ES2556596T3

ES2556596T3 - Polipéptidos de factor VII que se modifican y usos de los mismos

Info

Publication number: ES2556596T3
Application number: ES09730852.2T
Authority: ES
Inventors: Edwin L. Madison; Christopher Thanos
Original assignee: Catalyst Biosciences Inc
Current assignee: Gyre Therapeutics Inc
Priority date: 2008-04-11
Filing date: 2009-04-10
Publication date: 2016-01-19
Anticipated expiration: 2029-04-10
Also published as: US10160961B2; BRPI0911060A2; JP2011517942A; BRPI0911060B1; TW200942258A; HK1154273A1; WO2009126307A3; EP2687596A2; CO6331368A2; KR101623602B1; MX2010011170A; JP2014113157A; IL225740A0; IL225740A; NZ588322A; EA201301350A1; IL208373A; AU2009234390A1; ES2560236T3; SG193779A1

Abstract

Un polipéptido de factor VII (FVII) modificado, que comprende modificaciones en un polipéptido de FVII, donde: las modificaciones están en posiciones correspondientes a la posición 286 y posición 298 en un polipéptido de FVII que tiene la secuencia de aminoácidos expuesta en SEC ID Nº: 3 o en posiciones correspondientes en loci alineados en un polipéptido de FVII; la modificación en la posición 286 es un reemplazo de aminoácido con una arginina (Arg, R); la modificación en la posición 298 es un reemplazo de aminoácido con una glutamina (Gln, Q); y el polipéptido de FVII modificado muestra actividad coagulante aumentada en comparación con un polipéptido de FVII no modificado que no tiene la modificación en la posición 286.

Description

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G291C, G291N, G291K, A292C, A292K, A292D, A292E, T293K, E296V, E296L, E296I, E296M, E296F, E296W, E296P, E296G, E296S, E296T, E296C, E296Y, E296N, E296K, E296R, E296H, E296D, E296Q, M298Q, M298V, M298L, M298I, M298F, M298W, M298P, M298G, M298S, M298T, M298C, M298Y, M298N, M298K, M298R, M298H, M298E, M298D, P303S, P303T, R304Y, R304F, R304L, R304M, R304G, R304T, R304A, R304S, R304N, L305V, L305Y, L305I, L305F, L305A, L305M, L305W, L305P, L305G, L305S, L305T, L305C, L305N, L305E, L305K, L305R, L305H, L305D, L305Q, M306D, M306N, D309S, D309T, Q312N, Q313K, Q313D, Q313E, S314A, S314V, S3141, S314M, S314F, S314W, S314P, S314G, S314L, S314T, S314C, S314Y, S314N, S314E, S314K, S314R, S314H, S314D, S314Q, R315K, R315G, R315A, R315S, R315T, R315Q, R315C, R315D, R315E, K316D, K316C, K316E, V317C, V317K, V317D, V317E, G318N, N322Y, N322G, N322F, N322M, N322S, N322I, N322L, N322T, N322V, N322P, N322K, N322H, N322Q, N322E, N322R, N322W, N322C, G331N, Y332S, Y332A, Y332N, Y332Q, Y332G, D334G, D334E, D334A, D334V, D334I, D334M, D334F, D334W, D334P, D334L, D334T, D334C, D334Y, D334N, D334K, D334R, D334H, D334S, D334Q, S336G, S336E, S336A, S336V, S336I, S336M, S336F, S336W, S336P, S336L, S336T, S336C, S336Y, S336N, S336K, S336R, S336H, S336D, S336Q, K337L, K337V, K337I, K337M, K337F, K337W, K337P, K337G, K337S, K337T, K337C, K337Y, K337N, K337E, K337R, K337H, K337D, K337Q, K341E, K341Q, K341G, K341T, K341A, K341S, G342N, H348N, R353N, Y357N, I361N, F374P, F374A, F374V, F374I, F374L, F374M, F374W, F374G, F374S, F374T, F374C, F374Y, F374N, F374E, F374K, F374R, F374H, F374D, F374Q, V376N, R379N, L390C, L390K, L390D, L390E, M391D, M391C, M391K, M391N, M391E, R392C, R392D, R392E, S393D, S393C, S393K, S393E, E394K, P395K, E394C, P395D, P395C, P395E, R396K, R396C, R396D, R396E, P397D, P397K, P397C, P397E, G398K, G398C, G398D, G398E, V399C, V399D, V399K, V399E, L400K, L401K, L401C, L401D, L401E, R402D, R402C, R402K, R402E, A403K, A403C, A403D, A403E, P404E, P404D, P404C, P404K, F405K, P406C, K32N/A34S, K32N/A34T, F31N/D33S, F31N/D33T, I30N/K32S, I30N/K32T, A34N/R36S, A34N/R36T, K38N/F40S, K38N/F40T, T37N/L39S, T37N/L39T, R36N/K38S, R36N/K38T, L39N/W41S, L39N/W41T, F40N/142S, F40N/I42T, I42N/Y44S, I42N/Y44T, Y44N/D46S, Y44N/D46T, D46N/D48S, D46N/D48T, G47N/Q49S, G47N/Q49T, K143N/N145S, K143N/N145T, E142N/R144S, E142N/R144T, L141N/K143S, L141N/K143T, I140N/E1425, I140N/E142T, R144N/A146S, R144N/A146T, A146N/K148S, A146N/K148T, S147N/P149S/, S147N/P149T, R290N/A292S, R290N/A292T, D289N/G291S, D289N/G291T, L288N/R290S, L288N/R290T, L287N/D289S, L287N/D289T, A292N/A294S, A292N/A294T, T293N/L295S, T293N/L295T, R315N/V317S, R315N/V317T, S314N/ K316S, S314N/ K316T, Q313N/ R315S, Q313N/ R315T, K316N/G318S, K316N/G318T, V317N/D319S, V317N/D319T, K341N/ D343S, K341N/ D343T, S339N/K341S, S339N/K341T, D343N/G345S, D343N/G345T, R392N/E394S, R392N/E394T, L390N/ R392S, L390N/ R392T, K389N/M391S, K389N/M391T, S393N/P395S, S393N/P395T, E394N/R396S, E394N/R396T, P395N/P397S, P395N/P397T, R396N/G398S, R396N/G398T, P397N/V399S, P397N/V399T, G398N/L400S, G398N/L400T, V399N/L401S, V399N/L401T, L400N/R402S, L400N/R402T, L401N/A403S, L401N/A403T, R402N/P404S, R402N/P404T, A403N/F405S, A403N/F405T, P404N/P406S y P404N/P406T. En algunos ejemplos, los polipéptidos de FVII modificados también contienen una sustitución de posiciones 300-322, 305-322, 300-312 o 305-312 con los aminoácidos correspondientes de tripsina, trombina y FX, o sustituciones de las posiciones 310-329, 311-322 o 233329 con los aminoácidos correspondientes de tripsina.

Son ejemplos de polipéptidos de FVII modificados descritos en el presente documento los que tienen una secuencia de aminoácidos expuesta en cualquiera de SEC ID Nº: 113-273. En algunos ejemplos, las modificaciones se realizan en un polipéptido de FVII no modificado que es una variante alélicas o de especie del polipéptido expuesto en SEC ID Nº: 3. La variante alélica o de especie u otra puede tener 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 91 %, 92 %, 93 %, 94 %, 95 %, 96 %, 97 %, 98 % o 99 % de identidad de secuencia con el polipéptido expuesto en SEC ID Nº: 3, excluyendo la modificación o las modificaciones de aminoácidos. El polipéptido de FVII modificado descrito en el presente documento puede ser un polipéptido humano, un polipéptido no humano y/o un polipéptido maduro. En algunos ejemplos, solamente se modifica la secuencia primaria. En otros ejemplos, también se incluye una modificación química o una modificación postraduccional. Por ejemplo, el polipéptido de FVII modificado puede estar glucosilado, carboxilado, hidroxilado, sulfatado, fosforilado, albuminado o conjugado con un resto de polietilenglicol (PEG).

Los polipéptidos de FVII modificados proporcionados en el presente documento pueden ser polipéptidos monocatenarios, un polipéptido bicatenario y/o activos o activados. La activación puede efectuarse por escisión proteolítica por autoactivación, escisión por el Factor IX (FIXa), escisión por el Factor X (FXa), escisión por el Factor XII (FXIIa) o escisión por trombina. Los polipéptidos de FVII modificados descritos en el presente documento pueden conservar una o más actividades del polipéptido de FVII no modificado. Por ejemplo, los polipéptidos de FVII modificados pueden contener modificaciones en 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 20, 30, 40, 50 o 60 posiciones de aminoácidos siempre que el polipéptido conserve al menos una actividad de FVII del polipéptido de FVII no modificado. Dichos polipéptidos de FVII modificados pueden conservar al menos aproximadamente 1 %, 2 %, 3 %, 4 %, 5 %, 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100%, 200%, 300%, 400%, 500% o más de una actividad del polipéptido de FVII no modificado. En algunos ejemplos, se seleccionan una o más actividades de entre la unión a factor tisular (FT), activación de factor X (FX), activación de Factor IX (FIX), unión a fosfolípidos y actividad de coagulación. Además, las actividades que se conservan pueden aumentarse o reducirse en comparación con el polipéptido de FVII no modificado. En algunos ejemplos, la actividad de coagulación se aumenta en comparación con el polipéptido de FVII no modificado, tal como al menos aproximadamente 1 %, 2 %, 3 %, 4 %, 5 %, 6 %, 7 %, 8%, 9%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%,

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98 %, 99 %, 100 %, 200 %, 300 %, 400 %, 500 % o más de la actividad de coagulación del polipéptido de FVII no modificado. Las actividades pueden medirse in vitro, ex vivo o in vivo.

Se proporcionan en el presente documento moléculas de ácido nucleico que contienen una secuencia de nucleótidos que codifica polipéptidos de FVII modificados proporcionados en el presente documento. También se proporcionan vectores que contienen dichas moléculas de ácido nucleico, incluyendo vectores procariotas, vectores virales o vectores eucariotas, tales como un vector de mamífero. Los vectores virales pueden seleccionarse de entre un adenovirus, un virus adenoasociado, un retrovirus, un virus del herpes, un lentivirus, un poxvirus y un citomegalovirus. Se proporcionan en el presente documento células que contienen estos vectores, incluyendo células eucariotas, tales como células de mamífero. Son ejemplos de células de mamífero células de riñón de cría de hámster (BHK-21) o células 293 o células CHO. En algunos ejemplos, las células expresan el polipéptido de FVII modificado. Por lo tanto, también se proporcionan en el presente documento polipéptidos de FVII modificados que se producen por estas células.

Se proporcionan en el presente documento composiciones farmacéuticas que contienen una concentración o cantidad terapéuticamente eficaz de cualquier polipéptido de FVII modificado de acuerdo con las presentes reivindicaciones o molécula de ácido nucleico, vector o célula proporcionada en el presente documento en un vehículo farmacéuticamente aceptable. En algunos ejemplos, la composición farmacéutica se formula para administración local, sistémica o tópica, tal como administración oral, nasal, pulmonar, bucal, transdérmica, subcutánea, intraduodenal, entérica, parenteral, intravenosa o intramuscular. Las composiciones farmacéuticas también pueden formularse para administración de liberación controlada y/o dosificación individual.

Se proporcionan en el presente documento polipéptidos de FVII modificados de acuerdo con las presentes reivindicaciones para su uso en métodos para tratar a un sujeto administrando una composición farmacéutica proporcionada en el presente documento, en los que el sujeto tiene una enfermedad o afección que se trata por la administración de FVII o un procoagulante, tal como por la administración de FVII activo (FVIIa). En algunos ejemplos, el tratamiento con la composición farmacéutica alivia o mejora los síntomas asociados con la enfermedad

o afección. En ejemplos adicionales, los métodos descritos en el presente documento también incluyen controlar al sujeto con respecto a cambios en los síntomas asociados con enfermedad o afección que se trata por la administración de FVII o un procoagulante. La enfermedad o afección para tratar usando los métodos descritos en el presente documento puede seleccionarse de entre trastornos de la coagulación sanguínea, trastornos hematológicos, trastornos hemorrágicos, hemofilia, (tal como hemofilia A, hemofilia B o hemofilia C, hemofilia congénita o adquirida), deficiencia del factor VII y trastornos de sangrado, incluyendo complicación de sangrado debido a cirugía (tal como cirugía cardiaca, angioplastia, cirugía pulmonar, cirugía abdominal, cirugía espinal, cirugía cerebral, cirugía vascular, cirugía dental o cirugía de trasplante de órganos) o traumatismo. En algunos ejemplos, el sangrado se manifiesta como hemartrosis aguda, artropatía hemofílica crónica, hematomas, hematuria, sangrados del sistema nervioso central, sangrados gastrointestinales o hemorragia cerebral. En ejemplos adicionales, el sangrado se debe a extracción dental. La cirugía de trasplante puede seleccionarse de entre trasplante de médula ósea, corazón, pulmón, páncreas e hígado.

En algunos ejemplos, el método descrito en el presente documento puede usarse para tratar a un sujeto que tiene autoanticuerpos para el factor VIII o factor IX. Los métodos descritos en el presente documento también pueden incluir administrar uno o más factores de coagulación adicionales, tales como factores de coagulación recombinantes o purificados de plasma, procoagulantes, tales como vitamina K, derivado de vitamina K e inhibidores de proteína C, plasma, plaquetas, glóbulos rojos y corticosteroides, o tratamientos.

También se describen en el presente documento artículos de fabricación que contienen material de envasado y una composición farmacéutica proporcionada en el presente documento contenida dentro del material de envasado. En algunos ejemplos, el polipéptido de FVII modificado en la composición farmacéutica es eficaz para el tratamiento de una enfermedad o un trastorno mediado por FVII, y el material envasado incluye un marcador que indica que el polipéptido de FVII modificado se usa para el tratamiento de una enfermedad o un trastorno mediado por FVII. También se describen en el presente documento kits, que comprenden una composición farmacéutica descrita en el presente documento, un dispositivo para administración de la composición y, opcionalmente, instrucciones para su administración.

Breve descripción de las figuras

La Figura 1 representa la cascada de coagulación. La figura muestra la ruta intrínseca y la ruta extrínseca de coagulación para la producción independiente de FXa y convergencia de las rutas a una ruta común para generar trombina y fibrina para la formación de un coágulo. Estas rutas están interconectadas. La figura representa el orden de las moléculas implicadas en la cascada de activación en la que un zimógeno se convierte en una proteasa activada por escisión de uno o más enlaces peptídicos. La proteasa activada actúa después como la proteasa de activación para la siguiente molécula de zimógeno en la cascada, dando como resultado en última instancia formación de coágulos. La Figura 2 representa el modelo de coagulación basado en células (véase, por ejemplo, Hoffman et al. (2001) Thromb Haemost 85: 958-965). La figura representa los acontecimientos de coagulación como separados en tres

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fases, en las que el inicio de coagulación se efectúa por la activación de FX a FXa por el complejo de FT/FVIIa en la célula portadora de FT, dando como resultado la generación de una cantidad pequeña de trombina después de la activación por FXa/FVa. La amplificación tiene lugar cuando la trombina se une con y activa las plaquetas, e inicia la activación de suficientes cantidades de los factores de coagulación apropiados para formar los complejos de FVIIIa/FIXa y FVa/FXa. Se produce propagación de la coagulación en la superficie de grandes cantidades de plaquetas activadas en el sitio de lesión, dando como resultado un estallido de generación de trombina que es suficientemente grande para generar suficiente fibrina a partir de fibrinógeno para establecer un coágulo en el sitio de lesión. La Figura 3 representa los mecanismos por los que FVIIa puede iniciar la formación de trombina. La figura ilustra la ruta dependiente de FT de generación de trombina por FVIIa, que actúa en la superficie de una célula portadora de FT e implica formación de complejo de FVIIa con FT antes de la activación de FX a FXa. La figura también representa la ruta independiente de FT de la generación de trombina por FVIIa, durante la que FVIIa se une con fosfolípidos en la plaqueta activada y activa FX a FXa, que a su vez forma complejos con FVa para escindir la protrombina a trombina.

Descripción detallada

Esquema

A. Definiciones

B. Visión de conjunto de Hemostasia

1.: Adhesión y agregación de plaquetas

2.: Cascada de coagulación

a.: Inicio

b.: Amplificación

c.: Propagación

3.: Regulación de la Coagulación

C. Factor VII (FVII)

1.: Estructura y organización de FVII

2.: Modificaciones Postraduccionales

3.: Procesamiento de FVII

4.: Activación de FVII

5.: Función de FVII

a.: Actividad de FVIIa dependiente de factor tisular

b.: Actividad de FVIIa independiente de factor tisular

6.: FVII como un producto biofarmacéutico

D. Polipéptidos de FVII modificados

1. Actividad catalítica aumentada

a. Modificaciones ejemplares para aumentar la actividad catalítica

i. Sustituciones de aminoácidos básicos en la posición 286

ii. Otras mutaciones en la posición 286

2.: Resistencia aumentada a AT-III Modificaciones ejemplares para efectuar resistencia aumentada a AT-III

3.: Resistencia aumentada a la inhibición por Zn2+ Modificaciones ejemplares para aumentar la resistencia a la inhibición por Zn2+

4.: Glucosilación alterada Modificaciones ejemplares para alterar la glucosilación

5.: Unión aumentada a albúmina de suero y/o integrina de plaqueta IIb3

a.: Polipéptidos de FVII ejemplares con secuencias de unión a albúmina de suero

b.: Polipéptidos de FVII ejemplares con secuencias de unión a integrina de plaqueta IIb3

6.: Modificación por introducción de un dominio Gla heterólogo

7.: Combinaciones y modificaciones adicionales

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del mismo. Se incluyen polipéptidos de FVII modificados, tales como los de SEC ID Nº: 113 y 273 y variantes de los mismos. También se incluyen los que conservan al menos una actividad de un FVII, tal como unión a FT, unión a factor X, unión a fosfolípido y/o actividad coagulante de un FVII. Conservando la actividad, la actividad puede alterarse, tal como reducirse o aumentarse, en comparación con un FVII de tipo silvestre siempre que el nivel de actividad conservado sea suficiente para producir un efecto detectable. Los polipéptidos de FVII incluyen, pero sin limitación, isoformas específicas de tejido y variantes alélicas de las mismas, moléculas sintéticas preparadas por traducción de ácidos nucleicos, proteínas generadas por síntesis química, tal como síntesis que incluyen ligamiento de polipéptidos más cortos, mediante métodos recombinantes, proteínas aisladas de tejido y células humanos y no humanos, polipéptidos de FVII quiméricos y formas modificadas de los mismos. Los polipéptidos de FVII también incluyen fragmentos o partes de FVII que son de suficiente longitud o incluyen regiones apropiadas para conservar al menos una actividad (tras la activación si es necesario) de un polipéptido maduro de longitud completa. Los polipéptidos de FVII también incluyen los que contienen modificaciones químicas o postraduccionales y los que no contienen modificaciones químicas o postraduccionales. Dichas modificaciones incluyen, pero sin limitación, pegilación, albuminación, glucosilación, farnisilacion, carboxilación, hidroxilación, fosforilación y otras modificaciones de polipéptidos conocidas en la técnica.

Son polipéptidos de FVII ejemplares los de origen de mamífero, incluyendo humano. Se exponen secuencias de aminoácidos ejemplares de FVII de origen humano en SEC ID Nº: 1, 2 y 3. Las variantes ejemplares de dicho polipéptido de FVII humano incluyen cualquiera de los polipéptidos precursores expuestos en SEC ID Nº: 18-74. Los polipéptidos de FVII también incluyen cualquiera de origen no humano incluyendo, pero sin limitación, polipéptidos de factor VII murinos, caninos, felinos, leporinos, aviares, bovinos, ovinos, porcinos, equinos, ictícolas, anfibios y de otros primates. Los polipéptidos de FVII ejemplares de origen no humano incluyen, por ejemplo, vaca (Bos taurus, SEC ID Nº: 4), ratón (Mus musculus, SEC ID Nº: 5), chimpancé pigmeo (Pan paniscus, SEC ID Nº: 6), chimpancé (Pan troglodytes, SEC ID Nº: 7), conejo (Oryctolagus cuniculus, SEC ID Nº: 8), rata (Rattus norvegicus, SEC ID Nº: 9), macaco rhesus (Macaca mulatta, SEC ID Nº: 10), cerdo (Sus scrofa, SEC ID Nº: 11), perro (Canis familiaris, SEC ID Nº: 12), pez cebra (Brachydanio rerio, SEC ID Nº: 13), pez globo Japonés (Fugu rubripes, SEC ID Nº: 14), pollo (Gallus gallus, SEC ID Nº: 15), orangután (Pongo pygmaeus, SEC ID Nº: 16) y gorila (Gorilla gorilla, SEC ID Nº: 17).

Un experto en la materia reconoce que las posiciones referidas del polipéptido del factor VII maduro (SEC ID Nº: 3) difieren en 60 restos de aminoácidos en comparación con la isoforma de un polipéptido de FVII precursor expuesto en SEC ID Nº: 1, que es la isoforma de un polipéptido de factor VII que contienen el péptido señal y secuencias propeptídicas. Por lo tanto, el primer resto de aminoácido de SEC ID Nº: 3 “corresponde a” el sexagésimo primer (61º) resto de aminoácido de SEC ID Nº: 1. Un experto en la materia también reconoce que las posiciones referidas del polipéptido del factor VII maduro (SEC ID Nº: 3) difieren en 38 restos de aminoácidos en comparación con el polipéptido de FVII precursor expuesto en SEC ID Nº: 2, que es el polipéptido del factor VII de isoforma b que contiene las secuencias del péptido y propéptido señal. Por lo tanto, el primer resto de aminoácido de SEC ID Nº: 3 “corresponde a” el trigésimo noveno (39º) resto de aminoácido de SEC ID Nº: 2.

Como se usa en el presente documento, los restos correspondientes se refieren a restos que aparecen en loci alineados. Los polipéptidos relacionados o variantes se alinean por cualquier método conocido por los expertos en la materia. Dichos métodos típicamente maximizan las coincidencias, e incluyen métodos tales como el uso de alineamientos manuales y el uso de los numerosos programas de alineamiento disponibles (por ejemplo, BLASTP) y otros conocidos por los expertos en la materia. Alineando las secuencias de polipéptidos, un experto en la materia puede identificar restos correspondientes, usando restos de aminoácidos conservados idénticos como guías. Por ejemplo, alineando las secuencias de polipéptidos de factor VII, un experto en la materia puede identificar restos correspondientes, usando restos de aminoácidos conservados e idénticos como guías. Por ejemplo, la alanina en la posición de aminoácido 1 (A1) de SEC ID Nº: 3 (factor maduro VII) corresponde a la alanina en la posición de aminoácido 61 (A61) de SEC ID Nº: 1, y la alanina en la posición de aminoácido 39 (A39) de SEC ID Nº: 2. En otros casos, pueden identificarse regiones correspondientes. Por ejemplo, el dominio Gla corresponde a las posiciones de aminoácidos A1 a F45 de SEC ID Nº: 3, a las posiciones de aminoácidos A61 hasta S105 de SEC ID Nº: 1 y a las posiciones de aminoácidos A39 a S83 de SEC ID Nº: 2. Un experto en la materia también puede emplear restos de aminoácidos conservados como guías para encontrar restos de aminoácidos correspondientes entre y dentro de secuencias humanas y no humanas. Por ejemplo, los restos de aminoácidos S43 y E163 de SEC ID Nº: 3 (humana) corresponden a S83 y E203 de SEC ID Nº: 4 (bovina). Las posiciones correspondientes también pueden basarse en alineamientos estructurales, por ejemplo usando alineamientos simulados por ordenador de la estructura proteica. En otros casos, pueden identificarse regiones correspondientes.

Como se usa en el presente documento, una “prorregión”, un “propéptido” o una “prosecuencia” se refieren a una región o un segmento que se escinde para producir una proteína madura. Esto puede incluir segmentos que actúan para suprimir la actividad proteolítica enmascarando la maquinaria catalítica y evitando por lo tanto la formación del intermedio catalítico (es decir, ocluyendo de forma estérica el sitio de unión a sustrato). Una prorregión es una secuencia de aminoácidos situada en el extremo amino terminal de un polipéptido biológicamente activo maduro y puede ser tan poco como algunos aminoácidos o puede ser una estructura multidominio.

Como se usa en el presente documento, “factor VII maduro” se refiere a un polipéptido de FVII que carece de una secuencia señal y una secuencia propeptídica. Típicamente, una secuencia señal se dirige a una proteína para

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capacidad para unirse con el factor tisular, factor X o factor IX; y/o capacidad para unirse con fosfolípidos. En algunos casos, un polipéptido de FVII modificado puede conservar una actividad que aumenta en comparación con un polipéptido de FVII no modificado. En algunos casos, un polipéptido de FVII modificado puede conservar una actividad que se traduce en comparación con un polipéptido de FVII no modificado. La actividad de un polipéptido de FVII modificado puede ser cualquier nivel de porcentaje de actividad del polipéptido no modificado, donde ambos polipéptidos están en la misma forma, incluyendo pero sin limitación, 1 % de actividad, 2 %, 3 %, 4 %, 5 %, 10 %, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99%, 100%, 200%, 300%, 400%, 500 %, o más actividad en comparación con el polipéptido que no contiene la modificación en cuestión. Por ejemplo, un polipéptido de FVII modificado puede mostrar actividad aumentada o reducida en comparación con el polipéptido de FVII no modificado en la misma forma. Por ejemplo, puede conservar al menos aproximadamente o 1 %, 2 %, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98 % o al menos 99 % de la actividad del polipéptido de FVII no modificado. En otras realizaciones, el cambio de actividad es al menos aproximadamente 2 veces, 3 veces, 4 veces, 5 veces, 6 veces, 7 veces, 8 veces, 9 veces, 10 veces, 20 veces, 30 veces, 40 veces, 50 veces, 60 veces, 70 veces, 80 veces, 90 veces, 100 veces, 200 veces, 300 veces, 400 veces, 500 veces, 600 veces, 700 veces, 800 veces, 900 veces, 1000 veces, o más veces mayor que FVII no modificado. El nivel particular para conservar está en función del uso pretendido del polipéptido y puede determinarse de forma empírica. La actividad puede medirse, por ejemplo, usando ensayos in vitro o in vivo tales como los descritos en el presente documento o en los ejemplos posteriores.

Como se usa en el presente documento, “actividad de coagulación”, “actividad coagulante” o “actividad procoagulante” se refieren a la capacidad de un polipéptido para efectuar coagulación. Los expertos en la materia conocen ensayos para evaluar la actividad coagulante, e incluyen ensayo de tiempo de protromboplastina (PT) o el ensayo del tiempo de tromboplastina parcial activada (aP1T).

Como se usa en el presente documento, “actividad catalítica” o “actividad proteolítica” en referencia a FVII se refiere a la capacidad de una proteína FVII para catalizar la escisión proteolítica de un sustrato, y se usan indistintamente. Se conocen en la técnica ensayos para evaluar dichas actividades. Por ejemplo, la actividad proteolítica de FVII puede medirse usando sustratos cromogénicos tales como FVIIa Spectrozyme (CH3SO2-D-CHA-But-Arg-pNA), en el que la escisión de un sustrato se controla por la absorbancia y la tasa de hidrólisis de sustrato determinada por regresión lineal.

Como se usa en el presente documento, “actividad intrínseca” con referencia a FVII se refiere a la actividad catalítica, proteolítica y/o coagulante de una proteína de FVII en ausencia de factor tisular.

Como se usa en el presente documento, el dominio (típicamente una secuencia de tres o más, generalmente 5 o 7 o más aminoácidos) se refiere a una parte de una molécula, tal como proteínas o los ácidos nucleicos codificantes, que es estructuralmente y/o funcionalmente distinta de otras partes de la molécula y es identificable. Por ejemplo, los dominios incluyen las partes de una cadena polipeptídica que pueden formar una estructura plegada de forma independiente dentro de una proteína compuesta de uno o más motivos estructurales y/o que se reconoce en virtud de una actividad funcional, tal como actividad proteolítica. Una proteína puede tener un, o más de un, dominios distintos. Por ejemplo, un dominio puede identificarse, definirse o distinguirse por la homología de la secuencia en el mismo con miembros de la familia relacionados, tal como homología con motivos que definen un dominio de proteasa o un dominio Gla. En otro ejemplo, un dominio puede distinguirse por su función, tal como por actividad proteolítica, o una capacidad para interaccionar con una biomolécula, tal como unión a ADN, unión a ligando y dimerización. Un dominio de forma independiente puede mostrar una función o actividad biológica de modo que el dominio de forma independiente o fusionado con otra molécula pueda realizar una actividad, tal como, por ejemplo, actividad proteolítica o unión a ligando. Un dominio puede ser una secuencia lineal de aminoácidos o una secuencia no lineal de aminoácidos. Muchos polipéptidos contienen una pluralidad de dominios. Dichos dominios se conocen, y pueden identificarse por los expertos en la materia. Para ejemplificación en el presente documento, se proporcionan definiciones, pero se entiende que está dentro de la experiencia de la técnica reconocer dominios particulares por nombre. Si es necesario puede emplearse el software apropiado para identificar dominios.

Como se usa en el presente documento, un dominio de proteasa es la parte catalíticamente activa de una proteasa. La referencia a un dominio de proteasa de una proteasa incluye las formas monocatenaria, bicatenaria y multicatenaria de cualquiera de estas proteínas. Un dominio de proteasa de una proteína contiene todas las propiedades requeridas de esa proteína requeridas para su actividad proteolítica, tal como por ejemplo, el centro catalítico. En referencia a FVII, el dominio de proteasa comparte homología y característica estructural con los dominios de proteasa de la familia de quimotripsina/tripsina, incluyendo la tríada catalítica. Por ejemplo, en el polipéptido de FVII maduro expuesto en SEC ID Nº: 3, el dominio de proteasa corresponde a las posiciones de aminoácidos 153 a 392.

Como se usa en el presente documento, un dominio de gamma-carboxiglutamato (Gla) se refiere a la parte de una proteína, por ejemplo una proteína dependiente de vitamina K, que contiene modificaciones postraduccionales de restos de glutamato, generalmente la mayoría, pero no todos, de los restos de glutamato, por carboxilación dependiente de vitamina K para formar Gla. El dominio Gla es responsable de la unión de alta afinidad de iones de calcio y unión con fosfolípidos con carga negativa. Típicamente, el dominio Gla comienza en el extremo N terminal

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convencional, tal como el algoritmo GAP. Los números de quimotripsina correspondientes de las posiciones de aminoácidos 1 a 406 del polipéptido de FVII expuesto en SEC ID Nº: 3 se proporcionan en la Tabla 1. Las posiciones de aminoácidos relativas a la secuencia expuesta en SEC ID Nº: 3 están en fuente normal, los restos de aminoácidos en esas posiciones están en negrita, y los números de quimotripsina correspondientes están en 5 cursiva. Por ejemplo, tras el alineamiento del factor VII maduro (SEC ID Nº: 3) con quimotripsina madura (SEC ID Nº: 80), se proporciona a la isoleucina (I) en la posición de aminoácido 153 en el factor VII la numeración de quimotripsina de 116. Los aminoácidos posteriores se numeran en consecuencia. En un ejemplo, un ácido glutámico

(E) en la posición de aminoácido 210 del factor VII maduro (SEC ID Nº: 3) corresponde a la posición de aminoácido de E70 basada en la numeración de quimotripsina. Cuando existe un resto en una proteasa, pero no está presente

10 en quimotripsina, se proporciona al resto de aminoácido una notación de una letra. Por ejemplo, los restos en quimotripsina que son parte de un bucle con el aminoácido 60 basándose en la numeración de quimotripsina, pero se insertan en la secuencia del factor VII en comparación con quimotripsina, se denominan por ejemplo K60a, 160b, K60c o N60d. Estos restos corresponden a K197, I198, K199 y N200, respectivamente, por numeración relativa a la secuencia del factor VII maduro (SEC ID Nº: 3).

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Tabla 1. Numeración de quimotripsina en el factor VII

153: 154 155 156 157 158 159 160 161 162 163 164 165 166 167

I: V G G K V C P K G E C P W Q

16: 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30

168: 169 170 171 172 173 174 175 176 177 178 179 180 181 182

V: L L L V N G A Q L C G G T L

31: 32 33 34 35 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46

183: 184 185 186 187 188 189 190 191 192 193 194 195 196 197

I: N T I W V V S A A H C F D K

47: 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 60A

198: 199 200 201 202 203 204 205 206 207 208 209 210 211 212

I: K N W R N N I A V L G E H D

60B: 60C 60D 61 62 63 64 65 66 67 68 69 70 71 72

213: 214 215 216 217 218 219 220 221 222 223 224 225 226 227

L: S E H D G D E Q S R R V A Q

73: 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87

228: 229 230 231 232 233 234 235 236 237 238 239 240 241 242

V: I I P S T Y V P G T T N H D

88: 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 100 101 102

243: 244 245 246 247 248 249 250 251 252 253 254 255 256 257

I: A L L R L H Q P V V L T D H

103: 104 105 106 107 108 109 110 111 112 113 114 115 116 117

258: 259 260 261 262 263 264 265 266 267 268 269 270 271 272

V
V: P L C L P E R T F S E R T

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118: 119 120 121 122 123 124 125 126 127 128 129 129A 129B 129C

273: 274 275 276 277 278 279 280 281 282 283 284 285 286 287

L: A F V R F S L V S G W G Q
L

129D: 129E 129F 129G 134 135 136 137 138 139 140 141 142 143 144

288: 289 290 291 292 293 294 295 296 297 298 299 300 301 302

L: D R G A T A L E L M V L N V

145: 146 147 149 150 151 152 153 154 155 156 157 158 159 160

303: 304 305 306 307 308 309 310 311 312 313 314 315 316 317

P: R L M T Q D C L Q Q S R K V

161: 162 163 164 165 166 167 168 169 170 170A 170B 170C 170D 170E

318: 319 320 321 322 323 324 325 326 327 328 329 330 331 332

G: D S P N I T E Y M F C A G Y

170F: 170G 170H 170I 175 176 177 178 179 180 181 182 183 184A 184

333: 334 335 336 337 338 339 340 341 342 343 344 345 346 347

S: D G S K D S C K G D S G G P

185: 186 187 188A 188 189 190 191 192 193 194 195 196 197 198

348: 349 350 351 352 353 354 355 356 357 358 359 360 361 362

H: A T H Y R G T W Y L T G I V

199: 200 201 202 203 204 205 206 207 208 209 210 211 212 213

363: 364 365 366 367 368 369 370 371 372 373 374 375 376 377

S: W G Q G C A T V G H F G V Y

214: 215 216 217 219 220 221A 221 222 223 224 225 226 227 228

378: 379 380 381 382 383 384 385 386 387 388 389 390 391 392

T: R V S Q Y I E W L Q K L M R

229: 230 231 232 233 234 235 236 237 238 239 240 241 242 243

393: 394 395 396 397 398 399 400 401 402 403 404 405 406

S: E P R P G V L L R A P F P

244: 245 246 247 248 249 250 251 252 253 254 255 256 257

Como se usa en el presente documento, los ácidos nucleicos incluyen ADN, ARN y análogos de los mismos, incluyendo ácidos nucleicos peptídicos (PNA) y mezclas de los mismos. Los ácidos nucleicos pueden ser monocatenarios o bicatenarios. Cuando se hace referencia a sondas o cebadores, que están opcionalmente

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marcados, tal como con un marcador detectable, tal como un marcador fluorescente o radiomarcador, se contemplan moléculas monocatenarias. Dichas moléculas son típicamente de una longitud tal que su diana sea estadísticamente única o de un número de copias bajo (típicamente menor de 5, generalmente menor de 3) para explorar o aplicar un cebador a una biblioteca. Generalmente una sonda o cebador contiene al menos 14, 16 o 30

5 nucleótidos contiguos de secuencia complementaria a o idéntica a un gen de interés. Las sondas y los cebadores pueden ser de 10, 20, 30, 50, 100 o más ácidos nucleicos de longitud.

Como se usa en el presente documento, un péptido se refiere a un polipéptido que es de 2 a 40 aminoácidos de longitud.

10 Como se usa en el presente documento, los aminoácidos que aparecen en las diversas secuencias de aminoácidos proporcionadas en el presente documento se identifican de acuerdo con sus abreviaturas de tres letras o una letra conocidas (Tabla 2). Los nucleótidos que aparecen en los diversos fragmentos de ácido nucleico se designan con las designaciones de una única letra convencionales usadas habitualmente en este campo.

15 Como se usa en el presente documento, un “aminoácido” es un compuesto orgánico que contiene un grupo amino y un grupo de ácido carboxílico. Un polipéptido contiene dos o más aminoácidos. Para fines del presente documento, los aminoácidos incluyen los veinte aminoácidos de origen natural, aminoácidos no naturales y análogos de aminoácidos (es decir, aminoácidos en los que el carbono  tiene una cadena lateral).

20 De conformidad con la nomenclatura de polipéptidos convencional descrita en J. Biol. Chem., 243: 3552-3559 (1969), y adoptada en 37 C.F.R..§§ 1.821-1.822, se muestran abreviaturas para los restos de aminoácidos en la Tabla 2:

25 Tabla 2 -Tabla de correspondencia

SÍMBOLO

1 Letra: 3 Letras AMINOÁCIDO

Y: Tyr Tirosina

G: Gly Glicina

F: Phe Fenilalanina

M: Met Metionina

A: Ala Alanina

S: Ser Serina

I: Ile Isoleucina

L: Leu Leucina

T: Thr Treonina

V: Val Valina

P: Pro prolina

K: Lys Lisina

H: His Histidina

Q: Gln Glutamina

E: Glu ácido glutámico

Z: Glx Glu y/o Gin

W: Trp Triptófano

R: Arg Arginina

D: Asp ácido aspártico

N: Asn asparagina

B: Asx Asn y/o Asp

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SÍMBOLO

1 Letra: 3 Letras AMINOÁCIDO

C: Cys Cisteína

X: Xaa Desconocido u otro

Debería observarse que todas las secuencias de restos de aminoácidos representadas en el presente documento por fórmulas tienen una orientación de izquierda a derecha en la dirección convencional de amino terminal a carboxilo terminal. Además, se define en general que la expresión “resto de aminoácido” incluye los aminoácidos enumerados en la Tabla de Correspondencia (Tabla 2) y aminoácidos modificados y poco habituales, tales como los referidos en 37 C.F.R. §§ 1.821-1.822, e incorporados en el presente documento por referencia. Además, debería observarse que un guión al comienzo o al final de una secuencia de restos de aminoácidos indica un enlace peptídico con una secuencia adicional de uno o más restos de aminoácidos, con un grupo amino terminal tal como NH2 o con un grupo carboxilo terminal tal como COOH.

Como se usa en el presente documento, un “aminoácido hidrófobo” incluye uno cualquiera de los aminoácidos que se ha determinado que son hidrófobos usando la escala de consenso de hidrofobicidad de Eisenberg. Son ejemplos los aminoácidos hidrófobos de origen natural, tales como isoleucina, fenilalanina, valina, leucina, triptófano, metionina, alanina, glicina, cisteína y tirosina (Eisenberg et al., (1982) Faraday Symp. Chem. Soc. 17: 109-120). También se incluyen aminoácidos hidrófobos de origen no natural.

Como se usa en el presente documento, un “aminoácido ácido” incluye entre los aminoácidos de origen natural restos de ácido aspártico y ácido glutámico. También se incluyen aminoácidos ácidos de origen no natural.

Como se usa en el presente documento, “aminoácidos de origen natural” se refiere a los 20 aminoácidos L que aparecen en polipéptidos.

Como se usa en el presente documento, “aminoácido no natural” se refiere a un compuesto orgánico que contiene un grupo amino y un grupo de ácido carboxílico que no es uno de los aminoácidos de origen natural enumerados en la Tabla 2. Los aminoácidos de origen no natural incluyen por lo tanto, por ejemplo, aminoácidos o análogos de aminoácidos distintos de los 20 aminoácidos de origen natural e incluyen, pero sin limitación, los D-isoestereómeros de aminoácidos. Se conocen por los expertos en la materia aminoácidos no naturales ejemplares y pueden incluirse en un polipéptido de factor VII modificado.

Como se usa en el presente documento, una construcción de ADN es una molécula de ADN lineal o circular, monocatenaria o bicatenaria, que contienen segmentos de ADN combinados y yuxtapuestos de una manera no hallada en la naturaleza. Las construcciones de ADN existen como resultado de la manipulación humana, e incluyen clones y otras copias de moléculas manipuladas.

Como se usa en el presente documento, un segmento de ADN es una parte de una molécula de ADN mayor que tiene atributos específicos. Por ejemplo, un segmento de ADN que codifica un polipéptido específico es una parte de una molécula de ADN más larga, tal como un plásmido o fragmento plasmídico que, cuando se lee en la dirección de 5’ a 3’, codifica la secuencia de aminoácidos del polipéptido específico.

Como se usa en el presente documento, el término polinucleótido significa un polímero monocatenario o bicatenario de bases desoxirribonucleotídicas o ribonucleotídicas leídas del extremo 5’ al 3’. Los polinucleótidos incluyen ARN y ADN, y pueden aislarse de fuentes naturales, sintetizadas in vitro, o prepararse a partir de una combinación de moléculas naturales y sintéticas. La longitud de una molécula polinucleotídica se proporciona en el presente documento con respecto a nucleótidos (abreviado “nt”) o pares de bases (abreviado “pb”). El término nucleótidos se usa para moléculas mono y bicatenarias cuando el contexto lo permita. Cuando el término se aplica a moléculas bicatenarias se usa para indicar longitud global y se entenderá que es equivalente a la expresión pares de bases. Se reconocerá por los expertos en la materia que las dos cadenas de un polinucleótido bicatenario pueden diferir ligeramente en su longitud y que los extremos de las mismas pueden ser escalonados; por lo tanto todos los nucleótidos dentro de una molécula polinucleotídica bicatenaria no pueden emparejarse. Dichos extremos no emparejados, en general, no superarán los 20 nucleótidos de longitud.

Como se usa en el presente documento, la “secuencia primaria” se refiere a la secuencia de restos de aminoácidos en un polipéptido.

Como se usa en el presente documento, la “similitud” entre dos proteínas o ácidos nucleicos se refiere a la relación entre la secuencia de aminoácidos de las proteínas o las secuencias de nucleótidos de los ácidos nucleicos. La similitud puede basarse en el grado de identidad y/u homología de secuencias de restos y los restos contenidos en las mismas. Se conocen por los expertos en la materia métodos para evaluar el grado de similitud entre proteínas o ácidos nucleicos. Por ejemplo, en un método para evaluar la similitud de secuencia, se alinean dos secuencias de

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Se consigue adhesión y posterior activación de plaquetas cuando vWF se une mediante su dominio A con GPIb (parte del complejo de receptor de glucoproteína de plaquetas GPIb-IX-V). La interacción entre vWF y GPIb está regulada por fuerza de corte de modo que un aumento en el esfuerzo cortante dé como resultado un aumento correspondiente en la afinidad de vWF por GPIb. La integrina 12, también conocida en leucocitos como VLA-2, es

5 el receptor de colágeno principal en plaquetas, y la interacción mediante este receptor genera las señales intracelulares que contribuyen a la activación de plaquetas. La unión mediante 12 facilita la interacción del receptor de colágeno de menos afinidad, GP VI. Este es parte de la superfamilia de inmunoglobulina y es el receptor que genera las señales intracelulares más potentes para activación de plaquetas. La activación de plaquetas da como resultado la liberación de adenosin difosfato (ADP), que se convierte en tromboxano A2.

10 La activación de plaquetas también da como resultado expresión en superficie de receptores de glucoproteína de plaquetas IIb-IIIa (GP IIb-IIIa), también conocidos como integrina de plaquetas IIb3. Los receptores de GP IIb-IIIa permiten la adherencia de plaquetas entre sí (es decir agregación) en virtud de moléculas de fibrinógeno que unen las plaquetas a través de estos receptores. Esto da como resultado la formación de un tapón plaquetario en el sitio

15 de lesión para ayudar a prevenir pérdida de sangre adicional, mientras que el tejido vascular dañado libera factores que inician la cascada de coagulación y la información de una red de fibrina estabilizante alrededor del tapón plaquetario.

2. Cascada de coagulación

20 La ruta de coagulación es una ruta proteolítica donde cada enzima está presente en el plasma como un zimógeno, o una forma inactiva. La escisión del zimógeno está regulada para liberar la forma activa de la molécula precursora. Los cofactores de las proteasas activadas, tales como las glucoproteínas FVIII y FV, también están activados en la reacción de cascada y desempeña un papel en la formación de coágulos. La ruta actúa como una serie de bucles de

25 retroalimentación positiva y negativa que controlan el proceso de activación, donde el objetivo último es producir trombina, que después puede convertir fibrinógeno soluble en fibrina para formar un coágulo. Se proporciona típicamente a los factores en la coagulación un número romano, con una “a” en minúscula adjunta para indicar una forma activada. La Tabla 3 a continuación expone una lista ejemplar de los factores, incluyendo su nombre común, y su papel en la cascada de coagulación. En general, estas proteínas participan en la coagulación sanguínea a través

30 de una o más de las rutas de coagulación intrínseca, extrínseca o común (véase Figura 1). Como se analiza posteriormente, estas rutas están interconectadas, y se cree que la coagulación sanguínea se produce a través de un modelo basado en células de activación siendo el Factor VII (FVII) el iniciador primario de la coagulación.

Tabla 3

Factores de Coagulación

Factor: Nombre Común Ruta Característica

I: Fibrinógeno Ambas -

II: Protrombina Ambas Contiene dominio Gla N terminal

III: Factor Tisular Extrínseca -

IV: Calcio Ambas -

V: Proaccelerina, factor lábil, globulina Acelerante Ambas Cofactor proteico

VI (Va): Accelerina - (Redundante para factor V)

VII: Proconvertina, cotromboplastina aceleradora de conversión de protrombina en suero (SPCA) Extrínseca Endopeptidasa con dominio Gla

VIII: Factor antihemofílico A, globulina antihemofílica (AHG) Intrínseca Cofactor proteico

IX: Factor Christmas, factor antihemofílico B, componente de tromboplastina en plasma (PTC) Intrínseca Endopeptidasa con dominio Gla

X: Factor de Stuart-prower Ambas Endopeptidasa con dominio Gla

XI: Antecedente de tromboplastina en plasma (PTA) Intrínseca Endopeptidasa

XII: Factor de Hageman Intrínseca Endopeptidasa

XIII: Protransglutamidasa, factor estabilizante de fibrina (FSF), fibrinoligasa Ambas Transpeptidasa

32

imagen22

imagen23

Zimógenos de Factor de Coagulación y Cofactores

Nombre del Factor: Actividad

Zimógenos de Serina Proteasas

Factor IX: Activado por factor XIa + Ca2+

Factor VII: Activado por trombina, factor X, factor IXa o factor XIIa + Ca2+ , o autoactivación

Factor X: Activado en la superficie de plaquetas por el complejo de tenasa (FIXa/FVIIIa); También activado por factor VIIa + factor tisular + Ca2+, o factor VIIa + Ca2+

Factor II: Activado en la superficie de plaquetas por el complejo de protrombinasa (FXa/FVa)

Cofactores

Factor VIII: Activado por trombina; el factor VIIIa actúa como cofactor para el factor IXa en la activación del factor X

Factor V: Activado por trombina; el factor Va actúa como cofactor para el factor Xa en la activación de protrombina

Factor III (factor Tisular): Actúa como cofactor para el factor VIIa

Fibrinógeno

Factor I (Fibrinógeno): Escindido por trombina para formar fibrina

Transglutaminasa

Factor XIII: Activado por trombina + Ca2+; promueve la reticulación covalente de fibrina

Proteínas reguladoras y otras

Factor de von Willebrand (vWF): Actúa como enlace entre el complejo de GPIb-V-IX y colágeno

Proteína C: Activado por trombina unida a trombomodulina; Ca degrada los factores VIIIa y Va

Proteína S: Actúa como cofactor de la proteína C

Trombomodulina: Proteína de superficie celular endotelial; se une con trombina, que activa la proteína C

Antitrombina III: Inhibidor de coagulación, principalmente de trombina y factor Xa, pero también factores IXa, XIa, y XIIa, y el factor VIIa en complejo con FT

Inhibidor de la Ruta del Factor Tisular (IRFT): Se une con FXa y después forma una estructura cuaternaria con FT/FVIIa para inhibir la actividad de FT/FVIIa

*Tabla adaptada de M. W. King (2006) med.unibs.it/marchesi/blood.html

C. Factor VII (FVII)

El factor VII es una glucoproteína de serina proteasa dependiente de vitamina K que se sintetiza en animales,

5 incluyendo mamíferos, como un zimógeno monocatenario en el hígado y se secreta el torrente sanguíneo. Como se ha descrito anteriormente, FVII es la proteasa de coagulación responsable de iniciar la cascada de acontecimientos proteolíticos que conducen a generación de trombina y deposición de fibrina. Es parte de la ruta extrínseca, aunque los efectos corriente abajo de su actividad también influyen en gran medida en la ruta intrínseca. Este papel integral en la función de coágulos ha atraído un interés significativo en FVII como una diana para terapias anticoagulantes y

10 hemostáticas clínicas. Por ejemplo, se ha desarrollado FVII activado recombinante (rFVIIa) como un agente hemostático para su uso en sujetos hemófilos, y sujetos con otras afecciones de sangrado. Se proporcionan en el presente documento polipéptidos de FVII modificados que se diseñan para tener actividad de coagulación aumentada tras su activación, y que pueden actuar como productores terapéuticos mejorados para tratar enfermedades y afecciones susceptibles a terapia de factor VII.

15

35

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imagen33

Modificación -numeración de FVII maduro: Modificación -numeración de quimotripsina SEC ID Nº

Q286R/S222A/H257A: S82A/H117A/Q143R 134

Intercambio de Gla FIX/S222A/Q286R: S82A/Intercambio de Gla FIX/Q143R 135

Intercambio de Gla FIX/H257A/Q286R: H117A/Intercambio de Gla FLX/Q143R 136

Intercambio de Gla FIX /S222A/H257A/Q286R: Q143R/S82A/H117A/Intercambio de Gla FIX 137

Q286R/M298Q: Q143R/M156Q 138

Q286R/M298Q/K341Q: Q143R/M156Q/K192Q 139

Q286R/M298Q/K199E: Q143R/M156Q/K60cE 140

S222A/H257A/Q286R/M298Q: S82A/H117A/Q143R/M156Q 150

A175S/Q286R/Q366V: A39S/Q143R/Q217V 144

S222A/Q286R/Q366V: S82A/Q143R/Q217V 145

H257S/Q286R: H117S/Q143R 146

H257S/Q286R/Q366V: H117S/Q143R/Q217V 147

S222A/H257A/Q286R/Q366V: S82A/H117A/Q143R/Q217V 148

Q286R/H373A: Q143R/H224A 149

Q286R/K341D: Q143R/K192D 151

Q286R/Q366D: Q143R/Q217D 152

Q286R/Q366N: Q143R/Q217N 153

Q286R/M298Q/Q366N: Q143R/M156Q/Q217N 155

Q286R/H373F: Q143R/H224F 156

Q286R/M298Q/H373F: Q143R/M156Q/H224F 157

Q286R/M298Q: Q143R/M156Q 138

T128N/P129A/Q286R: T[128]N/P[129]A/Q143R 279

Intercambio de Gla FIX/T128N/P129A/ S222A/Q286R: Intercambio de Gla FIX/T[128]N/P[129]A/ S82A/Q143R 285

Intercambio de Gla FIX/ S52A/S60A/S222A/Q286R: Intercambio de Gla FIX/ S[52]A/S[60]A/S82A/Q143R 292

Intercambio de Gla FIX/Q286R/M298Q: Intercambio de Gla FIX/Q143R/M156Q 141

T128N/P129A/Q286R/ M298Q: T[128]N/P[129]A/Q 143R/M156Q 280

Intercambio de Gla FIX/T128N/P129A/Q286R/M298Q: Intercambio de Gla FIX/T[128]N/P[129]A/Q143R/ M156Q 286

{Intercambio de Gla FIX/E40L}/ Q286R/M298Q: {Intercambio de Gla FIX/E[40]L}/ Q143R/M156Q 274

{Intercambio de Gla FIX/K43I}/ Q286R/M298Q: {Intercambio de Gla FIX/K[43]I}/ Q143R/M156Q 275

{Intercambio de Gla FIX/Q44S}/ Q286R/M298Q: {Intercambio de Gla FIX/Q[44]S}/ Q143R/M156Q 276

{Intercambio de Gla FIX/M19K}/Q286R/M298Q: {Intercambio de Gla FIX/M[19]K}/ Q143R/M156Q 277

S52A/S60A/Q286R/M298Q: S[52]A/S[60]A/Q143R/M156Q 293

T128N/P129A/S222A/H257A/Q286R/M298Q: T[128]N/P[129]A/S82A/H117A/Q14 3R/M156Q 287

S52A/S60A/S222A/H257A/Q286R/M298Q: S[52]A/S[60]A/S82A/H117A/Q143R /M156Q 298

T128N/P129A/Q286R/H373F: T[128]N/P[129]A/Q143R/H224F 281

S52A/S60A/ Q286R/H373F: S[52]A/S[60]A/Q143R/H224F 296

46

T128N/P129A/Q286R/M298Q/H373F: T[128]N/P[129]A/Q143R/M156Q/H 224F 288

S52A/S60A/Q286R/M298Q/H373F: S[52]A/S[60]A/Q143R/M156Q/H22 4F 297

V21D/Q143R/E154V/M156Q
V21D/Q143R/E154V/M156Q: 282

Intercambio de Gla FIX /S222A/T239V/Q286R: Intercambio de Gla FIX /S82A/T99V/Q143R 301

T239V/Q286R/M298Q: T99V/Q143R/M156Q 302

Intercambio de Gla FIX/ T239V/Q286R/M298Q: Intercambio de Gla FIX/ T99V/Q143R/M156Q 304

S222A/T239V/H257A/Q286R/M298Q: S82A/T99V/H117A/Q143R/M156Q 303

T239V/Q286R/H373F: T99V/Q143R/H224F 305

T239V/Q286R/M298Q/H373F: T99V/Q143R/M156Q/H224F 306

T239I/Q286R: T99I/Q143R 308

Intercambio de Gla FIX/S222A/T239I/Q286R: Intercambio de Gla FIX /S82A/T99I/Q143R 310

T239I/Q286R/M298Q: T99I/Q143R/M156Q 311

Intercambio de Gla FIX /T239I/Q286R/M298Q: Intercambio de Gla FIX /T99I/Q143R/M156Q 313

S222A/T239I/H257A/Q286R/M298Q: S82A/T99I/H117A/Q143R/M156Q 312

T239I/Q286R/H373F: T99I/Q143R/H224F 314

T239V/Q286R: T99V/Q143R 299

T239I/Q286R/M298Q/ H373F: T99I/Q143R/M156Q/H224F 315

H257S/Q286R/M298Q: H117S/Q143R/M156Q 322

Intercambio de Gla FIX /Q286R/S222A/H257S: Intercambio de Gla FIX/Q143R/S82A/H117S 321

S222A/H257S/Q286R/M298Q: S82A/H117S/Q143R/M156Q 324

H257S/Q286R/M298Q/ H373F: H117S/Q143R/M156Q/H224F 325

S222A/Q286R/M298Q/ H373F: S82A/Q143R/M156Q/H224F 326

Intercambio de Gla FIX/S222A/Q286R/M298Q/H373F: Intercambio de Gla FIX S82A/Q143R/M156Q/H224F 318

S222A/Q286R/M298Q: S82A/Q143R/M156Q 328

Intercambio de Gla FIX/S222A/Q286R/M298Q: Intercambio de Gla FIX S82A/Q143R/M156Q 317

Intercambio de Gla FIX/ S222A/Q286R/H373F: Intercambio de Gla FIX/S82A/Q143R/H224F 316

H257A/Q286R/M298Q: H117A/Q143R/M156Q 321

T128N/P129A/A175S/Q286R/M298Q: T[128]N/P[129]A/A39S/Q143R/M15 6Q 337

A122N/G124S/A175S/Q286R/M298Q: A[122]N/G[124]S/A39S/Q143R/M1 56Q 338

T128N/P129A/A175S/S222A/H257A/Q286R/ M298Q: T[128]N/P[129]A/A39S/S82A/H117 A/Q143R/M156Q 339

A122N/G124S/A175S/S222A/H257A/Q286R/ M298Q: A[122]N/G[124]S/A39S/S82A/H117 A/Q143R/M156Q 340

T128N/P129A/A175S/Q286R/M298Q/H373F: T[128]N/P[129]A/A39S/Q143R/M15 6Q/H224F 341

A122N/G124S/A175S/Q286R/M298Q/H373F: A[122]N/G[124]S/A39S/Q143R/M1 56Q/H224F 342

V158D/Q286R/E296V/M298Q/H373F: V21D/Q143R/E154V/M156Q/H224 F 320

{Intercambio de Gla FIX /K43I}/T128N/P129A/Q286R/M298Q: {Intercambio de Gla FIX /K[43]I}/ T[128]N/P[129]A/Q143R/M156Q 355

T128N/P129A/Q286R/M298Q/Q365N: T[128]N/P[129]A/Q143R/M156Q/Q 217N 356

47 5

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{Intercambio de Gla FIX /K43I}/Q286R/M298Q/Q366N: {Intercambio de Gla FIX /K[43]I}/Q143R/M156QQ217N 357

{Intercambio de Gla FIX/K43I}/ T128N/P129A/Q286R/M298Q/Q366N: {Intercambio de Gla FIX /K[43]I}/ T[128]N/P[129]A/Q143R/M156QQ2 17N 358

V 158D/Q286R/E296V/M298Q: V21D/Q143R/E154V/M156Q 360

T128N/P129A/Q286R/M298Q/Q366N/H373F: T[128]N/P[129]A/Q143R/M156Q/Q 217N/H224F 364

T239V/Q286R/M298Q/Q366N: T99V/Q143R/M156Q/Q217N 365

T239I/Q286R/M298Q/Q366N: T99I/Q143R/M156Q/Q217N 366

T128N/P129A/T239V/Q286R/M298Q: T[128]N/P[129]A/T99V/Q143R/M1 56Q 367

T128N/P129A/S222A/T239V/H257A/Q286R/M 298Q: T[128]N/P[129]A/S82A/T99V/H117 A/Q143R/M156Q 368

T128N/P129A/T239V/Q286R/M298Q/H373F: T[128]N/P[129]A/T99V/Q143R/M1 56Q/H224F 369

T128N/P129A/T239I/Q286R/M299Q: T[128]N/P[129]A/T99I/Q143R/M15 6Q 370

T128N/P129A/T239I/Q286R/M298Q/H373F: T[128]N/P[129]A/T99I/Q143R/M15 6Q/H224F 371

Un polipéptido de FVII que contiene la mutación Q286R por numeración de FVII maduro también puede mostrar resistencia aumentada a AT-III. La resistencia aumentada a AT-III puede ser el resultado de una tasa de inhibición reducida por AT-III o unión reducida a AT-III en condiciones específicas, tal como después de la inyección en un animal o paciente. La resistencia a AT-III puede demostrarse midiendo la constante de velocidad de segundo orden para inhibición de polipéptidos de FVIIa de tipo silvestre y variantes. Otros métodos in vitro, tales como ensayos de BIAcore®, también pueden usarse. Los polipéptidos de FVII modificados pueden mostrar resistencia aumentada a los efectos inhibidores de AT-III en comparación con un polipéptido de FVII no modificado, que puede evaluarse en ensayos in vitro tales como los descritos en el Ejemplo 5. Los polipéptidos de FVII modificados que contienen las mutaciones Q286R pueden mostrar resistencia aumentada a AT-III de aproximadamente 1 %, 2 %, 3 %, 4 %, 5 %, 6 %, 7%, 8%, 9%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70 %, 80%, 90%, 100%, 200%, 300%, 400%, 500%,

: o más en comparación con la resistencia a AT-III de polipéptido de FVII no modificado o de tipo silvestre bien in vivo

: o bien in vitro. Por ejemplo, como se demuestra en el Ejemplo 5 posterior, un polipéptido de FVIIa que contiene la mutación Q286R (Q143R por numeración de quimotripsina) puede mostrar actividad catalítica para FX en presencia de AT-III y ausencia de FT que es de dos a cuatro veces o más mayor que la actividad catalítica mostrada por FVII de tipo silvestre. Por lo tanto, el polipéptido de FVII Q286R modificado puede mostrar un aumento en la resistencia a AT-III de aproximadamente 200 % a 400 % de la de un polipéptido de FVII no modificado.

La actividad catalítica aumentada y resistencia aumentada a AT-III pueden manifestarse como actividad coagulante aumentada en presencia y/o ausencia de FT. Dichas actividades pueden evaluarse in vitro, ex vivo o in vivo, tal como mediante administración a un sujeto humano o animal. La actividad de coagulación de los polipéptidos de FVII modificados que contienen la mutación Q286R puede aumentarse en al menos aproximadamente 1 %, 2 %, 3 %, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 200%, 300%, 400 %, 500 %, o más en comparación con la actividad de coagulación de polipéptido de FVII no modificado o de tipo silvestre bien in vivo o bien in vitro. Por ejemplo, el Ejemplo 6.B.2 demuestra que un polipéptido de FVIIa que contiene la mutación Q286R (Q143R por numeración de quimotripsina) muestra actividad de coagulación en un modelo de sangrado de ratón que es mayor (aproximadamente 2 veces) que la actividad de coagulación mostrada por un polipéptido de FVII de tipo silvestre (por ejemplo FVII NovoSeven®). El polipéptido de FVIIa que contiene las mutaciones Q286R y M298Q (Q143R y M156Q, respectivamente, por numeración de quimotripsina) muestra actividad de coagulación aún mayor.

ii. Otras mutaciones en la posición 286

Como se describe en el presente documento, la glutamina en la posición de aminoácido correspondiente a la posición 286 del polipéptido de FVII expuesto en SEC ID Nº: 3 puede reemplazarse con un aminoácido distinto de un aminoácido básico (es decir distinto de arginina, histidina o lisina). Dichas sustituciones pueden alterar la conformación del orificio de oxianión, por ejemplo, dando como resultado una conformación que aumenta la actividad catalítica del polipéptido de FVII modificado en comparación con un polipéptido de FVII de tipo silvestre. Los polipéptidos de FVII modificados que tienen una conformación de orificio oxianión alterado pueden mostrar actividad catalítica aumentada de aproximadamente 1 %, 2 %, 3 %, 4 %, 5 %, 6 %, 7 %, 8 %, 9 %, 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 100 %, 200 %, 300 %, 400 %, 500 %, o más en comparación con la actividad catalítica del polipéptido de FVII no modificado o de tipo silvestre cuando se miden usando ensayos in vivo, ex vivo,o in vitro.

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La Tabla 6 proporciona ejemplos no limitantes de reemplazos de aminoácidos ejemplares en Q286 distintos de reemplazo con arginina, correspondientes a las posiciones de aminoácidos de un polipéptido de FVII maduro como se expone en SEC ID Nº: 3. Como se observa, dichos polipéptidos de FVII se diseñan para cambiar la conformación del orificio de oxianión a una conformación más eficaz, y por lo tanto tienen actividad coagulante aumentada. En referencia a dichas mutaciones, el primer aminoácido (abreviatura de una letra) corresponde al aminoácido que se reemplaza, el número corresponde a la posición en la secuencia del polipéptido de FVII maduro con referencia a SEC ID Nº: 3, y el segundo aminoácido (abreviatura de una letra) corresponde al aminoácido seleccionado que reemplaza el primer aminoácido en esa posición. Las posiciones de aminoácidos para mutación también se denominan por el esquema de numeración de quimotripsina. En la Tabla 6 posterior, se identifica el identificador de secuencia (SEC ID Nº) en el que se exponen las secuencias de aminoácidos ejemplares del polipéptido de FVII modificado.

Tabla 6.

Q286N: Q143N 113

Q286E: Q143E 114

Q286D: Q143D 115

Q286S: Q143S 116

Q286T: Q143T 117

Q286A: Q143A 120

Q286V: Q143V 121

Q286M: Q143M 122

Q286L: Q143L 123

Q286Y: Q143Y 124

Q286G: Q143G 125

Q286F: Q143F 126

Q286I: Q143I 127

Q286P: Q143P 128

Q286W: Q143W 130

Los polipéptidos de FVII modificados que tienen una conformación de orificio de oxianión alterado pueden mostrar actividad catalítica aumentada de aproximadamente 1 %, 2 %, 3 %, 4 %, 5 %, 6 %, 7 %, 8 %, 9 %, 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 100 %, 200 %, 300 %, 400 %, 500 %, o más en comparación con actividad catalítica del polipéptido de FVII no modificado o de tipo silvestre cuando se mide usando ensayos in vivo, ex vivo o in vitro. En algunos ejemplos, los polipéptidos de FVII modificados que tienen una conformación de orificio de oxianión alterado también pueden mostrar resistencia aumentada a inhibidores de proteasa endógena (es decir, tasa reducida de inhibición por o afinidad reducida para inhibidores) tales como IRFT o AT-III en aproximadamente 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 200 %, 300 %, 400 %, 500 %, o más en comparación con la tasa de inhibición por o afinidad por inhibidores endógenos mostrada por polipéptido de FVII no modificado o de tipo silvestre bien in vivo, bien ex vivo o bien in vitro. La actividad catalítica y/o resistencia aumentada a inhibidores endógenos tales como resistencia a AT-III de dichos polipéptidos de FVII modificados también puede manifestarse como actividad de coagulación aumentada, duración de la actividad coagulante, inicio de la actividad coagulante más rápido y/o índice terapéutico potenciado. Por ejemplo, la actividad de coagulación de los polipéptidos de FVII modificados puede aumentarse en al menos aproximadamente 1 %, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9 %, 10%, 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90 %, 100 %, 200 %, 300 %, 400 %, 500 %, o más en comparación con la actividad de coagulación del polipéptido de FVII no modificado o de tipo silvestre bien in vivo, bien ex vivo o bien in vitro.

2. Resistencia aumentada a AT-III

La antitrombina III (también conocida como antitrombina o AT-III) es una serpina anticoagulante importante (inhibidor de serina proteasa). AT-III se sintetiza como una proteína precursora que contiene 464 restos de aminoácidos (SEC ID Nº: 122). Durante el transcurso de la secreción se escinde un péptido señal de 32 restos para generar una antitrombina humana madura de 432 aminoácidos (SEC ID Nº: 123). La glucoproteína de AT-III de 58 kDa circula en la sangre y actúa como un inhibidor de serina proteasa (serpina) para inhibir un gran número de serina proteasas del

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glutámico (Glu, E), serina (Ser, S), o tirosina (Tyr, Y). En ejemplos adicionales, la glutamina en la posición 366 (correspondiente a la posición 217 por numeración de quimotripsina) se reemplaza con una asparagina (Asn, N), ácido aspártico (Asp, D), ácido glutámico (Glu, E), serina (Ser, S), treonina (Thr, T), lisina (Lys, K), o valina (Val, V). En otros ejemplos, la histidina en la posición 373 (correspondiente a la posición 224 por numeración de 5 quimotripsina) se reemplaza con un ácido aspártico (Asp, D), ácido glutámico (Glu, E), serina (Ser, S), fenilalanina (Phe, F) o alanina (Ala, A). En un ejemplo adicional, pueden generarse mutantes de combinación. Se incluyen entre dichos mutantes de combinación los que tienen dos o más mutaciones de los restos T239, P321, Q366 y H373 (correspondientes a T99, P170i, Q217 y H224, respectivamente, por numeración de quimotripsina). Por ejemplo, un polipéptido de FVII modificado puede poseer sustituciones de aminoácidos en 2, 3, 4 o 5 de las posiciones 10 identificadas. Por lo tanto, un polipéptido modificado puede presentar 1, 2, 3, 4 o 5 mutaciones que pueden dar como resultado resistencia aumentada del polipéptido de FVII modificado a los efectos inhibidores de AT-III. Por ejemplo, un polipéptido de FVII puede modificarse en la posición de aminoácido 366 y la posición de aminoácidos 373. En algunos ejemplos, las posiciones se modifican por reemplazo de aminoácidos, tal como, por ejemplo, reemplazo de la glutamina en la posición 366 con un ácido aspártico, y reemplazo de la histidina en la posición 373 con un ácido

15 glutámico.

La Tabla 7 proporciona ejemplos no limitantes de reemplazos de aminoácidos ejemplares en los restos identificados, correspondientes a las posiciones de aminoácidos de un polipéptido de FVII maduro como se expone en SEC ID Nº:

3. Se incluyen entre estas mutaciones de combinación ejemplares. Como se observa, dichos polipéptidos de FVII se

20 diseñan para aumentar la resistencia a AT-III y por lo tanto tienen actividad coagulante aumentada. En referencia a dichas mutaciones, el primer aminoácido (abreviatura de una letra) corresponde al aminoácido que se reemplaza, el número corresponde a la posición en la secuencia del polipéptido de FVII maduro con referencia a SEC ID Nº: 3, y el segundo aminoácido (abreviatura de una letra) corresponde al aminoácido seleccionado que reemplaza el primer aminoácido en esa posición. Las posiciones de aminoácidos para mutación también se denominan por el esquema

25 de numeración de quimotripsina. En la Tabla 7 a continuación, se identifica el identificador de secuencia (SEC ID Nº) en el que se exponen secuencias de aminoácidos ejemplares del polipéptido de FVII modificado.

Tabla 7.

T239S: T99S 159

T239N: T99N 160

T239Q: T99Q 161

T239V: T99V 162

T239L: T99L 163

T239H: T99H 164

T2391: T99I 165

P321K: P170iK 166

P321E: P170iE 167

P321Y: P170iY 168

P321S: P170iS 169

Q366D: Q217D 170

Q366E: Q217E 171

Q366N: Q217N 172

Q366T: Q217T 173

Q366S: Q217S 174

Q366V: Q217V 175

Q366I: Q217I 176

Q366L: Q217L 177

Q366M: Q217M 178

H373D: H224D 179

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H216R: H76R 194

S222A: S82A 195

S222K: S82K 196

S222V: S82V 197

S222N: S82N 198

S222E: S82E 199

S222D: S82D 200

H257A: H117A 201

H257S: H117S 202

S222K/H257A: S82K/H117A 203

H216A/H257A: H76A/H117A 204

H216A/S222A: H76A/S82A 205

4. Glucosilación alterada

Las propiedades y actividades de una proteína pueden alterarse modulando el grado, nivel y/o tipo de glucosilación. Por ejemplo, la glucosilación puede aumentar la semivida en suero de polipéptidos aumentando la estabilidad, solubilidad y reduciendo la inmunogenicidad de una proteína. La glucosilación puede aumentar la estabilidad de proteínas reduciendo la proteólisis de la proteína y pueden proteger la proteína de degradación térmica, exposición a agentes desnaturalizantes, daño por radicales libres de oxígeno y cambios en el pH. La glucosilación también puede permitir que la proteína diana evada los mecanismos de eliminación que pueden implicar unión con otras proteínas, incluyendo receptores de superficie celular. Los restos de carbohidratos que contienen ácido siálico pueden afectar a la solubilidad de una proteína. Los restos de ácido siálico son altamente hidrófilos y pueden proteger restos hidrófobos de la proteína diana. Esto reduce la agregación y precipitación de la proteína diana. La agregación reducida también ayuda en la prevención de la respuesta inmunitaria contra la proteína diana. Los carbohidratos pueden además proteger secuencias inmunogénicas del sistema inmunitario. El volumen de espacio ocupado por los restos de carbohidratos puede reducir el área de superficie disponible que se vigila por el sistema inmunitario. Estas propiedades conducen a la reducción de inmunogenicidad de la proteína diana.

Los sitios de glucosilación proporcionan un sitio para unión de monosacáridos y oligosacáridos con un polipéptido mediante un enlace glucosídico, de modo que cuando se produce el polipéptido en una célula eucariota con capacidad de glucosilación, está glucosilado. Los dos tipos principales de glucosilación son glucosilación ligada a N, donde las unidades de azúcares se unen mediante el nitrógeno de amida de un resto de asparagina, y glucosilación ligada a O, donde las unidades de azúcares se unen mediante el grupo hidroxilo de restos de serina, treonina, hidroxilisina o hidroxiprolina. Otras formas menores más de enlaces glucosídicos incluyen enlace S con cisteína y enlace C con triptófano. Se produce glucosilación ligada a N en asparaginas en la secuencia consenso -Asn-Xaa-Ser/Thr/Cys donde Xaa no es prolina. No hay ningún motivo conocido para O-glucosilación, aunque la Oglucosilación es más probable en secuencias con una alta proporción de restos de serina, treonina y prolina. La presencia de un sitio de glucosilación potencial no asegura, sin embargo, que el sitio se glucosile durante el procesamiento postraduccional en el RE. Además, el nivel de glucosilación puede variar en un sitio dado, y un sitio puede tener muchas estructuras de glucano diferentes. Hay cuatro sitios de glucosilación de origen natural en FVII; dos sitios de N-glucosilación en N145 y N322, y dos sitios de O-glucosilación en S52 y S60, correspondientes a las posiciones de aminoácidos en el polipéptido de FVII maduro expuesto en SEC ID Nº: 3.

Modificaciones ejemplares para alterar la glucosilación

Se proporcionan en el presente documento polipéptidos de FVII que se ha modificado alterando el nivel y/o tipo de glucosilación en comparación con un polipéptido de FVII no modificado. La glucosilación puede aumentarse o reducirse en comparación con el FVII no modificado. En algunos casos, el nivel de glucosilación se aumenta, dando como resultado un polipéptido de FVII hiperglucosilado. Esto puede conseguirse, por ejemplo, mediante la incorporación de al menos un sitio de glucosilación no nativo no hallado en el polipéptido de FVII no modificado con el que se une un resto de carbohidrato. También pueden generarse polipéptidos de FVII hiperglucosilados por enlace de un resto de carbohidrato con al menos un sitio de glucosilación nativo hallado pero no glucosilado en el polipéptido de FVII no modificado. En otros ejemplos, el nivel de glucosilación en un polipéptido de FVII modificado se reduce en comparación con un polipéptido de FVII no modificado. Esto puede conseguirse eliminando uno o más

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sitio de glucosilación. También se incluyen en la Tabla 9 mutaciones de combinación ejemplares que crean más de un sitio de glucosilación no nativo nuevo en el polipéptido de FVII. Como se ha observado anteriormente, los cambios en los niveles de glucosilación pueden, por ejemplo, aumentar la semivida. Por lo tanto, los polipéptidos de FVII modificados pueden tener actividad coagulante aumentada. En referencia a dichas mutaciones, el primer 5 aminoácido (abreviatura de una letra) corresponde al aminoácido que se reemplaza, el número corresponde a la posición en la secuencia del polipéptido de FVII maduro con referencia a SEC ID Nº: 3, y el segundo aminoácido (abreviatura de una letra) corresponde al aminoácido seleccionado que reemplaza el primer aminoácido en esa posición. Las posiciones de aminoácidos para mutación también se denominan por el esquema de numeración de quimotripsina cuando sea apropiado. En casos donde una posición de aminoácido modificada no tiene un número de 10 quimotripsina correspondiente (es decir no está dentro de las posiciones de aminoácidos 153 a 406 correspondientes a un polipéptido de FVII maduro expuesto en SEC ID Nº: 3, y no se ha expuesto en la Tabla 1, anteriormente), la posición se indica entre corchetes usando la numeración de FVII maduro. Por ejemplo, A51N no tiene un número de quimotripsina correspondiente y se expone como A[51]N cuando se hace referencia a la numeración de quimotripsina. En la Tabla 9 posterior, se identifica el identificador de secuencia (SEC ID Nº) en el

15 que se exponen secuencias de aminoácidos ejemplares del polipéptido de FVII modificado. También se identifican en la Tabla 9 cualquier sitio o sitios de glucosilación no nativos nuevos generados por la modificación o las modificaciones.

Tabla 9.

Modificación o modificacionesnumeración de FVII maduro: Modificación o modificacionesnumeración de quimotripsina Sitio de glucosilación no nativo (numeración de FVII maduro) Sitio de glucosilación no nativo (numeración de quimotripsina) SEC ID Nº

S52A: S[52]A ninguno ninguno 206

S60A: S[60]A ninguno ninguno 207

E394N/P393A/R396S: E245N/P246A/R247S N394 N245 208

R202S: R62S N200 N60d 209

A292N/A294S: A150N/A152S N292 N150 210

G318N: G170fN N318 N170f 211

A175S: A39S N173 N37 212

K109N: K[109]N N109 N[109] 213

A122N/G124S: A[122]N/G[124]S N122 N[122] 214

A51N: A[51]N N51 N[51] 215

T130N/E132S: T[130]N/E[132]S N130 N[130] 216

A122N/G124S/ E394N/P395A/R396S: A[122]N/G[124]S/E245N/P246A/R 247S N122 y N394 N[122] y N245 217

A122N/G124S/ E394N/P395A/R396S/ G318N: A[122]N/G[124]S/E245N/P246A/R 247S/ G170fN N122, N394 y N318 N[122], N245 y N318 218

S52A/S60A: S[52]A/S[60]A ninguno ninguno 219

S52N/P54S: S[52]N/P[54]S N52 N[52] 220

S119N/L121S: S[119]N/L[121]S N119 N[119] 221

T128N/P129A: T[128]N/P[129]A N128 N[128] 222

Q66N/Y68S: Q[66]N/Y[68]S N66 N[66] 223

S52N/P54S/A122N/G1 24S/E394N/P395A/R39 6S: S[52]N/P[54]S/A[122] N/G[124]S/E245N/P24 6A/R247S N52, N122 y N397 N[52], N[122] y N245 224

K109N/A292N/A294S: K[109]N/A150N/A152 S N109 y N292 N[109] y N150 225

K109N/A175S: K[109]N/A39S N109 y N173 N[109] y N37 226

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(correspondientes a un polipéptido de FVII maduro expuesto en SEC ID Nº: 3) para generar un polipéptido de FVII modificado. En otros ejemplos, una secuencia de unión a albúmina de suero reemplaza los restos de aminoácidos H115 a S126, o T128 a P134 (correspondientes a un polipéptido de FVII maduro expuesto en SEC ID Nº: 3). Se exponen secuencias de unión a albúmina de suero ejemplares en las SEC ID Nº: 206-212.

La Tabla 10 proporciona ejemplos no limitantes de modificaciones ejemplares que pueden realizarse a un polipéptido de FVII para insertar una secuencia de unión a albúmina de suero. Como se ha observado anteriormente, la inclusión de una secuencia de unión a albúmina de suero puede aumentar la semivida de un polipéptido de FVII. Por lo tanto, los polipéptidos de FVII modificados pueden tener actividad coagulante aumentada. En referencia a las modificaciones enumeradas en la Tabla 10, los restos de aminoácidos en los que se inserta la secuencia de unión a albúmina de suero en el polipéptido de FVII, y la secuencia de la secuencia de unión, están ambos representados en la tabla. Por ejemplo, S103S111delinsQRLMEDICLPRWGCLWEDDF indica que los restos de aminoácidos S103 a S111 de una numeración de longitud completa de un polipéptido de FVII no modificado (restos correspondientes a la secuencia del polipéptido de FVII maduro expuesta en SEC ID Nº: 3) se han suprimido y reemplazado con una secuencia de unión a albúmina de suero con la secuencia de aminoácidos QRLMEDICLPRWGCLWEDDF (SEC ID Nº: 206). La enumeración de solamente un resto de aminoácido individual, tal como P406, indica que la secuencia de unión a albúmina de suero se inserta después de P406 y no se ha suprimido ningún resto de aminoácido del polipéptido de FVII. Las posiciones de aminoácidos para mutación también se denominan por el esquema de numeración de quimotripsina cuando sea apropiado. En casos en los que una posición de aminoácido modificada no tenga un número de quimotripsina correspondiente (es decir no esté dentro de las posiciones de aminoácidos 153 a 406 correspondientes a un polipéptido de FVII maduro expuesto en SEC ID Nº: 3, y no se exponga en la Tabla 1, anterior), la posición se indica entre corchetes usando la numeración de FVII maduro. Por ejemplo, S103 no tiene número de quimotripsina correspondiente y se expone como S[103] cuando se hace referencia a la numeración de quimotripsina. En la Tabla 10 posterior, se identifica el identificador de secuencia (SEC ID Nº) en el que se exponen secuencias de aminoácidos ejemplares del polipéptido de FVII modificado.

Tabla 10.

S103S111 delinsQRLMEDICLPRWG CLWEDDF: S[103]S[111]delinsQRLMEDICLPRW GCLWEDDF 227

H115S126delinsQR-LMEDICLPRWG CLWEDDF: H[115]S[126]delinsQRLMEDICLPRW GCLWEDDF 228

T128P134delinsQRLMEDICLPRWG CLWEDDF: T[128]P[134]delinsQRLMEDICLPRW GCLWEDDF 229

S103S111delinsIEDICLPRWGCLWE: S[103]S[111]delinsIEDICLPRWGCLW E 230

H115S126delinsIEDICLPRWGCLWE: H[115]S[126]delinsIEDICLPRWGCL WE 231

T128P134delinsIEDICLPRWGCLWE: T[128]P[134]delinsIEDICLPRWGCLW E 232

S103S11IdelinsDICLPRWGCLWED: S[103]S[111]delinsDICLPRWGCLWE 233

S103S111delinsDICLPRWGCLWED: S[103]S[111]delinsDICLPRWGCLWE D 233

H115S126delinsDICLPRWGCLWED: H[115]S[126]delinsDICLPRWGCLWE D 234

T128P134delinsDICLPRWGCLWED: T[128]P[134]delinsDICLPRWGCLWE D 235

P406insIEDICLPRWGCLW: P257insIEDICLPRWGCLW 236

P406insGGGSIEDICLPRWGCLW: P257insGGGSIEDICLPRWGCLW 237

P406insDICLPRWGCLWED: P257insDICLPRWGCLWED 238

P406insGGGSDICLPRWGCLWED: P257insGGGSDICLPRWGCLWED 239

Los polipéptidos de FVII modificados que contienen una secuencia de unión a albúmina de suero pueden mostrar unión aumentada con albúmina de suero que es al menos o aproximadamente 1 %, 2 %, 3 %, 4 %, 5 %, 6 %, 7 %, 8 %, 9%, 10%, 20%. 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 100%, 200%, 300%, 400%, 500%, o más en comparación con la unión del polipéptido de FVII de tipo silvestre o no modificado con albúmina de suero bien in vivo

o bien in vitro. Los polipéptidos de FVII modificados que pueden unirse con albúmina de suero pueden mostrar semivida en suero aumentada de al menos aproximadamente 1 %, 2 %, 3 %, 4 %, 5 %, 6 %, 7 %, 8 %, 9 %, 10 %, 20 %, 30 %, 40 %, 50 %, 60 %, 70 %, 80 %, 90 %, 100 %, 200 %, 300 %, 400 %, 500 %, o más en comparación con la semivida en suero del polipéptido de FVII no modificado o de tipo silvestre bien in vivo o bien in vitro. La unión a albúmina de suero aumentada y/o semivida en suero aumentada de dichos polipéptidos de FVII modificados también puede manifestarse como actividad de coagulación aumentada, duración de la actividad de coagulación y/o índice terapéutico potenciado. La actividad de coagulación de los polipéptidos de FVII modificados puede aumentarse en al

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FIX, donde el dominio Gla de FIX contiene la sustitución de aminoácidos M19K (numeración correspondiente a las posiciones de aminoácidos del dominio Gla de FIX expuesto en SEC ID Nº: 83), se indica por {Intercambio de Gla FIX/M19K}/Q286R. De forma similar, la modificación {Intercambio de Gla FIX/Q44S}/Q286R/M298Q indica que el polipéptido de FVII contiene una modificación de intercambio de Gla FIX donde la glutamina en la posición de 5 aminoácido correspondiente en la posición de aminoácido 44 del dominio Gla de FIX expuesto en SEC ID Nº: 83 se reemplaza con una serina, y también contiene las sustituciones de aminoácidos Q286R y M298Q, con numeración correspondiente al polipéptido de FVII maduro expuesto en SEC ID Nº: 3. En la Tabla 12 posterior, se identifica el identificador de secuencia (SEC ID Nº) en el que se exponen secuencias de aminoácidos ejemplares del polipéptido de FVII modificado. 10

Tabla 12

Intercambio de Gla FIX/Q286R: Intercambio de Gla FIX/Q143R 131

Q286R/H257A: H117A/Q143R 132

S222A/Q286R: S82A/Q143R 133

Q286R/S222A/H257A: S82A/H117A/Q143R 134

Intercambio de Gla FIX /S222A/Q286R: S82A/Intercambio de Gla FIX/Q143R 135

Intercambio de Gla FIX/H257A/Q286R: H117A/Intercambio de Gla FIX/Q143R 136

Q286R/M298Q: Q143R/M156Q 138

Q286R/M298Q/K341Q: Q143R/M156Q/K192Q 139

K199E/Q286R/M298Q: K60cE/Q143R/M156Q 140

Intercambio de Gla FIX/Q286R/M298Q: Intercambio de Gla FIX/Q143R/M156Q 141

Q286R/Q366V: Q143R/Q217V 142

Q286R/A292N/A294S/Q366V: Q143R/A150N/A152S/Q217V 143

A175S/Q286R/Q366V: A39S/Q143R/Q217V 144

S222A/Q286R/Q366V: S82A/Q143R/Q217V 145

H257S/Q286R: H117S/Q143R 146

H257S/Q286R/Q366V: H117S/Q143R/Q217V 147

S222A/H257A/Q286R/Q366V: S82A/H117A/Q143R/Q217V 148

Q286R/H373A: Q143R/H224A 149

S222A/H257A/Q286R/M298Q: S82A/H117A/Q143R/M156Q 150

Q286R/K341D: Q143R/K192D 151

Q286R/Q366D: Q143R/Q2I7D 152

Q286R/Q366N: Q143R/Q217N 153

Q286R/M298Q/Q366D: Q143R/M156Q/Q217D 154

Q286R/M298Q/Q366N: Q143R/M156Q/Q217N 155

Q286R/H373F: Q143R/H224F 156

Q286R/M298Q/H373F: Q143R/M156Q/H224F 157

Intercambio de Gla FIX/S222A: Intercambio de Gla FIX/S82A 245

Intercambio de Gla FIX/H257A: Intercambio de GlaFIX/H117A 246

Intercambio de Gla FIX/S222A/H257A: Intercambio de Gla FIX/S82A/H117A 247

S222A/M298Q: S82A/M156Q 248

H257A/M298Q: H117A/M156Q 249

S222A/H257A/M298Q: S82A/H117A/M156Q 250

S222A/A292N/A294S/Q366V: S82A/A150N/A152S/Q217V 251

A175S/S222A/0366V: A39S/S82A/0217V 252

S222A/Q366V: S82A/Q217V 253

H257S/Q366V: H117S/Q217V 254

S222A/H373A: S82A/H224A 255

V158T/L287T/M298K: V21T/L144T/M156K 256

V158D/L287T/M298K: V21D/L144T/M156K 257

S103S111delinsIEDICLPRWGCLWE/G237V: S[103]S[111]delinsIEDICLPRWGCLWE/G9 7V 258

S103S111delinsDiCLPRWGCLWED/G237V: S[103]S[111]delinsDICLPRWGCLWED/G9 7V 259

H115S126delinsQRLMEDICLPRWGCLWEDD: H[115]S[126]delinsQRLMEDICLPRWGCL 260

68 69 70

F/G237V: WEDDF/G97V

H115S126delinsIEDICLPRWGCLWE/G237V: H[115]S[126]delinsIEDICLPRWGCLWE/G9 7V 261

H115S126delinsDICLPRWGCLWED/G237V: H[115]S[126]delinsDICLPRWGCLWED/G9 7V 262

T128P134delinsQRLMEDICLPRWGCLWEDD F/G237V: T[128]P[134]delinsQRLMEDICLPRWGCL WEDDF/G97V 263

T128P134delinsIEDICLPRWGCLWE/G237V: T[128]P[134]delinsIEDICLPRWGCLWE/G9 7V 264

S103S111delinsQRLMEDICLPRWGCLWEDD F/G237V: S[103]S[111]delinsQRLMEDICLPRWGCL WEDDF/G97V 265

T128P134deIinsDICLPRWGCLWED/G237V: T[128]P[134]DICLPRWGCLWED/G97V 266

S103S111delinsSFGRGDIRNV/G237V: S[103]S[111]delinsSFGRGDIRNV/G97V 267

H115S126delinsSFGRGDIRNV/G237V: H[115]S[126]delinsSFGRGDIRNV/G97V 268

T128P134delinsSFGRGDIRNV/G237V: T[128]P[134]delinsSFGRGDIRNV/G97V 269

M298Q/H373F: M156Q/H224F 270

S119N/L121S/A175S: S[119]N/L[121]S/A39S 271

T128N/P129A/A175S: T[128]N/P[129]A/A39S 272

A122N/G124S/A175S: A[122]N/G[124]S/A39S 273

{Intercambio de Gla FIX/E40L}/Q286R/M298Q: {Intercambio de Gla FIX /E[40]L}/Q143R/M156Q 274

{Intercambio de Gla FIX/K431}/Q286R/M298Q: {Intercambio de Gla FIX /K[43]I}/Q143R/M156Q 275

{Intercambio de Gla FIX/Q44SJ/Q286R/M298Q: {Intercambio de Gla FIX/Q1441S}/Q143R/M156Q 276

{Intercambio de Gla FEX/M19K}/Q286R/M298Q: {Intercambio de Gla FEX/M[19]K}/Q143R/M156Q 277

{Intercambio de Gla FIX/M19K/E40L/K43I/Q44S}/Q286R/M298Q: {Intercambio de GlaFIX/M[19]K/E[40]L/K[43]I/Q[44]S}/Q143 R/M156Q 278

T128N/P129A/Q286R: T[128]N/P[129]A/Q143R 279

T128N/P129A/Q286R/M298Q: T[128]N/P[129]A/Q143R/M156Q 280

T128N/P129A/Q286R/H373F: T[128]N/P[129]A/Q143R/H224F 281

V158D/Q286R/E286V/M298Q: V21D/Q143R/E154V/M156Q 282

T128N/P129A/V158D/E296V/M298Q: T[128]N/P[129]A/V21D/E154V/M156Q 283

T128N/P129A/S222A: T[128]N/P[129]A/S82A 284

Intercambio de GlaFIX/T128N/P129A/S222 A/Q286R: Intercambio de GlaFIX/T[128]N/P[129]A/S82A/Q143R 285

Intercambio de GlaFIX/T128N/P129A/Q286R/M298Q: Intercambio de GlaFIX/T[128]N/P[129]A/Q143R/M156Q 286

T128N/P129A/S222A/H257A/Q286R/M298Q: T[128]N/P[129]A/S82A/H117A/Q143R/M15 6Q 287

T128N/P129A/Q286R/M298Q/H373F: T[128]N/P[129]A/Q143R/M156Q/H224F 288

S52A/S60A/V158D/E296V/M298Q: S[52]A/S[60] A/V21D/E154V/M156Q 289

S52A/S60A/Q286R: S[52]A/S[60]A/Q143R 290

S52A/S60A/S222A: S[52]A/S[60]A/S82A 291

Intercambio de GlaFIX/S52A/S60A/S222A/Q2 86R: Intercambio de GlaFIX/S[52]A/S[60]A/S82 A/Q143R 292

S52A/S60A/Q286R/M298Q: S[52]A/S[60]A/Q143R/M156Q 293

Intercambio de GlaFIX/S52A/S60A/Q286R/M298Q: Intercambio de GlaFIX/S[52]A/S[60]A/Q143R/M156Q 294

S52A/S60A/S222A/H257A/Q286R/M298Q: S[52]A/S[60]A/S82A/H117A/Q143R/M156Q 298

S52A/S60A/Q286R/H373F: S[52]A/S[60]A/Q143R/H224F 296

S52A/S60A/Q286R/M298Q/H373F: S[52]A/S[60]A/Q143R/M156Q/H224F 297

V158D/T239V/E296V/M298Q: V21D/T99V/E154V/M156Q 298

T239V/Q286R: T99V/Q143R 299

S222A/T239V: S82A/T99V 300

Intercambio de Gla FIX /S222A/T239V/Q286R: Intercambio de Gla FIX/S82A/T99V/Q143R 301

T239V/Q286R/M298Q: T99V/Q143R/M156Q 302

S222A/T239V/H257A/Q286R/M298Q: S82A/T99V/H117A/Q143R/M156 0 303

Intercambio de GlaFIX/T239V/Q286R/M298Q: Intercambio de GlaFIX/T99V/Q 143R/M156Q 304

T239V/Q286R/H373F: T99V/Q143R/H224F 305

T239V/Q286R/M298Q/H373F: T99V/Q143R/M156Q/H224F 306

V158D/T239I/E296V/M298Q: V21D/T99I/E154V/M156Q 307

T239I/Q286R: T99I/Q143R 308

S222A/T239I: S82A/T99I 309

Intercambio de GlaFIX/S222A/T239I/Q286R: Intercambio de GlaFIX/S82A/T99I/Q143R 310

T239I/Q286R/M298Q: T99I/0143R/M156Q 311

S222A/T239I/H257A/Q286R/M298Q: S82A/T99I/H117A/Q143R/M156Q 312

Intercambio de GlaFIX/T239I/Q286R/M298Q: Intercambio de GlaFIX/T99I/Q143R/M156Q 313

T239I/Q286R/H373F: T99I/0143R/H224F 314

T239I/Q286R/M298Q/H373F: T991/Q143R/M156Q/H224F 315

Intercambio de GlaFIX/S222A/Q286R/H373F: Intercambio de GlaFIX/S82A/Q143R/H224F 316

Intercambio de GlaFIX/S222A/Q286R/M298Q: Intercambio de GlaFIX/S82A/Q143R/M156Q 317

Intercambio de GlaFIX/S222A/Q286R/M298Q/ H373F: Intercambio de GlaFIX/S82A/Q143R/M156Q/H224F 318

V158D/E296V/M298Q/H373F: V21D/E154V/M156Q/H224F 319

V158D/Q286R/E296V/M298Q/H373F: V21D/Q143R/E154V/M156Q/H224F 320

H257A/Q286R/M298Q: H117A/Q143R/M156Q 321

H257S/Q286R/M298Q: H117S/0143R/M156Q 322

Intercambio de GlaFIX/S222A/H257S/Q286R: Intercambio de GlaFIX/S82A/H117S/Q143R 323

S222A/H257S/Q286R/M298Q: S82A/H117S/Q143R/M156Q 324

H257S/Q286R/M298Q/H373F: H117S/Q143R/M156Q/H224F 325

S222A/Q286R/M298Q/H373F: S82A/Q143R/M156Q/H224F 326

Intercambio de GlaFIX/Q366V: Intercambio de GlaFIX/Q217V 327

S222A/Q286R/M298Q: S82A/Q143R/M156Q 328

T128N/P129A/A175S/Q366V: T[128]N/P[129]A/A39S/Q217V 329

A122N/G124S/A175S/Q366V: A[122]N/G[124]S/A39S/Q217V 330

T128N/P129A/A175S/S222A: T[128]N/P[129]A/A39S/S82A 331

A122N/G124S/A175S/S222A: A[122]N/G[124]S/A39S/S82A 332

T128N/P129A/A175S/Q286R: T[128]N/P[129]A/A39S/0143R 333

A122N/G124S/A175S/Q286R: A[122]N/G[124]S/A39S/Q143R 334

Intercambio de GlaFIX/T128N/P129A/A175S/S222A/Q286R: Intercambio de GlaFIX/T[128]N/P[129]A/A39S/S82A/Q143 R 335

Intercambio de GlaFIX/A122N/G124S/A175S/S222A/Q286R: Intercambio de GlaFIX/A[122]N/G[124]S/A39S/S82A/Q143 R 336

T128N/P129A/A175S/Q286R/M298Q: T[128]N/P[129]A/A39S/Q143R/M156Q 337

A122N/G124S/A175S/Q286R/M298Q: A[122]N/G[124]S/A39S/Q143R/M156Q 338

T128N/P129A/A175S/S222A/H257A/Q286R/M 298Q: T[128]N/P[129]A/A39S/S82A/H117A/Q143 R/M156Q 339

A122N/G124S/A175S/S222A/H257A/Q286R/M 298Q: A[122]N/G[124]S/A39S/S82A/H117A/Q143 R/M156Q 340

T128N/P129A/A175S/Q286R/M298Q/H373F: T[128]N/P[129]A/A39S/Q143R/M156Q/H2 24F 341

A122N/G124S/A175S/Q286R/M298Q/H373F: A[122]N/G[124]S/A39S/Q143R/M156Q/H2 24F 342

T128N/P129A/M298Q: T[128]N/P[129]A/M156Q 354

{Intercambio de Gla FIX/K43I}/T128N/P129A/Q286R/M298Q: {Intercambio de Gla FIX/K[43]I}/ T[128]N/P[129]A/Q143R/M156Q 355

T128N/P129A/Q286R/M298Q/Q366N: T[128]N/P[129]A/Q143R/M156Q/ Q217N 356

{Intercambio de Gla FIX/K43I}/Q286R/M298Q/Q366N: {Intercambio de Gla FIX/K[43]I}/Q143R/M 156QQ217N 357

{Intercambio de Gla FIX/K43I}/T128N/P129A/Q286R/M298Q/Q366 N: {Intercambio de Gla FIX/K[43]l}/ T[128]N/P[129]A/Q143R/M156QQ217N 358

T128N/P129A/M298Q/H373F: T[128]N/P[129]A/M156Q/H224F 359

V158D/Q286R/E296V/M298Q: V21D/Q143R/E154V/M156Q 360

M298Q/Q366N/H373F: M156Q/Q217N/H224F 361

T239V/M298Q/H373F: T99V/M156Q/H224F 362

T239I/M298Q/H373F: T99I/M156Q/H224F 363

T128N/P129A/Q286R/M298Q/Q366N/H373F: T[128]N/P[129]A/Q143R/M156Q/ Q217N/H224F 364

T239V/Q286R/M298Q/Q366N: T99V/Q143R/M156Q/Q217N 365

T239I/Q286R/M298Q/Q366N: T99I/Q143R/M156Q/Q217N 366

T128N/P129A/T239V/Q286R/M298Q: T[128]N/P[129]A/T99V/Q143R/M156Q 367

T128N/P129A/S222A/T239V/H257A/Q286R/M 298Q: T[128]N/P[129]A/S82A/T99V/H117A/Q143 R/M156Q 368

T128N/P129A/T239V/Q286R/M298Q/H373F: T[128]N/P[129]A/T99V/Q143R/M156Q/H22 4F 369

T128N/P129A/T239I/Q286R/M298Q: T[128]N/P[129]A/T99I/Q143R/M156Q 370

T128N/P129A/T239I/Q286R/M298Q/H373F: T[128]N/P[129]A/T99I/Q143R/M156Q/H22 4F 371

E. Producción de polipéptidos de FVII

Pueden obtenerse polipéptidos de FVII, incluyendo polipéptidos de FVII modificados, o dominios de los mismos de

5 FVII u otro polipéptido de vitamina K, por métodos bien conocidos en la técnica para purificación de proteínas y expresión de proteínas recombinantes. Puede usarse cualquier método conocido por los expertos en la materia para identificación de ácidos nucleicos que codifiquen genes deseados. Puede usarse cualquier método disponible en la técnica para obtener un ADNc de longitud completa (es decir, que abarca la región codificante completa) o clon de ADN genómico que codifica un polipéptido de FVII u otro polipéptido de vitamina K, tal como de una fuente celular o

10 tisular, tal como por ejemplo del hígado. Los polipéptidos de FVII modificados pueden modificarse técnicamente como se describe en el presente documento, tal como por mutagénesis dirigida.

FVII pude clonarse o aislarse usando cualquier método disponible conocido en la técnica para clonar y aislar moléculas de ácido nucleico. Dichos métodos incluyen amplificación por PCR de ácidos nucleicos y exploración de

15 bibliotecas, incluyendo exploración de hibridación de ácidos nucleicos, exploración basada en anticuerpos y exploración basada en actividad.

Pueden usarse métodos para amplificación de ácidos nucleicos para aislar moléculas de ácido nucleico que codifican un polipéptido de FVII, incluyendo por ejemplo, métodos de reacción en cadena de la polimerasa (PCR). 20 Puede usarse un material que contiene ácido nucleico como un material de partida a partir del que puede aislarse una molécula de ácido nucleico que codifica FVII. Por ejemplo, pueden usarse preparaciones de ADN y ARNm, extractos celulares, extractos tisulares (por ejemplo de hígado), muestras de fluidos (por ejemplo sangre, suero, saliva), muestras de sujetos sanos y/o enfermos en métodos de amplificación. También pueden usarse bibliotecas de ácido nucleico como una fuente de material de partida. Los cebadores pueden diseñarse para amplificar una

25 molécula codificante de FVII. Por ejemplo, los cebadores pueden diseñarse basándose en secuencias expresadas a partir de las que se genera un FVII. Los cebadores pueden diseñarse basándose en la retrotraducción de una secuencia de aminoácidos de FVII. Las moléculas de ácido nucleico generadas por amplificación pueden secuenciarse y puede confirmarse que codifican un polipéptido de FVII.

30 Las secuencias de nucleótidos adicionales pueden unirse con una molécula de ácido nucleico que codifica FVII, incluyendo secuencias enlazadoras que contienen sitios de endonucleasas de restricción para el fin de clonar el gen sintético en un vector, por ejemplo, un vector de expresión de proteínas o un vector diseñado para la amplificación de las secuencias de ADN que codifican proteínas centrales. Además, secuencias de nucleótidos adicionales que especifican elementos de ADN funcionales pueden unirse operativamente con una molécula de ácido nucleico que

35 codifica FVII. Los ejemplos de dichas secuencias incluyen, pero sin limitación, secuencias promotoras diseñadas para facilitar la expresión de proteínas intracelulares y secuencias de secreción diseñadas para facilitar la secreción de proteínas. Secuencias de nucleótidos adicionales tales como secuencias que especifican regiones de unión a proteínas también pueden ligarse con moléculas de ácido nucleico que codifican FVII. Dichas regiones incluyen, pero sin limitación, secuencias para facilitar la captación de FVII en células diana específicas, o potenciar de otro

71

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Variante (numeración de FVII maduro): Variante (numeración de quimotripsina) Polipéptido de FVII SEC ID Nº

Intercambio de Gla FIX/ S222A/Q286R: Intercambio de Gla FIX/S82A/Q143R 135

Intercambio de Gla FIX/H257A/Q286R: Intercambio de Gla FIX/H117A/Q143R 136

Intercambio de Gla FIX /S222A/H257A/ Q286R: Intercambio de Gla FIX /S82A/H117A/ Q143R 137

Q286R/M298Q: Q143R/M156Q 138

Q286R/M298Q/K341Q: K192Q/Q143R/M156Q 139

K199E/Q286R/M298Q: K60cE/Q143R/M156Q 140

Intercambio de Gla FIX/Q286R/M298Q: Intercambio de Gla FIX/Q143R/M156Q 141

Q286R/Q366V: Q143R/Q217V 142

Q286R/A292N/A294S/Q366V: Q143R/A150N/A152S/Q217V 143

A175S/Q286R/Q366V: A39S/Q143R/Q217V 144

S222A/Q286R/Q366V: S82A/Q143R/Q217V 145

H257S/Q286R: H117S/Q143R 146

H257S/Q286R/Q366V: H117S/Q143R/Q217V 147

S222A/H257A/Q286R/Q366V: S82A/H117A/Q143R/Q217V 148

Q286R/H373A: Q143R/H224A 149

S222A/H257A/Q286R/M298Q: S82A/H117A/Q143R/M156Q 150

V158D/E296V/M298Q
V158D/E296V/M298Q: 158

Q286R/K341D: Q143R/K192D 151

Q286R/Q366D: Q143R/Q217D 152

Q286R/Q366N: Q143R/Q217N 153

Q286R/M298Q/Q366D: Q143R/M156Q/Q217D 154

Q286R/M298Q/Q366N: Q143R/M156Q/Q217N 155

Q286R/H373F: Q143R/H224F 156

Q286R/M298Q/H373F: Q143R/M156Q/H224F 157

T239S: T99S 159

T239N: T99N 160

T239Q: T990 161

T239V: T99V 162

T239L: T99L 163

T239H: T99H 164

T239I: T99I 165

P321K: P170iK 166

P321E: P170iE 167

P321Y: P170iY 168

P321S: P170iS 169

Q366D: Q217D 170

Q366E: Q217E 171

Q366N: Q217N 172

Q366T: Q217T 173

Q366S: Q217S 174

Q366V: Q217V 175

Q366I: Q217I 176

Q366L: Q217L 177

Q366M: Q217M 178

H373D: H224D 179

H373E: H224E 180

H373S: H224S 181

H373F: H224F 182

H373A: H224A 183

Q366D/H373E: Q217D/H224E 184

Q366V/H373V: Q217V/H224V 185

Q366V/H373L: Q217V/H224L 186

Q366V/H373I: Q217V/H224I 187

K161S: K24S 188

K161A: K24A 189

K161V: K24V 190

H216S: H76S 191

H216A: H76A 192

H216K: H76K 193

H216R: H76R 194

95 96 97 98

S222A: S82A 195

S222K: S82K 196

S222V: S82V 197

S222D: S82D 200

S222N: S82N 198

S222E: S82E 199

H257A: H117A 201

H257S: H117S 202

S222K/H257A: S82K/H117A 203

H216A/H257A: H76A/H117A 204

H216A/S222A: H76A/S82A 205

S52A: S[52]A 206

S60A: S[60]A 207

E394N/P395A/R396S: E245N/P246A/R247S 208

R202S: R62S 209

A292N/A294S: A150N/A152S 210

G318N: G170fN 211

A175S: A39S 212

K109N: K-26N 213

A122N/G124S: A[122]N/G[124]S 214

A51N: A-84N 215

T130N/E132S: T[130]N/E[132]S 216

S50A/S62A: S[50]A/S[62]A 217

A122N/G124S/E394N/P395A/R396S: A[122]N/G[124]S/E245N/P246A/ R247S 218

A122N/G124S/E394N/P395A/R396S/G318N: A[122]N/G[124]S/E245N/P246A/ R247S/G170fN 219

S52N/P54S: S[52]N/P[54]S 220

S119N/L121S: S[119]N/L[121]S 221

T128N/P129A: T[128]N/P[129]A 222

Q66N/Y68S: Q[66]N/Y[68]S 223

S52N/P54S/A122N/G124S/E394N/P395A/R39 6S: S[52]N/P[54]S/A[122]N/G[124]S/E245N/P246A/ R247S 224

K109N/A292N/A294S: [K109N]/A150N/A152S 225

K109N/A175S: [K109N]/A39S 226

V158T/L287T/M298K: V21T/L144T/M156K 256

V158D/L287T/M298K: V21D/L144T/M156K 257

S103S111delinsQRLMEDICLPRWGCLWEDD F: S[103]S[111]delinsQRLMEDICLP RWGCLWEDDF 227

H115S126delinsQRLMEDICLPRWGCLWEDD F: H[115]S[126]delinsQRLMEDICL PRWGCLWEDDF 228

T128P134delinsQRLMEDICLPRWGCLWEDD F: T[128]P[134]delinsQRLMEDICLP RWGCLWEDDF 229

S103S111delinsIEDICLPRWGCL WE: S[103]S[111]delinsIEDICLPRWG CLWE 230

H115S126delinsIEDICLPRWGCL WE: H[115]S[126]delinsIEDICLPRWG CLWE 231

T128P134delinsIEDICLPRWGCL WE: T[128]P[134]delinsIEDICLPRWG CLWE 232

S103S111delinsDICLPRWGCLWE D: S[103]S[111]delinsDICLPRWGC LWED 233

H115S126deinsDICLPRWGCLWE D: H[115]S[126]delinsDICLPRWGC LWED 234

T128P134delinsDICLPRWGCLWE D: T[128]P[134]delinsDICLPRWGC LWED 235

P406insIEDICLPRWGCLW: P257insTEDICLPRWGCLW 236

P406insGGGSIEDICLPRWGCLW: P257insGGGSIEDICLPRWGCL W 237

P406insDICLPRWGCLWED: P257insDICLPRWGCLWED 238

P406insGGGSDICLPRWGCLWED: P257insGGGSDICLPRWGCLWE D 239

S103S111delinsSFGRGDIRNV: S[103]S[111]delinsSFGRGDIRNV 240

H115S126delinsSFGRGDIRNV: H[1I5]S[126]delinsSFGRGDIRN V 241

T127P134delinsSFGRGDIRTN: T[128]P[134]delinsSFGRGDIRNV 242

P406insCSFGRGDIRNVC: P257insCSFGRGDIRNVC 243

P406insGGGSCSFGRGDIRNVC: P257insGGGSCSFGRGDIRNVC 244

Intercambio de Gla FIX/S222A: Intercambio de Gla FIX/S82A 245

Intercambio de Gla FIX/H257A: Intercambio de Gla FIX/H117A 246

Intercambio de Gla FIX/S222A/M257A: Intercambio de Gla FIX/S82A/H117A 247

S222A/M298Q: S82A/M156Q 248

H257A/M298Q: H117A/M156Q 249

S222A/H257A/M298Q: S82A/H117A/M156Q 250

S222A/A292N/A294S/Q366V: S82A/A150N/A152S/Q217V 251

A175S/S222A/Q366V: A39S/S82A/Q217V 252

S222A/Q366V: S82A/Q217V 253

H257S/Q366V: H117S/Q217V 254

S222A/H373A: S82A/H224A 255

S103S111delinsIEDICLPRWGCL WE/G237V: S[103]S[111]delinsIEDICLPRWG CLWE/G97V 258

S103S111delinsDICLPRWGCLWE D/G237V: S[103]S[111]delinsDICLPRWGC LWED/G97V 259

H115S126delinsQRLMEDICLPRW GCLWEDDF/G237V: H[115]S[126]delinsQRLMEDICL PRWGCLWEDDF/G97V 260

H115S126delinsIEDICLPRWGCL WE/G237V: H[115]S[126]delinsIEDICLPRWG CLWE/G97V 261

H115S126delinsDICLPRWGCLWE D/G237V: H[115]S[126]delinsDICLPRWGC LWED/G97V 262

T128P134delinsQRLMEDICLPRW GCLWEDDF/G237V: T[128]P[134]delinsQRLMEDICLP RWGCLWEDDF/G97V 263

T128P134delinsIEDICLPRWGCL WE/G237V: T[128]P[134]delinsIEDICLPRWG CLWE/G97V 264

S103S111delinsQRLMEDICLPRW GCLWEDDF/G237V: S[103]S[111]delinsQRLMEDICLP RWGCLWEDDF/G97V 265

T128P134delinsDICLPRWGCLWE D/G237V: T[128]P[134]delinsDICLPRWGC LWED/G97V 266

S103S111delinsSFGRGDERNV/G2 37V: S[103]S[111]delinsSFGRGDIRNV /G97V 267

H115S126delinsSFGRGDIRINV/G2 37V: H[115]S[126]delinsSFGRGDIRN V/G97V 268

T128P134delinsSFGRGDIRNV/G2 37V: T[128]P[134]delinsSFGRGDIRNV /G97V 269

M298Q/H373F: M156Q/H224F 270

S119N/L121S/A175S: S[119]N/L[121]S/A39S 271

T128N/P129A/A175S: T[128]N/P[129]A/A39S 272

A122N/G124S/A175S: A[122]N/G[124]S/A39S 273

{Intercambio de GlaFIX/E40L}/Q286R/M298 Q: {Intercambio de GlaFIX/E[40]L}/Q143R/M1 56Q 274

{Intercambio de GlaFIX/K43I}/Q286R/M298 Q: {Intercambio de GlaFIX/K[43]I}/Q143R/M1 56Q 275

{Intercambio de GlaFIX/Q44S}/Q286R/M298 Q: {Intercambio de GlaFIX/Q[44]S}/Q143R/M 156Q 276

{Intercambio de GlaFIX/M19K}/Q286R/M29 8Q: {Intercambio de GlaFIX/M[19]K}/Q143R/M 156Q 277

{Intercambio de GlaFIX/M19K/E40L/K43I/Q 44S}/Q286R/M298Q: {Intercambio de GlaFIX/M[19]K/E[40]L/K[43]I/Q[44]S}/Q14 3R/M156Q 278

T128N/P129A/Q286R: T[128]N/P[129]A/Q143R 279

T128N/P129A/Q286R/M298Q: T[128]N/P[129]A/Q 143R/M156Q 280

T128N/P129A/Q286R/H373F: T[128]N/P[129]A/Q143R/H224E 281

V158D/Q286R/E296V/M298Q: V21D/Q143R/E154V/M156Q 282

T128N/P129A/V158D/E296V/M29 8Q: T[128]N/P[129]A/V21D/E154V/M 156Q 283

T128N/P129A/S222A: T[128]N/P[129]A/S82A 284

Intercambio de GlaFIX/T128N/P129A/S222A/ Q286R: Intercambio de GlaFIX/T[128]N/P[129]A/S8 2A/Q143R 285

Intercambio de GlaFIX/T128N/P129A/Q286R /M298Q: Intercambio de GlaFIX/T[128]N/P[129]A/Q1 43R/M156Q 286

T128N/P129A/S222A/H257A/Q286 R/M298Q: T[128]N/P[129]A/S82A/H117A/Q 143R/M156Q 287

T128N/P129A/Q286R/M298Q/H37 3F: T[128]N/P[129]A/Q143R/M156Q/ H224F 288

S52A/S60A/V158D/E296V/M298Q: S[52]A/S[60]A/V21D/E154V/M15 6Q 289

S52A/S60A/Q286R: S[52]A/S[60]A/Q143R 290

S52A/S60A/S222A: S[52]A/S[60]A/S82A 291

Intercambio de GlaFIX/S52A/S60A/S222A/Q 286R: Intercambio de GlaFIX/S[52]A/S[60]A/S82A /Q143R 292

S52A/S60A/Q286R/M298Q: S[52]A/S[60]A/Q 143R/M156Q 293

S52A/S60A/S222A/H257A/Q286R/ M298Q: S[52]A/S[60]A/S82A/H117A/Q14 3R/M156Q 298

S52A/S60A/Q286R/H373F: S[52]A/S[60]A/Q143R/H224F 296

S52A/S60A/Q286R/M298Q/H373F: S[52]A/S[60]A/Q143R/M156Q/H2 24F 297

V158D/T239V/E296V/M298Q: V21D/T99V/E154V/M156Q 298

T239V/Q286R: T99V/Q143R 299

S222A/T239V: S82A/T99V 300

Intercambio de GlaFDC/S222A/T239V/Q286R: Intercambio de GlaFIX/S82A/T99V/Q143R 301

T239V/Q286R/M298Q: T99V/Q143R/M156Q 302

S222A/T239V/H257A/Q286R/M29 8Q: S82A/T99V/H117A/Q143R/M156 Q 303

Intercambio de GlaFIX/T239V/Q286R/M298 Q: Intercambio de GlaFIX/T99V/Q143R/M 156 Q 304

T239V/Q286R/H373F: T99V/Q143R/H224F 305

T239V/Q286R/M298Q/H373F: T99V/Q143R/M156Q/H224F 306

V158D/T239I/E296V/M298Q: V21D/T99I/E154V/M156Q 307

T239I/Q286R: T99I/Q143R 308

S322A/T239I: S82A/T99I 309

Intercambio de GlaFIX/S223A/T239I/Q286R: Intercambio de GlaFIX/S82A/T99I/Q143R 310

T239I/Q286R/M298Q: T99I/Q143R/M156Q 311

S222A/T239I/H257A/Q286R/M298 Q: S82A/T99I/M117A/Q143R/M156Q 312

Intercambio de GlaFIXC/T239I/Q286R/M298Q: Intercambio de GlaFIX/T99I/Q143R/M156Q 313

T239I/Q286R/H373F: T991/Q143R/H224F 314

T239I/Q286R/M298Q/H373F: T99I/Q143R/M156Q/H224F 315

Intercambio de GlaFIX/S222A/Q286R/M298 Q: Intercambio de GlaFIX/S82A/Q143R/M156 Q 317

Intercambio de GlaFDC/S222A/Q286R/M298 Q/H373F: Intercambio de GlaFIX/S82A/Q143R/M156 Q/H224F 318

V158D/E296V/M298Q/H373F: V21D/E154V/M156Q/H224F 319

V158D/Q286R/E296V/M298Q/H37 3F: V21D/Q143R/E154V/M156Q/H22 4F 320

H257A/Q286R/M298Q: H117A/Q143R/M156Q 321

H257S/Q286R/M298Q: H117/Q143R/M156Q 322

Intercambio de GlaFIX/S22A/H257S/Q286R: Intercambio de GlaFIX/S82A/H117S/Q143R 323

S222A/H257S/Q286R/M298Q: S82A/H117S/Q143R/M156Q 324

H257S/Q286R/M298Q/H373F: H117S/Q143R/M156Q/H224F 325

S222A/Q286R/M298Q/H373F: S82A/Q143R/M156Q/H224F 326

Intercambio de GlaFIX/Q366V: Intercambio de GlaFIX/Q217V 327

S222A/Q286R/M298Q: S82A/Q143R/M156Q 328

T128N/P129A/A175S/Q366V: T[128]N/P[129]A/A39S/Q217V 329

A122N/G124S/A175S/Q366V: A[122]N/G[124]S/A39S/Q217V/ 330

T128N/P129A/A175S/S222A: T[128]N/P[129]A/A39S/S82A 331

A122N/G124S/A175S/S222A: A[122]N/G[124]S/A39S/S82A 332

T128N/P129A/A175S/Q286R: T[128]N/P[129]A/A39S/Q 143R 333

A122N/G124S/A175S/Q286R: A[122]N/G[124]S/A39S/Q143R 334

Intercambio de GlaFIX/T128N/P129A/A175S/ S222A/Q286R: Intercambio de GlaFIX/T[128]N/P[129]A/A3 9S/S82A/Q143R 335

Intercambio de GlaFIX/A122N/G124S/A175S /S222A/Q286R: Intercambio de GlaFIX/A[122]N/G[124]S/A 39S/S82A/Q143R 336

T128N/P129A/A175S/Q286R/M298 Q: T[128]N/P[129]A/A39S/Q143R/M 156Q 337

A122N/G124S/A175S/Q286R/M29 8Q: A[122]N/G[124]S/A39S/Q143R/M 156Q 338

T128N/P129A/A175S/S222A/H257 A/Q286R/M298Q: T[128]N/P[129]A/A39S/S82A/H1 17A/Q143R/M156Q 339

A122N/G124S/A175S/S222A/H257 A/Q286R/M298Q: A[122]N/G[124]S/A39S/S82A/H1 17A/Q143R/M156Q 340

T128N/P129A/A175S/Q286R/M298 Q/H373F: T[128]N/P[129]A/A39S/Q143R/M 156Q/H224F 341

A122N/GI24S/A175S/Q286R/M29 8Q/H373F: A[122]N/G[124]S/A39S/Q143R/M 156Q/H224F 342

T128N/P129A/M298Q: T[128]N/P[129]A/M 156Q 354

{Intercambio de Gla FIX /K43I}/T128N/P129A/Q286R/M298 Q: {Intercambio de Gla FIX /K[43]I}/ T[128]N/P[129]A/Q143R/M156Q 355

T128N/P129A/Q286R/M298Q/Q36 6N: T[128]N/P[129]A/Q143R/M156Q/ Q217N 356

{Intercambio de Gla FIX /K43I}/ T128N/P129A/Q286R/M298Q/Q36 6N: {Intercambio de Gla FIX /K[43]I}/ T[128]N/P[129]A/Q143R/M156Q Q217N 358

T128N/P129A/M298Q/H373F: T[128]N/P[129]A/M 156Q/H224F 359

V158D/Q286R/E296V/M298Q: V21D/Q143R/E154V/M156Q 360

M298Q/Q366N/H373F: M156Q/Q217N/H224F 361

T239V/M298Q/H373F: T99V/M156Q/H224F 362

T239I/M298Q/H373F: T99I/M156Q/H224F 363

T128N/P129A/Q286R/M298Q/Q366N/H373: T[128]N/P[129]A/Q143R/M156Q/ Q217N/H224F 364

T239V/Q286R/M298Q/Q366N: T99V/Q143R/M156Q/Q217N 365

T239I/Q286R/M298Q/Q366N: T99I/Q143R/M156Q/Q217N 366

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a AT-III en ausencia de FT que era más de 4 veces mayor que la de FVIIa de tipo silvestre.

Tabla 16. Inhibición de variantes de FVIIa por AT-III/heparina en presencia de FT

Mutación (numeración de FVII maduro): Mutación (Numeración de Quimotripsina) Ensayo de Resistencia a ATIII Dependiente de FT

Células 293-F: Células BHK-21

K0,5 (nM): K0,5mut/K0,5wt K0,5 (nM) K0,5mut/K0,5wt

WT
WT: 72,3 1,0 56,0 1,0

V158D/E296V/M298Q: V21D/E154V/M156Q 75,1 1,0 79,0 1,4

Q286R: Q143R 60,6 0,8 59,1 1,1

S222A: S82A 47,6 0,7 43,9 0,8

H257S: H117S 50,6 0,7 52,9 0,9

H373D: H224D 423,6 5,9

H373E: H224E 152,1 2,1

H373S: H224S 64,2 0,9

H373F: H224F 38,7 0,5

H373A: H224A 76,9 1,1

Q366D: Q217D 2239,2 31,0

Q366E: Q217E 116,2 1,6

Q366N: Q217N 75,3 1,0

Q366T: Q217T 57,5 0,8

Q366S: Q217S 107,2 1,5

Q366V: Q217V 25,8 0,4 20,0 0,4

A175S: A39S 112,4 1,6

A122N/G124S: A[122]N/G[124]S 48,2 0,7

Q286R/S222A: Q143R/S82A 53,3 1,0

Q286R/S222A/ Intercambio de Gla FIX: Q143R/S82A/Intercambio de Gla FIX 83,7 1,2

Q286R/M298Q: Q143R/M156Q 74,2 1,3

Q286R/M298Q/K341Q: Q143R/M156Q/K192Q 21,8 0,4

Q286R/M298Q/K199E: Q143R/M156Q/K60cE 101,1 1,8

P321K: P170iK 97,5 1,7

P321E: P170iE 66,0 1,2

P321Y: P170iY 49,5 0,9

P321S: P170iS 60,7 1,1

T239S: T99S 254,6 3,5

T239Q: T99Q 117,2 2,1

T239V: T99V 42,5 0,8

T239L: T99L 81,1 1,4

T239H: T99H 52,0 0,9

130 131

Células 293-F: Células BHK-21

K0,5 (nM): K0,5mut/K0,5wt K0,5 (nM) K0,5mut/K0,5wt

T239I: T99I 125,3 2,2

H257A/M298Q: H117A/M156Q 89,1 1,6

S222A/H257A/Q286R/ M298Q: S82A/H117A/Q143R/M156Q 66,6 0,9

Q286R/Q366V: Q143R/Q217V 62,0 1,1

A175S/Q286R/Q366V: A39S/Q143R/Q217V 72,0 1,3

S222A/Q286R/Q366V: S82A/Q143R/Q217V 38,5 0,7

Q286M: Q143M 53,1 0,7

Q286L: Q143L 114,4 1,6

Q286Y: Q143Y 131,3 1,8

Q366I: Q217I 23,2 0,3

Q366L: Q217L 23,0 0,3

Q366M: Q217M 35,4 0,5

Tabla 17. Inhibición de variantes de FVIIa por AT-III/heparina en ausencia de FT

Mutación (numeración de FVII maduro): Mutación (Numeración de Quimotripsina) Ensayo de Resistencia a AT-III Dependiente de FT

Células 293-F
Células 293-F

K0,5 (nM): K0,5mut/K0,5wt K0,5 (nM) K0,5mut/K0,5wt

WT
WT: 2265 1,0 2222 1,0

V158D/E296V/M298 Q: V21D/E154V/M156Q 389 0,2 415 0,2

Q286R: Q143R 10000 >4,4 10000 >4,5

S222A: S82A 2338 1,0 2088 0,9

H257S: H117S 5884 2,6 5584 2,5

H373D: H224D 10000 >4,4

H373E: H224E 6949 3,1

H373S: H224S 9513 4,2

H373F: H224F 1306 0,6

H373A: H224A 10000 >4,4

Q366D: Q217D 10000 >4,4

Q366E: Q217E 6901 3,0

Q366N: Q217N 5186 2,3

Q366T: Q217T 5885 2,6

Q366S: Q217S 10000 >4,4

Q366V: Q217V 487 0,2 531 0,2

A175S: A39S 5785 2,6

Células 293-F
Células 293-F

K0,5 (nM): K0,5mut/K0,5wt K0,5 (nM) K0,5mut/K0,5wt

A122N/G124S: A[122]N/G[124]S 2926 1,3

Q286R/S222A: Q143R/S82A 10000 >4,5

Q286R/S222A/Intercambio de Gla FIX: Q143R/S82A/Intercambio de Gla FIX 10000 >4,4

Q286R/M298Q: Q143R/M156Q 3663 1,6

Q286R/M298Q/K34IQ: Q143R/M156Q/K192Q 72

Q286R/M298Q/K199E: Q143R/M156Q/K60cE 5182 2,3

P321K: P170iK 5274 2,4

P321E: P170iE 3666 1,6

P321Y: P170iY 705 0,3

P321S: P170iS 2689 1,2

T239S: T99S 10000 >4,4

T239Q: T99Q 2222 1,0

T239V: T99V 2644 1,2

T239L: T99L 8532 3,8

T239H: T99H 10000 >4,5

T2391: T99I 10000 >4,5

H257A/M298Q: H117A/M156Q 1344 0,6

S222A/H257A/Q286 R/M298Q: S82A/H117A/Q143R/ M156Q 7742 3,4

Q286R/Q366V: Q143R/Q217V 2251 1,0

A175S/Q286R/Q366V: A39S/Q143R/Q217V 10000 >4,5

S222A/Q286R/Q366V: S82A/Q143R/Q217V 3398 1,5

Q286M: Q143M 10000 >4,4

Q286L: Q143L 10000 >4,4

Q286Y: Q143Y 10000 >4,4

Q366I: Q217I 599 0,3

Q366L: Q217L 1708 0,8

Q366M: Q217M 914 0,4

Se realizó un conjunto adicional de experimentos para evaluar la inhibición de variantes de FVIIa por AT-III/heparina en ausencia de FT usando el mismo ensayo que se ha descrito anteriormente con modificaciones menores. Se usó heparina no fraccionada, de longitud completa (Calbiochem) en lugar de heparina de bajo peso molecular (heparina

5 BPM) para aumentar la velocidad de la reacción de inhibición (véase, por ejemplo, Olson et al. (2004) Thromb Haemost 92(5), 929-939). El tiempo de incubación del ensayo se aumentó a 60 minutos, y la concentración del sustrato de mesil-FPR-ACC usado para determinar la actividad residual se aumentó hasta una concentración final de 0,5 mM.

10 La Tabla 18 proporciona los resultados de los ensayos que se realizaron en ausencia de FT usando variantes de FVIIa expresadas en células BHK-21 y células CHOX. Los resultados se presentan tanto como el parámetro K0,5

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Tabla 19.

Mutación (numeración de FVII maduro): Mutación (numeración de Quimotripsina) Pérdida de Sangre de MHI; % de Inhibición (1,5 mg/kg) n Pérdida de Sangre por MHI; DE50 (mg/kg) n

WT (NovoSeven®)
WT (NovoSeven®): 61 1 0,7 1

WT
WT: 59 1 0,75 1

T128N/P129A: T[128]N1P[129]A 78 1 0,5 1

Intercambio de Gla FIX
Intercambio de Gla FIX: 63 1

A122N/G124S: A[122]N/G[124]S 64 1

V158D/E296V/M298Q: V21D/E154V/M156Q 86 3 0,5 3

Q286R: Q143R 76 2 0,55 2

S222A: S82A 75 1 0,45 1

H257S: H117S 50 1

H373F: H224F 78 1

Q366V: Q217V 64 1

A175S: A39S 58 1

K109N/A175S: K[109]N/A39S 60 1

Q286R/H257A: Q143R/H117A 58 1

Q286R/S222A: Q143R/S82A 50 1

Q286R/S222A/H257A: Q143R/S82A/H117A 68 1

Q286R/M298Q: Q143R/M156Q 85 2 0,15 2

Q286R/M298Q †: Q143R/M156Q † 89 1 0,16 2

Intercambio de Gla FIX/ Q286R/M298Q: Intercambio de Gla FIX/ Q143R/M156Q 83 2 0,13 1

S222A/H257A/Q286R/ M298Q: S82A/H117A/Q143R/M156Q 85 1 0,2 1

H257S/Q286R/Q366V: H117S/Q143R/Q217V 46 1

S222A/H257A/Q286R/ Q366V: S82A/H117A/Q143R/Q217V 49 1

Q286R/M298Q/Q366N: Q143R/M156Q/Q217N 88 1

Q286R/H373F: Q143R/H224F 75 1

Q286R/M298Q/H373F: Q143R/M156Q/H224F 95 1 0,15 1

M298Q/H373F: M156Q/H224F 95 1 0,21 1

Intercambio de Gla FIX/S222A/Q286R: Intercambio de Gla F1X/S82A/Q143R 85 1 0,4 1

V158D/Q286R/E296V/ M298Q: V21D/Q143R/E154V/M156Q 95 1

T128N/P129A/Q286R/ H373F: T[128]N/P[129]A/Q143R/H2 24F/ 70 1

† polipéptido de FVIIa producido a partir de células CHOX

E. Análisis de la actividad coagulante de variantes de FVIIa adicionales en el uso del modelo de hemofilia inducida

La actividad coagulante de varias variantes de FVIIa se evaluó usando el Modelo de Hemofilia Inducida (MHI) con ratones CD-1 descrito en el Ejemplo 6.B, anterior. El protocolo fue igual que el descrito anteriormente, excepto que para estos experimentos se usaron los lotes 4 a 6 de anti FVIII. Los detalles de estos lotes fueron los siguientes: lote 4 (detallado anteriormente), para el quinto lote (lote 5; Affinity Biologicals, lote IGI593R2, actividad neutralizante de

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muestras de plasma de ratón se calcularon a partir de la parte lineal del log de FVIIa frente a la curva patrón de log de tiempo de coagulación. La capacidad de las muestras de plasma para inducir coagulación en plasma deficiente en Factor VII se presentó como ng de FVIIa/ml de plasma de ratón después de restar el fondo de FVIIa de tipo silvestre endógeno en plasma de ratones tratados con simulación.

5 La semivida de cada proteína de FVII se determinó de forma rutinaria realizando un ajuste convencional del logaritmo natural de la actividad a una línea recta, y midiendo el tiempo que tarda la actividad de las proteínas de FVIIa en reducirse a la mitad. Para proteínas de FVII con degradación multiexponencial, la semivida se determinó a partir de la parte terminal del perfil de logaritmo de plasma frente a tiempo. Se calcularon parámetros

10 farmacocinéticos adicionales de la siguiente manera: AUC de plasma0-inf/Dosis (calculado como [AUC(0-t) + Ct/(ln2/T1/2)], donde t es el último punto temporal con concentración en plasma medible del polipéptido de FVIIa dividido por la dosis IV (mg/kg)); semivida (la semivida del polipéptido de FVIIa durante la fase terminal de perfil de concentración de FVIIa en plasma frente al tiempo; T1/2 se calcula como -ln2 dividido por la pendiente negativa durante la fase terminal de la representación logarítmica-lineal de la curva de concentración de FVIIa en plasma

15 frente al tiempo); MRT0-último (tiempo medio que el polipéptido de FVIIa reside en el cuerpo; calculado como AUMC 0último/AUC 0-último, donde AUMC0-último es el área total bajo la curva de primer momento frente a tiempo (curva de concentración de FVIIa · tiempo frente a tiempo), y se calcula por la regla trapezoide lineal); CI (eliminación sistémica; calcula como dosis/AUC0-inf); y Vd (volumen de distribución basado en la constante e de eliminación terminal (); calculado como [Cl/(ln2/T1/2)]).

20

D. Propiedades farmacocinéticas de variantes de FVIIa

Usando el protocolo de FVIIa:C descrito anteriormente, se evaluaron las propiedades farmacocinéticas de FVIIa de tipo silvestre y variantes de FVIIa basándose en la actividad de coagulación en plasma. Los resultados se exponen

25 en la Tabla 23. Varias variantes de FVIIa mostraron parámetros farmacocinéticos mejorados en comparación con FVIIa de tipo silvestre.

Tabla 23. Parámetros farmacocinéticos de ratón de variantes de FVIIa

Mutación (numeración de FVII maduro): Dosis IV (mg/kg) AUC0-inf en plasma (g.min/ml) /Dosis semivida (minutos) MRT0último (minutos) lC (ml/min /kg) Vd (ml /kg) N

NovoSeven® RT FVIIa: 0,1 1165 37 50 0,9 46 1

NovoSeven® FVIIa: 0,1 741 30 31 1,4 58 1

NovoSeven® FVIIa: 1,0 1156 36 41 1,7 89 1

WT: 0,1 686 37 37 1,8 92 6

WT: 1,0 798 50 57 1,5 118 2

P257insGGGSCSFGRGDIRNVC: 0,1 391 32 32 2,3 108 1

T128N/P129A: 0,1 1392 57 43 0,8 64 2

S52A: 0,1 594 51 58 1,6 118 1

K109N: 0,1 951 50 40 1,1 75 1

A51N: 0,1 270 33 32 3,7 174 1

S52A/S60A: 0,05 460 25 29 2,2 78 1

S52A/S60A: 0,1 408 17 34 2,5 61 1

M298Q: 0,1 258 76 33 4,9 443 2

T128N/P129A/M298Q: 0,1 495 26 28 2,0 75 1

V158D/E296V/M298Q: 0,05 72 13 10 13,9 258 1

V158D/E296V/M298Q: 0,1 44 16(á), 45(â) 20 22,8 146 5 1

V158D/E296V/M298Q: 1,0 39 7 13 26,6 979 2

V158D/E296V/M298Q: 3,0 22 7,7á 7,9 45,6 506 1

V158D/E296V/M298Q: 6,0 48 43 45 20,8 130 5 1

T128N/P129A/V158D/E296V/M2 98Q: 0,1 125 11 14 8,0 122 1

S52A/S60A/V158D/E296V/M298 Q: 0,1 47 15 11 21,4 450 1

Q286R: 0,1 181 55 59 5,5 439 1

Q286R: 0,3 460 41,7 76 1,8 110 1

Q286R: 1,0 1256 67 68 0,8 80 2

T128N/P129A/Q286R: 0,1 2443 96 82 0,4 56 1

S52A/S60A/Q286R: 0,1 1565 43 60 0,6 55 1

Intercambio de Gla FIX: 0,1 207 20 22 4,9 140 2

K341D: 0,1 2817 106 114 0,1 22 1

S222A: 0,1 189 32 33 5,3 248 1

156 157 158

S222A: 1,0 139 30 33 3,8 293 1

T128N/P129A/S222A: 0,1 422 28,4(á), 71(â) 58 2,4 244 1

S52A/S60A/S222A: 0,1 270 45 38 3,7 243 1

H257A: 0,1 595 31 30 1,7 76 1

H257S: 0,1 1015 59 62 1,0 84 1

H257S: 0,75 816 50 62 1,2 85 1

Q366V: 0,1 19 14 11 51,6 106 0 1

Intercambio de GlaFIX/Q366V: 0,1 157 11 7,0 6,4 107 1

A122N/G124S/E394N/P395A/ R396S: 0,1 1089 63 45 0,9 84 1

G318N: 1,0 568 95 56 1,8 242 1

A175S: 0,1 2081 111 85 0,5 76 2

K109N/A175S: 0,1 1280 183 51 0,8 207 1

S119N/L121S/A175S: 0,1 2460 102 50 0,4 60 1

T128N/P129A/A175S: 0,1 2770 83 48 0,4 43 1

A122N/G124S/A175S: 0,1 3240 91 50 0,3 40 1

A122N/G124S: 0,1 679 52,9 42 1,1 87 1

H257A/Q286R: 0,1 1848 56,8 73 0,5 44 1

S222A/Q286R: 0,1 861 30 38 1,5 97 2

Intercambio de GlaFIX/S222A/Q286R: 1,0 415 39 42 2,4 136 1

Intercambio de Gla FIX/T128N/P129A /S222A/Q286R: 0,1 929 55 59 1,1 86 1

S222A/H257A/Q286R: 0,1 976 56 42 1,0 83 1

Q286R/M298Q: 0,055 1198 40 44 0,8 49 1

Q286R/M298Q: 0,1 605 35 42 1,9 94 6

Q286R/M298Q: 1,0 363 29 36 2,8 116 1

Intercambio de Gla FIX/Q286R/M298Q: 0,1 231 26 20 4,9 194 3

T128N/P129A/Q286R/M298Q: 0,1 1571 41 60 0,6 38 1

T[128]N/P[129]A/

Q286R/M298Q: 0,1 1326 42,3 50 0,8 47 1

Intercambio de Gla FIX/T128N/P129A/ Q286R/M298Q: 0,1 427 30 32 2,3 101 1

{Intercambio de Gla FIX/E[40]L}/ Q286R/M298Q: 0,1 386 53 43 2,6 198 1

{Intercambio de Gla FIX/K[43]I}/ Q286R/M298Q: 0,1 439 85 47 2,3 280 1

{Intercambio de Gla FIX/Q[44]S}/ Q286R/M298Q: 0,1 291 14 24 3,4 150 1

{Intercambio de Gla FIX/M[19]K}/ Q286R/M298Q: 0,1 648 14 (á), 75 (â) 43 1,5 32 1

S52A/S60A/Q286R/M298Q: 0,1 374 32 34 2,7 122 1

Intercambio de Gla FIX/S52A/S60A/ Q286R/M298Q: 0,1 256 19 18 3,9 107 1

{Intercambio de Gla FIX/K[43]I}/ T128N/P129A/Q286R/M298Q: 0,1 154 18 17 6,5 166 1

S222A/M298Q: 0,1 72 17 12 13,9 332 1

S222A/H257A/Q286R/M298Q: 0,1 93 33 30 10,8 517 1

T128N/P129A/S222A/H257A/Q2 86R/M2986Q: 0,1 770 38 45 1,3 72 1

S52A/S60A/S222A/H257A/Q28R/ M2986Q: 0,1 469 26 28 2,1 78 1

A175S/Q286R/Q366V: 0,1 353 28,9 23 2,8 118 1

Q286R/M298Q/K341D: 0,1 219 23 20 4,6 151 1

M298Q/K341D: 0,1 2430 78 76 0,4 46 1

Q286R/M298Q/Q366N: 0,1 569 29 32 1,8 74 1

T128N/P129A/Q286R/M298Q /Q366N: 0,1 1897 50 58 0,5 38 1

{Intercambio de Gla FIX: 0,1 257 10(á), 20 3,9 163 1

K[43]I}/Q286R/M298Q/Q366N: 28(â)

{Intercambio de Gla FIX K[43]I}/T128N/P129A/Q286R/M2 98Q /Q366N: 0,1 393 24 27 2,5 89 1

T128N/P129A/0286R/H373F: 0,1 1467 59 62 0,9 74 1

Q286R/M298Q/H373F: 0,1 466 28 23 2,2 87 1

T128N/P129A/Q286R/M298Q /H373F: 0,1 597 27(á), 67(â) 51 1,6 153 1

T128N/P129A/M298Q/H1373F: 0,1 307 7(á), 27(â) 23 3,3 126 1

V158D/Q286R/E296V/M298 Q: 0,1 172 14 36 5,8 535 1

S222A/T239V: 0,1 127 47 39 7,9 535 1

Intercambio de Gla FIX/S222A/T239V/Q286R: 0,1 460 34 33 2,2 108 1

T239V/Q286R/M298Q: 0,1 398 28(á),71 ( â) 60 2,5 258 1

Intercambio de Gla FIX/T239V/Q286R/M298Q: 0,1 365 13(á),56( â) 29 2,7 220 1

T128N/P129A/T239V/Q286R/ M298Q: 0,1 914 38 36 1,1 60 1

S222A/T239V/H257A/Q286R/M2 98Q: 0,1 181 28 31 5,5 225 1

T128N/P129A/S222A/T239V/H25 7A/ Q286R/M298Q: 0,1 564 27 30 1,8 70 1

T239V/Q286R/H373F: 0,1 385 72 54 2,6 269 1

T239V/Q286R/M298Q/H373F: 0,1 149 36 23 6,7 353 1

T128N/P129A/T239V/Q286R/ M298Q/H373F: 0,1 345 27 27 2,9 113 1

V158D/T239I/E296V/M298Q: 0,1 370 14(á),70( â) 50 2,7 273 1

T239I/Q286R: 0,1 1820 85 76 0,6 68 1

S222A/T239I: 0,1 1300 6(á), 81(â) 69 0,8 90 1

Intercambio de Gla FIX/S222A/T239I/Q286R: 0,1 1073 70 66 0,9 94 1

T2391/Q286R/M298Q: 0,1 1029 27(á),60( â) 62 1,0 84 1

Intercambio de Gla FIX/T2391/Q286R/M298Q: 0,1 1269 54 62 0,8 61 1

T128N/P129A/T2391/Q286R/ M298Q: 0,1 2105 82 74 0,5 56 1

S222A/T2391/H257A/Q286R/M2 98Q: 0,1 1212 31(á), 79(â) 60 0,8 101 1

T239I/Q286R/H373F: 0,1 1841 30(á), 85(â) 69 0,5 62 1

V158D/T239V/E296V/M296Q: 0,1 184 24(á), 134(â) 78 5,4 105 3 1

T239V/Q286R: 0,1 1522 29(á), 72(â) 68 0,7 68 1

T239V/Q286R/M298Q/H373F: 0,1 950 36 61 1,1 55 1

T239V/Q286R/M298Q/H373F: 0,1 806 32 56 1,3 57 2

T239V/Q286R/M298Q/H373F: 0,1 663 27 52 1,5 59 1

T239V/Q286R/M298Q/H373E: 0,1 1350 53 62 0,7 57 1

S222A/H257S/Q286R/M298Q: 0,1 814 33 31 1,2 59 1

H257S/Q286R/M298Q/H373F: 0,1 297 34 34 3,4 163 1

S222A/Q286R/M298Q/H373F: 0,1 106 35 23 9,4 478 1

Intercambio de Gla FIX/S222A/: 0,1 104 9,1(á),17 13 9,7 242 1

Q286R/M298Q/H373F: (a)

S222A/Q286R/M298Q: 0,1 347 24 26 2,9 102 1

Intercambio de Gla FIX / S222A/ Q286R/M298Q: 0,1 263 11 13 3,8 62 1

T128N/P129A/A175S/Q366V: 0,1 2196 52(á), 85(â) 78 0,5 56 1

A122N/G124S/A175S/Q366V: 0,1 2148 92 81 0,5 62 1

T128N/P129A/A175S/S222A: 0,1 4248 122 88 0,2 41 1

A122N/G124S/A175S/S222A: 0,1 3316 102 83 0,3 44 1

T128N/P129A/A175S/Q286R: 0,1 6160 151 94 0,2 35 1

A122N/G124S/A175S/Q286R: 0,1 4097 139 93 0,2 49 1

Intercambio de Gla FIX /S222A/Q286R/H373F: 0,1 480 26 30 2,1 79 1

V258D/E296V/M298Q/H373F: 0,1 90 8,7(á), 20(â) 14 11,1 321 1

H257A/Q286R/M298Q: 0,1 1029 42 48 1,0 59 1

Intercambio de Gla FIX /T128N/ P129A/A175S/S222A/Q286R: 0,1 2787 38(á), 134(â) 88 0,4 69 1

Intercambio de Gla FIX /A122N/G124S/A175S/S222A/Q2 86R: 0,1 3492 148 95 0,3 61 1

T128N/P129A/A175S/Q286R/ M298Q: 0,1 5120 171 96 0,2 48 1

A122N/G124S/ A175S/Q286R/M298Q: 0,1 3681 154 92 0,3 61 1

T128N/P129A/A175S/S222A/ H257A/Q286R/M298Q: 0,1 3140 113 87 0,3 52 1

A122N/G124S/A175S/S222A /H257A/Q286R/M298Q: 0,1 2659 37,(á),13 0(â) 85 0,4 70 1

T128N/P129A/A175S/Q286R/ M298Q/H373F: 0,1 3580 118 88 0,3 48 1

A122N/G124S/A175S/Q286R/ M298Q/H373F: 0,1 3148 105 84 0,3 48 1

V158D/Q286R/E296V/M298 Q/H373F: 0,1 124 20 17 8,1 237 1

M298Q/H373F/Q366N: 0,1 169 8 8,2 5,9 69 1

T239V/M298Q/H373F: 0,1 110 18 16 9,1 235 1

T2391/M298Q/H373F: 0,1 562 26 28 1,8 66 1

T128N/P129A/Q286R/M298Q /Q366N/H373F: 0,1 607 29 30 1,6 69 1

T239V/Q286R/M298Q/ Q366N: 0,1 729 29 30 1,4 57 1

T239I/Q286R/M298Q/Q366N: 0,1 1548 72 73 0,6 67 1

 = semivida alfa, que mide la semivida de distribución  = semivida beta, que mide la semivida de eliminación

La Tabla 24 expone los resultados del estudio usando los siguientes parámetros farmacocinéticos: % de Recuperación (in vivo) (la concentración en plasma de FVIIa medida a los 5 minutos después de la dosis (primer punto temporal) dividido por el máximo teórico de concentración en plasma de FVIIa (basándose en la masa de 5 FVIIa administrada y el volumen sanguíneo total teórico) por 100 %); % de Recuperación (in vitro) (la concentración de FVIIa medida en plasma con adición de una cantidad conocida de FVIIa dividida por la concentración en plasma de FVIIa teórica (basándose en la cantidad de FVIIa añadida a un volumen en plasma conocido) por 100 %); AUC*Actividad/Dosis (Dependiente de FT) (la AUC en plasma/Dosis multiplicada por la Actividad Indirecta Dependiente de FT (véase Tabla 15, anterior); Mejora en la Exposición de Actividad sobre FVIIa NovoSeven®

10 (Dependiente de FT) (calculado por AUC*Actividad/Dosis (Dependiente de FT)NoVoSeven® FVIIa/AUC*Actividad/Dosis (Dependiente de FT)FVIIa Mutante); AUC*Actividad/Dosis (Independiente de FT) (la AUC en plasma/Dosis multiplicada por la Actividad Indirecta Independiente de FT (véase Tabla 15, anterior); Mejora en la Exposición de Actividad sobre FVIIa NovoSeven® (Independiente de FT) (calculada por AUC*Actividad/Dosis (Independiente de FT) FVIIa NovoSeven®/ AUC*Actividad/Dosis (Independiente de FT) FVIIa Mutante).

15

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Ejemplo 10

Determinación de la unión del Factor VIIa con factor tisular soluble

5 La capacidad de las variantes de FVIIa expresadas a partir de células HEK 293 o BHK para unirse con el factor tisular soluble (FTs) se evaluó usando resonancia de plasmón superficial de Biacore. Las variantes de FVIIa se evaluaron mediante la medición del perfil de unión a tres concentraciones de proteasa en dos experimentos por duplicado, usando dos niveles diferentes de FTs unido con una microplaca CM5 de Biacore.

10 Se acopló una nueva microplaca sensora CM5 Serie S (GE Healthcare Cat nº BR1006-68) con albúmina de suero bovino y factor tisular soluble usando un instrumento T100 Biacore. Se llevó a cabo acoplamiento usando un tampón de acoplamiento Biacore (Na Hepes 30 mM pH 7,4, NaCl 135 mM, EDTA 1 mM, Tween-20 0,01 %) con un kit de acoplamiento de Amina (GE Healthcare Cat nº BR-1000-50) y el asistente de protocolo en el software T100 de Biacore. Para la inmovilización, se usaron las cuatro células de la microplaca. Las células 1 y 3 se acoplaron con

15 500 unidades de respuesta (UR) de proteína de referencia de albúmina de suero bovino diluida en tampón de acetato, pH 4,0 y las células 2 y 4 se acoplaron con 500 y 250 UR de FTs (R&D Systems) diluido en tampón de Acetato, pH 4,5.

Cada variante de FVIIa, y la proteasa FVIIa de tipo silvestre, se ensayaron a tres concentraciones y por duplicado.

20 Las proteasas se diluyeron a 60 nM, 30 nM y 15 nM en 100 l e tampón de Ensayo Biacore (Na Hepes 20 mM, pH 7,4, NaCl 150 mM, CaCl2 5 mM, PEG 8000 0,1 %, BSA 0,1 %, Tween-20 0,01 %) en una placa de ensayo de 96 pocillos. Cada muestra se ensayó en el instrumento T100 Biacore usando 120 segundos de tiempo de contacto seguido de 180 segundos de tiempo de disociación a un caudal de 10 l/minuto. También se ensayó un blanco de tampón. La microplaca se regeneró con EDTA 50 mM, pH 7,0 durante 60 segundos y después 30 segundos. El

25 ensayo para medir la unión de FVIIa de tipo silvestre con FTs debería producir tres conjuntos de curvas que proporcionan una Kd de aproximadamente 8 nM.

Se usó software de evaluación Biacore T100 para analizar los datos. Específicamente, se utilizó el análisis de unión de Cinética/Afinidad 1:1, que ajusta los datos a la isoterma de Langmuir, y los datos se ajustaron individualmente

30 para dos repeticiones de cada variante en dos acoplamientos de unidades de respuesta. Los cuatro valores de Kd ajustados se promediaron y se presentan en la Tabla 25. Las variantes de FVIIa que contienen la mutación M298Q tendían a mostrar resultados de Kd menores y por lo tanto se unen más estrechamente con FTs.

Tabla 25. Unión de variantes de FVIIa con FT soluble

Mutación (numeración de FVII maduro): Mutación (numeración de quimotripsina) Kd de afinidad (nM)

Células 293-F: Células BHK

wt
wt: 7,9 9,0

Q286N: Q143N 8,9

Q286E: Q143E 3,8

Q286D: Q143D 9,8

Q286S: Q143S 8,2

Q286T: Q143T 10,6

Q286R: Q143R 7,6

Q286K: Q143K 8,2

Q286A: Q143A 6,3

Q286V: Q143V 11,9

S222A: S82A 4,2

H257S: H117S 4,2

Q366D: Q217D 3,2

Q366E: Q217E 5,6

Q366N: Q217N 3,8

Q366T: Q217T 7,1

165

Células 293-F: Células BHK

Q366S: Q217S 9,0

Q366V: Q217V 7,9

A175S: A39S 6,5

V158T/L287T/M298K: V21T/L144T/M156K 8,4

V158D/L287T/M298K: V21D/L144T/M156K 8,5

Q286R/S222A: Q143R/S82A 7,3

Q286R/S222A/Intercambio de Gla FIX: Q143R/S82A/intercambio de Gla FIX 8,4

Q286R/M298Q: Q143R/M156Q 4,7

Q286R/M298Q/K341Q: Q143R/M156Q/K192Q 11,4

Q286R/M298Q/K199E: Q143R/M156Q/K60cE 4,9

S222A/M298Q: S82A/M156Q 5,1

H257A/M298Q: H117A/M156Q 3,1

S222A/H257A /Q286R/M298Q: S82A/H117A/Q143R/M156Q 2,5

Q286R/Q366V: Q143R/Q217V 29,3

A175S/Q286R/Q366V: A39S/Q143R/Q217V 18,3

S222A/Q286R/Q366V: S82A/Q143R/Q217V 8,6

Q286M: Q143M 7,1

Q286L: Q143L 7,1

Q286Y: Q143Y 7,5

Q366I: Q217I 6,7

Q366L: Q217L 5,2

Q366M: Q217M 4,7

H216A/H257A: H76A/H117A 6,0

Q286R/K341D: Q143R/K192D 3,5

M298Q/K341D: Q143R/Q217D 7,9

Q286R/Q366N: Q143R/Q217N 8,0

Q286R/M298Q/Q366D: Q143R/M56Q/Q217D 4,6

Q286R/M298Q/Q366N: Q143R/M156Q/Q217N 3,8

Se realizó un conjunto adicional de experimentos para evaluar la unión de variantes de FVIIa con FT soluble usando el mismo ensayo que se ha descrito anteriormente, pero con una modificación del intervalo de dosis de FVIIa a 30 nM, 15 nM y 7,5 nM y el análisis de datos de modo que se usó un modelo de dos estados para ajustarse a los datos de RPS. Este análisis de modelo de dos estados se proporcionó en el conjunto de Software de Evaluación Biacore T100 y se reproduce a continuación. Los resultados se proporcionan en la Tabla 26, posteriormente.

166

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Ejemplo 11

Inhibición de variantes de FVIIa por Zn2+

5 Se ensayaron variantes de FVIIa, expresadas a partir de células HEK 293 o BHK, con respecto a resistencia a la inhibición por Zn2+ tanto en presencia como en ausencia de factor tisular soluble. Brevemente, se diluyó ZnCl2 (Aldrich) a 20 mM en dH2O y después a 4 mM en tampón de ensayo 1x (Na Hepes 50 mM, pH 7,5, NaCl 100 mM, CaCl2 1,5 mM, Tween-20 0,01 % y PEG-8000 0,01 %). Se realizaron diluciones dobles en serie para generar once concentraciones de cinc, hasta 3,9 M, a través de una placa de 96 pocillos. El último pocillo en la fila contenía

10 tampón sin cinc para medir la actividad proteolítica de FVIIa no inhibido. Las variantes de FVIIa, y la proteasa de tipo silvestre, se diluyeron hasta 500 nM y después de nuevo 10 veces hasta 50 nM. Esta solución de reserva 50 nM se usó para ensayos realizados sin factor tisular soluble (FTs, R&D Systems). Para ensayos con factor tisular soluble, la proteasa se diluyó de nuevo en tampón de ensayo 1X con FTs hasta concentraciones finales de 12,5 nM y 125 nM, respectivamente. Las soluciones se preincubaron durante al menos 5 minutos a temperatura ambiente.

15 Para comenzar la reacción de inhibición, se mezclaron 20 l de la solución de FVIIa/FTs o FVIIa con 60 l de la serie de cinc en cada fila para diez concentraciones. Para reacciones de inhibición solamente con FVIIa, las mezclas se iniciaron usando ZnCl2 2 mM, y para FVIIa/FTs, se iniciaron usando ZnCl2 4 mM. La placa se incubó durante 30 minutos a temperatura ambiente. Para ensayar la inhibición por Zn2+, se añadieron 20 l de sustrato de FVIIa (Mesil

20 dFPR-ACC, disuelto hasta 20 mM en DMSO y diluido en tampón de ensayo) a los pocillos hasta una concentración final de 90 M. Las concentraciones de FTs y cinc se mantuvieron en el ensayo añadiéndolas según fuera apropiado a la solución de sustrato. El aumento de fluorescencia (Ex: 380 nm, Em: 460 nm) se midió durante 60 minutos a 30 ºC en un lector de placas Spectramax Gemini M5 (Molecular Devices). La actividad proteolítica residual se calculó a cada concentración de cinc dividiendo la tasa inhibida por la tasa de proteasa no inhibida. Se calculó la

25 concentración de Zn2+ necesaria para inhibir la mitad de la actividad proteolítica (K0,5) representando la concentración de cinc frente a actividad residual, y ajustando con una ecuación hiperbólica usando software XLFit4 (IDBS). Cada proteasa se ensayó dos veces en dos ocasiones separadas para obtener un valor promedio para la K0,5.

30 Los resultados se proporcionan en la Tabla 27. Las mutaciones de H257 y H216 aumentaron la resistencia aproximadamente 3 veces. Las mutaciones M268Q también aumentaron la resistencia a cinc 3 veces. En todos los casos, el efecto se conservó en grados diferentes cuando se combinó con mutaciones adicionales. Las variantes más resistentes fueron combinaciones de las mutaciones anteriores: H216A/H257A-FVIIa y H257A/M298Q-FVIIa.

35 Tabla 27. Inhibición de variantes de FVIIa por Zn2+

Mutación (numeración de FVII maduro): Mutación (numeración de quimotripsina) K0,5 (mM)

HEK 293: BHK

WT
WT: 87,0 42,0

M298Q: M156Q 187,3

Q286R: Q143R 30,1 22,5

H216S: H76S 231,0

H216A: H76A 244,5

H216K: H76K 248,8

H216R: H76R 316,5

S222A: S82A 87,5 63,8

S222K: S82K 73,0

H257A: H117A 217,5 113,0

H257S: H117S 149,7 128,0

K161S: K24S 51,5

K161A: K24A 73,5

K161V: K24V 79,5

Q286R/S222A: S82A/Q143R 24,5

Q286R/S222A/ Intercambio de Gla: S82A/Q143R/intercambio de Gla FIX 34,0

172

HEK 293: BHK

FIX

S222A/M298Q: S82A/M156Q 138,0

H257A/M298Q: H117A/M156Q 481,0

S222A/H257A/Q286R/M298 Q: S82A/H117A/Q143R/M156Q 180,6

S222A/Q286R/Q366V: S82A/Q143R/Q217V 40,5

S222V: S82V 86,8

S222D: S82D 89,5

S222N: S82N 94,6

S222E: S82E 110,5

H216A/H257A: H76A/H117A 407,5

H216A/S222A: H76A/S82A 226,0

H257S/Q286R: H117S/143R 316,5

S222A/H373A: S82A/H224A 94,0

Ejemplo 12

Determinación de la concentración de proteasa catalíticamente activa usando el titulante de sitio activo 45 metilumbeliferil p’-guanidinobenzoato (MUGB)

En algunos casos, la concentración de FVIIa catalíticamente activo en una solución de reserva se determinó

valorando un complejo de FVIIa y factor tisular soluble (FTs) con 4-metilumbeliferil p’-guanidinobenzoato (MUGB), un

sustrato de éster fluorogénico desarrollado como un sitio activo para serina proteasa de tipo tripsina. El ensayo se 10 llevó a cabo esencialmente como se describe en Payne et al. (Biochemistry (1996) 35: 7100-7106) con algunas

modificaciones menores. MUGB reacciona fácilmente con FVIIa, pero no FVII o proteasa inactiva, para formar un

intermedio de acil-enzima eficazmente estable en condiciones en las que la concentración de MUGB es saturante y

la desacilación es especialmente lenta y limitante de la velocidad para catálisis. En estas condiciones, la proteasa

FVIIa experimenta una única renovación catalítica para liberar el fluoróforo 4-metilumbeliferona (4-MU). Cuando se 15 calibre el estallido inicial de fluorescencia a una curva patrón de concentración externa de fluorescencia de 4-MU,

puede calcularse la concentración de sitios activos.

Se realizaron ensayos con un volumen de reacción de 1 ml o 2 ml en una cubeta de cuarzo de 0,4 cm x 1 cm o 1 cm

x 1 cm, respectivamente, con agitación continua. Cada reacción contenía FTs 0,5 M (R&D Systems Human) en un 20 tampón de ensayo que contenía Hepes 50 mM, NaCl 100 mM, CaCl2 5 mM y PEG 8000 0,1 %, pH 7,6. La solución

patrón de 4-MU se preparó nueva a una concentración de reserva de 0,5 M en DMSO y la concentración se confirmó

mediante espectroscopia de absorbancia a 360 nm usando un coeficiente de extinción de 19.000 M-1 cm-1 en tampón

Tris 50 mM, pH 9,0. Se preparó MUGB a una concentración de reserva de 0,04 M en DMSO basándose en el peso

seco. Se iniciaron ensayos añadiendo 4 l de MUGB 4 mM (para la reacción de 2,0 ml) o MUGB 2 mM (para la 25 reacción de 1,0 ml) (en cada caso una concentración final de 8 M) a una solución de FTs 0,5 M (20,2 l o 10,1 l

de FTs 49,4 M) en tampón de ensayo 1x y midiendo en primer lugar la hidrólisis de fondo de MUGB durante 150

200 segundos antes de la adición de FVIIa o una variante de FVIIa a una concentración final de 100-200 nM

basándose en el ELISA inicial (Ejemplo 1C.1) o la valoración del sitio activo con FFR-CMK (Ejemplo 3). La liberación

de fluorescencia de 4-MU en la fase de estallido de la reacción se siguió durante 1000-1200 segundos adicionales. 30 Se preparó una curva patrón de 4-MU libre por valoración de la 4-MU calibrada por absorbancia en tampón de

ensayo 1x que contenía FTs 0,5 M en etapas de 20 nM hasta una concentración final de 260-300 nM.

Para análisis de datos, se importaron trazas de reacción al paquete de software Graphpad Prism y se restó la

contribución de hidrólisis de fondo de la curva por extrapolación de la tasa medida inicial de hidrólisis de MUGB 35 espontánea, que era típicamente menor de 5 % del estallido de fluorescencia total. La curva corregida se ajustó a

una única ecuación exponencial con un componente lineal (para explicar la lenta velocidad de desacilación) de la

forma fluorescencia = Amp(1-e-kt)+Bt, donde Amp = la amplitud de la fase de estallido en las condiciones de ensayo

de saturación representadas anteriormente, k es la constante de velocidad de primer orden observada para

formación de acil-enzima y B es una constante de velocidad aparente asociada con la renovación completa de

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Claims

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