BRPI1011445B1 - Adenovírus oncolíticos para o trat=nto de câncer - Google Patents

Abstract

ADENOVÍRUS ONCOLÍTICOS PARA O TRATAMENTO DE CÂNCER A invenção se relaciona a um adenovírus oncolítico que compreende uma sequência que codifica uma enzima hialuronidase inserida no seu genoma. Este adenovírus distribui-se de forma mais eficiente pela massa do tumor e, consequentemente, o efeito oncolítico é aumentado. A injeção endovenosa do adenovírus oncolítico da invenção gera regressões no volume do tumor. Portanto, o adenovírus oncolítico da presente invenção é de utilidade para o tratamento de um câncer ou de um estado pré-maligno do mesmo.

Description

A invenção se refere ao campo da medicina, com mais particularidade ao campo da oncologia, e especificamente à viroterapia.

Técnica anterior

O tratamento atual de câncer se baseia principalmente na quimioterapia, radioterapia e cirurgia. Apesar de uma taxa elevada de cura do câncer nos estágios iniciais, a maior parte dos casos de câncer avançados é 10 incurável, porque eles não podem ser extirpados cirurgicamente ou porque as doses de radio ou quimioterapia administradas são limitadas pela sua toxicidade em células normais. Para amenizar esta situação, desenvolveram-se estratégias de biotecnologia que buscam aumentar a potência 15 e a seletividade dos tratamentos oncológicos. Entre elas, a terapia genética e a viroterapia utilizam virus com propósito terapêutico contra câncer. Na terapia genética, o virus é modificado para prevenir a sua replicação e para servir como veiculo ou vetor de material genético 20 terapêutico. Pelo contrário, a viroterapia utiliza virus que se replicam e se propagam seletivamente nas células tumorais. Na viroterapia, a célula tumoral morre por meio do efeito citopático causado pela replicação do virus no seu interior, em vez de pelo efeito de um gene terapêutico.

A replicação preferencial em uma célula tumoral é chamada de oncotropismo, e a lise do tumor é chamada de oncólise. Em um sentido estrito, os virus que se replicam seletivamente em tumores são chamados oncoliticos, muito embora em um sentido mais amplo a palavra oncolotico possa 30 ser aplicada a qualquer virus de replicação competente capaz de gerar a lise de células tumorais, mesmo sem seletividade. Nesta descrição, o termo oncolitico é usado nos dois sentidos.

A viroterapia do câncer é muito anterior à terapia genética. As primeiras observações das curas de tumores com virus datam do inicio do século passado. Em 1912, De Pace obteve regressões de tumores depois da 5 inoculação de virus da raiva em carcinomas cervicais.

Desde então, muitos tipos de virus foram injetados em tumores para o seu tratamento. Existem virus que exibem um oncotropismo natural, tais como parvovirus autônomo, virus da estomatite vesicular, e reovirus. Outros virus podem 10 ser manipulados geneticamente para se replicarem seletivamente em tumores. Por exemplo, o virus Herpes Simplex (HSV) tornou-se oncotrópico por meio da eliminação do gene da ribonucleotideo redutase, uma atividade enzimática desnecessária nas células em proliferação ativa, 15 tais como as células tumorais. Não obstante, o adenovirus, devido à sua baixa patogenicidade e alta capacidade de infectar células tumorais, tem sido o virus utilizado com mais freqüência na viroterapia e na terapia genética do câncer.

Cinquenta e um sorotipos humanos de adenovirus foram identificados e classificados em 6 grupos diferentes de A até F.

O adenovirus humano do tipo 5 (Ad5), que pertence ao grupo C, é um virus formado por um capsideo protéico 25 icosaédrico que contém um DNA linear de 36 quilobases. Em adultos, a infecção com Ad5 é tipicamente assintomática, e nas crianças ela causa um resfriado comum e conjuntivite. De um modo geral, o Ad5 infecta as células epiteliais que, no decorrer de uma infecção natural são as células do 30 epitélio brônquico. Ele entra na célula por meio da interação da fibra, a proteina virai que se estende como uma antena a partir dos doze vértices do capsideo, com uma proteina celular envolvida na adesão intercelular chamada Receptor de Coxsackie-Adenovirus (CAR). Quando o DNA viral chega ao interior do núcleo, ele inicia uma transcrição ordenada dos genes iniciais (El até E4) do virus. Os primeiros genes virais que são expressos são os 5 genes da região de inicio IA (EIA). A EIA liga-se à proteina celular Rb para liberar E2F e ativar assim a transcrição de outros genes virais, tais como E2, E3, e E4, e dos genes celulares que ativam o ciclo celular. Por outro lado, a E1B se liga à p53 para ativar o ciclo celular 10 e para impedir a apoptose da célula infectada. A E2 codifica as proteinas envolvidas na replicação do vírus; E3 codifica as proteínas que inibem a resposta imune antiviral; E4 codifica as proteínas envolvidas no transporte de RNA virai. A expressão dos genes iniciais 15 conduz à replicação do DNA do vírus, e uma vez que este foi replicado, é ativado o promotor tardio que conduz à expressão de um transcrito de RNA mensageiro, que por splicing gera todos os RNAs que codificam as proteínas estruturais que formam o capsídeo.

Existem dois aspectos importantes a se considerar em relação à concepção dos adenovirus oncolíticos: seletividade e potência. Para obter-se seletividade no à célula tumoral utilizaram-se três estratégias: a eliminação das funções virais que são necessárias para a replicação em 25 células normais, mas que não são necessárias nas células tumorais; o controle dos genes virais que iniciam a replicação, utilizando-se promotores seletivos de tumores; e a modificação das proteínas do capsídeo virai implicadas na infecção da célula hospedeira. Com estas 30 modificações genéticas, obteve-se um nível considerável de seletividade, com uma eficácia de replicação nas células tumorais da ordem de 10000 vezes superior à capacidade de replicação em células normais. Com relação à potência oncolitica, diversas modificações genéticas também foram descritas para aumentar a mesma. Estas modificações incluem: a) o aumento da liberação de virus, por exemplo, por meio de eliminação de E1B19K, super-expressão de E3- 5 11.6K (ADP), ou realocação da proteina E3/19K na membrana plasmática; e b) a inserção de um gene terapêutico no genoma do adenovirus oncolitico para gerar um "adenovirus oncolitico armado". Neste caso, o gene terapêutico terá de mediar a morte das células tumorais não infectadas por meio 10 da ativação de um pró-fármaco com efeito adjacente (quer dizer, que mata as células vizinhas não infectadas), a ativação do sistema imune contra o tumor, a indução da apoptose, a inibição da angiogênese, ou a eliminação da matriz extracelular, entre outras. Nestes casos, a maneira 15 e o tempo de expressão do gene terapêutico serão criticos no resultado final da abordagem terapêutica.

Na última década, diferentes adenovirus oncoliticos foram administrados a pacientes com tumores da cabeça e pescoço, ovários, cólon retais, pancreáticos, e 20 carcinomas hepatocelulares, entre outros. O perfil de segurança destes adenovirus nos ensaios clinicos foi muito promissor. Os efeitos prejudiciais detectados, tais como alguns sintomas semelhantes à gripe e aumento dos niveis de transaminases, foram bem tolerados, mesmo depois da 25 administração sistêmica de altas doses de virus (cfr. D. Ko et al., "Development of transcriptionally regulated oncolytic adenoviruses", Oncogene 2005, vol. 24, pp. 7763- 74; e T. Reid et al., "Intravascular adenoviral agents in cancer patients: lessons from clinical trials", Cancer Gene 30 Therapy 2002, vol. 9, pp. 979-86). Embora a administração dos adenovirus recombinantes induzisse uma supressão parcial do crescimento do tumor, a erradicação completa dos tumores não foi obtida e depois de um curto periodo de tempo os tumores voltaram a crescer rapidamente. Estes resultados ocorreram provavelmente porque o adenovirus injetado distribuiu-se somente em uma pequena parte do tumor para produzir uma resposta antitumoral limitada, de 5 modo que as células não infectadas continuaram a crescer rapidamente. Em um trabalho recente, observou-se que a replicação dos adenovirus oncoliticos em tumores xenógrafos humanos persistiu até 100 dias depois da administração sistêmica, muito embora esta replicação não 10 se traduzisse em uma erradicação completa do tumor (cfr. H. Sauthoff et al., "Intratumoral spread of wild-type adenovirus is limited to after local injection of human xenograft tumors: virus persists and spreads systemically at late time points", Human Gene Therapy 2003, vol. 14, pp. 15 425-33) . Esta baixa eficácia antitumoral se dá em parte porque o tecido conectivo e a matriz extracelular (ECM) presentes na célula tumoral impedem a correta distribuição dos adenovirus recombinantes pelo tumor.

Esta dificuldade dos adenovirus oncoliticos se 20 distribuírem eficientemente pela massa tumoral também foi descrita para outros fármacos antitumorais, tais como doxorubicina, taxol, vincristina, ou metotrexato. São muitos os estudos que demonstram a função da ECM na resistência das células tumorais aos fármacos de 25 quimioterapia (cfr. BP Toole et al., "Hyaluronan: a constitutive regulator of chemoresistance and malignancy in cancer cells", Seminars in cancer biology 2008, vol. 18, pp. 244-50). As células tumorais e estromais produzem e montam uma matriz de colágenos, proteoglicanos e outras 30 moléculas que dificultam o transporte de macromoléculas para dentro do tumor. O ácido hialurônico (HA) é um dos componentes principais da ECM envolvidos na resistência das células tumorais aos fármacos terapêuticos. O HA é super- expresso em uma grande variedade de tecidos malignos, e em muitos casos, os níveis de HA são um fator prognóstico da progressão tumoral. A interação de HA com os receptores CD44 e RHAMM aumenta a sobrevivência do tumor e a invasão.

Além disso, o HA pode promover metástases tumorais pela indução de aderência e migração de células, e proteção contra o sistema imune. Por outro lado, a inibição das interações entre o ácido halurônico e as células tumorais revertem a 10 resistência à grande quantidade de fármacos. Diferentes estudos realizados indicaram que as hialuronidases (enzimas que degradam o HA) aumentam a atividade de diferentes quimioterapias em pacientes com melanoma, sarcoma de Kaposi, tumores da cabeça e do pescoço, e metástases 15 hepáticas do cólon. O mecanismo de ação das hialuronidases ainda é desconhecido, sendo que de uma maneira geral ele é atribuído à diminuição das barreiras de aderência celular, uma diminuição da pressão intersticial, e uma melhora na penetração do fármaco anticancerígeno no tumor, mais que a 20 seus efeitos inibitórios das vias de sinalização relacionadas com a sobrevivência celular.

Recentemente, descreveu-se que a co-administração de hialuronidase com adenovirus oncolíticos por meio de injeção intratumoral reduz a progressão tumoral (cfr. S. 25 Ganesh et al., "Intratumoral coadministration of hialuronidase enzyme and oncolytic adenoviruses enhances virus potency in mestastasic tumor models", Clin Cancer Res 2008, vol. 14, pp. 3933-41). Nestes estudos, os adenovirus oncolíticos são administrados em quatro injeções 30 intratumorais e a hialuronidase é administrada de forma intratumoral a cada dois dias durante todo o tratamento. Este regime de administração tem pouca aplicação para os pacientes, porque a maioria dos tumores são inacessíveis para ser injetada de forma intratumoral. Tampouco os pacientes com doença disseminada (metástase) poderiam se beneficiar do tratamento proposto por Ganesh e colaboradores.

Apesar dos esforços até agora, ainda é necessário descobrir novas abordagens terapêuticas que sejam efetivas no tratamento do câncer.

Sumário da Invenção

Os inventores descobriram que um adenovirus que 10 se replica e que contém o gene da hialuronidase no seu genoma é distribuído mais eficientemente na massa tumoral. A expressão da hialuronidase por parte do adenovirus oncolitico resulta na degradação do ácido hialurônico que é parte da matriz extracelular do tumor. A degradação do 15 ácido hialurônico resulta em uma diminuição da pressão intersticial no tumor e em uma resistência menor do tumor à distribuição do adenovirus, de modo que se melhora a distribuição do virus de célula para célula pela massa tumoral. Esta melhor distribuição se traduz em um aumento 20 do efeito oncolitico. Os inventores descobriram que injetando o adenovirus oncolitico da invenção de forma endovenosa, são obtidas regressões do volume do tumor. Por essa razão, o adenovirus oncolitico da presente invenção é de utilidade para o tratamento do câncer. Além disso, a 25 expressão do gene da hialuronidase não afeta nem a replicação virai nem a citotoxicidade do adenovirus oncolitico.

Tal como mencionado anteriormente, descreveu-se que a co-administração intratumoral de um adenovirus 30 oncolitico e hialuronidase solúvel aumenta a eficácia antitumoral do adenovirus oncolitico. Não obstante, anteriormente à presente invenção o gene da hialuronidase não havia sido introduzido em qualquer adenovirus oncolitico para o tratamento do câncer. Tal como se encontra descrito nos exemplos, a administração intratumoral in vivo do adenovirus oncolitico da invenção aperfeiçoa o efeito antitumoral com relação a 5 um controle de adenovirus sem a hialuronidase inserida (vide a Figura 7). Porém, quando o adenovirus oncolitico da invenção é injetado de forma endovenosa (vide Figura 8 e Figura 9) e, em comparação aos resultados apresentados na Figura 2 do manuscrito de Ganesh et al., observa-se uma 10 inibição de crescimento de tumor muito maior com o adenovirus da presente invenção, o que indica que o tratamento da invenção é mais eficiente. Os tumores dos camundongos injetados com o adenovirus oncolitico da invenção (ICOVIR17) mostram áreas necróticas muito 15 extensas, áreas com células viáveis muito reduzidas, e grandes e numerosos focos de replicação virai, em comparação com os tumores injetados com o controle de adenovirus, ICOVIR15.

Além disso, com o adenovirus da invenção as doses 20 administradas são menores: em Ganesh et al. (supra) quatro injeções intratumorais de IxlO10 particulas virais são administradas, enquanto que na presente invenção é administrada uma única dose endovenosa de 2xl09 particulas virais. Isto significa uma redução da dose de 20 vezes, e a 25 vantagem de se tratar de uma dose única. Na sua abordagem, Ganesh et al. administram hialuronidase de forma intratumoral de dois em dois dias durante toda a experiência. Além disso, o adenovirus também é administrado de forma intratumoral no inicio do tratamento. 30 Esta administração intratumoral do virus e hialuronidase é dificilmente aplicável à clinica, pelo fato de que a maior parte dos tumores não são acessíveis para uma administração intratumoral. Presumivelmente, a co-administração de hialuronidase solúvel e adenovirus não foi realizada por uma via sistêmica, porque a probabilidade de que os dois componentes alcancem conjuntamente as células tumorais disseminadas no organismo é baixa.

A presente invenção permite a expressão da hialuronidase no local e no momento em que ocorre a replicação virai. Esta expressão de hialuronidase melhora a distribuição do virus pela massa tumoral, e aumenta a sua potência antitumoral. É viável administrar doses 10 ajustadas, não tóxicas para o animal e com uma grande eficácia no tratamento.

Na presente invenção, os adenovirus oncolíticos chegam às células tumorais alvo, uma vez no interior se replicam, expressam as proteínas de capsídeo e, ao mesmo 15 tempo, a hialuronidase codificada no genoma adenoviral é expressa. Esta hialuronidase foi modificada para ser liberada para o meio extracelular que envolve as células. No meio extracelular, a hialuronidase destrói a matriz e ajuda os adenovirus que foram replicados na infecção das 20 células tumorais vizinhas.

Desta maneira, um aspecto da invenção se refere a um adenovirus oncolitico que compreende uma sequência que codifica uma enzima de hialuronidase inserida no seu genoma.

Tal como é usado neste contexto, o termo "adenovirus oncolitico" significa um adenovirus que é capaz de replicar-se ou que é competente para replicação na célula tumoral. Nesta descrição, adenovirus oncolitico e adenovirus replicativo são sinônimos. Eles se diferenciam 30 de um adenovirus não replicativo, porque este último é incapaz de se replicar na célula alvo. Os adenovirus não replicativos são aqueles usados na terapia genética como veiculos de genes para as células alvo, uma vez que a meta é expressar o gene terapêutico dentro da célula intacta e não a lise da célula. Em vez disso, a ação terapêutica dos adenovirus oncoliticos se baseia precisamente na capacidade de se replicar e lisar a célula alvo, e em particular a 5 célula tumoral que se quer eliminar.

Outro aspecto da invenção se refere a uma composição farmacêutica que compreende uma quantidade terapeuticamente efetiva do adenovirus oncolitico, em conjunto com veiculos ou excipientes farmaceuticamente 10 aceitáveis. Outro aspecto da invenção se refere ao adenovirus oncolitico da invenção para o seu uso como um medicamento.

Outro aspecto da invenção se refere ao adenovirus oncolitico da invenção para o tratamento de um câncer ou 15 um estado pré-maligno do mesmo em um mamifero, incluindo um ser humano.

Outro aspecto da invenção se refere ao uso do adenovirus oncolitico para a fabricação de um medicamento destinado ao tratamento de um câncer ou um estado pré- 20 maligno do mesmo em um mamifero, incluindo um ser humano.

O tratamento é baseado na replicação destes adenovirus oncoliticos em tumores. Alternativamente, este aspecto da invenção pode ser formulado como um método para o tratamento em um mamifero, incluindo o homem, de um câncer 25 ou um estado pré-maligno do mesmo, que compreende a administração ao mamifero de uma quantidade efetiva do adenovirus oncolitico.

Outro aspecto da invenção se refere a um vetor de transporte que é capaz de recombinar-se com um genoma 30 adenoviral para a construção do adenovirus oncolitico da invenção. Este vetor compreende sequências repetidas terminais invertidas sequênciaadenovirais ("inverted terminal repeats", ITRs), uma sequência que promove a expressão da sequência que codifica a enzima hialuronidase, a sequência que codifica a enzima, e uma sequência de poliadenilação.

De acordo com uma modalidade particular, o 5 adenovirus oncolitico da invenção é um adenovirus humano, ou seja, que infecciona seres humanos. Particularmente, o adenovirus humano é selecionado a partir do grupo que consiste dos sorotipos 1-51 do adenovirus humano e os seus derivados. Entende-se como "derivado" um adenovirus 10 recombinante hibrido de dois ou mais sorotipos diferentes de adenovirus, por exemplo, adenovirus de sorotipo 5 com a fibra do adenovirus de sorotipo 3. Em uma modalidade particular da invenção, o adenovirus oncolitico humano é do sorotipo 5.

As hialuronidases são compreendidas por uma familia de enzimas que degradam o ácido hialurônico. Em seres humanos existem 6 genes que codificam as hialuronidases com diferentes propriedades e localizações. As isoformas Hyall e Hyal2 estão presentes na maior parte 20 dos tecidos, sendo que a Hyall constitui a forma predominante no plasma humano. A Hyal3 está presente na medula óssea e testículos, mas a sua função não é bem caracterizada. A hialuronidase PH20 é altamente expressa nos testículos e está envolvida no processo de fertilização 25 do ovócito pelo espermatozóide. A hialuronidase PH20 é ancorada à membrana plasmática e à membrana acrossômica interna dos espermatozóides, e confere ao espermatozóide a capacidade de penetrar através da matriz extracelular do cumulus (rico em ácido hialurônico) para alcançar a zona 30 pelúcida do ovócito. Durante a reação acrossômica, parte das hialuronidases ancoradas na membrana do espermatozóide é processada enzimaticamente para produzir uma forma solúvel da proteina, que é liberada a partir da membrana acrossômica. Além disso, a hialuronidase foi identificada como o fator de dispersão do veneno de cobras, aranhas, escorpiões e marimbondos.

Em uma modalidade particular, a enzima 5 hialuronidase é uma hialuronidase testicular de mamifero, e mais particularmente, hialuronidase testicular humana. A hialuronidase testicular humana (GenBank GenelD: 6677) também é conhecida como SPAM1, ou molécula de adesão do espermatozóide 1 ("sperm adesion molecule 1"), e PH-20. A 10 proteina de membrana PH20 é a única enzima da familia das hialuronidases de mamifero com atividade sob pH neutro. 0 gene que o codifica produz duas variantes de transcrição: variante 1, mais longa, que codifica a isoforma 1 da proteina (número de acesso do GenBank NP_003108.2) e 15 variante 2, que utiliza um splicing alternativo na região codificante 3' comparado com a variante 1, resultando em uma isoforma 2 com uma extremidade C-terminal mais curta (número de acesso do GenBank NP_694859.1).

Em uma modalidade particular da invenção, a 20 sequência da enzima tem eliminada a sequência correspondente ao dominio carbóxiterminal de ligação à para que a enzima seja solúvel (vide Figura 2) . A eliminação deste dominio carbóxiterminal resulta na secreção da hialuronidase para o meio extracelular. Desta forma, 25 obteve-se um adenovirus oncolitico que expressa uma hialuronidase secretada com atividade enzimática em pH neutro. Em uma modalidade particular, a sequência inserida no genoma adenoviral é uma que codifica a SEQ ID NO: 1. Em uma modalidade mais particular, a sequência 30 inserida é a SEQ ID NO: 2.

Em outra modalidade, a sequência da enzima é inserida no adenovirus oncolitico depois da sequência de nucleotideos da fibra adenoviral.

Em outra modalidade particular, a expressão da enzima é controlada por meio de um promotor ativo nas células animais. Particularmente, o promotor é selecionado dentre grupo que consiste em promotor de citomegalovirus, 5 promotor principal tardio de adenovirus, promotor de SV4 0, promotor de timidina quinase de virus herpes simplex, promotor de RSV, promotor EF1 alfa, promotor de beta- actina, promotor de IL-2 humana, promotor de IL-4 humana, promotor de IFN, promotor de E2F e promotor de GM-CSF 10 humano. O promotor que regula a expressão da enzima pode estar nno adenovirus de forma natural, como é o caso do promotor principal tardio do adenovirus (vide Figura 1 (a), MLP, "major late promotor") . O promotor também pode ser inserido próximo a uma sequência que codifica a enzima. Em 15 uma modalidade preferida, o promotor é o promotor principal tardio do adenovirus.

O adenovirus replicativo da invenção pode ser dotado de modificações na sua sequência genômica que conferem replicação seletiva nas células tumorais. Em uma 20 modalidade particular, isto é obtido com a inserção de um promotor especifico de tecido ou um promotor especifico de tumor, em que este promotor controla a expressão de um ou mais genes do grupo de Ela, Elb, E2, e E4.

Particularmente, o promotor é selecionado dentre o grupo 25 que consiste em promotor de E2F, promotor de telomerase hTERT, promotor de tirosinase, promotor de antigeno especifico de próstata (PSA), promotor de alfa- fetoproteina, promotor de COX-2, assim como os promotores artificiais formados por vários sitios de ligação de 30 fatores de transcrição, tais como sitios de ligação para o fator induzido por hipoxemia (HIF-1), o fator de transcrição de Ets, o fator citotóxico de tumor (tcf), o fator de transcrição E2F ou o fator de transcrição Spl. Preferivelmente, o promotor controla a expressão de Ela.

Outra modificação para se obter a replicação seletiva em tumores é a eliminação das funções iniciais de E1A que bloqueiam a via de retinoblastoma (RB) . Outros 5 genes virais que interagem diretamente com a pRB como E4 e E4orf6/7 respectivamente, são candidatos a serem eliminados para a obtenção de replicação seletiva em células tumorais. Como ilustrado nos exemplos, o adenovirus oncolitico ICOVIR17 é caracterizado por conter simultaneamente o gene 10 de hialuronidase, a eliminação de Δ24 que afeta a interação de Ela com pRB, a inserção de quatro sitios de ligação a E2F-1 e um sitio de ligação de Spl no promotor endógeno de Ela para controlar a expressão de Ela, e finalmente, a inserção do peptideo RGD na fibra adenoviral para aumentar 15 infectividade do virus. O ICOVIR17 é uma modalidade preferida da invenção.

Outra modificação descrita para se obter a aplicação seletiva em tumores é a eliminação dos genes adenovirais que codificam os RNA associados ao virus (VA- 20 RNAs). Estes RNA bloqueiam a atividade antiviral do interferon e sua eliminação torna o adenovirus sensivel a ser inibido pelo interferon. Uma vez que as células tumorais são caracterizadas pelo truncamento da via do interferon, esses adenovirus replicam-se sob niveis normais 25 nos tumores. Desta forma, em outra modalidade particular, a aplicação seletiva em tumores é obtida com mutações em um ou mais genes do grupo Ela, Elb, E4, e VA-RNAs do adenovirus. Preferivelmente as mutações são realizadas em Ela. Estas duas estratégias para obtenção de replicação seletiva em tumores não excluem uma à outra.

Em outra modalidade da invenção, o adenovirus tem modificações no seu capsideo para aumentar a sua infectividade, ou para dirigi-la para um receptor presente em uma célula tumoral. Em uma modalidade preferida, as proteinas de capsideo do adenovirus foram modificadas geneticamente para incluir ligantes que aumentam a 5 infectividade ou que dirigem o virus para um receptor na célula tumoral. 0 direcionamento do adenovirus para o tumor também pode ser alcançado com ligantes bifuncionais que se ligam ao virus por um lado e ao receptor tumoral por outro. Por outro lado, para aumentar-se a persistência do 10 adenovirus no sangue, e com isto aumentar as possibilidades de alcançar nódulos tumorais disseminados, o capsideo pode ser coberto com polimeros, como o polietileno glicol. Em uma modalidade preferida, o adenovirus oncolitico tem o capsideo modificado para aumentar a sua infectividade ou 15 para dirigi-lo melhor à célula alvo, por meio de uma substituição do dominio de ligação KKTK dos heparan- sulfatos presentes na fibra adenoviral pelo dominio RGDK. Nos exemplos, encontra-se exposta a construção de um adenovirus com estas características, ICOVIR17RGDK.

Em outra modalidade particular, o adenovirus compreende uma sequência que otimiza a tradução protéica da sequência que codifica a hialuronidase.

Em outra modalidade particular, o adenovirus compreende uma sequência que promove a expressão da 25 sequência que codifica a hialuronidase. Mais particularmente, esta sequência é selecionada dentre o grupo que consiste de uma sequência de splicing que permite o processamento do RNA, uma sequência IRES ("internal ribosome entry site"), e a sequência 2A de 30 picornavirus.

Em outra modalidade particular, o adenovirus oncolitico, por sua vez, compreende outros genes inseridos no seu genoma que são usados comumente no campo da terapia genética de câncer para aumentar a citotoxicidade dos adenovirus oncoliticos às células tumorais. Alguns deles são o gene da timidina quinase, o gene da citosina deaminase, genes pro-apoptóticos, imunoestimuladores, 5 supressores tumorais ou ativadores de pró-fármacos.

Estas modificações no genoma do adenovirus não se excluem entre si. Existem vários métodos para manipular o genoma adenoviral. Os métodos de construção de um adenovirus geneticamente modificado são amplamente 10 estabelecidos no campo da terapia genética e da viroterapia com adenovirus. O método mais comumente usado é baseado na construção primeiro da modificação genética desejada em um plasmideo que contém a região adenoviral a ser modificada, e posteriormente realizar uma recombinação homóloga em 15 bactérias com um plasmideo que contém o restante do genoma virai.

O adenovirus que contém o gene de hialuronidase objeto da presente invenção é propagado e amplificado em linhagens celulares normalmente usadas no campo da terapia 20 genética e da viroterapia, tais como linhagens celulares HEK-293 e A549. 0 método de propagação preferido é por meio de infecção de uma linhagem celular permissiva para a replicação de adenovirus. A linhagem celular de adenocarcinoma pulmonar A549 é um exemplo de uma linhagem 25 com essas características. A propagação é realizada, por exemplo, da seguinte maneira: células A549 são semeadas em placas de cultivo celular de plástico e infectadas utilizando-se 100 partículas virais por célula. Dois dias depois, o efeito citopático que reflete a produção de 30 virus é observado como um agrupamento e arredondamento das células. As células são colhidas e armazenadas em tubos. Depois de centrifugação a 1000 g durante 5 minutos, o precipitado celular é congelado e descongelado três vezes para romper as células. 0 extrato de células resultante é centrifugado a 1000 g durante 5 minutos, e o sobrenadante com virus é carregado em um gradiente de cloreto de césio e centrifugado durante 1 hora a 35000 g. A banda de virus 5 obtidos a partir do gradiente é carregada em outro gradiente de cloreto de césio e centrifugada novamente durante 16 horas a 35000 g. A banda de virus é colhida e dialisada contra PBS-10% glicerol. O virus dealisado é aliquotado e mantido a -80°C. A quantificação do número de 10 particulas virais e de unidades de formação de placa é realizada seguindo-se protocolos padrão. O tampão fosfato- salino (PBS) com glicerol a 5% é uma formulação padrão para o armazenamento de adenovirus. Não obstante, novas formulações foram descritas que aperfeiçoam a estabilidade 15 do virus. Os métodos de purificação do adenovirus que contém o gene de hialuronidase para a sua utilização no tratamento do câncer são os mesmos que são descritos para outros adenovirus e vetores adenovirais usados em viroterapia e terapia genética do câncer.

O adenovirus oncolitico da presente invenção pode ser administrado a um mamifero, preferivelmente um ser humano. O propósito da administração do adenovirus oncolitico é terapêutico, incluindo, mas não limitando a, melanoma, câncer de pâncreas, câncer de cólon e câncer de pulmão. Da 25 mesma forma, considera-se a administração do adenovirus oncolitico em um estágio pré-maligno de um tumor.

Entende-se que o adenovirus oncolitico é administrado em uma forma farmaceuticamente aceitável. Aqueles versados na técnica podem assegurar a dose 30 apropriada mediante a utilização de procedimentos padrão.

Entende-se que a dose deve ser uma quantidade efetiva do adenovirus oncolitico para produzir uma redução do tumor no paciente tratado. A administração pode ser diretamente do virus ao tumor, na cavidade onde o tumor está localizado, na vasculatura do tumor, em torno do tumor, ou por meio de injeção endovenosa sistêmica no paciente. Preferivelmente, a administração é sistêmica.

Os protocolos para usar os virus descritos na presente invenção para o tratamento de câncer são os mesmos procedimentos usados nos campos da viroterapia com adenovirus e terapia genética com adenovirus. Existe uma ampla experiência no uso de adenovirus oncolíticos e não 10 oncolíticos no campo da terapia genética. Existem numerosas publicações que descrevem o tratamento de células tumorais em cultura, em modelos de animais, e em ensaios clínicos com pacientes. Para o tratamento de células em cultivos in vitro, o adenovirus purificado por meio de 15 qualquer uma das formulações descritas anteriormente é adicionado ao meio de cultura para obter a infecção das células tumorais. Para tratar tumores em modelos de animais ou em pacientes, o adenovirus pode ser administrado loco-regionalmente por meio de injeção no tumor ou na 20 cavidade corporal onde o tumor está localizado, ou sistemicamente por meio de injeção na corrente sanguínea.

O adenovirus oncolitico da invenção pode ser administrado isoladamente ou em combinação com veiculos ou excipientes farmaceuticamente aceitáveis. Aqueles versados 25 na técnica adaptarão a composição de acordo com a maneira particular de administração. As composições podem compreender o adenovirus oncolitico como o único agente contra o tumor, ou em combinação com outro agente terapêutico, tal como um fármaco quimioterapêutico ou um 30 vetor com um gene terapêutico inserido. Da mesma maneira, a terapia do adenovirus oncolitico poderá ser combinada com radioterapia.

A não ser que de outro modo definido, todos os termos técnicos e científicos usados neste contexto têm o mesmo significado que é usualmente compreendido por uma pessoa normalmente versada na técnica. Métodos e materiais 5 similares ou equivalentes àqueles descritos neste contexto podem ser usados na prática da presente invenção. Por toda a descrição e nas reivindicações, a palavra "compreende" e suas variações não pretendem excluir outros aspectos técnicos, aditivos, componentes ou etapas. Para aqueles 10 versados na técnica, objetivos, vantagens e aspectos adicionais da invenção serão evidenciados quando da descrição ou da prática da invenção. Os seguintes exemplos e desenhos são proporcionados com a finalidade de ilustração, e não pretende-se que sejam limitativos da 15 presente invenção.

Descrição dos Desenhos

A Figura 1 (a) mostra a estrutura de adenovirus oncoliticos caracterizados por conterem e expressarem o gene da hialuronidase PH20. O adenovirus AdwtRGD-PH20 20 contém o gene da proteína PH20 inserido depois do gene de fibra de adenovirus. A expressão do gene da proteína PH20 é regulada por meio do promotor principal tardio (MLP) do adenovirus, por meio de da inserção de splicing Illa do adenovirus (SA) antes do gene da proteína PH20. A tradução 25 protéica deste gene está otimizada devido à introdução da sequência de kozak (K) antes da sequência de início da tradução. Os adenovirus ICOVIR15 e ICOVIR17 são adenovirus de replicação seletiva em tumores. Eles se caracterizam por conterem 4 sítios de ligação a E2F e um sítio de 30 ligação a Spl no promotor endógeno de Ela. Ambos os vírus também apresentam uma versão modificada da fibra virai na qual foi inserido o peptídeo RGD-4C, e uma versão mutante da proteína EIA na qual os aminoácidos 121-129 da cadeia de polipeptidios foram eliminados (mutação de Δ24). Além disso, o ICOVIR17 contém o gene da hialuronidase PH20 da mesma forma que o adenovirus AdwtRGD-PH20. (b) mostra a sequência inserida no adenovirus AdΔ24RGD substituindo sua 5 sequência dos nucleotideos 419 até 422. Esta inserção é feita para inserir quatro sitios de ligação para o fator E2F-1 e um sitio de ligação para o fator Spl. As sequências sublinhadas como "nt 385-419" e "nt 422-461" correspondem ao tipo selvagem AdΔ24RGD. (c) mostra o cassete completo 10 inserido nos genomas de ICOVIR17 e AdwtRGD-PH20 com relação aos genomas de ICOVIR15 e AdwtRGD (SEQ ID NO: 4). Estão indicadas as sequências ativadoras de splicing Illa, de Kozak, e de poliadenilação (polyA). A sequência codificante da proteina PH20 abrange desde a sequência de 15 Kozak até a sequência de poliadenilação. A Figura 1 refere-se ao EXEMPLO 3.

A Figura 2 mostra a sequência de aminoácidos da proteina PH20 (SEQ ID NO: 1) e a representação gráfica hidropática de acordo com o algoritmo de Kyte-Doolittle.

A proteina PH20 é uma proteina de membrana presente nas membranas plasmática e acrossômica dos espermatozóides, (a) A sequência de aminoácidos mostra a sequência sequênciahidrofóbica responsável pela ancoramento da proteina na membrana (sequência sublinhada). Na presente 25 invenção, a proteina PH20 expressa pelo virus apresenta uma cauda hidrofóbica eliminada. O ponto de corte está indicado dentro de um circulo. Desta forma, a proteina PH20 é secretada para o meio extracelular. (b) Representação gráfica hidropática dos 100 aminoácidos terminais da 30 proteina PH20 de acordo com Kyte-Doolittle. A seta indica o inicio da cauda hidrofóbica que foi eliminada.

A Figura 3 demonstra que os adenovirus oncoliticos que contêm o gene da hialuronidase PH20 expressam uma proteína solúvel que exibe atividade de hialuronidase. Os géis mostram que as amostras de ácido hialurônico incubadas com o sobrenadante do vírus que expressa hialuronidase PH20 foram digeridas, produzindo 5 oligossacarídeos de diferentes dimensões. As amostras incubadas com os sobrenadantes do adenovirus de controle (AdwtRGD e ICOVIR15) exibem ácido hialurônico não digerido. A Figura 3 corresponde ao

EXEMPLO 4.

A Figura 4 demonstra que a inserção e expressão do gene de hialuronidase PH20 não interfere com a replicação de um adenovirus de replicação seletiva em tumor. As células provenientes das linhagens celulares A549 (a) e SKMel28 (b) foram infectadas com os adenovirus oncolíticos ICOVIR15 e ICOVIR17 (que diferem do ICOVIR15 por conterem o gene PH20) e a quantidade de vírus nos extratos celulares foi medida (vírus total, eixo X, em TU/ml) em tempos diferentes (eixo Y, em horas após infecção). Os gráficos mostram que a cinética da produção de vírus é idêntica para os dois vírus, demonstrando que a inserção e expressão do gene da hialuronidase PH20 no adenovirus ICOVIR17 não afeta a replicação de vírus. A Figura 4 corresponde ao EXEMPLO 5.

A Figura 5 mostra a eficácia oncolítica in vitro de um adenovirus oncolitico que contém e expressa o gene da hialuronidase PH20. A atividade oncolítica de um adenovirus que expressa hialuronidase PH20 (ICOVIR17) foi comparada in vitro com a atividade de um vírus oncolitico similar sem o gene da hialuronidase PH20 (ICOVIR15) em duas linhagens tumorais que expressam uma alta quantidade de ácido hialurônico, SKMel28 (a) e PC3 (b) . O efeito citopático (CPE) que o vírus induz é medido como uma diminuição da quantidade de proteína em uma monocamada celular infectada (método BCA). As células foram semeadas em placas de 96 poços a 10000 células/poço. No dia seguinte, as células foram infectadas com diluições seriadas dos virus. As células infectadas foram incubadas durante 5 dias, lavadas com PBS, e mediu-se a quantidade da 5 proteina restante no poço. Os resultados mostram que in vitro a expressão da hialuronidase PH20 não melhora a atividade oncolitica do adenovirus, sendo as curvas de citoxicidade as mesmas para os dois virus. A percentagem % de sobrevivência celular contra TU/célula está 10 representada. A Figura 5 corresponde ao EXEMPLO 5.

A Figura 6 é uma demonstração da atividade antitumoral de um adenovirus que expressa a hialuronidase PH20 in vivo. Células de melanoma humano (SKMel28) foram inoculadas em cada flanco posterior de camundongos atimicos 15 da estirpe Balb/c. Uma vez que os tumores alcançaram uma dimensão media de 150 mm3, foram injetados com PBS ou lxlO8 unidades de transdução de AdwtRGD-PH20 (10 tumores/grupo). (a) O gráfico mostra o crescimento médio do tumor (em %) em cada um dos grupos com relação ao dia 0 como uma função 20 de tempo pós-administração (em dias). O resultado demonstra que o adenovirus oncolitico que expressa o gene de hialuronidase PH20 apresenta uma atividade antitumoral mais alta, estatisticamente significativa em comparação com o grupo de controle (PBS), p<0,00001. Os 100% dos tumores 25 injetados com AdwtRGD-PH20 regrediram entre um volume de 10% e de 50% no dia 27 pós-injeção, em relação a uma regressão de 0% no grupo injetado com PBS. (b) A quantidade de ácido hialurônico nos tumores injetados com PBS ou AdwtRGD-PH20 foi analisada no final da experiência por meio 30 de imuno-histoquimica. As imagens mostram que os tumores injetados com o AdwtRGD-PH20 tiveram uma quantidade mais baixa de ácido hialurônico em comparação com os tumores de controle. A Figura 6 corresponde ao EXEMPLO 6.1.

A Figura 7 mostra que a expressão da hialuronidase PH20 melhora o efeito antitumoral de um adenovirus oncolitico depois de sua administração intratumoral. Células (SKMel28) de melanoma humano foram 5 inoculadas em cada flanco posterior de camundongos atimicos da estirpe Balb/c. Uma vez que os tumores alcançaram um volume médio de 130 mm3, eles foram injetados com PBS ou lxlO8 unidades de transdução de ICOVIR15 ou ICOVIR17 (10 tumores/grupo) em uma única dose, (a) O gráfico mostra o crescimento médio dos tumores (em %) com relação ao dia 0 em função de tempo pós-administração (em dias). O adenovirus oncolitico que expressa hialuronidase PH20 (ICOVIR17) apresenta um melhor efeito antitumoral do que o adenovirus de controle que não expressa esta hialuronidase 15 (ICOVIR15). (b) Depois de 42 dias de tratamento, os camundongos foram sacrificados e os tumores foram colhidos e pesados. A tabela mostra um resumo do volume de tumor, percentagem de crescimento do tumor, e peso dos tumores ao final da experiência. Os tumores injetados com ICOVIR17 20 apresentaram um peso tumoral significativamente mais baixo do que os tumores injetados com ICOVIR15 (* p<0,05) e os tumores injetados com PBS (# p<0,05). Diferentemente dos resultados obtidos in vitro, onde o virus pode espalhar-se sem dificuldade através da monocamada de células, os 25 resultados in vivo demonstram que dentro de um tumor, onde a matriz extracelular dificulta a propagação do virus, a expressão da hialuronidase PH20 aumenta a potência antitumoral de um adenovirus oncolitico. A Figura 7 corresponde ao EXEMPLO 6.2.

A Figura 8 mostra que a expressão da hialuronidase PH20 melhora o efeito antitumoral de um adenovirus oncolitico depois de sua administração sistêmica. Células (SKMel28) de melanoma humano foram inoculadas em cada flanco posterior de camundongos atimicos da estirpe Balb/c. Uma vez que os tumores alcançaram uma média de 100 mm3, os camundongos foram injetados com PBS ou 5xlO10 de partículas fisicas de ICOVIR15 ou ICOVIR17 5 (ICOVIR15 armado com PH20) (8-10 tumores/grupo) por via endovenosa. (a) O gráfico mostra o crescimento médio do tumor (em %) de cada grupo com relação ao dia 0 em função do tempo pós-administração (em dias). O resultado demonstra que a expressão de hialuronidase PH20 resulta em 10 um aumento da potência oncolitica do adenovirus, uma vez que a supressão do crescimento tumoral induzida por ICOVIR17 é significativamente melhor do que a supressão induzida no grupo de controle (ICOVIR15), * p<0,00001. (b) As imagens mostram a distribuição do adenovirus ICOVIR15 e 15 ICOVIR17 pelas massas tumorais, extraídas ao final da experiência (dia 48). Os tumores dos camundongos injetados com o adenovirus oncolitico ICOVIR17 mostram áreas necrosadas muito extensas (seta grossa), um número reduzido de áreas com células viáveis (v) , e grandes e numerosos 20 focos de replicação virai (áreas com fluorescência verde indicadas com setas finas) em comparação com os tumores injetados com o controle de adenovirus, ICOVIR15. A Figura 8 corresponde ao EXEMPLO 6.3.

A Figura 9 demonstra que o aumento da atividade 25 sistêmica antitumoral dos adenovirus que expressam a enzima hialuronidase PH20 não é restrito a um tipo de tumor, (a) O gráfico mostra o crescimento médio dos tumores pancreáticos NP-18 (em %) para cada grupo em relação ao dia 0, em função do tempo de pós-administração (em dias). #, expressa um resultado significativo (p = 0,02) em comparação com os tumores tratados com PBS a partir dia 14 ao dia 30; &, significativo (p = 0,05) em comparação com os tumores tratados com PBS do dia 14 ao dia 30; *, significativo (p = 0,02) em comparação com os tumores tratados com ICOVIR-15 a partir do dia 12 até 30. (b) As imagens mostram a distribuição do adenovirus ICOVIR15 e ICOVIR17 em tumores NP-18 no dia 30. *, p = 0,01 comparado 5 com os tumores tratados com ICOVIR15. "% a.p." significa % de área positiva. A Figura 9 corresponde ao EXEMPLO 6.4.

A Figura 10 (a) mostra a estrutura dos adenovirus oncoliticos ICOVIR17 e ICOVIR17RGDK. (b) mostra a sequência de aminoácidos da versão modificada da fibra em ICOVIR17RGDK (SEQ ID NO: 9) . A sequência sublinhada corresponde aos aminoácidos 91RGDK994, que diferem em relação à forma comum da fibra do adenovirus humano do tipo 5 . A Figura 10 corresponde ao EXEMPLO 8.

A Figura 11 mostra a atividade oncolitica dos 15 dois adenovirus (ICOVIR17 e ICOVIR17RGDK) em duas linhagens tumorais, sendo uma de pulmão A549 (a) e outra de pâncreas NP-18 (b) . % de sobrevivência de células versus TU/célula. A Figura 11 corresponde ao EXEMPLO 9.

EXEMPLOS EXEMPLO 1. Construção dos adenovirus oncoliticos

Construiram-se dois adenovirus oncoliticos contendo o gene de hialuronidase PH20: adenovirus AdwtRGD- PH20 e ICOVIR17. O cDNA da hialuronidase PH20 foi obtida por meio 25 de amplificação por PCR dos diferentes éxons da proteina a partir do genoma da linhagem celular A549 e posterior ligação destes éxons com oligonucleotideos específicos que continham o alvo da enzima de restrição Mfel. O fragmento resultante foi digerido com Mfel e clonado por meio de 30 ligação no plasmideo de transporte, pNKFiberRGD (que contém a sequência da fibra de adenovirus modificada com RGD), para produzir o plasmideo pNKFiberPH20. O cDNA correspondente à proteina PH20 clonado no plasmideo pNKFiberPH20 está mostrado na SEQ ID NO: 2. A SEQ ID NO: 2 mostra os nucleotideos codificantes para a proteina PH20 (isoforma com número de acesso GenBank NP_694859.1) de seu inicio de transcrição (ATG) até a posição 1467. A 5 sequência de nucleotideos da região 1468 até 1527 desta sequência GenBank codifica a cauda hidrofóbica da proteina que ancora a proteina à membrana. Esta sequência foi eliminada e não aparece na SEQ ID NO: 2. Depois do nucleotideo 1468 foi adicionado o códon de término da 10 tradução TAA.

EXEMPLO 2. Construção dos adenovirus AdwtRGD-PH20:

Com a finalidade de gerar o adenovirus AdwtRGD-PH20, o gene da fibra adenoviral do plasmideo pVK50cau (que contém a sequência completa da Ad5 com um sitio de restrição SwaI na 15 fibra) foi substituído por recombinação homóloga de levedura pelo gene da fibra seguido pelo gene da hialuronidase PH20 obtido a partir do plasmideo pNKFiberPH20 digerido com NotI/Kpnl.

O adenovirus AdwtRGD-PH20, caracterizado por 20 expressar o gene de hialuronidase PH20 sob o controle do promotor principal tardio e por conter o tri-peptideo RGD na fibra adenoviral, foi gerado por meio de digestão com Pad do plasmideo pAdwtRGD-PH20 e transfecção em células HEK293. O adenovirus AdwtRGD, previamente descrito, é 25 caracterizado por conter o tri-peptideo na fibra adenoviral (cfr. M. Majem et al., "Control of EIA under an E2F-1 promoter insulated with the myotonic dystrophy locus insulator reduces the toxicity of oncolytic adenoviruses Ad-Delta24RGD", Cancer Gene Therapy 2006, vol. 13, pp. 696- 30 705) . 0 AdwtRGD foi construído por meio de digestão do plasmideo pVK503, que contém o genoma completo de Ad5 com a fibra modificada RGD (cfr. I. Dmitriev et al., "An adenovirus vector with genetically modified fibres demonstrates expanded tropism via utilization of a coxsackievirus and adenovirus receptor-independent cell entry mechanism", J. Virol. 1998, vol. 72, pp. 9706-13) com Pad seguido por transfecção de células 293.

EXEMPLO 3. Construção de adenovirus ICOVIR17:

Para gerar este adenovirus, utilizou-se o plasmideo adenoviral pICOVIR17. Para gerar este plasmideo, o gene da fibra adenoviral do plasmideo pICOVIR15 foi substituído por meio de recombinação homóloga em levedura com o gene da fibra 10 seguido pelo gene da hialuronidase PH20 do plasmideo pAdwtRGD-PH20 digerido com Spel/Pacl. O adenovirus ICOVIR15 deriva do adenovirus AdΔ24RGD, que é caracterizado por conter a eliminação Δ24 na sequência codificadora da proteina Ela. Esta eliminação 15 afeta a interação de Ela com pRB. A AdΔ24RGD também tem a inserção do peptideo RGD na fibra adenoviral para aumentar a infectividade do virus. Estas duas modificações encontram-se descritas em K. Suzuki et al., "A conditionally replicative adenovirus with enhanced 20 infectivity shows improved oncolytic potency", Clin Cancer Res 2001, vol. 7, pp. 120-6. A partir do AdΔ24RGD, quatro sitios de ligação a E2F-1 e um sitio de ligação a Spl foram inseridos no promotor endógeno Ela para controlar a expressão de Ela. Desta maneira, obteve-se o ICOVIR15. Esta inserção foi feita pela substituição da sequência 419- 422 do genoma pela sequência com os 4 sitios de ligação a E2F-1 e um sitio de ligação a Spl, de modo que a sequência final é aquela que aparece na SEQ ID NO: 3 e Figura 1 (b). Para realizar esta etapa, foi criado um sitio único de 30 corte de BsiWI por meio de mutagênese dirigida no promotor EIA do plasmideo pEndK/Spe (cfr. J.E. Carette et al., "Conditionally replicating adenovirus expressing short hairpin RNAs silence the expression of a target gene in cancer cells", Cancer Res 2004, vol. 64, pp. 2663-7). 0 sitio de ligação a Spl foi introduzido no plasmideo pEndK/Spe com o sitio BsiW I por meio de ligação deste plasmideo digerido com BsiWI com os oligonucleotideos SplF (5'-GTACGTCGACCACAAACCCCGCCCAGCGTCTTGTCATTGGCGTCGACGCT-3', SEQ ID NO: 5) e SplR (5'-GTACAGCGTCGACGCCAATGACAAGACGCT GGGCGGGGTTTGTGGTCGAC-3', SEQ ID NO: 6) hibridizados entre si. Os sitios de ligação a E2F foram introduzidos mediante ligação dos oligonucleotideos E2FF2 (5'- GTACGTCGGCGGCTCGTGGCTCTTTCGCGGCAAAAAGGATTTGGCGCGTAAAAGTGGTT CGAA-3' , SEQ ID NO: 7) e E2FR2 (5'- GTACTTCGAACACTTTTACGCGCCAAATCCTTTTTGCCGCGAAAGAGCCACGAGCCGCC GAC-3', SEQ ID NO: 8) hibridizados entre si, para criarem o plasmideo pEndK415SplE2F2. Em seguida, introduziu-se por recombinação homóloga em leveduras a sequência CAU, que contém os elementos necessários para a replicação do plasmideo em leveduras (um centrômero, a sequência de recombinação autônoma ARS, e o marcador de seleção URS3) para criar o plasmideo pEndK415SplE2F2CAU. Finalmente, realizou-se uma recombinação homóloga em leveduras entre o plasmideo pEndK415SplE2F2CAU digerido com Kpnl e o genoma adenoviral do adenovirus AdΔ24RGD para construir o pICOVIR15cau. O ICOVIR15 foi obtido por transfecção da digestão Pad do pICOVIR15cau em células HEK293.

O virus ICOVIR17, que contém as mesmas modificações que ICOVIR15, mais a inserção do gene de hialuronidase depois do gene da fibra adenoviral, foi gerado por digestão com Pad do plasmideo pICOVIR17 e transfecção em células HEK293. A estrutura correta dos genomas AdwtRGD-PH20 e ICOVIR17 foi verificada por meio de restrição com HindIII. Adicionalmente, a região do gene PH20 foi sequenciada com oligonucleotideos específicos.

O cassete completo inserido nos genomas IC0VIR17 e AdwtRGD-PH20 em relação aos genomas ICOVIR15 e AdwtRGD está ilustrado na Figura 1 (c) e na SEQ ID NO: 4: A sequência codificadora da proteina PH20 se estende da 5 sequência kozak à sequência de poliadenilação.

EXEMPLO 4.

Expressão de uma proteína solúvel com atividade de hialuronidase por um adenovirus que contém o gene de hialuronidase PH20

Para demonstrar que um adenovirus que contém o 10 gene da hialuronidase PH20 expressa uma proteína solúvel com atividade de hialuronidase, infectou-se cultivos celulares da linhagem A549 com vírus AdwtRGD, AdwtRGD-PH20, ICOVIR15, ou ICOVIR17 utilizando-se uma multiplicidade de infecção que permitiu mais de 80% de infecção (20 M.OI).

Depois de 24 horas pós-inf ecção, o meio de infecção foi substituído com um meio fresco. Então, depois de mais 24 horas, o meio fresco (ou sobrenadante) foi colhido e concentrado por meio de filtragem em uma coluna de Amicon Ultra-4 (Millipore, Billerica, USA), segundo as instruções 20 do fabricante. Os sobrenadantes concentrados foram incubados durante a noite sob 37°C com uma solução de ácido hialurônico (1,5 mg/ml) em tampão fosfato (pH=6) contendo 0,1 M de NaCl e 0,05% de BSA. O ácido hialurônico digerido foi analisado por meio de eletroforese em gel de 25 poliacrilamida a 15% (cfr. M. Ikegami-Kawai et al., "Microanalysis of hyaluronan oligosaccharides by polyacrylamide gel electrophoresis and its application to assay of hialuronidase activity", Analytical biochemistry 2002, vol. 311, pp. 157-65). Os oligossacarideos 30 resultantes da digestão do ácido hialurônico foram fixados na matriz do gel mediante banho com uma solução de azul de alcian durante 30 min. Finalmente, os oligossacarideos foram corados com nitrato de prata. O resultado está ilustrado na Figura 3. Os resultados demonstram que o sobrenadante de células infectadas com adenovirus que contém o gene de hialuronidase PH20 (AdwtRGD-PH20 e ICOVIR17) contém uma proteina solúvel capaz de digerir 5 ácido hialurônico (polissacarideo de peso molecular elevado) em oligossacarideos de 5 até mais de 50 unidades de repetição de dissacarideos.

EXEMPLO 5.

Ausência de efeito na replicação virai e na citotoxicidade in vitro mediada pelo adenovirus oncolitico 10 que expressa o gene da hialuronidase PH20

Para comprovar que a inserção do gene da hialuronidase PH20 não afetou a replicação do virus, infectaram-se linhagens tumorais A549 e SKMel-28 com adenovirus oncolíticos ICOVIR15 ou ICOVIR17. Quatro horas 15 após infecção, o meio de infecção foi substituído com meio fresco. Extratos celulares totais foram colhidos em diferentes tempos após infecção e foram congelados e descongelados três vezes para liberar o virus. A quantidade de virus no extrato celular foi determinada por meio de 20 infecção de HEK293 e coloração anti-héxon (cfr. M. Majem supra). O resultado está ilustrado na Figura 4. A inserção do gene da hialuronidase PH20 não afeta a replicação do adenovirus ICOVIR17, sendo esta idêntica ao controle de adenovirus.

Para demonstrar o efeito da expressão da hialuronidase PH20 na citotoxicidade do adenovirus oncolitico in vitro, foram infectadas células das linhagens tumorais PC3 e SKMel-28 com diluições seriadas dos virus ICOVIR15 ou ICOVIR17. Cinco e seis dias após a infecção, 30 respectivamente, foi avaliada espectrofotometricamente a quantidade de proteina, como um indicador de sobrevivência de células. Os resultados estão ilustrados na Figura 5. A capacidade litica de ICOVIR17 nestas duas linhagens tumorais é a mesma que a atividade de ICOVIR15, indicando que a expressão da hialuronidase PH20 não oferece qualquer vantagem in vitro.

EXEMPLO 6.

Uso de um adenovirus que se replica e contém o 5 gene da hialuronidase PH20 para tratar tumores eficientemente 6.1. Uma experiência in vivo foi realizada utilizando-se camundongos atimicos da estirpe Balb/c que continham tumores SKMel-28. Um total de 5 x 106 células 10 tumorais da linhagem SKMel-28 foram injetadas subcutaneamente em cada flanco posterior do camundongo. Depois de 21 dias, os camundongos com tumores formados (com um volume tumoral de 150 mm3) foram distribuídos nos diferentes grupos experimentais (n=10 por grupo). Os 15 tumores do grupo de controle receberam uma única injeção intratumoral de tampão salino (20 μl) . Os camundongos do grupo tratado com AdwtRGD-PH20 receberam uma injeção intratumoral (20 μl) de IxlO8 unidades de transdução deste virus por tumor (equivalente a 2xl09 particulas virais ou 20 vp). Os tumores foram medidos a cada dois ou três dias com um calibrador, e o volume do tumor foi calculado de acordo com a fórmula: V (mm3) = A (mm) x B2 (mm2) x p/6, em que A é o comprimento maior ou longitudinal, e B é o comprimento seccional. A Figura 6 mostra a percentagem de crescimento 25 tumoral em relação ao inicio do tratamento (dia 0) . Os resultados estão ilustrados como a média ± S.E. A existência de diferenças significativas entre os resultados foi calculada utilizando-se um ensaio não-paramétrico de dados não pareados de Mann-Whitney. As curvas de 30 crescimento foram comparadas utilizando-se uma análise de variação. Os resultados foram considerados significativos se p<0,05. O tratamento dos tumores com adenovirus AdwtRGD-PH20 proporcionou regressões tumorais em 100% dos tumores tratados. A % de crescimento tumoral foi significativamente menor em comparação com o grupo de controle desde o primeiro dia após injeção. A análise dos tumores no final da experiência mostrou uma diminuição na 5 quantidade de ácido hialurônico contido na matriz extracelular dos tumores injetados com AdwtRGD-PH20.

6.2. Em outro experimento, o tratamento foi realizado por injeção intratumoral de ICOVIR15 ou ICOVIR17. Tumores da linhagem celular de melanoma humano 10 SKMel-28 foram implantados em camundongos atimicos Balb/C nu/nu, e uma vez estabelecidos foram tratados por administração intratumoral com PBS ou lxlO8 unidades de transdução dos virus ICOVIR15 ou ICOVIR17 (equivalente a 2xl09 partículas virais ou vp) . Os resultados estão 15 ilustrados na Figura 7. O tratamento com ICOVIR17 mostrou uma atividade oncolitica que resultou em uma supressão do crescimento tumoral significativamente distinta do grupo de controle (PBS), p<0,05. Ao final do experimento, os tumores foram extraídos e pesados. A tabela da Figura 7 20 mostra as médias do volume tumoral, percentagem de crescimento tumoral, e peso dos tumores ao final do experimento. O peso dos tumores injetados com ICOVIR17 é significativamente mais baixo do que o peso dos tumores nos grupos de controle, PBS (# p<0,05) e ICOVIR15 (* p<0,05).

6.3. Em outro experimento, o tratamento foi realizado por injeção sistêmica de ICOVIR15 ou ICOVIR17. Tumores da linhagem celular de melanoma humano SKMel-28 foram implantados em camundongos atimicos Balb/C nu/nu, e uma vez estabelecidos, os animais foram tratados por 30 administração na veia caudal com PBS ou 5xlO10 partículas fisicas dos virus ICOVIR15 ou ICOVIR17. Os resultados estão ilustrados na Figura 8. O tratamento com ICOVIR17 demonstrou uma atividade oncolitica que resultou em uma supressão de crescimento tumoral significativamente distinta dos grupos de controle, PBS (# p<0,0001) e ICOVIR15 (* p<0,00001). Ao final do experimento, os tumores foram extraidos e congelados em OCT. As diferentes seções 5 provenientes dos tumores congelados em OCT foram tratadas com um anticorpo a-hexon (proteina do capsideo de adenovirus) e foram contra-corados com 4' , 6-di-amidino-2- fenil-indol. A atividade antitumoral do ICOVIR17 relaciona-se com a replicação do adenovirus a nivel 10 intratumoral, avaliada nos tumores obtidos no dia 48 após injeção. Os tumores tratados com ICOVIR17 apresentam grandes áreas necróticas, uma melhor distribuição virai, e menos áreas de células viáveis do que os tumores injetados com ICOVIR15.

6.4. Em outro experimento, o tratamento foi realizado por injeção sistêmica de ICOVIR15 ou ICOVIR17 em camundongos atimicos Balb/C nu/nu implantados com tumores provenientes da linhagem celular de adenocarcinoma pancreático humano NP-18. Uma vez que os tumores foram 20 estabelecidos, alcançando uma média de 60 mm3, os animais foram tratados por administração na veia caudal com PBS ou 5xlO10 partículas fisicas do virus ICOVIR15 ou ICOVIR17 (10 tumores/grupo). Os resultados são ilustrados na Figura 9, onde é demonstrado que o aumento de atividade antitumoral 25 dos adenovirus que expressam a enzima hialuronidase PH20 não está restringido a um único tipo tumoral.

A Figura 9 (a) demonstra que a expressão de hialuronidase PH20 resulta também em um aumento da potência oncolitica do adenovirus em relação ao grupo PBS e 30 ao grupo de controle do virus (ICOVIR15). #, significativo (p = 0,02) em comparação com os tumores tratados com PBS a partir do dia 14 ao dia 30. &, significativo (p = 0,05) comparado com os tumores tratados com PBS a partir do dia 14 ao dia 30. *, significativo (p = 0,02) comparado com os tumores tratados com ICOVIR15 a partir do dia 12 ao dia 30. No dia 30, os tumores foram extraidos e congelados em OCT, e posteriormente tratados com um anticorpo a-hexon e 5 contra-corados com DAPI.

Para quantificar o nivel de replicação intratumoral de ICOVIR-17, cinco áreas viáveis de cada um dos tumores (7/10 animais por grupo) foram analisadas e a percentagem de áreas positivas foi medida utilizando-se um 10 programa de informática (software ImageJ). Os resultados desta análise estão ilustrados na Figura 9 (b) onde é observado que os tumores NP-18 tratados com ICOVIR17 exibem uma positividade significativamente maior para presença de adenovirus em comparação aos tumores tratados com ICOVIR15 15 (*, significativo p=0,01).

EXEMPLO 7.

Perfil toxicológico dos adenovirus oncolíticos que expressam o gene da hialuronidase

Para comprovar que a inserção do gene da hialuronidase não modifica substancialmente o padrão de 20 toxicidade induzido pelos adenovirus oncoliticos depois da administração endovenosa, um modelo animal foi escolhido em que o adenovirus humano é capaz de se replicar, como o modelo de hamster sirio dourado (Mesocricetus auratus). O hamster constitui um modelo animal permissivo à replicação 25 do adenovirus humano. Utilizaram-se animais imunocompetentes com 5 semanas de idade (5-6 animais/grupo), que receberam uma única dose de 4 x 1011 vp de ICOVIR15 ou ICOVIR17 por via intravenosa através da veia cefálica no dia 0 e em um volume de 300 μl de PBS. O 30 grupo de controle foi injetado com o mesmo volume de PBS. Cinco dias depois da administração, os animais foram sacrificados e de cada um deles se extraiu o sangue total e soro mediante punção cardiaca para a monitoração dos

parâmetros de toxicidade hepática (enzimas AST e ALT), assim como para contagem das diferentes populações sanguíneas mediante citometria de fluxo (hemograma). Simultaneamente, foram obtidos os figados dos animais, que 5 foram fixados em paraformaldeido a 4% para coloração por hematoxilina/eosina.

Os resultados do estudo de toxicidade hepática indicaram que ambos os virus induzem certa inflamação hepática neste modelo, com elevações dos niveis de 10 transaminases AST e ALT, mas não se observaram quaisquer diferenças entre os animais tratados com ICOVIR15 ou ICOVIR17. Ao nivel hematológico, ambos os virus provocaram elevações das populações de neutrófilos, basófilos e monócitos, assim como contagem plaquetária reduzida em 15 relação aos animais de controle, mas novamente sem diferenças entre ICOVIR15 e ICOVIR17.

EXEMPLO 8. Construção de virus ICOVIR17RGDK

Para gerar este adenovirus, utilizou-se o plasmideo adenoviral pICOVIR17RGDK. Neste plasmideo, o 20 gene da fibra do adenovirus tipo 5 comum foi substituído com uma versão modificada do seu dominio de ligação de heparan-sulfato (aminoácidos 91KKTK94 da sequência de polipeptidio substituído com 91RGDK94) . O plasmideo pICOVIR17RGDK foi construído por meio de uma recombinação 25 homóloga em leveduras entre o produto da digestão parcial de pICOVIR17 com Ndel e a digestão com EcoRI do plasmideo pBSattKKT (que continha a versão modificada da fibra de adenovirus, tal como descrita em N. Bayo et al. "Replacement of adenovirus type 5 fibre shaft heparan 30 sulphate proteoglycan-binding domain with RGD for improved tumor infectivity and targeting". Human Gene Therapy 2009, vol. 20, pp 1214-21).

A Figura 10 mostra a posição da modificação 91RGDK94 no contexto de ICOVIR17RGDK, assim como a sequência completa da proteina de fibra neste adenovirus. O adenovirus ICOVIR17 contém uma versão do gene da fibra 5 adenoviral onde o peptideo RGD-4C foi inserido (Cys-Asp- Cys-Arg-Gly-Asp-Cys-Phe-Cys; CDCRGDCFC, SEQ ID NO: 10) na região Hl da área de "cabeça" (domínio "knob") da proteína (laço hiper-variável evolutivamente, não conservado e muito exposto no capsídeo de adenovirus). ICOVIR17RGDK é 10 totalmente análogo ao ICOVIR17, exceto no gene da fibra, uma vez que a fibra ICOVIR17RGDK difere somente em relação à forma comum do adenovirus humano tipo 5 na substituição dos aminoácidos 91KKTK94 pelo peptideo alta afinidade a integrinas RGDK no domínio de "eixo" da proteína 15 (domínio "shaft") (SEQ ID NO: 9) .

EXEMPLO 9.

Eficácia oncolítica do adenovirus com a modificação do capsídeo ICOVIR17RGDK

Tal como ilustrado na Figura 11, a modificação do capsídeo presente em ICOVIR17RGDK não altera a citotoxicidade in vitro de um adenovirus oncolitico que contém e expressa o gene da hialuronidase PH20. A atividade oncolítica dos dois adenovirus que expressam hialuronidase PH20 (ICOVIR17 e ICOVR17RGDK) foi comparada em duas linhagens de células tumorais, uma de pulmão A549 25 (Figura 11 (a)) e outra de pâncreas NP-18 (Figura 11 (b)). O efeito citopático induzido pelo vírus é medido como uma diminuição da quantidade de proteína em uma monocamada celular infectada (método BCA). As células das duas linhagens celulares tumorais foram semeadas em placas de 96 30 poços a 10000 células/poço. No dia seguinte, as células foram infectadas com diluições seriadas de vírus. As células infectadas foram incubadas durante 6 dias, lavadas com PBS, e a quantidade de proteína remanescente no poço foi medida. Os resultados mostram que in vitro, a modificação de capsideo não altera de forma significativa a atividade oncolitica do adenovirus.

EXEMPLO 10, Perfil toxicológico de distintos adenovirus 5 oncoliticos que expressam o gene de hialuronidase

Para avaliar o impacto da modificação de RGDK no entorno dos adenovirus oncoliticos que expressam hialuronidase, utilizaram-se camundongos Balb/C imuno- competentes sem tumor. Neste caso, foram usados machos de 6 10 semanas de idade (7 animais/grupo). Eles receberam uma única dose de 5 x IO10 vp de ICOVIR17 ou ICOVIR17RGDK por via intravenosa através da veia caudal no dia 0 e em um volume de 150 μl de PBS. No dia 7 (2 animais/grupo) e no dia 12 (5 animais/grupo) após administração, os animais foram 15 sacrificados e de cada um deles extraiu-se o sangue total e o soro por meio de punção cardiaca para contagem das diferentes populações sanguíneas mediante citometria de fluxo (hemograma) e para a monitoração de parâmetros de toxicidade hepática (enzimas AST e ALT). O resultado deste estudo 20 mostrou que ambos os virus aumentaram os niveis das enzimas no dia 7, porém, estes niveis tendem a normalizar-se no dia 12. Não se observaram diferenças significativas entre os grupos ICOVIR17 e ICOVIR17RGDK em nenhum ponto, muito embora fosse observada uma tendência a menor hepatotoxicidade no 25 grupo de animais injetados com ICOVIR17RGDK em comparação com o grupo de ICOVIR17 (niveis levemente de AST e ALT ligeiramente inferiores). Com relação ao perfil hematológico dos animais obtido no dia 12 após administração, observou-se que não existiam quaisquer diferenças significativas nem dos 30 glóbulos brancos, nem na contagem plaquetária dos animais, exceto no número de linfócitos presentes no sangue de animais tratados com ICOVIR17, que era menor que o sangue dos animais dos grupos PBS e grupos ICOVIR17RGDK.

Claims (17)

1. Adenovirus oncolitico caracterizado pelo fato de que compreende uma sequência que codifica uma enzima hialuronidase inserida em seu genoma; em que a sequência de enzima possui a sequência de dominio de ligação à membrana eliminada resultando em uma enzima solúvel; em que a expressão da enzima é controlada pelo promotor principal tardio de adenovirus (MLP); e em que o adenovirus possui modificações no capsideo para aumentar sua infectividade ou alvejar um receptor presente em uma célula tumoral.

2. Adenovirus oncolitico, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o adenovirus é um adenovirus humano.

3. Adenovirus oncolitico, de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que o adenovirus humano é selecionado do grupo que consiste em adenovirus humano de sorotipos 1 a 51.

4. Adenovirus oncolitico, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo fato de que o adenovirus humano é de sorotipo 5.

5. Adenovirus oncolitico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 4, caracterizado pelo fato de que a enzima hialuronidase é uma hialuronidase testicular de mamifero.

6. Adenovirus oncolitico, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que a enzima hialuronidase é hialuronidase testicular humana.

7. Adenovirus oncolitico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, caracterizado pelo fato de que a sequência da enzima é inserida no adenovírus oncolítico depois da sequência de nucleotídeos da fibra adenoviral.

8. Adenovírus oncolítico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de que o adenovírus compreende um promotor específico de tecido ou de tumor, em que o promotor controla a expressão de um ou mais genes do grupo de E1a, E1b, E2 e E4, para obter replicação seletiva em tumores.

9. Adenovírus oncolítico, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que o promotor específico de tecido ou de tumor é selecionado do grupo que consiste em promotor de E2F, promotor de telomerase hTERT, promotor de tirosinase, promotor de antígeno específico de próstata, promotor de alfa-fetoproteína e promotor de COX-2.

10. Adenovírus oncolítico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, caracterizado pelo fato de que o adenovírus tem mutações em um ou mais genes selecionados do grupo que consiste em E1a, E1b, E4 e VA- RNAs, para obter replicação seletiva em tumores.

11. Adenovírus oncolítico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, caracterizado pelo fato de que a modificação do capsídeo é a substituição do domínio de ligação KKTK de heparan-sulfatos presente na fibra adenoviral com o domínio RGDK.

12. Adenovírus oncolítico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, caracterizado pelo fato de que o adenovírus compreende a sequência de nucleotídeos de Kozak que otimiza a tradução em proteína da sequência que codifica a hialuronidase.

13. Adenovírus oncolítico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12, caracterizado pelo fato de que o adenovírus compreende uma sequência que promove a expressão da sequência que codifica a hialuronidase.

14. Adenovírus oncolítico, de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que a sequência que promove a expressão é selecionada do grupo que consiste em uma sequência aceptora de splicing que permite o processamento do RNA, uma sequência de IRES e a sequência 2a de picornavírus.

15. Adenovírus oncolítico, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 14, caracterizado pelo fato de que o adenovírus compreende um ou mais genes inseridos em seu genoma.

16. Composição farmacêutica caracteri zada pelo fato de que compreende uma quantidade terapeuticamente eficaz do adenovírus oncolítico, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 15, em conjunto com veículos ou excipientes farmaceuticamente aceitáveis.

17. Uso do adenovírus oncolítico, conforme definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 15, caracteri zado pelo fato de ser para a fabricação de um medicamento para o tratamento de um câncer em um mamífero incluindo um ser humano; em que o câncer é selecionado do grupo que consiste em melanoma, câncer de pâncreas e câncer de pulmão.

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