BRPI1012141B1 - conjugado de sirna e método de preparação do mesmo - Google Patents
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Abstract
conjugado de sirma e método de preparação do mesmo. são providos um conjugado de sirna-polímero e um método para preparação do mesmo e mais especificamente, um conjugado híbrido formado por ligação covalente de sirna e um composto polimérico para aperfeiçoar a estabilidade in vivo de sirna e um método de preparação do conjugado híbrido. o conjugado da presente invenção pode aperfeiçoar a estabilidade in vivo de sirna, pelo que, obtendo uma liberação eficiente de sirna terapêutico nas células e exibindo a atividade de sirna mesmo com uma dose pequena de uma concentração relativa baixa. portanto, o conjugado pode ser usado vantajosamente não apenas como uma ferramenta para tratamento com sirna dos cânceres e outras doenças infecciosas, porém também um novo tipo de sistema de liberação de sirna.
Description
CONJUGADO DE SIRNA E MÉTODO
DE PREPARAÇÃO DO MESMO
CAMPO TÉCNICO [001] A presente invenção se refere a um conjugado no qual um composto polimérico para aperfeiçoamento da liberação de siRNA útil na terapia gênica de cânceres e outras doenças infecciosas é conjugado ao siRNA pelo emprego de uma ligação degradável ou não degradável, um método para preparação do conjugado e um método para liberação de siRNA utilizando o conjugado.
HISTÓRICO DA TÉCNICA [002] O RNA de interferência se refere a um mecanismo, que se constitui no silenciamento pós-transcricional do gene iniciado por um RNA de filamento duplo (dsRNA) através de uma sequência nucleotídica, de modo específico em um processo de expressão gênica, este mecanismo tendo sido observado primeiro em C. elegans, sendo geralmente encontrado em plantas, moscas de frutas e vertebrados (Fire e outros, Nature, 391:806-811, 1998; Novina & Sharp, Nature, 430:161-164, 2004). Sabe-se que a interferência do RNA ocorre de tal modo que o dsRNA de 19-25 bp que entra na célula é ligado a um RISC (complexo de silenciameno induzido por RNA) e apenas uma fita antissenso (guia) está ligada ao mRNA, tal que, a mesma é complementar à sequência nucleotídica de mRNA, pelo que degradando mRNA alvo por domínios de endonuclease existentes no RISC
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2/59 (Rana, T.M., Nat. Rev. Mol.Cell Biol., 8:23-36, 2007;
Tomari, Y. e Zamore, P.D., Genes Dev., 19: 517-529, 2005).
[003] O RNA de interferência se refere a um mecanismo, que se constitui no silenciamento pós-transcricional do gene iniciado por um RNA de filamento duplo (dsRNA) através de uma sequência nucleotídica, de modo específico em um processo de expressão gênica, este mecanismo tendo sido observado primeiro em C. elegans, sendo geralmente encontrado em plantas, moscas de frutas e vertebrados (Fire e outros, Nature, 391:806-811, 1998; Novina & Sharp, Nature, 430:161-164, 2004). Sabe-se que a interferência do RNA ocorre de tal modo que o dsRNA de 19-25 bp que entra na célula é ligado a um RISC (complexo de silenciameno induzido por RNA) e apenas uma fita antissenso (guia) está ligada ao mRNA, tal que, a mesma é complementar à sequência nucleotídica de mRNA, pelo que degradando mRNA alvo por domínios de endonuclease existentes no RISC (Rana, T.M., Nat. Rev. Mol.Cell Biol., 8:23-36, 2007; Tomari, Y. e Zamore, P.D., Genes Dev., 19: 517-529, 2005).
[004] Quando o dsRNA é liberado para o interior da célula, ele está especificamente ligado a uma sequência mRNA alvo e desta forma, é considerado como uma nova ferramenta capaz de regular a expressão gênica. Entretanto, no caso dos seres humanos, foi difícil a obtenção do efeito RNAi devido à indução de uma via de interferon antiviral na introdução de dsRNA no interior das células humanas. Em 2001, Elbashir e Tuschl e outros, verificaram que a introdução de dsRNA pequeno de 21nt de
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3/59 comprimento (nucleotídeos de comprimento) nas células humanas não obteve a via de interferon, porém especificamente degradou o mRNA alvo (Elbashir, S.M., Harborth, J., Lendeckel, W., Yalcin, A., Weber, K., Tuschl, T., Nature, 411, 494-498, 2001; Elbashir, S.M.,
Lendeckel, W., Tuschl, T., Genes & Dev., 15, 188-200,
2001; Elbashir, S.M., Martinez, J., Patkaniowska, A., Lendeckel, W., Tuschl, T., EMBO J., 20, 6877-6888, 2001). Após isto, dsRNA de 21 nucleotídeos de comprimento foi ressaltado como uma ferramenta das novas genômicas funcionais e denominado como RNA de interferência pequeno (siRNA).
[005] O siRNA é uma substância que provocou muito interesse como um agente para a terapia gênica uma vez que foi reportado que o mesmo apresenta um excelente efeito na inibição da expressão de um gene específico nas células de animais. Com efeito, em razão de sua alta atividade e seletividade gênica precisa, espera-se que o siRNA seja um agente terapêutico alternativo para um oligonucleotídeo (ODN) de sentido negativo sendo correntemente empregado como um agente terapêutico, como resultado de uma pesquisa de 20 anos (Dana J. Gary e outros, Journal of Controlled Release 121:64-73, 2007). Uma técnica de siRNA que almeja a terapia apresenta grandes vantagens pelo fato de ser facilmente projetada em comparação aos outros medicamentos e possuir seletividade de alvo alta além de uma propriedade de inibir a expressão de um gene específico. Além disto a mesma é menos tóxica uma vez que a interefência de RNA suprime a expressão gênica empregando
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4/59 um mecanismo naturalmente existente em um sistema vivo. 'Bevasiranib' recentemente desenvolvido como um agente terapêutico para degeneração macular úmida relacionada a idade por OPKO Inc., é um siRNA que atua seletivamente no fator de crescimento do endotélio vascular induzindo a neovascularização para inibir a expressão de VEGF e passa através de três faes de experimento clínico (Dejneka NS e outros, Mol Vis., 28(14):997-1005, 2008). Além disto, os agentes terapêuticos incluindo siRNAs alvejando vários genes estão sendo desenvolvidos atualmente (Ryan P. Million, Nature Reviews Drug Discovery 7: 115 - 116, 2008).
[006] A despeito dos vários resultados mostrando que a inibição de expressão específica é induzida in vivo através do RNA de interferência, a liberação de siRNA in vivo apresenta muitos problemas que devem ser resolvidos, tais como, degradação das enzimas pelo sangue, interação com componentes no sangue e liberação não específica para as células (Shigeru Kawakami and Mitsuru Hashida, Drug Metab. Pharmacokinet. 22(3): 142-151, 2007). As tentativas de resolver estes problemas estão em progresso pelo emprego parcial de análogos a nucleosídeo resistentes à nuclease ou aperfeiçoamento de técnicas de liberação.
[007] Exemplos de técnicas de liberação aperfeiçoadas incluem técnicas de liberação gênica usando vírus, tais como, adenovirus, retrovirus, etc. e técnicas de liberação gênica por vetores não virais usando lipossomas, lipídeo catiônico e compostos poliméricos catiônicos. Contudo, os
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5/59 veículos virais apresentam um problema de segurança, uma vez que os genes liberados provavelmente serão integrados a um cromossoma de um hospedeiro para induzir anormalidade às funções normais dos genes de um hospedeiro e ativar oncogenes e, além disso, podem causar doenças autoimunes devido à expressão sucessiva dos genes virais em quantidades pequenas ou podem não conduzir à imunidade protetora eficiente em um caso onde a infecção viral modificada é induzida dos veículos virais. Outrossim, os veículos não virais são menos eficientes que os veículos virais, porém apresentam vantagens de poucos efeitos colaterais e custos de produção baixos, considerando a segurança ín vivo e praticabilidade econômica(Lehrman S., Nature. 401(6753): 517-518, 1999). Além disto, os métodos de liberação não viral requerem a proteção eficaz contra degradação enzimática ou não enzimática, a fim de liberar moléculas de RNA incluindo siRNA, um método para isso sendo utilizar plasmídeos de expressão de DNA codificando um RNA de grampo curto (shRNA). Um sistema através de DNA apresenta a vantagem do siRNA ser expresso apenas enquanto existir o vetor de expressão. Além disso, um estudo recente na modificação química de siRNA propôs um método para aperfeiçoar a estabilidade contra nucleases e baixa absorção intracelular (Shigery Kawakami and Mitsuru Hashida. Drug Metab. Parmacokinet. 22(3): 142-151, 2007).
[008] Em um tipo de modificação química de siRNA, uma ligação fosforodiéster, que é uma porção degradada pela nuclease, foi modificada com uma ligação de fosforotioato ou a porção 2' de uma pentose é modificada com 2'-O-meRNA,
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2'-desóxi-2'-fluoridina, ou um ácido nucléico trancado (LNA) formado pela ligação da porção 2' e da porção 4' e como resultado, a estabilidade no soro é aperfeiçoada ((Braasch D. A. e outros, Bioorg. Med. Chem. Lett. 14:1139-1143, 2003; Chiu Y.L. e Rana T.M., RNA, 9:10341048, 2003; Amarzguioui M. e outros, Nucleic Acid Res.
31:589-595, 2003). Em outro tipo de modificação química, um grupo funcional é ligado a uma região de extremidade 3' de um fita senso (antiguia), resultando em aperfeiçoamento nas características farmacocinéticas em comparação a um controle e a alta eficiência é induzida no momento da aplicação in vivo através de um equilíbrio entre a hidorfilicidade e a hidrofobicidade de siRNA (Soutschek J. e outros, Nature 432:173-178 2004).
[009] Entretanto, os métodos acima ainda deixam muito a desejar a fim de protegerem siRNA das nucleases e aperfeiçoarem a eficiência da permeabilidade da membrana celular.
[010] Por esta razão, os inventores verificaram que um conjugado, no qual o composto polimérico hidrófilo ou hidrófobo é conjugado ao siRNA por uso de uma ligação degradável ou não degradável, aperfeiçoou a estabilidade in vivo de siRNA e, com base nisso, conceberam a presente invenção.
OBJETIVOS DA INVENÇÃO
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7/59 [011] Um objetivo da presente invenção é prover um conjugado no qual um composto polimérico hidrófilo ou hidrófobo, que é um composto polimérico biocompatível é conjugado a uma extremidade de uma fita senso ou uma fita antissenso de siRNA por emprego de uma ligação degradável ou não degradável, a fim de aperfeiçoar a eficiência intracelular de siRNA.
[012] Outro objetivo da presente invenção é prover um suporte sólido contendo um composto polimérico, especialmente, um composto polimérico com estabilidade comprovada quando aplicado ao corpo humano, por exemplo, polietileno glicol (PEG), e um método para preparar de forma eficiente um oligonucleotídeo incluindo RNA, DNA, quimera de RNA-DNA e seus análogos, onde PEG é ligado à extremidade 3' dos mesmos pelo emprego do suporte.
[013] Ainda outro objetivo da presente invenção é prover um método para preparação do conjugado de siRNA e um método para liberação de siRNA empregando o conjugado de siRNA.
DESCRIÇÃO RESUMIDA DA INVENÇÃO [014] De modo a atingir os objetivos acima, uma primeira solução da presente invenção provê um conjugado de siRNAcomposto polimérico da estrutura que se segue:
A-X-R-Y-B onde, A e B são independentemente um composto polimérico hidrófilo ou hidrófobo; X e Y são
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8/59 independentemente uma ligação covalente simples ou uma ligação covalente mediada por ligante; e R é siRNA.
[015] Uma segunda solução da presente invenção provê um conjugado de siRNA-composto polimérico da estrutura que se segue:
A-X-R onde A é um composto polimérico hidrófobo; X é uma ligação covalente simples ou uma ligação covalente mediada por ligante; e R é siRNA.
[016] Uma terceira solução da presente invenção provê um conjugado no qual uma fita simples de siRNA (R) é composta por 19 a 31 nucleotídeos.
[017] Uma quarta solução da presente invenção provê um conjugado no qual o composto polimérico hidrófobo (A) apresenta um peso molecular de 250 a 1.000.
[018] Uma quinta solução da presente invenção provê um conjugado no qual o composto polimérico hidrófobo (A) é hidrocarboneto de C16-C50 ou colesterol.
[019] Uma sexta solução da presente invenção provê um conjugado no qual a ligação covalente (X, Y) é uma ligação não degradável ou uma ligação degradável.
[020] Uma sétima solução da presente invenção provê um conjugado no qual a ligação não degradável é uma ligação amido ou uma ligação fosfato.
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9/59 [021] Uma oitava solução da presente invenção provê um conjugado no qual a ligação degradável é selecionada de uma ligação de dissulfeto, uma ligação clivável ácida, uma ligação éster, uma ligação anidrido, uma ligação biodegradável e uma ligação clivável por enzima.
[022] Uma nona solução da presente invenção provê um conjugado no qual o composto polimérico hidrófilo (A ou B) é um composto polimérico não iônico apresentando um peso molecular de 1.000 a 10.000.
[023] Uma décima solução da presente invenção provê um conjugado no qual o composto polimérico hidrófilo é selecionado de um grupo consistindo em polietileno glicol (PEG), polivinilpirolidona e polioxazolina.
[024] Uma décima primeira solução da presente invenção provê um suporte sólido de ligação de polietileno glicol da estrutura que se segue:
onde, R é alquila, alquenila, alquinila, arila, arilalquila, heteroalquila, ou heteroarila; m é um inteiro de 2 a 18; n é um inteiro de 5 a 120; e X é hidrogênio, 4monometoxitritila, 4,4’-dimetoxitritila, ou 4,4',4trimetoxitritila.
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10/59 [025] Uma décima segunda solução da presente invenção provê um suporte sólido de ligação de polietileno glicol no qual o suporte sólido é um vidro de poro controlado (CPG).
[026] Uma décima terceira solução da presente invenção provê um suporte sólido de ligação de polietileno glicol no qual o CPG apresenta um diâmetro de 40-180 e um tamanho de poro 500Â-3.000Â.
[027] Uma décima quarta solução da presente invenção provê um suporte sólido de ligação de polietileno glicol que é 3'-PEG-CPG apresentando a seguinte fórmula estrutural IV:
O
[028] Uma décima quinta solução da presente invenção provê um método para preparação 3'-PEG-CPG, o método incluindo:
1) reação de CPG com 3-aminopropiltrietoxisilano para formar vidro de poro controlado de alquil amina de cadeia longa (LCAA-CPG);
2) reação de polietileno glicol com cloreto de
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4,4'-dimetoxitritila para formar 2-[bis-(4-dimetoxitritil)poli(etileno glicol)];
3) reação do composto formado na etapa 2) e um composto da fórmula química 1 que se segue para formar um composto da fórmula estrutural I que se segue;
4) reação do composto formado da fórmula estrutural I que se segue e 4-nitrofenilcloroformato para formar um composto da fórmula estrutural II que se segue;
5) reação do composto da fórmula estrutural I que se segue formado na etapa 3) e ácido N-succinimidil trifluoracético para formar um composto da fórmula estrutural III que se segue; e
6) reação do composto de LCAA-CPG formado na etapa
1) com os compostos das fórmulas estruturais I, II e III que se seguem, respectivamente formados nas etapas 3) a 5) [Fórmula química 1]
[Fórmula estrutural I]
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12/59 [Fórmula estrutural II]
[Fórmula estrutural III]
[Fórmula estrutural IV]
onde, R é alquila, alquenila, alquinila, arila, arilalquila, heteroalquila, ou heteroarila; e n é um inteiro de não menos de 5 e não mais de 120.
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13/59 [029] Uma décima sexta solução da presente invenção provê um método para preparação de um conjugado de siRNA, o método incluindo:
1) preparação de um siRNA para um gene alvo pelo emprego do suporte sólido de ligação presente invenção; e
2) ligação de um grupo de extremidade de siRNA e polietileno glicol por uma ligação covalente.
[030] Uma décima sétima solução da presente invenção provê uma nanopartícula consistindo nos conjugados de siRNA da primeira ou segunda solução da presente invenção.
[031] Uma décima oitava solução da presente invenção provê um método para terapia gênica, incluindo:
1) preparação das nanopartículas da décima sétima solução da presente invenção; e
2) administração das nanopartículas ao corpo de um animal.
[032] Uma décima nona solução da presente invenção provê um método para terapia gênica, onde as nanopartículas são administradas ao corpo por administração oral ou injeção intravenosa.
[033] Uma vigésima solução da presente invenção provê uma composição farmacêutica incluindo uma quantidade farmaceuticamente eficaz dos conjugados de siRNA das primeira e segunda soluções da presente invenção.
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14/59 [034] Uma vigésima primeira solução da presente invenção provê uma composição farmacêutica incluindo uma quantidade farmaceuticamente eficaz das nanopartículas da décima sétima solução da presente invenção.
[035] A seguir, a presente invenção será descrita em detalhes.
[036] A presente invenção provê um conjugado de siRNAcomposto polimérico da estrutura que se segue:
A-X-R-Y-B.
onde, A e B são independentemente um composto polimérico hidrófilo ou hidrófobo; X e Y são independentemente uma ligação covalente simples ou uma ligação covalente mediada por ligante; e R é siRNA [037] Além disso, a presente invenção provê um conjugado de siRNA-composto polimérico da estrutura que se segue:
A-X-R.
onde A é um composto polimérico hidrófobo; X é uma ligação covalente simples ou uma ligação covalente mediada por ligante; e R é siRNA.
| [038] No conjugado da | presente invenção, uma | fita | de | |
| oligonucleotídeo do | siRNA | pode incluir 19 | a | 31 |
| nucleotídeos. Qualquer | siRNA | derivado de genes | que | for |
empregado ou que provavelmente seja empregado para terapia gênica ou estudo pode ser empregado como o siRNA empregável na presente invenção.
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15/59 [039] O composto polimérico hidrófobo pode ser um composto polimérico hidrófobo apresentando um peso molecular de 250 a 1.000. Exemplos do composto polimérico hidrófobo podem incluir hidrocarboneto, preferivelmente, Hidrocarboneto C16-C50, e colesterol. No presente documento, o composto polimérico hidrófobo não está limitado apenas ao hidrocarboneto e ao colesterol.
[040] O composto polimérico hidrófobo promove uma interação hidrófoba funcionando para formar uma micela consistindo nos conjugados de siRNA-compostos poliméricos hidrófobos. Entre os compostos poliméricos hidrófobos, especialmente, o hidrocarboneto saturado apresenta uma vantagem pelo que o mesmo pode ser facilmente conjugado ao siRNA durante fabricação do siRNA e assim se torna muito apropriado para fabricação dos conjugados da presente invenção.
[041] Também, a ligação covalente (isto é, X, Y) pode ser qualquer uma de uma ligação não degradável ou degradável. No presente documento, pode haver uma ligação amida ou uma ligação fosfato na ligação não degradável e pode haver uma ligação dissulfeto, uma ligação clivável ácida, uma ligação éster, uma ligação anidrido, uma ligação biodegradável e uma ligação clivável por enzima na ligação degradável. Entretanto, a ligação degradável ou não degradável não está limitada a isto.
[042] O ligante que media a ligação liga covalentemente o polímero hidrófilo (ou o polímero hidrófobo) e uma
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16/59 extremidade de um resíduo derivado de siRNA, e não está especificamente limitado à medida que o mesmo pode prover uma ligação degradável em um determinado ambiente, caso necessário. Portanto, o ligante pode incluir qualquer composto que possa ser ligado ao siRNA e/ou ao polímero hidrófilo (ou o polímero hidrófobo) de modo a ativar os mesmos durante o processo de fabricação do conjugado.
[043] Também, o composto polimérico hidrófilo pode ser um composto polimérico não iônico apresentando um peso molecular de 1.000 a 10.000. Por exemplo, o composto polimérico hidrófilo pode incluir um composto polimérico hidrófilo não iônico de polietileno glicol, polivinilpirolidona, polioxazolina, e semelhantes, porém não é limitado ao mesmo.
[044] Um grupo funcional do composto polimérico hidrófilo pode ser substituído por outro grupo funcional, caso desejado. Entre os compostos poliméricos hidrófilos, especificamente, PEG é muito apropriado para fabricação dos conjugados da presente invenção, uma vez que ele apresenta vários pesos moleculares, apresenta uma extremidade capaz de introduzir grupos funcionais, apresenta excelente biocompatibilidade, não induz reações imunes e aumenta a solubilidade em água para aperfeiçoar a eficiência da liberação gênica in vivo.
[045] Além disso, a presente invenção provê um suporte sólido de ligação de polietileno glicol da estrutura que se segue:
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-----------1 o onde, o suporte sólido inclui, por exemplo, CPG, poliestireno, gel de sílica, papel de celulose, etc., porém não está necessariamente limitado aos mesmos; R é alquila, alquenila, alquinila, arila, arilalquila, heteroalquila ou heteroarila; m é um inteiro de 2 a 18; n é um inteiro de 5 a 120 (peso molar 282 ~ 5300); e X é 4monometoxitritila, 4, 4'-dimetoxitritila ou 4, 4', 4trimetoxitritila] e removido após tratamento ácido para se tornar hidrogênio. Quando o suporte sólido for CPG, o mesmo pode apresentar um diâmetro de 40 ~ 180 θ um tamanho de poro de 500—3.000 Â.
[046] Também, a presente invenção provê um suporte sólido de ligação de polietileno glicol onde 3’-PEG-CPG apresentando a fórmula estrutura IV que se segue é ligado:
[Fórmula estrutural IV]
[047] Além disso, a presente invenção provê um método para preparação de 3'-PEG-CPG da fórmula estrutural IV que se segue, o método incluindo:
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1) reação de CPG com 3-aminopropiltrietoxisilano para formar LCAA-CPG;
2) reação de polietileno glicol com cloreto de 4,4'-trimetoxitritila para formar 2-[bis-(4dimetoxitritil)-poli(etileno glicol)];
3) reação do composto formado na etapa 2) e um composto da fórmula 1 que se segue para formar um composto da fórmula estrutural I que se segue;
4) reação do composto formado da fórmula estrutural I que se segue e 4-nitrofenilcloroformato para formar um composto da fórmula estrutural II que se segue;
5) reação do composto da fórmula estrutural I que se segue formado na etapa 3) e ácido N-succinimidil trifluoracético para formar um composto da fórmula estrutural III que se segue; e
6) reação do composto LCAA-CPG formado na etapa 1) com os compostos das fórmulas estruturais I, II e III que se seguem, respectivamente formados nas etapas 3) a 5) respectivamente.
[Fórmula 1]
[Fórmula estrutural I]
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19/59 [Fórmula estrutural II]
[Fórmula estrutural III]
[Fórmula estrutural IV]
onde, R é alquila, alquenila, alquinila, arila, arilalquila, heteroalquila ou heteroarila; e n é um inteiro de não menos de 5 e não mais de 120.
[048] Também, a presente invenção provê um método para preparação um conjugado compreendendo siRNA e PEG pelo emprego do suporte sólido de ligação de polietileno
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20/59 glicol. Mais especificamente, é provido um método para preparação um conjugado siRNA , o método incluindo:
1) preparação de um siRNA para um gene alvo pelo emprego do suporte sólido de ligação de polietileno glicol; e
2) ligação de um grupo de extremidade do siRNA e polietileno glicol por uma ligação covalente. Através disto, os oligonucleotídeos incluindo RNA, DNA, quimera de RNA-DNA e seus análogos podem ser preparados eficazmente.
[049] De acordo com uma concretização preferida da presente invenção, o siRNA pode ser preparado por união das ligações de fosfodiéster construindo uma estrutura de RNA, usando β-cianoetilfosforamidita (Shina e outros, Nucleic Acids Research, 12:4539-4557, 1984). Por exemplo, uma série de procedimentos consistindo em desbloqueio, acoplamento, oxidação e capeamento foram realizados repetidamente em um suporte sólido no qual o nucleotídeo foi anexado, pelo emprego de um sintetizador de RNA para obter o reagente contendo um comprimento desejado de RNA. Entretanto, a presente invenção não está limitada a isto.
[050] Também, a presente invenção provê uma nanopartícula consistindo em conjugados de siRNA.
[051] Os conjugados de siRNA-composto polimérico da presente invenção podem formar uma estrutura de nanopartícula por interação entre os mesmos, e o conjugado de siRNA-composto polimérico e a nanopartícula consistindo nos conjugados de siRNA-composto polimérico assim obtida
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21/59 aperfeiçoa a liberação intracelular de siRNA e pode ser aplicável ao tratamento terapêutico de modelos de doença. A preparação dos conjugados e características, eficiência de liberação celular e efeito da nanopartícula consistindo nos conjugados serão descritos em detalhes nos exemplos a serem descritos mais adiante.
[052] Também, a presente invenção provê um método para terapia gênica empregando a nanopartícula.
[053] Mais especificamente, o método para terapia gênica inclui a preparação das nanopartículas, cada uma consistindo nos conjugados de siRNA-composto polimérico e administração das nanopartículas ao corpo de um animal.
[054] Também, a presente invenção provê uma composição farmacêutica incluindo uma quantidade farmaceuticamente eficaz das nanopartículas, cada uma consistindo nos conjugados de siRNA.
[055] A composição da presente invenção pode ser preparada para incluir um ou mais veículos farmaceuticamente aceitáveis, além dos componentes ativos descritos acima, para administração. O veículo farmaceuticamente ativo precisa ser compatível com os componentes ativos da presente invenção. O veículo farmaceuticamente ativo pode ser empregado para mistura com solução de salmoura, água esterilizada, solução de Ringer, solução de salmoura tamponada, solução de dextrose, solução de maltodextrina, glicerol e etanol e um
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22/59 ou mais dos mesmos e conforme necessário, outros aditivos comuns, tais como, antioxidantes, solução tamponada, agentes bacteriostáticos ou semelhantes podem ser adicionados. Além disso, diluentes, dispersantes, agentes tensoativos, ligantes e lubrificantes podem ser adicionados conjuntamente para formular composições para injeção, tais como, solução aquosa, suspensão, emulsão ou semelhantes. Adicionalmente, a composição da presente invenção pode ser preferivelmente formulada de acordo com doenças específicas ou componentes, por emprego de métodos apropriados na técnica ou métodos revelados em Remington's Pharmaceutical Science (Mack Publishing Company, Easton PA).
[056] A composição farmacêutica da presente invenção pode ser determinada pelos técnicos no assunto, com base nas síndromes e gravidade das doenças dos pacientes. Também, a composição farmacêutica da presente invenção pode ser formulada em vários tipos, tais como, pós, comprimidos, cápsulas, líquidos, injetáveis, unguentos, xaropes e semelhantes e podem ser providas em recipiente de dosagem única ou de múltiplas dosagens, por exemplo, uma ampola vedada, garrafa ou semelhantes.
[057] A composição farmacêutica da presente invenção pode ser administrada oral ou parenteralmente. A via de administração da composição farmacêutica de acordo com a presente invenção pode incluir, porém não está limitada a oral, intravenosa, intramuscular, intramedular, intratecal, enteral, sublingual ou administração tópica.
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23/59 [058] Para esta administração clínica, a composição farmacêutica da presente invenção pode ser formulada em uma formulação apropriada por uso de técnicas conhecidas. A dosagem da composição da presente invenção possui várias faixas dependendo do peso, idade, sexo, estado de saúde, dieta, tempo de administração e método, taxa de excreção e gravidade da doença do paciente e pode ser facilmente determinada pelo versado na técnica.
EFEITOS VANTAJOSOS [059] A nanopartícula consistindo nos conjugados de siRNA-composto polimérico da presente invenção pode aperfeiçoar a estabilidade in vivo do siRNA para liberar de forma eficiente um siRNA terapêutico para a célula e pode ser muito útil em uma pesquisa básica para a biotecnologia e indústria médica como um novo tipo de sistema de liberação de siRNA, bem como uma ferramenta para tratamento de cânceres utilizando siRNA e outras doenças infecciosas, uma vez que pode exibir atividade siRNA em uma concentração de dosagem relativamente baixa, mesmo sem reagentes de transfecção.
DESCRIÇÃO DOS DESENHOS [060] A figura 1 ilustra uma fórmula estrutural preparada de 3'-PEG-CPG;
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24/59 [061]
A figura 2 ilustra dados de 1H
NMR do composto obtido no Exemplo 1;
[062]
A figura 3 ilustra dados de 1H NMR do [Composto
A], que é um reagente 3'-PEG para ligação com
LCAA-CPG no
Exemplo 1;
[063] A figura 4 ilustra dados de 1H NMR do [Composto
B], que é um reagente de 3'-PEG para ligação com LCAA-CPG no
Exemplo 1;
[064] A figura 5 ilustra dados de 1H NMR do [Composto C], que é um reagente de 3'-PEG para ligação com LCAA-CPG no
Exemplo ;
[065] A figura 6 ilustra dados de peso molecular MaldiTof após fabricação de 3'-PEG-CPG e um oligonucleotídeo (siRNA) no Exemplo 1-3;) [066] A figura 7 ilustra dados de peso molecular MaldiTof após fabricação de 3'-PEG-CPG e um oligonucleotídeo (siRNA) no Exemplo 1-4;
[067] A figura 8 ilustra uma fotografia de eletroforese de um siRNA desnudado no qual nenhum dos compostos poliméricos é conjugado e conjugados de siRNA-composto polimérico, onde um composto polimérico hidrófilo ou hidrófobo é conjugado (O siRNA significa siRNA conjugado e respectivos conjugados representam conjugados siRNAcomposto polimérico mostrados na Tabela 1. Também, 19mer,
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23mer, 27mer, e 31mer significam siRNAs consistindo em 19, 23, 27 e 31 nucleotídeos, respectivamente e todos foram usados para preparar os conjugados de siRNA-composto polimérico em uma estrutura do conjugado de siRNA 4.);
[068] A figura 9 ilustra uma fotografia de eletroforese expressando os graus de degradação de siRNA, de acordo com o tempo, na presença de proteína sérica, a fim de avaliar a estabilidade no sangue de um siRNA desnudado, no qual nenhum composto polimérico é conjugado e conjugados de siRNA-composto polimérico, nos quais um composto polimérico hidrófilo, PEG, é conjugado;
[069] A figura 10 é um diagrama esquemático de uma nanopartícula formada por um conjugado de siRNA-composto polimérico;
[070] A figura 11 ilustra resultados de tamanho de partícula de nanopartículas consistindo em siRNAs desnudados onde nenhum composto polimérico é conjugado, medidos por instrumento de medição em potencial zeta;
[071] A figura 12 ilustra resultados de tamanho de nanopartículas cada um consistindo em conjugados 9 de siRNA-composto polimérico, medidos por instrumento de medição em potencial zeta;
[072] A figura 13 ilustra resultados de tamanho de nanopartículas cada um consistindo em conjugados de
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26/59 siRNA-composto polimérico, medidos por instrumento de medição em potencial zeta;
[073] A figura 14 ilustra resultados de tamanho de nanopartículas cada um consistindo em conjugados 11 de siRNA-composto polimérico, medidos por instrumento de medição em potencial zeta;
[074] A figura 15 ilustra resultados de tamanho de nanopartículas cada um consistindo em conjugados 12 de siRNA-composto poliméricos, medidos por instrumento de medição em potencial zeta;
[075] A figura 16 ilustra resultados de tamanho de nanopartículas cada um consistindo em conjugados 13 de siRNA-composto polimérico, medidos por instrumento de medição em potencial zeta;
[076] A figura 17 é um gráfico comparando graus de expressão de mRNA do gene survivina após transfecção em conjunto com um reagente de transfecção, de modo a analisar efeitos RNAi de um siRNA desnudado e respectivos conjugados de siRNA-composto polimérico onde um composto polimérico hidrófilo, PEG, é conjugado;
[077] A figura 18 é um expressão de mRNA do gene conjunto com um reagente analisar efeitos RNAi gráfico comparando graus de survivina após transfecção em de transfecção, de modo a e respectivos de um siRNA desnudado
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27/59 siRNAs de sequência longa transformados no conjugado 4 de siRNA-composto polimérico; e [078] A figura 19 é um gráfico comparando graus de expressão de mRNA do gene survivina após transfecção na ausência de um reagente de transfecção, de modo a analisar efeitos RNAi de um siRNA desnudado e conjugados 1 a 5 e 9 a 14 de siRNA-composto polimérico.
MELHOR MODO DE REALIZAR A INVENÇÃO [079] As concretizações exemplares da presente invenção serão descritas em detalhes a seguir. Entretanto, as concretizações exemplares que se seguem descrevem a presente invenção apenas como exemplo e não devem limitar a mesma.
[080] Exemplo 1: Preparação do suporte sólido para preparação de oligonucleotídeo 3'-PEG [081] Exemplo 1-1: Preparação de reagentes 3'-PEG (Compostos A, B e C) para ligação com LCAA-CPG [082] No exemplo subsequente, 3'-PEG-CPG foi preparado conforme mostrado na fórmula de reação que se segue.
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[083] Exemplo 1-1-1: Preparação de 2-[bis-(4dimetoxitritil)-poli(etileno glicol)] g (15 mmol) de polietileno glicol 2000 (Alfa Aesar GmbH & Co. KG, Alemanha), como um material de partida, foram dissolvidos em 270 ni^ de piridina (Sigma Aldrich, USA), seguido por adição de 3,55 ni^ (25,5 mmol) de trietilamina (Sigma Aldrich, USA) e 7,12 g (21 mmol) de cloreto de 4,4’-dimetóxi tritila (GL biochem, China), e então a substância resultante foi reagida a temperatura ambiente por 20 horas. A mistura de reação após término da reação foi concentrada, e extraída com 450 de acetato de etila e 450 ni^ de água, seguido por evaporação a vácuo e então secagem a vácuo, para obter 2-[bis-(4dimetoxitritil)-poli(etileno glicol) 23 g (66%).
[084] Dados de XH NMR do composto são mostrados na figura .
XH NMR(CDC13); δ 1,93 (br, 1, OH) , 3,20-3,80 (m, 186, PEG, DMT-OCH3) , 6, 8 0-6, 8 3 (m, 4 , DMT) , 7,197,4 7 (m, 9, DMT)
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29/59 [085] Exemplo 1-1-2: Preparação de ácido 2-[bis-(4dimetoxitritil)-poli(etilenoglicol)] succínico [Composto AI
3,9 g (1,672 mmol) de 2-[bis-(4-dimetoxitritil)poli(etilenoglicol)] obtidos no exemplo 1-1-1 foram dissolvidos em 20 de piridina, e então resfriados a 0°C. 351 mg (3,512 mmol) de anidrido de ácido succínico (Acros Organics, USA) e 42,5 mg (0,334 mmol) de DMAP (4dimetilaminopiridina, Sigma Aldrich, USA) foram adicionados à substância reagente, e agitados a 50 C por 3 dias, e então a reação foi terminada. A mistura de reação após término da reação foi evaporada em vácuo para obter ácido 2-[bis-(4-dimetoxitritil)-poli(etileno glicol)] succínico [Composto A] 3,65 g (90%, branco sólido).
[086] Dados de 1H NMR do composto são mostrados na figura
3.
1H NMR(CDCl3); δ 2,65(m,2,CH2CO), 3,203,8 8(m,18 6,PEG,DMT-OCH3), 4,25(m,2,CH2CO), 6,806,82(m,4,DMT), 7,19-7,47(m,9,DMT).
[087] Exemplo 1-1-3: Preparação de ácido 2-[bis(dimetoxitritil)-poli(etileno glicol))] para-nitrofenil succínico [Composto B] g (0,411 mmol) do composto A obtido no exemplo 11-2 foi dissolvido em 20 de cloreto de metileno (DaeYeon Chemicals, Co. Ltd., Coréia) e resfriado a 0 C . 143 (1,03 mmol) de trietilamina foram colocados na substância reagente e 149 mg (0,740 mmol) de cloroformato de 4-nitro
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30/59 fenila foram adicionados. Então, a temperatura foi elevada para temperatura ambiente e a substância resultante foi agitada por 4 horas, e então a reação foi terminada. A mistura de reação após término da reação foi lavada uma vez com 2 0 de NaHCO3 aquoso saturado e 2 0 de 1M ácido cítrico (Sigma Aldrich, USA) que foi resfriado a 0°C-4°C, e então seco com Na2SO4 (Samchum Chemical Co., Coréia). A substância resultante foi filtrada pelo emprego de um frasco de filtração, um funil Bucher, ou um aspirador, seguido por evaporação a vácuo, para obter ácido 2-[bis-(4dimetoxitritil)-poli(etileno glicol) para-nitrofenil succínico [Composto B] 1,0 g (94%, sólido cremoso).
[088] Dados de 1H NMR do composto são mostrados na figura
4.
1H NMR(CDCl3); δ 2,8 0-2,90(m,2,CH2CO), 3,203,87(m,186,PEG,DMT-OCH3), 4,25(m,2,CH2CO), 6,806,82(m,4,DMT), 7,19-7,47(m,9,DMT) [089] Exemplo 1-1-4: Preparação de éster 2,5-dioxopirolidina-1-il do ácido 2-[bis-(4-dimetoxitritil)poli(etileno glicol)] succínico [Composto C]
500 mg (0,206 mmol) do composto A obtido no exemplo 1-1-2 foram dissolvidos em 10 de cloreto de metileno, e então 83,14 (1,03 mmol) de piridina foram adicionados. 165 mg (0,781 mmol) de ácido N-succinimidil triflúor acético (Sigma Aldrich, USA) foram adicionados e agitados a temperatura ambiente por 7 horas, e então a reação foi terminada. A mistura de reação após término da reação foi evaporada a vácuo para obter éster 2,5-dioxo-pirrolidin-1
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31/59 ila do ácido 2-[bis-(4-dimetoxitritil)-poli (etilenoglicol)] succinico [Composto C] 490 mg (94%, branco sólido).
[090] Dados de XH NMR do composto são mostrados na figura
5.
XH NMR(CDC13); δ 2,72-2,97 (m, 6, CH2CO, CH2CH2) , 3,203, 87 (m, 186, PEG, DMT-OCH3) , 4,2 7-4,2 8 (m, 2 , CH2CO) , 6,806,83(m,4,DMT), 7,20-7,47(m,9,DMT) [091] Exemplo 1-2: Ligação de LCAA-CPG e reagente de 3'PEG (Composto A)
No exemplo subsequente, CPG e reagente de 3'-PEG foram ligados conforme mostrado na fórmula de reação que se segue:
LCAA-CPG
SUBSTÂNCIA QUÍMICA A
3'-PEG CPI [092] Exemplo 1-2-1: Preparação de LCAA-CPG (2000Â) g de CPG(Silicycle Inc., Canadá) apresentando um diâmetro de 40-75 e um nanoporo de 2000 Â foram misturados e umectados com 100 de tolueno, e então 2 πτβ de 3-aminopropiltrietoxisilano (TCI Org. Chem, Japão) foram acrescentados. Então, a substância resultante foi misturada e então reagida a temperatura ambiente por 8 horas. A mistura após término da reação foi filtrada e
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32/59 lavada com metanol, água e cloreto de metileno naquela ordem, seguido por secagem a vácuo, para obter 10 g de LCAA-CPG (2 000Â).
[093] Exemplo 1-2-2: Preparação de 3'-PEG-CPG (2000 Â ) empregando ácido 2-[bis-(4-dimetoxitritil)-poli(etileno glicol)] succínico [Composto A] g de LCAA-CPG (2000 Â ) obtido no exemplo 1-2-1 foram umectados em 20 de cloreto de metileno. Além disto, a solução de LCAA-CPG(2000 Â ) foi igualmente misturada com uma solução de 80 mg do composto A, 14 de TEA (trietilamina, Sigma Aldrich, USA). 15 mg de BOP hexafluorfosfato de (benzotiazol-1iloxitris(dimetilamino)fosfônio, TCI Org. Chem, Japão), e 5 mg de HOBT (1-Hidroxibenzotriazol anidro, TCI Org. Chem, Japão) foram dissolvidos em 2 de cloreto de metileno. A substância resultante foi reagida ao refluxo por 8 horas e então a mistura após término da reação foi filtrada e lavada com metanol, água e metileno glicol nesta ordem, seguido por secagem a vácuo.
[094] 1 g da substância resultante foi umectado em 10 de piridina, e então 1 de 1-metilimidazol (Sigma
Aldrich, USA) e 1,6 de anidrido acético (Sigma Aldrich, USA) foram acrescentados. A substância resultante foi igualmente misturada e reagida a temperatura ambiente por 8 horas. O CPG completo em capeamento obtido após o término da reação foi lavado com metanol, água, metanol e cloreto de metileno nesta ordem, seguido por secagem a vácuo, para obter 1 g de 3'-PEG-CPG.
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33/59 [095] Exemplo 1-3: Ligação de LCAA-CPG (2000 Â ) e reagente de 3'-PEG (Composto B)
SUBSTÂNCIA QUÍMICA B
3'-PEG CPG
LCAA-CPG [096] A preparação de 3'-PEG-CPG(2000 Â ) foi realizada pelo emprego do Composto B.
[097] Especificamente, 1 g de LCAA-CPG (2000Â) obtido no exemplo 1-2-1 foi umectado de forma suficiente em 8 niü de piridina. Além disto, uma solução onde 205 mg (2 eq) do composto B e 55 de trietilamina foram dissolvidos em 2 ml! de piridina foi igualmente misturada com a solução de LCAA-CPG. A substância resultante foi reagida a 50-60 °C por 8 horas, e então a mistura após término da reação foi filtrada. O CPG em acoplamento filtrado foi lavado com metanol, água e cloreto de metileno nesta ordem, seguido por secagem a vácuo. 1 g de CPG-de acoplamento após término da secagem foi umectado em 10 nil! de piridina, e então 500 de 1-metil imidazol e 800 de anidrido acético foram adicionados. A substância resultante foi misturada igualmente, e então reagida a temperatura ambiente por 8 horas. A mistura após término da reação foi filtrada, e então to CPG de acoplamento foi lavado com metanol, água e cloreto de metileno nesta ordem, seguido por secagem a vácuo, para obter 3'-PEG-CPG 1 g.
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34/59 [098] A figura 6 ilustra os resultados da determinação do peso molecular de Maldi-Tof de siRNAs preparados pelo emprego de 3'-PEG-CPG como um material de partida, conforme mostrado no Exemplo 2 a ser descrito a seguir.
[099] Sequência de preparação de 3'-PEG-CPG;
sentido 5’-AAGGAGAUCAACAUUUUCA(dTdT)-PEG(6.664,96Da + 2.000 Da (Sequência ID No. 1) sentido negativo 5’-UGAAAAUGUUGAUCUCCUU(dTdT)PEG(6.592,84Da + 2.000 Da (Sequência ID No. 5) [0100] Podería ser verificado que o peso molecular de Maldi-Tof aumentou pelo peso molecular (2.000 Da de PEG.
[0101] Exemplo 1-4: Ligação de LCAA-CPG(2 000 Â ) e reagente de 3'-PEG (Composto C)
c o
o
I J CAPEAMENTO •os
ICAA^FS y-FEO CPG
SUBSTÂNCIA QUÍMICA C [0102] A preparação de 3'-PEG-CPG (2000 Â ) foi realizada pelo emprego do composto C.
Especificamente, 1 g de LCAA-CPG (2000Â) obtido no exemplo 1-2-1 foi suficientemente umectado em 8 ni^ de piridina. Além disto, uma solução onde 200 mg do composto C e 55 de trietilamina foram dissolvidos em 2 ni^ de
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35/59 piridina foi misturada igualmente com a solução de LCAACPG. A substância resultante foi reagida a 50-60 °C por 8 horas e então a mistura, após término da reação, foi filtrada. O acoplamento-CPG filtrado foi lavado com metanol, água e cloreto de metileno naquela ordem, seguido por secagem a vácuo. 1 g do acoplamento-CPG após término da secagem foi umectado em 10 de piridina, e então 500 de 1-metil imidazol e 800 de anidrido acético foram adicionados. A substância resultante foi misturada igualmente, e então reagida a temperatura ambiente por 8 horas. O CPG completo em capeamento após término da reação foi lavado com metanol, água e cloreto de metileno naquela ordem, seguido por secagem a vácuo, para obter 3'-PEG-CPG 1
g.
[0103] A figura 7 ilustra resultados dos siRNAs preparados pelo emprego de 3'-PEG-CPG como um material de partida, conforme mostrado no Exemplo 2 a ser descrito adiante.
[0104] Sequência de preparação de 3'-PEG-CPG;
sentido 5'-AAGGAGAUCAACAUUUUCA(dTdT)-PEG(6.664,96Da + 2.000 Da (Sequência ID No. 1) sentido negativo 5'-UGAAAAUGUUGAUCUCCUU(dTdT)PEG(6.592,84Da + 2.000 Da (Sequência ID No. 5) [0105] Poderia ser verificado que o peso molecular de Maldi-Tof foi aumentado pelo peso molecular (2.000 Da) de PEG.
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36/59 [0106] Exemplo 2: Preparação de conjugados de siRNAcomposto polimérico
Nos exemplos que se seguem, o siRNA survivina foi empregado a fim de suprimir a survivina. A survivina é uma proteína expressa geralmente na maioria dos tumores neoplásticos ou linhagens de células transformadas, testados até agora e assim espera-se que se torne um alvo importante no tratamento anticâncer (Abbrosini G. e outros, Nat. Med. 3(8): 917-921, 1997). Uma sequência de siRNA survivina da presente invenção, quando composta de 19 nucleotídeos, consiste em uma fita senso da Sequência ID No. 1 e uma fita antissenso apresentando uma complementariedade de sequencia com relação à fita senso e além disto, quando composta de 23, 27 ou 31 nucleotídeos, apresenta uma sequência de base da Sequência ID No. 2, 3 ou 4.
(Sequência ID No. 1.) 5'-AAGGAGAUCAACAUUUUCA-3' (Sequência ID No. 2) 5'-AGGAAAGGAGAUCAACAUUUUCA-3'
| (Sequência | ID | No. | 3) | 5'- |
| AGGAAAGGAGAUCAACAUUUUCAAAUU-3' | ||||
| (Sequência | ID | No. | 4) | 5'- |
| AAAGGAGAUCAACAUUUUCAAAUUAGAUGUU-3' |
[0107] O siRNA foi preparado por ligação das ligações de fosfordiéster constituindo uma estrutura de RNA usando βcianoetil fosforamidita (Shina e outros, Nucleic Acids Research, 12:4539-4557, 1984). Especificamente, uma série de procedimentos consistindo em desbloqueio, acoplamento, oxidação e capeamento foram realizados repetidamente em um suporte vendido, no qual o nucleotídeo foi anexado, por
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37/59 empergo de um sintetizador de RNA (384 Synthesizer, BIONEER, Coréia), para obter o reagente ontendo um comprimento desejado de RNA.
[0108] Aditivamente, o conjugado de siRNA-composto polimérico foi preparado por ligação de PEG à região de término 5 terminal ou hidrocarboneto hexadecano (C16) ou octadecano (C18), à região de término 5' por uso de um ligante dodecano, que é um composto polimérico hidrófobo. Além disto, a reação mencionada acima foi realizada por uso de 3'PEG-CPG preparado no Exemplo 1 como um suporte para obter o conjugado de siRNA-composto polimérico no qual PEG foi provida à região de término 3'.
[0109] Foi identificado se as substâncias reagentes eram consistentes com a sequência nucleotídica que deve ser preparada, por separação do RNA das substâncias reagentes usando HPLC (LC-20A Prominence, SHIMADZU, Japão) e medindo o peso molecular das mesmas usando espectrômetro de massa MALDI-TOF (MALDI TOF-MS, SHIMADZU, Japão). Após isto, uma fita senso de RNA e uma fita antissenso de RNA foram misturadas na mesma quantidade e colocadas em um tampão de recombinação 1x (30 mM de HEPES, 100 Mm de acetato de potássio, 2 mm de acetato de magnésio, pH 7,0-7,5). A substância resultante foi reagida em uma batelada de temperatura constante de 90°C por 3 minutos, e então novamente reagida a 37 °C , para preparar um conjugado de siRNA de fita duplo-composta polimérica. Os conjugados de siRNA-composto polimérico preparados possuem estruturas mostradas na Tabela 1. A recombinação do conjugado de
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38/59 siRNA-composto polimérico fotografias de eletroforese
Tabela 1
Estruturas e tipos foi confirmada através de (figura 8).
de modificação de término dos conjugados de siRNA-composto polimérico
| Denominação do conjugado | Denominação da estrutura dos conjugados | Tipos de modificação de término |
| siRNA | siRNA desnudado | Sentido: nenhum |
| Sentido negativo: nenhum | ||
| conjugado de siRNAcomposto polimérico 1 | 5'PEG-siRNA de sentido | Sentido: 5'PEG |
| Sentido negativo: nenhum | ||
| conjugado de siRNAcomposto polimérico 2 | 5'PEG-siRNA de sentido negativo | Sentido: nenhum |
| Sentido negativo: 5'PEG | ||
| conjugado de siRNAcomposto polimérico 3 | 5'ssPEG-siRNA de sentido negativo | Sentido: nenhum |
| Sentido negativo: 5'ssPEG | ||
| conjugado de siRNAcomposto polimérico 4 | 5'PEG+PEG siRNA | Sentido: 5'PEG |
| Sentido negativo: 5'PEG | ||
| conjugado de siRNAcomposto polimérico 5 | 5'PEG+ssPEG siRNA | Sentido: 5'PEG |
| Sentido negativo: 5'ssPEG | ||
| conjugado de siRNAcomposto polimérico 6 | 3'PEG-siRNA de sentido | Sentido: 3'PEG |
| Sentido negativo: nenhum |
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| conjugado composto 7 | de siRNApolimérico | 3'PEG-siRNA sentido negativo | de | Sentido: | nenhum |
| Sentido 3'PEG | negativo: | ||||
| conjugado | de siRNA- | Sentido: | 3'PEG | ||
| composto | polimérico | 3'PEG+PEG siRNA | Sentido | negativo: | |
| 8 | 3'PEG | ||||
| Sentido: | 5'C18-C6- | ||||
| conjugado | de siRNApolimérico | 5'C18-siRNA | de | ss-C6 | |
| composto | sentido | Sentido | negativo: | ||
| 9 | nenhum | ||||
| Sentido: | 5'C18-C6- | ||||
| conjugado | de siRNApolimérico | 5'C18+PEG siRNA | ss-C6 | ||
| composto | Sentido | negativo: | |||
| 10 | 5'PEG | ||||
| Sentido: | 5'C16-C6- | ||||
| conjugado | de siRNApolimérico | 5'C16+PEG siRNA | ss-C6 | ||
| composto | Sentido | negativo: | |||
| 11 | 5'PEG | ||||
| conjugado | de siRNA- | 5'C18-siRNA | de | Sentido: | nenhum |
| composto | polimérico | sentido negativo | Sentido | negativo: | |
| 12 | 5'C18-C6 | -ss-C6 | |||
| conjugado | de siRNA- | Sentido: | 5'PEG | ||
| composto | polimérico | 5'PEG+C18 siRNA | Sentido | negativo: | |
| 13 | 5'C18-C6 | -ss-C6 | |||
| conjugado | de siRNA- | Sentido: | 5'PEG | ||
| composto | polimérico | 5'PEG+C16 siRNA | Sentido | negativo: | |
| 14 | 5'C16-C6 | -ss-C6 |
* Nas estruturas de conjugados, ss significa uma ligação de dissulfeto e C16 ou C18 representa
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40/59 hidrocarboneto C16 ou C18. Portanto, C18-C6-ss-C6” e C16-C6-ss-C6” significam compostos poliméricos hidrófobos.
[0110] Exemplo 3: Avaliação da estabilidade dos conjugados de siRNA-composto polimérico nas condições ín vivo [0111] Foi identificado se ou não os conjugados de siRNAcomposto polimérico preparados e separados no Exemplo 2 apresentam estabilidade aperfeiçoada em comparação a um siRNA desnudado no qual nenhum composto polimérico é ligado. O siRNA desnudado sem modificação e os conjugados de siRNA-composto polimérico 1 a 5 preparados no Exemplo 2 foram incubados por 0, 1, 3, 6, 9, 12, 24, 36, ou 48 horas, em um meio de cultura contendo soro bovino fetal a 10% (FBS), que imita as condições ín vivo e então os graus aos quais o siRNA foi degradado foram avaliados por uso de eletroforese.
[0112] Os resultados mostraram que os conjugados de siRNAcomposto polimérico apresentando PEG introduzida exibiram estabilidade de siRNA por até 48 horas (figura 9). A estabilidade de siRNA foi exibida por 12 a 24 horas, mesmo sob a condição de soro a 100%.
[0113] Exemplo 4: Medição de tamanho das nanopartículas dos conjugados de siRNA-composto polimérico hidrófobo
Em cada caso dos conjugados de siRNA-composto polimérico 9 a 14, uma nanopartícula consistindo em conjugados de siRNA-composto polimérico, ou seja, uma micela é formada por interação hidrófoba entre os compostos
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41/59 poliméricos hidrófobos providos nas extremidades de siRNAs (figura 10). Os tamanhos das nanopartículas foram medidos empregando um instrumento de medição de potencial zeta. Os tamanhos das nanopartículas consistindo nos respectivos conjugados de siRNA-composto polimérico 9 a 13 preparados no Exemplo 2 e siRNAs foram medidos.
[0114] Especificamente, 2 nmol de siRNA e de conjugados de siRNA-composto polimérico foram dissolvidos em 1 de água destilada e então as nanopartículas dos mesmos foram homogeneizadas (200 W, 40 kHz, 5 segundos) pelo emprego de um homogeneizador ultrassônico (Wiseclean, DAIHAN, Coréia). Os tamanhos das nanopartículas homogeneizadas foram medidos empregando o instrumento de medição de potencial zeta (Nano-ZS, MALVERN, Reino Unido). No presente documento, o índice de refração e o índice de absorção para materiais foram estabelecidos em 1,454 e 0,001, respectivamente, e a temperatura da água como um solvente, 25 °C , era a de entrada, e a viscosidade de índice de refração da mesma foram os de entrada. Uma medição de uma única vez consiste em 20 medições de tamanho repetidas e esta medição foi realizada três vezes.
[0115] A figura 11 ilustra resultados de tamanhos de nanopartículas de siRNA desnudado, medidos por instrumento de medição em potencial zeta. Isto mostrou que tamanhos de 142-295 nm (ponto máximo: 164 nm) são responsáveis por 7,.5% do total de nanopartículas, cada uma consistindo em siRNAs.
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42/59 [0116] A figura 12 ilustra resultados de tamanhos de nanopartículas cada uma consistindo em conjugado de siRNAcomposto polimérico 9, medidos por instrumento de medição em potencial zeta. Isto mostrou que tamanhos de 4,19-7,53 nm (ponto máximo: 6,50 nm) são responsáveis por 59,1% do total de nanopartículas, cada uma consistindo em conjugado de siRNA-composto polimérico 9.
[0117] A figura 13 ilustra resultados de tamanhos de nanopartículas cada uma consistindo em conjugado de siRNAcomposto polimérico 10, medidos por instrumento de medição em potencial zeta. Isto mostrou que tamanhos de 5,61-10,1 nm (ponto máximo: 8,72 nm) são responsáveis por 58,9% do total de nanopartículas, cada uma consistindo em conjugado de siRNA-composto polimérico 10.
[0118] A figura 14 ilustra resultados de tamanhos de nanopartículas, cada um consistindo em conjugado de siRNAcomposto polimérico 11, medidos por instrumento de medição em potencial zeta. Isto mostrou que tamanhos de 5,61-10,1 nm (ponto máximo: 8,72 nm) são responsáveis por 45,6% do total de nanopartículas, cada uma consistindo em conjugado de siRNA-composto polimérico 11.
[0119] A figura 15 ilustra resultados de tamanho de nanopartículas, cada um consistindo em conjugado de siRNAcomposto polimérico 12, medidos por instrumento de medição em potencial zeta. Isto mostrou que tamanhos de 4,85-5,61 nm são responsáveis por 23,6%, tamanhos de 21,0-32,7 nm
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43/59 são responsáveis por 23,5%, e tamanhos de 68,1-78,8 nm são responsáveis por 23,1% do total de nanopartículas, cada uma consistindo em conjugado de siRNA-composto polimérico 12.
[0120] A figura 16 ilustra resultados de tamanho de nanopartículas, cada um consistindo em conjugado de siRNAcomposto polimérico 13, medidos por instrumento de medição em potencial zeta. Isto mostrou que tamanhos de 4,85-8,72 nm (o ponto máximo: 5,61 nm) são responsáveis por 84,6% do total de nanopartículas, cada uma consistindo em conjugado de siRNA-composto polimérico 13.
[0121] Nos casos dos conjugados de siRNA-composto polimérico 9 a 13, exceto para o conjugado de siRNAcomposto polimérico 12, os tamanhos das nanopartículas foram em sua maioria de 4-8 nm. No caso do conjugado de siRNA-composto polimérico 12, os tamanhos das nanopartículas apresentaram medições variadas, a razão para isto sendo considerada como que as respectivas nanopartículas se agregaram conforme o tempo passou durante o processo de medição, mesmo que a homogeneização fosse realizada usando o homogeneizador ultrassônico. Conforme mostrado nas figuras 12 a 16, os tamanhos medidos das nanopartículas, cada uma consistindo em conjugados siRNA exibem 100 nm ou menos, que são tamanhos suficientes para serem endocitosados nas células através da pinocitose (Kenneth A. Dawson e outros, Nature Nanotechnology 4:8485, 2009).
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44/59 [0122] Exemplo 5: Inibição da expressão de genes alvo nas linhagens de células tumorais pelo emprego de conjugados de siRNA-composto polimérico com reagentes de transfecção
Linhagens de células cancerígenas cervicais humanas, que são linhagens de células tumorais foram respectivamente transfectadas com conjugados de siRNAcomposto polimérico 1 a 8 preparados no Exemplo 2, e os níveis de expressão do gene survivina nas linhagens de células tumorais transfectadas foram analisados.
[0123] Exemplo 5-1: Cultura das linhagens de células tumorais
Células cancerígenas cervicais humanas (HeLa), obtidas na American Type Culture Collection (ATCC), foram cultivadas em um meio de cultura RPMI 1640 (GIBCO, Invitrogen, USA), onde 10% (v/v) de soro bovino fetal, penicilina 100 unidades/^, e estreptomicina 100 ^/^ foram adicionadas a 37°C sob condição de 5% (v/v) CO2.
[0124] Exemplo 5-2: Inibição da expressão de gene alvo pelo emprego de conjugados de siRNA-composto polimérico
Linhagens de células tumorais HeLa foram transfectadas com conjugados de siRNA-composto polimérico 1 a 8 da Sequência ID No. 1, preparada no Exemplo 2, e a expressão de genes survivinas foi analisada nas linhagens de células tumorais transfectadas.
[0125] Exemplo 5-2-1: Transfecção de linhagens de células tumorais pelo emprego de conjugados de siRNA-composto polimérico
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1,3 x 105 linhagens de células tumorais cultivadas no Exemplo 5-1 foram cultivadas no meio RPMI 1640 dentro de uma placa de 6 poços a 37 °C por 18 horas sob a condição de 5%(v/v) CO2, seguido por remoção do meio, e então 800 do meio Opti-MEM (GIBCO, USA) foram dispensados em cada poço.
[0126] Neste meio tempo, 2 de Lipofectamine ™ 2000 (Invitrogen, USA) e 198 de meio Opti-MEM foram misturados, seguido por reação entre os mesmos a temperatura ambiente por 5 minutos, e então 0,8 ou 4 dos respectivos conjugados de siRNA-composto polimérico (25 pmol/) preparados no Exemplo 2 foram adicionados ao mesmo (tratados no final a 20 ou 100 nM). Então, esta substância resultante foi novamente reagida a temperatura ambiente por 20 minutos, para preparar uma solução.
[0127] Após isto, 200 da solução de transfecção foram dispensados a cada um dos poços onde o meio Opti-MEM foi disperso, e as células tumorais foram cultivadas por 6 horas, seguido por remoção do meio Opti-MEM. 2,5 do meio de cultura RPMI 1640 foram dispensados às mesmas, e então as células tumorais foram cultivadas a 37 C sob a condição de 5%( v/v) CO2 por 24 horas.
[0128] Exemplo 5-2-2: Análise quantitativa relativa do mRNA do gene survivina
RNA total foi extraído da linhagem celular transfectada no Exemplo 5-2-1 para preparar cDNA, e então a quantidade do mRNA do gene survivina foi relativamente quantificada através da PCR em tempo real.
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46/59 [0129] Exemplo 5-2-2-1: Separação de RNA e preparação de cDNA a partir das células transfectadas
RNA total foi extraído da linhagem celular transfectada no Exemplo 5-2-1 pelo emprego de um kit de extração de RNA (Kit de extração total de RNA de célula AccuPrep BIONEER, Coréia), e cDNA foi preparado do RNA extraído pelo emprego de uma transcriptase reversa de RNA (AccuPower CycleScript RT Premix/dT20, BIONEER, Coréia), como se segue.
[0130] Especificamente, 1 do RNA extraído foi colocado em cada um dos tubos Eppendorf de 0,25 contendo AccuPower CycleScript RT Premix/dT20 (BIONEER, Coréia), e a água destilada tratada com pirocarbonato de dietila (DEPC) foi adicionada ao mesmo para obter um volume total de 20 Pelo emprego de uma máquina de PCR (MyGenie™ 96 Gradient Thermal Block, BIONEER, Coréia), duas etapas de hibridização de RNA-iniciador a 30 °C por 1 minuto e síntese de cDNA a 52 C por 4 minutos foram repetidas seis vezes. Então, a inativação da enzima foi realizada a 95C por 5 minutos para terminar a reação de ampliação.
[0131] Exemplo 5-2-2-2: Análise quantitativa relativa do mRNA do gene survivina
A quantidade relativa do mRNA survivina foi quantificada através da PCR em tempo real pelo emprego do cDNA preparado no Exemplo 5-2-2-1, como um modelo, como se segue.
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47/59 [0132] Ou seja, o cDNA preparado no Exemplo 5-2-2-1 foi diluído a 1/5 com água destilada em cada poço da placa de 96 poços, e então 3 do cDNA diluído, 10 de 2 x GreenStar™ Misturador PCR master (BIONEER, Coréia), 6 de água destilada, e 1 de iniciador de qPCR survivina (10 pmol/ cada, BIONEER, Coréia) deram entrada para preparar uma mistura líquida, de modo a analisar o nível de expressão de sobrevivência. Por outro lado, pelo emprego de HMBS (Hidroximetilbilase sintase), HPRT1 (Hipoxantina fosforibosil-transferase 1), UBC (Ubiquitina C), e YWHAZ (proteína de ativação de tirosina 3monooxigenase/triptofano 5-monooxigenase, polipeptídeo), que são genes constitutivos (doravante, referidos como “genes HK), como o gene de referência, a fim de normalizar o nível de expressão de mRNA, o cDNA preparado no Exemplo 5-2-2-1 foi diluído a 1/5, e então 3 do cDNA diluído, 10 de 2 x GreenStar ™ Misturador PCR master (BIONEER, Coréia), 6 de água destilada, e 1 do iniciador de qPCR de cada gene HK (10 pmol/ cada, BIONEER, Coréia) deram entrada para preparar uma mistura líquida para PCR em tempo real de gene HK em cada poço da placa de 96 poços. A reação que se segue foi realizada na placa de 96 poços contendo a mistura líquida pelo emprego de um Exicycler™ 96 Bloco Término Quantitativo em Tempo Real (BIONEER, Coréia).
[0133] A ativação da enzima e estrutura secundária de cDNA foram removidas por reação a 95 °C por 15 minutos. Então, quatro etapas de desnaturação a 94 C por 30 segundos, recombinação a 58 C por 30 segundos, extensão a 72 C por
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48/59 segundos e varredura de SYBR verde foram realizadas repetidamente 42 vezes e então a extensão final a 72 °C por 3 minutos foi realizada. Então a temperatura foi mantida a 55 C por 1 minuto, e uma curva de fusão de 55 C-95 C foi analisada.
[0134] Após o término da PCR, valores de Ct de sobrevivência (ciclo limite) obtidos respectivamente foram corrigidos pelo emprego de valores de mRNA (fator de normalização, NF) normalizados através dos genes HK e então os valores Δ Ct foram obtidos entre o valor Ct de um grupo de controle tratado apenas com um reagente de transfecção e os valores de Ct corrigidos. As taxas de expressão de mRNA survivina foram comparadas uma com a outra por emprego dos valores de Δ Ct e o cálculo da equação de 2(-Δ Ct)X100 (figura 17). Na figura 17, imitação mock significa o grupo de controle tratado apenas com o reagente de transfecção.
[0135] Como resultado, conforme mostrado na figura 17, isto mostrou que o efeito RNAi do siRNA variou dependendo dos tipos de modificação de extremidade dos conjugados de siRNA-composto polimérico onde PEG, o composto polimérico hidrófilo foi conjugado. Especificamente, os conjugados 6 a 8 cada um apresentando o tipo de modificação de extremidade onde PEG foi conjugado para a região de extremidade 3', exibiram graus de expressão-inibição semelhantes aos do siRNA desnudado. Portanto, espera-se que os conjugados 6 a 8 apresentem um impedimento estérico pequeno na formação de um complexo com um complexo de
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49/59 silenciamento induzido por RNA (RISC) no mecanismo RNAi do siRNA. Além disso, os conjugados siRNA-PEG exibiram inibição maior da expressão de mRNA de gene alvo em uma condição de tratamento de concentração baixa (20 nM) que em uma condição de tratamento de concentração alta (100 nM) e assim espera-se que siRNA seja impedido de se ligar ao RISC devido ao PEG como a condição de concentração do conjugado de siRNA-PEG é maior.
[0136] Exemplo 5-3: Inibição da expressão do gene alvo pelo emprego de conjugados de siRNA-composto polimérico de sequência longa
Quando as células foram transfectadas com conjugados de siRNA-composto polimério hidrófilo em conjunto com um reagente de transcrição, a inibição da expressão de mRNA de gene alvo foi analisada. No presente documento foram empregados os siRNAs, nos quais a modificação de extremidade dentro da estrutura do conjugado de siRNA-composto polimérico 4 foi induzida para cada sequencia de base da Sequência ID NO. 1 a 4 de siRNA.
[0137] Exemplo 5-3-1: Transfecção das linhagens de células tumorais pelo emprego dos conjugados de siRNAcomposto polimérico
1,3 x 105 linhagens de células tumorais cultivadas no Exemplo 5-1 foram cultivadas no meio RPMI 1640 dentro de uma placa de 6 poços a 37 °C, por 24 horas sob a condição de 5% (v/v) CO2, seguido por remoção do meio, e então 800 do meio Opti-MEM foram dispensados em cada poço.
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50/59 [0138] Neste meio tempo, 2 de Lipofectamine™ 2000 e 198 do meio Opti-MEM foram misturados, seguido por reação entre os mesmos a temperatura ambiente por 5 minutos, e então 0,8 ou 4 dos respectivos conjugados de siRNAcomposto polimérico (25 pmol/) preparados no Exemplo 2 foram adicionados ao mesmo (tratados no final a 20 ou 100 nM). Então, esta substância resultante foi novamente reagida à temperatura ambiente por 20 minutos, para preparar uma solução.
[0139] Após isto, 200 de uma solução de transfecção foram dispensados a cada um dos poços onde o meio Opti-MEM foi disperso, e as células tumorais foram cultivadas por 6 horas, seguido por remoção do meio Opti-MEM. 2,5 do meio de cultura RPMI 1640 foram dispensados, e então as células tumorais foram cultivadas a 37 °C sob a condição de 5% (v/v) CO2 por 24 horas.
[0140] Exemplo 5-3-2: Análise quantitativa relativa do mRNA do gene survivina
RNA total foi extraído da linhagem celular transfectada no Exemplo 5-3-1 para preparar cDNA, e então a quantidade de mRNA do gene survivina foi relativamente avaliada através da PCR em tempo real.
[0141] Exemplo 5-3-2-1: Separação do RNA e preparação de cDNA a partir de células transfectadas
RNA total foi extraído da linhagem celular transfectada no Exemplo 5-3-1 pelo emprego de um kit de extração de RNA (Kit de extração total de RNA de célula
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AccuPrep BIONEER, Coréia), e cDNA foi preparado do RNA extraído pelo emprego de uma transcriptase reversa de RNA (AccuPower CycleScript RT Premix/dT20, BIONEER, Coréia), como se segue.
[0142] Especificamente, 1 do RNA extraído foi colocado em cada um dos tubos Eppendorf de 0,25 contendo
AccuPower CycleScript RT Premix/dT20 (BIONEER, Coréia), e a água destilada tratada com pirocarbonato de dietila (DEPC) foi adicionada ao mesmo para obter um volume total de 2 0 . Pelo emprego de uma máquina de PCR (MyGenie ™
Bloco Térmico de Gradiente, BIONEER, Coréia), duas etapas de hibridização de RNA-iniciador a 30 °C por 1 minuto e preparação de cDNA a 52 C por 4 minutos foram repetidas seis vezes. Então, a inativação da enzima foi realizada a 95 C por 5 minutos para terminar a reação de ampliação.
[0143] Exemplo 5-3-2-2: Análise quantitativa relativa do mRNA do gene survivina
A quantidade relativa de RNA de gene survivina foi quantificada através da PCR em tempo real pelo emprego do cDNA preparado no Exemplo 5-3-2-1 como um modelo como se segue.
[0144] Ou seja, o cDNA preparado no Exemplo 5-3-2-1 foi diluído a 1/5 em cada poço da placa de 96 poços, e então 3 do cDNA diluído, 10 de 2X GreenStar™ Misturador PCR master (BIONEER, Coréia), 6 de água destilada, e 1 de iniciador de qPCR survivina (10 pmol/cada, BIONEER,
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Coréia) deram entrada para preparar uma mistura líquida, de modo a analisar o nível de expressão de sobrevivência. Por outro lado, pelo emprego de HMBS, HPRT1, UBC e YWHAZ, que são gene HK, como o gene de referência, a fim de normalizar o nível de expressão de mRNA, o cDNA preparado no Exemplo 5-3-2-1 foi diluído a 1/5, e então 3 do cDNA diluído, 10 de 2 x GreenStar ™ Misturador PCR master (BIONEER, Coréia), 6 de água destilada, e 1 do iniciador de qPCR de cada gene HK (10 pmol/ cada, BIONEER, Coréia) deram entrada para preparar uma mistura líquida para PCR em tempo real, de gene HK, em cada poço da placa de 96 poços. A reação que se segue foi realizada na placa de 96 poços contendo a mistura líquida pelo emprego de um Exicycler™ 96 Bloco Térmico Quantitativo em Tempo Real (BIONEER, Coréia).
[0145] A ativação da enzima e estrutura secundária de cDNA foram removidas por reação a 95 °C por 15 minutos. Então, quatro etapas de desnaturação a 94 C por 30 segundos, recombinação a 58 C por 30 segundos, extensão a 72 C por 30 segundos e varredura de SYBR verde foram realizadas repetidamente 42 vezes e então a extensão final a 72C por 3 minutos foi realizada. Então a temperatura foi mantida a 55 C por 1 minuto, e uma curva de fusão de 55 C -95 C foi analisada.
[0146] Após o término da PCR, valores de Ct de sobrevivência (ciclo limite) obtidos respectivamente foram corrigidos pelo emprego de valores de mRNA (fator de normalização, NF) normalizados através dos genes HK e
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53/59 então os valores Δ Ct foram obtidos entre o valor Ct de um grupo de controle tratado apenas com um reagente de transfecção e os valores de Ct corrigidos. As taxas de expressão de mRNA survivina foram comparadas uma com a outra por emprego dos valores de Δ Ct e o cálculo da equação de 2(-Δ Ct)X100 (figura 17). Na figura 17, imitação significa o grupo de controle tratado apenas com o reagente de transfecção e 19mer, 23mer, 27mer, e 31mer representam Sequência ID No. 1 a 4, respectivamente. 5'P+P representa a estrutura do conjugado de siRNAcomposto polimérico 4. As células foram tratadas com 20 nM e 100 nM respectivamente e os graus de inibição da expressão de gene alvo foram comparados um com o outro.
[0147] Como resultado, conforme mostrado na figura 18, os siRNAs desnudados de cadeia longa transformados na forma do conjugado de siRNA-composto polimérico 4 exibiram menos diferença na inibição da expressão de mRNA de gene alvo, em comparação ao siRNA desnudado. Portanto, seria verificado que o siRNA de cadeia longa transformado diminui o fenômeno de impedimento estérico devido ao PEG em comparação com uma cadeia curta.
[0148] Ou seja, no caso do siRNA de cadeia longa, o siRNA é clivado em uma estrutura de 19+2 por uma dicer em um mecanismo operacional de RNAi, e o siRNA clivado é ligado a um complexo RISC para obter o mecanismo operacional de RNAi. Por esta razão, o siRNA de cadeia longa, no qual PEG é provido em ambas regiões de extremidade, promove a existência de uma grande quantidade de siRNAs sem anexação
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PEG e assim, apresenta uma interação relativamente alta com o complexo RISC, em comparação com a Sequência ID No. 1, que se acredita mantém o efeito de indução de RNAi.
[0149] Exemplo 6: Inibição da expressão do gene alvo nas linhagens de células tumorais pelo emprego de apenas conjugados de siRNA-composto polimérico sem reagentes de transfecção
Linhagens de células tumorais HeLa foram transfectadas com conjugados de siRNA-composto polimérico 1 a 14 preparados no Exemplo 2, e foi analisada a expressão gênica survivina das linhagens de células tumorais transfectadas.
[0150] Exemplo 6-1: Cultura das linhagens de células tumorais
Células cancerígenas uterinas humanas (HeLa), obtidas da American Type Culture Collection (ATCC), foram cultivadas em um meio de cultura RPMI 1640 (GIBCO/Invitrogen, USA), onde 10% (v/v) de soro bovino fetal, penicilina 100 unidades/^, e estreptomicina 100 ^g/ foram adicionados, a 37°C, sob a condições de 5% (v/v) CO2.
[0151] Exemplo 6-2: Transfecção de linhagens de células tumorais por emprego de conjugados de siRNA-composto polimérico
1,3 x 105 linhagens de células tumorais cultivadas no Exemplo 6-1 foram cultivadas no meio RPMI 1640 em uma placa de 6 poços a 37 °C por 24 horas sob a condição de 5 %(v/v)
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CO2, seguido por remoção do meio, e então 900 do meio Opti-MEM foram dispensados em cada poço.
[0152] Nesse meio tempo, 100 do meio Opti-MEM, 5 ou 10 dos respectivos conjugados de siRNA-composto polimérico 1 a 5 (1 nmol/ ) preparados no Exemplo 2 foram adicionados ao mesmo (tratados no final a 500 nM ou 1 JM) , e a substância resultante foi novamente reagida a temperatura ambiente por 20 minutos, para preparar a solução.
[0153] Nesse meio tempo, 100 do meio Opti-MEM, 5 ou 10 dos respectivos conjugados de siRNA-composto polimérico 9 a 14 (1 nmol/ ) preparados no Exemplo 2 foram adicionados (tratados de forma final com 500 nM ou 1JM), e as micelas consistindo nos conjugados de siRNA-composto polimérico hidrófobo foram homogeneizados através de sonicação por sinais de alta frequência para preparar a solução.
[0154] Após isto, 100 da solução de transfecção foram dispensados a cada um dos poços onde o meio Opti-MEM foi disperso, e as células tumorais foram cultivadas por 24 horas, seguido por adição de 1 de meio RPMI 1640 contendo FBS a 20%. As células foram cultivadas adicionalmente a 37 °C por 24 horas sob condição de 5% (v/v) CO2, tratadas com conjugados de siRNA-composto polimérico, e então cultivadas por um total de 48 horas.
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56/59 [0155] Exemplo 6-3: Análise quantitativa relativa do mRNA do gene survivina
RNA total foi extraído da linhagem celular transfectada no Exemplo 6-2 para preparar cDNA, e então a quantidade do mRNA do gene survivina foi relativamente quantificada através da PCR em tempo real [0156] Exemplo 6-3-1: Separação do RNA e preparação de cDNA de células transfectadas
RNA total foi extraído da linhagem celular transfectada no Exemplo 6-2 pelo emprego de um kit de extração de RNA (Kit de extração total de RNA de célula AccuPrep BIONEER, Coréia), e cDNA foi preparado do RNA extraído pelo emprego de uma transcriptase reversa de RNA (AccuPower CycleScript RT Premix/dT20, BIONEER, Coréia), como se segue.
[0157] Especificamente, 1 do RNA extraído foi colocado em cada um dos tubos Eppendorf de 0,25 contendo AccuPower CycleScript RT Premix/dT20 (BIONEER, Coréia), e a água destilada tratada com pirocarbonato de dietila (DEPC) foi adicionada ao mesmo para obter um volume total de 20 Pelo emprego de uma máquina de PCR (MyGenie™ 96 Bloco Térmico Gradiente, BIONEER, Coréia), duas etapas de hibridização de RNA-iniciador a 30 °C por 1 minuto e preparação de cDNA a 52 C por 4 minutos foram repetidas seis vezes. Então, a inativação da enzima foi realizada a
95C por 5 minutos para terminar a reação de ampliação.
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57/59 [0158] Exemplo 6-3-2: Análise quantitativa relativa do mRNA do gene survivina
A quantidade relativa do mRNA do gene survivina foi quantificada através da PCR em tempo real pelo emprego do cDNA preparado no Exemplo 6-3-1 como um modelo como se segue.
[0159] Ou seja, o cDNA preparado no Exemplo 6-3-1 foi diluído a 1/5 em cada poço da placa de 96 poços, e então 3 do cDNA diluído, 10 de 2x GreenStar™ Misturador PCR master(BIONEER, Coréia), 6 de água destilada, e 1 de iniciador de qPCR survivina (10 pmol/ cada, BIONEER, Coréia) foram empregados para preparar uma mistura líquida de modo a analisar o nível de expressão de sobrevivência. Por outro lado, pelo emprego de HMBS (Hidroximetil-bilano sintase), HPRT1 (Hipoxantina fosforibosil-transferase 1), UBC (Ubiquitina C), YWHAZ (proteína de ativação de tirosina 3-monooxigenase/triptofano 5-monooxigenase, polipeptídeo zeta), que são genes constitutivos (doravante, referidos como “genes HK), como o gene de referência, a fim de normalizar o nível de expressão de mRNA, o cDNA preparado no Exemplo 6-3-1 foi diluído a 1/5, e então 3 do cDNA diluído, 10 de 2 x GreenStar ™ Misturador PCR master (BIONEER, Coréia), 6 de água destilada, e 1 do iniciador de qPCR de cada gene HK (10 pmol/cada, BIONEER, Coréia) deram entrada para preparar uma mistura líquida para PCR em tempo real de gene HK em cada poço da placa de 96 poços. A reação que se segue foi realizada na placa de 96 poços contendo a mistura líquida
Petição 870190138064, de 22/12/2019, pág. 64/68
58/59 pelo emprego de um Exicycler ™ 96 Bloco Térmico
Quantitativo em Tempo Real (BIONEER, Coréia).
[0160] A ativação da enzima e estrutura secundária de cDNA foram removidas por reação a 95 °C por 15 minutos. Então, quatro etapas de desnaturação a 94 C por 30 segundos, recombinação a 58 C por 30 segundos, extensão a 72 C por 30 segundos e varredura de SYBR verde foram realizadas repetidamente 42 vezes e então a extensão final a 72C por 3 minutos foi realizada. Então a temperatura foi mantida a 55 C por 1 minuto, e uma curva de fusão de 55 C -95 C foi analisada. Após o término da PCR, valores de Ct de sobrevivência (ciclo limite) obtidos respectivamente foram corrigidos pelo emprego de valores de mRNA (fator de normalização, NF) normalizados através dos genes HK e então os valores Δ Ct foram obtidos entre o valor Ct de um grupo de controle tratado apenas com um reagente de transfecção e os valores de Ct corrigidos. As taxas de expressão de mRNA survivina foram comparadas uma com a outra por emprego dos valores de Δ Ct e o cálculo da equação de 2(^Ct)X100 (figura 19).
[0161] Como resultado, conforme mostrado na figura 19, conjugados de siRNA PEG dos conjugados 2 a 5 inibiram altamente o nível de sobrevivência de mRNA, em comparação ao conjugado de siRNA-composto polimérico 1, a despeito do resultado do caso no qual a transfecção foi realizada através do reagente de transfecção. Os conjugados de siRNA-composto polimérico 1 a 5 exibiram efeito RNAi mais alto em uma concentração baixa (500 nM) em relação a uma
Petição 870190138064, de 22/12/2019, pág. 65/68
59/59 concentração alta. Além disso, os conjugados de siRNApolímero hidrófobo dos conjugados 9 a 14 exibiram uma inibição mais baixa do nível de expressão de mRNA survivina, em comparação aos conjugados de siRNA 1 a 5, quando tratados na mesma concentração (500 nM). Contudo, quando tratados na condição de concentração alta (1 μΜ), especificamente a modificação de término do conjugado de siRNA-composto polimérico 14 conduz a um efeito de inibição alto do nível de expressão de mRNA survivina.
Claims (6)
- REIVINDICAÇÕES1. Conjugado de siRNA - composto polimérico da seguinte estrutura:A - X - R - Y - B caracterizado pelo fato de que um dentre A e B é um composto polimérico hidrófilo e o outro um composto polimérico hidrófobo; X e Y são independentemente uma ligação covalente simples ou uma ligação covalente mediada por ligante; e R é siRNA e onde dito composto hidrófobo é um hidrocarboneto C16 C50 ou colesterol cujo peso molecular é de 250 a 1.000.2. Conjugado, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o composto polimérico hidrófilo e o composto polimérico hidrófobo são conjugados ao mesmo filamento de siRNA.3. Conjugado, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o composto polimérico hidrófilo e o composto polimérico hidrófobo são conjugados a ambos filamentos de siRNA.4. Conjugado, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que um filamento simples de siRNA (R) compreende de 19 a 31 nucleotídeos.5. Conjugado, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a ligação covalente (X, Y) é uma ligação não degradável ou uma ligação degradável.Petição 870190081608, de 21/08/2019, pág. 14/212 /8
6. Conjugado, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que a ligação não degradável é uma ligação amido ou uma ligação fosfato. 7. Conjugado, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que a ligação degradável é selecionada de uma ligação dissulfeto, uma ligação clivável ácida, uma ligação éster, uma ligação anidro, uma ligação biodegradável e uma ligação clivável por enzima.8. Conjugado, de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que o composto polimérico hidrófilo é um composto polimérico não iônico apresentando um peso molecular de 1.000 a 10.000.9. Conjugado, de acordo com a reivindicação 8, caracterizado pelo fato de que o composto polimérico hidrófilo é selecionado de um grupo consistindo em polietileno glicol (PEG), polivinilpirolidona e polioxazolina.10. Método para preparação de 3'-PEG-CPG da fórmula estrutural IV, caracterizado pelo fato de compreender:1) reação do CPG com 3-aminopropiltrietoxisilano para formar vidro de poro controlado de alquil amina de cadeia longa (LCAA-CPG); - 2) reação de polietileno glicol com cloreto de 4, 41 - trimetoxitritila para formar 2 - [bis- (4 dimetoxitritil) - poli (etileno glicol);Petição 870190081608, de 21/08/2019, pág. 15/213/8
- 3) reação do composto formado na etapa (2) com um composto da seguinte fórmula química 1, para formar um composto da fórmula estrutural I;
- 4) reação do composto formado da fórmula estrutural I com 4 - nitrofenilcloroformato para formar um composto da fórmula estrutural II;
- 5) reação do composto a fórmula estrutural I formado na etapa (3) com ácido N - succinimidil trifluoroacético para formar um composto de seguinte fórmula estrutural III; e
- 6) reação do composto LCAA-CPG formado na etapa (1) com os compostos das fórmulas estruturais I, II e III formados respectivamente nas etapas (3), (4) e (5).[Fórmula química 1]
[Fórmula estrutural I]
Petição 870190081608, de 21/08/2019, pág. 16/214/8 [Fórmula estrutural II]
[Fórmula estrutural III]
[Fórmula estrutural IV]
onde:R é alquila, alquenila, alquinila, arila, arilalquila heeroalquila ou heteroarila; e n é um inteiro não menor que 5 e não maior que 120.Petição 870190081608, de 21/08/2019, pág. 17/215 /811. Método para preparação do conjugado como definido na reivindicação 1, caracterizado pelo fato de compreender:1) preparação de um filamento simples de conjugado de siRNA - PEG utilizando o suporte sólido de ligação de polietileno glicol; e2) ligação de um composto polimérico hidrófobo ao filamento conjugado PEG na extremidade distal por uma ligação covalente;3) anelamento do filamento onde PEG e o composto polimérico hidrófobo são conjugados em ambas extremidades do filamento complementar.12. Método para preparação do conjugado como definido na reivindicação 1, caracterizado pelo fato de compreender:1) ligação de uma extremidade do grupo de um filamento de siRNA ao PEG ou um composto polimérico hidrófobo por uma ligação covalente;2) ligação de uma extremidade do grupo do outro filamento do siRNA ao PEG (se um composto polimérico hidrófobo for ligado na etapa 1) ou um composto polimérico hidrófobo (se PEG for ligado na etapa 1) por uma ligação covalente;3) anelamento do filamento da etapa 1 com o outro filamento da etapa 2.13. Nanopartícula, caracterizada pelo fato de que consiste em conjugados de siRNA como definidos na reivindicação 1.14. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende uma quantidade farmaceuticamente eficaz dosPetição 870190081608, de 21/08/2019, pág. 18/216 /8 conjuntos conjugados de siRNA como definidos na reivindicação 1.15. Composição farmacêutica, caracterizada pelo fato de que compreende uma quantidade farmaceuticamente eficaz de nanopartículas como definidas na reivindicação 13.16. Conjugado de siRNA específico de survivina e composto polimérico de estrutura abaixo:A - X - R - Y - B caracterizado pelo fato de que um dentre A e B é um composto polimérico hidrófilo e o outro um composto polimérico hidrófobo; X e Y são independentemente uma ligação covalente simples ou uma ligação covalente mediada por ligante; e R é um siRNA específico de survivina sendo qualquer um selecionado das seqüências de nucleotídeos de SEQ ID Nos.: 1 a 4.17. Conjugado, de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de um filamento simples de siRNA específico de survivina (R) ser composto por 19 a 31 nucleotídeos.18. Conjugado, de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de dito composto polimérico hidrófobo ser um hidrocarboneto saturado ^16_^50 ou colesterol, com peso molecular de 250 a 1.000, e onde a ligação covalente (X,Y) no conjugado de siRNA é uma ligação não degradável ou degradável.Petição 870190081608, de 21/08/2019, pág. 19/217 /819.Conjugado, de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de um siRNA específico de survivina (R) ter modificação química.20. Conjugado, de acordo com a reivindicação 19, caracterizado pelo fato da modificação química incluir pelo menos um, selecionado de:- modificar uma ligação fosforodiéster em uma ligação de fosforotioato;- modificar -OH na posição 2' de uma pentose para 2' OCH3 ou 2' - dioxi - 2' - fluoridina; e- modificar -OH na posição 2' da pentose para um tipo de LNA formado pela ligação na posição 2' e na posição 4' da pentose.21. Conjugado, de acordo com a reivindicação 16, caracterizado pelo fato de que o composto polimérico hidrófobo apresenta um peso molecular de 250 a 1.000; o composto polimérico hidrófilo é um composto polimérico não iônico tendo um peso molecular de 1.000 a 10.000; e a ligação covalente é uma ligação não degradável ou uma ligação degradável.22. Conjugado, de acordo com a reivindicação 21, caracterizado pelo fato de que a ligação não degradável é uma ligação amido ou uma ligação fosfato; e a ligação degradável é selecionada de uma ligação dissulfeto, uma ligação clivável ácida, uma ligação éster, uma ligação anidrido, uma ligação biodegradável e uma ligação clivável por enzima.Petição 870190081608, de 21/08/2019, pág. 20/218 /823. Conjugado, de acordo com a reivindicação 21, caracterizado pelo fato de que o composto polimérico hidrófilo inclui pelo menos um selecionado de polietileno glicol, polivinilpirolidona e polioxazolina.24. Nanopartícula caracterizada pelo fato de compreender o conjugado como definido na reivindicação 22.25.Composição caracterizada pelo fato de compreender conjugado como definido na reivindicação22 como um componente farmaceuticamente eficaz.26.Composição caracterizada pelo fato de compreender nanopartícula como definida na reivindicação 24 como um componente farmaceuticamente eficaz.
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