BRPI1011753B1 - conjugados imunogênicos de polissacarídeo capsular de staphylococcus aureus de sorotipos 5 e 8, seu uso e composições que os compreendem - Google Patents

conjugados imunogênicos de polissacarídeo capsular de staphylococcus aureus de sorotipos 5 e 8, seu uso e composições que os compreendem Download PDF

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Annaliesa Anderson
Viliam Pavliak
Kathrin Ute Jansen
Ingrid Lea Dodge
Tracy Dee Scott
Jasdeep Singh Nanra
A. Krishna Prasad
Bruce Arthur Green
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Abstract

composições e métodos para preparo de composições imunogênicas de conjugado de polissacarideo capsular de staphylococcus aureus de sorotipos 5 e 8. a presente invenção refere-se a conjugados imunogênicos compreendendo polissacarídeos capsulares de s. aureus de sorotipos 5 e 8 conjugados às proteínas veículos e a métodos para seu preparo e uso. métodos para produção dos conjugados imunogênicos da invenção envolvem conjugação covalente dos polissacarídeos capsulares com as proteínas veículos usando química de conjugação envolvendo 1,1-carboil-di-1,2,4-triazol (cdt) ou 3-(2-piridilditio)-propionil hidrazida (pdph).

Description

Referência Cruzada a Pedidos Relacionados
O presente pedido reivindica o benefício de prioridade dos Pedidos de Patente Provisórios U.S. Nos. 61/219.143 e 61/219.151, depositados em 22 de Junho de 2009, as divulgações completas dos quais são, cada uma, incorporadas aqui por referência na íntegra.
Campo da Invenção
A presente invenção refere-se, de modo geral, a composições imunogênicas de conjugados de polissacarídico capsular de Staphylococcus aureus de sorotipos 5 e 8 e a métodos para seu preparo e uso. Antecedentes da Invenção
Seres humanos são um reservatório natural para Staphylococcus aureus Gram-positivo. Por exemplo, S. aureus pode colonizar a pele, narinas e garganta, permanente ou transitoriamente, sem causar doença. Infecções por S. aureus oscilam de infecções brandas na pele à endocardite, osteomielite, bacteremia e sepsia. S. aureus também causa uma maioria de infecções nosocomiais e sua prevalência em infecções com início em comunidades está aumentando. Além disso, em 2005, infecções por S. aureus resistente à meticilina (Methicillin-Resistant S. aureus - MRSA) foram estimadas em 31,8 por 100.000 indivíduos, incluindo 16.650 mortes nos Estados Unidos em 2005 (Klevens et al. (2007) J. Am. Med. Assoc. 298: 1763-1771). A doença ocorre, subsequentemente, quando os indivíduos se tornam imu- nocomprometidos em virtude de brechas nas barreiras imunes, tal como durante cirurgia, colocação de cateteres de intumescimento ou outros dispositivos, trauma ou ferimentos.
S. aureus produz um grande número de antígenos extra- e intra-celulares, incluindo numerosas toxinas e enzimas. De interesse particular aqui são sorotipos de polissacarídeos capsulares de S. aureus (vide Kara- kawa & Vann, "Capsular polysaccharides of Staphylococcus aureus" em:
Weinstein & Fields, eds. Seminars in Infectious Disease. IV. Bacterial Vaccines. (New York, NY; Thieme Stratton; 1982. páginas 285-293), especialmente polissacarídeos capsulares de sorotipos 5 e 8. Estudos epidemiológicos sobre um grande número de cepas de S. aureus isoladas de indivíduos mostraram que 70% a 80% eram polissacarídeo capsular de sorotipo 5 ou 8 (Arbeit et al. (1984) Diagn. Microbiol. Infect. Dis. 2: 85-91). Infelizmente, os polissacarídeos capsulares são pobres imunogênios em si.
Infecções e doenças estafilocócicas aumentaram dramaticamente nos últimos vinte anos, assim como o uso de dispositivos intravasculares e procedimentos invasivos. A elevação na incidência de doenças é mais problemática em virtude de uma elevação paralela de resistência a antibióticos; portanto, há uma necessidade urgente por composições imunogênicas para prevenir infecções e doenças Estafilocócicas.
SUMÁRIO DA INVENÇÃO
A presente invenção é dirigida a conjugados imunogênicos compreendendo um polissacarídeo capsular de S. aureus de sorotipo 5 ou 8 conjugado a uma proteína veículo e métodos para produção de tais conjugados. Polissacarídeos capsulares de S. aureus de sorotipo 5 ou 8 podem ser obtidos diretamente das bactérias usando procedimentos de isolamento conhecidos por aqueles versados na técnica, podem ser produzidos usando protocolos sintéticos ou podem ser recombinantemente produzidos usando procedimentos de engenharia genética também conhecidos por aqueles versados na técnica. Além disso, a presente invenção proporciona métodos para indução de uma resposta imune contra uma bactéria Staphylococcus, métodos para prevenção de uma doença causada por uma bactéria Staphylococcus e métodos para redução da gravidade de pelo menos um sintoma de uma doença causada por infecção com uma bactéria Staphylococcus.
Em uma modalidade, a invenção compreende um conjugado de polissacarídeo imunogênico-proteína compreendendo um polissacarídeo capsular de Staphylococcus aureus de sorotipo 5 ou 8 isolado conjugado a uma proteína veículo, em que o polissacarídeo tem um peso molecular de entre 20 kDa e 1000 kDa. Em algumas modalidades, o conjugado imunogê- nico tem um peso molecular de entre 200 kDa e 5000 kDa. Em uma modalidade, a porção polissacarídica do conjugado imunogênico tem uma faixa de peso molecular de entre 70 kDa e 300 kDa. Em uma modalidade, o conjugado imunogênico tem uma faixa de peso molecular de entre 500 kDa e 2500 kDa.
Em uma modalidade, o polissacarídeo capsular de sorotipo 5 ou 8 tem um grau de O-acetilação entre 10-100%. Em uma modalidade, o grau de O-acetilação está entre 50-100%. Em uma modalidade, o grau de O- acetilação está entre 75-100%. Em uma modalidade, o conjugado imunogênico gera um anticorpo que é funcional, conforme medido pela morte de bactérias em um modelo de eficácia com animais ou via um ensaio de morte opsonofagocítica.
Em uma modalidade, a proteína veículo do conjugado imunogênico compreende CRM197. Em uma modalidade, a CRM197 é covalentemente ligada ao polissacarídeo através de uma ligação de carbamato, uma ligação de amida ou ambos. Em uma modalidade, a proporção molar de lisinas conjugadas à CRM197 pode ser cerca de 10:1 a cerca de 25:1. Em uma modalidade, o conjugado compreende uma ligação covalente entre a CRMI97 e o polissacarídeo para pelo menos cada 5 a 10 unidades de repetição sacarídi- ca do polissacarídeo. Em uma modalidade, a ligação entre a proteína veículo e 0 polissacarídeo ocorre para uma em cada 5 unidades repetidas do polis-sacarídeo.
Em uma modalidade, o conjugado imunogênico compreendendo CRM197 compreende 5 a 22 lisinas ou 8 a 15 lisinas covalentemente ligadas ao polissacarídeo. Em uma modalidade, o conjugado imunogênico compreendendo CRM197 compreende 5 a 23 lisinas ou 8 a 12 lisinas covalentemente ligadas ao polissacarídeo.
Em uma modalidade, o conjugado imunogênico compreende um polissacarídeo do tipo 5 ou 8 que é 10-100% O-Acetilado. Em uma modalidade, o conjugado imunogênico compreende um polissacarídeo do tipo 5 ou 8 que é 50-100% O-Acetilado. Em uma modalidade, o conjugado imunogênico compreende um polissacarídeo do tipo 5 ou 8 que é 75-100% O-
Acetilado. Em algumas modalidades, a composição imunogênica pode ser usada para gerar anticorpos que são funcionais em um modelo de eficácia com animais ou um ensaio de morte opsonofagocítica.
Em uma modalidade, o conjugado imunogênico compreende menos de cerca de 30% de polissacarídeo do tipo 5 ou 8 livre comparado com a quantidade total de polissacarídeo do tipo 5 ou 8.
Em uma modalidade, o conjugado imunogênico compreende menos de cerca de 20% de polissacarídeo do tipo 5 ou 8 livre comparado com a quantidade total de polissacarídeo do tipo 5 ou 8.
Em uma modalidade, a invenção compreende uma composição imunogênica compreendendo um conjugado imunogênico conforme descrito aqui e pelo menos um de um adjuvante, diluente ou veículo.
O adjuvante pode ser um adjuvante baseado em alumínio, tal como um ou mais de fosfato de alumínio, sulfato de alumínio e hidróxido de alumínio. Em uma modalidade, o adjuvante compreende fosfato de alumínio.
Em uma modalidade, a composição imunogênica compreende menos de cerca de 30% de polissacarídeo do tipo 5 ou 8 livre comparado com a quantidade total de polissacarídeo do tipo 5 ou 8.
Em uma modalidade, a composição imunogênica compreende menos de cerca de 20% de polissacarídeo do tipo 5 ou 8 livre comparado com a quantidade total de polissacarídeo do tipo 5 ou 8.
Em uma modalidade, a invenção compreende um método de indução de uma resposta imune a um conjugado de polissacarídeo capsular de Staphylococcus aureus de sorotipo 5 ou 8 em um indivíduo compreendendo administração, ao indivíduo, de uma quantidade imunologicamente eficaz de uma composição imunogênica, conforme descrito aqui.
Em uma modalidade, a invenção compreende um método de produção de um conjugado imunogênico de polissacarídeo-proteína compreendendo um polissacarídeo capsular de Staphylococcus aureus de sorotipo 5 ou 8 isolado conjugado a uma proteína veículo, o método compreendendo as etapas de: reação de um polissacarídeo capsular de S. aureus de sorotipo 5 ou 8 com 1,1 -carbonil-di-(1,2,4-triazol) (CDT) em um solvente or- gânico para produzir um polissacarídeo de sorotipo 5 ou 8 ativado; e reação do polissacarídeo de sorotipo 5 ou 8 ativado com uma proteína veículo em um solvente orgânico para produzir um conjugado de polissacarídeo de sorotipo 5 ou 8:proteína veículo.
Em uma modalidade, o método de ativação do polissacarídeo capsular de Staphylococcus aureus de sorotipo 5 ou 8 ainda compreende liofilização do polissacarídeo de sorotipo 5 ou 8 isolado e ressuspensão do polissacarídeo liofilizado em um solvente orgânico. Em uma modalidade, o polissacarídeo ressuspenso é ativado e, então, diretamente reagido com a proteína veículo. Em uma modalidade, o polissacarídeo de sorotipo 5 ou 8 ativado isolado é isolado antes de reação com a proteína veículo. Em uma modalidade, o polissacarídeo de sorotipo 5 ou 8 ativado isolado é liofilizado para produzir um polissacarídeo de sorotipo 5 ou 8 isolado ativado liofilizado antes de reação do polissacarídeo com a proteína veículo. Em uma modalidade, o método de produção de um conjugado de polissacarídeo-proteína veículo isolado compreende uma etapa de liofilização da proteína veículo para produzir uma proteína veículo liofilizada antes de reação da proteína veículo com o polissacarídeo. Em uma modalidade, o método de produção do conjugado de polissacarídeo-proteína veículo isolado compreende a etapa de ressuspensão do polissacarídeo de sorotipo 5 ou 8 isolado ativado liofilizado e proteína veículo liofilizada em um solvente orgânico como parte da reação do polissacarídeo de sorotipo 5 ou 8 isolado ativado com uma proteína veículo.
Em uma modalidade, o método de produção de um conjugado de polissacarídeo capsular de S. aureus do tipo 5 ou 8-proteína veículo iso-lado compreende a etapa de diluição da mistura de reação de polissacarídeo ativado e proteína veículo e manutenção de um pH de cerca de 8,8 a cerca de 9,2 durante pelo menos 4 horas a cerca de 20°C a cerca de 26°C.
Em uma modalidade, a mistura de reação de polissacarídeo capsular de S. aureus do tipo 5 ou 8 ativado e proteína veículo são mantidos em um pH de cerca de 9,0 durante pelo menos 4 horas em torno de 23°C.
Em uma modalidade, o método de produção de um polissacarí- deo capsular de S. aureus do tipo 5 ou 8-proteina veículo isolado compreende a etapa de isolamento do conjugado de polissacarídeo de sorotipo 5 ou 8- proteína após ele ser produzido.
Em uma modalidade, o solvente orgânico usado no método de produção de um conjugado de polissacarídeo capsular de S. aureus do tipo 5 ou 8-proteína veículo isolado é um solvente polar aprótico. Em uma modalidade, o solvente polar aprótico é selecionado do grupo consistindo em sul- fóxido de dimetila (DMSO). Em uma modalidade do método de produção de um conjugado de polissacarídeo-proteína veículo isolado, o solvente orgânico é DMSO.
Em uma modalidade, o método de produção do conjugado de polissacarídeo capsular de S. aureus do tipo 5-proteína veículo isolado compreende a etapa de ajuste da concentração de água da mistura de reação compreendendo polissacarídeo capsular do tipo 5 e CDT em um solvente orgânico para entre cerca de 0,1 e 0,3%. Em uma modalidade, a concentração de água da mistura de reação compreendendo polissacarídeo capsular do tipo 5 e CDT em um solvente orgânico é ajustada para cerca de 0,2%.
Em uma modalidade, a etapa de ativação do polissacarídeo capsular de S. aureus do tipo 5 compreende reação do polissacarídeo com uma quantidade de CDT que é um excesso molar de cerca de 20 vezes a quantidade de polissacarídeo presente na mistura de reação compreendendo polissacarídeo capsular do tipo 5 e CDT em um solvente orgânico.
Em uma modalidade, o método de produção do conjugado de polissacarídeo capsular de S. aureus do tipo 8:proteína veículo compreende a etapa de determinação da concentração de água da mistura de reação compreendendo polissacarídeo capsular do tipo 8. Em uma modalidade, a quantidade de CDT adicionada à mistura de reação para ativar o polissacarídeo é proporcionada em uma quantidade de CDT que é equimolar à quantidade de água presente na mistura de reação compreendendo polissacarídeo capsular do tipo 8 e CDT em um solvente orgânico.
Em uma modalidade, a quantidade de CDT adicionada à mistura de reação para ativar o polissacarídeo é fornecida em torno de uma quanti- dade de CDT que está em uma proporção molar de cerca de 0,5:1 comparado com a quantidade de água presente na mistura de reação compreendendo polissacarídeo capsular do tipo 8 e CDT em um solvente orgânico. Em uma modalidade, a quantidade de CDT adicionada à mistura de reação para ativar o polissacarídeo é fornecida em torno de uma quantidade de CDT que está em uma proporção molar de 0,75:1 comparado com a quantidade de água presente na mistura de reação compreendendo polissacarídeo capsu-lar do tipo 8 e CDT em um solvente orgânico.
Em uma modalidade, o método o qual compreende a etapa de isolamento do polissacarídeo ativado compreende a etapa de diafiltração.
Em uma modalidade, o método o qual compreende liofilização da proteína veículo, antes de liofilização a proteína veículo é diafiltrada contra NaCI e a proporção peso/peso de NaCI/proteína veículo é ajustada para cerca de 0,5 a cerca de 1,5. Em uma modalidade, a proporção de NaCI para proteína veículo é cerca de 1.
Em uma modalidade, a proteína veículo usada no método de produção de um conjugado de polissacarídeo capsular de S. aureus do tipo 5 ou 8-proteína veículo isolado compreende CRM197.
Em uma modalidade, a CRMI97 usada no método de produção de um conjugado de polissacarídeo capsular de S. aureus do tipo 5 ou 8- proteína veículo isolado é reagida com o polissacarídeo de sorotipo 5 ou 8 ativado em uma proporção em peso de cerca de 1:1.
Em uma modalidade, o método de produção de um conjugado de polissacarídeo capsular do tipo 5 ou 8-proteína veículo isolado compreende a etapa de mistura do polissacarídeo capsular do tipo 5 ou 8 com imi- dazol ou triazol antes de mistura com CDT em um solvente orgânico.
Em uma modalidade, o método de produção de um conjugado de polissacarídeo capsular de S. aureus do tipo 5 ou 8-proteína veículo isolado compreende a etapa de hidrólise do conjugado de polissacarídeo de sorotipo 5 ou 8-proteína veículo para remover grupos de ativação não reagidos.
Em uma modalidade, a invenção proporciona um método de produção de um conjugado imunogênico compreendendo um polissacarídeo capsular de Staphylococcus aureus de sorotipo 5 ou 8 isolado conjugado a uma proteína veículo, o método compreendendo as etapas de: reação do polissacarídeo capsular de S. aureus de sorotipo 5 ou 8 com 3-(2-piridilditio)- propionil hidrazida (PDPH) e uma carbodi-imida em um solvente orgânico para produzir um polissacarídeo PDPH-ligado; reação do polissacarídeo PDPH-ligado com um agente de redução para produzir um polissacarídeo ativado; isolamento do polissacarídeo de sorotipo 5 ou 8 ativado para produzir um polissacarídeo de sorotipo 5 ou 8 ativado isolado; fornecimento de uma proteína veículo; reação do polissacarídeo de sorotipo 5 ou 8 ativado isolado com a proteína veículo ativada para produzir um conjugado de polissacarídeo de sorotipo 5 ou 8-proteína veículo; pelo que um conjugado imunogênico compreendendo um polissacarídeo capsular de S. aureus de sorotipo 5 ou 8 isolado conjugado a uma proteína veículo é produzido. Em uma modalidade, a proteína veículo ativada é isolada antes de reação da proteína veículo ativada com o polissacarídeo ativado.
Em uma modalidade, a etapa de isolamento da proteína veículo ativada ainda compreende liofilização do polissacarídeo de sorotipo 5 ou 8 ativado isolado para produzir um polissacarídeo de sorotipo 5 ou 8 ativado liofilizado.
Em uma modalidade, o ácido bromoacético é um N-hidróxi- succinimida éster de ácido bromoacético (BAANS).
Em uma modalidade, o método de produção do conjugado de polissacarídeo capsular de sorotipo 5 ou 8-proteína veículo o qual utiliza PDPH compreende o uso de um solvente orgânico que é um solvente polar aprótico. Em uma modalidade, o solvente polar aprótico é selecionado do grupo consistindo em sulfóxido de dimetila (DMSO), dimetilformamida (DMF), dimetilacetamida, /V-metil-2-pirrolidona e hexametilfosforamida (HM- PA). Em uma modalidade, o solvente orgânico é sulfóxido de dimetila (DMSO).
Em uma modalidade, a carbodi-imida usada no método de produção do conjugado de polissacarídeo capsular de sorotipo 5 ou 8-proteína veículo o qual utiliza PDPH é 1-Etil-3-(3-dimetilaminopropil)-carbodi-imida (EDAC).
Em uma modalidade, o método de produção do conjugado de polissacarídeo capsular de sorotipo 5 ou 8-proteína veículo o qual utiliza PDPH e EDAC compreende a etapa de reação do polissacarídeo capsular de sorotipo 5 ou 8 com PDPH e EDAC em um solvente em uma proporção em peso de polissacarídeo:PDPH:EDAC de cerca de 1:5:3.
Em uma modalidade, o agente de redução usado no método de produção do conjugado de polissacarídeo capsular de sorotipo 5 ou 8- proteína veículo o qual utiliza PDPH e EDAC é ditiotreitol (DTT).
Em uma modalidade, ativação da proteína veículo no método de produção do conjugado de polissacarídeo capsular de sorotipo 5 ou 8- proteína veículo o qual utiliza PDPH e EDAC compreende reação da proteína veículo com um ácido bromoacético.
Em uma modalidade, a etapa de isolamento do polissacarídeo de sorotipo 5 ou 8 ativado no método de produção do conjugado de polissacarídeo capsular de sorotipo 5 ou 8-proteína veículo o qual utiliza PDPH e EDAC compreende diafiltração.
Em uma modalidade, o método de produção de conjugado de polissacarídeo capsular de sorotipo 5 ou 8-proteína veículo o qual utiliza PDPH e EDAC compreende a etapa de hidrólise do conjugado de polissacarídeo de sorotipo 5 ou 8-proteína veículo para remover grupos de ativação não reagidos. Em uma modalidade, a etapa de hidrólise do conjugado de polissacarídeo do sorotipo 5 ou 8-proteína veículo compreende a adição de cloridrato de cisteamina.
Em uma modalidade, o método de produção de um conjugado de polissacarídeo capsular de sorotipo 5 ou 8-proteína veículo o qual utiliza PDPH e EDAC ainda compreende isolamento do conjugado imunogênico compreendendo polissacarídeo capsular de S. aureus de sorotipo 5 ou 8 isolado a uma proteína veículo.
Em uma modalidade, o isolamento do conjugado de polissacarídeo de sorotipo 5 ou 8-proteína veículo compreende diafiltração.
Em uma modalidade, a proteína veículo usada no método de produção de conjugado de polissacarídeo capsular de sorotipo 5 ou 8- proteína veículo o qual utiliza PDPH e EDAC compreende CRMI97.
Em uma modalidade, a CRM197 no método de produção do conjugado de polissacarídeo capsular de sorotipo 5 ou 8-CRM-i97 o qual utiliza PDPH e EDAC é adicionada em uma proporção em peso de molécula de CRM197:polissacarídeo capsular de cerca de 1:1.
Em uma modalidade, polissacarídeo capsular do tipo 5 ou 8 ativado usado no método de produção do conjugado de polissacarídeo capsular de sorotipo 5 ou 8-proteína veículo o qual utiliza PDPH e EDAC tem um tamanho entre cerca de 50 kd e cerca de 500 kd.
Em uma modalidade, o conjugado imunogênico produzido no método de produção do conjugado de polissacarídeo capsular de sorotipo 5 ou 8-proteína veículo o qual utiliza PDPH e EDAC tem um tamanho entre cerca de entre 400 kd e cerca de 5000 kd.
Em uma modalidade, a invenção proporciona uma composição imunogênica compreendendo um conjugado de polissacarídeo capsular do tipo 5 ou 8-proteína veículo produzido por meio de qualquer um dos métodos descritos aqui.
Em uma modalidade, a invenção proporciona uma composição imunogênica compreendendo um conjugado de polissacarídeo capsular do tipo 5 ou 8-proteína veículo produzido por meio de qualquer um dos métodos descritos aqui e pelo menos um de um adjuvante, diluente ou veículo. Em uma modalidade, as composições imunogênicas compreendem um adjuvante baseado em alumínio que pode ser selecionado do grupo consistindo em fosfato de alumínio, sulfato de alumínio e hidróxido de alumínio. Em uma modalidade, as composições imunogênicas descritas aqui compreendem o adjuvante fosfato de alumínio.
As composições imunogênicas descritas aqui podem compreender menos de 30% e menos de 20% de polissacarídeo do tipo 5 ou 8 livre comparado com a quantidade total de polissacarídeo do tipo 5 ou 8. As composições imunogênicas descritas aqui podem ser armazenadas em água ou em um tampão de pH neutro de baixa resistência iônica.
Em uma modalidade, a invenção proporciona um método de redução ou prevenção de uma infecção, doença ou condição estafilocócica associada às bactérias Staphylococcus em um indivíduo, o método compreendendo a etapa de administração de uma quantidade terapêutica ou profila- ticamente eficaz de uma componente imunogênica conforme descrito aqui ao indivíduo. Em uma modalidade, a infecção, doença ou condição é selecionada do grupo consistindo em Staphylococcus aureus invasivo, sepsia e transmissão.
Em uma modalidade, a invenção proporciona um método de redução ou prevenção de uma infecção estafilocócica em um indivíduo que está sofrendo um procedimento cirúrgico, o método compreendendo a etapa de administração de uma quantidade profilaticamente eficaz de uma composição imunogênica conforme descrito aqui ao indivíduo antes do procedimento cirúrgico.
Em uma modalidade, o método da invenção compreende a substituição de CDI por CDT.
Em uma modalidade, a invenção proporciona um polissacarídeo capsular de Staphylococcus aureus do Tipo 5 ou 8 tendo um peso molecular de entre 50 kDa e 800 kDa covalentemente ligado a uma proteína veículo, em que o peso molecular combinado do polissacarídeo covalentemente ligado à proteína veículo está entre cerca de 400 kDa e 5000 kDa.
Em uma modalidade, o polissacarídeo covalentemente ligado à proteína veículo compreende uma porção polissacarídica que tem uma faixa de peso molecular de entre 70 kDa e 300 kDa. Em uma modalidade, o polissacarídeo covalentemente ligado à proteína veículo tem uma faixa de peso molecular de entre 500 kDa e 2500 kDa.
Em uma modalidade, a porção de proteína veículo do polissacarídeo covalentemente ligado à proteína veículo compreende CRM^. Em uma modalidade, a CRMi97é covalentemente ligada ao polissacarídeo através de uma ligação de carbamato, uma ligação de amida ou ambas. Em algumas modalidades, a proporção molar de lisinas conjugadas à CRMI97 é cerca de 10:1 a cerca de 25:1. Em algumas modalidades, o polissacarídeo covalentemente ligado à proteína veículo compreende pelo menos uma ligação covalente entre a CRM197 pelo menos a cada 5 a 10 unidades sacarídi- cas repetidas do polissacarídeo. Em algumas modalidades, o polissacarídeo covalentemente ligado à proteína veículo compreende pelo menos uma ligação entre a CRMI97 e o polissacarídeo ocorrendo a cada 5 unidades sacarí- dicas repetidas do polissacarídeo. Em algumas modalidades, a porção CRM197 do polissacarídeo covalentemente ligado à CRMI97 compreende 5 a 22 lisinas covalentemente ligadas ao polissacarídeo. Em algumas modalidades, a porção CRMI97 do polissacarídeo covalentemente ligado à CRM197 compreende 5 a 23 lisinas covalentemente ligadas ao polissacarídeo. Em algumas modalidades, a porção CRMI97 do polissacarídeo covalentemente ligado à proteína veículo compreende 8 a 15 lisinas covalentemente ligadas ao polissacarídeo. Em algumas modalidades, a porção CRMI97 do polissacarídeo covalentemente ligado à proteína veículo compreende 8 a 12 lisinas covalentemente ligadas ao polissacarídeo.
Em uma modalidade, a invenção proporciona uma composição imunogênica compreendendo um polissacarídeo de S. aureus de sorotipo 5 ou 8 covalentemente ligado a uma proteína veículo conforme descrito aqui e pelo menos um de um adjuvante, diluente ou veículo.
Em uma modalidade, a invenção proporciona um método de administração de uma composição imunogênica compreendendo um polissacarídeo de S. aureus de sorotipo 5 ou 8 covalentemente ligado a uma proteína veículo conforme descrito aqui a um indivíduo para gerar uma resposta imune, conforme descrito aqui.
Em uma modalidade, a invenção proporciona um método de isolamento de um polissacarídeo com um peso molecular entre 20 kDa e 1000 kDa.
Em uma modalidade, a invenção proporciona um anticorpo gerado por um polissacarídeo capsular, um conjugado imunogênico ou uma composição imunogênica da presente invenção.
BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS
A presente invenção será melhor entendida e outras características, aspectos e vantagens que não aquelas apresentadas acima se tornarão evidentes quando se considera a descrição detalha a seguir da mesma. Tal descrição detalhada faz referência aos desenhos a seguir, em que:
A figura 1 mostra uma estrutura de polissacarídeo repetida de polissacarídeo capsular de S. aureus de sorotipo 8 (ácido N-acetil manosa- minurônico é ManNAca, N-acetil L-fucosamina é L-FucNAc e N-acetil D- fucosamina é D-FucNAc).
A figura 2A mostra uma análise de frações a partir de cromato- grafia de troca de íons (Q-Sepharose) para polissacarídeo capsular de S. aureus de sorotipo 8 (ensaio de O-Acetila) e ácido teicoico (ensaio de fosfato); a figura 2B mostra uma análise de frações a partir de cromatografia de troca de íons (Q-Sepharose) para polissacarídeo capsular de S. aureus de sorotipo 8 através do ensaio de imunodifusão dupla.
A figura 3A mostra o efeito do pH (3,5, 4 ou 5) a 95°C sobre a redução de peso molecular de polissacarídeo capsular de S. aureus de sorotipo 8 quando de tratamento térmico; a figura 3B mostra o efeito da temperatura (55°C, 75°C ou 95°C) em um pH de 3,5 sobre a redução de peso molecular de polissacarídeo capsular de S. aureus de sorotipo 8 quando de tratamento térmico.
A figura 4 mostra o peso molecular de polissacarídeo capsular de S. aureus de sorotipo 8 purificado comparado com o polissacarídeo capsular de sorotipo 5 com o tempo durante tratamento térmico em um pH de 3,5 e 4,5, respectivamente e 95 °C.
A figura 5 mostra a sobrevida aumentada em camundongos que receberam conjugado de polissacarídeo capsular de sorotipo 8--CRM197 (diamantes) comparado com controles tratados com AIPO4 (círculos).
A figura 6 mostra uma estrutura de polissacarídeo repetida de polissacarídeo de S. aureus de sorotipo 5 (ácido A/-acetil manosaminurônico é ManNAcA, A/-acetil L-fucosamina é L-FucNAc e AZ-acetil D-fucosamina é D- FucNAcA).
A figura 7A mostra uma análise de frações a partir de cromato- grafia de troca de ions (Q-Sepharose) para polissacarídeo de S. aureus de sorotipo 5 (ensaio de O-Acetila) e ácido teicoico (ensaio de fosfato); a figura 7B mostra uma análise de frações a partir de cromatografia de troca de ions (Q-Sepharose) para polissacarídeo de S. aureus de sorotipo 5 através do ensaio de imunodifusão dupla.
A figura 8A mostra o efeito do pH (3,5, 4 ou 5) a 95°C sobre a redução de peso molecular do polissacarídeo capsular de S. aureus de sorotipo 5 quando de tratamento térmico; a figura 8B mostra o efeito da temperatura (55°C, 75°C ou 95°C) em um pH de 3,5 sobre a redução de peso molecular de polissacarídeo capsular de S. aureus de sorotipo 5 quando de tratamento térmico.
A figura 9 mostra pielonefrite reduzida em camundongos que receberam um conjugado de polissacarídeo de sorotipo 5-CRM197 comparado com controles tratados com PBS (área sombreada são os camundongos tratados).
A figura 10 mostra as unidades de formação de colônia (colony forming units - CFU) recuperadas em rins após estímulo com S. aureus PFESA0266 em camundongos vacinados com CP5-CRM de alto peso molecular (HMW), CP5-CRM de baixo peso molecular (LMW) ou PP5-CRM de controle.
A figura 11 mostra uma comparação de titulações de OPA (ge- omédia) de soro obtido de camundongos vacinados com diferentes formulações de conjugado polissacarídico (CP5-CRM de alto peso molecular - High Molecular Weight (HMW), CP5-CRM de baixo peso molecular - Low Molecular Weight (LMW)). Os grupos consistiam de 5 a 9 camundongos.
DESCRIÇÃO DETALHADA Visão Geral
A presente invenção refere-se a conjugados imunogênicos compreendendo polissacarídeos capsulares de S. aureus de sorotipo 5 ou 8 conjugados às proteínas veículos e métodos para seu preparo e uso. Novas características dos conjugados imunogênicos da invenção incluem os perfis de peso molecular dos polissacarídeos e conjugados resultantes, a proporção de lisinas conjugadas por proteína veículo CRM197 e 0 número de lisinas co- valentemente ligadas ao polissacarídeo, o número de ligações covalentes entre a proteína veículo e o polissacarídeo como uma função de unidades de repetição do polissacarídeo e a quantidade relativa de polissacarídeo livre comparado com o polissacarídeo total. O termo "polissacarídeo livre", conforme usado aqui, significa um polissacarídeo que não está conjugado a uma proteína veículo mas, todavia, está presente na composição de conjugado.
Métodos para produção dos conjugados imunogênicos da invenção envolve conjugação covalente dos polissacarídeos capsulares com as proteínas veículos usando química de conjugação envolvendo CDI (1,1- carbonildi-imidazol), CDT (1,1-carbonil-di-1,2,4-triazol) ou PDPH (3-(2- piridilditioj-propionil hidrazida). CDI é específica para conjugação de CP8 apenas. Uso de CDI/CDT resulta em um ligante com um carbono ou zero carbono entre o polissacarídeo capsular e a proteína veículo, enquanto que uso de PDPH resulta em uma ligação covalente de tioéter entre o polissacarídeo capsular e a proteína veículo.
Reticulantes adicionais para -SH (CP tiolado) à ligações -NH2 incluem, mas não estão limitados a: sulfo-LC-SMPT; sulfo-LC-SMPT (4- sulfo-succinimidil-6-metil-a-(2-piridilditio)toluamido]hexanoato)); sulfo-KMUS (A/-[k-maleimidoundecanoilóxi]sulfo-succinimida éster); sulfo-LC-SPDP (sul- fo-succinimidil 6-(3'-[2-piridilditio]-propionamido)hexanoato), o qual cliva bi tióis; sulfo-SMPB (sulfo-succinimidil 4-[p-maleimidofenil]butirato); sulfo-SIAB (A/-sulfo-succinimidil[4-iodoacetil]aminobenzoato); sulfo-EMCS ([N-e- maleimidocaproilóxi]sulfo-succinimida éster); EMCA (ácido /V-e- maleimidocaproico); sulfo-SMCC (4-[/V-maleimidometil]ciclohexano-1 - carboxilato de sulfo-succinimidila); sulfo-MBS (m-maleimidobenzoil-N- hidróxi-sulfo-succinimida éster); sulfo-GMBS (N-[g-maleimidobutirilóxi]sulfo- succinimida éster); BMPA (ácido N-β-maleimidopropionico); cloridrato de 2- imunotiolano; N-succinimidil éster de ácido 3-(2-piridilditio) propiônico; N- succinimidil éster de ácido 3-malemidopropiônico; N-succinimidil éster de ácido 4-maleimidobutírico; SMPT (4-succinimidilóxicarbonil-metil-a-[2- piridilditio]tolueno); LC-SMCC (succinimidil-4-[N-maleimidometil]ciclohexano- 1-carbóxi-[6-amidocaproato]); KMUA (ácido N-k-maleimidoundecanoico); LC- SPDP (succinimidil 6-(3-[2-piridilditio]-propionamido)hexanoato); SMPH (succinimidil-6-[β-maleimidopropionamido]hexanoato); SMPB (succinimidil 4- [p-maleimidofenil]butirato); SIAB (/V-succinimidil[4-iodoacetil]aminobenzoato); EMCS ([N-e-Maleimidocaproilóxi]succinimida éster); SMCC (succinimidil 4- [A/-maleimidometil]ciclohexano-1 -carboxilato); MBS (n?-Maleimidobenzoil-N- hidróxi-succinimida éster); SBAP (succinimidil 3- [bromoacetamido]propionato); BMPS (A/-[β-maleimidopropil0xi]succinimida éster); AMAS N-(a-maleimidoacetóxi) succinimida éster); SIA (A/-succinimidil iodoacetato); e N-succinimidil (4-iodoacetil)-aminobenzoato.
Os agentes podem também ser ligados de maneira cruzada u- sando reticulantes para grupos -SH a grupos -OH. Tais reticulantes incluem, mas não estão limitados a, PMPI (isocianato de N-[p-maleimidofenila]).
As composições e os métodos descritos aqui são úteis em uma variedade de aplicações. Por exemplo, os conjugados podem ser usados na produção de composições imunogênicas de conjugado para proteger os recipientes contra infecções por S. aureus. Alternativamente, os vários conjugados podem ser usados na produção de anticorpos contra polissacarídeos capsulares bacterianos os quais, subsequentemente, podem ser usados em pesquisa e ensaios em laboratório clínico, tais como detecção e sorotipifica- ção bacteriana. Tais anticorpos podem também ser usados para conferir i- munidade passiva a um indivíduo. Em algumas modalidades, os anticorpos produzidos contra polissacarídeos bacterianos são funcionais em um modelo de eficácia com animais ou em um ensaio de morte opsonofagocítica.
A menos que de outro modo definido, todos os termos técnicos e científicos usados aqui têm o mesmo significado conforme comumente entendido por aqueles versados na técnica ao qual a invenção pertence. Embora quaisquer métodos e materiais similares ou equivalentes àqueles descritos aqui possam ser usados na prática ou testagem da invenção, os métodos e materiais preferidos são descritos aqui. Na descrição das modalidades e reivindicações da invenção, determinada terminologia será usada de acordo com as definições apresentadas abaixo.
Conforme usado aqui, as formas no singular "um", "uma, "o" e "a" incluem as referências no plural, a menos que o contexto oriente clara- mente de outro modo. Assim, por exemplo, referências a "o método" incluem um ou mais métodos e/ou etapas do tipo descrito aqui e/ou as quais serão evidentes para aqueles versados na técnica quando de leitura da presente divulgação e assim por diante.
Conforme usado aqui, "cerca de" significa dentro de uma faixa estatisticamente significativa de um valor, tal como uma faixa de concentração estabelecida, período de tempo, peso molecular, temperatura ou pH. Tal faixa pode estar dentro de uma ordem de magnitude, tipicamente dentro de 20%, mais tipicamente dentro de 10% e, ainda mais tipicamente, dentro de 5% de um determinado valor ou faixa. A variação permissivel abrangida pelo termo "cerca de" dependerá do sistema sob estudo em particular e pode ser prontamente apreciada por aqueles versados na técnica. Sempre que uma faixa é mencionada dentro do presente pedido, cada número inteiro dentro da faixa também é considerado como uma modalidade da invenção.
Deve ser notado que, na presente divulgação, termos tais como "compreende", "compreendida", "compreendendo", "contém", "contendo" e semelhantes têm o significado atribuído aos mesmos na lei de patente U.S.; por exemplo, eles podem significar "incluem", "incluído", "incluindo" e semelhantes. Tais termos referem-se à inclusão de um ingrediente ou conjunto de ingredientes em particular sem excluir quaisquer outros ingredientes. Termos tais como "consistindo essencialmente de" e "consiste essencialmente de" têm o significado atribuído aos mesmos na lei de patente U.S., por exemplo, eles permitem a inclusão de ingredientes ou etapas adicionais que não se desviam as características novas ou básicas da invenção, isto é, eles excluem ingredientes ou etapas não mencionadas adicionais que se desviam das características novas ou básicas da invenção e eles excluem ingredientes ou etapas da técnica anterior, tais como documentos da técnica que são citados aqui ou são incorporados aqui por referência, especialmente uma vez que é um objetivo do presente documento definir modalidades que são passíveis de patente, por exemplo, novas, não óbvias, inventivas, com relação à técnica anterior, por exemplo, com relação aos documentos citados aqui ou incorporados aqui por referência. E os termos "consiste em" e "consistindo em" têm o significado atribuído aos mesmos na lei de patente U.S.; isto é, esses termos são de sentido limitado. Consequentemente, esses termos referem-se à inclusão de um ingrediente ou conjunto de ingredientes em particular e à exclusão de todos os outros ingredientes.
Conjugados Imunoqênicos
Conforme descrito acima, a presente invenção refere-se a conjugados imunogênicos compreendendo polissacarídeos capsulares de S. aureus de sorotipo 5 ou 8 conjugados às proteínas veículos. Uma modalidade da invenção proporciona conjugados imunogênicos compreendendo um polissacarídeo capsular de S. aureus de sorotipo 5 ou 8 conjugado a uma molécula ou proteína veículo tendo uma ou mais das seguintes características: o polissacarídeo tem um peso molecular de entre 50 kDa e 700 kDa; o conjugado imunogênico tem um peso molecular de entre 500 kDa a 2500 KDa; and o conjugado compreende menos de cerca de 30% de polissacarídeo livre com relação ao polissacarídeo total. Em algumas modalidades, o polissacarídeo tem um peso molecular de entre 20 kDa e 1000 kDa. Em algumas modalidades, o conjugado imunogênico tem um peso molecular de entre 200 kDa e 5000 kDa. Em outras modalidades, o conjugado compreende menos de cerca de 25%, cerca de 20%, cerca de 15%, cerca de 10% ou cerca de 5% de polissacarídeo livre com relação ao polissacarídeo total.
Os "conjugados", conforme usados aqui, compreendem um polissacarídeo capsular usualmente de uma faixa de peso molecular desejada e uma proteína veículo, em que o polissacarídeo capsular é conjugado à proteína veículo. Conjugados podem ou não conter alguma quantidade de polissacarídeo capsular livre. Conforme usado aqui, "polissacarídeo capsular livre" refere-se a um polissacarídeo capsular que é não covalentemente associado (isto é, não covalentemente ligado a, adsorvido a ou encerrado em ou com) o polissacarídeo capsular-proteína veículo conjugados. Os termos "polissacarídeo capsular livre", "polissacarídeo livre" e "sacarídeo livre" po- dem ser usados permutavelmente e se destinam a trazer o mesmo significado.
A despeito da natureza da molécula veículo, ela pode ser conjugada ao polissacarídeo capsular, quer diretamente ou através de um ligante. Conforme usado aqui, "conjugar", "conjugado" e "conjugação" referem-se a um processo pelo qual um polissacarídeo capsular bacteriano é covalentemente preso à molécula veículo. Conjugação intensifica a imunogenicidade dos polissacarídeos capsulares bacterianos. A conjugação pode ser realizada de acordo com os métodos descritos abaixo ou através de processos conhecidos no campo.
O peso molecular de um polissacarídeo capsular de S. aureus é uma consideração quando de uso em composições imunogênicas. Por e- xemplo, polissacarídeos capsulares de alto peso molecular capsulares podem ser capazes de induzir às determinadas respostas imunes de anticorpo em virtude de uma maior valência dos epitopos presentes sobre a superfície antigênica. O isolamento de "polissacarídeos capsulares de alto peso molecular" é considerado para uso nas composições e métodos da presente invenção. Em uma modalidade da invenção, o isolamento de polissacarídeos do tipo 5 de alto peso molecular oscilando, quanto ao tamanho, de cerca de 50 a cerca de 800 kDa quanto ao peso molecular é considerado. Em uma modalidade da invenção, polissacarídeo capsular de sorotipo 5 ou 8 de alto peso molecular pode ser isolado e purificado oscilando de 20 kDa a 1000 kDa de peso molecular. Em uma modalidade da invenção, polissacarídeo capsular de sorotipo 5 ou 8 de alto peso molecular pode ser isolado e purificado oscilando de 50 kDa a 700 kDa de peso molecular. Em uma modalidade da invenção, polissacarídeo capsular de sorotipo 5 ou 8 de alto peso mo-lecular pode ser isolado e purificado oscilando de 50 kDa a 300 kDa de peso molecular. Em uma modalidade, polissacarídeo capsular de sorotipo 5 ou 8 de alto peso molecular pode ser isolado e purificado oscilando de 70 kDa a 300 kDa de peso molecular. Em uma modalidade, polissacarídeo capsular de sorotipo 5 ou 8 de alto peso molecular pode ser isolado e purificado oscilando de 90 kDa a 250 kDa de peso molecular. Em uma modalidade, polis- sacarídeo capsular de sorotipo 5 ou 8 de alto peso molecular pode ser isolado e purificado oscilando de 90 kDa a 150 kDa de peso molecular. Em uma modalidade, polissacarídeo capsular de sorotipo 5 ou 8 de alto peso molecular pode ser isolado e purificado oscilando de 90 kDa a 120 kDa de peso molecular. Em uma modalidade, polissacarídeo capsular de sorotipo 5 ou 8 de alto peso molecular pode ser isolado e purificado oscilando de 80 kDa a 120 kDa de peso molecular. Outras faixas de polissacarídeo capsular de sorotipo ou 8 de alto peso molecular que pode ser isolado e purificado por meio dos métodos da presente invenção incluem 70 kDa a 100 kDa de peso molecular; 70 kDa a 110 kDa de peso molecular; 70 kDa a 120 kDa de peso mole cular; 70 kDa a 130 kDa de peso molecular; 70 kDa a 140 kDa de peso mo lecular; 70 kDa a 150 kDa de peso molecular; 70 kDa a 160 kDa de peso molecular; 80 kDa a 110 kDa de peso molecular; 80 kDa a 120 kDa de peso molecular; 80 kDa a 130 kDa de peso molecular; 80 kDa a 140 kDa de peso molecular; 80 kDa a 150 kDa de peso molecular; 80 kDa a 160 kDa de peso molecular; 90 kDa a 110 kDa de peso molecular; 90 kDa a 120 kDa de peso molecular; 90 kDa a 130 kDa de peso molecular; 90 kDa a 140 kDa de peso molecular; 90 kDa a 150 kDa de peso molecular; 90 kDa a 160 kDa de peso molecular; 100 kDa a 120 kDa de peso molecular; 100 kDa a 130 kDa de peso molecular; 100 kDa a 140 kDa de peso molecular; 100 kDa a 150 kDa de peso molecular; 100 kDa a 160 kDa de peso molecular; e faixas de peso molecular desejadas similares. Qualquer número inteiro dentro de qualquer uma das faixas acima é considerado como uma modalidade da invenção.
Em uma modalidade, o conjugado tem um peso molecular de entre cerca de 50 kDa e cerca de 5000 kDa de peso molecular. Em uma modalidade, o conjugado tem um peso molecular de entre cerca de 200 kDa e cerca de 5000 kDa de peso molecular. Em uma modalidade, o conjugado imunogênico tem um peso molecular de entre cerca de 500 kDa e cerca de 2500 kDa. Em uma modalidade, o conjugado imunogênico tem um peso molecular de entre cerca de 500 kDa e cerca de 2500 kDa. Em uma modalidade, o conjugado imunogênico tem um peso molecular de entre cerca de 600 kDa e cerca de 2800 kDa. Em uma modalidade, o conjugado imunogênico tem um peso molecular de entre cerca de 700 kDa e cerca de 2700 kDa. Em uma modalidade, o conjugado imunogênico tem um peso molecular de entre cerca de 1000 kDa e cerca de 2000 kDa; entre cerca de 1800 kDa e cerca de 2500 kDa; entre cerca de 1100 kDa e cerca de 2200 kDa; entre cerca de 1900 kDa e cerca de 2700 kDa; entre cerca de 1200 kDa e cerca de 2400 kDa; entre cerca de 1700 kDa e cerca de 2600 kDa; entre cerca de 1300 kDa e cerca de 2600 kDa; entre cerca de 1600 kDa e cerca de 3000 kDa. Qualquer número inteiro dentro de qualquer uma das faixas acima é considerado como uma modalidade da invenção.
Conforme usado aqui, "imunogênico" refere-se à capacidade de um antígeno (ou um epitopo do antígeno), tal como um polissacarídeo capsular bacteriano ou uma composição imunogênica de conjugado compreendendo o antígeno, de estimular uma resposta imune em um hospedeiro, tal como um mamífero, quer humoral ou célula-mediada ou ambos. Consequentemente, "conjugado imunogênico" ou "conjugado", conforme usado aqui, significa qualquer conjugado imunogênico contendo um antígeno ou determinante antigênico (isto é, epitopo) de um polissacarídeo capsular bacteriano conjugado a uma molécula veículo que pode ser usado para estimular uma resposta imune. O conjugado imunogênico serve para sensibilizar o hospedeiro mediante a apresentação do antígeno em associação com moléculas do MHC em uma superfície celular. Além disso, células T antígeno- específicas ou anticorpos podem ser gerados para permitir a futura proteção de um hospedeiro imunizado. Conjugados imunogênicos, assim, podem proteger o hospedeiro de um ou mais sintomas associados à infecção pelas bactérias ou podem proteger o hospedeiro contra morte em virtude da infecção com as bactérias associadas ao polissacarídeo capsular. Conjugados imunogênicos também podem ser usados para gerar anticorpos policlonais ou monoclonais, os quais podem ser usados para conferir imunidade passiva a um indivíduo. Conjugados imunogênicos podem também ser usados para gerar anticorpos que são funcionais, conforme medido pela morte de bactérias em um modelo de eficácia com animais ou via um ensaio de morte op- sonofagocítica.
Um "anticorpo" é uma molécula de imunoglobulina capaz de ligação específica a um alvo, tal como um carboidrato, polinucleotídeo, lipídio, polipeptídeo, etc., através de pelo menos um sítio de reconhecimento de antígeno, localizado na região variável da molécula de imunoglobulina. Conforme usado aqui, a menos que de outro modo indicado pelo contexto, o termo se destina a abranger não apenas anticorpos policlonais ou monoclo- nais intactos, mas também anticorpos manipulados (por exemplo, quiméricos, humanizados e/ou derivatizados para alterar funções efetuadoras, estabilidade e outras atividades biológicas) e fragmentos dos mesmos (tais como Fab, Fab', F(ab’)2, Fv), anticorpos com cadeia única (ScFv) e domínio, incluindo anticorpos de tubarão e camelídeo) e proteínas de fusão compreendendo uma porção de anticorpo, anticorpos multivalentes, anticorpos multiespe- cíficos (por exemplo, anticorpos biespecíficos, contanto que eles exibam a atividade biológica desejada) e fragmentos de anticorpo conforme descrito aqui e qualquer outra configuração modificada da molécula de imunoglobulina que compreende um sítio de reconhecimento de antígeno. Um anticorpo inclui um anticorpo de qualquer classe, tal como IgG, IgA ou IgM (ou subclasse das mesmas) e o anticorpo não precisa ser de qualquer classe em particular. Dependendo da sequência de aminoácido do domínio constante de anticorpo de suas cadeias pesadas, imunoglobulinas podem ser atribuídas à diferentes classes. Existem cinco principais classes de imunoglobulinas: IgA, IgD, IgE, IgG e IgM e várias dessas podem ser ainda divididas em subclasses (isotipos), por exemplo, lgG1, lgG2, lgG3, lgG4, lgA1 e lgA2 em seres humanos. Os domínios de cadeia pesada que correspondem às diferentes classes de imunoglobulinas são denominados alfa, delta, epsilon, gama e mu, respectivamente. As estruturas de subunidade e configurações tridimensionais de diferentes classes de imunoglobulinas são bem conhecidas.
"Fragmentos de anticorpo" compreendem apenas uma porção de um anticorpo intacto, em que a porção retém, de preferência, pelo menos uma, mais preferivelmente a maioria ou todas as funções normalmente associadas a essa porção quando presente em um anticorpo intacto.
O termo "antígeno" refere-se, em geral, a uma molécula biológica, usualmente uma proteína, peptídeo, polissacarídeo, lipídio ou conjugado o qual contém pelo menos um epitopo ao qual um anticorpo cognato pode se ligar seletivamente; ou, em alguns casos, a uma substância imunogênica que pode estimular a produção de anticorpos ou respostas de células T ou ambos, em um animal, incluindo composições que são injetadas ou absorvidas por um animal. A resposta imune pode ser gerada à molécula inteira ou a uma ou mais de várias porções da molécula (por exemplo, um epitopo ou hapteno). O termo pode ser usados para referir-se a uma molécula individual ou a uma população homogênea ou heterogênea de moléculas antigênicas. Um antígeno é reconhecido por anticorpos, receptores de células T ou outros elementos de imunidade humoral e/ou celular específicos. O termo "antígeno" inclui todos os epitopos antigênicos relacionados. Epitopos de um determinado antígeno podem ser identificados usando qualquer número de técnicas de mapeamento de epitopo bem conhecidos no campo. Vide, por exemplo, Epitope Mapping Protocols in Methods in Molecular Biology, Vol. 66 (Glenn E. Morris, Ed., 1996) Humana Press, Totowa, N. J. Por exemplo, epitopos lineares podem ser determinados, por exemplo, sintetizando concorrentemente grandes números de peptídeos sobre suportes sólidos, os peptídeos correspondendo à porções da molécula de proteína e reagindo os peptídeos com anticorpos enquanto os peptídeos ainda estão presos aos suportes. Tais técnicas são conhecidas no campo e descritas, por exemplo, na Pat. U.S. No. 4.708.871; Geysen et al. (1984) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 81: 3998-4002; Geysen et al. (1986) Molec. Immunol. 23: 709-715, todos incorporados aqui por referência na íntegra. Similarmente, epitopos confor- macionais podem ser identificados determinando-se a conformação espacial de aminoácidos tal como, por exemplo, por meio de cristalografia de raios x e ressonância magnética nuclear bidimensional. Vide, por exemplo, Epitope Mapping Protocols, supra. Além disso, para fins da presente invenção, um "antígeno" pode também ser usado para referir-se a uma proteína que inclui modificações, tais como deleções, adições e substituições (geralmente de natureza conservativa, mas podem ser não conservatives) na sequência na- tiva, contanto que a proteína mantenha a capacidade de estimular uma resposta imunológica. Essas modificações podem ser deliberadas, conforme por meio de mutagênese sítio-dirigida ou através de procedimentos sintéticos particulares ou uma abordagem de engenharia genética ou podem ser acidentais, tal como através de mutações de hospedeiros os quais produzem os antígenos. Além disso, o antígeno pode ser derivado, obtido ou isolado de um micróbio, por exemplo, uma bactéria ou pode ser um organismo inteiro. Similarmente, um oligonucleotídeo ou polinucleotídeo o qual expressa um antígeno, tal como em aplicações de imunização com ácido nucleico, tam-bém é incluído na definição. Antígenos sintéticos são também incluídos, por exemplo, poli-epitopos, epitopos de flanqueamento e outros antígenos re- combinantes ou sinteticamente derivados (Bergmann et al. (1993) Eur. J. Immunol. 23: 2777 2781; Bergmann et al. (1996) J. Immunol. 157: 3242 3249; Suhrbier, A. (1997) Immunol, and Cell Biol. 75: 402 408; Gardner et al. (1998) 12a World AIDS Conference, Geneva, Suíça, 28 de Junho - 3 de Julho, 1998).
Uma resposta imune "protetora" refere-se à capacidade de uma composição imunogênica de estimular uma resposta imune, quer humoral ou célula-mediada ou ambas, a qual serve para proteger o indivíduo contra uma infecção. A proteção proporcionada não precisa ser absoluta, isto é, uma infecção não precisa ser totalmente impedida ou erradicada, se há uma melhora estatisticamente significativa comparada com uma população de indivíduos de controle, por exemplo, animais infectados aos quais não foi administrada uma vacina ou composição imunogênica. Proteção pode estar limitada à alívio da gravidade ou rapidez de início de sintomas de uma infecção. Em geral, uma "resposta imune protetora" incluiria a indução de um aumento nos níveis de anticorpo específicos para um antígeno em particular em pelo menos 50% dos indivíduos, incluindo algum nível de respostas mensuráveis de anticorpos funcionais a cada antígeno. Em situações particulares, uma "resposta protetora imune" poderia incluir a indução de um aumento de duas vezes nos níveis de anticorpo ou um aumento de quatro vezes nos níveis de anticorpo específicos para um antígeno em particular em pelo menos 50% dos indivíduos, incluindo algum nível mensurável de respostas de anticorpo funcional a cada antígeno. Em determinadas modalidades, opsonização de anticorpos se correlaciona a uma resposta imune protetora. Assim, a resposta imune protetora pode ser avaliada medindo-se a diminuição percentual nas contagens bacterianas em um ensaio de opsonofagocitose, por exemplo, aqueles descritos abaixo. De preferência, há uma diminuição na contagem bacteriana de pelo menos 10%, 25%, 50%, 65%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% ou mais. A "quantidade imunogênica" de um conjugado em particular na componente é, em geral, dosada baseado no polissacarídeo total, conjugado ou não conjugado para esse conjugado. Por exemplo, um conjugado de polissacarídeo capsular de sorotipo 5 ou 8 com 20% de polissacarídeo livre terá cerca de 80 mcg de polissacarídeo conjugado e cerca de 20 mcg de polissacarídeo não conjugado em uma dose de 100 mcg. A contribuição da proteína para o conjugado usualmente não é considerada quando de cálculo da dose de um conjugado. A quantidade de conjugado pode variar, dependendo do sorotipo estafilocócico. Em geral, cada dose compreenderá 0,1 a 100 mcg de polissacarídeo, particularmente 0,1 a 10 mcg e, mais particularmente, 1 a 10 mcg.
O termo "indivíduo" refere-se a um mamífero, pássaro, peixe, réptil ou qualquer outro animal. O termo "indivíduo" também inclui seres humanos. O termo "indivíduo" inclui animais domésticos. Exemplos não limitativos de animais domésticos incluem: cães, gatos, porcos, coelhos, ratos, camundongos, gerbos, hâmsters, porcos-da-índia, furões, pássaros, cobras, lagartos, peixe, tartarugas e rãs. O termo "indivíduo" também inclui animais de criação. Exemplos não limitativos de animais de criação incluem: alpaca, bisão, camelo, gado, alce, porcos, cavalos, lhamas, mulas, burros, ovelha, cabras, coelhos, veados, búfalos, galinhas, gansos e perus.
Conforme mostrado na figura 1, polissacarídeos capsulares de S. aureus de sorotipos 5 e 8 têm as seguintes estruturas: sorotipo 5 [—>4)-β- D-ManNAcA-(1—>4) -3-O-Ac -α-L-FucNAc-(1—>3)-β-DFucNAc-(1 —>]n e sorotipo 8 [->3)-4-O-Ac-β-D-ManNAcA-(1->3)-α-L-FucNAc-(1->3)-β-DFucNAc- (1-»]n. Vide Jones (2005) Carbohydr. Res. 340: 1097-1106. O polissacarídeo capsular de sorotipo 8 tem unidades repetidas trissacarídicas similares ao polissacarídeo capsular de sorotipo 5; contudo, eles diferem quanto às ligações de açúcar e locais de O-acetilação, o que produz padrões sorologica- mente distintos de imuno-reatividade (Fournier et al. (1984) Infect. Immun. 45: 87-93; e Moreau et al. (1990) Carbohydr. Res. 201: 285-297). Polissaca- rídeos capsulares de sorotipos 8 e 5 são, portanto, carboidratos relativamente complexos que são solúveis em água, usualmente ácidos e anteriormente acreditava-se que tinham pesos moleculares de aproximadamente 25 kDa (Fattom (1990) Infect. Immun. 58, 2367-2374).
Em algumas modalidades, os polissacarídeos capsulares de sorotipo 5 e/ou 8 da invenção são O-acetilados. Em algumas modalidades, o grau de O-acetilação de polissacarídeo ou oligossacarídeo capsular do tipo 5 é 10-100%, 20-100%, 30-100%, 40-100%, 50-100%, 60-100%, 70-100%, 80- 100%, 90-100%, 50- 90%, 60-90%, 70-90% ou 80-90%. Em algumas modalidades, o grau de O-acetilação de polissacarídeo ou oligossacarídeo capsular do tipo 8 é 10-100%, 20-100%, 30-100%, 40-100%, 50-100%, 60-100%, 70-100%, 80-100%, 90-100%, 50-90%, 60-90%, 70-90% ou 80-90%. Em algumas modalidades, o grau de O-acetilação de polissacarídeos ou oligos- sacarídeos capsulares do tipo 5 e tipo 8 é 10-100%, 20-100%, 30-100%, 40- 100%, 50-100%, 60-100%, 70-100%, 80-100%, 90-100%, 50-90%, 60-90%, 70-90% ou 80-90%.
O grau de O-acetilação do polissacarídeo ou oligossacarídeo pode ser determinado por meio de qualquer método conhecido no campo, por exemplo, através de NRM de próton (Lemercinier e Jones 1996, Carbohydrate Research 296; 83-96, Jones e Lemercinier 2002, J Pharmaceutical and Biomedical Analysis 30; 1233-1247, documentos WO 05/033148 ou WO 00/56357). Outro método comumente usado é descrito por Hestrin (1949) J. Biol. Chem. 180; 249-261.
Em algumas modalidades, os polissacarídeos capsulares de sorotipo 5 e/ou 8 da invenção são usados para gerar anticorpos que são funcionais, conforme medido pela morte de bactérias em um modelo de eficácia com animais ou um ensaio de morte opsonofagocítica que demonstra que a morte de bactérias por anticorpos. Tal funcionalidade pode não ser observada usando um ensaio que monitora a geração de anticorpos isoladamente, o qual não é indicativo da importância de O-acetilação sobre a eficácia.
Polissacarídeos capsulares, tais como sorotipo 5 ou 8, podem ser obtidos diretamente das bactérias usando procedimentos de isolamento conhecidos por aqueles versados na técnica. Vide, por exemplo, Fournier et al. (1984), supra', Fournier et al. (1987) Ann. Inst. Pasteur/Microbiol. 138: 561-567; Publicação de Pedido de Patente US No. 2007/0141077; e Publicação de Pedido de Patente Internacional No. WO 00/56357; cada um dos quais é incorporado aqui por referência como se apresentado na íntegra. Além disso, eles podem ser produzidos usando protocolos sintéticos. Além disso, o polissacarídeo capsular de sorotipo 5 ou 8 pode ser recombinante- mente produzido usando procedimentos de engenharia genética também conhecidos por aqueles versados na técnica (vide Sau et al. (1997) Microbiology 143: 2395-2405; e Patente US No. 6.027.925; cada um dos quais é incorporado aqui por referência como se apresentado na íntegra).
Uma cepa de S. aureus que pode ser usada para obter o polissacarídeo capsular de sorotipo 8 isolado é S. aureus R2 PFESA0286. essa cepa foi selecionada por meio de citometria de fluxo com anticorpos antipo- lissacarídeo de sorotipo 8 de coelho após cultura de S. aureus PFESA0286 (American Type Culture Collection; Manassas, VA; No. de acesso ATCC 49525;) em Caldo de Frantz Modificado. Duas populações, R1 e R2, foram observadas durante citometria de fluxo. R1 e R2 foram purificadas e re- cultivadas. R2 proporcionou um polissacarídeo capsular de sorotipo 8. Análise citométrica de fluxo mostrou uma intensidade de fluorescência homogênea. Como tal, R2 foi selecionada para produção de polissacarídeo capsular de sorotipo 8.
Uma cepa de S. aureus que pode ser usada para obter um polissacarídeo capsular de sorotipo 5 isolado é S. aureus PFESA0266. Essa cepa produz o polissacarídeo capsular de sorotipo 5 durante crescimento e atinge um pico de produção quando as células estão em uma fase estacionária. Outras cepas de S. aureus do tipo 5 ou tipo 8 podem ser usadas para produzir os respectivos polissacarídeos que são obtidos a partir de coleções de cultura estabilizada ou espécimes clínicos.
Outro componente do conjugado imunogênico da invenção é uma molécula veículo ou proteína à qual o polissacarídeo capsular bacteria- no é conjugado. O termo "proteína veículo" ou "proteína carreadora" refere- se a qualquer molécula de proteína que pode ser conjugada a um antígeno (tais como polissacarídeos capsulares) contra o qual uma resposta imune é desejada. Conjugação a um veículo pode intensificar a imunogenicidade do antígeno. A conjugação pode ser realizada por meio de procedimentos padrões. Proteínas veículos preferidas para os antígenos são toxinas, toxóides ou qualquer material de reação cruzada mutante (Cross-Reactive Material - CRM) da toxina de tétano, difteria, pertussis, espécies Pseudomonas, E. coli, espécies Staphylococcus e espécies Streptococcus. Em uma modalidade, um veículo partícularmente preferido é o toxóide de difteria CRM197, derivada da cepa C7 de C. diphtheríae (β197), a qual produz a proteína CRM197. Essa cepa tem No. de acesso ATCC 53281. Um método para produção de CRM 197 é descrito na Patente US No. 5.614.382, a qual é incorporada aqui por referência conforme se apresentado na íntegra. Alternativamente, um fragmento ou epitopo da proteína veículo ou outra proteína imunogênica pode ser usado. Por exemplo, um antígeno haptênico pode ser acoplado a um epitopo de célula T de uma toxina bacteriana, toxóide ou CRM. Vide Pedido de Patente US No. 150.688, depositado em 1 de Fevereiro de 1988, intitulado "Synthetic Peptides Representing a T-Cell Epitope as a Carrier Molecule For Conjugate Vaccines"; incorporado aqui por referência como se apresentado na íntegra. Outras proteínas veículos adequadas incluem toxinas bacte- rianas inativadas, tais como toxóide do tétano, toxóide de pertussis, toxóide do cólera (por exemplo, conforme descrito no Pedido de Patente Internacional W02004/083251), LT de E. coli, ST de E. coli e exotoxina A de Pseudomonas aeruginosa. Proteínas da membrana externa bacteriana, tais como complexo de proteína c da membrana externa bacteriana (OMPC), porinas, proteínas de ligação à transferrina, pneumolisina, proteína A na superfície pneumocócica (PspA), proteína adesina pneumocócica (PsaA), enterotoxina de C. difficile (toxina A) e citotoxina (toxina B) ou proteína D de Haemophilus influenzae, podem também ser usadas. Outras proteínas, tais como ovalbu- mina, hemocianina do caramujo Megathura crenulata (Keyhole Limpet Hemocyanin - KLH), albumina de soro bovino (Bovine Serum Albumin - BSA) ou derivados purificados de proteína tuberculina (PPD) podem também ser usadas como proteínas veículos.
Consequentemente, em uma modalidade, a proteína veículo dentro do conjugado imunogênico da invenção é CRM197 e a CRMi97é cova- lentemente ligada ao polissacarídeo capsular via uma ligação de carbamato, uma ligação de amida ou ambas. Em algumas modalidades, a proteína veículo dentro do conjugado imunogênico da invenção é CRM197 e a CRM197é covalentemente ligada ao polissacarídeo capsular via uma ligação de tioéter. O número de resíduos de lisina em uma proteína veículo que se torna conjugada a um polissacarídeo capsular pode ser caracterizado como uma faixa de lisinas conjugadas. Por exemplo, em uma determinada composição imu- nogênica, a CRM197 pode compreender 5 a 15 lisinas de 39 covalentemente ligadas ao polissacarídeo capsular. Outra forma de expressar esse parâmetro é que 12% a 40% das lisinas de CRM197 são covalentemente ligadas ao polissacarídeo capsular. Por exemplo, em uma determinada composição imunogênica, a CRM197 pode compreender 18 a 22 lisinas de 39 covalentemente ligadas ao polissacarídeo capsular. Outra forma de expressar esse parâmetro é que 40% a 60% das lisinas da CRMI97 são covalentemente ligadas ao polissacarídeo capsular. Em algumas modalidades, a CRM197 compreende 5 a 15 lisinas de 39 covalentemente ligadas ao CP8. Outra forma de expressar esse parâmetro é que 12% a 40% das lisinas da CRM197 são covalentemente ligadas ao CP8. Em algumas modalidades, a CRM197 compreende 18 a 22 lisinas de 39 ligadas ao CP5. Outra forma de expressar esse parâmetro é que 40% a 60% das lisinas da CRM197 são covalentemente ligadas ao CP5.
Conforme discutido acima, o número de resíduos de lisina na proteína veículo conjugada ao polissacarídeo capsular pode ser caracterizado como uma faixa de lisinas conjugadas, a qual pode ser expressa como uma proporção molar. Por exemplo, a proporção molar de lisinas conjugadas ao CRM197 no conjugado imunogênico de CP8 pode estar entre cerca de 18:1 a cerca de 22:1. Em uma modalidade, a faixa de proporção molar de lisinas conjugadas ao CRM197 no conjugado imunogênico de CP8 pode estar entre cerca de 15:1 a cerca de 25:1. Em algumas modalidades, a faixa de proporção molar de lisinas conjugadas ao CRMI97 no conjugado imunogênico de CP8 pode estar entre cerca de 14:1 a cerca de 20:1; cerca de 12:1 a cerca de 18:1; cerca de 10:1 a cerca de 16:1; cerca de 8:1 a cerca de 14:1; cerca de 6:1 a cerca de 12:1; cerca de 4:1 a cerca de 10:1; cerca de 20:1 a cerca de 26:1; cerca de 22:1 a cerca de 28:1; cerca de 24:1 a cerca de 30:1; cerca de 26:1 a cerca de 32:1; cerca de 28:1 a cerca de 34:1; cerca de 30:1 a cerca de 36:1; cerca de 5:1 a cerca de 10:1; cerca de 5:1 a cerca de 20:1; cerca de 10:1 a cerca de 20:1; ou cerca de 10:1 a cerca de 30:1. Também, a proporção molar de lisinas conjugadas ao CRMI97 no conjugado imunogênico de CP5 pode estar entre cerca de 3:1 e 25:1. Em uma modalidade, a faixa de proporção molar de lisinas conjugadas ao CRMI97 no conjugado imunogênico de CP5 pode estar entre cerca de 5:1 a cerca de 20:1. Em uma modalidade, a faixa de proporção molar de lisinas conjugadas ao CRMI97 no conjugado imunogênico de CP5 pode estar entre cerca de 4:1 a cerca de 20:1; cerca de 6:1 a cerca de 20:1; cerca de 7:1 a cerca de 20:1; cerca de 8:1 a cerca de 20:1; cerca de 10:1 a cerca de 20:1; cerca de 11:1 a cerca de 20:1; cerca de 12:1 a cerca de 20:1; cerca de 13:1 a cerca de 20:1; cerca de 14:1 a cerca de 20:1; cerca de 15:1 a cerca de 20:1; cerca de 16:1 a cerca de 20:1; cerca de 17:1 a cerca de 20:1; cerca de 18:1 a cerca de 20:1; cerca de 5:1 a cerca de 18:1; cerca de 7:1 a cerca de 16:1; ou cerca de 9:1 a cerca de 14:1.
Outra forma de expressar o número de resíduos de lisina na proteína veículo conjugada ao polissacarídeo capsular pode ser como uma faixa de lisinas conjugadas. Por exemplo, em um determinado conjugado imunogênico de CP8, a CRMI97 pode compreender 5 a 15 lisinas de 39 covalentemente ligadas ao polissacarídeo capsular. Alternativamente, esse parâmetro pode ser expresso como um percentual. Por exemplo, em um determina- do conjugado imunogênico de CP8, o percentual de lisinas conjugadas pode estar entre 10% a 50%. Em algumas modalidades, 20% a 50% de lisinas podem ser covalentemente ligadas ao CP8. Ainda alternativamente, 30% a 50% de lisinas de CRMI97 podem ser covalentemente ligadas ao CP8; 10% a 40% de lisinas de CRMI97; 10% a 30% de lisinas de CRM197; 20% a 40% de lisinas de CRMi97; 25% a 40% de lisinas de CRMI97; 30% a 40% de lisinas de CRM197; 10% a 30% de lisinas de CRM197; 15% a 30% de lisinas de CRM197; 20% a 30% de lisinas de CRM197; 25% a 30% de lisinas de CRMI97; 10% a 15% de lisinas de CRMi97; ou 10% a 12% de lisinas de CRM197são covalentemente ligadas ao CP8. Também, em um determinado conjugado imunogênico de CP5, a CRM197 pode compreender 18 a 22 lisinas de 39 covalentemente ligadas ao polissacarídeo capsular. Alternativamente, esse parâmetro pode ser expresso como um percentual. Por exemplo, em um de-terminado conjugado imunogênico de CP5, o percentual de lisinas conjugadas pode estar entre 40% a 60%. Em algumas modalidades, 40% a 60% de lisinas podem ser covalentemente ligados ao CP5. Ainda alternativamente, 30% a 50% de lisinas de CRMI97 podem ser covalentemente ligados ao CP5; 20% a 40% de lisinas de CRM197; 10% a 30% de lisinas de CRM197; 50% a 70% de lisinas de CRMi97; 35% a 65% de lisinas de CRM197; 30% a 60% de lisinas de CRM197; 25% a 55% de lisinas de CRM197; 20% a 50% de lisinas de CRMI97; 15% a 45% de lisinas de CRMi97; 10% a 40% de lisinas de CRMI97; 40% a 70% de lisinas de CRM-|97; ou 45% a 75% de lisinas de CRMi97 são covalentemente ligados ao CP5.
A frequência de fixação da cadeia do polissacarídeo capsular a uma lisina sobre a molécula veículo é outro parâmetro para caracterização de conjugados de polissacarídeos capsulares. Por exemplo, em uma modalidade, pelo menos uma ligação covalente entre a CRMI97 e polissacarídeo ocorre a pelo menos cada 5 a 10 unidades de repetição sacaridica do polissacarídeo capsular. Em outra modalidade, há pelo menos uma ligação covalente entre a CRMI97 e o polissacarídeo capsular para cada 5 a 10 unidades sacarídicas repetidas; cada 2 a 7 unidades sacarídicas repetidas, cada 3 a 8 unidades sacarídicas repetidas; cada 4 a 9 unidades sacarídicas repetidas; cada 6 a 11 unidades sacarídicas repetidas; cada 7 a 12 unidades sacarídi- cas repetidas; cada 8 a 13 unidades sacarídicas repetidas; cada 9 a 14 unidades sacarídicas repetidas; cada 10 a 15 unidades sacarídicas repetidas; cada 2 a 6 unidades sacarídicas repetidas, cada 3 a 7 unidades sacarídicas repetidas; cada 4 a 8 unidades sacarídicas repetidas; cada 6 a 10 unidades sacarídicas repetidas; cada 7 a 11 unidades sacarídicas repetidas; cada 8 a 12 unidades sacarídicas repetidas; cada 9 a 13 unidades sacarídicas repetidas; cada 10 a 14 unidades sacarídicas repetidas; cada 10 a 20 unidades sacarídicas repetidas; cada 5 a 10 unidades sacarídicas repetidas do polissacarídeo capsular. Em outra modalidade, pelo menos uma ligação entre a CRM197 e o polissacarídeo capsular ocorre para cada 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10,11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ou 20 unidades sacarídicas repetidas do polissacarídeo capsular.
Uma modalidade da invenção proporciona uma composição i- munogênica compreendendo qualquer um dos conjugados imunogênicos compreendendo um polissacarídeo capsular de S. aureus de sorotipo 5 ou 8 conjugado a uma proteína veículo descrita acima.
O termo "composição imunogênica" refere-se a qualquer composição farmacêutica contendo um antígeno, por exemplo, um microorganismo ou um componente do mesmo, composição a qual pode ser usada para estimular uma resposta imune em um indivíduo. As composições imunogênicas da presente invenção podem ser usadas para tratar ou proteger um ser humano suscetível à infecção por S. aureus por meio de administração das composições imunogênicas através de uma via transdérmica sistêmica, dérmica ou mucosal ou ser usadas para gerar um preparado de anticorpo policlonal ou monoclonal que poderia ser usado para conferir imunidade passiva a outro indivíduo. Essas administrações podem incluir injeção através das vias intramuscular, intraperitoneal, intradérmica ou subcutânea; ou via administração mucosal aos tratos oral/alimentar, respiratório ou geni- tourinário. Em uma modalidade, administração intranasal é usada para o tratamento ou prevenção de transmissão nasofaringeal de S. aureus, assim, atenuando a infecção em seu estágio mais inicial. Composições imunogêni- cas podem também ser usadas para gerar anticorpos que são funcionais, conforme medido pela morte de bactérias em um modelo de eficácia com animais ou via um ensaio de morte opsonofagocítica.
Quantidades ótimas de componentes para uma composição i- munogênica particular podem ser determinadas por meio de estudos padrões envolvendo observação de respostas imunes apropriadas em indivíduos. Após uma vacinação inicial, os indivíduos podem receber uma ou várias imunizações de reforço adequadamente espaçadas.
As composições imunogênicas da presente invenção podem também incluir um ou mais dos seguintes antígenos: ClfA, ClfB, SdrC, SdrD, SdrE MntC/SitC/Proteína de Ligação Salivar, IsdB, IsdA, Opp3a, DltA, HtsA, LtaS, SdrH, SrtA, SpA, SBI, alfa-hemolisina (hla), beta-hemolisina, proteína A de ligação à fibronectina (fnbA), coagulase, map, leucocidina de Panton- Valentine (pvl), gama-toxina (hlg), ica, transportador ABC imunodominante, RAP, autolisina, receptores de laminina, IsaA/PisA, IsaB/PisB , SPOIIIE, SsaA, EbpS, SasF, SasH, EFB (FIB), FnbB, Npase, EBP, proteína II de sialo ligação óssea, precursor de aureolisina (AUR)/Sepp1, Cna, TSST-1, mecA, dPNAG, GehD, EbhA, EbhB, SSP-1, SSP-2 HBP, proteína de ligação à vi- tronectina, HarA, Enterotoxina A, Enterotoxina B, Enterotoxina C1 e nova autolisina.
Em uma modalidade, as composições imunogênicas da invenção ainda compreendem pelo menos um de um adjuvante, um tampão, um crioprotetor, um sal, um cátion divalente, um detergente não iônico, um inibidor de oxidação de radical livre, um diluente ou um veículo. Em uma modalidade, o adjuvante dentro da composição imunogênica da invenção é um adjuvante baseado em alumínio. Em uma modalidade, o adjuvante é um adjuvante baseado em alumínio selecionado do grupo consistindo em fosfato de alumínio, sulfato de alumínio e hidróxido de alumínio. Em uma modalidade, o adjuvante é fosfato de alumínio.
Um adjuvante é uma substância que intensifica a resposta imune quando administrado junto com um imunogênio ou antígeno. Foi mostrado que uma série de citocinas ou linfocinas tem atividade de modulação imune e, assim, são úteis como adjuvantes incluindo, mas não limitado a, interleu- cinas 1-a, 1-β, 2, 4, 5, 6, 7, 8, 10,12 (vide, por exemplo, Patente U.S. No. 5.723.127), 13, 14, 15, 16, 17 e 18 (e suas formas mutantes); os interferons- α, β e Y; fator de estimulação de colônia de granulócito-macrófago (GM-CSF) (vide, por exemplo, Patente U.S. No. 5.078.996 e Número de Acesso a ATCC 39900); fator de estimulação de colônia de macrófago (M-CSF); fator de estimulação de colônia de granulócito (G-CSF); e os fatores α e β de ne-crose de tumor. Ainda outros adjuvantes que são úteis com a composição imunogênica conforme descrito aqui incluem quimiocinas incluindo, sem limitação, MCP-1, MIP-1α, MIP-1β e RANTES; moléculas de adesão, tal como uma selectina, por exemplo, L-selectina, P-selectina e E-selectina; moléculas semelhantes à mucina, por exemplo, CD34, GlyCAM-1 e MadCAM-1; um membro da família integrina, tal como LFA-1, VLA-1, Mac-1 e p150,95; um membro da superfamília de imunoglobulina, tal como PECAM, ICAMs, por exemplo, ICAM-1, ICAM-2 e ICAM-3, CD2 e LFA-3; moléculas co- estimulatórias, tais como B7-1, B7-2.CD40 e CD40L; fatores de crescimento, incluindo fator de crescimento vascular, fator de crescimento de nervo, fator de crescimento de fibroblasto, fator de crescimento epidérmico, PDGF, BL-1 e fator de crescimento endotelial vascular; moléculas receptoras, incluindo Fas, receptor de TNF, Fit, Apo-1, p55, WSL-1, DR3, TRAMP, Apo-3, AIR, LARD, NGRF, DR4, DR5, KILLER, TRAIL-R2, TRICK2 e DR6; e Caspase, incluindo ICE.
Adjuvantes adequados usados para intensificar uma resposta imune ainda incluem, sem limitação, MPL™ (monofosforil lipídio A 3-O- deacilado, Corixa, Hamilton, MT), o qual é descrito na Patente U.S. No. 4.912.094. Também adequados para uso como adjuvantes são análogos de lipídio A sintéticos ou compostos de aminoalquil glucosamina fosfato (AGP) ou derivados ou análogos dos mesmos, os quais estão disponíveis da Corixa (Hamilton, MT) e os quais são descritos na Patente dos Estados Unidos No. 6.113.918. Um de tais AGP é 2-[(R)-3-Tetradecanoiloxitetradecanoilamino] etil 2-Deoxi-4-O-fosfono-3-O-[(R)-3-tetradecanoilóxitetradecanoil]-2-[(R)-3- tetradecanoilóxitetradecanoil-amino]-b-D-glucopiranosídeo, o qual é também conhecido como 529 (formalmente conhecido como RC529). Esse adjuvante 529 é formulado como uma forma aquosa (Aqueous Form - AF) ou como uma emulsão estável (Stable Emulsion - SE).
Ainda outros adjuvantes incluem peptídeos de muramila, tais como N-acetil-muramil-L-treonil-D-isoglutamina (thr-MDP), N-acetil- normuramil-L-alanina-2-(1'-2' dipalmitoil-sn-glicero-3-hidróxifosforilóxi)- etilamina (MTP-PE); emulsões óleo em água, tais como MF59 (Patente U.S. No. 6.299.884) (contendo 5% de Esqualeno, 0,5% de polissorbato 80 e 0,5% de Span 85 (opcionalmente contendo várias quantidades de MTP-PE) formuladas em partículas submicrônicas usando um microfluidizador, tal como o microfluidizador Modelo 110Y (Microfluidics, Newton, MA)) e SAF (contendo 10% de Esqualeno, 0,4% de polissorbato 80, 5% de polímero L121 Pluronic- bloqueado e thr-MDP, quer microfluidizada em uma emulsão submicrônica ou submetida a turbilhonamento para gerar uma emulsão com maior tamanho de partícula); adjuvante incompleto de Freund (IFA); sais de alumínio (alume), tais como hidróxido de alumínio, fosfato de alumínio, sulfato de a- lumínio; Amphigen; Avridine; L121/esqualeno; D-lactídeo- polilactídeo/glicosídeo; polióis Pluronic; Bordetella morta; saponinas, tais como Stimulon™ QS-21 Antigenics, Framingham, MA.), descritas na Patente U.S. No. 5.057.540, ISCOMATRIX (CSL Limited, Parkville, Austrália), descrita na Patente U.S. No. 5.254.339 e complexos de imunoestimulação (ISCOMATRIX); Mycobacterium tuberculosis-, lipopolissacarídeos bacterianos; poli- nucleotídeos sintéticos, tais como oligonucleotídeos contendo um motivo CpG (por exemplo, Patente U.S. No. 6.207.646); IC-31 (Intercell AG, Viena, Áustria), descrito nas Patentes Européias Nos. 1.296.713 e 1.326.634; uma toxina de pertussis (PT) ou mutante da mesma, uma toxina do cólera ou mutante da mesma (por exemplo, Patentes U.S. Nos. 7.285.281, 7.332.174, 7.361.355 e 7.384.640); ou uma toxina sensível ao calor (LT) de E. coli ou mutante da mesma, particularmente LT-K63, LT-R72 (por exemplo, Patentes U.S. Nos. 6.149.919, 7.115.730 e 7.291.588).
A composição imunogênica pode compreender, opcionalmente, um veículo farmaceuticamente aceitável. O termo "veículo farmaceuticamen- te aceitável" significa um veículo aprovado por uma agência regulatória de um governo Federal, estadual ou outra agência regulatória ou listado na Farmacopéia Norte Americana ou outra farmacopéia geralmente reconhecida para uso em animais, incluindo seres humanos, bem como mamíferos não humanos. O termo "veículo" refere-se a um diluente, adjuvante, excipi- ente ou veículo com o qual a composição farmacêutica é administrada. Á- gua, soluções salinas e soluções aquosas de dextrose e glicerol podem ser empregadas como veículos líquidos, particularmente para soluções injetáveis. Exemplos de veículos farmacêuticos adequados são descritos em "Remington's Pharmaceutical Sciences" por E. W. Martin. A formulação deverá se adequar ao modo de administração.
As composições imunogênicas da presente invenção podem a- inda compreender um ou mais "imunomoduladores" adicionais, os quais são agentes que alteram ou modificam o sistema imune, de modo que super- regulação ou sub-regulação de imunidade humoral e/ou célula-mediada seja observada. Em uma modalidade particular, super-regulação dos ramos humoral e/ou célula-mediada do sistema imune é preferida. Exemplos de determinados imunomoduladores incluem, por exemplo, um adjuvante ou cito- cina ou ISCOMATRIX (CSL Limited, Parkville, Austrália), descritos na Patente U.S. No. 5.254.339, dentre outros. Exemplos não limitativos de adjuvantes que pode ser usados em uma vacina da presente invenção incluem o sistema adjuvante RIBI (Ribi Inc., Hamilton, Mont), alume, géis minerais, tal como gel de hidróxido de alumínio, emulsões óleo-em-água, emulsões água- em-óleo tais como, por exemplo, adjuvantes completos e incompletos de Freund, copolímero em bloco (CytRx, Atlanta Ga.), QS-21 (Cambridge Biotech Inc., Cambridge Mass.), SAF-M (Chiron, Emeryville Calif.), adjuvante AMPHIGEN®, saponina, Quil A ou outra fração de saponina, monofosforil lipídio A e o adjuvante de lipidio-amina Avridine. Exemplos não limitativos de emulsões óleo-em-água úteis em uma vacina da invenção incluem formulações modificadas de SEAM62 e SEAM 1/2. SEAM62 modificado é uma e- mulsão óleo-em-água contendo 5% (v/v) de esqualeno (Sigma), 1% (v/v) de detergente SPAN® 85 (ICI Surfactants), 0,7% (v/v) de detergente polissorba- to ® 80 (ICI Surfactants), 2,5% (v/v) de etanol, 200 μg/ml de Quil A, 100 μ- g/ml de colesterol e 0,5% (v/v) de lecitina. SEAM 1/2 modificado é uma e- mulsão óleo-em-água compreendendo 5% (v/v) de esqualeno, 1% (v/v) de detergente SPAN® 85, 0,7% (v/v) de detergente polissorbato 80, 2,5% (v/v) de etanol, 100 μg/ml de Quil A e 50 μg/ml de colesterol. Outros "imunomodu- ladores" que podem ser incluídos em uma vacina incluem, por exemplo, uma ou mais interleucinas, interferons ou outras citocinas ou quimiocinas conhecidas. Em uma modalidade, o adjuvante pode ser um derivado de ciclodex- trina ou um polímero polianiônico, tais como aqueles descritos nas Patentes U.S. Nos. 6.165.995 e 6.610.310, respectivamente. Deve ser entendido que o imunomodulador e/ou adjuvante a serem usados dependerão do indivíduo ao qual a vacina ou composição imunogênica será administrada, a via de injeção e o número de injeções a serem fornecidas.
As composições imunogênicas da invenção podem ainda compreender um ou mais conservantes, além de uma pluralidade de antígenos de proteína estafilocócica e conjugados de polissacarídeo capsular-proteína. O FDA requer que produtos biológicos em frascos com múltiplas doses (múltiplas doses) contêm um conservante, com apenas umas poucas exceções. Produtos de vacina contendo conservantes incluem vacinas contendo cloreto de benzalcônio (antraz), 2-fenoxietanol (DTaP, HepA, Lyme, Polio (parenteral)), fenol (Pneumo, Tifoide (parenteral), Varíola) e timerosal (DTaP, DT, Td, HepB, Hib, Influenza, JE, Mening, Pneumo, Raiva). Conservantes aprovados para uso em fármacos injetáveis incluem, por exemplo, clorobutanol, m- cresol, metilparabeno, propilparabeno, 2-fenoxietanol, cloreto de benzetônio, ácido benzoico, álcool benzílico, fenol, timerosal e nitrato fenilmercúrico.
Formulações da invenção podem ainda compreender um ou mais de um tampão, um sal, um cátion divalente, um detergente não iônico, um crioprotetor, tal como açúcar e um antioxidante, tal como um removedor de radical livre ou agente de quelação ou qualquer múltipla combinação dos mesmos. A escolha de qualquer componente, por exemplo, um quelador, pode determinar se outro componente (por exemplo, um removedor) é desejável ou não. A composição final formulada para administração deverá ser estéril e/ou isenta de pirogênio. Aqueles versados na técnica podem determinar empiricamente quais combinações desses e outros componentes serão ótimas para inclusão nas composições imunogênicas contendo conservante da invenção, dependendo de uma variedade de fatores, tais como as condições de armazenamento e administração requeridas em particular.
Em determinadas modalidades, a formulação da invenção a qual é compatível com administração parenteral compreende um ou mais tampões fisiologicamente aceitáveis selecionados de, mas não limitado a, Tris (trimetamina), fosfato, acetato, borato, citrato, glicina, histidina e succinato. Em determinadas modalidades, a formulação é tamponada para dentro de uma faixa de pH de cerca de 6,0 a cerca de 9,0, de preferência de cerca de 6,4 a cerca de 7,4.
Em determinadas modalidades, pode ser desejável ajustar o pH da composição imunogênica ou formulação da invenção. O pH da formulação da invenção pode ser ajustado usando técnicas padrões no campo. O pH da formulação pode ser ajustado para estar entre 3,0 e 8,0. Em determinadas modalidades, o pH da formulação pode ser ou pode ser ajustado para estar entre 3.0 e 6.0,4.0 e 6.0 ou 5.0 e 8.0, Em outras modalidades, o pH da formulação pode ser ou pode ser ajustado para ser cerca de 3,0, cerca de 3,5, cerca de 4,0, cerca de 4,5, cerca de 5,0, cerca de 5,5, cerca de 5,8, cerca de 6,0, cerca de 6,5, cerca de 7,0, cerca de 7,5 ou cerca de 8,0. Em determinadas modalidades, o pH pode ser ou pode ser ajustado para estar em uma faixa de 4,5 a 7,5 ou de 4,5 a 6,5, de 5,0 a 5,4, de 5,4 a 5,5, de 5,5 a 5,6, de 5,6 a 5,7, de 5,7 a 5,8, de 5,8 a 5,9, de 5,9 a 6,0, de 6,0 a 6,1, de 6,1 a 6,2, de 6,2 a 6,3, de 6,3 a 6,5, de 6,5 a 7,0, de 7,0 a 7,5 ou de 7,5 a 8,0. Em uma modalidade específica, o pH da formulação é cerca de 5,8.
Em determinadas modalidades, a formulação da invenção a qual é compatível com administração parenteral compreende um ou mais cátions divalentes incluindo, mas não limitado a, MgCI2, CaCI2 e MnCI2, em uma concentração oscilando de cerca de 0,1 mM a cerca de 10 mM, com até cerca de 5 mM sendo preferido.
Em determinadas modalidades, a formulação da invenção a qual é compatível com administração parenteral compreende um ou mais sais incluindo, mas não limitado a, cloreto de sódio, cloreto de potássio, sulfato de sódio e sulfato de potássio, presentes em uma resistência iônica a qual é fisiologicamente aceitável para o indivíduo quando de administração parenteral e incluído em uma concentração final para produzir a resistência iônica ou osmolaridade selecionada na formulação final. A resistência iônica ou osmolalidade final da formulação será determinada por múltiplos componentes (por exemplo, íons de composto(s) de tamponamento e outros sais de não tamponamento). Um sal preferido, NaCI, está presente de uma faixa de até cerca de 250 mM, com as concentrações de sal sendo selecionadas para complementar outros componentes (por exemplo, açúcares), de modo que a osmolaridade final da formulação seja compatível com administração parenteral (por exemplo, injeção intramuscular ou subcutânea) e promoverá a estabilidade a longo prazo dos componentes imunogênicos da formulação de composição imunogênica sobre várias faixas de temperatura. Formula-ções sem sal tolerarão faixas aumentadas de um ou mais dos crioprotetores selecionados para manter os níveis finais desejados de osmolaridade.
Em determinadas modalidades, a formulação da invenção a qual é compatível com administração parenteral compreende um ou mais crioprotetores selecionados de, mas não limitado a, dissacarídeos (por exemplo, lactose, maltose, sacarose ou trealose) e poli-hidróxi hidrocarbonetos (por exemplo, dulcitol, glicerol, manitol e sorbitol).
Em determinadas modalidades, a osmolaridade da formulação está em uma faixa de cerca de 200 mOs/L a cerca de 800 mOs/L, com uma faixa preferida de cerca de 250 mOs/L a cerca de 500 mOs/L ou cerca de 300 mOs/L - cerca de 400 mOs/L. Uma formulação sem sal pode conter, por exemplo, de cerca de 5% a cerca de 25% de sacarose e, de preferência, de cerca de 7% a cerca de 15% ou cerca de 10% a cerca de 12% de sacarose. Alternativamente, uma formulação sem sal pode conter, por exemplo, de cerca de 3% a cerca de 12% de sorbitol e, de preferência, de cerca de 4% a 7% ou cerca de 5% a cerca de 6% de sorbitol. Se um sal, tal como cloreto de sódio, é adicionado, então, a faixa eficaz de sacarose ou sorbitol é relativa- mente diminuída. Essas e outras considerações sobre osmolalidade e osmo- laridade estão dentro da capacidade daqueles versados na técnica.
Em determinadas modalidades, a formulação da invenção a qual é compatível com administração parenteral compreende um ou mais inibidores de oxidação de radical livre e/ou agentes de quelação. Uma variedade de removedores e queladores de radical livre é conhecida na técnica e se aplicam às formulações e métodos de uso descritos aqui. Exemplos incluem, mas não estão limitados a, etanol, EDTA, uma combinação de EDTA/etanol, trietanolamina, manitol, histidina, glicerol, citrato de sódio, hexafosfato de inositol, tripolifosfato, ácido ascórbico/ascorbato, ácido succínico/succinato, ácido málico/maleato, desferal, EDDHA e DTPA e várias combinações de dois ou mais dos acima. Em determinadas modalidades, pelo menos um re- movedor de radical livre de não redução pode ser adicionado em uma concentração que intensifica eficazmente a estabilidade da formulação a longo prazo. Um ou mais inibidores de oxidação de radical livre/queladores podem também ser adicionados em várias combinações, tais como um removedor e um cátion divalente. A escolha do quelador determinará se a adição de um removedor é ou não necessária.
Em determinadas modalidades, a formulação da invenção a qual é compatível com administração parenteral compreende um ou mais tensoa- tivos não iônicos incluindo, mas não limitado a, polioxietileno sorbitan ésteres de ácido graxo, Polissorbato-80 (Tween 80), Polissorbato-60 (Tween 60), Polissorbato-40 (Tween 40) e Polissorbato-20 (Tween 20), polioxietileno al- quil éteres incluindo, mas não limitado a, Brij 58, Brij 35, bem como outros, tais como Triton X-100; Triton X-114, NP40, Span 85 e a série Pluronic de tensoativos não iônicos (por exemplo, Pluronic 121), com o componente preferido sendo Polissorbato-80 em uma concentração de cerca de 0,001% a cerca de 2% (com até cerca de 0,25% sendo preferido) ou Polissorbato-40 em uma concentração de cerca de 0,001% a 1% (com até cerca de 0,5% sendo preferido).
Em determinadas modalidades, uma formulação da invenção compreende um ou mais agentes de estabilização adicionais adequados para administração parenteral, por exemplo, um agente de redução compreendendo pelo menos um grupo tiol (-SH) (por exemplo, cisteína, N-acetil cis- teína, glutationa reduzida, tioglicolato de sódio, tiossulfato, monotioglicerol ou misturas dos mesmos). Alternativa ou opcionalmente, as formulações de composição imunogênica contendo conservante da invenção podem ainda ser estabilizadas mediante remoção de oxigênio dos recipientes de armazenamento, protegendo a formulação contra a luz (por exemplo, usando recipientes de vidro âmbar).
Formulações de composição imunogênica contendo conservante da invenção podem compreender um ou mais veículos ou excipientes far- maceuticamente aceitáveis, os quais incluem qualquer excipiente que, em si, não induz a uma resposta imune. Excipientes adequados incluem, mas não estão limitados a, macromoléculas, tais como proteínas, sacarídeos, ácidos polilácticos, ácidos poliglicólicos, aminoácidos poliméricos, copolímeros de aminoácido, sacarose (Paoletti et al, 2001, Vaccine, 19: 2118), trealose, lactose e agregados lipídicos (tais como gotículas de óleo ou lipossomas). Tais veículos são bem conhecidos por aqueles versados na técnica. Excipientes farmaceuticamente aceitáveis são discutidos, por exemplo, em Gennaro, 2000, Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20a edição, ISBN:0683306472.
As composições da invenção podem ser liofilizadas ou estar na forma aquosa, isto é, soluções ou suspensões. Formulações líquidas podem, vantajosamente, ser administradas diretamente de sua forma embalada e, assim, são ideais para injeção sem a necessidade de reconstituição em um meio aquoso, conforme de outro modo requerido para composições liofilizadas da invenção.
Distribuição direta de composições imunogênicas da presente invenção a um indivíduo pode ser realizada através de administração parenteral (intramuscular, intraperitoneal, intradérmica, subcutânea, intravenosamente ou ao espaço intersticial de um tecido); ou através de administração retal, oral, vaginal, tópica, transdérmica, intranasal, ocular, aural, pulmonar ou outra mucosal. Em uma modalidade preferida, administração parenteral é
através de injeção intramuscular, por exemplo, à coxa ou parte superior do braço do indivíduo. Injeção pode ser via uma agulha (por exemplo, uma agulha hipodérmica), mas injeção sem agulha pode, alternativamente, ser usada. Uma dose intramuscular típica é 0,5 ml_. As composições da invenção podem ser preparadas em várias formas, por exemplo, para injeção, quer como soluções ou suspensões líquidas. Em determinadas modalidades, a composição pode ser preparada como um pó ou pulverização para administração pulmonar, por exemplo, em um inalador. Em outras modalidades, a composição pode ser preparada como um supositório ou pessário para administração nasal, aural ou ocular, por exemplo, como um spray, gotas, gel ou pó.
A quantidade de conjugado em cada dose de composição imunogênica é selecionada como uma quantidade que induz a uma resposta imunoprotetora sem efeitos adversos significativos. Tal quantidade pode variar, dependendo do sorotipo estafilocócico. Em geral, cada dose compreenderá 0,1 a 100 μg de polissacarídeo, particularmente 0,1 a 10 μg e, mais particularmente, 1 a 5 μg.
Quantidades ótimas de componentes para uma composição i- munogênica particular podem ser determinadas por meio de estudos padrões envolvendo observação de respostas imunes apropriadas em indivíduos. Após uma vacinação inicial, os indivíduos podem receber uma ou várias imunizações de reforço adequadamente espaçadas.
Embalagem e Formas de Dosagem
Composições imunogênicas da invenção podem ser embaladas na forma de dose unitária ou múltiplas doses (por exemplo, 2 doses, 4 doses ou mais). Para formas com múltiplas doses, frascos são, tipicamente, mas não necessariamente, preferidos com relação às seringas pré-enchidas. Formatos com múltiplas doses adequados incluem, mas não estão limitados a: 2 a 10 doses por recipiente a 0,1 a 2 ml_ por dose. Em determinadas modalidades, a dose é uma dose de 0,5 mL. Vide, por exemplo, Pedido de Patente Internacional W02007/127668, o qual é incorporado aqui por referência.
As composições podem ser apresentadas em frascos ou outros recipientes de armazenamento adequados ou podem ser apresentadas em dispositivos de distribuição pré-enchidos, por exemplo, seringas com um ú- nico ou múltiplos componentes, as quais podem ser fornecidas com ou sem agulhas. Uma seringa pode, tipicamente, mas não necessariamente, conter uma única dose da composição imunogênica contendo conservante da invenção, embora seringas pré-enchidas com múltiplas doses também sejam consideradas. Da mesma forma, um frasco pode incluir uma única dose mas pode, alternativamente, incluir múltiplas doses.
Volumes de dosagem eficazes podem ser rotineiramente estabelecidos, mas uma dose típica da composição para injeção tem um volume de 0,5 ml_. Em determinadas modalidades, a dose é formulada para administração a um ser humano. Em determinadas modalidades, a dose é formada para administração a um adulto, adolescente, criança ou bebê (isto é, não mais de um ano de idade) e pode, em modalidades preferidas, ser administrada através de injeção.
Composições imunogênicas líquidas da invenção são também adequadas para reconstituição com outras composições imunogênicas as quais são apresentadas na forma liofilizada. Onde uma composição imunogênica tem de ser usada para tal reconstituição extemporânea, a invenção proporciona um kit com dois ou mais frascos, duas ou mais seringas prontas enchidas ou um ou mais de cada, com os conteúdos da seringa sendo usados para reconstituir os conteúdos do frasco antes de injeção ou vice-versa.
Alternativamente, composições imunogênicas da presente invenção podem ser liofilizadas e reconstituídas, por exemplo, usando um de uma variedade de métodos para secagem por congelamento bem conhecidos no campo para formar partículas secas de formato regular (por exemplo, esféricas), tais como micropelotas ou microesferas, tendo características de partícula, tal como tamanhos de diâmetro médio, que podem ser selecionadas e controladas variando os métodos exatos usados para preparar as mesmas. As composições imunogênicas podem ainda compreende um adjuvante, o qual pode ser opcionalmente preparado com ou contendo partícu- las secas de formato regular (por exemplo, esféricas) distintas, tais como micropelotas ou microesferas. Em tais modalidades, a presente invenção ainda proporciona um kit de composição imunogênica compreendendo um primeiro componente que inclui uma composição imunogênica seca estabilizada, opcionalmente ainda compreendendo um ou mais conservantes da invenção e um segundo componente compreendendo uma solução aquosa estéril para reconstituição do primeiro componente. Em determinadas moda-lidades, a solução aquosa compreende um ou mais conservantes e pode, opcionalmente, compreender pelo menos um adjuvante (vide, por exemplo, documento W02009/109550 (incorporado aqui por referência)).
Em ainda outra modalidade, um recipiente de múltiplos formatos de dose é selecionado de um ou mais do grupo consistindo em, mas não limitado a, utensílio de vidro geral para laboratório, frascos, béqueres, cilindros graduados, fermentadores, biorreatores, tubulações, tubos, sacos, jarros, frascos, vedações de frascos (por exemplo, uma rolha de borracha, uma tampa de rosca), ampolas, seringas, seringas com câmara dupla ou múltiplas câmaras, rolhas para seringa, êmbolos de seringa, vedações de borracha, vedações plásticas, vedações de vidro, cartuchos e canetas descartáveis e semelhantes. O recipiente da presente invenção não está limitado pelo material de fabricação e inclui materiais tais como vidro, metais (por e- xemplo, aço, aço inoxidável, alumínio, etc.) e polímeros (por exemplo, termoplásticos, elastômeros, elastômeros termoplásticos). Em uma modalidade particular, o recipiente do formato é um frasco de vidro Schott do Tipo 1 de 5 ml_ com uma rolha de butila. Aqueles versados na técnica apreciarão que o formato apresentado acima não se destina a ser uma lista exaustiva, mas serve meramente como uma orientação para o técnico com relação à variedade de formatos disponíveis para a presente invenção. Formatos adicionais considerados para uso na presente invenção podem ser encontrados em catálogos publicados de vendedores e fabricantes de equipamento para laboratório, tal como United States Plastic Corp. (Lima, OH), VWR.
Métodos para Produção de Conjugados Imunogênicos
A presente invenção também inclui métodos de produção dos conjugados imunogênicos descritos aqui. Métodos para produção dos conjugados imunogênicos da invenção envolvem conjugação covalente dos polis- sacarídeos capsulares com as proteínas veículos usando química de conjugação envolvendo CDI (1,1-carbonildi-imidazol), CDT (1,1-carbonil-di-1,2,4- triazol) ou PDPH (3-(2-piridilditio)-propionil hidrazida).
Consequentemente, uma modalidade da invenção proporciona um método baseado em CDT de produção de um conjugado imunogênico compreendendo um polissacarídeo capsular de S. aureus de sorotipo 5 ou 8 conjugado a uma proteína veículo, o método compreendendo as etapas de: a) composição de um polissacarídeo capsular de S. aureus de sorotipo 5 ou 8 com imidazol ou triazol para produzir um polissacarídeo composto; b) rea-ção do polissacarídeo composto com CDT em um solvente orgânico e cerca de 0,1% a cerca de 0,3% peso/v de água para produzir um polissacarídeo capsular de sorotipo 5 ou 8 ativado; c) purificação do polissacarídeo capsular de sorotipo 5 ou 8 ativado para produzir a polissacarídeo capsular de sorotipo 5 ou 8 ativado purificado; d) reação do polissacarídeo capsular de sorotipo 5 ou 8 ativado purificado com uma proteína veículo no solvente orgânico para produzir um conjugado de polissacarídeo capsular de sorotipo 5 ou 8:proteína veículo; e e) hidrólise do conjugado de polissacarídeo capsular de sorotipo 5 ou 8:proteína veículo para remover grupos de ativação não reagidos; pelo que um conjugado imunogênico compreendendo um polissacarídeo capsular de S. aureus de sorotipo 5 ou 8 conjugado a uma proteína veículo é produzido. Em uma modalidade, antes da etapa (d), o polissacarídeo capsular de sorotipo 5 ou 8 ativado purificado é composto com uma proteína veículo.
Em uma modalidade da invenção, outro método baseado em CDT de produção de um conjugado imunogênico é proporcionado compre-endendo um polissacarídeo capsular de S. aureus de sorotipo 5 ou 8 conju-gado a uma proteína veículo, o método compreendendo as etapas de: a) composição de um polissacarídeo capsular de S. aureus de sorotipo 5 ou 8 com imidazol ou triazol para produzir um polissacarídeo composto; b) reação do polissacarídeo composto com CDT em um solvente orgânico e cerca de 0,1% a cerca de 0,3% peso/v de água para produzir um polissacarídeo capsular de sorotipo 5 ou 8 ativado; c) reação do polissacarídeo capsular de sorotipo 5 ou 8 ativado com uma proteína veículo no solvente orgânico para produzir um conjugado de polissacarídeo capsular de sorotipo 5 ou 8:proteína veículo; e d) hidrólise do conjugado de polissacarídeo capsular de sorotipo 5 ou 8:proteína veículo para remover grupos de ativação não reagidos; pelo que um conjugado imunogênico compreendendo um polissacarídeo capsular de S. aureus de sorotipo 5 ou 8 conjugado a uma proteína veículo é produzido.
Em uma modalidade, o solvente orgânico dentro dos métodos baseados em CDT de produção de um conjugado imunogênico é um solvente polar aprótico. Em uma modalidade, o solvente orgânico é um solvente polar aprótico selecionado do grupo consistindo em sulfóxido de dimetila (DMSO), dimetilformamida (DMF), dimetilacetamida, A/-metil-2-pirrolidona e hexametilfosforamida (HMPA). Em uma modalidade, o solvente orgânico é DMSO.
Em uma modalidade, a etapa de reação do polissacarídeo composto com CDT dentro dos métodos baseados em CDT de produção de um conjugado imunogênico compreende fornecimento de um excesso molar de cerca de 20 vezes de CDT comparado com o polissacarídeo.
Em uma modalidade, a etapa de purificação do polissacarídeo capsular de sorotipo 5 ou 8 ativado dentro dos métodos baseados em CDT de produção de um conjugado imunogênico compreende diafiltração.
Em uma modalidade, a proteína veículo dentro dos métodos baseados em CDT de produção de um conjugado imunogênico é CRM197. Em uma modalidade, o polissacarídeo capsular de sorotipo 5 ou 8 ativado dentro dos métodos de produção de um conjugado imunogênico é reagido com a CRM197 em uma proporção em peso de cerca de 1:1.
Em uma modalidade, a etapa de hidrólise do conjugado de polissacarídeo de sorotipo 5 ou 8:proteína veículo para remover grupos de ativação não reagidos dentro dos métodos baseados em CDT de produção de um conjugado imunogênico compreende diluição em um tampão e manuten- ção de um pH de cerca de 8,8 a cerca de 9,2 durante pelo menos 4 horas em cerca de 20°C a cerca de 26°C. Em uma modalidade, a etapa de hidrólise do conjugado de polissacarídeo capsular de sorotipo 5 ou 8:proteína veículo compreende diluição em um tampão e manutenção de um pH de cerca de 9,0 durante pelo menos 4 horas em cerca de 23°C.
Em uma modalidade, o conjugado de polissacarídeo capsular de sorotipo 5 ou 8:proteína veículo produzido de acordo com os métodos baseados em CDT de produção de um conjugado imunogênico é purificado. Em uma modalidade, purificação do conjugado de polissacarídeo capsular de sorotipo 5 ou 8:proteína veículo compreende diafiltração.
Em uma modalidade, antes de reação do polissacarídeo composto com CDT dentro dos métodos baseados em CDT de produção de um conjugado imunogênico, o polissacarídeo de sorotipo 5 ou 8 composto é liofi- lizado ou ressuspenso. Em uma modalidade, o polissacarídeo composto e a proteína veículo são separadamente liofilizados e ressuspensos antes de reação do polissacarídeo composto com CDT. Em uma modalidade, o polissacarídeo composto liofilizado e/ou a proteína veículo liofilizada são ressuspensos em um solvente orgânico. Em uma modalidade, o solvente orgânico é DMSO.
Em uma modalidade, antes de reação do polissacarídeo capsular de sorotipo 5 ou 8 ativado composto com uma proteína veículo dentro do método baseado em CDT de produção de um conjugado imunogênico, o polissacarídeo capsular de sorotipo 5 ou 8 ativado purificado e a proteína veículo são separadamente liofilizados e ressuspensos. Em uma modalidade, a proteína veículo é CRM197 e, antes de liofilização, a CRM197 é diafiltra- da contra NaCI. Em uma modalidade, antes de liofilização, a CRMI97 é diafil- trada contra NaCI e a proporção peso/peso de NaCI/CRM é ajustada para cerca de 0,5 a cerca de 1,5.
Uma modalidade da presente invenção proporciona um método baseado em PDPH de produção de um conjugado imunogênico compreendendo um polissacarídeo capsular de S. aureus de sorotipo 5 ou 8 conjugado a uma proteína veículo, o método compreendendo as etapas de: a) rea- ção de um polissacarídeo capsular de S. aureus de sorotipo 5 ou 8 com PDPH e uma carbodi-imida em um solvente orgânico para produzir um polissacarídeo PDPH-ligado; b) reação do polissacarídeo PDPH-ligado com um a- gente de redução para produzir um polissacarídeo ativado; c) purificação do polissacarídeo capsular de sorotipo 5 ou 8 ativado para produzir a polissacarídeo capsular de sorotipo 5 ou 8 ativado purificado; d) reação de uma proteína veículo com um ácido bromoacético em um solvente orgânico para produzir uma proteína veículo ativada; e) purificação da proteína veículo ativada para produzir uma proteína veículo ativada purificada; f) reação do polissacarídeo capsular de sorotipo 5 ou 8 ativado purificado com a proteína veículo ativada purificada para produzir um conjugado de polissacarídeo capsular de sorotipo 5 ou 8:proteína veículo; e g) hidrólise do conjugado de polissacarídeo capsular de sorotipo 5 ou 8:proteína veículo para remover grupos de ativação não reagidos; pelo que um conjugado imunogênico compreendendo um polissacarídeo capsular de S. aureus de sorotipo 5 ou 8 conjugado a uma proteína veículo é produzido.
Em uma modalidade, o ácido bromoacético usado dentro dos métodos de produção de um conjugado imunogênico baseados em PDPH é um /V-hidróxi-succinimide éster de ácido bromoacético (BAANS). Em uma modalidade, a proteína veículo usada dentro dos métodos baseados em PDPH da invenção é CRM197 e o BAANS é adicionado em uma proporção em peso de CRM197:BAANS de cerca de 1:0,1 a cerca de 1:0,5.
Em uma modalidade, o solvente orgânico dentro dos métodos de produção de um conjugado imunogênico baseados em PDPH é um solvente polar aprótico. Em uma modalidade, o solvente orgânico é um solvente polar aprótico selecionado do grupo consistindo em DMSO, DMF, dimetilacetami- da, A/-metil-2-pirrolidona e HMPA. Em uma modalidade, o solvente orgânico é DMSO.
Em uma modalidade, a carbodi-imida usada dentro dos métodos de produção de um conjugado imunogênico baseados em PDPH é 1 -Etil-3- (3-dimetilaminopropil)-carbodi-imida (EDAC). Em uma modalidade, a etapa de reação de polissacarídeo capsular de sorotipo 5 ou 8 com PDPH e EDAC em um solvente orgânico compreende manutenção de uma proporção em peso de polissacarídeo:PDPH:EDAC de cerca de 1:5:3.
Em uma modalidade, o agente de redução usado dentro dos métodos de produção de um conjugado imunogênico baseados em PDPH é ditiotreitol (DTT).
Em uma modalidade, as etapas de purificação do polissacarídeo capsular de sorotipos 5 e 8 e purificação da proteína veículo dentro dos métodos de produção de um conjugado imunogênico baseados em PDPH compreendem, cada uma, diafiltração.
Em uma modalidade, a proteína veículo dentro dos métodos de produção de um conjugado imunogênico baseados em PDPH é CRMI97. Em uma modalidade, o polissacarídeo de sorotipo 5 ou 8 ativado dentro dos métodos de produção de um conjugado imunogênico é reagido com a CRMI97 em uma proporção em peso de cerca de 1:1.
Em uma modalidade, a etapa de hidrólise do conjugado de polissacarídeo de sorotipo 5 ou 8:proteína veículo para remover grupos de ativação não reagidos dentro dos métodos de produção de um conjugado imunogênico baseados em PDPH compreende a adição de cloridrato de cistea- mina.
Em uma modalidade, o conjugado de polissacarídeo capsular de sorotipo 5 ou 8:proteína veículo produzido de acordo com os métodos de produção de um conjugado imunogênico baseados em PDPH é purificado. Em uma modalidade, purificação do conjugado de polissacarídeo capsular de sorotipo 5 ou 8:proteína veículo compreende diafiltração.
Em uma modalidade, antes de reação do polissacarídeo capsular de sorotipo 5 ou 8 ativado purificado com a proteína veículo ativada purificada dentro dos métodos de produção de um conjugado imunogênico baseados em PDPH, o polissacarídeo ativado purificado e a proteína veículo ativada purificada são separadamente liofilizadas e re-suspensos. Em uma modalidade, o polissacarídeo ativado liofilizado e/ou a proteína veículo ativada liofilizada são ressuspensos em um solvente orgânico. Em uma moda-lidade, o solvente orgânico é DMSO.
Conforme usado aqui, "liofilização" significa um processo de desidratação no qual o polissacarídeo capsular bacteriano é congelado enquanto que a pressão circundante é reduzida na presença de calor o bastante para permitir que a água congelada sublime diretamente de uma fase sólida em uma fase gasosa. Qualquer método conhecido na técnica para liofilização de polissacarídeos pode ser usado. Vide, por exemplo, Harris & Angal (1989) "Protein Purificação Métodos" em: Kennedy & Cabral, eds. "Recovery Processes for Biological Materials" (John Wiley & Sons; 1993); Patente US No. 4.134.214; e Publicação de Pedido de Patente Internacional No. WO 2003/086471; cada um dos quais é aqui incorporado por referência como se apresentado em sua totalidade. Opcionalmente, um crioprotetor pode ser incluído durante liofilização tal como, por exemplo, sacarose, glicose, lactose, trealose, arabinose, xilose, galactose, sorbitol ou manitol.
Conforme usado aqui, "ativar" e "ativação" significam que um polissacarídeo capsular bacteriano ou proteína veículo é modificada de forma tal que ela é tornada passível de conjugação (isto é, pelo menos uma porção deve ser tornada capaz de ligação covalente à molécula veículo). Por exemplo, com relação aos métodos de conjugação baseados em CDT da presente invenção, o polissacarídeo é ativado em um ambiente de baixa umidade (por exemplo, em DMSO) para formar porções de carbamato de triazol com porções hidroxilas e aciltriazol disponíveis com ácidos carboxílicos. Polissacarídeos ativados podem, então, ser reagidos com a proteína CRMi97, o que leva a deslocamento nucleofílico da triazol pelos resíduos de lisina dentro da CRM197 e formação de uma ligação de carbamato (para hidroxilas ativadas) e ligação de amida (para ácidos carboxílicos ativados). Em contraste, com relação aos métodos de conjugação baseados em PDPH da presente invenção, as proteínas veículos e os polissacarídeos são ativados antes de conjugação: 1) ativação de CRM197 envolve introdução de grupos bromoacetila na proteína CRM197 mediante reação de grupos amina com o N-hidróxi- succimida éster de ácido bromoacético; e 2) ativação de polissacarídeo envolve acoplamento dos grupos carboxilato carbodi-imida-ativados de ácido N-acetilmanosaminourônico no polissacarídeo ao grupo hidrazida do ligante heterobifuncional PDPH sulfidrila-reativo, seguido por redução com DTT. Polissacarídeos ativados podem, então, ser reagidos com uma proteína veículo, de modo que tióis dos polissacarídeos PDPH-tiolados reajam com grupos bromoacetila da proteína veículo ativada, resultando em uma ligação de tioéter covalente formada por deslocamento de brometo.
De acordo com os métodos da invenção, os polissacarídeos capsulares, proteínas veículos e/ou conjugados de polissacarídeo- particularmente podem ser purificados. Qualquer método conhecido na técnica para purificação de polissacarídeos ou proteínas pode ser usado, tal como concentração/diafiltração, precipitação/eluição, cromatografia em coluna e filtração profunda. Vide, por exemplo, Farrés et al. (1996) Biotechnol. Tech. 10: 375-380; Gonçalves et al. em: Communicating Current Research e Educational Topics e Trends in Applied Microbiology (Antonio Mendez Vilas, ed. 1a ed. Badajoz, Espanha: Formatex; 2007. páginas 450-457); Tanizaki et al. (1996) J. Microbiol. Métodos 27: 19-23; e Patente US No. 6.146.902; e Publicação de Pedido de Patente US No. 2008/0286838; cada um dos quais é incorporado aqui por referência como se apresentado na íntegra.
Como usado aqui, o termo "isolado" ou "purificado" significa que o material é removido de seu ambiente original (por exemplo, o ambiente natural se ele ocorre naturalmente ou de seu organismo hospedeiro se ele é uma entidade recombinante ou tomado de um ambiente para um ambiente diferente). Por exemplo, um polissacarídeo capsular, proteína ou peptídeo "isolado" é substancialmente isento de material celular ou outras proteínas contaminantes da fonte celular ou tecidual da qual a proteína é derivada ou substancialmente isento de precursores químicos ou outros produtos químicos quando sintetizado quimicamente ou de outro modo presente na mistura como parte de uma reação química. Na presente invenção, as proteínas ou polissacarídeos podem ser isolados da célula bacteriana ou de resíduos celulares, de modo que eles são proporcionados em uma forma útil na fabricação de uma composição imunogênica. O termo "isolado" ou "isolamento" podem incluir purificação ou purificar incluindo, por exemplo, os métodos de purificação de proteínas ou polissacarídeos capsulares conforme descrito aqui. A expressão "substancialmente isento de material celular" inclui preparados de um polipeptídeo/proteína nos quais o polipeptídeo/proteína são separados de componentes celulares das células das quais eles são isolados ou recombinantemente produzidos. Assim, um polissacarídeo capsular, proteína ou peptídeo que é substancialmente isento de material celular inclui preparados do polissacarídeo capsular, proteína ou peptídeo tendo menos de cerca de 30%, 20%, 10%, 5%, 2,5% ou 1% (em peso seco) de proteína ou polissacarídeo ou outro material celular contaminante. Quando o polipeptídeo/proteína são recombinantemente produzidos, eles também são, de preferência, substancialmente isentos de meio de cultura, isto é, o meio de cultura representa menos de cerca de 20%, 10% ou 5% do volume do preparado de proteína. Quando o polipeptídeo/proteína ou polissacarídeo são produzidos através de síntese química, eles são, de preferência, substancialmente isentos de precursores químicos ou outros produtos químicos, isto é, eles são separados de precursores químicos ou outros produtos químicos os quais estão envolvidos na síntese da proteína ou polissacarídeo. Consequentemente, tais preparados de polipeptídeo/proteína ou polissacarídeo têm menos de cerca de 30%, 20%, 10%, 5%, 4%, 3%, 2% ou 1% (em peso seco) de precursores químicos ou outros compostos que não fragmentos de polipeptídeo/proteína ou polissacarídeo de interesse.
Conjugados imunogênicos produzidos por meio de qualquer um dos métodos descritos aqui podem ser armazenados em água ou em um tampão de pH neutro com baixa resistência iônica ou liofilizados em um pó seco.
Métodos Para Indução de uma Resposta Imune e Proteção Contra Infecção por S. Aureus
A presente invenção também inclui métodos de uso das composições imunogênicas descritas aqui. Por exemplo, uma modalidade da invenção proporciona um método de indução de uma resposta imune contra S. aureus compreendendo administração, a um indivíduo, de uma quantidade imunogênica de qualquer uma das composições imunogênicas descritas a- qui. Uma modalidade da invenção proporciona um método de proteção de um indivíduo contra uma infecção com S. aureus ou um método de prevenção de infecção com S. aureus ou um método de redução da gravidade ou retardo do início de pelo menos um sintoma associado a uma infecção causada por S. aureus, os métodos compreendendo administração, a um indivíduo, de uma quantidade imunogênica de qualquer uma das composições imunogênicas descritas aqui. Uma modalidade da invenção proporciona um método de tratamento ou prevenção de uma infecção, doença ou condição estafilocócica causada por S. aureus, os métodos compreendendo adminis-tração, a um indivíduo, de uma quantidade imunogênica de qualquer uma das composições imunogênicas descritas aqui. Uma modalidade da invenção proporciona um método de tratamento ou prevenção de uma infecção, doença ou condição estafilocócica associada a uma Staphylococcus sp. em um indivíduo, o método compreendendo a etapa de administração de uma quantidade terapêutica ou profilaticamente eficaz de uma composição imunogênica descrita aqui ao indivíduo. Em algumas modalidades, o método de tratamento ou prevenção de uma infecção, doença ou condição estafilocócica compreende tratamento humano, veterinário, animal ou agrícola. Outra modalidade proporciona um método de tratamento ou prevenção de uma infecção, doença ou condição estafilocócica associada a uma Staphylococcus sp. em um indivíduo, o método compreendendo geração de um preparado de anticorpo policlonal ou monoclonal a partir da composição imunogênica descrita aqui e uso do referido preparado de anticorpo para conferir imunidade passiva ao indivíduo. Uma modalidade da invenção proporciona um método de prevenção de uma infecção estafilocócica em um indivíduo que está sofrendo um procedimento cirúrgico, o método compreendendo a etapa de administração de uma quantidade profilaticamente eficaz de uma composição imunogênica descrita aqui ao indivíduo antes do procedimento cirúrgico.
Uma "resposta imune" a uma composição imunogênica é o desenvolvimento, em um indivíduo, de uma resposta imune humoral e/ou célu- la-mediada às moléculas presentes em uma composição de interesse (por exemplo, um antígeno, tal como uma proteína ou polissacarídeo). Para fins da presente invenção, uma "resposta imune humoral" é uma resposta imune anticorpo-mediada e envolve a geração de anticorpos com afinidade pelos antígenos presentes nas composições imunogênicas da invenção, enquanto que uma "resposta imune célula-mediada" é uma mediada por linfócitos T e/ou outras células sanguíneas brancas. Uma "resposta imune célula- mediada" é estimulada pela apresentação de epitopos antigênicos em asso-ciação com moléculas da Classe I ou Classe II do principal complexo de his- tocompatibilidade (Major Histocompatibility Complex - MHC). Isso ativa células T auxiliares CD4+ antígeno-específicas ou linfócitos T citotóxicos CD8+ às células ("CTLs"). CTLs têm especificidade por antígenos peptídicos ou lipídi- cos que são apresentados em associação com proteínas codificadas pelo principal complexo de histocompatibilidade (Major Histocompatibility Complex - MHC) ou CD1 e expressas sobre a superfície de células. CTLs ajudam a induzir e promove a destruição intracelular de micróbios intracelulares ou a lise das células infectadas com tais micróbios. Outro aspecto de imunidade celular envolve uma resposta antígeno-específica por células T auxiliares. Células T auxiliares atuam para ajudar a estimular a função e foco da atividade de células efetuadoras não específicas contra células que mostram antígenos peptídicos em associação com moléculas do MHC clássicas ou não clássicas sobre sua superfície. Uma "resposta imune célula-mediada" refere-se também à produção de citocinas, quimiocinas e outras de tais moléculas produzidas por células T ativadas e/ou outras células sanguíneas brancas, incluindo aquelas derivadas de células T CD4+ e CD8+. A capacidade de um antígeno ou componente em particular de estimular uma resposta imunológica célula-mediada pode ser determinada através de uma série de ensaios, tal como através de ensaios de linfoproliferação (ativação de linfócito), ensaios de célula citotóxica CTL, ensaio de linfócitos T específicos para o antígeno em um indivíduo sensibilizado ou medição da produção de citocina por células T em resposta à re-estimulação com antígeno. Tais ensaios são bem conhecidos na técnica. Vide, por exemplo, Erickson et al., J. Immunol. (1993) 151: 4189-4199; Doe et al., Eur. J. Immunol. (1994) 24: 2369-2376.
Conforme usado aqui, "tratamento" (incluindo variações do mesmo, por exemplo, "tratar" ou "tratados") refere-se a qualquer um ou mais dos seguintes: (i) a prevenção de infecção ou reinfecção, conforme em uma vacina tradicional, (ii) uma redução na gravidade de ou na eliminação de sin-tomas e (iii) a eliminação completa ou substancial do patógeno ou distúrbio em questão. Consequentemente, tratamento pode ser realizado profilatica- mente (antes de infecção) ou terapeuticamente (após infecção). Na presente invenção, tratamentos profiláticos ou terapêuticos podem ser usados. De acordo com uma modalidade particular da presente invenção, são propor-cionados composições e métodos os quais tratam, incluindo imunizam profilática e/ou terapeuticamente, um animal hospedeiro contra uma infecção microbiana (por exemplo, uma bactéria, tal como uma espécie Staphylococcus). Os métodos da presente invenção são úteis para conferir imunidade profilática e/ou terapêutica a um indivíduo. Os métodos da presente invenção podem também ser praticados com indivíduos para aplicações de pesquisa biomédica.
Conforme usado aqui, "mamífero" significa um animal humano ou não humano. Mais particularmente, mamífero refere-se a qualquer animal classificado como um mamífero, incluindo seres humanos, animais domésti-cos e de fazenda e animais de zoo, esportivos e de estimação, tais como animais de estimação domésticos e outros animais domesticados incluindo, mas não limitado a, gado, ovelha, furões, suínos, cavalos, coelhos, cabras, cães, gatos e semelhantes. Animais de companhia preferidos são cães e gatos. De preferência, o mamífero é um ser humano.
Uma "quantidade imunogênica" e "quantidade imunologicamente eficaz", ambas as quais são usadas permutavelmente aqui, referem-se à quantidade de antígeno ou composição imunogênica suficiente para estimu-lar uma resposta imune, quer uma resposta celular (célula T) ou humoral (célula B ou anticorpo) ou ambas, conforme medido por meio de ensaios padrões conhecidos por aqueles versados na técnica.
As quantidades de um conjugado em particular em uma compo-sição são, em geral, calculadas com base no polissacarídeo total, conjugado e não conjugado para esse conjugado. Por exemplo, um conjugado de CP5 com 20% de polissacarídeo livre terá cerca de 80 mcg de polissacarídeo CP5 conjugado e cerca de 20 mcg de polissacarídeo CP5 não conjugado em uma dose de 100 mcg de polissacarídeo CP5. A contribuição da proteína para o conjugado usualmente não é considerada quando de cálculo da dose de um conjugado. A quantidade de conjugado pode variar, dependendo do sorotipo estafilocócico. Em geral, cada dose compreenderá 0,1 a 100 mcg de polissacarídeo, particularmente 0,1 a 10 mcg e, mais preferivelmente, 1 a 10 mcg. A "quantidade imunogênica" dos diferentes componentes polissaca- rídicos na composição imunogênica pode divergir e cada um pode compreender 1 mcg, 2 mcg, 3 mcg, 4 mcg, 5 mcg, 6 mcg, 7 mcg, 8 mcg, 9 mcg, 10 mcg, 15 mcg, 20 mcg, 30 mcg, 40 mcg, 50 mcg, 60 mcg, 70 mcg, 80 mcg, 90 mcg ou cerca de 100 mcg de qualquer antígeno polissacarídico em particular.
"Doença invasiva" por S. aureus é o isolamento de bactérias de um local normalmente estéril, onde há sinais/sintomas clínicos associados de doença. Locais no corpo normalmente estéreis incluem sangue, CSF, fluido pleural, fluido pericardial, fluido peritonial, fluido articular/sinovial, osso, locais internos no corpo (nódulo linfático, cérebro, coração, fígado, baço, fluido vítreo, rim, pâncreas, ovário) ou outros locais normalmente estéreis. Condições clínicas que caracterizam doenças invasivas incluem bacteremia, pneumonia, celulite, osteomielite, endocardite, choque séptico e mais.
A eficácia de um antígeno como um imunogênio pode ser medida por meio de ensaios de proliferação, ensaios citolíticos tais como ensaios de liberação de cromo para medir a capacidade de uma célula T de submeter à lise sua célula alvo específica ou através de medição dos níveis de atividade de célula B medindo-se os níveis de anticorpos em circulação específicos para o antígeno no soro. Uma resposta imune pode também ser detectada medindo-se os níveis no soro de anticorpo antígeno-específico induzidos após administração do antígeno e, mais especificamente, medindo-se a capacidade dos anticorpos assim induzidos de intensificar a capacidade op- sonofagocítica de células sanguíneas brancas em particular, conforme des- crito aqui. O nível de proteção da resposta imune pode ser medido estimulando-se o hospedeiro imunizado com o antígeno que foi administrado. Por exemplo, se o antígeno ao qual uma resposta imune é desejada é uma bactéria, o nível de proteção induzida pela quantidade imunogênica do antígeno é medido detectando-se a sobrevida percentual ou a mortalidade percentual após estímulo dos animais com as células bacterianas. Em uma modalidade, a quantidade de proteção pode ser medida medindo-se pelo menos um sin-toma associado à infecção bacteriana, por exemplo, uma febre associada à infecção. A quantidade de cada um dos antígenos na vacina ou composições imunogênicas com múltiplos antígenos ou múltiplos componentes variará com relação a cada um dos outros componentes e pode ser determinada por meio de métodos conhecidos por aqueles versados na técnica. Tais métodos incluiriam procedimentos para medição de imunogenicidade e/ou eficácia in vivo. Em determinadas modalidades, o termo "cerca de" significa dentro de 20%, de preferência dentro de 10% e, mais preferivelmente, dentro de 5%.
A invenção ainda proporciona anticorpos e composições de anticorpo as quais se ligam específica e seletivamente aos polissacarídeos capsulares de sorotipo 5 ou 8 ou conjugados imunogênicos da presente invenção. Em algumas modalidades, anticorpos são gerados quando de administração, a um indivíduo, dos polissacarídeos capsulares de sorotipo 5 ou 8 ou conjugados imunogênicos da presente invenção. Em algumas modalidades, a invenção proporciona anticorpos purificados ou isolados dirigidos contra um ou mais dos polissacarídeos capsulares de sorotipo 5 ou 8 ou conjugados imunogênicos da presente invenção. Em algumas modalidades, os anticorpos da presente invenção são funcionais, conforme medido pela morte de bactérias em um modelo de eficácia com animais ou via um ensaio de morte opsonofagocítica. Em algumas modalidades, os anticorpos da invenção conferem imunidade passiva a um indivíduo. A presente invenção proporciona ainda moléculas de polinucleotídeo que codificam um anticorpo ou fragmento de anticorpo da invenção e uma célula, linhagem de célula (tal como células de hibridoma ou outras linhagens de célula manipuladas para a produção recombinante de anticorpos) ou um fragmento de anticorpo da invenção e uma célula, linhagem de célula (tal como células de hibridoma ou outras linhagens de célula manipulada para produção recombinante de anticorpos) ou um animal transgênico que produz um anticorpo ou composição de anticorpo da invenção usando técnicas bem conhecidas por aqueles versados na técnica.
Anticorpos ou composições de anticorpo da invenção podem ser usadas em um método de tratamento ou prevenção de infecção, doença ou condição estafilocócica associada a uma Staphylococcus sp. em um indivíduo, o método compreendendo geração de um preparado de anticorpo poli- clonal ou monoclonal e uso do referido anticorpo ou composição de anticorpo para conferir imunidade passiva ao indivíduo. Anticorpos da invenção podem também ser úteis para métodos diagnósticos, por exemplo, detecção da presença ou quantificação dos níveis de CP5, CP8 ou um conjugado dos mesmos.
Vários modelos animais conhecidos na técnica podem ser usados para avaliar a eficácia de qualquer uma das composições imunogênicas descritas aqui. Por exemplo:
Modelo de Sepsia Passiva em Murinos:
Os camundongos são passivamente imunizados intraperitone- almente (i.p.) com IgG imune ou anticorpo monoclonal. Os camundongos são estimulados 24 horas depois com uma dose letal de S. aureus. O estímulo bacteriano é administrado intravenosamente (i.v. ou i.p.), assegurando que qualquer sobrevida possa ser atribuída à interação específica in vivo do anticorpo com as bactérias. A dose de estímulo bacteriano é determinada como sendo a dose requerida para obter sepsia letal de aproximadamente 20% dos camundongos de controle não imunizados. Avaliação estatística de estudos de sobrevida pode ser realizada por meio de análise de Kaplan- Meier.
Modelo de Estímulo e Imunização Ativa:
Nesse modelo, camundongos são ativamente imunizados subcu- taneamente (s.c.) com um antígeno alvo nas semanas 0, 3 e 6 (ou um es- quema similar conhecido por aqueles versados na técnica) e estimulados com S. aureus na semana 8 (ou outro esquema similar conhecido por aqueles versados na técnica) através da via intravenosa ou intraperitoneal. A dose de estímulo bacteriano é calibrada para obter uma sobrevida de aproximadamente 20% no grupo de controle durante um período de 14 dias. Avaliação estatística de estudos de sobrevida pode ser realizada por meio de a- nálise de Kaplan-Meier.
Modelo de Endocardite Infecciosa Passiva:
Um modelo de imunização passiva para endocardite infecciosa (Infectious Endocarditis - IE) causada por S. aureus foi usado anteriormente para mostrar que ClfA pode induzir à imunidade protetora. Vide Vernachio et al. (2006) Antmicro. Agents & Chemo. 50: 511-518. Nesse modelo de IE, coelhos ou ratos são usados para simular infecções clínicas que inclui um cateter venoso central, bacteremia e cultura hematogênea a órgãos distais. A coelhos ou ratos com cateteres com vegetações da válvula aórtica estéreis é administrada uma única injeção intravenosa de um anticorpo monoclonal ou policlonal específico para o antígeno alvo. Após 24 horas, os animais são estimulados i.v. com cepas estafilocócicas heterólogas ou uma cepa MRSA. Então, 48 horas após estímulo, vegetações cardíacas, rins e sangue são colhidos e cultivados. A frequência de infecção estafilocócica em vegetações da válvula cardíaca, rins e sangue é, então, medida. Em um estudo, quando os animais foram estimulados com MRSE ATCC 35984 ou MRSA PFE- SA0003, reduções significativas na taxa de infecção foram mostradas usando o preparado de anticorpo policlonal ou o anticorpo monoclonal à ClfA. Vide Vernachio et al., supra.
Modelo de Endocardite Infecciosa Passiva:
O modelo de endocardite infecciosa também foi adaptado para estudos de imunização ativa. Coelhos ou ratos são imunizados intramuscularmente (i.m.) com o antígeno alvo e estimulados com S. aureus duas semanas depois através da via i.v.
Modelo de pielonefrite:
No modelo de pielonefrite, os camundongos são imunizados nas semanas 0, 3 e 6 (ou um esquema similar conhecido por aqueles versados na técnica) com os antígenos alvo. Na semana 8, os animais são estimulados, por exemplo, através de injeção i.p., por exemplo, de 1,7 x 10θ cfu de S. aureus PFESA0266. Após 48 horas, os rins e/ou outros tecidos são colhidos e cultivados. Finalmente, unidades de formação de colônia das bactérias de estímulo são enumeradas nos rins e/ou outros tecidos. Esse modelo avalia a disseminação sistêmica no animal.
Monitoramento de Anticorpos Funcionais Usando Ensaio de Morte Opsono- faqocítica
Células efetuadoras diferenciadas de uma linhagem de célula (por exemplo, HL60s) ou células polimorfonucleares (PolyMorphoNuclear - PMNs) isoladas de sangue de um doador humano usando solução LYM- PHOLYTE®-Poly (Cedarlane Laboratories Limited, Ontário, Canadá) conforme o protocolo do fabricante podem ser usadas para esse ensaio. Células efetuadoras foram ressuspensas em tampão de ensaio (Meio de Eagle modificado contendo albumina de soro bovino a 1%) em uma concentração de aproximadamente 2 X 107 células/ml e colocadas em uma incubadora a 37° C até prontas para uso. A cepa PFESA0266 de S. aureus foi crescida durante a noite lâminas de agar com soja tríptica. Células bacterianas foram raspadas, lavadas duas vezes e ressuspensas em tampão de ensaio contendo glicerol a 5% até uma OD6oo = 1, a qual é igual a uma concentração de aproximadamente 5 X 108 cfu/ml. Alíquotas de um ml da suspensão bacteriana foram congeladas e armazenadas a -40°C até prontas para uso. A suspensão bacteriana congelada foi descongelada e ajustada para uma concentração de 106 cfu/ml em tampão de ensaio e colocada sobre gelo. O ensaio foi realizado usando lâminas de polipropileno de 1 ml com 96 cavidades profundas estéreis. Diluições seriais duplas de amostras de anticorpo (50 μl) foram preparadas e seguidas pela adição de 300 μl de tampão de ensaio à mistura de anticorpo. Bactérias foram adicionadas (50 μl) às lâminas e colocadas sobre um agitador giratório a 4 °C durante 30 minutos. A etapa de opsoniza- ção foi seguida pela adição de 50 μl de complemento humano (concentração final de 1%). Finalmente, 50 μl de células efetuadoras (concentração de 107 células/ml) foram adicionados à lâmina e a suspensão bem misturada por meio de pipeteamento repetido. Uma alíquota de 50 μl da suspensão foi serialmente diluída 10 vezes em solução de saponina a 1%, submetida a turbi- Ihonamento para minimizar a aglutinação bacteriana e colocada sobre agar de soja tríptica em duplicata. A lâmina de ensaio foi incubada a 37°C durante 1 hora com mistura contínua usando um agitador estilo "rotisserie". Ao final da incubação, uma alíquota de 50 μl de suspensão foi serialmente diluída 10 vezes em solução de saponina a 1%, misturada por meio de turbilhonamento para minimizar a aglutinação bacteriana e colocada sobre agar de soja tríptica em duplicata. A morte percentual foi calculada determinando-se a proporção do número de cfu que sobrevivem a 60 minutos em cavidades com bactérias, anticorpos, complemento e células efetuadoras para o número de cfu que sobrevivem em tubos carecendo de anticorpos mas contendo bactérias, complemento e células efetuadoras. Controles contendo bactérias, complemento e soros foram incluídos para ajustar qualquer redução na CFU em virtude de aglutinação.
Adsorção de Complemento
Soro de doadores humanos adsorvido contra cepas PFE- SA0266, PFESA0286 e PFESA0270 de S. aureus pode ser usado como uma fonte de complemento no ensaio. Cepas de S. aureus foram crescidas durante a noite sobre lâminas TSA a 37°C. As células foram raspadas da lâmina e ressuspensas em PBS estéril. Células bacterianas foram centrifugadas a 10.000 rpm durante 10 minutos a 4°C e a pelota de células foi ressuspensas em human soro para adsorção. Soro foi incubado com bactérias sobre um Nutator a 4°C durante 30 minutos. As células foram centrifugadas, o soro transferido para outro tubo contendo bactérias e a etapa de adsorção repetida novamente durante 30 minutos. Finalmente, as células foram centrifugadas e o soro passado através de um filtro de 0,2 microns antes que alíquotas de 0,5 ml fossem congeladas em nitrogênio líquido.
Método II - OPA Usando Células HL-60
Células HL-60 foram diferenciadas de acordo com S. Romero- Steiner et a/., Clin Diagn Lab Immunol 4 (4) (1997), páginas 415^422. Célu- las HL-60 coletadas foram ressuspensas em tampão de ensaio (Meio de Eagle modificado contendo albumina de soro bovino a 1%) a aproximadamente 108 células/ml e colocadas em uma incubadora a 37 °C até prontas para u- so. S. aureus foi crescida durante a noite lâminas de agar com soja tríptica. Células bacterianas foram raspadas, lavadas duas vezes e ressuspensas em tampão de ensaio contendo glicerol a 5% até uma OD6oo = 1, a qual é igual a aproximadamente 5 X 108cfu/ml. Alíquotas de um ml da suspensão bacteriana foram congeladas e armazenadas a -40°C até prontas para uso. A suspensão bacteriana congelada foi descongelada e ajustada para uma concentração de 106 cfu/ml em tampão de ensaio e colocada sobre gelo. O ensaio foi realizado usando lâminas de polipropileno de 1 ml com 96 cavidades profundas estéreis. Diluições seriais duplas de amostras de anticorpo monoclonal (25μl) foram preparadas e seguido pela adição de 150 μl de tampão de ensaio à suspensão de anticorpo. Bactérias foram adicionadas (25μl) às lâminas e colocadas sobre um agitador giratório a 4 °C durante 30 minutos, seguido pela adição de 25 μl de complemento humano (concentração final de 1%). Finalmente, 25μl de células HL-60 (107 células/ml) foram adicionados à lâmina e a suspensão bem misturada por meio de pipetea- mento repetido. Uma alíquota de 25 μl da suspensão foi serialmente diluída 10 vezes em solução de saponina a 1%, misturada por meio de turbilhona- mento para minimizar a aglutinação bacteriana e colocada sobre agar de soja tríptica em duplicatas. A lâmina de ensaio foi incubada a 37°C durante 1 hora com mistura contínua usando um agitador estilo "rotisserie". Ao final da incubação, uma alíquota de 25 μl de suspensão foi serialmente diluída 10 vezes em solução de saponina a 1%, misturada por meio de turbilhonamento e colocada sobre agar de soja tríptica em duplicata. A morte percentual foi calculada determinando-se a proporção do número de cfu que sobrevivem a 60 minutos em cavidades com bactérias, anticorpos, complemento e células HL-60 para o número de cfu que sobrevivem em tubos carecendo de anticorpos, mas contendo bactérias, complemento e células HL-60. Controles contendo bactérias, complemento e mAb foi incluído para ajustar qualquer redução na CFU em virtude de aglutinação.
Os exemplos a seguir são proporcionados à guisa de ilustração, não de limitação.
EXEMPLOS Exemplo 1: Preparo de polissacarídeo capsular de S. aureus de sorotipo 8
Nesse exemplo, a produção de vários tamanhos de polissacarí-deos capsulares de S. aureus de sorotipo 8 é descrita. A estrutura das uni-dades de repetição do polissacarídeo capsular de S. aureus de sorotipo 8 é mostrada na figura 1. Os métodos descritos aqui são eficazes na produção de polissacarídeos capsulares de sorotipo 8 com pesos moleculares oscilando de cerca de 20 kDa a 700 kDa. Por meio de seleção apropriada de condições, polissacarídeos capsulares de sorotipo 8 de alto peso molecular podem ser isolados e purificados oscilando, quanto ao peso molecular, de 70 kDa a 300 kDa e muitas faixas deseejadas. Baseado nas características de crescimento e quantidade de cápsula produzida, as cepas PFESA0005 ou PFESA0286 foram usadas para a produção de polissacarídeo capsular de sorotipo 8. Foi mostrado que as cápsulas isoladas das cepas PFESA0005 e PFESA0286 eram idênticas.
Para produção de polissacarídeos capsulares de sorotipo 8, as cepas foram crescidas em um meio complexo consistindo primariamente uma fonte de carbono (lactose ou sacarose), farinha de soja hidrolisada co-mo a fonte de nitrogênio e metais residuais. As cepas foram crescidas em biorreatores durante 2 a 5 dias.
Antes de autoclave, uma amostra foi removida para testar o nível de enterotoxina de enterotoxina B estafilocócica (SEB) na cultura. Na presença de polissorbato 80 a 0,05%, a concentração de SEB na fermentação era de 15-20 ng/ml. Experimentos anteriores mostraram que autoclave da cultura durante 1 hora reduziu o nível de SEB para menos de 0,1 ng/ml, o qual está abaixo do limite de detecção para o kit TECRA.
Polissacarídeo diafiltrado, fracionado com etanol foi carregado sobre uma coluna Q-Sepharose AEC e eluído com um gradiente linear de NaCI, conforme descrito acima. As frações foram analisadas por meio do ensaio de O-acetila e o teste de imunodifusão dupla quanto à presença de polissacarídeo de sorotipo 8 e o ensaio de fosfato quanto à presença de ácido teicoico (TA). A presença de polissacarídeo de sorotipo 8 foi detectada nas frações 35 a 95 (figuras 2A-B).
Para reduzir a contaminação com ácido teicoico, as frações 35 a 75 foram agrupadas e qualquer ácido teicoico residual foi oxidado com me- taperiodato de sódio para permitir sua remoção através de diafiltração 3K contra diH2O.
Purificação de polissacarídeo capsular de sorotipo 8 usado para o preparo de conjugados foi realizada através de dois métodos diferentes que contam com temperatura elevada e baixo pH para realizar a liberação de cápsula da célula e reduzir o peso molecular do polissacarídeo. O peso molecular resultante é dependente do tempo, temperatura e pH da etapa de hidrólise.
Caracterização de polissacarídeo capsular de sorotipo 8 foi realizada usando as técnicas especificadas na Tabela 1.Tabela 1: Ensaios de caracterização para polissacarídeos capsulares de S.aureus de sorotipo 8
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Polissacarídeos capsulares produzidos por meio dos métodos descritos abaixo resultam em polissacarídeos puros bem caracterizados com baixos níveis de contaminantes de proteína, ácido nucleico, peptidoglicana e ácido teicoico.
No primeiro método, após liberação da cápsula da célula e redução de peso molecular, o preparado de cápsula é tratado com um coquetel de enzimas (por exemplo, ribonuclease, deoxirribonuclease, lisozima e protease) para digerir as impurezas. Após incubação, impurezas residuais são precipitadas mediante a adição de etanol (concentração final de cerca de 25%). Após remoção do etanol residual, solução contendo cápsula foi carregada sobre uma coluna de troca de ânions (Q-Sepharose) e eluída com um gradiente de sal linear. Frações contendo cápsula foram agrupadas e tratadas com meta-periodato de sódio. Esse tratamento resultou na hidrólise oxi- dativa de contaminante ácido teicoico residual, mas não afeta o polissacarídeo capsular de sorotipo 8. A reação foi resfriada mediante a adição de eti- leno glicol. O material foi concentrado e diafiltrado contra dH2O para remover quaisquer reagentes e subprodutos residuais.
O segundo método que foi usado para produzir cápsulas não envolve o uso de enzimas para digerir as várias impurezas derivadas de célula. Nesse método, após liberação da cápsula da célula e redução de peso molecular, o caldo de fermentação hidrolisado foi clarificado através de mi- crofiltração, seguido por ultrafiltração e diafiltração. A solução foi tratada com carvão ativado para remover impurezas. Após tratamento com carvão, o material foi tratado com meta-periodato de sódio para oxidar o ácido teicócico residual, seguido por resfriamento com propileno glicol. O material foi concentrado e diafiltrado contra dH2O para remover quaisquer reagentes e subprodutos residuais.
Preparados produzidos usando qualquer método resultaram em polissacarídeos capsulares puros com baixos níveis de contaminantes de proteína, ácido nucleico e ácido teicoico. Os métodos descritos podem ser usados para produzir faixas específicas dos polissacarídeos de alto peso molecular simplesmente variando as condições de hidrólise. Exemplos de polissacarídeos capsulares obteníveis por meio dos métodos descritos aqui são mostrados na Tabela 2 abaixo. Lotes de polissacarídeo capsular de sorotipo 8 purificado tinham alta pureza, conforme indicado por nenhum ácido teicoico (TA), peptidoglicana e baixo teor de proteína residual. Vide Tabela 2. A faixa de pesos moleculares abrangia 20,4 kDa a 65,1 kDa e os polissacarídeos purificados eram altamente O-acetilados (-100%). Os níveis de con- taminação por ácido nucleico foram baixos (0,12-2,45%).Tabela 2: Caracterização de Preparados de polissacarídeo capsular de soro-tipo 8
Figure img0002
Seleção de Peso Molecular de Polissacarídeos Capsulares:
Essa análise cinética demonstra que uma ampla faixa de pesos moleculares de polissacarídeos capsulares pode ser gerada através dos métodos descritos aqui. Inicialmente, polissacarídeos maiores foram produzidos pelas células bacterianas e, subsequentemente, uma faixa de peso molecular desejada pode ser selecionada e, então, purificada através de manipulação das condições de pH e calor e etapas de hidrólise.
Tratamento térmico do caldo de fermentação de S. aureus foi uma etapa de processo entre a fermentação e recuperação de polissacarídeo capsular. Essa etapa de processo usa calor para tratar caldo com pH ajustado durante um período especificado. Os objetivos do tratamento térmico em baixo pH eram matar células, inativar enterotoxinas, liberar o polissacarídeo ligado à célula e reduzir o peso molecular durante um período especificado. Dentre esses objetivos, a redução de peso molecular foi a mais lenta em termos de tempo de processamento requerido nessa etapa. Portanto, os outros objetivos foram inevitavelmente obtidos dentro do tempo de tratamento considerado.
Tratamento Térmico:
Condições de temperatura e pH para seleção de várias faixas de peso molecular de polissacarídeos capsulares foram determinadas. Um Fermentador Biolafitte de 15 L foi usado para esses estudos. O caldo de fermentação foi transferido para o fermentador por uma bomba peristáltica.
Usando uma velocidade de agitação de cerca de 200 rpm, o pH do caldo foi ajustado com ácido sulfúrico concentrado. Então, a temperatura do caldo foi elevada para o valor configurado. O tempo de tratamento térmico começou tão logo a temperatura atingisse o ponto de ajuste. Quando o tempo de tratamento desejado foi atingido, o caldo foi esfriado para a temperatura ambiente. Amostras do processo foram tomadas para determinar a concentração e peso molecular do polissacarídeo por meio de sistemas de HPLC e SEC- MALLS, respectivamente. Os dados de peso molecular (MW) foram usados na análise cinética. Os perfis de MW foram determinados com o tempo em um pH de 3,5, 4,0 e 5,0. Vide figura 3A.
A cinética de hidrólise de ácido suave de polissacarídeos foi conduzida usando polissacarídeo capsular de sorotipo 8 obtido do processo. A solução de polissacarídeo purificado foi ajustada para o pH desejado para o experimento com ácido sulfúrico. Cerca de 1,5 mL da solução foram transferidos para cada um dos tubos para centrífuga de 15 mL. Os tubos foram colocados em um banho de óleo equipado com um sistema de controle de temperatura de precisão. O tubo foi tirado em um intervalo de tempo predeterminado e foi esfriado em um balde de gelo. Ao final do experimento, uma alíquota de tampão de Tris a 1M (pH de 7,5) foi adicionada à amostra para ajustar o pH de volta para cerca de 7. As amostras foram analisadas por um sistema SEC-MALLS. Os dados de MW foram usados na análise cinética. O efeito da temperatura sobre o perfil de MW de CP8 em um pH de 3,5 foi determinado com o tempo. Vide figura 3B.
Resultados
Conforme mostrado na figura 3A, um menor pH foi mais eficaz na redução de tamanho do polissacarídeo. Pesos moleculares entre 300 kDa e 600 kDa podem ser gerados usando um pH de 5 a 95 °C durante entre 15 minutos e 120 minutos. Da mesma forma, pesos moleculares entre 250 kDa e 450 kDa podem ser gerados usando um pH de 4 a 95 °C durante entre 15 minutos e 120 minutos. Além disso, pesos moleculares entre 120 kDa e 450 kDa podem ser gerados usando um pH de 3,5 a 95 °C durante entre 15 mi-nutos e 120 minutos.
Conforme mostrado na figura 3B, quanto maior a temperatura, mais rápida a taxa de hidrólise e mais ampla a faixa de pesos moleculares do polissacarídeo produzido com o tempo. Uso de uma temperatura menor, 55 °C versus 95 °C no mesmo pH, produz uma faixa mais limitada de pesos moleculares do polissacarídeo.
Além disso, a figura 4 demonstra uma correlação entre o peso molecular do CP8 purificado com o tempo de tratamento para hidrólise ácida suave (pH de 3,5 a 95 °C). O polissacarídeo purificado é o produto final obtido do processo de recuperação detalhado anteriormente. Conforme mostrado na figura 4, um aumento no tempo de tratamento térmico da cepa PFE- SA0005 de S. aureus em um pH de 3,5 resultou em CP8 de menor peso molecular, enquanto que tempos de tratamento mais curtos em um pH de 3,5 resultaram em CP8 de maior peso molecular. O tamanho dos polissacarídeos capsulares de sorotipo 8 oscilava de cerca de 80 kDa a cerca de 220 kDa, dependendo da extensão de tempo de tratamento térmico em um pH de 3,5. A correlação entre o tempo de tratamento térmico em baixo pH e o tamanho do CP8 purificado, conforme mostrado na figura 4, permite uma estimativa do tempo de tratamento requerido para produzir polissacarídeos purificados com uma faixa especificada de peso molecular.
É importante notar que, conforme demonstrado acima, a faixa completa de pesos moleculares de polissacarídeos capsulares de sorotipo 8 de 20 kDa a mais de 500 kDa pode ser produzida, liberada e purificada. Os métodos, portanto, podem ser usados para produzir faixas específicas de polissacarídeos capsulares de alto peso molecular desejados, tal como é mostrado na Tabela 3. A faixa relativamente limitada de peso molecular do polissacarídeo produzido, onde os pesos moleculares de pico oscilam de 87 kDa a 108 kDa, representa uma faixa bem caracterizada de pesos moleculares que pode ser obtida por meio dos métodos descritos aqui. Uma faixa particularmente vantajosa de polissacarídeos de alto peso molecular, oscilando de 70 kDa a 300 kDa ou de 70 kDa a 150 kDa, é útil na produção de composições imunogênicas através de conjugação do polissacarídeo capsular a uma proteína veículo (vide Tabela 3). As condições usadas para gerar o po- lissacarídeo capsular CP8 tendo uma faixa de peso molecular de cerca de 80 a 120 kDa são como segue: 95°C, pH de 3,5 durante 300 minutos.Tabela 3: Produção de faixa específica de polissacarídeo capsular de soroti-po 8 de alto peso molecular
Figure img0003
Exemplo 2: Conjugação de Polissacarídeo Capsular de sorotipo 8 a CRMI97
Esse exemplo descreve processos e ensaios de caracterização usados na produção de conjugados de polissacarídeo capsular de S. aureus de sorotipo 8-CRM197. Diferentes químicas de conjugação foram desenvolvidas para conjugação de polissacarídeo capsular de S. aureus de sorotipo 8 a essa proteína veículo. Por exemplo, conjugação usando PDPH (3,2- piridilditio)-propionil hidrazida) resulta em uma ligação covalente de tioéter entre o CP e a proteína veículo. Alternativamente, conjugação usando CDI/CDT (1,1-carbonildi-imidazol/1,1-carbonil-di-1,2,4-triazol) resulta em um ligante com um carbono ou nenhum carbono entre o CP e a proteína veículo.
Conjugação de polissacarídeo capsular de sorotipo 8 a CRMI97 através de Química de Conjugação PDPH
A química de conjugação com PDPH é um processo com múltiplas etapas que envolve ativação do polissacarídeo, remoção do grupo de proteção tiol, purificação do intermediário polissacarídico ativado, ativação e purificação da proteína CRM-I97 e conjugação dos componentes ativados, seguido por purificação. Após introdução de um ligante contendo grupo tiol ao polissacarídeo e um grupo haloacetila a uma proteína veículo CRMI97, polissacarídeo capsular de S. aureus de sorotipo 8 foi ligado à proteína veículo através de uma ligação de tioéter. Os grupos bromoacetila foram introduzidos na proteína CRM197 através de reação de grupos amina com o N- hidróxi-succimida éster de ácido bromoacético. Para gerar o polissacarídeo tiolado, os grupos carboxilato ativados com carbodi-imida de ácido N- acetilmanosaminourônico no polissacarídeo foram acoplados ao grupo hi- drazida do ligante heterobifuncional de hidrazida sulfidrila-reativo, 3-(2- piridilditio)-propionil hidrazida (PDPH). Tióis de polissacarídeo PDPH-tiolado, gerados por meio de redução com DTT e purificado através de SEC sobre uma coluna Sephadex G25, reagiram com grupos bromoacetila da proteína ativada, resultando em ligação de tioéter covalente formada por meio de deslocamento de bromo entre o polissacarídeo e a proteína. Grupos bromoacetila não reagidos foram "revestidos" com cloridrato de cisteamina (clori- drato de 2-aminoetanotiol). A mistura de reação foi, então, concentrada e diafiltrada. Os grupos bromoacetila não conjugados restantes foram revestidos com cloridrato de cisteamina para assegurar que nenhum grupo bromoacetila reativo era deixado após conjugação. Isso formou uma ligação covalente entre a extremidade tiol da cisteamina e o grupo acetila sobre o resíduo de lisina após deslocamento de bromo.
1. Tiolação de Polissacarídeo Capsular de S. aureus de sorotipo 8 com PDPH:
O polissacarídeo foi primeiro ativado por meio de tiolação com PDPH. O polissacarídeo foi misturado com uma solução de estoque de PDPH recentemente preparada (250 mg/mL em DMSO), uma solução de estoque de EDAC (90 mg/mL em diH2O) e solução de estoque de tampão MES (0,5 M, pH de 4,85) para fazer uma solução final de MES a 0,1 M e 2 e 4 mg de CP/mL enquanto se mantinha uma proporção em peso de CP:PDPH:EDAC de 1:0,6:1,25 para polissacarídeo capsular de S. aureus de sorotipo 8. Essa mistura foi incubada durante 1 hora em temperatura ambiente e, então, submetida à diálise contra um volume de 1000X de H2O destilada quatro vezes usando um dispositivo de diálise com MWCO de 3500 em entre 4o e 8°C para remover o PDPH não reagido. O polissacarídeo PDPH- ligado foi feito em DTT a 0,2 M e incubado em temperatura ambiente durante 3 horas ou durante a noite em entre 4 e 8°C. DTT em excesso, bem como os subprodutos da reação, foram separados do sacarídeo ativado através de SEC usando resina Sephadex G25 e água destilada como a fase móvel. Frações foram ensaiadas através do ensaio DTDP para grupos tiol e frações tiol-positivas que eluíram próximo do volume vazio da coluna foram agrupa-das. O grupo de frações foi ensaiado por meio dos ensaios de PAHBAH e O- acetila para determinar o grau de ativação, o qual é expresso como um percentual molar das unidades de repetição contendo um grupo tiol (concentração molar de tióis/concentração molar de unidades de repetição). O polissacarídeo ativado foi liofilizado e armazenado a -25°C até necessário para conjugação.
Os resultados de reprodutibilidade de tiolação do polissacarídeo de sorotipo 8 com PDPH são mostrados na Tabela 4. O grau de ativação de polissacarídeo de sorotipo 8 estava na faixa de 12% a 16%, o qual corres-ponde a aproximadamente uma molécula ligante presa por dez unidades repetidas do polissacarídeo capsular a uma molécula ligante por cinco uni-dades repetidas. Tabela 4: Ativação de oolissacarídeo capsular de sorotipo 8 com PDPH -Estudo de reprodutibilidade Escala mg Rendimento mg (%, peso/peso)
Figure img0004
2. Ativação de Proteína Veículo:
Separadamente, a proteína veículo foi ativada por meio de bro- moacetilação. CRM197 foi diluída para 5 mg/mL com NaCI a 0,9% tamponado com fosfato a 10 mM, pH de 7 (PBS) e, então, com NaHCO3 a 0,1 M, pH de 7,0, usando solução de estoque a 1 M. O N-hidróxi-succinimida éster de ácido bromoacético (BAANS) foi adicionado em uma proporção de CRMi97:BAANS de 1:0,25 (peso:peso) usando uma solução de estoque de BAANS em 20 mg/mL de DMSO. Essa mistura de reação foi incubada a entre 4 e 8°C durante 1 hora, então, purificada usando SEC sobre Sephadex G-25. A CRM197 ativada purificada foi avaliada por meio do ensaio de Lowry para determinar a concentração de proteína e, então, diluída com PBS para 5 mg/mL. Sacarose foi adicionada a 5% peso/vol como um crioprotetor e a proteína ativada foi congelada e armazenada a -25°C até necessária para conjugação.
Bromoacetilação de resíduos de lisina de CRM197 foi muito consistente, resultando na ativação de 19 a 25 lisinas das 39 lisinas disponíveis (vide Tabela 5). A reação produziu altos rendimentos de proteína ativada. Tabela 5: Rendimentos e grau de bromoacetilação de CRM197
Figure img0005
3. Reação de Acoplamento:
Uma vez que o polissacarídeo capsular ativado e proteína veículo ativada foram preparados, os dois foram combinados em uma reação de conjugação. O polissacarídeo liofilizado e tiolado foi dissolvido em borato a 0,16 M, pH de 8,95, misturado com CRMI97 bromoacetilada descongelada e água destilada para fazer uma solução final de borato a 0,1 M, proporção em peso de 1:1 de CRM197:polissacarídeo e 1 mg/mL de polissacarídeo. Essa mistura foi incubada em temperatura ambiente durante entre 16 e 24 horas. Grupos bromoacetila não reagidos sobre a proteína foram revestidos mediante a adição de cloridrato de cisteamina em uma proporção de CRMi97:cisteamina de 1:2 (peso/peso) usando uma solução de estoque a 135 mg/mL de cisteamina dissolvida em borato a 0,1 M, pH de 8,95 e incubada durante 4 horas em temperatura ambiente. O conjugado de polissaca- rídeo capsular-CRMi97 (conjugado) foi purificado por meio de diafiltração 50 vezes contra NaCI a 0,9% usando um ultrafiltro de poliéter sulfona de 100K.
Os resultados da reprodutibilidade de estudos de tiolação de polissacarídeo capsular de S. aureus de sorotipo 8 com PDPH demonstraram que o grau de ativação do polissacarídeo estava na faixa de 12 a 16%, o qual corresponde a aproximadamente uma molécula ligante presa por dez unidades de repetição do polissacarídeo a uma molécula ligante por cinco unidades de repetição.
Conjugação de polissacarídeo capsular de sorotipo 8 a CRMI97 através de Química de Conjugação CDI/CDT
CDI e CDT proporcionam um processo de conjugação em uma etapa onde o polissacarídeo é ativado em um ambiente anidro (DMSO) para formar porções de carbamato de imidazol ou triazol com hidroxilas disponíveis e porções acilimidazol ou aciltriazol com ácidos carboxílicos. A adição de uma proteína veículo (em DMSO) leva ao deslocamento nucleofílico da imidazol ou triazol pela lisina e formação de uma ligação de carbamato (para hidroxilas ativadas) e uma ligação de amida (para ácidos carboxílicos ativados).
Químicas de conjugação com CDI e CDT produziram polissacarídeo capsular de S. aureus de sorotipo 8 covalentemente ligado à proteína veículo, o qual foi indicado pela presença do sacarídeo e proteína nas frações de cromatografia por exclusão de tamanho e análise de aminoácido do conjugado "revestido" com glicolaldeído ou cloridrato de cisteamina.
Um sumário dos resultados do preparo de vários lotes de conjugados preparados através de químicas PDPH e CDI/CDT para o polissacarídeo capsular de S. aureus de sorotipo 8 com um tamanho de polissacarídeo na faixa de 20 a 40 kDa é mostrado na Tabela 6 abaixo. Não houve diferença significativa no polissacarídeo capsular livre, proporção de polissacarí- deo:proteína e rendimentos de conjugados gerados através desses dois métodos de conjugação. A antigenicidade do polissacarídeo capsular de sorotipo 8 conjugado não foi alterada pela conjugação, conforme mostrado pela linha de identidade de precipitina entre os conjugados e o polissacarídeo nativo.Tabela 6: Caracterização de polissacarídeo capsular de sorotipo 8-CRM197 Preparado através de duas químicas de conjugação
Figure img0006
Conforme mostrado acima, os métodos descritos aqui podem ser usados para produzir faixas específicas de polissacarídeos capsulares de alto peso molecular desejados. Nós tentamos preparar conjugados a partir de uma faixa pré-selecionada de alto peso molecular que poderia ser polissacarídeo capsular de sorotipo 8 filtrado e purificado para uso em composições imunogênicas. A Tabela resume a análise dos conjugados de polis- 10 sacarídeo capsular de sorotipo 8 onde o polissacarídeo capsular de sorotipo 8 oscilava, quanto ao peso molecular, de cerca de 80 kDa a 120 kDa e a química de conjugação com imidazol foi utilizada. Os pesos moleculares dos conjugados oscilavam de 595 kDa a 1708 kDa. O número de lisinas conjugadas por CRM197 oscilava de um máximo de 9 a um mínimo de 3. O polis- 15 sacarídeo capsular livre oscilava de um máximo de 6% a um mínimo de 2 %.Tabela 7: Conjugados com faixa pré-selecionada de peso molecular de polissacarídeo capsular de sorotipo 8
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Ambas as químicas de conjugação produzem polissacarídeo de sorotipo 8 covalentemente ligado à proteína veículo. Não houve diferença significativa no polissacarídeo capsular livre, proporção de polissacarídeo capsular de sorotipo 8:proteína e rendimentos de conjugados gerados através desses dois métodos.
Exemplo 3: Processo com CDI/CDT complexo versus um recipiente
Conforme descrito acima, métodos para produção dos conjugados imunogênicos da invenção envolvem conjugação covalente dos polissacarídeos capsulares com as proteínas veículos usando química de conjugação envolvendo CDI (1,1-carbonildi-imidazol), CDT (1,1-carbonil-di-1,2,4- triazol) ou PDPH (3-(2-piridilditio)-propionil hidrazida). Uso de CDI/CDT resultou em um ligante com um carbono ou zero carbono entre o polissacarídeo capsular e a proteína veículo, enquanto que uso de PDPH resulta em um ligante com cinco carbonos contendo uma ligação covalente de tioéter entre o polissacarídeo capsular e a proteína veículo.
O método baseado em PDPH foi um processo com múltiplas e- tapas que envolve ativação do polissacarídeo, remoção do grupo de proteção tiol, purificação do intermediário polissacarídico ativado, ativação e purificação da proteína veículo e conjugação dos componentes ativados, seguido por purificação. Nesse método, polissacarídeo capsular de S. aureus de sorotipo 8 foi reagido com PDPH e uma carbodi-imida em um solvente orgânico, tal como DMSO, para produzir polissacarídeo PDPH-ligados. Os polissacarídeos PDPH-ligados foram reagidos com um agente de redução para produzir polissacarídeos ativados que foram, então, purificados. As proteínas veículos foram reagidas com ácido bromoacético em um solvente orgânico para produzir proteínas veículos ativadas que foram, então, purificadas. Os polissacarídeos de sorotipo 8 ativados purificados foram, então, reagidos com as proteínas veículos ativadas purificadas para produzir conjugados de polissacarídeo de sorotipo 8:proteína veículo.
Em contraste, os métodos baseados em CDI e CDT eram processos de conjugação em uma etapa, nos quais o polissacarídeo capsular foi ativado em um ambiente anidro (isto é, DMSO) para formar porções de carbamato de triazol com hidroxila e porções acilimidazol ou aciltriazol disponíveis com ácidos carboxílicos. Adição da proteína veículo (em DMSO) levou a um deslocamento nucleofílico da imidazol ou triazol pela lisina e formação de uma ligação de carbamato (para hidroxilas ativadas) e ligação de amida (para ácidos carboxílicos ativados), desse modo, permitindo que a conjugação se processasse em um recipiente. Consequentemente, dois métodos baseados em CDI ou CDT foram desenvolvidos: um processo mais complexo e um processo em um-recipiente mais simples. No processo mais complexo, polissacarídeos capsulares de S. aureus de sorotipo 8 foram compostos com imidazol ou triazol em então, reagidos com CDI ou CDT em um solvente orgânico (tal como DMSO) e cerca de 0,2% peso/v de água para produzir polissacarídeos de sorotipo 8 ativados. Os polissacarídeos de sorotipo 8 ativados foram purificados e, então, reagidos com proteínas veículos no solvente orgânico para produzir conjugados de polissacarídeo de sorotipo 8:proteína veículo. O processo em um-recipiente foi similar ao processo complexo, exceto que os polissacarídeos de sorotipo 8 ativados não foram purificados antes da reação com proteínas veículos.
Processo Complexo com CDI/CDT Ativação de polissacarídeo:
Polissacarídeo capsular de sorotipo 8 foi misturado com 10 g de triazol/g de sorotipo 8 e liofilizado. O bolo resultante foi dissolvido em DMSO a 2,0 mg de polissacarídeo de sorotipo 8/mL. O teor de água foi determinado. Uma solução de estoque recentemente preparada de CDT a 100 mg/mL em DMSO foi adicionada para obter uma quantidade molar de CDT equivalente à água. Altemativamente, a quantidade de CDT adicionada pode ser ajustada para obter um grau maior ou menor de ativação. Essa foi mantida 30 minutos a 23 °C.
Purificação de polissacarídeo de sorotipo 8 ativado:
A solução de polissacarídeo capsular de sorotipo 8 ativada (ACP8) foi entornada em 25 volumes de água para destruir o CDT em excesso. Esse foi concentrado para seu volume original sobre uma membrana de PES de 10 kDa a aproximadamente 1 mg/cm2 e diafiltrado contra água para pelo menos 10 volumes. Essa etapa foi terminada em menos de 4 horas. O material diafiltrado foi misturado com 10 g de triazol/g de polissacarí- deo capsular de sorotipo 8 original e liofilizada.
Preparo de CRM liofilizado:
CRM foi diafiltrado contra NaCI a 0,4%/5% de sacarose em um volume constante sobre uma membrana de PES de 10 kDa para pelo menos 10 volumes. A concentração de proteína foi determinada e tampão de diafiltração suficiente foi adicionado para levar a concentração de proteína para 5,0 g/L, assim, proporcionando uma proporção peso/peso de NaCI/CRM = 0,8. O CRM foi liofilizado.
Conjugação:
Polissacarídeo de sorotipo 8 ativado, diafiltrado foi dissolvido em DMSO a 1 mg/ml_. Solução de borato a 100 mM foi adicionada para obter 2% em v/v.
O CRM foi ressuspenso a 2 mg/mL e, quando dissolução estava completa, combinado com a solução de ACP8. Essa foi deixada reagir a 23 °C durante 20 horas.
A reação do conjugado foi entornada em 24 volumes de borato a 5 mM, pH de 9,0 e deixada agitar em temperatura ambiente durante 1 hora. Ela foi, então, ajustada para um pH de 7,5 com tampão de fosfato a 0,5 M, pH de 6,5. Essa foi filtrada através de um filtro de 5 microns e concentrada para o volume original sobre uma membrana de PES de 300 kDa em uma carga de ~ 1 mg/cm2 e diafiltrada contra pelo menos 10 volumes de água. O concentrado resultante foi filtrado através de um filtro de 0,22 micron e ar-mazenado a 2°C-8°C.
Processo com CDI/CDT em Um-Recipiente Troca de Matriz de CRM197;
CRM197 foi diafiltrada para permuta da matriz densa de aproximadamente fosfato a 10 mM/NaCI a 80 mM/15% de sacarose, pH de 7 para imidazol a 5 mM/NaCI a 0,72 %/octil-β-D-glucopiranosideo a 15 mM, pH de 7. A permuta permitiu a remoção de fosfato e sacarose, os quais são prejudiciais para a conjugação e definem a teor de cloreto de sódio transportado na conjugação. Octil-β-D-glucopiranosideo é adicionado para impedir a formação de partícula após filtração estéril.
A matriz de CRMI97 foi permutada através de filtração de fluxo tangencial contra imidazol a 5 mM/NaCI a 0,72%/octil-β-D-glucopiranosideo a 15 mM, pH de 7 através de 10 diavolumes usando membranas de PES de 10K em uma concentração de retentado de aproximadamente 4 mg/mL. Estímulo típico da membrana foi 2 gramas/pé2 e a concentração alvo final de CRM197 na matriz foi de 6 mg/mL. A CRM197 foi armazenada a 2°C-8°C.
Ativação/Conjugação:
O processo de ativação/conjugação para polissacarídeo capsular de S. aureus de sorotipo 8 consistia das seguintes etapas: Troca de matriz de uma CRM197; 2) Composição do polissacarídeo; 3) Congelamento e liofilização da CRM197 e polissacarídeo composto; 4) Dissolução do polissacarídeo e CRM197 liofilizados; 5) Ativação do polissacarídeo; 6) Conjugação do polissacarídeo ativado à CRM197; e 7) Purificação do conjugado (diluição, diafiltração, filtração estéril).
O polissacarídeo foi composto com 10 gramas de excipiente 1,2,4- triazol por grama de polissacarídeo. O excipiente foi adicionado como um pó ao polissacarídeo, com uma solução obtida após menos de 15 minutos de mistura em temperatura ambiente.
O polissacarídeo composto e CRM197 foram congelados separadamente usando um banho de etanol a -75°C. O volume por garrafa de 1L era de aproximadamente 500 mL.
Para dissolução do polissacarídeo, DMSO foi adicionado às garrafas de liofilização individuais com o polissacarídeo para obter uma suspensão e, então, transferidas para um recipiente de reação de ativação/conjugação para aquecimento. DMSO foi adicionado para obter uma concentração de 2 g/L. Uma solução clara foi obtida à medida que a suspensão atingia aproximadamente 45 °C com mistura. A solução foi, então, esfriada para 23°C + 2°C.
Para dissolução de CRM197, DMSO foi adicionado à garrafas de liofilização individuais contendo CRMI97 para obter uma suspensão e, então, transferida para um segundo recipiente para mistura. DMSO foi adicionado para obter uma concentração de 2 g/L. Uma solução clara foi, tipicamente, obtida em menos de 15 minutos.
A solução de polissacarídeo/DMSO foi coletada para análise de Karl Fischer a fim de determinar o teor de umidade. CDT foi preparado como uma solução a 100 mg/mL em DMSO e foi adicionado baseado no teor de umidade determinado. Adição contínua da solução de CDT foi realizada durante cerca de 5 minutos a 23°C + 2°C com mistura. A reação foi deixada processar durante um mínimo de 30 minutos a 23°C ± 2°C. A reação foi coletada para determinar o nível de ativação (UV a 220/205 nm) e, então, borato de sódio a 100 mM, pH de 9, foi adicionado para obter uma solução aquosa a 1,5%. A solução de reação foi, então, agitada durante um mínimo de 30 minutos a 23°C + 2°C.
Para conjugação do polissacarídeo ativado à CRM197, DMSO foi adicionado para atingir uma concentração de reação de 0,8 mg/mL. A CRM197 dissolvida em DMSO foi, então, adicionada à solução de polissacarídeo ativada com mistura. A reação foi agitada durante um mínimo de 4 horas a 23°C + 2°C.
A solução de reação foi diluída 10X mediante sua adição em tetraborate de sódio a 5 mM, pH de 9 com mistura para hidrolisar os grupos de ativação residuais. A solução diluída foi passada através de um filtro de 5 μm e concentrada para uma concentração alvo de retentado de 2 g/L. Filtração de fluxo tangencial foi realizada usando membranas de celulose regeneradas de 300K através de 20 diavolumes com succinate a 5 mM, pH de 7. Estímulo típico na membrana foi 1 grama/pé2 O conjugado purificado foi passado através de um filtro de 0,22 microns e armazenado a 2°C-8°C.
Exemplo 4: Conjugação de polissacarídeo capsular de sorotipo 8 usando processo de conjugação complexo e em um-recipiente
Esse exemplo demonstra que faixas de peso molecular pré- selecionadas podem ser conjugados em um processo complexo ou em um- recipiente. Os polissacarídeos maiores são inicialmente produzidos pelas células bacterianas e a faixa de peso molecular purificada resultante pode ser controlada pelo pH e calor do processo de hidrólise no Exemplo 1 (conforme mostrado na Tabela 3).
Nesse exemplo, oito lotes de polissacarídeo capsular de sorotipo 9 oscilando, quanto ao peso molecular, de cerca de 80 kDa a cerca de 120 kDa foram selecionados e conjugação foi realizada usando ativação com 1,1-carbonil-di-(1,2,4-triazol) para o polissacarídeo capsular de sorotipo 8.
Vide Tabela 8. Os pesos moleculares dos conjugados resultantes oscilavam de 595 kDa a 1708 kDa. O número de lisinas conjugadas por CRM oscilava de um máximo de 14 a um mínimo de 3. O açúcar livre oscilava de um máximo de 11% a um mínimo de 1%.Tabela 8: Conjugados de polissacarídeo capsular de sorotipo 8 preparados 10 com polissacarídeos capsulares de 80 kPa a 120 kDa
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Exemplo 5: Avaliação de polissacarídeo capsular de sorotipo 8 tratado com base e nativo conjugado em um modelo de bacteremia em murinos
A importância dos grupos O-acetila presentes sobre o polissacarídeo capsular de sorotipo 8 antes de conjugação para indução de respostas 15 de anticorpo funcional foi avaliada para conjugados de polissacarídeo capsular. Polissacarídeo capsular de sorotipo 9 foi de-O-Acetilado sob condições básicas suaves e RMN e cromatografia de ions (Ion Chromatography - IC) confirmaram a ausência de O-acetilação em polissacarídeo capsular de sorotipo 8 de-O-Ac-CRM. O conjugado de CP8 de-O-Ac-CRM foi preparado através de conjugação de polissacarídeo CP8 de-O-Ac ao CRM através de química com PDPH, conforme descrito no Exemplo 2.
O conjugado de polissacarídeo capsular de sorotipo 8, inesperadamente, não mostrou grupos acetila mensuráveis através do método IC. Isso poderia ser atribuído às diferenças na estrutura, locais de O-acetilação comparado com outros polissacarídeos capsulares de S. aureus o que, por sua vez, poderia causar a remoção ou modificação de grupos acetila nos polissacarídeos capsulares de sorotipo 8 durante conjugação.
O modelo de bacteremia em murinos foi usado para avaliar a e- ficácia do polissacarídeo capsular de sorotipo 8 nativo versus tratado com base conjugado à CRM197. Grupos de camundongos BALB/c fêmeas (15/grupo) foram vacinados nas semanas 0, 3 e 6 com 1 mcg de polissacarídeo capsular de sorotipo 8 de-O-Ac-CRM ou 1 μg de polissacarídeo capsular de sorotipo 8 O-Ac-CRM. Vacinas foram formuladas com 22 mcg de AIPO4. Os animais foram estimulados com S. aureus PFESA0003 e bactérias foram enumeradas a partir do sangue três horas depois. Os dados mostraram que houve uma redução estatisticamente significativa (p = 0,0362) na cfu bacteriana recuperada do sangue de animais imunizados com o conjugado de polissacarídeo capsular de sorotipo 8 nativo não tratado, conforme determinado pelo t-teste de Student (Tabela 9). Em animais que foram imunizados com conjugado de polissacarídeo capsular de sorotipo 8 tratado com base, a cfu bacteriana recuperada do sangue foi similar ao grupo de controle com solução salina.Tabela 9: Conjugado de polissacarídeo capsular de sorotipo 8-CRMI97 reduz a bacteremia causada por S. aureus PFESA0003 em camundongos
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Exemplo 6: Avaliação do polissacarídeo capsular de sorotipo 8 tratado com base e nativo conjugado em um modelo de bacteremia em murinos
Conjugados de polissacarídeo capsular de sorotipo 8 foram ava- liados com relação à sua capacidade de proteger os camundongos em um modelo de pielonefrite. Contagens bacterianas no sangue de camundongos que receberam estímulo com S. aureus foram significativamente reduzidas quando comparado com controles imunizados com PBS.
Dois estudos foram conduzidos para avaliar a eficácia do conjugado CP8-CRM197 no modelo de bacteremia em murinos, descrito anteriormente, após estímulo com S. aureus PFESA0268 (Tipo 8). O primeiro estudo (figura 5) mostrou uma redução significativa de bacteremia (p = 0,0308). Para o estudo, grupos de camundongos Swiss Webster de 6-8 semanas de idade (n = 30) foram ativamente imunizados através de injeção subcutânea com 1 μg de polissacarídeo capsular de sorotipo 8-CRM197 e solução salina, ambos formulados com 100 μg de AIPO4 nas semanas 0, 2 e 4 e estimulados na semana 6 por meio da via intravenosa com S. aureus PFESA0268 (Tipo 8). Experimentos de estimulação anteriores foram conduzidos para otimizar a dose de cepa de estímulo na idade que o camundongo tinha após três vacinações. Avaliação estatística de estudos de sobrevida foi realizada através de análise de Kaplan-Meier.
Exemplo 7: Atividade opsõnica de soros de camundongos imunizados com conjugados de polissacarídeo capsular de sorotipo 8 nativo e quimicamente modificado
Soro de camundongos selecionados (n = 5) com altas titulações de polissacarídeo capsular de sorotipo 8 a partir de um estudo de vacinação foram comparados quanto à atividade opsõnica usando a cepa PFESA0005. Os resultados de OPA (Tabela 10) mostram que apenas conjugados preparados por meio da conjugação de polissacarídeo capsular de sorotipo 8 nativo estimulou anticorpos opsônicos em camundongos. É notável que o conjugado de polissacarídeo capsular de sorotipo 8 de-OAc era imunogênico em camundongos, mas os anticorpos estimulados não eram opsônicos nesse ensaio. Titulações de OPA são reportadas como a recíproca da diluição na qual morte de 40% foi observada.Tabela 10: Atividade opsõnica polissacarídeo capsular de sorotipo 8 nativo versus soros de camundongo imunizado com polissacarídeo capsular de sorotipo 8 de-O-Ac-CRM
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Exemplo 8: Morte de cepas de S. aureus por antissoro de conjuqado do so- rotipo 8 pode ser inibida pela adição de polissacarídeo capsular de sorotipo 8 nativo
Para confirmar a especificidade da morte, o ensaio opsonofago- cítico foi realizado na presença de polissacarídeo capsular de sorotipo 8 nativo ou polissacarídeo pneumocócico não relacionado (poli Pn 14), essencialmente conforme descrito acima.
Os resultados (Tabela 11) mostraram que a presença de polis- sacarídeo capsular de sorotipo 8 nativo na mistura de reação inibiu a morte opsonofagocítica de S. aureus PFESA0286 (Tipo 8). Esses resultados con-firmam que morte opsonofagocítica pelo soro imune é mediada por anticorpos cápsula-específicos.Tabela 11: Adição de polissacarídeo capsular de sorotipo 8 inibe a morte opsonofagocítica de S. aureus por soros imunes
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SUMÁRIO
Todas as químicas de conjugação produziram polissacarídeo capsular de sorotipo 8 covalentemente ligado à proteína veículo CRM197. Não houve diferença significativa no sacarídeo livre, proporção de polissacarídeo capsular de sorotipo 8:proteína e rendimentos dos conjugados gerados por esses métodos.
Exemplo 9: Preparo de polissacarídeo capsular de S. aureus de sorotipo 5
Nesse exemplo, a produção de várias faixas de tamanho de po-lissacarídeo capsular de S. aureus de sorotipo 5 é descrita. A estrutura da unidade repetida do polissacarídeo capsular de sorotipo 5 é mostrada na figura 6. Os métodos descritos aqui são eficazes na produção de polissacarídeo capsular de sorotipo 5 com pesos moleculares oscilando de cerca de 20 kDa a 800 kDa. Através de seleção apropriada de condições, polissacarídeos capsulares de sorotipo 5 de alto peso molecular podem ser isolados e purificados oscilando de 50 kDa a 800 kDa de peso molecular. Para uso em composições imunogênicas, polissacarídeo capsular de sorotipo 5 pode ser isolado e purificado oscilando de 70 kDa a 300 kDa de peso molecular, de 70 kDa a 150 kDa e muitas outras faixas desejadas. A cepa PFESA0266 foi escolhida para produção do polissacarídeo capsular de sorotipo 5 baseado nas características de crescimento e quantidade de cápsula produzida.
Para produção de polissacarídeo capsular de sorotipo 5, a cepa PFESA0266 foi crescida em um meio complexo consistindo primariamente uma fonte de carbono (lactose ou sacarose), farinha de soja hidrolisada como a fonte de nitrogênio e metais residuais. As cepas foram crescidas em biorreatores durante 2 a 5 dias.
Fermentação da cepa PFESA0266 foi realizada conforme deta- lhado acima. No momento de coleta, a OD600 da cultura foi 7,38. A cultura foi submetida à autoclave durante 1 hora e, após esfriar, a cultura foi processada conforme descrito acima para separar as células do material sobrena- dante. Aproximadamente 1 L de cada um do sobrenadante filtrado e concentrado e células foi recuperado.
Antes de autoclave, uma amostra foi removida para testar o nível de enterotoxina de enterotoxina B estafilocócica (SEB) na cultura. Na presença de polissorbato 80 a 0,05%, a concentração de SEB na fermentação era de 15-20 ng/ml. Experimentos anteriores mostraram que autoclave da cultura durante 1 hora reduziu o nível de SEB para menos de 0,1 ng/ml, o qual está abaixo do limite de detecção para o kit TECRA.
Polissacarídeo diafiltrado, fracionado com etanol foi carregado sobre uma coluna Q-Sepharose AEC e eluído com um gradiente linear de NaCI, conforme descrito acima. As frações foram analisadas por meio do ensaio de O-acetila e o teste de imunodifusão dupla quanto à presença de polissacarídeo de sorotipo 5 e o ensaio de fosfato quanto à presença de ácido teicoico. A presença de polissacarídeo de sorotipo 5 foi detectada nas frações 60 a 105 (figuras 7A-B). Para reduzir a contaminação com ácido teicoico, as frações 60 a 85 foram agrupadas e qualquer ácido teicoico residual foi oxidado com metaperiodato de sódio para permitir sua remoção através de diafiltração 3K contra diH2O.
Purificação de polissacarídeo capsular de sorotipo 5 usado para o preparo de conjugados foi realizada através de dois métodos diferentes que contam com temperatura elevada e baixo pH para realizar a liberação de cápsula da célula e reduzir o peso molecular do polissacarídeo. O peso molecular resultante é dependente do tempo, temperatura e pH da etapa de hidrólise.
Caracterização de polissacarídeo capsular de sorotipo 5 foi realizada usando as técnicas especificadas na Tabela 1, supra.
Polissacarídeos capsulares produzidos através desse procedimento resultam em polissacarídeos puros com baixos níveis de contaminan- tes de proteína, ácido nucleico, peptidoglicana e ácido teicoico.
No primeiro método, após liberação do polissacarídeo capsular da célula e redução de peso molecular, o preparado de cápsula é tratado com um coquetel de enzimas (ribonuclease, deoxirribonuclease, lisozima e protease) para digerir as impurezas. Após incubação, impurezas residuais são precipitadas mediante a adição de etanol (concentração final de cerca de 25%). Após remoção do etanol residual, solução contendo cápsula foi carregada sobre uma coluna de troca de ânions (Q-Sepharose) e eluída com um gradiente de sal linear. Frações contendo cápsula foram agrupadas e tratadas com meta-periodato de sódio. Esse tratamento resultou na hidrólise oxidativa de contaminante ácido teicoico residual, mas não afeta o CP5 ou CP8. A reação foi resfriada mediante a adição de etileno glicol. O material foi concentrada e diafiltrada contra água destilada (dH2O) para remover quaisquer reagentes e subprodutos residuais.
O segundo método foi usado para produzir polissacarídeo capsular sem o uso de enzimas para digerir as várias impurezas derivadas de célula. Nesse método, após liberação da cápsula da célula e redução de peso molecular, o caldo de fermentação hidrolisado foi clarificado através de microfiltração, seguido por ultrafiltração e diafiltração. A solução foi tratada com carvão ativado para remover impurezas. Após tratamento com carvão, o material foi tratado com meta-periodato de sódio para oxidar o ácido teicóci- co residual, seguido por resfriamento com propileno glicol. O material foi concentrado e diafiltrado contra dH2O para remover quaisquer reagentes e subprodutos residuais.
Preparados produzidos usando qualquer método resultam em polissacarídeos puros com baixos níveis de contaminantes de proteína, ácido nucleico e ácido teicoico. Os métodos descritos podem ser usados para produzir faixas específicas dos polissacarídeos de alto peso molecular simplesmente variando as condições de hidrólise.
Exemplos de polissacarídeo capsular obteníveis por meio dos métodos descritos aqui são mostrados na Tabela 12 abaixo. Lotes de polis-sacarídeo capsular de sorotipo 5 purificado tinham alta pureza, conforme indicado por nenhum ácido teicoico (TA), peptidoglicana e baixo teor de pro- teína residual. Vide Tabelas 12 e 13. A faixa de pesos moleculares abrangia 132,7 kDa a 800 kDa e os polissacarídeos purificados eram altamente O- acetilados, oscilando de 90-100% e eram 100% N-acetilados. Os rendimentos de purificação do polissacarídeo capsular de sorotipo 5 foram 39% a 63% e o tamanho do polissacarídeo de sorotipo 5 purificado variava de 35 kDa a 65 kDa (vide Tabela 12). O nível de contaminação por ácido teicoico (TA) era aceitável e níveis de proteínas residuais e ácido nucleico também estavam nas faixas aceitáveis. Espectros de RMN do polissacarídeo de sorotipo 5 foram idênticos àqueles reportados na literatura.Tabela 12: Caracterização de polissacarídeo capsular de sorotipo 5
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Tabela 13: Caracterização adicional de polissacarídeo capsular de sorotipo 5
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ND = não detectado
Seleção de Peso Molecular de Polissacarídeos Capsulares:
Uma análise cinética demonstra que uma ampla faixa de pesos moleculares de polissacarídeos capsulares pode ser gerada através dos métodos descritos aqui. Inicialmente, polissacarídeos maiores foram produzidos pelas células bacterianas e, subsequentemente, uma faixa de peso molecular desejada pode ser selecionada e, então, purificada através de manipulação das condições de pH e calor e etapas de hidrólise.
Tratamento térmico do caldo de fermentação de S. aureus foi uma etapa de processo entre a fermentação e recuperação de CP. Essa e- tapa de processo usa calor para tratar caldo com pH ajustado durante um período especificado. Os objetivos do tratamento térmico em baixo pH eram matar células, inativar enterotoxinas, liberar o polissacarídeo ligado à célula e reduzir o peso molecular durante um período especificado. Dentre esses objetivos, a redução de peso molecular foi a mais lenta em termos de tempo de processamento requerido nessa etapa. Portanto, os outros objetivos foram inevitavelmente obtidos dentro do tempo de tratamento considerado.
Tratamento Térmico:
Condições de temperatura e pH para seleção de várias faixas de peso molecular de polissacarídeos capsulares foram determinadas. Um Fermentador Biolafitte de 15 L foi usado para esses estudos. O caldo de fermentação foi transferido para o fermentador por uma bomba peristáltica. Usando uma velocidade de agitação de cerca de 200 rpm, o pH do caldo foi ajustado com ácido sulfúrico concentrado. Então, a temperatura do caldo foi elevada para o valor configurado. O tempo de tratamento térmico começou tão logo a temperatura atingisse o ponto de ajuste. Quando o tempo de tratamento desejado foi atingido, o caldo foi esfriado para a temperatura ambiente. Amostras do processo foram tomadas para determinar a concentração e peso molecular do polissacarídeo por meio de sistemas de HPLC e SEC- MALLS, respectivamente. Os dados de peso molecular (MW) foram usados na análise cinética. Os perfis de MW foram determinados com o tempo em um pH de 3,5, 4,0 e 5,0. Vide figura 8A.
A cinética de hidrólise de ácido suave de polissacarídeos foi conduzida usando polissacarídeo capsular de sorotipo 5 purificado obtido do processo. A solução de polissacarídeo purificado foi ajustada para o pH de-sejado para o experimento com ácido sulfúrico. Cerca de 1,5 mL da solução foi transferido para cada um dos tubos para centrífuga de 15 mL. Os tubos foram colocados em um banho de óleo equipado com um sistema de controle de temperatura de precisão. O tubo foi tirado em um intervalo de tempo predeterminado e foi esfriado em um balde de gelo. Ao final do experimento, uma alíquota de tampão de Tris a 1M (pH de 7,5) foi adicionada à amostra para ajustar o pH de volta para cerca de 7. As amostras foram analisadas por um sistema SEC-MALLS. Os dados de MW foram usados na análise cinética. O efeito da temperatura sobre os perfis de MW de CP5 em um pH de 4,5 foi determinado com o tempo. Vide figura 8B.
Resultados
Conforme mostrado na figura 8A, um menor pH foi mais eficaz na redução de tamanho do polissacarídeo. Nesse exemplo, faixas de pesos moleculares entre cerca de 300 kDa e cerca de 600 kDa podem ser geradas usando um pH de 5 a 95 °C durante entre 15 minutos e 120 minutos. Vide figura 8A. Da mesma forma, escolha de um pH de 4,5 a 95 °C durante entre 15 minutos e 120 minutos pode proporcionar faixas de peso molecular do polissacarídeo entre 200 kDa e 400 kDa. Além disso, escolha de um pH de 4,0 a 95 °C durante 15 minutos e 120 minutos pode proporcionar faixas de peso molecular do polissacarídeo entre 120 kDa e 300 kDa.
Conforme mostrado na figura 8B, quanto maior a temperatura, mais rápida a taxa de hidrólise e mais ampla a faixa de pesos moleculares do polissacarídeo produzido com o tempo. Uso de uma temperatura menor, 55 °C versus 95 °C no mesmo pH, produz uma faixa mais limitada de pesos moleculares do polissacarídeo.
Além disso, a figura 4 demonstra uma correlação entre o peso molecular do polissacarídeo capsular de sorotipo 5 purificado com o tempo de tratamento para hidrólise ácida suave (pH de 3,5 a 95 °C). O polissacarídeo purificado é o produto final obtido do processo de recuperação detalhado anteriormente. Também conforme mostrado na figura 4, um aumento no tempo de tratamento térmico da cepa PFESA0266 de S. aureus em um pH de 4,5 resultou em polissacarídeo capsular de sorotipo 5 de menor peso molecular, enquanto que tempos de tratamento mais curtos em um pH de 4,5 resultaram em polissacarídeo capsular de sorotipo 5 de maior peso molecular. O tamanho dos polissacarídeos capsulares de sorotipo 5 oscilava de cerca de 90 kDa a cerca de 220 kDa, dependendo da extensão de tempo de tratamento térmico em um pH de 4,5. A correlação entre o tempo de tratamento térmico em baixo pH e o tamanho do polissacarídeo capsular de soro- tipo 5 purificado, conforme mostrado na figura 4, permite uma estimativa do tempo de tratamento requerido para produzir polissacarídeos purificados com uma faixa especificada de peso molecular.
Conforme demonstrado acima, a faixa completa de pesos mole-culares de polissacarídeos capsulares de sorotipo 5 de 20 kDa a mais de 500 kDa pode ser produzida, liberada e purificada. Os métodos, portanto, podem ser usados para produzir faixas específicas de polissacarídeos capsulares de alto peso molecular desejados, tal como é mostrado na Tabela 14. A faixa relativamente limitada de peso molecular do polissacarídeo produzido, onde os pesos moleculares de pico oscilam de 63 kDa a 142 kDa, representa uma faixa bem caracterizada de pesos moleculares que pode ser obtida por meio dos métodos descritos aqui. Uma faixa particularmente vantajosa de polissacarídeos de alto peso molecular, oscilando de 70 kDa a 300 kDa ou de 70 kDa a 150 kDa, é útil na produção de composições imunogênicas através de conjugação do polissacarídeo capsular a uma molécula ou proteína veículo. As condições usadas para gerar o polissacarídeo capsular CP5 tendo uma faixa de peso molecular de cerca de 100 a 140 kDa são como segue: 95°C, pH de 4,5 durante 135 minutos. Diferentes combinações de pH, temperatura e tempo, contudo, também gerarão moléculas de CP5 com uma faixa de peso molecular de cerca de 100 a 140 kDa.Tabela 14: Produção de faixa específica de polissacarídeo capsular de sorotipo 5 de alto peso molecular
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ND = não feito
Exemplo 10: Conjugação de Polissacarídeos Capsulares de sorotipo 5 a CRM-I97
Esse exemplo descreve processos e ensaios de caracterização usados na produção de conjugados de polissacarídeo capsular de S. aureus de sorotipo 8-CRM197. Diferentes químicas de conjugação foram desenvolvidas para conjugação de polissacarídeo capsular de S. aureus de sorotipo 8 a essa proteína veículo. Por exemplo, conjugação usando PDPH (3,2- piridilditio)-propionil hidrazida) resulta em uma ligação covalente de tioéter entre o CP e a proteína veículo. Alternativamente, conjugação usando CDI/CDT (1,1-carbonildi-imidazol/1,1-carbonil-di-1,2,4-triazol) resulta em um ligante com um carbono ou nenhum carbono entre o polissacarídeo capsular e a proteína veículo.
Conjugação de polissacarídeo capsular de de sorotipo 5 a CRM197 através de Química de Conjugação PDPH
A química de conjugação com PDPH é um processo com múltiplas etapas que envolvem ativação do polissacarídeo, remoção do grupo de proteção tiol, purificação do intermediário polissacarídico ativado, ativação e purificação da proteína CRMI97 e conjugação dos componentes ativados, seguido por purificação. Após introdução de um ligante contendo grupo tiol ao polissacarídeo e um grupo haloacetila a uma proteína veículo CRM197, polissacarídeo capsular de S. aureus de sorotipo 5 foi ligado à proteína veículo através de uma ligação de tioéter. Os grupos bromoacetila foram introduzidos na proteína CRM197 através de reação de grupos amina com o N- hidróxi-succimida éster de ácido bromoacético. Para gerar o polissacarídeo tiolado, os grupos carboxilato ativados com carbodi-imida de ácido N- acetilmanosaminourônico no polissacarídeo foram acoplados ao grupo hidrazida do ligante heterobifuncional de hidrazida sulfidrila-reativo, 3-(2- piridilditio)-propionil hidrazida (PDPH). Tióis de polissacarídeo PDPH-tiolado, gerados por meio de redução com DTT e purificado através de SEC sobre uma coluna Sephadex G25, reagiram com grupos bromoacetila da proteína ativada, resultando em ligação de tioéter covalente formada por meio de deslocamento de bromo entre o polissacarídeo e a proteína. Grupos bromo- acetila não reagidos foram "revestidos" com cloridrato de cisteamina (clori- drato de 2-aminoetanotiol). A mistura de reação foi, então, concentrada e diafiltrada. Os grupos bromoacetila não conjugados restantes foram revestidos com cloridrato de cisteamina para assegurar que nenhum grupo bromoacetila reativo era deixado após conjugação. Isso formou uma ligação covalente entre a extremidade tiol da cisteamina e o grupo acetila sobre o resíduo de lisina após deslocamento de bromo.
1. Tiolação de Polissacarídeo Capsular de S. aureus de sorotipo 5 com PDPH:
O polissacarídeo foi primeiro ativado por meio de tiolação com PDPH. O polissacarídeo foi misturado com uma solução de estoque de PDPH recentemente preparada (250 mg/mL em DMSO), uma solução de estoque de EDAC (90 mg/mL em diH2O) e solução de estoque de tampão MES (0,5 M, pH de 4,85) para fazer uma solução final de MES aO,1Me2e4mg de polissacarídeo capsular/mL enquanto se mantinha uma proporção em peso de polissacarídeo capsular:PDPH:EDAC de 1:5:3 para polissacarídeo capsular de sorotipo 5. Essa mistura foi incubada durante 1 hora em temperatura ambiente e, então, submetida à diálise contra um volume de 1000X de H2O destilada quatro vezes usando um dispositivo de diálise com MWCO de 3500 em entre 4o e 8°C para remover o PDPH não reagido. O polissacarídeo PDPH-ligado foi feito em DTT a 0,2 M e incubado em temperatura ambiente durante 3 horas ou durante a noite em entre 4 e 8°C. DTT em excesso, bem como os subprodutos da reação, foram separados do sacarídeo ativado a- través de SEC usando resina Sephadex G25 e água destilada como a fase móvel. Frações foram ensaiadas através do ensaio DTDP para grupos tiol e frações tiol-positivas que eluíram próximo do volume vazio da coluna foram agrupadas. O grupo de frações foi ensaiado por meio dos ensaios de PAH- BAH e O-acetila para determinar o grau de ativação, o qual é expresso como um percentual molar das unidades de repetição contendo um grupo tiol (concentração molar de tióis/concentração molar de unidades de repetição). O polissacarídeo ativado foi liofilizado e armazenado a -25°C até necessário para conjugação.
Os resultados de reprodutibilidade de tiolação do polissacarídeo de sorotipo 5 com PDPH são mostrados na Tabela 15. O grau de ativação de polissacarídeo de sorotipo 5 estava na faixa de 11% a 19%, o qual corresponde a aproximadamente uma molécula ligante presa por dez unidades repetidas do polissacarídeo capsular a uma molécula ligante por cinco unidades repetidas. Tabela 15: Ativação de polissacarídeo capsular de de sorotipo 5 com PDPH- Estudo de reprodutibilidade
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2. Ativação de Proteína Veículo:
Separadamente, a proteína veículo foi ativada por meio de bro- moacetilação. CRM197 foi diluída para 5 mg/mL com NaCt a 0,9% tamponado com fosfato a 10 mM, pH de 7 (PBS) e, então, com NaHCO3 a 0,1 M, pH de 7,0, usando solução de estoque a 1 M. O N-hidróxi-succinimida éster de ácido bromoacético (BAANS) foi adicionado em uma proporção de CRM197:BAANS de 1:0,25 (peso:peso) usando uma solução de estoque de BAANS em 20 mg/mL de DMSO. Essa mistura de reação foi incubada a entre 4 e 8°C durante 1 hora, então, purificada usando SEC sobre Sephadex G-25. A CRM i97 ativada purificada foi avaliada por meio do ensaio de Lowry para determinar a concentração de proteína e, então, diluída com PBS para 5 mg/mL. Sacarose foi adicionada a 5% peso/vol como um crioprotetor e a proteína ativada foi congelada e armazenada a -25°C até necessária para conjugação.
Bromoacetilação de resíduos de lisina de CRM197 foi muito con-sistente, resultando na ativação de 19 a 25 lisinas das 39 lisinas disponíveis (vide Tabela 16). A reação produziu altos rendimentos de proteína ativada. Tabela 16: Rendimentos e grau de bromoacetilação de CRMi97
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3. Reação de Acoplamento:
Uma vez que o polissacarídeo capsular ativado e proteína veículo ativada foram preparados, os dois foram combinados em uma reação de conjugação. O polissacarídeo liofilizado e tiolado foi dissolvido em borato a 0,16 M, pH de 8,95, misturado com CRM197 bromoacetilada descongelada e água destilada para fazer uma solução final de borato a 0,1 M, proporção em peso de 1:1 de CRM197:polissacarídeo e 1 mg/mL de polissacarídeo. Essa mistura foi incubada em temperatura ambiente durante entre 16 e 24 horas. Grupos bromoacetila não reagidos sobre a proteína foram revestidos mediante a adição de cloridrato de cisteamina em uma proporção de CRMi97:cisteamina de 1:2 (peso/peso) usando uma solução de estoque a 135 mg/mL de cisteamina dissolvida em borato a 0,1 M, pH de 8,95 e incubada durante 4 horas em temperatura ambiente. O conjugado de polissacarídeo capsular-CRM197 (conjugado) foi purificado por meio de diafiltração 50 vezes contra NaCI a 0,9% usando um ultrafiltro de poliéter sulfona de 100K.
Os resultados da reprodutibilidade de estudos de tiolação de po-lissacarídeo capsular de S. aureus de sorotipo 5 com PDPH demonstraram que o grau de ativação do polissacarídeo estava na faixa de 11 a 19%, o qual corresponde a aproximadamente uma molécula ligante presa por dez unidades de repetição do polissacarídeo a uma molécula ligante por cinco unidades de repetição.
Conjugação de polissacarídeo capsular de sorotipo 5 a CRMi97 através de Química de Conjugação CDT
CDT proporciona um processo de conjugação em uma etapa onde o polissacarídeo é ativado em um ambiente anidro (DMSO) para formar porções de carbamato de triazol com hidroxilas disponíveis e porções acilimidazol ou aciltriazol com ácidos carboxílicos. A adição de uma proteína veículo (em DMSO) leva ao deslocamento nucleofílico da triazol pela lisina e formação de uma ligação de carbamato (para hidroxilas ativadas) e uma ligação de amida (para ácidos carboxílicos ativados). A solução de reação é diluída 10 vezes em uma solução aquosa no preparo para purificação por meio de filtração de fluxo tangencial.
Química de conjugação com CDT produziu polissacarídeo capsular de S. aureus de sorotipo 5 covalentemente ligado à proteína veículo, o qual foi indicado pela presença do sacarídeo e proteína nas frações de cro- matografia por exclusão de tamanho e análise de aminoácido do conjugado "revestido" com glicolaldeído ou cloridrato de cisteamina.
Um sumário dos resultados do preparo de vários lotes de conju-gados preparados através de químicas PDPH e CDI/CDT para o polissacarídeo capsular de S. aureus de sorotipo 5 com um tamanho de polissacarídeo na faixa de 20 a 40 kDa é mostrado na Tabela 17 abaixo. Não houve diferença significativa no polissacarídeo capsular livre, proporção de polissaca- rídeo:proteína e rendimentos de conjugados gerados através desses dois métodos de conjugação. A antigenicidade do polissacarídeo capsular de S. aureus de sorotipo 5 conjugado não foi alterada pela conjugação, conforme mostrado pela linha de identidade de precipitina entre os conjugados e o CP nativo.Tabela 17: Caracterização de polissacarídeo capsular de sorotipo 5-CRMiq7
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ND = não detectado
Conforme mostrado acima, os métodos descritos aqui podem ser usados para produzir faixas específicas de polissacarídeos capsulares de alto peso molecular desejados. Nós tentamos preparar conjugados a partir de uma faixa pré-selecionada de alto peso molecular que poderia ser polissacarídeo capsular de sorotipo 5 filtrado e purificado para uso em composições imunogênicas. A Tabela 18 resume a análise dos conjugados de polissacarídeo capsular de sorotipo 5 onde o polissacarídeo capsular de sorotipo 5 oscilava, quanto ao peso molecular, de cerca de 92 kDa a 119 kDa e foram ativados com triazol (CDT). Os pesos moleculares dos conjugados oscilavam de 1533 kDa a 2656 kDa. O número de lisinas conjugadas por CRM 197 oscilava de um máximo de 22 a um mínimo de 15. O polissacarídeo capsular livre oscilava de um máximo de 18% a um mínimo de 11%.Tabela 18: Conjugados com faixa pré-selecionada de peso molecular de po-lissacarídeo capsular de sorotipo 5
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Ambas as químicas de conjugação produzem polissacarídeo de sorotipo 5 covalentemente ligado à proteína veículo. Não houve diferença significativa no polissacarídeo capsular livre, proporção de polissacarídeo capsular de sorotipo 5:proteína e rendimentos de conjugados gerados através desses dois métodos.
Exemplo 11: Processo com CDT complexo versus um recipiente
Conforme descrito acima, métodos para produção dos conjugados imunogênicos da invenção envolvem conjugação covalente dos polissacarídeos capsulares com as proteínas veículos usando química de conjugação envolvendo CDT (1,1-carbonil-di-1,2,4-triazol) ou PDPH (3-(2-piridilditio)- propionil hidrazida). Uso de CDT resultou em um ligante com um carbono ou zero carbono entre o polissacarídeo capsular e a proteína veículo, enquanto que uso de PDPH resulta em um ligante com cinco carbonos contendo uma ligação covalente de tioéter entre o polissacarídeo capsular e a proteína veículo.
O método baseado em PDPH foi um processo com múltiplas e- tapas que envolvem ativação do polissacarídeo, remoção do grupo de proteção tiol, purificação do intermediário polissacarídico ativado, ativação e purificação da proteína veículo e conjugação dos componentes ativados, seguido por purificação. Nesse método, polissacarídeo capsular de S. aureus de sorotipo 5 foi reagido com PDPH e uma carbodi-imida em um solvente orgânico, tal como DMSO, para produzir polissacarídeo PDPH-ligados. Os polissacarídeos PDPH-ligados foram reagidos com um agente de redução para produzir polissacarídeos ativados que foram, então, purificados. As proteínas veículos foram reagidas com ácido bromoacético em um solvente orgânico para produzir proteínas veículos ativadas que foram, então, purificadas. Os polissacarídeos de sorotipo 5 ativados purificados foram, então, reagidos com as proteínas veículos ativadas purificadas para produzir conjugados de polissacarídeo de sorotipo 5:proteína veículo.
Em contraste, os métodos baseados em CDT foram processos de conjugação em uma etapa, nos quais o polissacarídeo capsular foi ativado em um ambiente anidro (isto é, DMSO) para formar porções de carbama- to de triazol com hidroxila e porções acilimidazol ou aciltriazol disponíveis com ácidos carboxílicos. Adição da proteína veículo (em DMSO) levou a um deslocamento nucleofílico da imidazol ou triazol pela lisina e formação de uma ligação de carbamato (para hidroxilas ativadas) e ligação de amida (para ácidos carboxílicos ativados), desse modo, permitindo que a conjugação se processasse em um recipiente. Consequentemente, dois métodos baseados em CDT foram desenvolvidos: um processo mais complexo e um processo em um-recipiente mais simples. No processo mais complexo, polissacarídeos capsulares de S. aureus de sorotipo 5 foram compostos com imidazol ou triazol em então, reagidos com CDT em um solvente orgânico (tal como DMSO) e cerca de 0,2% peso/v de água para produzir polissacarídeos de sorotipo 5 ativados. Os polissacarídeos de sorotipo 5 ativados foram puri- ficados e, então, reagidos com proteínas veículos no solvente orgânico para produzir conjugados de polissacarídeo de sorotipo 5:proteína veículo. O pro-cesso em um-recipiente foi similar ao processo complexo, exceto que os po-lissacarídeos de sorotipo 5 ativados não foram purificados antes da reação com proteínas veículos.
Processo Complexo com CDT Ativação de polissacarídeo capsular de sorotipo 5:
Polissacarídeo capsular de sorotipo 5 foi misturado com 10 g de triazol/g de polissacarídeo capsular de sorotipo 5 e liofilizado. O bolo resultante foi dissolvido em DMSO a 2,0 mg de polissacarídeo capsular de sorotipo 5/mL. O teor de água foi determinado e ajustado para 0,2%. Uma solução de estoque recentemente preparada de CDT a 100 mg/mL em DMSO foi adicionada para obter uma quantidade em excesso molar de 20 vezes de CDT comparado com a quantidade de CP5. Alternativamente, a quantidade de CDT adicionada pode ser ajustada para obter um grau maior ou menor de ativação. Essa foi mantida 30 minutos a 23 °C.
Purificação de polissacarídeo capsular de sorotipo 5 ativado:
A solução de polissacarídeo capsular de sorotipo 5 ativada (ACP5) foi entornada em 25 volumes de água para destruir o CDT em excesso. Esse foi concentrado para seu volume original sobre uma membrana de PES de 10 kDa a aproximadamente 1 mg/cm2 e diafiltrado contra água para pelo menos 10 volumes. Essa etapa foi terminada em menos de 4 horas. O material diafiltrado foi misturado com 10 g de triazol/g de polissacarídeo capsular de sorotipo 5 original e liofilizada.
Preparo de CRM liofilizado:
CRM foi diafiltrado contra NaCI a 0,4%/5% de sacarose em um volume constante sobre uma membrana de PES de 10 kDa para pelo menos 10 volumes. A concentração de proteína foi determinada e tampão de diafiltração suficiente foi adicionado para levar a concentração de proteína para 5,0 g/L, assim, proporcionando uma proporção peso/peso de NaCI/CRM = 0,8. O CRM foi liofilizado.
Conjugação:
Polissacarídeo de sorotipo 5 ativado, diafiltrado foi dissolvido em DMSO a 1 mg/mL. Solução de borato a 100 mM foi adicionada para obter 2% em v/v.
O CRM foi ressuspenso a 2 mg/mL e, quando dissolução estava completa, combinado com a solução de ACP5. Essa foi deixada reagir a 4 °C durante 20 horas.
A reação do conjugado foi entornada em 24 volumes de borato a 5 mM, pH de 9,0 e deixada agitar em temperatura ambiente durante 1 hora. Ela foi, então, ajustada para um pH de 7,5 com tampão de fosfato a 0,5 M, pH de 6,5. Essa foi filtrada através de um filtro de 5 microns e concentrada para o volume original sobre uma membrana de PES de 300 kDa em uma carga de ~ 1 mg/cm2 e diafiltrada contra pelo menos 10 volumes de água. O concentrado resultante foi filtrado através de um filtro de 0,22 microns e armazenado a 2°C-8°C.
Processo com CDT em Um-Recipiente Troca de Matriz de CRM197:
CRM197 foi diafiltrada para permuta da matriz densa de aproxi-madamente fosfato a 10 mM/NaCI a 80 mM/15% de sacarose, pH de 7 para imidazol a 5 mM/NaCI a 0,72 %/octil-β-D-glucopiranosideo a 15 mM, pH de 7. A permuta permitiu a remoção de fosfato e sacarose, os quais são prejudiciais para a conjugação e definem a teor de cloreto de sódio transportado na conjugação. Octil-β-D-glucopiranosideo é adicionado para impedir a formação de partícula após filtração estéril.
A matriz de CRM197 foi permutada através de filtração de fluxo tangencial contra imidazol a 5 mM/NaCI a 0,72%/octil-β-D-glucopiranosideo a 15 mM, pH de 7 através de 10 diavolumes usando membranas de PES de 10K em uma concentração de retentado de aproximadamente 4 mg/mL. Estímulo típico da membrana foi 2 gramas/pé2 e a concentração alvo final de CRM197 na matriz foi de 6 mg/mL. A CRM197 foi armazenada a 2°C-8°C.
Ativação/Conjuqação:
O processo de ativação/conjugação para polissacarídeo capsular de S. aureus de sorotipo 5 consistia das seguintes etapas: 1) Composi- ção do polissacarídeo; 2) Congelamento e liofilização da CRM-I97 e polissacarídeo composto; 3) Dissolução do polissacarídeo e CRM197 liofilizados; 4) Ativação do polissacarídeo; 5) Conjugação do polissacarídeo ativado à CRM197; e 6) Purificação do conjugado (diluição, diafiltração, filtração estéril).
O polissacarídeo foi composto com 10 gramas de excipiente 1,2,4- triazol por grama de polissacarídeo. O excipiente foi adicionado como um pó ao polissacarídeo, com uma solução obtida após menos de 15 minutos de mistura em temperatura ambiente.
O polissacarídeo composto e CRMI97 foram congelados separa-damente usando um banho de etanol a -75°C. O volume por garrafa de 1L era de aproximadamente 500 ml_.
Para dissolução do polissacarídeo, DMSO foi adicionado à garrafas de liofilização individuais com o polissacarídeo para obter uma suspensão e, então, transferidas para um recipiente de reação de ativa- ção/conjugação para aquecimento. DMSO foi adicionado para obter uma concentração de 2 g/L. Uma solução clara foi obtida após 5-10 minutos de mistura.
Para dissolução de CRM197, DMSO foi adicionado à garrafas de liofilização individuais contendo CRMI97 para obter uma suspensão e, então, transferida para um segundo recipiente para mistura. DMSO foi adicionado para obter uma concentração de 2 g/L. Uma solução clara foi, tipicamente, obtida em menos de 15 minutos.
A solução de polissacarídeo/DMSO foi coletada para análise de Karl Fischer a fim de determinar o teor de umidade. CDT foi preparado como uma solução a 100 mg/mL em DMSO e foi adicionado em um excesso molar de 5 vezes ao polissacarídeo do tipo 5 (o processo complexo usou 20 equivalentes molares de CDT, enquanto que o processo em um-recipiente usou 5 equivalentes molares de CDT:CP5). Adição contínua da solução de CDT foi realizada durante cerca de 5 minutos a 23°C + 2°C com mistura. A reação foi deixada processar durante um mínimo de 30 minutos a 23°C ± 2°C. A reação foi coletada para determinar o nível de ativação (UV a 220/205 nm) e, então, borato de sódio a 100 mM, pH de 9, foi adicionado para obter uma solução aquosa a 1,5%. A solução de reação foi, então, agitada durante um mínimo de 30 minutos a 23°C + 2°C.
Para conjugação do polissacarídeo ativado a CRM197, DMSO foi adicionado para atingir uma concentração de reação de 0,8 mg/mL A CRM 197 dissolvida em DMSO foi, então, adicionada à solução de polissacarídeo ativada com mistura. A reação foi agitada durante um mínimo de 4 horas a 23°C + 2°C.
A solução de reação foi diluída 10X mediante sua adição em te- traborato de sódio a 5 mM, pH de 9 com mistura para hidrolisar os grupos de ativação residuais. A solução diluída foi passada através de um filtro de 5 μm e concentrada para uma concentração alvo de retentado de 2 g/L. Filtração de fluxo tangencial foi realizada usando membranas de celulose regeneradas de 300K através de 20 diavolumes com succinato a 5 mM, pH de 7. Estímulo típico na membrana foi 1 grama/pé2. O conjugado purificado foi passado através de um filtro de 0,22 microns e armazenado a 2°C-8°C.
Exemplo 12: Conjugação de polissacarídeo capsular de sorotipo 5 usando processos de conjugação em um recipiente e complexo
Esse exemplo demonstra que uma faixa pré-selecionada de pesos moleculares de polissacarídeos capsulares pode ser usada para conjugação em um processo em um recipiente ou complexo. Os polissacarídeos maiores são inicialmente produzidos pelas células bacterianas e a faixa de peso molecular resultante purificada pode ser controlada pelo pH e calor do processo de hidrólise no Exemplo 9. Nesse exemplo, oito lotes, onde o polissacarídeo capsular de sorotipo 5 oscilava, quanto ao peso molecular, de cerca de 90 kDa a cerca de 140 kDa, foram selecionados e conjugação foi realizada usando ativação com triazol (CDT) nos processos em um recipiente ou complexo descritos acima. Vide Tabela 19. Os pesos moleculares dos conjugados resultados oscilavam de 1125 kDa a 2656 kDa. O número de lisinas conjugadas por CRM oscilava de um máximo de 22 a um mínimo de 15. O açúcar livre oscilava de um máximo de 23% a um mínimo de 11%.Tabela 19: Conjugados de polissacarídeo capsular de sorotipo 5 preparados com polissacarídeos capsulares de 90 kPa a 140 kDa
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Exemplo 13: Conjugados de polissacarídeo capsular de sorotipo 5 exibem consistentemente proteção no modelo de pielonefrite em murinos
Conjugados de polissacarídeo capsular de sorotipo 5 foram ava-liados com relação à sua capacidade de proteger os camundongos em um modelo de pielonefrite. As contagens bacterianas no sangue de camundon-gos que receberam estímulo com S. aureus i.p. foram significativamente re-duzidas quando comparado com controles imunizados com PBS.
Todos os seis estudos individuais mostraram uma redução signi-ficativa na cfu/ml de rim em animais imunizados (figura 9). Quando esses estudos foram agrupados para meta análise, a significância global para os estudos como um todo aumentou para abaixo de 0,0001. Os dados mostra-ram redução consistente de colonização renal após vacinações ativas com o conjugado de polissacarídeo capsular.
Exemplo 14: Conjugados de polissacarídeo capsular de sorotipo 5 prepara-dos através de diferentes químicas de conjugação protegem os camundon-gos contra infecções experimentais
Estudos de imunização ativa no modelo de pielonefrite em muri-nos foram conduzidos com conjugados de polissacarídeo capsular de sorotipo 5 preparados através de química com PDPH ou CDT. Os métodos para conjugação de polissacarídeos capsulares à CRM197 são descritos acima. Os resultados mostraram que ambos os conjugados reduzem a colonização em camundongos, comparado com os animais simuladamente imunizados (Tabela 20). Tabela 20: Efeito de conjugação com PDPH versus CDT sobre a proteção contra estímulo com S. aureus no modelo de pielonefrite Significância
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Exemplo 15: Imunização ativa de conjugado de polissacarídeo capsular de sorotipo 5 protege ratos em um modelo de endocardite em ratos
Quatro estudos foram conduzidos com conjugado de CP5-CRM197 PDPH. Os conjugados de polissacarídeo capsular de sorotipo 5 re-duziram significativamente a CFU recuperada após estímulo com S. aureus PFESA0266 no coração e rins em 2 de 3 experimentos (Tabela 21). No ter-ceiro estudo, a titulação de anti-CP5, Titulação Média Geométrica (Geome- trie Mean Titer - GMT), foi a menor dos três experimentos, mas apenas ligei-ramente menor do que no experimento anterior.Tabela 21: Imunização com polissacarídeo capsular de sorotipo 5-CRMI97 reduz a CFU em um modelo de endocardite em ratos
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Exemplo 16: Imunoqenicidade intensificada de vacinas de conjugado de CP5 de HMW em camundongos comparada com vacinas de conjugado de CP5 de LMW
Um estudo de pielonefrite em murinos foi conduzido para avaliar a imunogenicidade e eficácia de diferentes formulações de conjugado de CP5. Duas formulações foram testadas: a primeira formulação era composta de um CP5 de alto peso molecular (HMW) (aproximadamente 300 kDa) con-jugado à CRM197. A segunda formulação continha um CP5 de baixo peso molecular (LMW) (aproximadamente 25 kDa) conjugado à CRM197. Três níveis de dose foram testados para a vacina de HMW (1, 0,1 e 0,01 mcg). A vacina de LMW foi testada a 1 mcg. Um grupo de controle negativo também foi incluído, composto de uma vacina de conjugado polissacarídico derivado de Streptococcus pneumoniae conjugado à CRMI97 (PP5). Polissacarídeos foram formulados com 22 mcg de AIPO4 nas semanas 0, 3 e 6 e estimuladas com S. aureus PFESA0266 na semana 8. Os rins foram colhidos e colônias bacterianas enumeradas 48 horas após estímulo. Ambas as vacinas foram eficazes na geração de uma resposta imune e uma redução nas CFUs de S. aureus PFESA0266 foi observada nos rins de camundongos vacinados com os grupos de 1 μg de vacinas de HMW e LMW. Essa foi dependente da do-sagem, conforme demonstrado por eficácia reduzida pelas menores dosa-gens de vacina (figura 10). A leitura de CFU não foi sensível o bastante para detectar uma diferença na eficácia para as vacinas de HMW e LMW. Soros dos camundongos foram, portanto, testados pela OPA. As titulações de OPA foram definidas como a diluição de soro requerida para matar 40% da cepa PFESA0266 de S. aureus em um ensaio OPA. Titulações de OPA intensifi- cadas foram observadas para a vacina de HMW comparado com a formula-ção de LMW (figura 11).
Exemplo 17: Conjugados de polissacarídeo capsular compreendendo polis- sacarideos de alto peso molecular mostram imunoqenicidade intensificada comparada com conjugados compreendendo polissacarídeos de baixo peso molecular
Estudos com primatas não humanos (NHP) foram conduzidos para avaliar a imunogenicidade de diferentes formulações de conjugado capsular. Duas formulações foram testadas em dois níveis de dosagem diferentes (2 e 20 μg). A primeira formulação continha um polissacarídeo de alto peso molecular (HMW) (aproximadamente 130 kDa) conjugado à CRM197. A segunda formulação continha um polissacarídeo de baixo peso molecular (LMW) (aproximadamente 25 kDa) conjugado a CRM197. Grupos de cinco primatas foram vacinados com uma única dose de qualquer vacina e as titulações imunes foram monitoradas antes de vacinação e duas semanas pós- vacinação. As titulações de OPA foram definidas como a diluição de soro requerida para matar 40% da cepa PFESA0266 de S. aureus em um ensaio OPA. As titulações de anticorpo foram também monitoradas por meio de E- LISA. Atividade intensificada foi observada para a vacina de HMW comparado com a formulação de LMW (Tabela 22), evidenciado por uma elevação de dez vezes nas titulações de anticorpo para a vacina de HMW comparado com a vacina de LMW. A taxa de respondedor OPA para os NHPs que receberam a vacina de HMW também foi maior (80% comparado com 40%).Tabela 22. Imunogenicidade intensificada é observada para vacinas de conjugado de polissacarídeo de HMW comparado com vacina de conjugado de polissacarídeo de LMW
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Exemplo 18: O-acetilação de polissacarídeo é importante para indução de respostas de anticorpo protetor ao conjugado de polissacarídeo capsular de sorotipo 5
Para avaliar a importância de O-acetilação de polissacarídeo 5 capsular de sorotipo 5, o polissacarídeo capsular nativo foi de-O-acetilado (dOAc) e conjugado à CRMI97 (dOAc-CRM197) usando química de conjugação com PDPH, conforme discutido acima. A eficácia do conjugado dO- ACCP-CRM197 foi comparada lado a lado com CP5-CRM197 em um modelo de pielonefrite em murinos.
Imunização com conjugados carecendo de grupos O-acetila (dOAc CP5-CRM) falhou em reduzir a CFU bacteriana recuperada nos rins. Esses dados (Tabela 23) indicam que O-acetilação é importante para esti-mulação de anticorpos funcionais contra CP5.Tabela 23: Imunização com conjugados de polissacarídeo capsular de soro- 15 tipo 5 de-O-acetilados não protege os camundongos contra colonização re- nal
Figure img0026
Exemplo 19: Confirmação da importância de O-acetilação como epitopo funcional de polissacarídeo capsular de sorotipo 5 por OPA usando anticorpos monoclonais com especificidades conhecidas
Anticorpos monoclonais ao polissacarídeo capsular de sorotipo 5 com especificidades por OAc+ (CP5-7-1), OAc+Z- (CP5-5-1) e OAc- (CP5-6- 1) foram avaliados com relação à atividade de morte OP contra a cepa PFE- SA0266 do tipo 5 (Tabela 24). Anticorpos monoclonais ao polissacarídeo capsular de sorotipo 8 (CP8-3-1 específico ao CP8 OAc+) foram usados como controle negativo.
A morte mediada pelo mAb anti-CP5 CP5-7-1 OAc-específico de S. aureus PFESA0266 (Tabela 24). Também, o anticorpo monoclonal CP5- 5-1, o qual reconhece epitopos compartilhados por CP5 OAc+ e CP5 OAc-, mediou a morte da cepa PFESA0266. O anticorpo monoclonal específico para epitopos presentes sobre o polissacarídeo capsular de sorotipo 5 OAc- não media a morte da cepa PFESA0266. Esses resultados indicam que epitopos de O-Acetila sobre o polissacarídeo capsular de sorotipo 5 são necessários para estimular a atividade funcional de anticorpos específicos ao sorotipo 5.
Anticorpos precisam ser funcionais, conforme medido pela morte de bactérias em um modelo de eficácia com animais ou um ensaio de morte opsonofagocítica que demonstra que os anticorpos matam as bactérias. Morte funcional pode não ser demonstrada usando um ensaio que monitora a geração de anticorpos isoladamente, o que não é indicativo da importância de O-acetilação sobre a eficácia.Tabela 24: Anticorpos monoclonais específicos ao polissacarídeo capsular de sorotipo 5 O-Acetilado (+) e polissacarídeo capsular de sorotipo 5 O- e de-O-Acetilado (+/-) são opsônicos contra S. aureus PFESA0266 (Tipo 5).
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Exemplo 20: Imunoqenicidade intensificada é observada para conjugados de CP5 compostos de polissacarídeos de alto peso molecular comparada com polissacarídeos de baixo peso molecular em primatas não humanos (Non Human Primates - NHP)
Estudos com primatas não humanos (NHP) foram conduzidos para avaliar a imunogenicidade de diferentes formulações de conjugado capsular. Duas formulações foram testadas em dois níveis de dosagem diferentes (2 e 20 μg). A primeira formulação era composta de um polissacarídeo de alto peso molecular (HMW) (aproximadamente 130 kDa) conjugado à CRM197. A segunda formulação continha um polissacarídeo de baixo peso molecular (LMW) (aproximadamente 25 kDa) conjugado à CRM197. Grupos de cinco primatas foram vacinados com uma única dose de qualquer vacina e as titulações imunes foram monitoradas antes de vacinação e duas semanas pós-vacinação. As titulações de OPA foram definidas como a diluição de soro requerida para matar 40% da cepa PFESA0266 de S. aureus em um ensaio de OPA. As titulações de anticorpo foram também monitoradas por meio de ELISA. Atividade intensificada foi observada para a vacina de HMW comparado com a formulação de LMW (Tabela 25). Houve uma elevação de três a dez vezes nas titulações de anticorpo para a vacina de HMW comparado com a vacina de LMW. A taxa de respondedor OPA para os NHPs que receberam a vacina de HMW também foi maior (80% comparado com 40%). Tabela 25: Imunogenicidade intensificada é observada para vacinas de conjugado polissacarídico de HMW comparada com vacina de conjugado polis- sacarídico de LMW
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SUMÁRIO
Ambas as químicas de conjugação, descritas aqui, produziram polissacarídeo capsular de sorotipo 5 covalentemente ligado à proteína veículo CRM197. Não houve diferenças significativas no sacarídeo livre, propor- 5 ção de polissacarídeo de sorotipo 5:proteína e rendimentos de conjugados gerados através desses dois métodos.
Todas as publicações e pedidos de patente mencionados no relatório descritivo são indicativos do nível daqueles versados na técnica ao qual a presente invenção pertence. Todas as publicações e pedidos de pa- 10 tente são aqui incorporados por referência até o mesmo ponto como se cada publicação ou pedido de patente individual fosse específica e individualmente indicado como sendo incorporado por referência.
Embora a invenção precedente tenha sido descrita em alguns detalhes à guisa de ilustração e exemplo para fins de clareza de compreen- 15 são, determinadas alterações e modificações podem ser praticadas dentro do escopo das reivindicações em anexo.

Claims (26)

1. Conjugado imunogênico de polissacarídeo-proteína, caracterizado pelo fato de que compreende um polissacarídeo capsular de Staphylococcus aureus isolado conjugado a uma proteína veículo, em que o polissacarídeo tem um peso molecular entre 70 kDa e 300 kDa, em que o conjugado tem um peso molecular na faixa de entre 600 kDa e 2800 kDa, e em que conjugado compreende um ligante com um carbono ou zero carbono entre o polissacarídeo e a proteína veículo.
2. Conjugado imunogênico de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o conjugado imunogênico tem um peso molecular de entre 595 kDa e 1708 kDa.
3. Conjugado imunogênico de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o polissacarídeo tem um peso molecular entre 70 kDa e 150 kDa.
4. Conjugado imunogênico de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende um polissacarídeo capsular de Staphylococcus aureus isolado conjugado a uma proteína veículo, em que o polissacarídeo tem um peso molecular entre 70 kDa e 300 kDa, em que o conjugado tem um peso molecular na faixa de entre 500 kDa e 2500 kDa, e em que conjugado compreende um ligante com um carbono ou zero carbono entre o polissacarídeo e a proteína veículo.
5. Conjugado imunogênico de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o polissacarídeo tem um grau de O-acetilação entre 10 a 100%.
6. Conjugado imunogênico de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que o polissacarídeo tem um grau de O-acetilação entre 50 a 100%.
7. Conjugado imunogênico de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que o polissacarídeo tem um grau de O-acetilação entre 75 a 100%.
8. Conjugado imunogênico de acordo com A reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a proteína veículo é CRM197.
9. Conjugado imunogênico de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que a CRM197 é covalentemente ligada ao polissacarídeo através de uma ligação de carbamato, uma ligação de amida ou ambas.
10. Conjugado imunogênico de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que a proporção molar de lisinas conjugadas a CRM197 é 10:1 a 25:1.
11. Conjugado imunogênico de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que pelo menos uma ligação covalente entre a CRM 197 e o polissacarídeo ocorre pelo menos a cada 5 a 10 unidades sacarídicas repetidas do polissacarídeo.
12. Conjugado imunogênico de acordo com a reivindicação 11, caracterizado pelo fato de que pelo menos uma ligação covalente entre a CRM 197 e o polissacarídeo ocorre a cada 5 unidades sacarídicas repetidas do polissacarídeo.
13. Conjugado imunogênico de acordo com a reivindicação 9, caracterizado pelo fato de que a CRM197 compreende 5 a 23 lisinas covalentemente ligadas ao polissacarídeo.
14. Conjugado imunogênico de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que a CRM197 compreende 5 a 15 lisinas covalentemente ligadas ao polissacarídeo.
15. Composição imunogênica, caracterizada pelo fato de que compreende um conjugado imunogênico, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 14, e pelo menos um dentre um adjuvante, diluente ou veículo.
16. Conjugado imunogênico de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o polissacarídeo capsular é um polissacarídeo capsular sorotipo 5 ou sorotipo 8.
17. Conjugado imunogênico de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que compreende um polissacarídeo capsular isolado de Staphylococcus aureus conjugado com uma proteína veículo, em que o polissacarídeo tem um peso molecular entre 70 kDa e 300 kDa, em que o conjugado tem uma faixa de peso molecular entre 1600 kDa e 3000 kDa, e em que o conjugado compreende um ligante de um carbono ou carbono zero entre o polissacarídeo e a proteína veículo.
18. Conjugado imunogênico de acordo com a reivindicação 13, caracterizado pelo fato de que o CRM197 compreende 18 a 22 lisinas ligadas covalentemente ao polissacarídeo.
19. Conjugado imunogênico de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o conjugado possui uma faixa de peso molecular entre 1533 kDa e 2656 kDa.
20. Conjugado imunogênico de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o conjugado tem uma faixa de peso molecular entre 1300 kDa e 2600 kDa.
21. Composição imunogênica de acordo com a reivindicação 15, caracterizada pelo fato de que o polissacarídeo capsular é um polissacarídeo capsular sorotipo 5 ou sorotipo 8.
22. Composição imunogênica de acordo com a reivindicação 21, caracterizada pelo fato de que a composição compreende menos de 30% de polissacarídeo sorotipo 5 ou sorotipo 8 livre em comparação com a quantidade total de polissacarídeo sorotipo 5 ou sorotipo 8.
23. Composição imunogênica de acordo com a reivindicação 24, caracterizada pelo fato de que a composição compreende menos de 20% de polissacarídeo sorotipo 5 ou sorotipo 8 livre em comparação com a quantidade total de polissacarídeo sorotipo 5 ou sorotipo 8.
24. Uso de um conjugado imunogênico, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 14, caracterizado pelo fato de ser na preparação de uma composição imunogênica para induzir uma resposta imune contra Staphylococcus aureus em um indivíduo.
25. Uso de um conjugado imunogênico, como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 14, caracterizado pelo fato de ser na preparação de uma composição imunogênica para reduzir uma infecção, doença ou condição estafilocócica associada a uma bactéria Staphylococcus em um indivíduo.
26. Uso de acordo com a reivindicação 25, caracterizado pelo fato de que a infecção, doença ou condição é selecionada do grupo que consiste em doença de Staphylococcus aureus invasiva, sépsis e transporte.
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