BRPI0922773B1 - célula microbiana hospedeira transgênica, métodos para produzir um polipeptídeo tendo atividade de intensificação celulolítica e para degradar ou converter um material celulósico, construção de ácido nucleico, vetor de expressão, e, composição detergente. - Google Patents

célula microbiana hospedeira transgênica, métodos para produzir um polipeptídeo tendo atividade de intensificação celulolítica e para degradar ou converter um material celulósico, construção de ácido nucleico, vetor de expressão, e, composição detergente. Download PDF

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BRPI0922773B1
BRPI0922773B1 BRPI0922773A BRPI0922773A BRPI0922773B1 BR PI0922773 B1 BRPI0922773 B1 BR PI0922773B1 BR PI0922773 A BRPI0922773 A BR PI0922773A BR PI0922773 A BRPI0922773 A BR PI0922773A BR PI0922773 B1 BRPI0922773 B1 BR PI0922773B1
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polypeptide
seq
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cellulolytic
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BRPI0922773A
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Spodsberg Nikolaj
Harris Paul
Kramer Randall
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Novozymes As
Novozymes Inc
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
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    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
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Description

(54) Título: CÉLULA MICROBIANA HOSPEDEIRA TRANSGÊNICA, MÉTODOS PARA PRODUZIR UM POLIPEPTÍDEO TENDO ATIVIDADE DE INTENSIFICAÇÃO CELULOLÍTICA E PARA DEGRADAR OU CONVERTER UM MATERIAL CELULÓSICO, CONSTRUÇÃO DE ÁCIDO NUCLEICO, VETOR DE EXPRESSÃO, E, COMPOSIÇÃO DETERGENTE.
(51) lnt.CI.: C12N 9/42; C12N 15/56; C12N 15/82; A01H 5/00; C11D 3/386 (30) Prioridade Unionista: 04/12/2008 US 61/120005,11/12/2008 US 61/121805 (73) Titular(es): NOVOZYMES, INC.. NOVOZYMES A/S (72) Inventor(es): NIKOLAJ SPODSBERG; PAUL HARRIS; RANDALL KRAMER (85) Data do Início da Fase Nacional: 03/06/2011 “CÉLULA MICROBIANA HOSPEDEIRA TRANSGÊNICA, MÉTODOS
PARA PRODUZIR UM POLIPEPTÍDEO TENDO ATIVIDADE DE
INTENSIFICAÇÃO CELULOLÍTICA E PARA DEGRADAR OU
CONVERTER UM MATERIAL CELULÓSICO, CONSTRUÇÃO DE
ÁCIDO NUCLÉICO, VETOR DE EXPRESSÃO, E, COMPOSIÇÃO DETERGENTE”
Referência para uma Listagem de Sequências
Este pedido contém uma Listagem de Sequências depositada eletronicamente por EFS, que é incorporada aqui por referência.
Referência a um Depósito de Material Biológico
Este pedido contém uma referência a um depósito de material biológico, cujo depósito é incorporado aqui por referência.
Fundamentos da Invenção
Campo da Invenção
A presente invenção refere-se a polipeptídeos isolados tendo atividade de intensificação celulolítica e polinucleotídeos isolados codificando os polipeptídeos. A invenção também se refere a construções de ácido nucléico, vetores, e células hospedeiras compreendendo os polinucleotídeos assim como métodos de produzir e usar os polipeptídeos.
Descrição da Técnica Relacionada
Celulose é um polímero da glicose de açúcar simples ligada por ligações beta-1,4. Muitos microorganismos produzem enzimas que hidrolisam glucanos beta ligados. Estas enzimas incluem endoglucanases, celobiohidrolases, e beta-glucosidases. Endoglucanases digerem o polímero de celulose em locais aleatórios, abrindo o mesmo para ataque pelas celobiohidrolases. Celobiohidrolases sequencialmente liberam moléculas de
Petição 870180068785, de 08/08/2018, pág. 9/15 celobiose a partir das extremidades do polímero de celulose. Celobiose é um dímero beta-l,4-ligado solúvel em água de glicose. Beta-glucosidases hidrolisam celobiose em glicose.
A conversão de cargas de alimentação lignocelulósicas em etanol tem as vantagens de uma pronta disponibilidade de grandes quantidades de carga de alimentação, o desejo de evitar a queima ou o descarte em aterros dos materiais, e a limpeza do combustível etanol. Madeira, resíduos agrícolas, culturas herbáceas, e lixo sólido municipal tem sido considerados como cargas de alimentação para a produção de etanol. Estes materiais primariamente consiste em celulose, hemicelulose, e lignina. Uma vez a celulose é convertida em glicose, a glicose é facilmente fermentada por levedura em etanol.
Seria vantajoso na arte melhorar a capacidade de degradar enzimaticamente as cargas de alimentação lignocelulósicas.
WO 2005/074647 descreve polipeptídeos isolados tendo atividade de intensificação celulolítica e polinucleotídeos dos mesmos a partir de Thielavia terrestris. WO 2005/074656 descreve um polipeptídeo isolado tendo atividade de intensificação celulolítica e os polinucleotídeos dos mesmos a partir de Thermoascus aurantiacus. WO 2007/089290 descreve um polipeptídeo isolado tendo atividade de intensificação celulolítica e os polinucleotídeos dos mesmos a partir de Trichoderma reesei.
A presente invenção provê polipeptídeos tendo atividade de intensificação celulolítica e polinucleotídeos codificando os polipeptídeos. Sumário da invenção
A presente invenção refere-se a polipeptídeos isolados tendo atividade de intensificação celulolítica selecionados dentre o grupo consistindo de:
(a) um polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 80% de identidade de sequência para o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2;
(b) um polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo que hibridiza sob pelo menos condições de alta estringência com (i) uma sequência de codificação de polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 1, (ii) uma sequência de cDNA contida em uma sequência de codificação de polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 1, ou (iii) um filamento complementar de comprimento completo de (i) ou (ii);
(c) um polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo compreendendo uma sequência de nucleotídeos tendo pelo menos 80% identidade de sequência para uma sequência de codificação de polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 1; e (d) uma variante compreendendo uma substituição, deleção, e/ou inserção de um ou mais (vários) aminoácidos do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2.
A presente invenção também se refere a polinucleotídeos isolados codificando polipeptídeos tendo atividade de intensificação celulolítica, selecionados dentre o grupo consistindo de:
(a) um polinucleotídeo codificando um polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 80% de identidade de sequência para o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2;
(b) um polinucleotídeo que hibridiza sob pelo menos condições de alta estringência com (i) uma sequência de codificação de polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 1, (ii) uma sequência de cDNA contida em uma sequência de codificação de polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 1, ou (iii) um filamento complementar de comprimento completo de (i) ou (ii);
(c) um polinucleotídeo compreendendo uma sequência de nucleotídeos tendo pelo menos 80% identidade de sequência para uma sequência de codificação de polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 1; e (d) um polinucleotídeo codificando uma variante compreendendo uma substituição, deleção, e/ou inserção de um ou mais (vários) aminoácidos do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2.
A presente invenção também se refere a construções de ácido nucléico, vetores de expressão recombinantes, células hospedeiras recombinantes compreendendo os polinucleotídeos, e métodos de produzir os polipeptídeos tendo atividade de intensificação celulolítica.
A presente invenção também se refere a métodos de inibir a expressão de um polipeptídeo tendo atividade de intensificação celulolítica em uma célula, compreendendo administrar à célula ou expressar na célula uma molécula de RNA de filamento duplo (dsRNA), em que o dsRNA compreende uma sub-sequência de um polinucleotídeo da presente invenção. A presente também se refere a tal molécula de RNA inibitório de filamento duplo (dsRNA), em que opcionalmente o dsRNA é uma molécula de siRNA ou miRNA.
A presente invenção também se refere a métodos para degradar ou converter um material celulósico, compreendendo: tratar o material celulósico com uma composição de enzima na presença de um polipeptídeo tendo atividade de intensificação celulolítica da presente invenção. Em um aspecto preferido, o método ainda compreende recuperar o material celulósico degradado ou convertido.
A presente invenção também se refere a métodos de produzir um produto de fermentação, compreendendo: (a) sacarificar um material celulósico com uma composição de enzima na presença de um polipeptídeo tendo atividade de intensificação celulolítica da presente invenção; (b) fermentar o material celulósico sacarificado com um ou mais microorganismos de fermentação para produzir o produto de fermentação; e (c) recuperar o produto de fennentação da fermentação.
A presente invenção também se refere a métodos de fermentar um material celulósico, compreendendo: fermentar o material celulósico com um ou mais microorganismos de fermentação, em que o material celulósico é sacarificado com uma composição de enzima na presença de um polipeptídeo tendo atividade de intensificação celulolítica da presente invenção. Em um aspecto preferido, a fermentação do material celulósico produz um produto de fermentação. Em um aspecto, o método ainda compreende recuperar o produto de fermentação da fermentação.
A presente invenção também se refere a plantas compreendendo um polinucleotídeo isolado codificando um polipeptídeo tendo atividade de intensificação celulolítica.
A presente invenção também se refere a métodos de produzir um polipeptídeo tendo atividade de intensificação celulolítica, compreendendo: (a) cultivar uma planta transgênica ou uma célula de planta compreendendo um polinucleotídeo codificando o polipeptídeo tendo atividade de intensificação celulolítica sob condições conduzindo à produção do polipeptídeo; e (b) recuperar o polipeptídeo.
A presente invenção ainda se refere a um polinucleotídeo isolado codificando um peptídeo de sinal compreendendo ou consistindo de aminoácidos 1 a 21 de SEQ ID NO: 2; a construções de ácido nucleico, vetores de expressão, e células hospedeiras recombinantes compreendendo os polinucleotídeos; e a métodos de produzir uma proteína.
Breve Descrição das Figuras
Figura 1 mostra a sequência de DNA genômico e a sequência deduzida de aminoácidos de um polipeptídeo GH61B de Thermoascus aurantiacus CGMCC 0670 tendo um gene de atividade de intensificação celulolítica (SEQ ID NOs: 1 e 2, respectivamente).
Figura 2 mostra um mapa de restrição de pXYG1051ND001860 de comprimento.
Figura 3 mostra um mapa de restrição de pXYZ1473.
Figura 4 mostra o efeito de polipeptídeo de Thermoascus aurantiacus GH61B tendo atividade de intensificação celulolítica sobre a hidrólise de PCS por uma mistura de celulase de base. O desempenho da mistura de celulase de base é mostrado pela linha cheia. O efeito de adição de quantidades crescentes do polipeptídeo GH61B de aproximadamente 25 kDa para a menor concentração da mistura de celulase de base (carga relativa de proteína de 1,0) é mostrado pela linha com círculos enquanto a adição de polipeptídeo GH61B de aproximadamente 50 kDa é representada pela linha com quadrados.
Definições
Atividade de intensificação celulolítica: O termo “atividade de intensificação celulolítica” é definido aqui como uma atividade biológica que melhora a hidrólise de um material celulósico por polipeptídeos tendo atividade celulolítica. Para fins da presente invenção, atividade de intensificação celulolítica é determinada por medida do aumento na redução dos açúcares ou o aumento do total de celobiose e glicose a partir da hidrólise de um material celulósico por proteína celulolítica sob as seguintes condições: 1-50 mg de proteína total/g de celulose em PCS, em que proteína total é composta de 50-99,5% peso/pesa proteína celulolítica e 0,5-50% peso/pesa proteína de atividade de intensificação celulolítica durante 1-7 dias a 50-65°C comparada a uma hidrólise de controle com carga de proteína total igual sem atividade de intensificação celulolítica (1-50 mg de proteína celulolítica/g de celulose em PCS). Em um aspecto preferido, uma mistura de CELUCLAST® 1,5L (Novozymes A/S, Bagsvasrd, Dinamarca) na presença de 3% peso de proteína total de beta-glucosidase de Aspergillus oryzae (recombinantemente produzida em Aspergillus oryzae de acordo com WO 02/095014) ou 3% peso de proteína total de beta-glucosidase de Aspergillus fumigatus (recombinantemente produzida em Aspergillus oryzae como descrito em WO 2002/095014) de carga de proteína de celulase é usada como a fonte da atividade celulolítica.
Os polipeptídeos tendo atividade de intensificação celulolítica tem pelo menos 20%, preferivelmente pelo menos 40%, mais preferivelmente pelo menos 50%, mais preferivelmente pelo menos 60%, mais preferivelmente pelo menos 70%, mais preferivelmente pelo menos 80%, ainda mais preferivelmente pelo menos 90%, o mais preferivelmente pelo menos 95%, e ainda o mais preferivelmente pelo menos 100% da atividade de intensificação celulolítica do polipeptídeo maduro de um polipeptídeo GH61.
Os polipeptídeos tendo atividade de intensificação celulolítica melhoram a hidrólise de um material celulósico catalisado por proteínas tendo atividade celulolítica por redução da quantidade de enzima celulolítica requerida para alcançar o mesmo grau de hidrólise preferivelmente pelo menos 1,01 vezes, mais preferivelmente pelo menos 1,05 vezes, mais preferivelmente pelo menos 1,10 vezes, mais preferivelmente pelo menos 1,25 vezes, mais preferivelmente pelo menos 1,5 vezes, mais preferivelmente pelo menos 2 vezes, mais preferivelmente pelo menos 3 vezes, mais preferivelmente pelo menos 4 vezes, mais preferivelmente pelo menos 5 vezes, ainda mais preferivelmente pelo menos 10 vezes, e o mais preferivelmente pelo menos 20 vezes.
Família 61 de glicosídeo hidrolase: O termo “Família 61 de glicosídeo hidrolase” ou “Família GH61” é definido aqui, como um polipeptídeo estando na Família 61 de glicosídeo hidrolase de acordo com Henrissat B., 1991, The classification of glycosyl hidrolases based on aminoacid sequence similarities, Biochem. J. 280: 309-316, e Henrissat B., e Bairoch A., 1996, Updating a sequence-based classification of glycosyl hidrolases, Biochem. J 316: 695-696.
Atividade celulolítica: O termo “atividade celulolítica” é definido aqui como uma atividade biológica que hidrolisa um material celulósico. As duas abordagens básicas para medir a atividade celulolítica incluem: (1) medir a atividade celulolítica total, e (2) medir as atividades celulolíticas individuais (endoglucanases, celobiohidrolases, e betaglucosidases) como estudado por Zhang et al., Outlook for celulase improvement: Screening and selection strategies, 2006, Biotechnology Advances 24: 452-481. A atividade celulolítica total é geralmente medida usando substratos insolúveis, incluindo papel de filtro Whatman N°l, celulose microcristalina, celulose bacteriana, celulose de algas, algodão, lignocelulose pré-tratada, etc. O teste de atividade celulolítica total mais comum é o teste com papel de filtro usando papel de filtro Whatman N° 1 como o substrato. O teste foi estabelecido pelo International Union of Pure and Applied Chemistry (IUPAC) (Ghose, 1987, Measurement of cellulose activities, Pure Appl. Chem. 59: 257-68).
Para fins da presente invenção, atividade celulolítica é determinada por medida do aumento em hidrólise de um material celulósico por enzima(s) celulolítica(s) sob as seguintes condições: 1-20 mg de proteína celulolítica/g de celulose em PCS durante 3-7 dias a 50-65°C comparado a uma hidrólise de controle sem adição de proteína celulolítica. As condições típicas são reações de 1 ml de sólidos insolúveis, lavados ou não lavados PCS, 5% sólidos insolúveis, 50 mM acetato de sódio pH 5, 1 mM MnSO4, 50-65°C, 72 horas, análise de açúcar por coluna HPX-87H AMINEX® (Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA).
Endoglucanase: O termo “endoglucanase” é definido aqui como uma endo-1,4-(1,3 ;l,4)-beta-D-glucano 4-glucanohidrolase (E.C. 3.2.1.4), que catalisa endohidrólise de ligações 1,4-beta-D-glicosídicas em celulose, derivados de celulose (como carboximetil celulose e hidroxietil celulose), licenina, ligações beta-1,4 em beta-1,3 glucanos mistos como de beta-D-glucanos ou xiloglucanos de cereais, e outro material de planta contendo componentes celulósicos. A atividade de endoglucanase pode ser determinada com base em uma redução em viscosidade do substrato ou aumento nas extremidade de redução determinada por teste de açúcar redutor (Zhang et al., 2006, Biotechnology Advances 24: 452-481). Para fins da presente invenção, atividade de endoglucanase é determinada usando hidrólise de carboximetil celulose (CMC) de acordo com o procedimento de
Ghose, 1987, Pure and Appl. Chem. 59:257-268.
Celobiohidrolase: O termo “celobiohidrolase” é definido aqui como uma 1,4-beta-D-glucano celobiohidrolase (E.C. 3.2.1.91), que catalisa a hidrólise de ligações 1,4-beta-D-glucosídicas em celulose, celooligossacarídeos, ou qualquer glicose beta-l,4-ligada contendo polímero, liberando celobiose a partir das extremidades redutoras ou não redutoras da cadeia (Teeri, 1997, Crystalline cellulose degradation: New insight into the function of cellobiohidrolases, Trends in Biotechnology 15: 160-167; Teeri et al., 1998, Trichoderma reesei cellobiohidrolases: why so efficient on crystaline cellulose?, Biochem. Soc. Trans. 26: 173-178). Para fins da presente invenção, a atividade de celobiohidrolase é determinada usando um 4-metilumbellferil-P-D-lactosídeo derivado de dissacarídeo fluorescente de acordo com os procedimentos descritos por van Tilbeurgh et al., 1982, FEBS Letters 149: 152-156 e van Tilbeurgh e Claeyssens, 1985, FEBS Letters 187: 283-288.
Beta-glucosidase: O termo “beta-glucosidase” é definido aqui como uma beta-D-glucosídeo glucohidrolase (E.C. 3.2.1,21), que catalisa a hidrólise de resíduos de beta-D-glicose não redutores terminais com a liberação de beta-D-glicose. Para fins da presente invenção, atividade de betaglucosidase é determinada de acordo com o procedimento básico descrito por Venturi et al., 2002, Extracellular beta-D-glucosidase from Chaetomium thermophilum var. coprophílum: production, purification and some biochemical properties, J. Basic Microbiol. 42: 55-66. Uma unidade de atividade de beta-glucosidase é definida como 1,0 pmole de p-nitrofenol produzido por minuto a 40°C, pH 5 de 1 mM p-nitrofenil-beta-Dglucopiranosídeo como substrato em 100 mM citrato de sódio contendo
0,01% TWEEN® 20.
Atividade de degradação de xilano: os termos “atividade de degradação de xilano” ou “atividade xilanolítica” são definidos aqui como uma atividade biológica que hidrolisa material contendo xilano. As duas abordagens básicas para medir atividade xilanolítica incluem: (1) medir a atividade total xilanolítica, e (2) medir as atividades xilanolíticas individuais (endoxilanases, beta-xilosidases, arabinofuranosidases, alfa-glucuronidases, acetilxilano esterases, feruloil esterases, e alfa-glucuronil esterases). O progresso recente em testes de enzimas xilanolíticas foi resumido em várias publicações incluindo Biely e Puchard, Recent progress in the assays of xylanolitical enzymes, 2006, Journal of the Science of Food and Agriculture 86(11): 1636-1647; Spanikova e Biely, 2006, Glucuronoyl esterase - Novel carbohydrate esterase produced by Schizophyllum commune, FEBS Letters 580(19): 4597-4601; Herrmann, Vrsanska, Jurickova, Hirsch, Biely, e Kubicek, 1997, The beta-D-xillosidase of Trichoderma reesei is a multifunctional beta-Dxilan xylohidrolase, Biochemical Journal 321: 375-381.
A atividade total de degradação de xilano pode ser medida por determinação dos açúcares redutores formados a partir de vários tipos de xilano, incluindo xilanos de espelta de aveia, madeira de faixa, e madeira de lariço, ou por determinação fotométrica de fragmentos de xilano tingidos liberados de vários xilanos covalentemente coloridos. O teste de atividade xilanolítica total mais comum é baseado em produção de açúcares redutores a partir de 4-O-metil glucuronoxilano polimérico como descrito em Bailey, Biely, Poutanen, 1992, Interlaboratory testing of methods for assay of xilanase activity, Journal of Biotechnology 23(3): 257-270.
Para fins da presente invenção, atividade de degradação de xilano é determinada por medida do aumento em hidrólise de xilano de madeira de bétula (Sigma Chemical Co., Inc., St. Louis, MO, USA) por enzima(s) degradando xilano sob as seguintes condições típicas: reações de substrato de lml, 5 mg/ml (sólidos totais), 5 mg de proteína xilanolítica /g de substrato, 50 mM acetato de sódio pH 5, 50°C, 24 horas, análise de açúcar usando teste de hidrazida de ácido p-hidroxibenzóico (PHBAH) como descrito por Lever, 1972, A new reaction for colorimetric determination of carbohydrates, Anal. Biochem 4Ί: 273-279.
Atividade de xilanase: O termo “atividade de xilanase” é definido aqui como uma atividade de 1,4-beta-D-xilan-xilohidrolase (E.C. 3.2.1.8) que catalisa a endo-hidrólise de ligações 1,4-beta-D-xilosídicas em xilanos. Para fins da presente invenção, a atividade de xilanase é determinada usando xilano de madeira de bétula como o substrato. Uma unidade de atividade de xilanase é definida como 1,0 pmole de açúcar redutor (medido em equivalentes de glicose como descrito por Lever, 1972, A new reaction for colorimetric determination of carbohydrates, Anal. Biochem 47: 273-279) produzido por minuto durante o período inicial de hidrólise a 50°C, pH 5 de 2 g de xilano de madeira de bétula por litro como substrato em 50 mM acetato de sódio contendo 0,01% TWEEN® 20.
Atividade de beta-xilosidase: O termo “atividade de betaxilosidase” é definido aqui como uma beta-D-xilosídeo xilohidrolase (E.C. 3.2.1.37) que catalisa a exo-hidrólise de beta (1—>4)-xilooligossacarídeos curtos, para remover sucessivos resíduos de D-xilose dos términos não redutores. Para fins da presente invenção, uma unidade de atividade de axilosidase é definida como 1,0 pmole de p-nitrophenol produzido por minuto a 40°C, pH 5 de 1 mM p-nitrofenil-beta-D-xilosídeo como substrato em 100 mM citrato de sódio contendo 0,01% TWEEN® 20.
Atividade de acetilxilano esterase: O termo “atividade de acetilxilano esterase” é definido aqui como uma atividade de carboxilesterase (EC 3.1.1.72) que catalisa a hidrólise de grupos acetila a partir de xilano polimérico, xilose acetilada, glicose acetilada, acetato de alfa-naftila, e acetato de /7-nitrofenila. Para fins da presente invenção, atividade de acetilxilano esterase é determinada usando 0,5 mM 77-nitrofenilacetato como substrato em mM acetato de sódio pH 5.0 contendo 0,01% TWEEN™ 20. Uma unidade de atividade de acetilxilano esterase é definida como a quantidade de enzima capaz de liberar 1 pmole de ânion/?-nitrofenolato por minuto a pH 5, 25°C.
Atividade de feruloil esterase: O termo “atividade de feruloil esterase” é definido aqui como uma atividade de 4-hidroxi-3metoxicinnamoil-açúcar hidrolase (EC 3.1.1.73) que catalisa a hidrólise de grupo 4-hidroxi-3-metoxicinamoil (feruloil) a partir de um açúcar esterificado, que é geralmente arabinose em substratos naturais, para produzir ferulato (4-hidroxi-3-metoxicinamato). Feruloil esterase é também conhecida como ácido ferúlico esterase, hidroxicinamoil esterase, FAE-III, cinamoil éster hidrolase, FAEA, cinnAE, FAE-I, ou FAE-II. Para fins da presente invenção, atividade de feruloil esterase é determinada usando 0,5 mM pnitrofenilferulato como substrato em 50 mM acetato de sódio pH 5,0. Uma unidade de atividade de feruloil esterase é igual à quantidade de enzima capaz de liberar 1 pmole de ânion de79-nitrofenolato por minuto a pH 5, 25°C.
Atividade de alfa-glucuronidase: O termo “atividade de alfaglucuronidase” é definido aqui como uma atividade de D-glucosiduronato glucuronohidrolase (EC 3.2.1.139) que catalisa a hidrólise de um alfa-Dglucuronosídeo em D-glucuronato e um álcool. Para fins da presente invenção, atividade de alfa-glucuronidase é determinada de acordo com de Vries, 1998, J. Bacteriol. 180: 243-249. Uma unidade de atividade de alfaglucuronidase é igual à quantidade de enzima capaz de liberar 1 pmole de ácido glucurônico ou 4-O-metilglucurônico por minuto a pH 5, 40°C.
Atividade de alfa-L-arabinofuranosidase: O termo “atividade de alfa-L-arabinofuranosidase” é definido aqui como uma atividade de alfa-Larabinofuranosídeo arabinofuranohidrolase (EC 3.2.1.55) que catalisa a hidrólise de resíduos alfa-L-arabinofuranosídeo não redutores terminais em alfa-L-arabinosídeos. A atividade de enzima atua sobre alfa-L13 arabinoíuranosídeos, alfa-L-arabinanos contendo (1,3)- e/ou (l,5)-ligações, arabinoxilanos, e arabinogalactanos. Alfa-L-arabinofuranosidase é também conhecida como arabinosidase, alfa-arabinosidase, alfa-L-arabinosidase, alfaarabinofuranosidase, polissacarídeo alfa-L-arabinofuranosidase, alfa-Larabinofuranosídeo hidrolase, L-arabinosidase, ou alfa-L-arabinanase. Para fins da presente invenção, atividade de alfa-L-arabinofuranosidase é determinada usando 5 mg de arabinoxilano de trigo de viscosidade média (Megazyme International Ireland, Ltd., Bray, Co. Wicklow, Ireland) por ml de 100 mM acetato de sódio pH 5 em um volume total de 200 μΐ durante 30 minutos a 40°C seguido por análise arabinose por cromatografia de coluna AMINEX® HPX-87H (Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA).
Material celulósico: O material celulósico pode ser qualquer material contendo celulose. O polissacarídeo predominante na parede da célula primária de biomassa é celulose, o segundo mais abundante é hemicelulose, e o terceiro é pectina. A parede de célula secundária, produzida após a célula ter parado de crescer, também contém polissacarídeos e é reforçada por lignina polimérica covalentemente reticulada em hemicelulose. Celulose é um homopolímero de anhidrocelobiose e assim um beta-(l-4)-Dglucano linear, enquanto as hemiceluloses incluem uma variedade de compostos, como xilanos, xiloglucanos, arabinoxilanos, e mananos em estruturas ramificadas complexas com um espectro de substituintes. Apesar de geralmente polimorfa, a celulose é encontrada em tecido de plantas primariamente como uma matriz cristalina insolúvel de cadeias de glucano paralelas. Hemiceluloses geralmente ligam por hidrogênio a celulose, assim como as outras hemiceluloses, que ajudam a estabilizar a matriz da parede da célula.
Celulose é geralmente encontrada, por exemplo, nas hastes, folhas, cascas, conchas e espigas de plantas ou folhas, ramos e madeira de árvores. O material celulósico pode ser, mas não é limitada a, material herbáceo, resíduo agrícola, resíduo florestal, resíduo sólido de lixo municipal, papel usado, e resíduo de fábricas de pasta e papel, por exemplo, Wiselogel et al., 1995, in Handbook on Bioethanol (Charles E. Wyman, editor), pp.105118, Taylor & Francis, Washington D.C.; Wyman, 1994, Bioresource Technology 50: 3-16; Lynd, 1990, Applied Biochemistry and Biotechnology 24/25: 695-719; Mosier et al., 1999, Recent Progress in Bioconversion of Lignocellulosics, in Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology, T. Scheper, editor-chefe, Volume 65, pp.23-40, Springer-Verlag, Nova Iorque). E entendido aqui que a celulose pode estar na forma de lignocelulose, um material de parede de célula de planta contendo lignina, celulose, e hemicelulose em uma matriz mista. Em um aspecto preferido, o material celulósico é lignocelulose.
Em um aspecto, o material celulósico é material herbáceo. Em outro aspecto, o material celulósico é resíduo agrícola. Em outro aspecto, o material celulósico é resíduo florestal. Em outro aspecto, o material celulósico é lixo sólido municipal. Em outro aspecto, o material celulósico é papel usado. Em outro aspecto, o material celulósico é resíduo de fábrica de papel e pasta.
Em outro aspecto, o material celulósico é palha de milho. Em outro aspecto, o material celulósico é fibra de milho. Em outro aspecto, o material celulósico é espiga de milho. Em outro aspecto, o material celulósico é casca de laranja. Em outro aspecto, o material celulósico é palha de arroz. Em outro aspecto, o material celulósico é palha de trigo. Em outro aspecto, o material celulósico é grama de crescimento rápido. Em outro aspecto, o material celulósico é miscanto. Em outro aspecto, o material celulósico é bagaço.
Em outro aspecto, o material celulósico é celulose microcristalina. Em outro aspecto, o material celulósico é celulose bacteriana. Em outro aspecto, o material celulósico é celulose de algas. Em outro aspecto, o material celulósico é fiapo de algodão. Em outro aspecto, o material celulósico é celulose tratada com ácido fosfórico amorfo. Em outro aspecto, o material celulósico é papel de filtro.
O material celulósico pode ser usado como tal ou pode ser submetido a um pré-tratamento, usando métodos convencionais conhecidos na arte, como descrito aqui. Em um aspecto preferido, o material celulósico é pré-tratado.
Palha de milho pré-tratada: O termo “PCS” ou “palha de milho pré-tratada” é definido aqui como um material celulósico derivado de palha de milho por tratamento com calor e ácido sulfurico diluído.
Polipeptídeo isolado: O termo “polipeptídeo isolado” como usado aqui se refere a um polipeptídeo que é isolado de uma fonte. Em um aspecto preferido, o polipeptídeo é pelo menos 1% puro, preferivelmente pelo menos 5% puro, mais preferivelmente pelo menos 10% puro, mais preferivelmente pelo menos 20% puro, mais preferivelmente pelo menos 40% puro, mais preferivelmente pelo menos 60% puro, ainda mais preferivelmente pelo menos 80% puro, e o mais preferivelmente pelo menos 90% puro, como determinado por SDS-PAGE.
Polipeptídeo substancialmente puro: O termo “polipeptídeo substancialmente puro” denota aqui uma preparação de polipeptídeo que contém no máximo 10%, preferivelmente no máximo 8%, mais preferivelmente no máximo 6%, mais preferivelmente no máximo 5%, mais preferivelmente no máximo 4%, mais preferivelmente no máximo 3%, ainda mais preferivelmente no máximo 2%, o mais preferivelmente no máximo 1%, e ainda o mais preferivelmente no máximo 0,5% em peso de outro material de polipeptídeo com o qual ele é nativamente ou recombinantemente associado. Assim, é preferido que o polipeptídeo substancialmente puro é pelo menos 92% puro, preferivelmente pelo menos 94% puro, mais preferivelmente pelo menos 95% puro, mais preferivelmente pelo menos 96% puro, mais preferivelmente pelo menos 97% puro, mais preferivelmente pelo menos 98% puro, ainda mais preferivelmente pelo menos 99% puro, o mais preferivelmente pelo menos 99.5% puro, e ainda o mais preferivelmente 100% puro em peso do material de polipeptídeo total presente na preparação. Os polipeptídeos da presente invenção estão preferivelmente em uma forma substanciaimente pura, isto é, que a preparação de polipeptídeo é essencialmente livre de outro material de polipeptídeo com o qual está nativamente ou recombinantemente associado. Isto pode ser obtido, por exemplo, por preparação do polipeptídeo por métodos recombinantes bem conhecidos ou por métodos de purificação clássicos.
Polipeptídeo maduro: O termo “polinucleotídeo maduro” é definido aqui como um polipeptídeo em sua forma final após a tradução e quaisquer modificações pós-translacionais, como processamento N-terminal, truncagem C-terminal, glicosilação, fosforilação, etc. Em um aspecto, o polipeptídeo maduro é aminoácidos 22 a 354 de SEQ ID NO: 2 baseado no programa SignalP (Nielsen et al., 1997, Protein Engineering 10: 1-6) que prevê que os aminoácidos 1 a 21 de SEQ ID NO: 2 são um peptídeo de sinal.
Sequência madura de codificação do polipeptídeo: O tenno “sequência de codificação do polipeptídeo maduro” é definido aqui como uma sequência de nucleotídeos que codifica um polinucleotídeo maduro tendo atividade de intensificação celulolítica. Em um aspecto, a sequência de codificação do polipeptídeo maduro são nucleotídeos 64 a 1112 de SEQ ID NO: 1 baseado no programa SignalP (Nielsen et al., 1997, supra) que prevê nucleotídeos 1 a 63 de SEQ ID NO: 1 codificam um peptídeo de sinal.
Identidade: O parentesco entre duas sequências de aminoácidos ou entre duas sequências de nucleotídeos é descrito pelo parâmetro “identidade”.
Para fins da presente invenção, o grau de identidade de sequência entre duas sequências de aminoácidos é determinada usando o algoritmo de Needleman-Wunsch (Needleman e Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48: 443-453) como implementado no programa Needle do pacote EMBOSS (EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, Rice et al., 2000, Trends in Genetics 16: 276-277), preferivelmente versão 3.0,0 ou posterior. Os parâmetros opcionais usados são penalidade de abertura de lacuna de 10, penalidade de extensão de lacuna de 0,5, e matriz de substituição EBLOSUM62 ( versão EMBOSS de BLOSUM62). A saída de Needle rotulada “identidade mais longa” (obtida usando a noção -nobrief) é usada como a identidade percentual e é calculada como a seguir:
(Resíduos idênticos x 100)/(comprimento de alinhamento número total de lacunas em alinhamento)
Para fins da presente invenção, o grau de identidade de sequência entre duas sequências de deoxiribo nucleotídeos é determinada usando o algoritmo de Needleman-Wunsch (Needleman e Wunsch, 1970, supra) como implementado no programa Needle do pacote EMBOSS (EMBOSS: The European Molecular Biology Open Software Suite, arroz et al., 2000, supra), preferivelmente versão 3.0,0 ou posterior. Os parâmetros opcionais usados são penalidade de lacuna aberta de 10, penalidade de extensão de lacuna de 0,5, e a matriz de substituição EDNAFULL (versão EMBOSS de NCBI NUC4.4). A saída de Needle rotulada “identidade mais longa” (obtida usando a noção -nobrief) é usada como a identidade percentual e é calculada como a seguir:
(Deoxiribonucleotídeos idênticos x 100)/( comprimento de alinhamento - número total de lacunas em alinhamento)
Sequência homóloga: O termo “sequência homóloga ” é definido aqui como uma proteína prevista tendo um valor E (ou escore de expectativa) de menos do que 0,001 em uma busca tfasty (Pearson, W.R., 1999, in Bioinformatics Methods and Protocols, S. Misener e S. A. Krawetz, ed., pp. 185-219) com o polipeptídeo de Thermoascus aurantiacus tendo atividade de intensificação celulolítica de SEQ ID NO: 2 ou o polipeptídeo maduro dos mesmos.
Fragmento de polipeptídeo: O termo “fragmento de polipeptídeo” é definido aqui como um polipeptídeo tendo um ou mais (vários) aminoácidos deletados do término amino e/ou carboxila do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2; ou uma sequência homóloga dos mesmos; em que o fragmento tem atividade de intensificação celulolítica. Em um aspecto preferido, o fragmento contém pelo menos 285 resíduos de aminoácido, mais preferivelmente pelo menos 300 resíduos de aminoácido, e o mais preferivelmente pelo menos 315 resíduos de aminoácido do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2 ou uma sequência homóloga do mesmo. Em outro aspecto preferido, o fragmento é aproximadamente 25 kDa.
Subsequência: O termo “subsequência” é definido aqui como uma sequência de nucleotídeos tendo um ou mais (vários) nucleotídeos deletados da extremidade 5' e/ou 3' de uma sequência de codificação de polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 1; ou uma sequência homóloga dos mesmos; em que a subsequência codifica um fragmento de polipeptídeo tendo atividade de intensificação celulolítica. Em um aspecto preferido, a subsequência contém pelo menos 855 nucleotídeos, mais preferivelmente pelo menos 900 nucleotídeos, e o mais preferivelmente pelo menos 945 nucleotídeos de uma sequência de codificação de polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 1 ou um sequência homóloga dos mesmos.
Variante alélica: O termo “variante alélica” denota aqui qualquer uma de duas ou mais formas alternativas de um gene ocupando o mesmo lócus cromossômico. A variação alélica surge naturalmente através de mutação, e pode resultar em polimorfismo dentro das populações. As mutações de genes podem ser silentes (sem mudança do polipeptídeo codificado) ou podem codificar polipeptídeos tendo sequências de aminoácidos alteradas. Um variante alélico de um polipeptídeo é um polipeptídeo codificado por uma variante alélica de um gene.
Polinucleotídeo isolado: O termo “polinucleotídeo isolado ” como usado aqui se refere a um polinucleotídeo que é isolado de uma fonte. Em um aspecto preferido, os polinucleotídeos são pelo menos 1% puros, preferivelmente pelo menos 5% puros, mais preferivelmente pelo menos 10% puros, mais preferivelmente pelo menos 20% puros, mais preferivelmente pelo menos 40% puros, mais preferivelmente pelo menos 60% puros, ainda mais preferivelmente pelo menos 80% puros, e o mais preferivelmente pelo menos 90% puros, como determinado por eletroforese de agarose.
Polinucleotídeo substancialmente puro: O termo “polinucleotídeo substancialmente puro” como usado aqui se refere a uma preparação de polinucleotídeo isenta de outros nucleotídeos estranhos ou indesejados e em uma forma apropriada para uso dentro de sistemas de produção de proteína geneticamente engenheirada. Assim, um polinucleotídeo substancialmente puro contém no máximo 10%, preferivelmente no máximo 8%, mais preferivelmente no máximo 6%, mais preferivelmente no máximo 5%, mais preferivelmente no máximo 4%, mais preferivelmente no máximo 3%, ainda mais preferivelmente no máximo 2%, o mais preferivelmente no máximo 1%, e ainda o mais preferivelmente no máximo 0,5% em peso de outro material de polinucleotídeo com o qual ele é nativamente ou recombinantemente associado. Um polinucleotídeo substancialmente puro pode, no entanto, incluir regiões não traduzidas 5’ e 3’ de ocorrência natural, como promotores e terminadores. Prefere-se que o polinucleotídeo substancialmente puro seja pelo menos 90% puro, preferivelmente pelo menos 92% puro, mais preferivelmente pelo menos 94% puro, mais preferivelmente pelo menos 95% puro, mais preferivelmente pelo menos 96% puro, mais preferivelmente pelo menos 97% puro, ainda mais preferivelmente pelo menos 98% puro, o mais preferivelmente pelo menos 99% puro, e ainda o mais preferivelmente pelo menos 99,5% puro em peso. Os polinucleotídeos da presente invenção estão preferivelmente em uma forma substancialmente pura, isto é, que a preparação dos polinucleotídeos é essencialmente livre de outro material de polinucleotídeo com o qual ele é nativamente ou recombinantemente associado. Os polinucleotídeos podem ser de origem genômica, cDNA, RNA, semi-sintética, sintética, ou quaisquer combinações dos mesmos.
Sequência de codificação: Quando usado aqui o termo “sequência de codificação” significa uma sequência de nucleotídeos, que diretamente especifica uma sequência de aminoácidos deste produto de proteína. Os limites da sequência de codificação são geralmente determinados por um quadro de leitura aberta, que geralmente começa com o códon de partida ATG ou códons de partida alternativos como GTG e TTG e termina com um códon de parada como TAA, TAG, e TGA. A sequência de codificação pode ser uma sequência de DNA, cDNA, sintética, ou recombinante de nucleotídeos.
cDNA: O termo cDNA é definido aqui como um molécula de DNA que pode ser preparada por transição reversa a partir de uma molécula de mRNA maduro, emendado, obtida de uma célula eucariótica. O cDNA falta sequências de introns que podem estar presentes no DNA genômico correspondente. O transcrito de RNA primário, inicial, é um precursor para mRNA que é processado através de uma série de etapas antes de aparecer como um mRNA emendado maduro. Estas etapas incluem a remoção das sequências de introns por um processo chamado emenda. cDNA derivado de mRNA falta, assim, quaisquer sequências intrônicas.
Construção de ácido nucleico: O termo construção de ácido nucleico como usado aqui se refere a uma molécula de ácido nucleio, de filamento único ou duplo, que é isolada de um gene de ocorrência natural ou que é modificado para conter os segmentos de ácidos nucléicos em um modo que não iria de outra forma existir na natureza ou que é sintético. O termo construção de ácido nucléico é sinônimo com o termo “cassete de expressão” quando a construção de ácido nucléico contém sequências de controle requeridas para expressão de uma sequência de codificação da presente invenção.
Sequências de controle: O termo “sequências de controle” é definido aqui para incluir todos os componentes necessários para a expressão de um polinucleotídeo codificando um polipeptídeo da presente invenção. Cada sequência de controle pode ser nativa ou estranho para a sequência de nucleotídeos codificando o polipeptídeo ou nativa ou estranha para cada outra. Estas sequências de controle incluem mas não são limitadas a, uma sequência líder, de poliadenilação, uma sequência pro-peptídeo, promotor, sequência de peptídeo de sinal, e terminador de transcrição. Em um mínimo, as sequências de controle incluem um promotor, e sinais de parada transcripcional e de tradução. As sequências de controle podem ser providas com ligadores para o fim de introduzir sítios de restrição específicos facilitando a ligação das sequências de controle com a região de codificação de uma sequência de nucleotídeos codificando um polipeptídeo.
Ligados operavelmente: O termo “ligados operavelmente” denota aqui a configuração em que a sequência de controle é colocada em uma posição apropriada relativa à sequência de codificação de um polinucleotídeo sequência de moco que a sequência de controle dirige expressão da sequência de codificação de um polipeptídeo.
Expressão: O termo “expressão” inclui qualquer etapa envolvida em uma produção de um polipeptídeo incluindo, mas não limitado a, transcrição, modificação pos-transcripcional, tradução, modificação póstradução, e secreção.
Vetor de expressão: O termo “vetor de expressão” é definido aqui como uma molécula de DNA linear ou circular que compreende um polinucleotídeo codificando um polipeptídeo da presente invenção e é ligada operavelmente para adicionar nucleotídeos que fornecem sua expressão.
Célula hospedeira: O termo célula hospedeira, como usado aqui, inclui qualquer tipo de célula que é susceptível à transformação, transfecção, transdução e outros com uma construção de ácido nucleico ou vetor de expressão compreendendo um polinucleotídeo da presente invenção.
Modificação: O termo “modificação” significa aqui qualquer modificação química do polipeptídeo compreendendo ou consistindo do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2; ou uma sequência homóloga dos mesmos; assim como manipulação genética do DNA codificando este polipeptídeo. A modificação pode ser uma substituição, uma deleção e/ou uma inserção de um ou mais (vários) aminoácidos assim como substituições de uma ou mais (várias) cadeias laterais de aminoácido.
Variante artificial: Quando usado aqui, o termo “variante artificial” significa um polipeptídeo tendo atividade de intensificação celulolítica produzida por um organismo expressando uma sequência de polinucleotídeos modificada de uma sequência de codificação de polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 1; ou sequências homólogas às mesmas. A sequência de nucleotídeos modificada é obtida através de intervenção humana por modificação da sequência de polinucleotídeos descrita em SEQ ID NO: 1; ou uma sequência homóloga dos mesmos.
DESCRIÇÃO DETALHADA DA INVENÇÃO Polipeptídeos tendo atividade de intensificação celulolítica
Em um primeiro aspecto, a presente invenção refere-se a polipeptídeos isolados compreendendo sequências de aminoácidos tendo um grau de identidade de sequência para o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2 de preferivelmente pelo menos 80%, mais preferivelmente pelo menos 85%, ainda mais preferivelmente pelo menos 90%, o mais preferivelmente pelo menos 95%, e ainda o mais preferivelmente pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, ou pelo menos 99%, que têm atividade de intensificação celulolítica (aqui a seguir polipeptídeos homólogos). Em um aspecto preferido, os polipeptídeos homólogos compreendem sequência de aminoácidos que diferem por dez aminoácidos, preferivelmente por cinco aminoácidos, mais preferivelmente por quatro aminoácidos, ainda mais preferivelmente por três aminoácidos, o mais preferivelmente por dois aminoácidos, e ainda o mais preferivelmente por um aminoácido a partir do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2.
A polipeptídeo da presente invenção preferivelmente compreende uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 ou uma variante alélica dos mesmos; ou um fragmento do mesmo tendo atividade de intensificação celulolítica. Em um aspecto preferido, o polipeptídeo compreende a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2. Em outro aspecto preferido, o polipeptídeo compreende o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO:
2. Em outro aspecto preferido, o polipeptídeo compreende aminoácidos 22 a 354 de SEQ ID NO: 2, ou uma variante alélica dos mesmos; ou um fragmento do mesmo tendo atividade de intensificação celulolítica. Em outro aspecto preferido, o polipeptídeo compreende aminoácidos 22 a 354 de SEQ ID NO:
2. Em outro aspecto preferido, o polipeptídeo consiste de sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 ou uma variante alélica do mesmo; ou um fragmento do mesmo tendo atividade de intensificação celulolítica. Em outro aspecto preferido, o polipeptídeo consiste de sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2. Em outro aspecto preferido, o polipeptídeo consiste do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2. Em outro aspecto preferido, o polipeptídeo consiste de aminoácidos 22 a 354 de SEQ ID NO: 2 ou uma variante alélica dos mesmos; ou um fragmento do mesmo tendo atividade de intensificação celulolítica. Em outro aspecto preferido, o polipeptídeo consiste de aminoácidos 22 a 354 de SEQ ID NO: 2.
Em um segundo aspecto, a presente invenção refere-se a polipeptídeos isolados tendo atividade de intensificação celulolítica que são codificados por polinucleotídeos que hibridizam sob preferivelmente condições de estringência muito baixas, mais preferivelmente condições de estringência baixas, mais preferivelmente condições de estringência médias, mais preferivelmente condições de estringência médias altas, ainda mais preferivelmente condições de estringência altas, e o mais preferivelmente condições de estringência muito altas com (i) uma sequência de codificação de polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 1, (ii) uma sequência de cDNA contida em uma sequência de codificação de polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 1, ou (iii) um filamento complementar de comprimento completo de (i) ou (ii) (J. Sambrook, E.F. Fritsch, e T. Maniatis, 1989, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2d Ed., Cold Spring Harbor, Nova Iorque).
A sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 1; ou uma subseqüência dos mesmos; assim como a sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2; ou um fragmento dos mesmos; pode ser usado para projetar sondas de ácido nucleico para identificar e clonar DNA codificando polipeptídeos tendo atividade de intensificação celulolítica a partir de cepas de espécies ou gêneros diferentes de acordo com métodos bem conhecidos na arte. Em particular, estas sondas podem ser usadas por hibridização com o genômico ou cDNA de gênero ou espécie de interesse, seguindo procedimentos padrões de Southern blotting, a fim de identificar e isolar o correspondente gene aqui. Estas sondas podem ser consideravelmente mais curtas do que a sequência completa, mas devem ser pelo menos 14, preferivelmente pelo menos 25, mais preferivelmente pelo menos 35, e o mais preferivelmente pelo menos 70 nucleotídeos em comprimento. No entanto, prefere-se que a sonda de ácido nucleico tenha pelo menos 100 nucleotídeos em comprimento. Por exemplo, a sonda de ácido nucleico pode ter pelo menos 200 nucleotídeos, preferivelmente pelo menos 300 nucleotídeos, mais preferivelmente pelo menos 400 nucleotídeos, ou o mais preferivelmente pelo menos 500 nucleotídeos em comprimento. Ambas as sondas de DNA e RNA podem ser usadas. As sondas são tipicamente rotuladas para detecção do correspondente
3 35 gene (por exemplo, com Ρ, H, S, biotina, ou avidina). Estas sondas são englobadas pela presente invenção.
Uma biblioteca de DNA genômico ou cDNA preparada a partir destas outras cepas pode, assim, ser triada para DNA que hibridiza com as sondas descritas acima e codifica um polipeptídeo tendo atividade de intensificação celulolítica. DNA genômico ou outro a partir destas outras cepas pode ser separado por eletroforese de agarose ou gel poliacrilamida, ou outras técnicas de separação. DNA das bibliotecas ou o DNA separado pode ser transferido para e imobilizado em nitrocelulose ou outro apropriado material de veículo. A fim de identificar um clone ou DNA que é homólogo com SEQ ID NO: 1, ou uma subsequência do mesmo, o material de veículo é preferivelmente usado em um Southern blot.
Para fins da presente invenção, hibridização indica que a sequência de nucleotídeos hibridiza uma sonda de ácido nucleico rotulada correspondente para uma sequência de codificação de polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 1; a sequência de cDNA contida em uma sequência de codificação de polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 1; seu filamento complementar de comprimento completo; ou uma subsequência do mesmo; sob condições de estringência muito baixas a muito altas. Moléculas em que a sonda de ácido nucleico hibridiza sob estas condições podem ser detectadas usando, por exemplo, filme de raios-X.
Em um aspecto preferido, a sonda de ácido nucleico é uma sequência de codificação de polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 1. Em outro aspecto preferido, a sonda de ácido nucleico são nucleotídeos 64 a 1112 de SEQ ID NO: 1. Em outro aspecto preferido, a sonda de ácido nucleico é uma sequência de polinucleotídeos que codifica o polipeptídeo de SEQ ID NO: 2, ou uma subsequência do mesmo. Em outro aspecto preferido, a sonda de ácido nucleico é SEQ ID NO: 1. Em outro aspecto preferido, a sonda de ácido nucléico é a sequência de polinucleotídeos contida em plasmídeo pXYZ1473 que está contido em E. coli DSM 22075, em que a sequência de polinucleotídeos do mesmo codifica um polipeptídeo tendo atividade de intensificação celulolítica. Em outro aspecto preferido, a sonda de ácido nucléico é a região de codificação do polipeptídeo maduro contida em plasmídeo pXYZ1473 que está contido em E. coli DSM 22075.
Para sondas mais longas de pelo menos 100 nucleotídeos em comprimento, condições de estringência muito baixas a muito altas são definidas como pré-hibridização e hibridização a 42°C em 5X SSPE, 0,3% SDS, 200 pg/ml de DNA de esperma de salmão cisalhado e desnaturado, e ou 25% formamida para estringências muito baixas e baixas, 35% formamida estringências médias e médias-elevadas, ou 50% formamida para estringências altas e muito altas, seguindo procedimentos padrões de Southern blotting durante 12 a 24 horas de modo ótimo.
Para sondas longas de pelo menos 100 nucleotídeos em comprimento, o material de veículo é finalmente lavado três vezes a cada 15 minutos usando 2X SSC, 0,2% SDS preferivelmente a 45°C (estringência muito baixa), mais preferivelmente a 50°C (estringência baixa), mais preferivelmente a 55°C (estringência média), mais preferivelmente a 60°C (estringência média-alta), ainda mais preferivelmente a 65°C (estringência alta), e o mais preferivelmente a 70°C (estringência muito alta).
Para sondas curtas de cerca de 15 nucleotídeos a cerca de 70 nucleotídeos em comprimento, condições de estringência são definidas como pré-hibridização, hibridização, e lavagem após a hibridização a cerca de 5°C a cerca de 10°C abaixo do Tm calculado usando o cálculo de acordo com Bolton e McCarthy (1962, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 48:1390) em 0,9 M NaCI, 0,09 M Tris-HCl pH 7,6, 6 mM EDTA, 0,5% NP40, IX solução de Denhardt, 1 mM pirofosfato de sódio, 1 mM fosfato de sódio monobásico, 0,1 mM ATP, e 0,2 mg de RNA de levedura por ml
Tl seguindo procedimentos padrões Southern blotting de para 12 a 24 horas de modo ótimo.
Para sondas curtas de cerca de 15 nucleotídeos a cerca de 70 nucleotídeos em comprimento, o material de veículo é lavado uma vez em 6X SCC mais 0,1% SDS por 15 minutos e duas vezes cada por 15 minutos usando 6X SSC a 5°C a 10°C abaixo do Tm calculado.
Em um terceiro aspecto, a presente invenção refere-se a polipeptídeos isolados tendo atividade de intensificação celulolítica codificado por polinucleotídeos compreendendo ou consistindo de sequências de nucleotídeos que têm um grau de identidade de sequência para uma sequência de codificação de polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 1 de preferivelmente pelo menos 80%, mais preferivelmente pelo menos 85%, ainda mais preferivelmente pelo menos 90%, o mais preferivelmente pelo menos 95%, e ainda o mais preferivelmente pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, ou pelo menos 99%, que codificam um polipeptídeo tendo atividade de intensificação celulolítica. Ver seção de polinucleotídeos aqui.
Em um quarto aspecto, a presente invenção refere-se a variantes artificiais compreendendo uma substituição, deleção, e/ou inserção de um ou mais (ou vários) aminoácidos do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2, ou uma sequência homóloga dos mesmos. Preferivelmente, as mudanças de aminoácido são de uma natureza pequena, isto é substituições ou inserções conservativas de aminoácidos que não afetam de modo significante a duplicação e/ou atividade de uma proteína; deleções pequenas, tipicamente de um a cerca de 30 aminoácidos; extensões terminais amino- ou carboxila pequenas, como um resíduo metionina amino-terminal; um peptídeo ligado pequeno de até cerca de 20-25 resíduos; ou uma extensão pequena que facilita a purificação por mudança de carga líquida ou outra função, como um trato poli-histidina, um epítopo antigênico, ou um domínio de ligação.
Exemplos de substituições conservativas estão dentro do grupo de aminoácidos básicos (arginina, lisina e histidina), aminoácidos acídicos (ácido glutâmico e ácido aspártico), aminoácidos polares (glutamina e asparagina), aminoácidos hidrofóbicos (leucina, isoleucina e valina), aminoácidos aromáticos (fenilalanina, triptofano e tirosina), e aminoácidos pequenos (glicina, alanina serina, treonina e metionina). Substituições de aminoácidos que não alteram geralmente a atividade específica são conhecidas na arte e são descritas, por exemplo, por H. Neurath e R.L. Hill, 1979, In, The Proteins, Academic Press, Nova Iorque. As mudanças de ocorrência mais comuns são Ala/Ser, Val/Ile, Asp/Glu, Thr/Ser, Ala/Gly, Ala/Thr, Ser/Asn, Ala/Val, Ser/Gly, Tyr/Phe, Ala/Pro, Lys/Arg, Asp/Asn, Leu/Ile, Leu/Val, Ala/Glu, e Asp/Gly.
Além dos 20 aminoácidos padrões, aminoácidos não padrões (como 4-hidroxiprolina, 6-V-metil lisina, ácido 2-aminoisobutírico, isovalina, e alfa-metil serina) podem ser substituídos por resíduos de aminoácidos de um polipeptídeo de tipo selvagem. Um número limitado de aminoácidos não conservativos, aminoácidos que não são codificados pelo código genético e aminoácidos não naturais podem ser substituídos por resíduos de aminoácidos. “Aminoácidos não naturais” foram modificados após a síntese da proteína, e/ou tem uma estrutura química em suas cadeia(s) lateral(ais) diferente(s) da dos aminoácidos padrões. Aminoácidos não naturais podem ser quimicamente sintetizados, e preferivelmente, são comercialmente disponíveis, e incluem ácido pipecólico, ácido tiazolidina carboxílico, dehidroprolina, 3- e 4-metilprolina, e 3,3-dimetilprolina.
Altemativamente, as mudanças de aminoácido são de tal natureza que as propriedades físico-químicas dos polipeptídeos são alteradas, Por exemplo, mudanças de aminoácidos podem melhorar a estabilidade térmica do polipeptídeo, alterar a especificidade do substrato, mudar o pH ótimo, e semelhantes.
Os aminoácidos essenciais no polipeptídeo parental podem ser identificados de acordo com procedimentos conhecidos na arte, como mutagenese dirigida ao sítio ou mutagenese de varredura de alanina (Cunningham e Wells, 1989, Science 244: 1081-1085). Na última técnica, as mutações de alanina única são introduzidas em cada resíduo na molécula, e as moléculas mutantes resultantes são testadas para atividade biológica (isto é, atividade de intensificação celulolítica) para identificar resíduos de aminoácidos que são críticos para a atividade da molécula. Ver também, Hilton et al., 1996, J. Biol. Chem. 271: 4699-4708. O sítio ativo da enzima ou outra interação biológica também pode ser determinado por análise física de estrutura, como determinado por tais técnicas como ressonância magnética nuclear, cristalografia, difração de elétrons, ou rotulação por fotoafinidade, em conjunto com a mutação de aminoácidos de sítio de contato putativo. Ver, por exemplo, de Vos et al., 1992, Science 255: 306-312; Smith et al., 1992, J. Mol. Biol. 224: 899-904; Wlodaver et al., 1992, FEBS Lett. 309: 59-64. As identidades de aminoácidos essenciais também podem ser deduzidas da análise de identitidades com polipeptídeos que estão relacionados com um polipeptídeo de acordo com a invenção.
As substituições, deleções, e/ou inserções aminoácido únicas ou múltiplas podem ser feitas e testadas usando métodos conhecidos de mutagenese, recombinatção, e/ou embaralhamento, seguido por um procedimento de triagem relevante, como o descrito por Reidhaar-Olson e Sauer, 1988, Science 241: 53-57; Bowie e Sauer, 1989, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 86: 2152-2156; WO 95/17413; ou WO 95/22625. Outros métodos que podem ser usados incluem PCR error-prone, apresentação de fagos (por exemplo, Lowman et al., 1991, Biochem. 30: 10832-10837; Patente US 5.223.409; WO 92/06204), e mutagenese dirigida na região (Derbyshire et ai, 1986, Gene 46: 145; Ner et al., 1988, DNA Ί: 127).
Os métodos de mutagenese/embaralhamento podem ser combinados com produção elevada, métodos de triagem automatizada, para detectar a atividade de polipeptídeos mutagenizados, clonados, expressados por células hospedeiras (Ness et al., 1999, Nature Biotechnology 17: 893896). As moléculas de DNA mutagenizadas que codificam polipeptídeos ativos podem ser recuperadas das células hospedeiras e rapidamente sequenciadas usando métodos padrões na arte. Estes métodos permitem a rápida determinação da importância de resíduos de aminoácidos individuais em um polipeptídeo de interesse, e podem ser aplicados a polipeptídeos de estrutura desconhecida.
O número total de substituições, deleções e/ou inserções de aminoácidos do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2 é 10, preferivelmente 9, mais preferivelmente 8, mais preferivelmente 7, mais preferivelmente no máximo 6, mais preferivelmente 5, mais preferivelmente 4, ainda mais preferivelmente 3, o mais preferivelmente 2, e ainda o mais preferivelmente 1. Fontes de Polipeptídeos tendo atividade de intensificação celulolítica
Um polipeptídeo tendo atividade de intensificação celulolítica da presente invenção pode ser obtido a partir de microorganismos de qualquer gênero. Para fins da presente invenção, o termo “obtido a partir de” como usado aqui em conjunto com uma dada fonte deve significar que o polipeptídeo codificado por uma sequência de nucleotídeos é produzido pela fonte ou pela cepa em que a sequência de nucleotídeos a partir da fonte foi inserida. Em um aspecto preferido, o polipeptídeo obtido a partir de uma dada fonte é secretado extracelulannente.
Um polipeptídeo tendo atividade de intensificação celulolítica da presente invenção pode ser um polipeptídeo bacteriano. Por exemplo, o polipeptídeo pode ser um polipeptídeo bacteriano gram positivo como um polipeptídeo de Bacillus, Streptococcus, Streptomyces, Staphylococcus, Enterococcus, Lactobacillus, Lactococcus, Clostridium, Geobacillus, ou Oceanobacillus tendo atividade de intensificação celulolítica, ou um polipeptídeo Gram negativo bacteriano como um polipeptídeo de E. coli, Pseudomonas, Salmonella, Campylobacter, Helicobacter, Flavobacterium, Fusobacterium, Ilyobacter, Neisseria, ou Ureaplasmum tendo atividade de intensificação celulolítica.
Em um aspecto preferido, o polipeptídeo é um polipeptídeo de Bacillus alkalophilus, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus brevis, Bacillus circulans, Bacillus clausii, Bacillus coagulans, Bacillus firmus, Bacillus lautus, Bacillus lentus, Bacillus lichcniformis, Bacillus mcgaterium, Bacillus pumilus, Bacillus stearothermophilus, Bacillus subtilis, ou Bacillus thuringiensis tendo atividade de intensificação celulolítica.
Em outro aspecto preferido, o polipeptídeo é um polipeptídeo de Streptococcus equisimilis, Streptococcus pyogenes, Streptococcus uberis, ou Streptococcus equi subsp. Zooepidemicus tendo atividade de intensificação celulolítica.
Em outro aspecto preferido, o polipeptídeo é um polipeptídeo de Streptomyccs achromogenes, Strcptomyccs avermitilis, Streptomyces coelicolor, Streptomyccs griscus, ou Streptomyces lividans tendo atividade de intensificação celulolítica.
Um polipeptídeo tendo atividade de intensificação celulolítica da presente invenção também pode ser um polipeptídeo de fungo, e mais preferivelmente um polipeptídeo de levedura como um polipeptídeo de Candida, Kluyveromyces, Pichia, Saccharomyces, Schizosaccharomyces, ou Yarrowium tendo atividade de intensificação celulolítica; ou mais preferivelmente um polipeptídeo de fungo filamentoso como um polipeptídeo de Acrcmonium, Agaricus, Alternaria, Aspergillus, Aureobasidium, Botryospaeria, Ceriporiopsis, Chaetomidium, Chrysosporium, Claviceps, Cochliobolus, Coprinopsís, Coptotermes, Corynascus, Cryphonectria, Cryptococcus, Diplodía, Exidia, Filibasidium, Fusarium, Gíbberella, Holomastigotoídes, Humicola, Irpex, Lentinula, Leptospaeria, Magnaporthe,
Melanocarpus, Meripilus, Mucor, Myceliophthora, Neocallimastix, Neurospora, Paecilomyces, Penicillium, Phanerochaete, Piromyces, Poitrasía, Pseudoplectania, Pseudotrichonympha, Rhizomucor, Schizophyllum, Scytalidium, Talaromyces, Thermoascus, Thielavia, Tolypocladium, Trichoderma, Trichophaea, Verticillium, Volvariella, ou Xilarium tendo atividade de intensificação celulolítica.
Em um aspecto preferido, o polipeptídeo é um polipeptídeo de Saccharomyces carlsbergensis, Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces díastaticus, Saccharomyces douglasii, Saccharomyces kluyveri, Saccharomyces norbensis, ou Saccharomyces ovíformis tendo atividade de intensificação celulolítica.
Em outro aspecto preferido, o polipeptídeo é um polipeptídeo de Acremonium cellulolyticus, Aspcrgillus aculeatus, Aspergillus awamori, Aspergillus fumigatus, Aspergillus foetidus, Aspergillus japonicus, Aspergillus nídulans, Aspergillus nigcr, Aspergillus oryzae, Chrysosporium keratinophilum, Chrysosporium lucknowense, Chrysosporium tropicum, Chrysosporium merdarium, Chrysosporium inops, Chrysosporium pannicola, Chrysosporium queenslandicum, Chrysosporium zonatum, Fusarium bactridioides, Fusarium cerealis, Fusarium crookwellense, Fusarium culmorum, Fusarium graminearum, Fusarium graminum, Fusarium heterosporum, Fusarium negundi, Fusarium oxísporum, Fusarium reticulatum, Fusarium roseum, Fusarium sambucinum, Fusarium sarcochroum, Fusarium sporotrichioides, Fusarium sulphureum, Fusarium torulosum, Fusarium trichothecioides, Fusarium venenatum, Humícola grisea, Humícola insolens, Humicola lanuginosa, Irpex lacteus, Mucor miehei, Myceliophthora thermophila, Neurospora crassa, Penicillium funiculosum, Penicillium purpurogenum, Phanerochaete chrysosporium, Thielavia achromatíca, Thielavia albomyces, Thielavia albopilosa, Thielavia australeinsis, Thielavia fimeti, Thielavia microspora, Thielavia ovíspora,
Thielavia peruviana, Thielavia spededonium, Thielavia setosa, Thielavia subthermophila, Thielavia terrestris, Trichoderma harzianum, Trichoderma koningii, Trichoderma longibrachiatum, Trichoderma reesei, ou Trichoderma viride tendo atividade de intensificação celulolítica.
Em um aspecto mais preferido, o polipeptídeo é um polipeptídeo de Thermoascus aurantíacus tendo atividade de intensificação celulolítica. Em um aspecto o mais preferido, o polipeptídeo é um polipeptídeo de Thermoascus aurantíacus CGMCC 0670 tendo atividade de intensificação celulolítica, por exemplo, o polipeptídeo compreendendo o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2.
Será entendido que para as espécies acima mencionadas, a invenção engloba tanto os estados perfeitos como imperfeitos, e outros equivalentes taxonômicos, por exemplo, anamorfos, sem levar em conta o nome da espécie pelo qual eles são conhecidos. Os versados irão prontamente reconhecer a identidade dos equivalentes apropriados.
Cepas destas espécies são prontamente acessíveis para o público em várias coleções de cultura, como American Type Culture Collection (ATCC), Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSM), Centraalbureau Voor Schimmelcultures (CBS), e Agricultural Research Service Patent Culture Collection, Northern Regional Research Center (NRRL).
Ainda mais, estes polipeptídeos podem ser identificados e obtidos a partir de outras fontes, incluindo microorganismos isolados da natureza (por exemplo, solo, estrumes, água, etc.) usando as sondas acima mencionadas. As técnicas para isolar os microorganismos dos habitats naturais são bem conhecidas na arte. Os polinucleotídeos podem então ser obtidos por triagem similar de uma biblioteca de cDNA ou genômica a partir deste microorganismo. Uma vez um polinucleotídeo codificando um polipeptídeo detectado com a(s) sonda(s), os polinucleotídeos podem ser isolados ou clonados utilizando técnicas que são bem conhecidas para os versados (ver, por exemplo, Sambrook et al., 1989, supra).
Polipeptídeos da presente invenção também incluem polipeptídeos fusionados ou polipeptídeos de fusão cliváveis em que o outro polipeptídeo é fusionado no N-término ou C-término do polipeptídeo ou fragmento do mesmo. Um polipeptídeo fusionado é produzido por fusão de uma sequência de nucleotídeos (ou uma porção dos mesmos) codificando outro polipeptídeo em uma sequência de nucleotídeos (ou uma porção dos mesmos) da presente invenção. Técnicas para produzir polipeptídeos de fusão são conhecidas na arte, e incluem ligar as sequências de codificação codificando os polipeptídeos de modo que eles estão in frame e que expressão do polipeptídeo fusionado está sob controle do mesmo promotor(s) e terminador.
Um polipeptídeo de fusão pode ainda compreender um sítio de divagem. Quando da secreção da proteína de fusão, o sítio é clivado liberando o polipeptídeo tendo atividade de intensificação celulolítica a partir da proteína de fusão. Exemplos de sítios de divagem incluem mas não são limitados a, um sítio Kex2 que codifica o dipeptídeo Lys-Arg (Martin et al., 2003, J. Ind. Microbiol. Biotechnol. 3: 568-576; Svetina et al., 2000, J. Biotechnol. 76: 245-251; Rasmussen-Wilson et al., 1997, Appl. Environ. Microbiol. 63: 3488-3493; Ward et al., 1995, Biotechnology 13: 498-503; e Contreras et al., 1991, Biotechnology 9: 378-381), um sítio Ile-(Glu ou Asp)Gly-Arg, que é clivado por uma protease de Fator Xa após o resíduo arginina (Eaton et al., 1986, Biochem. 25: 505-512); um sítio Asp-Asp-Asp-Asp-Lys, que é clivado por uma enteroquinase após a lisina (Collins-Racie et al., 1995, Biotechnology 13: 982-987); um sítio His-Tyr-Glu ou His-Tyr-Asp, que é clivado por Genenase I (Carter et al., 1989, Proteins: Structure, Function, and Genetícs 6: 240-248); um sítio Leu-Val-Pro-Arg-Gly-Ser, que é clivado por trombina após o Arg (Stevens, 2003, Drug Díscovery World 4: 35-48); um sítio Glu-Asn-Leu-Tyr-Phe-Gln-Gly, que é clivado por TEV protease após o Gin (Stevens, 2003, supra); e um sítio Leu-Glu-Val-Leu-Phe-Gln-Gly-Pro, que é clivado por uma forma geneticamente engenheirada de uma protease de rhinovirus 3C humano após o Gin (Stevens, 2003, supra).
Polinucleotídeos
A presente invenção também se refere a polinucleotídeos isolados compreendendo ou consistindo de sequências de nucleotídeos que codificam polipeptídeos tendo atividade de intensificação celulolítica da presente invenção.
Em um aspecto preferido, a sequência de nucleotídeos compreende ou consiste de SEQ ID NO: 1. Em outro aspecto mais preferido, a sequência de nucleotídeos compreende ou consiste de sequência contida em plasmídeo pXYZ1473 que está contido em E. coli DSM 22075. Em outro aspecto preferido, a sequência de nucleotídeos compreende ou consiste de uma sequência de codificação de polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 1. Em outro aspecto preferido, a sequência de nucleotídeos compreende ou consiste de nucleotídeos 64 a 1112 de SEQ ID NO: 1. Em outro aspecto mais preferido, a sequência de nucleotídeos compreende ou consiste de sequência de codificação do polipeptídeo maduro contida em plasmídeo pXYZ1473 que está contido em E. coli DSM 22075. A presente invenção também engloba sequências de nucleotídeos que codificam polipeptídeos compreendendo ou consistindo de uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2 ou o polipeptídeo maduro dos mesmos, que diferem de SEQ ID NO: 1 ou a sequência de codificação do polipeptídeo maduro do mesmo devido à degenerescência do código genético. A presente invenção também se refere a subsequências de SEQ ID NO: 1 que codificam fragmentos de SEQ ID NO: 2 que têm atividade de intensificação celulolítica.
A presente invenção também se refere a polinucleotídeos mutantes compreendendo ou consistindo de pelo menos uma mutação em uma sequência de codificação de polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 1, em que a sequência de nucleotídeos mutantes codifica o polipeptídeo maduro de SEQ
ID NO: 2.
As técnicas usadas para isolar ou clonar um polinucleotídeo codificando um polipeptídeo são conhecidos na arte e incluem isolamento do DNA genômico, preparação a partir de cDNA, ou uma combinação das mesmas. A clonagem dos polinucleotídeos da presente invenção a partir deste DNA genômico pode ser efetuada, por exemplo, por uso de reação de cadeia polimerase bem conhecida (PCR) ou triagem de anticorpo de bibliotecas de expressão para detectar os fragmentos de DNA clonados com aspectos estruturais compartilhados. Ver, por exemplo, Innis et al., 1990, PCR: A Guide to Methods and Application, Academic Press, Nova Iorque. Outros procedimentos de amplificação de ácido nucleico como reação de cadeia ligase (LCR), transcrição ativada ligada (LAT) e amplificação baseada em sequência de nucleotídeos (NASBA) podem ser usados. Os polinucleotídeos podem ser clonados a partir de uma cepa de Thermoascus, ou outro ou relacionado organismo e assim, por exemplo, pode ser uma variante alélica ou de espécie da região de codificação do polipeptídeo de uma sequência de nucleotídeos.
A presente invenção também se refere a polinucleotídeos isolados compreendendo ou consistindo de sequências de nucleotídeos que têm um grau de identidade de sequência para uma sequência de codificação de polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 1 de preferivelmente pelo menos 80%, mais preferivelmente pelo menos 85%, ainda mais preferivelmente pelo menos 90%, o mais preferivelmente pelo menos 95%, e ainda o mais preferivelmente pelo menos 96%, pelo menos 97%, pelo menos 98%, ou pelo menos 99%, que codificam um polipeptídeo tendo atividade de intensificação celulolítica.
Modificação de uma sequência de nucleotídeos codificando um polipeptídeo da presente invenção pode ser necessária para a síntese de polipeptídeos substancialmente similares ao polipeptídeo. O termo “substancialmente similar” ao polipeptídeo refere-se a formas de ocorrência não naturalmente do polipeptídeo. Estes polipeptídeos podem diferir em algum modo engenheirado do polipeptídeo isolado a partir de sua fonte nativa, por exemplo, variantes artificiais que diferem em atividade específica, termoestabilidade, pH ótimo e semelhantes. A sequência variante pode ser construída com base em uma sequência de nucleotídeos apresentada como uma sequência de codificação de polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 1, por exemplo, uma subsequência do mesmo, e/ou por introdução de substituições de nucleotídeo que não dão lugar a outra sequência de aminoácidos do polipeptídeo codificado por uma sequência de nucleotídeos, mas que correspondem ao uso de códons do organismo hospedeiro destinado à produção da enzima, ou por introdução de substituições de nucleotídeos que podem dar lugar a uma sequência de aminoácidos diferente. Para uma descrição geral de substituição de nucleotídeos, ver, por exemplo, Ford et al., 1991, Protein Expression and Purification 2: 95-107.
Será evidente para os versados na arte que estas substituições podem ser feitas fora das regiões críticas para a função da molécula e ainda resultar em um polipeptídeo ativo. Os resíduos de aminoácidos essenciais para a atividade do polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo isolado da invenção, e assim preferivelmente não submetidos a substituição, podem ser identificados de acordo com procedimentos conhecidos na arte, como mutagenese dirigida ao sítio ou mutagenese de varredura de alanina (ver, por exemplo, Cunningham e Wells, 1989, supra). Na última técnicas, as mutações são introduzidas em cada resíduo positivamente carregado na molécula, e as moléculas mutantes resultantes são testadas para atividade de intensificação celulolítica para identificar resíduos de aminoácidos que são críticos para a atividade da molécula. Os sítios de interação substrato-enzima também podem ser determinados por análise da estrutura tri-dimensional como determinado por técnicas como análise de ressonância magnética nuclear, cristalografia ou rotulação por fotoafinidade (ver, por exemplo, de Vos et al., 1992, supra; Smith et al., 1992, supra; Wlodaver et al., 1992, supra).
A presente invenção também se refere a polinucleotideos isolados codificando polipeptídeos da presente invenção, que hibridizam sob condições de estringência muito baixas, preferivelmente condições de estringência baixas, mais preferivelmente condições de estringência médias, mais preferivelmente condições de estringência médias-altas, ainda mais preferivelmente condições de alta estringência, e o mais preferivelmente condições de estringência muito altas com (i) uma sequência de codificação de polipeptideo maduro de SEQ ID NO: 1, (ii) uma sequência de cDNA contida em uma sequência de codificação de polipeptideo maduro de SEQ ID NO: 1, ou (iii) um filamento complementar de comprimento completo de (i) ou (ii); ou variantes alélicas e subsequências das mesmas (Sambrook et al., 1989, supra), como definido aqui. Em um aspecto preferido, o filamento complementar é o filamento complementar de comprimento completo de uma sequência de codificação de polipeptideo maduro de SEQ ID NO: 1.
A presente invenção também se refere a polinucleotideos isolados obtidos por (a) hibridizar uma população de DNA sob condições de estringência muito baixas, baixas, médias, médias-elevadas, altas ou muito altas com (i) uma sequência de codificação de polipeptideo maduro de SEQ ID NO: 1, (ii) uma sequência de cDNA contida em uma sequência de codificação de polipeptideo maduro de SEQ ID NO: 1, ou (iii) um filamento complementar de comprimento completo de (i) ou (ii); e (b) isolar o polinucleotídeo hibridizando, que codifica um polipeptideo tendo atividade de intensificação celulolítica. Em um aspecto preferido, o filamento complementar é o filamento complementar de comprimento completo de uma sequência de codificação de polipeptideo maduro de SEQ ID NO: 1.
Construções de ácido nucleico
A presente invenção também se refere a construções de ácido nucleico compreendendo um polinucleotídeo isolado da presente invenção ligado operavelmente a uma ou mais (várias) sequências de controle que dirigem a expressão da sequência de codificação em uma célula hospedeira apropriada sob condições compatíveis com as sequências de controle.
Um polinucleotídeo isolado codificando um polipeptídeo da presente invenção pode ser manipulado em uma variedade de modos para prover a expressão do polipeptídeo. Manipulação da sequência dos polinucleotídeo antes de sua inserção no vetor pode ser desejável ou necessária dependendo do vetor de expressão. As técnicas para modificar as sequências de polinucleotídeos usando métodos de DNA recombinantes são bem conhecidas na arte.
A sequência de controle pode ser uma sequência de promotor apropriada, uma sequência de nucleotídeos que é reconhecida por uma célula hospedeira para expressão de um polinucleotídeo codificando um polipeptídeo da presente invenção. A sequência de promotor contém sequências de controle transcripcional que mediam a expressão do polipeptídeo. O promotor pode ser qualquer sequência de nucleotídeos que mostra atividade transcripcional na célula hospedeira de escolha incluindo promotores mutantes, truncados e híbridos, e pode ser obtido a partir de genes codificando polipeptídeos extracelulares ou intracelulares ou homólogos ou heterólogos para a célula hospedeira.
Exemplos de promotores apropriados para dirigir a transcrição das construções de ácido nucleico da presente invenção, especialmente em uma célula hospedeira bacteriana, são os promotores obtidos a partir de operon em E. coli lac, gene agarase em Streptomyces coelicolor (dagÁ), gene levansucrase em Bacillus subtilis (sacB), gene alfa-amilase em Bacillus licheniformis (amyL), gene amilase maltogênica em Bacillus stearothermophilus (amyM), gene alfa-amilase em Bacillus amyloliquefaciens (amyQ), gene penicilinase em Bacillus licheniformis (penP), genes xila e xylB em Bacillus subtilis, e gene beta-lactamase procariótico (Villa-Kamaroff et al., 1978, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 75: 37273731), assim como o promotor tac (DeBoer et al., 1983, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 80: 21-25). Ainda outros promotores são descritos em Useful proteins from recombinant bactéria in Scientific American, 1980, 242: 74-94; e em Sambrook et al., 1989, supra.
Exemplos de promotores apropriados para dirigir a transcrição das construções de ácido nucléico da presente invenção em uma célula hospedeira de fungo filamentoso são promotores obtidos a partir dos genes para Aspergillus oryzae amilase TAKA, Rhizomucor miehei proteinse aspártica, Aspergillus niger alfa-amilase neutral, Aspergillus niger alfaamilase estável em ácido, Aspergillus niger ou Aspergillus awamori glucoamilase (glaA), Rhizomucor miehei lipase, Aspergillus oryzae protease alcalina, Aspergillus oryzae triose fosfato isomerase, Aspergillus nidulans acetamidase, Fusarium venenatum amiloglucosidase (WO 00/56900), Fusarium venenatum Daria (WO 00/56900), Fusarium venenatum Quinn (WO 00/56900), Fusarium oxisporum protease tipo tripsina (WO 96/00787), Trichoderma reesei beta-glucosidase, Trichoderma reesei celobiohidrolase I, Trichoderma reesei celobiohidrolase II, Trichoderma reesei endoglucanase I, Trichoderma reesei endoglucanase II, Trichoderma reesei endoglucanase III, Trichoderma reesei endoglucanase IV, Trichoderma reesei endoglucanase V, Trichoderma reesei xilanase I, Trichoderma reesei xilanase II, Trichoderma reesei beta-xilosidase, assim como o promotor NA2-tpi (um promotor modificado incluindo um gene codificando uma alfa-amilase neutral em Aspergilli em que o líder não traduzido foi substituído por um líder não traduzido de um gene codificando triose fosfato isomerase em Aspergilli', exemplos não limitativos incluem promotores modificados incluindo o gene codificando alfa-amilase neutral em Aspergillus niger em que o líder não traduzido foi substituído por um líder não traduzido do gene codificando triose fosfato isomerase em Aspergillus nidulans ou Aspergillus oryzae); e promotores mutantes, truncados e hídridos dos mesmos.
Em um hospedeiro de levedura, promotores utilizáveis são obtidos a partir dos genes para Saccharomyces cerevisiae enolase (ENO-1), Saccharomyces cerevisiae galactoquinase (GAL1), Saccharomyces cerevisiae álcool dehidrogenase/gliceraldeído-3-fosfato dehidrogenase (ADH1, ADH2/GAP), Saccharomyces cerevisiae triose fosfato isomerase (TPI), Saccharomyces cerevisiae metallothionein (CUP1), e Saccharomyces cerevisiae 3-fosfoglycerate quinase. Outros promotores utilizáveis para células hospedeiras de leveduras são descritos por Romanos et al., 1992, Levedura 8: 423-488.
A sequência de controle também pode ser uma sequência apropriada de terminador de transcrição, a sequência reconhecida por uma célula hospedeira para terminar a transcrição. A sequência de terminador é ligada operavelmente ao 3’ término de uma sequência de nucleotídeos codificando o polipeptídeo. Qualquer terminador que é funcional na célula hospedeira de escolha pode ser usado na presente invenção.
Os terminadores preferidos para células hospedeiras de fungos filamentosos são obtidos a partir dos para Aspergillus oryzae TAKA amilase, Aspergillus niger glucoamilase, Aspergillus nidulans anthranilate sintase, Aspergillus niger alfa-glucosidase, e Fusarium oxisporum protease tipo tripsina.
Os terminadores preferidos para células hospedeiras de levedura são obtidos a partir de genes para Saccharomyces cerevisiae enolase, Saccharomyces cerevisiae citocromo C (CYC1), e Saccharomyces cerevisiae gliceraldeído-3-fosfato dehidrogenase. Outros terminadores utilizáveis células hospedeiras de levedura são descritos por Romanos et al., 1992, supra.
A sequência de controle também pode ser uma sequência líder apropriada, uma região não traduzida de um mRNA que é importante para a tradução pela célula hospedeira. A sequência líder é ligada operavelmente ao 5’ término de uma sequência de nucleotídeos codificando o polipeptídeo. Qualquer sequência líder que é funcional na célula hospedeira de escolha pode ser usada na presente invenção.
Os líderes preferidos para células hospedeiras de fungos filamentosos são obtidas a partir dos genes para Aspergillus oryzae TAKA amilase e Aspergillus mdulans triose fosfato isomerase.
Apropriados líderes para células hospedeiras de levedura são obtidos a partir dos genes para Saccharomyces cerevisiae enolase (ENO-1), Saccharomyces cerevisiae 3-fosfoglicerato quinase, Saccharomyces cerevisiae alfa-fator, e Saccharomyces cerevisiae álcool dehidrogenase/gliceraldeído-3-fosfato dehidrogenase (ADH2/GAP).
A sequência de controle também pode ser uma sequência poliadenilação, uma sequência ligada operavelmente ao 3’ término de uma sequência de nucleotídeos e, quando transcrita, é reconhecida pela célula hospedeira como um sinal para adicionar resíduos de poliadenosina ao mRNA transcrito. Qualquer sequência de poliadenilação que é funcional na célula hospedeira de escolha pode ser usada na presente invenção.
As sequências poliadenilação preferidas para células hospedeiras de fungos filamentosos são obtidas a partir dos genes para Aspergillus oryzae TAKA amilase, Aspergillus niger glucoamilase, Aspergillus nidulans anthranilate sintase, Fusarium oxisporum protease tipo tripsina, e Aspergillus niger alfa-glucosidase.
As sequências de poliadenilação utilizáveis para células hospedeiras de levedura são descritas por Guo e Sherman, 1995, Molecular Cellular Biology 15: 5983-5990.
A sequência de controle também pode ser uma sequência de codificação de peptídeo de sinal que codifica um peptídeo de sinal ligado ao amino término de um polipeptídeo e dirige o polipeptídeo codificado na via secretória da célula. A extremidade 5’ da sequência de codificação de uma sequência de nucleotídeos pode conter inerentemente uma sequência de codificação de peptídeo de sinal naturalmente ligada em quadro de leitura de tradução com o segmento da sequência de codificação que codifica o polipeptídeo secretado. Altemativamente, a extremidade 5’ da sequência de codificação pode conter uma sequência de codificação de peptídeo de sinal que é estranha para a sequência de codificação. A sequência de codificação de peptídeo de sinal estranho pode ser requerida onde a sequência de codificação não contém naturalmente a sequência de codificação de peptídeo de sinal. Altemativamente, a sequência de codificação de peptídeo de sinal estranho pode simplesmente substituir a sequência de codificação natural de peptídeo de sinal a fim de melhorar a secreção do polipeptídeo. No entanto, qualquer sequência de codificação de peptídeo de sinal que dirige o polipeptídeo expressado na via secretória de uma célula hospedeira de escolha, isto é, secretado em um meio de cultura, pode ser usado na presente invenção.
As sequências de codificação de peptídeo de sinal efetivas para células hospedeiras bacterianas são as sequências de codificação de peptídeos de sinal obtidas a partir dos genes para Bacillus NCIB 11837 amilase maltogênica, Bacillus stcarothermophilus alfa-amilase, Bacillus licheniformis subtilisina, Bacillus licheniformis beta-lactamase, Bacillus stearothermophílus proteases neutrais (nprT, nprS, nprM), e Bacillus subtilis prsA. Ainda peptídeos de sinal são descritos por Simonen e Paiva, 1993,
Microbiologícal Reviews 57: 109-137.
A sequência de codificação de peptídeos de sinal efetiva para células hospedeiras de fungos filamentosos são as sequências de codificação de peptídeos de sinal obtidas a partir dos genes para Aspergillus oryzae TAKA amilase, Aspergillus niger neutral amilase, Aspergillus niger glucoamilase, Rhizomucor miehei proteinase aspártica, Humicola insolens celulase, Humicola insolens endoglucanase V, e Humicola lanuginosa lipase.
Os peptídeos de sinal utilizáveis para células hospedeiras de levedura são obtidos a partir dos genes para Saccharomyces cerevisiae alfa-fator e Saccharomyces cerevisiae invertase. Outras sequências de codificação de peptídeos de sinal utilizáveis são descritas por Romanos et al., 1992, supra.
Em um aspecto preferido, o peptídeo de sinal compreende ou consiste de aminoácidos 1 a 21 de SEQ ID NO: 2. Em outro aspecto preferido, a sequência de codificação de peptídeo de sinal compreende ou consiste de nucleotídeos 1 to 63 de SEQ ID NO: 1.
A sequência de controle também pode ser uma sequência de codificação de um propeptídeo que codifica um propeptídeo posicionado no amino término de um polipeptídeo. O polipeptídeo resultante é conhecido como uma proenzima ou propolipeptídeo (ou um zymogen em alguns casos). Um propeptídeo é geralmente inativo e pode ser convertido em um polipeptídeo maduro ativo por clivagem catalítica ou auto-catalítica do propeptídeo a partir do propolipeptídeo. A sequência de codificação do propeptídeo pode ser obtida a partir dos genes para Bacillus subtilis protease alcalina (aprE), Bacillus subtilis protease neutral (nprT), Saccharomyces cerevisiae alfa-fator, Rhizomucor miehei proteinase aspártica, e Myceliophthora thermophila lacase (WO 95/33836).
Onde ambas as sequências de peptídeo de sinal e propeptídeo estão presentes no amino término de um polipeptídeo, a sequência de propeptídeo está posicionada próxima do amino término de um polipeptídeo e a sequência de peptídeo de sinal está posicionada próximo do amino término da sequência de propeptídeo.
Também pode ser desejável adicionar sequências regulatórias que permitem a regulação da expressão do polipeptídeo relativo ao crescimento da célula hospedeira. Exemplos de sistemas regulatórios são os que causam a expressão do gene a ser ligado ou desligado em resposta a um estímulo químico ou físico, incluindo a presença de um composto regulatório. Os sistemas regulatórios em sistemas procarióticos incluem os sistemas de operador lac, tac, e trp. Em levedura, o sistema DH2 ou sistema GAL1 pode ser usado. Em fungos filamentosos, o promotor TAKA alfa-amilase, promotor em Aspergillus niger glucoamilase, e promotor em Aspergillus oryzae glucoamilase podem ser usados como sequências regulatórias. Outros exemplos de sequências regulatórias são os que permitem a amplificação de gene. Em sistemas eucarióticos, estas sequências regulatórias incluem o gene dihidrofolato reductase que é amplificado na presença de metotrexato, e os genes de metalotioneína que são amplificados com metais pesados. Nestes casos, a sequência de nucleotídeos codificando o polipeptídeo deve ser ligada operavelmente com a sequência regulatória.
Vetores de expressão
A presente invenção também se refere a vetores de expressão recombinantes compreendendo um polinucleotídeo da presente invenção, um promotor, e sinais de parada transcripcional e translacional. Os vários ácidos nucléicos e sequências de controle, como descritos aqui, podem ser unidos juntos para produzir um vetor de expressão recombinante que pode incluir um ou mais (vários) sítios de restrição convenientes para permitir a inserção ou substituição de uma sequência de nucleotídeos codificando o polipeptídeo em tais sítios. Altemativamente, uma sequência de polinucleotídeos da presente invenção pode ser expressada por inserção de uma sequência de nucleotídeos ou uma construção de ácido nucléico compreendendo a sequência em um vetor para expressão apropriado. Na criação do vetor de expressão, a sequência de codificação está localizada no vetor de modo que a sequência de codificação é ligada operavelmente com as sequências apropriadas de controle para expressão.
O vetor de expressão recombinante pode ser qualquer vetor (por exemplo, um plasmídeo ou vírus) que pode ser convenientemente submetido a procedimentos DNA de recombinante e pode ocasionar a expressão de uma sequência de nucleotídeos. A escolha do vetor irá tipicamente depender da compatibilidade do vetor com a célula hospedeira em que o vetor deve ser introduzido. Os vetores podem ser lineares ou plasmídeos circulares fechados.
O vetor pode ser um vetor de replicação autônoma, isto é, vetor que existe como uma entidade extracromossômica, cuja replicação é independente de replicação cromossômica, por exemplo, um plasmídeo, um elemento extra cromossômico, um minicromossomo, ou um cromossomo artificial. O vetor pode conter qualquer meio para assegurar auto-replicação. Altemativamente, o vetor pode ser um que, quando introduzido na célula hospedeira, é integrado no genoma e replicado junto com o(s) cromossomo(s) em que ele foi integrado. Ainda mais, um vetor único ou plasmídeo ou dois ou mais vetores ou plasmídeos que juntos contêm o DNA total a ser introduzido no genoma da célula hospedeira, ou um transposon, pode ser usado.
Os vetores da presente invenção preferivelmente contêm um ou mais (vários) marcadores selecionáveis que permitem a fácil seleção de células transformas, transfectadas, traduzidas, ou semelhantes. Um marcador selecionável é um gene cujo produto provê uma resistência viral ou biocida, resistência a metais pesados, prototrofia ou auxotrofos, e semelhantes.
Exemplos de marcadores selecionáveis bacterianos são os genes dal de Bacillus subtílis ou Bacillus licheniformis, ou marcadores que conferem resistência a antibióticos como resistência a ampicilina, canamicina, cloranfenicol, ou tetraciclina. Os marcadores apropriados para células hospedeiras de levedura são ADE2, HIS3, LEU2, LYS2, MET3, TRP1, e URA3. Os marcadores selecionáveis para uso em célula hospedeira de fungos filamentosos incluem mas não são limitados a, amdS (acetamidase), argB (omitina carbamoiltransferase), bar (fosfinotricina acetiltransferase), hph (higromicina fosfotransferase), niaD (nitrato reductase), pyrG (orotidina-5’fosfato decarboxilase), sC (sulfato adeniltransferase), e trpC (antranilato sintase), assim como equivalentes dos mesmos. Preferidos para uso em uma célula de Aspergillus são os genes amdS e pyrG de Aspergillus nidulans ou Aspergillus oryzae e o gene bar de Streptomyces hygroscopicus.
Os vetores da presente invenção preferivelmente contêm um elemento(s) que permite integração do vetor no genoma da célula hospedeira ou replicação autônoma do vetor em uma célula independente do genoma.
Para integração no genoma da célula hospedeira, o vetor pode se basear sobre a sequência do polinucleotídeo codificando o polipeptídeo ou qualquer outro elemento do vetor para integração no genoma por recombinação homóloga ou não homóloga. Altemativamente, o vetor pode conter sequências de nucleotídeos adicionais para dirigir integração por recombinação homóloga no genoma da célula hospedeira em um local (ais) preciso(s) no(s) cromossomo(s). Para aumentar a possibilidade de integração em um local preciso, os elementos integracionais devem conter preferivelmente um número suficiente de ácidos nucléicos, como 100 a 10.000 pares de base, preferivelmente 400 a 10.000 pares de base, e o mais preferivelmente 800 a 10.000 pares de base, que tem um elevado grau de identidade para a sequência alvo correspondente para melhorar a probabilidade de recombinação homóloga. Os elementos integracionais podem ser qualquer sequência que é homóloga com a sequência alvo no genoma da célula hospedeira. Ainda mais, os elementos integracionais podem ser sequências de nucleotídeos não codificantes ou codificantes. Por outro lado, o vetor pode ser integrado no genoma da célula hospedeira por recombinação não homóloga.
Para replicação autônoma, o vetor pode ainda compreender uma origem de replicação permitindo ao vetor replicar autonomamente na célula hospedeira em questão. A origem de replicação pode ser qualquer replicação autônoma mediando o replicador de plasmídeo que funciona em uma célula. O termo “origem de replicação” ou “replicador de plasmídeo” é definido aqui como uma sequência de nucleotídeos que permite ao plasmídeo ou vetor replicar in vivo.
Exemplos de origens de replicação bacterianas são as origens de replicação de plasmídeos pBR322, pUC19, pACYC177, e pACYC184 permitindo a replicação em E. coli, e pUBllO, pE194, pTA1060, e pAMBl permitindo a replicação em Bacillus.
Exemplos de origens de replicação para uso em uma célula hospedeira de levedura são a origem de replicação de 2 microns, ARS1, ARS4, a combinação de ARS1 e CEN3, e a combinação de ARS4 e CEN6.
Exemplos de origens de replicação utilizáveis em uma célula de fungo filamentoso são AMAI e ANS1 (Gems et al., 1991, Gene 98: 61-67; Cullen et al., 1987, Nucleic Acids Research 15: 9163-9175; WO 00/24883). Isolamento do gene AMAI e construção de plasmídeos ou vetores compreendendo o gene podem ser obtidos de acordo com os métodos descritos em WO 00/24883.
Mais de uma cópia de um polinucleotídeo da presente invenção pode ser inserida em uma célula hospedeira para aumentar a produção do produto de gene. Um aumento no número de cópias dos polinucleotideos pode ser obtido por integração de pelo menos uma cópia adicional de uma sequência no genoma da célula hospedeira ou incluindo um gene de marcador selecionável amplificável, com os polinucleotideos em que as células contendo copias amplificadas do gene de marcador selecionável, e assim cópias adicionais dos polinucleotídeo, podem ser selecionadas para o cultivo das células na presença do agente selecionável apropriado.
Os procedimentos usados para ligar os elementos descritos acima para construir os vetores de expressão recombinantes da presente invenção são bem conhecidos dos versados na arte (ver, por exemplo,
Sambrook et al., 1989, supra).
Células hospedeiras
A presente invenção também se refere a células hospedeiras recombinantes, compreendendo um polinucleotídeo isolado da presente invenção, que são usadas com vantagem na produção recombinante dos polipeptídeos tendo atividade de intensificação celulolítica. Um vetor compreendendo um polinucleotídeo da presente invenção é introduzido em uma célula hospedeira de modo que o vetor é mantido como um integrante cromossômico ou como um vetor extra- cromossômico de auto-replicação, como descrito antes. O termo célula hospedeira engloba qualquer progênie de uma célula parental que não é idêntica à célula parental devido a mutações que ocorrem durante a replicação. A escolha de uma célula hospedeira irá em uma grande extensão depender do gene codificando o polipeptídeo e sua fonte.
A célula hospedeira pode ser qualquer célula utilizável na produção recombinante de um polipeptídeo da presente invenção, por exemplo, um procarióte ou um eucarióte.
A célula hospedeira procariótica pode ser qualquer bactéria Gram positiva ou uma bactéria Gram negativa. As bactérias Gram positivas incluem, mas não são limitadas a, Bacillus, Streptococcus, Streptomyces, Staphylococcus, Enterococcus, Lactobacillus, Lactococcus, Clostridíum, Geobacillus, e Oceanobacillus. As bactérias Gram negativas incluem, mas não são limitadas a, E. coli, Pseudomonas, Salmonella, Campylobacter, Helicobacter, Flavobacterium, Fusobacterium, Ilyobacter, Neisseria, e Ureaplasma.
A célula hospedeira bacteriana pode ser qualquer célula de Bacillus. As células de Bacillus utilizáveis na prática da presente invenção incluem mas não são limitadas a, células de Bacillus alkalophilus, Bacillus amyloliquefacíens, Bacillus brevís, Bacillus círculans, Bacillus clausii,
Bacillus coagulans, Bacillusfirmus, Bacillus lautus, Bacillus lentus, Bacillus licheniformis, Bacillus megaterium, Bacillus pumilus, Bacillus stearothermophilus, Bacillus subtilis, e Bacillus thuringiensis.
Em um aspecto preferido, a célula hospedeira bacteriana é uma célula de Bacillus amyloliquefaciens. Em outro aspecto preferido, a célula hospedeira bacteriana é uma célula de Bacillus clausii. Em outro aspecto preferido, a célula hospedeira bacteriana é uma célula de Bacillus lentus. Em outro aspecto preferido, a célula hospedeira bacteriana é uma célula de Bacillus licheniformis. Em outro aspecto preferido, a célula hospedeira bacteriana é uma célula de Bacillus stearothermophilus. Em outro aspecto preferido, a célula hospedeira bacteriana é uma célula de Bacillus subtilis.
A célula hospedeira bacteriana também pode ser qualquer célula de Streptococcus. As células de Streptococcus utilizáveis na prática da presente invenção incluem mas não são limitadas a, células de Streptococcus equisimilis, Streptococcus pyogenes, Streptococcus uberis, e Streptococcus equi subsp. Zooepidemicus.
Em um aspecto preferido, a célula hospedeira bacteriana é uma célula de Streptococcus equisimilis. Em outro aspecto preferido, a célula hospedeira bacteriana é uma célula de Streptococcus pyogenes. Em outro aspecto preferido, a célula hospedeira bacteriana é uma célula de Streptococcus uberis. Em outro aspecto preferido, a célula hospedeira bacteriana é uma célula de Streptococcus equi subsp. Zooepidemicus.
A célula hospedeira bacteriana também pode ser qualquer célula de Streptomyces. As células de Streptomyces utilizáveis na prática da presente invenção incluem, mas não são limitadas a, células de Streptomyces achromogenes, Streptomyces avermitilis, Streptomyces coelicolor, Streptomyces griseus, e Streptomyces lívidans.
Em um aspecto preferido, a célula hospedeira bacteriana é uma célula de Streptomyces achromogenes. Em outro aspecto preferido, a célula hospedeira bacteriana é uma célula de Streptomyces avermitilis. Em outro aspecto preferido, a célula hospedeira bacteriana é uma célula de Streptomyces coelicolor. Em outro aspecto preferido, a célula hospedeira bacteriana é uma célula de Streptomyces griseus. Em outro aspecto preferido, a célula hospedeira bacteriana é uma célula de Streptomyces lividans.
A introdução de DNA em uma célula de Bacillus pode, por exemplo, ser efetuada por transformação de protoplasto (ver, por exemplo, Chang e Cohen, 1979, Molecular General Genetics 168: 111-115), usando células competentes (ver, por exemplo, Young e Spizizen, 1961, Journal of Bacteriology 81: 823-829, ou Dubnau e Davidoff-Abelson, 1971, Journal of Molecular Biology 56: 209-221), por eíectroporação (ver, por exemplo, Shigekawa e Dower, 1988, Bíotechniques 6: 742-751), ou por conjugação (ver, por exemplo, Koehler e Thome, 1987, Journal of Bacteriology 169: 5271-5278). A introdução de DNA em uma célula de E coli pode, por exemplo, ser efetuada por transformação do protoplasto (ver, por exemplo, Hanahan, 1983, J. Mol. Biol. 166: 557-580) ou eíectroporação (ver, por exemplo, Dower et al., 1988, Nuclei Acid Res. 16: 6127-6145). A introdução de DNA em uma célula de Streptomyces pode, por exemplo, ser efetuada por transformação do protoplasto e eíectroporação (ver, por exemplo, Gong et al., 2004, Folia Microbiol. (Praha) 49: 399-405), por conjugação (ver, por exemplo, Mazodier et al., 1989, J. Bacteriol. 171: 3583-3585), ou por transdução (ver, por exemplo, Burke et al., 2001, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 98: 6289-6294). A introdução de DNA em uma célula de Pseudomonas, por exemplo, ser efetuada por eíectroporação (ver, por exemplo, Choi et al., 2006, J. Microbiol. Methods 64: 391-397) ou por conjugação (ver, por exemplo, Pinedo e Smets, 2005, Appl. Environ. Microbiol. 71: 51-57). A introdução de DNA em uma célula de Streptococcus pode, por exemplo, ser efetuada por competência natural (ver, por exemplo, Perry e Kuramitsu, 1981, Infect. Immun. 32: 1295-1297), por transformação do protoplasto (ver, por exemplo,
Catt e Jollick, 1991, Microbios. 68: 189-207, por electroporação (ver, por exemplo, Buckley et al., 1999, Appl. Environ. Microbiol. 65: 3800-3804) ou por conjugação (ver, por exemplo, Clewell, 1981, Microbiol. Rev. 45: 409436). No entanto, qualquer método conhecido na arte para introduzir DNA em uma célula hospedeira pode ser usado.
A célula hospedeira também pode ser um eucarióte, como uma célula de mamífero, inseto, planta ou fungo.
Em um aspecto preferido, a célula hospedeira é uma célula de fungo. “Fungos” como usados aqui incluem os filos Ascomycota, Basidiomycota, Chytridiomycota, e Zygomycota (como definido por Hawksworth et al., In, Ainsworth e Bisby’s Dictionary of The Fungi, 8a. Ed. 1995, CAB International, University Press, Cambridge, UK) assim como Oomycota (como citado em Hawksworth et al., 1995, supra, pag, 171) e todos os fungos mitospóricos (Hawksworth et al., 1995, supra).
Em um aspecto mais preferido, a célula hospedeira de fungo é uma célula de levedura. “Levedura” como usado aqui inclui levedura ascosporogenosa (Endomycetales), levedura basidiosporogenosa, e levedura pertencendo a Fungi Imperfecti (Blastomycetes). Porque a classificação de levedura pode mudar no futuro, para os fins desta invenção, a levedura deve ser definida como descrito em Biology and Activities ofYeast fSkinner, F.A., Passmore, S.M., e Davenport, R.R., eds, Soc. App. Bacteriol. Symposium Series No. 9, 1980).
Em um aspecto ainda mais preferido, a célula hospedeira de levedura é uma célula de Candida, Hansenula, Kluyveromyces, Pichia, Saccharomyces, Schizosaccharomyces, ou Yarrowia.
Em um aspecto o mais preferido, a célula hospedeira de levedura é uma célula de Saccharomyces carlsbergensis, Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces diastaticus, Saccharomyces douglasii, Saccharomyces kluyveri, Saccharomyces norbensis, ou Saccharomyces oviformis. Em outro aspecto o mais preferido, a célula hospedeira de levedura é uma célula de Kluyveromyces lactis. Em outro aspecto o mais preferido, a célula hospedeira de levedura é uma célula de Yarrowia lipolytica.
Em outro aspecto mais preferido, a célula hospedeira de fungo é uma célula de fungo filamentoso. “Fungos filamentosos” incluem todas as formas filamentosas da sub-divisão Eumycota e Oomycota (como definido por Hawksworth et al., 1995, supra). Os fungos filamentosos são geralmente caracterizados por uma parece miceliana composta de quitina, celulose, glucano, quitosano, manano, e outros polyssacarídeos complexos. O crescimento vegetativo é por alongamento hifal e catabolismo de carbono é obrigatoriamente aeróbico. Em contraste, crescimento vegetativo por leveduras como Saccharomyces cerevisiae é por formação de broto e um talo unicelular e catabolismo de carbono pode ser fermentativo.
Em um aspecto ainda mais preferido, a célula hospedeira de fungo filamentoso é uma célula de Acremonium, Aspergillus, Aureobasidium, Bjerkandera, Ceriporiopsis, Ckrysosporium, Coprinus, Coriolus, Cryptococcus, Filibasidium, Fusarium, Humicola, Magnaporthe, Mucor, Myceliophthora, Neocallimastíx, Neurospora, Paecilomyces, Penicillium, Phanerochaete, Phlebia, Piromyces, Pleurotus, Schizophyllum, Talaromyces, Thermoascus, Thielavia, Tolypocladium, Trametes, ou Trichoderma.
Em um aspecto o mais preferido, a célula hospedeira de fungo filamentoso é uma célula de Aspergillus awamori, Aspergillus fumigatus, Aspergillus foetidus, Aspergillus japonicus, Aspergillus nidulans, Aspergillus niger ou Aspergillus oryzae. Em outro aspecto o mais preferido, a célula hospedeira de fungo filamentoso é uma célula de Fusarium bactridioides, Fusarium cerealis, Fusarium crookwellense, Fusarium culmorum, Fusarium graminearum, Fusarium graminum, Fusarium heterosporum, Fusarium negundí, Fusarium oxísporum, Fusarium reticulatum, Fusarium roseum, Fusarium sambucinum, Fusarium sarcochroum, Fusarium sporotrichioides,
Fusarium sulphureum, Fusarium torulosum, Fusarium trichothecioides, ou Fusarium venenatum. Em outro aspecto o mais preferido, a célula hospedeira de fungo filamentoso é uma célula de Bjerkandera adusta, Ceriporiopsis aneirina, Ceriporiopsis aneirina, Ceriporiopsis caregiea, Ceriporiopsis gílvescens, Ceriporiopsis pannocinta, Ceriporiopsis rivulosa, Ceriporiopsis subrufa, Ceriporiopsis subvermispora, Chrysosporium keratinophilum, Chrysosporium lucknowense, Chrysosporium tropicum, Chrysosporium merdarium, Chrysosporium inops, Chrysosporium pannicola, Chrysosporium queenslandicum, Chrysosporium zonatum, Coprinus cinereus, Coriolus hirsutus, Humicola insolens, Humicola lanuginosa, Mucor miehei, . Myceliophthora thermophila, Neurospora crassa, Penicillium purpurogenum, Phanerochaete chrysosporium, Phlebia radiata, Pleurotus eryngii, Thielavia terrestris, Trametes villosa, Trametes versicolor, Trichoderma harzianum, Trichoderma koningii, Trichoderma longibrachiatum, Trichoderma reesei, ou Trichoderma viride.
Em outro aspecto o mais preferido, a célula hospedeira de fungo filamentoso é uma célula de Aspergillus niger. Em outro aspecto o mais preferido, a célula hospedeira de fungo filamentoso é uma célula de Aspergillus oryzae. Em outro aspecto o mais preferido, a célula hospedeira de fungo filamentoso é uma célula de Chrysosporium lucknowense. Em outro aspecto o mais preferido, a célula hospedeira de fungo filamentoso é uma célula de Fusarium venenatum. Em outro aspecto o mais preferido, a célula hospedeira de fungo filamentoso é uma célula de Myceliophthora thermophila. Em outro aspecto o mais preferido, a célula hospedeira de fungo filamentoso é uma célula de Trichoderma reesei.
As células fungicas podem ser transformadas por um processo envolvendo a formação de protoplastos, transformação dos protoplastos, e regeneração de uma parede de célula em um modo conhecido por si. Os apropriados procedimentos para transformação de células hospedeiras de
Aspergillus e Trichoderma são descritos em EP 238 023 e Yelton et al., 1984, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 81: 1470-1474. Apropriados métodos para transformar as espécies de Fusarium descritos por Malardier et al., 1989, Gene 78: 147-156, e WO 96/00787. Levedura pode ser transformada usando os procedimentos descritos por Becker e Guarente, In Abelson, J.N. e Simon, M.I., editores, Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology, Methods in Enzymology, Volume 194, pp 182-187, Academic Press, Inc., Nova Iorque; Ito et al., 1983, Journal of Bacteriology 153: 163; e Hinnen et al., 1978, Proceedings of the National Academy of Sciences USA 75: 1920.
Métodos de produção
A presente invenção também se refere a métodos de produzir um polipeptídeo da presente invenção, compreendendo: (a) cultivar uma célula, que em sua forma de tipo selvagem produz o polipeptídeo, sob condições conduzindo à produção do polipeptídeo; e (b) recuperar o polipeptídeo. Em um aspecto preferido, a célula é do gênero Thermoascus. Em um aspecto mais preferido, a célula é Thermoascus aurantíacus. Em um aspecto o mais preferido, a célula é Thermoascus aurantíacus CGMCC 0670.
A presente invenção também se refere a métodos de produzir um polipeptídeo da presente invenção, compreendendo: (a) cultivar uma célula hospedeira recombinante, como descrito aqui, sob condições conduzindo à produção do polipeptídeo; e (b) recuperar o polipeptídeo.
A presente invenção também se refere a métodos de produzir um polipeptídeo da presente invenção, compreendendo: (a) cultivar uma célula hospedeira recombinante sob condições conduzindo à produção do polipeptídeo, em que a célula hospedeira compreende a sequência de nucleotídeos mutantes tendo pelo menos uma mutação em uma sequência de codificação de polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 1, em que a sequência de nucleotídeos mutantes codifica um polipeptídeo que compreende ou consiste do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2; e (b) recuperar o polipeptídeo.
Nos métodos de produção da presente invenção, as células são cultivadas em um meio nutriente apropriado para produção do polipeptídeo usando métodos bem conhecidos na arte. Por exemplo, a célula pode ser cultivada por cultivo em frasco agitado, e fermentação em pequena ou grande escala (incluindo fermentações contínuas, em batelada, batelada alimentada ou em estado sólido) em fermentadores de laboratório ou industriais realizadas no meio apropriado e sob condições permitindo ao polipeptídeo ser expressado e/ou isolado. O cultivo ocorre em um meio nutriente apropriado compreendendo fontes de carbono e nitrogênio e sais inorgânicos, usando procedimentos conhecidos na arte. Os meios apropriados são disponíveis de fornecedores comerciais ou podem ser preparados de acordo com composições publicadas (por exemplo, em catálogos do American Type Culture Collection). Se o polipeptídeo for secretado no meio nutriente, o polipeptídeo pode ser recuperado diretamente do meio Se o polipeptídeo não é secretado no meio, ele pode ser recuperado dos lisados de células.
Os polipeptídeos podem ser detectados usando métodos conhecidos na arte que são específicos para os polipeptídeos. Estes métodos de detecção podem incluir o uso de anticorpos específicos, formação de um produto de enzima, ou desaparecimento de um substrato de enzima. Por exemplo, um teste de enzima pode ser usado para determinar a atividade do polipeptídeo como descrito aqui.
O polipeptídeo resultante pode ser recuperado usando métodos conhecidos na arte. Por exemplo, o polipeptídeo pode ser recuperado do meio nutriente por procedimentos convencionais incluindo, mas não limitado a, centrifugação, filtração, extração, secagem por pulverização, evaporação, ou precipitação.
Os polipeptídeos da presente invenção podem ser purificados por vários procedimentos conhecidos na arte incluindo, mas não limitados a cromatografia (por exemplo, troca iônica, afinidade, hidrofóbica, cromatofocalização e exclusão de tamanho), procedimentos eletroforéticos (por exemplo, focalização isoelétrica preparativa), solubilidade diferencial y (por exemplo, precipitação de sulfato de amônio), SDS-PAGE, ou extração (ver, por exemplo, Protein Purification, J.-C. Janson e Lars Ryden, editores, VCH Publishers, Nova Iorque, 1989) para obter polipeptídeos substancialmente puros.
Plantas
A presente invenção também se refere a plantas, por exemplo, uma planta transgênica, parte de planta ou célula de planta, compreendendo um polinucleotídeo isolado codificando um polipeptídeo tendo atividade de intensificação celulolítica da presente invenção de modo a expressar e produzir o polipeptídeo em quantidades recuperáveis. O polipeptídeo pode ser recuperado da planta ou parte da planta. Altemativamente, a planta ou parte de planta contendo o polipeptídeo recombinante pode ser usada como tal para melhorar a qualidade de um alimento ou ração, por exemplo, melhorando o valor nutricional, palatabilidade, e propriedades reológicas, ou destruir um fator antinutritivo.
A planta transgênica pode ser dicotiledônea (uma dicótile) ou monocotiledônea (uma monocótile). Exemplos de plantas monocotiledôneas são gramíneas como gramas do campo (grama azul, Poa), gramas para forragem como Festuca, Lolium, grama temperata, como Agrostis, e cereais, por exemplo, trigo, aveia, centeio, cevada, arroz, sorgo e maize (milho).
Exemplos de plantas dicotiledôneas são tabaco, legumes, como tremoços, batata, beterraba de açúcar, ervilha, feijão e soja, e plantas crucíferas (família Brassicaceae), como couve-flor, semente de colza, e o organismo modelo intimamente relacionado Arabidopsis thaliana.
Exemplos de partes da planta são o caule, calos, folhas, raízes, frutas, sementes e tubérculos, assim como os tecidos individuais compreendendo estas partes, por exemplo, epiderme, mesófilo, parênquima, tecidos vasculares, meristemas. Os compartimentos de células de planta específicos, como cloroplastos, apoplastos, mitocondria, vacúolos, peroxisomas e citoplasma são também considerados como sendo uma parte da planta. Ainda mais, qualquer célula de planta, qualquer que seja a origem do tecido, é considerada como sendo uma parte da planta. Do mesmo modo, partes da planta como tecidos específicos e células isoladas para facilitar a utilização da invenção são também consideradas partes da planta, por exemplo, embriões, endospermas, aleurona e capas de sementes.
Também incluídas dentro do escopo da presente invenção são a progênie destas plantas, partes da planta, e células de plantas.
A planta transgênica ou célula de planta expressando um polipeptídeo da presente invenção pode ser construída de acordo com métodos conhecidos na arte. Em resumo, a planta ou célula de planta é construída incorporando uma ou mais (várias) construções de expressão codificando um polipeptídeo da presente invenção no genoma hospedeiro da planta ou genoma do cloroplasto e propagando as plantas ou células de planta modificadas resultantes em uma planta transgênica ou célula de planta.
A construção de expressão é convenientemente uma construção de ácido nucleico que compreende um polinucleotídeo codificando um polipeptídeo da presente invenção ligado operavelmente com sequências regulatórias apropriadas requeridas para expressão de uma sequência de nucleotídeos na planta ou parte de planta de escolha. Ainda mais, a construção de expressão pode compreender um marcador selecionável útil para identificar as células hospedeiras na construção de expressão que foi integrada e sequências de DNA necessárias para introdução da construção na planta em questão (a última depende do método de introdução do DNA a ser usado).
A escolha de sequências regulatórias, como sequências de promotor e terminador e opcionalmente sequências de sinal ou transito, é determinada, por exemplo, com base em quando, onde e como o polipeptídeo é desejado ser expressado. Por exemplo, a expressão do gene codificando um polipeptídeo da presente invenção pode ser constitutiva ou indutível, ou pode ser específica para o desenvolvimento, estágio ou tecido, e o produto de gene pode ser marcado em um tecido específico ou parte de planta como semente ou folhas. As sequências regulatórias são, por exemplo, descritas por Tague et al., 1988, Plant Physiology 86: 506.
Para expressão constitutiva, o 35S-CaMV, a ubiquitina 1 de milho, e o promotor de actina de arroz 1 podem ser usados (Franck et al., 1980, Cell 21: 285-294; Christensen et al., 1992, Plant Mol. Biol. 18: 675689; Zhang et al., 1991, Plant Cell 3: 1155-1165). Os promotores específicos para órgãos podem ser, por exemplo, um promotor de tecidos de imersão de armazenamento como sementes, tubérculos de batata e frutas (Edwards e Coruzzi, 1990, Ann. Rev. Genet. 24: 275-303), ou de tecidos de imersão metabólicos, como meristemas (Ito et al., 1994, Plant Mol. Biol. 24: 863878), um promotor específico para semente como o promotor glutelina, prolamina, globulina, ou albumina de arroz (Wu et al., 1998, Plant and Cell Physiology 39: 885-889), um promotor de Vicia faba de legumina B4 e o gene de proteína de semente desconhecido de Vicia faba (Conrad et al., 1998, Journal of Plant Physiology 152: 708-711), um promotor de uma proteína do corpo de óleo da semente (Chen et al., 1998, Plant and Cell Physiology 39: 935-941), o promotor da proteína de armazenamento napA de Brassica napus, ou qualquer outro promotor específico para semente conhecido na arte, por exemplo, como descrito em WO 91/14772. Ainda mais, o promotor pode ser um promotor específico de folha como o promotor rbcs de arroz ou tomate (Kyozuka et al., 1993, Plant Physiology 102: 991-1000, o promotor do gene de adenina metiltransferase do vírus chlorella (Mitra e Higgins, 1994, Plant Molecular Biology 26: 85-93), ou o promotor do gene aldP de arroz (Kagaya et al., 1995, Molecular and General Genetics 248: 668-674), ou um promotor indutível por ferida como o promotor de batatapin2 (Xu et al., 1993, Plant Molecular Biology ll'. 573-588). Do mesmo modo, o promotor pode ser indutível por tratamentos abióticos como temperatura, seca, ou alterações em salinidade ou induzidas por substâncias aplicadas exogenamente que ativam o promotor, por exemplo, etanol, oestrogens, hormônios de plantas como etileno, ácido abscíssico e ácido giberélico, e metais pesadas.
Um elemento intensificador do promotor também pode ser usado para obter maior expressão de um polipeptídeo da presente invenção na planta. Por exemplo, o elemento intensificador do promotor pode ser um intron que é colocado entre o promotor e uma sequência de nucleotídeos codificando um polipeptídeo da presente invenção. Por exemplo, Xu et al., 1993, supra, descrevem o uso do primeiro intron do gene de actina 1 de arroz para melhorar a expressão.
O marcador selecionável gene e quaisquer outras partes da construção de expressão pode ser escolhido dentre os disponíveis na arte.
A construção de ácido nucléico é incorporada no genoma da planta de acordo com técnicas convencionais conhecidas na arte, incluindo transformação mediada por Agrobacterium, transformação mediada por vírus, microinjeção, bombardeio de partículas, transformação biolística, e eletroporação (Gasser et al., 1990, Science 244: 1293; Potrykus, 1990, Bio/Tecknology 8: 535; Shimamoto et al., 1989, Nature 338: 274).
Atualmente, a transferência de genes mediada por Agrobacterium tumefaciens é o método de escolha para gerar dicotiledôneas transgênicas (para uma revisão, Ver Hooykas e Schilperoort, 1992, Plant Molecular Biology 19: 15-38) e também pode ser usada para transformar monocotiledôneas, apesar de outros métodos de transformação serem com frequência usados para estas plantas. Atualmente, o método de escolha para gerar monocotiledôneas transgênicas é o bombardeio de partículas (partículas microscópicas de ouro ou tungstênio revestidas com o DNA transformante) de calos embriônico ou calos em desenvolvimento (Christou, 1992, Plant Journal 2: 275-281; Shimamoto, 1994, Current Opinion Biotechnology 5: 158-162; Vasil et al., 1992, Bio/Technology 10: 667-674). Um método alternativo para transformação de monocotiledôneas é baseado em transformação do protoplasto como descrito por Omirulleh et al., 1993, Plant Molecular Biology 21: 415-428.
Seguindo a transformação, os transformantes tendo incorporado uma construção de expressão são selecionados e regenerados em plantas completas de acordo com métodos bem conhecidos na arte. Com freqüência, o procedimento de transformação é projetado para a eliminação seletiva de genes de seleção ou durante a regeneração ou seguindo gerações usando, por exemplo, co-transformação com duas construções de T-DNA separadas ou excisão específica para o sítio do gene de seleção para uma recombinase específica.
A presente invenção também se refere a métodos de produzir um polipeptídeo da presente invenção compreendendo: (a) cultivar uma planta transgênica ou uma célula de planta compreendendo um polinucleotídeo codificando o polipeptídeo tendo atividade de intensificação celulolítica da presente invenção sob condições conduzindo à produção do polipeptídeo; e (b) recuperar o polipeptídeo.
Em formas de realização, além de dirigir a transformação de um genótipo particular de planta com uma construção preparada de acordo com a presente invenção, plantas transgênicas podem ser feitas por cruzamento de uma planta tendo uma construção da presente invenção para uma segunda planta faltando a construção. Por exemplo, a construção codificando um polipeptídeo tendo atividade de intensificação celulolítica ou uma porção do mesmo pode ser introduzida em uma variedade de planta particular por cruzamento, sem a necessidade de nunca transformar diretamente uma planta da dada variedade. Assim, a presente invenção não somente engloba uma planta diretamente regenerada das células que foram transformadas de acordo com a presente invenção, mas também a progênie de tais plantas. Como usado aqui, progênie pode fazer referência à descendência de qualquer geração de uma planta parental preparada de acordo com a presente invenção. Esta progênie pode incluir uma construção de DNA preparada de acordo com a presente invenção, ou uma porção de uma construção DNA preparada de acordo com a presente invenção. Em formas de realização, cruzamento resulta em um transgene da presente invenção sendo introduzido em uma linhagem de planta por polinização cruzada de uma linhagem de partida com uma linhagem de planta doadora que inclui um transgene da presente invenção. Exemplos não limitativos de tais etapas são ainda articulados na Patente U.S. No: 7.151.204.
E visado que plantas incluindo um polipeptídeo tendo atividade de intensificação celulolítica da presente invenção incluem plantas geradas através de um processo de conversão retro-cruzada. Por exemplo, plantas da presente invenção incluem plantas referidas como de genótipo, linhagem, endogâmico ou híbrido retro-cruzados.
Em formas de realização, marcadores genéticos podem ser usados para auxiliar na introgressão de um ou mais transgenes da invenção a partir de um fundo genético para dentro de outro. A seleção auxiliada por marcador oferece vantagens relativas ao cruzamento convencional em que pode ser usada para evitar erros causados por variações fenotípicas. Além disso, os marcadores genéticos podem fornecer dados com relação ao grau relativo do germoplasma de elite da progênie individual de um cruzamento particular. Por exemplo, quando uma planta com um traço desejado que de outra forma tem um fundo genético não agronomicamente desejável é cruzada com um parental de elite, os marcadores genéticos podem ser usados para selecionar a progênie que não somente possui o traço de interesse, mas também tem uma proporção relativamente grande do germoplasma desejado. Deste modo, o número de gerações requeridas para introgredir um ou mais traços em um fundo genético particular é minimizado.
Remoção ou redução de atividade de intensificação celulolítica
A presente invenção também se refere a métodos de produzir um mutante de uma célula parental, que compreende romper ou deletar um polinucleotídeo, ou uma porção do mesmo, codificando um polipeptídeo da presente invenção, que resulta na célula mutante produzindo menos do polipeptídeo do que a célula parental quando cultivada sob as mesmas condições.
A célula mutante pode ser construída por redução ou eliminação da expressão de uma sequência de nucleotídeos codificando um polipeptídeo da presente invenção usando métodos bem conhecidos na arte, por exemplo, inserções, rupturas, substituições, ou deleções. Em um aspecto preferido, a sequência de nucleotídeos é inativada. A sequência de nucleotídeos a ser modificada ou inativada pode ser, por exemplo, a região de codificação ou uma parte da mesma essencial para atividade, ou um elemento regulatório requerido para a expressão da região de codificação. Um exemplo de tal sequência regulatória ou de controle pode ser uma sequência de promotor ou uma parte funcional da mesma, isto é, uma parte que é suficiente para afetar a expressão de uma sequência de nucleotídeos. Outras sequências de controle para modificação possível incluem mas não são limitadas a, um líder, sequência de poliadenilação, sequência de propeptídeo, sequência de peptídeo de sinal, terminador de transcrição, e ativator transcripcional.
Modificação ou inativação de uma sequência de nucleotídeos pode ser realizada submetendo a célula parental a mutagenese e seleção para células mutantes em que a expressão de uma sequência de nucleotídeos foi reduzida ou eliminada. A mutagenese, que pode ser específica ou aleatória pode ser realizada, por exemplo, por uso de um agente de mutagenização físico ou químico apropriado, pelo uso de um oligonucleotídeo apropriado, ou submetendo a sequência de DNA a mutagenese gerada por PCR. Ainda mais, a mutagenese pode ser realizada por uso de qualquer combinação destes agentes mutagenizantes.
Exemplos de um agente de mutagenização físico ou químico apropriado para o presente fim incluem irradiação ultravioleta (UV), hidroxilamina, N-metil-N'-nitro-N-nitrosoguanidina (MNNG), O-metil hidroxilamina, ácido nitroso etil metano sulfonato (EMS), bissulfito de sódio, ácido fórmico e análogos de nucleotídeo.
Quando estes agentes são usados, a mutagenese é tipicamente realizada por incubação da célula parental a ser mutagenizada na presença do agente mutagenizante de escolha sob condições apropriadas, e triando e/ou selecionando células mutantes exibindo expressão reduzida ou nenhuma do gene.
Modificação ou inativação de uma sequência de nucleotídeos pode ser obtida por introdução, substituição, ou remoção de um ou mais (vários) nucleotídeos no gene ou um elemento regulatório requerido para a transcrição ou tradução dos mesmos. Por exemplo, nucleotídeos podem ser inseridos ou removidos de modo a resultar em uma introdução de um códon de parada, a remoção do códon de partida, ou uma mudança no quadro de leitura aberta. Esta modificação ou inativação pode ser obtida por mutagenese sítio-dirigida ou mutagenese gerada por PCR de acordo com métodos conhecidos na arte. Apesar de, em princípio, a modificação poder ser realizada in vivo, isto é, diretamente em uma célula expressando a sequência de nucleotídeos a ser modificada, é preferido que a modificação seja realizada in vitro como exemplificado abaixo.
Um exemplo de um modo conveniente para eliminar ou reduzir a expressão de uma sequência de nucleotídeos por uma célula é baseado em técnicas de substituição de gene, deleção de gene, ou ruptura de gene. Por exemplo, no método de ruptura de genes, uma sequência de ácido nucleico correspondente à sequência de nucleotídeos endógena é mutagenizada in vitro para produzir uma sequência de ácido nucleico defeituosa que é então transformada na célula parental para produzir um gene defeituoso. Por recombinação homóloga, a sequência de ácido nucleico defeituosa substitui a sequência de nucleotídeos endógena. Pode ser desejável que a sequência de nucleotídeos defeituosa também codifica um marcador que pode ser usado para seleção de transformantes em que a sequência de nucleotídeos foi modificada ou destruída. Em um aspecto particularmente preferido, a sequência de nucleotídeos é rompida com um marcador selecionável como o descrito aqui.
Altemativamente, modificação ou inativação de uma sequência de nucleotídeos pode ser realizada por técnicas de RNAi ou antisentido estabelecidas usando uma sequência complementar a uma sequência de nucleotídeos. Mais especificãmente, expressão de uma sequência de nucleotídeos por uma célula pode ser reduzida ou eliminada por introdução de uma sequência complementar a uma sequência de nucleotídeos do gene que pode ser transcrita em uma célula e é capaz de hibridizar para o mRNA produzido na célula. Sob condições permitindo à sequência de nucleotídeos anti-sentido complementar hibridizar para o mRNA, a quantidade de proteína traduzida é assim reduzida ou eliminada.
A presente invenção ainda se refere a uma célula mutante de uma célula parental que compreende uma ruptura ou deleção de uma sequência de nucleotídeos codificando o polipeptídeo ou a sequência de controle dos mesmos, que resulta na célula mutante produzindo menos do polipeptídeo ou no polipeptídeo comparado com a célula parental.
As células mutantes deficientes em polipeptídeo assim criadas são particularmente utilizáveis como células hospedeiras para a expressão de polipeptídeos nativos e/ou heterólogos. Assim, a presente invenção ainda refere-se a métodos de produzir um polipeptídeo nativo ou heterólogo, compreendendo: (a) cultivar uma célula mutante sob condições conduzindo à produção do polipeptídeo; e (b) recuperar o polipeptídeo. O termo polipeptídeos heterólogos é definido aqui como polipeptídeos que não são nativos para a célula hospedeira, uma proteína nativa em que modificações foram feitas para alterar a sequência nativa, ou uma proteína nativa cuja expressão é quantitativamente alterada como um resultado de uma manipulação da célula hospedeira por técnicas de DNA recombinante.
Em um outro aspecto, a presente invenção refere-se a um Método para produzir um produto de proteína essencialmente livre de atividade de intensificação celulolítica por fermentação de uma célula que produz tanto um polipeptídeo da presente invenção assim como um produto de proteína de interesse por adição de uma quantidade efetiva de um agente capaz de inibir a atividade de intensificação celulolítica para o caldo de fermentação antes, durante ou após a fermentação ter sido completada, recuperar o produto de interesse do caldo de fermentação, e opcionalmente submeter o produto recuperado para outra purificação.
Em um outro aspecto, a presente invenção refere-se a um Método para produzir um produto de proteína essencialmente isento de atividade de intensificação celulolítica por cultivo de uma célula sob condições permitindo a expressão do produto, submetendo o caldo de cultura resultante a um tratamento combinado de pH e temperatura de modo a reduzir a atividade de intensificação celulolítica substanciaimente, e recuperar o produto do caldo de cultura. Altemativamente, o tratamento combinado de pH e temperatura pode ser realizado em uma preparação de enzima recuperada do caldo de cultura. O tratamento combinado de pH e temperatura pode ser opcionalmente usado em combinação com um tratamento com um inibidor de melhora celulolítica.
De acordo com este aspecto da invenção, é possível remover pelo menos 60%, preferivelmente pelo menos 75%, mais preferivelmente pelo menos 85%, ainda mais preferivelmente pelo menos 95%, e o mais preferivelmente pelo menos 99% da atividade de intensificação celulolítica. A remoção completa da atividade de intensificação celulolítica pode ser obtida por uso deste método.
O tratamento combinado de pH e temperatura é preferivelmente realizado a um pH na faixa de 2-4 ou 9-11 e uma temperatura na faixa de pelo menos 60-70°C durante um período de tempo suficiente para atingir o efeito desejado, onde tipicamente, 30 a 60 minutos são suficientes.
Os métodos usados para cultivo e purificação do produto de interesse podem ser realizados por métodos conhecidos na arte.
Os métodos da presente invenção para produzir um produto essencialmente isento de melhora celulolítica é de interesse particular na produção de polipeptídeos eucarióticos, em particular proteínas fungicas como enzimas. A enzima pode ser selecionada dentre, por exemplo, uma enzima amilolítica, enzima lipolítica, enzima proteolítica, enzima celulolítica, oxidoreductase, ou enzima degradando parede da célula da planta. Exemplos destas enzimas incluem uma aminopeptidase, amilase, amiloglucosidase, carbohidrase, carboxipeptidase, catalase, celobiohidrolase, celulase, quitinase, cutinase, ciclodextrina glicosiltransferase, deoxiribonuclease, endoglucanase, esterase, galactosidase, beta-galactosidase, glucoamilase, glicose oxidase, glucosidase, haloperoxidase, hemicelulase, invertase, isomerase, lacase, ligase, lipase, liase, manosidase, oxidase, enzima pectinolitica, peroxidase, fitase, fenoloxidase, polifenoloxidase, enzima proteolítica, ribonuclease, transferase, transglutaminase, ou xilanase. As células deficientes em melhora celulolítica também podem ser usadas para expressar proteínas heterólogas de interesse farmacêutico como os hormônios, fatores de crescimento, receptores e semelhantes.
Será entendido que o termo “polipeptídeos eucarióticos inclui não somente polipeptídeos nativos, mas também os polipeptídeos, por exemplo, enzimas, que foram modificados por substituições, deleções ou adições de aminoácido, ou outras tais modificações para melhorar a atividade, termoestabilidade, tolerância a pH e semelhantes.
Em um outro aspecto, a presente invenção refere-se a um produto de proteína essencialmente livre de atividade de intensificação celulolítica que é produzido por um método da presente invenção.
Métodos de inibir expressão de um polipeptídeo tendo atividade de intensificação celulolítica
A presente invenção também se refere a métodos de inibir a expressão de um polipeptídeo tendo atividade de intensificação celulolítica em uma célula, compreendendo administrar à célula ou expressar na célula uma molécula de RNA de filamento duplo (dsRNA), em que o dsRNA compreende uma sub-sequência de um polinucleotídeo da presente invenção. Em um aspecto preferido, o dsRNA é cerca de 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 ou more nucleotídeos duplex em comprimento.
O dsRNA é preferivelmente RNA interferência pequena (siRNA) ou um micro RNA (miRNA). Em um aspecto preferido, o dsRNA é RNA interferência pequena (siRNAs) para inibir a transcrição. Em outro aspecto preferido, o dsRNA é micro RNA (miRNAs) para inibir a tradução.
A presente invenção também se refere a tal molécula de RNA de filamento duplo (dsRNA)s, compreendendo uma porção de uma sequência de codificação de polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 1 para inibir a expressão de um polipeptídeo tendo atividade de intensificação celulolítica em uma célula. Apesar da presente invenção não ser limitada por qualquer mecanismo particular de ação, o dsRNA pode entrar na célula e causar a degradação de RNA de filamento único (sRNA) de sequências similares ou idênticas, incluindo mRNAs endógenos. Quando uma célula é exposta a dsRNA, mRNA do gene homólogo é seletivamente degradado por um processo chamado RNA interferência (RNAi).
Os dsRNAs da presente invenção podem ser usados em silenciamento de genes. Em um aspecto, a invenção provê métodos para seletivamente degradar RNA usando os dsRNAis da presente invenção. O processo pode ser praticado ín vitro, ex vivo ou in vivo. Em um aspecto, as moléculas de dsRNA podem ser usadas para gerar uma mutação de perda-defunção em uma célula, um órgão ou um animal. Métodos para fazer e usar as moléculas de dsRNA para seletivamente degradar RNA são bem conhecidos na arte, ver, por exemplo, Patente US 6.506.559; Patente US 6.511.824; Patente US 6.515.109; e Patente US 6.489.127.
Composições
A presente invenção também se refere a composições compreendendo um polipeptídeo da presente invenção. Preferivelmente, as composições são enriquecidas em tal polipeptídeo. O termo enriquecida indica que a atividade de intensificação celulolítica da composição foi elevada, por exemplo, com um fator de enriquecimento de pelo menos 1,1.
A composição pode compreender um polipeptídeo da presente invenção como o maior componente enzimático, por exemplo, uma composição de monocomponente. Altemativamente, a composição pode compreender múltiplas atividades enzimáticas, como uma aminopeptidase, amilase, carboidrase, carboxipeptidase, catalase, celulase, quitinase, cutinase, ciclodextrina glicosiltransferase, deoxiribonuclease, esterase, alfagalactosidase, beta-galactosidase, glucoamilase, alfa-glucosidase, betaglucosidase, haloperoxidase, invertase, lacase, lipase, manosidase, oxidase, enzima pectinolítica, peptidoglutaminase, peroxidase, fitase, polifenoloxidase, enzima proteolítica, ribonuclease, transglutaminase, ou xilanase. A(s) enzima(s) adicional (ais) pode(m) ser produzida(s), por exemplo, por um microorganismo pertencendo ao gênero Aspergillus, preferivelmente Aspergillus aculeatus, Aspergillus awamori, Aspergillus fumigatus,
Aspergillus foetidus, Aspergillus japonicus, Aspergillus nidulans, Aspergillus niger, ou Aspergillus oryzae; Fusarium, preferivelmente Fusarium bactridioides, Fusarium cerealis, Fusarium crookwellense, Fusarium culmorum, Fusarium graminearum, Fusarium graminum, Fusarium heterosporum, Fusarium negundi, Fusarium oxisporum, Fusarium reticulatum, Fusarium roseum, Fusarium sambucinum, Fusarium sarcochroum, Fusarium sulphureum, Fusarium toruloseum, Fusarium trichothecioides, ou Fusarium venenatum; Humicola, preferivelmente Humicola insolens ou Humicola lanuginosa; ou Trichoderma, preferivelmente Trichoderma harzianum, Trichoderma koningii, Trichoderma longibrachiatum, Trichoderma reesei, ou Trichoderma viride.
As composições de polipeptídeo podem ser preparadas de acordo com métodos conhecidos na arte e podem estar na forma de uma composição líquida ou seca. Por exemplo, a composição de polipeptídeo pode estar na forma de um granulado ou um microgranulado. O polipeptídeo a ser incluído na composição pode ser estabilizado de acordo com métodos conhecidos na arte.
Exemplos são dados abaixo de usos preferidos das composições de polipeptídeo da invenção. A dosagem da composição de polipeptídeo da invenção e outras condições sob as quais a composição é usada podem ser determinadas com base em métodos conhecidos na arte. Processamento de Material celulósico
A presente invenção também se refere a métodos para degradar ou converter um material celulósico, compreendendo: tratar o material celulósico com uma composição de enzima na presença de um polipeptídeo tendo atividade de intensificação celulolítica da presente invenção. Em um aspecto preferido, o método ainda compreende recuperar o material celulósico degradado ou convertido.
A presente invenção também se refere a métodos de produzir um produto de fermentação, compreendendo: (a) sacarificar um material celulósico com uma composição de enzima na presença de um polipeptídeo tendo atividade de intensificação celulolítica da presente invenção; (b) fermentar o material celulósico sacarificado com uma ou mais (várias) microrganismos de fermentação para produzir o produto de fermentação; e (c) recuperar o produto de fermentação da fermentação.
A presente invenção também se refere a métodos de fermentar um material celulósico, compreendendo: fermentar o material celulósico com uma ou mais (várias) microrganismos de fermentação, em que o material celulósico é sacarificado com uma composição de enzima na presença de um polipeptídeo tendo atividade de intensificação celulolítica da presente invenção. Em um aspecto preferido, a fermentação do material celulósico produz um produto de fermentação. Em outro aspecto preferido, o método ainda compreende recuperar o produto de fermentação da fermentação.
Os métodos da presente invenção podem ser usados para sacarificar um material celulósico para açúcares fermentáveis e converter os açúcares fermentáveis para muitas substâncias úteis, por exemplo, combustível, etanol potável, e/ou produtos de fermentação (por exemplo, ácidos, álcoois, cetonas, gases, e semelhantes). A produção de um produto de fermentação desejado de material celulósico tipicamente envolve prétratamento, hidrólise enzimática (sacarificação), e fermentação.
O processamento de material celulósico de acordo com a presente invenção pode ser conseguido usando processos convencionais na arte. Além disso, os métodos da presente invenção podem ser implementados usando qualquer aparelho de processamento de biomassa convencional configurado para operar de acordo com a invenção.
Hidrólise (sacarificação) e fermentação, separadas ou simultâneas, incluem, mas não são limitadas a, hidrólise e fermentação (SHF) separadas; sacarificação e fermentação (SSF) simultâneas; sacarificação e co72 fermentação (SSCF) simultâneas; hidrólise e fermentação (HHF) híbridas; hidrólise e co-fermentação (SHCF) separadas; hidrólise e fermentação (HHCF) híbridas; e conversão microbiana direta (DMC). SHF usa etapas de processo separadas para primeiro enzimaticamente hidrolisar material celulósico para açúcares fermentáveis, por exemplo, glicose, celobiose, celotriose, e açúcares de pentose, e então fermentar os açúcares fermentáveis para etanol. Em SSF, a hidrólise enzimática de material celulósico e a fermentação de açúcares para etanol são combinadas em uma etapa (Philippidis, G. P., 1996, Celullose bioconversion technology, in Handbook on Bioetanol: Production and Utilization, Wyman, C. E., ed., Taylor & Francis, Washington, DC, 179-212). SSCF envolve a co-fermentação de múltiplos açúcares (Sheehan, J., e Himmel, M., 1999, Enzymes, energy and the environment: A strategic perspective on the U.S. Department of Energy’s research and development activities for bioethanol, Biotechnol. Prog. 15: 817827). HHF envolve uma etapa de hidrólise separada, e em adição a etapa de sacarificação e hidrólise simultânea, que pode ser efetuada no mesmo reator. As etapas em um processo HHF podem ser efetuadas em diferentes temperaturas, isto é, sacarificação enzimática de elevada temperatura seguido por SSF em uma menor temperatura que a cepa de fermentação pode tolerar. DMC combina todos três processos (produção de enzima, hidrólise, e fermentação) em uma ou mais (várias) etapas onde o mesmo organismo é usado para produzir as enzimas para conversão do material celulósico para açúcares fermentáveis e para converter os açúcares fermentáveis em um produto final (Lynd, L. R., Weimer, P. J., van Zyl, W. H., e Pretorius, I. S., 2002, Microbial celullose utilization: Fundamentais and biotechnology, Microbiol. Mol. Biol. Reviews 66: 506-577). É entendido aqui que quaisquer métodos conhecidos na arte compreendendo pré-tratamento, hidrólise enzimática (sacarificação), fermentação, ou uma combinação dos mesmos, pode ser usado na prática dos métodos da presente invenção.
Um aparelho convencional pode incluir um reator agitado de partida alimentada, um reator agitado de partida, um reator agitado de fluxo contínuo com ultrafiltração, e/ou um reator de coluna de fluxo por plugue contínuo (Fernanda de Castilhos Corazza, Flávio Faria de Moraes, Gisella Maria Zanin e Ivo Neitzel, 2003, Optimal control in fed-batch reactor for the celobiose hydrolisis, Acta Scientiarum. Technology 25: 33-38; Gusakov, A. V., e Sinitsyn, A. P., 1985, Kinetics of the enzymatic hydrolysis of cellulose:
1. A mathematical model for a batch reactor process, Enz. Microb. Technol. 7: 346-352), um reator de atrito (Ryu, S. K., e Lee, J. M., 1983, Bioconversion of waste celullose by using an attrition bioreactor, Biotechnol. Bioeng. 25: 5365), ou um reator com agitação intensiva induzida por um campo eletromagnético (Gusakov, A. V., Sinitsyn, A. P., Davydkin, I. Y., Davydkin, V. Y., Protas, Ο. V., 1996, Enhancement of enzymatic cellulose hydrolysis using a novel type of bioreactor with intensive stirring induced by electromagnetic field, Appl. Biochem. Biotechnol. 56: 141-153). Tipos de reator adicionais: leito fluidizado, lençol de fluxo ascendente, imobilizado, e reatores tipo extrusora para hidrólise e/ou fermentação.
Pré-tratamento. Em praticar os métodos da presente invenção, qualquer processo de pré-tratamento conhecido na arte pode ser usado para romper componentes de parede de célula de planta de material celulósico (Chandra et al., 2007, Substrate pretreatment: The key to effective enzymatic hydrolysis of lignocellulosics? Adv. Biochem. Engin./Biotechnol. 108: 67-93; Galbe e Zacchi, 2007, Pretreatment of lignocellulosic materiais for efficient bioethanol production, Adv. Biochem. Engin. / Biotechnol. 108: 41-65; Hendriks e Zeeman, 2009, Pretreatments to enhance the digestibility of lignocellulosic biomass, Bíoresource Technol. 100: 10-18; Mosier et al., 2005, Features of promising technologies for pretreatment of lignocellulosic biomass, Bíoresource Technol. 96: 673-686; Taherzadeh e Karimi, 2008, Pretreatment of lignocellulosic wastes to improve ethanol and biogas production: A review, Int. J. ofMol. Sei. 9: 1621-1651; Yang e Wyman, 2008, Pretreatment: the key to unlocking low-cost cellulosic ethanol, Biofuels Bioproducts andBiorefining-Biofpr. 2: 26-40).
O material celulósico pode também ser submetido a redução de tamanho de partícula, pré-embebimento, molhamento, lavagem, ou condicionamento antes de pré-tratamento usando métodos conhecidos na arte.
Pré-tratamentos convencionais incluem, mas não são limitadas a, pré-tratamento de vapor (com ou sem explosão), pré-tratamento de ácido diluído, pré-tratamento de água, pré-tratamento alcalino, pré-tratamento de cal, oxidação úmida, explosão úmida, explosão de fibra de amônia, prétratamento com organosolv, e pré-tratamento biológico. Pré-tratamentos adicionais incluem pré-tratamentos de percolação de amônia, ultrassom, eletroporação, microondas, CO2 supercrítico, H2O supercrítico, ozônio, e irradiação gama.
O material celulósico pode ser pré-tratado antes de hidrólise e/ou fermentação. Pré-tratamento é preferivelmente realizado antes da hidrólise. Altemativamente, o pré-tratamento pode ser efetuado simultaneamente com enzima hidrólise para liberar açúcares fermentáveis, como glicose, xilose, e/ou celobiose. Na maioria dos casos a etapa de prétratamento por si só resulta em alguma conversão de biomassa a açúcares fermentáveis (mesmo em ausência de enzimas).
Pré-tratamento com vapor. Em pré-tratamento com vapor, material celulósico é aquecido para romper componentes de parede de célula de planta, incluindo lignina, hemicelulose, e celulose para fazer a celulose e outras frações, por exemplo, hemicelulose, acessíveis a enzimas. Material celulósico é passado para ou através de um vaso de reação onde vapor é injetado para aumentar a temperatura para a temperatura requerida e pressão e é retida aqui para o tempo de reação desejado. Pré-tratamento de vapor é preferivelmente feito a 140-230°C, mais preferivelmente 160-200°C, e o mais preferivelmente 170-190°C, onde a faixa de temperatura ótima depende de qualquer adição de um catalisador químico. Tempo de residência para o prétratamento de vapor é preferivelmente 1-15 minutos, mais preferivelmente 312 minutos, e o mais preferivelmente 4-10 minutos, onde o tempo de residência ótimo depende da faixa de temperatura e qualquer adição de um catalisador químico. Pré-tratamento de vapor permite para cargas de sólidos relativamente elevadas, de modo que material celulósico é geralmente apenas úmido durante o pré-tratamento. O pré-tratamento de vapor é frequentemente combinado com uma descarga explosiva do material após o pré-tratamento, que é conhecida como explosão de vapor, que é uma destilação instantânea rápida para pressão atmosférica e fluxo turbulento do material para aumentar a área de superfície acessível por fragmentação (Duff e Murray, 1996, Bioresource Technology 855: 1-33; Galbe e Zacchi, 2002, Appl. Microbíol. Biotechnol. 59: 618-628; Pedido de patente US No. 20020164730). Durante pré-tratamento de vapor, grupos acetil hemicelulose são clivados e o ácido resultante autocatalisa a hidrólise parcial da hemicelulose para monossacarídeos e oligossacarídeos. Lignina é removida para apenas uma extensão limitada.
Um catalisador como H2SO4 ou SO2 (tipicamente 0,3 a 3% peso/peso) é frequentemente adicionado antes de pré-tratamento de vapor, que diminui o tempo e temperatura, aumenta a recuperação, e melhora hidrólise enzimática (Ballesteros et al., 2006, Appl. Biochem. Biotechnol. 129-132: 496-508; Varga et al., 2004, Appl. Biochem. Biotechnol. 113-116: 509-523;. Sassner et al., 2006, Enzima Microb. Technol. 39: 756-762).
Pré-tratamento químico: O termo “tratamento químico” referese a qualquer pré-tratamento químico que promove a separação e/ou liberação de celulose, hemicelulose, e/ou lignina. Exemplos de processos de prétratamento químico apropriados incluem, por exemplo, pré-tratamento de ácido diluído, pré-tratamento com cal, oxidação úmida, explosão com congelamento de fibra de amônia (tipo AFEX), percolação de amônia (APR), e pré-tratamentos de organosolv.
Em pré-tratamento de ácido diluído, material celulósico é misturado com ácido diluído, tipicamente H2SO4, e água para formar uma pasta fluida, aquecida por vapor para a temperatura desejada, e após um tempo de residência, destilada instantaneamente em pressão atmosférica. O pré-tratamento de ácido diluído pode ser realizado com um número de projetos de reator, por exemplo, reator de fluxo por plugue, reatores contracorrente, ou reatores de leito de contração contra-corrente contínua (Duff e Murray, 1996, supra; Schell et al., 2004, Bioresource Technol. 91: 179-188; Lee et al., 1999, Adv. Biochem. Eng. Biotechnol. 65: 93-115).
Vários métodos de pré-tratamento sob condições alcalinas podem também ser usados. Esses pré-tratamentos alcalinos incluem, mas não são limitadas a, pré-tratamento de cal, oxidação úmida, percolação de amônia (APR), e explosão com congelamento de fibra de amônia (tipo AFEX).
O pré-tratamento com cal é realizado com carbonato de cálcio, hidróxido de sódio, ou amônia em temperaturas baixas de 85-150°C e tempo de residências de 1 hora para vários dias (Wyman et al., 2005, Bioresource Technol. 96: 1959-1966; Mosier et al., 2005, Bioresource Technol. 96: 673686). WO 2006/110891, WO 2006/11899, WO 2006/11900, e WO 2006/110901 descrevem métodos de pré-tratamento usando amônia.
Oxidação úmida é um pré-tratamento térmico realizado tipicamente a 180-200°C por 5-15 minutos com adição de um agente oxidante como peróxido de hidrogênio ou sobre pressão de oxigênio (Schmidt e Thomsen, 1998, Bioresource Technol. 64: 139-151; Palonen et al., 2004, Appl. Biochem. Biotechnol. 117: 1-17; Varga et al., 2004, Biotechnol. Bioeng. 88: 567-574; Martin et al., 2006, J. Chem. Technol. Biotechnol. 81: 16691677). O pré-tratamento é realizado a preferivelmente 1-40% de matéria seca, mais preferivelmente 2-30% de matéria seca, e o mais preferivelmente 5-20% de matéria seca, e frequentemente o pH inicial é aumentado pela adição de alcalino como carbonato de sódio.
A modificação do método de pré-tratamento de oxidação úmida, conhecida como explosão úmida (combinação de oxidação úmida e explosão de vapor), pode manusear matéria seca até 30%. Em explosão úmida, o agente oxidante é introduzido durante pré-tratamento após um certo tempo de residência. O pré-tratamento é então terminado por destilação instantânea em pressão atmosférica (WO 2006/032282).
Explosão de fibra de amônia (AFEX) envolve tratar material celulósico com amônia líquida ou gasosa em moderadas temperaturas como 90-100°C e elevada pressão como 17-20 bar por 5-10 minutos, onde o teor de matéria seca pode ser tão elevada quanto 60% (Gollapalli et al., 2002, Appl. Biochem. Biotechnol. 98: 23-35; Chundawat et al., 2007, Biotechnol. Bioeng. 96: 219-231; Alizadeh et al., 2005, Appl. Biochem. Biotechnol. 121: 11331141; Teymouri et al., 2005, Bioresource Technol. 96: 2014-2018). Prétratamento de AFEX resulta na despolimerização de celulose e hidrólise parcial de hemicelulose. Complexos de lignina-carboidrato são clivados.
Pré-tratamento com organosolv deslignifica material celulósico por extração usando etanol aquoso (40-60% etanol) a 160-200°C por 30-60 minutos (Pan et al., 2005, Biotechnol. Bioeng. 90: 473-481; Pan et al., 2006, Biotechnol. Bioeng. 94: 851-861; Kurabi et al., 2005, Appl. Biochem. Biotechnol. 121: 219-230). Ácido sulfúrico é geralmente adicionado como um catalisador. Em pré-tratamento de organosolv, a maior parte de hemicelulose é removida.
Outros exemplos de métodos de pré-tratamento apropriados são descritos por Schell et al., 2003, Appl. Biochem. and Biotechnol. Vol. 105-108, p. 69-85, e Mosier et al., 2005, Bioresource Technology 96: 673686, e Pedido Publicado de U.S 2002/0164730.
Em um aspecto, o pré-tratamento químico é preferivelmente efetuado como um tratamento de ácido, e mais preferivelmente como um tratamento de ácido diluído e/ou brando contínuo. O ácido é tipicamente ácido sulfurico, mas outros ácidos podem também ser usados, como ácido acético, ácido cítrico, ácido nítrico, ácido fosfórico, ácido tartárico, ácido succínico, cloreto de hidrogênio, ou misturas dos mesmos. Tratamento de ácido brando é conduzido na faixa de pH de preferivelmente 1-5, mais preferivelmente 1-4, e o mais preferivelmente 1-3. Em um aspecto, a concentração de ácido está na faixa de preferivelmente 0,01 a 20 % em peso de ácido, mais preferivelmente 0,05 a 10 % em peso de ácido, ainda mais preferivelmente 0,1 a 5 % em peso de ácido, e o mais preferivelmente 0,2 a 2,0 % em peso de ácido. O ácido é contatado com material celulósico e mantido a uma temperatura na faixa de preferivelmente 160-220°C, e mais preferivelmente 165-195°C, por períodos variando de segundos a minutos a, por exemplo, 1 segundo a 60 minutos.
Em outro aspecto, pré-tratamento é efetuado como uma etapa de explosão de fibra de amônia (etapa de pré-tratamento de AFEX).
Em outro aspecto, pré-tratamento ocorre em uma pasta fluida aquosa. Em aspectos preferidos, material celulósico está presente durante prétratamento em quantidades preferivelmente entre 10-80 % em peso, mais preferivelmente entre 20-70 % em peso, e o mais preferivelmente entre 30-60 % em peso, como em tomo de 50 % em peso. O material celulósico prétratado pode ser não lavada ou lavado usando quaisquer métodos conhecidos na arte, por exemplo, lavado com água.
Pré-tratamento mecânico: O termo “pré-tratamento mecânico” refere-se a vários tipos de moagem ou trituração (por exemplo, moagem a seco, moagem em umidade, ou moagem de esfera vibratória).
Pré-tratamento físico: O termo “pré-tratamento físico” referese a qualquer pré-tratamento que promove a separação e/ou liberação de celulose, hemicelulose, e/ou lignina de material celulósico. Por exemplo, prétratamento físico pode envolver irradiação (por exemplo, irradiação microondas), vaporização/explosão de vapor, hidrotermólise, e combinações dos mesmos.
Pré-tratamento físico pode envolver pressão elevada e/ou temperatura elevada (explosão de vapor). Em um aspecto, pressão elevada significa pressão na faixa de preferivelmente cerca de 21 kg/cm a cerca de 42 kg/cm , mais preferivelmente cerca de 24 a cerca de 38,6 kg/cm , e o mais preferivelmente cerca de 28 a cerca de 35 kg/cm , como em tomo de 31,6 kg/cm2. Em outro aspecto, temperatura elevada significa temperaturas na faixa de cerca de 100 a cerca de 300°C, preferivelmente cerca de 140 a cerca de 235°C. Em um aspecto preferido, pré-tratamento mecânico é realizado em um processo de partida, sistema hidrolisador de vapor que usa pressão elevada e temperatura elevada como definido acima, por exemplo, um Hidrolisador Sunds disponível de Sunds Defibrator AB, Suécia.
Pré-tratamento físico e químico combinados: Material celulósico pode ser pré-tratado ambos, fisicamente e quimicamente. Por exemplo, a etapa de pré-tratamento pode envolver tratamento de ácido diluído ou brando e temperatura elevada e/ou tratamento de pressão. O prétratamentos físico e químico podem ser efetuados sequencialmente ou simultaneamente, como desejado. Um pré-tratamento mecânico pode também ser incluído.
Assim, em um aspecto preferido, material celulósico é submetido a pré-tratamento mecânico, químico, ou físico, ou qualquer combinação dos mesmos, para promover a separação e/ou liberação de celulose, hemicelulose, e/ou lignina.
Pré-tratamento biológico: O termo ”pré-tratamento biológico” refere-se a qualquer pré-tratamento biológico que promove a separação e/ou liberação de celulose, hemicelulose, e/ou lignina de material celulósico. Técnicas de pré-tratamento biológico podem envolver aplicar microorganismos solubilizando lignina (ver, por exemplo, Hsu, T.-A., 1996,
Pretreatment of biomass, em Handbook on Bioethanol: Production and Utilization, Wyman, C. E., ed., Taylor & Francis, Washington, DC, 179-212; Ghosh e Singh, 1993, Physicochemical and biological treatments for enzymatic/microbial conversion of cellulosic biomass, Adv. Appl. Microbiol. 39: 295-333; McMillan, J. D., 1994, Pretreating lignocellulosic biomass: a review, in Enzymatic Conversion of Biomass for Fuels Production, Himmel, Μ. E., Baker, J. O., e Overend, R. P., eds., ACS Symposium Series 566, American Chemical Society, Washington, DC, chapter 15; Gong, C. S., Cao, N. J., Du, J., e Tsao, G. T., 1999, Ethanol production from renewable resources, in Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology, Scheper, T., ed., Springer-Verlag Berlin Heidelberg, Germany, 65: 207-241; Olsson e Hahn-Hagerdal, 1996, Fermentation of lignocellulosic hydrolysates for ethanol production, Enz. Microb. Tech. 18: 312-331; e Vallander e Eriksson, 1990, Production of ethanol from lignocellulosic materiais: State of the art, Adv. Biochem. Eng./Biotechnol. 42: 63-95).
Sacarificação. Na etapa de hidrólise, também conhecida como sacarificação, o material celulósico pré-tratado é hidrolisado para quebrar celulose e altemativamente também hemicelulose para açúcares fermentáveis, como glicose, celobiose, xilose, xilulose, arabinose, manose, galactose, e/ou oligossacarídeos solúveis. A hidrólise é realizada enzimaticamente por uma composição de enzima na presença de um polipeptídeo tendo atividade de intensificação celulolítica da presente invenção. A composição pode ainda compreender uma ou mais (várias) enzima hemicelulolíticas. As enzimas das composições podem também ser adicionadas sequencialmente.
Hidrólise enzimática é preferivelmente efetuada em um ambiente aquoso apropriado sob condições que podem ser prontamente determinadas por um versado na arte. Em um aspecto preferido, hidrólise é realizada sob condições apropriadas para a atividade da(s) enzima(s), isto é, ótima para enzima(s). A hidrólise pode ser efetuada como um processo de partida alimentada ou contínua onde o material celulósico pré-tratado (substrato) é alimentado gradualmente a, por exemplo, uma enzima contendo solução de hidrólise.
A sacarificação é geralmente realizada em reatores de tanque agitado ou fermentadores sob pH controlada, temperatura, e condições de mistura. Tempo de processo apropriado, temperatura e condições de pH podem prontamente ser determinadas por um versado na arte. Por exemplo, uma sacarificação pode durar até 200 horas, mas é tipicamente realizada por preferivelmente cerca de 12 a cerca de 96 horas, mais preferivelmente cerca de 16 a cerca de 72 horas, e o mais preferivelmente cerca de 24 a cerca de 48 horas. A temperatura é na faixa de preferivelmente cerca de 25°C a cerca de 70°C, mais preferivelmente cerca de 30°C a cerca de 65°C, e mais preferivelmente cerca de 40°C a 60°C, em particular cerca de 50°C. O pH é na faixa de preferivelmente cerca de 3 a cerca de 8, mais preferivelmente cerca de 3,5 a cerca de 7, e o mais preferivelmente cerca de 4 a cerca de 6, em particular cerca de pH 5. O teor de sólidos secos é na faixa de preferivelmente cerca de 5 a cerca de 50 % em peso, mais preferivelmente cerca de 10 a cerca de 40 % em peso, e o mais preferivelmente cerca de 20 a cerca de 30 % em peso.
A composição de enzima preferivelmente compreende enzimas tendo atividade celulolítica e/ou atividade de degradação de xilano. Em um aspecto, a composição de enzima compreende uma ou mais (várias) enzimas celulolíticas. Em outro aspecto, a composição de enzima compreende uma ou mais (várias) enzimas de degradação de xilano. Em outro aspecto, a composição de enzima compreende uma ou mais (várias) enzimas celulolíticas e uma ou mais (várias) enzimas de degradação de xilano.
A uma ou mais (várias) enzimas celulolíticas são preferivelmente selecionadas dentre o grupo consistindo de uma endoglucanase, uma celobiohidrolase, e uma beta-glucosidase. A uma ou mais (várias) enzimas de degradação de xilano são preferivelmente selecionadas dentre o grupo consistindo de uma xilanase, uma acetixilano esterase, uma feruloil esterase, uma arabinofuranosidase, uma xilosidase, e uma glucuronidase.
Em outro aspecto, a composição de enzima pode ainda ou mesmo ainda compreender uma ou mais (várias) atividades de enzima adicionais para melhorar a degradação do material contendo celulose. Enzimas adicionadas preferidas são hemicelulases (por exemplo, alfa-Dglucuronidases, alfa-L-arabinofuranosidases, endo-mananases, betamannosidases, alfa-galactosidases, endo-alfa-L-arabinanases, betagalactosidases), carboidrato-esterases (por exemplo, acetil-xilano esterases, acetil-manano esterases, ácido ferúlico esterases, ácido cumárico esterases, glucuronoil esterases), pectinases, proteases, enzimas ligninolíticas (por exemplo, lacases, manganês peroxidases, lignina peroxidases, enzimas produtoras de H2O2, oxidoreductases), expansinas, swoleninas, ou misturas dos mesmos. Nos métodos da presente invenção, a(s) enzima(s) adicional(is) pode ser adicionada antes de ou durante fermentação, por exemplo, durante sacarificação ou durante ou após propagação do(s) microorganismo(s) de fermentação(s).
Um ou mais (vários) componentes da composição de enzima pode ser proteínas tipo selvagem, proteínas recombinantes, ou uma combinação de proteínas tipo selvagem e proteínas recombinantes. Por exemplo, um ou mais (vários) componentes pode ser proteínas nativas de uma célula, que é usado como uma célula hospedeira para expressar recombinantemente um ou mais (vários) outros componentes da composição de enzima. Um ou mais (vários) componentes da composição de enzima pode ser produzido como monocomponentes, que são então combinados para formar a composição de enzima. A composição de enzima pode ser uma combinação de preparações de proteína multicomponente e monocomponente.
As enzimas usadas nos métodos da presente invenção podem ser em qualquer forma apropriada para uso nos processos descritos aqui, como, por exemplo, uma fermentação cru com ou sem células removidas, um preparação de enzima semi-purificada ou purificada, ou uma célula hospedeira como fonte das enzimas. A composição de enzima pode ser um pó seco ou granulado, um granulado de não varredura, um líquido, um líquido estabilizado, ou uma enzima protegida estabilizada. Preparações de enzima líquida podem, por exemplo, ser estabilizadas adicionando estabilizadores como um açúcar, um açúcar álcool ou outro poliol, e/ou ácido lático ou outro ácido de acordo com processos estabelecidos.
As quantidades ótimas das enzimas e polipeptídeos tendo atividade de intensificação celulolítica dependem de vários fatores incluindo, mas não limitado a, uma mistura de enzimas celulolíticas de componente, os substratos celulósicos, a concentração de substratos celulósicos, o(s) prétratamento(s) dos substratos celulósicos, temperatura, tempo, pH, e inclusão de organismo de fermentação (por exemplo, levedura para sacarificação e fermentação simultâneas).
Em um aspecto preferido, uma quantidade efetiva de enzima(s) celulolítica(s) para material celulósico é cerca de 0,5 a cerca de 50 mg, preferivelmente a cerca de 0,5 a cerca de 40 mg, mais preferivelmente a cerca de 0,5 a cerca de 25 mg, mais preferivelmente a cerca de 0,75 a cerca de 20 mg, mais preferivelmente a cerca de 0,75 a cerca de 15 mg, ainda mais preferivelmente a cerca de 0,5 a cerca de 10 mg, e o mais preferivelmente a cerca de 2.5 a cerca de 10 mg por g de material celulósico.
Em outro aspecto preferido, uma quantidade efetiva de polipeptídeo(s) tendo atividade de intensificação celulolítica para material celulósico é cerca de 0,01 a cerca de 50,0 mg, preferivelmente cerca de 0,01 a cerca de 40 mg, mais preferivelmente cerca de 0,01 a cerca de 30 mg, mais preferivelmente cerca de 0,01 a cerca de 20 mg, mais preferivelmente cerca de 0,01 a cerca de 10 mg, mais preferivelmente cerca de 0,01 a cerca de 5 mg, mais preferivelmente a cerca de 0,025 a cerca de 1,5 mg, mais preferivelmente a cerca de 0,05 a cerca de 1,25 mg, mais preferivelmente a cerca de 0,075 a cerca de 1,25 mg, mais preferivelmente a cerca de 0,1 a cerca de 1,25 mg, ainda mais preferivelmente a cerca de 0,15 a cerca de 1,25 mg, e o mais preferivelmente a cerca de 0,25 a cerca de 1,0 mg por g de material celulósico.
Em outro aspecto preferido, uma quantidade efetiva de polipeptídeo(s) tendo atividade de intensificação celulolítica para enzima(s) celulolítica(s) é cerca de 0,005 a cerca de 1,0 g, preferivelmente a cerca de 0,01 a cerca de 1,0 g, mais preferivelmente a cerca de 0,15 a cerca de 0,75 g, mais preferivelmente a cerca de 0,15 a cerca de 0,5 g, mais preferivelmente a cerca de 0,1 a cerca de 0,5 g, ainda mais preferivelmente a cerca de 0,1 a cerca de 0,5 g, e o mais preferivelmente a cerca de 0,05 a cerca de 0,2 g por g de enzima(s) celulolítica(s).
As enzimas podem ser derivadas ou obtidas a partir de qualquer origem apropriada, incluindo, origem em bactérias, fungos, levedura, planta, ou mamífero. O termo “obtido” significa aqui que a enzima foi isolado de um organismo que naturalmente produz a enzima como uma enzima nativa. O termo “obtido” também significa aqui que a enzima pode ter sido produzida recombinantemente em um organismo hospedeiro empregando métodos descritos aqui, em que a enzima recombinantemente produzida é ou nativa ou estranha para o organismo hospedeiro ou tem uma sequência de aminoácidos modificada, por exemplo, tendo um ou mais (vários) aminoácidos que são deletados, inseridos e/ou substituídos, isto é, uma enzima recombinantemente produzida que é um mutante e/ou um fragmento de uma sequência nativa de aminoácidos ou uma enzima produzida por processos de embaralhamento de ácido nucléico conhecidos na arte. Englobadas dentro do significado de uma enzima nativa estão as variantes naturais e dentro do significado e uma enzima estranha estão as variantes obtidas recombinantemente, como por mutagenese sítio- dirigido ou embaralhamento.
Um polipeptídeo tendo atividade de enzima celulolítica ou atividade de degradação de xilano pode ser um polipeptídeo bacteriano. Por exemplo, o polipeptídeo pode ser um polipeptídeo bacteriano gram positivo como um polipeptídeo de Bacillus, Streptococcus, Streptomyces, Staphylococcus, Enterococcus, Lactobacillus, Lactococcus, Clostridium, Geobacillus, ou Oceanobacillus tendo atividade de enzima celulolítica ou atividade de degradação de xilano, ou um polipeptídeo bacteriano Gram negativo como um polipeptídeo de E. coli, Pseudomonas, Salmonella, Campylobacter, Helicobacter, Flavobacterium, Fusobacterium, Ilyobacter, Neisseria, ou Ureaplasmum tendo atividade de enzima celulolítica ou atividade de degradação de xilano.
Em um aspecto preferido, o polipeptídeo é um polipeptídeo de Bacillus alkalophilus, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus brevis, Bacillus circulans, Bacillus clausii, Bacillus coagulans, Bacillus firmus, Bacillus lautus, Bacillus lentus, Bacillus licheniformis, Bacillus megaterium, Bacillus pumilus, Bacillus stearothermophilus, Bacillus subtilis, ou Bacillus thuringiensis tendo atividade de enzima celulolítica ou atividade de degradação de xilano.
Em outro aspecto preferido, o polipeptídeo é um polipeptídeo de Streptococcus equisimilis, Streptococcus pyogenes, Streptococcus uberis, ou Streptococcus equi subsp. Zooepidemicus tendo atividade de enzima celulolítica ou atividade de degradação de xilano.
Em outro aspecto preferido, o polipeptídeo é um polipeptídeo de Streptomyces achromogenes, Streptomyces avermitilis, Streptomyces coelicolor, Streptomyces griseus, ou Streptomyces lividans tendo atividade de enzima celulolítica ou atividade de degradação de xilano.
O polipeptídeo tendo atividade de enzima celulolítica ou atividade de degradação de xilano também pode ser um polipeptídeo de fungo, e mais preferivelmente um polipeptídeo de levedura como um polipeptídeo de Candida, Kluyveromyces, Pichia, Saccharomyces,
Schizosaccharomyces, ou Yarrowium tendo atividade de enzima celulolítica ou atividade de degradação de xilano; ou mais preferivelmente um polipeptídeo de fungo filamentoso como um polipeptídeo de Acremonium, Agarícus, Alternaria, Aspergillus, Aureobasidium, Botryospaeria, Ceriporiopsis, Chaetomidium, Chrysosporíum, Claviceps, Cochliobolus,
Coprinopsis, Coptotermes, Corynascus, Cryphonectría, Cryptococcus, Diplodia, Exidia, Filibasidium, Fusarium, Gibberella, Holomastigotoides, Humicola, Irpex, Lentinula, Leptospaeria, Magnaporthe, Melanocarpus, Meripilus, Mucor, Myceliophthora, Neocallimastíx, Neurospora, Paecilomyces, Penicillium, Phanerochaete, Piromyces, Poitrasia,
Pseudoplectania, Pseudotrichonympha, Rhizomucor, Schizophyllum,
Scytalidium, Talaromyces, Thermoascus, Thielavia, Tolypocladium,
Trichoderma, Trichophaea, Verticillium, Volvariella, ou Xilarium tendo atividade de enzima celulolítica ou atividade de degradação de xilano.
Em um aspecto preferido, o polipeptídeo é um polipeptídeo de
Saccharomyces carlsbergensis, Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces diastaticus, Saccharomyces douglasii, Saccharomyces kluyveri, Saccharomyces norbensis, ou Saccharomyces oviformis tendo atividade de enzima celulolítica ou atividade de degradação de xilano.
Em outro aspecto preferido, o polipeptídeo é um polipeptídeo de Acremonium cellulolyticus, Aspergillus aculeatus, Aspergillus awamori, Aspergillus fumigatus, Aspergillus foetidus, Aspergillus japonicus, Aspergillus nidulans, Aspergillus niger, Aspergillus oryzae, Chrysosporium keratinophilum, Chrysosporium lucknowense, Chrysosporium tropicum, Chrysosporium merdarium, Chrysosporium inops, Chrysosporíum pannicola,
Chrysosporium queenslandicum, Chrysosporium zonatum, Fusarium bactridioides, Fusarium cerealis, Fusarium crookwellense, Fusarium culmorum, Fusarium graminearum, Fusarium graminum, Fusarium heterosporum, Fusarium negundi, Fusarium oxisporum, Fusarium reticulatum, Fusarium roseum, Fusarium sambucinum, Fusarium sarcochroum, Fusarium sporotrichioides, Fusarium sulphureum, Fusarium torulosum, Fusarium trichothecioides, Fusarium venenatum, Humicola grisea, Humicola insolens, Humicola lanuginosa, Irpex lacteus, Mucor miehei, Myceliophthora thermophila, Neurospora crassa, Penicillium funiculosum, Penicillium purpurogenum, Phanerochaete chrysosporium, Thielavia achromatica, Thielavia albomyces, Thielavia albopilosa, Thielavia australeinsis, Thielavia fimeti, Thielavia microspora, Thielavia ovispora, Thielavia peruviana, Thielavia spededonium, Thielavia setosa, Thielavia subthermophíla, Thielavia terrestris, Trichoderma harzianum, Trichoderma koníngii, Trichoderma longibrachiatum, Trichoderma reesei, Trichoderma viride, ou Trichophaea saccatum tendo atividade de enzima celulolítica ou atividade de degradação de xilano.
Os mutantes quimicamente modificados ou engenheirados com proteínas de polipeptídeos tendo atividade de enzima celulolítica ou atividade de degradação de xilano também podem ser usados.
Uma ou mais (vários) componentes da composição de enzima podem ser um componente recombinante, isto é, produzido por clonagem de uma sequência de DNA codificando o componente único e célula transformada subsequente com a sequência de DNA e expressado em um hospedeiro (ver, por exemplo, WO 91/17243 e WO 91/17244). O hospedeiro é preferivelmente um hospedeiro heterólogo (enzima é estranha para o hospedeiro), mas o hospedeiro pode sob certas condições também ser um hospedeiro homólogo (enzima é nativa para hospedeiro). As proteínas celulolíticas monocomponentes também podem ser preparadas por purificação desta proteína a partir do caldo de fermentação.
Exemplos de preparações de proteína celulolítica apropriadas para uso na presente invenção incluem, por exemplo, CELLIC™ Ctec (Novozymes A/S), CELUCLAST™ (Novozymes A/S), NOVOZYM™ 188 (Novozymes A/S), CELUZYME™ (Novozymes A/S), CEREFLO™ (Novozymes A/S), e ULTRAFLO™ (Novozymes A/S), ACCELERASE™ (Genencor Int.), LAMINEX™ (Genencor Int.), SPEZYME™ CP (Genencor Int.), ROHAMENT™ 7069 W (Rohm GmbH), FIBREZYME® LDI (Dyadic International, Inc.), FIBREZYME® LBR (Dyadic International, Inc.), ou VISCOSTAR® 150L (Dyadic International, Inc.). As enzimas celulase são adicioandas em quantidades efetivas de cerca de 0,001 a cerca de 5,0 % em peso de sólidos, mais preferivelmente de cerca de 0,025 a cerca de 4,0 % em peso de sólidos, e o mais preferivelmente de cerca de 0,005 a cerca de 2,0 % em peso de sólidos. As enzimas celulase são adicionadas em quantidades efetivas de cerca de 0,001 a cerca de 5,0 % em peso de sólidos, mais preferivelmente de cerca de 0,025 a cerca de 4,0% em peso de sólidos, e o mais preferivelmente de cerca de 0,005 a cerca de 2,0 % em peso de sólidos.
Exemplos de endoglucanases bacterianas que podem ser usadas nos métodos da presente invenção, incluem mas não são limitadas a, uma Acídothermus cellulolytícus endoglucanase (WO 91/05039; WO 93/15186; Patente US 5.275.944; WO 96/02551; Patente US 5.536.655, WO 00/70031, WO 05/093050); Thermobifida fusca endoglucanase III (WO 05/093050); e Thermobifida fusca endoglucanase V (WO 05/093050).
Exemplos de endoglucanases de fungos que podem ser usadoas nos métodos da presente invenção, incluem mas não são limitados a, a Trichoderma reesei endoglucanase I (Penttila et al., 1986, Gene 45: 253263; GENBANK™ número de acesso Ml5665); Trichoderma reesei endoglucanase II (Saloheimo, et al., 1988, Gene 63:11-22; GENBANK™ número de acesso M19373); Trichoderma reesei endoglucanase III (Okada et al., 1988, Appl. Environ. Microbiol. 64: 555-563; GENBANK™ número de acesso AB003694); Trichoderma reesei endoglucanase IV (Saloheimo et al., 1997, Eur. J. Biochem. 249: 584-591; GENBANK™ número de acesso Y11113); e Trichoderma reesei endoglucanase V (Saloheimo et al., 1994, Molecular Microbiology 13: 219-228; GENBANK™ número de acesso Z33381); Aspergillus aculeatus endoglucanase (Ooi et al., 1990, Nuclei Acid Research 18: 5884); Aspergillus kawachii endoglucanase (Sakamoto et al., 1995, Current Genetics 2T. 435-439); Erwínia carotovara endoglucanase (Saarilahti et al., 1990, Gene 90: 9-14); Fusarium oxisporum endoglucanase (GENBANK™ número de acesso L29381); Humicola grísea var. thermoidea endoglucanase (GENBANK™ número de acesso AB003107); Melanocarpus albomyces endoglucanase (GENBANK™ número de acesso MAL515703); Neurospora crassa endoglucanase (GENBANK™ número de acesso XM_324477); Humicola insolens endoglucanase V; Myceliophthora thermophila CBS 117.65 endoglucanase; basidiomycete CBS 495.95 endoglucanase; basidiomicete CBS 494.95 endoglucanase; Thielavia terrestris NRRL 8126 CEL6B endoglucanase; Thielavia terrestris NRRL 8126 CEL6C endoglucanase); Thielavia terrestris NRRL 8126 CEL7C endoglucanase; Thielavia terrestris NRRL 8126 CEL7E endoglucanase; Thielavia terrestris NRRL 8126 CEL7F endoglucanase; Cladorrhinum foecundissimum ATCC 62373 CEL7A endoglucanase; e Trichoderma reesei cepa No. VTT-D-80133 endoglucanase (GENBANK™ número de acesso Ml 5665).
Exemplos de celobiohidrolases utilizáveis nos métodos da presente invenção incluem mas não são limitados a, Trichoderma reesei celobiohidrolase I; Trichoderma reesei celobiohidrolase II; Humicola insolens celobiohidrolase I, Myceliophthora thermophila celobiohidrolase II, Thielavia terrestris celobiohidrolase II (CEL6A), Chaetomíum thermophilum celobiohidrolase I, e Chaetomíum thermophilum celobiohidrolase II.
Exemplos de beta-glucosidases utilizáveis nos métodos da presente invenção incluem mas não são limitados a, Aspergillus oryzae betaglucosidase; Aspergillus fumigatus beta-glucosidase; Penicillium brasilianum IBT 20888 beta-glucosidase; Aspergillus niger beta-glucosidase; e Aspergillus aculeatus beta-glucosidase.
O polipeptídeo de Aspergillus oryzae tendo atividade de betaglucosidase pode ser obtido de acordo com WO 2002/095014. O polipeptídeo de Aspergillus fumigatus tendo atividade beta-glucosidase pode ser obtido de acordo com WO 2005/047499. O polipeptídeo de Penicillium brasilianum tendo atividade beta-glucosidase pode ser obtido de acordo com WO 2007/019442. O polipeptídeo de Aspergillus niger tendo atividade betaglucosidase pode ser obtido de acordo com Dan et al., 2000, J. Biol. Chem. 275: 4973-4980. O de polipeptídeo Aspergillus aculeatus tendo atividade de beta-glucosidase pode ser obtido de acordo com Kawaguchi et al., 1996, Gene 173:287-288.
A beta-glucosidase pode ser uma proteína de fusão. Em um aspecto, a beta-glucosidase é a proteína de fusão variante BG de Aspergillus oryzae beta-glucosidase a proteína de fusão de Aspergillus oryzae betaglucosidase obtida de acordo com WO 2008/057637.
Outras endoglucanases, celobiohidrolases, e beta-glucosidases são descritas em numerosas famílias de Glicosil Hidrolase usando a classificação de acordo com Henrissat B., 1991, The classification of glycosyl hidrolases based on amino-acid sequence similarities, Biochem. J. 280: 309316, e Henrissat B., e Bairoch A., 1996, Updating a sequence-based classification of glycosyl hidrolases, Biochem. J. 316: 695-696.
Outras enzimas celulolíticas que podem ser usadas na presente invenção são descritas em EP 495,257, EP 531,315, EP 531,372, WO 89/09259, WO 94/07998, WO 95/24471, WO 96/11262, WO 96/29397, WO 96/034108, WO 97/14804, WO 98/08940, WO 98/012307, WO 98/13465,
WO 98/015619, WO 98/015633, WO 98/028411, WO 99/06574, WO 99/10481, WO 99/025846, WO 99/025847, WO 99/031255, WO 2000/009707, WO 2002/050245, WO 2002/0076792, WO 2002/101078, WO 2003/027306, WO 2003/052054, WO 2003/052055, WO 2003/052056, WO 2003/052057, WO 2003/052118, WO 2004/016760, WO 2004/043980, WO 2004/048592, WO 2005/001065, WO 2005/028636, WO 2005/093050, WO 2005/093073, WO 2006/074005, WO 2006/117432, WO 2007/071818, WO 2007/071820, WO 2008/008070, WO 2008/008793, Patente US 4.435.307, Patente US 5.457.046, Patente US 5.648.263, Patente US 5.686.593, Patente US 5.691.178, Patente US 5.763.254, e Patente US 5.776.757.
Exemplos de preparações de enzima degradando xilano comercial apropriadas para uso na presente invenção incluem, por exemplo, SHEARZYME™ (Novozymes A/S), CELLIC™ Htec (Novozymes A/S), VISCOZYME® (Novozymes A/S), ULTRAFLO® (Novozymes A/S), PULPZYME® HC (Novozymes A/S), MULTIFECT® Xilanase (Genencor), ECOPULP® TX-200A (AB Enzimas), HSP 6000 Xilanase (DSM), DEPOL™ 333P (Biocatalysts Limit, Wales, UK), DEPOL™ 740L. (Biocatalysts Limit, Wales, UK), e DEPOL™ 762P (Biocatalysts Limit, Wales, UK).
Exemplos de xilanases utilizáveis nos métodos da presente invenção incluem mas não são limitados a, Aspergillus aculeatus xilanase (GeneSeqP:AAR63790; WO 94/21785), Aspergillus fumigatus xilanases (WO 2006/078256), e Thielavia terrestris NRRL 8126 xilanases (WO 2009/079210).
Exemplos de beta-xilosidases utilizáveis nos métodos da presente invenção incluem mas não são limitados a, Trichoderma reesei betaxilosidase (UniProtKB/TrEMBL número de acesso Q92458), Talaromyces emersonii (SwissProt número de acesso Q8X212), e Neurospora crassa (SwissProt número de acesso Q7SOW4).
Exemplos de acetilxilano esterases utilizáveis nos métodos da presente invenção incluem mas não são limitados a, Hypocrea jecorina acetilxilano esterase (WO 2005/001036), Neurospora crassa acetilxilano esterase (UniProt número de acesso q7s259), Thielavia terrestris NRRL 8126 acetilxilano esterase (WO 2009/042846), Chaetomium globosum acetilxilano esterase (Uniprot número de acesso Q2GWX4), Chaetomium gracile acetilxilano esterase (GeneSeqP número de acesso AAB82124), Phaeosphaeria nodorum acetilxilano esterase (Uniprot número de acesso Q0UHJ1), e Humicola insolens DSM 1800 acetilxilano esterase (WO 2009/073709).
Exemplos de ácido ferúlico esterases utilizáveis nos métodos da presente invenção incluem mas não são limitados a, Humicola insolens DSM 1800 feruloil esterase (WO 2009/076122), Neurospora crassa feruloil esterase (UniProt número de acesso Q9HGR3), e Neosartoryafischeri feruloil esterase (UniProt Accession number A1D9T4).
Exemplos de arabinofuranosidases utilizáveis nos métodos da presente invenção incluem mas não são limitados a, Humicola insolens DSM 1800 arabinofuranosidase (WO 2009/073383) e Aspergillus niger arabinofuranosidase (GeneSeqP número de acesso AAR94170).
Exemplos de alfa-glucuronidases utilizáveis nos métodos da presente invenção incluem mas não são limitados a, Aspergillus clavatus alfaglucuronidase (UniProt número de acesso alccl 2), Trichoderma reesei alfaglucuronidase (Uniprot número de acesso Q99024), Talaromyces emersonii alfa-glucuronidase (UniProt número de acesso Q8X211), Aspergillus niger alfa-glucuronidase (Uniprot número de acesso Q96WX9), Aspergillus terreus alfa-glucuronidase (SwissProt número de acesso Q0CJP9), e Aspergillus fumigatus alfa-glucuronidase (SwissProt número de acesso Q4WW45).
As enzimas e proteínas usadas nos métodos da presente invenção podem ser produzidas por fermentação das cepas microbianas acima mencionadas em um meio nutriente contendo fontes apropriadas de carbono e nitrogênio e sais inorgânicos, usando procedimentos conhecidos na arte (ver, por exemplo, Bennett, J.W. e LaSure, L. (eds.), More Gene Manipulations in Fungi, Academic Press, CA, 1991). Os meios apropriados são disponíveis de fomecedoes comerciais ou podem ser preparados de acordo com composições publicadas (por exemplo, em catálogos do American Type Culture Collection). As faixas de temperatura e outras condições apropriadas para crescimento e produção de enzima são conhecidas na arte (ver, por exemplo, Bailey, J.E., e Ollis, D.F., Biochemical Engineering Fundamentais, McGrawHill Book Company, NY, 1986).
A fermentação pode ser qualquer método de cultivo de uma célula resultando na expressão ou isolamento de uma enzima. Fermentação pode, assim, ser entendida como compreendendo cultivo em frasco agitado, ou fermentação em pequena ou grande escala (incluindo fermentações contínuas, em batelada, batelada alimentada ou em estado sólido) em fermentadores laboratoriais ou industriais realizadas em um meio apropriado e sob condições permitindo que a enzima seja expressada ou isolada. As enzimas resultantes produzidas pelos métodos descritos acima podem ser recuperadas do meio de fermentação e purificadas por procedimentos convencionais.
Fermentação. Os açúcares fermentáveis obtidos a partir do material celulósico pré-tratado e hidrolisado podem ser fermentados por um ou mais (vários) microorganismos de fermentação capazes de fermentar os açúcares diretamente ou indiretamente em um produto de fermentação desejado. “Fermentação” ou “processo de fermentação” refere-se a qualquer processo de fermentação ou qualquer processo compreendendo uma etapa de fermentação. Os processo de fermentação também incluem processos de fermentação usados na indústria de álcool consumível (por exemplo, cerveja e vinho), indústria de laticínios (por exemplo, laticínios fermentados), indústria de couro e indústria de tabaco. As condições de fermentação dependem do produto de fermentação desejado e organismo de fermentação e podem ser facilmente determinadas por um versado.
Na etapa de fermentação, açúcares, liberados do material celulósico como um resultado das etapas de pré-tratamento e hidrólise enzimática, são fermentados em um produto, por exemplo, etanol, por um organismo de fermentação, como levedura. Hidrólise (sacarificação) e fermentação podem ser separadas ou simultâneas, como descrito aqui.
Qualquer material celulósico apropriado hidrolisado pode ser usado na etapa de fermentação na prática da presente invenção. O material é geralmente selecionado baseado no produto de fermentação desejado, isto é, a substância a ser obtida da fermentação, e o processo empregado, como tal, bem conhecidos na arte.
O termo “meio de fermentação” é entendido aqui para fazer referência a um meio antes do (s) microorganismo(s) de fermentação ser adicionado(s), como um meio resultando de um processo de sacarificação, assim como um meio usado em um processo simultâneo de sacarificação e fermentação (SSF).
“Microorganismo de fermentação” refere-se a qualquer microorganismo, incluindo organismos bacterianos e fúngicos, apropriados para uso em um desejado processo de fermentação para produzir um produto de fermentação. O organismo de fermentação pode ser organismos de fermentação Cô e/ou C5, ou uma combinação dos mesmos. Ambos os organismos de fermentação C6 e C5 são bem conhecidos na arte. Os apropriados microorganismos de fermentação são capazes de fennentar, isto é, converte, açúcares, como glicose, xilose, xilulose, arabinose, maltose, manose, galactose, ou oligossacarídeos, diretamente ou indiretamente no produto de fermentação desejado.
Exemplos de organismos de fermentação bacterianos e fúngicos produzindo etanol são descritos por Lin et al., 2006, Appl.
Microbiol. Biotechnol. 69: 627-642.
Exemplos de microorganismos de fermentação que podem fermentar os açúcares C6 incluem organismos bacterianos e fúngicos, como levedura. A levedura preferida inclui cepas de Saccharomyces spp., preferivelmente Saccharomyces cerevisiae.
Exemplos de organismos de fermentação que podem fermentar açúcares C5 incluem organismos bacterianos e fúngicos, como levedura. As levedura sde fermentação C5 preferidas incluem cepas de Pichia, preferivelmente Pichia stipitis, como Pichia stipitis CBS 5773; cepas de Candida, preferivelmente Candida boidinii, Candida brassicae, Candida sheatae, Candida diddensii, Candida pseudotropicalis, ou Candida utilis.
Outros organismos de fermentação incluem cepas de Zymomonas, como Zymomonas mobilis; Hansenula, como Hansenula anômala; Kluyveromyces, como K. fragilis; Schizosaccharomyces, como S. pombe; e E. coli, especialmente cepas E. coli que foram geneticamente modificadas para melhorar o rendimento de etanol.
Em um aspecto preferido, a levedura é a Saccharomyces spp. Em um aspecto mais preferido, a levedura é Saccharomyces cerevisiae. Em outro aspecto mais preferido, a levedura é Saccharomyces distaticus. Em outro aspecto mais preferido, a levedura é Saccharomyces uvarum. Em outro aspecto preferido, a levedura é a Kluyveromyces. Em outro aspecto mais preferido, a levedura é Kluyveromyces marxianus. Em outro aspecto mais preferido, a levedura é Kluyveromyces fragilis. Em outro aspecto preferido, a levedura é uma Candida. Em outro aspecto mais preferido, a levedura é Candida boidinii. Em outro aspecto mais preferido, a levedura é Candida brassicae. Em outro aspecto mais preferido, a levedura é Candida diddensii. Em outro aspecto mais preferido, a levedura é Candida pseudotropicalis. Em outro aspecto mais preferido, a levedura é Candida utilis. Em outro aspecto preferido, a levedura é a Clavispora. Em outro aspecto mais preferido, a levedura é Clavispora lusitaniae. Em outro aspecto mais preferido, a levedura é Clavispora opuntiae. Em outro aspecto preferido, a levedura é a Pachysolen. Em outro aspecto mais preferido, a levedura é Pachysolen tannophilus. Em outro aspecto preferido, a levedura é a Pichia. Em outro aspecto mais preferido, a levedura é a Pichia stipitis. Em outro aspecto preferido, a levedura é Bretannomyces. Em outro aspecto mais preferido, a levedura é Bretannomyces clausenii (Philippidis, G. P., 1996, Celulose bioconversion technology, in Handbook on Bioetanol: Production and Utilization, Wyman, C. E., ed., Taylor & Francis, Washington, DC, 179-212).
Bactérias que podem efetivamente fermentar hexose e pentose em etanol incluem, por exemplo, Zymomonas mobilis e Clostridium thermocellum (Philippidis, 1996, supra).
Em um aspecto preferido, a bactéria é uma Zymomonas. Em um aspecto mais preferido, a bactéria é Zymomonas mobilis. Em outro aspecto preferido, a bactéria é Clostridium. Em outro aspecto mais preferido, a bactéria é Clostridium thermocellum.
As leveduras comercialmente disponíveis apropriadas para a produção de etanol incluem, por exemplo, leveduras ETANOL RED™ (disponíveis de Fermentis/Lesaffre, USA), FALI™ (disponíveis de Fleischmann’s Yeast, USA), SUPERSTART™ e THERMOSACC™ levedura fresca (disponível de Etanol Technology, Wl, USA), BIOFERM™ AFT e XR (disponível de NABC - North American Bioproducts Corporation, GA, USA), GERT STRAND™ (disponível de Gert Strand AB, Suécia), e FERMIOL™ (disponível de DSM Specialties).
Em um aspecto preferido, o microorganismo de fermentação foi geneticamente modificado para prover a capacidade de fermentar açúcares de microorganismos de pentose, como utilizando xilose, utilizando arabinose, e co-utilizando xilose e arabinose.
A clonagem de genes heterólogos em vários microorganismos de fermentação levou à construção de organismos capazes de converter hexoses e pentoses em etanol (cofermentação) (Chen e Ho, 1993, Cloning and improving the expression of Pichia stipitis xylose reductase gene in Saccharomyces cerevisiae, Appl. Biochem. Biotechnol. 39-40: 135-147; Ho et al., 1998, Genetically engineered Saccharomyces yeast capable of effectively cofermenting glucose and xylose, Appl. Environ. Microbiol. 64: 1852-1859; Kotter and Ciriacy, 1993, Xylose fermentation by Saccharomyces cerevisiae, Appl. Microbiol. Biotechnol. 38: 776-783; Walffidsson et al., 1995, Xylosemetabolizing Saccharomyces cerevisiae strains overexpressing the TKL1 and
TAL1 genes encoding the pentose phosphate pathway enzymes transketolase and transaldolase, Appl. Environ. Microbiol. 61: 4184-4190; Kuyper et al., 2004, Minimal metabolic engineering of Saccharomyces cerevisiae for efficient anaerobic xylose fermentation: a proof of principie, FEMS Yeast Research 4: 655-664; Beall et al., 1991, Parametric studies of ethanol production from xylose and other sugars by recombinant Escherichia coli, Biotech. Bioeng. 38: 296-303; Ingram et al., 1998, Metabolic engineering of bactéria for ethanol production, Biotechnol. Bioeng. 58: 204-214; Zhang et al., 1995, Metabolic engineering of a pentose metabolism pathway in ethanologenic Zymomonas mobílis, Science 26Ί'. 240-243; Deanda et al.,
1996, Development of an arabinose-fermenting Zymomonas mobilis strain by metabolic pathway engineering, Appl. Environ. Microbiol. 62: 4465-4470; WO 2003/062430, xilose isomerase).
Em um aspecto preferido, o microorganismo geneticamente modificado de fermentação é Saccharomyces cerevisiae. Em outro aspecto preferido, o microorganismo geneticamente modificado de fermentação é Zymomonas mobilis. Em outro aspecto preferido, o microorganismo geneticamente modificado de fermentação é Escherichia coli. Em outro aspecto preferido, o microorganismo geneticamente modificado de fermentação é Klebsiella oxitoca. Em outro aspecto preferido, o microorganismo geneticamente modificado de fermentação é Kluyveromyces sp.
E bem conhecido na arte que os organismos descritos acima também podem ser usados para produzir outras substâncias, como descrito aqui.
O microorganismo de fermentação é tipicamente adicionado ao hidrolisado degradado de lignocelulose ou a fermentação é realizada durante cerca de 8 a cerca de 96 horas, como cerca de 24 a cerca de 60 horas. A temperatura está tipicamente entre cerca de 26°C a cerca de 60°C, em particular cerca de 32°C ou 50°C, e a cerca de pH 3 a cerca de pH 8, como em tomo de pH 4-5, 6, ou 7.
Em um aspecto preferido, a levedura e/ou outro microorganismo é aplicado ao material celulósico degradado e a fermentação é realizada durante cerca de 12 a cerca de 96 horas, como tipicamente 24-60 horas. Em um aspecto preferido, a temperatura é preferivelmente entre cerca de 20°C a cerca de 60°C, mais preferivelmente cerca de 25°C a cerca de 50°C, e o mais preferivelmente cerca de 32°C a cerca de 50°C, em particular cerca de 32°C ou 50°C, e o pH é geralmente de cerca de pH 3 a cerca de pH 7, preferivelmente em tomo de pH 4-7. No entanto, alguns organismos de fermentação, por exemplo, bactéria, tem uma maior temperatura ótima de fermentação. Levedura ou outro microorganismo é preferivelmente aplicado em quantidades de aproximadamente 105 a 1012, preferivelmente de
10 8 aproximadamente 10 a 10 , especialmente aproximadamente 2 x 10 contagem de células viáveis por ml de caldo de fermentação. Outra diretriz com relação ao uso de levedura para fermentação pode ser encontrada em, por exemplo, “The Alcohol Textbook” (Editores K. Jacques, T.P. Lyons e D.R. Kelsall, Nottingham University Press, United Kingdom 1999), que é pelo presente incorporado por referência.
Para a produção de etanol, após a fermentação, a pasta fluida fermentada é destilada para extrair o etanol. O etanol obtido de acordo com os métodos da invenção pode ser usado como, por exemplo, etanol combustível, etanol para bebidas, isto é, álcoois neutros potáveis ou etanol industrial.
Um estimulador da fermentação pode ser usado em combinação com qualquer um dos processos descritos aqui para ainda melhorar o processo de fermentação, e em particular, o desempenho do microorganismo de fermentação, como, melhora da taxa e rendimento do etanol. Um “estimulador de fermentação” refere-se a estimuladores para o crescimento dos microorganismos de fermentação, em particular, levedura. Os estimuladores de fermentação preferidos para crescimento incluem vitaminas e minerais. Exemplos de vitaminas incluem multivitaminas, biotina, pantotenato, ácido nicotinico, meso-inositol, tiamina, piridoxina, ácido paraaminobenzóico, ácido fólico, riboflavina e Vitaminas A, B, C, D, e E. Ver, por exemplo, Alfenore et al., Improving ethanol production and viability of Saccharomyces cerevisiae por a vitamin feeding strategy during fed-batch process, Springer-Verlag (2002), que é pelo presente incorporado por referência. Exemplos de minerais incluem minerais e sais de mineral que podem fornecer nutrientes compreendendo P, K, Mg, S, Ca, Fe, Zn, Mn, e Cu.
Produtos de fermentação: Um produto de fermentação pode ser qualquer substância derivada da fermentação. O produto de fermentação pode ser, sem limitação, um álcool (por exemplo, arabinitol, butanol, etanol, glicerol, metanol, 1,3-propanodiol, sorbitol, e xylitol); um ácido orgânico (por exemplo, ácido acético, ácido acetonico, ácido adipico, ácido ascorbico, ácido citrico, ácido 2,5-diceto-D-gluconico, ácido fórmico, ácido fumarico, ácido glucarico, ácido glucônico, ácido glucurônico, ácido glutárico, ácido 3hidroxipropiônico, ácido itacônico, ácido láctico, ácido málico, ácido malônico, ácido oxálico, ácido propiônico, ácido succínico, ácido xilonico); uma cetona (por exemplo, acetona); um aminoácido (por exemplo, ácido aspártico, ácido glutâmico, glicina, lisina, serina, e treonina); e um gás (por exemplo, metano, hidrogênio (H2), dióxido de carbono (CO2), e monóxido de carbono (CO)). O produto de fermentação também pode ser proteína como
100 um produto de valor elevado.
Em um aspecto preferido, o produto de fermentação é álcool. Será entendido que o termo “álcool” engloba uma substância que contém uma ou mais porções hidroxila. Em um aspecto mais preferido, o álcool é arabinitol. Em outro aspecto mais preferido, o álcool é butanoi. Em outro aspecto mais preferido, o álcool é etanol. Em outro aspecto mais preferido, o álcool é glicerol. Em outro aspecto mais preferido, o álcool é metanol. Em outro aspecto mais preferido, o álcool é 1,3-propanodiol. Em outro aspecto mais preferido, o álcool é sorbitol. Em outro aspecto mais preferido, o álcool é xilitol. Ver, por exemplo, Gong, C. S., Cao, N. J., Du, J., e Tsao, G. T., 1999, Ethanol production from renewable resources, in Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology, Scheper, T., ed., Springer-Verlag Berlin Heidelberg, Germany, 65: 207-241; Silveira, Μ. M., e Jonas, R., 2002, The biotechnological production of sorbitol, Appl. Microbiol. Biotechnol. 59: 400-408; Nigam, P., e Singh, D., 1995, Processes for fermentative production of xylitol -a sugar substitute, Process Biochemistry 30 (2): 117-124; Ezeji, T. C., Qureshi, N. e Blaschek, Η. P., 2003, Production of acetone, butanoi and ethanol por Clostridium beijerinckii BA101 e in situ recovery by gas stripping, World Journal of Microbiology e Biotechnology 19 (6): 595-603.
Em outro aspecto preferido, o produto de fermentação é um ácido orgânico. Em outro aspecto mais preferido, o ácido orgânico é ácido acético. Em outro aspecto mais preferido, o ácido orgânico é ácido acetonico. Em outro aspecto mais preferido, o ácido orgânico é ácido adipico. Em outro aspecto mais preferido, o ácido orgânico é ácido ascórbico=. Em outro aspecto mais preferido, o ácido orgânico é ácido citrico. Em outro aspecto mais preferido, o ácido orgânico é ácido 2,5-diceto-D-glucônico. Em outro aspecto mais preferido, o ácido orgânico é ácido fórmico. Em outro aspecto mais preferido, o ácido orgânico é ácido fumárico. Em outro aspecto mais preferido, o ácido orgânico é ácido glucarico. Em outro aspecto mais
101 preferido, o ácido orgânico é ácido gluconico. Em outro aspecto mais preferido, o ácido orgânico é ácido glucurônico. Em outro aspecto mais preferido, o ácido orgânico é ácido glutárico. Em outro aspecto preferido, o ácido orgânico é ácido 3-hidroxipropiônico. Em outro aspecto mais preferido, o ácido orgânico é ácido itaconico. Em outro aspecto mais preferido, o ácido orgânico é ácido láctico. Em outro aspecto mais preferido, o ácido orgânico é ácido malico. Em outro aspecto mais preferido, o ácido orgânico é ácido malônico. Em outro aspecto mais preferido, o ácido orgânico é ácido oxálico. Em outro aspecto mais preferido, o ácido orgânico é ácido propiônico. Em outro aspecto mais preferido, o ácido orgânico é ácido succinico. Em outro aspecto mais preferido, o ácido orgânico é ácido xilônico. See, por exemplo, Chen, R., e Lee, Y. Y., 1997, Membrane-mediated extractive fermentation for lactic acid production from cellulosic biomass, Appl. Biochem. Biotechnol. 63-65: 435-448.
Em outro aspecto preferido, o produto de fermentação é uma cetona. Será entendido que o termo “cetona” engloba uma substância que contém um ou mais porções de cetona. Em outro aspecto mais preferido, a cetona é acetona. Ver, por exemplo, Qureshi e Blaschek, 2003, supra.
Em outro aspecto preferido, o produto de fermentação é um aminoácido. Em outro aspecto mais preferido, o ácido orgânico é ácido aspartico. Em outro aspecto mais preferido, o aminoácido é ácido glutamico. Em outro aspecto mais preferido, o aminoácido é glicina. Em outro aspecto mais preferido, o aminoácido é lisina. Em outro aspecto mais preferido, o aminoácido é serina. Em outro aspecto mais preferido, o aminoácido é treonina. Ver, por exemplo, Richard, A., e Margaritis, A., 2004, Empirical modeling of batch fermentation kinetics for poly(glutamic acid) production and other microbial biopolymers, Biotechnology e Bioengineering 87 (4): 501-515.
Em outro aspecto preferido, o produto de fermentação é um
102 gás. Em outro aspecto mais preferido, o gás é metano. Em outro aspecto mais preferido, o gás é H2. Em outro aspecto mais preferido, o gás é CO2. Em outro aspecto mais preferido, o gás é CO. Ver, por exemplo, Kataoka, N., A. Miya, e K. Kiriyama, 1997, Studies on hidrogen production for continuous culture system of hidrogen-producing anaerobic bacterium, Water Science and Technology 36 (6-7): 41-47; e Gunaseelan V.N. in Biomass and Bioenergy, Vol. 13 (1-2), pp. 83-114, 1997, Anaerobic digestion of biomass for methane production: A review.
Recuperação. O(s) produto de fermentação(s) pode(m) ser opcionalmente recuperado(s) do meio de fermentação usando qualquer método conhecido a arte incluindo, mas não limitado a, cromatografia, procedimentos eletroforéticos, solubilidade diferencial, destilação, ou extração. Por exemplo, álcool é separado do material celulósico fermentado e purificado por métodos convencionais de destilação. O etanol com uma pureza de até cerca de 96 vol.% pode ser obtido, que pode ser usado como, por exemplo, etanol combustível, etanol para bebidas, isto é álcool neutro potável, ou etanol industrial.
Composições Detergentes
Os polipeptídeos tendo atividade de intensificação celulolítica da presente invenção podem adicionados e assim se tomar um componente de uma composição detergente.
A composição detergente da presente invenção pode ser formulada, por exemplo, como uma composição detergente para lavagem manual ou automática, incluindo uma composição de aditivo para lavagem de roupas apropriada para pre-tratamento de tecidos manchados e um enxágüe adicionado à composição de amaciante de tecidos, ou ser formulada como uma composição detergente para uso em operações de limpeza de superfícies duras de uso doméstico ou ser formulada para operações de lavagem de louça manual ou em máquina.
103
Em um aspecto específico, a presente invenção provê um aditivo detergente compreendendo um polipeptídeo da invenção. O aditivo detergente assim como a composição detergente pode compreender uma ou mais enzimas como uma protease, lipase, cutinase, uma amilase, carbohidrase, celulase, pectinase, mananase, arabinase, galactanase, xilanase, oxidase, por exemplo, uma lacase, e/ou peroxidase.
Em geral, as propriedades da(s) enzima(s) selecionada(s) devem ser compatíveis com o detergente selecioando, (isto é, pH-ótimo, compatibilidade com outros ingredientes enzimáticos e não enzimáticos, etc.), e a(s) enzima(s) deve(m) estar presente(s) em quantidades efetivas.
Celulases: As celulases apropriadas incluem as de origem bacteriana ou de fungosn. Os mutantes quimicamente modificados ou engenheirados por proteína são incluídos. Apropriadas celulases incluem celulases dos gêneros Bacíllus, Pseudomonas, Humicola, Fusarium, Thielavía, Acremonium, por exemplo, as celulases de fungos produzidas a partir de Humicola insolens, Myceliophthora thermophila e Fusarium oxisporum descritos em US 4.435.307, US 5.648.263, US 5.691.178, US 5.776.757 e WO 89/09259.
As celulases especialmente apropriadas são as celulases alcalinas ou neutras tendo benefícios de cuidado da cor. Exemplos de tais celulases são celulases descritas em EP 0 495 257, EP 0 531 372, WO 96/11262, WO 96/29397, WO 98/08940. Outros exemplos são variantes de celulase como as descritas em WO 94/07998, EP 0 531 315, US 5.457.046, US 5.686.593, US 5.763.254, WO 95/24471, WO 98/12307 e PCT/DK98/00299.
As celulases comercialmente disponíveis incluem CELUZYME™, e CAREZYME™ (Novozymes A/S), CLAZINASE™, e PURADAX HA™ (Genencor International Inc.), e KAC-500(B)™ (Kao Corporation).
104
Proteases: As proteases apropriadas incluem as de origem animal, vegetal ou microbiana. A origem microbiana é preferida. Os mutantes quimicamente modificados ou engenheirados por proteína são incluídos. A protease pode ser uma serina protease ou uma metaloprotease, preferivelmente uma protease alcalina microbiana ou protease tipo tripsina. Exemplos de proteases alcalinas são subtilisinas, especialmente as derivadas de Bacillus, por exemplo, subtilisina Novo, subtilisina Carlsberg, subtilisina 309, subtilisina 147 e subtilisina 168 (descritas in WO 89/06279). Exemplos de proteases tipo tripsina são tripsina (por exemplo, de origem de suíno ou bovinos e a Fusarium protease descrita em WO 89/06270 e WO 94/255,83.
Exemplos de proteases utilizáveis são as variantes descritas em WO 92/19729, WO 98/20115, WO 98/20116, e WO 98/34946, especialmente as variantes com substituições em uma ou mais das seguintes posições: 27, 36, 57, 76, 87,97, 101,104,120,123,167, 170, 194,206,218,222,224,235, e 274.
As enzimas protease preferidas comercialmente disponíveis incluem ALCALASE™, SAVINASE™, PRIMASE™, DURALASE™, ESPERASE™, e KANNASE™ (Novozymes A/S), MAXATASE™, MAXACAL™, MAXAPEM™, PROPERASE™, PURAFECT™, PURAFECT OXP™, FN2™, e FN3™ (Genencor International Inc.).
Lipases: As lipases apropriadas incluem as de origem bacteriana ou fungica. Os mutantes quimicamente modificados ou engenheirados por proteína são incluídos. Exemplos de lipases utilizáveis incluem lipases de Humicola (sinônimo Thermomyces), por exemplo, de H. lanuginosa (T. lanuginosus) como descrito em EP 258 068 e EP 305 216 ou de H insolens como descrito em WO 96/13580, a Pseudomonas lipase, por exemplo, de P. alcaligenes ou P. pseudoalcaligenes (EP 218 272), P. cepacia (EP 331 376), P. stutzeri (GB 1,372,034), P. flúores cens, Pseudomonas sp. cepa SD 705 (WO 95/06720 e WO 96/27002), P. wisconsinensis (WO 96/12012), a Bacillus lipase, por exemplo, de B. subtilis (Dartois et al., 1993,
105
Biochemica et Biophysica Acta, 1131: 253-360), B. stearothermophílus (JP 64/744992) ou B. pumilus (WO 91/16422).
Outros exemplos são variantes de lipase como os descritos em WO 92/05249, WO 94/01541, EP 407 225, EP 260 105, WO 95/35381, WO 96/00292, WO 95/30744, WO 94/25578, WO 95/14783, WO 95/22615, WO 97/04079 e WO 97/07202.
As enzimas lipase preferidas comercialmente disponíveis incluem LIPOLASE™ e LIPOLASE ULTRA™ (Novozymes A/S).
Amilases: As amilases apropriadas (a e/ou β) incluem as de origem bacteriana ou fungica. Os mutantes quimicamente modificados ou engenheirados por proteína são incluídos. Amilases incluem, por exemplo, α-amilases obtidas de Bacillus, por exemplo, uma cepa especial de Bacillus licheniformis, descrita em maiores detalhes em GB 1.296.839.
Exemplos de amilases utilizáeis são as variantes descritas em WO 94/02597, WO 94/18314, WO 96/23873, e WO 97/43424, especialmente as variantes com substituições em uma ou mais das seguintes posições: 15, 23, 105, 106, 124, 128, 133, 154, 156, 181, 188, 190, 197, 202, 208, 209, 243, 264, 304, 305,391,408, e 444.
As amilases comercialmente disponíveis são DURAMYL™, TERMAMYL™, FUNGAMYL™ e BAN™ (Novozymes A/S), RAPIDASE™ e PURASTAR™ (de Genencor International Inc.).
Peroxidases/Oxidases: As peroxidases/oxidases apropriadas incluem as de origem de planta, bacteriana ou fungica. Os mutantes quimicamente modificados ou engenheirados por proteína são incluídos. Exemplos de peroxidases utilizáeis incluem peroxidases de Coprinus, por exemplo, de C. cinereus, e variantes dos mesmos como descritos em WO 93/24618, WO 95/10602, e WO 98/15257.
As peroxidases comercialmente disponíveis incluem GUARDZYME™ (Novozymes A/S).
106
A(s) enzima(s) detergente(s) pode(m) ser incluída(s) em uma composição detergente por adição de aditivos separados contendo uma ou mais enzimas, ou por adição de um aditivo combinado compreendendo todas estas enzimas. Um aditivo detergente da invenção, isto é, um aditivo separado ou um aditivo combinado, pode ser formulado, por exemplo, como um granulado, líquido, pasta fluida, etc. As formulações de aditivo de detergente preferidas são granulados, em particular granulados sem formação de pó, líquidos, em particular líquidos estabilizados ou pastas fluidas.
Os granulados sem formação de pó podem ser produzidos, por exemplo, como descrito em US 4,106.991 e 4.661.452 e opcionalmente ser revestidos por métodos conhecidos na arte. Exemplos de materiais de revestimento ceroso são produtos de poli(óxido de etileno) (polietileno glicol, PEG) com pesos molares médios de 1000 a 20000; nonilfenóis etoxilados tendo de 16 a 50 unidades de óxido de etileno; álcoois graxos etoxilados em que o álcool contém de 12 a 20 átomos de carbono e em que se tem 15 a 80 unidades de óxido de etileno; álcoois graxos, ácidos graxos e mono- e di- e triglicerídeos de ácidos graxos. Exemplos de materiais de revestimento formando filmes apropriados para aplicação para técnicas de leito fluido são dados em GB 1483591. As preparações líquidas de enzimas podem, por exemplo, ser estabilizadas por adição de um poliol como propileno glicol, um açúcar ou álcool de açúcar, ácido láctico ou ácido bórico de acordo com métodos estabelecidos. As enzimas protegidas podem ser preparadas de acordo com o método descrito em EP 238,216.
A composição detergente da invenção pode estar em qualquer fonna conveniente, por exemplo, uma barra, um tablete, um pó, um grânulo, uma pasta ou um líquido. O detergente líquido pode ser aquoso, tipicamente contendo até 70% de água e 0-30% solvente orgânico, ou não aquoso.
A composição detergente compreende um ou mais tensoativos, que podem ser não iônicos incluindo semi-polar e/ou aniônico e/ou catiônico
107 e/ou zwiteriônico. Os tensoativos são tipicamente presentes em um nível de 0,1% a 60% em peso.
Quando incluídos aqui o detergente irá geralmente conter de cerca de 1% a cerca de 40% de um tensoativo aniônico como alquilbenzenossulfonato linear, alfa-olefina sulfonato, sulfato de alquila ( sulfato de álcool graxo), etoxissulfato de álcool, alcanossulfonato secundário, metil éster de ácido alfa-sulfo graxo, ácido alquil- ou alquenil succínico ou sabão.
Quando incluído aqui, o detergente geralmente contêm de cerca de 0,2% a cerca de 40% de um tensoativo não iônico como etoxilato de álcool, etoxilato de nonilvenol, alquil poliglicosídeo, alquil dimetilaminaóxido, monoetanolamida de ácido graxo etoxilado, monoetanolamida de ácido graxo, amida de ácido graxo polihidroxi alquila, ou derivados N-acil N-alquil de glucosamina (“glucamidas”).
O detergente pode conter 0-65% de um reforçador detergente ou agente complexante como zeólito, difosfato, trifosfato, fosfonato, carbonato, citrato, ácido nitrilotriacético, ácido etilenodiaminatetraacetico, ácido dietilenotriaminapentaacetico, ácido alquil- ou alquenil sucínico, silicatos solúveis, ou silicatos em camadas (por exemplo, SKS-6 de Hoechst).
O detergente pode compreender um ou mais polímeros. Exemplos são carboximetilcelulose, poli(vinilpirrolidona), poli (etileno glicol), poli(vinil álcool), poli(vinilpiridina-N-óxido), poli(vinilimidazol), policarboxilatos como poliacrilatos, copolímeros de ácido maleico/acrílico, e copolímeros lauril metacrilato/ ácido acrílico.
O detergente pode compreender um sistema alvejante que pode compreender uma fonte de H2O2 como perborato ou percarbonato que pode ser combinada com um ativador alvejante formando perácido como tetraacetiletilenodiamina ou nonanoiloxibenzenossulfonato. Altemativamente, o sistema alvejante pode compreender peroxiácidos de, por exemplo, o tipo
108 amida, imida, ou sulfona.
A(s) enzima(s) da composição de detergente da invenção pode(m) ser estabilizada usando agentes estabilizantes convencionais, por exemplo, um poliol como propileno glicol, ou glicerol, um açúcar ou álcool de açúcar, ácido láctico, ácido bórico ou um derivado de ácido bórico por exemplo, um éster de borato aromático, ou um derivado de ácido fenil borônico, como ácido 4-formil fenil borônico, e a composição pode ser formulada como descrito em, por exemplo, WO 92/19709 e WO 92/19708.
O detergente também pode conter outros convencionais ingredientes detergentes como, por exemplo, condicionadores de tecidos incluindo argilas, reforçadores de espuma, supressores de espuma, agentes anti-corrosão, agentes de suspensão de sujeira, agentes anti-redeposição de sujeira, corantes, bactericidas, abrilhantadores ópticos, hidrótropos, inibidores de verniz, ou perfumes.
Nas composições detergentes, qualquer enzima pode ser adicionada em uma quantidade correspondente a 0,01-100 mg de enzima proteína por litro de licor de lavagem, preferivelmente 0,05-5 mg de enzima proteína por litro de licor de lavagem, em particular 0,1-1 mg de enzima proteína por litro de licor de lavagem.
Nas composições detergentes, um polipeptídeo da presente invenção tendo atividade de intensificação celulolítica pode ser adicionado em uma quantidade correspondente a 0,001-100 mg de proteína, preferivelmente 0,005-50 mg de proteína, mais preferivelmente 0,01-25 mg de proteína, ainda mais preferivelmente 0,05-10 mg de proteína, o mais preferivelmente 0,05-5 mg de proteína, e ainda o mais preferivelmente 0,01-1 mg de proteína por litro de licor de lavagem.
Um polipeptídeo da invenção tendo atividade de intensificação celulolítica também pode ser incorporado nas formulações de detergentes descritas em WO 97/07202, que é pelo presente incorporado por referência.
109
Peptídeo de sinal
A presente invenção também se refere a um polinucleotídeo isolado codificando um peptídeo de sinal compreendendo ou consistindo de aminoácidos 1 a 21 de SEQ ID NO: 2. A presente invenção também se refere a construções de ácido nucleico compreendendo um gene codificando uma proteína, em que o gene é ligado operavelmente a tal polinucleotídeo codificando um peptídeo de sinal compreendendo ou consistindo de aminoácidos 1 a 21 de SEQ ID NO: 2, em que o gene é estranho para os polinucleotídeos codificando o peptídeo de sinal.
Em um aspecto preferido, a sequência de polinucleotídeos compreende ou consiste de nucleotídeos 1 a 63 de SEQ ID NO: 1.
A presente invenção também se refere a vetores de expressão recombinantes e células hospedeiras recombinantes compreendendo estas construções de ácido nucleico.
A presente invenção também se refere a métodos de produzir uma proteína, compreendendo: (a) cultivar uma célula hospedeira recombinante compreendendo um gene codificando uma proteína ligada operavelmente a tal polinucleotídeo codificando um peptídeo de sinal, em que o gene é estranho para os polinucleotídeos codificando o peptídeo de sinal, sob condições conduzindo à produção da proteína; e (b) recuperar a proteína A proteína pode ser nativa ou heteróloga a uma célula hospedeira. O termo “proteína” não significa aqui fazer referência a um comprimento específico do produto codificado e, assim, engloba peptídeos, oligopeptídeos, e proteínas. O termo “proteína” também engloba dois ou mais polipeptídeos combinados para formar o produto codificado. As proteínas também incluem polipeptídeos híbridos que compreendem uma combinação de sequências de polipeptídeo parciais ou completas obtidas a partir de pelo menos duas diferentes proteínas em que uma ou mais (várias) podem ser heterólogas ou nativas para a célula hospedeira. Proteínas ainda incluem
110 variações aléligas de ocorrência natural e engenheiradas das proteínas acima mencionadas e proteínas híbridas.
Preferivelmente, uma proteína é um hormônio ou variante do mesmo, enzima, receptor ou porção dos mesmos, anticorpo ou porção dos mesmos, ou repórter. Em um aspecto mais preferido, a proteína é uma oxidoreductase, transferase, hidrolase, liase, isomerase, ou ligase. Em um aspecto ainda mais preferido, a proteína é uma aminopeptidase, amilase, carbohidrase, carboxipeptidase, catalase, celulase, quitinase, cutinase, ciclodextrina glicosiltransferase, deoxiribonuclease, esterase, alfagalactosidase, beta-galactosidase, glucoamilase, alfa-glucosidase, betaglucosidase, invertase, lacase, another lipase, mannosidase, mutanase, oxidase, enzima petinolítica, peroxidase, fitase, polifenoloxidase, enzima proteolítica, ribonuclease, transglutaminase ou xilanase.
O gene pode ser obtido a partir de qualquer fonte procariótica, eucariótica ou outra.
A presente invenção é ainda descrita pelos seguintes exemplos que não devem ser construídos como limitando o escopo da invenção. Exemplos
Produtos químicos usados como tampões e substratos foram produtos comerciais de pelo menos grau reagente.
Cepas
Thermoascus aurantiacus CGMCC 0670 foi usada como uma fonte de um polipeptídeo tendo atividade de intensificação celulolítica. Cepa de Aspergillus oryzae cepa JaL355 (WO 2005/070962) foi usada para expressão do polipeptídeo de Thermoascus aurantiacus CGMCC 0670 tendo atividade de intensificação celulolítica.
Meios
Placas PDA foram compostas de 39 gramas de ágar de dextrose de batata e água deionizada a 1 litro.
111
Meio de cultura YG foi composto de 5,0 g de extrato de levedura, 10,0 g de glicose, e água deionizada a 1 litro.
Placas de ágar de YG foram compostas de 5,0 g de extrato de levedura, 10,0 g de glicose, 20,0 g de ágar, e água deionizada a 1 litro.
Meio de cultura de YPM foi composto de 10 g de extrato de levedura, 20 g de Bacto peptona, 20 g de maltose, e água deionizada a 1 litro.
Meio de cultura de farelo de trigo sólido foi composto de 30 g de farelo de trigo, 0,18 g de extrato de levedura, 0,045 g de KH2PO4, 0,225 g de MgSO4-7H2O, 0,675 g de glicose, e água deionizada a 1 litro.
Placas LB foram compostas de 10 g de triptona, 5 g de extrato de levedura, 10 g de cloreto de sódio, 15 g de ágar, e água deionizada a 1 litro.
Meio de cultura de SOC foi composto de 2% de triptona, 0,5% de extrato de levedura, 10 mM de NaCl, 2,5 mM de KC1, 10 mM de MgCl2, e
10 mM de MgSO4; esterilizado autoclavando e então glicose esterilizada por filtro foi adicionada a 20 mM.
Exemplo 1: Preparação de micélios de Thermoascus aurantiaeus cepa CGMCC 0670 para produção de biblioteca de cDNA
Cepa CGMCC 0670 de Thermoascus aurantiaeus foi inoculada em uma placa de ágar YG e incubada por 4 dias a 45°C no escuro. Vários tampões de micélio-YG ágar foram inoculados em 500 ml de frascos de agitação contendo 100 ml de meio de cultura de YG. Os frascos foram incubados por 2 dias a 45°C com agitação a 260 rpm. Então aproximadamente 2 ml do caldo de cultura foram transferidos para um frasco de agitação de 500 ml contendo meio de cultura de farelo de trigo sólido e o frasco de agitação inoculado foi incubado por 3 dias a 45°C sem agitação. O micélios dos meios de cultura sólidos foram coletados e congelados em nitrogênio líquido e então armazenados em um congelador a -80°C até uso.
Exemplo 2: Isolamento de RNA de Thermoascus aurantiaeus cepa CGMCC
112
0670
Os micélios congelados foram transferidos em um almofariz previamente congelado com nitrogênio líquido e moídos e triturados em um pó fino com uma quantidade pequena de areia de quartzo cozida. RNA total foi preparado dos micélios em pó por extração com tiocianato de guanidíneo seguido por ultracentrifugação através de 5.7 M de uma almofada de CsCl de acordo com Chirgwin et al., 1979, Biochemistry 18: 5294-5299. O RNA enriquecido com poliA foi isolado por cromatografia de afinidade de oligo (dT)-celulose de acordo com Aviv et al., 1972, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 69:
1408-1412.
Exemplo 3: Construção de uma biblioteca de cDNA de cepa CGMCC 0670 Thermoascus aurantiacus cDNA de filamento duplo foi sintetizado de acordo com os métodos gerais de Gubler e Hoffman, 1983, Gene 25: 263-269; Sambrook, J.,
Fritsch, E.F., e Maniantis, T. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2a ed., 1989, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, Nova Iorque; e Kofod et al., 1994, J. Biol. Chem. 269: 29182-29189, usando um iniciador Not I-(dT)i8 (GE Healthcare Life Sciences, Piscataway, NJ, USA). Após síntese, o cDNA foi tratado com nuclease de feijão mung, terminado de modo obtuso com T4 DNA polimerase, e ligado a um adaptador Eco RI (GE Healthcare Life Sciences, Piscataway, NJ, USA). O cDNA foi clivado com Not I e o cDNA foi fracionado em tamanho por 0,8% de eletroforese de gel de agarose usando 44 mM Tris base, 44 mM de ácido bórico, 0,5 mM de tampão de EDTA (TBE). A fração de cDNA de 700 bp e maior foi excisada do gel e purificada usando um kit de DNA PCR GFX® e Purificação de Banda de Gel (GE Healthcare Life Sciences, Piscataway, NJ, USA) de acordo com as instruções do fabricante.
O cDNA preparado foi então direccionalmente clonado por ligação em pMHas5 (WO 2004/013350) clivado de Eco Rl-ZVot I usando T4
113 ligase (Promega, Madison, WI, USA) de acordo com as instruções do fabricante. A mistura de ligação foi eletroporada em células E. coli DH10B (Boehringer Mannheim, Indianapolis, IN, USA) usando um GENE PULSER® e controlador de pulso (Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA) a 200 ohms, 25 mF, 1,8 kV com uma pequena cuba de espaço de 2 mm de acordo com o procedimento do fabricante.
As células eletroporadas foram colocadas em placas LB suplementadas com 100 pg de ampicilina por ml. Uma poça de plasmídeo de cDNA foi preparada a partir de 30.000 transformantes totais da ligação de vetor pMHas5 original. DNA de plasmídeo foi preparado diretamente da poça de colônias usando um QIAGEN®-tip 100 (QIAGEN GmbH Corporation, Hilden, Alemanha).
Exemplo 4: Construção de um transposon SigA4 contendo o gene repórter beta-lactamase
Um plasmídeo contendo transposon designado pSigA4 foi construído do transposon pSigA2 contendo plasmídeo descrito em WO 2001/77315 a fim de criar uma versão melhorada do transposon de aprisionamento de sinal de pSigA2 com fondo de seleção diminuído. O transposon pSigA2 contém uma construção de beta-lactamase de sinal menos codificada no próprio transposon. PCR foi usado para criar uma deleção do gene de beta-lactamase intato encontrado na estrutura dorsal do plasmídeo usando uma polimerase de DNA PROOFSTART® tipo proofreading (QIAGEN GmbH Corporation, Hilden, Alemanha) e os seguintes iniciadores fosforilados de 5’ (TAG Copenhagen, Dinamarca):
SigA2NotU-P:
5’-TCGCGATCCGTTTTCGCATTTATCGTGAAACGCT-3’ (SEQ ID NO: 3) SigA2NotD-P:
5’-CCGCAAACGCTGGTGAAAGTAAAAGATGCTGAA-3’ (SEQ ID NO: 4)
A reação de amplificação foi composta de 1 μΐ de pSigA2 (10
114 ng/μΐ), 5 μΐ de Tampão 10X PROOFSTART® (QIAGEN GmbH Corporation, Hilden, Alemanha), 2,5 μΐ de mistura de dNTP (20 mM), 0,5 μΐ de SigA2NotU-P (10 mM), 0,5 μΐ de SigA2NotD-P (10 mM), 10 μΐ de solução Q (QIAGEN GmbH Corporation, Hilden, Alemanha), e 31,25 μΐ de água deionizada. A reação de amplificação foi incubada em um Ciclador térmico PTC-200 DNA ENGINE™ (MJ Research Inc., Waltham, MA, USA) programado para 1 ciclos em 95°C por 5 minutos; e 20 ciclos cada a 94°C por 30 segundos, 62°C por 30 segundos, e 72°C por 4 minutos.
Um produto de reação de PCR de 3,9 kb foi isolado por 0,8% 10 de eletroforese de gel agarose usando 40 mM de Tris base-20 mM de tampão de EDTA (TAE) de dissódio de lmM de acetato de sódio e 0,1 pg de brometo de etídio por ml. A banda de DNA foi visualizada com o auxílio de um sistema de imagem EAGLE EYE® (Stratagene, La Jolla, CA, USA) a 360 nm. A banda de DNA de 3,9 kb foi excisado do gel e purificada usando um
DNA de PCR GFX® e Kit de purificação de banda de gel de acordo com as instruções do fabricante.
O fragmento de 3,9 kb foi auto-ligado a 16°C durante a noite com 10 unidades de T4 DNA ligase (New England Biolabs, Inc., Beverly, MA, USA), 9 μΐ do fragmento de PCR de 3,9 kb, e 1 μΐ de tampão de ligação de 10X (New England Biolabs, Inc., Beverly, MA, USA). A reação de ligação foi aquecida desativada por 10 minutos a 65°C e então digerida com Dpn I a 37°C por 2 horas. Após incubação, a digestão foi purificada usando um DNA DE PCR GFX® e Kit de purificação de banda de gel.
O material purificado foi então transformado em células competentes de E. coli TOP 10 (Invitrogen Corp., Carlsbad, CA, USA) de acordo com as instruções do fabricante. A mistura de transformação foi colocada em placas LB suplementadas com 25 pg de cloranfenicol por ml. Minipreparações de plasmídeo foram preparadas a partir de vários transformantes e digeridas com Bgl II. Um plasmídeo com a construção
115 correta foi escolhido. O plasmídeo foi designado pSigA4. Plasmídeo pSigA4 contém o transposon SigA2 idêntico flanqueado de Bgl II com o que foi descrito em WO 01/77315.
Uma amostra de 60 μΐ de DNA de plasmídeo pSigA4 (0,3 pg/μΙ) foi digerida com Bgl II e separada por 0,8% de eletroforese de gel de agarose usando tampão de TBE. Uma banda de DNA de transposon SigA2 de 2 kb foi eluída com 200 μΐ de tampão de EB (QIAGEN GmbH Corporation, Hilden, Alemanha) e purificada usando um DNA de PCR GFX® e Kit de purificação de banda de gel de acordo com as instruções do fabricante e eluída em 200 μΐ de tampão de EB. SigA2 foi usado para aprisionamento de sinal assistido por transposon.
Exemplo 5: Aprisionamento de sinal assistido por transposon de Thermoascus aurantiacus CGMCC 0670
Uma descrição completa de aprisionamento de sinal assistido por transposon pode ser encontrada em WO 2001/77315. Uma poça de cDNA plasmídeo foi preparada a partir de 50.000 transformantes totais da ligação de vetor pMHas5 de cDNA original. Plasmídeo DNA foi preparado diretamente de uma poça de colônias recuperadas de placas LB suplementadas com 100 pg de ampicilina por ml usando um Kit QIAPREP® Spin Midi/Maxiprep (QIAGEN GmbH Corporation, Hilden, Alemanha). A poça de plasmídeo foi tratada com transposon SigA2 e MuA transposase (Finnzymes OY, Espoo, Finlândia) de acordo com as instruções do fabricante.
Para etiquetagem de transposon in vitro da biblioteca de cDNA de Thermoascus aurantiacus CGMCC NO.0670, 4 μΐ de SigA2 transposon contendo aproximadamente 100 ng de DNA foram misturados com 5 μΐ da poça de DNA plasmídeo da biblioteca de cDNA Thermoascus aurantiacus CGMCC NO.0670 contendo 3 pg de DNA, 1 μΐ de MuA transposase (0,22 pg/μΙ), e 4 μΐ de 5X tampão (Finnzymes OY, Espoo, Finlândia) em um volume total de 20 μΐ e incubados a 37°C por 2,5 horas seguido por
116 inativação por calor a 70°C por 10 minutos. O DNA foi precipitado por adição de 2 μΐ de 3 M de acetato de sódio pH 5 e 55 μΐ de 96% etanol e centrifugado por 30 minutos a 10.000 x g, 4°C. O grânulo foi lavado em 70% etanol, secada a ar em temperatura ambiente, e colocado novamente em suspensão em 7 μΐ de água deionizada.
Um volume de 1,5 μΐ da poça de plasmídeo etiquetado de transposon foi eletroporado em 40 μΐ de células E. coli ElectroMAX DH10B (Invitrogen Corp., Carlsbad, CA, USA) de acordo com as instruções do fabricante usando um GENE PULSER® e Controlador de pulso a 25 uF, 25 mAmp, 2.5 kV com a 2 mm cadinho de lacuna de acordo com o procedimento do fabricante.
As células eletroporadas foram incubadas em meio de cultura de SOC com agitação a 225 rpm por 1 hora a 37°C antes de serem colocadas em placas nos seguintes meios de cultura seletivos: meio de LB suplementado com 50 pg de canamicina por ml; meio de cultura LB suplementado com 50 pg de canamicina por ml e 15 pg de cloranfenicol por ml; e meio de cultura LB suplementado com 50 pg de canamicina por ml, 15 pg de cloranfecol por ml, e 15 pg de ampicilina por ml.
A partir da colocação nas placas da eletroporação em meio de cultura LB suplementado com 50 pg de canamicina por ml, 15 pg de cloranfecol por ml, e 15 pg de ampicilina por ml, aproximadamente 269 colônias foram observadas após 3 dias a 30°C. Todas colônias foram colocadas em réplica em placas LB suplementadas com 50 pg de canamicina, 15 pg de cloranfenicol com 50 pg de ampicilina por ml. Um total de 188 colônias foi recuperado sob essa condição de seleção. Além de eletroporação e de colocação em placa, experimentos foram efetuados até 550 colônias totais serem recuperadas sob seleção tripla. As colônias foram mini-preparadas usando um Kit QIAPREP® 96 Turbo Miniprep (QIAGEN GmbH Corporation, Hilden, Alemanha). Plasmídeos foram seqüenciados com o transposon dianteiro e
117 iniciadores reversos (iniciadores A e B), mostrados abaixo, de acordo com o procedimento descrito em WO 01/77315 (página 28).
Iniciador A:
5’-AGCGTTTGCGGCCGCGATCC-3’ (SEQIDNO: 5)
Iniciador B:
5’-TTATTCGGTCGAAAAGGATC C-3’ (SEQ ID NO: 6)
Exemplo 6: Montagem de sequência e anotação
Sequências de DNA foram obtidas para as reações em um Sistema de análise de DNA MEGABACE™ 500 (GE Healthcare Life Sciences, Piscataway, NJ, USA). Leituras de sequência de Iniciador A e Iniciador B para cada plasmídeo foram ajustadas para remover a sequência de vetor e transposon, que resultou em 208 sequências montadas que foram agrupadas em 83 contigs usando o programa PhredPhrap (Ewing et al., 1998, Genome Research 8: 175-185; Ewing e Green, 1998, Genome Research 8: 186-194). Todos 83 contigs foram subsequentemente comparados a sequências disponíveis em bancos de dados de sequências de DNA e proteína públicos padrão (TrEMBL, SWALL, PDB, EnsemblPep, GeneSeqP) usando o programa BLASTX 2.0al9MP-WashU [14-Jul-1998] [Build linux-x86 18:51:44 30-Jul-1998] (Gish et al., 1993, Nat. Genet. 3: 266-72). O candidato de família GH61B foi identificado diretamente por análise dos resultados de BlastX. Exemplo 7: Clonagem do gene ghólb Thermoascus aurantiacus a partir do DNA genômico
Baseado na sequência de cDNA, iniciadores de oligonucleotídeo, mostrados abaixo, foram projetados para amplificar o gene ghólb de DNA genômico de Thermoascus aurantiacus cepa CGMCC 0670. Iniciador de sentido:
5'-TATCAATTGATGTCGTTCTCGAAGATTGCTG-3' (SEQ ID NO: 7) Iniciador de anti-sentido:
5'-TATGCGGCCGCTCTGTTCAGCGCATGTCGTT-3' (SEQ ID NO: 8)
118
A reação de amplificação foi composto de tampão de PCR IX REDDYMTX™ (Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA), 0,75 unidades de DNA polimerase ThermoPrime Taq (Thermo Fisher Scientific Inc., Waltham, MA, USA), 75 mM de Tris-HCl (pH 8,8 a 25°C), 20 mM (NEUhSCU, 0,01 % (% em volume) TWEEN® 20, 0,2 mM de dNTPs, e 1,5 mM de MgCl2, assim como 0,2 μΜ de cada iniciador e 0,5-1 μg de DNA genômico de T. aurantiacus (isolado usando métodos padrões). A reação de amplificação foi incubada em um ciclador térmico PTC-200 DNA ENGINE™ programado para desnaturação inicial de 2 minutos a 94°C, seguido por 35 ciclos cada a 94°C por 15 segundos e combinada recozimento e extensão a 60°C por 2 minutos.
Um produto de PCR de aproximadamente 1,1 kb foi purificado por 1% de eletroforese de gel de agarose usando tampão de TAE, extraído do gel, e purificado usando um DNA de PCR GFX® e Kit de purificação de banda de gel de acordo com as instruções do fabricante. A banda de DNA purificado foi então clonada em plasmídeo pXYG1051 (WO 2005/080559) digerida com Mfe l/Not I. Quatro das inserções de plasmídeo resultantes foram submetidas a seqüenciamento Sanger usando técnicas padrões. Todos os plasmídeos continham mutações aparentemente introduzidas pela amplificação de PCR. Um plasmídeo tendo apenas mutações silentes na região codificante foi selecionado para outro trabalho e designado pXYG1051-ND001860 de comprimento (Figura 2). O vetor de expressão pXYG1051 contém o mesmo promotor de amilase II (NA2) neutro derivado de Aspergillus niger, e elemento terminador como pCaHj483 (descrito em Exemplo 4 de WO 98/00529). Além disso pXYG1051 tem sequências derivadas de pUC18 para seleção e propagação em E. coli, e sequências derivadas de pDSY82 (descrito em Exemplo 4 de Patente US 5.958.727) para seleção e expressão em Aspergillus facilitada pelo gene pyrG de Aspergillus oryzae, que codifica orotidina decarboxilase e é usada para complementar uma cepa Aspergillus mutante de pyrG.
119
A fim de subclonar o gene de polipeptídeo GH61B de Thermoascus aurantiacus em pCR®2.1 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA), o fragmento longo contendo o CDS e um intron foi amplificado por PCR de pXYG1051-ND001860 longa usando iniciadores ND1860-3F e ND1860-2R, mostrados abaixo, contendo sítios de restrição Hind III e Not I, respectivamente, para permitir para subclonar em pCR®2.1.
ND1860-3F:
5’-cccaagcttatgtcgttctcgaagattgctg-3’ (SEQ ID NO: 9)
ND1860-2R:
5’-tatgcggccgctctgttcagcgcatgtcgtt-3’ (SEQIDNO: 10)
A reação de amplificação foi composta de tampão de PCR IX REDDYMIX™, 0.75 unidades de DNA polimerase ThermoPrime Taq, 75 mM Tris-HCl (pH 8,8 a 25°C), 20 mM (NH4)2SO4, 0,01% (% em volume) TWEEN® 20, 0,2 mM dNTPs, e 1,5 mM MgCl2, assim como 0,2 μΜ de cada iniciador e 0,1 pg do plasmídeo DNA. A reação de amplificação foi incubada em um ciclador térmico PTC-200 DNA ENGINE™ programado para desnaturação inicial de 2 minutos a 94°C, seguido por 25 ciclos cada a 94°C por 15 segundos e recozimento combinado e extensão a 60°C por 2 minutos.
O produto amplificado foi purificado com gel usando um DNA de PCR GFX® e Kit de purificação de banda de gel de acordo com as instruções do fabricante. O produto de PCR digerido de Hind III e Not I foi então clonado por ligação em pCR®2.1 digerido com Hind III-tVoí I usando técnicas de biologia molecular padrão para dar pXYZ1473 (Figura 3). A inserção de gene de polipeptídeo de Thermoascus aurantiacus GH61B em pXYZ1473 foi confirmada por seqüenciamento Sanger. E. coli pXYZ1473 foi depositado com o Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSM) em 2 de Dezembro de 2008 e recebeu o número de acesso DSM 22075.
Exemplo 8: Caracterização da sequência genômica de Thermoascus
120 aurantiacus codificando um polipeptídeo de Família GH61B tendo atividade de intensificação celulolítica
A sequência de nucleotídeos (SEQ ID NO: 1) e sequência deduzida de aminoácidos (SEQ ID NO: 2) do polipeptídeo de Thermoascus aurantiacus GH61B tendo sequência de DNA genômico de atividade de intensificação celulolítica são mostradas em Figura 1. O polinucleotídeo genômico é 1115 bp (incluindo códon de parada), interrompido por 1 íntron de 50 bp, e codifica um polipeptídeo de 354 aminoácidos. O teor % de G+C da sequência de codificação de comprimento completo e a sequência de codificação madura, incluindo o intron, é 55,2% e 55,8%, respectivamente. Usando o programa SignalP (Nielsen et al., 1997, Protein Engineering 10: Ιό), um peptídeo de sinal de 21 resíduos foi previsto. A proteína madura prevista contém 333 aminoácidos com uma massa molecular de 34,6 kDa.
Análise de um sequência deduzida de aminoácidos do polipeptídeo GH61B tendo atividade de intensificação celulolítica com o programa Interproscan (Mulder et al., 2007, Nucleic Acids Res. 35: D224D228) mostrou que o polipeptídeo GH61B continha uma assinatura de sequência de glicosídeo hidrolase Família 61 (Acesso InterPro IPR005103). Essa assinatura de sequência foi encontrada de aproximadamente resíduos 1 a 220 do polipeptídeo maduro (Acesso Pfam PF03443).
Um alinhamento global de paridade comparativa de sequências de aminoácidos foi determinada usando o algoritmo Needleman-Wunsch (Needleman e Wunsch, 1970, J. Mol. Biol. 48: 443-453) como implementado no programa Needle de EMBOSS com penalidade de abertura de lacuna de 10, penalidade de extensão de lacuna de 0,5, e a matriz EBLOSUM62. O alinhamento mostrou que uma sequência deduzida de aminoácidos do polipeptídeo maduro de Thermoascus aurantiacus GH61B compartilhou 77,2.% de identidade de sequência (excluindo lacunas) para uma sequência deduzida de aminoácidos de outra proteína de glicosídeo hidrolase de Família
121 de Thermoascus aurantiacus (número de acesso de GeneSeqP AEC05922).
Exemplo 9: Produção de polipeptídeo GH61B de Thermoascus aurantiacus tendo atividade de intensificação celulolítica em Aspergillus oryzae
O plasmídeo de expressão pXYG1051-ND001860 de comprimento foi transformado em Aspergillus oryzae JaL355 de acordo com o protocolo descrito em WO 98/00529. Transformantes foram purificados em placas de seleção através de conídios simples antes de esporular os mesmos em placas de PDA. Produção do polipeptídeo de Thermoascus aurantiacus GH61B pelos transformantes foi analisada de sobrenadantes de cultura de cultivos estacionários em 96 cavidades de profundidade de 1 ml a 26°C em meio de cultura YP com 2% de maltodextrina. Expressão foi verificada por NU-PAGE® 10% Bis-Tris SDS-PAGE (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) por coloração com Coomassie. Um transformante foi selecionado para outro trabalho e projetou Aspergillus oryzae ND1860.
Para produção de grande escala, esporos de Aspergillus oryzae ND1860 foram espalhados em uma placa de PDA e incubados por cinco dias a 34°C. A placa de esporo confluente foi lavada duas vezes com 5 ml de 0,01% TWEEN® 20 para maximizar o número de esporos coletados. A suspensão de esporo foi então usada para inocular 100 ml de meio de cultura YPM em um frasco de 500 ml. A cultura foi incubada a 28°C com constante agitação a 200 rpm. No dia quatro pós-inoculação, o caldo de cultura foi coletado por filtração através de uma membrana EXPRESS™ Plus de 0,22 pm (Millipore, Bedford, MA, USA). Caldo de cultura fresco produziu uma banda de proteína GH61B de aproximadamente 50 kDa. Em subsequente incubação de caldo de cultura a 4°C, a banda de aproximadamente 50 kDa lentamente degradou para bandas predominantes de aproximadamente 37 kDa e aproximadamente 25 kDa. A identidade dessas bandas como fragmentos do polipeptídeo Thermoascus aurantiacus GH61B foi verificada por
122 espectrometria de massa.
Exemplo 10: Teste de atividade de intensificação celulolítica de polipeptídeo de Thermoascus aurantiacus GH61B
Caldo de cultura de Aspergillus oryzae ND1860 foi preparado como descrito em Exemplo 9. O caldo de cultura foi concentrado aproximadamente 20 vezes usando um dispositivo de ultrafiltração Amicon (Millipore, Bedfored, MA, USA; 10 kDa membrana de polietersulfona, 40 psi, 4°C). O caldo de cultura concentrado foi dessalgado (coluna de dessalinização HIPREP™26/10, GE Healthcare, Piscataway, NJ, USA) em 20 mM de Tris-HCl pH 8,0 e então aplicado a uma coluna de 20 ml MONO Q™ (HR 16/10, GE Healthcare, Piscataway, NJ, USA) equilibrada com 20 mM de Tris-HCl pH 8,0. Proteínas ligadas foram eluídas com um gradiente de sal de coluna de coluna 15 de 0 mM a 500 mM de NaCI em 20 mM de Tris-HCl pH 8,0. Frações foram examinadas por 8-16% de géis de SDS-PAGE e revelaram que o polipeptídeo de 25 kDa eluído em aproximadamente 160 mM de NaCI enquanto o polipeptídeo de aproximadamente 50 kDa eluído em aproximadamente 210 mM de NaCI. Ambas amostras foram >85% puras como julgado por gel de SDS-PAGE. Concentração de proteína foi estimada por densitometria seguindo SDS-PAGE e coloração de azul de Coomassie. Forragem de milho foi pré-tratada e preparada como um substrato de teste de acordo com WO 2005/074647 para gerar forragem de milho pré-tratada (PCS). A mistura de celulase de base usada para testar atividade intensificadora foi preparada a partir de Trichoderma reesei cepa SMA135 (WO 2008/057637).
Hidrólise de PCS foi conduzida usando placas de cavidades profundas de 1,6 ml (Axygen, Santa Clara, CA, USA) usando um volume de reação total de 1,0 ml e uma concentração de PCS de 50 mg/ml em 1 mM de sulfato de manganês-50 mM de acetato de sódio pH 5,0. Cada polipeptídeo de T. aurantiacus GH61B foi adicionado à mistura de celulase de base em
123 concentrações variando de 0 a 100% de uma concentração de proteína da mistura de celulase de base. Incubação foi a 50°C por 168 horas. Testes foram tipicamente efetuados em triplicata. Alíquotas foram centrifugadas, e o sobrenadante líquido foi filtrado por centrifugação (MXJLTISCREEN® HV 0,45 pm, Millipore, Billerica, MA, USA) a 3000 rpm por 10 minutos usando uma centrífuga de placa (SORVALL® RT7, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA). Quando não usadas imediatamente, alíquotas hidrolisadas filtradas foram congeladas a -20°C. Concentrações de açúcar de amostras diluídas em 0,005 M de H2SO4 com 0,05% % em peso de ácido benzóico foram medidas após eluição por 0,005 M de H2SO4 com 0,05% % em peso de ácido benzóico em uma taxa de fluxo de 0,6 ml/minuto de uma coluna AMINEX® HPX-87H de 4.6 x 250 mm (Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA) a 65°C com quantificação por integração de glicose e sinais de celobiose usando detecção de índice refratário (CHEMSTATION®, AGILENT® 1100 HPLC, Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA) calibrado por amostras de açúcar puras (Absolute Standards Inc., Hamden, CT, USA). Os resultantes equivalentes foram usados para calcular a percentagem de conversão de celulose para cada reação. O grau de conversão de celulose para glicose mais açúcares de celobiose (conversão, %) foi calculada usando a seguinte equação:
Conversão (%) = (glicose+celobiose x 1,053) (mg/ml) x 100 x 162 / (celulose (mg/ml) x 180) = (glicose+celobiose x 1,053) (mg/ml) x 100 / (celulose (mg/ml) x 1,111)
Nesse equação o fator 1.111 reflete o ganho de peso em conversão de celulose para glicose, e o fator 1,053 reflete o ganho de peso em conversão de celobiose para glicose. Celulose em PCS foi determinada por uma digestão limite de PCS para liberar glicose e celobiose.
Os resultados de adicionar quantidades crescentes de polipeptídeo Thermoascus aurantiacus GH61B à mistura de celulase de base
124 são mostrados em Figura 4. O desempenho da mistura de celulase de base é mostrado pela linha horizontal em Figura 4. Adição do polipeptídeo de T. aurantiacus GH61B de aproximadamente 25 kDa permitiu a redução da carga de proteína total para alcançar 80% de conversão de glucano por um fator de pelo menos 1,50 vez. Em contraste, adição do polipeptídeo de T. aurantiacus GH61B de aproximadamente 50 kDa não proveu uma redução da carga de proteína total para alcançar 80% conversão de glucano sugerindo que o polipeptídeo de aproximadamente 25 kDa é a forma ativa de T. aurantiacus GH61B.
Depósito de Material Biológico
O seguinte material biológico foi depositado sob os termos do
Tratado de Budapeste com o Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSM), Mascheroder Weg 1 B, D-38124 Braunschweig, Alemanha, e recebeu o seguinte número de acesso:
Depósito Número de acesso Data do Depósito
E. coli pXYZ1473 DSM 22075 2 de dez. de 2008
A cepa foi depositada sob condições que asseguram que o acesso à cultura estará disponível durante a pendência deste pedido de patente para um versado determinado por leis de patente no estrangeiro como sendo habilitado ao mesmo. O depósito representa uma cultura substancialmente pura da cepa depositada. O depósito é disponível como requerido por leis de patente no estrangeiro em países em que as contra-partes do pedido em questão, ou sua progênie estão depositadas. No entanto, deve ser entendido que a disponibilidade do depósito não constitui uma licença para praticar a presente invenção em denOgativa dos direitos de patente garantidos pela ação governamental.
A presente invenção é ainda descrita pelos seguintes parágrafos numerados:
[1] Um polipeptídeo isolado tendo atividade de intensificação
125 celulolítica, selecionada dentre o grupo consistindo de: (a) um polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 80% de identidade de sequência para o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2; (b) um polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo que hibridiza sob pelo menos condições de alta estringência com (i) uma sequência de codificação de polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 1, (ii) uma sequência de cDNA contida em uma sequência de codificação de polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 1, ou (iii) um filamento complementar de comprimento completo de (i) ou (ii); (c) um polipeptídeo codificado por um polinucleotídeo compreendendo uma sequência de nucleotídeos tendo pelo menos 80% identidade de sequência para uma sequência de codificação de polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 1; e (d) uma variante compreendendo uma substituição, deleção, e/ou inserção de um ou mais (vários) aminoácidos do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2.
[2] O polipeptídeo de parágrafo 1, compreendendo uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 80% de identidade de sequência para o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2.
[3] O polipeptídeo de parágrafo 2, compreendendo uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 85% de identidade de sequência para o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2.
[4] O polipeptídeo de parágrafo 3, compreendendo uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 90% de identidade de sequência para o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2.
[5] O polipeptídeo de parágrafo 4, compreendendo uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 95% de identidade de sequência para o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2.
[6] O polipeptídeo de parágrafo 5, compreendendo uma sequência de aminoácidos tendo pelo menos 97% de identidade de sequência para o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2.
126 [7] O polipeptídeo de parágrafo 1, compreendendo ou consistindo de uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2; ou um fragmento do mesmo tendo atividade de intensificação celulolítica.
[8] O polipeptídeo de parágrafo 7, compreendendo ou consistindo de uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 2.
[9] O polipeptídeo de parágrafo 1, compreendendo ou consistindo do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2.
[10] O polipeptídeo de parágrafo 1, que é codificado por um polinucleotídeo que hibridiza sob pelo menos condições de alta estringência com (i) uma sequência de codificação de polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 1, (ii) uma sequência de cDNA contida em uma sequência de codificação de polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 1, ou (iii) um filamento complementar de comprimento completo de (i) ou (ii).
[11] O polipeptídeo de parágrafo 10, que é codificado por um polinucleotídeo que hibridiza sob pelo menos condições de estringência muito alta com (i) uma sequência de codificação de polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 1, (ii) uma sequência de cDNA contida em uma sequência de codificação de polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 1, ou (iii) um filamento complementar de comprimento completo de (i) ou (ii).
[12] O polipeptídeo de parágrafo 1, que é codificado por um polinucleotídeo compreendendo uma sequência de nucleotídeos tendo pelo menos 80% identidade de sequência para uma sequência de codificação de polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 1.
[13] O polipeptídeo de parágrafo 12, que é codificado por um polinucleotídeo compreendendo uma sequência de nucleotídeos tendo pelo menos 85% identidade de sequência para uma sequência de codificação de polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 1.
[14] O polipeptídeo de parágrafo 13, que é codificado por um polinucleotídeo compreendendo uma sequência de nucleotídeos tendo pelo
127 menos 90% identidade de sequência para uma sequência de codificação de polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 1.
[15] O polipeptídeo de parágrafo 14, que é codificado por um polinucleotídeo compreendendo uma sequência de nucleotídeos tendo pelo menos 95% identidade de sequência para uma sequência de codificação de polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 1.
[16] O polipeptídeo de parágrafo 15, que é codificado por um polinucleotídeo compreendendo uma sequência de nucleotídeos tendo pelo menos 97% identidade de sequência para uma sequência de codificação de polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 1.
[17] O polipeptídeo de parágrafo 1, que é codificado por um polinucleotídeo compreendendo ou consistindo de uma sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 1; ou uma subsequência do mesmo codificando um fragmento tendo atividade de intensificação celulolítica.
[18] O polipeptídeo de parágrafo 17, que é codificado por um polinucleotídeo compreendendo ou consistindo de uma sequência de nucleotídeos de SEQ ID NO: 1.
[19] O polipeptídeo de parágrafo 1, que é codificado por um polinucleotídeo compreendendo ou consistindo de uma sequência de codificação de polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 1.
[20] O polipeptídeo de parágrafo 1, em que o polipeptídeo é uma variante compreendendo uma substituição, deleção, e/ou inserção de um ou mais (vários) aminoácidos do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2.
[21] O polipeptídeo de parágrafo 1, que é codificado pelo 25 polinucleotídeo contido em plasmídeo pXYZ1473 que está contido em E. coli
DSM 22075.
[22] O polipeptídeo de qualquer um dos parágrafos 1-21, em que o polinucleotídeo maduro são aminoácidos 22 a 354 de SEQ ID NO: 2.
[23] O polipeptídeo de qualquer um dos parágrafos 1-22, em
128 que a sequência de codificação do polipeptídeo maduro são nucleotídeos 64 a 1112 de SEQIDNO: 1.
[24] Um polinucleotídeo isolado compreendendo uma sequência de nucleotídeos que codifica o polipeptídeo de qualquer um dos parágrafos 1-23.
[25] O polinucleotídeo isolado de parágrafo 24, compreendendo pelo menos uma mutação em uma sequência de codificação de polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 1, em que a sequência de nucleotídeos mutantes codifica o polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2.
[26] Uma construção de ácido nucléico compreendendo os polinucleotídeos de parágrafo 24 ou 25 ligados operavelmente a uma ou mais (várias) sequências de controle que dirigem a produção do polipeptídeo em um hospedeiro de expressão.
[27] Um vetor de expressão recombinante compreendendo a construção de ácido nucléico de parágrafo 26.
[28] Uma célula hospedeira recombinante compreendendo a construção de ácido nucléico de parágrafo 26.
[29] Método para produzir o polipeptídeo de qualquer um dos parágrafos 1-23, compreendendo: (a) cultivar uma célula, que em sua forma de tipo selvagem produz o polipeptídeo, sob condições conduzindo à produção do polipeptídeo; e (b) recuperar o polipeptídeo.
[30] Um Método para produzir o polipeptídeo de qualquer um dos parágrafos 1-23, compreendendo: (a) cultivar uma célula hospedeira compreendendo uma construção de ácido nucléico compreendendo um polinucleotídeo codificando o polipeptídeo sob condições conduzindo à produção do polipeptídeo; e (b) recuperar o polipeptídeo.
[31] Um Método para produzir um mutante de uma célula parental, compreendendo romper ou deletar um polinucleotídeo codificando o polipeptídeo, ou uma porção do mesmo, de qualquer um dos parágrafos 1-23,
129 que resulta no mutante produzindo menos do polipeptídeo do que a célula parental.
[32] Uma célula mutante produzida pelo método de parágrafo 31.
[33] A célula mutante de parágrafo 32, ainda compreendendo um gene codificando uma proteína nativa ou heteróloga.
[34] Um Método para produzir uma proteína, compreendendo: (a) cultivar uma célula mutante de parágrafo 33 sob condições conduzindo à produção da proteína; e (b) recuperar a proteína.
[35] O polinucleotídeo isolado de parágrafo 24 ou 25, obtido por (a) hibridizar uma população de DNA sob pelo menos condições de alta estringência com (i) uma sequência de codificação de polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 1, (ii) uma sequência de cDNA contida em uma sequência de codificação de polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 1, ou (iii) um filamento complementar de comprimento completo de (i) ou (ii); e (b) isolar o polinucleotídeo hibridizando, que codifica um polipeptídeo tendo atividade de intensificação celulolítica.
[36] O polinucleotídeo isolado de parágrafo 35, obtido por (a) hibridizar uma população de DNA sob pelo menos condições de estringência muito alta com (i) uma sequência de codificação de polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 1, (ii) uma sequência de cDNA contida em uma sequência de codificação de polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 1, ou (iii) um filamento complementar de comprimento completo de (i) ou (ii); e (b) isolar o polinucleotídeo hibridizando, que codifica um polipeptídeo tendo atividade de intensificação celulolítica.
[37] O polinucleotídeo isolado de parágrafo 35 ou 36, em que a sequência de codificação do polipeptídeo maduro são nucleotídeos 64 a 1112 de SEQ ID NO: 1.
[38] Um Método para produzir um polinucleotídeo compreendendo a sequência de nucleotídeos mutantes codificando um
130 polipeptídeo tendo atividade de intensificação celulolítica, compreendendo: (a) introduzir pelo menos uma mutação em uma sequência de codificação de polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 1, em que a sequência de nucleotídeos mutantes codifica um polipeptídeo compreendendo ou consistindo do polipeptídeo maduro de SEQ ID NO: 2; e (b) recuperar os polinucleotídeos compreendendo a sequência de nucleotídeos mutantes.
[39] Um polinucleotídeo mutante produzido pelo método de parágrafo 38.
[40] Um Método para produzir um polipeptídeo, compreendendo: (a) cultivar uma célula compreendendo o polinucleotídeo mutante de parágrafo 39 codificando o polipeptídeo sob condições conduzindo à produção do polipeptídeo; e (b) recuperar o polipeptídeo.
[41] Um Método para produzir o polipeptídeo de qualquer um dos parágrafos 1-23, compreendendo: (a) cultivar uma planta transgênica ou uma célula de planta compreendendo um polinucleotídeo codificando o polipeptídeo sob condições conduzindo à produção do polipeptídeo; e (b) recuperar o polipeptídeo.
[42] Uma planta transgênica, parte de planta ou célula de planta transformada com um polinucleotídeo codificando o polipeptídeo de qualquer um dos parágrafos 1-23.
[43] Uma molécula de RNA inibitório de filamento duplo (dsRNA) compreendendo uma sub-sequência dos polinucleotídeos de parágrafo 24 ou 25, em que opcionalmente o dsRNA é uma molécula de siRNA ou miRNA.
[44] Uma molécula de RNA inibitório de filamento duplo (dsRNA) de parágrafo 43, que tem cerca de 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 ou mais nucleotídeos duplex em comprimento.
[45] Um método de inibir a expressão de um polipeptídeo tendo atividade de intensificação celulolítica em uma célula, compreendendo
131 administrar à célula ou expressar na célula uma molécula de RNA de filamento duplo (dsRNA), em que o dsRNA compreende uma sub-sequência dos polinucleotídeos de parágrafo 24 ou 25.
[46] O método de acordo com o parágrafo 45, em que o dsRNA tem cerca de 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25 ou mais nucleotídeos duplex de comprimento.
[47] Um polinucleotídeo isolado codificando um peptídeo de sinal compreendendo ou consistindo de aminoácidos 1 a 21 de SEQ ID NO: 2.
[48] Uma construção de ácido nucleico compreendendo um gene codificando uma proteína ligada operavelmente aos polinucleotídeos de parágrafo 47, em que o gene é estranho para o polinucleotídeo.
[49] Um vetor de expressão recombinante compreendendo um gene codificando uma proteína ligada operavelmente aos polinucleotídeos de parágrafo 47, em que o gene é estranho para os polinucleotídeos codificando o peptídeo de sinal.
[50] Uma célula hospedeira recombinante compreendendo um gene codificando uma proteína ligada operavelmente aos polinucleotídeos de parágrafo 47, em que o gene é estranho para os polinucleotídeos codificando o peptídeo de sinal.
[51] Um Método para produzir uma proteína, compreendendo: (a) cultivar uma célula hospedeira recombinante compreendendo um gene codificando uma proteína ligada operavelmente aos polinucleotídeos de parágrafo 47, em que o gene é estranho para os polinucleotídeos codificando o peptídeo de sinal, sob condições conduzindo à produção da proteína; e (b) recuperar a proteína.
[52] Uma composição compreendendo o polipeptídeo de qualquer um dos parágrafos 1-23.
[53] Uma composição de detergente compreendendo o polipeptídeo de qualquer um dos parágrafos 1 -23.
132 [54] Um método para degradar ou converter um material celulósico, compreendendo: tratar o material celulósico com uma composição de enzima na presença do polipeptídeo tendo atividade de intensificação celulolítica de qualquer um dos parágrafos 1-23.
[55] O método de acordo com o parágrafo 54, em que o material celulósico é pré-tratado.
[56] O método de acordo com o parágrafo 54 ou 55, em que a composição de enzima compreende um ou mais enzima celulolíticas selecionadas dentre o grupo consistindo de uma endoglucanase, uma celobiohidrolase, e uma beta-glucosidase.
[57] O método de acordo com qualquer um dos parágrafos 5456, em que a composição de enzima ainda compreende uma ou mais enzimas selecionadas dentre o grupo consistindo de uma xilanase, uma hemicelulase, uma esterase, uma protease, uma lacase, ou uma peroxidase.
[58] O método de acordo com qualquer um dos parágrafos 5457, ainda compreendendo recuperar o material celulósico degradado.
[59] O método de acordo com o parágrafo 58, em que o material celulósico degradado é um açúcar.
[60] O método de acordo com o parágrafo 59, em que o açúcar é selecionado dentre o grupo consistindo de glicose, xilose, manose, galactose, e arabinose.
[61] Um método para produzir um produto de fermentação, compreendendo: (a) sacarificar um material celulósico com uma composição de enzima na presença do polipeptídeo tendo atividade de intensificação celulolítica de qualquer um dos parágrafos 1-23; (b) fermentar o material celulósico sacarificado com um ou mais microorganismos de fermentação para produzir o produto de fermentação; e (c) recuperar o produto de fermentação da fermentação.
[62] O método de acordo com o parágrafo 61, em que o
133 material celulósico é pré-tratado.
[63] O método de acordo com o parágrafo 61 ou 62, em que a composição de enzima compreende uma ou mais enzimas celulolíticas selecionadas dentre o grupo consistindo de uma endoglucanase, uma celobiohidrolase, e uma beta-glucosidase.
[64] O método de acordo com qualquer um dos parágrafos 6163, em que a composição de enzima ainda compreende uma ou mais enzimas selecionadas dentre o grupo consistindo de uma xilanase, uma hemicelulase, uma esterase, uma protease, uma lacase, ou uma peroxidase.
[65] O método de acordo com qualquer um dos parágrafos 6164, em que etapas (a) e (b) são realizadas simultaneamente em uma sacarificação e fermentação simultâneas.
[66] O método de acordo com qualquer um dos parágrafos 6165, em que o produto de fermentação é um álcool, um ácido orgânico, uma cetona, um aminoácido, ou um gás.
[67] Um método de fermentar um material celulósico, compreendendo: fermentar o material celulósico com um ou mais microorganismos de fermentação, em que o material celulósico é sacarificado com uma composição de enzima na presença de um polipeptídeo tendo atividade de intensificação celulolítica de qualquer um dos parágrafos 1-23.
[68] O método de acordo com o parágrafo 67, em que a fermentação do material celulósico produz um produto de fermentação.
[69] O método de acordo com o parágrafo 68, ainda compreendendo recuperar o produto de fermentação da fermentação.
[70] O método de acordo com qualquer um dos parágrafos 6769, em que o material celulósico é pré-tratado antes de sacarificação.
[71] O método de acordo com qualquer um dos parágrafos 6770, em que a composição de enzima compreende um ou mais enzimas celulolíticas selecionadas dentre o grupo consistindo de uma endoglucanase,
134 uma celobiohidrolase, e uma beta-glucosidase.
[72] O método de acordo com qualquer um dos parágrafos 6771, em que a composição de enzima ainda compreende uma ou mais enzimas selecionadas dentre o grupo consistindo de uma xilanase, uma hemicelulase, uma esterase, uma protease, uma lacase, ou uma peroxidase.
[73] O método de acordo com qualquer um dos parágrafos 6772, em que o produto de fermentação é um álcool, um ácido orgânico, uma cetona, um aminoácido, ou um gás.
A invenção descrita e reivindicada aqui não é limitada em escopo para os aspectos específicos aqui descritos, porque estes aspectos são destinados como ilustrações de vários aspectos da invenção. Quaisquer aspectos equivalentes se destinam a estar dentro do escopo desta invenção. De fato, várias modificações da invenção além das mostradas e descritas aqui irão se tomar evidentes para os versados na arte a partir da descrição aqui acima.
Estas modificações também se destinam a estar no escopo das reivindicações anexas. No caso de conflito, a presente descrição incluindo definições irá controlar.

Claims (16)

  1. REIVINDICAÇÕES
    1. Célula microbiana hospedeira transgênica, caracterizada pelo fato de compreender uma construção de ácido nucleico compreendendo um polinucleotídeo que codifica um polipeptídeo tendo atividade de
    5 intensificação celulolítica, em que o polinucleotídeo compreende ou consiste na SEQ ID NO: 1 ou nos nucleotídeos 64 a 1112 da SEQ ID NO: 1.
  2. 2. Célula microbiana hospedeira transgênica de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que o polipeptídeo tendo atividade de intensificação celulolítica compreende ou consiste na SEQ ID NO: 2 ou
    10 nos aminoácidos 22 a 354 da SEQ ID NO: 2.
  3. 3. Célula microbiana hospedeira transgênica de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de ser E. coli DSM 22075.
  4. 4. Método para produzir um polipeptídeo tendo atividade de intensificação celulolítica, caracterizado pelo fato de compreender: (a)
    15 cultivar uma célula microbiana hospedeira transgênica como definida em qualquer uma das reivindicações 1-3 sob condições adequadas para a produção do polipeptídeo; e (b) recuperar o polipeptídeo.
  5. 5. Método para degradar ou converter um material celulósico, caracterizado pelo fato de compreender: tratar o material celulósico com uma
    20 composição de enzima celulolítica na presença de um polipeptídeo tendo atividade de intensificação celulolítica compreendendo ou consistindo na SEQ ID NO: 2 ou ou nos aminoácidos 22 a 354 da SEQ ID NO: 2.
  6. 6. Método de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo é codificado por um polinucleotídeo que
    25 compreende ou consiste na SEQ ID NO: 1 ou nos nucleotídeos 64 a 1112 da SEQIDNO: 1.
  7. 7. Método de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo compreende ou consiste nos aminoácidos 22 a 354 da SEQ ID NO: 2.
    Petição 870180068785, de 08/08/2018, pág. 10/15
  8. 8. Método de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que o polipeptídeo é codificado pelo polinucleotídeo contido no plasmídeo pXYZ1473, que está contido em E. coli DSM 22075.
  9. 9. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 55 8, caracterizado pelo fato de ainda compreender recuperar o material celulósico degradado.
  10. 10. Construção de ácido nucléico, caracterizada pelo fato de compreender um polinucleotídeo compreendendo ou consistindo de SEQ ID NO: 1 ou dos nucleotídeos 64 a 1112 da SEQ ID NO: 1, operavelmente ligada
    10 a uma ou mais sequências de controle heterólogas que dirigem a produção do polipeptídeo em um hospedeiro de expressão.
  11. 11. Construção de ácido nucléico de acordo com a reivindicação 10, caracterizada pelo fato de que os nucleotídeos 64 a 1112 da SEQ ID NO: 1 codificam um polipeptídeo compreendendo ou consistindo nos
    15 aminoácidos 22 a 354 da SEQ ID NO: 2.
  12. 12. Construção de ácido nucléico de acordo com a reivindicação 10, caracterizada pelo fato de que o polinucleotídeo está contido no plasmídeo pXYZ1473, que está contido em E. coli DSM 22075.
  13. 13. Vetor de expressão, caracterizado pelo fato de 20 compreender um polinucleotídeo compreendendo ou consistindo de SEQ ID
    NO: 1 ou dos nucleotídeos 64 a 1112 da SEQ ID NO: 1, operavelmente ligada a uma ou mais sequências de controle heterólogas que dirigem a produção do polipeptídeo em um hospedeiro de expressão.
  14. 14. Vetor de expressão de acordo com a reivindicação 13, 25 caracterizado pelo fato de que os nucleotídeos 64 a 1112 da SEQ ID NO: 1 codificam um polipeptídeo compreendendo ou consistindo nos aminoácidos 22 a 354 da SEQ ID NO: 2.
  15. 15. Vetor de expressão de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que o polinucleotídeo está contido no plasmídeo
    Petição 870180068785, de 08/08/2018, pág. 11/15 pXYZ1473, que está contido em E. coli DSM 22075.
  16. 16. Composição detergente, caracterizada pelo fato de compreender um tensoativo e o polipeptídeo tendo atividade de intensificação celulolítica compreendendo ou consistindo na SEQ ID NO: 2 ou nos
    5 aminoácidos 22 a 354 da SEQ ID NO: 2.
    Petição 870180068785, de 08/08/2018, pág. 12/15
    1/4
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
BRPI1011597B1 (pt) * 2009-05-29 2019-08-20 Novozymes, Inc. Métodos para degradar um material celulósico, para produzir um produto de fermentação, e para fermentar um material celulósico, e, composição de enzima
DK2454590T3 (en) 2009-07-17 2016-12-05 Novozymes As A method of analysis of cellulose degradation by hydrolysis of the cellulose-containing material
CA2794471A1 (en) * 2010-03-31 2011-10-06 Meiji Seika Pharma Co., Ltd. Novel cellulase gene
EP2588604B1 (en) 2010-06-30 2016-06-29 Novozymes, Inc. Polypeptides having beta-glucosidase activity and polynucleotides encoding same
DK2591119T4 (da) 2010-07-07 2022-12-12 Novozymes North America Inc Fermenteringsproces
WO2012012590A2 (en) 2010-07-23 2012-01-26 Novozymes A/S Processes for producing fermentation products
US9458483B2 (en) 2010-08-12 2016-10-04 Novozymes, Inc. Compositions comprising a polypeptide having cellulolytic enhancing activity and a bicyclic compound and uses thereof
WO2012021401A1 (en) 2010-08-12 2012-02-16 Novozymes, Inc. Compositions comprising a polypeptide having cellulolytic enhancing activity and a bicyclic compound and uses thereof
HUE033334T2 (en) 2010-08-20 2017-11-28 Codexis Inc Use of glycoside hydrolase 61 family proteins in processing of cellulose
WO2012030811A1 (en) 2010-08-30 2012-03-08 Novozymes A/S Polypeptides having cellobiohydrolase activity and polynucleotides encoding same
US8629325B2 (en) 2010-08-30 2014-01-14 Novozymes A/S Polypeptides having beta-glucosidase activity and polynucleotides encoding same
WO2012030849A1 (en) 2010-08-30 2012-03-08 Novozymes A/S Polypeptides having xylanase activity and polynucleotides encoding same
WO2012030844A1 (en) 2010-08-30 2012-03-08 Novozymes A/S Polypeptides having endoglucanase activity and polynucleotides encoding same
US20130212746A1 (en) 2010-08-30 2013-08-15 Novoyzmes A/S Polypeptides Having Hemicellulolytic Activity And Polynucleotides Encoding Same
CN103282489B (zh) * 2010-09-30 2016-12-14 诺维信股份有限公司 具有纤维素分解增强活性的多肽变体及其编码多核苷酸
ES2599613T3 (es) 2010-09-30 2017-02-02 Novozymes, Inc. Variantes de polipéptidos que tienen actividad de mejora celulolítica y polinucleótidos que codifican los mismos
WO2012058293A1 (en) 2010-10-26 2012-05-03 Novozymes North America, Inc. Methods of saccharifying sugarcane trash
CN110079558A (zh) 2010-11-02 2019-08-02 诺维信股份有限公司 用家族61多肽预处理纤维素材料的方法
US9212354B2 (en) 2010-11-04 2015-12-15 Novozymes Inc. Polypeptides having cellobiohydrolase activitiy and polynucleotides encoding same
BR112013009026A2 (pt) 2010-11-12 2016-07-12 Novozymes Inc polipeptídeo isolado, célula hospedeira recombinante, métodos para produzir um polipeptídeo, um mutante de uma célula precursora, uma proteína, e um produto de fermentação, para inibir a expressão de um polipeptídeo, para degradar ou converter um material celulósico, e método para fermentar um material celulósico, planta transgênica, parte de planta ou célula de planta, molécula de rna inibidora de filamento duplo, polinucleotídeo isolado, e, formulação de caldo integral ou composição de cultura de célula
WO2012068509A1 (en) 2010-11-18 2012-05-24 Novozymes, Inc. Chimeric polypeptides having cellulolytic enhancing activity and polynucleotides encoding same
CN103517986B (zh) 2011-01-26 2016-12-07 诺维信公司 具有纤维二糖水解酶活性的多肽及编码该多肽的多核苷酸
MX337985B (es) 2011-01-26 2016-03-30 Novozymes As Polipeptidos que tienen actividad de celobiohidrolasa y polinucleotidos que codifican los mismos.
EP2668266B1 (en) 2011-01-26 2018-01-03 Novozymes A/S Polypeptides having cellobiohydrolase activity and polynucleotides encoding same
MX2013007720A (es) 2011-01-26 2013-08-09 Novozymes As Polipeptidos que tienen actividad celobiohidrolasa y polinucleotidos que codifican para los mismos.
BR112013016830A2 (pt) 2011-02-23 2017-03-01 Novozymes Inc polipeptídeo isolado, polinucleotídeo isolado, método de produzir o polipeptídeo, de produzir um mutante de uma célula parental, de inibir a expressão de um polipeptídeo, de produzir uma proteína, de degradar ou converter um material celulósico, de produzir um produto de fermentação e de fermentar um material celulósico, planta transgênica, parte da planta ou célula de planta transformada com um polinucleotídeo, molécula de rna de fita dupla, composição, e, formulação de caldo completo ou composição de cultura de células
US9051376B2 (en) 2011-02-23 2015-06-09 Novozymes, Inc. Polypeptides having cellulolytic enhancing activity and polynucleotides encoding same
EP2683830A1 (en) 2011-03-09 2014-01-15 Novozymes A/S Methods of increasing the cellulolytic enhancing activity of a polypeptide
WO2012122477A1 (en) 2011-03-10 2012-09-13 Novozymes A/S Polypeptides having cellulolytic enhancing activity and polynucleotides encoding same
WO2012125925A2 (en) * 2011-03-17 2012-09-20 Danisco Us Inc. Method for reducing viscosity in saccharification process
EP3333258A3 (en) 2011-03-25 2018-07-25 Novozymes A/S Method for degrading or converting cellulosic material
US20140080182A1 (en) 2011-03-31 2014-03-20 Novozymes, Inc. Cellulose Binding Domain Variants and Polynucleotides Encoding Same
WO2012135659A2 (en) 2011-03-31 2012-10-04 Novozymes A/S Methods for enhancing the degradation or conversion of cellulosic material
US9340810B2 (en) 2011-04-25 2016-05-17 Novozymes, Inc. Polypeptides having cellulolytic enhancing activity and polynucleotides encoding same
EP2702071A4 (en) * 2011-04-25 2014-10-22 Novozymes Inc POLYPEPTIDES WITH REINFORCED CELLULOSE-BROKEN EFFECT AND POLYNUCLEOTIDES THAT CODE
WO2012149192A1 (en) 2011-04-28 2012-11-01 Novozymes, Inc. Polypeptides having endoglucanase activity and polynucleotides encoding same
US9624518B2 (en) 2011-04-29 2017-04-18 Novozymes, Inc. Methods for enhancing the degradation or conversion of cellulosic material
US8993286B2 (en) 2011-05-19 2015-03-31 Novozymes, Inc. Methods for enhancing the degradation of cellulosic material with chitin binding proteins
US20140141471A1 (en) 2011-05-19 2014-05-22 Novozymes, Inc. Methods for Enhancing the Degradation of Cellulosic Material with Chitin Binding Proteins
WO2013000928A1 (en) * 2011-06-29 2013-01-03 Dsm Ip Assets B.V. Process for the digestion of organic material
US20140147895A1 (en) 2011-07-22 2014-05-29 Novozymes A/S Processes for Pretreating Cellulosic Material and Improving Hydrolysis Thereof
EP2739727B1 (en) 2011-08-04 2016-05-25 Novozymes, Inc. Polypeptides having xylanase activity and polynucleotides encoding same
WO2013019780A2 (en) 2011-08-04 2013-02-07 Novozymes A/S Polypeptides having endoglucanase activity and polynucleotides encoding same
DK2748317T3 (en) * 2011-08-22 2017-07-17 Codexis Inc GH61 glycoside hydrolase protein variants and cofactors that enhance GH61 activity
CN103748226A (zh) 2011-08-24 2014-04-23 诺维信股份有限公司 获得丝状真菌宿主细胞的阳性转化体的方法
US9493790B2 (en) 2011-08-24 2016-11-15 Novozymes, Inc. Methods for producing multiple recombinant polypeptides in a filamentous fungal host cell
US20140308705A1 (en) 2011-09-20 2014-10-16 Novozymes A/S Polypeptides Having Cellulolytic Enhancing Activity And Polynucleotides Encoding Same
US10017753B2 (en) 2011-09-29 2018-07-10 Novozymes, Inc. Polypeptides having cellulolytic enhancing activity and polynucleotides encoding same
US20140329284A1 (en) 2011-09-30 2014-11-06 Novozymes, Inc. Chimeric Polypeptides Having Beta-Glucosidase Activity and Polynucleotides Encoding Same
US10308921B2 (en) 2011-10-31 2019-06-04 Novozymes, Inc. Polypeptides having cellulolytic enhancing activity and polynucleotides encoding same
WO2013064071A1 (en) * 2011-10-31 2013-05-10 Novozymes, Inc. Polypeptides having cellulolytic enhancing activity and polynucleotides encoding same
EP3409769A1 (en) 2011-11-18 2018-12-05 Novozymes A/S Polypeptides having beta-glucosidase activity, beta-xylosidase activity, or beta-glucosidase and beta-xylosidase activity and polynucleotides encoding same
CN109112118A (zh) 2011-11-21 2019-01-01 诺维信股份有限公司 Gh61多肽变体以及编码所述变体的多核苷酸
EP2782998B1 (en) 2011-11-22 2018-01-10 Novozymes Inc. Polypeptides having beta-xylosidase activity and polynucleotides encoding same
BR112014012417A2 (pt) * 2011-12-01 2017-06-06 Novozymes Inc polipeptídeo e polinucleotídeo isolados, célula hospedeira recombinante, métodos para a produção de um polipeptídeo, de um mutante de uma célula de origem, e de uma proteína, e para a inibição da expressão de um polipeptídeo, planta transgênica, parte da planta ou célula de planta, molécula de rna, processos para degradar ou converter um material celulósico ou contendo xilano, para produzir um produto de fermentação, e de fermentação de um material celulósico ou contendo xilano, e, formulação de caldo integral ou composição de cultura de células
DK2791330T3 (da) 2011-12-16 2017-11-06 Novozymes Inc Polypeptider med laccaseaktivitet og polynukleotider, som koder for dem
AU2012359280B2 (en) 2011-12-19 2016-08-25 Novozymes A/S Processes and compositions for increasing the digestibility of cellulosic materials
BR112014014697A2 (pt) 2011-12-19 2020-10-27 Novozymes, Inc. polipeptídeo isolado, composição, polinucleotídeo isolado, construto de ácido nucleico ou vetor de expressão, célula hospedeira recombinante, métodos para produzir um polipeptídeo e uma proteína, para gerar oxigênio molecular, e para remover peróxido de hidrogênio do tecido, processos para degradar ou converter um material celulósico, e para produzir um produto de fermentação, e, formulação de caldo integral ou composição de cultura de células
CN103998605B (zh) 2011-12-20 2021-08-03 诺维信股份有限公司 纤维二糖水解酶变体和编码它们的多核苷酸
US20150017670A1 (en) 2011-12-21 2015-01-15 Novozymes, Inc. Methods For Determining The Degradation Of A Biomass Material
BR112014026625A2 (pt) 2012-04-27 2017-07-18 Novozymes Inc E Novozymes As variante do polipeptídeo, polinucleotídeo isolado, célula hospedeira recombinante, métodos para produção de uma variante do polipeptídeo e para obtenção de uma variante do polipeptídeo, planta, parte de planta ou célula de planta transgênica, processos para degradação ou conversão de um material celulósico, para produção de um produto da fermentação e para fermentação de um material celulósico, composição, e, formulação ou composição de cultura celular de caldo inteiro
BR112014032865A2 (pt) 2012-07-18 2017-08-01 Novozymes As método para tratamento de têxtil de poliéster, e, composição
BR112015005884A2 (pt) 2012-09-19 2017-08-08 Novozymes Inc E Novozymes As processos para degradação de um material celulósico, para produção de um produto da fermentação, e de fermentação de um material celulósico, composição, e, formulação de caldo inteiro ou composição de cultura de células
US9708592B2 (en) 2012-09-28 2017-07-18 Novosymes, Inc. Polypeptides having cellulolytic enhancing activity and polynucleotides encoding same
EP2903412B1 (en) 2012-10-08 2019-09-11 Novozymes A/S Polypeptides having cellulolytic enhancing activity and polynucleotides encoding same
US20150275194A1 (en) 2012-10-24 2015-10-01 Novozymes A/S Polypeptides Having Cellulolytic Enhancing Activity And Polynucleotides Encoding Same
AU2013358981A1 (en) 2012-12-14 2015-06-04 Novozymes A/S Polypeptides having cellulolytic enhancing activity and polynucleotides encoding same
WO2014099798A1 (en) 2012-12-19 2014-06-26 Novozymes A/S Polypeptides having cellulolytic enhancinc activity and polynucleotides encoding same
CN105164254B (zh) 2013-03-08 2019-06-28 诺维信公司 纤维二糖水解酶变体和编码它们的多核苷酸
DK2994529T3 (en) 2013-05-10 2019-03-04 Novozymes As Polypeptides with xylanase activity and polynucleotides encoding them
BR112016004818B1 (pt) 2013-09-04 2022-05-31 Novozymes A/S Um processo para degradação de um material celulósico, um processo para produção de um produto de fermentação, um processo de fermentação de um material celulósico e uma composição de enzimas
WO2015081139A1 (en) 2013-11-26 2015-06-04 Novozymes A/S Enzyme compositions and uses thereof
MY205075A (en) 2014-01-07 2024-10-01 Novozymes As Process for degrading mannan-containing cellulosic materials
DK3152315T3 (en) 2014-06-06 2018-11-26 Novozymes As ENZYME COMPOSITIONS AND APPLICATIONS THEREOF
BR112017003847B1 (pt) 2014-08-28 2024-01-09 Renescience A/S Processo para solubilização de resíduos tais como resíduos sólidos urbanos (rsu), e processo para produção de um produto de fermentação
US11390898B2 (en) 2014-09-05 2022-07-19 Novozymes A/S Polypeptides having cellobiohydrolase activity and polynucleotides encoding same
US10066244B2 (en) 2014-09-23 2018-09-04 Novozymes A/S Process for producing ethanol and fermenting organisms
PL3640336T3 (pl) 2015-01-28 2022-08-01 Dsm Ip Assets B.V. Sposób enzymatycznej hydrolizy materiału lignocelulozowego i fermentacji cukrów
WO2016120298A1 (en) 2015-01-28 2016-08-04 Dsm Ip Assets B.V. Process for enzymatic hydrolysis of lignocellulosic material and fermentation of sugars
MY181342A (en) 2015-01-28 2020-12-21 Dsm Ip Assets Bv Process for enzymatic hydrolysis of lignocellulosic material and fermentation of sugars
EP4458964A3 (en) 2015-02-24 2025-03-26 Novozymes A/S Cellobiohydrolase variants and polynucleotides encoding same
BR112017018461A2 (pt) 2015-03-12 2018-04-17 Novozymes As processos para hidrólise multiestágio, para produção de um produto de fermentação, e, para aumento de rendimento de açúcar de hidrólise.
US20180051306A1 (en) 2015-03-12 2018-02-22 Novozymes A/S Enzymatic Hydrolysis with Hemicellulolytic Enzymes
EP3268484B1 (en) 2015-03-12 2020-06-17 Novozymes A/S Multi-stage enzymatic hydrolysis of lignocellulosic biomass
WO2016169893A1 (en) 2015-04-20 2016-10-27 Dsm Ip Assets B.V. Whole fermentation broth
WO2016169892A1 (en) 2015-04-20 2016-10-27 Dsm Ip Assets B.V. Process for enzymatic hydrolysis of lignocellulosic material and fermentation of sugars
WO2016188459A1 (en) 2015-05-27 2016-12-01 Novozymes A/S Polypeptides having cellobiohydrolase activity and polynucleotides encoding same
WO2016207144A1 (en) 2015-06-22 2016-12-29 Dsm Ip Assets B.V. Process for enzymatic hydrolysis of lignocellulosic material and fermentation of sugars
US20180216089A1 (en) 2015-07-24 2018-08-02 Novozymes, Inc. Polypeptides Having Beta-Xylosidase Activity And Polynucleotides Encoding Same
WO2017019490A1 (en) 2015-07-24 2017-02-02 Novozymes Inc. Polypeptides having arabinofuranosidase activity and polynucleotides encoding same
CN107949637A (zh) 2015-09-04 2018-04-20 诺维信公司 抑制酶组合物的aa9溶解性多糖单加氧酶催化的失活的方法
DK3353195T3 (da) 2015-09-22 2021-11-22 Novozymes As Polypeptider med cellobiohydrolaseaktivitet og polynukleotider, der koder for dem
WO2017070219A1 (en) 2015-10-20 2017-04-27 Novozymes A/S Lytic polysaccharide monooxygenase (lpmo) variants and polynucleotides encoding same
CN108136452A (zh) 2015-11-02 2018-06-08 雷内科学有限公司 用混合酶溶解城市固体废物
BR112018015184B1 (pt) 2016-02-19 2022-09-06 Intercontinental Great Brands Llc Processos para criar múltiplas correntes de valor a partir de fontes de biomassa
EP4410974A3 (en) 2016-03-02 2025-04-02 Novozymes A/S Cellobiohydrolase variants and polynucleotides encoding same
DK3433358T3 (da) 2016-03-24 2022-09-26 Novozymes As Cellobiohydrolasevarianter og polynukleotider, der koder for dem
WO2017205535A1 (en) 2016-05-27 2017-11-30 Novozymes, Inc. Polypeptides having endoglucanase activity and polynucleotides encoding same
WO2017211957A1 (en) 2016-06-09 2017-12-14 Dsm Ip Assets B.V. Seed train for large scale enzyme production
WO2018019948A1 (en) 2016-07-29 2018-02-01 Dsm Ip Assets B.V. Polypeptides having cellulolytic enhancing activity and uses thereof
WO2018026868A1 (en) 2016-08-01 2018-02-08 Novozymes, Inc. Polypeptides having endoglucanase activity and polynucleotides encoding same
WO2018085370A1 (en) 2016-11-02 2018-05-11 Novozymes A/S Processes for reducing production of primeverose during enzymatic saccharification of lignocellulosic material
EP3545099A1 (en) 2016-11-24 2019-10-02 DSM IP Assets B.V. Enzyme composition
BR112019010355B1 (pt) 2016-11-24 2024-03-05 Dsm Ip Assets B.V. Composição de enzimas
WO2018185071A1 (en) 2017-04-03 2018-10-11 Dsm Ip Assets B.V. Process for enzymatic hydrolysis of lignocellulosic material and fermentation of sugars
SI3695001T1 (sl) 2017-10-09 2024-03-29 Versalis S.P.A. Postopek encimske hidrolize lignoceluloznega materiala in fermentacije sladkorjev
WO2019074828A1 (en) 2017-10-09 2019-04-18 Danisco Us Inc CELLOBIOSE DEHYDROGENASE VARIANTS AND METHODS OF USE
CN118726495A (zh) 2017-10-23 2024-10-01 诺维信公司 减少生物燃料发酵系统中乳酸的方法
WO2019086370A1 (en) 2017-10-30 2019-05-09 Dsm Ip Assets B.V. Process for enzymatic hydrolysis of lignocellulosic material and fermentation of sugars
MY200112A (en) 2017-10-30 2023-12-07 Versalis Spa Process for enzymatic hydrolysis of lignocellulosic material and fermentation of sugars
WO2019185681A1 (en) 2018-03-28 2019-10-03 Dsm Ip Assets B.V. Enzyme composition
BR112020018791A2 (pt) 2018-03-28 2020-10-13 Dsm Ip Assets B.V. composição de enzima
EP3781697A1 (en) 2018-04-20 2021-02-24 Renescience A/S Method for determining chemical compounds in waste
MY202507A (en) 2018-05-17 2024-05-01 Dsm Ip Assets Bv Process for producing a polypeptide
ES2944736T3 (es) 2018-05-30 2023-06-23 Versalis Spa Proceso para producir azúcares a partir de materiales de carbohidratos
WO2020058248A1 (en) 2018-09-18 2020-03-26 Dsm Ip Assets B.V. Process for enzymatic hydrolysis of carbohydrate material and fermentation of sugars
WO2020058253A1 (en) 2018-09-18 2020-03-26 Dsm Ip Assets B.V. Process for enzymatic hydrolysis of carbohydrate material and fermentation of sugars
WO2020058249A1 (en) 2018-09-18 2020-03-26 Dsm Ip Assets B.V. Process for enzymatic hydrolysis of carbohydrate material and fermentation of sugars
EP3870715A1 (en) 2018-10-24 2021-09-01 DSM IP Assets B.V. Process for enzymatic hydrolysis of carbohydrate material and fermentation of sugars
CN113302293A (zh) 2018-12-12 2021-08-24 诺维信公司 具有木聚糖酶活性的多肽以及编码这些多肽的多核苷酸
WO2020182843A1 (en) 2019-03-12 2020-09-17 Dsm Ip Assets B.V. Process for producing a fermentation broth
WO2021048164A1 (en) 2019-09-10 2021-03-18 Dsm Ip Assets B.V. Enzyme composition
CN110981965B (zh) * 2019-11-06 2022-11-15 天津科技大学 一种提高木质纤维素水解率的融合蛋白、构建方法、表达及应用
GB202005073D0 (en) 2020-04-06 2020-05-20 Mellizyme Biotechnology Ltd Enzymatic degradation of plastics
WO2022013148A1 (en) 2020-07-13 2022-01-20 Dsm Ip Assets B.V. Process for the production of biogas
EP4240543A1 (en) 2020-11-04 2023-09-13 Renescience A/S Method for enzymatic and/or microbial processing of waste comprising recirculation of process water
BR112023020370A2 (pt) 2021-04-06 2023-11-21 Dsm Ip Assets Bv Composição de enzimas
CA3216054A1 (en) 2021-04-06 2022-10-13 Dsm Ip Assets B.V. Enzyme composition
EP4320252A1 (en) 2021-04-06 2024-02-14 DSM IP Assets B.V. Enzyme composition
AU2022253636C1 (en) 2021-04-08 2025-04-03 Versalis S.P.A. Process for the preparation of a sugar product and a fermentation product
CN114904384B (zh) * 2021-06-04 2023-08-22 浙江施维康生物医学材料有限公司 一种含生物酶的空气净化剂及其制备方法

Family Cites Families (137)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB1296839A (pt) 1969-05-29 1972-11-22
GB1372034A (en) 1970-12-31 1974-10-30 Unilever Ltd Detergent compositions
GB1483591A (en) 1973-07-23 1977-08-24 Novo Industri As Process for coating water soluble or water dispersible particles by means of the fluid bed technique
GB1590432A (en) 1976-07-07 1981-06-03 Novo Industri As Process for the production of an enzyme granulate and the enzyme granuate thus produced
DK187280A (da) 1980-04-30 1981-10-31 Novo Industri As Ruhedsreducerende middel til et fuldvaskemiddel fuldvaskemiddel og fuldvaskemetode
DK263584D0 (da) 1984-05-29 1984-05-29 Novo Industri As Enzymholdige granulater anvendt som detergentadditiver
US4933287A (en) 1985-08-09 1990-06-12 Gist-Brocades N.V. Novel lipolytic enzymes and their use in detergent compositions
EG18543A (en) 1986-02-20 1993-07-30 Albright & Wilson Protected enzyme systems
DK122686D0 (da) 1986-03-17 1986-03-17 Novo Industri As Fremstilling af proteiner
EP0258068B1 (en) 1986-08-29 1994-08-31 Novo Nordisk A/S Enzymatic detergent additive
NZ221627A (en) 1986-09-09 1993-04-28 Genencor Inc Preparation of enzymes, modifications, catalytic triads to alter ratios or transesterification/hydrolysis ratios
EP0305216B1 (en) 1987-08-28 1995-08-02 Novo Nordisk A/S Recombinant Humicola lipase and process for the production of recombinant humicola lipases
JPS6474992A (en) 1987-09-16 1989-03-20 Fuji Oil Co Ltd Dna sequence, plasmid and production of lipase
EP0394352B1 (en) 1988-01-07 1992-03-11 Novo Nordisk A/S Enzymatic detergent
DK6488D0 (da) 1988-01-07 1988-01-07 Novo Industri As Enzymer
JP3079276B2 (ja) 1988-02-28 2000-08-21 天野製薬株式会社 組換え体ｄｎａ、それを含むシュードモナス属菌及びそれを用いたリパーゼの製造法
US5776757A (en) 1988-03-24 1998-07-07 Novo Nordisk A/S Fungal cellulase composition containing alkaline CMC-endoglucanase and essentially no cellobiohydrolase and method of making thereof
EP0406314B1 (en) 1988-03-24 1993-12-01 Novo Nordisk A/S A cellulase preparation
US5223409A (en) 1988-09-02 1993-06-29 Protein Engineering Corp. Directed evolution of novel binding proteins
GB8915658D0 (en) 1989-07-07 1989-08-23 Unilever Plc Enzymes,their production and use
US5110735A (en) 1989-09-26 1992-05-05 Midwest Research Institute Thermostable purified endoglucanase from thermophilic bacterium acidothermus cellulolyticus
US5536655A (en) 1989-09-26 1996-07-16 Midwest Research Institute Gene coding for the E1 endoglucanase
US5275944A (en) 1989-09-26 1994-01-04 Midwest Research Institute Thermostable purified endoglucanas from acidothermus cellulolyticus ATCC 43068
NZ237549A (en) 1990-03-23 1993-06-25 Gist Brocades Nv Production of enhanced levels of enzymes in the seeds of transgenic plants and the use of these seeds
EP0528828B2 (de) 1990-04-14 1997-12-03 Genencor International GmbH Alkalische bacillus-lipasen, hierfür codierende dna-sequenzen sowie bacilli, die diese lipasen produzieren
DE69107455T3 (de) 1990-05-09 2004-09-23 Novozymes A/S Eine ein endoglucanase enzym enthaltende zellulasezubereitung.
DK115890D0 (da) 1990-05-09 1990-05-09 Novo Nordisk As Enzym
DK0548228T3 (da) 1990-09-13 1999-05-10 Novo Nordisk As Lipasevarianter
IL99552A0 (en) 1990-09-28 1992-08-18 Ixsys Inc Compositions containing procaryotic cells,a kit for the preparation of vectors useful for the coexpression of two or more dna sequences and methods for the use thereof
EP0495257B1 (en) 1991-01-16 2002-06-12 The Procter & Gamble Company Compact detergent compositions with high activity cellulase
EP0511456A1 (en) 1991-04-30 1992-11-04 The Procter & Gamble Company Liquid detergents with aromatic borate ester to inhibit proteolytic enzyme
HU213044B (en) 1991-04-30 1997-01-28 Procter & Gamble Built liquid detergents with boric-polyol complex to inhibit proteolytic enzyme with additives improving detergent effect
DE69226182T2 (de) 1991-05-01 1999-01-21 Novo Nordisk A/S, Bagsvaerd Stabilisierte enzyme und waschmittelzusammensetzungen
DK72992D0 (da) 1992-06-01 1992-06-01 Novo Nordisk As Enzym
DK88892D0 (da) 1992-07-06 1992-07-06 Novo Nordisk As Forbindelse
WO1994002597A1 (en) 1992-07-23 1994-02-03 Novo Nordisk A/S MUTANT α-AMYLASE, DETERGENT, DISH WASHING AGENT, AND LIQUEFACTION AGENT
MX9306229A (es) 1992-10-06 1994-05-31 Novo Nordisk As Variantes de celulasa y composiciones detergentes que la contienen.
EP0689589B2 (en) 1993-02-11 2009-09-02 Genencor International, Inc. Oxidatively stable alpha-amylase
DE69433499T2 (de) 1993-03-10 2004-12-02 Novozymes A/S Enzyme mit xylanaseaktivität aus aspergillus aculeatus
AU673078B2 (en) 1993-04-27 1996-10-24 Genencor International, Inc. New lipase variants for use in detergent applications
DK52393D0 (pt) 1993-05-05 1993-05-05 Novo Nordisk As
JP2859520B2 (ja) 1993-08-30 1999-02-17 ノボ ノルディスク アクティーゼルスカブ リパーゼ及びそれを生産する微生物及びリパーゼ製造方法及びリパーゼ含有洗剤組成物
BR9407808A (pt) 1993-10-13 1997-05-06 Novo Nordisk As Variante de peroxidase com melhorada estabilidade para peróxido de hidrogenio em condições alcalinas composição de alvejamento e composição detergente
JPH07143883A (ja) 1993-11-24 1995-06-06 Showa Denko Kk リパーゼ遺伝子及び変異体リパーゼ
DE4343591A1 (de) 1993-12-21 1995-06-22 Evotec Biosystems Gmbh Verfahren zum evolutiven Design und Synthese funktionaler Polymere auf der Basis von Formenelementen und Formencodes
US5605793A (en) 1994-02-17 1997-02-25 Affymax Technologies N.V. Methods for in vitro recombination
AU1806795A (en) 1994-02-22 1995-09-04 Novo Nordisk A/S A method of preparing a variant of a lipolytic enzyme
AU1890095A (en) 1994-03-08 1995-09-25 Novo Nordisk A/S Novel alkaline cellulases
EP0755442B1 (en) 1994-05-04 2002-10-09 Genencor International, Inc. Lipases with improved surfactant resistance
DK0765394T3 (da) 1994-06-03 2001-12-10 Novozymes As Oprensede Myceliopthora-laccaser og nukleinsyrer der koder for disse
AU2884595A (en) 1994-06-20 1996-01-15 Unilever Plc Modified pseudomonas lipases and their use
WO1996000292A1 (en) 1994-06-23 1996-01-04 Unilever N.V. Modified pseudomonas lipases and their use
EP1559776A3 (en) 1994-06-30 2006-01-11 Novozymes Biotech, Inc. Non-toxic, non-toxigenic, non-pathogenic Fusarium expression system and promoters and terminators for use therein
US5919691A (en) 1994-10-06 1999-07-06 Novo Nordisk A/S Enzyme and enzyme preparation with endoglucanase activity
BE1008998A3 (fr) 1994-10-14 1996-10-01 Solvay Lipase, microorganisme la produisant, procede de preparation de cette lipase et utilisations de celle-ci.
CN1167503A (zh) 1994-10-26 1997-12-10 诺沃挪第克公司 一种具有脂解活性的酶
AR000862A1 (es) 1995-02-03 1997-08-06 Novozymes As Variantes de una ó-amilasa madre, un metodo para producir la misma, una estructura de adn y un vector de expresion, una celula transformada por dichaestructura de adn y vector, un aditivo para detergente, composicion detergente, una composicion para lavado de ropa y una composicion para la eliminacion del
JPH08228778A (ja) 1995-02-27 1996-09-10 Showa Denko Kk 新規なリパーゼ遺伝子及びそれを用いたリパーゼの製造方法
WO1996029397A1 (en) 1995-03-17 1996-09-26 Novo Nordisk A/S Novel endoglucanases
US6313081B1 (en) 1995-04-28 2001-11-06 Henkel Kommanditgesellschaft Auf Aktien (Kgaa) Detergents comprising cellulases
JP4307549B2 (ja) 1995-07-14 2009-08-05 ノボザイムス アクティーゼルスカブ 脂肪分解活性を有する修飾された酵素
EP0851913B1 (en) 1995-08-11 2004-05-19 Novozymes A/S Novel lipolytic enzymes
US20030044956A1 (en) 1995-08-23 2003-03-06 Short Jay M. Enzymes having carboxymethyl cellulase activity and methods of use thereof
ES2525677T3 (es) 1995-10-17 2014-12-29 Ab Enzymes Oy Celulasas, genes que las codifican y usos de las mismas
US5763385A (en) 1996-05-14 1998-06-09 Genencor International, Inc. Modified α-amylases having altered calcium binding properties
AU719536B2 (en) 1996-06-28 2000-05-11 Novozymes A/S A recombinant enzyme with dextranase activitiy
WO1998008940A1 (en) 1996-08-26 1998-03-05 Novo Nordisk A/S A novel endoglucanase
EP0966521A1 (en) 1996-09-13 1999-12-29 Novo Nordisk Biotech, Inc. Cells having dna insertion mutations which produce altered amounts of a polypeptide
CN100362100C (zh) 1996-09-17 2008-01-16 诺沃奇梅兹有限公司 纤维素酶变体
US6451063B1 (en) 1996-09-25 2002-09-17 Genencor International, Inc. Cellulase for use in industrial processes
CA2265734A1 (en) 1996-10-08 1998-04-16 Novo Nordisk A/S Diaminobenzoic acid derivatives as dye precursors
US6017870A (en) 1996-10-09 2000-01-25 Genencor International, Inc. Purified cellulase and method of producing
US7883872B2 (en) 1996-10-10 2011-02-08 Dyadic International (Usa), Inc. Construction of highly efficient cellulase compositions for enzymatic hydrolysis of cellulose
US5811381A (en) 1996-10-10 1998-09-22 Mark A. Emalfarb Cellulase compositions and methods of use
BR9712878A (pt) 1996-11-04 2000-02-01 Novo Nordisk As Variante de enzima subtilase, processos para a identificação de uma variante de protease apresentando estabilidade autoproteolìtica e paraq a produção de uma enzima subtilase mutante e de uma variante de subtilase, sequência de dna, vetor, célula hospedeira microbiana, composição e uso de uma variante de subtilase.
EP0948610B1 (en) 1996-11-04 2011-05-25 Novozymes A/S Subtilase variants and compositions
US5989899A (en) 1996-12-23 1999-11-23 Genencor International, Inc. Oversized cellulase compositions for use in detergent compositions and in the treatment of textiles
US6159731A (en) 1997-02-12 2000-12-12 Massachusetts Institute Of Technology Daxx, a Fas-binding protein that activates JNK and apoptosis
US6558937B1 (en) 1997-07-31 2003-05-06 Dsm N.V. Cellulose degrading enzymes of aspergillus
US5871550A (en) 1997-08-26 1999-02-16 Genencor International, Inc. Mutant Thermonospora spp. cellulase
US6562612B2 (en) 1997-11-19 2003-05-13 Genencor International, Inc. Cellulase producing actinomycetes, cellulase produced therefrom and method of producing same
ATE290599T1 (de) 1997-11-19 2005-03-15 Genencor Int Cellulase aus actinomycetes und herstellungsverfahren dafür
JP2001523464A (ja) 1997-11-19 2001-11-27 ジェネンコア インターナショナル インコーポレーテッド 放線菌類により産生されるセルラーゼとその産生方法
DE69836227T2 (de) 1997-12-16 2007-08-23 Genencor International, Inc., Palo Alto Verfahren zur herstellung egiii-ähnlicher enzyme
US6506559B1 (en) 1997-12-23 2003-01-14 Carnegie Institute Of Washington Genetic inhibition by double-stranded RNA
EP1408108B1 (en) 1998-06-24 2009-07-15 Genencor International, Inc. Cellulase producing actinomycetes, cellulase produced therefrom and method of producing same
AU6188599A (en) 1998-10-26 2000-05-15 Novozymes A/S Constructing and screening a dna library of interest in filamentous fungal cells
US6511824B1 (en) 1999-03-17 2003-01-28 Exelixis, Inc. Nucleic acids and polypeptides of invertebrate TWIK channels and methods of use
CN1526820B (zh) 1999-03-22 2010-05-26 诺沃奇梅兹有限公司 用于在真菌细胞中表达基因的启动子
EP1179051A4 (en) 1999-05-19 2003-04-23 Midwest Research Inst ENDOGLUCANASE E1 VARIANTS: Y245G, Y82R AND W42R
US6531644B1 (en) 2000-01-14 2003-03-11 Exelixis, Inc. Methods for identifying anti-cancer drug targets
ES2166316B1 (es) 2000-02-24 2003-02-16 Ct Investig Energeticas Ciemat Procedimiento de produccion de etanol a partir de biomasa lignocelulosica utilizando una nueva levadura termotolerante.
WO2001077315A1 (en) 2000-04-07 2001-10-18 Novozymes A/S Signal sequence trapping
AU7707801A (en) 2000-07-21 2002-02-05 Us Health Adult human dental pulp stem cells in vitro and in vivo
JP2004518413A (ja) 2000-10-12 2004-06-24 エクセリクシス・インコーポレイテッド ヒトｅｃｔ２と使用方法
US7151204B2 (en) 2001-01-09 2006-12-19 Monsanto Technology Llc Maize chloroplast aldolase promoter compositions and methods for use thereof
JP2004527261A (ja) 2001-05-18 2004-09-09 ノボザイムス アクティーゼルスカブ セロビアーゼ活性を有するポリペプチド及びそれをコードするポリヌクレオチド
US6982159B2 (en) 2001-09-21 2006-01-03 Genencor International, Inc. Trichoderma β-glucosidase
US7056721B2 (en) 2001-12-18 2006-06-06 Genencor International, Inc. EGVI endoglucanase and nucleic acids encoding the same
US7049125B2 (en) 2001-12-18 2006-05-23 Genencor International, Inc. EGVIII endoglucanase and nucleic acids encoding the same
US7045331B2 (en) 2001-12-18 2006-05-16 Genencor International, Inc. EGVII endoglucanase and nucleic acids encoding the same
US7005289B2 (en) 2001-12-18 2006-02-28 Genencor International, Inc. BGL5 β-glucosidase and nucleic acids encoding the same
US7045332B2 (en) 2001-12-18 2006-05-16 Genencor International, Inc. BGL4 β-glucosidase and nucleic acids encoding the same
US7622284B2 (en) 2002-01-23 2009-11-24 Royal Nedalco B.V. Transformed eukaryotic cells that directly convert xylose to xylulose
WO2004013350A1 (en) 2002-08-01 2004-02-12 Novozymes A/S Methods for rolling circle amplification and signal trapping of libraries
AU2003263842A1 (en) 2002-08-16 2004-03-03 Genencor International, Inc. Novel variant hyprocrea jecorina cbh1 cellulases
US7273738B2 (en) * 2002-10-01 2007-09-25 Novozymes A/S Family GH-61 polypeptides
EP1556512B1 (en) 2002-11-07 2016-06-15 Danisco US Inc. Bgl6 beta-glucosidase and nucleic acids encoding the same
US7407788B2 (en) 2002-11-21 2008-08-05 Danisco A/S, Genencor Division BGL7 beta-glucosidase and nucleic acids encoding the same
EP2298876A1 (en) 2003-03-21 2011-03-23 Genencor International, Inc. Novel cbh1 homologs and variant cbh1 cellulases
CN101374948B (zh) 2003-04-01 2012-04-11 金克克国际有限公司 灰腐质霉cbh1.1变体
ATE524543T1 (de) 2003-05-29 2011-09-15 Genencor Int Neue trichoderma-gene
DK1682656T3 (da) 2003-10-28 2013-11-18 Novozymes Inc Polypeptider med beta-glucosidaseaktivitet og polynukleotider, der koder for dem
WO2006011899A1 (en) 2003-11-25 2006-02-02 L-3 Communications Security and Detection Systems Corporation Security system for detecting nuclear masses
AU2005206251A1 (en) 2004-01-21 2005-08-04 Novozymes A/S Production of a monoclonal antibody in a heterokaryon fungus or in a fungal host cell
EP2305703B1 (en) 2004-01-30 2014-03-12 Novozymes Inc. Polypeptides having cellulolytic enhancing activity and polynucleotides encoding same
JP5015610B2 (ja) * 2004-02-06 2012-08-29 ノボザイムス，インコーポレイティド セルロース分解増強活性を有するポリペプチド及びそれをコードするポリヌクレオチド
WO2006078256A2 (en) 2004-02-12 2006-07-27 Novozymes, Inc. Polypeptides having xylanase activity and polynucleotides encoding same
CN1922314B (zh) 2004-02-25 2010-05-05 诺维信公司 真菌细胞壁降解酶
US8097445B2 (en) 2004-03-25 2012-01-17 Danisco Us Inc. Exo-endo cellulase fusion protein
JP5114194B2 (ja) 2004-03-25 2013-01-09 ジェネンコー・インターナショナル・インク セルラーゼ融合タンパク質及びこれをコードする異種セルラーゼ融合構築体
US20060004699A1 (en) 2004-06-30 2006-01-05 Nokia Corporation Method and system for managing metadata
DK176540B1 (da) 2004-09-24 2008-07-21 Cambi Bioethanol Aps Fremgangsmåde til behandling af biomasse og organisk affald med henblik på at udvinde önskede biologisk baserede produkter
US8008056B2 (en) 2004-12-30 2011-08-30 Danisco Us Inc. Variant Hypocrea jecorina CBH2 cellulases
US7932063B2 (en) 2005-04-12 2011-04-26 E. I. Du Pont De Nemours And Company Treatment of biomass to obtain fermentable sugars
WO2006117432A1 (en) 2005-04-29 2006-11-09 Ab Enzymes Oy Improved cellulases
WO2007019442A2 (en) 2005-08-04 2007-02-15 Novozymes, Inc. Polypeptides having beta-glucosidase activity and polynucleotides encoding same
CN104404106A (zh) 2005-09-30 2015-03-11 诺维信股份有限公司 用于增强纤维素材料降解或转化的方法
FI120045B (fi) 2005-12-22 2009-06-15 Roal Oy Selluloosamateriaalin käsittely ja siinä käyttökelpoiset entsyymit
BRPI0620318B1 (pt) 2005-12-22 2019-02-05 Ab Enzymes Oy proteína de fusão endoglicanase, polinucleotídeo isolado, vetor de expressão, célula hospedeira de trichoderma reesei, preparação de enzima, composição detergente, cepa de escherichia coli, e processos para produção de um polipeptídeo endoglicanase, para bioestonagem, para bioacabamento, para tratamento de material têxtil contendo fibra celulósica, para tratamento de polpa ou fibra derivada de madeira, e para aperfeiçoamento de qualidade de alimentação animal
US8304212B2 (en) 2006-07-10 2012-11-06 Dyadic International, Inc. Methods and compositions for degradation of lignocellulosic material
BRPI0714870A2 (pt) 2006-07-21 2013-05-28 Novozymes Inc mÉtodo para produzir um polipeptÍdeo secretado tendo atividade biolàgica, proteÍna de fusço isolada, polinucleotÍdeo isolado, construÇço de proteÍna de fusço, vetor de expressço, cÉlula hospedeira féngica, mÉtodos para degradar ou conventer um material celulàsico e para produzir uma substÂncia
BRPI0817471A2 (pt) 2007-09-28 2014-10-14 Novozymes As Polipeptídeo isolado, polinucleotídeo isolado, construção de ácido nucleico, célula hospedeira recombinante, métodos para produzir o polipeptídeo para produzir um mutante de uma célula precursora, para inibir a expressão de um polipeptídeo em uma célula, para produzir uma proteína, e para degradar um xilano acetilado, planta transgênica, parte de planta ou célula de planta, e , moléculas de rna inibidoras de filamento duplo
CN101978049B (zh) 2007-11-30 2013-11-06 诺维信公司 具有阿拉伯呋喃糖苷酶活性的多肽及其编码多核苷酸
CA2707771A1 (en) 2007-12-05 2009-06-25 Novozymes A/S Polypeptides having xylanase activity and polynucleotides encoding same
CN101909461B (zh) 2007-12-06 2015-10-07 诺维信公司 具有乙酰木聚糖酯酶活性的多肽和编码该多肽的多核苷酸
US8034995B2 (en) 2007-12-07 2011-10-11 Novozymes A/S Polypeptides having feruloyl esterase activity and polynucleotides encoding same

Also Published As

Publication number Publication date
BRPI0922773A2 (pt) 2017-05-30
WO2010065830A1 (en) 2010-06-10
US7771983B2 (en) 2010-08-10
CA2745760A1 (en) 2010-06-10
US7868227B2 (en) 2011-01-11
EP2373788A1 (en) 2011-10-12
CN102300986A (zh) 2011-12-28
US20100263092A1 (en) 2010-10-14
US20100143971A1 (en) 2010-06-10

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