e na artéria carótida através de uma pequena incisão na pele do pescoço para facilitar a respiração sem restrições e a administração de anticorpo anti-fator VIII, fator Vila humano recombinante (rhFVIIa) e/ou polipéptidos de FVII modificados.
Administrou-se aos ratinhos com cânulas 3,76 mg de anticorpo de ovelha anti-FVIII humano (Affinity Biologicals, lote IG129R4, 612 BU de ratinho/ml) em 40 yL. Esta dose foi determinada numa experiência de resposta à dose inicial com o anticorpo (usando 0,376, 0,94, 1,88 e 3,76 mg de anti-FVIII humano) e avaliação da perda de sangue e tempo de sangramento. Após 20 minutos, colocaram-se as caudas dos ratinhos em tubos de 15 mL contendo solução salina tamponada de fosfato (PBS) a 39 °C durante um período de 10 minutos. Aos 30 minutos, removeram-se brevemente as caudas da solução de PBS e cortaram-se os 5 mm terminais das caudas para iniciar o sangramento. Anotou-se o tempo ao qual se iniciou o sangramento. Voltaram então a pôr-se as caudas no tubo contendo PBS a 39 °C e deixaram-se sangrar durante 5 minutos (pré-sangramento) para assegurar que os ratinhos tinham respondido ao anticorpo anti-FVIII. Após o pré-sangramento, administraram-se aos ratinhos polipéptidos de FVIIa ou o veículo no qual se prepararam e entregaram as proteínas de FVIIa. Diluiram-se polipéptidos de FVIIa em PBS ou num tampão composto por cloreto de sódio 52 mM, cloreto de cálcio desidratado 10,2 mM, glicilglicina 9,84 mM, polissorbato 80 a 0,01% e manitol 165 mM. Administraram-se as preparações de FVIIa a 1, 3 ou 10 mg/kg, num volume equivalente a 3 mL/kg, através das cânulas da carótida e colocaram-se as caudas em tubos frescos contendo PBS a 39 °C. Monitorizou-se o sangramento durante um período de 20 minutos e registou-se o número de vezes que o sangramento parou. Calculou-se o tempo total de sangramento como a soma da duração do sangramento durante o pré-sangramento e a duração do sangramento após administração de polipéptidos de FVIIa ou PBS ou tampão.
Para determinar a quantidade de sangue perdido durante os episódios de sangramento, ensaiaram-se os conteúdos dos tubos de 15 mL para teor em hemoglobina. Diluiu-se Triton X-100 a 1 para 4 em água estéril e adicionaram-se 100 pL a 1 mL das amostras para provocar hemólise. Mediu-se então a absorvância das amostras a um comprimento de onda de 546 nm. Para calcular a quantidade de sangue perdido, leu-se a absorvância contra uma curva padrão gerada por medição da absorvância a 546 nm de volumes conhecidos de sangue murino, diluído em PBS e hemolisado tal como anteriormente em Triton X 100.
Fez-se uma experiência comparando rhFVIIa gerado tal como descrito anteriormente com o FVIIa humano recombinante disponível comercialmente (NovoSeven®, Novo Nordisk) e avaliou-se a perda de sangue após administração de uma dose de 3 mg/kg de cada proteína. A perda de sangue no grupo de veículo (tampão, n = 15) foi de 671,9 ± 57,89 μΐ ao longo do período de 20 minutos. Tal foi reduzido pelo rhFVIIa produzido por Catalyst Biosciences para 264,1 ± 56,59 μΐ e por NovoSeven® para 273, 7 ± 53, 93 μΐ (n = 14) . Esta experiência demonstrou equivalência entre as duas proteínas.
B. Análise da atividade coagulante de variantes de FVIIa em ratinhos CD-I com indução de hemofilia A
Efetuaram-se experiências iniciais para determinar a dose necessária e o tempo e duração do efeito de anticorpos anti-FVIII humanos quando administrados por via intraperitoneal para induzir hemofilia em ratinhos CD-I. Para o primeiro lote de anti-FVIII (lote 1; Affinity Biologicals, lote IG129R4), tal baseou-se inicialmente na dose usada para as experiências de inserção de cânulas descritas anteriormente. A dose que se determinou causar um estado hemofílico (sangramento descontrolado ao longo do período de ensaio de 20 minutos) foi de 7,54 mg/ratinho (80 μΐ de uma solução-mãe de 94,25 mg/ml). Este lote tinha uma atividade neutralizante de 612 BU de ratinho/ml. Para o segundo lote de anti-FVIII humano (lote 2; Affinity Biologicals, lote IG1577R2, atividade neutralizante de 474 BU de ratinho/ml) a dose usada foi de 11,98 mg/ratinho (120 μΐ de uma solução-mãe de 99,8 mg/ml) e administrou-se às 6 horas antes do corte da cauda.
Para induzir hemofilia, administraram-se intraperitonealmente a ratinhos CD-I macho (25-35 g) o lote 1 ou o lote 2 de anti-FVIII antes da experiência. Anestesiaram-se ratinhos macho CD-I e FVIII_/_ por administração intraperitoneal de uma mistura cetamina/xilazina (45 mg/mL e 3,6 mg/mL, respetivamente, em soro fisiológico) e colocaram-se numa plataforma aquecida (39 °C) para assegurar que não havia descida da temperatura corporal. Manteve-se a divisão onde se efetuou o procedimento a uma temperatura de 82 °F. Dez minutos antes do corte da cauda imergiu-se a cauda em 10 ml de PBS pré-aquecido (tubo de centrífuga de 15 ml; 39 °C) . Injetaram-se oito a dez ratinhos com FVIIa humano recombinante (Novoseven®, Novo Nordisk) ou polipéptidos de FVII modificados diluídos num tampão composto por cloreto de sódio 52 mM, cloreto de cálcio desidratado 10,2 mM, glicilglicina 9,84 mM, polissorbato 80 a 0,01% e manitol 165 mM através da veia da cauda numa injeção única. Injetou-se também veículo apenas num grupo de ratinhos como controlo. Caso se falhasse a injeção o animal era excluído do estudo. Administrou-se injeção com polipéptido de FVIIa ou veículo 5 minutos antes do corte da cauda. Fez-se um corte de cauda usando uma lâmina da barba a 5 mm da extremidade da cauda e recolheu-se o sangue em PBS durante um período de 20 minutos. No final do período de recolha, avaliou-se a perda total de sangue. Misturaram-se os tubos de recolha e retirou-se uma alíquota de 1 ml de cada amostra e ensaiou-se o teor em hemoglobina. Diluiu-se Triton X—10 0 a 1 para 4 em água estéril e adicionaram-se 100 pL a 1 mL das amostras para provocar hemólise. Mediu-se então a absorvância das amostras a um comprimento de onda de 546 nm. Para calcular a quantidade de sangue perdido, leu-se a absorvância contra uma curva padrão gerada por medição da absorvância a 546 nm de volumes conhecidos de sangue murino, diluído em PBS e hemolisado tal como anteriormente em Triton X 100 . 1. Estudo de resposta à dose que avalia a atividade coagulante de FVIIa de tipo selvagem
Efetuou-se também um estudo de resposta à dose no qual se avaliou FVIIa de tipo selvagem a 0,3, 1 ou 3 mg/kg. Os ratinhos que receberam o veículo perderam 1002,3 ± 60,71 pL nos 20 minutos do ensaio. Tal foi reduzido significativamente em ratinhos aos quais se administraram 3 mg/kg de FVIIa de tipo selvagem, para 415,5 ± 90,85 pL (p < 0,05 usando Kruskal-Wallis seguido de um pós-ensaio de Dunn) . A redução da dose para 1 mg/kg resultou em perda de sangue de 679,57 ± 83,95 pL e uma dose menor que 0,3 mg/kg resultou em perda de sangue de 852,42 ± 94,46 pL. 2. Análise inicial da atividade coagulante de variantes de FVIIa
Usou-se como controlo a injeção de veículo sozinho. Os ratinhos que receberam o veículo sozinho perderam 915,2 ± 105,6 pL nos 20 minutos de ensaio, que foi reduzido para 352 ± 99, 86 pL (média ± E.P.M) ao administrar aos ratinhos FVIIa humano recombinante. Reduziu-se ainda mais a quantidade de sangue perdido para 165,8 ± 48,41 pL caso se administrasse aos ratinhos Q286R-FVIIa (i.e. FVIIa contendo a mutação Q286R), para 141,3 ± 43,77 pL com Q286R/M298Q-FVIIa ou para 129,5 ± 36,64 pL com VI58D/E296V/M298Q-FVIIa. Os ratinhos aos quais se administrou S222A-FVIIa também apresentaram perda de sangue reduzida (para 225,7 ± 62,75 pL) comparativamente com ratinhos aos quais se administrou FVIIa de tipo selvagem. A administração de Gla Swap FIX-FVIIa, Q366V-FVIIa ou A122N/G124S-FVIIa resultou numa quantidade de perda de sangue aproximadamente igual à observada em ratinhos aos quais se administrou FVIIa humano recombinante (334,6 ± 54,95 pL, 321,7 ± 102,6 pL e 329,8 ± 83,91 pL respetivamente), enquanto ratinhos aos quais se administraram H257A-FVIIa, S222A/Q286R-FVIIa ou H257A-FVIIa pareceram ter uma perda de sangue ligeiramente superior (390 ± 107 pL, 447,3 ± 127,7 pL e 443,7 ± 139,5 pL, respetivamente). 3. Resposta à dose para avaliar a atividade coagulante de variantes de FVIIa
Estudo de resposta à dose no qual se administraram aos ratinhos 0,1, 0,3, 1 ou 3 mg/kg de Q286R-FVIIa, S222A-FVIIa, Q2 8 6R/M2 98Q-FVIIa ou V158D/E296V/M298Q-FVIIa . Os ratinhos que receberam apenas veículo perderam 915,2 ± 105,6 pL de sangue no ensaio de 20 minutos. Tal reduziu-se significativamente em ratinhos as quais se administrou 3 mg/kg de qualquer um de Q28 6R-FVIIa (141,3 ± 43,77 pL) , S222A-FVIIa (225,7 ± 62,75pL) ou Q286R/M298Q-FVIIa (129,5 ± 36,64 pL) (p < 0,05 usando Kruskal-Wallis seguido de um pós-ensaio de Dunn). A redução da dose para 1 mg/kg resultou em perda de sangue de 641 ± 96,48 pL em ratinhos que receberam Q286R-FVIIa e 487,92 ± 92,07 pL em ratinhos que receberam S222A-FVIIa. Doses menores desta variante de FVIIa resultaram em aproximadamente a mesma perda de sangue (817,71 ± 107,94 pL e 900,34 ± 115,77 pL para Q286R-FVIIa e S222A-FVIIa respetivamente) tal como observado em ratinhos que receberam o controlo de veículo. Contrariamente, os ratinhos que receberam 1 mg/kg de Q286R/M298Q-FVIIa apresentaram uma perda de sangue significativamente reduzida (69,36 ± 15,55 pL) comparativamente a ratinhos de controlo com veículo sozinho. A doses menores de 0,3 mg/kg e 0,1 mg/kg, a perda de sangue foi de 538,3 ± 94, 04 pL e 664 ± 121,6 pL, respetivamente. Os ratinhos que receberam 0,3, 1 e 3 mg/kg de V158D/E296V/M298Q-FVIIa apresentaram perda de sangue de 754,49 ± 121,6 pL, 481,95 ± 114,22 pL e 133,25 ± 50,09 pL respetivamente.
Efetuaram-se estudos de resposta à dose adicionais para Q2 8 6R-FVIIa, Q286R/M298Q-FVIIa e V158D/E296V/M298Q-FVIIa e combinaram-se os dados com os anteriores. Nas experiências de avaliação do efeito de Q286R-FVIIa, o grupo que recebeu o veículo perdeu 833,61 ± 73,95 pL de sangue. Tal foi reduzido significativamente para 196,71 ± 49,18 pL em ratinhos que foram tratados com 3 mg/kg de Q286R-FVIIa. Reduzindo a dose para 1 mg/kg resultou em perda de sangue de 577,78 ± 66,29 pL. Quando se administraram aos ratinhos doses com 0,1 e 0,3 mg/kg de Q286R-FVIIa a perda de sangue produzida foi semelhante ao valor do controlo de veículo (739,58 ± 104,28 pL e 806,63 ± 65,17 pL, respetivamente). Nas experiências de avaliação do efeito de Q286R/M298Q-FVIIa, o grupo de veículo produziu perda de sangue de 902,42 ± 88, 04 pL, que foi reduzida significativamente por tratamento com 1 e 3 mg/kg Q286R/M298Q-FVIIa para 145,17 ± 38,89 pL e 140,76 ± 33,36 pL de perda de sangue. Reduzindo a dose para 0,1 e 0,3 mg/kg resultou em valores de perda de sangue de 664,03 ± 121,62 pL e 551,94 ± 67,60 pL respetivamente. As experiências de avaliação de V158D/E296V/M298Q-FVIIa no grupo de veiculo de controlo demonstraram perda de sangue de 966,64 ± 57,97 pL, que foi reduzida significativamente por tratamento com V158D/E296V/M298Q-FVIIa a 3 mg/kg para 128,19 ± 27,73 pL. Reduzindo a dose para 1 mg/kg levou a perda de sangue de 565,50 ± 65,78 pL e reduzindo a dose adicionalmente para 0,3 e 0,1 mg/kg produziu perda de sangue que foi semelhante ao grupo de controlo (811,16 ± 71,87 pL e 893,62 ± 106,73 pL). Efetuou-se análise estatística com Kruskal-Wallis seguido de um pós-ensaio de Dunn e a significância foi aceite quando p < 0,05. 4. Atividade coagulante de H216A-FVIIa, H373F-FVIIa, Q366D-FVIIa e Q366N-FVIIa a uma dose de 3 mg/kg.
Um conjunto de experiências ensaiou H216A-FVIIa, H373F-FVIIa, Q366D-FVIIa e Q366N-FVIIa a uma dose de 3 mg/kg. Usou-se a injeção de veiculo sozinho como um controlo. Os ratinhos que receberam o veiculo perderam 915,2 ± 105,6 pL nos 20 minutos do ensaio. Tal foi ainda reduzido adicionalmente para 211,1 ± 67,70 pL caso se tratassem os ratinhos com H373F-FVIIa. A perda de sangue foi menos afetada por tratamento com H216A-FVIIa, Q366D-FVIIa e Q366N-FVIIa, com valores de 558,6 ± 66,22, 577,1 ± 151,4 e 477,1 ± 112,6 pL, respetivamente. 4. Atividade coagulante de Q286R/M298Q/Gla swap FIX-FVIIa, S2 2 2A/H2 5 7A/Q2 8 6R/M15 8Q-FVIIa, Q286R/M298Q/K34lD-FVIIa e Q286R/M298Q/H373F-FVIIa a uma dose de 3 mg/kg.
Avaliou-se a atividade coagulante de Q286R/M298Q/Gla swap FIX-FVIIa, S222A/H257A/Q286R/M15 8Q-FVIIa, Q286R/M298Q/K341 D-FVIIa e Q286R/M298Q/H373F-FVIIa a uma dose de 3 mg/kg no modelo de ratinho de hemofilia CD-I. Usou-se a injeção de veiculo sozinho como um controlo. Os ratinhos que receberam o veiculo perderam 803 ± 92,18 pL no ensaio de 20 minutos. Tal foi reduzido por tratamento com S222A/H257A/Q286R/M158Q-FVIIa para 118,6 ± 63,27 pL. O tratamento com Q286R/M298Q/Gla swap FIX-FVIIa a 3 mg/kg reduziu a perda de sangue comparativamente com o grupo de veiculo desde 888,89 ± 104,76 pL para 171,83 ± 62,06 pL . Nas experiências de avaliação de Q286R/M298Q/K341D-FVIIa e Q286R/M298Q/H373F-FVIIa a perda de sangue do grupo de veiculo foi de 813,1 ± 82,66 pL. Tal foi reduzido para 39,42 ± 5,53 pL de perda de sangue após tratamento com Q2 8 6R/M2 98Q/H373F-FVIIa . Q286R/M298Q/K341D-FVIIa pareceu ser menos eficaz no ensaio, resultando em perda de sangue de 636,7 ± 121,6 pL. 5. Estudo de resposta à dose para avaliar a atividade coagulante de S222A/H257A/Q286R/Ml58Q-FVIIa e Q2 8 6R/M2 9 8Q/H3 7 3F-FVIIa
Avaliou-se a resposta à dose de S222A/H257A/Q286R/M158Q-FVIIa a 0,3, 0,5, 1 e 3 mg/kg. Os ratinhos que receberam o veiculo perderam 832,48 ± 71,70 pL no ensaio de 20 minutos. Tal foi significativamente reduzido por administração aos ratinhos de 3 mg/kg de S222A/H257A/Q286R/M158Q-FVIIa, para 118,63 ± 63,27 pL (p < 0,05 usando Kruskal-Wallis seguido de um pós-ensaio de Dunn) . Reduzindo a dose para 1 e 0,5 mg/kg resultou numa redução significativa da perda de sangue (202,69 ± 77,60 pL e 366,52 ± 106,21 pL) e uma dose menor de 0,3 mg/kg resultou em perda de sangue que comparou melhor com os niveis de veiculo (742,04 ± 112 pL). A resposta à dose de Q286R/M298Q/H373F-FVIIa a 0,1, 0,3, 1 e 3 mg/kg foi também
avaliada e nesta experiência os ratinhos que receberam o veiculo tiveram uma perda de sangue de 813,15 ± 82, 66 pL. Tal foi significativamente reduzido em ratinhos que foram tratados com 3 mg/kg de Q286R/M298Q/H373F-FVIIa, para 39,42 ± 5,52 pL (p < 0,05 usando Kruskal-Wallis seguido de um pós-ensaio de Dunn). Reduzindo a dose para 1 e 0,3 mg/kg levou a valores de perda de sangue de 208,10 ± 105,12 e 508,9 ± 155,8 pL respetivamente. A menor dose ensaiada de 0,1 mg/kg produziu perda de sangue que foi próxima dos niveis de controlo de veiculo (733,5 ± 152,88 pL). C. Análise de atividade coagulante de FVIIa em ratinhos FVIII-/-
Usou-se também um modelo de ratinho de hemofilia A usando ratinhos deficientes em FVIII (ratinhos FVIII_/_) para avaliar a atividade coagulante de polipéptidos de FVIIa, usando os mesmos protocolos tal como descrito anteriormente com exceção dos ratinhos não terem sido tratados com anticorpos anti-FVIII. 1. Estudo de resposta à dose que avalia a atividade coagulante de FVIIa de tipo selvagem
Efetuaram-se estudos de resposta à dose para avaliar a atividade coagulante de NovoSeven® e rhFVIIa de tipo selvagem em ratinhos FVIIild7- a 0,3, 1, 3 e 6 mg/kg. Na experiência com NovoSeven®, a perda de sangue no grupo de veiculo foi 912,79 ± 38,32 pL, que foi reduzido significativamente por tratamento de NovoSeven® a 6 e 3 mg/kg (para 361,74 ± 55,28 pL e 586,98 ± 60,56 pL; p < 0,05 usando Kruskal-Wallis seguido de um pós-ensaio de Dunn) . A redução da dose para 1 mg/kg resultou em perda de sangue de 674,84 ± 46,88 pL e à menor dose ensaiada o valor foi de 801, 08 ± 41,39 pL. Na experiência de rhFVIIa de tipo selvagem, o grupo de controlo de veiculo produziu perda de sangue de 904, 08 ± 15,38 pL. Tal foi reduzido significativamente (p < 0,05 usando Kruskal-Wallis seguido de um pós-ensaio de Dunn) por rhFVIIa de tipo selvagem a 6 mg/kg para 451,04 ± 74,17 pL. A redução da dose para 3 mg/kg produziu um valor de perda de sangue de 695,75 ± 60,50 pL enquanto a redução adicional da dose para 1 e 0,3 mg/kg resultou em valores de perda de sangue próximos ou equivalentes aos níveis de controlo de veículo (846,08 ± 34,17 pL e 936,43 ± 31,39 pL, respetivamente). 2. Avaliação da resposta à dose da atividade coagulante de Q143R—FVIIa, S222A-FVIIa, Q286R/M298Q-FVIIa e Vl58D/E296V/M298Q-FVIIa O primeiro conjunto de experiências ensaiou FVIIa humano recombinante (NovoSeven®, Novo Nordisk), V158D/E296V/M298Q-FVIIa, Q286R-FVIIa e S222A-FVIIa a 3 mg/kg. Usou-se injeção de veículo sozinho como um controlo. Os ratinhos que receberam veículo sozinho tiveram uma perda de sangue de 942,9 ± 27,37 pL no ensaio de 20 minutos. O tratamento com FVII NovoSeven®, V158D/E29 6V/M2 9 8Q-FVIIa, Q143R-FVIIa e S222A-FVIIa reduziu a perda de sangue para 468 ± 55,9 pL, 302,38 ± 73,12 pL, 697,26 ± 92,22 pL e 675,07 ± 35,29 pL, respetivamente. Q143R-FVIIa, quando ensaiado novamente em ratinhos FVIII_/_ a 3 mg/kg, demonstrou uma perda de sangue reduzida de 754,84 ± 60,96 pL comparativamente com o grupo de veiculo de controlo (935,54 ± 51,96 pL). Quando avaliado a 5 mg/kg, Q143R-FVIIa produziu uma redução adicional da perda de sangue para 445,87 ± 79,62 pL comparativamente com o grupo de controlo de veiculo (960,42 ± 24,5 pL). O segundo conjunto de experiências foram estudos de resposta à dose nos quais se avaliaram V158D/E296V/M298Q-FVIIa e Q286R/M298Q-FVIIa a 0,3, 1 e 3 mg/kg. O tratamento com V158D/E296V/M298Q-FVIIa a 3 mg/kg resultou na redução significativa da perda de sangue (375,62 ± 74,22 pL) comparativamente com o controlo de veiculo (960,42 ± 24,5 pL; p < 0,05 usando Kruskal-Wallis seguido de um pós-ensaio de Dunn). A redução da dose para 1 e 0,3 mg/kg levou a valores de perda de sangue mais perto dos valores de controlo de 834,76 ± 54,38 pL e 841,62 ± 68,99 pL, respetivamente. Uma segunda experiência que avaliou um lote diferente de V158D/E296V/M298Q-FVIIa produziu um valor de perda de sangue por controlo de veiculo de 912,79 ± 38,32 pL, que foi inibida significativamente a 3 e 1 mg/kg (247,24 ± 35,17 pL e 628,30 ± 37,36 pL; p < 0,05 usando Kruskal-Wallis seguido de um pós-ensaio de Dunn) . O tratamento com uma dose menor de V158D/E296V/M298Q-FVIIa produziu perda de sangue que se aproximou dos valores de controlo (841, 85 ± 19,32 pL) . Na experiência que avaliou o efeito de Q286R/M298Q-FVIIa em ratinhos FVIII^, o grupo de veiculo produziu perda de sangue de 941,39 ± 35,18 pL. Tal foi inibido significativamente a uma dose de 3 mg/kg, resultando em perda de sangue de 258,92 ± 59,82 pL. A doses menores de 1 e 0,3 mg/kg os niveis de perda de sangue produzidos foram 616,82 ± 78,43pL e 924,9 ± 38,01 pL, respetivamente. D. Análise da atividade coagulante de variantes de FVIIa adicionais por utilização do modelo de hemofilia induzida
Avaliou-se a atividade coagulante de várias variantes de FVIIa usando o modelo de hemofilia induzida (IHM) com ratinhos CD-I descrito no exemplo 6.B, anteriormente. O protocolo foi o mesmo tal como descrito anteriormente, exceto para a avaliação da variante T128N/P129A-FVIIa e da variante M156Q/H224F-FVIIa, nas quais se usaram lotes diferentes (terceiro e quarto, respetivamente) de anti-FVIII humano. Para o terceiro lote de anti-FVIII humano (lote 3; Affinity Biologicals, lote IG1603R1, atividade neutralizante de 418 BU de ratinho/ml) a dose usada foi de 12,17 mg/ratinho (120 μΐ de uma solução-mãe de 101,4 mg/ml), que foi administrada às 18 horas antes do corte da cauda. Para o quarto lote de anti-FVIII humano (lote 4; Affinity Biologicals, lote IG1639R1, atividade neutralizante de 875 BU de ratinho/ml) a dose usada foi 8,04 mg/ratinho (80 μΐ de uma solução-mãe de 100,45 mg/ml. Mediu-se a perda de sangue tal como descrito anteriormente e apresenta-se seguidamente na tabela 19 como a percentagem de inibição (calculada usando os valores médios para a variante de interesse divididos pelo grupo de veiculo) e o valor de ED50 (determinado usando análise de regressão não linear (usando o utilitário GraphPad Prism®, GraphPad Software, Inc.), com as restrições para o inicio e final da curva de resposta com a perda de sangue observada com os animais de controlo tratados com veiculo e de controlo normais, respetivamente.
E. Análise da atividade coagulante de variantes de FVIIa adicionais usando o modelo de hemofilia induzida
Avaliou-se a atividade coagulante de várias variantes de FVIIa usando o modelo de hemofilia induzida (IHM) com ratinhos CD-I descrito no exemplo 6.B, anteriormente. 0 protocolo foi tal como descrito anteriormente, exceto que para estas experiências se usaram os lotes 4 a 6 de anti-FVIII. Os detalhes para estes lotes são os seguintes: lote 4 (detalhado anteriormente), para o quinto lote (lote 5; Affinity
Biologicals, lote IGI 593R2, atividade neutralizante de 255 BU de ratinho/ml) a dose usada foi de 12,25 mg/ratinho (120 μΐ de uma solução-mãe a 102,1 mg/ml), que foi administrada às 6 horas antes do corte da cauda. Para o sexto lote (lote 6;
Affinity Biologicals, lote IG1703R2, atividade neutralizante de 685 BU de ratinho/ml) a dose usada foi de 8,02 mg/ratinho (80 μΐ de uma solução-mãe a 100,2 mg/ml), que foi administrada às 16:00h no dia anterior à experiência. Mediu-se a perda de sangue tal como descrito anteriormente e apresentada seguidamente na tabela 20 como a percentagem de inibição (calculada usando os valores médios para a variante de interesse e dividindo pelo grupo de veículo), em cada caso apresentam-se todas as doses com os valores de inibição correspondentes em baixo e o valor de ED50 (determinado usando análise de regressão não linear (usando o utilitário GraphPad Prism® software, GraphPad Software, Inc.), com as restrições para o início e final da curva de resposta com a perda de sangue observada com os animais de controlo tratados com veículo e de controlo normais, respetivamente. O ' n/grupo' refere-se à quantidade de ratinhos por grupo enquanto o ' n' em referência ao cálculo de ED50 se refere à quantidade de experiências efetuadas com a variante.
t a dose foi 0,6 mg/kg
Exemplo 7
Determinação das constantes cinéticas de Michaelis Menten da atividade amidolítica de FVIIa num substrato de molécula pequena
Pode avaliar-se a atividade amidolítica das variantes de FVII por medição das constantes cinéticas de Michaelis Menten do polipéptido de FVIIa no substrato de peptidilo Spectrozyme FVIIa (CH3S02-D-CHA-But-Arg-pNA.AcOH) . Tal ensaio pode efetuar-se como se segue.
Inclui-se no ensaio fator tecidular humano purificado lipidado (Innovin, Dade Behring, n2 de catálogo VWR 68100-390) para proporcionar atividade ótima de FVIIa. O complexo de TF-FVIIa cliva Spectrozyme FVIIa como um substrato cromogénico altamente específico libertando um cromóforo paranitroanilina (pNA), que pode ser monitorizado por medição da absorvância a 405 nm. Determina-se a atividade enzimática por monitorização da absorvância a 405 nm para a pNA livre gerada em função do tempo.
Efetuaram-se as reações a três concentrações diferentes de enzima. Para a reação, diluíram-se primeiramente as variantes de FVIIa para 40 nM em 1 χ tampão de ensaio direto (Tris 100 mM pH 8,4, NaCl 100 mM, CaCl2 5 mM, BSA a 0,01%) num tubo de 1,7 mL (tubos de microcentrífuga de baixa adesão de ISC Bioexpress) . Dilui-se adicionalmente FVIIa na presença de TF (Innovin, Dade Behring) por diluição para 2 nM num reservatório de polipropileno de 12 poços (Axygen) como se segue: 720 μΐ de 5* tampão direto (Tris 500 mM pH 8,4, NaCl 500 mM, CaCl2 25 mM, BSA a 0,05%), 180 μΐ de FVIIa 40 nM e 2700 μΐ de 2xTF (solução-mãe 6 nM reconstituída em 10 mL de água). Incuba-se a protease diluída durante 5 minutos à temperatura ambiente. Dilui-se adicionalmente a solução-mãe de FVIIa 2 nM em duas diluições em série para proporcionar soluções-mãe de protease 1 nM e 0,5 nM, respetivamente, também na presença de TF. As reações de diluição em série são como se segue: primeiro, diluem-se 1800 μΐ de solução-mãe de FVIIa/TF 2 nM anterior para 360 μΐ de 5 X tampão direto, 900 μΐ de 2xTF e 540 μΐ de água. Dilui-se novamente 1:1 esta solução-mãe diluída para 1800 μΐ em 1 xTF em tampão direto.
Prepara-se uma placa de diluição de substrato Spectrozyme FVIIa (American Diagnostica). Prepara-se a solução-mãe de Spectrozyme FVIIa por reconstituição do frasquinho com 50 pmoles em água destilada para 10 mM e armazena-se a 4 °C. Adicionam-se 80 μΐ (Spectrozyme FVIIa 10 mM) e 60 μΐ + 20 μΐ de água (Spectrozyme FVIIa 7,5 mM) de Spectrozyme FVIIa 10 mM aos poços em duas colunas adjacentes de uma placa de ensaio de polipropileno de 96 poços (Costar). Diluem-se os dois poços 2 vezes em série ao longo de cada um dos 8 poços da coluna respectiva para produzir uma série de 10x concentrações de substrato na gama entre 10 mM e 78 μΜ de substrato ao longo dos poços da primeira coluna e entre 7,5 mM e 58,6 μΜ de substrato ao longo dos poços da segunda coluna.
Adiciona-se 5 μΐ de cada diluição de substrato Spectrozyme FVIIa a uma placa de ensaio de 96 poços com meia área transparente (Costar). Adiciona-se 45 μΐ de cada uma das três diluições FVIIa/TF a três grupos de colunas das diluições em série de substrato. Durante esta etapa, toma-se cuidado para evitar a introdução de bolhas nos poços do ensaio. Caso se introduzam bolhas, estas podem ser removidas picando-as com uma agulha limpa antes do início de cada ensaio. Misturam-se então as placas por agitação. Antes de iniciar o ensaio, mede-se o passo ótico dos poços de ensaio usando um espectrofotómetro de leitor de placas Spectramax Gemini M5 (Molecular Devices) obtendo uma leitura de ponto final e usando a funcionalidade Pathcheck do utilitário SoftMax Pro (Molecular Devices). Mede-se o aumento de absorvância a 405 nm de 30 em 30 segundos durante uma hora a 37 °C.
Usa-se o utilitário SoftMax Pro para converter a taxa de absorvância (miliunidades/s) em concentração de pNA libertado (μΜ/s) por utilização do passo ótico e do coeficiente de extinção do grupo de saída do pNA a 405 nm, 9600 M^cirr1. A equação de conversão é como se segue: taxa χ (1/60 χ 1000) χ (1/9600 χ passo ótico) χ 100 000. Representam-se graficamente os resultados para cada concentração de protease usando o utilitário Graph Pad Prism com a concentração de substrato no eixo dos XX e as taxas determinadas em μΜ/s no eixo dos YY. Usando o utilitário Graph Pad Prism 4 determinam-se Km e Ymáx por ajuste dos dados a uma equação de Michaelis Menten como se segue: Y = (Ucat-Km/1 000 000) x X x [E] ) / (1+(X + Jfm) em que; X é a concentração de substrato (μΜ) Y é a atividade enzimática (μΜ/s) -kcat-Km é a constante de especificidade (M_1s_1)
Km é a constante de Michaelis (μΜ) E é a concentração de enzima (μΜ)
Estabeleceram-se os valores iniciais de E=l, Km = X a 0,5 χ Y máx e kcatKm = 10 0 0.
Exemplo 8
Avaliação da potência da interação entre as variantes de
FVIIa e TFPI
Pode avaliar-se a potência da interação entre os polipéptidos de FVIIa, tal como os aqui proporcionados e TFPI, usando um ou mais ensaios. Num exemplo, avalia-se a potência da interação entre TFPI e um complexo de FVIIa/TF por medição do nível de inibição de várias concentrações de TFPI na atividade catalítica de um FVIIa/TF relativamente a um substrato, Spectrazyme Vila. Noutro exemplo, pode usar-se um ensaio de ressonância plasmónica de superfície (SPR) de elevado rendimento.
A. Determinação do IC50 para inibição de FVIIa/TF por TFPI
Avaliou-se a potência da interação entre TFPI e o complexo de FVIIa/TF por medição do nível de inibição de várias concentrações de TFPI na atividade catalítica de um FVIIa/TF relativamente a um substrato, Spectrazyme Vila. Calculou-se a concentração de TFPI que foi necessária para uma inibição de 50% (IC50) para cada variante de FVII e um padrão de FVIIa.
Pré-tratou-se uma placa de ensaio de 96 poços com meia área transparente (Nunc) por adição de 150 μΐ/poço de 1 χ tampão de placa (Tris 100 mM pH 8,4, NaCl 100 mM, BSA a 0,01%, Tween-20 a 0,01%) a cada poço e incubação da placa a 37 °C durante um mínimo de 1 hora. Removeu-se completamente o tampão por agitação e secagem da placa em papel absorvente e centrifugação da placa em posição invertida para remover o tampão remanescente. Secou-se a placa ao ar durante 1 hora e armazenou-se à temperatura ambiente.
Preparou-se uma mistura de FVIIa/TF num tubo de microcentrífuga de 1,7 ml (tubo de microcentrífuga de baixa adesão de ISC Bioexpress) , num volume total de 450 μΐ por mistura de 9 μΐ de FVIIa (American Diagnostica, FVIIa de tipo selvagem ou uma variante respectiva a ser ensaiada) 250 nM com 337,5 μΐ de 2x TF (Innovin; Dade Behring; produto liofilizado ressuspendido em 10 mL de água destilada para gerar 2X TF, que é aproximadamente igual a 7 nM de TF lipidado) , 90 μΐ de 5x tampão de ensaio (Tris 500 mM pH 8,4, NaCl 500 mM, CaCÍ2 25 mM, BSA a 0,05%) e 13,5 μΐ de água, resultando numa solução contendo FVIIa 5 nM e TF 5,2 nM. Incubou-se a mistura à temperatura ambiente durante 5 minutos para permitir complexação dos componentes. A cada poço das 2 colunas na placa de ensaio de 96 poços com meia área transparente pré-tratada, adicionou-se 25 μΐ da respectiva mistura de FVIIa/sTF e cobriu-se a placa para evitar evaporação.
Dissolveu-se inicialmente TFPI humano recombinante (R&D Systems) em 33 μΐ de glicerol a 50% (v/v) para produzir uma solução-mãe 10 μΜ para armazenagem a -20 °C. Diluiu-se adicionalmente a solução-mãe de TFPI para 1,5 μΜ para um final de 1 x tampão (Tris 100 mM pH 8,4, NaCl 100 mM, CaCÍ2 5 mM, BSA a 0,01%) numa placa de armazenamento de polipropileno como se segue: para cada protease ensaiada, prepararam-se 87,5 μΐ de uma solução de TFPI 1,5 μΜ por mistura de 13,1 μΐ de TFPI 10 μΜ com 17,5 μΐ de 5x tampão de ensaio e 56,9 μΐ de água destilada. Prepararam-se diluições de 3 vezes em série da solução de TFPI em 1 χ tampão de ensaio por mistura de 27,5 μΐ de TFPI em 55 μΐ de 1 χ tampão de ensaio, tal que se geram soluções contendo TFPI 750 nM, 250 nM, 83,3 nM, 27,8 nM, 9,26 nM, 3,1 nM e 1,03 nM. O poço final da série continha apenas 1 χ tampão como um controlo.
Adicionaram-se 25 μΐ de cada diluição de TFPI a 2 poços (i.e. em duplicado) de 2 colunas de placa de ensaio de 96 poços com meia área transparente contendo a mistura de FVIIa/TF, tal que se ensaiou a mistura de protease em duplicado com cada diluição de TFPI. Adicionou-se igualmente uma solução de 1 χ tampão de ensaio sem TFPI a 2 poços contendo a mistura de FVIIa/TF como um controlo negativo. Agitou-se a placa brevemente e seguidamente centrifugou-se a 3000 rpm durante 5 minutos antes da incubação a 37 °C durante 1,5 horas.
Preparou-se uma solução-mãe de Spectrazyme Vila (American Diagnostica) por reconstituição de 50 pmoles em 5 ml de água destilada para 10 mM e armazenou-se a 4 °C até utilização. Imediatamente antes da utilização, diluiu-se a solução para 600 μΜ em água destilada. Após incubação da placa de ensaio anterior, adicionou-se 10 μΐ de Spectrazyme Vila diluída a cada poço da placa de ensaio. Misturaram-se as reações e incubou-se a placa a 37 °C. Mediu-se o aumento de absorvância a 405 nm de 30 em 30 segundos durante uma hora a 37 °C e calculou-se a taxa de absorvância usando o utilitário SoftMax Pro (Molecular Devices).
Para determinar o grau de inibição por TFPI, primeiramente dividiram-se as taxas de absorvância das reações de protease contendo TFPI pela taxa de absorvância das reações sem TFPI (a amostra de controlo) para obter a atividade fracionária e determinou-se o logio de cada concentração de TFPI. Usando o utilitário GraphPad Prism, representou-se graficamente o logio de [TFPI] relativamente à atividade fracionária para cada protease e gerou-se a curva de resposta à dose com um ajuste de curva que assumiu que os dados de atividade superior e inferior estão fixos a 1 e 0, respetivamente. Usou-se o utilitário para determinar a inibição por TFPI tanto como o valor de log IC50 (pICso) como IC50 absoluta (inibição de TFPI em nM) para cada protease e determinou-se a sua média e desvio padrão.
Determinou-se o nivel de inibição por TFPI de cada uma das variantes de FVIIa em complexo com TF lipidado (Innovin; Dade Behring) e expressou-se como o número de vezes de aumento da resistência a TFPI comparativamente a FVIIa de tipo selvagem (tabela 21).
B. Rastreio por ressonância plasmónica de superfície (SPR) de variantes de FVIIa para resistência a TFPI
Avaliou-se a resistência relativa de várias variantes de FVIIa a inibição por TFPI solúvel recombinante humano usando um ensaio de ressonância plasmónica de superfície (SPR) de alto rendimento com o instrumento Biacore T100. Avaliou-se a resistência relativa de variantes de FVIIa a inibição por TFPI por medição da quantidade relativa de variante de FVIIa ligada a TFPI solúvel imobilizado num chip de sensor Biacore CM5 comparativamente com a quantidade de FVIIa de tipo selvagem ligado subsequentemente a um tempo de injeção e concentração de protease padronizados.
Para cada experiência, imobilizou-se TFPI solúvel (R&D Systems) num novo chip sensor de 4 canais Biacore CM5 série S (GE Healthcare) usando o protocolo de acoplamento de amina disponível no utilitário de controlo de Biacore T-100 (GE Healthcare) e os reagentes proporcionados com o kit de acoplamento de amina (GE Healthcare). Utilizaram-se todos os quatro canais disponíveis para imobilização de duas densidades diferentes de TFPI e albumina de soro bovino (BSA), que serviu como um agente de bloqueamento nos canais de referência. Diluiu-se BSA para 5 pg/mL em acetato de sódio (pH 4,0) e imobilizou-se nos canais 1 a 3 a 1000 e 2000 unidades de resposta (RU), respetivamente. Para imobilização de TFPI, ressuspendeu-se TFPI solúvel liofilizado (10 pg) em 100 pL de 1 x tampão de acoplamento (Hepes 30 mM, NaCl 135 mM, EDTA 1 mM, Tween-20 a 0,01%, pH 7,4) para uma concentração de 0,1 mg/mL. Diluiu-se um total de 20 pL de TFPI a 0,1 mg/mL para 10 pg/mL em acetato de sódio pH 4,0 para imobilização nos canais 2 e 4 a 1000 e 2000 RU, respetivamente. Usou-se o tampão de acoplamento como tampão de corrida durante as etapas de imobilização.
Preparou-se cada amostra de FVIIa a uma concentração final de 320 nM em IX tampão de corrida (Hepes 20 mM, NaCl 150 mM, CaCl2 5 mM, PEG 8000 a 0,1%, BSA a 0,1%, Tween-20 a 0,01%, pH 7,4) contendo sTF 620 nM (fator III de coagulação humano; R&D Systems) . De um modo geral, diluiu-se cada variante de FVIIa 10 vezes em 1 χ tampão de corrida antes da diluição final de 320 nM. Prepararam-se complexos de FVIIa/sTF para um volume final de 120 pL em duplicado permitindo a carga de até 48 variantes de FVIIa únicos numa placa de armazenamento de 96 poços e avaliaram-se com injeções em duplicado numa única corrida. Incubou-se o complexo de FVIIa/sTF à temperatura ambiente durante 10-15 min antes do início da injeção da primeira amostra.
Criou-se um método padronizado de análise de ligação com o utilitário de controlo de Biacore (GE Healthcare) no qual cada replicado de FVIIa é injetado durante 180 segundos de tempo de associação seguido por uns curtos 60 segundos de dissociação a um caudal de 10 pL/min. Regenerou-se o chip sensor após a fase de dissociação durante 30 segundos com glicina 10 mM, NaCl 500 mM, pH 3,0 e seguidamente um período de estabilização de 60 segundos com IX tampão de corrida ao mesmo caudal de 10 pL/min. Registaram-se dois pontos de referência do ensaio para cada corrida e análise de dados subsequente, urn aos 5 segundos antes da conclusão da fase de associação (ligação) e urn segundo foi registado 5 segundos antes da conclusão da fase de dissociação (dissociação) . Antes de iniciar um ensaio completo, testou-se o chip sensor com uma injeção única de FVIIa de tipo selvagem 320 nM/sTF durante 180 segundos, que deveria dar uma resposta de aproximadamente 400-450 RU e 750-850 RU para ligação aos canais 2 (1000 RU) e 4 (200 RU), respetivamente.
Efetuou-se análise de dados primeiramente com o utilitário de avaliação Biacore T100 (GE Healthcare) para inspecionar os parâmetros de validação do ensaio, que incluem verificar que ocorre a ligação à célula de referência é mínima, o desvio da linha de base e injeções de ligação de branco de controlo (tampão de corrida). Geraram-se tabelas de dados com esta aplicação que indicaram a quantidade de variante de FVIIa ligada (em RU) tanto no ponto relatado para ligação como no ponto relatado para dissociação. As tabelas de dados foram subsequentemente exportadas para análise adicional no ambiente da folha de cálculo Microsoft Excel. Corrigiram-se os pontos experimentais em bruto (RU de ligação) para a ligação de controlo ao chip sensor e seguidamente determinou-se para cada parâmetro a razão entre a quantidade de FVIIa de tipo selvagem ligada (em RU) e a quantidade de variante de FVIIa ligada (em RU) para cada parâmetro e relatou-se como Ligação (tipo selvagem/variante) e Dissociação (tipo selvagem/variante). A tabela 22 apresenta os resultados do estudo. A resistência à inibição por TFPI reflete-se como um aumento na razão para um ou para ambos os parâmetros avaliados. Por exemplo, um valor de Ligação (tipo selvagem/variante) ou de Dissociação (tipo selvagem/variante) de 20 para uma variante de FVIIa específica indica que a variante é 20 vezes mais resistente a inibição por TFPI do que FVIIa de tipo selvagem. Várias variantes apresentaram resistência aumentada à inibição por TFPI. Por exemplo, as variantes contendo a mutação K341D (numeração de FVII maduro) tais como Q286R/M298Q/K341D-FVIIa, Q286R/K341D-FVIIa e M298Q/K341D-FVIIa, têm razões indicativas de resistência significativa a TFPI (superior a 40-150 vezes). Em alguns casos a taxa de dissociação foi mais afetada do que a taxa de associação.
Exemplo 9
Análise farmacocinética de polipéptidos de FVIIa
Avaliaram-se as propriedades farmacocinéticas dos polipéptidos de FVIIa por medição da quantidade de fator Vila humano em plasma de ratinho. Podem usar-se dois ensaios para quantificar FVIIa no plasma. Pode usar-se um ELISA para quantificar a proteína FVIIa total em plasma de ratinho e usa-se um ensaio de coagulação dependente de FVIIa (FVIIa:C) para quantificar a atividade coagulante dos polipéptidos de FVIIa no plasma. A. Administração de polipéptidos de FVIIa a ratinhos
Avaliaram-se polipéptidos de FVIIa modificados e proteína não modificada FVIIa humana recombinante (rhFVIIa) (NovoSeven®, Novo Nordisk) em estudos de farmacocinética. Para cada estudo, injetaram-se 18 ratinhos CD-I macho com uma dose em bolus intravenoso (0,1-3,0 mg/kg, dependendo do estudo) de rFVIIa. Aos 5, 15, 30, 60, 120 e 240 minutos após a injeção, submeteram-se a eutanásia três ratinhos de cada protocolo de injeção usando asfixia com CO2 e retirou-se aproximadamente 1,0 mL de sangue para uma seringa de 1,0 mL através de uma punção cardíaca percutânea. Pré-carregou-se cada seringa com citrato de sódio suficiente para obter uma concentração final de 3,2% em 1 mL de sangue. Centrifugaram-se então as amostras de sangue a 9000 rpm durante 8 min a 4 °C. Removeu-se o plasma para tubos individuais de 1,5 ml (Eppendorf) marcados, congelaram-se instantaneamente em azoto líquido e armazenaram-se a -80 °C. Adicionalmente, injetou-se um ratinho por experiência com veículo sozinho (simulado) e usou-se plasma deste ratinho para determinação da atividade basal de FVIIa.
B. Ensaio de ELISA
Usou-se um kit disponível comercialmente de ELISA de fator VII IMUBIND® (American Diagnostica) para detetar proteína FVII em soro por ELISA. Este kit utiliza uma placa pré-revestida com um anticorpo anti-FVII/FVIIa para capturar a proteína e um anticorpo anti-FVII biotinilado para detecção através de peroxidase de rábano marcada com estreptavidina. Usou-se o kit segundo as instruções do fabricante com as seguintes exceções: primeiramente, encurtou-se a curva padrão para assegurar uma gama linear ao longo de toda a gama de concentração e abranger as concentrações de 0,88 ng/ml a 10 ng/ml; em segundo lugar, pode usar-se a própria variante de FVIIa purificada para a curva padrão em vez do padrão de FVII proporcionado com o kit devido às diferenças na afinidade do anticorpo. As experiências indicaram que o complexo de FVIIa com anti-trombina III (ATUI), um potencial inibidor plasmático de FVIIa, é detetado a 75% do nivel de protease livre, assegurando que o ensaio pode detetar o FVIIa total na amostra de plasma tanto na forma ativa como na forma inativa.
Sucintamente, descongelaram-se as amostras de plasma à temperatura ambiente e diluíram-se 10 vezes em tampão de amostra (PBS + Triton X-100 a 0,1% + BSA a 1,0%) e seguidamente diluíram-se em série 5,5 vezes para quatro diluições. As quatro amostras diluídas foram diluídas 2 vezes para a placa de ELISA para diluições de amostra finais de 20, 110, 605 e 3327,5 vezes. Estas quatro diluições de plasma de ratinho abrangeram uma gama de concentrações de protease de 33 000 ng/ml a 20 ng/ml. Mediu-se cada amostra em duas placas de ensaio independentes e usaram-se essas medidas incluídas na gama da curva padrão para calcular a concentração de variantes de FVIIa na amostra de plasma. C. Ensaio de coagulação
Usou-se um kit disponível comercialmente (STACLOT FVIIa-rTF, Diagnostica Stago, Parsippany, NJ) como o ensaio de coagulação. Para determinar a atividade coagulante dos polipéptidos de FVIIa ativos, ensaiaram-se amostras de plasma usando em ensaio de coagulação dependente de FVIIa (FVIIa:C). Efetuou-se o ensaio usando reagentes e instruções proporcionados num kit comercial e mediu-se o tempo de coagulação utilizando um instrumento eletromecânico de detecção de coágulo (STArt4, Diagnostica Stago, Parsippany, NJ) . Usou-se o kit de acordo com as instruções do fabricante com as seguintes exceções: primeiramente, usou-se a própria variante de FVIIa purificada para a curva padrão em vez do padrão de rhFVIIa proporcionado com o kit; em segundo lugar, usaram-se os seguintes reagentes comerciais genéricos para os ensaios de rastreio de farmacocinética convencionais e proporcionaram resultados comparáveis aos reagentes do kit: fator tecidular solúvel (CalBioChem, La Jolla, Ca) e mistura de fosfolipidos sintéticos (Avanti Polar Lipids, Alabaster, AL), tampão TBSA (Tris-NaCl, pH 7,5 com BSA a 1%; DiaPharma, West Chester, Ohio) e solução de cloreto de cálcio 25 μΜ (Diagnostica Stago, Parsippany, NJ) .
Efetuou-se o ensaio de coagulação como se segue. Descongelaram-se à temperatura ambiente durante aproximadamente 45 min as amostras de plasma congeladas e seguidamente diluiram-se 1:5000 em tampão. Combinaram-se 50 μΐ do plasma diluído com 50 pL de plasma humano deficiente em fator VII e 50 pL de fator tecidular relipidado e pré-incubaram-se durante 180 segundos. Após pré-incubação, adicionou-se 50 pL de solução de cloreto de cálcio (25 pM) para iniciar a coagulação. Determinou-se o tempo de coagulação usando detecção eletromecânica de coágulo. Ensaiou-se cada amostra de plasma em duplicado. Calibrou-se o sistema por construção de uma curva padrão usando o tempo de coagulação das diluições em série de tampão contendo uma quantidade conhecida da variante de FVIIa específica a ser ensaiada. Calcularam-se as concentrações de FVIIa em amostras de plasma de ratinho a partir da parte linear da curva padrão de log de FVIIa em função de log de tempo de coagulação. A capacidade das amostras de plasma induzirem coagulação em plasma deficiente em fator VII foi relatada como ng FVIIa/mL de plasma de ratinho após subtração de linha de base de FVIIa de tipo selvagem endógeno em plasma de ratinhos com simulação de tratamento.
Determinou-se rotineiramente a semivida de cada proteína de FVII fazendo um ajuste convencional do logaritmo natural da atividade a uma linha reta e medindo o tempo que demora para a atividade das proteínas de FVIIa ser reduzida para metade. Para as proteínas de FVII com decaimento multiexponencial, determinou-se uma semivida a partir da parte terminal do perfil de log de plasma em função do tempo. Calcularam-se parâmetros f armacocinét icos adicionais como se segue: AUCo-inf em plasma/dose (calculado como [AUC(o-t) + Ct/(In2/Tú) ] , em que t é o último ponto temporal com concentração plasmática
mensurável do polipéptido de FVIIa dividido pela dose IV (mg/kg)); semivida (semivida do polipéptido de FVIIa durante a fase terminal do perfil de concentração plasmática de FVIIa relativamente ao tempo; calcula-se 1½ como -ln2 dividido pelo declive negativo durante a fase terminal da representação gráfica da curva de logaritmo linear da concentração plasmática de FVIIa relativamente ao tempo); MRTo-fmai (tempo médio de residência do polipéptido de FVIIa no organismo; calculado como AUMCo-fmai/AUCo-fmai, em que AUMCo-finai é a área total debaixo da curva de primeiro momento relativamente ao tempo (curva temporal de concentração de FVIIa relativamente ao tempo) e calcula-se pela regra do trapezoide linear); Cl (depuração sistémica; calculada como dose / AUCo-mf) ; e Vd (volume de distribuição baseado na eliminação terminal e na constante (β) ; calculado como [Cl/ (ln2/TC) ] ) . D. Propriedades farmacocinéticas de variantes de FVIIa
Usando o protocolo de FVIIa:C anteriormente descrito, avaliaram-se as propriedades farmacocinéticas de FVIIa de tipo selvagem e variantes de FVIIa com base na atividade de coagulação do plasma. Apresentam-se os resultados na tabela 23. Várias variantes de FVIIa apresentaram parâmetros farmacocinéticos melhorados comparativamente a FVIIa de tipo selvagem.
= semivida alfa, que mede a semivida da distribçlo = semivida beta, que mede a semivida da elimição A tabela 24 apresenta os resultados do estudo usando os seguintes parâmetros farmacocinéticos: % de recuperação (in vivo) (a concentração plasmática medida de FVIIa aos 5 minutos pós-dose (primeiro ponto temporal) dividido pela concentração plasmática teórica máxima de FVIIa (com base na massa de FVIIa administrada e no volume teórico de sangue total) vezes 100%); % de recuperação (in vitro) (concentração medida de FVIIa em plasma com adição de uma quantidade conhecida de FVIIa dividida pela concentração plasmática teórica de FVIIa (com base na quantidade de massa de FVIIa que se acrescentou a um volume plasmático conhecido) vezes 100%); AUC*atividade/dose (dependente de TF) (AUC plasmática/dose multiplicado pela atividade indireta dependente de TF (consultar tabela 15, anteriormente); melhoria da exposição de atividade relativamente a NovoSeven® FVIIa (dependente de TF) (calculado por AUC*atividade/dose (dependente de TF) Novoseven® fviih/ AUC*atividade/dose (dependente de TF)Fvna mutante) ; AUC*atividade/dose (independente de TF) (AUC plasmática/dose multiplicado pela atividade indireta independente de TF (consultar tabela 15, anteriormente); melhoria da exposição de atividade relativamente a NovoSeven® FVIIa (independente de TF) (calculado por AUC*atividade/dose (independente de TF) Novoseven® Fviia/ AUC * at i vi dade / do s e (independente de TF)Fvna mutante) ·
Exemplo 10
Determinação da ligação de fator Vila a fator tecidular solúvel
Avaliou-se a capacidade das variantes de FVIIa expressas a partir de células HEK 293 ou BHK se ligarem a fator tecidular solúvel (sTF) usando ressonância plasmónica de superfície de Biacore. Avaliaram-se as variantes de FVIIa através da medição do perfil de ligação a três concentrações de protease em duas experiências em duplicado, usando dois níveis diferentes de sTF ligado a um chip CM5 de Biacore.
Acoplou-se um novo sensor de chip CM5 da série S (GE Healthcare n2 de catálogo BR1006-68) com albumina de soro bovino e fator tecidular solúvel usando um instrumento Biacore T100. Efetuou-se o acoplamento usando um tampão de acoplamento Biacore (Na Hepes 30 mM pH 7,4, NaCl 135 mM, EDTA 1 mM, Tween-20 a 0,01%) com um kit de acoplamento de amina (GE Healthcare n2 de catálogo BR-1000-50) e o construtor de protocolos do utilitário Biacore T100. Para a imobilização, usaram-se todos os 4 canais do chip. Acoplaram-se os canais 1 e 3 com 500 unidades de resposta (RU) com uma referência de proteína de albumina de soro bovino diluída em tampão de acetato, pH 4,0 e acoplaram-se os canais 2 e 4 com 500 e 250 RU de sTF (R&D Systems) diluída em tampão de acetato, pH 4,5.
Testou-se cada variante de FVIIa e a protease de FVIIa de tipo selvagem a três concentrações e em duplicado. Diluíram-se as proteases para 60 nM, 30 nM e 15 nM em 100 pL de tampão de ensaio de Biacore (Na Hepes 20 mM, pH 7,4, NaCl 150 mM, CaCl2 5 mM, PEG 8000 a 0,1 %, BSA a 0,1%, Tween-20 a 0,01%) numa placa de ensaio de 96 poços. Ensaiou-se cada amostra no instrumento Biacore T100 usando 120 segundos de tempo de contacto seguido de 180 segundos de tempo de dissociação a um caudal de 10 pL/min. Ensaiou-se também um branco de tampão. Regenerou-se o chip com EDTA 50 mM, pH 7,0 durante 60 segundos e seguidamente 30 segundos. O ensaio para medir a ligação de FVIIa de tipo selvagem a sTF deve proporcionar três conjuntos de curvas que dão um Kd de aproximadamente 8 nM.
Usou-se o utilitário de avaliação de Biacore T100 para analisar os dados. Especificamente, usou-se a análise de ligação cinética/afinidade 1:1, que ajusta os dados a uma isotérmica de Langmuir e ajustaram-se individualmente os dados para dois replicados de cada variante a dois acoplamentos de unidades de resposta. Fez-se a média dos quatro valores ajustados de Kd e apresentam-se na tabela 25. As variantes de FVIIa contendo a mutação M298Q exibiram tendencialmente resultados menores para Kd e portanto ligam-se mais fortemente a sTF.
Efetuou-se um conjunto adicional de experiências para avaliar a ligação de variantes de FVIIa a TF solúvel usando o mesmo ensaio tal como descrito anteriormente, mas com uma modificação da gama de dosagem de FVIIa para 30 nM, 15 nM e 7,5 nM e análise de dados de modo a usar o modelo de dois estados para ajustar os dados de SPR. Esta análise de modelo de dois estados foi introduzida no sistema de utilitário de avaliação Biacore T100 e reproduz-se seguidamente. Os resultados são apresentados na tabela 26, seguidamente.
t produzido em células CHOX § produzido na linha celular estável CHOX clone 52-5F7
Exemplo 11
Inibição de variantes de FVIIa por Zn2+
Ensaiaram-se as variantes de FVIIa, expressas a partir de células HEK 293 ou BHK, para resistência à inibição por Zn2+ tanto na presença como na ausência de fator tecidular solúvel. Sucintamente, diluiu-se ZnCÍ2 (Aldrich) para 20 mM em H2O destilada e seguidamente para 4 mM em 1 χ tampão de ensaio (Na Hepes 50 mM, pH 7,5, NaCl 100 mM, CaCÍ2 1,5 mM, Tween-20 a 0,01%, PEG 8000 a 0,01%) . Efetuaram-se diluições em série de 2 vezes para gerar onze concentrações de zinco, até 3, 9 μΜ, ao longo de uma placa de 96 poços. O poço final da linha continha tampão sem zinco para medir a atividade proteolítica de FVIIa sem inibição. Diluíram-se as variantes de FVIIa e a protease de tipo selvagem para 500 nM e seguidamente 10 vezes para 50 nM. Usou-se esta solução-mãe 50 nM para ensaios efetuados sem fator tecidular solúvel (sTF, R&D Systems). Para ensaios com fator tecidular solúvel, diluiu-se novamente protease em IX tampão de ensaio com sTF para concentrações finais de 12,5 nM e 125 nM, respetivamente. Pré-incubaram-se as soluções pelo menos 5 minutos à temperatura ambiente.
Para iniciar a reação de inibição, misturaram-se 20 pL de solução de FVIIa/sTF ou de FVIIa com 60 pL da série de zinco para cada fila para dez concentrações. Para as reações de inibição com FVIIa sozinho, iniciaram-se as misturas usando ZnCÍ2 2 mM e para FVIIa/sTF, iniciaram-se usando ZnCÍ2 4 mM. Incubou-se a placa durante 30 minutos à temperatura ambiente.
Para ensaiar a inibição por Zn2+, adicionou-se aos poços 20 pL de substrato de FVIIa (mesil-dFPR-ACC, dissolvido até 20 mM em DMSO e diluído em tampão de ensaio) para uma concentração final de 90 μΜ. Mantiveram-se as concentrações de sTF e zinco no ensaio pela sua adição tal como adequado à solução de substrato. Mediu-se o aumento de fluorescência (Ex: 380 nm, Em: 460 nm) durante 60 minutos a 30 °C num leitor de placas Spectramax Gemini M5 (Molecular Devices). Calculou-se a atividade proteolítica residual a cada concentração de zinco por divisão da velocidade inibida pela velocidade de protease não inibida. Calculou-se a concentração de Zn2+ necessária para inibir metade da atividade proteolítica (Ko,s) pela representação gráfica da concentração de zinco em função da atividade residual e ajuste com uma equação hiperbólica usando o utilitário XLFit4 (IDBS) . Ensaiou-se cada protease duas vezes em duas ocasiões independentes para obter um valor médio para K0,s.
Apresentam-se os resultados na tabela 27. As mutações H257 e H216 aumentaram a resistência em aproximadamente 3 vezes. As mutações M268Q também aumentaram a resistência ao zinco em 3 vezes. Em todos os casos, o efeito foi mantido em graus diferentes quando se combinaram com mutações adicionais. As variantes mais resistentes foram combinações das mutações anteriores: H216A/H257A-FVIIa e H257A/M298Q-FVIIa.
Exemplo 12
Determinação da concentração de protease cataliticamente ativa usando o titulante de local ativo 4-metilumbeliferil-p' - guanidinobenzoato (MUGB)
Em algumas situações determinou-se a concentração de FVIIa ativo cataliticamente numa solução-mãe por titulação de um complexo de FVIIa e fator tecidular solúvel (sTF) com 4-metilumbeliferil-p'-guanidinobenzoato (MUGB), um substrato que é um éster fluorogénico desenvolvido como um local ativo para protease de serina do tipo tripsina. Efetuou-se o ensaio essencialmente como descrito por Payne et ai. (Biochemistry (1996) 35:7100-7106) com algumas pequenas modificações. O MUGB reage facilmente com FVIIa, mas não com FVII ou com protease inativa, para formar um intermediário acil-enzima efetivamente estável em condições nas quais a concentração de MUGB é saturante e a desacilação é especialmente lenta e é o passo limitante para a catálise. Nestas condições, a protease de FVIIa sofre apenas um ciclo catalítico para libertar o fluoróforo 4-metilumbeliferona (4-MU). Ao calibrar o aumento repentino inicial de fluorescência com uma curva padrão de concentração externa de fluorescência de 4-MU, pode calcular-se a concentração de locais ativos.
Efetuaram-se os ensaios com um volume reacional de 1 mL ou 2 mL em células de quartzo com 0,4 cm x 1 cm ou 1 cm x 1 cm, respetivamente, com agitação contínua. Cada reação continha sTF (humano, R&D Systems) 0,5 μΜ num tampão de ensaio contendo Hepes 50 mM, NaCl 100 mM, CaCÍ2 5 mM e PEG 8000 a 0,1%, pH 7,6. A solução padrão de 4-MU foi preparada de fresco para uma concentração da solução-mãe de 0,5 M em DMSO e confirmou-se a concentração por espectroscopia de absorvância a 360 nm usando um coeficiente de extinção de 19 000 M^cirr1 em tampão Tris 50 mM, pH 9,0. Preparou-se MUGB a uma concentração da solução-mãe de 0,04 M em DMSO com base no peso seco. Iniciaram-se os ensaios por adição de 4 pL de MUGB 4 mM (para a reação de 2,0 mL) ou MUGB 2 mM (para a reação de 1,0 mL) (em cada caso para uma concentração final de 8 μΜ) a uma solução de sTF 0,5 μΜ (20,2 pL ou 10,1 pL de sTF 49,4 pM) em 1 χ tampão de ensaio e medindo primeiramente a hidrólise de linha de base de MUGB durante 150-200 segundos antes da adição de FVIIa ou variante de FVIIa para uma concentração final de 100-200 nM com base no ELISA inicial (exemplo 1C.1) ou na titulação do local ativo com FFR-CMK (exemplo 3). A libertação da fluorescência de 4-MU na fase de aumento repentino da reação foi seguida por 1000-1200 segundos adicionais. Preparou-se uma curva padrão de 4-MU livre por titulação de 4-MU com absorção calibrada para 1 x tampão de ensaio contendo sTF 0,5 μΜ com adições de 20 nM para uma concentração final de 260-300 nM.
Para análise de dados, importaram-se os dados temporais correspondentes à reação para o pacote utilitário Graphpad Prism e subtraiu-se da curva a contribuição da hidrólise de linha de base por extrapolação da velocidade medida inicialmente de hidrólise espontânea de MUGB, que foi tipicamente inferior a 5% do aumento repentino de fluorescência total. Ajustou-se a curva corrigida a uma única equação exponencial com uma componente linear (para ter em consideração a velocidade lenta de desacilação) sob a forma Fluoreência = Amp (1 -e~kt) +Bt, em que Amp = amplitude da fase de aumento repentino nas condições de ensaio saturantes descritas anteriormente, k é a constante de velocidade de primeira ordem observada para formação de acil-enzima e B é a constante de velocidade global associada ao ciclo catalítico total de MUGB. Calcula-se a concentração de protease de FVIIa ativa por comparação do parâmetro de ajuste para a amplitude com a curva padrão de 4-MU. Mediram-se os valores de vários ensaios, fez-se a média e determinou-se o desvio padrão.
Exemplo 13
Atividade especifica de variante de polipéptidos de FVIIa
para mesil-dFPR-ACC
Para avaliar a atividade de variantes de FVIIa, determinou-se a atividade (atividade/mole) de polipéptidos de FVIIa para clivagem de um substrato tripeptídico ACC (mesil-dFPR-ACC) sob um conjunto de condições de ensaio padronizadas. O ensaio envolveu uma pré-incubação de polipéptidos de FVIIa com uma quantidade saturante de sTF antes da diluição no substrato mesil-dFPR-ACC. Seguiram-se então as velocidades iniciais de clivagem de substrato por avaliação do aumento de fluorescência de ACC. Normalizaram-se as velocidades iniciais de libertação de fluorescência a uma curva padrão de ACC interna e relataram-se os dados como pmol/s/pmol FVIIa.
Para preparar as reações, diluíu-se cada amostra de FVIIa a ser ensaiada para 200 nM numa placa de armazenamento de polipropileno em 1 x tampão de ensaio (Hepes 20 mM, NaCl 150 mM, CaCl2 5 mM, BSA a 0,1%, PEG-8000 a 0,1%, pH 7,5). Quando necessário, preparou-se uma diluição 1:10 da solução-mãe de FVIIa de modo a que o volume mínimo pipetado fosse de 5 pL. Preparou-se uma diluição da solução-mãe de fator tecidular solúvel (sTF) (R&D Systems) para uma concentração final de 1,0 μΜ com um volume apropriado de IX tampão de ensaio necessário para o rastreio de 8 a 32 proteases/placa. Por exemplo, quando se ensaiam 8 proteases, são necessários 1,0 mL de sTF 1,0 μΜ por placa, enquanto para ensaiar 32 proteases, são necessários 2,5 mL de sTF por placa. Complexaram-se as amostras de FVIIa com sTF a uma concentração final de FVIIa 100 nM/sTF 500 nM num volume de ensaio de 50 pL por mistura de 25 pL de variante de FVIIa 200 nM com 25 pL de sTF 1,0 μΜ na placa de armazenamento de polipropileno. Incubaram-se então as reações do complexo FVIIa/sTF à temperatura ambiente durante 15 minutos para atingir o equilíbrio. Após o período de equilíbrio, adicionou-se 10 pL de cada reação de complexo FVIIa/sTF na linha correspondente de uma placa de ensaio de 96 poços com meia área negra (Costar). Ensaiaram-se as variantes de FVIIa e os controlos em triplicado. Preparou-se o substrato mesil-dFPR-ACC para uma concentração final de 1,1X de 0,09 mM para ter em conta a diluição 1:10 do polipéptido de FVIIa no substrato. Para uma placa de meia área de 96 poços completa prepararam-se 20 mL do substrato mesil-dFPR-ACC 0,1 mM em IX tampão de ensaio por diluição da solução-mãe de substrato armazenada em DMSO seco.
Correu-se o ensaio numa estação de trabalho automática BioMek® FX (Beckman Coulter) equipada com uma cabeça de 96 pontas (pontas de 130 pL MBP BioRobotix ART®). Colocou-se a placa de ensaio (onde se colocou previamente 10 pL das reações de FVIIa/sTF) na plataforma da estação de trabalho com um reservatório de canal único cheio com a solução de 1,1 X mesil-dFPR-ACC. Programou-se a temperatura do leitor de placas para 37 °C. A estação de trabalho BioMek® FX iniciou o ensaio por transferência de 90 pL a partir do reservatório de canal único cheio com 1,1X substrato mesil-dFPR-ACC para cada poço da placa de ensaio negra contendo 10 pL de FVIIa/sTF. As concentrações finais das variantes de FVIIa, sTF e mesil-dFPR-ACC no ensaio foram de 10 nM, 50 nM e 0,09 mM, respetivamente. A estação de trabalho misturou então duas vezes 70 pL da amostra de 100 pL. Transferiu-se a placa de ensaio negra para um leitor de placas SpectraMax Gemini (Molecular Devices) e seguiram-se as velocidades iniciais de reação durante 10 min a 37 °C.
Após a finalização do ensaio, leu-se uma placa contendo uma curva padrão de ACC livre (100 pL/poço) no mesmo leitor de placas SpectraMax Gemini e usou-se para proporcionar uma conversão correta de RFU/s para pM/s. Preparou-se a placa padrão como se segue. Em todos os poços com "numeração par" (i.e. poço sim, poço não) da linha de cima de uma placa de ensaio de 96 poços com meia área negra, diluiu-se a amostra de ACC 1 mM para 25 nM em IX tampão de ensaio para um volume final de 200 pL (5 pL ACC 1 mM em 195 pL de lx tampão de ensaio) . Pipetou-se 100 pL de lx tampão de ensaio para todos os poços remanescentes das colunas com "numeração par". Diluiu-se em série o substrato ACC 1:1 ao longo das colunas par para gerar mais 6 concentrações de ACC. Deixou-se a linha final com apenas 100 pL de lx tampão de ensaio (i.e. sem ACC) . Mediu-se a fluorescência usando uma versão de leitura de ponto final das condições de ensaio e representou-se um gráfico de fluorescência em função da concentração de ACC. O declive da reta que atravessa esses pontos deu o fator de conversão de RFU para pM.
Recorreu-se ao utilitário SoftMax Pro (Molecular Devices) para analisar os dados da leitura da placa assim como da reta padrão. Guardou-se o ficheiro contendo os dados e exportou-se como um ficheiro de texto ASCII, que foi importado para um programa de Microsoft Excel, processado e analisado usando um molde criado em Microsoft Excel. Após importação dos dados para o molde de Microsoft Excel, calculou-se a conversão média RFU/pM a partir do declive da reta padrão de ACC e usou-se para proporcionar um fator de conversão que alterou os dados da placa de RFU/s para a medição de atividade em pM/s. Avaliaram-se todos os valores em triplicado para pontos excêntricos, que se excluíram caso necessário. Expressou-se a atividade especifica de cada variante de FVIIa e de controlos de tipo selvagem em unidades de pmol/s/pmol e calcularam-se com as seguintes expressões: Média dos dados (RFU/s)*fator de conversão (RFU/μΜ) = Atividade (em μΜ/s)
Atividade especifica (em pmol/s/pmol) = [(μΜ/s)*(100 pL) * (1/1 000 000) ] / [ (10 nM) *(100 pL)*(l/l 000 0 0 0 ) * (1 /10 0 0 ) ] A tabela 28 apresenta a atividade especifica das variantes de FVIIa que foram ensaiadas, incluindo a atividade relativa de FVIIa de tipo selvagem. Também se incluem os desvios padrão (DP) e os coeficientes de variação (como percentagem; %CV) . Várias variantes de FVIIa apresentaram aumento da atividade especifica para clivagem de mesil-dFPR-ACC comparativamente ao polipéptido de FVIIa de tipo selvagem. Por exemplo, Q366V-FVIIa apresentou atividade especifica para clivagem de mesil-dFPR-ACC que foi 4 vezes superior à observada com a variante de FVIIa de tipo selvagem. As variantes de FVIIa contendo a mutação H373F também tiveram tendência a apresentar aumento da atividade especifica para clivagem de mesil-dFPR-ACC comparativamente ao polipéptido de FVIIa de tipo selvagem.
Exemplo 15
Ativação de FX e determinação da concentração de protease ativa cataliticamente usando o titulante de local ativo fluoresceína-mono-p' -guanidinobenzoato (FMGB)
Determinou-se a concentração de fator X (FX) , que é capaz de se tornar ativo cataliticamente, numa solução-mãe do zimogénio por ativação de amostras FX com veneno de vibora de Russel (RVV-ase) seguido por titulação do fator X ativo (FXa) com fluoresceína-mono-p' -guanidinobenzoato (FMGB), substrato de éster fluorogénico desenvolvido como um titulante de local ativo para proteases de serina do tipo tripsina. Após ativação, efetuou-se o ensaio de titulação de local ativo essencialmente tal como descrito por Bock et ai. (Archives of Biochemistry and Biophysics (1989) 273:375-388) com algumas pequenas modificações. 0 FMGB reage facilmente com FXa, mas não com FX ou com protease inativa, para formar um intermediário acil-enzima efetivamente estável sob condições nas quais a concentração de FMGB é saturante e a desacilação é especialmente lenta e constitui o passo limitante da catálise. Nestas condições, a protease de FXa sofre apenas um ciclo catalítico para libertar o fluoróforo de fluoresceína. Quando o aumento repentino inicial da fluorescência é calibrado por uma curva padrão de concentração de fluorescência de fluoresceína externa, pode calcular-se a concentração de locais ativos.
Prepararam-se as reações de ativação de FXa a uma concentração final de FX de 10 μΜ (com base na absorvância A280 e num coeficiente de extinção de 1,16) num volume final de 50 - 100 pL num tampão de reação contendo Tris 100 mM, NaCl 50 mM, CaCl2 5 mM, PEG 8000 a 0,1%, pH 8,1. Iniciou-se a ativação por adição de RVV-ase para uma concentração final de 5 pg/mL (5 pL de uma diluição de 98 pg/mL por 100 pL de reação ou 2,5 pL por 50 pL de reação) a 37 °C durante 45-60 min de tempo de ativação (anteriormente determinado como representando ativação completa por recolha de amostras de 15 em 15 min e ensaiando o aumento de clivagem do substrato fluorogénico Spectrafluor FXa). Extinguiram-se as reações com 1/10 de volume de tampão de extinção contendo Tris 100 mM, NaCl 50 mM, 5 mM, EDTA 100 mM, PEG 8000 a 0,1%, pH 8,1.
Efetuaram-se ensaios com a volume de reação de 1 mL numa célula de quartzo de 0,4 cm x 1 cm com agitação contínua. As reações continham 100-400 nM de FXa recém-ativado e FMGB 5 pM num tampão de ensaio contendo Hepes 30 mM, NaCl 135 mM, EDTA 1 mM e PEG 8000 a 0,1%, pH 7,4. A solução padrão de fluoresceína foi preparada de fresco para uma concentração de solução-mãe de 7 0 mM em DMF e a concentração foi confirmada por espectroscopia de absorvância em condições padrão a 496 nm usando um coeficiente de extinção de 89, 125 M^cirr1 em NaOH 0,1 N. Preparou-se FMGB a uma concentração de solução-mãe de 0,01 M em DMF com base no peso seco e confirmou-se a concentração por espectroscopia de absorvância a 452 nm usando um coeficiente de extinção de 19,498 em solução salina tamponada de fosfato (PBS), pH 7,2. Iniciaram-se os ensaios por adição de 5 pL de FMGB 1 mM (concentração final de 5 μΜ) a 1 x tampão de ensaio e medindo inicialmente a hidrólise basal de FMGB durante -150-200 segundos antes da adição de FXa para uma concentração final de - 100-400 nM com base na concentração inicial determinada por absorvância antes da ativação por RVV-ase (consultar anteriormente). A libertação de fluorescência de fluoresceina na fase de aumento repentino da reação foi seguida por 3600 segundos adicionais. Preparou-se uma curva padrão de fluoresceina livre por titulação de um padrão de fluoresceina calibrado por absorvância por 1 x tampão de ensaio em adições de 20 nM para uma concentração final de 260-300 nM.
Para análise de dados, importaram-se os dados temporais correspondentes à reação para o pacote utilitário Graphpad Prism e subtraiu-se da curva a contribuição da hidrólise de linha de base por extrapolação da velocidade medida inicialmente de hidrólise espontânea de FMGB, que foi tipicamente inferior a 5% do aumento repentino de fluorescência total. Ajustou-se a curva corrigida a uma única equação exponencial com uma componente linear (para ter em consideração a velocidade lenta de desacilação) sob a forma Fluoreência = Amp (1 -e~kt) +Bt, em que Amp = amplitude da fase de aumento repentino nas condições de ensaio saturantes descritas anteriormente, k é a constante de velocidade de primeira ordem observada para formação de acil-enzima e B é a constante de velocidade global associada ao ciclo catalítico total de FMGB. Calcula-se a concentração de protease de FXa ativa por comparação do parâmetro de ajuste para a amplitude com a curva padrão de fluoresceina. Mediram-se os valores de vários ensaios, fez-se a média e determinou-se o desvio padrão. Consequentemente, a quantidade de FXa ativo na preparação representa diretamente a concentração de FX numa preparação de solução-mãe, que pode ser ativada por FVIIa. Este valor titulado para o local ativo é usado quando se calcula a concentração de FX a usar num ensaio indireto tal como os ensaios dependentes de TF e independentes de TF descritos no exemplo 4.
Dado que as modificações serão óbvias para os peritos na especialidade, pretende-se que esta invenção seja limitada apenas pelo âmbito das reivindicações anexas.
LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS <110> Catalyst Biosciences, Inc.
Edwin Madison Christopher Thanos
<120> POLIPÉPTIDOS DE FACTOR VII QUE ESTÃO MODIFICADOS E SUAS UTILIZAÇÕES
<130> 119357-00101/4919PC <140> Ainda não atribuído <141> Com o presente <150> 61/124,021 <151> 2008-04-11 <160> 371 <170> FastSEQ for Windows Version 4.0
<210> 1 <211> 466 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Isoforma a do precursor do Factor VII <400> 1
Met Vai Ser Gin Ala Leu Arg Leu Leu Cys Leu Leu Leu Gly Leu Gin 15 10 15
Gly Cys Leu Ala Ala Gly Gly Vai Ala Lys Ala Ser Gly Gly Glu Thr 20 25 30
Arg Asp Met Pro Trp Lys Pro Gly Pro His Arg Vai Phe Vai Thr Gin 35 40 45
Glu Glu Ala His Gly Vai Leu His Arg Arg Arg Arg Ala Asn Ala Phe 50 55 60
Leu Glu Glu Leu Arg Pro Gly Ser Leu Glu Arg Glu Cys Lys Glu Glu 65 70 75 80
Gin Cys Ser Phe Glu Glu Ala Arg Glu lie Phe Lys Asp Ala Glu Arg 85 90 95
Thr Lys Leu Phe Trp Ile Ser Tyr Ser Asp Gly Asp Gin Cys Ala Ser 100 105 110
Ser Pro Cys Gin Asn Gly Gly Ser Cys Lys Asp Gin Leu Gin Ser Tyr 115 120 125 lie Cys Phe Cys Leu Pro Ala Phe Glu Gly Arg Asn Cys Glu Thr His 130 135 140
Lys Asp Asp Gin Leu Ile Cys Vai Asn Glu Asn Gly Gly Cys Glu Gin 145 150 155 160
Tyr Cys Ser Asp His Thr Gly Thr Lys Arg Ser Cys Arg Cys His Glu 165 170 175
Gly Tyr Ser Leu Leu Ala Asp Gly Val Ser Cys Thr Pro Thr Val Glu 180 185 190
Tyr Pro Cys Gly Lys lie Pro lie Leu Glu Lys Arg Asn Ala Ser Lys 195 200 205
Pro Gin Gly Arg lie Val Gly Gly Lys Val Cys Pro Lys Gly Glu Cys 210 215 220
Pro Trp Gin Val Leu Leu Leu Val Asn Gly Ala Gin Leu Cys Gly Gly 225 230 235 240
Thr Leu lie Asn Thr lie Trp Val Val Ser Ala Ala His Cys Phe Asp 245 250 255
Lys lie Lys Asn Trp Arg Asn Leu lie Ala Val Leu Gly Glu His Asp 260 265 270
Leu Ser Glu His Asp Gly Asp Glu Gin Ser Arg Arg Val Ala Gin Val 275 280 285 lie lie Pro Ser Thr Tyr Val Pro Gly Thr Thr Asn His Asp lie Ala 290 295 300
Leu Leu Arg Leu His Gin Pro Val Val Leu Thr Asp His Val Val Pro 305 310 315 320
Leu Cys Leu Pro Glu Arg Thr Phe Ser Glu Arg Thr Leu Ala Phe Val 325 330 335
Arg Phe Ser Leu Val Ser Gly Trp Gly Gin Leu Leu Asp Arg Gly Ala 340 345 350
Thr Ala Leu Glu Leu Met Val Leu Asn Val Pro Arg Leu Met Thr Gin 355 360 365
Asp Cys Leu Gin Gin Ser Arg Lys Val Gly Asp Ser Pro Asn lie Thr 370 375 380
Glu Tyr Met Phe Cys Ala Gly Tyr Ser Asp Gly Ser Lys Asp Ser Cys 385 390 395 400
Lys Gly Asp Ser Gly Gly Pro His Ala Thr His Tyr Arg Gly Thr Trp 405 410 415
Tyr Leu Thr Gly lie Val Ser Trp Gly Gin Gly Cys Ala Thr Val Gly 420 425 430
His Phe Gly Val Tyr Thr Arg Val Ser Gin Tyr lie Glu Trp Leu Gin 435 440 445
Lys Leu Met Arg Ser Glu Pro Arg Pro Gly Val Leu Leu Arg Ala Pro 450 455 460
Phe Pro 465
<210> 2 <211> 444 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Isoforma b do precursor do Factor VII <400> 2
Met Val Ser Gin Ala Leu Arg Leu Leu Cys Leu Leu Leu Gly Leu Gin 15 10 15
Gly Cys Leu Ala Ala Val Phe Val Thr Gin Glu Glu Ala His Gly Val 20 25 30
Leu His Arg Arg Arg Arg Ala Asn Ala Phe Leu Glu Glu Leu Arg Pro 35 40 45
Gly Ser Leu Glu Arg Glu Cys Lys Glu Glu Gin Cys Ser Phe Glu Glu 50 55 60
Ala Arg Glu lie Phe Lys Asp Ala Glu Arg Thr Lys Leu Phe Trp lie 65 70 75 80
Ser Tyr Ser Asp Gly Asp Gin Cys Ala Ser Ser Pro Cys Gin Asn Gly 85 90 95
Gly Ser Cys Lys Asp Gin Leu Gin Ser Tyr lie Cys Phe Cys Leu Pro 100 105 110
Ala Phe Glu Gly Arg Asn Cys Glu Thr His Lys Asp Asp Gin Leu lie 115 120 125
Cys Val Asn Glu Asn Gly Gly Cys Glu Gin Tyr Cys Ser Asp His Thr 130 135 140
Gly Thr Lys Arg Ser Cys Arg Cys His Glu Gly Tyr Ser Leu Leu Ala 145 150 155 160
Asp Gly Val Ser Cys Thr Pro Thr Val Glu Tyr Pro Cys Gly Lys lie 165 170 175
Pro lie Leu Glu Lys Arg Asn Ala Ser Lys Pro Gin Gly Arg lie Val 180 185 190
Gly Gly Lys Val Cys Pro Lys Gly Glu Cys Pro Trp Gin Val Leu Leu 195 200 205
Leu Val Asn Gly Ala Gin Leu Cys Gly Gly Thr Leu lie Asn Thr lie 210 215 220
Trp Val Val Ser Ala Ala His Cys Phe Asp Lys lie Lys Asn Trp Arg 225 230 235 240
Asn Leu lie Ala Val Leu Gly Glu His Asp Leu Ser Glu His Asp Gly 245 250 255
Asp Glu Gin Ser Arg Arg Val Ala Gin Val lie lie Pro Ser Thr Tyr 260 265 270
Val Pro Gly Thr Thr Asn His Asp lie Ala Leu Leu Arg Leu His Gin 275 280 285
Pro Val Val Leu Thr Asp His Val Val Pro Leu Cys Leu Pro Glu Arg 290 295 300
Thr Phe Ser Glu Arg Thr Leu Ala Phe Val Arg Phe Ser Leu Val Ser 305 310 315 320
Gly Trp Gly Gin Leu Leu Asp Arg Gly Ala Thr Ala Leu Glu Leu Met 325 330 335
Val Leu Asn Val Pro Arg Leu Met Thr Gin Asp Cys Leu Gin Gin Ser 340 345 350
Arg Lys Val Gly Asp Ser Pro Asn lie Thr Glu Tyr Met Phe Cys Ala 355 360 365
Gly Tyr Ser Asp Gly Ser Lys Asp Ser Cys Lys Gly Asp Ser Gly Gly 370 375 380
Pro His Ala Thr His Tyr Arg Gly Thr Trp Tyr Leu Thr Gly lie Val 385 390 395 400
Ser Trp Gly Gin Gly Cys Ala Thr Val Gly His Phe Gly Val Tyr Thr 405 410 415
Arg Val Ser Gin Tyr lie Glu Trp Leu Gin Lys Leu Met Arg Ser Glu 420 425 430
Pro Arg Pro Gly Val Leu Leu Arg Ala Pro Phe Pro 435 440
<210> 3 <211> 406 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Factor Vila maduro <400> 3
Ala Asn Ala Phe Leu Glu Glu Leu Arg Pro Gly Ser Leu Glu Arg Glu 15 10 15
Cys Lys Glu Glu Gin Cys Ser Phe Glu Glu Ala Arg Glu lie Phe Lys 20 25 30
Asp Ala Glu Arg Thr Lys Leu Phe Trp lie Ser Tyr Ser Asp Gly Asp 35 40 45
Gin Cys Ala Ser Ser Pro Cys Gin Asn Gly Gly Ser Cys Lys Asp Gin 50 55 60
Leu Gin Ser Tyr lie Cys Phe Cys Leu Pro Ala Phe Glu Gly Arg Asn 65 70 75 80
Cys Glu Thr His Lys Asp Asp Gin Leu lie Cys Val Asn Glu Asn Gly 85 90 95
Gly Cys Glu Gin Tyr Cys Ser Asp His Thr Gly Thr Lys Arg Ser Cys 100 105 110
Arg Cys His Glu Gly Tyr Ser Leu Leu Ala Asp Gly Val Ser Cys Thr 115 120 125
Pro Thr Val Glu Tyr Pro Cys Gly Lys lie Pro lie Leu Glu Lys Arg 130 135 140
Asn Ala Ser Lys Pro Gin Gly Arg lie Val Gly Gly Lys Val Cys Pro 145 150 155 160
Lys Gly Glu Cys Pro Trp Gin Val Leu Leu Leu Val Asn Gly Ala Gin 165 170 175
Leu Cys Gly Gly Thr Leu lie Asn Thr lie Trp Val Val Ser Ala Ala 180 185 190
His Cys Phe Asp Lys lie Lys Asn Trp Arg Asn Leu lie Ala Val Leu 195 200 205
Gly Glu His Asp Leu Ser Glu His Asp Gly Asp Glu Gin Ser Arg Arg 210 215 220
Val Ala Gin Val lie lie Pro Ser Thr Tyr Val Pro Gly Thr Thr Asn 225 230 235 240
His Asp lie Ala Leu Leu Arg Leu His Gin Pro Val Val Leu Thr Asp 245 250 255
His Val Val Pro Leu Cys Leu Pro Glu Arg Thr Phe Ser Glu Arg Thr 260 265 270
Leu Ala Phe Val Arg Phe Ser Leu Val Ser Gly Trp Gly Gin Leu Leu 275 280 285
Asp Arg Gly Ala Thr Ala Leu Glu Leu Met Val Leu Asn Val Pro Arg 290 295 300
Leu Met Thr Gin Asp Cys Leu Gin Gin Ser Arg Lys Val Gly Asp Ser 305 310 315 320
Pro Asn lie Thr Glu Tyr Met Phe Cys Ala Gly Tyr Ser Asp Gly Ser 325 330 335
Lys Asp Ser Cys Lys Gly Asp Ser Gly Gly Pro His Ala Thr His Tyr 340 345 350
Arg Gly Thr Trp Tyr Leu Thr Gly lie Val Ser Trp Gly Gin Gly Cys 355 360 365
Ala Thr Val Gly His Phe Gly Val Tyr Thr Arg Val Ser Gin Tyr lie 370 375 380
Glu Trp Leu Gin Lys Leu Met Arg Ser Glu Pro Arg Pro Gly Val Leu 385 390 395 400
Leu Arg Ala Pro Phe Pro 405 <210> 4 <211> 447 <212> PRT <213> Bos taurus <220> <223> Precursor do Factor VII <400> 4
Met Leu Ser Gin Ala Trp Ala Leu Ala Leu Leu Cys Phe Leu Leu Ser 15 10 15
Leu Trp Gly Ser Leu Pro Ala Val Phe Leu Pro Gin Glu Gin Ala Leu 20 25 30
Ser lie Leu His Arg Pro Arg Arg Ala Asn Gly Phe Leu Glu Glu Leu 35 40 45
Leu Pro Gly Ser Leu Glu Arg Glu Cys Arg Glu Glu Leu Cys Ser Phe 50 55 60
Glu Glu Ala His Glu lie Phe Arg Asn Glu Glu Arg Thr Arg Gin Phe 65 70 75 80
Trp Val Ser Tyr Asn Asp Gly Asp Gin Cys Ala Ser Ser Pro Cys Gin 85 90 95
Asn Gly Gly Ser Cys Glu Asp Gin Leu Arg Ser Tyr lie Cys Phe Cys 100 105 110
Pro Asp Gly Phe Glu Gly Arg Asn Cys Glu Thr Asp Lys Gin Ser Gin 115 120 125
Leu lie Cys Ala Asn Asp Asn Gly Gly Cys Glu Gin Tyr Cys Gly Ala 130 135 140
Asp Pro Gly Ala Gly Arg Phe Cys Trp Cys His Glu Gly Tyr Ala Leu 145 150 155 160
Gin Ala Asp Gly Val Ser Cys Ala Pro Thr Val Glu Tyr Pro Cys Gly 165 170 175
Lys lie Pro Val Leu Glu Lys Arg Asn Gly Ser Lys Pro Gin Gly Arg 180 185 190 lie Val Gly Gly His Val Cys Pro Lys Gly Glu Cys Pro Trp Gin Ala 195 200 205
Met Leu Lys Leu Asn Gly Ala Leu Leu Cys Gly Gly Thr Leu Val Gly 210 215 220
Pro Ala Trp Val Val Ser Ala Ala His Cys Phe Glu Arg Leu Arg Ser 225 230 235 240
Arg Gly Asn Leu Thr Ala Val Leu Gly Glu His Asp Leu Ser Arg Val 245 250 255
Glu Gly Pro Glu Gin Glu Arg Arg Val Ala Gin lie lie Val Pro Lys 260 265 270
Gin Tyr Val Pro Gly Gin Thr Asp His Asp Val Ala Leu Leu Gin Leu 275 280 285
Ala Gin Pro Val Ala Leu Gly Asp His Val Ala Pro Leu Cys Leu Pro 290 295 300
Asp Pro Asp Phe Ala Asp Gin Thr Leu Ala Phe Val Arg Phe Ser Ala 305 310 315 320
Val Ser Gly Trp Gly Gin Leu Leu Glu Arg Gly Val Thr Ala Arg Lys 325 330 335
Leu Met Val Val Leu Val Pro Arg Leu Leu Thr Gin Asp Cys Leu Gin 340 345 350
Gin Ser Arg Gin Arg Pro Gly Gly Pro Val Val Thr Asp Asn Met Phe 355 360 365
Cys Ala Gly Tyr Ser Asp Gly Ser Lys Asp Ala Cys Lys Gly Asp Ser 370 375 380
Gly Gly Pro His Ala Thr Arg Phe Arg Gly Thr Trp Phe Leu Thr Gly 385 390 395 400
Val Val Ser Trp Gly Glu Gly Cys Ala Ala Ala Gly His Phe Gly lie 405 410 415
Tyr Thr Arg Val Ser Arg Tyr Thr Ala Trp Leu Arg Gin Leu Met Gly 420 425 430
His Pro Pro Ser Arg Gin Gly Phe Phe Gin Val Pro Leu Leu Pro 435 440 445
<210> 5 <211> 446 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <223> Precursor do Factor VII <400> 5
Met Val Pro Gin Ala His Gly Leu Leu Leu Leu Cys Phe Leu Leu Gin 15 10 15
Leu Gin Gly Pro Leu Gly Thr Ala Val Phe lie Thr Gin Glu Glu Ala 20 25 30
His Gly Val Leu His Arg Gin Arg Arg Ala Asn Ser Leu Leu Glu Glu 35 40 45
Leu Trp Pro Gly Ser Leu Glu Arg Glu Cys Asn Glu Glu Gin Cys Ser 50 55 60
Phe Glu Glu Ala Arg Glu lie Phe Lys Ser Pro Glu Arg Thr Lys Gin 65 70 75 80
Phe Trp lie Val Tyr Ser Asp Gly Asp Gin Cys Ala Ser Asn Pro Cys 85 90 95
Gin Asn Gly Gly Thr Cys Gin Asp His Leu Lys Ser Tyr Val Cys Phe 100 105 110
Cys Leu Leu Asp Phe Glu Gly Arg Asn Cys Glu Lys Ser Lys Asn Glu 115 120 125
Gin Leu lie Cys Ala Asn Glu Asn Gly Asp Cys Asp Gin Tyr Cys Arg 130 135 140
Asp His Val Gly Thr Lys Arg Thr Cys Ser Cys His Glu Asp Tyr Thr 145 150 155 160
Leu Gin Pro Asp Glu Val Ser Cys Lys Pro Lys Val Glu Tyr Pro Cys 165 170 175
Gly Arg lie Pro Val Val Glu Lys Arg Asn Ser Ser Ser Arg Gin Gly 180 185 190
Arg lie Val Gly Gly Asn Val Cys Pro Lys Gly Glu Cys Pro Trp Gin 195 200 205
Ala Val Leu Lys lie Asn Gly Leu Leu Leu Cys Gly Ala Val Leu Leu 210 215 220
Asp Ala Arg Trp lie Val Thr Ala Ala His Cys Phe Asp Asn lie Arg 225 230 235 240
Tyr Trp Gly Asn lie Thr Val Val Met Gly Glu His Asp Phe Ser Glu 245 250 255
Lys Asp Gly Asp Glu Gin Val Arg Arg Val Thr Gin Val lie Met Pro 260 265 270
Asp Lys Tyr lie Arg Gly Lys lie Asn His Asp lie Ala Leu Leu Arg 275 280 285
Leu His Arg Pro Val Thr Phe Thr Asp Tyr Val Val Pro Leu Cys Leu 290 295 300
Pro Glu Lys Ser Phe Ser Glu Asn Thr Leu Ala Arg lie Arg Phe Ser 305 310 315 320
Arg Val Ser Gly Trp Gly Gin Leu Leu Asp Arg Gly Ala Thr Ala Leu 325 330 335
Glu Leu Met Ser lie Glu Val Pro Arg Leu Met Thr Gin Asp Cys Leu 340 345 350
Glu His Ala Lys His Ser Ser Asn Thr Pro Lys lie Thr Glu Asn Met 355 360 365
Phe Cys Ala Gly Tyr Met Asp Gly Thr Lys Asp Ala Cys Lys Gly Asp 370 375 380
Ser Gly Gly Pro His Ala Thr His Tyr His Gly Thr Trp Tyr Leu Thr 385 390 395 400
Gly Val Val Ser Trp Gly Glu Gly Cys Ala Ala lie Gly His lie Gly 405 410 415
Val Tyr Thr Arg Val Ser Gin Tyr lie Asp Trp Leu Val Arg His Met 420 425 430
Asp Ser Lys Leu Gin Val Gly Val Phe Arg Leu Pro Leu Leu 435 440 445
<210> 6 <211> 466 <212> PRT <213> Pan paniscus <220> <223> Precursor do Factor VII <220>
<221> UNSURE <222> (0)...(0) <223> Xaa pode ser qualquer aminoácido <400> 6
Met Val Ser Gin Ala Leu Arg Leu Leu Cys Leu Leu Leu Gly Leu Gin 15 10 15
Gly Cys Leu Ala Ala Gly Gly Val Ala Glu Ala Ser Gly Gly Glu Thr 20 25 30
Arg Asp Met Pro Trp Lys Pro Gly Pro His Arg Val Phe lie Thr Gin 35 40 45
Glu Glu Ala His Gly Val Leu His Arg Arg Arg Arg Ala Asn Ala Phe 50 55 60
Leu Glu Glu Leu Arg Pro Gly Ser Leu Glu Arg Glu Cys Lys Glu Glu 65 70 75 80
Gin Cys Ser Phe Glu Glu Ala Arg Glu lie Phe Lys Asp Leu Glu Arg 85 90 95
Thr Lys Leu Phe Trp Ile Ser Tyr Ser Asp Gly Asp Gin Cys Ala Ser 100 105 110
Ser Pro Cys Gin Asn Gly Gly Ser Cys Lys Asp Gin Leu Gin Ser Tyr 115 120 125 lie Cys Phe Cys Leu Pro Ala Phe Glu Gly Arg Asn Cys Glu Thr Tyr 130 135 140
Lys Asp Asp Gin Leu Ile Cys Vai Asn Glu Asn Gly Gly Cys Glu Gin 145 150 155 160
Tyr Cys Ser Asp His Thr Gly Thr Lys Arg Ser Cys Arg Cys His Glu 165 170 175
Gly Tyr Ser Leu Leu Ala Asp Gly Vai Ser Cys Thr Pro Thr Vai Glu 180 185 190
Tyr Pro Cys Gly Lys lie Pro lie Leu Glu Asn Arg Asn Ala Ser Lys 195 200 205
Pro Gin Gly Arg lie Vai Gly Gly Lys Vai Cys Pro Lys Gly Glu Cys 210 215 220
Pro Trp Gin Xaa Leu Leu Xaa Vai Asn Gly Ala Gin Leu Cys Gly Gly 225 230 235 240
Thr Leu Ile Asn Thr Ile Trp Vai Ala Ser Ala Ala His Cys Phe Asp 245 250 255
Lys Ile Lys Asn Trp Arg Asn Leu Ile Ala Vai Leu Gly Glu His Asp 260 265 270
Leu Ser Glu His Asp Gly Asp Glu Gin Ser Arg Arg Vai Ala Gin Vai 275 280 285 lie lie Pro Ser Thr Tyr lie Pro Gly Thr Thr Asn His Asp Ile Ala 290 295 300
Leu Leu Arg Leu His Gin Pro Vai Vai Leu Thr Asp His Vai Vai Pro 305 310 315 320
Leu Cys Leu Pro Glu Arg Ala Phe Ser Glu Arg Thr Leu Ala Phe Vai 325 330 335
Arg Phe Ser Leu Vai Ser Gly Trp Gly Gin Leu Leu Asp Arg Gly Ala 340 345 350
Thr Ala Leu Glu Leu Met Vai Leu Asn Vai Pro Arg Leu Met Thr Gin 355 360 365
Asp Cys Leu Gin Gin Ser Arg Lys Vai Gly Asp Ser Pro Asn Ile Thr 370 375 380
Glu Tyr Met Phe Cys Ala Gly Tyr Ser Asp Gly Ser Lys Asp Ser Cys 385 390 395 400
Lys Gly Asp Ser Gly Gly Pro His Ala Thr His Tyr Arg Gly Thr Trp 405 410 415
Tyr Leu Thr Gly Ile Vai Ser Trp Gly Gin Gly Cys Ala Ser Vai Gly 420 425 430
His Phe Gly Vai Tyr Thr Arg Vai Ser Gin Tyr Ile Glu Trp Leu Gin 435 440 445
Lys Leu Met Arg Ser Glu Pro Arg Pro Gly Vai Leu Leu Arg Ala Pro 450 455 460
Phe Pro 465
<210> 7 <211> 466 <212> PRT <213> Pan troglodytes <220> <223> Precursor do Factor VII <220>
<221> UNSURE <222> (0)...(0) <223> Xaa pode ser qualquer aminoácido <400> 7
Met Val Ser Gin Ala Leu Arg Leu Leu Cys Leu Leu Leu Gly Leu Gin 15 10 15
Gly Cys Leu Ala Ala Gly Gly Val Ala Glu Ala Ser Gly Gly Glu Thr 20 25 30
Arg Asp Xaa Xaa Trp Lys Pro Gly Pro His Arg Val Phe lie Thr Gin 35 40 45
Glu Glu Ala His Gly Val Leu His Arg Arg Arg Arg Ala Asn Ala Phe 50 55 60
Leu Glu Glu Leu Arg Pro Gly Ser Leu Glu Arg Glu Cys Lys Glu Glu 65 70 75 80
Gin Cys Ser Phe Glu Glu Ala Arg Glu lie Phe Lys Asp Leu Glu Arg 85 90 95
Thr Lys Leu Phe Trp lie Ser Tyr Ser Asp Gly Asp Gin Cys Ala Ser 100 105 110
Ser Pro Cys Gin Asn Gly Gly Ser Cys Lys Asp Gin Leu Gin Ser Tyr 115 120 125 lie Cys Phe Cys Leu Pro Ala Phe Glu Gly Arg Asn Cys Glu Thr Tyr 130 135 140
Lys Asp Asp Gin Leu lie Cys Val Asn Glu Asn Gly Gly Cys Glu Gin 145 150 155 160
Tyr Cys Ser Asp His Thr Gly Thr Lys Arg Ser Cys Arg Cys His Glu 165 170 175
Gly Tyr Ser Leu Leu Ala Asp Gly Val Ser Cys Thr Pro Thr Val Glu 180 185 190
Tyr Pro Cys Gly Lys lie Pro lie Leu Glu Lys Arg Asn Ala Ser Lys 195 200 205
Pro Gin Gly Arg lie Val Gly Gly Lys Val Cys Pro Lys Gly Glu Cys 210 215 220
Pro Trp Gin Val Leu Leu Leu Val Asn Gly Ala Gin Leu Cys Gly Gly 225 230 235 240
Thr Leu lie Asn Thr lie Trp Val Val Ser Ala Ala His Cys Phe Asp 245 250 255
Lys lie Lys Asn Trp Arg Asn Leu lie Ala Val Leu Gly Glu His Asp 260 265 270
Leu Ser Glu His Asp Gly Asp Glu Gin Ser Arg Arg Val Ala Gin Val 275 280 285 lie lie Pro Ser Thr Tyr lie Pro Gly Thr Thr Asn His Asp lie Ala 290 295 300
Leu Leu Arg Leu His Gin Pro Val Val Leu Thr Asp His Val Val Pro 305 310 315 320
Leu Cys Leu Pro Glu Arg Ala Phe Ser Glu Arg Thr Leu Ala Phe Val 325 330 335
Arg Phe Ser Leu Val Ser Gly Trp Gly Gin Leu Leu Asp Arg Gly Ala 340 345 350
Thr Ala Leu Glu Leu Met Val Leu Asn Val Pro Arg Leu Met Thr Gin 355 360 365
Asp Cys Leu Gin Gin Ser Arg Lys Val Gly Asp Ser Pro Asn lie Thr 370 375 380
Glu Tyr Met Phe Cys Ala Gly Tyr Ser Asp Gly Ser Lys Asp Ser Cys 385 390 395 400
Lys Gly Asp Ser Gly Gly Pro His Ala Thr His Tyr Arg Gly Thr Trp 405 410 415
Tyr Leu Thr Gly lie Val Ser Trp Gly Gin Gly Cys Ala Ser Val Gly 420 425 430
His Phe Gly Val Tyr Thr Arg Val Ser Gin Tyr lie Glu Trp Leu Gin 435 440 445
Lys Leu Met Arg Ser Glu Pro Arg Pro Gly Val Leu Leu Arg Ala Pro 450 455 460
Phe Pro 465
<210> 8 <211> 444 <212> PRT <213> Oryctolagus cuniculus <220> <223> Precursor do Factor VII <400> 8
Met Ala Pro Gin Ala Arg Gly Leu Gly Leu Cys Ser Leu Leu Ala Leu 15 10 15
Gin Ala Ser Leu Ala Ala Val Phe lie Thr Gin Glu Glu Ala His Ser 20 25 30
Val Leu Arg Arg Gin Arg Arg Ala Asn Ser Phe Leu Glu Glu Leu Arg 35 40 45
Pro Gly Ser Leu Glu Arg Glu Cys Lys Glu Glu Leu Cys Ser Phe Glu 50 55 60
Glu Ala Arg Glu Val Phe Gin Ser Thr Glu Arg Thr Lys Gin Phe Trp 65 70 75 80 lie Thr Tyr Asn Asp Gly Asp Gin Cys Ala Ser Asn Pro Cys Gin Asn 85 90 95
Gly Gly Ser Cys Glu Asp Gin lie Gin Ser Tyr lie Cys Phe Cys Leu 100 105 110
Ala Asp Phe Glu Gly Arg Asn Cys Glu Lys Asn Lys Asn Asp Gin Leu 115 120 125 lie Cys Met Tyr Glu Asn Gly Gly Cys Glu Gin Tyr Cys Ser Asp His 130 135 140
Val Gly Ser Gin Arg Ser Cys Arg Cys His Glu Gly Tyr Thr Leu Leu 145 150 155 160
Pro Asn Gly Val Ser Cys Thr Pro Thr Val Asp Tyr Pro Cys Gly Lys 165 170 175
Val Pro Ala Leu Glu Lys Arg Gly Ala Ser Asn Pro Gin Gly Arg lie 180 185 190
Vai Gly Gly Lys Vai Cys Pro Lys Gly Glu Cys Pro Trp Gin Ala Ala 195 200 205
Leu Met Asn Gly Ser Thr Leu Leu Cys Gly Gly Ser Leu Leu Asp Thr 210 215 220
His Trp Vai Vai Ser Ala Ala His Cys Phe Asp Lys Leu Ser Ser Leu 225 230 235 240
Arg Asn Leu Thr Ile Vai Leu Gly Glu His Asp Leu Ser Glu His Glu 245 250 255
Gly Asp Glu Gin Vai Arg His Vai Ala Gin Leu lie Met Pro Asp Lys 260 265 270
Tyr Vai Pro Gly Lys Thr Asp His Asp Ile Ala Leu Leu Arg Leu Leu 275 280 285
Gin Pro Ala Ala Leu Thr Asn Asn Vai Vai Pro Leu Cys Leu Pro Glu 290 295 300
Arg Asn Phe Ser Glu Ser Thr Leu Ala Thr Ile Arg Phe Ser Arg Vai 305 310 315 320
Ser Gly Trp Gly Gin Leu Leu Tyr Arg Gly Ala Leu Ala Arg Glu Leu 325 330 335
Met Ala lie Asp Vai Pro Arg Leu Met Thr Gin Asp Cys Vai Glu Gin 340 345 350
Ser Glu His Lys Pro Gly Ser Pro Glu Vai Thr Gly Asn Met Phe Cys 355 360 365
Ala Gly Tyr Leu Asp Gly Ser Lys Asp Ala Cys Lys Gly Asp Ser Gly 370 375 380
Gly Pro His Ala Thr Ser Tyr His Gly Thr Trp Tyr Leu Thr Gly Vai 385 390 395 400
Vai Ser Trp Gly Glu Gly Cys Ala Ala Vai Gly His Vai Gly Vai Tyr 405 410 415
Thr Arg Vai Ser Arg Tyr Thr Glu Trp Leu Ser Arg Leu Met Arg Ser 420 425 430
Lys Leu His His Gly lie Gin Arg His Pro Phe Pro 435 440
<210> 9 <211> 446 <212> PRT <213> Rattus norvegicus <220> <223> Precursor do Factor VII <400> 9
Met Vai Pro Gin Thr His Gly Leu Leu Leu Leu Tyr Phe Leu Leu Gin 15 10 15
Leu Gin Gly Pro Leu Gly Ala Vai Vai Phe Ile Thr Gin Glu Glu Ala 20 25 30
His Gly Vai Leu His Arg Gin Arg Arg Ala Asn Ser Leu Leu Glu Glu 35 40 45
Leu Trp Ser Ser Ser Leu Glu Arg Glu Cys Asn Glu Glu Arg Cys Ser 50 55 60
Phe Glu Glu Ala Arg Glu Ile Phe Lys Ser Pro Glu Arg Thr Lys Gin 65 70 75 80
Phe Trp Thr Ile Tyr Ser Asp Gly Asp Gin Cys Ala Ser Asn Pro Cys 85 90 95
Gin Asn Gly Gly Thr Cys Gin Asp His Leu Lys Ser Tyr Val Cys Phe 100 105 110
Cys Pro Leu Asp Phe Glu Gly Arg Asn Cys Glu Lys Asn Lys Asn Glu 115 120 125
Gin Leu lie Cys Ala Asn Glu Asn Gly Asp Cys Asp Gin Tyr Cys Arg 130 135 140
Asp His Val Gly Thr Lys Arg Thr Cys Ser Cys His Glu Asp Tyr Val 145 150 155 160
Leu Gin Pro Asp Glu Val Ser Cys Lys Pro Lys Val Glu Tyr Pro Cys 165 170 175
Gly Arg lie Pro Val Val Glu Lys Arg Asn Phe Ser Arg Pro Gin Gly 180 185 190
Arg lie Val Gly Gly Tyr Val Cys Pro Lys Gly Glu Cys Pro Trp Gin 195 200 205
Ala Val Leu Lys Phe Asn Glu Ala Leu Leu Cys Gly Ala Val Leu Leu 210 215 220
Asp Thr Arg Trp lie Val Thr Ala Ala His Cys Phe Asp Lys Phe Gly 225 230 235 240
Lys Leu Val Asn lie Thr Val Val Leu Gly Glu His Asp Phe Ser Glu 245 250 255
Lys Glu Gly Thr Glu Gin Val Arg Leu Val Glu Gin Val lie Met Pro 260 265 270
Asn Lys Tyr Thr Arg Gly Arg Thr Asp His Asp lie Ala Leu Val Arg 275 280 285
Leu His Arg Pro Val Thr Phe Thr Asp Tyr Val Val Pro Leu Cys Leu 290 295 300
Pro Glu Arg Ala Phe Ser Glu Asn Thr Leu Ala Ser lie Arg Phe Ser 305 310 315 320
Arg Val Ser Gly Trp Gly Gin Leu Leu Asp Arg Gly Ala Thr Ala Leu 325 330 335
Glu Leu Met Val lie Glu Val Pro Arg Leu Met Thr Gin Asp Cys Leu 340 345 350
Glu His Ala Lys His Ser Ala Asn Thr Pro Arg lie Thr Glu Asn Met 355 360 365
Phe Cys Ala Gly Tyr Met Asp Gly Thr Lys Asp Ala Cys Lys Gly Asp 370 375 380
Ser Gly Gly Pro His Ala Thr His Tyr His Gly Thr Trp Tyr Leu Thr 385 390 395 400
Gly Val Val Ser Trp Gly Glu Gly Cys Ala Ala lie Gly His lie Gly 405 410 415
Val Tyr Thr Arg Val Ser Gin Tyr lie Asp Trp Leu Val Lys Tyr Met 420 425 430
Asp Ser Lys Leu Arg Val Gly lie Ser Arg Val Ser Leu Leu 435 440 445
<210> 10 <211> 469 <212> PRT <213> Macaca mulatta <220>
<223> Precursor do Factor VII <4 Ο Ο > 10
Met Vai Ser Arg Ala Leu Gly Leu Leu Cys Leu Leu Leu Gly Leu Gin 15 10 15
Gly Cys Leu Ala Ala Ala Thr Phe Leu Pro Gin Ala Gly Ser Leu Arg 20 25 30
Pro Gin Glu Glu Lys Thr Gin Asp Leu Leu Trp Lys Pro Gly Pro His 35 40 45
Arg Vai Phe Vai Thr Gin Glu Glu Ala His Gly Vai Leu His Arg Gin 50 55 60
Arg Arg Ala Asn Ser Phe Leu Glu Glu Leu Arg Pro Gly Ser Leu Glu 65 70 75 80
Arg Glu Cys Lys Glu Glu Gin Cys Ser Phe Glu Glu Ala Arg Glu Ile 85 90 95
Phe Lys Asp Leu Glu Arg Thr Lys Leu Phe Trp Ile Ser Tyr Ser Asp 100 105 110
Gly Asp Gin Cys Ala Ser Asn Pro Cys Gin Asn Gly Gly Ser Cys Lys 115 120 125
Asp Gin Leu Gin Ser Tyr lie Cys Phe Cys Leu Pro Ser Phe Glu Gly 130 135 140
Arg Asn Tyr Lys Asp Asp Gin Leu Ile Cys Vai Asn Glu Asn Gly Gly 145 150 155 160
Cys Glu Gin Tyr Cys Ser Asp His Ala Gly Ala Lys Arg Ser Cys Trp 165 170 175
Cys His Glu Gly Tyr Ser Leu Leu Ala Asp Gly Vai Ser Cys Met Pro 180 185 190
Thr Vai Glu Tyr Pro Cys Gly Lys lie Pro lie Leu Glu Lys Arg Asn 195 200 205
Ala Ser Lys Pro Gin Gly Arg lie Vai Gly Gly Arg Vai Cys Pro Lys 210 215 220
Gly Glu Cys Pro Trp Gin Vai Leu Leu Leu Vai Asn Gly Ala Gin Leu 225 230 235 240
Cys Gly Gly Thr Leu Ile Asn Thr Ile Trp Vai Vai Ser Ala Ala His 245 250 255
Cys Phe Asp Lys Ile Lys Ser Trp Arg Asn Leu Thr Ala Vai Leu Gly 260 265 270
Glu His Asp Leu Ser Glu His Glu Gly Asp Glu Gin Ser Arg Arg Vai 275 280 285
Ala Gin Vai lie lie Pro Ser Thr Tyr Vai Leu Gly Ala Thr Asn His 290 295 300
Asp lie Ala Leu Leu Arg Leu Gin Gin Pro Vai Vai Leu Thr Asp His 305 310 315 320
Vai Vai Pro Leu Cys Leu Pro Glu Arg Met Phe Ser Glu Arg Thr Leu 325 330 335
Ala Phe Vai Arg Phe Ser Leu Vai Ser Gly Trp Gly Gin Leu Leu Asp 340 345 350
Arg Gly Ala Thr Ala Leu Glu Leu Met Ala Leu Asn Vai Pro Arg Leu 355 360 365
Met Thr Gin Asp Cys Leu Gin Gin Ser Gin Lys Ala Glu Ala Ser Pro 370 375 380
Asn lie Thr Glu Tyr Met Phe Cys Ala Gly Tyr Ser Asp Gly Ser Arg 385 390 395 400
Asp Ser Cys Lys Gly Asp Ser Gly Gly Pro His Ala Thr Arg Tyr Arg 405 410 415
Gly Thr Trp Tyr Leu Thr Gly Ile Vai Ser Trp Gly Gin Gly Cys Ala 420 425 430
Ala Val Gly His Phe Gly Val Tyr Thr Arg Val Ser Gin Tyr lie Glu 435 440 445
Trp Leu Gin Lys Leu Met His Ser Glu Pro Arg Pro Gly Val Leu Leu 450 455 460
Arg Ala Pro Phe Pro 465 <210> 11 <211> 445 <212> PRT <213> Sus scrota <220> <223> Precursor do Factor VII (isoforma b) <400> 11
Met Ala Ser Leu Arg Pro Ala Leu Leu Cys Leu Leu Leu Cys Leu Gin 15 10 15
Gly Ser Leu Ala Ala Val Phe Val Gly His Glu Glu Ala His Ser Leu 20 25 30
Leu His Arg Phe Arg Arg Ala Asn Ser Phe Leu Glu Glu Leu Trp Pro 35 40 45
Gly Ser Leu Glu Arg Glu Cys Arg Glu Glu Gin Cys Ser Phe Glu Glu 50 55 60
Ala Arg Glu lie Phe Lys Ser Glu Glu Arg Thr Arg Gin Phe Trp Val 65 70 75 80
Ser Tyr Asn Asp Gly Asp Gin Cys Ala Ser Asn Pro Cys Leu Asn Gly 85 90 95
Gly Ser Cys Glu Asp Gin Leu Gin Ala Tyr lie Cys Phe Cys Pro Glu 100 105 110
Gly Phe Glu Gly Arg Asn Cys Glu Thr Asn Lys Lys Ser Gin Leu lie 115 120 125
Cys Met Asn Asp Asn Gly Gly Cys Glu Gin Tyr Cys Ser Asp His Ala 130 135 140
Glu Ala Gly Arg Ser Cys Trp Cys His Glu Gly Tyr Ala Leu Gin Glu 145 150 155 160
Asp Gly Val Ser Cys Glu Pro Thr Val Glu Tyr Pro Cys Gly Lys lie 165 170 175
Pro Val Leu Glu Lys Arg Asn Asp Ser Asn Pro Gin Gly Arg lie Val 180 185 190
Gly Gly Lys Val Cys Pro Lys Gly Glu Cys Pro Trp Gin Ala Met Leu 195 200 205
Lys Leu Lys Gly Ala Leu Leu Cys Gly Gly Thr Leu Leu Asn Thr Ser 210 215 220
Trp Val Val Ser Ala Ala His Cys Phe Asp Arg lie Arg Ser Trp Lys 225 230 235 240
Asp Leu Thr Val Val Leu Gly Glu His Asp Leu Ser Lys Asp Glu Gly 245 250 255
Asp Glu Gin Glu Arg Pro Val Ala Gin Val Phe Val Pro Asp Lys Tyr 260 265 270
Val Pro Gly Lys Thr Asp His Asp Leu Ala Leu Val Arg Leu Ala Arg 275 280 285
Pro Val Ala Leu Thr Asp His Val Val Pro Leu Cys Leu Pro Glu Arg 290 295 300
Ser Phe Ser Glu Arg Thr Leu Ala Phe Ile Arg Phe Ser Ala Vai Ser 305 310 315 320
Gly Trp Gly Arg Leu Leu Asp Arg Gly Ala Lys Ala Arg Vai Leu Met 325 330 335
Ala lie Gin Vai Pro Arg Leu Met Thr Gin Asp Cys Leu Glu Gin Ala 340 345 350
Arg Arg Arg Pro Gly Ser Pro Ser lie Thr Asp Asn Met Phe Cys Ala 355 360 365
Gly Tyr Leu Asp Gly Ser Lys Asp Ala Cys Lys Gly Asp Ser Gly Gly 370 375 380
Pro His Ala Thr Arg Phe Arg Gly Thr Trp Phe Leu Thr Gly Vai Vai 385 390 395 400
Ser Trp Gly Glu Gly Cys Ala Ala Thr Gly Arg Phe Gly Vai Tyr Thr 405 410 415
Arg Vai Ser Arg Tyr Thr Ala Trp Leu Leu Gly Leu Met Ser Ala Pro 420 425 430
Pro Pro Pro Ser Glu Gly Leu Leu Arg Ala Pro Leu Pro 435 440 445
<210> 12 <211> 446 <212> PRT <213> Canis familiaris <220> <223> Precursor do Factor VII <400> 12
Met Val Ala Trp Ala Gly Glu Leu Ala Leu Leu Cys Phe Leu Leu Gly 15 10 15
Leu Gin Gly Ser Leu Ala Ala Val Phe Leu Thr Gin Glu Glu Ala Gin 20 25 30
Gly Val Leu His Arg Gin Arg Arg Ala Asn Ser Phe Leu Glu Glu Leu 35 40 45
Arg Ala Gly Ser Leu Glu Arg Glu Cys Arg Glu Glu Gin Cys Ser Phe 50 55 60
Glu Glu Ala Arg Glu Ile Phe Gin Asp Val Asp Arg Thr Arg Gin Phe 65 70 75 80
Trp Ile Ser Tyr Lys Asp Gly Asp Gin Cys Ala Ser Asn Pro Cys Gin 85 90 95
Asn Gly Gly Ser Cys Glu Asp Gin Leu Gin Ser Tyr Ile Cys Phe Cys 100 105 110
Pro Asp Asp Phe Gin Gly Arg Asn Cys Glu Thr Asp Lys Lys Asp Gin 115 120 125
Leu Ile Cys Met Asn Glu Asn Gly Gly Cys Gin Gin Tyr Cys Ser Asp 130 135 140
His Ala Glu Ala Arg Arg Ser Cys Trp Cys His Glu Gly Tyr Thr Leu 145 150 155 160
Gin Asp Asp Gly Val Ser Cys Met Pro Ile Val Glu Tyr Pro Cys Gly 165 170 175
Lys Ile Pro Val Leu Glu Lys Arg Ile Gly Ser Asn Pro Gin Gly Arg 180 185 190
Ile Val Gly Gly Lys Val Cys Pro Lys Gly Glu Cys Pro Trp Gin Ala 195 200 205
Ala Val Lys Val Asp Gly Lys Leu Leu Cys Gly Gly Thr Leu lie Asp 210 215 220
Ala Ala Trp Val Val Ser Ala Ala His Cys Phe Glu Arg lie Lys Asn 225 230 235 240
Trp Lys Asn Leu Thr Val Val Leu Gly Glu His Asp Leu Ser Glu Asp 245 250 255
Asp Gly Asp Glu Gin Glu Arg His Val Ala Arg Val lie Val Pro Asp 260 265 270
Lys Tyr lie Pro Leu Lys Thr Asn His Asp lie Ala Leu Leu His Leu 275 280 285
Arg Thr Pro Val Ala Tyr Thr Asp His Val Val Pro Leu Cys Leu Pro 290 295 300
Glu Lys Thr Phe Ser Glu Arg Thr Leu Ala Phe lie Arg Phe Ser Thr 305 310 315 320
Val Ser Gly Trp Gly Gin Leu Leu Asp Arg Gly Ala Thr Ala Leu Gin 325 330 335
Leu Met Ala lie Asp Val Pro Arg Val Met Thr Gin Asp Cys Gin Glu 340 345 350
Gin Ser Arg Arg Arg Ser Gly Ser Pro Ala lie Thr Glu Asn Met Phe 355 360 365
Cys Ala Gly Tyr Leu Asp Gly Ser Lys Asp Ala Cys Gin Gly Asp Ser 370 375 380
Gly Gly Pro His Ala Thr Lys Phe Gin Gly Thr Trp Tyr Leu Thr Gly 385 390 395 400
Val Val Ser Trp Gly Glu Gly Cys Ala Ala Glu Gly His Phe Gly Val 405 410 415
Tyr Thr Arg Val Ser Gin Tyr lie Glu Trp Leu Arg Gin Leu Met Val 420 425 430
Ser Ser His Thr Leu Arg Gly Leu Leu Arg Ala Pro Leu Pro 435 440 445
<210> 13 <211> 433 <212> PRT <213> Brachydanio rerio <220> <223> Precursor do Factor VII <400> 13
Met Ser Leu Leu Leu Val Phe Ser Val Leu Trp Ser Leu His Tyr Cys 15 10 15
His Ser Ala Ala Val Phe Val His Arg Asp Glu Ala His Glu Val Leu 20 25 30 lie Arg Ser Lys Arg Ala Asn Ser Gly Trp Phe Glu Glu Leu Lys Thr 35 40 45
Gly Asn Leu Glu Arg Glu Cys Leu Glu Glu Lys Cys Ser Tyr Glu Gly 50 55 60
Ala Arg Glu Val Phe Glu His Thr Glu Ala Thr Asn Glu Phe Trp Lys 65 70 75 80 lie Tyr Asp Val Lys Asp His Cys Ala Ser Ser Pro Cys Glu His Asp 85 90 95
Gly Leu Cys Thr Thr Gin Asn Ala Asp Ser Tyr Met Cys Leu Cys Ala 100 105 110
Pro Gly Phe Ser Gly Arg His Cys Glu Gin Ser lie Gly Asp Val Pro 115 120 125
Asp Ser Cys Leu His Asp Asn Gly Gly Cys Glu His Phe Cys Thr Glu 130 135 140
Gin Asp Gly Arg Arg Asn Cys Ser Cys Ala Asp Gly Tyr Tyr Leu Asp 145 150 155 160
Asn Gly Gly Gin Lys Cys Arg Ser His Glu Val Phe Pro Cys Gly Lys 165 170 175
Val Pro Leu Leu Gin Ala Gly Lys Ala Ala Asp His Gin Val Asp Leu 180 185 190
Arg Ser Arg lie Val Gly Gly Ser Glu Cys Pro Lys Gly His Cys Pro 195 200 205
Trp Gin Val Leu Leu Lys Tyr Gly Glu Lys Gly Phe Cys Gly Gly Val 210 215 220 lie Tyr Lys Pro Thr Trp lie Leu Thr Ala Ala His Cys Leu Glu Lys 225 230 235 240
Leu Lys Val Lys Phe Leu Arg lie Val Ala Gly Glu His Asp Leu Glu 245 250 255
Val Asp Glu Gly Thr Glu Gin Leu lie Gin Val Asp Gin Met Phe Thr 260 265 270
His Pro Ala Tyr Val Ser Glu Thr Ala Asp Ser Asp lie Ala Leu Leu 275 280 285
Arg Leu Arg Thr Pro lie Val Tyr Ser Val Tyr Ala Val Pro Val Cys 290 295 300
Leu Pro Leu Arg Glu Met Ala Glu Arg Glu Leu Trp Ala Val Ser Lys 305 310 315 320
His Thr Val Ser Gly Trp Gly Lys Arg Ser Glu Asp Gly Pro Thr Ser 325 330 335
Arg Leu Leu Arg Arg Leu Leu Val Pro Arg lie Arg Thr Gin Glu Cys 340 345 350
Val Gin Val Ser Asn Leu Thr Leu Thr Ser Asn Met Phe Cys Ala Gly 355 360 365
Tyr lie Glu Gly Arg Gin Asp Ser Cys Lys Gly Asp Ser Gly Gly Pro 370 375 380
Leu Val Thr Arg Tyr Arg Asp Thr Ala Phe Leu Leu Gly lie Val Ser 385 390 395 400
Trp Gly Lys Gly Cys Ala Arg Pro Gly Ser Tyr Gly lie Tyr Thr Arg 405 410 415
Val Ser Asn Tyr Leu Gin Trp lie Arg Gin Thr Thr Asn Thr Thr lie 420 425 430
His
<210> 14 <211> 441 <212> PRT <213> Fugu rubripes <220> <223> Precursor do Factor VII <400> 14
Met Arg Leu Arg Val Phe Phe Thr Leu Val Phe Thr Phe Thr His Cys 15 10 15
Arg Ala Ala Ser Val Phe Leu Asp Ala Asp Lys Ala His Asp Val Leu 20 25 30
Val Arg Thr Arg Arg Tyr Asn Ser Gly Trp Leu Glu Glu Leu Gin Lys 35 40 45
Gly Asp Leu Lys Arg Glu Cys Leu Glu Glu lie Cys Ser Tyr Glu Glu 50 55 60
Ala Arg Glu Val Phe Glu His Thr Lys Thr Thr Asp Glu Phe Trp Lys 65 70 75 80 lie Tyr Asn Arg Pro Asn Ser Cys Lys Ser Asn Pro Cys Leu Asn Gly 85 90 95
Gly Ser Cys Ser Ala Glu Gly Ser Ser Tyr Thr Cys Phe Cys Leu Pro 100 105 110
Glu Phe Ser Gly Val Asp Cys Glu Leu Glu Tyr Gin Thr Val Pro Asp 115 120 125
Thr Cys Leu Leu Glu Asn Gly Gly Cys Glu His Phe Cys His Glu Asn 130 135 140
Ser Ala Gly Gin Arg Gly Asn Cys Ser Cys Ala Asp Gly Tyr Asp Leu 145 150 155 160
Asp Val Asp Gly Leu Ser Cys Lys Ala Lys Glu Ser Val Ala Cys Gly 165 170 175
Met Val Leu Ser Ala Gin Phe Glu His Asn Gin Leu Asn Pro Arg Ala 180 185 190
Arg lie Val Gly Gly Asn Glu Cys Pro Lys Gly Glu Cys Pro Trp Gin 195 200 205
Val Leu Leu Val Tyr Lys Gly Lys Gly Phe Cys Gly Gly Val lie Tyr 210 215 220
Lys Pro Thr Trp lie Leu Thr Ala Ser His Cys Met Ala Asp lie Asp 225 230 235 240
Val Gin Phe Leu Lys Val Val Ala Gly Glu His Asn Thr Glu Val Asp 245 250 255
Glu Gly Thr Glu Gin lie lie Gin Val Ser Glu lie lie Met His Glu 260 265 270
Lys Tyr Val Pro Arg Thr Ala Asp Asn Asp lie Ala Leu Leu His Leu 275 280 285
Ala Val Pro lie Thr Tyr Thr Thr Tyr Ala lie Pro Val Cys Leu Pro 290 295 300
Thr Arg Pro Leu Ala Glu Arg Glu Leu Trp Ala Val Ser Leu His Thr 305 310 315 320
Val Ser Gly Trp Gly Arg Arg Ser Glu Asn Gly Pro Thr Ser His Leu 325 330 335
Leu Arg Gin Leu Lys Val Pro Arg lie Arg Thr Gin Gin Cys lie Glu 340 345 350
Glu Ser Gly Val Val Leu Thr Gin Asn Met Phe Cys Ala Gly Tyr Met 355 360 365
Glu Gly Arg Gin Asp Ser Cys Lys Gly Asp Ser Gly Gly Pro Leu Val 370 375 380
Thr Lys Tyr Lys Lys Thr Val Phe Leu Leu Gly lie Val Ser Trp Gly 385 390 395 400
Lys Gly Cys Ala Arg Pro Gly Asn Tyr Gly lie Tyr Thr Arg Val Ala 405 410 415
Asn Tyr Leu Glu Trp lie His Asn Arg Thr Ala Thr Val Asn Gin Pro 420 425 430
Thr Asn Asn Thr Glu Asn Phe Thr Thr 435 440
<210> 15 <211> 425 <212> PRT <213> Gallus gallus <220> <223> Precursor do Factor VII <400> 15
Met Val Ser Arg Gin Cys Val Ala Leu Leu Leu Cys Phe Pro Leu Leu 15 10 15
Val Pro Pro Ser Leu Glu Ala Val Phe Leu Lys Gin Glu Glu Ala Asn 20 25 30
Ser lie Phe Gin Arg His Arg Arg Ala Asn Ser Phe Phe Glu Glu lie 35 40 45
Lys Leu Gly Pro Leu Glu Arg Glu Cys lie Glu Glu Lys Cys Ser Phe 50 55 60
Glu Glu Ala Arg Glu lie Tyr Arg Asp Asp Glu Arg Thr Lys Glu Phe 65 70 75 80
Trp His lie Tyr Ser Asp Pro Asn Gin Cys Asp Ser Ser Pro Cys Gin 85 90 95
Asn Gly Gly Ser Cys Asp Asp Gin Phe Gin Asp Tyr Val Cys Arg Cys 100 105 110
Pro Pro Glu Tyr Glu Gly Lys Ser Cys Glu Thr Ala Val Ala Glu Asn 115 120 125
Leu Lys Cys lie Tyr Asp Asn Gly Gly Cys Glu Gin Tyr Cys Ala Asp 130 135 140
Glu Gin Ser Glu Lys Arg Val Cys Phe Cys Ala Glu Gly Tyr Ala Leu 145 150 155 160
Ala Ser Asp Gly Val Ser Cys lie Pro Gin Val Lys Tyr Pro Cys Gly 165 170 175
Thr lie Pro Val Leu Ala Arg Lys Asn Thr Thr Ala Gin Gly Arg lie 180 185 190
Val Gly Gly Val Thr Cys Pro Pro Gly Glu Cys Pro Trp Gin Ala Leu 195 200 205 lie lie Gin Asp Gin Lys Gly Lys Cys Gly Gly Ser Leu Leu Ser Pro 210 215 220
Glu Trp Val Val Thr Ala Ala His Cys Leu Asp Tyr Ala His Ser Lys 225 230 235 240
Gin Leu Arg Val Arg Leu Gly Glu Tyr Ser Val Lys Val Ala Glu Lys 245 250 255
Thr Glu Gin Glu Ser Gly Val Ser Lys lie lie Arg His Glu Glu Tyr 260 265 270
Thr lie Gly Gin Val Asn His Asp lie Ala Leu Leu Lys Leu Glu Thr 275 280 285
Pro Val Asn Leu Thr Asp Phe Val Val Pro lie Cys Leu Pro Glu Lys 290 295 300
Arg Phe Ala Val Tyr Glu Leu Ser Ser lie Lys Phe Ser Met Val Ser 305 310 315 320
Gly Trp Gly Arg Leu Leu Asp Gly Gly Ala Thr Ser Thr Phe Leu Met 325 330 335
Arg Val His Leu Pro Arg Val Lys Thr Gin Glu Cys Glu Lys Gin Ala 340 345 350
Asn Leu Asn lie Thr Glu Asn Met Phe Cys Ala Gly Asp Leu Thr Gly 355 360 365
Lys Lys Asp Ser Cys Lys Gly Asp Ser Gly Gly Pro His Ala Thr Lys 370 375 380
Tyr Lys Asn Thr Trp Phe Leu Thr Gly lie Val Ser Trp Gly Lys Gly 385 390 395 400
Cys Ala Val Glu Gly Ser Tyr Gly Val Tyr Thr Arg Val Ser Arg Tyr 405 410 415 lie Asn Trp Leu Lys Arg His Met Glu 420 425
<210> 16 <211> 444 <212> PRT <213> Pongo pygmaeus <220> <223> Factor VII (fragmento) <400> 16
Gly Val Ala Glu Ala Ser Gly Gly Glu Thr Arg Asp Met Gin Trp Lys 15 10 15
Leu Gly Pro His Arg Val Phe lie Thr Gin Glu Glu Ala His Gly Val 20 25 30
Leu His Arg Arg Arg Arg Ala Asn Thr Phe Leu Glu Glu Leu Arg Pro 35 40 45
Gly Ser Leu Glu Arg Glu Cys Lys Glu Glu Gin Cys Ser Phe Glu Glu 50 55 60
Ala Arg Glu lie Phe Lys Asp Leu Glu Arg Thr Lys Leu Phe Trp lie 65 70 75 80
Ser Tyr Ser Asp Gly Asp Gin Cys Ala Ser Ser Pro Cys Gin Asn Gly 85 90 95
Gly Ser Cys Lys Asp Gin Leu Gin Ser Tyr lie Cys Phe Cys Leu Pro 100 105 110
Asp Phe Glu Gly Arg Asn Cys Glu Met Tyr Lys Asp Asp Gin Leu lie 115 120 125
Cys Val Asn Glu Asn Gly Gly Cys Glu Gin Tyr Cys Ser Asp His Met 130 135 140
Gly Ala Lys Arg Ser Cys Trp Cys His Glu Gly Tyr Ser Leu Leu Ala 145 150 155 160
Asp Gly Val Ser Cys Thr Pro Thr Val Glu Tyr Pro Cys Gly Lys lie 165 170 175
Pro lie Leu Glu Lys Arg Asn Ala Ser Lys Pro Gin Gly Arg lie Val 180 185 190
Gly Gly Lys Val Cys Pro Lys Gly Glu Cys Pro Trp Gin Val Leu Leu 195 200 205
Leu Val Asn Gly Ala Gin Leu Cys Gly Gly Thr Leu lie Asn Thr lie 210 215 220
Trp Val Val Ser Ala Ala His Cys Phe Asp Lys lie Lys Asn Trp Arg 225 230 235 240
Asn Leu lie Ala Val Leu Gly Glu His Asp Leu Ser Glu Arg Asp Gly 245 250 255
Asp Glu Gin Ser Arg Arg Val Ala Gin Val lie lie Pro Ser Thr Tyr 260 265 270
Val Pro Gly Thr Thr Asn His Asp lie Ala Leu Leu Arg Leu His Gin 275 280 285
Pro Val Val Leu Thr Asp His Val Val Pro Leu Cys Leu Pro Glu Arg 290 295 300
Thr Phe Ser Glu Arg Thr Leu Ala Phe Val Arg Phe Ser Leu Val Ser 305 310 315 320
Gly Trp Gly Gin Leu Leu Asp Arg Gly Ala Thr Ala Leu Glu Leu Met 325 330 335
Ala Leu Asn Val Pro Arg Leu Met Thr Gin Asp Cys Leu Gin Gin Ser 340 345 350
Arg Lys Val Gly Asp Ser Pro Asn lie Thr Glu Tyr Met Phe Cys Ala 355 360 365
Gly Tyr Ser Asp Gly Ser Lys Asp Ser Cys Lys Gly Asp Ser Gly Gly 370 375 380
Pro His Ala Thr Arg Tyr Arg Gly Thr Trp Tyr Leu Thr Gly lie Val 385 390 395 400
Ser Trp Gly Gin Gly Cys Ala Ala Val Gly His Phe Gly Val Tyr Thr 405 410 415
Arg Val Ser Gin Tyr lie Glu Trp Leu Gin Lys Leu Met Cys Ser Glu 420 425 430
Pro Arg Pro Gly Val Leu Leu Arg Ala Pro Phe Pro 435 440
<210> 17 <211> 221 <212> PRT <213> Gorilla gorilla <220> <223> Factor VII (fragment) <220>
<221> UNSURE <222> (0)...(0) <223> Xaa pode ser qualquer aminoácido <400> 17 lie Trp Val Val Ser Ala Ala His Cys Phe Asp Lys lie Lys Asn Trp 15 10 15
Arg Asn Leu lie Ala Val Leu Gly Glu His Asp Leu Ser Glu His Asp 20 25 30
Gly Asp Glu Gin Ser Arg Arg Val Ala Gin Val lie lie Pro Ser Met 35 40 45
Tyr Val Pro Gly Thr Thr Asn His Asp lie Ala Leu Leu Arg Leu His 50 55 60
Gin Pro Val Val Leu Thr Asp His Val Val Pro Leu Cys Leu Pro Glu 65 70 75 80
Arg Thr Phe Ser Glu Arg Thr Leu Ala Phe Val Arg Phe Ser Leu Val 85 90 95
Ser Gly Trp Gly Gin Leu Leu Asp Arg Gly Ala Thr Ala Leu Glu Leu 100 105 110
Met Val Leu Asn Val Pro Arg Leu Met Thr Gin Asp Cys Leu Gin Gin 115 120 125
Ser Arg Lys Vai Gly Asp Ser Pro Asn lie Thr Glu Tyr Met Phe Cys 130 135 140
Ala Gly Tyr Ser Asp Gly Ser Lys Asp Ser Cys Lys Gly Asp Ser Gly 145 150 155 160
Gly Pro His Ala Thr His Tyr Arg Gly Thr Trp Xaa Leu Thr Gly Ile 165 170 175
Xaa Ser Trp Gly Gin Gly Cys Ala Thr Vai Gly His Phe Gly Vai Tyr 180 185 190
Thr Arg Vai Ser Gin Tyr lie Glu Trp Leu Gin Lys Leu Met Arg Ser 195 200 205
Glu Pro Arg Pro Gly Vai Leu Leu Arg Ala Pro Phe Pro 210 215 220
<210> 18 <211> 466 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Variante L13P de FVII <400> 18
Met Vai Ser Gin Ala Leu Arg Leu Leu Cys Leu Leu Pro Gly Leu Gin 15 10 15
Gly Cys Leu Ala Ala Gly Gly Vai Ala Lys Ala Ser Gly Gly Glu Thr 20 25 30
Arg Asp Met Pro Trp Lys Pro Gly Pro His Arg Vai Phe Vai Thr Gin 35 40 45
Glu Glu Ala His Gly Vai Leu His Arg Arg Arg Arg Ala Asn Ala Phe 50 55 60
Leu Glu Glu Leu Arg Pro Gly Ser Leu Glu Arg Glu Cys Lys Glu Glu 65 70 75 80
Gin Cys Ser Phe Glu Glu Ala Arg Glu Ile Phe Lys Asp Ala Glu Arg 85 90 95
Thr Lys Leu Phe Trp Ile Ser Tyr Ser Asp Gly Asp Gin Cys Ala Ser 100 105 110
Ser Pro Cys Gin Asn Gly Gly Ser Cys Lys Asp Gin Leu Gin Ser Tyr 115 120 125 lie Cys Phe Cys Leu Pro Ala Phe Glu Gly Arg Asn Cys Glu Thr His 130 135 140
Lys Asp Asp Gin Leu Ile Cys Vai Asn Glu Asn Gly Gly Cys Glu Gin 145 150 155 160
Tyr Cys Ser Asp His Thr Gly Thr Lys Arg Ser Cys Arg Cys His Glu 165 170 175
Gly Tyr Ser Leu Leu Ala Asp Gly Vai Ser Cys Thr Pro Thr Vai Glu 180 185 190
Tyr pro Cys Gly Lys lie Pro lie Leu Glu Lys Arg Asn Ala Ser Lys 195 200 205
Pro Gin Gly Arg lie Vai Gly Gly Lys Vai Cys Pro Lys Gly Glu Cys 210 215 220
Pro Trp Gin Vai Leu Leu Leu Vai Asn Gly Ala Gin Leu Cys Gly Gly 225 230 235 240
Thr Leu Ile Asn Thr Ile Trp Vai Vai Ser Ala Ala His Cys Phe Asp 245 250 255
Lys lie Lys Asn Trp Arg Asn Leu lie Ala Val Leu Gly Glu His Asp 260 265 270
Leu Ser Glu His Asp Gly Asp Glu Gin Ser Arg Arg Val Ala Gin Val 275 280 285 lie lie Pro Ser Thr Tyr Val Pro Gly Thr Thr Asn His Asp lie Ala 290 295 300
Leu Leu Arg Leu His Gin Pro Val Val Leu Thr Asp His Val Val Pro 305 310 315 320
Leu Cys Leu Pro Glu Arg Thr Phe Ser Glu Arg Thr Leu Ala Phe Val 325 330 335
Arg Phe Ser Leu Val Ser Gly Trp Gly Gin Leu Leu Asp Arg Gly Ala 340 345 350
Thr Ala Leu Glu Leu Met Val Leu Asn Val Pro Arg Leu Met Thr Gin 355 360 365
Asp Cys Leu Gin Gin Ser Arg Lys Val Gly Asp Ser Pro Asn lie Thr 370 375 380
Glu Tyr Met Phe Cys Ala Gly Tyr Ser Asp Gly Ser Lys Asp Ser Cys 385 390 395 400
Lys Gly Asp Ser Gly Gly Pro His Ala Thr His Tyr Arg Gly Thr Trp 405 410 415
Tyr Leu Thr Gly lie Val Ser Trp Gly Gin Gly Cys Ala Thr Val Gly 420 425 430
His Phe Gly Val Tyr Thr Arg Val Ser Gin Tyr lie Glu Trp Leu Gin 435 440 445
Lys Leu Met Arg Ser Glu Pro Arg Pro Gly Val Leu Leu Arg Ala Pro 450 455 460
Phe Pro 465
<210> 19 <211> 466 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Variante de FVII (precursor F64L) <400> 19
Met Val Ser Gin Ala Leu Arg Leu Leu Cys Leu Leu Leu Gly Leu Gin 15 10 15
Gly Cys Leu Ala Ala Gly Gly Val Ala Lys Ala Ser Gly Gly Glu Thr 20 25 30
Arg Asp Met Pro Trp Lys Pro Gly Pro His Arg Val Phe Val Thr Gin 35 40 45
Glu Glu Ala His Gly Val Leu His Arg Arg Arg Arg Ala Asn Ala Leu 50 55 60
Leu Glu Glu Leu Arg Pro Gly Ser Leu Glu Arg Glu Cys Lys Glu Glu 65 70 75 80
Gin Cys Ser Phe Glu Glu Ala Arg Glu lie Phe Lys Asp Ala Glu Arg 85 90 95
Thr Lys Leu Phe Trp lie Ser Tyr Ser Asp Gly Asp Gin Cys Ala Ser 100 105 110
Ser Pro Cys Gin Asn Gly Gly Ser Cys Lys Asp Gin Leu Gin Ser Tyr 115 120 125 lie Cys Phe Cys Leu Pro Ala Phe Glu Gly Arg Asn Cys Glu Thr His 130 135 140
Lys Asp Asp Gin Leu lie Cys Val Asn Glu Asn Gly Gly Cys Glu Gin 145 150 155 160
Tyr Cys Ser Asp His Thr Gly Thr Lys Arg Ser Cys Arg Cys His Glu 165 170 175
Gly Tyr Ser Leu Leu Ala Asp Gly Val Ser Cys Thr Pro Thr Val Glu 180 185 190
Tyr Pro Cys Gly Lys lie Pro lie Leu Glu Lys Arg Asn Ala Ser Lys 195 200 205
Pro Gin Gly Arg lie Val Gly Gly Lys Val Cys Pro Lys Gly Glu Cys 210 215 220
Pro Trp Gin Val Leu Leu Leu Val Asn Gly Ala Gin Leu Cys Gly Gly 225 230 235 240
Thr Leu lie Asn Thr lie Trp Val Val Ser Ala Ala His Cys Phe Asp 245 250 255
Lys lie Lys Asn Trp Arg Asn Leu lie Ala Val Leu Gly Glu His Asp 260 265 270
Leu Ser Glu His Asp Gly Asp Glu Gin Ser Arg Arg Val Ala Gin Val 275 280 285 lie lie Pro Ser Thr Tyr Val Pro Gly Thr Thr Asn His Asp lie Ala 290 295 300
Leu Leu Arg Leu His Gin Pro Val Val Leu Thr Asp His Val Val Pro 305 310 315 320
Leu Cys Leu Pro Glu Arg Thr Phe Ser Glu Arg Thr Leu Ala Phe Val 325 330 335
Arg Phe Ser Leu Val Ser Gly Trp Gly Gin Leu Leu Asp Arg Gly Ala 340 345 350
Thr Ala Leu Glu Leu Met Val Leu Asn Val Pro Arg Leu Met Thr Gin 355 360 365
Asp Cys Leu Gin Gin Ser Arg Lys Val Gly Asp Ser Pro Asn lie Thr 370 375 380
Glu Tyr Met Phe Cys Ala Gly Tyr Ser Asp Gly Ser Lys Asp Ser Cys 385 390 395 400
Lys Gly Asp Ser Gly Gly Pro His Ala Thr His Tyr Arg Gly Thr Trp 405 410 415
Tyr Leu Thr Gly lie Val Ser Trp Gly Gin Gly Cys Ala Thr Val Gly 420 425 430
His Phe Gly Val Tyr Thr Arg Val Ser Gin Tyr lie Glu Trp Leu Gin 435 440 445
Lys Leu Met Arg Ser Glu Pro Arg Pro Gly Val Leu Leu Arg Ala Pro 450 455 460
Phe Pro 465
<210> 20 <211> 466 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Variante de FVII (precursor L73Q) <4 Ο Ο > 20
Met Vai Ser Gin Ala Leu Arg Leu Leu Cys Leu Leu Leu Gly Leu Gin 15 10 15
Gly Cys Leu Ala Ala Gly Gly Val Ala Lys Ala Ser Gly Gly Glu Thr 20 25 30
Arg Asp Met Pro Trp Lys Pro Gly Pro His Arg Val Phe Val Thr Gin 35 40 45
Glu Glu Ala His Gly Val Leu His Arg Arg Arg Arg Ala Asn Ala Phe 50 55 60
Leu Glu Glu Leu Arg Pro Gly Ser Gin Glu Arg Glu Cys Lys Glu Glu 65 70 75 80
Gin Cys Ser Phe Glu Glu Ala Arg Glu lie Phe Lys Asp Ala Glu Arg 85 90 95
Thr Lys Leu Phe Trp lie Ser Tyr Ser Asp Gly Asp Gin Cys Ala Ser 100 105 110
Ser Pro Cys Gin Asn Gly Gly Ser Cys Lys Asp Gin Leu Gin Ser Tyr 115 120 125 lie Cys Phe Cys Leu Pro Ala Phe Glu Gly Arg Asn Cys Glu Thr His 130 135 140
Lys Asp Asp Gin Leu lie Cys Val Asn Glu Asn Gly Gly Cys Glu Gin 145 150 155 160
Tyr Cys Ser Asp His Thr Gly Thr Lys Arg Ser Cys Arg Cys His Glu 165 170 175
Gly Tyr Ser Leu Leu Ala Asp Gly Val Ser Cys Thr Pro Thr Val Glu 180 185 190
Tyr Pro Cys Gly Lys lie Pro lie Leu Glu Lys Arg Asn Ala Ser Lys 195 200 205
Pro Gin Gly Arg lie Val Gly Gly Lys Val Cys Pro Lys Gly Glu Cys 210 215 220
Pro Trp Gin Val Leu Leu Leu Val Asn Gly Ala Gin Leu Cys Gly Gly 225 230 235 240
Thr Leu lie Asn Thr lie Trp Val Val Ser Ala Ala His Cys Phe Asp 245 250 255
Lys lie Lys Asn Trp Arg Asn Leu lie Ala Val Leu Gly Glu His Asp 260 265 270
Leu Ser Glu His Asp Gly Asp Glu Gin Ser Arg Arg Val Ala Gin Val 275 280 285 lie lie Pro Ser Thr Tyr Val Pro Gly Thr Thr Asn His Asp lie Ala 290 295 300
Leu Leu Arg Leu His Gin Pro Val Val Leu Thr Asp His Val Val Pro 305 310 315 320
Leu Cys Leu Pro Glu Arg Thr Phe Ser Glu Arg Thr Leu Ala Phe Val 325 330 335
Arg Phe Ser Leu Val Ser Gly Trp Gly Gin Leu Leu Asp Arg Gly Ala 340 345 350
Thr Ala Leu Glu Leu Met Val Leu Asn Val Pro Arg Leu Met Thr Gin 355 360 365
Asp Cys Leu Gin Gin Ser Arg Lys Val Gly Asp Ser Pro Asn lie Thr 370 375 380
Glu Tyr Met Phe Cys Ala Gly Tyr Ser Asp Gly Ser Lys Asp Ser Cys 385 390 395 400
Lys Gly Asp Ser Gly Gly Pro His Ala Thr His Tyr Arg Gly Thr Trp 405 410 415
Tyr Leu Thr Gly lie Val Ser Trp Gly Gin Gly Cys Ala Thr Val Gly 420 425 430
His Phe Gly Val Tyr Thr Arg Val Ser Gin Tyr lie Glu Trp Leu Gin 435 440 445
Lys Leu Met Arg Ser Glu Pro Arg Pro Gly Val Leu Leu Arg Ala Pro 450 455 460
Phe Pro 465
<210> 21 <211> 466 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Variante de FVII (precursor E79Q) <400> 21
Met Val Ser Gin Ala Leu Arg Leu Leu Cys Leu Leu Leu Gly Leu Gin 15 10 15
Gly Cys Leu Ala Ala Gly Gly Val Ala Lys Ala Ser Gly Gly Glu Thr 20 25 30
Arg Asp Met Pro Trp Lys Pro Gly Pro His Arg Val Phe Val Thr Gin 35 40 45
Glu Glu Ala His Gly Val Leu His Arg Arg Arg Arg Ala Asn Ala Phe 50 55 60
Leu Glu Glu Leu Arg Pro Gly Ser Leu Glu Arg Glu Cys Lys Gin Glu 65 70 75 80
Gin Cys Ser Phe Glu Glu Ala Arg Glu lie Phe Lys Asp Ala Glu Arg 85 90 95
Thr Lys Leu Phe Trp lie Ser Tyr Ser Asp Gly Asp Gin Cys Ala Ser 100 105 110
Ser Pro Cys Gin Asn Gly Gly Ser Cys Lys Asp Gin Leu Gin Ser Tyr 115 120 125 lie Cys Phe Cys Leu Pro Ala Phe Glu Gly Arg Asn Cys Glu Thr His 130 135 140
Lys Asp Asp Gin Leu lie Cys Val Asn Glu Asn Gly Gly Cys Glu Gin 145 150 155 160
Tyr Cys Ser Asp His Thr Gly Thr Lys Arg Ser Cys Arg Cys His Glu 165 170 175
Gly Tyr Ser Leu Leu Ala Asp Gly Val Ser Cys Thr Pro Thr Val Glu 180 185 190
Tyr Pro Cys Gly Lys lie Pro lie Leu Glu Lys Arg Asn Ala Ser Lys 195 200 205
Pro Gin Gly Arg lie Val Gly Gly Lys Val Cys Pro Lys Gly Glu Cys 210 215 220
Pro Trp Gin Val Leu Leu Leu Val Asn Gly Ala Gin Leu Cys Gly Gly 225 230 235 240
Thr Leu lie Asn Thr lie Trp Val Val Ser Ala Ala His Cys Phe Asp 245 250 255
Lys lie Lys Asn Trp Arg Asn Leu lie Ala Val Leu Gly Glu His Asp 260 265 270
Leu Ser Glu His Asp Gly Asp Glu Gin Ser Arg Arg Val Ala Gin Val 275 280 285 lie lie Pro Ser Thr Tyr Val Pro Gly Thr Thr Asn His Asp lie Ala 290 295 300
Leu Leu Arg Leu His Gin Pro Val Val Leu Thr Asp His Val Val Pro 305 310 315 320
Leu Cys Leu Pro Glu Arg Thr Phe Ser Glu Arg Thr Leu Ala Phe Val 325 330 335
Arg Phe Ser Leu Val Ser Gly Trp Gly Gin Leu Leu Asp Arg Gly Ala 340 345 350
Thr Ala Leu Glu Leu Met Val Leu Asn Val Pro Arg Leu Met Thr Gin 355 360 365
Asp Cys Leu Gin Gin Ser Arg Lys Val Gly Asp Ser Pro Asn lie Thr 370 375 380
Glu Tyr Met Phe Cys Ala Gly Tyr Ser Asp Gly Ser Lys Asp Ser Cys 385 390 395 400
Lys Gly Asp Ser Gly Gly Pro His Ala Thr His Tyr Arg Gly Thr Trp 405 410 415
Tyr Leu Thr Gly lie Val Ser Trp Gly Gin Gly Cys Ala Thr Val Gly 420 425 430
His Phe Gly Val Tyr Thr Arg Val Ser Gin Tyr lie Glu Trp Leu Gin 435 440 445
Lys Leu Met Arg Ser Glu Pro Arg Pro Gly Val Leu Leu Arg Ala Pro 450 455 460
Phe Pro 465
<210> 22 <211> 466 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Variante de FVII (precursor S120P) <400> 22
Met Val Ser Gin Ala Leu Arg Leu Leu Cys Leu Leu Leu Gly Leu Gin 15 10 15
Gly Cys Leu Ala Ala Gly Gly Val Ala Lys Ala Ser Gly Gly Glu Thr 20 25 30
Arg Asp Met Pro Trp Lys Pro Gly Pro His Arg Val Phe Val Thr Gin 35 40 45
Glu Glu Ala His Gly Val Leu His Arg Arg Arg Arg Ala Asn Ala Phe 50 55 60
Leu Glu Glu Leu Arg Pro Gly Ser Leu Glu Arg Glu Cys Lys Glu Glu 65 70 75 80
Gin Cys Ser Phe Glu Glu Ala Arg Glu lie Phe Lys Asp Ala Glu Arg 85 90 95
Thr Lys Leu Phe Trp lie Ser Tyr Ser Asp Gly Asp Gin Cys Ala Ser 100 105 110
Ser Pro Cys Gin Asn Gly Gly Pro Cys Lys Asp Gin Leu Gin Ser Tyr 115 120 125 lie Cys Phe Cys Leu Pro Ala Phe Glu Gly Arg Asn Cys Glu Thr His 130 135 140
Lys Asp Asp Gin Leu lie Cys Val Asn Glu Asn Gly Gly Cys Glu Gin 145 150 155 160
Tyr Cys Ser Asp His Thr Gly Thr Lys Arg Ser Cys Arg Cys His Glu 165 170 175
Gly Tyr Ser Leu Leu Ala Asp Gly Val Ser Cys Thr Pro Thr Val Glu 180 185 190
Tyr Pro Cys Gly Lys lie Pro lie Leu Glu Lys Arg Asn Ala Ser Lys 195 200 205
Pro Gin Gly Arg lie Val Gly Gly Lys Val Cys Pro Lys Gly Glu Cys 210 215 220
Pro Trp Gin Val Leu Leu Leu Val Asn Gly Ala Gin Leu Cys Gly Gly 225 230 235 240
Thr Leu lie Asn Thr lie Trp Val Val Ser Ala Ala His Cys Phe Asp 245 250 255
Lys lie Lys Asn Trp Arg Asn Leu lie Ala Val Leu Gly Glu His Asp 260 265 270
Leu Ser Glu His Asp Gly Asp Glu Gin Ser Arg Arg Val Ala Gin Val 275 280 285 lie lie Pro Ser Thr Tyr Val Pro Gly Thr Thr Asn His Asp lie Ala 290 295 300
Leu Leu Arg Leu His Gin Pro Val Val Leu Thr Asp His Val Val Pro 305 310 315 320
Leu Cys Leu Pro Glu Arg Thr Phe Ser Glu Arg Thr Leu Ala Phe Val 325 330 335
Arg Phe Ser Leu Val Ser Gly Trp Gly Gin Leu Leu Asp Arg Gly Ala 340 345 350
Thr Ala Leu Glu Leu Met Val Leu Asn Val Pro Arg Leu Met Thr Gin 355 360 365
Asp Cys Leu Gin Gin Ser Arg Lys Val Gly Asp Ser Pro Asn lie Thr 370 375 380
Glu Tyr Met Phe Cys Ala Gly Tyr Ser Asp Gly Ser Lys Asp Ser Cys 385 390 395 400
Lys Gly Asp Ser Gly Gly Pro His Ala Thr His Tyr Arg Gly Thr Trp 405 410 415
Tyr Leu Thr Gly lie Val Ser Trp Gly Gin Gly Cys Ala Thr Val Gly 420 425 430
His Phe Gly Val Tyr Thr Arg Val Ser Gin Tyr lie Glu Trp Leu Gin 435 440 445
Lys Leu Met Arg Ser Glu Pro Arg Pro Gly Val Leu Leu Arg Ala Pro 450 455 460
Phe Pro 465
<210> 23 <211> 466 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Variante de FVII (precursor C121F) <400> 23
Met Val Ser Gin Ala Leu Arg Leu Leu Cys Leu Leu Leu Gly Leu Gin 15 10 15
Gly Cys Leu Ala Ala Gly Gly Val Ala Lys Ala Ser Gly Gly Glu Thr 20 25 30
Arg Asp Met Pro Trp Lys Pro Gly Pro His Arg Val Phe Val Thr Gin 35 40 45
Glu Glu Ala His Gly Vai Leu His Arg Arg Arg Arg Ala Asn Ala Phe 50 55 60
Leu Glu Glu Leu Arg Pro Gly Ser Leu Glu Arg Glu Cys Lys Glu Glu 65 70 75 80
Gin Cys Ser Phe Glu Glu Ala Arg Glu lie Phe Lys Asp Ala Glu Arg 85 90 95
Thr Lys Leu Phe Trp Ile Ser Tyr Ser Asp Gly Asp Gin Cys Ala Ser 100 105 110
Ser Pro Cys Gin Asn Gly Gly Ser Phe Lys Asp Gin Leu Gin Ser Tyr 115 120 125 lie Cys Phe Cys Leu Pro Ala Phe Glu Gly Arg Asn Cys Glu Thr His 130 135 140
Lys Asp Asp Gin Leu Ile Cys Vai Asn Glu Asn Gly Gly Cys Glu Gin 145 150 155 160
Tyr Cys Ser Asp His Thr Gly Thr Lys Arg Ser Cys Arg Cys His Glu 165 170 175
Gly Tyr Ser Leu Leu Ala Asp Gly Vai Ser Cys Thr Pro Thr Vai Glu 180 185 190
Tyr Pro Cys Gly Lys lie Pro lie Leu Glu Lys Arg Asn Ala Ser Lys 195 200 205
Pro Gin Gly Arg lie Vai Gly Gly Lys Vai Cys Pro Lys Gly Glu Cys 210 215 220
Pro Trp Gin Vai Leu Leu Leu Vai Asn Gly Ala Gin Leu Cys Gly Gly 225 230 235 240
Thr Leu Ile Asn Thr Ile Trp Vai Vai Ser Ala Ala His Cys Phe Asp 245 250 255
Lys Ile Lys Asn Trp Arg Asn Leu Ile Ala Vai Leu Gly Glu His Asp 260 265 270
Leu Ser Glu His Asp Gly Asp Glu Gin Ser Arg Arg Vai Ala Gin Vai 275 280 285 lie lie Pro Ser Thr Tyr Vai Pro Gly Thr Thr Asn His Asp Ile Ala 290 295 300
Leu Leu Arg Leu His Gin Pro Vai Vai Leu Thr Asp His Vai Vai Pro 305 310 315 320
Leu Cys Leu Pro Glu Arg Thr Phe Ser Glu Arg Thr Leu Ala Phe Vai 325 330 335
Arg Phe Ser Leu Vai Ser Gly Trp Gly Gin Leu Leu Asp Arg Gly Ala 340 345 350
Thr Ala Leu Glu Leu Met Vai Leu Asn Vai Pro Arg Leu Met Thr Gin 355 360 365
Asp Cys Leu Gin Gin Ser Arg Lys Vai Gly Asp Ser Pro Asn Ile Thr 370 375 380
Glu Tyr Met Phe Cys Ala Gly Tyr Ser Asp Gly Ser Lys Asp Ser Cys 385 390 395 400
Lys Gly Asp Ser Gly Gly Pro His Ala Thr His Tyr Arg Gly Thr Trp 405 410 415
Tyr Leu Thr Gly Ile Vai Ser Trp Gly Gin Gly Cys Ala Thr Vai Gly 420 425 430
His Phe Gly Vai Tyr Thr Arg Vai Ser Gin Tyr Ile Glu Trp Leu Gin 435 440 445
Lys Leu Met Arg Ser Glu Pro Arg Pro Gly Vai Leu Leu Arg Ala Pro 450 455 460
Phe Pro 465 <210> 24 <211> 466
<212> PRT <213> Hmo sapiens <220> <223> Variante de FVII (precursor L125P) <400> 24
Met Val Ser Gin Ala Leu Arg Leu Leu Cys Leu Leu Leu Gly Leu Gin 15 10 15
Gly Cys Leu Ala Ala Gly Gly Val Ala Lys Ala Ser Gly Gly Glu Thr 20 25 30
Arg Asp Met Pro Trp Lys Pro Gly Pro His Arg Val Phe Val Thr Gin 35 40 45
Glu Glu Ala His Gly Val Leu His Arg Arg Arg Arg Ala Asn Ala Phe 50 55 60
Leu Glu Glu Leu Arg Pro Gly Ser Leu Glu Arg Glu Cys Lys Glu Glu 65 70 75 80
Gin Cys Ser Phe Glu Glu Ala Arg Glu lie Phe Lys Asp Ala Glu Arg 85 90 95
Thr Lys Leu Phe Trp lie Ser Tyr Ser Asp Gly Asp Gin Cys Ala Ser 100 105 110
Ser Pro Cys Gin Asn Gly Gly Ser Cys Lys Asp Gin Pro Gin Ser Tyr 115 120 125 lie Cys Phe Cys Leu Pro Ala Phe Glu Gly Arg Asn Cys Glu Thr His 130 135 140
Lys Asp Asp Gin Leu lie Cys Val Asn Glu Asn Gly Gly Cys Glu Gin 145 150 155 160
Tyr Cys Ser Asp His Thr Gly Thr Lys Arg Ser Cys Arg Cys His Glu 165 170 175
Gly Tyr Ser Leu Leu Ala Asp Gly Val Ser Cys Thr Pro Thr Val Glu 180 185 190
Tyr Pro Cys Gly Lys lie Pro lie Leu Glu Lys Arg Asn Ala Ser Lys 195 200 205
Pro Gin Gly Arg lie Val Gly Gly Lys Val Cys Pro Lys Gly Glu Cys 210 215 220
Pro Trp Gin Val Leu Leu Leu Val Asn Gly Ala Gin Leu Cys Gly Gly 225 230 235 240
Thr Leu lie Asn Thr lie Trp Val Val Ser Ala Ala His Cys Phe Asp 245 250 255
Lys lie Lys Asn Trp Arg Asn Leu lie Ala Val Leu Gly Glu His Asp 260 265 270
Leu Ser Glu His Asp Gly Asp Glu Gin Ser Arg Arg Val Ala Gin Val 275 280 285 lie lie Pro Ser Thr Tyr Val Pro Gly Thr Thr Asn His Asp lie Ala 290 295 300
Leu Leu Arg Leu His Gin Pro Val Val Leu Thr Asp His Val Val Pro 305 310 315 320
Leu Cys Leu Pro Glu Arg Thr Phe Ser Glu Arg Thr Leu Ala Phe Val 325 330 335
Arg Phe Ser Leu Val Ser Gly Trp Gly Gin Leu Leu Asp Arg Gly Ala 340 345 350
Thr Ala Leu Glu Leu Met Val Leu Asn Val Pro Arg Leu Met Thr Gin 355 360 365
Asp Cys Leu Gin Gin Ser Arg Lys Val Gly Asp Ser Pro Asn lie Thr 370 375 380
Glu Tyr Met Phe Cys Ala Gly Tyr Ser Asp Gly Ser Lys Asp Ser Cys 385 390 395 400
Lys Gly Asp Ser Gly Gly Pro His Ala Thr His Tyr Arg Gly Thr Trp 405 410 415
Tyr Leu Thr Gly lie Val Ser Trp Gly Gin Gly Cys Ala Thr Val Gly 420 425 430
His Phe Gly Val Tyr Thr Arg Val Ser Gin Tyr lie Glu Trp Leu Gin 435 440 445
Lys Leu Met Arg Ser Glu Pro Arg Pro Gly Val Leu Leu Arg Ala Pro 450 455 460
Phe Pro 465
<210> 25 <211> 466 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Variante de FVII (precursor Y128C) <400> 25
Met Val Ser Gin Ala Leu Arg Leu Leu Cys Leu Leu Leu Gly Leu Gin 15 10 15
Gly Cys Leu Ala Ala Gly Gly Val Ala Lys Ala Ser Gly Gly Glu Thr 20 25 30
Arg Asp Met Pro Trp Lys Pro Gly Pro His Arg Val Phe Val Thr Gin 35 40 45
Glu Glu Ala His Gly Val Leu His Arg Arg Arg Arg Ala Asn Ala Phe 50 55 60
Leu Glu Glu Leu Arg Pro Gly Ser Leu Glu Arg Glu Cys Lys Glu Glu 65 70 75 80
Gin Cys Ser Phe Glu Glu Ala Arg Glu lie Phe Lys Asp Ala Glu Arg 85 90 95
Thr Lys Leu Phe Trp lie Ser Tyr Ser Asp Gly Asp Gin Cys Ala Ser 100 105 110
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Lys Asp Asp Gin Leu lie Cys Val Asn Glu Asn Gly Gly Cys Glu Gin 145 150 155 160
Tyr Cys Ser Asp His Thr Gly Thr Lys Arg Ser Cys Arg Cys His Glu 165 170 175
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Lys lie Lys Asn Trp Arg Asn Leu lie Ala Val Leu Gly Glu His Asp 260 265 270
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Lys Leu Met Arg Ser Glu Pro Arg Pro Gly Val Leu Leu Arg Ala Pro 450 455 460
Phe Pro 465
<210> 26 <211> 466 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Variante de FVII (precursor R139K) <400> 26
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Gly Cys Leu Ala Ala Gly Gly Val Ala Lys Ala Ser Gly Gly Glu Thr 20 25 30
Arg Asp Met Pro Trp Lys Pro Gly Pro His Arg Val Phe Val Thr Gin 35 40 45
Glu Glu Ala His Gly Val Leu His Arg Arg Arg Arg Ala Asn Ala Phe 50 55 60
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Gin Cys Ser Phe Glu Glu Ala Arg Glu lie Phe Lys Asp Ala Glu Arg 85 90 95
Thr Lys Leu Phe Trp lie Ser Tyr Ser Asp Gly Asp Gin Cys Ala Ser 100 105 110
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Lys lie Lys Asn Trp Arg Asn Leu lie Ala Val Leu Gly Glu His Asp 260 265 270
Leu Ser Glu His Asp Gly Asp Glu Gin Ser Arg Arg Val Ala Gin Val 275 280 285 lie lie Pro Ser Thr Tyr Val Pro Gly Thr Thr Asn His Asp lie Ala 290 295 300
Leu Leu Arg Leu His Gin Pro Val Val Leu Thr Asp His Val Val Pro 305 310 315 320
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Phe Pro 465
<210> 27 <211> 466 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Variante de FVII (precursor R139Q) <400> 27
Met Val Ser Gin Ala Leu Arg Leu Leu Cys Leu Leu Leu Gly Leu Gin 15 10 15
Gly Cys Leu Ala Ala Gly Gly Val Ala Lys Ala Ser Gly Gly Glu Thr 20 25 30
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Gin Cys Ser Phe Glu Glu Ala Arg Glu lie Phe Lys Asp Ala Glu Arg 85 90 95
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Leu Cys Leu Pro Glu Arg Thr Phe Ser Glu Arg Thr Leu Ala Phe Val 325 330 335
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<210> 28 <211> 466 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Variante de FVII R139W <400> 28
Met Val Ser Gin Ala Leu Arg Leu Leu Cys Leu Leu Leu Gly Leu Gin 15 10 15
Gly Cys Leu Ala Ala Gly Gly Val Ala Lys Ala Ser Gly Gly Glu Thr 20 25 30
Arg Asp Met Pro Trp Lys Pro Gly Pro His Arg Val Phe Val Thr Gin 35 40 45
Glu Glu Ala His Gly Val Leu His Arg Arg Arg Arg Ala Asn Ala Phe 50 55 60
Leu Glu Glu Leu Arg Pro Gly Ser Leu Glu Arg Glu Cys Lys Glu Glu 65 70 75 80
Gin Cys Ser Phe Glu Glu Ala Arg Glu lie Phe Lys Asp Ala Glu Arg 85 90 95
Thr Lys Leu Phe Trp lie Ser Tyr Ser Asp Gly Asp Gin Cys Ala Ser 100 105 110
Ser Pro Cys Gin Asn Gly Gly Ser Cys Lys Asp Gin Leu Gin Ser Tyr 115 120 125 lie Cys Phe Cys Leu Pro Ala Phe Glu Gly Trp Asn Cys Glu Thr His 130 135 140
Lys Asp Asp Gin Leu lie Cys Val Asn Glu Asn Gly Gly Cys Glu Gin 145 150 155 160
Tyr Cys Ser Asp His Thr Gly Thr Lys Arg Ser Cys Arg Cys His Glu 165 170 175
Gly Tyr Ser Leu Leu Ala Asp Gly Val Ser Cys Thr Pro Thr Val Glu 180 185 190
Tyr Pro Cys Gly Lys lie Pro lie Leu Glu Lys Arg Asn Ala Ser Lys 195 200 205
Pro Gin Gly Arg lie Val Gly Gly Lys Val Cys Pro Lys Gly Glu Cys 210 215 220
Pro Trp Gin Val Leu Leu Leu Val Asn Gly Ala Gin Leu Cys Gly Gly 225 230 235 240
Thr Leu lie Asn Thr lie Trp Val Val Ser Ala Ala His Cys Phe Asp 245 250 255
Lys lie Lys Asn Trp Arg Asn Leu lie Ala Val Leu Gly Glu His Asp 260 265 270
Leu Ser Glu His Asp Gly Asp Glu Gin Ser Arg Arg Val Ala Gin Val 275 280 285 lie lie Pro Ser Thr Tyr Val Pro Gly Thr Thr Asn His Asp lie Ala 290 295 300
Leu Leu Arg Leu His Gin Pro Val Val Leu Thr Asp His Val Val Pro 305 310 315 320
Leu Cys Leu Pro Glu Arg Thr Phe Ser Glu Arg Thr Leu Ala Phe Val 325 330 335
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Phe Pro 465
<210> 29 <211> 466 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Variante de FVII (precursor C151S) <400> 29
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Gly Cys Leu Ala Ala Gly Gly Val Ala Lys Ala Ser Gly Gly Glu Thr 20 25 30
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Glu Glu Ala His Gly Val Leu His Arg Arg Arg Arg Ala Asn Ala Phe 50 55 60
Leu Glu Glu Leu Arg Pro Gly Ser Leu Glu Arg Glu Cys Lys Glu Glu 65 70 75 80
Gin Cys Ser Phe Glu Glu Ala Arg Glu lie Phe Lys Asp Ala Glu Arg 85 90 95
Thr Lys Leu Phe Trp lie Ser Tyr Ser Asp Gly Asp Gin Cys Ala Ser 100 105 110
Ser Pro Cys Gin Asn Gly Gly Ser Cys Lys Asp Gin Leu Gin Ser Tyr 115 120 125 lie Cys Phe Cys Leu Pro Ala Phe Glu Gly Arg Asn Cys Glu Thr His 130 135 140
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Tyr Cys Ser Asp His Thr Gly Thr Lys Arg Ser Cys Arg Cys His Glu 165 170 175
Gly Tyr Ser Leu Leu Ala Asp Gly Val Ser Cys Thr Pro Thr Val Glu 180 185 190
Tyr Pro Cys Gly Lys lie Pro lie Leu Glu Lys Arg Asn Ala Ser Lys 195 200 205
Pro Gin Gly Arg lie Val Gly Gly Lys Val Cys Pro Lys Gly Glu Cys 210 215 220
Pro Trp Gin Val Leu Leu Leu Val Asn Gly Ala Gin Leu Cys Gly Gly 225 230 235 240
Thr Leu lie Asn Thr lie Trp Val Val Ser Ala Ala His Cys Phe Asp 245 250 255
Lys lie Lys Asn Trp Arg Asn Leu lie Ala Val Leu Gly Glu His Asp 260 265 270
Leu Ser Glu His Asp Gly Asp Glu Gin Ser Arg Arg Val Ala Gin Val 275 280 285 lie lie Pro Ser Thr Tyr Val Pro Gly Thr Thr Asn His Asp lie Ala 290 295 300
Leu Leu Arg Leu His Gin Pro Val Val Leu Thr Asp His Val Val Pro 305 310 315 320
Leu Cys Leu Pro Glu Arg Thr Phe Ser Glu Arg Thr Leu Ala Phe Val 325 330 335
Arg Phe Ser Leu Val Ser Gly Trp Gly Gin Leu Leu Asp Arg Gly Ala 340 345 350
Thr Ala Leu Glu Leu Met Val Leu Asn Val Pro Arg Leu Met Thr Gin 355 360 365
Asp Cys Leu Gin Gin Ser Arg Lys Val Gly Asp Ser Pro Asn lie Thr 370 375 380
Glu Tyr Met Phe Cys Ala Gly Tyr Ser Asp Gly Ser Lys Asp Ser Cys 385 390 395 400
Lys Gly Asp Ser Gly Gly Pro His Ala Thr His Tyr Arg Gly Thr Trp 405 410 415
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Lys Leu Met Arg Ser Glu Pro Arg Pro Gly Val Leu Leu Arg Ala Pro 450 455 460
Phe Pro 465
<210> 30 <211> 466 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Variante de FVII (precursor E154K) <400> 30
Met Val Ser Gin Ala Leu Arg Leu Leu Cys Leu Leu Leu Gly Leu Gin 15 10 15
Gly Cys Leu Ala Ala Gly Gly Val Ala Lys Ala Ser Gly Gly Glu Thr 20 25 30
Arg Asp Met Pro Trp Lys Pro Gly Pro His Arg Val Phe Val Thr Gin 35 40 45
Glu Glu Ala His Gly Val Leu His Arg Arg Arg Arg Ala Asn Ala Phe 50 55 60
Leu Glu Glu Leu Arg Pro Gly Ser Leu Glu Arg Glu Cys Lys Glu Glu 65 70 75 80
Gin Cys Ser Phe Glu Glu Ala Arg Glu lie Phe Lys Asp Ala Glu Arg 85 90 95
Thr Lys Leu Phe Trp lie Ser Tyr Ser Asp Gly Asp Gin Cys Ala Ser 100 105 110
Ser Pro Cys Gin Asn Gly Gly Ser Cys Lys Asp Gin Leu Gin Ser Tyr 115 120 125 lie Cys Phe Cys Leu Pro Ala Phe Glu Gly Arg Asn Cys Glu Thr His 130 135 140
Lys Asp Asp Gin Leu lie Cys Val Asn Lys Asn Gly Gly Cys Glu Gin 145 150 155 160
Tyr Cys Ser Asp His Thr Gly Thr Lys Arg Ser Cys Arg Cys His Glu 165 170 175
Gly Tyr Ser Leu Leu Ala Asp Gly Val Ser Cys Thr Pro Thr Val Glu 180 185 190
Tyr Pro Cys Gly Lys lie Pro lie Leu Glu Lys Arg Asn Ala Ser Lys 195 200 205
Pro Gin Gly Arg lie Val Gly Gly Lys Val Cys Pro Lys Gly Glu Cys 210 215 220
Pro Trp Gin Val Leu Leu Leu Val Asn Gly Ala Gin Leu Cys Gly Gly 225 230 235 240
Thr Leu lie Asn Thr lie Trp Val Val Ser Ala Ala His Cys Phe Asp 245 250 255
Lys lie Lys Asn Trp Arg Asn Leu lie Ala Val Leu Gly Glu His Asp 260 265 270
Leu Ser Glu His Asp Gly Asp Glu Gin Ser Arg Arg Val Ala Gin Val 275 280 285 lie lie Pro Ser Thr Tyr Val Pro Gly Thr Thr Asn His Asp lie Ala 290 295 300
Leu Leu Arg Leu His Gin Pro Val Val Leu Thr Asp His Val Val Pro 305 310 315 320
Leu Cys Leu Pro Glu Arg Thr Phe Ser Glu Arg Thr Leu Ala Phe Val 325 330 335
Arg Phe Ser Leu Val Ser Gly Trp Gly Gin Leu Leu Asp Arg Gly Ala 340 345 350
Thr Ala Leu Glu Leu Met Val Leu Asn Val Pro Arg Leu Met Thr Gin 355 360 365
Asp Cys Leu Gin Gin Ser Arg Lys Val Gly Asp Ser Pro Asn lie Thr 370 375 380
Glu Tyr Met Phe Cys Ala Gly Tyr Ser Asp Gly Ser Lys Asp Ser Cys 385 390 395 400
Lys Gly Asp Ser Gly Gly Pro His Ala Thr His Tyr Arg Gly Thr Trp 405 410 415
Tyr Leu Thr Gly lie Val Ser Trp Gly Gin Gly Cys Ala Thr Val Gly 420 425 430
His Phe Gly Val Tyr Thr Arg Val Ser Gin Tyr lie Glu Trp Leu Gin 435 440 445
Lys Leu Met Arg Ser Glu Pro Arg Pro Gly Val Leu Leu Arg Ala Pro 450 455 460
Phe Pro 465
<210> 31 <211> 466 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Variante de FVII (precursor G157C) <400> 31
Met Val Ser Gin Ala Leu Arg Leu Leu Cys Leu Leu Leu Gly Leu Gin 15 10 15
Gly Cys Leu Ala Ala Gly Gly Val Ala Lys Ala Ser Gly Gly Glu Thr 20 25 30
Arg Asp Met Pro Trp Lys Pro Gly Pro His Arg Val Phe Val Thr Gin 35 40 45
Glu Glu Ala His Gly Val Leu His Arg Arg Arg Arg Ala Asn Ala Phe 50 55 60
Leu Glu Glu Leu Arg Pro Gly Ser Leu Glu Arg Glu Cys Lys Glu Glu 65 70 75 80
Gin Cys Ser Phe Glu Glu Ala Arg Glu lie Phe Lys Asp Ala Glu Arg 85 90 95
Thr Lys Leu Phe Trp lie Ser Tyr Ser Asp Gly Asp Gin Cys Ala Ser 100 105 110
Ser Pro Cys Gin Asn Gly Gly Ser Cys Lys Asp Gin Leu Gin Ser Tyr 115 120 125 lie Cys Phe Cys Leu Pro Ala Phe Glu Gly Arg Asn Cys Glu Thr His 130 135 140
Lys Asp Asp Gin Leu lie Cys Val Asn Glu Asn Gly Cys Cys Glu Gin 145 150 155 160
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Pro Trp Gin Val Leu Leu Leu Val Asn Gly Ala Gin Leu Cys Gly Gly 225 230 235 240
Thr Leu lie Asn Thr lie Trp Val Val Ser Ala Ala His Cys Phe Asp 245 250 255
Lys lie Lys Asn Trp Arg Asn Leu lie Ala Val Leu Gly Glu His Asp 260 265 270
Leu Ser Glu His Asp Gly Asp Glu Gin Ser Arg Arg Val Ala Gin Val 275 280 285 lie lie Pro Ser Thr Tyr Val Pro Gly Thr Thr Asn His Asp lie Ala 290 295 300
Leu Leu Arg Leu His Gin Pro Val Val Leu Thr Asp His Val Val Pro 305 310 315 320
Leu Cys Leu Pro Glu Arg Thr Phe Ser Glu Arg Thr Leu Ala Phe Val 325 330 335
Arg Phe Ser Leu Val Ser Gly Trp Gly Gin Leu Leu Asp Arg Gly Ala 340 345 350
Thr Ala Leu Glu Leu Met Val Leu Asn Val Pro Arg Leu Met Thr Gin 355 360 365
Asp Cys Leu Gin Gin Ser Arg Lys Val Gly Asp Ser Pro Asn lie Thr 370 375 380
Glu Tyr Met Phe Cys Ala Gly Tyr Ser Asp Gly Ser Lys Asp Ser Cys 385 390 395 400
Lys Gly Asp Ser Gly Gly Pro His Ala Thr His Tyr Arg Gly Thr Trp 405 410 415
Tyr Leu Thr Gly lie Val Ser Trp Gly Gin Gly Cys Ala Thr Val Gly 420 425 430
His Phe Gly Val Tyr Thr Arg Val Ser Gin Tyr lie Glu Trp Leu Gin 435 440 445
Lys Leu Met Arg Ser Glu Pro Arg Pro Gly Val Leu Leu Arg Ala Pro 450 455 460
Phe Pro 465
<210> 32 <211> 466 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Variante de FVII (precursor G157S) <400> 32
Met Val Ser Gin Ala Leu Arg Leu Leu Cys Leu Leu Leu Gly Leu Gin 15 10 15
Gly Cys Leu Ala Ala Gly Gly Val Ala Lys Ala Ser Gly Gly Glu Thr 20 25 30
Arg Asp Met Pro Trp Lys Pro Gly Pro His Arg Val Phe Val Thr Gin 35 40 45
Glu Glu Ala His Gly Val Leu His Arg Arg Arg Arg Ala Asn Ala Phe 50 55 60
Leu Glu Glu Leu Arg Pro Gly Ser Leu Glu Arg Glu Cys Lys Glu Glu 65 70 75 80
Gin Cys Ser Phe Glu Glu Ala Arg Glu lie Phe Lys Asp Ala Glu Arg 85 90 95
Thr Lys Leu Phe Trp lie Ser Tyr Ser Asp Gly Asp Gin Cys Ala Ser 100 105 110
Ser Pro Cys Gin Asn Gly Gly Ser Cys Lys Asp Gin Leu Gin Ser Tyr 115 120 125 lie Cys Phe Cys Leu Pro Ala Phe Glu Gly Arg Asn Cys Glu Thr His 130 135 140
Lys Asp Asp Gin Leu lie Cys Val Asn Glu Asn Gly Ser Cys Glu Gin 145 150 155 160
Tyr Cys Ser Asp His Thr Gly Thr Lys Arg Ser Cys Arg Cys His Glu 165 170 175
Gly Tyr Ser Leu Leu Ala Asp Gly Val Ser Cys Thr Pro Thr Val Glu 180 185 190
Tyr Pro Cys Gly Lys lie Pro lie Leu Glu Lys Arg Asn Ala Ser Lys 195 200 205
Pro Gin Gly Arg lie Val Gly Gly Lys Val Cys Pro Lys Gly Glu Cys 210 215 220
Pro Trp Gin Val Leu Leu Leu Val Asn Gly Ala Gin Leu Cys Gly Gly 225 230 235 240
Thr Leu lie Asn Thr lie Trp Val Val Ser Ala Ala His Cys Phe Asp 245 250 255
Lys lie Lys Asn Trp Arg Asn Leu lie Ala Val Leu Gly Glu His Asp 260 265 270
Leu Ser Glu His Asp Gly Asp Glu Gin Ser Arg Arg Val Ala Gin Val 275 280 285 lie lie Pro Ser Thr Tyr Val Pro Gly Thr Thr Asn His Asp lie Ala 290 295 300
Leu Leu Arg Leu His Gin Pro Val Val Leu Thr Asp His Val Val Pro 305 310 315 320
Leu Cys Leu Pro Glu Arg Thr Phe Ser Glu Arg Thr Leu Ala Phe Val 325 330 335
Arg Phe Ser Leu Val Ser Gly Trp Gly Gin Leu Leu Asp Arg Gly Ala 340 345 350
Thr Ala Leu Glu Leu Met Val Leu Asn Val Pro Arg Leu Met Thr Gin 355 360 365
Asp Cys Leu Gin Gin Ser Arg Lys Val Gly Asp Ser Pro Asn lie Thr 370 375 380
Glu Tyr Met Phe Cys Ala Gly Tyr Ser Asp Gly Ser Lys Asp Ser Cys 385 390 395 400
Lys Gly Asp Ser Gly Gly Pro His Ala Thr His Tyr Arg Gly Thr Trp 405 410 415
Tyr Leu Thr Gly lie Val Ser Trp Gly Gin Gly Cys Ala Thr Val Gly 420 425 430
His Phe Gly Val Tyr Thr Arg Val Ser Gin Tyr lie Glu Trp Leu Gin 435 440 445
Lys Leu Met Arg Ser Glu Pro Arg Pro Gly Val Leu Leu Arg Ala Pro 450 455 460
Phe Pro 465
<210> 33 <211> 466 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Variante de FVII (precursor G157V) <4 Ο Ο > 33
Met Vai Ser Gin Ala Leu Arg Leu Leu Cys Leu Leu Leu Gly Leu Gin 15 10 15
Gly Cys Leu Ala Ala Gly Gly Val Ala Lys Ala Ser Gly Gly Glu Thr 20 25 30
Arg Asp Met Pro Trp Lys Pro Gly Pro His Arg Val Phe Val Thr Gin 35 40 45
Glu Glu Ala His Gly Val Leu His Arg Arg Arg Arg Ala Asn Ala Phe 50 55 60
Leu Glu Glu Leu Arg Pro Gly Ser Leu Glu Arg Glu Cys Lys Glu Glu 65 70 75 80
Gin Cys Ser Phe Glu Glu Ala Arg Glu lie Phe Lys Asp Ala Glu Arg 85 90 95
Thr Lys Leu Phe Trp lie Ser Tyr Ser Asp Gly Asp Gin Cys Ala Ser 100 105 110
Ser Pro Cys Gin Asn Gly Gly Ser Cys Lys Asp Gin Leu Gin Ser Tyr 115 120 125 lie Cys Phe Cys Leu Pro Ala Phe Glu Gly Arg Asn Cys Glu Thr His 130 135 140
Lys Asp Asp Gin Leu lie Cys Val Asn Glu Asn Gly Val Cys Glu Gin 145 150 155 160
Tyr Cys Ser Asp His Thr Gly Thr Lys Arg Ser Cys Arg Cys His Glu 165 170 175
Gly Tyr Ser Leu Leu Ala Asp Gly Val Ser Cys Thr Pro Thr Val Glu 180 185 190
Tyr Pro Cys Gly Lys lie Pro lie Leu Glu Lys Arg Asn Ala Ser Lys 195 200 205
Pro Gin Gly Arg lie Val Gly Gly Lys Val Cys Pro Lys Gly Glu Cys 210 215 220
Pro Trp Gin Val Leu Leu Leu Val Asn Gly Ala Gin Leu Cys Gly Gly 225 230 235 240
Thr Leu lie Asn Thr lie Trp Val Val Ser Ala Ala His Cys Phe Asp 245 250 255
Lys lie Lys Asn Trp Arg Asn Leu lie Ala Val Leu Gly Glu His Asp 260 265 270
Leu Ser Glu His Asp Gly Asp Glu Gin Ser Arg Arg Val Ala Gin Val 275 280 285 lie lie Pro Ser Thr Tyr Val Pro Gly Thr Thr Asn His Asp lie Ala 290 295 300
Leu Leu Arg Leu His Gin Pro Val Val Leu Thr Asp His Val Val Pro 305 310 315 320
Leu Cys Leu Pro Glu Arg Thr Phe Ser Glu Arg Thr Leu Ala Phe Val 325 330 335
Arg Phe Ser Leu Val Ser Gly Trp Gly Gin Leu Leu Asp Arg Gly Ala 340 345 350
Thr Ala Leu Glu Leu Met Val Leu Asn Val Pro Arg Leu Met Thr Gin 355 360 365
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Phe Pro 465
<210> 34 <211> 466 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Variante de FVII (precursor Q160R) <400> 34
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Phe Pro 465
<210> 35 <211> 466 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Variante de FVII (precursor P194T) <400> 35
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Phe Pro 465
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Phe Pro 465
<210> 37 <211> 466 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Variante de FVII (precursor K197E) <400> 37
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Gly Cys Leu Ala Ala Gly Gly Val Ala Lys Ala Ser Gly Gly Glu Thr 20 25 30
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Leu Glu Glu Leu Arg Pro Gly Ser Leu Glu Arg Glu Cys Lys Glu Glu 65 70 75 80
Gin Cys Ser Phe Glu Glu Ala Arg Glu lie Phe Lys Asp Ala Glu Arg 85 90 95
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Phe Pro 465
<210> 38 <211> 466 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Variante de FVII (precursor R212Q) <400> 38
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Gly Cys Leu Ala Ala Gly Gly Val Ala Lys Ala Ser Gly Gly Glu Thr 20 25 30
Arg Asp Met Pro Trp Lys Pro Gly Pro His Arg Val Phe Val Thr Gin 35 40 45
Glu Glu Ala His Gly Val Leu His Arg Arg Arg Arg Ala Asn Ala Phe 50 55 60
Leu Glu Glu Leu Arg Pro Gly Ser Leu Glu Arg Glu Cys Lys Glu Glu 65 70 75 80
Gin Cys Ser Phe Glu Glu Ala Arg Glu lie Phe Lys Asp Ala Glu Arg 85 90 95
Thr Lys Leu Phe Trp lie Ser Tyr Ser Asp Gly Asp Gin Cys Ala Ser 100 105 110
Ser Pro Cys Gin Asn Gly Gly Ser Cys Lys Asp Gin Leu Gin Ser Tyr 115 120 125 lie Cys Phe Cys Leu Pro Ala Phe Glu Gly Arg Asn Cys Glu Thr His 130 135 140
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Tyr Cys Ser Asp His Thr Gly Thr Lys Arg Ser Cys Arg Cys His Glu 165 170 175
Gly Tyr Ser Leu Leu Ala Asp Gly Val Ser Cys Thr Pro Thr Val Glu 180 185 190
Tyr Pro Cys Gly Lys lie Pro lie Leu Glu Lys Arg Asn Ala Ser Lys 195 200 205
Pro Gin Gly Gin lie Val Gly Gly Lys Val Cys Pro Lys Gly Glu Cys 210 215 220
Pro Trp Gin Val Leu Leu Leu Val Asn Gly Ala Gin Leu Cys Gly Gly 225 230 235 240
Thr Leu lie Asn Thr lie Trp Val Val Ser Ala Ala His Cys Phe Asp 245 250 255
Lys lie Lys Asn Trp Arg Asn Leu lie Ala Val Leu Gly Glu His Asp 260 265 270
Leu Ser Glu His Asp Gly Asp Glu Gin Ser Arg Arg Val Ala Gin Val 275 280 285 lie lie Pro Ser Thr Tyr Val Pro Gly Thr Thr Asn His Asp lie Ala 290 295 300
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Phe Pro 465
<210> 39 <211> 466 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Variante de FVII (precursor G216D) <400> 39
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Gly Cys Leu Ala Ala Gly Gly Val Ala Lys Ala Ser Gly Gly Glu Thr 20 25 30
Arg Asp Met Pro Trp Lys Pro Gly Pro His Arg Val Phe Val Thr Gin 35 40 45
Glu Glu Ala His Gly Val Leu His Arg Arg Arg Arg Ala Asn Ala Phe 50 55 60
Leu Glu Glu Leu Arg Pro Gly Ser Leu Glu Arg Glu Cys Lys Glu Glu 65 70 75 80
Gin Cys Ser Phe Glu Glu Ala Arg Glu lie Phe Lys Asp Ala Glu Arg 85 90 95
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Thr Leu lie Asn Thr lie Trp Val Val Ser Ala Ala His Cys Phe Asp 245 250 255
Lys lie Lys Asn Trp Arg Asn Leu lie Ala Val Leu Gly Glu His Asp 260 265 270
Leu Ser Glu His Asp Gly Asp Glu Gin Ser Arg Arg Val Ala Gin Val 275 280 285 lie lie Pro Ser Thr Tyr Val Pro Gly Thr Thr Asn His Asp lie Ala 290 295 300
Leu Leu Arg Leu His Gin Pro Val Val Leu Thr Asp His Val Val Pro 305 310 315 320
Leu Cys Leu Pro Glu Arg Thr Phe Ser Glu Arg Thr Leu Ala Phe Val 325 330 335
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Phe Pro 465
<210> 40 <211> 466 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Variante de FVII (precursor C238Y) <400> 40
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Gly Cys Leu Ala Ala Gly Gly Val Ala Lys Ala Ser Gly Gly Glu Thr 20 25 30
Arg Asp Met Pro Trp Lys Pro Gly Pro His Arg Val Phe Val Thr Gin 35 40 45
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Pro Trp Gin Val Leu Leu Leu Val Asn Gly Ala Gin Leu Tyr Gly Gly 225 230 235 240
Thr Leu lie Asn Thr lie Trp Val Val Ser Ala Ala His Cys Phe Asp 245 250 255
Lys lie Lys Asn Trp Arg Asn Leu lie Ala Val Leu Gly Glu His Asp 260 265 270
Leu Ser Glu His Asp Gly Asp Glu Gin Ser Arg Arg Val Ala Gin Val 275 280 285 lie lie Pro Ser Thr Tyr Val Pro Gly Thr Thr Asn His Asp lie Ala 290 295 300
Leu Leu Arg Leu His Gin Pro Val Val Leu Thr Asp His Val Val Pro 305 310 315 320
Leu Cys Leu Pro Glu Arg Thr Phe Ser Glu Arg Thr Leu Ala Phe Val 325 330 335
Arg Phe Ser Leu Val Ser Gly Trp Gly Gin Leu Leu Asp Arg Gly Ala 340 345 350
Thr Ala Leu Glu Leu Met Val Leu Asn Val Pro Arg Leu Met Thr Gin 355 360 365
Asp Cys Leu Gin Gin Ser Arg Lys Val Gly Asp Ser Pro Asn lie Thr 370 375 380
Glu Tyr Met Phe Cys Ala Gly Tyr Ser Asp Gly Ser Lys Asp Ser Cys 385 390 395 400
Lys Gly Asp Ser Gly Gly Pro His Ala Thr His Tyr Arg Gly Thr Trp 405 410 415
Tyr Leu Thr Gly lie Val Ser Trp Gly Gin Gly Cys Ala Thr Val Gly 420 425 430
His Phe Gly Val Tyr Thr Arg Val Ser Gin Tyr lie Glu Trp Leu Gin 435 440 445
Lys Leu Met Arg Ser Glu Pro Arg Pro Gly Val Leu Leu Arg Ala Pro 450 455 460
Phe Pro 465
<210> 41 <211> 466 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Variante de FVII (precursor T241N) <400> 41
Met Val Ser Gin Ala Leu Arg Leu Leu Cys Leu Leu Leu Gly Leu Gin 15 10 15
Gly Cys Leu Ala Ala Gly Gly Val Ala Lys Ala Ser Gly Gly Glu Thr 20 25 30
Arg Asp Met Pro Trp Lys Pro Gly Pro His Arg Val Phe Val Thr Gin 35 40 45
Glu Glu Ala His Gly Val Leu His Arg Arg Arg Arg Ala Asn Ala Phe 50 55 60
Leu Glu Glu Leu Arg Pro Gly Ser Leu Glu Arg Glu Cys Lys Glu Glu 65 70 75 80
Gin Cys Ser Phe Glu Glu Ala Arg Glu lie Phe Lys Asp Ala Glu Arg 85 90 95
Thr Lys Leu Phe Trp lie Ser Tyr Ser Asp Gly Asp Gin Cys Ala Ser 100 105 110
Ser Pro Cys Gin Asn Gly Gly Ser Cys Lys Asp Gin Leu Gin Ser Tyr 115 120 125 lie Cys Phe Cys Leu Pro Ala Phe Glu Gly Arg Asn Cys Glu Thr His 130 135 140
Lys Asp Asp Gin Leu lie Cys Val Asn Glu Asn Gly Gly Cys Glu Gin 145 150 155 160
Tyr Cys Ser Asp His Thr Gly Thr Lys Arg Ser Cys Arg Cys His Glu 165 170 175
Gly Tyr Ser Leu Leu Ala Asp Gly Val Ser Cys Thr Pro Thr Val Glu 180 185 190
Tyr Pro Cys Gly Lys lie Pro lie Leu Glu Lys Arg Asn Ala Ser Lys 195 200 205
Pro Gin Gly Arg lie Val Gly Gly Lys Val Cys Pro Lys Gly Glu Cys 210 215 220
Pro Trp Gin Val Leu Leu Leu Val Asn Gly Ala Gin Leu Cys Gly Gly 225 230 235 240
Asn Leu lie Asn Thr lie Trp Val Val Ser Ala Ala His Cys Phe Asp 245 250 255
Lys lie Lys Asn Trp Arg Asn Leu lie Ala Val Leu Gly Glu His Asp 260 265 270
Leu Ser Glu His Asp Gly Asp Glu Gin Ser Arg Arg Val Ala Gin Val 275 280 285 lie lie Pro Ser Thr Tyr Val Pro Gly Thr Thr Asn His Asp lie Ala 290 295 300
Leu Leu Arg Leu His Gin Pro Val Val Leu Thr Asp His Val Val Pro 305 310 315 320
Leu Cys Leu Pro Glu Arg Thr Phe Ser Glu Arg Thr Leu Ala Phe Val 325 330 335
Arg Phe Ser Leu Val Ser Gly Trp Gly Gin Leu Leu Asp Arg Gly Ala 340 345 350
Thr Ala Leu Glu Leu Met Val Leu Asn Val Pro Arg Leu Met Thr Gin 355 360 365
Asp Cys Leu Gin Gin Ser Arg Lys Val Gly Asp Ser Pro Asn lie Thr 370 375 380
Glu Tyr Met Phe Cys Ala Gly Tyr Ser Asp Gly Ser Lys Asp Ser Cys 385 390 395 400
Lys Gly Asp Ser Gly Gly Pro His Ala Thr His Tyr Arg Gly Thr Trp 405 410 415
Tyr Leu Thr Gly lie Val Ser Trp Gly Gin Gly Cys Ala Thr Val Gly 420 425 430
His Phe Gly Val Tyr Thr Arg Val Ser Gin Tyr lie Glu Trp Leu Gin 435 440 445
Lys Leu Met Arg Ser Glu Pro Arg Pro Gly Val Leu Leu Arg Ala Pro 450 455 460
Phe Pro 465
<210> 42 <211> 466 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Variante de FVII (precursor C254Y) <400> 42
Met Val Ser Gin Ala Leu Arg Leu Leu Cys Leu Leu Leu Gly Leu Gin 15 10 15
Gly Cys Leu Ala Ala Gly Gly Val Ala Lys Ala Ser Gly Gly Glu Thr 20 25 30
Arg Asp Met Pro Trp Lys Pro Gly Pro His Arg Val Phe Val Thr Gin 35 40 45
Glu Glu Ala His Gly Val Leu His Arg Arg Arg Arg Ala Asn Ala Phe 50 55 60
Leu Glu Glu Leu Arg Pro Gly Ser Leu Glu Arg Glu Cys Lys Glu Glu 65 70 75 80
Gin Cys Ser Phe Glu Glu Ala Arg Glu lie Phe Lys Asp Ala Glu Arg 85 90 95
Thr Lys Leu Phe Trp lie Ser Tyr Ser Asp Gly Asp Gin Cys Ala Ser 100 105 110
Ser Pro Cys Gin Asn Gly Gly Ser Cys Lys Asp Gin Leu Gin Ser Tyr 115 120 125 lie Cys Phe Cys Leu Pro Ala Phe Glu Gly Arg Asn Cys Glu Thr His 130 135 140
Lys Asp Asp Gin Leu lie Cys Val Asn Glu Asn Gly Gly Cys Glu Gin 145 150 155 160
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Gly Tyr Ser Leu Leu Ala Asp Gly Val Ser Cys Thr Pro Thr Val Glu 180 185 190
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<210> 43 <211> 466 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Variante de FVII (precursor A266T) <400> 43
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Leu Leu Arg Leu His Gin Pro Val Val Leu Thr Asp His Val Val Pro 305 310 315 320
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Lys lie Lys Asn Trp Arg Asn Leu lie Ala Val Leu Gly Glu His Asp 260 265 270
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Leu Leu Arg Leu His Gin Pro Val Val Leu Thr Asp His Val Val Pro 305 310 315 320
Leu Cys Leu Pro Glu Arg Thr Phe Ser Glu Arg Thr Leu Ala Phe Val 325 330 335
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Thr Ala Leu Glu Leu Met Val Leu Asn Val Pro Arg Leu Met Thr Gin 355 360 365
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Phe Pro 465
<210> 47 <211> 466 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Variante de FVII (precursor D302N) <400> 47
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Gin Cys Ser Phe Glu Glu Ala Arg Glu lie Phe Lys Asp Ala Glu Arg 85 90 95
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Phe Pro 465
<210> 48 <211> 466 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Variante de FVII (precursor A304T) <400> 48
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Phe Pro 465
<210> 49 <211> 466 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Variante de FVII (precursor A304V) <400> 49
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Lys lie Lys Asn Trp Arg Asn Leu lie Ala Val Leu Gly Glu His Asp 260 265 270
Leu Ser Glu His Asp Gly Asp Glu Gin Ser Arg Arg Val Ala Gin Val 275 280 285 lie lie Pro Ser Thr Tyr Val Pro Gly Thr Thr Asn His Asp lie Val 290 295 300
Leu Leu Arg Leu His Gin Pro Val Val Leu Thr Asp His Val Val Pro 305 310 315 320
Leu Cys Leu Pro Glu Arg Thr Phe Ser Glu Arg Thr Leu Ala Phe Val 325 330 335
Arg Phe Ser Leu Val Ser Gly Trp Gly Gin Leu Leu Asp Arg Gly Ala 340 345 350
Thr Ala Leu Glu Leu Met Val Leu Asn Val Pro Arg Leu Met Thr Gin 355 360 365
Asp Cys Leu Gin Gin Ser Arg Lys Val Gly Asp Ser Pro Asn lie Thr 370 375 380
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Lys Gly Asp Ser Gly Gly Pro His Ala Thr His Tyr Arg Gly Thr Trp 405 410 415
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Lys Leu Met Arg Ser Glu Pro Arg Pro Gly Val Leu Leu Arg Ala Pro 450 455 460
Phe Pro 465
<210> 50 <211> 466 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Variante de FVII (precursor R307C) <400> 50
Met Val Ser Gin Ala Leu Arg Leu Leu Cys Leu Leu Leu Gly Leu Gin 15 10 15
Gly Cys Leu Ala Ala Gly Gly Val Ala Lys Ala Ser Gly Gly Glu Thr 20 25 30
Arg Asp Met Pro Trp Lys Pro Gly Pro His Arg Val Phe Val Thr Gin 35 40 45
Glu Glu Ala His Gly Val Leu His Arg Arg Arg Arg Ala Asn Ala Phe 50 55 60
Leu Glu Glu Leu Arg Pro Gly Ser Leu Glu Arg Glu Cys Lys Glu Glu 65 70 75 80
Gin Cys Ser Phe Glu Glu Ala Arg Glu lie Phe Lys Asp Ala Glu Arg 85 90 95
Thr Lys Leu Phe Trp lie Ser Tyr Ser Asp Gly Asp Gin Cys Ala Ser 100 105 110
Ser Pro Cys Gin Asn Gly Gly Ser Cys Lys Asp Gin Leu Gin Ser Tyr 115 120 125 lie Cys Phe Cys Leu Pro Ala Phe Glu Gly Arg Asn Cys Glu Thr His 130 135 140
Lys Asp Asp Gin Leu lie Cys Val Asn Glu Asn Gly Gly Cys Glu Gin 145 150 155 160
Tyr Cys Ser Asp His Thr Gly Thr Lys Arg Ser Cys Arg Cys His Glu 165 170 175
Gly Tyr Ser Leu Leu Ala Asp Gly Val Ser Cys Thr Pro Thr Val Glu 180 185 190
Tyr Pro Cys Gly Lys lie Pro lie Leu Glu Lys Arg Asn Ala Ser Lys 195 200 205
Pro Gin Gly Arg lie Val Gly Gly Lys Val Cys Pro Lys Gly Glu Cys 210 215 220
Pro Trp Gin Val Leu Leu Leu Val Asn Gly Ala Gin Leu Cys Gly Gly 225 230 235 240
Thr Leu lie Asn Thr lie Trp Val Val Ser Ala Ala His Cys Phe Asp 245 250 255
Lys lie Lys Asn Trp Arg Asn Leu lie Ala Val Leu Gly Glu His Asp 260 265 270
Leu Ser Glu His Asp Gly Asp Glu Gin Ser Arg Arg Val Ala Gin Val 275 280 285 lie lie Pro Ser Thr Tyr Val Pro Gly Thr Thr Asn His Asp lie Ala 290 295 300
Leu Leu Cys Leu His Gin Pro Val Val Leu Thr Asp His Val Val Pro 305 310 315 320
Leu Cys Leu Pro Glu Arg Thr Phe Ser Glu Arg Thr Leu Ala Phe Val 325 330 335
Arg Phe Ser Leu Val Ser Gly Trp Gly Gin Leu Leu Asp Arg Gly Ala 340 345 350
Thr Ala Leu Glu Leu Met Val Leu Asn Val Pro Arg Leu Met Thr Gin 355 360 365
Asp Cys Leu Gin Gin Ser Arg Lys Val Gly Asp Ser Pro Asn lie Thr 370 375 380
Glu Tyr Met Phe Cys Ala Gly Tyr Ser Asp Gly Ser Lys Asp Ser Cys 385 390 395 400
Lys Gly Asp Ser Gly Gly Pro His Ala Thr His Tyr Arg Gly Thr Trp 405 410 415
Tyr Leu Thr Gly lie Val Ser Trp Gly Gin Gly Cys Ala Thr Val Gly 420 425 430
His Phe Gly Val Tyr Thr Arg Val Ser Gin Tyr lie Glu Trp Leu Gin 435 440 445
Lys Leu Met Arg Ser Glu Pro Arg Pro Gly Val Leu Leu Arg Ala Pro 450 455 460
Phe Pro 465
<210> 51 <211> 466 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Variante de FVII (precursor R307H) <400> 51
Met Val Ser Gin Ala Leu Arg Leu Leu Cys Leu Leu Leu Gly Leu Gin 15 10 15
Gly Cys Leu Ala Ala Gly Gly Val Ala Lys Ala Ser Gly Gly Glu Thr 20 25 30
Arg Asp Met Pro Trp Lys Pro Gly Pro His Arg Val Phe Val Thr Gin 35 40 45
Glu Glu Ala His Gly Val Leu His Arg Arg Arg Arg Ala Asn Ala Phe 50 55 60
Leu Glu Glu Leu Arg Pro Gly Ser Leu Glu Arg Glu Cys Lys Glu Glu 65 70 75 80
Gin Cys Ser Phe Glu Glu Ala Arg Glu lie Phe Lys Asp Ala Glu Arg 85 90 95
Thr Lys Leu Phe Trp Ile Ser Tyr Ser Asp Gly Asp Gin Cys Ala Ser 100 105 110
Ser Pro Cys Gin Asn Gly Gly Ser Cys Lys Asp Gin Leu Gin Ser Tyr 115 120 125 lie Cys Phe Cys Leu Pro Ala Phe Glu Gly Arg Asn Cys Glu Thr His 130 135 140
Lys Asp Asp Gin Leu Ile Cys Vai Asn Glu Asn Gly Gly Cys Glu Gin 145 150 155 160
Tyr Cys Ser Asp His Thr Gly Thr Lys Arg Ser Cys Arg Cys His Glu 165 170 175
Gly Tyr Ser Leu Leu Ala Asp Gly Vai Ser Cys Thr Pro Thr Vai Glu 180 185 190
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Thr Leu Ile Asn Thr Ile Trp Vai Vai Ser Ala Ala His Cys Phe Asp 245 250 255
Lys Ile Lys Asn Trp Arg Asn Leu Ile Ala Vai Leu Gly Glu His Asp 260 265 270
Leu Ser Glu His Asp Gly Asp Glu Gin Ser Arg Arg Vai Ala Gin Vai 275 280 285 lie lie Pro Ser Thr Tyr Vai Pro Gly Thr Thr Asn His Asp Ile Ala 290 295 300
Leu Leu His Leu His Gin Pro Vai Vai Leu Thr Asp His Vai Vai Pro 305 310 315 320
Leu Cys Leu Pro Glu Arg Thr Phe Ser Glu Arg Thr Leu Ala Phe Vai 325 330 335
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Thr Ala Leu Glu Leu Met Vai Leu Asn Vai Pro Arg Leu Met Thr Gin 355 360 365
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Phe Pro 465
<210> 52 <211> 466 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Variante de FVII (precursor V312M) <400> 52
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Gly Cys Leu Ala Ala Gly Gly Val Ala Lys Ala Ser Gly Gly Glu Thr 20 25 30
Arg Asp Met Pro Trp Lys Pro Gly Pro His Arg Val Phe Val Thr Gin 35 40 45
Glu Glu Ala His Gly Val Leu His Arg Arg Arg Arg Ala Asn Ala Phe 50 55 60
Leu Glu Glu Leu Arg Pro Gly Ser Leu Glu Arg Glu Cys Lys Glu Glu 65 70 75 80
Gin Cys Ser Phe Glu Glu Ala Arg Glu lie Phe Lys Asp Ala Glu Arg 85 90 95
Thr Lys Leu Phe Trp lie Ser Tyr Ser Asp Gly Asp Gin Cys Ala Ser 100 105 110
Ser Pro Cys Gin Asn Gly Gly Ser Cys Lys Asp Gin Leu Gin Ser Tyr 115 120 125 lie Cys Phe Cys Leu Pro Ala Phe Glu Gly Arg Asn Cys Glu Thr His 130 135 140
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Tyr Cys Ser Asp His Thr Gly Thr Lys Arg Ser Cys Arg Cys His Glu 165 170 175
Gly Tyr Ser Leu Leu Ala Asp Gly Val Ser Cys Thr Pro Thr Val Glu 180 185 190
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Phe Pro 465
<210> 53 <211> 466 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Variante de FVII (precursor E325K) <400> 53
Met Val Ser Gin Ala Leu Arg Leu Leu Cys Leu Leu Leu Gly Leu Gin 15 10 15
Gly Cys Leu Ala Ala Gly Gly Val Ala Lys Ala Ser Gly Gly Glu Thr 20 25 30
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Glu Glu Ala His Gly Val Leu His Arg Arg Arg Arg Ala Asn Ala Phe 50 55 60
Leu Glu Glu Leu Arg Pro Gly Ser Leu Glu Arg Glu Cys Lys Glu Glu 65 70 75 80
Gin Cys Ser Phe Glu Glu Ala Arg Glu lie Phe Lys Asp Ala Glu Arg 85 90 95
Thr Lys Leu Phe Trp lie Ser Tyr Ser Asp Gly Asp Gin Cys Ala Ser 100 105 110
Ser Pro Cys Gin Asn Gly Gly Ser Cys Lys Asp Gin Leu Gin Ser Tyr 115 120 125 lie Cys Phe Cys Leu Pro Ala Phe Glu Gly Arg Asn Cys Glu Thr His 130 135 140
Lys Asp Asp Gin Leu lie Cys Val Asn Glu Asn Gly Gly Cys Glu Gin 145 150 155 160
Tyr Cys Ser Asp His Thr Gly Thr Lys Arg Ser Cys Arg Cys His Glu 165 170 175
Gly Tyr Ser Leu Leu Ala Asp Gly Val Ser Cys Thr Pro Thr Val Glu 180 185 190
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Pro Gin Gly Arg lie Val Gly Gly Lys Val Cys Pro Lys Gly Glu Cys 210 215 220
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Thr Leu lie Asn Thr lie Trp Val Val Ser Ala Ala His Cys Phe Asp 245 250 255
Lys lie Lys Asn Trp Arg Asn Leu lie Ala Val Leu Gly Glu His Asp 260 265 270
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Leu Cys Leu Pro Lys Arg Thr Phe Ser Glu Arg Thr Leu Ala Phe Val 325 330 335
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Thr Ala Leu Glu Leu Met Val Leu Asn Val Pro Arg Leu Met Thr Gin 355 360 365
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Phe Pro 465
<210> 54 <211> 466 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Variante de FVII (precursor T332M) <400> 54
Met Val Ser Gin Ala Leu Arg Leu Leu Cys Leu Leu Leu Gly Leu Gin 15 10 15
Gly Cys Leu Ala Ala Gly Gly Val Ala Lys Ala Ser Gly Gly Glu Thr 20 25 30
Arg Asp Met Pro Trp Lys Pro Gly Pro His Arg Val Phe Val Thr Gin 35 40 45
Glu Glu Ala His Gly Val Leu His Arg Arg Arg Arg Ala Asn Ala Phe 50 55 60
Leu Glu Glu Leu Arg Pro Gly Ser Leu Glu Arg Glu Cys Lys Glu Glu 65 70 75 80
Gin Cys Ser Phe Glu Glu Ala Arg Glu lie Phe Lys Asp Ala Glu Arg 85 90 95
Thr Lys Leu Phe Trp Ile Ser Tyr Ser Asp Gly Asp Gin Cys Ala Ser 100 105 110
Ser Pro Cys Gin Asn Gly Gly Ser Cys Lys Asp Gin Leu Gin Ser Tyr 115 120 125 lie Cys Phe Cys Leu Pro Ala Phe Glu Gly Arg Asn Cys Glu Thr His 130 135 140
Lys Asp Asp Gin Leu Ile Cys Vai Asn Glu Asn Gly Gly Cys Glu Gin 145 150 155 160
Tyr Cys Ser Asp His Thr Gly Thr Lys Arg Ser Cys Arg Cys His Glu 165 170 175
Gly Tyr Ser Leu Leu Ala Asp Gly Vai Ser Cys Thr Pro Thr Vai Glu 180 185 190
Tyr Pro Cys Gly Lys lie Pro lie Leu Glu Lys Arg Asn Ala Ser Lys 195 200 205
Pro Gin Gly Arg lie Vai Gly Gly Lys Vai Cys Pro Lys Gly Glu Cys 210 215 220
Pro Trp Gin Vai Leu Leu Leu Vai Asn Gly Ala Gin Leu Cys Gly Gly 225 230 235 240
Thr Leu Ile Asn Thr Ile Trp Vai Vai Ser Ala Ala His Cys Phe Asp 245 250 255
Lys Ile Lys Asn Trp Arg Asn Leu Ile Ala Vai Leu Gly Glu His Asp 260 265 270
Leu Ser Glu His Asp Gly Asp Glu Gin Ser Arg Arg Vai Ala Gin Vai 275 280 285 lie lie Pro Ser Thr Tyr Vai Pro Gly Thr Thr Asn His Asp Ile Ala 290 295 300
Leu Leu Arg Leu His Gin Pro Vai Vai Leu Thr Asp His Vai Vai Pro 305 310 315 320
Leu Cys Leu Pro Glu Arg Thr Phe Ser Glu Arg Met Leu Ala Phe Vai 325 330 335
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Thr Ala Leu Glu Leu Met Vai Leu Asn Vai Pro Arg Leu Met Thr Gin 355 360 365
Asp Cys Leu Gin Gin Ser Arg Lys Vai Gly Asp Ser Pro Asn Ile Thr 370 375 380
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His Phe Gly Vai Tyr Thr Arg Vai Ser Gin Tyr Ile Glu Trp Leu Gin 435 440 445
Lys Leu Met Arg Ser Glu Pro Arg Pro Gly Vai Leu Leu Arg Ala Pro 450 455 460
Phe Pro 465
<210> 55 <211> 466 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Variante de FVII (precursor V341F) <400> 55
Met Val Ser Gin Ala Leu Arg Leu Leu Cys Leu Leu Leu Gly Leu Gin 15 10 15
Gly Cys Leu Ala Ala Gly Gly Val Ala Lys Ala Ser Gly Gly Glu Thr 20 25 30
Arg Asp Met Pro Trp Lys Pro Gly Pro His Arg Val Phe Val Thr Gin 35 40 45
Glu Glu Ala His Gly Val Leu His Arg Arg Arg Arg Ala Asn Ala Phe 50 55 60
Leu Glu Glu Leu Arg Pro Gly Ser Leu Glu Arg Glu Cys Lys Glu Glu 65 70 75 80
Gin Cys Ser Phe Glu Glu Ala Arg Glu lie Phe Lys Asp Ala Glu Arg 85 90 95
Thr Lys Leu Phe Trp lie Ser Tyr Ser Asp Gly Asp Gin Cys Ala Ser 100 105 110
Ser Pro Cys Gin Asn Gly Gly Ser Cys Lys Asp Gin Leu Gin Ser Tyr 115 120 125 lie Cys Phe Cys Leu Pro Ala Phe Glu Gly Arg Asn Cys Glu Thr His 130 135 140
Lys Asp Asp Gin Leu lie Cys Val Asn Glu Asn Gly Gly Cys Glu Gin 145 150 155 160
Tyr Cys Ser Asp His Thr Gly Thr Lys Arg Ser Cys Arg Cys His Glu 165 170 175
Gly Tyr Ser Leu Leu Ala Asp Gly Val Ser Cys Thr Pro Thr Val Glu 180 185 190
Tyr Pro Cys Gly Lys lie Pro lie Leu Glu Lys Arg Asn Ala Ser Lys 195 200 205
Pro Gin Gly Arg lie Val Gly Gly Lys Val Cys Pro Lys Gly Glu Cys 210 215 220
Pro Trp Gin Val Leu Leu Leu Val Asn Gly Ala Gin Leu Cys Gly Gly 225 230 235 240
Thr Leu lie Asn Thr lie Trp Val Val Ser Ala Ala His Cys Phe Asp 245 250 255
Lys lie Lys Asn Trp Arg Asn Leu lie Ala Val Leu Gly Glu His Asp 260 265 270
Leu Ser Glu His Asp Gly Asp Glu Gin Ser Arg Arg Val Ala Gin Val 275 280 285 lie lie Pro Ser Thr Tyr Val Pro Gly Thr Thr Asn His Asp lie Ala 290 295 300
Leu Leu Arg Leu His Gin Pro Val Val Leu Thr Asp His Val Val Pro 305 310 315 320
Leu Cys Leu Pro Glu Arg Thr Phe Ser Glu Arg Thr Leu Ala Phe Val 325 330 335
Arg Phe Ser Leu Phe Ser Gly Trp Gly Gin Leu Leu Asp Arg Gly Ala 340 345 350
Thr Ala Leu Glu Leu Met Val Leu Asn Val Pro Arg Leu Met Thr Gin 355 360 365
Asp Cys Leu Gin Gin Ser Arg Lys Val Gly Asp Ser Pro Asn lie Thr 370 375 380
Glu Tyr Met Phe Cys Ala Gly Tyr Ser Asp Gly Ser Lys Asp Ser Cys 385 390 395 400
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His Phe Gly Val Tyr Thr Arg Val Ser Gin Tyr lie Glu Trp Leu Gin 435 440 445
Lys Leu Met Arg Ser Glu Pro Arg Pro Gly Val Leu Leu Arg Ala Pro 450 455 460
Phe Pro 465
<210> 56 <211> 466 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Variante de FVII (precursor A352T) <400> 5 6
Met Val Ser Gin Ala Leu Arg Leu Leu Cys Leu Leu Leu Gly Leu Gin 15 10 15
Gly Cys Leu Ala Ala Gly Gly Val Ala Lys Ala Ser Gly Gly Glu Thr 20 25 30
Arg Asp Met Pro Trp Lys Pro Gly Pro His Arg Val Phe Val Thr Gin 35 40 45
Glu Glu Ala His Gly Val Leu His Arg Arg Arg Arg Ala Asn Ala Phe 50 55 60
Leu Glu Glu Leu Arg Pro Gly Ser Leu Glu Arg Glu Cys Lys Glu Glu 65 70 75 80
Gin Cys Ser Phe Glu Glu Ala Arg Glu lie Phe Lys Asp Ala Glu Arg 85 90 95
Thr Lys Leu Phe Trp lie Ser Tyr Ser Asp Gly Asp Gin Cys Ala Ser 100 105 110
Ser Pro Cys Gin Asn Gly Gly Ser Cys Lys Asp Gin Leu Gin Ser Tyr 115 120 125 lie Cys Phe Cys Leu Pro Ala Phe Glu Gly Arg Asn Cys Glu Thr His 130 135 140
Lys Asp Asp Gin Leu lie Cys Val Asn Glu Asn Gly Gly Cys Glu Gin 145 150 155 160
Tyr Cys Ser Asp His Thr Gly Thr Lys Arg Ser Cys Arg Cys His Glu 165 170 175
Gly Tyr Ser Leu Leu Ala Asp Gly Val Ser Cys Thr Pro Thr Val Glu 180 185 190
Tyr Pro Cys Gly Lys lie Pro lie Leu Glu Lys Arg Asn Ala Ser Lys 195 200 205
Pro Gin Gly Arg lie Val Gly Gly Lys Val Cys Pro Lys Gly Glu Cys 210 215 220
Pro Trp Gin Val Leu Leu Leu Val Asn Gly Ala Gin Leu Cys Gly Gly 225 230 235 240
Thr Leu lie Asn Thr lie Trp Val Val Ser Ala Ala His Cys Phe Asp 245 250 255
Lys lie Lys Asn Trp Arg Asn Leu lie Ala Val Leu Gly Glu His Asp 260 265 270
Leu Ser Glu His Asp Gly Asp Glu Gin Ser Arg Arg Val Ala Gin Val 275 280 285 lie lie Pro Ser Thr Tyr Val Pro Gly Thr Thr Asn His Asp lie Ala 290 295 300
Leu Leu Arg Leu His Gin Pro Val Val Leu Thr Asp His Val Val Pro 305 310 315 320
Leu Cys Leu Pro Glu Arg Thr Phe Ser Glu Arg Thr Leu Ala Phe Val 325 330 335
Arg Phe Ser Leu Val Ser Gly Trp Gly Gin Leu Leu Asp Arg Gly Thr 340 345 350
Thr Ala Leu Glu Leu Met Val Leu Asn Val Pro Arg Leu Met Thr Gin 355 360 365
Asp Cys Leu Gin Gin Ser Arg Lys Val Gly Asp Ser Pro Asn lie Thr 370 375 380
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Lys Gly Asp Ser Gly Gly Pro His Ala Thr His Tyr Arg Gly Thr Trp 405 410 415
Tyr Leu Thr Gly lie Val Ser Trp Gly Gin Gly Cys Ala Thr Val Gly 420 425 430
His Phe Gly Val Tyr Thr Arg Val Ser Gin Tyr lie Glu Trp Leu Gin 435 440 445
Lys Leu Met Arg Ser Glu Pro Arg Pro Gly Val Leu Leu Arg Ala Pro 450 455 460
Phe Pro 465
<210> 57 <211> 466 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Variante de FVII (precursor A354V) <400> 57
Met Val Ser Gin Ala Leu Arg Leu Leu Cys Leu Leu Leu Gly Leu Gin 15 10 15
Gly Cys Leu Ala Ala Gly Gly Val Ala Lys Ala Ser Gly Gly Glu Thr 20 25 30
Arg Asp Met Pro Trp Lys Pro Gly Pro His Arg Val Phe Val Thr Gin 35 40 45
Glu Glu Ala His Gly Val Leu His Arg Arg Arg Arg Ala Asn Ala Phe 50 55 60
Leu Glu Glu Leu Arg Pro Gly Ser Leu Glu Arg Glu Cys Lys Glu Glu 65 70 75 80
Gin Cys Ser Phe Glu Glu Ala Arg Glu lie Phe Lys Asp Ala Glu Arg 85 90 95
Thr Lys Leu Phe Trp Ile Ser Tyr Ser Asp Gly Asp Gin Cys Ala Ser 100 105 110
Ser Pro Cys Gin Asn Gly Gly Ser Cys Lys Asp Gin Leu Gin Ser Tyr 115 120 125 lie Cys Phe Cys Leu Pro Ala Phe Glu Gly Arg Asn Cys Glu Thr His 130 135 140
Lys Asp Asp Gin Leu Ile Cys Vai Asn Glu Asn Gly Gly Cys Glu Gin 145 150 155 160
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Pro Trp Gin Vai Leu Leu Leu Vai Asn Gly Ala Gin Leu Cys Gly Gly 225 230 235 240
Thr Leu Ile Asn Thr Ile Trp Vai Vai Ser Ala Ala His Cys Phe Asp 245 250 255
Lys Ile Lys Asn Trp Arg Asn Leu Ile Ala Vai Leu Gly Glu His Asp 260 265 270
Leu Ser Glu His Asp Gly Asp Glu Gin Ser Arg Arg Vai Ala Gin Vai 275 280 285 lie lie Pro Ser Thr Tyr Vai Pro Gly Thr Thr Asn His Asp Ile Ala 290 295 300
Leu Leu Arg Leu His Gin Pro Vai Vai Leu Thr Asp His Vai Vai Pro 305 310 315 320
Leu Cys Leu Pro Glu Arg Thr Phe Ser Glu Arg Thr Leu Ala Phe Vai 325 330 335
Arg Phe Ser Leu Vai Ser Gly Trp Gly Gin Leu Leu Asp Arg Gly Ala 340 345 350
Thr Vai Leu Glu Leu Met Vai Leu Asn Vai Pro Arg Leu Met Thr Gin 355 360 365
Asp Cys Leu Gin Gin Ser Arg Lys Vai Gly Asp Ser Pro Asn Ile Thr 370 375 380
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Lys Gly Asp Ser Gly Gly Pro His Ala Thr His Tyr Arg Gly Thr Trp 405 410 415
Tyr Leu Thr Gly Ile Vai Ser Trp Gly Gin Gly Cys Ala Thr Vai Gly 420 425 430
His Phe Gly Vai Tyr Thr Arg Vai Ser Gin Tyr Ile Glu Trp Leu Gin 435 440 445
Lys Leu Met Arg Ser Glu Pro Arg Pro Gly Vai Leu Leu Arg Ala Pro 450 455 460
Phe Pro 465
<210> 58 <211> 466 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Variante de FVII (precursor M358I) <400> 58
Met Val Ser Gin Ala Leu Arg Leu Leu Cys Leu Leu Leu Gly Leu Gin 15 10 15
Gly Cys Leu Ala Ala Gly Gly Val Ala Lys Ala Ser Gly Gly Glu Thr 20 25 30
Arg Asp Met Pro Trp Lys Pro Gly Pro His Arg Val Phe Val Thr Gin 35 40 45
Glu Glu Ala His Gly Val Leu His Arg Arg Arg Arg Ala Asn Ala Phe 50 55 60
Leu Glu Glu Leu Arg Pro Gly Ser Leu Glu Arg Glu Cys Lys Glu Glu 65 70 75 80
Gin Cys Ser Phe Glu Glu Ala Arg Glu lie Phe Lys Asp Ala Glu Arg 85 90 95
Thr Lys Leu Phe Trp lie Ser Tyr Ser Asp Gly Asp Gin Cys Ala Ser 100 105 110
Ser Pro Cys Gin Asn Gly Gly Ser Cys Lys Asp Gin Leu Gin Ser Tyr 115 120 125 lie Cys Phe Cys Leu Pro Ala Phe Glu Gly Arg Asn Cys Glu Thr His 130 135 140
Lys Asp Asp Gin Leu lie Cys Val Asn Glu Asn Gly Gly Cys Glu Gin 145 150 155 160
Tyr Cys Ser Asp His Thr Gly Thr Lys Arg Ser Cys Arg Cys His Glu 165 170 175
Gly Tyr Ser Leu Leu Ala Asp Gly Val Ser Cys Thr Pro Thr Val Glu 180 185 190
Tyr Pro Cys Gly Lys lie Pro lie Leu Glu Lys Arg Asn Ala Ser Lys 195 200 205
Pro Gin Gly Arg lie Val Gly Gly Lys Val Cys Pro Lys Gly Glu Cys 210 215 220
Pro Trp Gin Val Leu Leu Leu Val Asn Gly Ala Gin Leu Cys Gly Gly 225 230 235 240
Thr Leu lie Asn Thr lie Trp Val Val Ser Ala Ala His Cys Phe Asp 245 250 255
Lys lie Lys Asn Trp Arg Asn Leu lie Ala Val Leu Gly Glu His Asp 260 265 270
Leu Ser Glu His Asp Gly Asp Glu Gin Ser Arg Arg Val Ala Gin Val 275 280 285 lie lie Pro Ser Thr Tyr Val Pro Gly Thr Thr Asn His Asp lie Ala 290 295 300
Leu Leu Arg Leu His Gin Pro Val Val Leu Thr Asp His Val Val Pro 305 310 315 320
Leu Cys Leu Pro Glu Arg Thr Phe Ser Glu Arg Thr Leu Ala Phe Val 325 330 335
Arg Phe Ser Leu Val Ser Gly Trp Gly Gin Leu Leu Asp Arg Gly Ala 340 345 350
Thr Ala Leu Glu Leu lie Val Leu Asn Val Pro Arg Leu Met Thr Gin 355 360 365
Asp Cys Leu Gin Gin Ser Arg Lys Val Gly Asp Ser Pro Asn lie Thr 370 375 380
Glu Tyr Met Phe Cys Ala Gly Tyr Ser Asp Gly Ser Lys Asp Ser Cys 385 390 395 400
Lys Gly Asp Ser Gly Gly Pro His Ala Thr His Tyr Arg Gly Thr Trp 405 410 415
Tyr Leu Thr Gly lie Val Ser Trp Gly Gin Gly Cys Ala Thr Val Gly 420 425 430
His Phe Gly Val Tyr Thr Arg Val Ser Gin Tyr lie Glu Trp Leu Gin 435 440 445
Lys Leu Met Arg Ser Glu Pro Arg Pro Gly Val Leu Leu Arg Ala Pro 450 455 460
Phe Pro 465
<210> 59 <211> 466 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Variante de FVII (precursor M358V) <400> 59
Met Val Ser Gin Ala Leu Arg Leu Leu Cys Leu Leu Leu Gly Leu Gin 15 10 15
Gly Cys Leu Ala Ala Gly Gly Val Ala Lys Ala Ser Gly Gly Glu Thr 20 25 30
Arg Asp Met Pro Trp Lys Pro Gly Pro His Arg Val Phe Val Thr Gin 35 40 45
Glu Glu Ala His Gly Val Leu His Arg Arg Arg Arg Ala Asn Ala Phe 50 55 60
Leu Glu Glu Leu Arg Pro Gly Ser Leu Glu Arg Glu Cys Lys Glu Glu 65 70 75 80
Gin Cys Ser Phe Glu Glu Ala Arg Glu lie Phe Lys Asp Ala Glu Arg 85 90 95
Thr Lys Leu Phe Trp lie Ser Tyr Ser Asp Gly Asp Gin Cys Ala Ser 100 105 110
Ser Pro Cys Gin Asn Gly Gly Ser Cys Lys Asp Gin Leu Gin Ser Tyr 115 120 125 lie Cys Phe Cys Leu Pro Ala Phe Glu Gly Arg Asn Cys Glu Thr His 130 135 140
Lys Asp Asp Gin Leu lie Cys Val Asn Glu Asn Gly Gly Cys Glu Gin 145 150 155 160
Tyr Cys Ser Asp His Thr Gly Thr Lys Arg Ser Cys Arg Cys His Glu 165 170 175
Gly Tyr Ser Leu Leu Ala Asp Gly Val Ser Cys Thr Pro Thr Val Glu 180 185 190
Tyr Pro Cys Gly Lys lie Pro lie Leu Glu Lys Arg Asn Ala Ser Lys 195 200 205
Pro Gin Gly Arg lie Val Gly Gly Lys Val Cys Pro Lys Gly Glu Cys 210 215 220
Pro Trp Gin Val Leu Leu Leu Val Asn Gly Ala Gin Leu Cys Gly Gly 225 230 235 240
Thr Leu lie Asn Thr lie Trp Val Val Ser Ala Ala His Cys Phe Asp 245 250 255
Lys lie Lys Asn Trp Arg Asn Leu lie Ala Val Leu Gly Glu His Asp 260 265 270
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Leu Leu Arg Leu His Gin Pro Val Val Leu Thr Asp His Val Val Pro 305 310 315 320
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Arg Phe Ser Leu Val Ser Gly Trp Gly Gin Leu Leu Asp Arg Gly Ala 340 345 350
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Glu Tyr Met Phe Cys Ala Gly Tyr Ser Asp Gly Ser Lys Asp Ser Cys 385 390 395 400
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Lys Leu Met Arg Ser Glu Pro Arg Pro Gly Val Leu Leu Arg Ala Pro 450 455 460
Phe Pro 465
<210> 60 <211> 466 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Variante de FVII (precursor P363R) <400> 60
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Lys lie Lys Asn Trp Arg Asn Leu lie Ala Val Leu Gly Glu His Asp 260 265 270
Leu Ser Glu His Asp Gly Asp Glu Gin Ser Arg Arg Val Ala Gin Val 275 280 285 lie lie Pro Ser Thr Tyr Val Pro Gly Thr Thr Asn His Asp lie Ala 290 295 300
Leu Leu Arg Leu His Gin Pro Val Val Leu Thr Asp His Val Val Pro 305 310 315 320
Leu Cys Leu Pro Glu Arg Thr Phe Ser Glu Arg Thr Leu Ala Phe Val 325 330 335
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Phe Pro 465
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Gly Cys Leu Ala Ala Gly Gly Val Ala Lys Ala Ser Gly Gly Glu Thr 20 25 30
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Phe Pro 465
<210> 62 <211> 466 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Variante de FVII (precursor T367S) <400> 62
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Gly Cys Leu Ala Ala Gly Gly Val Ala Lys Ala Ser Gly Gly Glu Thr 20 25 30
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Leu Ser Glu His Asp Gly Asp Glu Gin Ser Arg Arg Val Ala Gin Val 275 280 285 lie lie Pro Ser Thr Tyr Val Pro Gly Thr Thr Asn His Asp lie Ala 290 295 300
Leu Leu Arg Leu His Gin Pro Val Val Leu Thr Asp His Val Val Pro 305 310 315 320
Leu Cys Leu Pro Glu Arg Thr Phe Ser Glu Arg Thr Leu Ala Phe Val 325 330 335
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Thr Ala Leu Glu Leu Met Val Leu Asn Val Pro Arg Leu Met Ser Gin 355 360 365
Asp Cys Leu Gin Gin Ser Arg Lys Val Gly Asp Ser Pro Asn lie Thr 370 375 380
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Phe Pro 465
<210> 63 <211> 466 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Variante de FVII (precursor C370F) <400> 63
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Gly Cys Leu Ala Ala Gly Gly Val Ala Lys Ala Ser Gly Gly Glu Thr 20 25 30
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Thr Leu lie Asn Thr lie Trp Val Val Ser Ala Ala His Cys Phe Asp 245 250 255
Lys lie Lys Asn Trp Arg Asn Leu lie Ala Val Leu Gly Glu His Asp 260 265 270
Leu Ser Glu His Asp Gly Asp Glu Gin Ser Arg Arg Val Ala Gin Val 275 280 285 lie lie Pro Ser Thr Tyr Val Pro Gly Thr Thr Asn His Asp lie Ala 290 295 300
Leu Leu Arg Leu His Gin Pro Val Val Leu Thr Asp His Val Val Pro 305 310 315 320
Leu Cys Leu Pro Glu Arg Thr Phe Ser Glu Arg Thr Leu Ala Phe Val 325 330 335
Arg Phe Ser Leu Val Ser Gly Trp Gly Gin Leu Leu Asp Arg Gly Ala 340 345 350
Thr Ala Leu Glu Leu Met Val Leu Asn Val Pro Arg Leu Met Thr Gin 355 360 365
Asp Phe Leu Gin Gin Ser Arg Lys Val Gly Asp Ser Pro Asn lie Thr 370 375 380
Glu Tyr Met Phe Cys Ala Gly Tyr Ser Asp Gly Ser Lys Asp Ser Cys 385 390 395 400
Lys Gly Asp Ser Gly Gly Pro His Ala Thr His Tyr Arg Gly Thr Trp 405 410 415
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His Phe Gly Val Tyr Thr Arg Val Ser Gin Tyr lie Glu Trp Leu Gin 435 440 445
Lys Leu Met Arg Ser Glu Pro Arg Pro Gly Val Leu Leu Arg Ala Pro 450 455 460
Phe Pro 465
<210> 64 <211> 466 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Variante de FVII (precursor C389G) <400> 64
Met Val Ser Gin Ala Leu Arg Leu Leu Cys Leu Leu Leu Gly Leu Gin 15 10 15
Gly Cys Leu Ala Ala Gly Gly Val Ala Lys Ala Ser Gly Gly Glu Thr 20 25 30
Arg Asp Met Pro Trp Lys Pro Gly Pro His Arg Val Phe Val Thr Gin 35 40 45
Glu Glu Ala His Gly Val Leu His Arg Arg Arg Arg Ala Asn Ala Phe 50 55 60
Leu Glu Glu Leu Arg Pro Gly Ser Leu Glu Arg Glu Cys Lys Glu Glu 65 70 75 80
Gin Cys Ser Phe Glu Glu Ala Arg Glu lie Phe Lys Asp Ala Glu Arg 85 90 95
Thr Lys Leu Phe Trp lie Ser Tyr Ser Asp Gly Asp Gin Cys Ala Ser 100 105 110
Ser Pro Cys Gin Asn Gly Gly Ser Cys Lys Asp Gin Leu Gin Ser Tyr 115 120 125 lie Cys Phe Cys Leu Pro Ala Phe Glu Gly Arg Asn Cys Glu Thr His 130 135 140
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Tyr Cys Ser Asp His Thr Gly Thr Lys Arg Ser Cys Arg Cys His Glu 165 170 175
Gly Tyr Ser Leu Leu Ala Asp Gly Val Ser Cys Thr Pro Thr Val Glu 180 185 190
Tyr Pro Cys Gly Lys lie Pro lie Leu Glu Lys Arg Asn Ala Ser Lys 195 200 205
Pro Gin Gly Arg lie Val Gly Gly Lys Val Cys Pro Lys Gly Glu Cys 210 215 220
Pro Trp Gin Val Leu Leu Leu Val Asn Gly Ala Gin Leu Cys Gly Gly 225 230 235 240
Thr Leu lie Asn Thr lie Trp Val Val Ser Ala Ala His Cys Phe Asp 245 250 255
Lys lie Lys Asn Trp Arg Asn Leu lie Ala Val Leu Gly Glu His Asp 260 265 270
Leu Ser Glu His Asp Gly Asp Glu Gin Ser Arg Arg Val Ala Gin Val 275 280 285 lie lie Pro Ser Thr Tyr Val Pro Gly Thr Thr Asn His Asp lie Ala 290 295 300
Leu Leu Arg Leu His Gin Pro Val Val Leu Thr Asp His Val Val Pro 305 310 315 320
Leu Cys Leu Pro Glu Arg Thr Phe Ser Glu Arg Thr Leu Ala Phe Val 325 330 335
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Thr Ala Leu Glu Leu Met Val Leu Asn Val Pro Arg Leu Met Thr Gin 355 360 365
Asp Cys Leu Gin Gin Ser Arg Lys Val Gly Asp Ser Pro Asn lie Thr 370 375 380
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Lys Gly Asp Ser Gly Gly Pro His Ala Thr His Tyr Arg Gly Thr Trp 405 410 415
Tyr Leu Thr Gly He Val Ser Trp Gly Gin Gly Cys Ala Thr Val Gly 420 425 430
His Phe Gly Val Tyr Thr Arg Val Ser Gin Tyr lie Glu Trp Leu Gin 435 440 445
Lys Leu Met Arg Ser Glu Pro Arg Pro Gly Val Leu Leu Arg Ala Pro 450 455 460
Phe Pro 465
<210> 65 <211> 466 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Variante de FVII (precursor G391S) <400> 65
Met Val Ser Gin Ala Leu Arg Leu Leu Cys Leu Leu Leu Gly Leu Gin 15 10 15
Gly Cys Leu Ala Ala Gly Gly Val Ala Lys Ala Ser Gly Gly Glu Thr 20 25 30
Arg Asp Met Pro Trp Lys Pro Gly Pro His Arg Val Phe Val Thr Gin 35 40 45
Glu Glu Ala His Gly Val Leu His Arg Arg Arg Arg Ala Asn Ala Phe 50 55 60
Leu Glu Glu Leu Arg Pro Gly Ser Leu Glu Arg Glu Cys Lys Glu Glu 65 70 75 80
Gin Cys Ser Phe Glu Glu Ala Arg Glu He Phe Lys Asp Ala Glu Arg 85 90 95
Thr Lys Leu Phe Trp He Ser Tyr Ser Asp Gly Asp Gin Cys Ala Ser 100 105 110
Ser Pro Cys Gin Asn Gly Gly Ser Cys Lys Asp Gin Leu Gin Ser Tyr 115 120 125
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Gly Tyr Ser Leu Leu Ala Asp Gly Val Ser Cys Thr Pro Thr Val Glu 180 185 190
Tyr Pro Cys Gly Lys He Pro He Leu Glu Lys Arg Asn Ala Ser Lys 195 200 205
Pro Gin Gly Arg He Val Gly Gly Lys Val Cys Pro Lys Gly Glu Cys 210 215 220
Pro Trp Gin Val Leu Leu Leu Val Asn Gly Ala Gin Leu Cys Gly Gly 225 230 235 240
Thr Leu He Asn Thr He Trp Val Val Ser Ala Ala His Cys Phe Asp 245 250 255
Lys lie Lys Asn Trp Arg Asn Leu lie Ala Val Leu Gly Glu His Asp 260 265 270
Leu Ser Glu His Asp Gly Asp Glu Gin Ser Arg Arg Val Ala Gin Val 275 280 285 lie lie Pro Ser Thr Tyr Val Pro Gly Thr Thr Asn His Asp lie Ala 290 295 300
Leu Leu Arg Leu His Gin Pro Val Val Leu Thr Asp His Val Val Pro 305 310 315 320
Leu Cys Leu Pro Glu Arg Thr Phe Ser Glu Arg Thr Leu Ala Phe Val 325 330 335
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His Phe Gly Val Tyr Thr Arg Val Ser Gin Tyr lie Glu Trp Leu Gin 435 440 445
Lys Leu Met Arg Ser Glu Pro Arg Pro Gly Val Leu Leu Arg Ala Pro 450 455 460
Phe Pro 465
<210> 6 6 <211> 466 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Variante de FVII (precursor G402E) <400> 6 6
Met Val Ser Gin Ala Leu Arg Leu Leu Cys Leu Leu Leu Gly Leu Gin 15 10 15
Gly Cys Leu Ala Ala Gly Gly Val Ala Lys Ala Ser Gly Gly Glu Thr 20 25 30
Arg Asp Met Pro Trp Lys Pro Gly Pro His Arg Val Phe Val Thr Gin 35 40 45
Glu Glu Ala His Gly Val Leu His Arg Arg Arg Arg Ala Asn Ala Phe 50 55 60
Leu Glu Glu Leu Arg Pro Gly Ser Leu Glu Arg Glu Cys Lys Glu Glu 65 70 75 80
Gin Cys Ser Phe Glu Glu Ala Arg Glu lie Phe Lys Asp Ala Glu Arg 85 90 95
Thr Lys Leu Phe Trp lie Ser Tyr Ser Asp Gly Asp Gin Cys Ala Ser 100 105 110
Ser Pro Cys Gin Asn Gly Gly Ser Cys Lys Asp Gin Leu Gin Ser Tyr 115 120 125 lie Cys Phe Cys Leu Pro Ala Phe Glu Gly Arg Asn Cys Glu Thr His 130 135 140
Lys Asp Asp Gin Leu lie Cys Val Asn Glu Asn Gly Gly Cys Glu Gin 145 150 155 160
Tyr Cys Ser Asp His Thr Gly Thr Lys Arg Ser Cys Arg Cys His Glu 165 170 175
Gly Tyr Ser Leu Leu Ala Asp Gly Val Ser Cys Thr Pro Thr Val Glu 180 185 190
Tyr Pro Cys Gly Lys lie Pro lie Leu Glu Lys Arg Asn Ala Ser Lys 195 200 205
Pro Gin Gly Arg lie Val Gly Gly Lys Val Cys Pro Lys Gly Glu Cys 210 215 220
Pro Trp Gin Val Leu Leu Leu Val Asn Gly Ala Gin Leu Cys Gly Gly 225 230 235 240
Thr Leu lie Asn Thr lie Trp Val Val Ser Ala Ala His Cys Phe Asp 245 250 255
Lys lie Lys Asn Trp Arg Asn Leu lie Ala Val Leu Gly Glu His Asp 260 265 270
Leu Ser Glu His Asp Gly Asp Glu Gin Ser Arg Arg Val Ala Gin Val 275 280 285 lie lie Pro Ser Thr Tyr Val Pro Gly Thr Thr Asn His Asp lie Ala 290 295 300
Leu Leu Arg Leu His Gin Pro Val Val Leu Thr Asp His Val Val Pro 305 310 315 320
Leu Cys Leu Pro Glu Arg Thr Phe Ser Glu Arg Thr Leu Ala Phe Val 325 330 335
Arg Phe Ser Leu Val Ser Gly Trp Gly Gin Leu Leu Asp Arg Gly Ala 340 345 350
Thr Ala Leu Glu Leu Met Val Leu Asn Val Pro Arg Leu Met Thr Gin 355 360 365
Asp Cys Leu Gin Gin Ser Arg Lys Val Gly Asp Ser Pro Asn lie Thr 370 375 380
Glu Tyr Met Phe Cys Ala Gly Tyr Ser Asp Gly Ser Lys Asp Ser Cys 385 390 395 400
Lys Glu Asp Ser Gly Gly Pro His Ala Thr His Tyr Arg Gly Thr Trp 405 410 415
Tyr Leu Thr Gly lie Val Ser Trp Gly Gin Gly Cys Ala Thr Val Gly 420 425 430
His Phe Gly Val Tyr Thr Arg Val Ser Gin Tyr lie Glu Trp Leu Gin 435 440 445
Lys Leu Met Arg Ser Glu Pro Arg Pro Gly Val Leu Leu Arg Ala Pro 450 455 460
Phe Pro 465
<210> 67 <211> 466 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Variante de FVII (precursor G402R) <4 Ο Ο > 67
Met Vai Ser Gin Ala Leu Arg Leu Leu Cys Leu Leu Leu Gly Leu Gin 15 10 15
Gly Cys Leu Ala Ala Gly Gly Val Ala Lys Ala Ser Gly Gly Glu Thr 20 25 30
Arg Asp Met Pro Trp Lys Pro Gly Pro His Arg Val Phe Val Thr Gin 35 40 45
Glu Glu Ala His Gly Val Leu His Arg Arg Arg Arg Ala Asn Ala Phe 50 55 60
Leu Glu Glu Leu Arg Pro Gly Ser Leu Glu Arg Glu Cys Lys Glu Glu 65 70 75 80
Gin Cys Ser Phe Glu Glu Ala Arg Glu lie Phe Lys Asp Ala Glu Arg 85 90 95
Thr Lys Leu Phe Trp lie Ser Tyr Ser Asp Gly Asp Gin Cys Ala Ser 100 105 110
Ser Pro Cys Gin Asn Gly Gly Ser Cys Lys Asp Gin Leu Gin Ser Tyr 115 120 125 lie Cys Phe Cys Leu Pro Ala Phe Glu Gly Arg Asn Cys Glu Thr His 130 135 140
Lys Asp Asp Gin Leu lie Cys Val Asn Glu Asn Gly Gly Cys Glu Gin 145 150 155 160
Tyr Cys Ser Asp His Thr Gly Thr Lys Arg Ser Cys Arg Cys His Glu 165 170 175
Gly Tyr Ser Leu Leu Ala Asp Gly Val Ser Cys Thr Pro Thr Val Glu 180 185 190
Tyr Pro Cys Gly Lys lie Pro lie Leu Glu Lys Arg Asn Ala Ser Lys 195 200 205
Pro Gin Gly Arg lie Val Gly Gly Lys Val Cys Pro Lys Gly Glu Cys 210 215 220
Pro Trp Gin Val Leu Leu Leu Val Asn Gly Ala Gin Leu Cys Gly Gly 225 230 235 240
Thr Leu lie Asn Thr lie Trp Val Val Ser Ala Ala His Cys Phe Asp 245 250 255
Lys lie Lys Asn Trp Arg Asn Leu lie Ala Val Leu Gly Glu His Asp 260 265 270
Leu Ser Glu His Asp Gly Asp Glu Gin Ser Arg Arg Val Ala Gin Val 275 280 285 lie lie Pro Ser Thr Tyr Val Pro Gly Thr Thr Asn His Asp lie Ala 290 295 300
Leu Leu Arg Leu His Gin Pro Val Val Leu Thr Asp His Val Val Pro 305 310 315 320
Leu Cys Leu Pro Glu Arg Thr Phe Ser Glu Arg Thr Leu Ala Phe Val 325 330 335
Arg Phe Ser Leu Val Ser Gly Trp Gly Gin Leu Leu Asp Arg Gly Ala 340 345 350
Thr Ala Leu Glu Leu Met Val Leu Asn Val Pro Arg Leu Met Thr Gin 355 360 365
Asp Cys Leu Gin Gin Ser Arg Lys Val Gly Asp Ser Pro Asn lie Thr 370 375 380
Glu Tyr Met Phe Cys Ala Gly Tyr Ser Asp Gly Ser Lys Asp Ser Cys 385 390 395 400
Lys Arg Asp Ser Gly Gly Pro His Ala Thr His Tyr Arg Gly Thr Trp 405 410 415
Tyr Leu Thr Gly lie Val Ser Trp Gly Gin Gly Cys Ala Thr Val Gly 420 425 430
His Phe Gly Val Tyr Thr Arg Val Ser Gin Tyr lie Glu Trp Leu Gin 435 440 445
Lys Leu Met Arg Ser Glu Pro Arg Pro Gly Val Leu Leu Arg Ala Pro 450 455 460
Phe Pro 465
<210> 68 <211> 466 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Variante de FVII (precursor D403H) <400> 68
Met Val Ser Gin Ala Leu Arg Leu Leu Cys Leu Leu Leu Gly Leu Gin 15 10 15
Gly Cys Leu Ala Ala Gly Gly Val Ala Lys Ala Ser Gly Gly Glu Thr 20 25 30
Arg Asp Met Pro Trp Lys Pro Gly Pro His Arg Val Phe Val Thr Gin 35 40 45
Glu Glu Ala His Gly Val Leu His Arg Arg Arg Arg Ala Asn Ala Phe 50 55 60
Leu Glu Glu Leu Arg Pro Gly Ser Leu Glu Arg Glu Cys Lys Glu Glu 65 70 75 80
Gin Cys Ser Phe Glu Glu Ala Arg Glu lie Phe Lys Asp Ala Glu Arg 85 90 95
Thr Lys Leu Phe Trp lie Ser Tyr Ser Asp Gly Asp Gin Cys Ala Ser 100 105 110
Ser Pro Cys Gin Asn Gly Gly Ser Cys Lys Asp Gin Leu Gin Ser Tyr 115 120 125 lie Cys Phe Cys Leu Pro Ala Phe Glu Gly Arg Asn Cys Glu Thr His 130 135 140
Lys Asp Asp Gin Leu lie Cys Val Asn Glu Asn Gly Gly Cys Glu Gin 145 150 155 160
Tyr Cys Ser Asp His Thr Gly Thr Lys Arg Ser Cys Arg Cys His Glu 165 170 175
Gly Tyr Ser Leu Leu Ala Asp Gly Val Ser Cys Thr Pro Thr Val Glu 180 185 190
Tyr Pro Cys Gly Lys lie Pro lie Leu Glu Lys Arg Asn Ala Ser Lys 195 200 205
Pro Gin Gly Arg lie Val Gly Gly Lys Val Cys Pro Lys Gly Glu Cys 210 215 220
Pro Trp Gin Val Leu Leu Leu Val Asn Gly Ala Gin Leu Cys Gly Gly 225 230 235 240
Thr Leu lie Asn Thr lie Trp Val Val Ser Ala Ala His Cys Phe Asp 245 250 255
Lys lie Lys Asn Trp Arg Asn Leu lie Ala Val Leu Gly Glu His Asp 260 265 270
Leu Ser Glu His Asp Gly Asp Glu Gin Ser Arg Arg Val Ala Gin Val 275 280 285 lie lie Pro Ser Thr Tyr Val Pro Gly Thr Thr Asn His Asp lie Ala 290 295 300
Leu Leu Arg Leu His Gin Pro Val Val Leu Thr Asp His Val Val Pro 305 310 315 320
Leu Cys Leu Pro Glu Arg Thr Phe Ser Glu Arg Thr Leu Ala Phe Val 325 330 335
Arg Phe Ser Leu Val Ser Gly Trp Gly Gin Leu Leu Asp Arg Gly Ala 340 345 350
Thr Ala Leu Glu Leu Met Val Leu Asn Val Pro Arg Leu Met Thr Gin 355 360 365
Asp Cys Leu Gin Gin Ser Arg Lys Val Gly Asp Ser Pro Asn lie Thr 370 375 380
Glu Tyr Met Phe Cys Ala Gly Tyr Ser Asp Gly Ser Lys Asp Ser Cys 385 390 395 400
Lys Gly His Ser Gly Gly Pro His Ala Thr His Tyr Arg Gly Thr Trp 405 410 415
Tyr Leu Thr Gly lie Val Ser Trp Gly Gin Gly Cys Ala Thr Val Gly 420 425 430
His Phe Gly Val Tyr Thr Arg Val Ser Gin Tyr lie Glu Trp Leu Gin 435 440 445
Lys Leu Met Arg Ser Glu Pro Arg Pro Gly Val Leu Leu Arg Ala Pro 450 455 460
Phe Pro 465
<210> 69 <211> 466 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Variante de FVII (precursor R413Q) <400> 6 9
Met Val Ser Gin Ala Leu Arg Leu Leu Cys Leu Leu Leu Gly Leu Gin 15 10 15
Gly Cys Leu Ala Ala Gly Gly Val Ala Lys Ala Ser Gly Gly Glu Thr 20 25 30
Arg Asp Met Pro Trp Lys Pro Gly Pro His Arg Val Phe Val Thr Gin 35 40 45
Glu Glu Ala His Gly Val Leu His Arg Arg Arg Arg Ala Asn Ala Phe 50 55 60
Leu Glu Glu Leu Arg Pro Gly Ser Leu Glu Arg Glu Cys Lys Glu Glu 65 70 75 80
Gin Cys Ser Phe Glu Glu Ala Arg Glu lie Phe Lys Asp Ala Glu Arg 85 90 95
Thr Lys Leu Phe Trp lie Ser Tyr Ser Asp Gly Asp Gin Cys Ala Ser 100 105 110
Ser Pro Cys Gin Asn Gly Gly Ser Cys Lys Asp Gin Leu Gin Ser Tyr 115 120 125 lie Cys Phe Cys Leu Pro Ala Phe Glu Gly Arg Asn Cys Glu Thr His 130 135 140
Lys Asp Asp Gin Leu lie Cys Val Asn Glu Asn Gly Gly Cys Glu Gin 145 150 155 160
Tyr Cys Ser Asp His Thr Gly Thr Lys Arg Ser Cys Arg Cys His Glu 165 170 175
Gly Tyr Ser Leu Leu Ala Asp Gly Val Ser Cys Thr Pro Thr Val Glu 180 185 190
Tyr Pro Cys Gly Lys lie Pro lie Leu Glu Lys Arg Asn Ala Ser Lys 195 200 205
Pro Gin Gly Arg lie Val Gly Gly Lys Val Cys Pro Lys Gly Glu Cys 210 215 220
Pro Trp Gin Val Leu Leu Leu Val Asn Gly Ala Gin Leu Cys Gly Gly 225 230 235 240
Thr Leu lie Asn Thr lie Trp Val Val Ser Ala Ala His Cys Phe Asp 245 250 255
Lys lie Lys Asn Trp Arg Asn Leu lie Ala Val Leu Gly Glu His Asp 260 265 270
Leu Ser Glu His Asp Gly Asp Glu Gin Ser Arg Arg Val Ala Gin Val 275 280 285 lie lie Pro Ser Thr Tyr Val Pro Gly Thr Thr Asn His Asp lie Ala 290 295 300
Leu Leu Arg Leu His Gin Pro Val Val Leu Thr Asp His Val Val Pro 305 310 315 320
Leu Cys Leu Pro Glu Arg Thr Phe Ser Glu Arg Thr Leu Ala Phe Val 325 330 335
Arg Phe Ser Leu Val Ser Gly Trp Gly Gin Leu Leu Asp Arg Gly Ala 340 345 350
Thr Ala Leu Glu Leu Met Val Leu Asn Val Pro Arg Leu Met Thr Gin 355 360 365
Asp Cys Leu Gin Gin Ser Arg Lys Val Gly Asp Ser Pro Asn lie Thr 370 375 380
Glu Tyr Met Phe Cys Ala Gly Tyr Ser Asp Gly Ser Lys Asp Ser Cys 385 390 395 400
Lys Gly Asp Ser Gly Gly Pro His Ala Thr His Tyr Gin Gly Thr Trp 405 410 415
Tyr Leu Thr Gly lie Val Ser Trp Gly Gin Gly Cys Ala Thr Val Gly 420 425 430
His Phe Gly Val Tyr Thr Arg Val Ser Gin Tyr lie Glu Trp Leu Gin 435 440 445
Lys Leu Met Arg Ser Glu Pro Arg Pro Gly Val Leu Leu Arg Ala Pro 450 455 460
Phe Pro 465
<210> 70 <211> 466 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Variante de FVII (precursor T419M) <4 Ο Ο > 70
Met Vai Ser Gin Ala Leu Arg Leu Leu Cys Leu Leu Leu Gly Leu Gin 15 10 15
Gly Cys Leu Ala Ala Gly Gly Val Ala Lys Ala Ser Gly Gly Glu Thr 20 25 30
Arg Asp Met Pro Trp Lys Pro Gly Pro His Arg Val Phe Val Thr Gin 35 40 45
Glu Glu Ala His Gly Val Leu His Arg Arg Arg Arg Ala Asn Ala Phe 50 55 60
Leu Glu Glu Leu Arg Pro Gly Ser Leu Glu Arg Glu Cys Lys Glu Glu 65 70 75 80
Gin Cys Ser Phe Glu Glu Ala Arg Glu lie Phe Lys Asp Ala Glu Arg 85 90 95
Thr Lys Leu Phe Trp lie Ser Tyr Ser Asp Gly Asp Gin Cys Ala Ser 100 105 110
Ser Pro Cys Gin Asn Gly Gly Ser Cys Lys Asp Gin Leu Gin Ser Tyr 115 120 125 lie Cys Phe Cys Leu Pro Ala Phe Glu Gly Arg Asn Cys Glu Thr His 130 135 140
Lys Asp Asp Gin Leu lie Cys Val Asn Glu Asn Gly Gly Cys Glu Gin 145 150 155 160
Tyr Cys Ser Asp His Thr Gly Thr Lys Arg Ser Cys Arg Cys His Glu 165 170 175
Gly Tyr Ser Leu Leu Ala Asp Gly Val Ser Cys Thr Pro Thr Val Glu 180 185 190
Tyr Pro Cys Gly Lys lie Pro lie Leu Glu Lys Arg Asn Ala Ser Lys 195 200 205
Pro Gin Gly Arg lie Val Gly Gly Lys Val Cys Pro Lys Gly Glu Cys 210 215 220
Pro Trp Gin Val Leu Leu Leu Val Asn Gly Ala Gin Leu Cys Gly Gly 225 230 235 240
Thr Leu lie Asn Thr lie Trp Val Val Ser Ala Ala His Cys Phe Asp 245 250 255
Lys lie Lys Asn Trp Arg Asn Leu lie Ala Val Leu Gly Glu His Asp 260 265 270
Leu Ser Glu His Asp Gly Asp Glu Gin Ser Arg Arg Val Ala Gin Val 275 280 285 lie lie Pro Ser Thr Tyr Val Pro Gly Thr Thr Asn His Asp lie Ala 290 295 300
Leu Leu Arg Leu His Gin Pro Val Val Leu Thr Asp His Val Val Pro 305 310 315 320
Leu Cys Leu Pro Glu Arg Thr Phe Ser Glu Arg Thr Leu Ala Phe Val 325 330 335
Arg Phe Ser Leu Val Ser Gly Trp Gly Gin Leu Leu Asp Arg Gly Ala 340 345 350
Thr Ala Leu Glu Leu Met Val Leu Asn Val Pro Arg Leu Met Thr Gin 355 360 365
Asp Cys Leu Gin Gin Ser Arg Lys Val Gly Asp Ser Pro Asn lie Thr 370 375 380
Glu Tyr Met Phe Cys Ala Gly Tyr Ser Asp Gly Ser Lys Asp Ser Cys 385 390 395 400
Lys Gly Asp Ser Gly Gly Pro His Ala Thr His Tyr Arg Gly Thr Trp 405 410 415
Tyr Leu Met Gly lie Val Ser Trp Gly Gin Gly Cys Ala Thr Val Gly 420 425 430
His Phe Gly Val Tyr Thr Arg Val Ser Gin Tyr lie Glu Trp Leu Gin 435 440 445
Lys Leu Met Arg Ser Glu Pro Arg Pro Gly Val Leu Leu Arg Ala Pro 450 455 460
Phe Pro 465
<210> 71 <211> 466 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Variante de FVII (precursor G435E) <400> 71
Met Val Ser Gin Ala Leu Arg Leu Leu Cys Leu Leu Leu Gly Leu Gin 15 10 15
Gly Cys Leu Ala Ala Gly Gly Val Ala Lys Ala Ser Gly Gly Glu Thr 20 25 30
Arg Asp Met Pro Trp Lys Pro Gly Pro His Arg Val Phe Val Thr Gin 35 40 45
Glu Glu Ala His Gly Val Leu His Arg Arg Arg Arg Ala Asn Ala Phe 50 55 60
Leu Glu Glu Leu Arg Pro Gly Ser Leu Glu Arg Glu Cys Lys Glu Glu 65 70 75 80
Gin Cys Ser Phe Glu Glu Ala Arg Glu lie Phe Lys Asp Ala Glu Arg 85 90 95
Thr Lys Leu Phe Trp lie Ser Tyr Ser Asp Gly Asp Gin Cys Ala Ser 100 105 110
Ser Pro Cys Gin Asn Gly Gly Ser Cys Lys Asp Gin Leu Gin Ser Tyr 115 120 125 lie Cys Phe Cys Leu Pro Ala Phe Glu Gly Arg Asn Cys Glu Thr His 130 135 140
Lys Asp Asp Gin Leu lie Cys Val Asn Glu Asn Gly Gly Cys Glu Gin 145 150 155 160
Tyr Cys Ser Asp His Thr Gly Thr Lys Arg Ser Cys Arg Cys His Glu 165 170 175
Gly Tyr Ser Leu Leu Ala Asp Gly Val Ser Cys Thr Pro Thr Val Glu 180 185 190
Tyr Pro Cys Gly Lys lie Pro lie Leu Glu Lys Arg Asn Ala Ser Lys 195 200 205
Pro Gin Gly Arg lie Val Gly Gly Lys Val Cys Pro Lys Gly Glu Cys 210 215 220
Pro Trp Gin Val Leu Leu Leu Val Asn Gly Ala Gin Leu Cys Gly Gly 225 230 235 240
Thr Leu lie Asn Thr lie Trp Val Val Ser Ala Ala His Cys Phe Asp 245 250 255
Lys lie Lys Asn Trp Arg Asn Leu lie Ala Val Leu Gly Glu His Asp 260 265 270
Leu Ser Glu His Asp Gly Asp Glu Gin Ser Arg Arg Val Ala Gin Val 275 280 285 lie lie Pro Ser Thr Tyr Val Pro Gly Thr Thr Asn His Asp lie Ala 290 295 300
Leu Leu Arg Leu His Gin Pro Val Val Leu Thr Asp His Val Val Pro 305 310 315 320
Leu Cys Leu Pro Glu Arg Thr Phe Ser Glu Arg Thr Leu Ala Phe Val 325 330 335
Arg Phe Ser Leu Val Ser Gly Trp Gly Gin Leu Leu Asp Arg Gly Ala 340 345 350
Thr Ala Leu Glu Leu Met Val Leu Asn Val Pro Arg Leu Met Thr Gin 355 360 365
Asp Cys Leu Gin Gin Ser Arg Lys Val Gly Asp Ser Pro Asn lie Thr 370 375 380
Glu Tyr Met Phe Cys Ala Gly Tyr Ser Asp Gly Ser Lys Asp Ser Cys 385 390 395 400
Lys Gly Asp Ser Gly Gly Pro His Ala Thr His Tyr Arg Gly Thr Trp 405 410 415
Tyr Leu Thr Gly lie Val Ser Trp Gly Gin Gly Cys Ala Thr Val Gly 420 425 430
His Phe Glu Val Tyr Thr Arg Val Ser Gin Tyr lie Glu Trp Leu Gin 435 440 445
Lys Leu Met Arg Ser Glu Pro Arg Pro Gly Val Leu Leu Arg Ala Pro 450 455 460
Phe Pro 465
<210> 72 <211> 466 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Variante de FVII (precursor E445K) <400> 72
Met Val Ser Gin Ala Leu Arg Leu Leu Cys Leu Leu Leu Gly Leu Gin 15 10 15
Gly Cys Leu Ala Ala Gly Gly Val Ala Lys Ala Ser Gly Gly Glu Thr 20 25 30
Arg Asp Met Pro Trp Lys Pro Gly Pro His Arg Val Phe Val Thr Gin 35 40 45
Glu Glu Ala His Gly Val Leu His Arg Arg Arg Arg Ala Asn Ala Phe 50 55 60
Leu Glu Glu Leu Arg Pro Gly Ser Leu Glu Arg Glu Cys Lys Glu Glu 65 70 75 80
Gin Cys Ser Phe Glu Glu Ala Arg Glu lie Phe Lys Asp Ala Glu Arg 85 90 95
Thr Lys Leu Phe Trp lie Ser Tyr Ser Asp Gly Asp Gin Cys Ala Ser 100 105 110
Ser Pro Cys Gin Asn Gly Gly Ser Cys Lys Asp Gin Leu Gin Ser Tyr 115 120 125 lie Cys Phe Cys Leu Pro Ala Phe Glu Gly Arg Asn Cys Glu Thr His 130 135 140
Lys Asp Asp Gin Leu lie Cys Val Asn Glu Asn Gly Gly Cys Glu Gin 145 150 155 160
Tyr Cys Ser Asp His Thr Gly Thr Lys Arg Ser Cys Arg Cys His Glu 165 170 175
Gly Tyr Ser Leu Leu Ala Asp Gly Val Ser Cys Thr Pro Thr Val Glu 180 185 190
Tyr Pro Cys Gly Lys lie Pro lie Leu Glu Lys Arg Asn Ala Ser Lys 195 200 205
Pro Gin Gly Arg lie Val Gly Gly Lys Val Cys Pro Lys Gly Glu Cys 210 215 220
Pro Trp Gin Val Leu Leu Leu Val Asn Gly Ala Gin Leu Cys Gly Gly 225 230 235 240
Thr Leu lie Asn Thr lie Trp Val Val Ser Ala Ala His Cys Phe Asp 245 250 255
Lys lie Lys Asn Trp Arg Asn Leu lie Ala Val Leu Gly Glu His Asp 260 265 270
Leu Ser Glu His Asp Gly Asp Glu Gin Ser Arg Arg Val Ala Gin Val 275 280 285 lie lie Pro Ser Thr Tyr Val Pro Gly Thr Thr Asn His Asp lie Ala 290 295 300
Leu Leu Arg Leu His Gin Pro Val Val Leu Thr Asp His Val Val Pro 305 310 315 320
Leu Cys Leu Pro Glu Arg Thr Phe Ser Glu Arg Thr Leu Ala Phe Val 325 330 335
Arg Phe Ser Leu Val Ser Gly Trp Gly Gin Leu Leu Asp Arg Gly Ala 340 345 350
Thr Ala Leu Glu Leu Met Val Leu Asn Val Pro Arg Leu Met Thr Gin 355 360 365
Asp Cys Leu Gin Gin Ser Arg Lys Val Gly Asp Ser Pro Asn lie Thr 370 375 380
Glu Tyr Met Phe Cys Ala Gly Tyr Ser Asp Gly Ser Lys Asp Ser Cys 385 390 395 400
Lys Gly Asp Ser Gly Gly Pro His Ala Thr His Tyr Arg Gly Thr Trp 405 410 415
Tyr Leu Thr Gly lie Val Ser Trp Gly Gin Gly Cys Ala Thr Val Gly 420 425 430
His Phe Gly Val Tyr Thr Arg Val Ser Gin Tyr lie Lys Trp Leu Gin 435 440 445
Lys Leu Met Arg Ser Glu Pro Arg Pro Gly Val Leu Leu Arg Ala Pro 450 455 460
Phe Pro 465
<210> 73 <211> 466 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Variante de FVII (precursor R375W) <400> 73
Met Val Ser Gin Ala Leu Arg Leu Leu Cys Leu Leu Leu Gly Leu Gin 15 10 15
Gly Cys Leu Ala Ala Gly Gly Val Ala Lys Ala Ser Gly Gly Glu Thr 20 25 30
Arg Asp Met Pro Trp Lys Pro Gly Pro His Arg Val Phe Val Thr Gin 35 40 45
Glu Glu Ala His Gly Val Leu His Arg Arg Arg Arg Ala Asn Ala Phe 50 55 60
Leu Glu Glu Leu Arg Pro Gly Ser Leu Glu Arg Glu Cys Lys Glu Glu 65 70 75 80
Gin Cys Ser Phe Glu Glu Ala Arg Glu lie Phe Lys Asp Ala Glu Arg 85 90 95
Thr Lys Leu Phe Trp lie Ser Tyr Ser Asp Gly Asp Gin Cys Ala Ser 100 105 110
Ser Pro Cys Gin Asn Gly Gly Ser Cys Lys Asp Gin Leu Gin Ser Tyr 115 120 125 lie Cys Phe Cys Leu Pro Ala Phe Glu Gly Arg Asn Cys Glu Thr His 130 135 140
Lys Asp Asp Gin Leu lie Cys Val Asn Glu Asn Gly Gly Cys Glu Gin 145 150 155 160
Tyr Cys Ser Asp His Thr Gly Thr Lys Arg Ser Cys Arg Cys His Glu 165 170 175
Gly Tyr Ser Leu Leu Ala Asp Gly Val Ser Cys Thr Pro Thr Val Glu 180 185 190
Tyr Pro Cys Gly Lys lie Pro lie Leu Glu Lys Arg Asn Ala Ser Lys 195 200 205
Pro Gin Gly Arg lie Val Gly Gly Lys Val Cys Pro Lys Gly Glu Cys 210 215 220
Pro Trp Gin Val Leu Leu Leu Val Asn Gly Ala Gin Leu Cys Gly Gly 225 230 235 240
Thr Leu lie Asn Thr lie Trp Val Val Ser Ala Ala His Cys Phe Asp 245 250 255
Lys lie Lys Asn Trp Arg Asn Leu lie Ala Val Leu Gly Glu His Asp 260 265 270
Leu Ser Glu His Asp Gly Asp Glu Gin Ser Arg Arg Val Ala Gin Val 275 280 285 lie lie Pro Ser Thr Tyr Val Pro Gly Thr Thr Asn His Asp lie Ala 290 295 300
Leu Leu Arg Leu His Gin Pro Val Val Leu Thr Asp His Val Val Pro 305 310 315 320
Leu Cys Leu Pro Glu Arg Thr Phe Ser Glu Arg Thr Leu Ala Phe Val 325 330 335
Arg Phe Ser Leu Val Ser Gly Trp Gly Gin Leu Leu Asp Arg Gly Ala 340 345 350
Thr Ala Leu Glu Leu Met Val Leu Asn Val Pro Arg Leu Met Thr Gin 355 360 365
Asp Cys Leu Gin Gin Ser Trp Lys Val Gly Asp Ser Pro Asn lie Thr 370 375 380
Glu Tyr Met Phe Cys Ala Gly Tyr Ser Asp Gly Ser Lys Asp Ser Cys 385 390 395 400
Lys Gly Asp Ser Gly Gly Pro His Ala Thr His Tyr Arg Gly Thr Trp 405 410 415
Tyr Leu Thr Gly lie Val Ser Trp Gly Gin Gly Cys Ala Thr Val Gly 420 425 430
His Phe Gly Val Tyr Thr Arg Val Ser Gin Tyr lie Glu Trp Leu Gin 435 440 445
Lys Leu Met Arg Ser Glu Pro Arg Pro Gly Val Leu Leu Arg Ala Pro 450 455 460
Phe Pro 465
<210> 74 <211> 466 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Variante de FVII (precursor R375K) <400> 74
Met Val Ser Gin Ala Leu Arg Leu Leu Cys Leu Leu Leu Gly Leu Gin 15 10 15
Gly Cys Leu Ala Ala Gly Gly Val Ala Lys Ala Ser Gly Gly Glu Thr 20 25 30
Arg Asp Met Pro Trp Lys Pro Gly Pro His Arg Val Phe Val Thr Gin 35 40 45
Glu Glu Ala His Gly Val Leu His Arg Arg Arg Arg Ala Asn Ala Phe 50 55 60
Leu Glu Glu Leu Arg Pro Gly Ser Leu Glu Arg Glu Cys Lys Glu Glu 65 70 75 80
Gin Cys Ser Phe Glu Glu Ala Arg Glu lie Phe Lys Asp Ala Glu Arg 85 90 95
Thr Lys Leu Phe Trp lie Ser Tyr Ser Asp Gly Asp Gin Cys Ala Ser 100 105 110
Ser Pro Cys Gin Asn Gly Gly Ser Cys Lys Asp Gin Leu Gin Ser Tyr 115 120 125 lie Cys Phe Cys Leu Pro Ala Phe Glu Gly Arg Asn Cys Glu Thr His 130 135 140
Lys Asp Asp Gin Leu lie Cys Val Asn Glu Asn Gly Gly Cys Glu Gin 145 150 155 160
Tyr Cys Ser Asp His Thr Gly Thr Lys Arg Ser Cys Arg Cys His Glu 165 170 175
Gly Tyr Ser Leu Leu Ala Asp Gly Val Ser Cys Thr Pro Thr Val Glu 180 185 190
Tyr Pro Cys Gly Lys lie Pro lie Leu Glu Lys Arg Asn Ala Ser Lys 195 200 205
Pro Gin Gly Arg lie Val Gly Gly Lys Val Cys Pro Lys Gly Glu Cys 210 215 220
Pro Trp Gin Val Leu Leu Leu Val Asn Gly Ala Gin Leu Cys Gly Gly 225 230 235 240
Thr Leu lie Asn Thr lie Trp Val Val Ser Ala Ala His Cys Phe Asp 245 250 255
Lys lie Lys Asn Trp Arg Asn Leu lie Ala Val Leu Gly Glu His Asp 260 265 270
Leu Ser Glu His Asp Gly Asp Glu Gin Ser Arg Arg Val Ala Gin Val 275 280 285 lie lie Pro Ser Thr Tyr Val Pro Gly Thr Thr Asn His Asp lie Ala 290 295 300
Leu Leu Arg Leu His Gin Pro Val Val Leu Thr Asp His Val Val Pro 305 310 315 320
Leu Cys Leu Pro Glu Arg Thr Phe Ser Glu Arg Thr Leu Ala Phe Val 325 330 335
Arg Phe Ser Leu Val Ser Gly Trp Gly Gin Leu Leu Asp Arg Gly Ala 340 345 350
Thr Ala Leu Glu Leu Met Val Leu Asn Val Pro Arg Leu Met Thr Gin 355 360 365
Asp Cys Leu Gin Gin Ser Lys Lys Val Gly Asp Ser Pro Asn lie Thr 370 375 380
Glu Tyr Met Phe Cys Ala Gly Tyr Ser Asp Gly Ser Lys Asp Ser Cys 385 390 395 400
Lys Gly Asp Ser Gly Gly Pro His Ala Thr His Tyr Arg Gly Thr Trp 405 410 415
Tyr Leu Thr Gly lie Val Ser Trp Gly Gin Gly Cys Ala Thr Val Gly 420 425 430
His Phe Gly Val Tyr Thr Arg Val Ser Gin Tyr lie Glu Trp Leu Gin 435 440 445
Lys Leu Met Arg Ser Glu Pro Arg Pro Gly Val Leu Leu Arg Ala Pro 450 455 460
Phe Pro 465
<210> 75 <211> 304 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Precursor da isoforma a de TFPI <400> 75
Met lie Tyr Thr Met Lys Lys Val His Ala Leu Trp Ala Ser Val Cys 15 10 15
Leu Leu Leu Asn Leu Ala Pro Ala Pro Leu Asn Ala Asp Ser Glu Glu 20 25 30
Asp Glu Glu His Thr lie lie Thr Asp Thr Glu Leu Pro Pro Leu Lys 35 40 45
Leu Met His Ser Phe Cys Ala Phe Lys Ala Asp Asp Gly Pro Cys Lys 50 55 60
Ala lie Met Lys Arg Phe Phe Phe Asn lie Phe Thr Arg Gin Cys Glu 65 70 75 80
Glu Phe lie Tyr Gly Gly Cys Glu Gly Asn Gin Asn Arg Phe Glu Ser 85 90 95
Leu Glu Glu Cys Lys Lys Met Cys Thr Arg Asp Asn Ala Asn Arg lie 100 105 110 lie Lys Thr Thr Leu Gin Gin Glu Lys Pro Asp Phe Cys Phe Leu Glu 115 120 125
Glu Asp Pro Gly lie Cys Arg Gly Tyr lie Thr Arg Tyr Phe Tyr Asn 130 135 140
Asn Gin Thr Lys Gin Cys Glu Arg Phe Lys Tyr Gly Gly Cys Leu Gly 145 150 155 160
Asn Met Asn Asn Phe Glu Thr Leu Glu Glu Cys Lys Asn lie Cys Glu 165 170 175
Asp Gly Pro Asn Gly Phe Gin Val Asp Asn Tyr Gly Thr Gin Leu Asn 180 185 190
Ala Val Asn Asn Ser Leu Thr Pro Gin Ser Thr Lys Val Pro Ser Leu 195 200 205
Phe Glu Phe His Gly Pro Ser Trp Cys Leu Thr Pro Ala Asp Arg Gly 210 215 220
Leu Cys Arg Ala Asn Glu Asn Arg Phe Tyr Tyr Asn Ser Val lie Gly 225 230 235 240
Lys Cys Arg Pro Phe Lys Tyr Ser Gly Cys Gly Gly Asn Glu Asn Asn 245 250 255
Phe Thr Ser Lys Gin Glu Cys Leu Arg Ala Cys Lys Lys Gly Phe lie 260 265 270
Gin Arg lie Ser Lys Gly Gly Leu lie Lys Thr Lys Arg Lys Arg Lys 275 280 285
Lys Gin Arg Val Lys lie Ala Tyr Glu Glu lie Phe Val Lys Asn Met 290 295 300
<210> 76 <211> 276 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Isoforma a madura de TFPI <400> 76
Asp Ser Glu Glu Asp Glu Glu His Thr lie lie Thr Asp Thr Glu Leu 15 10 15
Pro Pro Leu Lys Leu Met His Ser Phe Cys Ala Phe Lys Ala Asp Asp 20 25 30
Gly Pro Cys Lys Ala lie Met Lys Arg Phe Phe Phe Asn lie Phe Thr 35 40 45
Arg Gin Cys Glu Glu Phe lie Tyr Gly Gly Cys Glu Gly Asn Gin Asn 50 55 60
Arg Phe Glu Ser Leu Glu Glu Cys Lys Lys Met Cys Thr Arg Asp Asn 65 70 75 80
Ala Asn Arg lie lie Lys Thr Thr Leu Gin Gin Glu Lys Pro Asp Phe 85 90 95
Cys Phe Leu Glu Glu Asp Pro Gly lie Cys Arg Gly Tyr lie Thr Arg 100 105 110
Tyr Phe Tyr Asn Asn Gin Thr Lys Gin Cys Glu Arg Phe Lys Tyr Gly 115 120 125
Gly Cys Leu Gly Asn Met Asn Asn Phe Glu Thr Leu Glu Glu Cys Lys 130 135 140
Asn lie Cys Glu Asp Gly Pro Asn Gly Phe Gin Val Asp Asn Tyr Gly 145 150 155 160
Thr Gin Leu Asn Ala Val Asn Asn Ser Leu Thr Pro Gin Ser Thr Lys 165 170 175
Val Pro Ser Leu Phe Glu Phe His Gly Pro Ser Trp Cys Leu Thr Pro 180 185 190
Ala Asp Arg Gly Leu Cys Arg Ala Asn Glu Asn Arg Phe Tyr Tyr Asn 195 200 205
Ser Val lie Gly Lys Cys Arg Pro Phe Lys Tyr Ser Gly Cys Gly Gly 210 215 220
Asn Glu Asn Asn Phe Thr Ser Lys Gin Glu Cys Leu Arg Ala Cys Lys 225 230 235 240
Lys Gly Phe lie Gin Arg lie Ser Lys Gly Gly Leu lie Lys Thr Lys 245 250 255
Arg Lys Arg Lys Lys Gin Arg Val Lys lie Ala Tyr Glu Glu lie Phe 260 265 270
Val Lys Asn Met 275
<210> 77 <211> 251 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Precursor da isoforma b de TFPI <400> 77
Met lie Tyr Thr Met Lys Lys Val His Ala Leu Trp Ala Ser Val Cys 15 10 15
Leu Leu Leu Asn Leu Ala Pro Ala Pro Leu Asn Ala Asp Ser Glu Glu 20 25 30
Asp Glu Glu His Thr lie lie Thr Asp Thr Glu Leu Pro Pro Leu Lys 35 40 45
Leu Met His Ser Phe Cys Ala Phe Lys Ala Asp Asp Gly Pro Cys Lys 50 55 60
Ala lie Met Lys Arg Phe Phe Phe Asn lie Phe Thr Arg Gin Cys Glu 65 70 75 80
Glu Phe lie Tyr Gly Gly Cys Glu Gly Asn Gin Asn Arg Phe Glu Ser 85 90 95
Leu Glu Glu Cys Lys Lys Met Cys Thr Arg Asp Asn Ala Asn Arg lie 100 105 110 lie Lys Thr Thr Leu Gin Gin Glu Lys Pro Asp Phe Cys Phe Leu Glu 115 120 125
Glu Asp Pro Gly lie Cys Arg Gly Tyr lie Thr Arg Tyr Phe Tyr Asn 130 135 140
Asn Gin Thr Lys Gin Cys Glu Arg Phe Lys Tyr Gly Gly Cys Leu Gly 145 150 155 160
Asn Met Asn Asn Phe Glu Thr Leu Glu Glu Cys Lys Asn lie Cys Glu 165 170 175
Asp Gly Pro Asn Gly Phe Gin Val Asp Asn Tyr Gly Thr Gin Leu Asn 180 185 190
Ala Val Asn Asn Ser Leu Thr Pro Gin Ser Thr Lys Val Pro Ser Leu 195 200 205
Phe Val Thr Lys Glu Gly Thr Asn Asp Gly Trp Lys Asn Ala Ala His 210 215 220 lie Tyr Gin Val Phe Leu Asn Ala Phe Cys lie His Ala Ser Met Phe 225 230 235 240
Phe Leu Gly Leu Asp Ser lie Ser Cys Leu Cys 245 250
<210> 78 <211> 222 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Isoforma b madura de TFPI <400> 78
Ser Glu Glu Asp Glu Glu His Thr lie lie Thr Asp Thr Glu Leu Pro 15 10 15
Pro Leu Lys Leu Met His Ser Phe Cys Ala Phe Lys Ala Asp Asp Gly 20 25 30
Pro Cys Lys Ala lie Met Lys Arg Phe Phe Phe Asn lie Phe Thr Arg 35 40 45
Gin Cys Glu Glu Phe lie Tyr Gly Gly Cys Glu Gly Asn Gin Asn Arg 50 55 60
Phe Glu Ser Leu Glu Glu Cys Lys Lys Met Cys Thr Arg Asp Asn Ala 65 70 75 80
Asn Arg lie lie Lys Thr Thr Leu Gin Gin Glu Lys Pro Asp Phe Cys 85 90 95
Phe Leu Glu Glu Asp Pro Gly lie Cys Arg Gly Tyr lie Thr Arg Tyr 100 105 110
Phe Tyr Asn Asn Gin Thr Lys Gin Cys Glu Arg Phe Lys Tyr Gly Gly 115 120 125
Cys Leu Gly Asn Met Asn Asn Phe Glu Thr Leu Glu Glu Cys Lys Asn 130 135 140 lie Cys Glu Asp Gly Pro Asn Gly Phe Gin Val Asp Asn Tyr Gly Thr 145 150 155 160
Gin Leu Asn Ala Val Asn Asn Ser Leu Thr Pro Gin Ser Thr Lys Val 165 170 175
Pro Ser Leu Phe Val Thr Lys Glu Gly Thr Asn Asp Gly Trp Lys Asn 180 185 190
Ala Ala His lie Tyr Gin Val Phe Leu Asn Ala Phe Cys lie His Ala 195 200 205
Ser Met Phe Phe Leu Gly Leu Asp Ser lie Ser Cys Leu Cys 210 215 220
<210> 79 <211> 213 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> TFPI-2 maduro <400> 79
Asp Ala Ala Gin Glu Pro Thr Gly Asn Asn Ala Glu lie Cys Leu Leu 15 10 15
Pro Leu Asp Tyr Gly Pro Cys Arg Ala Leu Leu Leu Arg Tyr Tyr Tyr 20 25 30
Asp Arg Tyr Thr Gin Ser Cys Arg Gin Phe Leu Tyr Gly Gly Cys Glu 35 40 45
Gly Asn Ala Asn Asn Phe Tyr Thr Trp Glu Ala Cys Asp Asp Ala Cys 50 55 60
Trp Arg lie Glu Lys Val Pro Lys Val Cys Arg Leu Gin Val Ser Val 65 70 75 80
Asp Asp Gin Cys Glu Gly Ser Thr Glu Lys Tyr Phe Phe Asn Leu Ser 85 90 95
Ser Met Thr Cys Glu Lys Phe Phe Ser Gly Gly Cys His Arg Asn Arg 100 105 110 lie Glu Asn Arg Phe Pro Asp Glu Ala Thr Cys Met Gly Phe Cys Ala 115 120 125
Pro Lys Lys lie Pro Ser Phe Cys Tyr Ser Pro Lys Asp Glu Gly Leu 130 135 140
Cys Ser Ala Asn Val Thr Arg Tyr Tyr Phe Asn Pro Arg Tyr Arg Thr 145 150 155 160
Cys Asp Ala Phe Thr Tyr Thr Gly Cys Gly Gly Asn Asp Asn Asn Phe 165 170 175
Val Ser Arg Glu Asp Cys Lys Arg Ala Cys Ala Lys Ala Leu Lys Lys 180 185 190
Lys Lys Lys Met Pro Lys Leu Arg Phe Ala Ser Arg lie Arg Lys lie 195 200 205
Arg Lys Lys Gin Phe 210
<210> 80 <211> 245 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Quimiotripsinogénio B maduro <400> 80
Cys Gly Val Pro Ala lie His Pro Val Leu Ser Gly Leu Ser Arg lie 15 10 15
Val Asn Gly Glu Asp Ala Val Pro Gly Ser Trp Pro Trp Gin Val Ser 20 25 30
Leu Gin Asp Lys Thr Gly Phe His Phe Cys Gly Gly Ser Leu lie Ser 35 40 45
Glu Asp Trp Val Val Thr Ala Ala His Cys Gly Val Arg Thr Ser Asp 50 55 60
Val Val Val Ala Gly Glu Phe Asp Gin Gly Ser Asp Glu Glu Asn lie 65 70 75 80
Gin Val Leu Lys lie Ala Lys Val Phe Lys Asn Pro Lys Phe Ser lie 85 90 95
Leu Thr Val Asn Asn Asp lie Thr Leu Leu Lys Leu Ala Thr Pro Ala 100 105 110
Arg Phe Ser Gin Thr Val Ser Ala Val Cys Leu Pro Ser Ala Asp Asp 115 120 125
Asp Phe Pro Ala Gly Thr Leu Cys Ala Thr Thr Gly Trp Gly Lys Thr 130 135 140
Lys Tyr Asn Ala Asn Lys Thr Pro Asp Lys Leu Gin Gin Ala Ala Leu 145 150 155 160
Pro Leu Leu Ser Asn Ala Glu Cys Lys Lys Ser Trp Gly Arg Arg lie 165 170 175
Thr Asp Val Met lie Cys Ala Gly Ala Ser Gly Val Ser Ser Cys Met 180 185 190
Gly Asp Ser Gly Gly Pro Leu Val Cys Gin Lys Asp Gly Ala Trp Thr 195 200 205
Leu Val Gly lie Val Ser Trp Gly Ser Asp Thr Cys Ser Thr Ser Ser 210 215 220
Pro Gly Val Tyr Ala Arg Val Thr Lys Leu lie Pro Trp Val Gin Lys 225 230 235 240 lie Leu Ala Ala Asn 245
<210> 81 <211> 3141 <212> ADN <213> Homo sapiens <220> <223> Variante 1 de transcrito de FVII <400> 81 agtcccatgg ggaatgtcaa caggcagggg cagcactgca gagatttcat catggtctcc 60 caggccctca ggctcctctg ccttctgctt gggcttcagg gctgcctggc tgcaggcggg 120 gtcgctaagg cctcaggagg agaaacacgg gacatgccgt ggaagccggg gcctcacaga 180 gtcttcgtaa cccaggagga agcccacggc gtcctgcacc ggcgccggcg cgccaacgcg 240 ttcctggagg agctgcggcc gggctccctg gagagggagt gcaaggagga gcagtgctcc 300 ttcgaggagg cccgggagat cttcaaggac gcggagagga cgaagctgtt ctggatttct 360 tacagtgatg gggaccagtg tgcctcaagt ccatgccaga atgggggctc ctgcaaggac 420 cagctccagt cctatatctg cttctgcctc cctgccttcg agggccggaa ctgtgagacg 480 cacaaggatg accagctgat ctgtgtgaac gagaacggcg gctgtgagca gtactgcagt 540 gaccacacgg gcaccaagcg ctcctgtcgg tgccacgagg ggtactctct gctggcagac 600 ggggtgtcct gcacacccac agttgaatat ccatgtggaa aaatacctat tctagaaaaa 660 agaaatgcca gcaaacccca aggccgaatt gtggggggca aggtgtgccc caaaggggag 720 tgtccatggc aggtcctgtt gttggtgaat ggagctcagt tgtgtggggg gaccctgatc 780 aacaccatct gggtggtctc cgcggcccac tgtttcgaca aaatcaagaa ctggaggaac 840 ctgatcgcgg tgctgggcga gcacgacctc agcgagcacg acggggatga gcagagccgg 900 cgggtggcgc aggtcatcat ccccagcacg tacgtcccgg gcaccaccaa ccacgacatc 960 gcgctgctcc gcctgcacca gcccgtggtc ctcactgacc atgtggtgcc cctctgcctg 1020 cccgaacgga cgttctctga gaggacgctg gccttcgtgc gcttctcatt ggtcagcggc 1080 tggggccagc tgctggaccg tggcgccacg gccctggagc tcatggtcct caacgtgccc 1140 cggctgatga cccaggactg cctgcagcag tcacggaagg tgggagactc cccaaatatc 1200 acggagtaca tgttctgtgc cggctactcg gatggcagca aggactcctg caagggggac 1260 agtggaggcc cacatgccac ccactaccgg ggcacgtggt acctgacggg catcgtcagc 1320 tggggccagg gctgcgcaac cgtgggccac tttggggtgt acaccagggt ctcccagtac 1380 atcgagtggc tgcaaaagct catgcgctca gagccacgcc caggagtcct cctgcgagcc 1440 ccatttccct agcccagcag ccctggcctg tggagagaaa gccaaggctg cgtcgaactg 1500 tcctggcacc aaatcccata tattcttctg cagttaatgg ggtagaggag ggcatgggag 1560 ggagggagag gtggggaggg agacagagac agaaacagag agagacagag acagagagag 1620 actgagggag agactctgag gacatggaga gagactcaaa gagactccaa gattcaaaga 1680 gactaataga gacacagaga tggaatagaa aagatgagag gcagaggcag acaggcgctg 1740 gacagagggg caggggagtg ccaaggttgt cctggaggca gacagcccag ctgagcctcc 1800 ttacctccct tcagccaagc ccacctgcac gtgatctgct ggcctcaggc tgctgctctg 1860 ccttcattgc tggagacagt agaggcatga acacacatgg atgcacacac acacacgcca 1920 atgcacacac acagagatat gcacacacac ggatgcacac acagatggtc acacagagat 1980 acgcaaacac accgatgcac acgcacatag agatatgcac acacagatgc acacacagat 2040 atacacatgg atgcacgcac atgccaatgc acgcacacat cagtgcacac ggatgcacag 2100 agatatgcac acaccgatgt gcgcacacac agatatgcac acacatggat gagcacacac 2160 acaccaatgc gcacacacac cgatgtacac acacagatgc acacacagat gcacacacac 2220 cgatgctgac tccatgtgtg ctgtcctctg aaggcggttg tttagctctc acttttctgg 2280 ttcttatcca ttatcatctt cacttcagac aattcagaag catcaccatg catggtggcg 2340 aatgccccca aactctcccc caaatgtatt tctcccttcg ctgggtgccg ggctgcacag 2400 actattcccc acctgcttcc cagcttcaca ataaacggct gcgtctcctc cgcacacctg 2460 tggtgcctgc cacccactgg gttgcccatg attcattttt ggagcccccg gtgctcatcc 2520 tctgagatgc tcttttcttt cacaattttc aacatcactg aaatgaaccc tcacatggaa 2580 gctatttttt aaaaacaaaa gctgtttgat agatgtttga ggctgtagct cccaggatcc 2640 tgtggaattg gatgttctct ccctgccaca gcccttgtca atgatatttc acagagaccc 2700 tgggagcacc tgctcaagag tcagggacac acgcatcact aaatgcaagt tcccaggccc 2760 tggctgcagt gggaggacct ggcaagctgc actcttgctg agtccccagg gtggtggaag 2820 aagaatgaga aacacatgaa cagagaaatg gggaggtgac aaacagtgcc cccactcaga 2880 ctccggcaag cacggctcag agagtggact cgatgccatc cctgcagggc cgtcctgggc 2940 accactggca ctcacagcag caaggtgggc accattggca ctcacagcag caaggcaggc 3000 accagcaacc cacctcgggg gcactcaggc atcatctact tcagagcaga cagggtctat 3060 gaactacagc cgtgggctgc ttccaaggca ccctgctctt gtaaataaag ttttatggga 3120 3.C3.C6.6.3.6.3.3. 3.3.3.3.3.3.3.3.3.3. 3 3141
<210> 82 <211> 3075 <212> ADN <213> Homo sapiens <220> <223> Variante 2 de transcrito de FVII <400> 82 agtcccatgg ggaatgtcaa caggcagggg cagcactgca gagatttcat catggtctcc 60 caggccctca ggctcctctg ccttctgctt gggcttcagg gctgcctggc tgcagtcttc 120 gtaacccagg aggaagccca cggcgtcctg caccggcgcc ggcgcgccaa cgcgttcctg 180 gaggagctgc ggccgggctc cctggagagg gagtgcaagg aggagcagtg ctccttcgag 240 gaggcccggg agatcttcaa ggacgcggag aggacgaagc tgttctggat ttcttacagt 300 gatggggacc agtgtgcctc aagtccatgc cagaatgggg gctcctgcaa ggaccagctc 360 cagtcctata tctgcttctg cctccctgcc ttcgagggcc ggaactgtga gacgcacaag 420 gatgaccagc tgatctgtgt gaacgagaac ggcggctgtg agcagtactg cagtgaccac 480 acgggcacca agcgctcctg tcggtgccac gaggggtact ctctgctggc agacggggtg 540 tcctgcacac ccacagttga atatccatgt ggaaaaatac ctattctaga aaaaagaaat 600 gccagcaaac cccaaggccg aattgtgggg ggcaaggtgt gccccaaagg ggagtgtcca 660 tggcaggtcc tgttgttggt gaatggagct cagttgtgtg gggggaccct gatcaacacc 720 atctgggtgg tctccgcggc ccactgtttc gacaaaatca agaactggag gaacctgatc 780 gcggtgctgg gcgagcacga cctcagcgag cacgacgggg atgagcagag ccggcgggtg 840 gcgcaggtca tcatccccag cacgtacgtc ccgggcacca ccaaccacga catcgcgctg 900 ctccgcctgc accagcccgt ggtcctcact gaccatgtgg tgcccctctg cctgcccgaa 960 cggacgttct ctgagaggac gctggccttc gtgcgcttct cattggtcag cggctggggc 1020 cagctgctgg accgtggcgc cacggccctg gagctcatgg tcctcaacgt gccccggctg 1080 atgacccagg actgcctgca gcagtcacgg aaggtgggag actccccaaa tatcacggag 1140 tacatgttct gtgccggcta ctcggatggc agcaaggact cctgcaaggg ggacagtgga 1200 ggcccacatg ccacccacta ccggggcacg tggtacctga cgggcatcgt cagctggggc 1260 cagggctgcg caaccgtggg ccactttggg gtgtacacca gggtctccca gtacatcgag 1320 tggctgcaaa agctcatgcg ctcagagcca cgcccaggag tcctcctgcg agccccattt 1380 ccctagccca gcagccctgg cctgtggaga gaaagccaag gctgcgtcga actgtcctgg 1440 caccaaatcc catatattct tctgcagtta atggggtaga ggagggcatg ggagggaggg 1500 agaggtgggg agggagacag agacagaaac agagagagac agagacagag agagactgag 1560 ggagagactc tgaggacatg gagagagact caaagagact ccaagattca aagagactaa 1620 tagagacaca gagatggaat agaaaagatg agaggcagag gcagacaggc gctggacaga 1680 ggggcagggg agtgccaagg ttgtcctgga ggcagacagc ccagctgagc ctccttacct 1740 cccttcagcc aagcccacct gcacgtgatc tgctggcctc aggctgctgc tctgccttca 1800 ttgctggaga cagtagaggc atgaacacac atggatgcac acacacacac gccaatgcac 1860 acacacagag atatgcacac acacggatgc acacacagat ggtcacacag agatacgcaa 1920 acacaccgat gcacacgcac atagagatat gcacacacag atgcacacac agatatacac 1980 atggatgcac gcacatgcca atgcacgcac acatcagtgc acacggatgc acagagatat 2040 gcacacaccg atgtgcgcac acacagatat gcacacacat ggatgagcac acacacacca 2100 atgcgcacac acaccgatgt acacacacag atgcacacac agatgcacac acaccgatgc 2160 tgactccatg tgtgctgtcc tctgaaggcg gttgtttagc tctcactttt ctggttctta 2220 tccattatca tcttcacttc agacaattca gaagcatcac catgcatggt ggcgaatgcc 2280 cccaaactct cccccaaatg tatttctccc ttcgctgggt gccgggctgc acagactatt 2340 ccccacctgc ttcccagctt cacaataaac ggctgcgtct cctccgcaca cctgtggtgc 2400 ctgccaccca ctgggttgcc catgattcat ttttggagcc cccggtgctc atcctctgag 2460 atgctctttt ctttcacaat tttcaacatc actgaaatga accctcacat ggaagctatt 2520 ttttaaaaac aaaagctgtt tgatagatgt ttgaggctgt agctcccagg atcctgtgga 2580 attggatgtt ctctccctgc cacagccctt gtcaatgata tttcacagag accctgggag 2640 cacctgctca agagtcaggg acacacgcat cactaaatgc aagttcccag gccctggctg 2700 cagtgggagg acctggcaag ctgcactctt gctgagtccc cagggtggtg gaagaagaat 2760 gagaaacaca tgaacagaga aatggggagg tgacaaacag tgcccccact cagactccgg 2820 caagcacggc tcagagagtg gactcgatgc catccctgca gggccgtcct gggcaccact 2880 ggcactcaca gcagcaaggt gggcaccatt ggcactcaca gcagcaaggc aggcaccagc 2940 aacccacctc gggggcactc aggcatcatc tacttcagag cagacagggt ctatgaacta 3000 cagccgtggg ctgcttccaa ggcaccctgc tcttgtaaat aaagttttat gggaacacaa 3060 3.3.3.3.3.3.3.3.3.3. 33333 3075
<210> 83 <211> 46 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> domínio Gla do factor IX <400> 83
Tyr Asn Ser Gly Lys Leu Glu Glu Phe Val Gin Gly Asn Leu Glu Arg 15 10 15
Glu Cys Met Glu Glu Lys Cys Ser Phe Glu Glu Ala Arg Glu Val Phe 20 25 30
Glu Asn Thr Glu Arg Thr Thr Glu Phe Trp Lys Gin Tyr Val 35 40 45
<210> 84 <211> 45 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> domínio Gla do factor X <400> 84
Ala Asn Ser Phe Leu Glu Glu Met Lys Lys Gly His Leu Glu Arg Glu 15 10 15
Cys Met Glu Glu Thr Cys Ser Tyr Glu Glu Ala Arg Glu Val Phe Glu 20 25 30
Asp Ser Asp Lys Thr Asn Glu Phe Trp Asn Lys Tyr Lys 35 40 45
<210> 85 <211> 46 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> domínio Gla de protrombina/trombina <400> 85
Ala Asn Thr Phe Leu Glu Glu Val Arg Lys Gly Asn Leu Glu Arg Glu 15 10 15
Cys Val Glu Glu Thr Cys Ser Tyr Glu Glu Ala Phe Glu Ala Leu Glu 20 25 30
Ser Ser Thr Ala Thr Asp Val Phe Trp Ala Lys Tyr Thr Ala 35 40 45
<210> 86 <211> 46 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> domínio Gla de proteína C <400> 86
Ala Asn Ser Phe Leu Glu Glu Leu Arg His Ser Ser Leu Glu Arg Glu 15 10 15
Cys lie Glu Glu lie Cys Asp Phe Glu Glu Ala Lys Glu lie Phe Gin 20 25 30
Asn Val Asp Asp Thr Leu Ala Phe Trp Ser Lys His Val Asp 35 40 45
<210> 87 <211> 46 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> domínio Gla de proteína S <400> 87
Ala Asn Ser Leu Leu Glu Glu Thr Lys Gin Gly Asn Leu Glu Arg Glu 15 10 15
Cys lie Glu Glu Leu Cys Asn Lys Glu Glu Ala Arg Glu Val Phe Glu 20 25 30
Asn Asp Pro Glu Thr Asp Tyr Phe Tyr Pro Lys Tyr Leu Val 35 40 45
<210> 88 <211> 47 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> domínio Gla de osteocalcina (proteína Gla óssea) <400> 88
Tyr Leu Tyr Gin Trp Leu Gly Ala Pro Val Pro Tyr Pro Asp Pro Leu 15 10 15
Glu Pro Arg Arg Glu Val Cys Glu Leu Asn Pro Asp Cys Asp Glu Leu 20 25 30
Ala Asp His lie Gly Phe Gin Glu Ala Tyr Arg Arg Phe Tyr Gly 35 40 45
<210> 89 <211> 47 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> domínio Gla de proteína Gla da matriz <400> 89
Arg Ala Lys Val Gin Glu Arg lie Arg Glu Arg Ser Lys Pro Val His 15 10 15
Glu Leu Asn Arg Glu Ala Cys Asp Asp Tyr Arg Leu Cys Glu Arg Tyr 20 25 30
Ala Met Val Tyr Gly Tyr Asn Ala Ala Tyr Asn Arg Tyr Phe Arg 35 40 45
<210> 90 <211> 42 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> domínio Gla de proteína 6 específica de paragem do crescimento <400> 90
Phe Glu Glu Ala Lys Gin Gly His Leu Glu Arg Glu Cys Val Glu Glu 15 10 15
Leu Cys Ser Arg Glu Glu Ala Arg Glu Val Phe Glu Asn Asp Pro Glu 20 25 30
Thr Asp Tyr Phe Tyr Pro Arg Tyr Leu Asp 35 40
<210> 91 <211> 46 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> domínio Gla de proteína Z <400> 91
Ala Gly Ser Tyr Leu Leu Glu Glu Leu Phe Glu Gly Asn Leu Glu Lys 15 10 15
Glu Cys Tyr Glu Glu lie Cys Val Tyr Glu Glu Ala Arg Glu Val Phe 20 25 30
Glu Asn Glu Val Val Thr Asp Glu Phe Trp Arg Arg Tyr Lys 35 40 45
<210> 92 <211> 45 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> domínio Gla de factor VII <400> 92
Ala Asn Ala Phe Leu Glu Glu Leu Arg Pro Gly Ser Leu Glu Arg Glu 15 10 15
Cys Lys Glu Glu Gin Cys Ser Phe Glu Glu Ala Arg Glu lie Phe Lys 20 25 30
Asp Ala Glu Arg Thr Lys Leu Phe Trp lie Ser Tyr Ser 35 40 45
<210> 93 <211> 40 <212> PRT <213> Notechis scutatus scutatus <220> <223> protease semelhante ao factor Xa da coagulação do veneno -domínio Gla <220>
<221> UNSURE <222> (0)...(0) <223> Xaa pode ser qualquer aminoácido <400> 93
Ser Asn Ser Leu Phe Glu Glu lie Arg Pro Gly Asn lie Glu Arg Glu 15 10 15
Cys lie Glu Glu Lys Cys Ser Lys Glu Glu Ala Arg Glu Val Phe Glu 20 25 30
Asp Asn Glu Lys Thr Xaa Xaa Phe 35 40
<210> 94 <211> 46 <212> PRT <213> Tropidechis carinatus <220> <223> protease semelhante ao factor Xa da coagulação do veneno -domínio Gla <400> 94
Ser Asn Ser Leu Phe Glu Glu lie Arg Pro Gly Asn lie Glu Arg Glu 15 10 15
Cys lie Glu Glu Lys Cys Ser Lys Glu Glu Ala Arg Glu Val Phe Glu 20 25 30
Asp Asn Glu Lys Thr Glu Thr Phe Trp Asn Val Tyr Val Asp 35 40 45
<210> 95 <211> 464 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Precursor de antitrombina III <400> 95
Met Tyr Ser Asn Val lie Gly Thr Val Thr Ser Gly Lys Arg Lys Val 15 10 15
Tyr Leu Leu Ser Leu Leu Leu lie Gly Phe Trp Asp Cys Val Thr Cys 20 25 30
His Gly Ser Pro Val Asp lie Cys Thr Ala Lys Pro Arg Asp lie Pro 35 40 45
Met Asn Pro Met Cys lie Tyr Arg Ser Pro Glu Lys Lys Ala Thr Glu 50 55 60
Asp Glu Gly Ser Glu Gin Lys lie Pro Glu Ala Thr Asn Arg Arg Val 65 70 75 80
Trp Glu Leu Ser Lys Ala Asn Ser Arg Phe Ala Thr Thr Phe Tyr Gin 85 90 95
His Leu Ala Asp Ser Lys Asn Asp Asn Asp Asn lie Phe Leu Ser Pro 100 105 110
Leu Ser lie Ser Thr Ala Phe Ala Met Thr Lys Leu Gly Ala Cys Asn 115 120 125
Asp Thr Leu Gin Gin Leu Met Glu Val Phe Lys Phe Asp Thr lie Ser 130 135 140
Glu Lys Thr Ser Asp Gin lie His Phe Phe Phe Ala Lys Leu Asn Cys 145 150 155 160
Arg Leu Tyr Arg Lys Ala Asn Lys Ser Ser Lys Leu Val Ser Ala Asn 165 170 175
Arg Leu Phe Gly Asp Lys Ser Leu Thr Phe Asn Glu Thr Tyr Gin Asp 180 185 190 lie Ser Glu Leu Val Tyr Gly Ala Lys Leu Gin Pro Leu Asp Phe Lys 195 200 205
Glu Asn Ala Glu Gin Ser Arg Ala Ala lie Asn Lys Trp Val Ser Asn 210 215 220
Lys Thr Glu Gly Arg lie Thr Asp Val lie Pro Ser Glu Ala lie Asn 225 230 235 240
Glu Leu Thr Val Leu Val Leu Val Asn Thr lie Tyr Phe Lys Gly Leu 245 250 255
Trp Lys Ser Lys Phe Ser Pro Glu Asn Thr Arg Lys Glu Leu Phe Tyr 260 265 270
Lys Ala Asp Gly Glu Ser Cys Ser Ala Ser Met Met Tyr Gin Glu Gly 275 280 285
Lys Phe Arg Tyr Arg Arg Val Ala Glu Gly Thr Gin Val Leu Glu Leu 290 295 300
Pro Phe Lys Gly Asp Asp lie Thr Met Val Leu lie Leu Pro Lys Pro 305 310 315 320
Glu Lys Ser Leu Ala Lys Val Glu Lys Glu Leu Thr Pro Glu Val Leu 325 330 335
Gin Glu Trp Leu Asp Glu Leu Glu Glu Met Met Leu Val Val His Met 340 345 350
Pro Arg Phe Arg lie Glu Asp Gly Phe Ser Leu Lys Glu Gin Leu Gin 355 360 365
Asp Met Gly Leu Val Asp Leu Phe Ser Pro Glu Lys Ser Lys Leu Pro 370 375 380
Gly lie Val Ala Glu Gly Arg Asp Asp Leu Tyr Val Ser Asp Ala Phe 385 390 395 400
His Lys Ala Phe Leu Glu Val Asn Glu Glu Gly Ser Glu Ala Ala Ala 405 410 415
Ser Thr Ala Val Val lie Ala Gly Arg Ser Leu Asn Pro Asn Arg Val 420 425 430
Thr Phe Lys Ala Asn Arg Pro Phe Leu Val Phe lie Arg Glu Val Pro 435 440 445
Leu Asn Thr lie lie Phe Met Gly Arg Val Ala Asn Pro Cys Val Lys 450 455 460
<210> 96 <211> 432 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Antitrombina III madura <400> 9 6
His Gly Ser Pro Val Asp lie Cys Thr Ala Lys Pro Arg Asp lie Pro 15 10 15
Met Asn Pro Met Cys lie Tyr Arg Ser Pro Glu Lys Lys Ala Thr Glu 20 25 30
Asp Glu Gly Ser Glu Gin Lys lie Pro Glu Ala Thr Asn Arg Arg Val 35 40 45
Trp Glu Leu Ser Lys Ala Asn Ser Arg Phe Ala Thr Thr Phe Tyr Gin 50 55 60
His Leu Ala Asp Ser Lys Asn Asp Asn Asp Asn lie Phe Leu Ser Pro 65 70 75 80
Leu Ser lie Ser Thr Ala Phe Ala Met Thr Lys Leu Gly Ala Cys Asn 85 90 95
Asp Thr Leu Gin Gin Leu Met Glu Val Phe Lys Phe Asp Thr lie Ser 100 105 110
Glu Lys Thr Ser Asp Gin lie His Phe Phe Phe Ala Lys Leu Asn Cys 115 120 125
Arg Leu Tyr Arg Lys Ala Asn Lys Ser Ser Lys Leu Val Ser Ala Asn 130 135 140
Arg Leu Phe Gly Asp Lys Ser Leu Thr Phe Asn Glu Thr Tyr Gin Asp 145 150 155 160 lie Ser Glu Leu Val Tyr Gly Ala Lys Leu Gin Pro Leu Asp Phe Lys 165 170 175
Glu Asn Ala Glu Gin Ser Arg Ala Ala lie Asn Lys Trp Val Ser Asn 180 185 190
Lys Thr Glu Gly Arg lie Thr Asp Val lie Pro Ser Glu Ala lie Asn 195 200 205
Glu Leu Thr Val Leu Val Leu Val Asn Thr lie Tyr Phe Lys Gly Leu 210 215 220
Trp Lys Ser Lys Phe Ser Pro Glu Asn Thr Arg Lys Glu Leu Phe Tyr 225 230 235 240
Lys Ala Asp Gly Glu Ser Cys Ser Ala Ser Met Met Tyr Gin Glu Gly 245 250 255
Lys Phe Arg Tyr Arg Arg Val Ala Glu Gly Thr Gin Val Leu Glu Leu 260 265 270
Pro Phe Lys Gly Asp Asp lie Thr Met Val Leu lie Leu Pro Lys Pro 275 280 285
Glu Lys Ser Leu Ala Lys Val Glu Lys Glu Leu Thr Pro Glu Val Leu 290 295 300
Gin Glu Trp Leu Asp Glu Leu Glu Glu Met Met Leu Val Val His Met 305 310 315 320
Pro Arg Phe Arg lie Glu Asp Gly Phe Ser Leu Lys Glu Gin Leu Gin 325 330 335
Asp Met Gly Leu Val Asp Leu Phe Ser Pro Glu Lys Ser Lys Leu Pro 340 345 350
Gly lie Val Ala Glu Gly Arg Asp Asp Leu Tyr Val Ser Asp Ala Phe 355 360 365
His Lys Ala Phe Leu Glu Val Asn Glu Glu Gly Ser Glu Ala Ala Ala 370 375 380
Ser Thr Ala Val Val lie Ala Gly Arg Ser Leu Asn Pro Asn Arg Val 385 390 395 400
Thr Phe Lys Ala Asn Arg Pro Phe Leu Val Phe lie Arg Glu Val Pro 405 410 415
Leu Asn Thr lie lie Phe Met Gly Arg Val Ala Asn Pro Cys Val Lys 420 425 430
<210> 97 <211> 263 <212> PRT <213> Homo sapiens <220>
<221> THIOLEST <222> (0)...(0) <223> Factor tissular maduro <400> 97
Ser Gly Thr Thr Asn Thr Val Ala Ala Tyr Asn Leu Thr Trp Lys Ser 15 10 15
Thr Asn Phe Lys Thr lie Leu Glu Trp Glu Pro Lys Pro Val Asn Gin 20 25 30
Val Tyr Thr Val Gin lie Ser Thr Lys Ser Gly Asp Trp Lys Ser Lys 35 40 45
Cys Phe Tyr Thr Thr Asp Thr Glu Cys Asp Leu Thr Asp Glu lie Val 50 55 60
Lys Asp Val Lys Gin Thr Tyr Leu Ala Arg Val Phe Ser Tyr Pro Ala 65 70 75 80
Gly Asn Val Glu Ser Thr Gly Ser Ala Gly Glu Pro Leu Tyr Glu Asn 85 90 95
Ser Pro Glu Phe Thr Pro Tyr Leu Glu Thr Asn Leu Gly Gin Pro Thr 100 105 110 lie Gin Ser Phe Glu Gin Val Gly Thr Lys Val Asn Val Thr Val Glu 115 120 125
Asp Glu Arg Thr Leu Val Arg Arg Asn Asn Thr Phe Leu Ser Leu Arg 130 135 140
Asp Val Phe Gly Lys Asp Leu lie Tyr Thr Leu Tyr Tyr Trp Lys Ser 145 150 155 160
Ser Ser Ser Gly Lys Lys Thr Ala Lys Thr Asn Thr Asn Glu Phe Leu 165 170 175 lie Asp Val Asp Lys Gly Glu Asn Tyr Cys Phe Ser Val Gin Ala Val 180 185 190 lie Pro Ser Arg Thr Val Asn Arg Lys Ser Thr Asp Ser Pro Val Glu 195 200 205
Cys Met Gly Gin Glu Lys Gly Glu Phe Arg Glu lie Phe Tyr lie lie 210 215 220
Gly Ala Val Val Phe Val Val lie lie Leu Val lie lie Leu Ala lie 225 230 235 240
Ser Leu His Lys Cys Arg Lys Ala Gly Val Gly Gin Ser Trp Lys Glu 245 250 255
Asn Ser Pro Leu Asn Val Ser 260
<210> 98 <211> 406 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Variante V21D/E154V/M156Q de Factor Vila <400> 98
Ala Asn Ala Phe Leu Glu Glu Leu Arg Pro Gly Ser Leu Glu Arg Glu 15 10 15
Cys Lys Glu Glu Gin Cys Ser Phe Glu Glu Ala Arg Glu lie Phe Lys 20 25 30
Asp Ala Glu Arg Thr Lys Leu Phe Trp lie Ser Tyr Ser Asp Gly Asp 35 40 45
Gin Cys Ala Ser Ser Pro Cys Gin Asn Gly Gly Ser Cys Lys Asp Gin 50 55 60
Leu Gin Ser Tyr lie Cys Phe Cys Leu Pro Ala Phe Glu Gly Arg Asn 65 70 75 80
Cys Glu Thr His Lys Asp Asp Gin Leu lie Cys Val Asn Glu Asn Gly 85 90 95
Gly Cys Glu Gin Tyr Cys Ser Asp His Thr Gly Thr Lys Arg Ser Cys 100 105 110
Arg Cys His Glu Gly Tyr Ser Leu Leu Ala Asp Gly Val Ser Cys Thr 115 120 125
Pro Thr Val Glu Tyr Pro Cys Gly Lys lie Pro lie Leu Glu Lys Arg 130 135 140
Asn Ala Ser Lys Pro Gin Gly Arg lie Val Gly Gly Lys Asp Cys Pro 145 150 155 160
Lys Gly Glu Cys Pro Trp Gin Val Leu Leu Leu Val Asn Gly Ala Gin 165 170 175
Leu Cys Gly Gly Thr Leu lie Asn Thr lie Trp Val Val Ser Ala Ala 180 185 190
His Cys Phe Asp Lys lie Lys Asn Trp Arg Asn Leu lie Ala Val Leu 195 200 205
Gly Glu His Asp Leu Ser Glu His Asp Gly Asp Glu Gin Ser Arg Arg 210 215 220
Val Ala Gin Val lie lie Pro Ser Thr Tyr Val Pro Gly Thr Thr Asn 225 230 235 240
His Asp lie Ala Leu Leu Arg Leu His Gin Pro Val Val Leu Thr Asp 245 250 255
His Val Val Pro Leu Cys Leu Pro Glu Arg Thr Phe Ser Glu Arg Thr 260 265 270
Leu Ala Phe Val Arg Phe Ser Leu Val Ser Gly Trp Gly Gin Leu Leu 275 280 285
Asp Arg Gly Ala Thr Ala Leu Val Leu Gin Val Leu Asn Val Pro Arg 290 295 300
Leu Met Thr Gin Asp Cys Leu Gin Gin Ser Arg Lys Val Gly Asp Ser 305 310 315 320
Pro Asn lie Thr Glu Tyr Met Phe Cys Ala Gly Tyr Ser Asp Gly Ser 325 330 335
Lys Asp Ser Cys Lys Gly Asp Ser Gly Gly Pro His Ala Thr His Tyr 340 345 350
Arg Gly Thr Trp Tyr Leu Thr Gly lie Val Ser Trp Gly Gin Gly Cys 355 360 365
Ala Thr Val Gly His Phe Gly Val Tyr Thr Arg Val Ser Gin Tyr lie 370 375 380
Glu Trp Leu Gin Lys Leu Met Arg Ser Glu Pro Arg Pro Gly Val Leu 385 390 395 400
Leu Arg Ala Pro Phe Pro 405
<210> 99 <211> 4278 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> vector pCMV Script <400> 99 atgcattagt tattaatagt aatcaattac ggggtcatta gttcatagcc catatatgga 60 gttccgcgtt acataactta cggtaaatgg cccgcctggc tgaccgccca acgacccccg 120 cccattgacg tcaataatga cgtatgttcc catagtaacg ccaataggga ctttccattg 180 acgtcaatgg gtggagtatt tacggtaaac tgcccacttg gcagtacatc aagtgtatca 240 tatgccaagt acgcccccta ttgacgtcaa tgacggtaaa tggcccgcct ggcattatgc 300 ccagtacatg accttatggg actttcctac ttggcagtac atctacgtat tagtcatcgc 360 tattaccatg gtgatgcggt tttggcagta catcaatggg cgtggatagc ggtttgactc 420 acggggattt ccaagtctcc accccattga cgtcaatggg agtttgtttt ggcaccaaaa 480 tcaacgggac tttccaaaat gtcgtaacaa ctccgcccca ttgacgcaaa tgggcggtag 540 gcgtgtacgg tgggaggtct atataagcag agctggttta gtgaaccgtc agatccgcta 600 gcgattacgc caagctcgaa attaaccctc actaaaggga acaaaagctg gagctccacc 660 gcggtggcgg ccgctctagc ccgggcggat cccccgggct gcaggaattc gatatcaagc 720 ttatcgatac cgtcgacctc gagggggggc ccggtaccag gtaagtgtac ccaattcgcc 780 ctatagtgag tcgtattaca attcactcga tcgcccttcc caacagttgc gcagcctgaa 840 tggcgaatgg agatccaatt tttaagtgta taatgtgtta aactactgat tctaattgtt 900 tgtgtatttt agattcacag tcccaaggct catttcaggc ccctcagtcc tcacagtctg 960 ttcatgatca taatcagcca taccacattt gtagaggttt tacttgcttt aaaaaacctc 1020 ccacacctcc ccctgaacct gaaacataaa atgaatgcaa ttgttgttgt taacttgttt 1080 attgcagctt ataatggtta caaataaagc aatagcatca caaatttcac aaataaagca 1140 tttttttcac tgcattctag ttgtggtttg tccaaactca tcaatgtatc ttaacgcgta 1200 aattgtaagc gttaatattt tgttaaaatt cgcgttaaat ttttgttaaa tcagctcatt 1260 ttttaaccaa taggccgaaa tcggcaaaat cccttataaa tcaaaagaat agaccgagat 1320 agggttgagt gttgttccag tttggaacaa gagtccacta ttaaagaacg tggactccaa 1380 cgtcaaaggg cgaaaaaccg tctatcaggg cgatggccca ctacgtgaac catcacccta 1440 atcaagtttt ttggggtcga ggtgccgtaa agcactaaat cggaacccta aagggagccc 1500 ccgatttaga gcttgacggg gaaagccggc gaacgtggcg agaaaggaag ggaagaaagc 1560 gaaaggagcg ggcgctaggg cgctggcaag tgtagcggtc acgctgcgcg taaccaccac 1620 acccgccgcg cttaatgcgc cgctacaggg cgcgtcaggt ggcacttttc ggggaaatgt 1680 gcgcggaacc cctatttgtt tatttttcta aatacattca aatatgtatc cgctcatgag 1740 acaataaccc tgataaatgc ttcaataata ttgaaaaagg aagaatcctg aggcggaaag 1800 aaccagctgt ggaatgtgtg tcagttaggg tgtggaaagt ccccaggctc cccagcaggc 1860 agaagtatgc aaagcatgca tctcaattag tcagcaacca ggtgtggaaa gtccccaggc 1920 tccccagcag gcagaagtat gcaaagcatg catctcaatt agtcagcaac catagtcccg 1980 cccctaactc cgcccatccc gcccctaact ccgcccagtt ccgcccattc tccgccccat 2040 ggctgactaa ttttttttat ttatgcagag gccgaggccg cctcggcctc tgagctattc 2100 cagaagtagt gaggaggctt ttttggaggc ctaggctttt gcaaagatcg atcaagagac 2160 aggatgagga tcgtttcgca tgattgaaca agatggattg cacgcaggtt ctccggccgc 2220 ttgggtggag aggctattcg gctatgactg ggcacaacag acaatcggct gctctgatgc 2280 cgccgtgttc cggctgtcag cgcaggggcg cccggttctt tttgtcaaga ccgacctgtc 2340 cggtgccctg aatgaactgc aagacgaggc agcgcggcta tcgtggctgg ccacgacggg 2400 cgttccttgc gcagctgtgc tcgacgttgt cactgaagcg ggaagggact ggctgctatt 2460 gggcgaagtg ccggggcagg atctcctgtc atctcacctt gctcctgccg agaaagtatc 2520 catcatggct gatgcaatgc ggcggctgca tacgcttgat ccggctacct gcccattcga 2580 ccaccaagcg aaacatcgca tcgagcgagc acgtactcgg atggaagccg gtcttgtcga 2640 tcaggatgat ctggacgaag aacatcaggg gctcgcgcca gccgaactgt tcgccaggct 2700 caaggcgagc atgcccgacg gcgaggatct cgtcgtgacc catggcgatg cctgcttgcc 2760 gaatatcatg gtggaaaatg gccgcttttc tggattcatc gactgtggcc ggctgggtgt 2820 ggcggaccgc tatcaggaca tagcgttggc tacccgtgat attgctgaag aacttggcgg 2880 cgaatgggct gaccgcttcc tcgtgcttta cggtatcgcc gctcccgatt cgcagcgcat 2940 cgccttctat cgccttcttg acgagttctt ctgagcggga ctctggggtt cgaaatgacc 3000 gaccaagcga cgcccaacct gccatcacga gatttcgatt ccaccgccgc cttctatgaa 3060 aggttgggct tcggaatcgt tttccgggac gccggctgga tgatcctcca gcgcggggat 3120 ctcatgctgg agttcttcgc ccaccctagg gggaggctaa ctgaaacacg gaaggagaca 3180 ataccggaag gaacccgcgc tatgacggca ataaaaagac agaataaaac gcacggtgtt 3240 gggtcgtttg ttcataaacg cggggttcgg tcccagggct ggcactctgt cgatacccca 3300 ccgagacccc attggggcca atacgcccgc gtttcttcct tttccccacc ccacccccca 3360 agttcgggtg aaggcccagg gctcgcagcc aacgtcgggg cggcaggccc tgccatagcc 3420 tcaggttact catatatact ttagattgat ttaaaacttc atttttaatt taaaaggatc 3480 taggtgaaga tcctttttga taatctcatg accaaaatcc cttaacgtga gttttcgttc 3540 cactgagcgt cagaccccgt agaaaagatc aaaggatctt cttgagatcc tttttttctg 3600 cgcgtaatct gctgcttgca aacaaaaaaa ccaccgctac cagcggtggt ttgtttgccg 3660 gatcaagagc taccaactct ttttccgaag gtaactggct tcagcagagc gcagatacca 3720 aatactgtcc ttctagtgta gccgtagtta ggccaccact tcaagaactc tgtagcaccg 3780 cctacatacc tcgctctgct aatcctgtta ccagtggctg ctgccagtgg cgataagtcg 3840 tgtcttaccg ggttggactc aagacgatag ttaccggata aggcgcagcg gtcgggctga 3900 acggggggtt cgtgcacaca gcccagcttg gagcgaacga cctacaccga actgagatac 3960 ctacagcgtg agctatgaga aagcgccacg cttcccgaag ggagaaaggc ggacaggtat 4020 ccggtaagcg gcagggtcgg aacaggagag cgcacgaggg agcttccagg gggaaacgcc 4080 tggtatcttt atagtcctgt cgggtttcgc cacctctgac ttgagcgtcg atttttgtga 4140 tgctcgtcag gggggcggag cctatggaaa aacgccagca acgcggcctt tttacggttc 4200 ctggcctttt gctggccttt tgctcacatg ttctttcctg cgttatcccc tgattctgtg 4260 gataaccgta ttaccgcc 4278
<210> 100 <211> 45 <212> ADN <213> Seguência Artificial <220> <223> Iniciador de PCR direto de Factor VII, CBO-125 <400> 100 gcatcatgac gtgacggatc cgccaccatg gtctcccagg ccctc 45
<210> 101 <211> 45 <212> ADN <213> Sequência Artificial <220> <223> Iniciador de PCR inverso de Factor VII, CBO-126 <400> 101 gatcgtacga tacgtgaatt cctagggaaa tggggctcgc aggag 45
<210> 102 <211> 1398 <212> ADN <213> Homo sapiens <220> <223> ADNc de FVII (molde para PCR) <400> 102 atggtctccc aggccctcag gctcctctgc cttctgcttg ggcttcaggg ctgcctggct 60 gcaggcgggg tcgctaaggc ctcaggagga gaaacacggg acatgccgtg gaagccgggg 120 cctcacagag tcttcgtaac ccaggaggaa gcccacggcg tcctgcaccg gcgccggcgc 180 gccaacgcgt tcctggagga gctgcggccg ggctccctgg agagggagtg caaggaggag 240 cagtgctcct tcgaggaggc ccgggagatc ttcaaggacg cggagaggac gaagctgttc 300 tggatttctt acagtgatgg ggaccagtgt gcctcaagtc catgccagaa tgggggctcc 360 tgcaaggacc agctccagtc ctatatctgc ttctgcctcc ctgccttcga gggccggaac 420 tgtgagacgc acaaggatga ccagctgatc tgtgtgaacg agaacggcgg ctgtgagcag 480 tactgcagtg accacacggg caccaagcgc tcctgtcggt gccacgaggg gtactctctg 540 ctggcagacg gggtgtcctg cacacccaca gttgaatatc catgtggaaa aatacctatt 600 ctagaaaaaa gaaatgccag caaaccccaa ggccgaattg tggggggcaa ggtgtgcccc 660 aaaggggagt gtccatggca ggtcctgttg ttggtgaatg gagctcagtt gtgtgggggg 720 accctgatca acaccatctg ggtggtctcc gcggcccact gtttcgacaa aatcaagaac 780 tggaggaacc tgatcgcggt gctgggcgag cacgacctca gcgagcacga cggggatgag 840 cagagccggc gggtggcgca ggtcatcatc cccagcacgt acgtcccggg caccaccaac 900 cacgacatcg cgctgctccg cctgcaccag cccgtggtcc tcactgacca tgtggtgccc 960 ctctgcctgc ccgaacggac gttctctgag aggacgctgg ccttcgtgcg cttctcattg 1020 gtcagcggct ggggccagct gctggaccgt ggcgccacgg ccctggagct catggtcctc 1080 aacgtgcccc ggctgatgac ccaggactgc ctgcagcagt cacggaaggt gggagactcc 1140 ccaaatatca cggagtacat gttctgtgcc ggctactcgg atggcagcaa ggactcctgc 1200 aagggggaca gtggaggccc acatgccacc cactaccggg gcacgtggta cctgacgggc 1260 atcgtcagct ggggccaggg ctgcgcaacc gtgggccact ttggggtgta caccagggtc 1320 tcccagtaca tcgagtggct gcaaaagctc atgcgctcag agccacgccc aggagtcctc 1380 ctgcgagccc catttccc 1398
<210> 103 <211> 20 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> sequência de ligação a albumina sérica <400> 103
Gin Arg Leu Met Glu Asp lie Cys Leu Pro Arg Trp Gly Cys Leu Trp 15 10 15
Glu Asp Asp Phe 20
<210> 104 <211> 14 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> sequência de liqação a albumina sérica <400> 104 lie Glu Asp lie Cys Leu Pro Arg Trp Gly Cys Leu Trp Glu 15 10
<210> 105 <211> 13 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> sequência de ligação a albumina sérica <400> 105
Asp lie Cys Leu Pro Arg Trp Gly Cys Leu Trp Glu Asp 15 10
<210> 106 <211> 13 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> sequência de ligação a albumina sérica <400> 106 lie Glu Asp lie Cys Leu Pro Arg Trp Gly Cys Leu Trp 15 10
<210> 107 <211> 17 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> sequência de ligação a albumina sérica <400> 107
Gly Gly Gly Ser lie Glu Asp lie Cys Leu Pro Arg Trp Gly Cys Leu 15 10 15
Trp
<210> 108 <211> 13 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> sequência de ligação a albumina sérica <400> 108
Asp lie Cys Leu Pro Arg Trp Gly Cys Leu Trp Glu Asp 15 10
<210> 109 <211> 17 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> sequência de ligação a albumina sérica <400> 109
Gly Gly Gly Ser Asp lie Cys Leu Pro Arg Trp Gly Cys Leu Trp Glu 15 10 15
Asp
<210 > 110 <211> 10 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> sequência de ligação a integrina Ilb-IIIa de plaquetas <400> 110
Ser Phe Gly Arg Gly Asp lie Arg Asn Val 15 10
<210> 111 <211> 12 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> sequência de ligação a integrina Ilb-IIIa de plaquetas <400> 111
Cys Ser Phe Gly Arg Gly Asp lie Arg Asn Val Cys 15 10
<210> 112 <211> 16 <212> PRT <213> Sequência Artificial <220> <223> sequência de ligação a integrina Ilb-IIIa de plaquetas <400> 112
Gly Gly Gly Ser Cys Ser Phe Gly Arg Gly Asp lie Arg Asn Val Cys 15 10 15
<210> 113 <211> 406 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Q286N <400> 113
Ala Asn Ala Phe Leu Glu Glu Leu Arg Pro Gly Ser Leu Glu Arg Glu 15 10 15
Cys Lys Glu Glu Gin Cys Ser Phe Glu Glu Ala Arg Glu lie Phe Lys 20 25 30
Asp Ala Glu Arg Thr Lys Leu Phe Trp lie Ser Tyr Ser Asp Gly Asp 35 40 45
Gin Cys Ala Ser Ser Pro Cys Gin Asn Gly Gly Ser Cys Lys Asp Gin 50 55 60
Leu Gin Ser Tyr lie Cys Phe Cys Leu Pro Ala Phe Glu Gly Arg Asn 65 70 75 80
Cys Glu Thr His Lys Asp Asp Gin Leu lie Cys Val Asn Glu Asn Gly 85 90 95
Gly Cys Glu Gin Tyr Cys Ser Asp His Thr Gly Thr Lys Arg Ser Cys 100 105 110
Arg Cys His Glu Gly Tyr Ser Leu Leu Ala Asp Gly Val Ser Cys Thr 115 120 125
Pro Thr Val Glu Tyr Pro Cys Gly Lys lie Pro lie Leu Glu Lys Arg 130 135 140
Asn Ala Ser Lys Pro Gin Gly Arg lie Val Gly Gly Lys Val Cys Pro 145 150 155 160
Lys Gly Glu Cys Pro Trp Gin Val Leu Leu Leu Val Asn Gly Ala Gin 165 170 175
Leu Cys Gly Gly Thr Leu lie Asn Thr lie Trp Val Val Ser Ala Ala 180 185 190
His Cys Phe Asp Lys lie Lys Asn Trp Arg Asn Leu lie Ala Val Leu 195 200 205
Gly Glu His Asp Leu Ser Glu His Asp Gly Asp Glu Gin Ser Arg Arg 210 215 220
Val Ala Gin Val lie lie Pro Ser Thr Tyr Val Pro Gly Thr Thr Asn 225 230 235 240
His Asp lie Ala Leu Leu Arg Leu His Gin Pro Val Val Leu Thr Asp 245 250 255
His Val Val Pro Leu Cys Leu Pro Glu Arg Thr Phe Ser Glu Arg Thr 260 265 270
Leu Ala Phe Val Arg Phe Ser Leu Val Ser Gly Trp Gly Asn Leu Leu 275 280 285
Asp Arg Gly Ala Thr Ala Leu Glu Leu Met Val Leu Asn Val Pro Arg 290 295 300
Leu Met Thr Gin Asp Cys Leu Gin Gin Ser Arg Lys Val Gly Asp Ser 305 310 315 320
Pro Asn lie Thr Glu Tyr Met Phe Cys Ala Gly Tyr Ser Asp Gly Ser 325 330 335
Lys Asp Ser Cys Lys Gly Asp Ser Gly Gly Pro His Ala Thr His Tyr 340 345 350
Arg Gly Thr Trp Tyr Leu Thr Gly lie Val Ser Trp Gly Gin Gly Cys 355 360 365
Ala Thr Val Gly His Phe Gly Val Tyr Thr Arg Val Ser Gin Tyr lie 370 375 380
Glu Trp Leu Gin Lys Leu Met Arg Ser Glu Pro Arg Pro Gly Val Leu 385 390 395 400
Leu Arg Ala Pro Phe Pro 405
<210> 114 <211> 406 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Q286E <400> 114
Ala Asn Ala Phe Leu Glu Glu Leu Arg Pro Gly Ser Leu Glu Arg Glu 15 10 15
Cys Lys Glu Glu Gin Cys Ser Phe Glu Glu Ala Arg Glu lie Phe Lys 20 25 30
Asp Ala Glu Arg Thr Lys Leu Phe Trp lie Ser Tyr Ser Asp Gly Asp 35 40 45
Gin Cys Ala Ser Ser Pro Cys Gin Asn Gly Gly Ser Cys Lys Asp Gin 50 55 60
Leu Gin Ser Tyr lie Cys Phe Cys Leu Pro Ala Phe Glu Gly Arg Asn 65 70 75 80
Cys Glu Thr His Lys Asp Asp Gin Leu lie Cys Val Asn Glu Asn Gly 85 90 95
Gly Cys Glu Gin Tyr Cys Ser Asp His Thr Gly Thr Lys Arg Ser Cys 100 105 110
Arg Cys His Glu Gly Tyr Ser Leu Leu Ala Asp Gly Val Ser Cys Thr 115 120 125
Pro Thr Val Glu Tyr Pro Cys Gly Lys lie Pro lie Leu Glu Lys Arg 130 135 140
Asn Ala Ser Lys Pro Gin Gly Arg lie Val Gly Gly Lys Val Cys Pro 145 150 155 160
Lys Gly Glu Cys Pro Trp Gin Val Leu Leu Leu Val Asn Gly Ala Gin 165 170 175
Leu Cys Gly Gly Thr Leu lie Asn Thr lie Trp Val Val Ser Ala Ala 180 185 190
His Cys Phe Asp Lys lie Lys Asn Trp Arg Asn Leu lie Ala Val Leu 195 200 205
Gly Glu His Asp Leu Ser Glu His Asp Gly Asp Glu Gin Ser Arg Arg 210 215 220
Val Ala Gin Val lie lie Pro Ser Thr Tyr Val Pro Gly Thr Thr Asn 225 230 235 240
His Asp lie Ala Leu Leu Arg Leu His Gin Pro Val Val Leu Thr Asp 245 250 255
His Val Val Pro Leu Cys Leu Pro Glu Arg Thr Phe Ser Glu Arg Thr 260 265 270
Leu Ala Phe Val Arg Phe Ser Leu Val Ser Gly Trp Gly Glu Leu Leu 275 280 285
Asp Arg Gly Ala Thr Ala Leu Glu Leu Met Val Leu Asn Val Pro Arg 290 295 300
Leu Met Thr Gin Asp Cys Leu Gin Gin Ser Arg Lys Val Gly Asp Ser 305 310 315 320
Pro Asn lie Thr Glu Tyr Met Phe Cys Ala Gly Tyr Ser Asp Gly Ser 325 330 335
Lys Asp Ser Cys Lys Gly Asp Ser Gly Gly Pro His Ala Thr His Tyr 340 345 350
Arg Gly Thr Trp Tyr Leu Thr Gly lie Val Ser Trp Gly Gin Gly Cys 355 360 365
Ala Thr Val Gly His Phe Gly Val Tyr Thr Arg Val Ser Gin Tyr lie 370 375 380
Glu Trp Leu Gin Lys Leu Met Arg Ser Glu Pro Arg Pro Gly Val Leu 385 390 395 400
Leu Arg Ala Pro Phe Pro 405
<210> 115 <211> 406 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Q286D <400> 115
Ala Asn Ala Phe Leu Glu Glu Leu Arg Pro Gly Ser Leu Glu Arg Glu 15 10 15
Cys Lys Glu Glu Gin Cys Ser Phe Glu Glu Ala Arg Glu lie Phe Lys 20 25 30
Asp Ala Glu Arg Thr Lys Leu Phe Trp lie Ser Tyr Ser Asp Gly Asp 35 40 45
Gin Cys Ala Ser Ser Pro Cys Gin Asn Gly Gly Ser Cys Lys Asp Gin 50 55 60
Leu Gin Ser Tyr lie Cys Phe Cys Leu Pro Ala Phe Glu Gly Arg Asn 65 70 75 80
Cys Glu Thr His Lys Asp Asp Gin Leu lie Cys Val Asn Glu Asn Gly 85 90 95
Gly Cys Glu Gin Tyr Cys Ser Asp His Thr Gly Thr Lys Arg Ser Cys 100 105 110
Arg Cys His Glu Gly Tyr Ser Leu Leu Ala Asp Gly Val Ser Cys Thr 115 120 125
Pro Thr Val Glu Tyr Pro Cys Gly Lys lie Pro lie Leu Glu Lys Arg 130 135 140
Asn Ala Ser Lys Pro Gin Gly Arg lie Val Gly Gly Lys Val Cys Pro 145 150 155 160
Lys Gly Glu Cys Pro Trp Gin Val Leu Leu Leu Val Asn Gly Ala Gin 165 170 175
Leu Cys Gly Gly Thr Leu lie Asn Thr lie Trp Val Val Ser Ala Ala 180 185 190
His Cys Phe Asp Lys lie Lys Asn Trp Arg Asn Leu lie Ala Val Leu 195 200 205
Gly Glu His Asp Leu Ser Glu His Asp Gly Asp Glu Gin Ser Arg Arg 210 215 220
Val Ala Gin Val lie lie Pro Ser Thr Tyr Val Pro Gly Thr Thr Asn 225 230 235 240
His Asp lie Ala Leu Leu Arg Leu His Gin Pro Val Val Leu Thr Asp 245 250 255
His Val Val Pro Leu Cys Leu Pro Glu Arg Thr Phe Ser Glu Arg Thr 260 265 270
Leu Ala Phe Val Arg Phe Ser Leu Val Ser Gly Trp Gly Asp Leu Leu 275 280 285
Asp Arg Gly Ala Thr Ala Leu Glu Leu Met Val Leu Asn Val Pro Arg 290 295 300
Leu Met Thr Gin Asp Cys Leu Gin Gin Ser Arg Lys Val Gly Asp Ser 305 310 315 320
Pro Asn lie Thr Glu Tyr Met Phe Cys Ala Gly Tyr Ser Asp Gly Ser 325 330 335
Lys Asp Ser Cys Lys Gly Asp Ser Gly Gly Pro His Ala Thr His Tyr 340 345 350
Arg Gly Thr Trp Tyr Leu Thr Gly lie Val Ser Trp Gly Gin Gly Cys 355 360 365
Ala Thr Val Gly His Phe Gly Val Tyr Thr Arg Val Ser Gin Tyr lie 370 375 380
Glu Trp Leu Gin Lys Leu Met Arg Ser Glu Pro Arg Pro Gly Val Leu 385 390 395 400
Leu Arg Ala Pro Phe Pro 405
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Cys Lys Glu Glu Gin Cys Ser Phe Glu Glu Ala Arg Glu lie Phe Lys 20 25 30
Asp Ala Glu Arg Thr Lys Leu Phe Trp lie Ser Tyr Ser Asp Gly Asp 35 40 45
Gin Cys Ala Ser Ser Pro Cys Gin Asn Gly Gly Ser Cys Lys Asp Gin 50 55 60
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Leu Ala Phe Val Arg Phe Ser Leu Val Ser Gly Trp Gly Ser Leu Leu 275 280 285
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Leu Met Thr Gin Asp Cys Leu Gin Gin Ser Arg Lys Val Gly Asp Ser 305 310 315 320
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Lys Asp Ser Cys Lys Gly Asp Ser Gly Gly Pro His Ala Thr His Tyr 340 345 350
Arg Gly Thr Trp Tyr Leu Thr Gly lie Val Ser Trp Gly Gin Gly Cys 355 360 365
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Cys Lys Glu Glu Gin Cys Ser Phe Glu Glu Ala Arg Glu lie Phe Lys 20 25 30
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Cys Lys Glu Glu Gin Cys Ser Phe Glu Glu Ala Arg Glu lie Phe Lys 20 25 30
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Leu Cys Gly Gly Thr Leu lie Asn Thr lie Trp Val Val Ser Ala Ala 180 185 190
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Leu Met Thr Gin Asp Cys Leu Gin Gin Ser Arg Lys Val Gly Asp Ser 305 310 315 320
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Lys Asp Ser Cys Lys Gly Asp Ser Gly Gly Pro His Ala Thr His Tyr 340 345 350
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Leu Arg Ala Pro Phe Pro 405
<210> 121 <211> 406 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Q286V <400> 121
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Cys Lys Glu Glu Gin Cys Ser Phe Glu Glu Ala Arg Glu lie Phe Lys 20 25 30
Asp Ala Glu Arg Thr Lys Leu Phe Trp lie Ser Tyr Ser Asp Gly Asp 35 40 45
Gin Cys Ala Ser Ser Pro Cys Gin Asn Gly Gly Ser Cys Lys Asp Gin 50 55 60
Leu Gin Ser Tyr lie Cys Phe Cys Leu Pro Ala Phe Glu Gly Arg Asn 65 70 75 80
Cys Glu Thr His Lys Asp Asp Gin Leu lie Cys Val Asn Glu Asn Gly 85 90 95
Gly Cys Glu Gin Tyr Cys Ser Asp His Thr Gly Thr Lys Arg Ser Cys 100 105 110
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Lys Gly Glu Cys Pro Trp Gin Val Leu Leu Leu Val Asn Gly Ala Gin 165 170 175
Leu Cys Gly Gly Thr Leu lie Asn Thr lie Trp Val Val Ser Ala Ala 180 185 190
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Gly Glu His Asp Leu Ser Glu His Asp Gly Asp Glu Gin Ser Arg Arg 210 215 220
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His Asp lie Ala Leu Leu Arg Leu His Gin Pro Val Val Leu Thr Asp 245 250 255
His Val Val Pro Leu Cys Leu Pro Glu Arg Thr Phe Ser Glu Arg Thr 260 265 270
Leu Ala Phe Val Arg Phe Ser Leu Val Ser Gly Trp Gly Val Leu Leu 275 280 285
Asp Arg Gly Ala Thr Ala Leu Glu Leu Met Val Leu Asn Val Pro Arg 290 295 300
Leu Met Thr Gin Asp Cys Leu Gin Gin Ser Arg Lys Val Gly Asp Ser 305 310 315 320
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Leu Met Thr Gin Asp Cys Leu Gin Gin Ser Arg Lys Val Gly Asp Ser 305 310 315 320
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Leu Arg Ala Pro Phe Pro 405
<210> 123 <211> 406 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Q296L <400> 123
Ala Asn Ala Phe Leu Glu Glu Leu Arg Pro Gly Ser Leu Glu Arg Glu 15 10 15
Cys Lys Glu Glu Gin Cys Ser Phe Glu Glu Ala Arg Glu lie Phe Lys 20 25 30
Asp Ala Glu Arg Thr Lys Leu Phe Trp lie Ser Tyr Ser Asp Gly Asp 35 40 45
Gin Cys Ala Ser Ser Pro Cys Gin Asn Gly Gly Ser Cys Lys Asp Gin 50 55 60
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Gly Glu His Asp Leu Ser Glu His Asp Gly Asp Glu Gin Ser Arg Arg 210 215 220
Val Ala Gin Val lie lie Pro Ser Thr Tyr Val Pro Gly Thr Thr Asn 225 230 235 240
His Asp lie Ala Leu Leu Arg Leu His Gin Pro Val Val Leu Thr Asp 245 250 255
His Val Val Pro Leu Cys Leu Pro Glu Arg Thr Phe Ser Glu Arg Thr 260 265 270
Leu Ala Phe Val Arg Phe Ser Leu Val Ser Gly Trp Gly Leu Leu Leu 275 280 285
Asp Arg Gly Ala Thr Ala Leu Glu Leu Met Val Leu Asn Val Pro Arg 290 295 300
Leu Met Thr Gin Asp Cys Leu Gin Gin Ser Arg Lys Val Gly Asp Ser 305 310 315 320
Pro Asn lie Thr Glu Tyr Met Phe Cys Ala Gly Tyr Ser Asp Gly Ser 325 330 335
Lys Asp Ser Cys Lys Gly Asp Ser Gly Gly Pro His Ala Thr His Tyr 340 345 350
Arg Gly Thr Trp Tyr Leu Thr Gly lie Val Ser Trp Gly Gin Gly Cys 355 360 365
Ala Thr Val Gly His Phe Gly Val Tyr Thr Arg Val Ser Gin Tyr lie 370 375 380
Glu Trp Leu Gin Lys Leu Met Arg Ser Glu Pro Arg Pro Gly Val Leu 385 390 395 400
Leu Arg Ala Pro Phe Pro 405
<210> 124 <211> 406 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Q286Y <400> 124
Ala Asn Ala Phe Leu Glu Glu Leu Arg Pro Gly Ser Leu Glu Arg Glu 15 10 15
Cys Lys Glu Glu Gin Cys Ser Phe Glu Glu Ala Arg Glu lie Phe Lys 20 25 30
Asp Ala Glu Arg Thr Lys Leu Phe Trp lie Ser Tyr Ser Asp Gly Asp 35 40 45
Gin Cys Ala Ser Ser Pro Cys Gin Asn Gly Gly Ser Cys Lys Asp Gin 50 55 60
Leu Gin Ser Tyr lie Cys Phe Cys Leu Pro Ala Phe Glu Gly Arg Asn 65 70 75 80
Cys Glu Thr His Lys Asp Asp Gin Leu lie Cys Val Asn Glu Asn Gly 85 90 95
Gly Cys Glu Gin Tyr Cys Ser Asp His Thr Gly Thr Lys Arg Ser Cys 100 105 110
Arg Cys His Glu Gly Tyr Ser Leu Leu Ala Asp Gly Val Ser Cys Thr 115 120 125
Pro Thr Val Glu Tyr Pro Cys Gly Lys lie Pro lie Leu Glu Lys Arg 130 135 140
Asn Ala Ser Lys Pro Gin Gly Arg lie Val Gly Gly Lys Val Cys Pro 145 150 155 160
Lys Gly Glu Cys Pro Trp Gin Val Leu Leu Leu Val Asn Gly Ala Gin 165 170 175
Leu Cys Gly Gly Thr Leu lie Asn Thr lie Trp Val Val Ser Ala Ala 180 185 190
His Cys Phe Asp Lys lie Lys Asn Trp Arg Asn Leu lie Ala Val Leu 195 200 205
Gly Glu His Asp Leu Ser Glu His Asp Gly Asp Glu Gin Ser Arg Arg 210 215 220
Val Ala Gin Val lie lie Pro Ser Thr Tyr Val Pro Gly Thr Thr Asn 225 230 235 240
His Asp lie Ala Leu Leu Arg Leu His Gin Pro Val Val Leu Thr Asp 245 250 255
His Val Val Pro Leu Cys Leu Pro Glu Arg Thr Phe Ser Glu Arg Thr 260 265 270
Leu Ala Phe Val Arg Phe Ser Leu Val Ser Gly Trp Gly Tyr Leu Leu 275 280 285
Asp Arg Gly Ala Thr Ala Leu Glu Leu Met Val Leu Asn Val Pro Arg 290 295 300
Leu Met Thr Gin Asp Cys Leu Gin Gin Ser Arg Lys Val Gly Asp Ser 305 310 315 320
Pro Asn lie Thr Glu Tyr Met Phe Cys Ala Gly Tyr Ser Asp Gly Ser 325 330 335
Lys Asp Ser Cys Lys Gly Asp Ser Gly Gly Pro His Ala Thr His Tyr 340 345 350
Arg Gly Thr Trp Tyr Leu Thr Gly lie Val Ser Trp Gly Gin Gly Cys 355 360 365
Ala Thr Val Gly His Phe Gly Val Tyr Thr Arg Val Ser Gin Tyr lie 370 375 380
Glu Trp Leu Gin Lys Leu Met Arg Ser Glu Pro Arg Pro Gly Val Leu 385 390 395 400
Leu Arg Ala Pro Phe Pro 405
<210> 125 <211> 406 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Q286G <400> 125
Ala Asn Ala Phe Leu Glu Glu Leu Arg Pro Gly Ser Leu Glu Arg Glu 15 10 15
Cys Lys Glu Glu Gin Cys Ser Phe Glu Glu Ala Arg Glu lie Phe Lys 20 25 30
Asp Ala Glu Arg Thr Lys Leu Phe Trp lie Ser Tyr Ser Asp Gly Asp 35 40 45
Gin Cys Ala Ser Ser Pro Cys Gin Asn Gly Gly Ser Cys Lys Asp Gin 50 55 60
Leu Gin Ser Tyr lie Cys Phe Cys Leu Pro Ala Phe Glu Gly Arg Asn 65 70 75 80
Cys Glu Thr His Lys Asp Asp Gin Leu lie Cys Val Asn Glu Asn Gly 85 90 95
Gly Cys Glu Gin Tyr Cys Ser Asp His Thr Gly Thr Lys Arg Ser Cys 100 105 110
Arg Cys His Glu Gly Tyr Ser Leu Leu Ala Asp Gly Val Ser Cys Thr 115 120 125
Pro Thr Val Glu Tyr Pro Cys Gly Lys lie Pro lie Leu Glu Lys Arg 130 135 140
Asn Ala Ser Lys Pro Gin Gly Arg lie Val Gly Gly Lys Val Cys Pro 145 150 155 160
Lys Gly Glu Cys Pro Trp Gin Val Leu Leu Leu Val Asn Gly Ala Gin 165 170 175
Leu Cys Gly Gly Thr Leu lie Asn Thr lie Trp Val Val Ser Ala Ala 180 185 190
His Cys Phe Asp Lys lie Lys Asn Trp Arg Asn Leu lie Ala Val Leu 195 200 205
Gly Glu His Asp Leu Ser Glu His Asp Gly Asp Glu Gin Ser Arg Arg 210 215 220
Val Ala Gin Val lie lie Pro Ser Thr Tyr Val Pro Gly Thr Thr Asn 225 230 235 240
His Asp lie Ala Leu Leu Arg Leu His Gin Pro Val Val Leu Thr Asp 245 250 255
His Val Val Pro Leu Cys Leu Pro Glu Arg Thr Phe Ser Glu Arg Thr 260 265 270
Leu Ala Phe Val Arg Phe Ser Leu Val Ser Gly Trp Gly Gly Leu Leu 275 280 285
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Leu Met Thr Gin Asp Cys Leu Gin Gin Ser Arg Lys Val Gly Asp Ser 305 310 315 320
Pro Asn lie Thr Glu Tyr Met Phe Cys Ala Gly Tyr Ser Asp Gly Ser 325 330 335
Lys Asp Ser Cys Lys Gly Asp Ser Gly Gly Pro His Ala Thr His Tyr 340 345 350
Arg Gly Thr Trp Tyr Leu Thr Gly lie Val Ser Trp Gly Gin Gly Cys 355 360 365
Ala Thr Val Gly His Phe Gly Val Tyr Thr Arg Val Ser Gin Tyr lie 370 375 380
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His Val Val Pro Leu Cys Leu Pro Glu Arg Thr Phe Ser Glu Arg Thr 260 265 270
Leu Ala Phe Val Arg Phe Ser Leu Val Ser Gly Trp Gly Phe Leu Leu 275 280 285
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Leu Met Thr Gin Asp Cys Leu Gin Gin Ser Arg Lys Val Gly Asp Ser 305 310 315 320
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<223> Q286I <4 Ο Ο > 127
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Leu Ala Phe Val Arg Phe Ser Leu Val Ser Gly Trp Gly lie Leu Leu 275 280 285
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<223> Q286R/S222A <4 Ο Ο > 133
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Pro Asn lie Thr Glu Tyr Met Phe Cys Ala Gly Tyr Ser Asp Gly Ser 325 330 335
Lys Asp Ser Cys Lys Gly Asp Ser Gly Gly Pro His Ala Thr His Tyr 340 345 350
Arg Gly Thr Trp Tyr Leu Thr Gly lie Val Ser Trp Gly Gin Gly Cys 355 360 365
Ala Thr Val Gly His Phe Gly Val Tyr Thr Arg Val Ser Gin Tyr lie 370 375 380
Glu Trp Leu Gin Lys Leu Met Arg Ser Glu Pro Arg Pro Gly Val Leu 385 390 395 400
Leu Arg Ala Pro Phe Pro 405
<210> 134 <211> 406 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Q286R/S222A/H257A <400> 134
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Cys Lys Glu Glu Gin Cys Ser Phe Glu Glu Ala Arg Glu lie Phe Lys 20 25 30
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Gin Cys Ala Ser Ser Pro Cys Gin Asn Gly Gly Ser Cys Lys Asp Gin 50 55 60
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Cys Glu Thr His Lys Asp Asp Gin Leu lie Cys Val Asn Glu Asn Gly 85 90 95
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Leu Cys Gly Gly Thr Leu lie Asn Thr lie Trp Val Val Ser Ala Ala 180 185 190
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Gly Glu His Asp Leu Ser Glu His Asp Gly Asp Glu Gin Ala Arg Arg 210 215 220
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His Asp lie Ala Leu Leu Arg Leu His Gin Pro Val Val Leu Thr Asp 245 250 255
Ala Val Val Pro Leu Cys Leu Pro Glu Arg Thr Phe Ser Glu Arg Thr 260 265 270
Leu Ala Phe Val Arg Phe Ser Leu Val Ser Gly Trp Gly Arg Leu Leu 275 280 285
Asp Arg Gly Ala Thr Ala Leu Glu Leu Met Val Leu Asn Val Pro Arg 290 295 300
Leu Met Thr Gin Asp Cys Leu Gin Gin Ser Arg Lys Val Gly Asp Ser 305 310 315 320
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Lys Asp Ser Cys Lys Gly Asp Ser Gly Gly Pro His Ala Thr His Tyr 340 345 350
Arg Gly Thr Trp Tyr Leu Thr Gly lie Val Ser Trp Gly Gin Gly Cys 355 360 365
Ala Thr Val Gly His Phe Gly Val Tyr Thr Arg Val Ser Gin Tyr lie 370 375 380
Glu Trp Leu Gin Lys Leu Met Arg Ser Glu Pro Arg Pro Gly Val Leu 385 390 395 400
Leu Arg Ala Pro Phe Pro 405
<210> 135 <211> 407 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Q286R/S222A/Gla Swap FIX <400> 135
Tyr Asn Ser Gly Lys Leu Glu Glu Phe Val Gin Gly Asn Leu Glu Arg 15 10 15
Glu Cys Met Glu Glu Lys Cys Ser Phe Glu Glu Ala Arg Glu Val Phe 20 25 30
Glu Asn Thr Glu Arg Thr Thr Glu Phe Trp Lys Gin Tyr Ser Asp Gly 35 40 45
Asp Gin Cys Ala Ser Ser Pro Cys Gin Asn Gly Gly Ser Cys Lys Asp 50 55 60
Gin Leu Gin Ser Tyr lie Cys Phe Cys Leu Pro Ala Phe Glu Gly Arg 65 70 75 80
Asn Cys Glu Thr His Lys Asp Asp Gin Leu lie Cys Val Asn Glu Asn 85 90 95
Gly Gly Cys Glu Gin Tyr Cys Ser Asp His Thr Gly Thr Lys Arg Ser 100 105 110
Cys Arg Cys His Glu Gly Tyr Ser Leu Leu Ala Asp Gly Val Ser Cys 115 120 125
Thr Pro Thr Val Glu Tyr Pro Cys Gly Lys lie Pro lie Leu Glu Lys 130 135 140
Arg Asn Ala Ser Lys Pro Gin Gly Arg lie Val Gly Gly Lys Val Cys 145 150 155 160
Pro Lys Gly Glu Cys Pro Trp Gin Val Leu Leu Leu Val Asn Gly Ala 165 170 175
Gin Leu Cys Gly Gly Thr Leu lie Asn Thr lie Trp Val Val Ser Ala 180 185 190
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Leu Arg Ala Pro Phe Pro 405
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Gin Cys Ala Ser Ser Pro Cys Gin Asn Gly Gly Ser Cys Lys Asp Gin 50 55 60
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Leu Cys Gly Gly Thr Leu lie Asn Thr lie Trp Val Val Ser Ala Ala 180 185 190
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Gly Glu His Asp Leu Ser Glu His Asp Gly Asp Glu Gin Ser Arg Arg 210 215 220
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His Asp lie Ala Leu Leu Arg Leu His Gin Pro Val Val Leu Thr Asp 245 250 255
His Val Val Pro Leu Cys Leu Pro Glu Arg Thr Phe Ser Glu Arg Thr 260 265 270
Leu Ala Phe Val Arg Phe Ser Leu Val Ser Gly Trp Gly Arg Leu Leu 275 280 285
Asp Arg Gly Ala Thr Ala Leu Glu Leu Met Val Leu Asn Val Pro Arg 290 295 300
Leu Met Thr Gin Asp Cys Leu Gin Gin Ser Arg Lys Val Gly Asp Ser 305 310 315 320
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Leu Arg Ala Pro Phe Pro 405
<210> 145 <211> 406 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> S222A/Q286R/Q366V <400> 145
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Leu Ala Phe Val Arg Phe Ser Leu Val Ser Gly Trp Gly Arg Leu Leu 275 280 285
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Leu Arg Ala Pro Phe Pro 405
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<223> Q286R/Q366D <4 Ο Ο > 152
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Leu Arg Ala Pro Phe Pro 405
<210> 154 <211> 406 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Q286R/M298Q/Q366D <400> 154
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Asp Ala Glu Arg Thr Lys Leu Phe Trp He Ser Tyr Ser Asp Gly Asp 35 40 45
Gin Cys Ala Ser Ser Pro Cys Gin Asn Gly Gly Ser Cys Lys Asp Gin 50 55 60
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Cys Glu Thr His Lys Asp Asp Gin Leu He Cys Val Asn Glu Asn Gly 85 90 95
Gly Cys Glu Gin Tyr Cys Ser Asp His Thr Gly Thr Lys Arg Ser Cys 100 105 110
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Leu Cys Gly Gly Thr Leu He Asn Thr He Trp Val Val Ser Ala Ala 180 185 190
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Gly Glu His Asp Leu Ser Glu His Asp Gly Asp Glu Gin Ser Arg Arg 210 215 220
Val Ala Gin Val He He Pro Ser Thr Tyr Val Pro Gly Thr Thr Asn 225 230 235 240
His Asp He Ala Leu Leu Arg Leu His Gin Pro Val Val Leu Thr Asp 245 250 255
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Leu Ala Phe Val Arg Phe Ser Leu Val Ser Gly Trp Gly Arg Leu Leu 275 280 285
Asp Arg Gly Ala Thr Ala Leu Glu Leu Gin Val Leu Asn Val Pro Arg 290 295 300
Leu Met Thr Gin Asp Cys Leu Gin Gin Ser Arg Lys Val Gly Asp Ser 305 310 315 320
Pro Asn lie Thr Glu Tyr Met Phe Cys Ala Gly Tyr Ser Asp Gly Ser 325 330 335
Lys Asp Ser Cys Lys Gly Asp Ser Gly Gly Pro His Ala Thr His Tyr 340 345 350
Arg Gly Thr Trp Tyr Leu Thr Gly lie Val Ser Trp Gly Asp Gly Cys 355 360 365
Ala Thr Val Gly His Phe Gly Val Tyr Thr Arg Val Ser Gin Tyr lie 370 375 380
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Leu Arg Ala Pro Phe Pro 405
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Leu Cys Gly Gly Thr Leu lie Asn Thr lie Trp Val Val Ser Ala Ala 180 185 190
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Leu Arg Ala Pro Phe Pro 405
<210> 164 <211> 406 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> T239H <400> 164
Ala Asn Ala Phe Leu Glu Glu Leu Arg Pro Gly Ser Leu Glu Arg Glu 15 10 15
Cys Lys Glu Glu Gin Cys Ser Phe Glu Glu Ala Arg Glu lie Phe Lys 20 25 30
Asp Ala Glu Arg Thr Lys Leu Phe Trp lie Ser Tyr Ser Asp Gly Asp 35 40 45
Gin Cys Ala Ser Ser Pro Cys Gin Asn Gly Gly Ser Cys Lys Asp Gin 50 55 60
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Gly Cys Glu Gin Tyr Cys Ser Asp His Thr Gly Thr Lys Arg Ser Cys 100 105 110
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Pro Thr Val Glu Tyr Pro Cys Gly Lys lie Pro lie Leu Glu Lys Arg 130 135 140
Asn Ala Ser Lys Pro Gin Gly Arg lie Val Gly Gly Lys Val Cys Pro 145 150 155 160
Lys Gly Glu Cys Pro Trp Gin Val Leu Leu Leu Val Asn Gly Ala Gin 165 170 175
Leu Cys Gly Gly Thr Leu lie Asn Thr lie Trp Val Val Ser Ala Ala 180 185 190
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Gly Glu His Asp Leu Ser Glu His Asp Gly Asp Glu Gin Ser Arg Arg 210 215 220
Val Ala Gin Val lie lie Pro Ser Thr Tyr Val Pro Gly Thr His Asn 225 230 235 240
His Asp lie Ala Leu Leu Arg Leu His Gin Pro Val Val Leu Thr Asp 245 250 255
His Val Val Pro Leu Cys Leu Pro Glu Arg Thr Phe Ser Glu Arg Thr 260 265 270
Leu Ala Phe Val Arg Phe Ser Leu Val Ser Gly Trp Gly Gin Leu Leu 275 280 285
Asp Arg Gly Ala Thr Ala Leu Glu Leu Met Val Leu Asn Val Pro Arg 290 295 300
Leu Met Thr Gin Asp Cys Leu Gin Gin Ser Arg Lys Val Gly Asp Ser 305 310 315 320
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Lys Asp Ser Cys Lys Gly Asp Ser Gly Gly Pro His Ala Thr His Tyr 340 345 350
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Glu Trp Leu Gin Lys Leu Met Arg Ser Glu Pro Arg Pro Gly Val Leu 385 390 395 400
Leu Arg Ala Pro Phe Pro 405
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Cys Lys Glu Glu Gin Cys Ser Phe Glu Glu Ala Arg Glu lie Phe Lys 20 25 30
Asp Ala Glu Arg Thr Lys Leu Phe Trp lie Ser Tyr Ser Asp Gly Asp 35 40 45
Gin Cys Ala Ser Ser Pro Cys Gin Asn Gly Gly Ser Cys Lys Asp Gin 50 55 60
Leu Gin Ser Tyr lie Cys Phe Cys Leu Pro Ala Phe Glu Gly Arg Asn 65 70 75 80
Cys Glu Thr His Lys Asp Asp Gin Leu lie Cys Val Asn Glu Asn Gly 85 90 95
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Lys Gly Glu Cys Pro Trp Gin Val Leu Leu Leu Val Asn Gly Ala Gin 165 170 175
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Val Ala Gin Val lie lie Pro Ser Thr Tyr Val Pro Gly Thr lie Asn 225 230 235 240
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Leu Ala Phe Val Arg Phe Ser Leu Val Ser Gly Trp Gly Gin Leu Leu 275 280 285
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Leu Arg Ala Pro Phe Pro 405
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Asp Ala Glu Arg Thr Lys Leu Phe Trp lie Ser Tyr Ser Asp Gly Asp 35 40 45
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Leu Cys Gly Gly Thr Leu lie Asn Thr lie Trp Val Val Ser Ala Ala 180 185 190
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Gly Glu His Asp Leu Ser Glu His Asp Gly Asp Glu Gin Ser Arg Arg 210 215 220
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His Val Val Pro Leu Cys Leu Pro Glu Arg Thr Phe Ser Glu Arg Thr 260 265 270
Leu Ala Phe Val Arg Phe Ser Leu Val Ser Gly Trp Gly Gin Leu Leu 275 280 285
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Leu Met Thr Gin Asp Cys Leu Gin Gin Ser Arg Lys Val Gly Asp Ser 305 310 315 320
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Leu Arg Ala Pro Phe Pro 405
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<223> Q366E <4 Ο Ο > 171
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Cys Lys Glu Glu Gin Cys Ser Phe Glu Glu Ala Arg Glu lie Phe Lys 20 25 30
Asp Ala Glu Arg Thr Lys Leu Phe Trp lie Ser Tyr Ser Asp Gly Asp 35 40 45
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Gly Glu His Asp Leu Ser Glu His Asp Gly Asp Glu Gin Ser Arg Arg 210 215 220
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Cys Lys Glu Glu Gin Cys Ser Phe Glu Glu Ala Arg Glu lie Phe Lys 20 25 30
Asp Ala Glu Arg Thr Lys Leu Phe Trp He Ser Tyr Ser Asp Gly Asp 35 40 45
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Leu Arg Ala Pro Phe Pro 405
<210> 174 <211> 406 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Q366S <400> 174
Ala Asn Ala Phe Leu Glu Glu Leu Arg Pro Gly Ser Leu Glu Arg Glu 15 10 15
Cys Lys Glu Glu Gin Cys Ser Phe Glu Glu Ala Arg Glu lie Phe Lys 20 25 30
Asp Ala Glu Arg Thr Lys Leu Phe Trp lie Ser Tyr Ser Asp Gly Asp 35 40 45
Gin Cys Ala Ser Ser Pro Cys Gin Asn Gly Gly Ser Cys Lys Asp Gin 50 55 60
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Lys Gly Glu Cys Pro Trp Gin Val Leu Leu Leu Val Asn Gly Ala Gin 165 170 175
Leu Cys Gly Gly Thr Leu lie Asn Thr lie Trp Val Val Ser Ala Ala 180 185 190
His Cys Phe Asp Lys lie Lys Asn Trp Arg Asn Leu lie Ala Val Leu 195 200 205
Gly Glu His Asp Leu Ser Glu His Asp Gly Asp Glu Gin Ser Arg Arg 210 215 220
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His Asp lie Ala Leu Leu Arg Leu His Gin Pro Val Val Leu Thr Asp 245 250 255
His Val Val Pro Leu Cys Leu Pro Glu Arg Thr Phe Ser Glu Arg Thr 260 265 270
Leu Ala Phe Val Arg Phe Ser Leu Val Ser Gly Trp Gly Gin Leu Leu 275 280 285
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Lys Asp Ser Cys Lys Gly Asp Ser Gly Gly Pro His Ala Thr His Tyr 340 345 350
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<221> UNSURE <222> (0)...(0)
<223> Q366V <400> 175
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Leu Arg Ala Pro Phe Pro 405
<210> 183 <211> 406 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> H373A <400> 183
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Leu Arg Ala Pro Phe Pro 405
<210> 184 <211> 406 <212> PRT <213> Homo sapiens <220>
<223> Q366D/H373E <4 Ο Ο > 184
Ala Asn Ala Phe Leu Glu Glu Leu Arg Pro Gly Ser Leu Glu Arg Glu 15 10 15
Cys Lys Glu Glu Gin Cys Ser Phe Glu Glu Ala Arg Glu lie Phe Lys 20 25 30
Asp Ala Glu Arg Thr Lys Leu Phe Trp lie Ser Tyr Ser Asp Gly Asp 35 40 45
Gin Cys Ala Ser Ser Pro Cys Gin Asn Gly Gly Ser Cys Lys Asp Gin 50 55 60
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Cys Glu Thr His Lys Asp Asp Gin Leu lie Cys Val Asn Glu Asn Gly 85 90 95
Gly Cys Glu Gin Tyr Cys Ser Asp His Thr Gly Thr Lys Arg Ser Cys 100 105 110
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Asn Ala Ser Lys Pro Gin Gly Arg lie Val Gly Gly Lys Val Cys Pro 145 150 155 160
Lys Gly Glu Cys Pro Trp Gin Val Leu Leu Leu Val Asn Gly Ala Gin 165 170 175
Leu Cys Gly Gly Thr Leu lie Asn Thr lie Trp Val Val Ser Ala Ala 180 185 190
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Gly Glu His Asp Leu Ser Glu His Asp Gly Asp Glu Gin Ser Arg Arg 210 215 220
Val Ala Gin Val lie lie Pro Ser Thr Tyr Val Pro Gly Thr Thr Asn 225 230 235 240
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Leu Ala Phe Val Arg Phe Ser Leu Val Ser Gly Trp Gly Gin Leu Leu 275 280 285
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Leu Met Thr Gin Asp Cys Leu Gin Gin Ser Arg Lys Val Gly Asp Ser 305 310 315 320
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Lys Asp Ser Cys Lys Gly Asp Ser Gly Gly Pro His Ala Thr His Tyr 340 345 350
Arg Gly Thr Trp Tyr Leu Thr Gly lie Val Ser Trp Gly Asp Gly Cys 355 360 365
Ala Thr Val Gly Glu Phe Gly Val Tyr Thr Arg Val Ser Gin Tyr lie 370 375 380
Glu Trp Leu Gin Lys Leu Met Arg Ser Glu Pro Arg Pro Gly Val Leu 385 390 395 400
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Leu Ala Phe Val Arg Phe Ser Leu Val Ser Gly Trp Gly Gin Leu Leu 275 280 285
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Leu Ala Phe Val Arg Phe Ser Leu Val Ser Gly Trp Gly Gin Leu Leu 275 280 285
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Leu Arg Ala Pro Phe Pro 405
<210> 190 <211> 406 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> K161V <400> 190
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Leu Ala Phe Val Arg Phe Ser Leu Val Ser Gly Trp Gly Gin Leu Leu 275 280 285
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His Asp lie Ala Leu Leu Arg Leu His Gin Pro Val Val Leu Thr Asp 245 250 255
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Leu Ala Phe Val Arg Phe Ser Leu Val Ser Gly Trp Gly Gin Leu Leu 275 280 285
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Lys Asp Ser Cys Lys Gly Asp Ser Gly Gly Pro His Ala Thr His Tyr 340 345 350
Arg Gly Thr Trp Tyr Leu Thr Gly lie Val Ser Trp Gly Gin Gly Cys 355 360 365
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Leu Arg Ala Pro Phe Pro 405
<210> 193 <211> 406 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> H216K <400> 193
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Cys Lys Glu Glu Gin Cys Ser Phe Glu Glu Ala Arg Glu lie Phe Lys 20 25 30
Asp Ala Glu Arg Thr Lys Leu Phe Trp lie Ser Tyr Ser Asp Gly Asp 35 40 45
Gin Cys Ala Ser Ser Pro Cys Gin Asn Gly Gly Ser Cys Lys Asp Gin 50 55 60
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Cys Glu Thr His Lys Asp Asp Gin Leu lie Cys Val Asn Glu Asn Gly 85 90 95
Gly Cys Glu Gin Tyr Cys Ser Asp His Thr Gly Thr Lys Arg Ser Cys 100 105 110
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Lys Gly Glu Cys Pro Trp Gin Val Leu Leu Leu Val Asn Gly Ala Gin 165 170 175
Leu Cys Gly Gly Thr Leu lie Asn Thr lie Trp Val Val Ser Ala Ala 180 185 190
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Gly Glu His Asp Leu Ser Glu Lys Asp Gly Asp Glu Gin Ser Arg Arg 210 215 220
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His Asp lie Ala Leu Leu Arg Leu His Gin Pro Val Val Leu Thr Asp 245 250 255
His Val Val Pro Leu Cys Leu Pro Glu Arg Thr Phe Ser Glu Arg Thr 260 265 270
Leu Ala Phe Val Arg Phe Ser Leu Val Ser Gly Trp Gly Gin Leu Leu 275 280 285
Asp Arg Gly Ala Thr Ala Leu Glu Leu Met Val Leu Asn Val Pro Arg 290 295 300
Leu Met Thr Gin Asp Cys Leu Gin Gin Ser Arg Lys Val Gly Asp Ser 305 310 315 320
Pro Asn lie Thr Glu Tyr Met Phe Cys Ala Gly Tyr Ser Asp Gly Ser 325 330 335
Lys Asp Ser Cys Lys Gly Asp Ser Gly Gly Pro His Ala Thr His Tyr 340 345 350
Arg Gly Thr Trp Tyr Leu Thr Gly lie Val Ser Trp Gly Gin Gly Cys 355 360 365
Ala Thr Val Gly His Phe Gly Val Tyr Thr Arg Val Ser Gin Tyr lie 370 375 380
Glu Trp Leu Gin Lys Leu Met Arg Ser Glu Pro Arg Pro Gly Val Leu 385 390 395 400
Leu Arg Ala Pro Phe Pro 405
<210> 194 <211> 406 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> H216R <400> 194
Ala Asn Ala Phe Leu Glu Glu Leu Arg Pro Gly Ser Leu Glu Arg Glu 15 10 15
Cys Lys Glu Glu Gin Cys Ser Phe Glu Glu Ala Arg Glu lie Phe Lys 20 25 30
Asp Ala Glu Arg Thr Lys Leu Phe Trp lie Ser Tyr Ser Asp Gly Asp 35 40 45
Gin Cys Ala Ser Ser Pro Cys Gin Asn Gly Gly Ser Cys Lys Asp Gin 50 55 60
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Cys Glu Thr His Lys Asp Asp Gin Leu lie Cys Val Asn Glu Asn Gly 85 90 95
Gly Cys Glu Gin Tyr Cys Ser Asp His Thr Gly Thr Lys Arg Ser Cys 100 105 110
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Pro Thr Val Glu Tyr Pro Cys Gly Lys lie Pro lie Leu Glu Lys Arg 130 135 140
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Lys Gly Glu Cys Pro Trp Gin Val Leu Leu Leu Val Asn Gly Ala Gin 165 170 175
Leu Cys Gly Gly Thr Leu lie Asn Thr lie Trp Val Val Ser Ala Ala 180 185 190
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Val Ala Gin Val lie lie Pro Ser Thr Tyr Val Pro Gly Thr Thr Asn 225 230 235 240
His Asp lie Ala Leu Leu Arg Leu His Gin Pro Val Val Leu Thr Asp 245 250 255
His Val Val Pro Leu Cys Leu Pro Glu Arg Thr Phe Ser Glu Arg Thr 260 265 270
Leu Ala Phe Val Arg Phe Ser Leu Val Ser Gly Trp Gly Gin Leu Leu 275 280 285
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Leu Met Thr Gin Asp Cys Leu Gin Gin Ser Arg Lys Val Gly Asp Ser 305 310 315 320
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Leu Ala Phe Val Arg Phe Ser Leu Val Ser Gly Trp Gly Gin Leu Leu 275 280 285
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Leu Met Thr Gin Asp Cys Leu Gin Gin Ser Arg Lys Val Gly Asp Ser 305 310 315 320
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Leu Ala Phe Val Arg Phe Ser Leu Val Ser Gly Trp Gly Gin Leu Leu 275 280 285
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Leu Met Thr Gin Asp Cys Leu Gin Gin Ser Arg Lys Val Gly Asp Ser 305 310 315 320
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Leu Cys Gly Gly Thr Leu lie Asn Thr lie Trp Val Val Ser Ala Ala 180 185 190
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Gly Glu His Asp Leu Ser Glu His Asp Gly Asp Glu Gin Glu Arg Arg 210 215 220
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Leu Met Thr Gin Asp Cys Leu Gin Gin Ser Arg Lys Val Gly Asp Ser 305 310 315 320
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Ala Thr Val Gly His Phe Gly Val Tyr Thr Arg Val Ser Gin Tyr lie 370 375 380
Glu Trp Leu Gin Lys Leu Met Arg Ser Glu Pro Arg Pro Gly Val Leu 385 390 395 400
Leu Arg Ala Pro Phe Pro 405
<210> 200 <211> 406 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> S222D <400> 200
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Leu Cys Gly Gly Thr Leu lie Asn Thr lie Trp Val Val Ser Ala Ala 180 185 190
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Leu Ala Phe Val Arg Phe Ser Leu Val Ser Gly Trp Gly Gin Leu Leu 275 280 285
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Leu Cys Gly Gly Thr Leu lie Asn Thr lie Trp Val Val Ser Ala Ala 180 185 190
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Asp Ala Glu Arg Thr Lys Leu Phe Trp lie Ser Tyr Ser Asp Gly Asp 35 40 45
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Gly Glu His Asp Leu Ser Glu His Asp Gly Asp Glu Gin Ser Arg Arg 210 215 220
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His Asp lie Ala Leu Leu Arg Leu His Gin Pro Val Val Leu Thr Asp 245 250 255
Ser Val Val Pro Leu Cys Leu Pro Glu Arg Thr Phe Ser Glu Arg Thr 260 265 270
Leu Ala Phe Val Arg Phe Ser Leu Val Ser Gly Trp Gly Gin Leu Leu 275 280 285
Asp Arg Gly Ala Thr Ala Leu Glu Leu Met Val Leu Asn Val Pro Arg 290 295 300
Leu Met Thr Gin Asp Cys Leu Gin Gin Ser Arg Lys Val Gly Asp Ser 305 310 315 320
Pro Asn lie Thr Glu Tyr Met Phe Cys Ala Gly Tyr Ser Asp Gly Ser 325 330 335
Lys Asp Ser Cys Lys Gly Asp Ser Gly Gly Pro His Ala Thr His Tyr 340 345 350
Arg Gly Thr Trp Tyr Leu Thr Gly lie Val Ser Trp Gly Gin Gly Cys 355 360 365
Ala Thr Val Gly His Phe Gly Val Tyr Thr Arg Val Ser Gin Tyr lie 370 375 380
Glu Trp Leu Gin Lys Leu Met Arg Ser Glu Pro Arg Pro Gly Val Leu 385 390 395 400
Leu Arg Ala Pro Phe Pro 405
<210> 203 <211> 406 <212> PRT <213> Homo sapiens <220>
<223> S222K/H257A <400> 203
Ala Asn Ala Phe Leu Glu Glu Leu Arg Pro Gly Ser Leu Glu Arg Glu 15 10 15
Cys Lys Glu Glu Gin Cys Ser Phe Glu Glu Ala Arg Glu lie Phe Lys 20 25 30
Asp Ala Glu Arg Thr Lys Leu Phe Trp lie Ser Tyr Ser Asp Gly Asp 35 40 45
Gin Cys Ala Ser Ser Pro Cys Gin Asn Gly Gly Ser Cys Lys Asp Gin 50 55 60
Leu Gin Ser Tyr lie Cys Phe Cys Leu Pro Ala Phe Glu Gly Arg Asn 65 70 75 80
Cys Glu Thr His Lys Asp Asp Gin Leu lie Cys Val Asn Glu Asn Gly 85 90 95
Gly Cys Glu Gin Tyr Cys Ser Asp His Thr Gly Thr Lys Arg Ser Cys 100 105 110
Arg Cys His Glu Gly Tyr Ser Leu Leu Ala Asp Gly Val Ser Cys Thr 115 120 125
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Lys Gly Glu Cys Pro Trp Gin Val Leu Leu Leu Val Asn Gly Ala Gin 165 170 175
Leu Cys Gly Gly Thr Leu lie Asn Thr lie Trp Val Val Ser Ala Ala 180 185 190
His Cys Phe Asp Lys lie Lys Asn Trp Arg Asn Leu lie Ala Val Leu 195 200 205
Gly Glu His Asp Leu Ser Glu His Asp Gly Asp Glu Gin Lys Arg Arg 210 215 220
Val Ala Gin Val lie lie Pro Ser Thr Tyr Val Pro Gly Thr Thr Asn 225 230 235 240
His Asp lie Ala Leu Leu Arg Leu His Gin Pro Val Val Leu Thr Asp 245 250 255
Ala Val Val Pro Leu Cys Leu Pro Glu Arg Thr Phe Ser Glu Arg Thr 260 265 270
Leu Ala Phe Val Arg Phe Ser Leu Val Ser Gly Trp Gly Gin Leu Leu 275 280 285
Asp Arg Gly Ala Thr Ala Leu Glu Leu Met Val Leu Asn Val Pro Arg 290 295 300
Leu Met Thr Gin Asp Cys Leu Gin Gin Ser Arg Lys Val Gly Asp Ser 305 310 315 320
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Lys Asp Ser Cys Lys Gly Asp Ser Gly Gly Pro His Ala Thr His Tyr 340 345 350
Arg Gly Thr Trp Tyr Leu Thr Gly lie Val Ser Trp Gly Gin Gly Cys 355 360 365
Ala Thr Val Gly His Phe Gly Val Tyr Thr Arg Val Ser Gin Tyr lie 370 375 380
Glu Trp Leu Gin Lys Leu Met Arg Ser Glu Pro Arg Pro Gly Val Leu 385 390 395 400
Leu Arg Ala Pro Phe Pro 405
<210> 204 <211> 406 <212> PRT <213> Homo sapiens <220>
<223> H216A/H257A <4 Ο Ο > 204
Ala Asn Ala Phe Leu Glu Glu Leu Arg Pro Gly Ser Leu Glu Arg Glu 15 10 15
Cys Lys Glu Glu Gin Cys Ser Phe Glu Glu Ala Arg Glu lie Phe Lys 20 25 30
Asp Ala Glu Arg Thr Lys Leu Phe Trp lie Ser Tyr Ser Asp Gly Asp 35 40 45
Gin Cys Ala Ser Ser Pro Cys Gin Asn Gly Gly Ser Cys Lys Asp Gin 50 55 60
Leu Gin Ser Tyr lie Cys Phe Cys Leu Pro Ala Phe Glu Gly Arg Asn 65 70 75 80
Cys Glu Thr His Lys Asp Asp Gin Leu lie Cys Val Asn Glu Asn Gly 85 90 95
Gly Cys Glu Gin Tyr Cys Ser Asp His Thr Gly Thr Lys Arg Ser Cys 100 105 110
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Pro Thr Val Glu Tyr Pro Cys Gly Lys lie Pro lie Leu Glu Lys Arg 130 135 140
Asn Ala Ser Lys Pro Gin Gly Arg lie Val Gly Gly Lys Val Cys Pro 145 150 155 160
Lys Gly Glu Cys Pro Trp Gin Val Leu Leu Leu Val Asn Gly Ala Gin 165 170 175
Leu Cys Gly Gly Thr Leu lie Asn Thr lie Trp Val Val Ser Ala Ala 180 185 190
His Cys Phe Asp Lys lie Lys Asn Trp Arg Asn Leu lie Ala Val Leu 195 200 205
Gly Glu His Asp Leu Ser Glu Ala Asp Gly Asp Glu Gin Ser Arg Arg 210 215 220
Val Ala Gin Val lie lie Pro Ser Thr Tyr Val Pro Gly Thr Thr Asn 225 230 235 240
His Asp lie Ala Leu Leu Arg Leu His Gin Pro Val Val Leu Thr Asp 245 250 255
Ala Val Val Pro Leu Cys Leu Pro Glu Arg Thr Phe Ser Glu Arg Thr 260 265 270
Leu Ala Phe Val Arg Phe Ser Leu Val Ser Gly Trp Gly Gin Leu Leu 275 280 285
Asp Arg Gly Ala Thr Ala Leu Glu Leu Met Val Leu Asn Val Pro Arg 290 295 300
Leu Met Thr Gin Asp Cys Leu Gin Gin Ser Arg Lys Val Gly Asp Ser 305 310 315 320
Pro Asn lie Thr Glu Tyr Met Phe Cys Ala Gly Tyr Ser Asp Gly Ser 325 330 335
Lys Asp Ser Cys Lys Gly Asp Ser Gly Gly Pro His Ala Thr His Tyr 340 345 350
Arg Gly Thr Trp Tyr Leu Thr Gly lie Val Ser Trp Gly Gin Gly Cys 355 360 365
Ala Thr Val Gly His Phe Gly Val Tyr Thr Arg Val Ser Gin Tyr lie 370 375 380
Glu Trp Leu Gin Lys Leu Met Arg Ser Glu Pro Arg Pro Gly Val Leu 385 390 395 400
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<210> 205 <211> 406 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> H216A/S222A <400> 205
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Cys Lys Glu Glu Gin Cys Ser Phe Glu Glu Ala Arg Glu lie Phe Lys 20 25 30
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Asn Ala Ser Lys Pro Gin Gly Arg lie Val Gly Gly Lys Val Cys Pro 145 150 155 160
Lys Gly Glu Cys Pro Trp Gin Val Leu Leu Leu Val Asn Gly Ala Gin 165 170 175
Leu Cys Gly Gly Thr Leu lie Asn Thr lie Trp Val Val Ser Ala Ala 180 185 190
His Cys Phe Asp Lys lie Lys Asn Trp Arg Asn Leu lie Ala Val Leu 195 200 205
Gly Glu His Asp Leu Ser Glu Ala Asp Gly Asp Glu Gin Ala Arg Arg 210 215 220
Val Ala Gin Val lie lie Pro Ser Thr Tyr Val Pro Gly Thr Thr Asn 225 230 235 240
His Asp lie Ala Leu Leu Arg Leu His Gin Pro Val Val Leu Thr Asp 245 250 255
His Val Val Pro Leu Cys Leu Pro Glu Arg Thr Phe Ser Glu Arg Thr 260 265 270
Leu Ala Phe Val Arg Phe Ser Leu Val Ser Gly Trp Gly Gin Leu Leu 275 280 285
Asp Arg Gly Ala Thr Ala Leu Glu Leu Met Val Leu Asn Val Pro Arg 290 295 300
Leu Met Thr Gin Asp Cys Leu Gin Gin Ser Arg Lys Val Gly Asp Ser 305 310 315 320
Pro Asn lie Thr Glu Tyr Met Phe Cys Ala Gly Tyr Ser Asp Gly Ser 325 330 335
Lys Asp Ser Cys Lys Gly Asp Ser Gly Gly Pro His Ala Thr His Tyr 340 345 350
Arg Gly Thr Trp Tyr Leu Thr Gly lie Val Ser Trp Gly Gin Gly Cys 355 360 365
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Cys Lys Glu Glu Gin Cys Ser Phe Glu Glu Ala Arg Glu lie Phe Lys 20 25 30
Asp Ala Glu Arg Thr Lys Leu Phe Trp He Ser Tyr Ser Asp Gly Asp 35 40 45
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Leu Cys Gly Gly Thr Leu He Asn Thr He Trp Val Val Ser Ala Ala 180 185 190
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Leu Ala Phe Val Arg Phe Ser Leu Val Ser Gly Trp Gly Gin Leu Leu 275 280 285
Asp Arg Gly Ala Thr Ala Leu Glu Leu Met Val Leu Asn Val Pro Arg 290 295 300
Leu Met Thr Gin Asp Cys Leu Gin Gin Ser Arg Lys Val Gly Asp Ser 305 310 315 320
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Cys Lys Glu Glu Gin Cys Ser Phe Glu Glu Ala Arg Glu lie Phe Lys 20 25 30
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Asn Ala Ser Lys Pro Gin Gly Arg lie Val Gly Gly Lys Val Cys Pro 145 150 155 160
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Leu Cys Gly Gly Thr Leu lie Asn Thr lie Trp Val Val Ser Ala Ala 180 185 190
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Gly Glu His Asp Leu Ser Glu His Asp Gly Asp Glu Gin Ser Arg Arg 210 215 220
Vai Ala Gin Val lie lie Pro Ser Thr Tyr Val Pro Gly Thr Thr Asn 225 230 235 240
His Asp lie Ala Leu Leu Arg Leu His Gin Pro Val Val Leu Thr Asp 245 250 255
His Val Val Pro Leu Cys Leu Pro Glu Arg Thr Phe Ser Glu Arg Thr 260 265 270
Leu Ala Phe Val Arg Phe Ser Leu Val Ser Gly Trp Gly Gin Leu Leu 275 280 285
Asp Arg Gly Ala Thr Ala Leu Glu Leu Met Val Leu Asn Val Pro Arg 290 295 300
Leu Met Thr Gin Asp Cys Leu Gin Gin Ser Arg Lys Val Gly Asp Ser 305 310 315 320
Pro Asn lie Thr Glu Tyr Met Phe Cys Ala Gly Tyr Ser Asp Gly Ser 325 330 335
Lys Asp Ser Cys Lys Gly Asp Ser Gly Gly Pro His Ala Thr His Tyr 340 345 350
Arg Gly Thr Trp Tyr Leu Thr Gly lie Val Ser Trp Gly Gin Gly Cys 355 360 365
Ala Thr Val Gly His Phe Gly Val Tyr Thr Arg Val Ser Gin Tyr lie 370 375 380
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Leu Arg Ala Pro Phe Pro 405
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Asp Ala Glu Arg Thr Lys Leu Phe Trp lie Ser Tyr Ser Asp Gly Asp 35 40 45
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Ala Asn Ala Phe Leu Glu Glu Leu Arg Pro Gly Ser Leu Glu Arg Glu 15 10 15
Cys Lys Glu Glu Gin Cys Ser Phe Glu Glu Ala Arg Glu lie Phe Lys 20 25 30
Asp Ala Glu Arg Thr Lys Leu Phe Trp lie Ser Tyr Ser Asp Gly Asp 35 40 45
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Cys Glu Thr His Lys Asp Asp Gin Leu lie Cys Val Asn Glu Asn Gly 85 90 95
Gly Cys Glu Gin Tyr Cys Ser Asp His Thr Gly Thr Lys Arg Ser Cys 100 105 110
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Pro Thr Val Glu Tyr Pro Cys Gly Lys lie Pro lie Leu Glu Lys Arg 130 135 140
Asn Ala Ser Lys Pro Gin Gly Arg lie Val Gly Gly Lys Val Cys Pro 145 150 155 160
Lys Gly Glu Cys Pro Trp Gin Val Leu Leu Leu Val Asn Gly Ala Gin 165 170 175
Leu Cys Gly Gly Thr Leu lie Asn Thr lie Trp Val Val Ser Ala Ala 180 185 190
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Gly Glu His Asp Leu Ser Glu His Asp Gly Asp Glu Gin Ser Arg Arg 210 215 220
Val Ala Gin Val lie lie Pro Ser Thr Tyr Val Pro Gly Thr Thr Asn 225 230 235 240
His Asp lie Ala Leu Leu Arg Leu His Gin Pro Val Val Leu Thr Asp 245 250 255
His Val Val Pro Leu Cys Leu Pro Glu Arg Thr Phe Ser Glu Arg Thr 260 265 270
Leu Ala Phe Val Arg Phe Ser Leu Val Ser Gly Trp Gly Gin Leu Leu 275 280 285
Asp Arg Gly Ala Thr Ala Leu Glu Leu Met Val Leu Asn Val Pro Arg 290 295 300
Leu Met Thr Gin Asp Cys Leu Gin Gin Ser Arg Lys Val Gly Asp Ser 305 310 315 320
Pro Asn lie Thr Glu Tyr Met Phe Cys Ala Gly Tyr Ser Asp Gly Ser 325 330 335
Lys Asp Ser Cys Lys Gly Asp Ser Gly Gly Pro His Ala Thr His Tyr 340 345 350
Arg Gly Thr Trp Tyr Leu Thr Gly lie Val Ser Trp Gly Gin Gly Cys 355 360 365
Ala Thr Val Gly His Phe Gly Val Tyr Thr Arg Val Ser Gin Tyr lie 370 375 380
Glu Trp Leu Gin Lys Leu Met Arg Ser Glu Pro Arg Pro Gly Val Leu 385 390 395 400
Leu Arg Ala Pro Phe Pro 405
<210> 210 <211> 406 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> A292N/A294S <400> 210
Ala Asn Ala Phe Leu Glu Glu Leu Arg Pro Gly Ser Leu Glu Arg Glu 15 10 15
Cys Lys Glu Glu Gin Cys Ser Phe Glu Glu Ala Arg Glu lie Phe Lys 20 25 30
Asp Ala Glu Arg Thr Lys Leu Phe Trp lie Ser Tyr Ser Asp Gly Asp 35 40 45
Gin Cys Ala Ser Ser Pro Cys Gin Asn Gly Gly Ser Cys Lys Asp Gin 50 55 60
Leu Gin Ser Tyr lie Cys Phe Cys Leu Pro Ala Phe Glu Gly Arg Asn 65 70 75 80
Cys Glu Thr His Lys Asp Asp Gin Leu lie Cys Val Asn Glu Asn Gly 85 90 95
Gly Cys Glu Gin Tyr Cys Ser Asp His Thr Gly Thr Lys Arg Ser Cys 100 105 110
Arg Cys His Glu Gly Tyr Ser Leu Leu Ala Asp Gly Val Ser Cys Thr 115 120 125
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Asn Ala Ser Lys Pro Gin Gly Arg lie Val Gly Gly Lys Val Cys Pro 145 150 155 160
Lys Gly Glu Cys Pro Trp Gin Val Leu Leu Leu Val Asn Gly Ala Gin 165 170 175
Leu Cys Gly Gly Thr Leu lie Asn Thr lie Trp Val Val Ser Ala Ala 180 185 190
His Cys Phe Asp Lys lie Lys Asn Trp Arg Asn Leu lie Ala Val Leu 195 200 205
Gly Glu His Asp Leu Ser Glu His Asp Gly Asp Glu Gin Ser Arg Arg 210 215 220
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His Asp lie Ala Leu Leu Arg Leu His Gin Pro Val Val Leu Thr Asp 245 250 255
His Val Val Pro Leu Cys Leu Pro Glu Arg Thr Phe Ser Glu Arg Thr 260 265 270
Leu Ala Phe Val Arg Phe Ser Leu Val Ser Gly Trp Gly Gin Leu Leu 275 280 285
Asp Arg Gly Asn Thr Ser Leu Glu Leu Met Val Leu Asn Val Pro Arg 290 295 300
Leu Met Thr Gin Asp Cys Leu Gin Gin Ser Arg Lys Val Gly Asp Ser 305 310 315 320
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Lys Asp Ser Cys Lys Gly Asp Ser Gly Gly Pro His Ala Thr His Tyr 340 345 350
Arg Gly Thr Trp Tyr Leu Thr Gly lie Val Ser Trp Gly Gin Gly Cys 355 360 365
Ala Thr Val Gly His Phe Gly Val Tyr Thr Arg Val Ser Gin Tyr lie 370 375 380
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Leu Arg Ala Pro Phe Pro 405
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Ala Asn Ala Phe Leu Glu Glu Leu Arg Pro Gly Ser Leu Glu Arg Glu 15 10 15
Cys Lys Glu Glu Gin Cys Ser Phe Glu Glu Ala Arg Glu lie Phe Lys 20 25 30
Asp Ala Glu Arg Thr Lys Leu Phe Trp lie Ser Tyr Ser Asp Gly Asp 35 40 45
Gin Cys Ala Ser Ser Pro Cys Gin Asn Gly Gly Ser Cys Lys Asp Gin 50 55 60
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Leu Ala Phe Val Arg Phe Ser Leu Val Ser Gly Trp Gly Gin Leu Leu 275 280 285
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Leu Arg Ala Pro Phe Pro 405
<210> 212 <211> 406 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> A175S <400> 212
Ala Asn Ala Phe Leu Glu Glu Leu Arg Pro Gly Ser Leu Glu Arg Glu 15 10 15
Cys Lys Glu Glu Gin Cys Ser Phe Glu Glu Ala Arg Glu lie Phe Lys 20 25 30
Asp Ala Glu Arg Thr Lys Leu Phe Trp lie Ser Tyr Ser Asp Gly Asp 35 40 45
Gin Cys Ala Ser Ser Pro Cys Gin Asn Gly Gly Ser Cys Lys Asp Gin 50 55 60
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Leu Cys Gly Gly Thr Leu lie Asn Thr lie Trp Val Val Ser Ala Ala 180 185 190
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Gly Glu His Asp Leu Ser Glu His Asp Gly Asp Glu Gin Ser Arg Arg 210 215 220
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His Asp lie Ala Leu Leu Arg Leu His Gin Pro Val Val Leu Thr Asp 245 250 255
His Val Val Pro Leu Cys Leu Pro Glu Arg Thr Phe Ser Glu Arg Thr 260 265 270
Leu Ala Phe Val Arg Phe Ser Leu Val Ser Gly Trp Gly Gin Leu Leu 275 280 285
Asp Arg Gly Ala Thr Ala Leu Glu Leu Met Val Leu Asn Val Pro Arg 290 295 300
Leu Met Thr Gin Asp Cys Leu Gin Gin Ser Arg Lys Val Gly Asp Ser 305 310 315 320
Pro Asn lie Thr Glu Tyr Met Phe Cys Ala Gly Tyr Ser Asp Gly Ser 325 330 335
Lys Asp Ser Cys Lys Gly Asp Ser Gly Gly Pro His Ala Thr His Tyr 340 345 350
Arg Gly Thr Trp Tyr Leu Thr Gly lie Val Ser Trp Gly Gin Gly Cys 355 360 365
Ala Thr Val Gly His Phe Gly Val Tyr Thr Arg Val Ser Gin Tyr lie 370 375 380
Glu Trp Leu Gin Lys Leu Met Arg Ser Glu Pro Arg Pro Gly Val Leu 385 390 395 400
Leu Arg Ala Pro Phe Pro 405
<210> 213 <211> 406 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> K109N <400> 213
Ala Asn Ala Phe Leu Glu Glu Leu Arg Pro Gly Ser Leu Glu Arg Glu 15 10 15
Cys Lys Glu Glu Gin Cys Ser Phe Glu Glu Ala Arg Glu lie Phe Lys 20 25 30
Asp Ala Glu Arg Thr Lys Leu Phe Trp lie Ser Tyr Ser Asp Gly Asp 35 40 45
Gin Cys Ala Ser Ser Pro Cys Gin Asn Gly Gly Ser Cys Lys Asp Gin 50 55 60
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Cys Glu Thr His Lys Asp Asp Gin Leu lie Cys Val Asn Glu Asn Gly 85 90 95
Gly Cys Glu Gin Tyr Cys Ser Asp His Thr Gly Thr Asn Arg Ser Cys 100 105 110
Arg Cys His Glu Gly Tyr Ser Leu Leu Ala Asp Gly Val Ser Cys Thr 115 120 125
Pro Thr Val Glu Tyr Pro Cys Gly Lys lie Pro lie Leu Glu Lys Arg 130 135 140
Asn Ala Ser Lys Pro Gin Gly Arg lie Val Gly Gly Lys Val Cys Pro 145 150 155 160
Lys Gly Glu Cys Pro Trp Gin Val Leu Leu Leu Val Asn Gly Ala Gin 165 170 175
Leu Cys Gly Gly Thr Leu lie Asn Thr lie Trp Val Val Ser Ala Ala 180 185 190
His Cys Phe Asp Lys lie Lys Asn Trp Arg Asn Leu lie Ala Val Leu 195 200 205
Gly Glu His Asp Leu Ser Glu His Asp Gly Asp Glu Gin Ser Arg Arg 210 215 220
Val Ala Gin Val lie lie Pro Ser Thr Tyr Val Pro Gly Thr Thr Asn 225 230 235 240
His Asp lie Ala Leu Leu Arg Leu His Gin Pro Val Val Leu Thr Asp 245 250 255
His Val Val Pro Leu Cys Leu Pro Glu Arg Thr Phe Ser Glu Arg Thr 260 265 270
Leu Ala Phe Val Arg Phe Ser Leu Val Ser Gly Trp Gly Gin Leu Leu 275 280 285
Asp Arg Gly Ala Thr Ala Leu Glu Leu Met Val Leu Asn Val Pro Arg 290 295 300
Leu Met Thr Gin Asp Cys Leu Gin Gin Ser Arg Lys Val Gly Asp Ser 305 310 315 320
Pro Asn lie Thr Glu Tyr Met Phe Cys Ala Gly Tyr Ser Asp Gly Ser 325 330 335
Lys Asp Ser Cys Lys Gly Asp Ser Gly Gly Pro His Ala Thr His Tyr 340 345 350
Arg Gly Thr Trp Tyr Leu Thr Gly lie Val Ser Trp Gly Gin Gly Cys 355 360 365
Ala Thr Val Gly His Phe Gly Val Tyr Thr Arg Val Ser Gin Tyr lie 370 375 380
Glu Trp Leu Gin Lys Leu Met Arg Ser Glu Pro Arg Pro Gly Val Leu 385 390 395 400
Leu Arg Ala Pro Phe Pro 405
<210> 214 <211> 406 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> A122N/G124S <400> 214
Ala Asn Ala Phe Leu Glu Glu Leu Arg Pro Gly Ser Leu Glu Arg Glu 15 10 15
Cys Lys Glu Glu Gin Cys Ser Phe Glu Glu Ala Arg Glu lie Phe Lys 20 25 30
Asp Ala Glu Arg Thr Lys Leu Phe Trp lie Ser Tyr Ser Asp Gly Asp 35 40 45
Gin Cys Ala Ser Ser Pro Cys Gin Asn Gly Gly Ser Cys Lys Asp Gin 50 55 60
Leu Gin Ser Tyr lie Cys Phe Cys Leu Pro Ala Phe Glu Gly Arg Asn 65 70 75 80
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Leu Met Thr Gin Asp Cys Leu Gin Gin Ser Arg Lys Val Gly Asp Ser 305 310 315 320
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Leu Cys Gly Gly Thr Leu He Asn Thr He Trp Val Val Ser Ala Ala 180 185 190
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Leu Arg Ala Pro Phe Pro 405
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Gin Cys Ala Ser Ser Pro Cys Gin Asn Gly Gly Ser Cys Lys Asp Gin 50 55 60
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Lys Gly Glu Cys Pro Trp Gin Val Leu Leu Leu Val Asn Gly Ala Gin 165 170 175
Leu Cys Gly Gly Thr Leu lie Asn Thr lie Trp Val Val Ser Ala Ala 180 185 190
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Gly Glu His Asp Leu Ser Glu His Asp Gly Asp Glu Gin Ser Arg Arg 210 215 220
Val Ala Gin Val lie lie Pro Ser Thr Tyr Val Pro Gly Thr Thr Asn 225 230 235 240
His Asp lie Ala Leu Leu Arg Leu His Gin Pro Val Val Leu Thr Asp 245 250 255
His Val Val Pro Leu Cys Leu Pro Glu Arg Thr Phe Ser Glu Arg Thr 260 265 270
Leu Ala Phe Val Arg Phe Ser Leu Val Ser Gly Trp Gly Gin Leu Leu 275 280 285
Asp Arg Gly Ala Thr Ala Leu Glu Leu Met Val Leu Asn Val Pro Arg 290 295 300
Leu Met Thr Gin Asp Cys Leu Gin Gin Ser Arg Lys Val Gly Asp Ser 305 310 315 320
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Lys Asp Ser Cys Lys Gly Asp Ser Gly Gly Pro His Ala Thr His Tyr 340 345 350
Arg Gly Thr Trp Tyr Leu Thr Gly lie Val Ser Trp Gly Gin Gly Cys 355 360 365
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Leu Arg Ala Pro Phe Pro 405
<210> 224 <211> 406 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> S52N/P54S/AI22N/G124S/E394N/P395A/R396S <400> 224
Ala Asn Ala Phe Leu Glu Glu Leu Arg Pro Gly Ser Leu Glu Arg Glu 15 10 15
Cys Lys Glu Glu Gin Cys Ser Phe Glu Glu Ala Arg Glu lie Phe Lys 20 25 30
Asp Ala Glu Arg Thr Lys Leu Phe Trp lie Ser Tyr Ser Asp Gly Asp 35 40 45
Gin Cys Ala Asn Ser Ser Cys Gin Asn Gly Gly Ser Cys Lys Asp Gin 50 55 60
Leu Gin Ser Tyr lie Cys Phe Cys Leu Pro Ala Phe Glu Gly Arg Asn 65 70 75 80
Cys Glu Thr His Lys Asp Asp Gin Leu lie Cys Val Asn Glu Asn Gly 85 90 95
Gly Cys Glu Gin Tyr Cys Ser Asp His Thr Gly Thr Lys Arg Ser Cys 100 105 110
Arg Cys His Glu Gly Tyr Ser Leu Leu Asn Asp Ser Val Ser Cys Thr 115 120 125
Pro Thr Val Glu Tyr Pro Cys Gly Lys lie Pro lie Leu Glu Lys Arg 130 135 140
Asn Ala Ser Lys Pro Gin Gly Arg lie Val Gly Gly Lys Val Cys Pro 145 150 155 160
Lys Gly Glu Cys Pro Trp Gin Val Leu Leu Leu Val Asn Gly Ala Gin 165 170 175
Leu Cys Gly Gly Thr Leu lie Asn Thr lie Trp Val Val Ser Ala Ala 180 185 190
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Gly Glu His Asp Leu Ser Glu His Asp Gly Asp Glu Gin Ser Arg Arg 210 215 220
Val Ala Gin Val lie lie Pro Ser Thr Tyr Val Pro Gly Thr Thr Asn 225 230 235 240
His Asp lie Ala Leu Leu Arg Leu His Gin Pro Val Val Leu Thr Asp 245 250 255
His Val Val Pro Leu Cys Leu Pro Glu Arg Thr Phe Ser Glu Arg Thr 260 265 270
Leu Ala Phe Val Arg Phe Ser Leu Val Ser Gly Trp Gly Gin Leu Leu 275 280 285
Asp Arg Gly Ala Thr Ala Leu Glu Leu Met Val Leu Asn Val Pro Arg 290 295 300
Leu Met Thr Gin Asp Cys Leu Gin Gin Ser Arg Lys Val Gly Asp Ser 305 310 315 320
Pro Asn lie Thr Glu Tyr Met Phe Cys Ala Gly Tyr Ser Asp Gly Ser 325 330 335
Lys Asp Ser Cys Lys Gly Asp Ser Gly Gly Pro His Ala Thr His Tyr 340 345 350
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Ala Thr Val Gly His Phe Gly Val Tyr Thr Arg Val Ser Gin Tyr lie 370 375 380
Glu Trp Leu Gin Lys Leu Met Arg Ser Asn Ala Ser Pro Gly Val Leu 385 390 395 400
Leu Arg Ala Pro Phe Pro 405
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Ala Asn Ala Phe Leu Glu Glu Leu Arg Pro Gly Ser Leu Glu Arg Glu 15 10 15
Cys Lys Glu Glu Gin Cys Ser Phe Glu Glu Ala Arg Glu lie Phe Lys 20 25 30
Asp Ala Glu Arg Thr Lys Leu Phe Trp lie Ser Tyr Ser Asp Gly Asp 35 40 45
Gin Cys Ala Ser Ser Pro Cys Gin Asn Gly Gly Ser Cys Lys Asp Gin 50 55 60
Leu Gin Ser Tyr lie Cys Phe Cys Leu Pro Ala Phe Glu Gly Arg Asn 65 70 75 80
Cys Glu Thr His Lys Asp Asp Gin Leu lie Cys Val Asn Glu Asn Gly 85 90 95
Gly Cys Glu Gin Tyr Cys Ser Asp His Thr Gly Thr Asn Arg Ser Cys 100 105 110
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Pro Thr Val Glu Tyr Pro Cys Gly Lys lie Pro lie Leu Glu Lys Arg 130 135 140
Asn Ala Ser Lys Pro Gin Gly Arg lie Val Gly Gly Lys Val Cys Pro 145 150 155 160
Lys Gly Glu Cys Pro Trp Gin Val Leu Leu Leu Val Asn Gly Ala Gin 165 170 175
Leu Cys Gly Gly Thr Leu lie Asn Thr lie Trp Val Val Ser Ala Ala 180 185 190
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Gly Glu His Asp Leu Ser Glu His Asp Gly Asp Glu Gin Ser Arg Arg 210 215 220
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His Asp lie Ala Leu Leu Arg Leu His Gin Pro Val Val Leu Thr Asp 245 250 255
His Val Val Pro Leu Cys Leu Pro Glu Arg Thr Phe Ser Glu Arg Thr 260 265 270
Leu Ala Phe Val Arg Phe Ser Leu Val Ser Gly Trp Gly Gin Leu Leu 275 280 285
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Leu Met Thr Gin Asp Cys Leu Gin Gin Ser Arg Lys Val Gly Asp Ser 305 310 315 320
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Leu Arg Ala Pro Phe Pro 405
<210> 226 <211> 406 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> K109N/A175S <400> 226
Ala Asn Ala Phe Leu Glu Glu Leu Arg Pro Gly Ser Leu Glu Arg Glu 15 10 15
Cys Lys Glu Glu Gin Cys Ser Phe Glu Glu Ala Arg Glu lie Phe Lys 20 25 30
Asp Ala Glu Arg Thr Lys Leu Phe Trp lie Ser Tyr Ser Asp Gly Asp 35 40 45
Gin Cys Ala Ser Ser Pro Cys Gin Asn Gly Gly Ser Cys Lys Asp Gin 50 55 60
Leu Gin Ser Tyr lie Cys Phe Cys Leu Pro Ala Phe Glu Gly Arg Asn 65 70 75 80
Cys Glu Thr His Lys Asp Asp Gin Leu lie Cys Val Asn Glu Asn Gly 85 90 95
Gly Cys Glu Gin Tyr Cys Ser Asp His Thr Gly Thr Asn Arg Ser Cys 100 105 110
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Leu Cys Gly Gly Thr Leu lie Asn Thr lie Trp Val Val Ser Ala Ala 180 185 190
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Gly Glu His Asp Leu Ser Glu His Asp Gly Asp Glu Gin Ser Arg Arg 210 215 220
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His Asp lie Ala Leu Leu Arg Leu His Gin Pro Val Val Leu Thr Asp 245 250 255
His Val Val Pro Leu Cys Leu Pro Glu Arg Thr Phe Ser Glu Arg Thr 260 265 270
Leu Ala Phe Val Arg Phe Ser Leu Val Ser Gly Trp Gly Gin Leu Leu 275 280 285
Asp Arg Gly Ala Thr Ala Leu Glu Leu Met Val Leu Asn Val Pro Arg 290 295 300
Leu Met Thr Gin Asp Cys Leu Gin Gin Ser Arg Lys Val Gly Asp Ser 305 310 315 320
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Leu Arg Ala Pro Phe Pro 405
<210> 227 <211> 417 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> S103S11IdelinsQRLMEDICLPRWGCLWEDDF <400> 227
Ala Asn Ala Phe Leu Glu Glu Leu Arg Pro Gly Ser Leu Glu Arg Glu 15 10 15
Cys Lys Glu Glu Gin Cys Ser Phe Glu Glu Ala Arg Glu lie Phe Lys 20 25 30
Asp Ala Glu Arg Thr Lys Leu Phe Trp lie Ser Tyr Ser Asp Gly Asp 35 40 45
Gin Cys Ala Ser Ser Pro Cys Gin Asn Gly Gly Ser Cys Lys Asp Gin 50 55 60
Leu Gin Ser Tyr lie Cys Phe Cys Leu Pro Ala Phe Glu Gly Arg Asn 65 70 75 80
Cys Glu Thr His Lys Asp Asp Gin Leu lie Cys Val Asn Glu Asn Gly 85 90 95
Gly Cys Glu Gin Tyr Cys Gin Arg Leu Met Glu Asp lie Cys Leu Pro 100 105 110
Arg Trp Gly Cys Leu Trp Glu Asp Asp Phe Cys Arg Cys His Glu Gly 115 120 125
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Leu lie Asn Thr lie Trp Val Val Ser Ala Ala His Cys Phe Asp Lys 195 200 205 lie Lys Asn Trp Arg Asn Leu lie Ala Val Leu Gly Glu His Asp Leu 210 215 220
Ser Glu His Asp Gly Asp Glu Gin Ser Arg Arg Val Ala Gin Val lie 225 230 235 240 lie Pro Ser Thr Tyr Val Pro Gly Thr Thr Asn His Asp lie Ala Leu 245 250 255
Leu Arg Leu His Gin Pro Val Val Leu Thr Asp His Val Val Pro Leu 260 265 270
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Cys Leu Gin Gin Ser Arg Lys Val Gly Asp Ser Pro Asn lie Thr Glu 325 330 335
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Leu Met Arg Ser Glu Pro Arg Pro Gly Val Leu Leu Arg Ala Pro Phe 405 410 415
Pro
<210> 228 <211> 414 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> H115S126delinsQRLMEDICLPRWGCLWEDDF <400> 228
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Cys Lys Glu Glu Gin Cys Ser Phe Glu Glu Ala Arg Glu lie Phe Lys 20 25 30
Asp Ala Glu Arg Thr Lys Leu Phe Trp lie Ser Tyr Ser Asp Gly Asp 35 40 45
Gin Cys Ala Ser Ser Pro Cys Gin Asn Gly Gly Ser Cys Lys Asp Gin 50 55 60
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Leu Leu Leu Val Asn Gly Ala Gin Leu Cys Gly Gly Thr Leu lie Asn 180 185 190
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<210> 229 <211> 419 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> T128P134delinsQRLMEDICLPRWGCLWEDDF <400> 229
Ala Asn Ala Phe Leu Glu Glu Leu Arg Pro Gly Ser Leu Glu Arg Glu 15 10 15
Cys Lys Glu Glu Gin Cys Ser Phe Glu Glu Ala Arg Glu lie Phe Lys 20 25 30
Asp Ala Glu Arg Thr Lys Leu Phe Trp lie Ser Tyr Ser Asp Gly Asp 35 40 45
Gin Cys Ala Ser Ser Pro Cys Gin Asn Gly Gly Ser Cys Lys Asp Gin 50 55 60
Leu Gin Ser Tyr lie Cys Phe Cys Leu Pro Ala Phe Glu Gly Arg Asn 65 70 75 80
Cys Glu Thr His Lys Asp Asp Gin Leu lie Cys Val Asn Glu Asn Gly 85 90 95
Gly Cys Glu Gin Tyr Cys Ser Asp His Thr Gly Thr Lys Arg Ser Cys 100 105 110
Arg Cys His Glu Gly Tyr Ser Leu Leu Ala Asp Gly Val Ser Cys Gin 115 120 125
Arg Leu Met Glu Asp lie Cys Leu Pro Arg Trp Gly Cys Leu Trp Glu 130 135 140
Asp Asp Phe Cys Gly Lys lie Pro lie Leu Glu Lys Arg Asn Ala Ser 145 150 155 160
Lys Pro Gin Gly Arg lie Val Gly Gly Lys Val Cys Pro Lys Gly Glu 165 170 175
Cys Pro Trp Gin Val Leu Leu Leu Val Asn Gly Ala Gin Leu Cys Gly 180 185 190
Gly Thr Leu lie Asn Thr lie Trp Val Val Ser Ala Ala His Cys Phe 195 200 205
Asp Lys lie Lys Asn Trp Arg Asn Leu lie Ala Val Leu Gly Glu His 210 215 220
Asp Leu Ser Glu His Asp Gly Asp Glu Gin Ser Arg Arg Val Ala Gin 225 230 235 240
Val lie lie Pro Ser Thr Tyr Val Pro Gly Thr Thr Asn His Asp lie 245 250 255
Ala Leu Leu Arg Leu His Gin Pro Val Val Leu Thr Asp His Val Val 260 265 270
Pro Leu Cys Leu Pro Glu Arg Thr Phe Ser Glu Arg Thr Leu Ala Phe 275 280 285
Val Arg Phe Ser Leu Val Ser Gly Trp Gly Gin Leu Leu Asp Arg Gly 290 295 300
Ala Thr Ala Leu Glu Leu Met Val Leu Asn Val Pro Arg Leu Met Thr 305 310 315 320
Gin Asp Cys Leu Gin Gin Ser Arg Lys Val Gly Asp Ser Pro Asn lie 325 330 335
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Gly His Phe Gly Val Tyr Thr Arg Val Ser Gin Tyr lie Glu Trp Leu 385 390 395 400
Gin Lys Leu Met Arg Ser Glu Pro Arg Pro Gly Val Leu Leu Arg Ala 405 410 415
Pro Phe Pro
<210> 230 <211> 411 <212> PRT <213> Homo sapiens <220>
<223> S103SllldelinsIEDICLPRWGCLWE <4 Ο Ο > 230
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Cys Lys Glu Glu Gin Cys Ser Phe Glu Glu Ala Arg Glu lie Phe Lys 20 25 30
Asp Ala Glu Arg Thr Lys Leu Phe Trp lie Ser Tyr Ser Asp Gly Asp 35 40 45
Gin Cys Ala Ser Ser Pro Cys Gin Asn Gly Gly Ser Cys Lys Asp Gin 50 55 60
Leu Gin Ser Tyr lie Cys Phe Cys Leu Pro Ala Phe Glu Gly Arg Asn 65 70 75 80
Cys Glu Thr His Lys Asp Asp Gin Leu lie Cys Val Asn Glu Asn Gly 85 90 95
Gly Cys Glu Gin Tyr Cys lie Glu Asp lie Cys Leu Pro Arg Trp Gly 100 105 110
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Gly Val Ser Cys Thr Pro Thr Val Glu Tyr Pro Cys Gly Lys lie Pro 130 135 140 lie Leu Glu Lys Arg Asn Ala Ser Lys Pro Gin Gly Arg lie Val Gly 145 150 155 160
Gly Lys Val Cys Pro Lys Gly Glu Cys Pro Trp Gin Val Leu Leu Leu 165 170 175
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Val Val Ser Ala Ala His Cys Phe Asp Lys lie Lys Asn Trp Arg Asn 195 200 205
Leu lie Ala Val Leu Gly Glu His Asp Leu Ser Glu His Asp Gly Asp 210 215 220
Glu Gin Ser Arg Arg Val Ala Gin Val lie lie Pro Ser Thr Tyr Val 225 230 235 240
Pro Gly Thr Thr Asn His Asp lie Ala Leu Leu Arg Leu His Gin Pro 245 250 255
Val Val Leu Thr Asp His Val Val Pro Leu Cys Leu Pro Glu Arg Thr 260 265 270
Phe Ser Glu Arg Thr Leu Ala Phe Val Arg Phe Ser Leu Val Ser Gly 275 280 285
Trp Gly Gin Leu Leu Asp Arg Gly Ala Thr Ala Leu Glu Leu Met Val 290 295 300
Leu Asn Val Pro Arg Leu Met Thr Gin Asp Cys Leu Gin Gin Ser Arg 305 310 315 320
Lys Val Gly Asp Ser Pro Asn lie Thr Glu Tyr Met Phe Cys Ala Gly 325 330 335
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His Ala Thr His Tyr Arg Gly Thr Trp Tyr Leu Thr Gly lie Val Ser 355 360 365
Trp Gly Gin Gly Cys Ala Thr Val Gly His Phe Gly Val Tyr Thr Arg 370 375 380
Val Ser Gin Tyr lie Glu Trp Leu Gin Lys Leu Met Arg Ser Glu Pro 385 390 395 400
Arg Pro Gly Val Leu Leu Arg Ala Pro Phe Pro 405 410
<210> 231 <211> 408 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> H115S126delinsIEDICLPRWGCLWE <400> 231
Ala Asn Ala Phe Leu Glu Glu Leu Arg Pro Gly Ser Leu Glu Arg Glu 15 10 15
Cys Lys Glu Glu Gin Cys Ser Phe Glu Glu Ala Arg Glu lie Phe Lys 20 25 30
Asp Ala Glu Arg Thr Lys Leu Phe Trp lie Ser Tyr Ser Asp Gly Asp 35 40 45
Gin Cys Ala Ser Ser Pro Cys Gin Asn Gly Gly Ser Cys Lys Asp Gin 50 55 60
Leu Gin Ser Tyr lie Cys Phe Cys Leu Pro Ala Phe Glu Gly Arg Asn 65 70 75 80
Cys Glu Thr His Lys Asp Asp Gin Leu lie Cys Val Asn Glu Asn Gly 85 90 95
Gly Cys Glu Gin Tyr Cys Ser Asp His Thr Gly Thr Lys Arg Ser Cys 100 105 110
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Ala Gin Leu Cys Gly Gly Thr Leu lie Asn Thr lie Trp Val Val Ser 180 185 190
Ala Ala His Cys Phe Asp Lys lie Lys Asn Trp Arg Asn Leu lie Ala 195 200 205
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Arg Arg Val Ala Gin Val lie lie Pro Ser Thr Tyr Val Pro Gly Thr 225 230 235 240
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Gly Cys Ala Thr Val Gly His Phe Gly Val Tyr Thr Arg Val Ser Gin 370 375 380
Tyr lie Glu Trp Leu Gin Lys Leu Met Arg Ser Glu Pro Arg Pro Gly 385 390 395 400
Val Leu Leu Arg Ala Pro Phe Pro 405
<210> 232 <211> 413 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> 128P134delinsIEDICLPRWGCLWE <400> 232
Ala Asn Ala Phe Leu Glu Glu Leu Arg Pro Gly Ser Leu Glu Arg Glu 15 10 15
Cys Lys Glu Glu Gin Cys Ser Phe Glu Glu Ala Arg Glu lie Phe Lys 20 25 30
Asp Ala Glu Arg Thr Lys Leu Phe Trp lie Ser Tyr Ser Asp Gly Asp 35 40 45
Gin Cys Ala Ser Ser Pro Cys Gin Asn Gly Gly Ser Cys Lys Asp Gin 50 55 60
Leu Gin Ser Tyr lie Cys Phe Cys Leu Pro Ala Phe Glu Gly Arg Asn 65 70 75 80
Cys Glu Thr His Lys Asp Asp Gin Leu lie Cys Val Asn Glu Asn Gly 85 90 95
Gly Cys Glu Gin Tyr Cys Ser Asp His Thr Gly Thr Lys Arg Ser Cys 100 105 110
Arg Cys His Glu Gly Tyr Ser Leu Leu Ala Asp Gly Val Ser Cys lie 115 120 125
Glu Asp lie Cys Leu Pro Arg Trp Gly Cys Leu Trp Glu Cys Gly Lys 130 135 140 lie Pro lie Leu Glu Lys Arg Asn Ala Ser Lys Pro Gin Gly Arg lie 145 150 155 160
Val Gly Gly Lys Val Cys Pro Lys Gly Glu Cys Pro Trp Gin Val Leu 165 170 175
Leu Leu Val Asn Gly Ala Gin Leu Cys Gly Gly Thr Leu lie Asn Thr 180 185 190 lie Trp Val Val Ser Ala Ala His Cys Phe Asp Lys lie Lys Asn Trp 195 200 205
Arg Asn Leu lie Ala Val Leu Gly Glu His Asp Leu Ser Glu His Asp 210 215 220
Gly Asp Glu Gin Ser Arg Arg Val Ala Gin Val lie lie Pro Ser Thr 225 230 235 240
Tyr Val Pro Gly Thr Thr Asn His Asp lie Ala Leu Leu Arg Leu His 245 250 255
Gin Pro Val Val Leu Thr Asp His Val Val Pro Leu Cys Leu Pro Glu 260 265 270
Arg Thr Phe Ser Glu Arg Thr Leu Ala Phe Val Arg Phe Ser Leu Val 275 280 285
Ser Gly Trp Gly Gin Leu Leu Asp Arg Gly Ala Thr Ala Leu Glu Leu 290 295 300
Met Vai Leu Asn Vai Pro Arg Leu Met Thr Gin Asp Cys Leu Gin Gin 305 310 315 320
Ser Arg Lys Vai Gly Asp Ser Pro Asn lie Thr Glu Tyr Met Phe Cys 325 330 335
Ala Gly Tyr Ser Asp Gly Ser Lys Asp Ser Cys Lys Gly Asp Ser Gly 340 345 350
Gly Pro His Ala Thr His Tyr Arg Gly Thr Trp Tyr Leu Thr Gly Ile 355 360 365
Vai Ser Trp Gly Gin Gly Cys Ala Thr Vai Gly His Phe Gly Vai Tyr 370 375 380
Thr Arg Vai Ser Gin Tyr lie Glu Trp Leu Gin Lys Leu Met Arg Ser 385 390 395 400
Glu Pro Arg Pro Gly Vai Leu Leu Arg Ala Pro Phe Pro 405 410
<210> 233 <211> 410 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> S103S11IdelinsDICLPRWGCLWED <400> 233
Ala Asn Ala Phe Leu Glu Glu Leu Arg Pro Gly Ser Leu Glu Arg Glu 15 10 15
Cys Lys Glu Glu Gin Cys Ser Phe Glu Glu Ala Arg Glu Ile Phe Lys 20 25 30
Asp Ala Glu Arg Thr Lys Leu Phe Trp Ile Ser Tyr Ser Asp Gly Asp 35 40 45
Gin Cys Ala Ser Ser Pro Cys Gin Asn Gly Gly Ser Cys Lys Asp Gin 50 55 60
Leu Gin Ser Tyr lie Cys Phe Cys Leu Pro Ala Phe Glu Gly Arg Asn 65 70 75 80
Cys Glu Thr His Lys Asp Asp Gin Leu Ile Cys Vai Asn Glu Asn Gly 85 90 95
Gly Cys Glu Gin Tyr Cys Asp lie Cys Leu Pro Arg Trp Gly Cys Leu 100 105 110
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Vai Ser Cys Thr Pro Thr Vai Glu Tyr Pro Cys Gly Lys lie Pro lie 130 135 140
Leu Glu Lys Arg Asn Ala Ser Lys Pro Gin Gly Arg Ile Vai Gly Gly 145 150 155 160
Lys Vai Cys Pro Lys Gly Glu Cys Pro Trp Gin Vai Leu Leu Leu Vai 165 170 175
Asn Gly Ala Gin Leu Cys Gly Gly Thr Leu Ile Asn Thr Ile Trp Vai 180 185 190
Vai Ser Ala Ala His Cys Phe Asp Lys Ile Lys Asn Trp Arg Asn Leu 195 200 205
Ile Ala Vai Leu Gly Glu His Asp Leu Ser Glu His Asp Gly Asp Glu 210 215 220
Gin Ser Arg Arg Val Ala Gin Val lie lie Pro Ser Thr Tyr Val Pro 225 230 235 240
Gly Thr Thr Asn His Asp lie Ala Leu Leu Arg Leu His Gin Pro Val 245 250 255
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Val Gly Asp Ser Pro Asn lie Thr Glu Tyr Met Phe Cys Ala Gly Tyr 325 330 335
Ser Asp Gly Ser Lys Asp Ser Cys Lys Gly Asp Ser Gly Gly Pro His 340 345 350
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Gly Gin Gly Cys Ala Thr Val Gly His Phe Gly Val Tyr Thr Arg Val 370 375 380
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Ser Arg Arg Val Ala Gin Val lie lie Pro Ser Thr Tyr Val Pro Gly 225 230 235 240
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Leu Met Thr Gin Asp Cys Leu Gin Gin Ser Arg Lys Val Gly Asp Ser 305 310 315 320
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Lys Asp Ser Cys Lys Gly Asp Ser Gly Gly Pro His Ala Thr His Tyr 340 345 350
Arg Gly Thr Trp Tyr Leu Thr Gly lie Val Ser Trp Gly Val Gly Cys 355 360 365
Ala Thr Val Gly His Phe Gly Val Tyr Thr Arg Val Ser Gin Tyr lie 370 375 380
Glu Trp Leu Gin Lys Leu Met Arg Ser Glu Pro Arg Pro Gly Val Leu 385 390 395 400
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<210> 253 <211> 406 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> S222A/Q366V <400> 253
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Cys Lys Glu Glu Gin Cys Ser Phe Glu Glu Ala Arg Glu lie Phe Lys 20 25 30
Asp Ala Glu Arg Thr Lys Leu Phe Trp lie Ser Tyr Ser Asp Gly Asp 35 40 45
Gin Cys Ala Ser Ser Pro Cys Gin Asn Gly Gly Ser Cys Lys Asp Gin 50 55 60
Leu Gin Ser Tyr lie Cys Phe Cys Leu Pro Ala Phe Glu Gly Arg Asn 65 70 75 80
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Lys Gly Glu Cys Pro Trp Gin Val Leu Leu Leu Val Asn Gly Ala Gin 165 170 175
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His Val Val Pro Leu Cys Leu Pro Glu Arg Thr Phe Ser Glu Arg Thr 260 265 270
Leu Ala Phe Val Arg Phe Ser Leu Val Ser Gly Trp Gly Gin Leu Leu 275 280 285
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Leu Arg Ala Pro Phe Pro 405
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Cys Lys Glu Glu Gin Cys Ser Phe Glu Glu Ala Arg Glu lie Phe Lys 20 25 30
Asp Ala Glu Arg Thr Lys Leu Phe Trp lie Ser Tyr Ser Asp Gly Asp 35 40 45
Gin Cys Ala Ser Ser Pro Cys Gin Asn Gly Gly Ser Cys Lys Asp Gin 50 55 60
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Cys Glu Thr His Lys Asp Asp Gin Leu lie Cys Val Asn Glu Asn Gly 85 90 95
Gly Cys Glu Gin Tyr Cys Ser Asp His Thr Gly Thr Lys Arg Ser Cys 100 105 110
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Asn Ala Ser Lys Pro Gin Gly Arg lie Val Gly Gly Lys Val Cys Pro 145 150 155 160
Lys Gly Glu Cys Pro Trp Gin Val Leu Leu Leu Val Asn Gly Ala Gin 165 170 175
Leu Cys Gly Gly Thr Leu lie Asn Thr lie Trp Val Val Ser Ala Ala 180 185 190
His Cys Phe Asp Lys lie Lys Asn Trp Arg Asn Leu lie Ala Val Leu 195 200 205
Gly Glu His Asp Leu Ser Glu His Asp Gly Asp Glu Gin Ser Arg Arg 210 215 220
Val Ala Gin Val lie lie Pro Ser Thr Tyr Val Pro Gly Thr Thr Asn 225 230 235 240
His Asp lie Ala Leu Leu Arg Leu His Gin Pro Val Val Leu Thr Asp 245 250 255
Ser Val Val Pro Leu Cys Leu Pro Glu Arg Thr Phe Ser Glu Arg Thr 260 265 270
Leu Ala Phe Val Arg Phe Ser Leu Val Ser Gly Trp Gly Gin Leu Leu 275 280 285
Asp Arg Gly Ala Thr Ala Leu Glu Leu Met Val Leu Asn Val Pro Arg 290 295 300
Leu Met Thr Gin Asp Cys Leu Gin Gin Ser Arg Lys Val Gly Asp Ser 305 310 315 320
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Leu Arg Ala Pro Phe Pro 405
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<223> S222A/H373A <4 Ο Ο > 255
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Cys Lys Glu Glu Gin Cys Ser Phe Glu Glu Ala Arg Glu lie Phe Lys 20 25 30
Asp Ala Glu Arg Thr Lys Leu Phe Trp lie Ser Tyr Ser Asp Gly Asp 35 40 45
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Leu Cys Gly Gly Thr Leu lie Asn Thr lie Trp Val Val Ser Ala Ala 180 185 190
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His Val Val Pro Leu Cys Leu Pro Glu Arg Thr Phe Ser Glu Arg Thr 260 265 270
Leu Ala Phe Val Arg Phe Ser Leu Val Ser Gly Trp Gly Gin Leu Leu 275 280 285
Asp Arg Gly Ala Thr Ala Leu Glu Leu Met Val Leu Asn Val Pro Arg 290 295 300
Leu Met Thr Gin Asp Cys Leu Gin Gin Ser Arg Lys Val Gly Asp Ser 305 310 315 320
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Leu Arg Ala Pro Phe Pro 405
<210> 256 <211> 406 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> V158T/L287T/M298K <400> 256
Ala Asn Ala Phe Leu Glu Glu Leu Arg Pro Gly Ser Leu Glu Arg Glu 15 10 15
Cys Lys Glu Glu Gin Cys Ser Phe Glu Glu Ala Arg Glu lie Phe Lys 20 25 30
Asp Ala Glu Arg Thr Lys Leu Phe Trp lie Ser Tyr Ser Asp Gly Asp 35 40 45
Gin Cys Ala Ser Ser Pro Cys Gin Asn Gly Gly Ser Cys Lys Asp Gin 50 55 60
Leu Gin Ser Tyr lie Cys Phe Cys Leu Pro Ala Phe Glu Gly Arg Asn 65 70 75 80
Cys Glu Thr His Lys Asp Asp Gin Leu lie Cys Val Asn Glu Asn Gly 85 90 95
Gly Cys Glu Gin Tyr Cys Ser Asp His Thr Gly Thr Lys Arg Ser Cys 100 105 110
Arg Cys His Glu Gly Tyr Ser Leu Leu Ala Asp Gly Val Ser Cys Thr 115 120 125
Pro Thr Val Glu Tyr Pro Cys Gly Lys lie Pro lie Leu Glu Lys Arg 130 135 140
Asn Ala Ser Lys Pro Gin Gly Arg lie Val Gly Gly Lys Thr Cys Pro 145 150 155 160
Lys Gly Glu Cys Pro Trp Gin Val Leu Leu Leu Val Asn Gly Ala Gin 165 170 175
Leu Cys Gly Gly Thr Leu lie Asn Thr lie Trp Val Val Ser Ala Ala 180 185 190
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Leu Ala Phe Val Arg Phe Ser Leu Val Ser Gly Trp Gly Gin Thr Leu 275 280 285
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Leu Ala Phe Val Arg Phe Ser Leu Val Ser Gly Trp Gly Gin Thr Leu 275 280 285
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Leu Arg Ala Pro Phe Pro 405
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Ala Asn Ala Phe Leu Glu Glu Leu Arg Pro Gly Ser Leu Glu Arg Glu 15 10 15
Cys Lys Glu Glu Gin Cys Ser Phe Glu Glu Ala Arg Glu lie Phe Lys 20 25 30
Asp Ala Glu Arg Thr Lys Leu Phe Trp lie Ser Tyr Ser Asp Gly Asp 35 40 45
Gin Cys Ala Ser Ser Pro Cys Gin Asn Gly Gly Ser Cys Lys Asp Gin 50 55 60
Leu Gin Ser Tyr lie Cys Phe Cys Leu Pro Ala Phe Glu Gly Arg Asn 65 70 75 80
Cys Glu Thr His Lys Asp Asp Gin Leu lie Cys Val Asn Glu Asn Gly 85 90 95
Gly Cys Glu Gin Tyr Cys lie Glu Asp lie Cys Leu Pro Arg Trp Gly 100 105 110
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Gly Lys Val Cys Pro Lys Gly Glu Cys Pro Trp Gin Val Leu Leu Leu 165 170 175
Val Asn Gly Ala Gin Leu Cys Gly Gly Thr Leu lie Asn Thr lie Trp 180 185 190
Val Val Ser Ala Ala His Cys Phe Asp Lys lie Lys Asn Trp Arg Asn 195 200 205
Leu lie Ala Val Leu Gly Glu His Asp Leu Ser Glu His Asp Gly Asp 210 215 220
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Leu Asn Vai Pro Arg Leu Met Thr Gin Asp Cys Leu Gin Gin Ser Arg 305 310 315 320
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Cys Lys Glu Glu Gin Cys Ser Phe Glu Glu Ala Arg Glu Ile Phe Lys 20 25 30
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Ser Glu Arg Thr Leu Ala Phe Val Arg Phe Ser Leu Val Ser Gly Trp 275 280 285
Gly Gin Leu Leu Asp Arg Gly Ala Thr Ala Leu Glu Leu Met Val Leu 290 295 300
Asn Val Pro Arg Leu Met Thr Gin Asp Cys Leu Gin Gin Ser Arg Lys 305 310 315 320
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Gly Gin Gly Cys Ala Thr Val Gly His Phe Gly Val Tyr Thr Arg Val 370 375 380
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Ser Glu Pro Arg Pro Gly Val Leu Leu Arg Ala Pro Phe Pro 405 410
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Ala Asn Ala Phe Leu Glu Glu Leu Arg Pro Gly Ser Leu Glu Arg Glu 15 10 15
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Asp Ala Glu Arg Thr Lys Leu Phe Trp lie Ser Tyr Ser Asp Gly Asp 35 40 45
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Ala Gin Leu Cys Gly Gly Thr Leu lie Asn Thr lie Trp Val Val Ser 180 185 190
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Arg Arg Val Ala Gin Val lie lie Pro Ser Thr Tyr Val Pro Val Thr 225 230 235 240
Thr Asn His Asp lie Ala Leu Leu Arg Leu His Gin Pro Val Val Leu 245 250 255
Thr Asp His Val Val Pro Leu Cys Leu Pro Glu Arg Thr Phe Ser Glu 260 265 270
Arg Thr Leu Ala Phe Val Arg Phe Ser Leu Val Ser Gly Trp Gly Gin 275 280 285
Leu Leu Asp Arg Gly Ala Thr Ala Leu Glu Leu Met Val Leu Asn Val 290 295 300
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Gly Ser Lys Asp Ser Cys Lys Gly Asp Ser Gly Gly Pro His Ala Thr 340 345 350
His Tyr Arg Gly Thr Trp Tyr Leu Thr Gly lie Val Ser Trp Gly Gin 355 360 365
Gly Cys Ala Thr Val Gly His Phe Gly Val Tyr Thr Arg Val Ser Gin 370 375 380
Tyr lie Glu Trp Leu Gin Lys Leu Met Arg Ser Glu Pro Arg Pro Gly 385 390 395 400
Val Leu Leu Arg Ala Pro Phe Pro 405
<210> 262 <211> 407 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> Hl15S12 6delinsDICLPRWGCLWED/G237V <400> 262
Ala Asn Ala Phe Leu Glu Glu Leu Arg Pro Gly Ser Leu Glu Arg Glu 15 10 15
Cys Lys Glu Glu Gin Cys Ser Phe Glu Glu Ala Arg Glu lie Phe Lys 20 25 30
Asp Ala Glu Arg Thr Lys Leu Phe Trp lie Ser Tyr Ser Asp Gly Asp 35 40 45
Gin Cys Ala Ser Ser Pro Cys Gin Asn Gly Gly Ser Cys Lys Asp Gin 50 55 60
Leu Gin Ser Tyr lie Cys Phe Cys Leu Pro Ala Phe Glu Gly Arg Asn 65 70 75 80
Cys Glu Thr His Lys Asp Asp Gin Leu lie Cys Val Asn Glu Asn Gly 85 90 95
Gly Cys Glu Gin Tyr Cys Ser Asp His Thr Gly Thr Lys Arg Ser Cys 100 105 110
Arg Cys Asp lie Cys Leu Pro Arg Trp Gly Cys Leu Trp Glu Asp Cys 115 120 125
Thr Pro Thr Val Glu Tyr Pro Cys Gly Lys lie Pro lie Leu Glu Lys 130 135 140
Arg Asn Ala Ser Lys Pro Gin Gly Arg lie Val Gly Gly Lys Val Cys 145 150 155 160
Pro Lys Gly Glu Cys Pro Trp Gin Val Leu Leu Leu Val Asn Gly Ala 165 170 175
Gin Leu Cys Gly Gly Thr Leu lie Asn Thr lie Trp Val Val Ser Ala 180 185 190
Ala His Cys Phe Asp Lys lie Lys Asn Trp Arg Asn Leu lie Ala Val 195 200 205
Leu Gly Glu His Asp Leu Ser Glu His Asp Gly Asp Glu Gin Ser Arg 210 215 220
Arg Val Ala Gin Val lie lie Pro Ser Thr Tyr Val Pro Val Thr Thr 225 230 235 240
Asn His Asp lie Ala Leu Leu Arg Leu His Gin Pro Val Val Leu Thr 245 250 255
Asp His Val Val Pro Leu Cys Leu Pro Glu Arg Thr Phe Ser Glu Arg 260 265 270
Thr Leu Ala Phe Val Arg Phe Ser Leu Val Ser Gly Trp Gly Gin Leu 275 280 285
Leu Asp Arg Gly Ala Thr Ala Leu Glu Leu Met Val Leu Asn Val Pro 290 295 300
Arg Leu Met Thr Gin Asp Cys Leu Gin Gin Ser Arg Lys Val Gly Asp 305 310 315 320
Ser Pro Asn lie Thr Glu Tyr Met Phe Cys Ala Gly Tyr Ser Asp Gly 325 330 335
Ser Lys Asp Ser Cys Lys Gly Asp Ser Gly Gly Pro His Ala Thr His 340 345 350
Tyr Arg Gly Thr Trp Tyr Leu Thr Gly lie Val Ser Trp Gly Gin Gly 355 360 365
Cys Ala Thr Val Gly His Phe Gly Val Tyr Thr Arg Val Ser Gin Tyr 370 375 380 lie Glu Trp Leu Gin Lys Leu Met Arg Ser Glu Pro Arg Pro Gly Val 385 390 395 400
Leu Leu Arg Ala Pro Phe Pro 405
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Cys Lys Glu Glu Gin Cys Ser Phe Glu Glu Ala Arg Glu lie Phe Lys 20 25 30
Asp Ala Glu Arg Thr Lys Leu Phe Trp lie Ser Tyr Ser Asp Gly Asp 35 40 45
Gin Cys Ala Ser Ser Pro Cys Gin Asn Gly Gly Ser Cys Lys Asp Gin 50 55 60
Leu Gin Ser Tyr lie Cys Phe Cys Leu Pro Ala Phe Glu Gly Arg Asn 65 70 75 80
Cys Glu Thr His Lys Asp Asp Gin Leu lie Cys Val Asn Glu Asn Gly 85 90 95
Gly Cys Glu Gin Tyr Cys Ser Asp His Thr Gly Thr Lys Arg Ser Cys 100 105 110
Arg Cys His Glu Gly Tyr Ser Leu Leu Ala Asp Gly Val Ser Cys Gin 115 120 125
Arg Leu Met Glu Asp lie Cys Leu Pro Arg Trp Gly Cys Leu Trp Glu 130 135 140
Asp Asp Phe Cys Gly Lys lie Pro lie Leu Glu Lys Arg Asn Ala Ser 145 150 155 160
Lys Pro Gin Gly Arg lie Val Gly Gly Lys Val Cys Pro Lys Gly Glu 165 170 175
Cys Pro Trp Gin Val Leu Leu Leu Val Asn Gly Ala Gin Leu Cys Gly 180 185 190
Gly Thr Leu lie Asn Thr lie Trp Val Val Ser Ala Ala His Cys Phe 195 200 205
Asp Lys lie Lys Asn Trp Arg Asn Leu lie Ala Val Leu Gly Glu His 210 215 220
Asp Leu Ser Glu His Asp Gly Asp Glu Gin Ser Arg Arg Val Ala Gin 225 230 235 240
Val lie lie Pro Ser Thr Tyr Val Pro Val Thr Thr Asn His Asp lie 245 250 255
Ala Leu Leu Arg Leu His Gin Pro Val Val Leu Thr Asp His Val Val 260 265 270
Pro Leu Cys Leu Pro Glu Arg Thr Phe Ser Glu Arg Thr Leu Ala Phe 275 280 285
Val Arg Phe Ser Leu Val Ser Gly Trp Gly Gin Leu Leu Asp Arg Gly 290 295 300
Ala Thr Ala Leu Glu Leu Met Val Leu Asn Val Pro Arg Leu Met Thr 305 310 315 320
Gin Asp Cys Leu Gin Gin Ser Arg Lys Val Gly Asp Ser Pro Asn lie 325 330 335
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Cys Lys Gly Asp Ser Gly Gly Pro His Ala Thr His Tyr Arg Gly Thr 355 360 365
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Gly His Phe Gly Val Tyr Thr Arg Val Ser Gin Tyr lie Glu Trp Leu 385 390 395 400
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Pro Phe Pro
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Cys Lys Glu Glu Gin Cys Ser Phe Glu Glu Ala Arg Glu lie Phe Lys 20 25 30
Asp Ala Glu Arg Thr Lys Leu Phe Trp lie Ser Tyr Ser Asp Gly Asp 35 40 45
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Cys Glu Thr His Lys Asp Asp Gin Leu lie Cys Val Asn Glu Asn Gly 85 90 95
Gly Cys Glu Gin Tyr Cys Ser Asp His Thr Gly Thr Lys Arg Ser Cys 100 105 110
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Glu Asp lie Cys Leu Pro Arg Trp Gly Cys Leu Trp Glu Cys Gly Lys 130 135 140 lie Pro lie Leu Glu Lys Arg Asn Ala Ser Lys Pro Gin Gly Arg lie 145 150 155 160
Val Gly Gly Lys Val Cys Pro Lys Gly Glu Cys Pro Trp Gin Val Leu 165 170 175
Leu Leu Val Asn Gly Ala Gin Leu Cys Gly Gly Thr Leu lie Asn Thr 180 185 190 lie Trp Val Val Ser Ala Ala His Cys Phe Asp Lys lie Lys Asn Trp 195 200 205
Arg Asn Leu lie Ala Val Leu Gly Glu His Asp Leu Ser Glu His Asp 210 215 220
Gly Asp Glu Gin Ser Arg Arg Val Ala Gin Val lie lie Pro Ser Thr 225 230 235 240
Tyr Val Pro Val Thr Thr Asn His Asp lie Ala Leu Leu Arg Leu His 245 250 255
Gin Pro Val Val Leu Thr Asp His Val Val Pro Leu Cys Leu Pro Glu 260 265 270
Arg Thr Phe Ser Glu Arg Thr Leu Ala Phe Val Arg Phe Ser Leu Val 275 280 285
Ser Gly Trp Gly Gin Leu Leu Asp Arg Gly Ala Thr Ala Leu Glu Leu 290 295 300
Met Val Leu Asn Val Pro Arg Leu Met Thr Gin Asp Cys Leu Gin Gin 305 310 315 320
Ser Arg Lys Val Gly Asp Ser Pro Asn lie Thr Glu Tyr Met Phe Cys 325 330 335
Ala Gly Tyr Ser Asp Gly Ser Lys Asp Ser Cys Lys Gly Asp Ser Gly 340 345 350
Gly Pro His Ala Thr His Tyr Arg Gly Thr Trp Tyr Leu Thr Gly lie 355 360 365
Val Ser Trp Gly Gin Gly Cys Ala Thr Val Gly His Phe Gly Val Tyr 370 375 380
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Ala Asn Ala Phe Leu Glu Glu Leu Arg Pro Gly Ser Leu Glu Arg Glu 15 10 15
Cys Lys Glu Glu Gin Cys Ser Phe Glu Glu Ala Arg Glu lie Phe Lys 20 25 30
Asp Ala Glu Arg Thr Lys Leu Phe Trp lie Ser Tyr Ser Asp Gly Asp 35 40 45
Gin Cys Ala Ser Ser Pro Cys Gin Asn Gly Gly Ser Cys Lys Asp Gin 50 55 60
Leu Gin Ser Tyr lie Cys Phe Cys Leu Pro Ala Phe Glu Gly Arg Asn 65 70 75 80
Cys Glu Thr His Lys Asp Asp Gin Leu lie Cys Val Asn Glu Asn Gly 85 90 95
Gly Cys Glu Gin Tyr Cys Gin Arg Leu Met Glu Asp lie Cys Leu Pro 100 105 110
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Gin Gly Arg lie Val Gly Gly Lys Val Cys Pro Lys Gly Glu Cys Pro 165 170 175
Trp Gin Val Leu Leu Leu Val Asn Gly Ala Gin Leu Cys Gly Gly Thr 180 185 190
Leu lie Asn Thr lie Trp Val Val Ser Ala Ala His Cys Phe Asp Lys 195 200 205 lie Lys Asn Trp Arg Asn Leu lie Ala Val Leu Gly Glu His Asp Leu 210 215 220
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Ala Leu Glu Leu Met Val Leu Asn Val Pro Arg Leu Met Thr Gin Asp 305 310 315 320
Cys Leu Gin Gin Ser Arg Lys Val Gly Asp Ser Pro Asn lie Thr Glu 325 330 335
Tyr Met Phe Cys Ala Gly Tyr Ser Asp Gly Ser Lys Asp Ser Cys Lys 340 345 350
Gly Asp Ser Gly Gly Pro His Ala Thr His Tyr Arg Gly Thr Trp Tyr 355 360 365
Leu Thr Gly lie Val Ser Trp Gly Gin Gly Cys Ala Thr Val Gly His 370 375 380
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Leu Met Arg Ser Glu Pro Arg Pro Gly Val Leu Leu Arg Ala Pro Phe 405 410 415
Pro
<210> 266 <211> 412 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> T128P134delinsDICLPRWGCLWED/G237V <400> 266
Ala Asn Ala Phe Leu Glu Glu Leu Arg Pro Gly Ser Leu Glu Arg Glu 15 10 15
Cys Lys Glu Glu Gin Cys Ser Phe Glu Glu Ala Arg Glu lie Phe Lys 20 25 30
Asp Ala Glu Arg Thr Lys Leu Phe Trp lie Ser Tyr Ser Asp Gly Asp 35 40 45
Gin Cys Ala Ser Ser Pro Cys Gin Asn Gly Gly Ser Cys Lys Asp Gin 50 55 60
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Cys Glu Thr His Lys Asp Asp Gin Leu lie Cys Val Asn Glu Asn Gly 85 90 95
Gly Cys Glu Gin Tyr Cys Ser Asp His Thr Gly Thr Lys Arg Ser Cys 100 105 110
Arg Cys His Glu Gly Tyr Ser Leu Leu Ala Asp Gly Val Ser Cys Asp 115 120 125 lie Cys Leu Pro Arg Trp Gly Cys Leu Trp Glu Asp Cys Gly Lys lie 130 135 140
Pro lie Leu Glu Lys Arg Asn Ala Ser Lys Pro Gin Gly Arg lie Val 145 150 155 160
Gly Gly Lys Val Cys Pro Lys Gly Glu Cys Pro Trp Gin Val Leu Leu 165 170 175
Leu Val Asn Gly Ala Gin Leu Cys Gly Gly Thr Leu lie Asn Thr lie 180 185 190
Trp Val Val Ser Ala Ala His Cys Phe Asp Lys lie Lys Asn Trp Arg 195 200 205
Asn Leu lie Ala Val Leu Gly Glu His Asp Leu Ser Glu His Asp Gly 210 215 220
Asp Glu Gin Ser Arg Arg Val Ala Gin Val lie lie Pro Ser Thr Tyr 225 230 235 240
Val Pro Val Thr Thr Asn His Asp lie Ala Leu Leu Arg Leu His Gin 245 250 255
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Gly Trp Gly Gin Leu Leu Asp Arg Gly Ala Thr Ala Leu Glu Leu Met 290 295 300
Val Leu Asn Val Pro Arg Leu Met Thr Gin Asp Cys Leu Gin Gin Ser 305 310 315 320
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Gly Tyr Ser Asp Gly Ser Lys Asp Ser Cys Lys Gly Asp Ser Gly Gly 340 345 350
Pro His Ala Thr His Tyr Arg Gly Thr Trp Tyr Leu Thr Gly lie Val 355 360 365
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Ala Asn Ala Phe Leu Glu Glu Leu Arg Pro Gly Ser Leu Glu Arg Glu 15 10 15
Cys Lys Glu Glu Gin Cys Ser Phe Glu Glu Ala Arg Glu lie Phe Lys 20 25 30
Asp Ala Glu Arg Thr Lys Leu Phe Trp lie Ser Tyr Ser Asp Gly Asp 35 40 45
Gin Cys Ala Ser Ser Pro Cys Gin Asn Gly Gly Ser Cys Lys Asp Gin 50 55 60
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Cys Glu Thr His Lys Asp Asp Gin Leu lie Cys Val Asn Glu Asn Gly 85 90 95
Gly Cys Glu Gin Tyr Cys Ser Phe Gly Arg Gly Asp lie Arg Asn Val 100 105 110
Cys Arg Cys His Glu Gly Tyr Ser Leu Leu Ala Asp Gly Val Ser Cys 115 120 125
Thr Pro Thr Val Glu Tyr Pro Cys Gly Lys lie Pro lie Leu Glu Lys 130 135 140
Arg Asn Ala Ser Lys Pro Gin Gly Arg lie Val Gly Gly Lys Val Cys 145 150 155 160
Pro Lys Gly Glu Cys Pro Trp Gin Val Leu Leu Leu Val Asn Gly Ala 165 170 175
Gin Leu Cys Gly Gly Thr Leu lie Asn Thr lie Trp Val Val Ser Ala 180 185 190
Ala His Cys Phe Asp Lys lie Lys Asn Trp Arg Asn Leu lie Ala Val 195 200 205
Leu Gly Glu His Asp Leu Ser Glu His Asp Gly Asp Glu Gin Ser Arg 210 215 220
Arg Val Ala Gin Val lie lie Pro Ser Thr Tyr Val Pro Val Thr Thr 225 230 235 240
Asn His Asp lie Ala Leu Leu Arg Leu His Gin Pro Val Val Leu Thr 245 250 255
Asp His Val Val Pro Leu Cys Leu Pro Glu Arg Thr Phe Ser Glu Arg 260 265 270
Thr Leu Ala Phe Val Arg Phe Ser Leu Val Ser Gly Trp Gly Gin Leu 275 280 285
Leu Asp Arg Gly Ala Thr Ala Leu Glu Leu Met Val Leu Asn Val Pro 290 295 300
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Tyr Arg Gly Thr Trp Tyr Leu Thr Gly lie Val Ser Trp Gly Gin Gly 355 360 365
Cys Ala Thr Val Gly His Phe Gly Val Tyr Thr Arg Val Ser Gin Tyr 370 375 380 lie Glu Trp Leu Gin Lys Leu Met Arg Ser Glu Pro Arg Pro Gly Val 385 390 395 400
Leu Leu Arg Ala Pro Phe Pro 405
<210> 268 <211> 404 <212> PRT <213> Homo sapiens <220>
<223> H115S126delinsSFGRGDIRNV/G237V <4 Ο Ο > 268
Ala Asn Ala Phe Leu Glu Glu Leu Arg Pro Gly Ser Leu Glu Arg Glu 15 10 15
Cys Lys Glu Glu Gin Cys Ser Phe Glu Glu Ala Arg Glu lie Phe Lys 20 25 30
Asp Ala Glu Arg Thr Lys Leu Phe Trp lie Ser Tyr Ser Asp Gly Asp 35 40 45
Gin Cys Ala Ser Ser Pro Cys Gin Asn Gly Gly Ser Cys Lys Asp Gin 50 55 60
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Cys Glu Thr His Lys Asp Asp Gin Leu lie Cys Val Asn Glu Asn Gly 85 90 95
Gly Cys Glu Gin Tyr Cys Ser Asp His Thr Gly Thr Lys Arg Ser Cys 100 105 110
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Gly Ala Thr Ala Leu Glu Leu Met Val Leu Asn Val Pro Arg Leu Met 290 295 300
Thr Gin Asp Cys Leu Gin Gin Ser Arg Lys Val Gly Asp Ser Pro Asn 305 310 315 320 lie Thr Glu Tyr Met Phe Cys Ala Gly Tyr Ser Asp Gly Ser Lys Asp 325 330 335
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Ala Asn Ala Phe Leu Glu Glu Leu Arg Pro Gly Ser Leu Glu Arg Glu 15 10 15
Cys Lys Glu Glu Gin Cys Ser Phe Glu Glu Ala Arg Glu lie Phe Lys 20 25 30
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Gly Ala Gin Leu Cys Gly Gly Thr Leu lie Asn Thr lie Trp Val Val 180 185 190
Ser Ala Ala His Cys Phe Asp Lys lie Lys Asn Trp Arg Asn Leu lie 195 200 205
Ala Val Leu Gly Glu His Asp Leu Ser Glu His Asp Gly Asp Glu Gin 210 215 220
Ser Arg Arg Val Ala Gin Val lie lie Pro Ser Thr Tyr Val Pro Val 225 230 235 240
Thr Thr Asn His Asp lie Ala Leu Leu Arg Leu His Gin Pro Val Val 245 250 255
Leu Thr Asp His Val Val Pro Leu Cys Leu Pro Glu Arg Thr Phe Ser 260 265 270
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Leu Arg Ala Pro Phe Pro 405
<210> 271 <211> 406 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> S119N/L121S/A175S <400> 271
Ala Asn Ala Phe Leu Glu Glu Leu Arg Pro Gly Ser Leu Glu Arg Glu 15 10 15
Cys Lys Glu Glu Gin Cys Ser Phe Glu Glu Ala Arg Glu lie Phe Lys 20 25 30
Asp Ala Glu Arg Thr Lys Leu Phe Trp lie Ser Tyr Ser Asp Gly Asp 35 40 45
Gin Cys Ala Ser Ser Pro Cys Gin Asn Gly Gly Ser Cys Lys Asp Gin 50 55 60
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Lys Gly Glu Cys Pro Trp Gin Val Leu Leu Leu Val Asn Gly Ser Gin 165 170 175
Leu Cys Gly Gly Thr Leu lie Asn Thr lie Trp Val Val Ser Ala Ala 180 185 190
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Gly Glu His Asp Leu Ser Glu His Asp Gly Asp Glu Gin Ser Arg Arg 210 215 220
Vai Ala Gin Val lie lie Pro Ser Thr Tyr Val Pro Gly Thr Thr Asn 225 230 235 240
His Asp lie Ala Leu Leu Arg Leu His Gin Pro Val Val Leu Thr Asp 245 250 255
His Val Val Pro Leu Cys Leu Pro Glu Arg Thr Phe Ser Glu Arg Thr 260 265 270
Leu Ala Phe Val Arg Phe Ser Leu Val Ser Gly Trp Gly Gin Leu Leu 275 280 285
Asp Arg Gly Ala Thr Ala Leu Glu Leu Met Val Leu Asn Val Pro Arg 290 295 300
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Leu Arg Ala Pro Phe Pro 405
<210> 272 <211> 406 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> T128N/P129A/A175S <400> 272
Ala Asn Ala Phe Leu Glu Glu Leu Arg Pro Gly Ser Leu Glu Arg Glu 15 10 15
Cys Lys Glu Glu Gin Cys Ser Phe Glu Glu Ala Arg Glu lie Phe Lys 20 25 30
Asp Ala Glu Arg Thr Lys Leu Phe Trp lie Ser Tyr Ser Asp Gly Asp 35 40 45
Gin Cys Ala Ser Ser Pro Cys Gin Asn Gly Gly Ser Cys Lys Asp Gin 50 55 60
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Cys Glu Thr His Lys Asp Asp Gin Leu lie Cys Val Asn Glu Asn Gly 85 90 95
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Asn Ala Ser Lys Pro Gin Gly Arg lie Val Gly Gly Lys Val Cys Pro 145 150 155 160
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Leu Cys Gly Gly Thr Leu lie Asn Thr lie Trp Val Val Ser Ala Ala 180 185 190
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His Asp lie Ala Leu Leu Arg Leu His Gin Pro Val Val Leu Thr Asp 245 250 255
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Leu Ala Phe Val Arg Phe Ser Leu Val Ser Gly Trp Gly Gin Leu Leu 275 280 285
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Leu Leu Arg Ala Pro Phe Pro 405
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Leu Cys Gly Gly Thr Leu lie Asn Thr lie Trp Val Val Ser Ala Ala 180 185 190
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Gly Glu His Asp Leu Ser Glu His Asp Gly Asp Glu Gin Ser Arg Arg 210 215 220
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Leu Arg Ala Pro Phe Pro 405
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Gin Cys Ala Ser Ser Pro Cys Gin Asn Gly Gly Ser Cys Lys Asp Gin 50 55 60
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Ala Asn Ala Phe Leu Glu Glu Leu Arg Pro Gly Ser Leu Glu Arg Glu 15 10 15
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Leu Cys Gly Gly Thr Leu lie Asn Thr lie Trp Val Val Ser Ala Ala 180 185 190
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Gly Glu His Asp Leu Ser Glu His Asp Gly Asp Glu Gin Ala Arg Arg 210 215 220
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Ala Val Val Pro Leu Cys Leu Pro Glu Arg Thr Phe Ser Glu Arg Thr 260 265 270
Leu Ala Phe Val Arg Phe Ser Leu Val Ser Gly Trp Gly Arg Leu Leu 275 280 285
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<223> T128N/P129A/Q286R/M298Q/H373F <4 Ο Ο > 288
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Leu Ala Phe Val Arg Phe Ser Leu Val Ser Gly Trp Gly Arg Leu Leu 275 280 285
Asp Arg Gly Ala Thr Ala Leu Glu Leu Gin Val Leu Asn Val Pro Arg 290 295 300
Leu Met Thr Gin Asp Cys Leu Gin Gin Ser Arg Lys Val Gly Asp Ser 305 310 315 320
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Ala Thr Val Gly Phe Phe Gly Val Tyr Thr Arg Val Ser Gin Tyr lie 370 375 380
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Leu Arg Ala Pro Phe Pro 405
<210> 289 <211> 406 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> S52A/S60A/V158D/E296V/M298Q <400> 289
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Leu Arg Ala Pro Phe Pro 405
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Ala Asn Ala Phe Leu Glu Glu Leu Arg Pro Gly Ser Leu Glu Arg Glu 15 10 15
Cys Lys Glu Glu Gin Cys Ser Phe Glu Glu Ala Arg Glu lie Phe Lys 20 25 30
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Leu Cys Gly Gly Thr Leu He Asn Thr He Trp Val Val Ser Ala Ala 180 185 190
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Gly Glu His Asp Leu Ser Glu His Asp Gly Asp Glu Gin Ser Arg Arg 210 215 220
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Leu Ala Phe Val Arg Phe Ser Leu Val Ser Gly Trp Gly Arg Leu Leu 275 280 285
Asp Arg Gly Ala Thr Ala Leu Glu Leu Met Val Leu Asn Val Pro Arg 290 295 300
Leu Met Thr Gin Asp Cys Leu Gin Gin Ser Arg Lys Val Gly Asp Ser 305 310 315 320
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Lys Asp Ser Cys Lys Gly Asp Ser Gly Gly Pro His Ala Thr His Tyr 340 345 350
Arg Gly Thr Trp Tyr Leu Thr Gly lie Val Ser Trp Gly Gin Gly Cys 355 360 365
Ala Thr Val Gly His Phe Gly Val Tyr Thr Arg Val Ser Gin Tyr lie 370 375 380
Glu Trp Leu Gin Lys Leu Met Arg Ser Glu Pro Arg Pro Gly Val Leu 385 390 395 400
Leu Arg Ala Pro Phe Pro 405
<210> 291 <211> 406 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> S52A/S60A/S222A <400> 291
Ala Asn Ala Phe Leu Glu Glu Leu Arg Pro Gly Ser Leu Glu Arg Glu 15 10 15
Cys Lys Glu Glu Gin Cys Ser Phe Glu Glu Ala Arg Glu lie Phe Lys 20 25 30
Asp Ala Glu Arg Thr Lys Leu Phe Trp lie Ser Tyr Ser Asp Gly Asp 35 40 45
Gin Cys Ala Ala Ser Pro Cys Gin Asn Gly Gly Ala Cys Lys Asp Gin 50 55 60
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Lys Gly Glu Cys Pro Trp Gin Val Leu Leu Leu Val Asn Gly Ala Gin 165 170 175
Leu Cys Gly Gly Thr Leu lie Asn Thr lie Trp Val Val Ser Ala Ala 180 185 190
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Gly Glu His Asp Leu Ser Glu His Asp Gly Asp Glu Gin Ala Arg Arg 210 215 220
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His Asp lie Ala Leu Leu Arg Leu His Gin Pro Val Val Leu Thr Asp 245 250 255
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Asp Arg Gly Ala Thr Ala Leu Glu Leu Met Val Leu Asn Val Pro Arg 290 295 300
Leu Met Thr Gin Asp Cys Leu Gin Gin Ser Arg Lys Val Gly Asp Ser 305 310 315 320
Pro Asn lie Thr Glu Tyr Met Phe Cys Ala Gly Tyr Ser Asp Gly Ser 325 330 335
Lys Asp Ser Cys Lys Gly Asp Ser Gly Gly Pro His Ala Thr His Tyr 340 345 350
Arg Gly Thr Trp Tyr Leu Thr Gly lie Val Ser Trp Gly Gin Gly Cys 355 360 365
Ala Thr Val Gly His Phe Gly Val Tyr Thr Arg Val Ser Gin Tyr lie 370 375 380
Glu Trp Leu Gin Lys Leu Met Arg Ser Glu Pro Arg Pro Gly Val Leu 385 390 395 400
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Thr Leu Ala Phe Val Arg Phe Ser Leu Val Ser Gly Trp Gly Arg Leu 275 280 285
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Leu Ala Phe Val Arg Phe Ser Leu Val Ser Gly Trp Gly Arg Leu Leu 275 280 285
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Leu Met Thr Gin Asp Cys Leu Gin Gin Ser Arg Lys Val Gly Asp Ser 305 310 315 320
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Leu Leu Arg Ala Pro Phe Pro 405
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Leu Cys Gly Gly Thr Leu lie Asn Thr lie Trp Val Val Ser Ala Ala 180 185 190
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Leu Arg Ala Pro Phe Pro 405
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His Val Val Pro Leu Cys Leu Pro Glu Arg Thr Phe Ser Glu Arg Thr 260 265 270
Leu Ala Phe Val Arg Phe Ser Leu Val Ser Gly Trp Gly Arg Leu Leu 275 280 285
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His Asp lie Ala Leu Leu Arg Leu His Gin Pro Val Val Leu Thr Asp 245 250 255
His Val Val Pro Leu Cys Leu Pro Glu Arg Thr Phe Ser Glu Arg Thr 260 265 270
Leu Ala Phe Val Arg Phe Ser Leu Val Ser Gly Trp Gly Gin Leu Leu 275 280 285
Asp Arg Gly Ala Thr Ala Leu Glu Leu Met Val Leu Asn Val Pro Arg 290 295 300
Leu Met Thr Gin Asp Cys Leu Gin Gin Ser Arg Lys Val Gly Asp Ser 305 310 315 320
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Arg Gly Thr Trp Tyr Leu Thr Gly lie Val Ser Trp Gly Gin Gly Cys 355 360 365
Ala Thr Val Gly His Phe Gly Val Tyr Thr Arg Val Ser Gin Tyr lie 370 375 380
Glu Trp Leu Gin Lys Leu Met Arg Ser Glu Pro Arg Pro Gly Val Leu 385 390 395 400
Leu Arg Ala Pro Phe Pro 405
<210> 301 <211> 407 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> GlaSwapFIX/S222A/T2 39V/Q2 86R <400> 301
Tyr Asn Ser Gly Lys Leu Glu Glu Phe Val Gin Gly Asn Leu Glu Arg 15 10 15
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Gin Leu Cys Gly Gly Thr Leu Ile Asn Thr Ile Trp Vai Vai Ser Ala 180 185 190
Ala His Cys Phe Asp Lys Ile Lys Asn Trp Arg Asn Leu Ile Ala Vai 195 200 205
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Arg Vai Ala Gin Vai lie lie Pro Ser Thr Tyr Vai Pro Gly Thr Vai 225 230 235 240
Asn His Asp lie Ala Leu Leu Arg Leu His Gin Pro Vai Vai Leu Thr 245 250 255
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Thr Leu Ala Phe Vai Arg Phe Ser Leu Vai Ser Gly Trp Gly Arg Leu 275 280 285
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Ser Lys Asp Ser Cys Lys Gly Asp Ser Gly Gly Pro His Ala Thr His 340 345 350
Tyr Arg Gly Thr Trp Tyr Leu Thr Gly Ile Vai Ser Trp Gly Gin Gly 355 360 365
Cys Ala Thr Vai Gly His Phe Gly Vai Tyr Thr Arg Vai Ser Gin Tyr 370 375 380 lie Glu Trp Leu Gin Lys Leu Met Arg Ser Glu Pro Arg Pro Gly Vai 385 390 395 400
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Leu Cys Gly Gly Thr Leu lie Asn Thr lie Trp Val Val Ser Ala Ala 180 185 190
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Gly Glu His Asp Leu Ser Glu His Asp Gly Asp Glu Gin Ser Arg Arg 210 215 220
Val Ala Gin Val lie lie Pro Ser Thr Tyr Val Pro Gly Thr Val Asn 225 230 235 240
His Asp lie Ala Leu Leu Arg Leu His Gin Pro Val Val Leu Thr Asp 245 250 255
His Val Val Pro Leu Cys Leu Pro Glu Arg Thr Phe Ser Glu Arg Thr 260 265 270
Leu Ala Phe Val Arg Phe Ser Leu Val Ser Gly Trp Gly Arg Leu Leu 275 280 285
Asp Arg Gly Ala Thr Ala Leu Glu Leu Gin Val Leu Asn Val Pro Arg 290 295 300
Leu Met Thr Gin Asp Cys Leu Gin Gin Ser Arg Lys Val Gly Asp Ser 305 310 315 320
Pro Asn lie Thr Glu Tyr Met Phe Cys Ala Gly Tyr Ser Asp Gly Ser 325 330 335
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Leu Cys Gly Gly Thr Leu lie Asn Thr lie Trp Val Val Ser Ala Ala 180 185 190
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Leu Ala Phe Val Arg Phe Ser Leu Val Ser Gly Trp Gly Arg Leu Leu 275 280 285
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Leu Gly Glu His Asp Leu Ser Glu His Asp Gly Asp Glu Gin Ser Arg 210 215 220
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Leu Leu Arg Ala Pro Phe Pro 405
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Leu Cys Gly Gly Thr Leu lie Asn Thr lie Trp Val Val Ser Ala Ala 180 185 190
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Leu Ala Phe Val Arg Phe Ser Leu Val Ser Gly Trp Gly Arg Leu Leu 275 280 285
Asp Arg Gly Ala Thr Ala Leu Glu Leu Gin Val Leu Asn Val Pro Arg 290 295 300
Leu Met Thr Gin Asp Cys Leu Gin Gin Ser Arg Lys Val Gly Asp Ser 305 310 315 320
Pro Asn lie Thr Glu Tyr Met Phe Cys Ala Gly Tyr Ser Asp Gly Ser 325 330 335
Lys Asp Ser Cys Lys Gly Asp Ser Gly Gly Pro His Ala Thr His Tyr 340 345 350
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Ala Thr Val Gly Phe Phe Gly Val Tyr Thr Arg Val Ser Gin Tyr lie 370 375 380
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Leu Arg Ala Pro Phe Pro 405
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Gin Leu Cys Gly Gly Thr Leu lie Asn Thr lie Trp Val Val Ser Ala 180 185 190
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Leu Gly Glu His Asp Leu Ser Glu His Asp Gly Asp Glu Gin Ala Arg 210 215 220
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Leu Leu Arg Ala Pro Phe Pro 405
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Leu Ala Phe Val Arg Phe Ser Leu Val Ser Gly Trp Gly Arg Leu Leu 275 280 285
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Leu Arg Ala Pro Phe Pro 405
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Leu Ala Phe Val Arg Phe Ser Leu Val Ser Gly Trp Gly Gin Leu Leu 275 280 285
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Leu Met Thr Gin Asp Cys Leu Gin Gin Ser Arg Lys Val Gly Asp Ser 305 310 315 320
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Leu Arg Ala Pro Phe Pro 405
<210> 350 <211> 406 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> T106N/V253N <400> 350
Ala Asn Ala Phe Leu Glu Glu Leu Arg Pro Gly Ser Leu Glu Arg Glu 15 10 15
Cys Lys Glu Glu Gin Cys Ser Phe Glu Glu Ala Arg Glu lie Phe Lys 20 25 30
Asp Ala Glu Arg Thr Lys Leu Phe Trp lie Ser Tyr Ser Asp Gly Asp 35 40 45
Gin Cys Ala Ser Ser Pro Cys Gin Asn Gly Gly Ser Cys Lys Asp Gin 50 55 60
Leu Gin Ser Tyr lie Cys Phe Cys Leu Pro Ala Phe Glu Gly Arg Asn 65 70 75 80
Cys Glu Thr His Lys Asp Asp Gin Leu lie Cys Val Asn Glu Asn Gly 85 90 95
Gly Cys Glu Gin Tyr Cys Ser Asp His Asn Gly Thr Lys Arg Ser Cys 100 105 110
Arg Cys His Glu Gly Tyr Ser Leu Leu Ala Asp Gly Val Ser Cys Thr 115 120 125
Pro Thr Val Glu Tyr Pro Cys Gly Lys lie Pro lie Leu Glu Lys Arg 130 135 140
Asn Ala Ser Lys Pro Gin Gly Arg lie Val Gly Gly Lys Val Cys Pro 145 150 155 160
Lys Gly Glu Cys Pro Trp Gin Val Leu Leu Leu Val Asn Gly Ala Gin 165 170 175
Leu Cys Gly Gly Thr Leu lie Asn Thr lie Trp Val Val Ser Ala Ala 180 185 190
His Cys Phe Asp Lys lie Lys Asn Trp Arg Asn Leu lie Ala Val Leu 195 200 205
Gly Glu His Asp Leu Ser Glu His Asp Gly Asp Glu Gin Ser Arg Arg 210 215 220
Val Ala Gin Val lie lie Pro Ser Thr Tyr Val Pro Gly Thr Thr Asn 225 230 235 240
His Asp lie Ala Leu Leu Arg Leu His Gin Pro Val Asn Leu Thr Asp 245 250 255
His Val Val Pro Leu Cys Leu Pro Glu Arg Thr Phe Ser Glu Arg Thr 260 265 270
Leu Ala Phe Val Arg Phe Ser Leu Val Ser Gly Trp Gly Gin Leu Leu 275 280 285
Asp Arg Gly Ala Thr Ala Leu Glu Leu Met Val Leu Asn Val Pro Arg 290 295 300
Leu Met Thr Gin Asp Cys Leu Gin Gin Ser Arg Lys Val Gly Asp Ser 305 310 315 320
Pro Asn lie Thr Glu Tyr Met Phe Cys Ala Gly Tyr Ser Asp Gly Ser 325 330 335
Lys Asp Ser Cys Lys Gly Asp Ser Gly Gly Pro His Ala Thr His Tyr 340 345 350
Arg Gly Thr Trp Tyr Leu Thr Gly lie Val Ser Trp Gly Gin Gly Cys 355 360 365
Ala Thr Val Gly His Phe Gly Val Tyr Thr Arg Val Ser Gin Tyr lie 370 375 380
Glu Trp Leu Gin Lys Leu Met Arg Ser Glu Pro Arg Pro Gly Val Leu 385 390 395 400
Leu Arg Ala Pro Phe Pro 405
<210> 351 <211> 406 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> K143N/N145T <400> 351
Ala Asn Ala Phe Leu Glu Glu Leu Arg Pro Gly Ser Leu Glu Arg Glu 15 10 15
Cys Lys Glu Glu Gin Cys Ser Phe Glu Glu Ala Arg Glu lie Phe Lys 20 25 30
Asp Ala Glu Arg Thr Lys Leu Phe Trp lie Ser Tyr Ser Asp Gly Asp 35 40 45
Gin Cys Ala Ser Ser Pro Cys Gin Asn Gly Gly Ser Cys Lys Asp Gin 50 55 60
Leu Gin Ser Tyr lie Cys Phe Cys Leu Pro Ala Phe Glu Gly Arg Asn 65 70 75 80
Cys Glu Thr His Lys Asp Asp Gin Leu lie Cys Val Asn Glu Asn Gly 85 90 95
Gly Cys Glu Gin Tyr Cys Ser Asp His Thr Gly Thr Lys Arg Ser Cys 100 105 110
Arg Cys His Glu Gly Tyr Ser Leu Leu Ala Asp Gly Val Ser Cys Thr 115 120 125
Pro Thr Val Glu Tyr Pro Cys Gly Lys lie Pro lie Leu Glu Asn Arg 130 135 140
Thr Ala Ser Lys Pro Gin Gly Arg lie Val Gly Gly Lys Val Cys Pro 145 150 155 160
Lys Gly Glu Cys Pro Trp Gin Val Leu Leu Leu Val Asn Gly Ala Gin 165 170 175
Leu Cys Gly Gly Thr Leu lie Asn Thr lie Trp Val Val Ser Ala Ala 180 185 190
His Cys Phe Asp Lys lie Lys Asn Trp Arg Asn Leu lie Ala Val Leu 195 200 205
Gly Glu His Asp Leu Ser Glu His Asp Gly Asp Glu Gin Ser Arg Arg 210 215 220
Val Ala Gin Val lie lie Pro Ser Thr Tyr Val Pro Gly Thr Thr Asn 225 230 235 240
His Asp lie Ala Leu Leu Arg Leu His Gin Pro Val Val Leu Thr Asp 245 250 255
His Val Val Pro Leu Cys Leu Pro Glu Arg Thr Phe Ser Glu Arg Thr 260 265 270
Leu Ala Phe Val Arg Phe Ser Leu Val Ser Gly Trp Gly Gin Leu Leu 275 280 285
Asp Arg Gly Ala Thr Ala Leu Glu Leu Met Val Leu Asn Val Pro Arg 290 295 300
Leu Met Thr Gin Asp Cys Leu Gin Gin Ser Arg Lys Val Gly Asp Ser 305 310 315 320
Pro Asn lie Thr Glu Tyr Met Phe Cys Ala Gly Tyr Ser Asp Gly Ser 325 330 335
Lys Asp Ser Cys Lys Gly Asp Ser Gly Gly Pro His Ala Thr His Tyr 340 345 350
Arg Gly Thr Trp Tyr Leu Thr Gly lie Val Ser Trp Gly Gin Gly Cys 355 360 365
Ala Thr Val Gly His Phe Gly Val Tyr Thr Arg Val Ser Gin Tyr lie 370 375 380
Glu Trp Leu Gin Lys Leu Met Arg Ser Glu Pro Arg Pro Gly Val Leu 385 390 395 400
Leu Arg Ala Pro Phe Pro 405
<210> 352 <211> 406 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> R315N/V317T <400> 352
Ala Asn Ala Phe Leu Glu Glu Leu Arg Pro Gly Ser Leu Glu Arg Glu 15 10 15
Cys Lys Glu Glu Gin Cys Ser Phe Glu Glu Ala Arg Glu lie Phe Lys 20 25 30
Asp Ala Glu Arg Thr Lys Leu Phe Trp lie Ser Tyr Ser Asp Gly Asp 35 40 45
Gin Cys Ala Ser Ser Pro Cys Gin Asn Gly Gly Ser Cys Lys Asp Gin 50 55 60
Leu Gin Ser Tyr lie Cys Phe Cys Leu Pro Ala Phe Glu Gly Arg Asn 65 70 75 80
Cys Glu Thr His Lys Asp Asp Gin Leu lie Cys Val Asn Glu Asn Gly 85 90 95
Gly Cys Glu Gin Tyr Cys Ser Asp His Thr Gly Thr Lys Arg Ser Cys 100 105 110
Arg Cys His Glu Gly Tyr Ser Leu Leu Ala Asp Gly Val Ser Cys Thr 115 120 125
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Lys Gly Glu Cys Pro Trp Gin Val Leu Leu Leu Val Asn Gly Ala Gin 165 170 175
Leu Cys Gly Gly Thr Leu lie Asn Thr lie Trp Val Val Ser Ala Ala 180 185 190
His Cys Phe Asp Lys lie Lys Asn Trp Arg Asn Leu lie Ala Val Leu 195 200 205
Gly Glu His Asp Leu Ser Glu His Asp Gly Asp Glu Gin Ser Arg Arg 210 215 220
Val Ala Gin Val lie lie Pro Ser Thr Tyr Val Pro Gly Thr Thr Asn 225 230 235 240
His Asp lie Ala Leu Leu Arg Leu His Gin Pro Val Val Leu Thr Asp 245 250 255
His Val Val Pro Leu Cys Leu Pro Glu Arg Thr Phe Ser Glu Arg Thr 260 265 270
Leu Ala Phe Val Arg Phe Ser Leu Val Ser Gly Trp Gly Gin Leu Leu 275 280 285
Asp Arg Gly Ala Thr Ala Leu Glu Leu Met Val Leu Asn Val Pro Arg 290 295 300
Leu Met Thr Gin Asp Cys Leu Gin Gin Ser Asn Lys Thr Gly Asp Ser 305 310 315 320
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Leu Arg Ala Pro Phe Pro 405
<210> 353 <211> 406 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> K143N/N145T/R315N/V317T <400> 353
Ala Asn Ala Phe Leu Glu Glu Leu Arg Pro Gly Ser Leu Glu Arg Glu 15 10 15
Cys Lys Glu Glu Gin Cys Ser Phe Glu Glu Ala Arg Glu lie Phe Lys 20 25 30
Asp Ala Glu Arg Thr Lys Leu Phe Trp lie Ser Tyr Ser Asp Gly Asp 35 40 45
Gin Cys Ala Ser Ser Pro Cys Gin Asn Gly Gly Ser Cys Lys Asp Gin 50 55 60
Leu Gin Ser Tyr lie Cys Phe Cys Leu Pro Ala Phe Glu Gly Arg Asn 65 70 75 80
Cys Glu Thr His Lys Asp Asp Gin Leu lie Cys Val Asn Glu Asn Gly 85 90 95
Gly Cys Glu Gin Tyr Cys Ser Asp His Thr Gly Thr Lys Arg Ser Cys 100 105 110
Arg Cys His Glu Gly Tyr Ser Leu Leu Ala Asp Gly Val Ser Cys Thr 115 120 125
Pro Thr Val Glu Tyr Pro Cys Gly Lys lie Pro lie Leu Glu Asn Arg 130 135 140
Thr Ala Ser Lys Pro Gin Gly Arg lie Val Gly Gly Lys Val Cys Pro 145 150 155 160
Lys Gly Glu Cys Pro Trp Gin Val Leu Leu Leu Val Asn Gly Ala Gin 165 170 175
Leu Cys Gly Gly Thr Leu lie Asn Thr lie Trp Val Val Ser Ala Ala 180 185 190
His Cys Phe Asp Lys lie Lys Asn Trp Arg Asn Leu lie Ala Val Leu 195 200 205
Gly Glu His Asp Leu Ser Glu His Asp Gly Asp Glu Gin Ser Arg Arg 210 215 220
Val Ala Gin Val lie lie Pro Ser Thr Tyr Val Pro Gly Thr Thr Asn 225 230 235 240
His Asp lie Ala Leu Leu Arg Leu His Gin Pro Val Val Leu Thr Asp 245 250 255
His Val Val Pro Leu Cys Leu Pro Glu Arg Thr Phe Ser Glu Arg Thr 260 265 270
Leu Ala Phe Val Arg Phe Ser Leu Val Ser Gly Trp Gly Gin Leu Leu 275 280 285
Asp Arg Gly Ala Thr Ala Leu Glu Leu Met Val Leu Asn Val Pro Arg 290 295 300
Leu Met Thr Gin Asp Cys Leu Gin Gin Ser Arg Lys Val Gly Asp Ser 305 310 315 320
Pro Asn lie Thr Glu Tyr Met Phe Cys Ala Gly Tyr Ser Asp Gly Ser 325 330 335
Lys Asp Ser Cys Lys Gly Asp Ser Gly Gly Pro His Ala Thr His Tyr 340 345 350
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Glu Trp Leu Gin Lys Leu Met Arg Ser Glu Pro Arg Pro Gly Val Leu 385 390 395 400
Leu Arg Ala Pro Phe Pro 405
<210> 354 <211> 406 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> T128N/P129A/M298Q <400> 354
Ala Asn Ala Phe Leu Glu Glu Leu Arg Pro Gly Ser Leu Glu Arg Glu 15 10 15
Cys Lys Glu Glu Gin Cys Ser Phe Glu Glu Ala Arg Glu lie Phe Lys 20 25 30
Asp Ala Glu Arg Thr Lys Leu Phe Trp lie Ser Tyr Ser Asp Gly Asp 35 40 45
Gin Cys Ala Ser Ser Pro Cys Gin Asn Gly Gly Ser Cys Lys Asp Gin 50 55 60
Leu Gin Ser Tyr lie Cys Phe Cys Leu Pro Ala Phe Glu Gly Arg Asn 65 70 75 80
Cys Glu Thr His Lys Asp Asp Gin Leu lie Cys Val Asn Glu Asn Gly 85 90 95
Gly Cys Glu Gin Tyr Cys Ser Asp His Thr Gly Thr Lys Arg Ser Cys 100 105 110
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Asn Ala Ser Lys Pro Gin Gly Arg lie Val Gly Gly Lys Val Cys Pro 145 150 155 160
Lys Gly Glu Cys Pro Trp Gin Val Leu Leu Leu Val Asn Gly Ala Gin 165 170 175
Leu Cys Gly Gly Thr Leu lie Asn Thr lie Trp Val Val Ser Ala Ala 180 185 190
His Cys Phe Asp Lys lie Lys Asn Trp Arg Asn Leu lie Ala Val Leu 195 200 205
Gly Glu His Asp Leu Ser Glu His Asp Gly Asp Glu Gin Ser Arg Arg 210 215 220
Val Ala Gin Val lie lie Pro Ser Thr Tyr Val Pro Gly Thr Thr Asn 225 230 235 240
His Asp lie Ala Leu Leu Arg Leu His Gin Pro Val Val Leu Thr Asp 245 250 255
His Val Val Pro Leu Cys Leu Pro Glu Arg Thr Phe Ser Glu Arg Thr 260 265 270
Leu Ala Phe Val Arg Phe Ser Leu Val Ser Gly Trp Gly Gin Leu Leu 275 280 285
Asp Arg Gly Ala Thr Ala Leu Glu Leu Gin Val Leu Asn Val Pro Arg 290 295 300
Leu Met Thr Gin Asp Cys Leu Gin Gin Ser Arg Lys Val Gly Asp Ser 305 310 315 320
Pro Asn lie Thr Glu Tyr Met Phe Cys Ala Gly Tyr Ser Asp Gly Ser 325 330 335
Lys Asp Ser Cys Lys Gly Asp Ser Gly Gly Pro His Ala Thr His Tyr 340 345 350
Arg Gly Thr Trp Tyr Leu Thr Gly lie Val Ser Trp Gly Gin Gly Cys 355 360 365
Ala Thr Val Gly His Phe Gly Val Tyr Thr Arg Val Ser Gin Tyr lie 370 375 380
Glu Trp Leu Gin Lys Leu Met Arg Ser Glu Pro Arg Pro Gly Val Leu 385 390 395 400
Leu Arg Ala Pro Phe Pro 405
<210> 355 <211> 407 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> {Gla Swap FIX /K43I}/T128N/P129A/Q286R/M298Q <400> 355
Tyr Asn Ser Gly Lys Leu Glu Glu Phe Val Gin Gly Asn Leu Glu Arg 15 10 15
Glu Cys Met Glu Glu Lys Cys Ser Phe Glu Glu Ala Arg Glu Vai Phe 20 25 30
Glu Asn Thr Glu Arg Thr Thr Glu Phe Trp Ile Gin Tyr Ser Asp Gly 35 40 45
Asp Gin Cys Ala Ser Ser Pro Cys Gin Asn Gly Gly Ser Cys Lys Asp 50 55 60
Gin Leu Gin Ser Tyr lie Cys Phe Cys Leu Pro Ala Phe Glu Gly Arg 65 70 75 80
Asn Cys Glu Thr His Lys Asp Asp Gin Leu Ile Cys Vai Asn Glu Asn 85 90 95
Gly Gly Cys Glu Gin Tyr Cys Ser Asp His Thr Gly Thr Lys Arg Ser 100 105 110
Cys Arg Cys His Glu Gly Tyr Ser Leu Leu Ala Asp Gly Vai Ser Cys 115 120 125
Asn Ala Thr Vai Glu Tyr Pro Cys Gly Lys lie Pro lie Leu Glu Lys 130 135 140
Arg Asn Ala Ser Lys Pro Gin Gly Arg Ile Vai Gly Gly Lys Vai Cys 145 150 155 160
Pro Lys Gly Glu Cys Pro Trp Gin Vai Leu Leu Leu Vai Asn Gly Ala 165 170 175
Gin Leu Cys Gly Gly Thr Leu Ile Asn Thr Ile Trp Vai Vai Ser Ala 180 185 190
Ala His Cys Phe Asp Lys Ile Lys Asn Trp Arg Asn Leu Ile Ala Vai 195 200 205
Leu Gly Glu His Asp Leu Ser Glu His Asp Gly Asp Glu Gin Ser Arg 210 215 220
Arg Vai Ala Gin Vai lie lie Pro Ser Thr Tyr Vai Pro Gly Thr Thr 225 230 235 240
Asn His Asp lie Ala Leu Leu Arg Leu His Gin Pro Vai Vai Leu Thr 245 250 255
Asp His Vai Vai Pro Leu Cys Leu Pro Glu Arg Thr Phe Ser Glu Arg 260 265 270
Thr Leu Ala Phe Vai Arg Phe Ser Leu Vai Ser Gly Trp Gly Arg Leu 275 280 285
Leu Asp Arg Gly Ala Thr Ala Leu Glu Leu Gin Vai Leu Asn Vai Pro 290 295 300
Arg Leu Met Thr Gin Asp Cys Leu Gin Gin Ser Arg Lys Vai Gly Asp 305 310 315 320
Ser Pro Asn lie Thr Glu Tyr Met Phe Cys Ala Gly Tyr Ser Asp Gly 325 330 335
Ser Lys Asp Ser Cys Lys Gly Asp Ser Gly Gly Pro His Ala Thr His 340 345 350
Tyr Arg Gly Thr Trp Tyr Leu Thr Gly Ile Vai Ser Trp Gly Gin Gly 355 360 365
Cys Ala Thr Vai Gly His Phe Gly Vai Tyr Thr Arg Vai Ser Gin Tyr 370 375 380 lie Glu Trp Leu Gin Lys Leu Met Arg Ser Glu Pro Arg Pro Gly Vai 385 390 395 400
Leu Leu Arg Ala Pro Phe Pro 405
<210> 356 <211> 406 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> T128N/P129A/Q286R/M298Q/Q366N <400> 356
Ala Asn Ala Phe Leu Glu Glu Leu Arg Pro Gly Ser Leu Glu Arg Glu 15 10 15
Cys Lys Glu Glu Gin Cys Ser Phe Glu Glu Ala Arg Glu lie Phe Lys 20 25 30
Asp Ala Glu Arg Thr Lys Leu Phe Trp lie Ser Tyr Ser Asp Gly Asp 35 40 45
Gin Cys Ala Ser Ser Pro Cys Gin Asn Gly Gly Ser Cys Lys Asp Gin 50 55 60
Leu Gin Ser Tyr lie Cys Phe Cys Leu Pro Ala Phe Glu Gly Arg Asn 65 70 75 80
Cys Glu Thr His Lys Asp Asp Gin Leu lie Cys Val Asn Glu Asn Gly 85 90 95
Gly Cys Glu Gin Tyr Cys Ser Asp His Thr Gly Thr Lys Arg Ser Cys 100 105 110
Arg Cys His Glu Gly Tyr Ser Leu Leu Ala Asp Gly Val Ser Cys Asn 115 120 125
Ala Thr Val Glu Tyr Pro Cys Gly Lys lie Pro lie Leu Glu Lys Arg 130 135 140
Asn Ala Ser Lys Pro Gin Gly Arg lie Val Gly Gly Lys Val Cys Pro 145 150 155 160
Lys Gly Glu Cys Pro Trp Gin Val Leu Leu Leu Val Asn Gly Ala Gin 165 170 175
Leu Cys Gly Gly Thr Leu lie Asn Thr lie Trp Val Val Ser Ala Ala 180 185 190
His Cys Phe Asp Lys lie Lys Asn Trp Arg Asn Leu lie Ala Val Leu 195 200 205
Gly Glu His Asp Leu Ser Glu His Asp Gly Asp Glu Gin Ser Arg Arg 210 215 220
Val Ala Gin Val lie lie Pro Ser Thr Tyr Val Pro Gly Thr Thr Asn 225 230 235 240
His Asp lie Ala Leu Leu Arg Leu His Gin Pro Val Val Leu Thr Asp 245 250 255
His Val Val Pro Leu Cys Leu Pro Glu Arg Thr Phe Ser Glu Arg Thr 260 265 270
Leu Ala Phe Val Arg Phe Ser Leu Val Ser Gly Trp Gly Arg Leu Leu 275 280 285
Asp Arg Gly Ala Thr Ala Leu Glu Leu Gin Val Leu Asn Val Pro Arg 290 295 300
Leu Met Thr Gin Asp Cys Leu Gin Gin Ser Arg Lys Val Gly Asp Ser 305 310 315 320
Pro Asn lie Thr Glu Tyr Met Phe Cys Ala Gly Tyr Ser Asp Gly Ser 325 330 335
Lys Asp Ser Cys Lys Gly Asp Ser Gly Gly Pro His Ala Thr His Tyr 340 345 350
Arg Gly Thr Trp Tyr Leu Thr Gly lie Val Ser Trp Gly Asn Gly Cys 355 360 365
Ala Thr Val Gly His Phe Gly Val Tyr Thr Arg Val Ser Gin Tyr lie 370 375 380
Glu Trp Leu Gin Lys Leu Met Arg Ser Glu Pro Arg Pro Gly Val Leu 385 390 395 400
Leu Arg Ala Pro Phe Pro 405
<210> 357 <211> 407 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> {Gla Swap FIX /K43I}/Q286R/M298Q/Q366N <400> 357
Tyr Asn Ser Gly Lys Leu Glu Glu Phe Val Gin Gly Asn Leu Glu Arg 15 10 15
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Glu Asn Thr Glu Arg Thr Thr Glu Phe Trp lie Gin Tyr Ser Asp Gly 35 40 45
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Gin Leu Gin Ser Tyr lie Cys Phe Cys Leu Pro Ala Phe Glu Gly Arg 65 70 75 80
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Gly Gly Cys Glu Gin Tyr Cys Ser Asp His Thr Gly Thr Lys Arg Ser 100 105 110
Cys Arg Cys His Glu Gly Tyr Ser Leu Leu Ala Asp Gly Val Ser Cys 115 120 125
Thr Pro Thr Val Glu Tyr Pro Cys Gly Lys lie Pro lie Leu Glu Lys 130 135 140
Arg Asn Ala Ser Lys Pro Gin Gly Arg lie Val Gly Gly Lys Val Cys 145 150 155 160
Pro Lys Gly Glu Cys Pro Trp Gin Val Leu Leu Leu Val Asn Gly Ala 165 170 175
Gin Leu Cys Gly Gly Thr Leu lie Asn Thr lie Trp Val Val Ser Ala 180 185 190
Ala His Cys Phe Asp Lys lie Lys Asn Trp Arg Asn Leu lie Ala Val 195 200 205
Leu Gly Glu His Asp Leu Ser Glu His Asp Gly Asp Glu Gin Ser Arg 210 215 220
Arg Val Ala Gin Val lie lie Pro Ser Thr Tyr Val Pro Gly Thr Thr 225 230 235 240
Asn His Asp lie Ala Leu Leu Arg Leu His Gin Pro Val Val Leu Thr 245 250 255
Asp His Val Val Pro Leu Cys Leu Pro Glu Arg Thr Phe Ser Glu Arg 260 265 270
Thr Leu Ala Phe Val Arg Phe Ser Leu Val Ser Gly Trp Gly Arg Leu 275 280 285
Leu Asp Arg Gly Ala Thr Ala Leu Glu Leu Gin Val Leu Asn Val Pro 290 295 300
Arg Leu Met Thr Gin Asp Cys Leu Gin Gin Ser Arg Lys Val Gly Asp 305 310 315 320
Ser Pro Asn lie Thr Glu Tyr Met Phe Cys Ala Gly Tyr Ser Asp Gly 325 330 335
Ser Lys Asp Ser Cys Lys Gly Asp Ser Gly Gly Pro His Ala Thr His 340 345 350
Tyr Arg Gly Thr Trp Tyr Leu Thr Gly lie Val Ser Trp Gly Asn Gly 355 360 365
Cys Ala Thr Val Gly His Phe Gly Val Tyr Thr Arg Val Ser Gin Tyr 370 375 380 lie Glu Trp Leu Gin Lys Leu Met Arg Ser Glu Pro Arg Pro Gly Val 385 390 395 400
Leu Leu Arg Ala Pro Phe Pro 405
<210> 358 <211> 407 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> {Gla Swap FIX /K43I}/
T128N/P129A/Q286R/M298Q/Q366N <400> 358
Tyr Asn Ser Gly Lys Leu Glu Glu Phe Val Gin Gly Asn Leu Glu Arg 15 10 15
Glu Cys Met Glu Glu Lys Cys Ser Phe Glu Glu Ala Arg Glu Val Phe 20 25 30
Glu Asn Thr Glu Arg Thr Thr Glu Phe Trp lie Gin Tyr Ser Asp Gly 35 40 45
Asp Gin Cys Ala Ser Ser Pro Cys Gin Asn Gly Gly Ser Cys Lys Asp 50 55 60
Gin Leu Gin Ser Tyr lie Cys Phe Cys Leu Pro Ala Phe Glu Gly Arg 65 70 75 80
Asn Cys Glu Thr His Lys Asp Asp Gin Leu lie Cys Val Asn Glu Asn 85 90 95
Gly Gly Cys Glu Gin Tyr Cys Ser Asp His Thr Gly Thr Lys Arg Ser 100 105 110
Cys Arg Cys His Glu Gly Tyr Ser Leu Leu Ala Asp Gly Val Ser Cys 115 120 125
Asn Ala Thr Val Glu Tyr Pro Cys Gly Lys lie Pro lie Leu Glu Lys 130 135 140
Arg Asn Ala Ser Lys Pro Gin Gly Arg lie Val Gly Gly Lys Val Cys 145 150 155 160
Pro Lys Gly Glu Cys Pro Trp Gin Val Leu Leu Leu Val Asn Gly Ala 165 170 175
Gin Leu Cys Gly Gly Thr Leu lie Asn Thr lie Trp Val Val Ser Ala 180 185 190
Ala His Cys Phe Asp Lys lie Lys Asn Trp Arg Asn Leu lie Ala Val 195 200 205
Leu Gly Glu His Asp Leu Ser Glu His Asp Gly Asp Glu Gin Ser Arg 210 215 220
Arg Val Ala Gin Val lie lie Pro Ser Thr Tyr Val Pro Gly Thr Thr 225 230 235 240
Asn His Asp lie Ala Leu Leu Arg Leu His Gin Pro Val Val Leu Thr 245 250 255
Asp His Val Val Pro Leu Cys Leu Pro Glu Arg Thr Phe Ser Glu Arg 260 265 270
Thr Leu Ala Phe Val Arg Phe Ser Leu Val Ser Gly Trp Gly Arg Leu 275 280 285
Leu Asp Arg Gly Ala Thr Ala Leu Glu Leu Gin Val Leu Asn Val Pro 290 295 300
Arg Leu Met Thr Gin Asp Cys Leu Gin Gin Ser Arg Lys Val Gly Asp 305 310 315 320
Ser Pro Asn lie Thr Glu Tyr Met Phe Cys Ala Gly Tyr Ser Asp Gly 325 330 335
Ser Lys Asp Ser Cys Lys Gly Asp Ser Gly Gly Pro His Ala Thr His 340 345 350
Tyr Arg Gly Thr Trp Tyr Leu Thr Gly lie Val Ser Trp Gly Asn Gly 355 360 365
Cys Ala Thr Val Gly His Phe Gly Val Tyr Thr Arg Val Ser Gin Tyr 370 375 380 lie Glu Trp Leu Gin Lys Leu Met Arg Ser Glu Pro Arg Pro Gly Val 385 390 395 400
Leu Leu Arg Ala Pro Phe Pro 405
<210> 359 <211> 406 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> T128N/P129A/M298Q/H373F <400> 359
Ala Asn Ala Phe Leu Glu Glu Leu Arg Pro Gly Ser Leu Glu Arg Glu 15 10 15
Cys Lys Glu Glu Gin Cys Ser Phe Glu Glu Ala Arg Glu lie Phe Lys 20 25 30
Asp Ala Glu Arg Thr Lys Leu Phe Trp lie Ser Tyr Ser Asp Gly Asp 35 40 45
Gin Cys Ala Ser Ser Pro Cys Gin Asn Gly Gly Ser Cys Lys Asp Gin 50 55 60
Leu Gin Ser Tyr lie Cys Phe Cys Leu Pro Ala Phe Glu Gly Arg Asn 65 70 75 80
Cys Glu Thr His Lys Asp Asp Gin Leu lie Cys Val Asn Glu Asn Gly 85 90 95
Gly Cys Glu Gin Tyr Cys Ser Asp His Thr Gly Thr Lys Arg Ser Cys 100 105 110
Arg Cys His Glu Gly Tyr Ser Leu Leu Ala Asp Gly Val Ser Cys Asn 115 120 125
Ala Thr Val Glu Tyr Pro Cys Gly Lys lie Pro lie Leu Glu Lys Arg 130 135 140
Asn Ala Ser Lys Pro Gin Gly Arg lie Val Gly Gly Lys Val Cys Pro 145 150 155 160
Lys Gly Glu Cys Pro Trp Gin Val Leu Leu Leu Val Asn Gly Ala Gin 165 170 175
Leu Cys Gly Gly Thr Leu lie Asn Thr lie Trp Val Val Ser Ala Ala 180 185 190
His Cys Phe Asp Lys lie Lys Asn Trp Arg Asn Leu lie Ala Val Leu 195 200 205
Gly Glu His Asp Leu Ser Glu His Asp Gly Asp Glu Gin Ser Arg Arg 210 215 220
Val Ala Gin Val lie lie Pro Ser Thr Tyr Val Pro Gly Thr Thr Asn 225 230 235 240
His Asp lie Ala Leu Leu Arg Leu His Gin Pro Val Val Leu Thr Asp 245 250 255
His Val Val Pro Leu Cys Leu Pro Glu Arg Thr Phe Ser Glu Arg Thr 260 265 270
Leu Ala Phe Val Arg Phe Ser Leu Val Ser Gly Trp Gly Gin Leu Leu 275 280 285
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Leu Arg Ala Pro Phe Pro 405
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Leu Arg Ala Pro Phe Pro 405
<210> 368 <211> 406 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> T128N/P129A/S222A/T239V/H257A/Q286R/M298Q <400> 368
Ala Asn Ala Phe Leu Glu Glu Leu Arg Pro Gly Ser Leu Glu Arg Glu 15 10 15
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Gly Glu His Asp Leu Ser Glu His Asp Gly Asp Glu Gin Ala Arg Arg 210 215 220
Val Ala Gin Val lie lie Pro Ser Thr Tyr Val Pro Gly Thr Val Asn 225 230 235 240
His Asp lie Ala Leu Leu Arg Leu His Gin Pro Val Val Leu Thr Asp 245 250 255
Ala Val Val Pro Leu Cys Leu Pro Glu Arg Thr Phe Ser Glu Arg Thr 260 265 270
Leu Ala Phe Val Arg Phe Ser Leu Val Ser Gly Trp Gly Arg Leu Leu 275 280 285
Asp Arg Gly Ala Thr Ala Leu Glu Leu Gin Val Leu Asn Val Pro Arg 290 295 300
Leu Met Thr Gin Asp Cys Leu Gin Gin Ser Arg Lys Val Gly Asp Ser 305 310 315 320
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Lys Asp Ser Cys Lys Gly Asp Ser Gly Gly Pro His Ala Thr His Tyr 340 345 350
Arg Gly Thr Trp Tyr Leu Thr Gly lie Val Ser Trp Gly Gin Gly Cys 355 360 365
Ala Thr Val Gly His Phe Gly Val Tyr Thr Arg Val Ser Gin Tyr lie 370 375 380
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Leu Arg Ala Pro Phe Pro 405
<210> 369 <211> 406 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> T128N/P129A/T239V/Q286R/M298Q/H373F <400> 369
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Gly Cys Glu Gin Tyr Cys Ser Asp His Thr Gly Thr Lys Arg Ser Cys 100 105 110
Arg Cys His Glu Gly Tyr Ser Leu Leu Ala Asp Gly Val Ser Cys Asn 115 120 125
Ala Thr Val Glu Tyr Pro Cys Gly Lys lie Pro lie Leu Glu Lys Arg 130 135 140
Asn Ala Ser Lys Pro Gin Gly Arg lie Val Gly Gly Lys Val Cys Pro 145 150 155 160
Lys Gly Glu Cys Pro Trp Gin Val Leu Leu Leu Val Asn Gly Ala Gin 165 170 175
Leu Cys Gly Gly Thr Leu lie Asn Thr lie Trp Val Val Ser Ala Ala 180 185 190
His Cys Phe Asp Lys lie Lys Asn Trp Arg Asn Leu lie Ala Val Leu 195 200 205
Gly Glu His Asp Leu Ser Glu His Asp Gly Asp Glu Gin Ser Arg Arg 210 215 220
Val Ala Gin Val lie lie Pro Ser Thr Tyr Val Pro Gly Thr Val Asn 225 230 235 240
His Asp lie Ala Leu Leu Arg Leu His Gin Pro Val Val Leu Thr Asp 245 250 255
His Val Val Pro Leu Cys Leu Pro Glu Arg Thr Phe Ser Glu Arg Thr 260 265 270
Leu Ala Phe Val Arg Phe Ser Leu Val Ser Gly Trp Gly Arg Leu Leu 275 280 285
Asp Arg Gly Ala Thr Ala Leu Glu Leu Gin Val Leu Asn Val Pro Arg 290 295 300
Leu Met Thr Gin Asp Cys Leu Gin Gin Ser Arg Lys Val Gly Asp Ser 305 310 315 320
Pro Asn lie Thr Glu Tyr Met Phe Cys Ala Gly Tyr Ser Asp Gly Ser 325 330 335
Lys Asp Ser Cys Lys Gly Asp Ser Gly Gly Pro His Ala Thr His Tyr 340 345 350
Arg Gly Thr Trp Tyr Leu Thr Gly lie Val Ser Trp Gly Gin Gly Cys 355 360 365
Ala Thr Val Gly Phe Phe Gly Val Tyr Thr Arg Val Ser Gin Tyr lie 370 375 380
Glu Trp Leu Gin Lys Leu Met Arg Ser Glu Pro Arg Pro Gly Val Leu 385 390 395 400
Leu Arg Ala Pro Phe Pro 405
<210> 370 <211> 406 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> T128N/P129A/T239I/Q286R/M298Q <400> 370
Ala Asn Ala Phe Leu Glu Glu Leu Arg Pro Gly Ser Leu Glu Arg Glu 15 10 15
Cys Lys Glu Glu Gin Cys Ser Phe Glu Glu Ala Arg Glu lie Phe Lys 20 25 30
Asp Ala Glu Arg Thr Lys Leu Phe Trp lie Ser Tyr Ser Asp Gly Asp 35 40 45
Gin Cys Ala Ser Ser Pro Cys Gin Asn Gly Gly Ser Cys Lys Asp Gin 50 55 60
Leu Gin Ser Tyr lie Cys Phe Cys Leu Pro Ala Phe Glu Gly Arg Asn 65 70 75 80
Cys Glu Thr His Lys Asp Asp Gin Leu lie Cys Val Asn Glu Asn Gly 85 90 95
Gly Cys Glu Gin Tyr Cys Ser Asp His Thr Gly Thr Lys Arg Ser Cys 100 105 110
Arg Cys His Glu Gly Tyr Ser Leu Leu Ala Asp Gly Val Ser Cys Asn 115 120 125
Ala Thr Val Glu Tyr Pro Cys Gly Lys lie Pro lie Leu Glu Lys Arg 130 135 140
Asn Ala Ser Lys Pro Gin Gly Arg lie Val Gly Gly Lys Val Cys Pro 145 150 155 160
Lys Gly Glu Cys Pro Trp Gin Val Leu Leu Leu Val Asn Gly Ala Gin 165 170 175
Leu Cys Gly Gly Thr Leu lie Asn Thr lie Trp Val Val Ser Ala Ala 180 185 190
His Cys Phe Asp Lys lie Lys Asn Trp Arg Asn Leu lie Ala Val Leu 195 200 205
Gly Glu His Asp Leu Ser Glu His Asp Gly Asp Glu Gin Ser Arg Arg 210 215 220
Val Ala Gin Val lie lie Pro Ser Thr Tyr Val Pro Gly Thr lie Asn 225 230 235 240
His Asp lie Ala Leu Leu Arg Leu His Gin Pro Val Val Leu Thr Asp 245 250 255
His Val Val Pro Leu Cys Leu Pro Glu Arg Thr Phe Ser Glu Arg Thr 260 265 270
Leu Ala Phe Val Arg Phe Ser Leu Val Ser Gly Trp Gly Arg Leu Leu 275 280 285
Asp Arg Gly Ala Thr Ala Leu Glu Leu Gin Val Leu Asn Val Pro Arg 290 295 300
Leu Met Thr Gin Asp Cys Leu Gin Gin Ser Arg Lys Val Gly Asp Ser 305 310 315 320
Pro Asn lie Thr Glu Tyr Met Phe Cys Ala Gly Tyr Ser Asp Gly Ser 325 330 335
Lys Asp Ser Cys Lys Gly Asp Ser Gly Gly Pro His Ala Thr His Tyr 340 345 350
Arg Gly Thr Trp Tyr Leu Thr Gly lie Val Ser Trp Gly Gin Gly Cys 355 360 365
Ala Thr Val Gly His Phe Gly Val Tyr Thr Arg Val Ser Gin Tyr lie 370 375 380
Glu Trp Leu Gin Lys Leu Met Arg Ser Glu Pro Arg Pro Gly Val Leu 385 390 395 400
Leu Arg Ala Pro Phe Pro 405
<210> 371 <211> 406 <212> PRT <213> Homo sapiens <220> <223> T128N/P129A/T239I/Q286R/M298Q/H373F <400> 371
Ala Asn Ala Phe Leu Glu Glu Leu Arg Pro Gly Ser Leu Glu Arg Glu 15 10 15
Cys Lys Glu Glu Gin Cys Ser Phe Glu Glu Ala Arg Glu lie Phe Lys 20 25 30
Asp Ala Glu Arg Thr Lys Leu Phe Trp lie Ser Tyr Ser Asp Gly Asp 35 40 45
Gin Cys Ala Ser Ser Pro Cys Gin Asn Gly Gly Ser Cys Lys Asp Gin 50 55 60
Leu Gin Ser Tyr lie Cys Phe Cys Leu Pro Ala Phe Glu Gly Arg Asn 65 70 75 80
Cys Glu Thr His Lys Asp Asp Gin Leu lie Cys Val Asn Glu Asn Gly 85 90 95
Gly Cys Glu Gin Tyr Cys Ser Asp His Thr Gly Thr Lys Arg Ser Cys 100 105 110
Arg Cys His Glu Gly Tyr Ser Leu Leu Ala Asp Gly Val Ser Cys Asn 115 120 125
Ala Thr Val Glu Tyr Pro Cys Gly Lys lie Pro lie Leu Glu Lys Arg 130 135 140
Asn Ala Ser Lys Pro Gin Gly Arg lie Val Gly Gly Lys Val Cys Pro 145 150 155 160
Lys Gly Glu Cys Pro Trp Gin Val Leu Leu Leu Val Asn Gly Ala Gin 165 170 175
Leu Cys Gly Gly Thr Leu lie Asn Thr lie Trp Val Val Ser Ala Ala 180 185 190
His Cys Phe Asp Lys lie Lys Asn Trp Arg Asn Leu lie Ala Val Leu 195 200 205
Gly Glu His Asp Leu Ser Glu His Asp Gly Asp Glu Gin Ser Arg Arg 210 215 220
Val Ala Gin Val lie lie Pro Ser Thr Tyr Val Pro Gly Thr lie Asn 225 230 235 240
His Asp lie Ala Leu Leu Arg Leu His Gin Pro Val Val Leu Thr Asp 245 250 255
His Val Val Pro Leu Cys Leu Pro Glu Arg Thr Phe Ser Glu Arg Thr 260 265 270
Leu Ala Phe Val Arg Phe Ser Leu Val Ser Gly Trp Gly Arg Leu Leu 275 280 285
Asp Arg Gly Ala Thr Ala Leu Glu Leu Gin Val Leu Asn Val Pro Arg 290 295 300
Leu Met Thr Gin Asp Cys Leu Gin Gin Ser Arg Lys Val Gly Asp Ser 305 310 315 320
Pro Asn lie Thr Glu Tyr Met Phe Cys Ala Gly Tyr Ser Asp Gly Ser 325 330 335
Lys Asp Ser Cys Lys Gly Asp Ser Gly Gly Pro His Ala Thr His Tyr 340 345 350
Arg Gly Thr Trp Tyr Leu Thr Gly lie Val Ser Trp Gly Gin Gly Cys 355 360 365
Ala Thr Val Gly Phe Phe Gly Val Tyr Thr Arg Val Ser Gin Tyr lie 370 375 380
Glu Trp Leu Gin Lys Leu Met Arg Ser Glu Pro Arg Pro Gly Val Leu 385 390 395 400
Leu Arg Ala Pro Phe Pro 405
Lisboa, 2015-12-21
Claims (46)
- REIVINDICAÇÕES 1. Polipéptido de fator VII (FVII) modificado, compreendendo modificações num polipéptido de FVII, em que: as modificações são nas posições correspondentes à posição 286 e posição 298 num polipéptido de FVII com a sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 3 ou em posições correspondentes em locais alinhados num polipéptido de FVII; a modificação na posição 286 é uma substituição de aminoácido por uma arginina (Arg, R); a modificação na posição 298 é uma substituição de aminoácido por uma glutamina (Gin, Q); e o polipéptido de FVII modificado apresenta atividade coagulante aumentada comparativamente a um polipéptido de FVII não modificado que não tem a modificação na posição 286.
- 2. Polipéptido de FVII modificado da reivindicação 1, em que a modificação na posição 286 é substituição de Gin (Q) por Arg (R) .
- 3. Polipéptido de FVII modificado da reivindicação 1, em que a modificação na posição 298 é substituição de Met (M) por Gin (Q) .
- 4. Polipéptido de FVII modificado da reivindicação 1, compreendendo as modificações Q286R e M298Q.
- 5. Polipéptido de FVII modificado de qualquer das reivindicações 1-4, em que: o polipéptido de FVII não modificado compreende uma sequência de aminoácidos apresentada em qualquer de SEQ ID NOS: 1-3, 18-74, 98, 158 ou 343-353 ou uma variante com pelo menos 60% de identidade de sequência com o FVII de qualquer de SEQ ID NOS: 1-3, 18-74, 98, 158 ou 343-353.
- 6. Polipéptido de FVII modificado de qualquer das reivindicações 1-5, compreendendo uma ou mais modificações adicionais noutra posição no polipéptido de FVII.
- 7. Polipéptido de FVII modificado da reivindicação 6, em que uma modificação adicional é uma substituição de aminoácido numa posição correspondente a uma posição selecionada entre 51, 52, 54, 60, 66, 68, 109, 119, 122, 124, 130, 132, 158, 161, 175, 196, 197, 199, 202, 216, 222, 237, 239, 257, 287, 290, 292, 294, 296, 305, 314, 318, 321, 337, 341, 366, 373, 374, 394, 395 e 396.
- 8. Polipéptido de FVII modificado da reivindicação 6, em que uma modificação adicional é selecionada de entre D196K, D196R, D196A, D196Y, D196F, D196W, D196L, D196I, K197Y, K197A, K197E, K197D, K197L, K197M, K197I, K197V, K197F, K197W, K199A, K199D, K199E, G237W, G237T, G237I, G237V, T239A, R290A, R290E, R290D, R290N, R290Q, R290K, R290M, R290V, K341E, K341R, K341Q, K341N, K341M, K341D, G237T238insA, G237T238insS, G237T238insV, G237T238insAS, G237T238insSA, D196K197insK, D196K197insR, Dl 9 6K197insY, Dl 96K197insW, Dl96K197insA, Dl 96K197insM, Kl 971198insE, Kl 971198insY, Kl 971198insA, Kl 971198insS, T239S, T239N, T239Q, T239V, T239L, T239H, T239I, L287T, P321K, P321E, P321Y, P321S, Q366D, Q366E, Q366N, Q366T, Q366S, Q366V, Q366I, Q366L, Q366M, H373D, H373E, H373S, H373L, H373I, H373F, H373A, Kl 61S, K161A, Kl 6IV, H216S, H216A, H216K, H216R, S222A, S222K, S222V, S222N, S222E, S222D, H257A, H257S, Gla Swap FIX, {Gla Swap FIX/E40L}, {Gla Swap FIX/K43I}, {Gla Swap FIX/Q44S}, {Gla Swap FIX/M19K}, {Gla Swap FIX/M19K/E40L/K43I/Q44S}, Gla Swap FX, Gla Swap Prot C, Gla Swap Prot S, Gla Swap Trombina, S52A, S60A, E394N, P395A, R396S, R202S, A292N, A294S, G318N, A175S, K109N, A122N, G124S, A51N, T130N, E132S, S52N, P54S, S119N, L121S, T128N, P129A, Q66N, Y68S, S103SllldelinsQRLMEDICLPRWGCLWEDDF, Hl15S12 6delinsQRLMEDICLPRWGCLWEDDF, T12 8P134delinsQRLMEDICLPRWGCLWEDDF, S103SllldelinsIEDICLPRWGCLWE, Hl15S126delinsIEDICLPRWGCLWE, T128P134delinsIEDICLPRWGCLWE, S103SllldelinsDICLPRWGCLWED, Hl15S12 6delinsDICLPRWGCLWED, T12 8P134delinsDICLPRWGCLWED, P4 0 6insIEDICLPRWGCLW, P406insGGGSIEDICLPRWGCLW, P4 0 6insDICLPRWGCLWED, P4 0 6insGGGSDICLPRWGCLWED, S103S111de1insSFGRGDIRNV, Hl15S12 6delinsSFGRGDIRNV, T127P134 de1i n s S F GRGDIRNV, P406insCSFGRGDIRNVC, P4 0 6insGGGSCSFGRGDIRNVC, V158T, V158D, L287T e E296V.
- 9. Polipéptido de FVII modificado de qualquer uma das reivindicações 6-8, compreendendo modificações selecionadas entre Q286R/M298Q/K341Q, Q286R/M298Q/K199E, Q286R/M298Q/Gla Swap FIX, Q28 6R/M2 98Q/Q36 6D, Q286R/M298Q/Q366N, Q286R/M298Q/H373F, {Gla Swap FIX/E40L}/Q286R/M298Q, {Gla Swap FIX/K43I}/Q286R/M298Q, {Gla Swap FIX/Q44S}/Q286R/M298Q, {Gla Swap FIX/M19K}/Q286R/M298Q, {Gla Swap FIX/M19K/E40L/K43I/Q44S}/Q286R/M298Q, T128N/P129A/Q286R/M298Q, V158D/Q286R/E29 6V/M2 9 8Q, Gla Swap FIX/T128N/P129A/Q286R/M298Q, T128N/P129A/S222A/H257A/Q286R/M298Q, T128N/P12 9A/Q28 6R/M2 98Q/H373F, S52A/S60A/Q286R/M298Q, Gla Swap FIX/S52A/S60A/Q28 6R/M2 98Q, S52A/S6OA/S222A/H257A/Q286R/M298Q, S52A/S60A/Q28 6R/M2 98Q/H37 3F, T239V/Q286R/M298Q, S222A/T239V/H257A/Q286R/M298Q, Gla Swap FIX/T239V/Q286R/M298Q, T239V/Q286R/M298Q/H373F, T239I/Q286R/M298Q, S222A/T239I/H257A/Q286R/M298Q, Gla Swap FIX/T239I/Q286R/M298Q, T239I/Q286R/M298Q/H373F, Gla Swap FIX/S222A/Q286R/M298Q, Gla Swap FIX/S222A/Q28 6R/M2 98Q/H373F, V158D/Q286R/E29 6V/M2 98Q/H373F, H257A/Q286R/M298Q, H257S/Q28 6R/M2 98Q, S222A/H257S/Q286R/M298Q, H257S/Q28 6R/M2 98Q/H373F, S222A/Q286R/M298Q/H373F, S222A/Q286R/M298Q, T128N/P129A/A175S/Q286R/M298Q, A122N/G124S/A175S/Q28 6R/M298Q, T128N/P129A/A175S/S222A/H257A/Q286R/M298Q, A122N/G124S/A175S/S222A/H257A/Q286R/M298Q, T128N/P12 9A/A175S/Q28 6R/M298Q/H373F, A122N/G124S/A175S/Q28 6R/M2 98Q/H373F, {Gla Swap FIX /K43I}/T128N/P129A/Q286R/M298Q, T128N/P129A/Q286R/M298Q/Q366N, {Gla Swap FIX/K43I}/Q286R/M298Q/Q366N, {Gla Swap FIX/K43I}/ T128N/P12 9A/Q28 6R/M2 98Q/Q36 6N, VI58D/Q286R/E296V/M298Q, T128N/P129A/Q286R/M298Q/Q366N/H373F, T239V/Q286R/M298Q/Q366N, T239I/Q28 6R/M2 98Q/Q36 6N, T128N/P129A/T239V/Q286R/M298Q, T128N/P129A/S222A/T239V/H257A/Q286R/M298Q, T128N/P12 9A/T23 9V/Q28 6R/M298Q/H373F, T128N/P129A/T239I/Q286R/M298Q e T128N/P129A/T239I/Q286R/M298Q/H373F.
- 10. Polipéptido de FVII modificado de qualquer das reivindicações 6-9, compreendendo modificações selecionados entre T128N/P129A/Q286R/M298Q, T239I/Q286R/M298Q/Q366N, T23 9V/Q28 6R/M2 98Q/Q36 6N, T128N/P129A/Q286R/M298Q/Q366N/H373F, V158D/Q286R/E29 6V/M2 98Q/H373F, A122N/G124S/A175S/Q28 6R/M298Q/H373F, T128N/P12 9A/A175S/Q28 6R/M298Q/H373F, A122N/G124S/A175S/S222A/H257A/Q286R/M298Q, T128N/P129A/A175S/S222A/H257A/Q286R/M298Q, A122N/G124S/A175S/Q28 6R/M298Q, T128N/P129A/A175S/Q286R/M298Q, H257A/Q28 6R/M2 9 8Q, Gla Swap FIX/S222A/Q286R/M298Q, S222A/Q28 6R/M2 9 8Q, Gla Swap FIX/S222A/Q286R/M298Q/H373F, S222A/Q286R/M298Q/H373F, S222A/H257S/Q286R/M298Q, T239I/Q28 6R/M2 98Q/H373F, S222A/T2391/H257A/Q286R/M298Q, T128N/P129A/T239I/Q286R/M298Q, Gla Swap FIX/T239I/Q286R/M298Q, T239I/Q28 6R/M2 98Q, T128N/P129A/S222A/T239V/H257A/Q286R/M298Q, S222A/T239V/H257A/Q286R/M298Q, T128N/P129A/T239V/Q286R/M298Q, Gla Swap FIX/T239V/Q286R/M298Q, V158D/Q286R/E296V/M298Q, T128N/P12 9A/Q28 6R/M2 98Q/H373F, Q286R/M298Q/H373F, {Gla Swap FIX K[43]I}/T128N/P129A/Q286R/M298Q/Q366N, {Gla Swap FIX K[43]I}/Q2 8 6R/M2 98Q/Q36 6N, Q286R/M298Q/Q366N, S52A/S60A/S222A/H257A/Q286R/M298Q, T128N/P129A/S222A/H257A/Q286R/M298Q, S222A/H257A/Q286R/M298Q, {Gla Swap FIX/K[43]I}/T128N/P129A/Q286R/M298Q, Gla Swap FIX/S52A/S60A/Q28 6R/M2 9 8Q, S52A/S60A/Q286R/M298Q, {Gla Swap FIX/M[19]K]/Q286R/M298Q, Gla Swap FIX/Q[44]S}/Q286R/M298Q, {Gla Swap FIX/K[43]I}/Q286R/M298Q, {Gla Swap FIX/E[40]L]/Q286R/M298Q e Gla Swap FIX/T12 8N/P12 9A/Q286R/M2 98Q.
- 11. Polipéptido de FVII modificado de qualquer das reivindicações 1-10 que contém um domínio Gla heterólogo ou uma parte contígua suficiente do domínio Gla para alterar a ligação a fosfolípido.
- 12. Polipéptido de FVII modificado de qualquer das reivindicações 1-11, compreendendo uma sequência de aminoácidos apresentada em qualquer uma de SEQ ID NOS: 138- 141, 150, 154, 155, 157, 274-278, 280, 282, 286-288, 293-295, 297, 302-304, 306, 311-313, 317, 318, 321, 322, 324-326, 328, 337-342, 355-358, 360 ou 364-371.
- 13. Polipéptido de FVII modificado de qualquer das reivindicações 1-12 que é ativo ou ativado.
- 14. Polipéptido de FVII modificado de qualquer das reivindicações 1-13, compreendendo 2, 3, 4, 5, 6, 7 ou mais modificações.
- 15. Polipéptido de FVII modificado da reivindicação 11, em que o domínio Gla heterólogo é selecionado entre um domínio Gla de fator IX (FIX), fator X (FX), protrombina, proteína C, proteína S, osteocalcina, proteína Gla de matriz, proteína 6 específica de paragem de crescimento (Gas6) e proteína Z.
- 16. Polipéptido de FVII modificado da reivindicação 11 ou da reivindicação 15, em que o domínio Gla heterólogo tem uma sequência de aminoácidos apresentada em qualquer de SEQ ID NOS: 83-91, 93 e 94 ou uma sua parte suficiente para efetuar ligação a fosfolípido.
- 17. Polipéptido de FVII modificado da reivindicação 11, em que o domínio Gla de FVII nativo inclui os aminoácidos 1-45 num polipéptido de FVII com uma sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO:3 ou em resíduos correspondentes num polipéptido de FVII.
- 18. Polipéptido de FVII modificado de qualquer das reivindicações 11-17, em que o domínio Gla heterólogo contém uma modificação comparativamente à forma de tipo selvagem do domínio Gla heterólogo.
- 19. Polipéptido de FVII modificado da reivindicação 18, em que: o domínio Gla heterólogo é um domínio Gla de FIX; e a modificação é uma substituição de aminoácido numa posição correspondente a uma posição selecionada entre as posições 19, 40, 43 e 44 do domínio Gla de FIX apresentado em SEQ ID NO:8 3.
- 20. Polipéptido de FVII modificado da reivindicação 19, em que a modificação é selecionada de entre M19K, E40L, K43I e Q44S .
- 21. Polipéptido de FVII modificado de qualquer das reivindicações 1-20, em que a modificação é M19K/E4 0L/K43I/Q44S .
- 22. Polipéptido de FVII modificado de qualquer das reivindicações 1-20, compreendendo modificações selecionadas de entre Q286R/M298Q/Gla Swap FIX, {Gla Swap FIX/E40L}/Q286R/M298Q, {Gla Swap FIX/K431}/Q286R/M298Q, {Gla Swap FIX/Q44S}/Q286R/M298Q, {Gla Swap FIX/M19K}/Q286R/M298Q, {Gla Swap FIX/M19K/E40L/K43I/Q44S}/Q286R/M298Q, Gla Swap FIX/T12 8N/P12 9A/Q286R/M2 98Q, Gla Swap FIX/S52A/S60A/Q28 6R/M2 98Q, Gla Swap FIX/T239V/Q286R/M298Q, Gla Swap FIX/T239I/Q286R/M298Q, Gla Swap FIX/S222A/Q286R/M298Q, Gla Swap FIX/S222A/Q286R/M298Q/H373F, {Gla Swap FIX/K43I}/T128N/P129A/Q286R/M298Q, {Gla Swap FIX /K43l}/Q28 6R/M2 98Q/Q36 6N e {Gla Swap FIX/K43I}/T128N/P12 9A/Q28 6R/M2 98Q/Q36 6N.
- 23. Polipéptido de FVII modificado de qualquer das reivindicações 1-22, compreendendo uma ou mais modificações adicionais de aminoácidos que aumentam a resistência a antitrombina-III, aumentam ligação e/ou afinidade para fosfolipidos, aumentam afinidade para fator tecidular, aumentam atividade intrínseca, aumentam atividade dependente de TF, aumentam atividade coagulante, alteram a conformação do polipéptido para alterar zimogenicidade, aumentam a atividade catalítica ou coagulante por desvio do equilíbrio entre as conformações altamente ativa e menos ativa de FVIIa em favor das conformações altamente ativas, aumentam a resistência a proteases, diminuem a glicosilação, aumentam a glicosilação, diminuem a imunogenicidade, aumentam a estabilidade e/ou facilitam ligação a um grupo químico.
- 24. Polipéptido de FVII modificado de qualquer das reivindicações 1-23, compreendendo uma ou mais modificações de aminoácidos adicionais selecionadas de entre S279C/V302C, L280C/N301C, V281C/V302C, S282C/V299C, inserção de uma tirosina na posição 4, F4S, F4T, P10Q, P10E, P10D, P10N, Q21N, R28F, R28E, I30C, I30D, I30E, K32D, K32Q, K32E, K32G, K32H, K32T, K32C, K32A, K32S, D33C, D33F, D33E, D33K, A34C, A34E, A34D, A34I, A34L, A34M, A34V, A34F, A34W, A34Y, R36D, R36E, T37C, T37D, T37E, K38C, K38E, K38T, K38D, K38L, K38G, K38A, K38S, K38N, K38H, L39E, L39Q, L39H, W41N, W41C, W41E, W41D, I42R, I42N, I42S, I42A, I42Q, I42N, I42S, I42A, I42Q, I42K, S43Q, S43N, Y44K, Y44C, Y44D, Y44E, S45C, S45D, S45E, D46C, A51N, S53N, G58N, G59S, G59T, K62E, K62R, K62D, K62N, K62Q, K62T, L65Q, L65S, L65N, F71D, F71Y, F71E, F71Q, F71N, P74S, P74A, A75E, A75D, E77A, E82Q, E82N, E82S, E82T T83K, N95S, N95T, G97S, G97T, Y101N, D104N, T106N, K109N, E116D, G117N, G124N, S126N, T128N, L141C, L141D, L141E, E142D, E142C, K143C, K143D, K143E, R144E, R144C, R144D, N145Y, N145G, N145F, N145M, N145S, N145I, N145L, N145T, N145V, N145P, N145K, N145H, N145Q, N145E, N145R, N145W, N145D, N145C, K157V, K157L, K157I, K157M, K157F, K157W, K157P, K157G, K157S, K157T, K157C, K157Y, K157N, K157E, K157R, K157H, K157D, K157Q, V158L, V158I, V158M, V158F, V158W, V158P, V158G, V158S, V158T, V158C, V158Y, V158N, V158E, V158R, V158K, V158H, V158D, V158Q, A175S, A175T, G179N, I186S, I186T, V188N, R202S, R202T, I205S, I205T, D212N, E220N, I230N, P231N, P236N, G237N, Q250C, V253N, E265N, T267N, E270N, A274M, A274L, A274K, A274R, A274D, A274V, A274I, A274F, A274W, A274P, A274G, A274T, A274C, A274Y, A274N, A274E, A274H, A274S, A274Q, F275H, R277N, F278S, F278A. F278N, F278Q, F278G, L280N, L288K, L288C, L288D, D289C, D289K, L288E, R290C, R290G, R290A, R290S, R290T, R290K, R290D, R290E, G291E, G291D, G291C, G291N, G291K, A292C, A292K, A292D, A292E, T293K, E296V, E296L, E296I, E296M, E296F, E296W, E296P, E296G, E296S, E296T, E296C, E296Y, E296N, E296K, E296R, E296H, E296D, E296Q, M298V, M298L, M298I, M298F, M298W, M298P, M298G, M298S, M298T, M298C, M298Y, M298N, M298K, M298R, M298H, M298E, M298D, P303S, P303T, R304Y, R304F, R304L, R304M, R304G, R304T, R304A, R304S, R304N, L305V, L305Y, L305I, L305F, L305A, L305M, L305W, L305P, L305G, L305S, L305T, L305C, L305N, L305E, L305K, L305R, L305H, L305D, L305Q, M306D, M306N, D309S, D309T, Q312N, Q313K, Q313D, Q313E, S314A, S314V, S314I, S314M, S314F, S314W, S314P, S314G, S314L, S314T, S314C, S314Y, S314N, S314E, S314K, S314R, S314H, S314D, S314Q, R315K, R315G, R315A, R315S, R315T, R315Q, R315C, R315D, R315E, K316D, K316C, K316E, V317C, V317K, V317D, V317E, G318N, N322Y, N322G, N322F, N322M, N322S, N322I, N322L, N322T, N322V, N322P, N322K, N322H, N322Q, N322E, N322R, N322W, N322C, G331N, Y332S, Y332A, Y332N, Y332Q, Y332G, D334G, D334E, D334A, D334V, D334I, D334M, D334F, D334W, D334P, D334L, D334T, D334C, D334Y, D334N, D334K, D334R, D334H, D334S, D334Q, S336G, S336E, S336A, S336V, S336I, S336M, S336F, S336W, S336P, S336L, S336T, S336C, S336Y, S336N, S336K, S336R, S336H, S336D, S336Q, K337L, K337V, K337I, K337M, K337F, K337W, K337P, K337G, K337S, K337T, K337C, K337Y, K337N, K337E, K337R, K337H, K337D, K337Q, K341E, K341Q, K341G, K341T, K341A, K341S, G342N, H348N, R353N, Y357N, I361N, F374P, F374A, F374V, F374I, F374L, F374M, F374W, F374G, F374S, F374T, F374C, F374Y, F374N, F374E, F374K, F374R, F374H, F374D, F374Q, V376N, R379N, L390C, L390K, L390D, L390E, M391D, M391C, M391K, M391N, M391E, R392C, R392D, R392E, S393D, S393C, S393K, S393E, E394K, P395K, E394C, P395D, P395C, P395E, R396K, R396C, R396D, R396E, P397D, P397K, P397C, P397E, G398K, G398C, G398D, G398E, V399C, V399D, V399K, V399E, L400K, L401K, L401C, L401D, L401E, R402D, R402C, R402K, R402E, A403K, A403C, A403D, A403E, P404E, P404D, P404C, P404K, F405K, P406C, K32N/A34S, K32N/A34T, F31N/D33S, F31N/D33T, I30N/K32S, I30N/K32T, A34N/R36S, A34N/R36T, K38N/F40S, K38N/F40T, T37N/L39S, T37N/L39T, R36N/K38S, R36N/K38T, L39N/W41S, L39N/W41T, F40N/I42S, F40N/I42T, I42N/Y44S, I42N/Y44T, Y44N/D46S, Y44N/D46T, D46N/D48S, D46N/D48T, G47N/Q49S, G47N/Q49T, K143N/N145S, K143N/N145T, E142N/R144S, E142N/R144T, L141N/K143S, L141N/K143T, I140N/E142S, I140N/E142T, R144N/A146S, R144N/A146T, A146N/K148S, A146N/K148T, S147N/P149S/, S147N/P149T, R290N/A292S, R290N/A292T, D289N/G291S, D289N/G291T, L288N/R290S, L288N/R290T, L287N/D289S, L287N/D289T, A292N/A294S, A292N/A294T, T293N/L295S, T293N/L295T, R315N/V317S, R315/V317T, S314N/K316S, S314N/K316T, Q313N/R315S, Q313N/R315T, K316N/G318S, K316N/G318T, V317N/D319S, V317N/D319T, K341N/D343S, K341N/D343T, S339N/K341S, S339N/K341T, D343N/G345S, D343N/G345T, R392N/E394S, R392N/E394T, L390N/R392S, L390N/R392T, K389N/M391S, K389N/M391T, S393N/P395S, S393N/P395T, E394N/R396S, E394N/R396T, P395N/P397S, P395N/P397T, R396N/G398S, R396N/G398T, P397N/V399S, P397N/V399T, G398N/L400S, G398N/L400T, V399N/L401S, V399N/L401T, L400N/R402S, L400N/R402T, L401N/A403S, L401N/A403T, R402N/P404S, R402N/P404T, A403N/F405S, A403N/F405T, P404N/P406S e P404N/P406T.
- 25. Polipéptido de FVII modificado de qualquer das reivindicações 1-24, em que: o polipéptido de FVII não modificado tem uma sequência de aminoácidos apresentada em SEQ ID NO: 3 ou uma variante com pelo menos 60% de identidade de sequência com o FVII de qualquer de SEQ ID NOS: 1-3, 18-74, 98, 158 ou 343-353.
- 26. Polipéptido de FVII modificado da reivindicação 1 que compreende as modificações T128N/P129A/Q286R/M298Q.
- 27. Polipéptido de FVII modificado da reivindicação 26 cuja sequência de aminoácidos consiste da sequência apresentada em SEQ ID NO:280.
- 28. Polipéptido de FVII modificado de qualquer das reivindicações 1-25 que é um polipéptido maduro.
- 29. Polipéptido de FVII modificado de qualquer das reivindicações 1-26 que é um polipéptido em cadeia única ou um polipéptido com duas cadeias.
- 30. Molécula de ácido nucleico, compreendendo uma sequência de nucleótidos que codifica um polipéptido de FVII modificado de qualquer uma das reivindicações 1-27.
- 31. Vetor compreendendo a molécula de ácido nucleico da reivindicação 30.
- 32. Célula compreendendo o vetor da reivindicação 31.
- 33. Polipéptido de FVII modificado de qualquer das reivindicações 1-29, para uso no tratamento de uma doença ou condição que é tratada por administração de FVII ou de um pró-coagulante.
- 34. Polipéptido de FVII modificado da reivindicação 33, em que a doença ou condição é tratada por administração de um zimogénio ou de forma ativa de FVII.
- 35. Polipéptido de FVII modificado da reivindicação 33 ou da reivindicação 34, em que a doença ou condição a ser tratada é selecionada entre distúrbios de coagulação sanguínea, distúrbios hematológicos, distúrbios hemorrágicos, hemofilias, deficiência em fator VII, distúrbios de sangramento, hemorragia cirúrgica ou hemorragia resultante de traumatismo.
- 36. Polipéptido de FVII modificado da reivindicação 35, em que a doença ou condição é hemofilia e a hemofilia é hemofilia A ou hemofilia B ou hemofilia C.
- 37. Polipéptido de FVII modificado da reivindicação 27, em que o polipéptido é a forma ativada com duas cadeias resultante da clivagem entre os aminoácidos Argl52 e Ilel53, em que a primeira e a segunda cadeia consistem respetivamente dos aminoácidos 1-152 e 153-406 de SEQ ID NO:280, ligados entre si através de uma ponte dissulfureto.
- 38. Forma ativada com duas cadeias do polipéptido de FVII modificado da reivindicação 37, em que o polipéptido de FVII é do tipo zimogénio.
- 39. Forma ativada com duas cadeias do polipéptido de FVII modificado da reivindicação 37, em que o polipéptido de FVII é completamente ativado.
- 40. Forma ativada com duas cadeias do polipéptido de FVII modificado da reivindicação 37, em que o polipéptido de FVII inclui pelo menos uma modificação pós-tradução selecionada entre glicosilação ligada a O, glicosilação ligada a N, carboxilação de ácido glutâmico a ácido -carboxiglutâmico e hidroxilação de ácido aspártico a ácido -hidroxiaspártico.
- 41. Composição farmacêutica compreendendo a forma ativada com duas cadeias do polipéptido de FVII modificado da reivindicação 37 e um transportador farmaceuticamente aceitável.
- 42. Composição da reivindicação 41, que é formulada para administração intravenosa, parentérica, intramuscular ou subcutânea.
- 43. Composição da reivindicação 41 que é liofilizada.
- 44. Forma ativada com duas cadeias do polipéptido de FVII modificado de qualquer uma das reivindicações 37-40, para uso no tratamento de um doente com hemofilia A com inibidores ou de hemofilia B com inibidores.
- 45. Composição farmacêutica, compreendendo uma concentração ou quantidade terapeuticamente eficaz de um polipéptido de FVII modificado de qualquer das reivindicações 1-29 e 37-40 ou uma molécula de ácido nucleico da reivindicação 30 ou um vetor da reivindicação 31 ou uma célula da reivindicação 32, num veiculo farmaceuticamente aceitável.
- 46. Composição farmacêutica da reivindicação 45, que é formulada para administração em dosagem única. Lisboa, 2015-12-21
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