ES2535605T5

ES2535605T5 - Utilización de lipasa ácida lisosomal para el tratamiento de la deficiencia en lipasa ácida lisosomal en pacientes

Info

Publication number: ES2535605T5
Application number: ES11758644.6T
Authority: ES
Inventors: Anthony Quinn
Original assignee: Synageva Biopharma Corp
Current assignee: Synageva Biopharma Corp
Priority date: 2010-09-09
Filing date: 2011-09-09
Publication date: 2018-04-30
Anticipated expiration: 2031-09-09
Also published as: RU2550961C2; PT2977057T; US20120064055A1; PL2613798T5; SG10201507199UA; RS53947B1; BR112013005673A2; SG188456A1; JP6156882B2; PT2613798E; WO2012050695A1; US12076376B2; KR20150038636A; MX365007B; AR082953A1; ME02062B; CO6710913A2; IL225095A; PL2977057T3; US20140348752A1

Description

imagen1

imagen2

imagen3

imagen4

imagen5

5

15

25

35

45

55

65

identidad entre las dos secuencias es función del número de posiciones idénticas compartidas por las secuencias (es decir, % de homología = # de posiciones idénticas/# total de posiciones x 100), teniendo en cuenta el número de huecos, y la longitud de cada hueco, que necesitan introducirse para un alineamiento óptimo de las dos secuencias. La comparación de secuencias y la determinación del porcentaje de identidad entre dos secuencias se pueden conseguir utilizando un algoritmo matemático, tal como se describe en los ejemplos no limitantes siguientes.

[0037] El porcentaje de identidad entre dos secuencias de aminoácidos puede determinarse usando el algoritmo de E. Meyers y W. Miller (Comput Appl Biosci, 4: 11-17 (1988)), que se ha incorporado en el programa ALIGN (versión 2.0), utilizando una tabla de residuos de peso PAM120, una penalización de longitud de hueco de 12 y una penalización por hueco de 4. Además, el porcentaje de identidad entre dos secuencias de aminoácidos puede determinarse utilizando el algoritmo de Needleman y Wunsch (J. Mol. Biol. 48: 444-453 (1970)) que se ha incorporado en el programa GAP en el paquete de software GCG (disponible en http://www.gcg.com), utilizando ya sea una matriz Blossom 62 o una matriz PAM250, y un peso de hueco de 16, 14, 12, 10, 8, 6, ó 4 y un peso de longitud de 1, 2, 3, 4, 5, ó 6.

[0038] Por un polipéptido "aislado" o un fragmento, variante, o derivado del mismo se entiende un polipéptido que no está en su medio natural. No se requiere ningún nivel particular de purificación. Por ejemplo, un polipéptido aislado puede extraerse de su entorno nativo o natural. Los polipéptidos y proteínas producidos de forma recombinante expresados en células huésped se consideran aislados tal como se describen en el presente documento, ya que son polipéptidos nativos o recombinantes que han sido separados, fraccionados o purificados parcial o sustancialmente por cualquier técnica adecuada.

[0039] Otros polipéptidos descritos en este documento son fragmentos, derivados, análogos, o variantes de los polipéptidos anteriores, y cualquier combinación de los mismos. Los términos "fragmento", "variantes", "derivado" y "análogo" cuando se refieren a cualquiera de los polipéptidos descritos en el presente documento incluyen cualquier polipéptido que retiene al menos parte de la actividad del polipéptido nativo correspondiente (por ejemplo, fragmentos de polipéptido LAL, variantes, derivados, y análogos que retienen la capacidad para hidrolizar ésteres de colesterol y/o triglicéridos). Los fragmentos de polipéptidos incluyen, por ejemplo, fragmentos proteolíticos, así como fragmentos por deleción. Las variantes de un polipéptido incluyen fragmentos tal como se describe anteriormente, y también polipéptidos con secuencias de aminoácidos alteradas debido a sustituciones, deleciones o inserciones de aminoácidos. Las variantes pueden ser naturales o de origen no natural. Las variantes de origen no natural pueden producirse usando técnicas de mutagénesis conocidas en la técnica. Los polipéptidos variantes pueden comprender sustituciones conservativas o no conservativas de aminoácidos, deleciones o adiciones. Los derivados son polipéptidos que han sido alterados con el fin de mostrar características adicionales que no se encuentran en el polipéptido nativo. Los ejemplos incluyen proteínas de fusión. Los polipéptidos variantes también pueden referirse en el presente documento como "análogos de polipéptidos". Tal como se utiliza en el presente documento, un "derivado" de un polipéptido en cuestión puede contener uno o más residuos químicamente derivatizados por reacción de un grupo lateral funcional. También se incluyen como "derivados" aquellos péptidos que contienen uno o más derivados de aminoácidos naturales de los veinte aminoácidos estándar. Por ejemplo, 4-hidroxiprolina se puede sustituir por prolina; 5-hidroxilisina se puede sustituir por lisina; 3-metilhistidina se puede sustituir por histidina; homoserina puede ser sustituido por serina; y/o la ornitina se puede sustituir por lisina.

[0040] El término "polinucleótido" pretende abarcar un ácido nucleico singular así como los ácidos nucleicos plurales, y se refiere a una molécula de ácido nucleico aislada o construcción, por ejemplo, ARN mensajero (ARNm) o ADN plasmídico (pDNA). Un polinucleótido puede comprender un enlace fosfodiéster convencional o un enlace no convencional (por ejemplo, un enlace amida, tal como se encuentra en los ácidos nucleicos peptídicos (PNA)). El término "ácido nucleico" se refiere a cualquiera de uno o más segmentos de ácido nucleico, por ejemplo, fragmentos de ADN o ARN, presentes en un polinucleótido. Por ácido nucleico o polinucleótido "aislado" se entiende una molécula de ácido nucleico, ADN o ARN, que ha sido extraído de su medio nativo. Por ejemplo, un polinucleótido recombinante que codifica LAL contenido en un vector se considera aislado para los fines de la presente descripción. Otros ejemplos de un polinucleótido aislado incluyen polinucleótidos recombinantes mantenidos en células huésped heterólogas o polinucleótidos purificados (parcial o sustancialmente) en solución. Las moléculas de ARN aisladas incluyen transcritos de ARN in vivo o in vitro de polinucleótidos de la presente descripción. Los polinucleótidos o ácidos nucleicos aislados según la presente descripción incluyen además dichas moléculas producidas sintéticamente. Además, un polinucleótido

: o un ácido nucleico pueden ser o pueden incluir un elemento regulador, tal como un promotor, sitio de unión a ribosomas, o un terminador de transcripción.

[0041] Tal como se utiliza en el presente documento, una "región codificante" es una parte de ácido nucleico que consiste en codones traducidos en aminoácidos. Aunque un "codón de parada" (TAG, TGA o TAA) no se traduce en un aminoácido, puede considerarse como parte de una región codificante, pero ninguna de las secuencias flanqueantes, por ejemplo, promotores, sitios de unión a ribosoma, terminadores de la transcripción, intrones, y similares, no son parte de una región codificante. Dos o más regiones codificantes de la presente descripción pueden estar presentes en una sola construcción de polinucleótido, por ejemplo, en un solo vector, o en construcciones de polinucleótidos separados, por ejemplo, en (diferentes) vectores separados. Además, cualquier vector puede contener una sola región codificante,

: o puede comprender dos o más regiones codificantes. Además, un vector, polinucleótido o ácido nucleico de la descripción pueden codificar regiones codificantes heterólogas, fusionados o no fusionados a un ácido nucleico que codifica un polipéptido LAL o fragmento, variante, o derivado del mismo. Las regiones codificantes heterólogas incluyen,

7

imagen6

5

15

25

35

45

55

65

[0048] Tal como se utiliza en el presente documento, "células huésped" se refiere a células que albergan vectores construidos utilizando técnicas de ADN recombinante y que codifican al menos un gen heterólogo.

[0049] Tal como se utiliza en el presente documento, los términos "N-glicanos", "oligosacárido", "estructura de oligosacárido", "patrón de glicosilación", "perfil de glicosilación," y "estructura de glicosilación" tienen esencialmente el mismo significado y se refieren cada uno a una o más estructuras que se forman a partir de residuos de azúcar y están unidos a proteínas glicosiladas.

[0050] Tal como se utiliza en el presente documento, el término "composición farmacéutica" se refiere a una mezcla de un compuesto descrito en el presente documento con otros componentes químicos, tales como vehículos, estabilizadors, diluyentes, agentes dispersantes, agentes de suspensión, agentes espesantes, y/o excipientes.

Pacientes con actividad de LAL insuficiente

[0051] Sin desear limitar la descripción al tratamiento de alguna afección o grupo de afecciones particulares, la descripción incluye el tratamiento de deficiencias en lipasa ácida lisosómica (LAL) en pacientes. Tal como se utiliza en el presente documento, un paciente con una deficiencia en LAL es cualquier paciente que tiene una actividad de LAL insuficiente. La actividad de LAL insuficiente en el paciente puede, por ejemplo, ser el resultado de bajos niveles de ARN, bajos niveles de proteínas, o baja actividad de la proteína. La actividad de LAL insuficiente puede resultar de una mutación en la secuencia codificante de LAL, una secuencia reguladora de LAL, o en otro gen (por ejemplo, un gen que regula LAL). La actividad de LAL insuficiente también puede ser el resultado de factores ambientales.

[0052] La presente descripción se puede utilizar para tratar una amplia variedad de afecciones en un sujeto o paciente. Por lo tanto, cualquier afección que pueda ser tratada de forma beneficiosa por LAL exógena según la descripción se incluye dentro del alcance de la descripción. Un aspecto de la descripción, y una realización de la invención, se centra en el tratamiento de enfermedades por depósits lisosomal (LSD) que resultan de una deficiencia en la lipasa ácida lisosomal, específicamente la enfermedad de Wolman (WD) y Enfermedad por Depósito de Ésteres de Colesterilo (CESD). Sin desear limitar la presente descripción a cualquier teoría o mecanismo de operación en particular, tanto WD como CESD pueden deberse a mutaciones en el locus de LAL y dar lugar a una acumulación masiva de material lipídico en los lisosomas en un número de tejidos y una profunda alteración en los mecanismos homeostáticos de colesterol y lípidos que pueden ser tratados mediante la administración de LAL exógena según los procedimientos de la presente descripción. Por lo tanto, en un caso, la deficiencia en LAL tratada según la descripción es WD. En otro caso, la deficiencia en LAL tratada según la descripción es CESD. En algunos casos, un diagnóstico de WD o CESD se basa en un análisis genético (por ejemplo, identificación de una mutación funcional en una secuencia codificante de LAL). En otros casos, un diagnóstico de WD o CESD se basa en los hallazgos clínicos (por ejemplo, el examen físico y/o pruebas de laboratorio).

[0053] En algunos casos, la LAL exógena puede utilizarse para tratar las complicaciones en una variedad de afecciones, tales como enfermedad de hígado graso no alcohólico (NAFLD) y la esteatohepatitis no alcohólica (NASH). La NAFLD se refiere a una enfermedad del hígado que tiene una histopatología similar a la enfermedad del hígado que es debida a la ingesta excesiva de alcohol. Se caracteriza por macrovesicularesteatosis que causa el agrandamiento del hígado. La NAFLD puede progresar a NASH que se refiere a la enfermedad hepática que es similar a NAFLD con la adición de la inflamación y el daño al hígado que puede conducir a fibrosis y cirrosis.

[0054] En algunos casos, la LAL exógena se puede utilizar para tratar afecciones incluyendo pancreatitis, por ejemplo, pancreatitis crónica y/o pancreatitis aguda, así como la lesión pancreática inducida por el alcohol, tal como pancreatitis inducida por el alcohol.

[0055] La LAL exógena producida por cualquier procedimiento útil se puede utilizar para tratar enfermedades debidas a la lesión celular inducida por alcohol, incluyendo, pero sin limitación, las lesiones celulares inducidas por el alcohol que dan lugar a la acumulación de ésteres de lípidos en el tejido corporal, tal como, pero sin limitación, hígado, bazo, intestino, y el tejido cardiovascular. Según la descripción, la mala absorción también se puede tratar mediante la administración de LAL exógena. La LAL exógena también es útil para el tratamiento de pacientes con enfermedad de Tangier e hipoalfalipoproteinemia familiar. La enfermedad de Tangier/hipoalfalipoproteinemia familiar se asocia con la acumulación de ésteres de colesterol en los macrófagos acompañada por hepatoesplenomegalia y/o linfadenopatía junto con niveles bajos de HDL que se pueden tratar mediante la administración de LAL exógena. Por ejemplo, sin desear limitar la descripción a ninguna teoría o mecanismo de operación en particular, la actividad de LAL alterada puede disminuir la expresión de ABCA1 y por el contrario un aumento de la actividad de LAL obtenida mediante la administración de LAL exógena a un paciente con la enfermedad de Tangier/hipoalfalipoproteinemia familiar aumentará la expresión de ABCA1 para superar los efectos de un gen ABCA1 con una actividad funcional reducida como resultado de polimorfismo.

[0056] En algunos casos, el nivel de actividad de LAL en un paciente antes del tratamiento es de aproximadamente el 1%, aproximadamente 2%, aproximadamente 3%, aproximadamente 5%, aproximadamente 10%, aproximadamente 15%, aproximadamente 20%, aproximadamente 30%, aproximadamente 40%, aproximadamente 50%, aproximadamente 60%, aproximadamente 70%, o aproximadamente 80% de los niveles normales de actividad de LAL.

9

imagen7

imagen8

imagen9

5

15

25

35

45

55

65

también puede aumentar la tasa de crecimiento (es decir, aumento del peso corporal) en un bebé o un paciente niño que padece deficiencia en LAL de aparición temprana. Por ejemplo, la administración de LAL exógena puede aumentar la tasa de aumento del peso corporal en al menos aproximadamente el 10%, aproximadamente el 20%, aproximadamente el 30%, aproximadamente el 40%, aproximadamente el 50%, aproximadamente el 60%, aproximadamente el 70%, aproximadamente el 80%, aproximadamente el 90%, aproximadamente el 100%, aproximadamente el 200%, aproximadamente el 300%, aproximadamente el 400%, o aproximadamente 500% de la tasa/velocidad de crecimiento observada antes de la administración. En algunos casos, la administración de LAL exógena restablece la tasa de crecimiento normal en un paciente niño que padece de deficiencia en LAL de aparición temprana (por ejemplo, Enfermedad de Wolman), cuya edad está entre aproximadamente 1 mes y aproximadamente 24 meses. "Normal" en este contexto se refiere a la tasa de crecimiento normal para el paciente que está siendo tratado determinado por un médico con experiencia ordinaria en la técnica de las ciencias médicas.

[0078] En un caso, por ejemplo, con referencia a WD y CESD u otras deficiencias en LAL, la hepatomegalia se invierte significativamente regresando el tamaño del hígado a un tamaño de que está dentro de aproximadamente un 1% a aproximadamente un 60% más grande que el normal. "Normal" en este contexto se refiere a un hígado de tamaño normal para el paciente que está siendo tratado según lo determinado por un médico con experiencia ordinaria en la técnica de las ciencias médicas. En un caso, el tamaño del hígado se reduce a entre aproximadamente un 1% y aproximadamente un 50% mayor de lo normal. En otro caso, el tamaño del hígado se reduce a entre aproximadamente un 1% y aproximadamente un 40% mayor de lo normal. En un caso, el tamaño del hígado se reduce a entre aproximadamente un 1% y aproximadamente un 30% mayor de lo normal. En otro caso, el tamaño del hígado se reduce a entre aproximadamente un 1% y aproximadamente un 20% mayor de lo normal. En otro ejemplo, el tamaño del hígado se reduce a entre aproximadamente un 10% y aproximadamente un 20% mayor de lo normal. Por ejemplo, el hígado puede ser un 10%, 11%, 12% 13% 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, o 20% mayor que el tamaño normal. En todavía otro caso, el tamaño del hígado se reduce a entre aproximadamente un 0% y aproximadamente un 10% mayor de lo normal. Por ejemplo, el hígado puede ser un 0%, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, o 10% mayor que el tamaño normal del hígado.

[0079] El tratamiento con LAL exógena también puede mejorar la función hepática. De este modo, en algunos casos, el tratamiento con LAL exógena es suficiente para restaurar la función normal del hígado y/o normalizar las pruebas hepáticas. En algunos casos, el tratamiento con LAL exógena es suficiente para disminuir los niveles séricos de transaminasas hepáticas, por ejemplo, en al menos aproximadamente el 20%, aproximadamente el 30%, aproximadamente el 40%, aproximadamente el 50%, aproximadamente el 60%, aproximadamente el 70%, aproximadamente el 80%, y/o a al menos aproximadamente el 90%. En un caso, el tratamiento con LAL exógena es suficiente para disminuir los niveles séricos de transaminasas hepáticas en al menos aproximadamente el 40%. En un caso, el tratamiento con LAL exógena es suficiente para disminuir los niveles séricos de transaminasas hepáticas en al menos aproximadamente el 50%. En un caso, el tratamiento con LAL exógena es suficiente para disminuir los niveles séricos de transaminasas hepáticas en al menos aproximadamente el 60%. En un caso, el tratamiento con LAL exógena es suficiente para disminuir los niveles séricos de transaminasas hepáticas en al menos aproximadamente el 70%. En un caso, el tratamiento con LAL exógena es suficiente para disminuir los niveles séricos de transaminasas hepáticas en al menos aproximadamente el 80%. En un caso, el tratamiento con LAL exógena es suficiente para disminuir los niveles séricos de transaminasas hepáticas en al menos aproximadamente el 90%.

[0080] En algunos casos, la transaminasa hepática es la alanina aminotransferasa (ALT). En un caso, la administración de LAL exógena es suficiente para reducir la ALT sérica. Por ejemplo, la administración de LAL exógena puede reducir la ALT en suero, por ejemplo, en al menos aproximadamente el 50%, 60%, 70%, 80% ó 90%. El nivel de ALT en suero puede servir como una indicación de daño hepático. Por lo tanto, la presente descripción también contempla procedimientos para reducir la lesión hepática en un paciente humano que padece deficiencia en LAL mediante la administración de una cantidad eficaz de LAL exógena para reducir la ALT en suero.

[0081] En algunos casos, la transaminasa hepática es aspartato transaminasa en suero (AST). En un caso, la administración de LAL exógena es suficiente para reducir la AST en suero. Por ejemplo, la administración de LAL exógena puede reducir la AST en suero, por ejemplo, en al menos aproximadamente el 50%, 60%, 70%, 80% ó 90%. El nivel de AST en suero puede servir como una indicación de daño hepático. Por consiguiente, la presente descripción también contempla un procedimiento para reducir la lesión hepática en un paciente que padece deficiencia en LAL mediante la administración de una cantidad eficaz de LAL exógena para reducir la AST en suero.

[0082] En algunos casos, el tratamiento con LAL exógena puede disminuir los niveles de ferritina en suero. Por lo tanto, en algunos casos, el tratamiento con LAL exógena es suficiente para disminuir la ferritina sérica, por ejemplo, en al menos aproximadamente el 20%, 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, ó 95% en comparación con los niveles de pretratamiento. En un caso, el tratamiento con LAL exógena es suficiente para disminuir los niveles séricos de ferritina en al menos el 50%. En otro caso, el tratamiento con LAL exógena es suficiente para disminuir los niveles séricos de ferritina en al menos aproximadamente el 60%. En un caso, el tratamiento con LAL exógena es suficiente para disminuir los niveles séricos de ferritina en al menos aproximadamente el 70%. En un caso, el tratamiento con LAL exógena es suficiente para disminuir los niveles séricos de ferritina en al menos aproximadamente el 80%. En un caso, el tratamiento con LAL exógena es suficiente para disminuir los niveles séricos de ferritina en al menos aproximadamente el 90%. En un caso, el tratamiento con LAL exógena es suficiente para disminuir los niveles séricos de ferritina en al

13 5

15

25

35

45

55

65

menos aproximadamente el 95%.

[0083] En un caso, por ejemplo, con referencia a la enfermedad de Wolman y CESD u otras deficiencias en LAL, la esplenomegalia se invierte significativamente regresando el tamaño del bazo a un tamaño de que está dentro de aproximadamente el 1% a aproximadamente el 60% más grande que el normal. "Normal" en este contexto se refiere a un bazo de tamaño normal para el paciente que está siendo tratado según lo determinado por un médico con experiencia ordinaria en la técnica de las ciencias médicas. En un caso, el tamaño del bazo se reduce a entre aproximadamente un 1% y aproximadamente un 50% mayor de lo normal. En otro caso, el tamaño del bazo se reduce a entre aproximadamente un 1% y aproximadamente un 40% mayor de lo normal. En un caso, el tamaño del bazo se reduce a entre aproximadamente un 1% y aproximadamente un 30% mayor de lo normal. En otro caso, el tamaño del bazo se reduce a entre aproximadamente un 1% y aproximadamente un 20% mayor de lo normal. En otro ejemplo, el tamaño del bazo se reduce a entre aproximadamente un 10% y aproximadamente un 20% mayor de lo normal. Por ejemplo, el bazo puede ser un 10%, 11%, 12% 13% 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, ó 20% mayor que el tamaño normal. En todavía otro caso, el tamaño del bazo se reduce a entre aproximadamente un 0% y aproximadamente un 10% mayor de lo normal. Por ejemplo, el bazo puede ser un 0%, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, o 10% mayor que el tamaño normal del bazo.

[0084] En un caso, la administración de LAL exógena es suficiente para disminuir la linfadenopatía (es decir, los ganglios linfáticos agrandados). Por lo tanto, en algunos casos, los ganglios linfáticos se reducen hasta aproximadamente un tamaño de que está dentro de aproximadamente el 1% a aproximadamente el 60% más grande que el normal. "Normal" en este contexto se refiere a los ganglios linfáticos de tamaño normal para el paciente que está siendo estudiado según lo determinado por un médico con experiencia ordinaria en la técnica de las ciencias médicas. En un caso, el tamaño de los ganglios linfáticos se reduce entre aproximadamente un 1% y aproximadamente un 50% mayor de lo normal. En otro caso, el tamaño de los ganglios linfáticos se reduce entre aproximadamente un 1% y aproximadamente un 40% mayor de lo normal. En un caso, el tamaño de los ganglios linfáticos se reduce entre aproximadamente un 1% y aproximadamente un 30% mayor de lo normal. En otro caso, el tamaño de los ganglios linfáticos se reduce entre aproximadamente un 1% y aproximadamente un 20% mayor de lo normal. En otro caso, el tamaño de los ganglios linfáticos se reduce entre aproximadamente un 10% y aproximadamente un 20% mayor de lo normal. Por ejemplo, los ganglios linfáticos pueden ser un 10%, 11%, 12% 13% 14%, 15%, 16%, 17%, 18%, 19%, o 20% mayor que el tamaño normal. En todavía otro ejemplo, el tamaño de los ganglios linfáticos se reduce entre aproximadamente un 0% y aproximadamente un 10% mayor de lo normal. Por ejemplo, el ganglio linfático puede ser un 0%, 1%, 2%, 3%, 4%, 5%, 6%, 7%, 8%, 9%, ó 10% más grande que el tamaño normal de los ganglios linfáticos. En otro caso, se lleva a cabo un análisis de lípidos para controlar la mejora de la afección. Por ejemplo, el análisis de lípidos se puede hacer para evaluar el efecto terapéutico de la LAL exógena. El análisis de lípidos puede llevarse a cabo en una muestra de tejido de un paciente (por ejemplo, una muestra de sangre, muestra de biopsia de hígado) mediante cualquier procedimiento útil, tal como, pero sin limitación, cromatografía líquida de alto rendimiento, cromatografía de gases, espectroscopía de masas, o cromatografía de capa fina, o cualquier combinación de las mismas según se considere apropiado por un experto en la técnica. En un caso, los análisis de lípidos realizados según la descripción demuestran niveles totales de colesterol, triglicéridos, lipoproteínas de baja densidad, lipoproteínas de alta densidad y/o éster de colesterilo.

[0085] En un caso, por ejemplo, con referencia a la enfermedad de Wolman y CESD u otras deficiencias en LAL, el análisis de lípidos de un paciente tratado según la descripción muestra una normalización de las concentraciones de lípidos en el hígado, bazo, intestino, ganglios linfáticos, y/o aorta como puede determinarse por un médico con experiencia ordinaria en el campo de las ciencias médicas.

[0086] Los niveles de lípidos pueden evaluarse utilizando los análisis de lípidos en plasma o los análisis de lípidos en tejido. En el análisis de lípidos en plasma, el plasma sanguíneo se pueden recoger, y pueden medirse los niveles plasmáticos de colesterol libre total utilizando, por ejemplo, ensayos colorimétricos con un kit de COD-PAP (Wako Chemicals), los triglicéridos plasmáticos totales pueden medirse utilizando, por ejemplo, un kit de Triglicéridos/GB (Boehringer Mannheim), y/o el colesterol total en plasma se puede determinar usando un kit de colesterol/HP (Boehringer Mannheim). En el análisis de lípidos en tejidos, los lípidos se pueden extraer, por ejemplo, de hígado, bazo, y/o muestras de intestino delgado (por ejemplo, usando el procedimiento de Folch proporcionado en Folch et al J. Biol Chem 226: 497-505 (1957)). Las concentraciones de colesterol total en tejido se pueden medir, por ejemplo, usando Oftalaldehído.

[0087] En algunos casos, la administración de LAL exógena es suficiente para aumentar la absorción de nutrientes. En un caso, la administración exógena de LAL aumenta la absorción de nutrientes medida por los niveles de alfa tocoferol sérico, 25OH vitamina D, retinol sérico, dideshidroretinol o transtiretina.

[0088] En algunos casos, por ejemplo con referencia a WD y CESD u otras deficiencias en LAL, la administración de LAL exógena es suficiente para aumentar los niveles de hemoglobina (Hb) en suero. En un caso, el nivel de hemoglobina se incrementa al menos aproximadamente el 10% o aproximadamente el 20% en comparación con el observado antes de la administración con LAL exógena.

[0089] En algunos casos, la LAL exógena se puede administrar usando procedimientos para minimizar los efectos

14

imagen10

imagen11

imagen12

5

15

25

35

45

55

65

acuosas u oleosas, soluciones, emulsiones, jarabes o elixires, o se pueden presentar como un producto seco para constitución con agua u otro vehículo adecuado antes del uso. Dichas preparaciones líquidas pueden contener aditivos convencionales, tales como agentes de suspensión, agentes emulsionantes, vehículos no acuosos (que pueden incluir aceites comestibles) o conservantes.

[0109] Las proteínas terapéuticas de la presente descripción también se pueden formular para administración parenteral (por ejemplo, por inyección, por ejemplo inyección de bolo o infusión continua) y pueden presentarse en forma de dosificación unitaria en ampollas, jeringas precargadas, infusión de pequeño volumen o en recipientes de múltiples dosis con un conservante añadido. Las proteínas terapéuticas se pueden inyectar mediante, por ejemplo, inyecciones subcutáneas, inyecciones intramusculares, e infusiones o inyecciones intravenosas (IV). En un caso, la LAL exógena se administra intravenosamente mediante infusión IV por cualquier procedimiento útil. En un ejemplo, la LAL exógena se puede administrar mediante infusión intravenosa a través de una línea periférica. En otro ejemplo, la LAL exógena se puede administrar mediante infusión intravenosa a través de un catéter central de inserción periférica. En otro ejemplo, la LAL exógena se puede administrar mediante infusión intravenosa facilitada por una máquina de infusión ambulatoria conectada a un puerto de acceso vascular venoso. En un caso, de la infusión intravenosa, el medicamento se administra durante un período de 1 a 8 horas, dependiendo de la cantidad de medicamento a ser infundido y del historial de reacciones relacionadas con infusiones previas del paciente, según se determina por un médico experto en la técnica. En otro caso, la LAL exógena se administra por vía intravenosa mediante inyección IV. En otro caso, la LAL exógena se puede administrar a través de inyección intraperitoneal. En todavía otro caso, la LAL exógena se administra a través de una cápsula farmacéuticamente aceptable de la proteína terapéutica. Por ejemplo, la cápsula puede ser una cápsula de gelatina con cubierta entérica.

[0110] En algunos casos, las proteínas terapéuticas se administran mediante infusión, y la infusión puede tener lugar durante un período de tiempo prolongado, por ejemplo, de 30 minutos a 10 horas. Por lo tanto, la infusión puede tener, por ejemplo, durante un período de aproximadamente 1 hora, aproximadamente 2 horas, aproximadamente 3 horas, aproximadamente 4 horas, o aproximadamente 5 horas. La infusión también puede puede tener a diferentes tasas. De este modo, por ejemplo, la velocidad de infusión puede ser de aproximadamente 1 ml por hora a aproximadamente 20 ml por hora. En algunos casos, la velocidad de infusión es de 5 ml a 10 ml por hora. En un caso, la velocidad de infusión es 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ó 20 ml por hora . En un caso, la velocidad de infusión es de 0,1 a 5 mg/kg/h. En un caso, la velocidad de infusión es de aproximadamente 0,1, aproximadamente 0,2, aproximadamente 0,3, aproximadamente 0,5, aproximadamente 1,0, aproximadamente 1,5, aproximadamente 2,0, o aproximadamente 3 mg/kg/h.

[0111] Las proteínas terapéuticas pueden tomar formas, tales como suspensiones, soluciones, o emulsiones en vehículos oleosos o acuosos, y pueden contener agentes de formulación, tales como agentes de suspensión, estabilizadors y/o dispersantes. Las proteínas terapéuticas pueden estar en forma de polvo, obtenido por aislamiento aséptico de un sólido estéril o por liofilización a partir de la solución, para la constitución con un vehículo adecuado, por ejemplo, agua estéril, libre de pirógenos, antes de su uso.

[0112] Para la administración tópica a la epidermis, las proteínas terapéuticas se pueden formular como pomadas, cremas o lociones, o como un parche transdérmico. Los ungüentos y cremas pueden formularse, por ejemplo, con una base acuosa u oleosa con la adición de agentes espesantes y/o gelificantes adecuados. Las lociones pueden formularse con una base acuosa u oleosa y en general también contendrán uno o más agentes emulsionantes, agentes estabilizadors, agentes dispersantes, agentes espesantes, agentes de suspensión o agentes colorantes.

[0113] Las formulaciones adecuadas para la administración tópica en la boca incluyen pastillas de chupar que comprenden el principio activo en una base aromatizada, normalmente sacarosa y acacia o tragacanto; pastillas que comprenden el principio activo en una base inerte, tal como gelatina y glicerina o sacarosa y acacia; y enjuagues bucales que comprenden el principio activo en un portador líquido adecuado. Las formulaciones farmacéuticas adecuadas para la administración rectal en las que el portador es un sólido se representan más preferiblemente como supositorios en dosis unitaria. Los portadores adecuados incluyen manteca de cacao y otros materiales comúnmente usados en la técnica, y los supositorios pueden formarse convenientemente mediante mezcla del compuesto activo con el portador o portadores ablandados o fundidos, seguido por enfriamiento y conformación en moldes.

[0114] Las formulaciones adecuadas para administración vaginal pueden presentarse como pesarios, tampones, cremas, geles, pastas, espumas o pulverizadores que contienen, además del principio activo, potadores tales como se conocen en la técnica como apropiados.

[0115] Para la administración intranasal las proteínas terapéuticas de la invención se pueden utilizar como un pulverizador líquido o polvo dispersable o en forma de gotas.

[0116] Las gotas se pueden formular con una base acuosa o no acuosa que comprenden también uno o más agentes dispersantes, agentes solubilizantes o agentes de suspensión. Los pulverizadores líquidos se suministran convenientemente desde envases presurizados.

[0117] Para la administración por inhalación, las proteínas terapéuticas según la presente descripción pueden

18

imagen13

imagen14

imagen15

imagen16

imagen17

imagen18

imagen19

imagen20

imagen21

imagen22

imagen23

imagen24

imagen25

Administración de LAL recombinante en un modelo de rata

[0179] Se evaluaron los efectos de la dosificación con repetición con LAL humana recombinante en el peso, los

5 triglicéridos y el colesterol de tejidos, hepatomegalia, esplenomegalia, linfadenopatía, el peso intestinal, y otros parámetros en ratas Donryu deficientes en LAL descritos en Yoshida y Kuriyama (1990) Laboratory Animal Science, vol 40, p. 486-489 (véase también Kuriyama et al (1990) Journal of Lipid Research, vol 31, p 1605-1611; Nakagawa et al, (1995) Journal of Lipid Research, vol 36, p 2212-2218). A las 4 semanas de vida, se asignaron las ratas Donryu que son homocigotas para la deleción de LAL (LAL -/-) en

10 grupos para ser dosificadas con LAL humana recombinante producida en un sistema oviducto de pollo transgénico o con un placebo de solución salina. Como controles se utilizaron ratas crías de tipo salvaje de la misma edad. Las ratas LAL -/-se dosificaron una vez a la semana durante cuatro semanas (cuatro dosis en total) o una vez cada dos semanas durante cuatro semanas (dos dosis en total) mediante inyección en la vena de la cola como una sola dosis o en dos dosis iguales administradas con 30 minutos de diferencia. Las dosis de LAL recombinante fueron 1 mg/kg o 5 mg/kg. El

15 programa de dosificación se muestra en la tabla 5. Las ratas se pretrataron con difenhidramina (5 mg/kg) para contrarrestar posibles reacciones anafilácticas, un procedimiento que se basa en experiencias previas en modelos animales de tratamiento de sustitución enzimática para el tratamiento de la enfermedad de depósito lisosomal (Shull et al., (1994) Procedings of the National Academy of Science, vol 91, p.12937; Bielicki et al (1999) The Journal of Biological Chemistry, 274, p. 36335; Vogler et al (1999) Pediatric Research, 45, p. 838.).

20 [0180] La figura 9 muestra el progreso diario en el aumento de peso de ratas a las que se les administró 1 mg/kg de LAL recombinante por semana o 5 mg/kg de LAL recombinante por semana o 5 mg/kg de LAL recombinante por dos semanas. Se puede observar en la figura que hay poca o ninguna diferencia en el efecto terapéutico entre los dos tamaños de dosis y frecuencias.

25 Tabla 5

Día desde el nacimiento: Evaluaciones/inyecciones realizadas

Día 13: P E S A D O

Día 14

Día 20

Día 21: Cría destetada

Día 24

Día 25

Día 27

Día 28: Primera inyección para la administración una vez por semana y una vez cada dos semanas

Día 31

Día 32

Día 34

Día 35: Segunda inyección para la administración una vez por semana

Día 38

Día 39

Día 41

Día 42: Tercera inyección para la administración una vez por semana; segunda administración una vez cada dos semanas

Día 45

Día 48

Día 49: Cuarta inyección para la administración una vez por semana

Día 55

Día 56: Necropsia

Ejemplo 9

30

Examen patológico de ratas LAL -/-tratadas con LAL recombinante

[0181] Al final del estudio descrito en el ejemplo 8, se sacrificaron humanitariamente los animales de estudio y se hicieron las necropsias para examinar la patología macroscópica, la histopatología, y la química clínica. La necropsia 35 macoscópica incluyó el examen de la superficie externa del cuerpo, todos los orificios, y las cavidades craneal, torácica y abdominal y sus contenidos. Se determinó para las ratas la masa de órganos y tejidos internos y se recogieron los

33

imagen26

imagen27

imagen28

imagen29

imagen30

[0209] Como se tabulan en la tabla 12, los pacientes que recibieron la dosis semanal de 0,35 mg/kg de SBC-102 durante 4 semanas no mostraron niveles elevados de anticuerpo anti-SBC-102, lo que sugiere que la terapia de sustitución de enzimas por la infusión de SBC-102 no provoca ninguna inmunogenicidad significativa en pacientes humanos. Estos pacientes no presentan ningún efecto adverso o reacción relacionada con la infusión (IRR).

Tabla 12

Muestra: DO promedio Desv. Estan. Concentración de SBC102 (ng/ml)

Control negativo: 0,056 N/D 0

Control positivo 1: 0,076 0,005 15,6

Control positivo 2: 0,090 0,003 31,2

Control positivo 3: 0,132 0,008 62,5

Control positivo 4: 0,201 0,009 125

Control positivo 5: 0,349 0,019 250

Control positivo 6: 0,635 0,012 500

Control positivo 7: 0,958 0,101 1000

Paciente ID: DO promedio Desv. Estan.

01-001 Visita 1: 0,053 0,000

02-001 Visita 1: 0,051 0,000

02-001 Visita 7: 0,053 0,002

02-001 Visita 8: 0,050 0,001

03-001 Visita 1: 0,051 0,001

03-001 Visita 2: 0,051 0,001

03-001 Visita 7: 0,050 0,000

03-002 Visita 1: 0,052 0,004

03-002 Visita 2: 0,056 0,006

Ejemplo 17

10

Tratamiento de la enfermedad de Wolman (WD) mediante la administración de LAL recombinante

[0210] A las 7 semanas de vida una paciente es admitida en el hospital debido a la dificultad en el aumento de peso y la mala evolución desde su nacimiento. En la exploración física inicial la paciente pesa 3,6 kg (peso al nacer 3,7 kg) y está

15 delgada, con pliegues de piel suelta. El abdomen está distendido, con una hepatomegalia firme de 6 cm y una esplenomegalia firme de aproximadamente 4 cm. Los ganglios linfáticos agrandados se observan en la ingle y la actividad muscular es débil.

[0211] El nivel de hemoglobina inicial es de 9,2 g, plaquetas 506.000, y glóbulos blancos 11.550. El análisis de orina es

20 normal, y frotis de médula ósea reveló linfocitos vacuolados y numerosas células espumosas. Mediciones químicas en suero: lípidos totales 834 mg/100 ml, fosfolípidos 176 mg/100 ml, triglicéridos 141 mg/100 ml, colesterol 129 mg/100 ml, bilirrubina 0,3 mg/100 ml, fosfatasa alcalina 9,0 BU%, SGOT 90 unidades, SGPT 50 unidades, colinesterasa 20 unidades, nitrógeno de urea 8,3 mg, azúcar en ayuno 45 mg/100 ml. La tomografía computarizada del abdomen muestra hepatoesplenomegalia y glándulas suprarrenales bilaterales simétricamente agrandadas con calcificación.

25 [0212] A la paciente se le implanta quirúrgicamente un puerto de acceso vascular venosa para la dosificación. Después de conectar el puerto a una máquina de infusión ambulatoria, la paciente se trata previamente con 1 mg/kg de difenhidramina 20 minutos antes de la infusión de LAL recombinante con el fin de contrarrestar posibles reacciones anafilácticas de la infusión. A la paciente se le administra entonces LAL recombinante a 1 mg/kg en el transcurso de 5

30 horas mediante infusión intravenosa. Esta terapia se repite una vez cada 7 días indefinidamente.

[0213] Dentro de las dos semanas después de la administración de la primera dosis de LAL recombinante, la paciente es evaluada en el aumento de peso y el tamaño de los órganos abdominales clave según lo determinado por ecografía. También se realizan resultados de laboratorio que analizan la actividad de la lipasa ácida lisosomal en la paciente.

35

Ejemplo 18

Tratamiento de la enfermedad por depósito de éster de colesterilo (CESD) mediante la administración de LAL recombinante

40 [0214] Se examina por su pediatra un niño de 3 años de edad con una erupción pruriginosa abdominal. Tras un examen abdominal, se observa hepatomegalia por el médico y confirmada por ultrasonido. En este punto no se realiza un diagnóstico y el paciente es monitorizado periódicamente.

39

Claims

imagen1

imagen2