BRPI9904104B1

BRPI9904104B1 - processo para produção de sacarídeos empregando uma enzima de formação de sacarídeo não redutor e uma enzima de liberação de trealose

Info

Publication number: BRPI9904104B1
Application number: BRPI9904104A
Authority: BR
Inventors: Kazuhiko Maruta; Michio Kubota; Shigeharu Fukuda; Takuo Yamamoto; Toshio Miyake
Original assignee: Hayashibara Co; Hayashibara Biochem Lab
Priority date: 1998-09-11
Filing date: 1999-09-13
Publication date: 2016-04-26
Also published as: BR9904104A; CN1252442A; CN1271203C; US20070218529A1; KR20000023095A; EP0990704B1; US20070281346A1; EP0990704A2; CN1180081C; EP0990704A3; US7186535B1; KR100729498B1; ATE417110T1; ES2318884T3; DK0990704T3; JP2000228980A; JP3958884B2; CN1504567A; US7582463B2; DE69940045D1

Abstract

patente de invenção: <b>"método para enzima de formação de sacarídeo irredutível, enzima de liberação de trehalose, e processo para produção de sacarídeos empregando as enzimas"<d>. uma enzima de formação de sacarídeo irredutível e uma enzima de liberação de trehalose, que têm uma temperatura ideal em uma faixa de temperatura média, isto é, uma temperatura de acima de 40 ou 45 porém abaixo de 60°c; e um ph ideal em uma faixa de ph ácido, isto é, um ph de menos do que 7. os dois tipos de enzimas podem ser obtidos em uma quantidade desejada, por exemplo, por cultura em um veículo de cultura nutriente de microorganismos capazes de produzir as enzimas ou por tecnologia de dna recombinante.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "PROCESSO PARA PRODUÇÃO DE SACARÍDEOS EMPREGANDO UMA ENZIMA DE FORMAÇÃO DE SACARÍDEO NÃO REDUTOR E UMA ENZIMA DE LIBERAÇÃO DE TREALOSE".

Fundamento da Invenção Campo da Invenção [001] A presente invenção refere-se a uma enzima de formação de sacarídeo não redutor, uma enzima de liberação de trealose, e um processo para produção de sacarídeos empregando as enzimas. Descrição da Técnica Anterior [002] A trealose é um dissacarídeo consistindo em dois moles de glicose ligado a seus resíduos redutores, e é amplamente encontrado em natureza, por exemplo, em micro-organismos, fungos, algas, insetos, crustáceos, etc. Uma vez que o sacarídeo foi por muito tempo conhecido como um sacarídeo útil substancialmente livre de redutibilida-de e tendo uma ação de retenção de umidade satisfatória, ele foi suposto para uso em campos extensivos incluindo alimentos, cosméticos e farmacêuticos. Entretanto, produção não eficiente do sacarídeo foi estabilizado, e isto restringe o uso de trealose a despeito de sua expectativa destacada. Portanto o suprimento de trealose em um custo inferior é enormemente esperado.

[003] Como uma proposta para uma tal expectativa, os presentes inventores já estabeleceram um processo para enzimaticamente produzir trealose de amidos de material através de seus estudos energéticos. O processo é caracterizado por uma etapa de submeter hidrolisa-dos de amido redutor parcial à ação de uma enzima de formação de sacarídeo não redutor, que forma um sacarídeo não redutor tendo uma estrutura de trealose como uma unidade de terminação de hidrolisados de amido redutor parcial, e â ação de uma enzima de liberação de trealose que atua em um sacarídeo não redutor tendo uma estrutura de trealose como uma unidade de terminação a fim de hidrolisar o sítio entre uma parte da estrutura de trealose e uma parte dos restantes. Estas enzimas e processos delas são descritos nas Patentes Japonesas Kokai n% 143.876/95, 213.283/95, 322.883/95, 298.8 80/95, 66.187/96, 66.188/96, 73.504/96, 84.586/96 e 336.388/96, aplicadas pela mesma requerente da presente invenção. Portanto, uma produção de baixo-custo de trealose foi alcançada.

[004] Durante os estudos, encontraram-se uma verificação original de que a enzima de formação de sacarídeo não redutor pode ser aplicada para uma produção nova de sacarídeos não redutores que podem superar a desvantagem convencional residente nos hidrolisa-dos de amido redutor parcial. Como um problema, os hidrolisados de amido redutor parcial como as dextrinas e malto-oligossacarídeos têm aspectos vantajosos de que eles podem ser empregados como adoçantes e fontes de sacarídeo de suplementação de energia, porém como um demérito eles são altamente reativos com substâncias por causa de sua reducibilidade e são suscetíveis à reação de bronzeamento quando coexistida com aminoácidos e/ou proteínas e para facilmente deteriorar suas qualidades. Para superar um tal problema, conhece-se apenas um método para converter hidrolisados de amido redutor parcial em álcoois de açúcar empregando-se um método de hidrogenação de pressão elevada, etc. Em uso real, o método, entretanto, precisa muitos aquecimentos e instrumentos construídos sob consideração segurança em visto do uso de hidrogênio, resultando em um custo mais elevado e muito custo de mão de obra. Pelo contrário, a enzima de formação de sacarídeo não redutor acima mencionada previamente atua em hidrolisados de amido de parcial redução e forma sacarídeo não redutor tendo uma estrutura de trealose como uma unidade de terminação, e a reação prossegue sob uma condição relativamente suave devido à sua reação enzimática. Empregando-se a ação da enzima, os presentes inventores estabeleceram um novo processo eficiente para sacarídeos não redutores empregando as enzimas, que pode superar as desvantagens convencionais residentes nos hidrolisados de amido redutor parcial. Por causa destas verificações, o desenvolvimento de usos aplicáveis para trealose e sacarídeos não redutores tornaram-se floridos em vários campos, e isto diversifica os usos destes sacarídeos e agora extraordinariamente aumenta a demanda dos sacarídeos em uma ampla variedade de campos.

[005] Sob estas circunstâncias, um processo mais eficiente para produzir trealose e sacarídeos não redutores tendo uma estrutura de trealose foi mais esperado nesta técnica. Uma chave para uma tal expectativa é estabelecer uma enzima de formação de sacarídeo não redutor e uma enzima de liberação de trealose com várias condições ideais, e para prover uma ampla variedade de fontes para tais enzimas usáveis na produção dos sacarídeos. Portanto, uma enzima ideal pode ser escolhida de vários tipos de enzimas dependendo das condições ideais de outras enzimas usáveis na combinação com as enzimas acima para produzir os sacarídeos desejados, bem como em instalações e usos finais dos sacarídeos produzidos, resultando em uma eficiente produção dos sacarídeos. Convencionalmente as enzimas de formação de sacarídeo não redutores conhecidas podem ser agrupadas naquelas tendo temperaturas ideais de temperaturas relativamente inferiores de cerca de 40*0 ou inferior, e aquelas tendo tempe raturas ideais de temperaturas relativamente mais elevadas de cerca de 60*0 ou superior. Enquanto as enzimas de liberação de trealose convencionalmente conhecidas podem ser agrupadas naquelas tendo temperaturas ideais em uma faixa de temperatura relativamente inferior, cerca de 45*0 ou inferior, ou aquelas tendo temperaturas ideais em uma faixa de temperatura relativamente mais elevada, cerca de ΘΟΌ ou superior. Entretanto, qualquer enzima de formação de sacarídeo não redutor e uma enzima de liberação de trealose tendo uma temperatura ideal em uma faixa de temperatura média, cerca de 50Ό, nunca fo i contudo aberta.

[006] Entre as enzimas relacionadas a sacarídeo empregadas na produção de sacarídeos de materiais de amido, enzimas tais como um grupo maior têm uma temperatura ideal em uma faixa de temperatura média. Tais enzimas podem ser requeridas no processo para produção da trealose e sacarídeos não redutores acima mencionados; Nenhuma enzima de formação de sacarídeo não redutor e nenhuma enzima de liberação de trealose, que tenha uma temperatura ideal em uma faixa de temperatura média, não foi até agora estabelecida de modo que não foi até agora realizado um processo para produção de sacarídeos em uma produção suficiente empregando qualquer das duas ou ambas destas enzimas junto com as enzimas relacionadas com sacarídeos acima mencionadas. Dependendo das instalações para produção de sacarídeos e empregos finais delas, foram requeridas enzimas tendo uma temperatura ideal em uma faixa de temperatura média em suas reações enzimátícas. É longe de dizer que foi estabelecido um processo para produção de sacarídeos em um campo satisfatoriamente elevado empregando uma enzima de formação de sacarídeo não redutor e uma enzima de liberação de trealose. Como acima descrito o estabelecimento de uma enzima de formação de sacarídeo não redutor e uma enzima de liberação de trealose tendo uma temperatura ideal em uma faixa de temperatura média, e um processo para produção de sacarídeos compreendendo sacarídeos não redutores são em grande demanda.

Sumário da Invenção [007] Em vista disto, o primeiro objetivo da presente invenção é fornecer uma enzima de formação de sacarídeo não redutor tendo uma temperatura ideal em uma faixa de temperatura média.

[008] O segundo objetivo da presente invenção é fornecer um DNA codificando a enzima de formação de sacarídeo não redutor.

[009] O terceiro objetivo da presente invenção é fornecer um processo para produzir a enzima de formação de sacarídeo não redutor.

[0010] O quarto objetivo da presente invenção é fornecer uma enzima de liberação de trealose tendo uma temperatura ideal em uma faixa de temperatura média.

[0011] O quinto objetivo da presente invenção é fornecer um DNA codificando a enzima de liberação de trealose.

[0012] O sexto objetivo da presente invenção é fornecer um processo para produção de enzima de liberação de trealose.

[0013] O sétimo objetivo da presente invenção é fornecer um mi-cro-organismo capaz de produzir a enzima de formação de sacarídeo não redutor e/ou a enzima de liberação de trealose.

[0014] O oitavo objetivo da presente invenção é fornecer um processo para produção de sacarídeos compreendendo sacarídeos não redutores, que emprega a enzima de formação de sacarídeo não redutor e/ou a enzima de liberação de trealose.

[0015] A fim de alcançar os objetivos acima, os presentes inventores extensivamente analisaram os micro-organismos, que podem superar os objetivos, em sujeiras. Como um resultado, eles constataram que um micro-organismo recentemente isolado de uma sujeira em Ako-shi, Hyogo, Japão, produziu enzimas que podem solucionar os objetivos acima. Os presentes inventores isolaram separadamente as enzimas de formação de sacarídeo não redutor e enzima de liberação de trealose do micro-organismo, e então identificaram suas propriedades, revelando que as enzimas igualmente tinham uma temperatura ideal em uma faixa de temperatura média. A identificação do microorganismo confirmou que ele era um novo micro-organismo do gênero Arthrobacter, e designado Arthrobacter sp. s34. O micro-organismo foi depositado em 6 de agosto de 1998, no National Institute de Bioscien- ce e Human-Technology Agency of Industrial Science e Technology, Higashi 1-1-3, Tsukuba-shi, Ibaraki, Japão, e aceito e foi mantido pelo instituto sob o número de acessão de FERM BP-6450.

[0016] Os presentes inventores continuaram estudando, isolaram DNAs codificando as enzimas acima identificadas do micro-organismo Arthrobacter sp. S34, FERM BP-6450, decodificaram as sequências de nucleotídeo, e determinaram as sequências de aminoácidos das enzimas. Os inventores confirmaram que o Arthrobacter sp. S34, FERM BP-6450, e os transformantes, nos quais os DNAs obtidos no acima foram introduzidos de uma maneira usual, produziram as quantidades desejadas de enzimas. Confirmou-se também que as enzimas portanto obtidas podem ser vantajosamente empregadas na produção de saca-rídeos que compreende trealose e sacarídeos não redutores tendo uma estrutura de trealose em uma faixa de temperatura média. A presente invenção foi feita baseado nestas constatações.

[0017] O primeiro objetivo da presente invenção é solucionado por uma nova enzima de formação de sacarídeo não redutor que forma um sacarídeo não redutor tendo uma estrutura de trealose como uma unidade de terminação de hidrolisados de amido redutor parcial, e tem uma temperatura ideal em uma faixa de temperatura média.

[0018] O segundo objetivo da presente invenção é solucionado por um DNA codificando a enzima de formação de sacarídeo não redutor.

[0019] O terceiro objetivo da presente invenção é solucionado por um processo para produção da enzima de formação de sacarídeo não redutor, caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de cultivar um micro-organismo capaz de produzir a enzima, e coletar a enzima produzida da cultura.

[0020] O quarto objetivo da presente invenção é solucionado por uma nova enzima de liberação de trealose que especificamente hidro-lisa um sacarídeo não redutor tendo uma estrutura de trealose como uma unidade de terminação e um grau de polimerização de glicose de pelo menos 3 em um sítio entre uma parte de trealose e uma parte das restantes, e que tem uma temperatura ideal em uma faixa de temperatura média.

[0021] O quinto objetivo da presente invenção é solucionado por um DNA codificando a enzima de liberação de trealose.

[0022] O sexto objetivo da presente invenção é solucionado por um processo para produção da enzima de liberação de trealose, caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de cultivar um microorganismo capaz de produzir a enzima, e coletar a enzima produzida da cultura.

[0023] O sétimo objetivo da presente invenção é solucionado por um micro-organismo selecionado de Arthrobacter sp, S34, FERM BP-6450, e os mutantes dele.

[0024] O oitavo objetivo da presente invenção é solucionado por um processo para produzir sacarídeos, compreeendendo as etapas de permitir qualquer das duas ou ambas das enzimas acima atuarem sobre hidrolisados de amido redutor parcial para produzir sacarídeos não redutores, e coletar os sacarídeos não redutores ou composições de sacarídeos tendo uma reducibilidade relativamente baixa e contendo os sacarídeos não redutores.

Breve Descrição dos Desenhos de Acompanhamento [0025] Figura 1 é uma figura que mostra a influência de temperatura sobre a atividade de uma enzima de formação de sacar ideo não redutor de Arthrobacter sp. S34, FERM BP-6450, de acordo com a presente invenção.

[0026] Figura 2 é uma figura que mostra a influência de pH sobre a atividade de uma enzima de formação de sacarídeo não redutor de Arthrobacter sp. S34, FERN BO-6450, de acordo com a presente invenção.

[0027] Figura 3 é uma figura que mostra a influência de temperatura sobre a estabilidade de uma enzima de formação de sacarídeo não redutor de Arthrobacter sp. S34, FERM BP-6450, de acordo com a presente invenção.

[0028] Figura 4 é uma figura que mostra a influência de pH sobre a estabilidade de uma enzima de formação de sacarídeo não redutor de Arthrobacter sp. S34, FERM BP-6450, de acordo com a presente invenção.

[0029] Figura 5 é um mapa de restrição do DNA recombinante PGY1 de acordo com a presente invenção. A linha em negrito mostra a sequência de nucleotídeo de Arthrobacter sp. S34, FERM BP-6450. A seta negra dentro da linha em negrito mostra uma sequência de nucleotídeo codificando a presente enzima de formação de sacarídeo não redutor, enquanto a seta oblíqua mostra uma sequência de nucleotídeo codificando a presente enzima de liberação de trealose.

[0030] Figura 6 é um mapa de restrição do DNA recombinante pGY2 de acordo com a presente invenção. A linha em negrito mostra a sequência de nucleotídeo de Arthrobacter sp. S34, FERM BP-6450. A seta preta dentro da linha em negrito mostra uma sequência de nucleotídeo codificando a presente enzima de formação de sacarídeo não redutor.

[0031] Figura 7 é um mapa de restrição do DNA recombinante PGY3 de acordo com a presente invenção. A seta preta mostra a sequência de nucleotídeo, codificando a presente enzima de formação de sacarídeo não redutor, de Arthrobacter sp. S34, FERM BP-6450.

[0032] Figura 8 é uma figura que mostra a influência de temperatura sobre a atividade de uma enzima de liberação de trealose de Arthrobacter sp. S34, FERM BP-6450, de acordo com a presente invenção.

[0033] Figura 9 é uma figura que mostra a influência de pH sobre a atividade de uma enzima de liberação de trealose de Arthrobacter sp. S34, FERM BP-6450, de acordo com a presente invenção.

[0034] Figura 10 é uma figura que mostra a influência de temperatura sobre a estabilidade de uma enzima de liberação de trealose de Arthrobacter sp. S34, FERM BP-6450, de acordo com a presente invenção.

[0035] Figura 11 é uma figura que mostra a influência de pH sobre a estabilidade de uma enzima de liberação de trealose de Arthrobacter sp. S34, FERM BP-6450, de acordo com a presente invenção.

[0036] Figura 12 é um mapa de restrição do DNA recombinante pGZ2 de acordo com a presente invenção. A linha em negrito mostra a sequência de nucleotídeo de Arthrobacter sp. S34, FERM BP-6450. A seta oblíqua dentro da linha em negrito mostra uma sequência de nucleotídeo codificando a presente enzima de liberação de trealose.

[0037] Figura 13 é um mapa de restrição do DNA recombinante pGZ3 de acordo com a presente invenção. A seta oblíqua mostra a sequência de nucleotídeo de Arthrobacter sp. S34f FERM BP-6450. Descrição Detalhada da Invenção [0038] A presente invenção refere-se a uma enzima de formação de sacarídeo não redutor e uma enzima de liberação de trealose, e um processo para produção de um sacarídeo empregando qualquer das duas ou ambas as enzimas. A frase "enzima de formação de sacarídeo não redutor" conforme referida na presente invenção representa uma enzima que tem uma ação de formação de um sacarídeo não redutor tendo uma estrutura de trealose como uma unidade de terminação de hidrolísados parciais de amido redutores. A frase "enzima de liberação de trealose" conforme referida na presente invenção representa uma enzima que especificamente hidrolisa um sacarídeo não redutor tendo uma estrutura de trealose como uma unidade de terminação e um grau de polimerização de glicose de pelo menos 3 em um sítio entre a parte de trealose e as restantes. A frase "uma faixa de temperatura média" conforme referida na presente invenção representa uma faixa de temperatura média em temperaturas de reação que são convencionalmente empregadas em produção de sacarídeos de materiais de amido por uma reação enzimática. Em muitos casos de tais processos, as temperaturas de reação diferentes de cerca de 10Ό a cer ca de 100*0 e próximas das temperaturas são empregadas. A enzima de formação de sacarídeo não redutor de acordo com a presente invenção tem uma ação tal como uma enzima e tem uma temperatura ideal em uma faixa de temperatura média, preferivelmente uma faixa de temperatura acima de 40*C porém menor do que 60*C, e mais preferiv elmente tem um pH ideal em uma faixa de pH ácido em adição à temperatura ideal. A enzima de liberação de trealose de acordo com a presente invenção tem uma ação tal como uma enzima e tem uma temperatura ideal em uma faixa de temperatura média, preferivelmente uma faixa de temperatura acima de 45Ό, porém abaixo de 60*0, e mais preferivelmente tem um pH ideal em uma faixa de pH ácido em adição à temperatura ideal. Estas enzimas presentes não devem ser restritas a suas origens e fontes.

[0039] A atividade da presente enzima de formação de sacarídeo não redutor é testada como segue: Um ml de uma solução de enzima é adicionado a quatro ml de 1,25 peso/volume % de maltopentaose como um substrato em 20 mM de tampão de fosfato (pH 6,0), e a solução de mistura é incubada a 50*C durante 60 minutos. A mistura de reação é aquecida a 100*0 durante 10 minutos para suspender a reação enzimática, e a mistura de reação é precisamente diluída por 10 vezes com água deionizada, seguido por determinação do poder redutor da solução diluída no método de Somogyi-Nelson. Como um controle, uma solução de enzima, que foi aquecida a 1000 durante 10 minutos para inativar a enzima, é tratada similarmente como acima. Uma uni- dade de atividade da presente enzima é definida como a quantidade de enzima que elimina o poder redutor daquela de um oc mol de maltopen-taose por minuto quando determinado com o teste acima mencionado. A temperatura ideal da enzima como referido na presente invenção é determinada de acordo com o teste; É testada ajustando-se a temperatura de ração enzimática em diferentes temperaturas incluindo 50*0, permitindo uma quantidade prescrita da enzima para atual sobre o substrato nas diferentes temperaturas de acordo com o teste, e determinando o nível de redução de poder redutor nas temperaturas de acordo com o teste, seguido pela comparação dos níveis de redução determinados entre um e outro e determinando a temperatura ideal da presente enzima que mostrou uma temperatura máxima.

[0040] A atividade da presente enzima de liberação de trealose é testada como segue: Um ml de uma solução de enzima é adicionado a quatro ml de 1,25 peso/volume % de maltotriosiltrealose, isto é, a-maltotetraosil-a-D-glucosídeo, como um substrato, em 20 mM de tampão de fosfato (pH 6,0), e a solução de mistura é incubada a 50Ό durante 30 minutos, seguido pela suspensão da reação enzimática pela adição da solução de cobre Somogyi e testando-se o poder redutor pelo método de Somogyi-Nelson. Como um controle, é similarmente testado empre-gando-se uma solução de enzima que foi inativada aquecendo-se a 100Ό durante 10 minutos. Uma atividade de unidade da presente enzima é definida como a quantidade de enzima que aumenta o poder redutor de um oc mol de glicose por minuto quando determinado com o teste acima mencionado. A temperatura ideal da enzima como referida na presente invenção é determinada de acordo com o teste; Ela é testada ajustando-se a temperatura de reação enzimática nas diferentes temperaturas incluindo õOO, permitindo uma quantid ade prescrita da enzima atuar sobre o substrato nas temperaturas de acordo com o tes- te, e determinando o nível aumentado de poder redutor nas diferentes temperaturas de acordo com o teste, seguido comparando-se os níveis aumentados determinados entre si e determinando-se a temperatura ideal da presente enzima que mostrou uma temperatura máxima.

[0041] Explanando-se a presente enzima de formação de sacarí-deo não redutor sobre a sequência de aminoácido, a enzima tem a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 1 como um todo, e tem as sequências de aminoácido de SEQ ID NOs: 2 a 6 como sequências parciais de aminoácido em alguns casos. Em adição a estas enzimas tendo o total das sequências de aminoácido acima identificadas, a presente invenção inclui outros tipos de enzimas que compreendem uma parte de qualquer uma das sequências de aminoácido selecionadas delas ou que têm a ação como a presente enzima e formação de sacarídeo não redutor e a temperatura ideal acima identificada. Exemplos de sequências de aminoácido de tais enzimas são aquelas que contêm, dentro das sequências de aminoácido, uma sequência parcial de aminoácido ou um resíduo de aminoácido que são relacionados à expressão das propriedades da presente enzima de formação de sacarídeo não redutor, e que um ou mais aminoácidos são substituídos com diferentes aminoácidos, adicionados a ela e/ou deletados dela de outra maneira a sequência parcial de aminoácido ou o resíduo de aminoácido. Exemplos das sequências de aminoácido substituídas com diferentes aminoácidos como referido na presente invenção incluem aqueles que menos do que 30% e preferivelmente menos do que 20% das sequências de aminoácido compondo a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 1 são substituídas com outros aminoácidos que têm propriedades e estruturas similares a outras respectivas a serem substituídas. Exemplos de grupos de tais aminoácidos são um grupo de ácido as-pártico e ácido glutâmico como aminoácidos, um de lisina, arginina, e histidina como aminoácidos básicos, um de asparagina e glutamina como aminoácidos tipo amida, e um se serina e treonina como ácidos hidroxiamino, e um de valina, leucina e isoleucina como aminoácidos de cadeia ramificada. Exemplos de outras sequências de aminoácido da presente enzima contendo uma parte de qualquer uma das sequências de aminoácido selecionadas de SEQ ID NOS: 1 a 6 são aquelas que devem ter uma estrutura estéreo substancialmente similar a uma das sequências de aminoácido de SEQ ID NO: 1, isto é, substituição, deleção e/ou adição de aminoácido(s) são introduzidas na sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 1. A estrutura estéreo de proteínas é esti-mável avaliando-se bases de dados comercialmente disponíveis para estruturas estéreo de proteínas que têm sequências de aminoácido relacionadas a outras alvo e têm revelado estruturas estéreo, referindo-se a estruturas estéreo analisadas, e empregando-se utensílios suaves comercialmente disponíveis para visualização das estruturas estéreo. A sequência de aminoácido acima identificada da presente enzima de sacarídeo não redutor tem uma homologia de pelo menos 57%, preferivelmente pelo menos 70%, e mais preferivelmente pelo menos 80% da SEQ ID NO: 1.

[0042] Como acima descrito, a enzima de formação de sacarídeo não redutor não deve ser restrita a uma origem/fonte específica. Exemplos de tais são aqueles derivados de micro-organismos, isto é, aquelas do gênero Arthrobacter, Arthrobacter sp S34, FERM BP-6450, e os seus mutantes. Os mutantes podem ser obtidos tratando de uma maneira usual o Arthrobacter sp S34, FERM BP-6450, com mutagêni-cos conhecidos, tais como N-metil-N'-nitro-N-nitrosoguanidina, meta-nossulfonato de etila, ultravioleta, e transposon; analisando os mutantes desejados capazes de produzir uma enzima de formação de sacarídeo não redutor e tendo uma temperatura ideal em temperaturas em uma faixa de temperatura média, e usualmente em temperaturas na faixa de acima de 40*0, porém abaixo de 60Ό. A enz ima de Ar- throbacter sp S34, FERM BP-6450, usualmente tem as sequências de aminoácido de SEQ ID NOs: 1 a 6. Outras enzimas de formação de sacarídeo não redutor de micro-organismos de mutantes Arthrobacter sp S34, FERM BP-6450, e outros micro-organismos compreende o todo ou uma parte de qualquer uma das sequências de aminoácido de SEQ ID NOs: 1 a 6. Exemplos concretos de outras enzimas incluem enzimas recombinantes que atuam como a presente enzima de formação de sacarídeo não redutor e têm uma temperatura ideal em temperaturas em uma faixa de temperatura média, e usualmente em temperaturas de acima de 40Ό porém abaixo de 60Ό. As e nzimas recombinantes podem ser obteníveis aplicando-se a tecnologia de DNA re-combinante para o DNA codificando a presente enzima de formação de sacarídeo não redutor, e ter, o todo ou uma parte de qualquer uma das sequências de aminoácido de SEQ ID NOs: 1 a 6.

[0043] A maioria das enzimas de formação de sacarídeo não redutor de acordo com a presente invenção tem as seguintes propriedades fisicoquímicas: (1) Ação [0044] Formar um sacarídeo não redutor tendo uma estrutura de trealose como uma unidade de terminação de um hidrolisado parcial de amido redutor tendo um grau de polimerização de glicose de 3 ou mais elevado; (2) Peso Molecular [0045] Cerca de 75.000 ± 10.000 Daltons em eletroforese de gel de poliacrilamida de sulfato de dodecila de sódio (SDS-PAGE); (3) Ponto Isoelétrico (pl) [0046] Cerca de 4,5 ± 0,5 em isoeletroforese empregando anfólito ; (4) Temperatura Ideal [0047] Cerca de 50Ό quando incubado em pH 6,0 dura nte 60 min (5) pH Ideal [0048] Cerca de 6,0 quando incubado em 50Ό durante 60 min ; (6) Estabilidade térmica [0049] Estável até uma temperatura de 55Ό quando i ncubado em pH 7,0 durante 60 min; e (7) Estabilidade de pH

[0050] Estável em pHs de cerca de 5,0 a cerca de 10,0 quando incubado em 4*C durante 24 horas.

[0051] A presente enzima de formação de sacarídeo não redutor pode ser obtida em uma quantidade prescrita pelo último presente processo descrito para produção da mesma.

[0052] A presente invenção fornece um DNA codificando a presente enzima de formação de sacarídeo não redutor. Um tal DNA é bastante útil na produção de enzima na forma de uma proteína recombi-nante. Em geral, o DNA inclui aqueles que codificam a enzima independentemente de sua origem/fonte. Exemplos de um tal DNA são aqueles que contêm o todo ou uma parte da sequência de nucleotídeo de SEQ ID NO:7 ou outras complementares a elas. O DNA compreendendo o todo da sequência de nucleotídeo de SEQ ID NO: 7 codifica a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 1. Os DNAs que contêm o todo ou uma parte da sequência de nucleotídeo de SEQ ID NO: 7, incluem aqueles que têm uma sequência de aminoácido relativa à expressão das propriedades da presente enzima de formação de sacarídeo não redutor, e têm uma sequência de nucleotídeo correspondendo à sequência de aminoácido e a sequência de nucleotídeo de SEQ ID NO: 7 introduzida com uma substituição, deleção e/ou adição de uma ou mais bases ao mesmo tempo que retêm a sequência de nucleotídeo relacionando-se à expressão das propriedades da presente enzima de formação de sacarídeo não redutor. Os DNAs de acordo com a presente invenção devem incluir aqueles que uma ou mais bases são substi- tuídas com outras diferentes baseadas na degeneração de código genético. Também os DNAs de acordo com a presente invenção incluem aqueles que compreendem as sequências de nucleotídeo que codificam a presente enzima de formação de sacarídeo não redutor e ainda compreendem uma ou mais outras sequências de nucleotídeo adicionais selecionadas do grupo consistindo de sequências de ligação de ribossoma tal como um códon de iniciação, códon de terminação, e sequência Shine-Dalgarno; sequências de nucleotídeo codificando peptídeos de sinal, sequências de reconhecimento para enzimas de restrição apropriada; sequências de nucleotídeo para regular a expressão de genes para promotor e realçadores; e terminadores, todos os quis são geralmente empregados em tecnologia de DNA recombinante para produção de proteínas recombinantes. Por exemplo, uma vez que uma parte de e o todo da sequência de nucleotídeo de SEQ ID NO: 8 funciona como sequências de ligação de ribossomo, os DNAs aos quais a parte de e o todo da sequência de nucleotídeo de SEQ ID NO: 8 são ligados a montante das sequências de nucleotídeo codificando a presente enzima de formação de sacarídeo não redutor podem ser arbitrariamente empregados na produção da enzima como uma proteína recombinante.

[0053] Como acima descrito, os DNA codificando a presente enzima de formação de sacarídeo não redutor não devem ser restritos a suas origens/fontes, e elas são preparáveis analisando-se os DNAs de diferentes fontes baseado na hibridização com um DNA compreendendo uma sequência de nucleotídeo que codifica pelo menos uma parte da sequência de aminoácido da enzima, por exemplo, a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 1. Os exemplos reais destas fontes são micro-organismos do gênero Arthrobacter, e preferivelmente, Ar-throbacter sp S34, FERM BP-6450, e seus mutantes, todos aqueles que produzem a enzima de formação de sacarídeo não redutor. Para analisar os micro-organismos, métodos convencionais empregados neste campo para análise ou clonagem de DNAs tais como os métodos de análise de bibliotecas recombinantes, o método PCR, e seus métodos modificados. Como um resultado de análise, os DNAs desejados podem ser obtidos coletando-se de um modo usual os DNAs confirmados com a hibridização esperada. Geralmente, os DNAs dessa maneira obtidos compreendem uma parte de ou o todo da sequência de nu-cleotídeo de SEQ ID NO: 7. Por exemplo, um DNA que compreende o todo da sequência de nucleotídeo de SEQ ID NO: 7 é geralmente obtido de Arthrobacter sp S34, FERM BP-6450. Os DNAs compreendendo uma parte da sequência de nucleotídeo de SEQ ID NO: 7 podem ser obtidos similarmente analisando-se os DNAs de micro-organismos como fontes de outra maneira da espécie acima, capaz de produzir a presente enzima de formação de sacarídeo não redutor. Tais DNAs podem ser preparados selecionando-se DNAs que codificam as enzimas tendo as propriedades da presente enzima, de DNAs nos quais foram introduzidos uma substituição, adição e/ou deleção de uma ou mais bases dos DNAs acima mencionados empregando-se um ou mais métodos convencionais de introdução de mutação. Os DNAs podem também ser obtidos aplicando-se as sínteses químicas convencionais baseadas na sequência de nucleotídeo codificando a presente enzima de formação de sacarídeo não redutor, por exemplo, uma das SEQ ID NO: 7. Uma vez em mãos, os DNAs de acordo com a presente invenção podem ser facilmente amplificados ao nível desejado aplicando-se ou empregando o método PCR e os vetores autonomamente replicá-veis.

[0054] O presente DNA codificando a enzima de formação de sacarídeo não redutor inclui aqueles na forma de DNAs recombinantes cujos DNAs foram introduzidos em vetores apropriados. Os DNAs recombinantes podem ser relativa facilmente preparáveis pela tecnologia de DNA recombinante em geral se apenas os DNAs são disponíveis. Quaisquer tipos de vetores podem ser empregados na presente invenção contanto que eles sejam autonomamente replicáveis em hospedeiros apropriados. Exemplos de tais vetores são pUC18, pBluescript II SK(+), pKK223-3, Xgt^C, etc., que empregam o Escherichia coli como um hospedeiro; pUB110, pTZ4, pC194, p11, φ1, φ105, etc., que empregam microoganismos do gênero Bacilo; e pHY300PLK, pHV14, TRp7, YEp7, pBS7, etc., que emprega dois ou mais micro-organismos como hospedeiros. Os métodos para inserir o presente DNA em tais vetores na presente invenção podem ser aqueles convencionais geralmente empregados neste campo. Um gene contendo o presente DNA e um vetor autonomamente replicável são primeiro digeridos com uma enzima de restrição e/ou desintegrador ultra-sônico, então os fragmentos de DNA resultantes e fragmentos de vetores são ligados. A ligação é facilitada pelo uso de enzimas de restrição que especificamente atuam na divisão do DNA, especialmente, Kpnl, Acct, BamHI, BstXI, EcoRI, Hindlll, Notl, Pstl, Saci, Sall, Smal, Spel, Xbal, Xhol, etc. Para ligar fragmentos de DNA e vetores, primeiramente eles podem ser temperados se necessário, então submetidos à ação de uma ligase in vivo ou in vitro. O DNA recombinante dessa maneira obtido pode ser replicável sem limitação substancial em um hospedeiro apropriado.

[0055] O presente DNA codificando a enzima de formação de sa-carídeo não redutor ainda inclui transformantes nos quais o DNA foi introduzido em vetores apropriados. Os transformantes podem ser facilmente preparáveis introduzindo-se o DNA ou DNA recombinante obtido no acima descrito em hospedeiros apropriados para transformá-los. Como os hospedeiros, os micro-organismos e células de plantas e animais, que são convencional mente empregados neste campo e escolhidos dependendo dos vetores no DNA recombinante, podem ser empregados. Os micro-organismos como hospedeiros incluem aqueles dos gêneros Escherichia, Bacillus e Arthrobacter, e outro actinomice-tos, levedura, fungo, etc. Para introduzir o presente DNA nestes microorganismos hospedeiros, método de célula competente convencional e método de protoplasto podem ser empregados. O presente DNA, que codifica a enzima de formação de sacarídeo não redutor introduzida nos transformantes na presente invenção, podem estar presente em uma forma separadora de cromossomas ou em uma forma incorporada em cromossomas. O DNA incorporado em cromossomas de hospedeiros tem um caráter de ser estavelmente retido neles e podem ser vantajosamente empregados na produção da presente proteína recombi-nante.

[0056] A presente enzima de formação de sacarídeo não redutor pode ser obtida em uma quantidade desejada por um processo para produção da enzima caracterizada pelo fato de que compreende as etapas de cultivar micro-organismos capazes de produzir a enzima, e coletar a enzima produzida da cultura. Os micro-organismos empregados no processo podem ser empregados independentemente do gênero ou das espécies contanto que eles produzam a enzima. Os exemplos de tais micro-organismos são micro-organismos do gênero Arthrobacter, Arthrobacter sp S34, FERM BP-6450, e os mutantes deles, bem como os transformantes obteníveis introduzindo-se o presente DNA codificando a enzima em hospedeiros apropriados.

[0057] Quaisquer veículos de cultura nutriente empregado na cultura do processo para produção da presente enzima de formação de sacarídeo não redutor podem ser empregados contanto que os microorganismos acima mencionados desenvolvam aqui e produzam a enzima sem restrição a um veículo específico de cultura nutriente. Geralmente, os veículos de cultura nutriente contêm fontes de carbono e nitrogênio, e se necessário minerais podem ser adicionados. Exemplos das fontes de carbono são os sacarídeos tal como as dextrinas, ami- dos, hidrolisados de amido parcial, glicose, etc., e são substâncias contendo sacarídeo tais como extratos de melaço e levedura, e ácidos orgânicos tais como ácido glucurônico e ácido succínico. A concentração das fontes de carbono é escolhida dependendo dos tipos empregados, usualmente 30 peso/volume %, e preferivelmente 15 pe-so/volume % ou inferior. Exemplos das fontes de nitrogênio apropriadamente empregadas na presente invenção são substâncias contendo nitrogênio inorgânico tais como sais de amônio, nitrato, etc.; substâncias contendo nitrogênio orgânico tais como ureia, licor macerado de milho, caseína, peptona, extrato de levedura, extrato de carne, etc. Dependendo do uso, é seletivamente empregado entre ingredientes inorgânicos tais como sais de cálcio, magnésio, potássio, sódio, ácido fos-fórico, manganês, zinco, ferro, cobre, molibdênio, cobalto, etc.

[0058] As condições de cultura empregadas para produção da presente enzima podem ser empregadas seletivamente de condições apropriadas adequadas para desenvolvimento dos respectivos microorganismos empregados. Por exemplo, no caso de empregar microorganismos do gênero Arthrobacter incluindo Arthrobacter sp S34, FERM BP-6450, a temperatura de cultura é usualmente na faixa de 20 a 50*0, e preferivelmente 25 a 37Ό; o pH de cultur a é usualmente na faixa de pH de 4 a 10, e preferivelmente pH de 5 a 9; e o tempo de cultura é na faixa de 10 a 150 horas. Com estas condições, os microorganismos são cultivados sob condições aeróbicas. Quando empregados transformantes preparados introduzindo-se em hospedeiros apropriados o presente DNA codificando a presente enzima de formação de sacarídeo não redutor, os transformantes são cultivados sob condições aeróbicas em condições selecionadas das condições de cultura tal como as temperaturas de cultura de 20 a 65*0, o pH de cultura de 2 a 9, e o tempo de cultura de 1 a 6 dias, embora elas variem dependendo do gênero, espécies, linhagens ou tipos de micro- organismos e vetores. As culturas dessa maneira obtidas geralmente contêm a presente enzima em frações celulares. No caso de transfor-mantes de cultura obtidos empregando-se como hospedeiros os microorganismos do gênero Bacilo, as culturas resultantes podem conter a presente enzima em frações de sobrenadante dependendo dos vetores empregados para transformar os hospedeiros. O conteúdo da presente enzima nas culturas dessa maneira obtidas é usualmente de 0,01 a 1.000 unidades por ml da cultura, embora varie dependendo do gênero, espécies ou linhagens dos micro-organismos e condições de cultura empregados.

[0059] A presente enzima de formação de sacarídeo não redutor é coletada das culturas resultantes. O método de coletagem não é restringido; A presente enzima pode ser obtida separando-se e coletando-se qualquer uma das frações de células e sobrenadantes de cultura encontrados com uma maior atividade da enzima, e se necessário submeter a fração coletada a um método de purificação apropriado para coletar uma fração contendo a enzima. Para separar as frações de células e sobrenadantes de cultura das culturas, métodos convencionais de separação de líquido de sólido tais como centrifugação e filtragem empregando filtros pré-revestidos e membranas de fibra lisa e côncava podem ser arbitrariamente empregadas. As frações desejadas são coletadas das frações separadas de células e sobrenadante de cultura. Para a fração de células, as células são rompidas em um des-trutor celular que é então separado em um extrato celular e uma fração celular insolúvel, seguido coletando-se qualquer das frações desejadas. A fração celular insolúvel pode ser solubilizada por métodos convencionais, se necessário. Como um método para romper células, qualquer uma das técnicas de ultra-sonicação, tratamento com enzimas de lise de parede celular tal como lisozima e glucanase, e carga de prensa mecânica pode ser arbitrariamente empregada. Para romper células as culturas podem ser diretamente tratadas com qualquer uma das técnicas acima, e então as misturas resultantes são tratadas com qualquer um dos métodos de separação de líquido de sólido acima mencionados para coletar uma fração de líquido. Portanto um extrato celular pode ser arbitrariamente obtido.

[0060] Os métodos empregados para maior purificação da presente enzima de formação de sacarídeo não redutor incluem aqueles convencionais para purificar enzimas relacionadas com sacarídeo em geral tal como precipitação por saturação, diálise, filtragem, concentração, cromatografia de filtragem de gel, cromatografia de troca de íon, cromatografia hidrofóbica, cromatografia de fase reversa, cromatografia de afinidade, eletroforese de gel e, eletroforese de ponto isoelétrico. Estes métodos podem ser empregados em combinação dependendo dos propósitos. Das frações resultantes separadas por estes métodos, frações com uma atividade desejada ensaiada pelo método para enzima de formação de sacarídeo não redutor são coletadas para obter a presente enzima de formação de sacarídeo não redutor purificada para um nível desejado. De acordo com os métodos nos últimos exemplos descritos, a presente enzima pode ser purificada em um nível homogêneo eletroforeti ca mente. Como acima descrito, o presente método fornece a presente enzima de formação de sacarídeo não redutor na forma de uma cultura, fração celular, fração de sobrenadante de cultura, destrutor celular, extrato celular, fração celular solúvel e insolúvel, fração de enzima parcialmente purificada, e fração de enzima purificada. Estas frações podem conter outro tipo da presente enzima de liberação de trealose. A enzima de formação de sacarídeo não redutor dessa maneira obtida pode ser imobilizada de uma maneira usual antes do uso. Os métodos para imobilização são, por exemplo, método de ligação a permutadores de íon, ligação/adsorção covalente a e sobre resinas e membranas, e método de imobilização por captação empregan- do substâncias de peso molecular elevado. A enzima de formação de sacarídeo não redutor dessa maneira obtida pode ser arbitrariamente empregada em processos para produção de sacarídeos incluindo o último presente processo descrito para produção de sacarídeo. Particularmente, uma vez que a presente enzima de formação de sacarídeo não redutor tem uma temperatura ideal em uma faixa de temperatura média e preferivelmente tem um pH ideal em uma faixa de pH ácido, pode ser vantajosamente empregada para produzir sacarídeos quando empregada em combinação com a última presente enzima de liberação de trealose descrita, enzima desramificadoras de amido tendo um pH ideal em uma faixa de pH ácido, e glucanotransferase de ciclomal-todextrina que eficazmente atua em faixa de temperatura média.

[0061] Explanando a presente enzima de liberação de trealose baseada na sequência de aminoácido, a enzima tem a sequência de ami-noácido de SEQ ID NO: 9 como um todo, e tem as sequências de aminoácido de SEQ ID NOs: 10 a 16 como sequências de aminoácido parcial em alguns casos. Em adição a estas enzimas tendo o total das sequências de aminoácido acima identificadas, a presente invenção inclui outros tipos de enzimas que compreendem uma parte de qualquer uma das sequências de aminoácido selecionada delas ou que têm igual mente a ação como a presente enzima de liberação de trealose e a temperatura ideal acima identificada. Exemplos das sequências de aminoácido de tais enzimas são aquelas que contêm, dentro das sequências de aminoácido, uma sequência de aminoácido parcial ou um resíduo de amioácido relacionado à expressão das propriedades da presente enzima de formação de sacarídeo não redutor, e que um ou mais aminoácidos são substituídos com diferentes aminoácidos, adicionados a ela e/ou deletados dela de outra maneira a sequência de aminoácido parcial ou o resíduo de aminoácido. Exemplos de sequências de aminoácido substituído com diferentes aminoácidos como refe- rido na presente invenção incluem aqueles com menos do que 30% e preferivelmente menos do que 20% das sequências de aminoácido compondo as sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 9 são substituídos com outros aminoácidos que têm propriedades e estruturas similares àquelas respectivas a serem substituídas. Exemplos de grupos de tais aminoácidos são um grupo de ácido aspártico e ácido glutâmi-co como ácidos de aminoácido, um de lisina, arginina, e histidina como aminoácidos básicos, um de asparagina e glutamina como aminoácidos tipo amida, um de serina e treonina como ácidos hidroxiamino, e um de valina, leucina e isoleucina como aminoácidos de cadeia ramificada. Exemplos de outras sequências de aminoácido da enzima contendo uma parte de qualquer uma das sequências de aminoácido selecionada de SEQ ID NOs: 9 a 16 são aquelas que podem ter uma estrutura estéreo substancialmente similar a uma da sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 9, isto é, substituição, deleção e/ou adição de aminoácido(s) são introduzidas na sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 9. A estrutura estéreo de proteínas é estimável analisando-se as bases de dados comercialmente disponíveis para estruturas estéreo de proteínas que têm sequências de aminoácido relacionadas com aquelas alvo e têm estruturas estéreo reveladas, referenciando as estruturas estéreo analisadas, e empregando artigos macios para visualização de estruturas estéreo. A sequência de aminoácido acima identificada da presente enzima de liberação de trealose tem uma homolo-gia de pelo menos 60%, preferivelmente pelo menos 70%, e mais preferivelmente pelo menos 80% a SEQ ID NO: 9.

[0062] Como acima descrito, a enzima de liberação de trealose não deve ser restrita a uma origem/fonte específica. Exemplos de tais são aquelas derivadas de micro-organismos, isto é, aqueles do gênero Arthrobacter, Arthrobacter sp S34, FERM BP-6450, e os mutantes dele. Os mutantes podem ser obtidos de uma maneira usual do Ar- throbacter sp S34, FERM BP-6450, com mutagenes tais como N-metil-Ν'-nitro-N-nitrosoguanidina, metanossulfonato de etila, ultravioleta, e transposon; analisando os mutantes desejados capazes de produzir uma enzima de formação de sacarídeo não redutor e tendo uma temperatura ideal em temperaturas em uma faixa de temperatura média, e usual mente em temperaturas na faixa de acima 45Ό, porém abaixo de 60*0. A enzima de Arthrobacter sp S34, FERM BP-6450, usualmente tem as sequências de aminoácido de SEQ ID NOs: 9 a 16. Outras enzimas de formação de sacarídeo não redutor de micro-organismos de mutantes de Arthrobacter sp S34, FERM BP-6450, e outros microorganismos compreendem o todo ou uma parte de qualquer uma das sequências de aminoácido de SEQ ID NOs: 9 a 16. Os exemplos concretos de outras enzimas incluem enzimas recombinantes que atuam como a presente enzima de liberação de trealose e têm uma temperatura ideal em temperaturas em uma faixa de temperatura média, e usualmente em temperaturas de acima de 45*0, porém abaixo de 600. As enzimas recombinantes podem ser obteníveis aplicando-se a tecnologia de DNA recombinante para o DNA codificando a presente enzima de liberação de trealose, e têm o todo ou uma parte de qualquer uma das sequências de aminoácido de SEQ ID NOs: 9 a 16.

[0063] A maioria das enzimas de liberação de trealose de acordo com a presente invenção tem as seguintes propriedades físico-químicas: (1) Ação [0064] Especificamente hidrolisar um sacarídeo não redutor tendo uma estrutura de trealose como uma unidade de terminação em um sítio entre uma parte da estrutura de trealose e uma parte das restantes; (2) Peso Molecular [0065] Cerca de 62.000 + 5.000 Dáltons em eletroforese de gel de poliacrilamida de sulfato de dodecila de sódio (SDS-PAGE); (3) Ponto Isoelétrico (pl) [0066] Cerca de 4,7 + 0,5 em isoeletroforese empregando anfólito ; (4) Temperatura Ideal [0067] Cerca de 50*C a cerca de 55Ό quando incubad o em pH 6,0 durante 30 min ; (5) pH Ideal [0068] Cerca de 6,0 quando incubado em 50Ό durante 30 min; (6) Estabilidade térmica [0069] Estável até uma temperatura de 50Ό quando i ncubado em pH 7,0 durante 60 min; e (7) Estabilidade de pH

[0070] Estável em pHs de cerca de 4,5 a cerca de 10,0 quando incubado em 4*C durante 24 horas.

[0071] A presente enzima de liberação de trealose pode ser obtida em uma quantidade prescrita pelo último presente processo descrito para produção da mesma.

[0072] A presente invenção fornece um DNA codificando a presente enzima de liberação de trealose. Um tal DNA é bastante útil na produção da enzima na forma de uma proteína recombinante. Em geral, o DNA inclui aqueles que codificam a enzima independentemente de sua origem/fonte. Exemplos de um tal DNA são aqueles que contêm o todo ou uma parte da sequência de nucleotídeo de SEQ ID NO: 17 ou aqueles complementares a ela. O DNA compreendendo o todo da sequência de nucleotídeo de SEQ ID NO: 17 codifica a sequência de aminoá-cido de SEQ ID NO: 9. Os DNAs que contêm o todo ou uma parte da sequência de nucleotídeo de SEQ ID NO: 17, incluem aqueles que têm uma sequência de nucleotídeo correspondendo a uma sequência de aminoácido relacionando-se à expressão das propriedades da presente enzima de formação de sacarídeo não redutor, e têm a sequência de nucleotídeo de SEQ ID NO: 17 introduzida com uma substituição, dele-ção e/ou adição de uma ou mais bases ao mesmo tempo que retendo a sequência de nucleotídeo relacionando-se com a expressão das propriedades da presente enzima de trealose. Os DNAs de acordo com a presente invenção devem incluir aqueles que uma ou mais bases são substituídas com diferentes bases com base na degeneração de código genético. Também os DNAs de acordo com a presente invenção incluem aqueles que compreendem as sequências de nucleotídeo que codificam a presente enzima de liberação de trealose e ainda compreendem uma ou mais outras sequências de nucleotídeo adicionais selecionadas do grupo consistindo de sequências de ligação de ribossoma tal como um códon de iniciação, códon de terminação, e sequência Shine-Dalgarno; sequências de nucleotídeo codificando peptídeos de sinal, sequências de reconhecimento para enzimas de restrição apropriada; sequências de nucleotídeo para regular a expressão de genes para promotor e realçadores; e terminadores, todos os quais são geralmente empregados em tecnologia de DNA recombinante para produção de proteínas recombinantes. Por exemplo, uma vez que uma parte de e o todo da sequência de nucleotídeo de SEQ ID NO: 8 funcione como sequências de ligação de ribossoma, os DNAs ao qual parte de e o todo da sequência de nucleotídeo de SEQ ID NO: 8 são ligados a montante das sequências de nucleotídeo codificando a presente enzima de liberação de trealose podem ser arbitrariamente empregados na produção de enzima como uma proteína recombinante.

[0073] Como acima descrito, os DNAs codificando a presente enzima de liberação de trealose não devem ser restritos a suas ori-gens/fontes, e eles são preparáveis analisando-se os DNAs de fontes diferentes baseadas na hibridização com um DNA compreendendo uma sequência de nucleotídeo que codifica pelo menos parte da sequência de aminoácido da enzima, por exemplo, a sequência de ami- noácido de SEQ ID NO: 9. Os exemplos reais destas fontes são microorganismos do gênero Arthrobacter, e preferivelmente, Arthrobacter sp S34, FERM BP-6450, e seus mutantes, todos que produzem a enzima de formação de sacarídeo não redutor. Para analisar os microorganismos os métodos convencionais empregados neste campo para análise ou clonagem de DNAs tais como métodos de análise de bibliotecas recombinantes, método PCR, e seus métodos modificados. Como um resultado de análise, os DNAs desejados podem ser obtidos coletando-se de uma maneira usual os DNAs confirmados com a hibri-dização esperada. Geralmente, os DNAs desse modo obtidos compreendem uma parte de ou o todo da sequência de nucleotídeo de SEQ ID NO: 17. Por exemplo, um DNA que compreende o todo da sequência de nucleotídeo de SEQ ID NO: 17 é geralmente obtido de Arthrobacter sp S34, FERM BP-6450. Os DNAs compreendendo uma parte da sequência de nucleotídeo de SEQ ID NO: 17 podem ser obtidos similarmente analisando-se os DNAs de micro-organismos como fontes de outra maneira da linhagem acima, capaz de produzir a enzima de liberação de trealose. Tais DNAs podem ser preparados selecionando-se DNAs que codificam as enzimas tendo as propriedades da enzima, de DNAs nos quais foram introduzidos uma substituição, adição e/ou de-leção de uma ou mais bases dos DNAs acima mencionados empre-gando-se um ou mais métodos de introdução de mutação convencional. Os DNAs podem ser também obtidos aplicando-se as sínteses químicas convencionais com base nas sequências de nucleotídeo codificando a presente enzima de liberação de trealose, por exemplo, uma da SEQ ID NO: 17. Uma vez em mão, os DNAs de acordo com a presente invenção podem ser facilmente amplificados para o nível desejado aplicando-se ou empregando-se método PCR e vetores autonoma-mente replicáveis.

[0074] O presente DNA codificando a enzima de liberação de trea- lose inclui aqueles na forma de DNAs recombinantes que os DNAs foram introduzidos nos vetores apropriados. Os DNAs recombinantes podem ser relativa facilmente preparáveis pela tecnologia de DNA re-combinante em geral se apenas os DNAs são disponíveis. Quaisquer tipos de vetores podem ser empregados na presente invenção contanto que eles autonomamente replicáveis em hospedeiros apropriados. Exemplos de tais vetores são pUC18, pBluescript II SK(+), pKK223-3, λgt.λC, etc., que empregam o Escherichia coli como um hospedeiro; pUB110, pTZ4, pC194, p11, φ1, φ105, etc., que empregam microorganismos do gênero Bacilo: e pHY300PLK, pHV14, TRp7, YEp7, pBS7, etc., que empregam dois ou mais micro-organismos como hospedeiros. Os métodos para inserir o presente DNA em tais vetores na presente invenção podem ser métodos convencionais geralmente empregados neste campo. Um gene contendo o presente DNA e um vetor autonomamente replicável são primeiro digeridos com uma enzima de restrição e/ou desintegrador ultra-sônico, então os fragmentos de DNA resultantes e os fragmentos de vetor são ligados. A ligação é facilitada pelo uso de enzimas de restrição que especificamente atuam sobre a divisão do DNA, especialmente, Kpnl, Accl, BamHi, BstXI, EcoRI, Hin-dlll, Notl, Pstl, Saci, Sall, Smal, Spel, Xbal, Xhol, etc. Para ligar fragmentos de DNA e vetores, primeiramente eles podem ser temperados se necessário, então submetidos à ação de uma ligase de DNA in vivo ou in vitro. O DNA recombinante dessa maneira obtido pode ser replicável sem limitação substancial em um hospedeiro apropriado.

[0075] O presente DNA codificando a enzima de liberação de trea-lose ainda inclui transformantes que o DNA introduziu em vetores apropriados. Os transformantes podem ser facilmente preparáveis introduzindo-se o DNA ou DNA recombinante obtido no acima mencionado nos hospedeiros apropriados para transformá-los. Como os hospedeiros, os micro-organismos e células de plantas e animais, que são convencionalmente empregados neste campo e escolhidos dependendo dos vetores no DNA recombinante, podem ser empregados. Os mi-cro-organismos como hospedeiros incluem aqueles dos gêneros Es-cherichia, Bacilo, e Arthrobacter, e outros actinomicetos, levedura, fungo, etc. Para introduzir o presente DNA nestes micro-organismos hospedeiros, método de célula competente convencional e método de pro-toplasto podem ser empregados. O presente DNA, que codifica a enzima de liberação de trealose introduzida nos transformantes na presente invenção, pode estar presente em uma forma separadora de cromossomas ou em uma forma incorporada em cromossomas. O DNA incorporado em cromossomas de hospedeiros tem um caráter de ser estavelmente retido neles e podem ser vantajosamente empregados na produção da presente proteína recombinante.

[0076] As técnicas supracitadas empregadas para obtenção dos presentes DNAs incluindo DNAs recombinantes e transformantes, e as técnicas para obtenção dos DNAs e proteínas recombinantes são co-mumente empregadas na técnica; Por exemplo, J. Sumbruck e outros em " Molecular Cloning a Laboratory Manual", 2a edição, publicada por Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989), descreve em detalhes métodos para obter os DNAs desejados e aplicações para emprego da produção dos DNAs obtidos. Por exemplo, a Patente Japonesa n° 2.576.970 descreve um método para estabilização de um DNA transformado, que emprega como um hospedeiro um micro-organismo defeituoso em um gene alvo. A Patente Japonesa Kokai n° 157.987/88 descreve um vetor que eficazmente expressa um DNA alvo em micro-organismos do gênero Bacilo. A Patente Japonesa Kohyo n° 502.162/93 descreve um método para estavelmente introduzir um DNA desejado em um cromossoma bacterial. A Patente Japonesa Kohyo n° 506.731/96 descreve um método de produção eficiente de uma enzima de hidrolisação de amido, empregando tecnologia de DNA recombinante. A Patente Ja- ponesa Kohyo n°s 500.543/97 e 500.024/98 descreve um sistema de vetor hospedeiro empregando fungo para produção eficiente de proteínas recombinantes. Estes métodos convencionalmene empregados na técnica são arbitrariamente aplicáveis para a presente invenção.

[0077] Na técnica, quando os DNAs desejados são disponíveis pelos métodos acima, existem comumente fornecidos transformantes que os DNAs são introduzidos em plantas e animais apropriados, isto é, plantas e animais transgênicos. O presente DNA, que codifica a enzima de formação de sacarídeo não redutor e a enzima de liberação de trealose na forma de um DNA introduzido em hospedeiros apropriados, também inclui as plantas e animais transgênicos. Para obter os animais transgênicos, é obtido como um todo por um processo compreendendo o DNA que codifica qualquer uma das enzimas presentes sozinhas ou junto com outro DNA desejado tal como um promotor e real-çador em um vetor apropriado selecionado dependendo das espécies do animal hospedeiro, introduzindo o DNA recombinante resultante em um ovo fertilizado ou célula de espécie embriônica do animal hospedeiro por um método tal como microinjeção e eletroporação, ou por um método de infecção empregando viroses recombinantes contendo o DNA recombinante. Exemplos dos animais hospedeiros são roedores experimentais convencionais tais como camundongos, ratos, e hamsters; e mamíferos convencionalmente empregados como animais domésticos tais como cabra, carneiro, porcos, e vacas, todos dos quais têm uma vantagem de ser facilmente trabalhado. As células resultantes introduzidas com o DNA são transplantadas em tubo uterino ou úteros de um animal feminino peseudográvido das mesmas espécies como as células. Consequentemente, os animais transgênicos, que foram introduzidos com o DNA codificando as presente enzimas aplicando-se hibridi-zação ou método PCR, são obtidos de recém-nascidos de uma maneira natural ou cesariana seccional. Dessa maneira, o presente DNA na forma de um animal transgênico pode ser obtido. Referindo-se a animais transgênicos, eles são descritos em detalhes em "Jikken-lgaku-Besaatsu-Shin-ldennshi-Kogaku-Handbook (Handbook of Genetic Engi-neering), pp. 269 - 283 (1996), editado por Mosami MATSUMURA, Hi-roto OKAYAMA, e Tadashi YAMAMOTO, publica por Yodosha Co., Ltd., Tokyo, Japan. O método para obtenção de plantas transgênicas compreende, por exemplo, prover um plasmídeo como um vetor de um micro-organismo do gênero Agrobacterium infeccioso para plantas, introduzindo o DNA codificando qualquer das duas enzimas presentes no vetor, e ou introduzindo o DNA recombinante resultante em corpos ou protoplastos de planta, ou revestindo partículas de metal pesado com um DNA incluindo sequência de nucleotídeo codificando qualquer das enzimas presentes e diretamente injetando as partículas revestidas em corpos ou protoplastos de planta empregando um tiro de partícula. Embora vários tipos de plantas possam ser empregados como plantas hospedeiras, eles geralmente incluem plantas comestíveis tais como batata, soja, trigo, burley (fumo de folha fina), arroz, trigo, tomate, alface, alfafa, maçã, pêssego, melão, etc. Aplicando-se a hibridização ou método PCR para os acima mencionados corpos de plantas transformadas e protoplastos, transformantes contendo o DNA desejado são selecionados. Os protoplastos transformados podem ser regenerados em corpos de plantas como o presente DNA na forma de plantas transgênica. As técnicas de plantas transgênicas são geralmente descritas em Genetic Engineering, editado por Jane K. Setlow, publicado por Plenum Publishing Corporation, NY, USA, Vol. 16 pp. 93 a 113 (1994). O DNA na forma dos animais e plantas transgênicos supracitados pode ser empregado como fontes da presente enzima de formação de saca-rídeo não redutor e/ou enzima de liberação de trealose, e empregado como plantas comestíveis e animais que contêm trealose ou sacarídeo não redutor tendo uma estrutura de trealose.

[0078] A presente enzima de liberação de trealose presente pode ser obtida em uma quantidade desejada pelo presente processo para produção da enzima que é caracterizada pelo fato de que compreende cultivar um micro-organismo capaz de produzir a enzima em um veículo de cultura nutriente, e coletando-se a enzima produzida da cultura resultante. Quaisquer micro-organismos podem ser empregados no presente processo independentemente de seus gêneros e espécies contanto que eles produzam a presente enzima de liberação de trealose. Os exemplos de tais micro-organismos são aqueles do gênero Ar-throbacter, Arthrobacter sp S34, FERM BP-6450, e os seus mutantes, bem como transformantes obteníveis introduzindo-se o presente DNA codificando a enzima em micro-organismos hospedeiros apropriados.

[0079] Quaisquer veículos de cultura nutriente para cultivar o processo para produção da enzima de liberação de trealose podem ser empregados contanto que os micro-organismos supracitados desenvolvam nele e produzam as enzimas sem restrição para um veículo de cultura nutriente específico. Geralmente, o veículo de cultura nutriente contem fontes de carbono e nitrogênio, e se necessário minerais podem ser adicionados. Exemplos das fontes de carbono são os sacarí-deos tais como dextrina, amidos, hidrolisados de amido parcial, glicose, etc., e são substâncias contendo sacarídeo tais como melaço e extratos de levedura, e ácidos orgânicos tais como ácido glucurônico e ácido succínico. A concentração das fontes de carbono é escolhida dependendo dos tipos empregados, usualmente 30 peso/volume %, e preferivelmente 15 peso/volume % ou inferior. Exemplos das fontes de nitrogênio apropriadamente empregadas na presente invenção são substâncias contendo nitrogênio inorgânico tais como sais de amônio, nitrato, etc.; substâncias contendo nitrogênio orgânico tais como uréia, licor macerado de milho, caseína, peptona, extrato de levedura, extrato de carne, etc. Dependendo do uso, é seletivamente empregado entre ingredientes inorgânicos tais como sais de cálcio, magnésio, potássio, sódio, ácido fosfórico, manganês, zinco, ferro, cobre, molibdeno, cobalto, etc.

[0080] As condições de cultura empregadas para produção da presente enzima de liberação de trealose podem ser empregadas seletivamente de condições apropriadas adequadas para desenvolvimento dos respectivos micro-organismos empregados. Por exemplo, no caso de empregar micro-organismos do gênero Arthrobacter incluindo Ar-throbacter sp S34, FERM BP-6450, a temperatura de cultura é usualmente na faixa de 20 a õOO, e preferivelmente 25 a 37^; o pH de cultura é usualmente na faixa de pH de 4 a 10, e preferivelmente pH de 5 a 9; e o tempo de cultura é na faixa de 10 a 150 horas. Com estas condições, os micro-organismos são cultivados sob condições aeróbicas. Quando empregados transformantes preparados introduzindo-se em hospedeiros apropriados o presente DNA codificando a presente enzima de liberação de trealose, os transformantes são cultivados sob condições aeróbicas em condições selecionadas das condições de cultura tal como as temperaturas de cultura de 20 a 65*0, o pH de cultura de 2 a 9, e o tempo de cultura de 1 a 6 dias, embora elas variem dependendo do gênero, espécies, linhagens ou tipos de microorganismos e vetores. As culturas dessa maneira obtidas geralmente contêm a presente enzima em frações celulares. No caso de transformantes de cultura obtidos empregando-se como hospedeiros os microorganismos do gênero Bacilo, as culturas resultantes podem conter a presente enzima em frações de sobrenadante dependendo dos vetores empregados para transformar os hospedeiros. O conteúdo da presente enzima nas culturas dessa maneira obtidas é usualmente de 0,01 a 3.000 unidades por ml da cultura, embora varie dependendo do gênero, espécies ou linhagens dos micro-organismos e condições de cultura empregados.

[0081] A presente enzima de liberação de trealose é coletada das culturas resultantes. O método de coletagem não é restringido; A enzima pode ser obtida separando-se e coletando-se qualquer uma das frações de células e sobrenadantes de cultura encontrados com uma maior atividade da enzima, e se necessário submeter a fração coletada a um método de purificação apropriado para coletar uma fração purificada contendo a enzima. Para separar as frações de células e sobrenadantes de cultura das culturas, métodos convencionais de separação de líquido de sólido tais como centrifugação e filtragem empregando filtros pré-revestidos e membranas de fibra lisa e côncava podem ser arbitrariamente empregadas. As frações desejadas são coletadas das frações separadas de células e sobrenadante de cultura. Para a fração de células, as células são rompidas em um destrutor celular que é então separado em um extrato celular e uma fração celular insolúvel, seguido coletando-se qualquer das frações desejadas. A fração celular insolúvel pode ser solubilizada por métodos convencionais, se necessário. Como um método para romper células, qualquer uma das técnicas de ultra-sonicação, tratamento com enzimas de lise de parede celular tal como lisozima e glucanase, e carga de prensa mecânica pode ser arbitrariamente empregada. Para romper células as culturas podem ser diretamente tratadas com qualquer uma das técnicas acima, e então as misturas resultantes são tratadas com qualquer um dos métodos de separação de líquido de sólido acima mencionados para coletar uma fração de líquido. Portanto um extrato celular pode ser arbitrariamente obtido.

[0082] Os métodos empregados para maior purificação da presente enzima de liberação de trealose incluem métodos convencionais para purificar enzimas relacionadas com sacarídeo em geral tal como precipitação por saturação, diálise, filtragem, concentração, cromato-grafia de filtragem de gel, cromatografia de troca de íon, cromatografia hidrofóbica, cromatografia de fase reversa, cromatografia de afinidade, eletroforese de gel e eletroforese de ponto isoelétrico. Estes métodos podem ser empregados em combinação dependendo dos propósitos. Das frações resultantes separadas por estes métodos, frações com uma atividade desejada ensaiada pelo método para enzima de liberação de trealose são coletadas para obter a presente enzima purificada para um nível desejado. De acordo com os métodos nos últimos exemplos descritos, a presente enzima pode ser purificada em um nível eletroforeticamente homogêneo. Como acima descrito, o presente método fornece a presente enzima de liberação de trealose na forma de uma cultura, fração celular, fração de sobrenadante de cultura, des-trutor celular, extrato celular, fração celular solúvel e insolúvel, fração de enzima parcialmente purificada, e fração de enzima purificada. Estas frações podem conter outro tipo da presente enzima de formação de sacarídeo não redutor. A presente enzima de liberação de trealose dessa maneira obtida pode ser imobilizada de uma maneira usual antes do uso. Os métodos para imobilização são, por exemplo, método de ligação a permutadores de íon, ligação/adsorção covalente a e sobre resinas e membranas, e método de imobilização por captação empregando substâncias de peso molecular elevado. A enzima de liberação de trealose dessa maneira obtida pode ser arbitrariamente empregada em processos para produção de sacarídeos incluindo o último presente processo descrito para produção de sacarídeo. Particularmente, uma vez que a presente enzima de liberação de trealose tem uma temperatura ideal em uma faixa de temperatura média e preferivelmente tem um pH ideal em uma faixa de pH ácido, pode ser vantajosamente empregada para produzir sacarídeos quando empregada em combinação com a última presente enzima de liberação de trealose descrita, enzima desramificadoras de amido tendo um pH ideal em uma faixa de pH ácido, e glucanotransferase de ciclomaltodextrina que eficazmente atua em faixa de temperatura média.

[0083] A presente invenção fornece um processo para produção de sacarídeos compreendendo sacarídeos não redutores empregando-se as presente enzimas supracitadas; o processo compreendendo as etapas de permitir a enzima de formação de sacarídeo não redutor e/ou a enzima de liberação de trealose para atual em hidrolisados parciais de amido redutor para formar sacarídeos não redutores, e coletando-se os sacarídeos não redutores resultantes ou composições de sacarídeos com uma redutibilidade menor. No processo, o uso de um ou mais outros tipos de enzimas de formação de sacarídeo não redutor e enzimas de liberação de trealose de outra maneira as presente enzimas, e outras enzimas relacionadas com sacarídeos não devem ser excluídas da presente invenção. Os hidrolisados parciais de amido redutor empregados no processo podem ser empregados independentemente de suas origens/fontes. Os sacarídeos não redutores como referidos a na presente invenção incluem sacarídeos não redutores em geral tais como trealose e aqueles tendo uma estrutura de trealose.

[0084] Os hidrolisados parciais de amido redutor empregados no presente processo para produção de sacarídeos podem ser obtidos, por exemplo, liquefazendo-se substâncias de amidos ou amiláceas por métodos convencionais. Os amidos incluem amidos terrestres tais como amido de milho, amido de arroz, e amido de trigo, amido de batata doce, e amido de tapioca. Para liquefazer estes amidos, eles são geralmente suspensos em água em suspensões de amido, preferivelmente, aquelas com uma concentração de pelo menos 10 % peso/peso, e mais preferivelmente aqueles com uma concentração de cerca de 20 a cerca de 50 % peso/peso, e tratadas com tratamentos mecânicos, ácidos e/ou enzimáticos. O grau de liquefação relativamente inferior é satisfatoriamente empregado, preferivelmente, DE (destrose equivalente) ou menos do que 15, e mais preferivelmente DE de menos do que 10.

Quando liquefeitos com ácidos, os amidos são tratados com ácido clorídrico, ácido fosfórico, ácido oxálico, etc., e então as misturas resultantes são neutralizadas com carbonato de cálcio, óxido de cálcio, carbonato de sódio, etc., para pHs desejados antes do uso. Para liquefazer os amidos com enzimas, α-amilase, particularmente, e a-amilase de liquefação termostável são satisfatoriamente empregadas. Os amidos liquefeitos dessa maneira obtidos podem ser ainda submetidos à ação de α-amilase, amilase de formação de maltotriose, amilase de formação de maltotetraose, amilase de formação de maltopentaose, amilase de formação de maltohexaose, etc., e as misturas de reação resultantes podem ser empregadas como os hidrolisados parciais de amido redutor. As propriedades das enzimas relacionadas com amido são descritas em detalhes em Handbook of Amylases and Related Enzymes, pp. 18 a 81, e pp. 125 a 142 (1988), publicados por Perga-mon Press.

[0085] Os hidrolisados parciais de amido redutor dessa maneira obtidos são submetidos à ação da presente enzima de formação de sacarídeo não redutor e/ou enzima de liberação de trealose, e se necessário ainda submetido à ação de uma ou mais enzimas relacionadas com amido tais como a-amilase, β-amilase, glucoamilase, enzimas desramificadas de amido tais como isoamilase e pululanase, glu-canotransferase de ciclomaltodextrina, α-glucosidase, e β-fructofuranosidase. As condições empregadas para reações enzimáti-cas são aquelas adequadas para enzimas empregadas; Usualmente elas são selecionadas de pHs 4 a 10 e temperaturas de 20 a 7010, e preferivelmente pHs 5 a 7 e temperaturas de 30 a 60*0. Particularmente, os sacarídeos não redutores podem ser eficazmente produzidos por reações enzimáticas em temperaturas em uma faixa de temperatura média, isto é, temperaturas de acima de 40*0, porém abaixo de 60*0 ou acima de 45*C porém abaixo de 50^, e pHs de con dições de pH ácido ou de ácido leve. A instrução de permitir as enzimas de atuarem sobre os hidrolisados parciais de amido redutor não é restringida; um prossegue ou segue o outro, ou plural de enzimas pode ser arbitrariamente permitido atuar em substratos simultaneamente.

[0086] A quantidade de enzimas é apropriadamente estabelecida dependendo das condições enzimáticas e tempos de reação, e os empregos finais de composições de sacarídeos não redutores ou sacarí-deos menos redutíveis contendo-as. Para a presente enzima de formação de sacarídeo não redutor e enzima de liberação de trealose, a primeira é empregada em uma quantidade de cerca de 0,01 a cerca de 100 unidades/g de sólido de hidrolisados parciais de amido redutor, e a última é empregada em uma quantidade de cerca de 1 a cerca de 10.000 unidades/g de sólido de hidrolisados parciais de amido redutor. Glucanotransferase de ciclomatodextrina é empregada em uma quantidade de cerca de 0,05 a cerca de 500 unidades/g sólido de hidrolisados parciais de amido redutor. As misturas de reação obtidas com estas enzimas usualmente contêm trealose, α-glucosiltrealose, a-maltosiltrealose, a-maltotriosiltrealose, α-maltotetraosiltrealose, ou a-maltopentaosiltrealose. No processo acima, quando empregado em combinação, a presente enzima de formação de sacarídeo não redutor e enzima de liberação de trealose junto de enzima desramificada de amido e glucanotransferase de ciclomatodextrina caracteristicamente mais produzem uma grande quantidade de trealose e um peso molecular relativamente inferior de sacarídeo não redutor tendo uma estrutura de trealose.

[0087] Das misturas de reação resultantes, as composições de sacarídeos não redutores e sacarídeo com uma menor redutibilidade são coletadas. Nestas etapas de produção, empregos convencionalmente processados para sacarídeos podem ser apropriadamente seleciona- dos. As misturas de reação resultantes são submetidas à filtragem e centrifugação para remover substâncias insolúveis, e então as soluções resultantes são purificadas por descoloração com um carvão vegetal ativado, dessalgado com cambiadores de íon em forma de H e OH, e concentrado em produtos xaroposos. Se necessário, os produtos xaroposos podem ser ainda purificados em sacarídeos não redutores com uma pureza relativamente elevada; Na purificação, um ou mais métodos, por exemplo, fracionações cromatográficas de coluna tais como cromatografia de coluna de troca de íon, cromatografia de coluna empregando um carvão vegetal ativado ou um sílica gel; sedimentação separadora empregando ácidos orgânicos tais como acetona e álcool; separação empregando membranas com uma separabilidade apropriada; e tratamentos alcalinos para decompor e remover os sacarídeos redutíveis remanescentes. Em particular, a cromatografia de coluna de troca de íon pode ser adequadamente empregada na presente invenção como uma preparação de escala industrial dos sacarídeos objeto. Os sacarídeos não redutores com uma pureza melhorada podem ser arbitrariamente preparados por, por exemplo, cromatografia de coluna empregando uma resina de troca de cátion fortemente ácido, como descrito na Patente Japonesa Kokai n°s 23.799/83 e 72.598/83 para remover sacarídeos concomitantes. Neste caso, qualquer dos métodos de leito fixo, leito móvel, e semimóvel pode ser empregado.

[0088] Se necessário, os sacarídeos não redutores resultantes ou sacarídeos de redução relativamente baixa contendo os sacarídeos não redutores podem ser hidrolisados por amilase tal como a-amilase, β-amilase, glucoamilase e α-glucosidase para controlar seu poder de doçura e redução ou para sua viscosidade inferior; e os produtos dessa maneira obtidos podem ainda ser tratados com processamentos onde os sacarídeos redutíveis remanescentes são hidrogenados em álcoois de açúcar para diminuir seu poder redutor. Particularmente, a trealose pode ser facilmente preparada permitindo glucoamilase ou a-glucosidase de atuarem sobre os sacarídeos não redutores ou sacarí-deos de redução relativamente baixa, contendo os sacarídeos não redutores. Uma fração de conteúdo de trealose elevada é obtenível permitindo glucoamilase ou α-glucosidase de atuarem sobre estes sacarídeos para formarem um mistura de trealose e glicose, e submetendo a mistura aos métodos de purificação supracitados tais como cromato-grafia de coluna empregando cambiadores de íon para remover glicose. A fração de conteúdo de trealose elevada pode ser arbitrariamente purificada e concentrada em um produto xaroposo. Se necessário, o produto xaroposo pode ser concentrado em uma solução supersatura-da, seguida cristalizando-se trealose cristalina hidratada ou anidra e recuperando o cristal resultante.

[0089] Para produzir a trealose cristalina hidratada, uma solução de cerca de 65 a 90 % peso/peso de trealose com uma pureza de cerca de 60 % peso/peso ou mais elevada é colocada em um cristaliza-dor, e se necessário na presença de 0,1 a 20 peso/volume % de cristal arenoso, gradualmente resfriada ao mesmo tempo que agitando em uma temperatura de 95*C ou inferior, e preferivelme nte em uma temperatura de 10 a 90*0 para obter um massecuite contendo trealose cristalina hidratada. Método de cristalização contínua para executar a cristalização sob condições de concentração em vácuo pode ser arbitrariamente empregado.

[0090] Os métodos convencionais tais como separação, pulverização de bloco, granulação de leito fluidizado, e secagem por vaporiza-ção podem ser empregados na invenção para preparo da trealose cristalina hidratada de massecuite ou sacarídeos cristalinos contendo o cristal de trealose.

[0091] No caso de separação, os massecuites são usualmente submetidos a uma centrífuga do tipo cesta para separar a trealose cris- talina hidratada de um licor mãe, e se necessário a trealose cristalina hidratada é lavada por vaporização com uma pequena quantidade de água fria para facilitar a preparação de trealose cristalina hidratada com uma pureza elevada. No caso de secagem por vaporização, os sacarídeos cristalinos com nenhuma ou substancialmente livre de hi-groscopicidade são facilmente preparados vaporizando-se massacui-tes com uma concentração de 70 a 85 % peso/peso, em uma base de sólido seco (d. s. b.), e uma cristalinidade de cerca de 20 a 60%, d.s.b., de um bico por uma bomba de pressão elevada; secando os produtos resultantes com ar aquecido a 60 a 10013 q ue não funde os pós cristalinos resultantes; e envelhecendo os pós resultantes durante cerca de 1 a 20 horas ao mesmo tempo que soprando neles ar quente a 30 a 60*0. No caso de pulverização de bloco, os s acarídeos cristalinos com nenhuma ou substancial mente livre de higroscopicidade são facilmente preparados permitindo-se massecuites com um conteúdo de umidade de 10 a 20 % peso/peso e uma cristalinidade de cerca de 10 a 60%, d.s.b., permanecer durante cerca de 0,1 a cerca de 3 dias cristalizar e solidificar o conteúdo total em blocos; e vaporizando-se e cortando-se os blocos resultantes.

[0092] Para produzir trealose cristalina anidra, a trealose cristalina hidratada obtida no acima descrito é seca em uma pressão normal ou reduzida em temperaturas de 70 a 16013, e preferivelmente a 80 a 100Ό; ou uma solução de trealose de conteúdo e concentração relativamente elevada com um conteúdo de umidade de menos do que 1013 é colocada em um cristalizador, agitado na presença de um cristal arenoso em temperaturas de 50 a 16013, e preferivelmente 80 a 14013 para produzir um massecuite contendo trealose cristalina anidra, e tratar o massecuite com métodos tais como vaporização de bloco, granulação de leito fluidizado, e secagem por vaporização sob temperaturas relativamente elevadas e condições de secagem.

[0093] Os sacarídeos não redutores ou composições de sacarí- deos, contendo-os com uma redutibilidade relativamente baixa, dessa maneira obtidos são baixas em redutibilidade e satisfatoriamente em estabilidade; eles não tornam-se acastanhados, formam cheiro desagradável, e deterioram os outros materiais seguintes quando misturados e processados com outros materiais, por exemplo, substâncias contendo aminoácido tais como os aminoácidos, oligopeptídeos e proteínas. Mesmo com uma redutibilidade relativamente baixa, os sacarídeos abaixo identificados têm uma viscosidade relativamente baixa, e aqueles com um grau de polimerização de glicose médio relatívamente baixo, têm uma qualidade e doçura relativamente elevada. Estes sacarídeos podem ser arbitrariamente empregados nos campos de alimentos, cosméticos e farmacêuticos, etc., conforme descrito na Patente Japonesa Kokai n°s 66.187/96, 66.188/96, 73.482/96, 73.506/96, 73.504/96, 336.363/96, 9.986/97, 154.493/97, 252.719/97, 66.540/98 e 168.093/98; e Pedido de Patente Japonêsa n°s 236.441/97, 256.219/97, 268.202/97, 274,962/97, 320.519/97, 338.294/97, 55.710/98, 67.628/98, 134.553/98 e 214.375/98, que foram todos aplicados pela mesma requerente como a presente requerente.

[0094] Os seguintes exemplos descrevem a presente invenção em maiores detalhes: Exemplo 1 Micro-orqanismos capazes de produzir enzima de formação de sacarí-deo não redutor e enzima de liberação de trealose [0095] Os presentes inventores amplamente analisaram sujeiras para isolar um micro-organismo capaz de produzir enzima de formação de sacarídeo não redutor e enzima de liberação de trealose. Como um resultado, isolou-se um micro-organismo com uma tal propriedade de uma sujeira em Ako, Hyogo, Japan, e identificaram-se os microorganismos de acordo com o método conforme descrito em "Beiseibu- tsu-no-Bunrui-to-Dotei" (Classificação e Identificação de Microorganismos), editado porTakaji Hasegawa, publicado por Japan Scien-tific Societies Press, Tokyo, Japan (1985). Os resultados foram como seguem: [0096] Resultados em morfologia celular: (1) Características de células quando incubadas a 37Ό em caldo de ágar nutriente.

[0097] Usualmente existindo uma forma de bastonete de 0,4 a 0,5 x 0,8 a 1,2 ocm; Existindo em uma forma única porém incomumente existindo em uma forma polimórfica ;

[0098] Livre de motilidade;

[0099] Asporogênica não ácida ; e [00100] Mancha de Gram: Positiva. (2) Características de células quando incubadas a 37Ό em ágar nutriente EYG.

[00101] Exibindo um ciclo de crescimento de bastonete e cochoni-Iha.

[00102] Resultados em propriedade Cultural (1) Características de colônias formadas quando incubadas a Z1°C em placa de caldo de ágar nutriente;

[00103] Formato: Colônia circular tendo um diâmetro de cerca de 1 a 2 mm após dois dias de incubação ;

Aro: Integral ;

Projeção: convexa ;

Brilho: brilho úmido ;

Superfície: Plana; e Cor: Semitransparente ou creme. (2) Características de colônias formadas quando incubadas a Z1°C em inclinação de caldo de ágar nutriente ;

[00104] Desenvolvimento: satisfatório ; e [00105] Formato: tipo linha. (3) Características de colônias formadas quando incubadas a Z1°C em inclinação de ágar com extrato de levedura e peptona ;

[00106] Desenvolvimento: satisfatório ; e [00107] Formato: tipo linha. (4) Características de colônias formadas quando cultivadas por tentativa a 27Ό em caldo de gelatina nutriente não liquefazendo a gelatina.

[00108] Resultados em propriedades fisiológicas: (1) Teste em vermelho de metila: Negativo. (2) Teste VP: Positivo. (3) Formação de indol: Negativa. (4) Formação de sulfeto de hidrogênio: Negativa. (5) Hidrólise de amido: Positiva. (6) Liquefação de gelatina: Negativa. (7) Utilização de ácido cítrico: Positiva. (8) Utilização de fonte de nitrogênio inorgânico: Utilizando nitrato, porém não sais de amônio. (9) Formação de pigmento: Não (10) Urease: Negativa. (11) Oxidase: Negativa. (12) Catalase: Positiva. (13) Faixa de Desenvolvimento: Desenvolvimento em pHs de 4,5 a 8,0 e temperaturas de 20 a 50 Ό; e temperaturas ideais de 30 a45X;. (14) Requisitos de Oxigênio: Aeróbico. (15) Utilização de fontes de carbono: [00109] L-Arabinose: Assimilada [00110] D-Glicose: Assimilada [00111] D-Frutose: Não assimilada [00112] D-Galactose: Não assimilada [00113] L-Ramnose: Não assimilada [00114] D-Xilose: Não assimilada [00115] D-Manose: Assimilada [00116] Rafinose: Não assimilada [00117] Trealose: Não assimilada [00118] Sacarose: Não assimilada [00119] Maltose: Não assimilada [00120] Lactose: Não assimilada [00121] D-Dulcitol: Não assimilado [00122] D-Manitol: Não assimilado [00123] Ácido Glucônico: Assimilado [00124] Ácido Sucínico: Assimilado [00125] Ácido Nicotínico: Não assimilado.

[00126] Ácido L-maleico: Assimilado [00127] Ácido Acético: Assimilado [00128] Ácido Lático: Assimilado (16) Formação ácida de açúcares [00129] L-Arabinose: Formada superficialmente.

[00130] D-Glicose: Formada superficialmente.

[00131] D-Frutose: Não formada.

[00132] D-Galactose: Formada superficialmente.

[00133] L-Ramnose: Formada superficialmente.

[00134] D-Xilose: Formada superficialmente.

[00135] Glicerol: Formado superficialmente.

[00136] Rafinose: Não formada.

[00137] Trealose: Formada superficialmente.

[00138] Sacarose: Formada superficialmente.

[00139] Maltose: Formada superficialmente.

[00140] Lactose: Não formada. (17) Utilização de aminoácido [00141] Não utilização de L-glutamato de sódio, L-aspartato de sódio, L-histidina e L-arginina. (18) Teste de Decarboxilase em aminoácido Negativo contra L-lisina, L-ornitina e L-arginina. (19) DNase: Negativa (20) N-Acila tipo de parede celular: acetila. (21) Ácido diamino essencial de parede celular: lisina (22) Mol % de guanina (G) + citosina (C) de DNA: 71,2%.

[00142] Estas propriedades bacteriológicas foram comparadas com aquelas de micro-organismos com referência a Bergey's Manual of Systematic Bacteriology, Vol. 2 (1984). Como um resultado, foi revelado que os micro-organismos foram identificados como um novo microorganismo do gênero Arthrobacter. Baseado nos resultados, os presentes inventores denominaram este micro-organismo "Arthrobacter sp. S34". Os micro-organismos foram depositados e admitidos em 6 de agosto de 1998, sob o número de acessão de FERM BP-6450 em e pelo Patent Microorganism Depository, National Institute of Bioscience and Human-Technology Agency of Industrial Science & Technology, Ministry of International Trasde & Industry, 1-3, Higashi, 1 chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken 305 - 8566, Japão.

[00143] A homologia de DNA entre o micro-organismo identificado e linhagens de tipo do gênero Arthrobacter, depositada em American Type Culture Collection (ATCC), um depositório internacional de microorganismo nos Estados Unidos, foi examinada de acordo com o método de hibridização DNA-DNA em Bergey's Manual of Systematic Bacteriology, Vol. 1 (1984). Doze linhagens-tipo mostradas na Tabela 1 abaixo foram respectiva mente cultivadas de uma maneira usual, e células proliferadas foram coletadas das culturas resultantes. O Arthrobacter sp. S34, FERM BP-6450, foi cultivado pelo método de cultu- ra de semente no último Exemplo 2-1 descrito, seguido coletando-se as células proliferadas. De acordo com o método convencional, os DNAs foram obtidos de cada linhagem-tipo de micro-organismos, duas alíquotas de microgramas dos DNAs foram digeridas com uma enzima de restrição, Pst I. As misturas digeridas resultantes foram respectivamente manchadas sobre "Hybond-N", uma membrana de náilon comercializada pela Amersham International, Arlington Heights, IL, USA, e de uma maneira usual, tratada com álcali, neutralizada, e seca para fixar os DNAs sobre a membrana de náilon. Um micrograma do DNA obtido de Arthrobacter sp. S34, FERM BP-6450, foi fornecido e digerido com Pst I. Empregando [a"32P] dcTP comercializado pela Amersham International, Arlington Heights, IL, USA, e "READY-TO-GO DNA-LABELLING KIT", um kit de rótulo de DNA comercializado pela Pharmacia LKB Biotechnology AB, Uppsala, SWeden, o digestivo foi rotulado com um isótopo para obter uma sonda. A sonda e o DNA acima fixado sobre a película de náilon foram hibridizadas durante duas horas sob condições de agitação a 65*0 em "TAMPÃO DE HIBR IDIZAÇÃO RÁPIDA", um tampão para hibridização comercializada pela Amersham Corp., Div., Amersham International, Arlington Heights, IL, USA. A película de náilon após a hibridização foi lavada de uma maneira usual, seca e submetida à auto-radiografia de uma maneira usual. Os sinais de hibridização observadas em radiografia foram analisados em "IMAGEM MESTRE", um sistema de análise de imagem comercializado pela Pharmacia LKB Biotechnology AB, Uppsala, Sweden, seguido pela numericamente expressa intensidade dos sinais para hidridização. Baseado nos numerais, as intensidades relativas (%) de manchas para os DNAs derivados das linhagens-tipo foram calculadas com respeito à intensidade de sinal de uma mancha para o DNA de Arthrobacter sp S34, FERM BP-6450, como 100 e empregadas como um índice da homologia de DNA entre o micro-organismo e as linhagens-tipo. Os resultados estão na Tabela 1. TABELA 1 Linhagem de Micro-organismo Intensidade de Sinal de Hibridiza- ção Arthrobacter atrocyaneus, ATCC 42,0 13752 Arthrobacter aurescens, ATCC 12,4 13344 Arthrobacter citreus, ATCC 36,2 11624 Arthrobacter crystallpoietes, 31,6 ATCC 15481 Arthrobacter globiformis, ATCC 55,1 8010 Arthrobacter nicotianae, ATCC 18,8 15236 Arthrobacter oxydans, ATCC 28,3 14358 Arthrobacter pascens, ATCC 24,6 13346 Arthrobacter protophormiae, 29,3 ATCC 19271 Arthrobacter ramosus, ATCC 98,6 13727 Arthrobacter ureafaciens, ATCC 42,3 7562 Arthrobacter viscous, ATCC 0,0 19584 19584 Arthrobacter $p. S34, FERM BP- 100 6450 [00144] Como mostrado na Tabela 1, a intensidade de sinal de hibridi-zação para a mancha de DNA de linhagem-tipo Arthrobacter ramosus, ATCC 13727, foi tão elevada quanto 98,6%. Os dados revelaram que o Arthrobacter sp. S34, FERM BP-6450, tinha a mais elevada homologia com a linhagem-tipo Arthrobacter ramosus, ATCC 13727, entre os 12 tipos de linhagens empregadas neste Exemplo. Os resultados no acima mostraram que o Arthrobacter sp. S34, FERM BP-6450, é um novo micro-organismo intimamente relacionado com a linhagem-tipo Arthrobacter ramosos, ATCC 13727. EXEMPLO 2 Enzima de formação de sacarídeo não redutor Experiência 2-1 Preparação de enzima [00145] Um veiculo de cultura nutriente, consistindo de 1,0 pe-so/volume% "PINE-DEX #4", uma dextrina comercializada pela Matsutani Chemical Ind., Tokyo, Japão, 0,5 peso/vo lume % de peptona, 0,1 pe-so/volume % de extrato de levedura, 0,1 peso/volume % de fosfato de monossódio, 0,06 peso/volume % de fosfato de hidrogênio de dipotássio, 0,05 peso/volume % de sulfato de magnésio, e água, foi preparado e ajustado em pH 7,0. Cerca de 100 ml de alíquota do veículo foram colocados em um frasco Erlenmeyer de 500 ml que foram então auto-clavado a 1200 durante 20 minutos e resfriado, seg uído por uma íno-culação de uma semente de Arthrobacter sp. S34, FERM BP-6450 e uma cultura a 37<C durante 48 horas sob condições de agitação de 260 rpm para obter uma cultura de semente.

[00146] Exceto por conter 0,05 peso/volume % de ”KM-75", um an-tiespumante comercializado pela Shin-Etsu Chemical, Co., Ltd, Tokyo, Japão, em cerca de 20 I do mesmo veículo de cultura de nutriente como empregado na cultura de semente foi colocado em um fermentador de 30 i, esterilizado, resfriado a 37Ό, e inoculad o com um % volu-me/volume da cultura de semente para o veículo, seguido por uma incubação a 37^ e pHs de 5,5 - 7,5 durante cerca de 72 horas sob condições de agitação por aeração.

[00147] Uma porção da cultura resultante foi amostrada, centrifugada para separar em células e um sobrenadante de cultura. As células foram ultra-sonicamente rompidas e centrifugadas para coletar sobrenadante para um extrato celular. Ensaio para atividade de enzima de formação de sacarídeo não redutor em cada sobrenadante de cultura e extrato celular revelou que o primeiro mostrou uma atividade de enzima relativamente baixa e o último exibiu cerca de 0,1 unidade com respeito a um mililitro da cultura. EXEMPLO 2-2 Purificação de Enzima [00148] Cerca de 80 I de uma cultura, obtida de acordo com o método no Exemplo 2-1, foram centrifugados a 8,000 rpm durante 30 minutos para obter cerca de 800 g de células por peso úmido. As células úmidas foram suspensas em dois litros de 10 M de tampão de fosfato (pH 7,0) e tratados com "MODEL UH-600", um homogeneizador ultra-sônico comercializado pela SMT Co., Tokyo, Japão. A solução resultante foi centrifugada a 10.000 rpm durante 30 minutos para produzir cerca de 2 litros de um sobrenadante de cultura, Para e no sobrenadante de cultura foi adicionado e dissolvido sulfato de amônio para produzir um grau de saturação de 0,7, e a mistura foi permitida permanecer a 4"O durante 24 horas e centrifugada a 10.00 0 rpm durante 30 minutos para obter um precipitado. O precipitado dessa maneira obtido foi dissolvido em 10 mm de tampão de fosfato (pH 7,0) e dialisado contra uma preparação do mesmo tampão como acima durante 48 horas, seguido pela centrifugação da solução interna dialisada a 10.000 rpm durante 30 minutos para remover substâncias insolúveis. Cerca de um litro da solução resultante foi submetida a uma cromatografia de coluna de troca de íon empregando um pacote de coluna com cerca de 1,3 litro de "SEPABEADS FP-DA13 GEL", um cambiador de ânion comercializado pela Mitsubishi Chemical Industries Ltd., Tokyo, Japão. A etapa de elui-ção foi realizada empregando-se um tampão de gradiente linear de 10 mM de tampão de fosfato (pH 7,0) contendo sal que aumentou de 0 m a 0,6 Μ. O eluído da coluna foi fracionado, e as frações foram respectivamente testadas quanto a atividade de enzima de formação de saca-rídeo não redutor. Como um resultado, a atividade de enzima foi extraordinariamente encontrada em frações eluídas com tampão tendo uma concentração de sal de cerca de 0,2 M, seguido por agrupamento das frações.

[00149] O sulfato de amônio foi adicionado à solução resultante para dar uma concentração de 1 M, e a mistura foi permitida permanecer a 4Ό durante 12 horas, centrifugada a 10.000 rpm d urante 30 minutos para coletar um sobrenadante. O sobrenadante dessa maneira obtido foi submetido à cromatografia de coluna hidrofóbica empregando-se um pacote de coluna com "BUTIL TOYOPEARL 650M GEL", um gel hidrofóbico comercializado pela Tosoh Corporation, Tokyo, Japão. O volume de gel empregado foi de cerca de 300 ml e empregado após equilibrado com 10 mM de tampão de fosfato (pH 7,0) contendo 1 M de sulfato de amônio. A etapa de eluição foi realizada empregando-se um tampão de gradiente linear de 10 mM de tampão de fosfato (pH 7,0) contendo sulfato de amônio que diminuiu de 1 m para 0 M durante a alimentação. O eluído da coluna foi fracionado, e as frações foram respectivamente testadas quanto a atividade de enzima de formação de sacarídeo não redutor. Como um resultado, a atividade da enzima foi extraordinariamente encontrada em frações eluídas com tampão tendo uma concentração de sal de cerca de 0,75 M, seguido por agrupamento das frações.

[00150] A solução resultante foi dialisada contra 10 mM de tampão de fosfato (pH 7,0), e a solução íntima dialisada resultante foi centrifugada a 10.000 rpm durante 30 minutos para coletar um sobrenadante, seguido submetendo-se o sobrenadante à cromatografia de coluna de troca de íon empregando um pacote de coluna com cerca de 40 ml de "DEAE TOYOPEARL 650g GEL", um cambiador de ânion comercializado pela Tosoh Corporation, Tokyo, Japão. A etapa de eluição foi realizada empregando uma solução de sal aquosa linear que aumentou de 0 M a 0,2 M durante a alimentação. O eluído da coluna foi fracionado, e as frações foram respectivamente testadas quanto à atividade de enzima de formação de sacarídeo não redutor. Como um resultado, a atividade da enzima foi extraordinariamente encontrada em frações eluí-das com tampão tendo uma concentração de sal de cerca de 0,75 M, seguido por agrupamento das frações. A solução resultante foi ainda submetida à cromatografia de coluna por filtragem de gel empregando-se um pacote de coluna com cerca de 380 ml de "ULTROGEL® ACA44 GEL", um gel para cromatografia de coluna por filtragem de gel comercializado pela Sepracor/IBF s.a. Villeneuve Ia Garenne, France, seguido coletando-se frações com a atividade de enzima desejada. O nível da atividade de enzima de formação de sacarídeo não redutor, atividade específica, e campos da etapa de purificação acima estão na Tabela 2.

Tabela 2 Etapa de Purifica- Atividade de En- Atividade Pro- ção zima de Enzima Específica dução de Formação de (unida- (%) Sacarídeo Não de/mg de redutor Proteína) Extrato celular 8.000 - 100 Solução íntima dia- 7.500 0,2 94 lisada após precipitação por saturação com sal de amônio Eluído de uma co- 5.200 0,7 65 luna de SEFABE-ADS

Eluído de uma co- 2.600 6,3 33 luna hidrofóbica Eluído de uma co- 910 67,4 11 luna de TOYO PE-ARL

Eluído de filtragem 59,0 168 0,7 de gel [00151] A solução eluída e coletada da cromatografia de filtragem de gel acima foi de uma maneira submetida à eletroforese empregando 7,5 peso/volume % de gel de poliacrilamida e resultou em uma banda de proteína única. Os dados mostram que o eluído da cromatografia de filtragem de gel foi uma espécime purificada de uma enzima de formação de sacarídeo não redutor purificado até uma forma eletroforetíca-mente homogênea. EXEMPLO 2 - 3 Propriedade da Enzima Exemplo 2 - 3 fal Acão [00152] Uma solução 20% aquosa contendo glicose, maltose, mal-totriose, maltotetraose, maltopentaose, maltohexaose ou maltohepta-ose como um substrato para enzima foi preparada, misturada com du- as unidades/g substrato, d.s.b., de uma espécime purificada de uma enzima de formação de sacarídeo não redutor obtida pelo método no Exemplo 2 - 2, e enzimaticamente reagido a 50Ό e p H 6,0 durante 48 horas. A mistura de reação foi dessalgada e analisada em cromatogra-fia líquida de elevado desempenho (abreviada como "HPLC" a seguir) empregando duas colunas de "MCI GEL CK04SS COLUMN", comercializada pela Mitsubishi Chemical Industries Ltd., Tokyo, Japão, que foram cascateadas em séries, seguida determinando-se a composição de sacarídeo da mistura de reação. As condições e mecanismos empregados em HPLC foram como segue: A coluna foi mantida a 85Ό empregando-se "CO-8020", um forno de coluna comercializado pela Tosoh Corporation, Tokyo, Japão. Água como uma fase de movimento foi alimentada em uma taxa de fluxo de 0,4 ml/min. O eluído foi analisado em "RI-8020", um refractômetro diferencial comercializado pela Tosoh Corporation, Tokyo, Japão. Os resultados estão na Tabela 3.

Tabela 3 Substrato Produto de Rea- Tempo de Percen- ção Eluição (min.) tagem (%) glicose glicose 57,2 100,0 maltose maltose 50,8 100,0 maltotriose glucosiltrealose 43,2 36,2 maltotriose 46,2 63,8 maltotetraose maltosiltrealose 38,9 87,2 maltotetraose 42,3 12,8 maltopenta- maltotriosiltrea- 35,4 93,0 ose lose maltopentaose 38,4 7,0 maltohexaose maltotetraosiltre- 32,7 93,8 alose maltoberaose 35,2 6,2 continuação maltohepta- maltopentaosil- 30,2 94,2 ose trealose maltoheptaose 32,4 5,8 [00153] Como evidente nos resultados na Tabela 3, cada produto de reação consistiu essencialmente do substrato remanescente e um sa-carídeo não redutor formado recentemente de α-glucosi(trealose, a-maltosiltrealose, a-maltotriosiltreaiose, a-maltotetraosíItreaIose, ou a-maltopentaosiltrealose (na Tabela 3, foi expresso como glucosiltrealose, maltosiltrealose, maltotriosiItrealose, maltotetraosiltrealose, ou mal-topentaosiltrealose). Substancial mente nenhum outro sacarídeo foi detectado na mistura de reação. Considerando e avaliando a percentagem de sacarídeo não redutor em cada produto de reação como um rendimento de produção, foi revelado que o rendimento de a-glucosiltrealose tendo um grau de polímerização de glicose de 3 foi relatívamente baixo e o rendimento daqueles tendo um grau de polime-rização de glicose de 4 ou maior tal como α-maltosiltrealose, a-maltotriosiltrealose, α-maltotetraosi Itrealose, e a- maltopentaosiltrealose foi tão elevado quanto cerca de 85% ou mais elevado. Nenhuma formação de sacarídeo não redutor de glicose e maltose foi observada. EXEMPLO 2 - 3 fbl Peso Molecular [00154] Uma espécime purificada de uma enzima de formação de sacarídeo não redutor, obtida pelo método do Exemplo 2-2, foi submetida a SDS-PAGE empregando-se 10 peso/volume % de gel de po- liacrilamida de uma maneira usual em paralelo com marcadores moleculares comercializados por Japan Bio-Rad Laboratories, Tokyo, Japão. Comparando com as posições dos marcadores moleculares após eletroforese, a enzima de formação de sacarídeo não redutor exibiu um peso molecular de cerca de 75.000 ± 10.000 Dãltons. EXEMPLO 2 - 3 fcl Ponto Isoelétrico [00155] Uma espécime de uma enzima de formação de sacarídeo não redutor, obtida pelo método do Exemplo 2-2, foi isoeletroforesado empregando-se um gel de poliacrilamida contendo 2 peso/volume % "AMPHOLINE", um arrfólito, comercializado pela Pharmacia LKB Bio-technology AB, Uppsala, Sweden. Após a isoeletroforese, a medida de pH de gel revelou que a enzima de formação de sacarídeo não redutor tinha um ponto isoelétrico de cerca de 4,5 ± 0,5. EXEMPLO 2 - 3 íd) Temperatura Ideal e pH

[00156] Empregando uma espécime purificada de uma enzima de formação de sacarídeo não redutor, obtida pelo método do Exemplo 2 -2, fot examinada a influência de temperatura e pH sobre a atividade da enzima de formação de sacarídeo não redutor. Quando examinando a influência de temperatura, foi conduzida simílarmente como no teste quanto a atividade de enzima exceto para reagir a enzima em temperaturas diferentes. No exame da influência de pH, foi conduzida similarmente como no teste quanto a atividade de enzima exceto para reagir a enzima em diferentes pHs empregando 20 mM de tampões apropriados. Em cada exame, um valor relativo (%) de um nível reduzido de poder de redução de substrato em cada sistema de reação foi calculado em suas correspondentes atividades de enzima relativa (%). Figura 1 mostra um resultado da influência de temperatura, e Figura 2 é de pH. Os eixos cruzados nas Figuras 1 e 2 mostram as temperaturas de reação e pHs de reação, respectivamente. Como mostrado na Figura 1, a temperatura ideal da enzima foi de cerca de 50Ό quando incubado em pH 6,0 durante 60 minutos. Também como mostrado na Figura 2, o pH ideal da enzima foi um pH de cerca de 6,0 quando incubado a 50*0 durante 60 minutos. EXEMPLO 2 - 3 fe) Estabilidades Térmica e de pH

[00157] Empregando uma espécime purificada de uma enzima de formação de sacarídeo não redutor, obtido pelo método do Exemplo 2 -2, foram examinadas as estabilidades térmica e de pH da enzima. A estabilidade térmica foi examinada diluindo-se a espécime com 20 mM de tampão de fosfato (pH 7,0), incubando as diluições em temperaturas prescritas durante 60 minutos, resf ri ando-se as diluições incubadas, e determinando-se a atividade da enzima restante nas diluições de acordo com o método do teste quanto à atividade da enzima. A estabilidade de pH da enzima foi examinada diluindo-se a espécime com 50 mm de tampões com pHs diferentes apropriados, incubando-se as diluições a 4*O durante 24 horas, ajustando-se as d iluições a pH 6, e determinando-se a atividade de enzima restante nas diluições de acordo com o método do teste quanto a atividade da enzima. Os resultados das estabilidades térmica e de pHl da enzima são respectivamente mostrados nas Figuras. 3 e 4. Os eixos cruzados nas Figuras 3 e 4 mostram as temperaturas de incubação e os pHs para a enzima, res-pectivamente, Como mostrado na Figura 3, a enzima foi estável a cerca de 550 e foi estável em pHs na faixa de cerca d e 5,0 a 10,0 como mostrado na Figura 4.

[00158] Estes resultados evidenciam que a enzima de formação de sacarídeo não redutor, obtida pelo método no Exemplo 2 - 2, é a presente enzima de formação de sacarídeo não redutor tendo uma temperatura ideal em uma faixa de temperatura média. EXEMPLO 2 - 4 Sequência parcial de aminoácido [00159] Uma porção de uma espécime purificada de uma enzima de formação de sacarídeo não redutor, obtida pelo método no Exemplo 2 -2, foi dialisada junto a água destilada para obter cerca de 80 ocm de uma amostra em peso como uma proteína para analisar a sequência de aminoácido N-terminal. Empregando-se "PROTEIN SEQUENCER MODEL 4730", um seqüenciador de proteína comercializado pela Applied Biosystems, Inc., Fostser City, USA, a sequência de aminoácido N-terminal foi analisada até 20 resíduos de aminoácido do término N. A sequência de aminoácido N-terminal foi a sequência de aminoácido parcial de SEQ ID NO:4. Uma porção de uma espécime de uma enzima de formação de sacarídeo não redutor, obtida pelo método no Exemplo 2-2, foi dialisada junto a 10 mM de tampão Tris-HCI (pH 9,0) e de uma maneira usual concentrada até cerca de um mg/ml de solução empregando "ULTRACENT-30", uma membrana de uttrafiltragem comercializada pela Tosoh Corporation, Tokyo, Japão. A 0,2 ml do concentrado foram adicionados 10 ocg de "TPCK-TRYPSIN", uma trip-sina reagente comercializada pela Wako Pure Chemical Industries, Ltd., Tokyo, Japão, permitida reagir a 30"C durante 22 horas para digerir a enzima para formar peptídeos. Os peptídeos foram separados submetendo-se a mistura de reação à fase reversa HPLC empregando-se V-BONDASHERE C18 COLUMN" tendo um diâmetro de 3,9 mm e um comprimento de 150 mm, um produto de W ate rs Chromatography Div., MILLIPORE Corp., Milford, USA. A etapa de eluição foi realizada em temperatura ambiente alimentando-se para a coluna uma solução aquosa contendo 0,1 % volume/volume de acetato de trifiuoro e aceto-nitrila aumentando de 24 para 48 volume/volume durante 60 minutos durante a alimentação em uma taxa de fluxo de 0,9 ml/min. Os peptídeos eluídos da coluna foram detectados monitorando-se a absorvên- cia em um comprimento de onda de 210 nm. Dois peptídeos, que foram bem separados dos outros, isto é, "S5" eluído em um tempo de retenção de cerca de duas horas e MS8” eluído em um tempo de retenção de cerca de 30 minutos foram separados, respectivamente secos em vácuo, e dissolvido em 50 % volume/volume de soluções de aceto-nitrila aquosas contendo 50 xl de 0,1 % volume/volume de acetato de trifluoro. As soluções de peptídeo foram submetidas a um seqüencia-dor de proteína para analisar até 20 resíduos de amínoácído. De peptídeos "S5" e "S8" as sequências de aminoácidos de SEQ ID NOs: 5 e 6 foram obtidas. EXEMPLO 3 DNA codificando enzima de formação de sacarídeo não redutor EXEMPLO 3 - 1 Construção e avaliação de biblioteca de gene [00160] Exceto para fixação de temperatura e tempo para cultura foram respectiva mente fixados em 27*C e 24 horas, o Arthrobacter sp. S34 perm BP-6450, foi cultivado similarmente como no Exemplo 2-1.

[00161] A cultura foi centrifugada para remover células que foram então suspensas em uma quantidade adequada de salina tamponada por sal Tris-DETA (a seguir designada como "tampão TES" (pH 8,0), misturado com lisozima em uma quantidade de 0,05 peso/volume % para a suspensão celular em volume, seguido por uma incubação a 37^ durante 30 minutos. A mistura resultante foi congelada mantendo-se a -80Ό durante uma hora, e então misturado e suficientemente agitado com uma mistura de tampão TES e fenol preaquecido a 6CTC, resfriado, e centrifugado para coletar o sobrenadante formado. Ao so-brenadante foi adicionado etanol gelado, e então o sedimento formado foi coletado, dissolvido em uma quantidade adequada de tampão SSC (pH 7,1), misturado com 7,5 ocg de ribonuclease e 125 ocg de protease, e incubado a 37Ό durante uma hora. A mistura resul tante foi mistura- da e agitada com clorofórmio/álcool de isoamila, e permitida permanecer, seguido coletando-se a camada superior formada, adicionando-se etanol gelado à camada, e coletando-se o sedimento formado. O sedimento foi lavado com 70 volume/volume de etanol gelado, seco em vácuo para obter um DNA, seguido dissolvendo-se em tampão de SSC (pH 7,1) para produzir uma concentração de cerca de um mg/ml, e congelamento a -800.

[00162] Cinqüenta microlitros do DNA foram fornecidos, misturados com cerca de 50 unidades de Kpnl como uma enzima de restrição, e incubado a 370 durante uma hora para digerir o DNA. Três microgra-mas do DNA digerido e 0,3 micrograma de "pBluescript II SK (+)", um vetor de plasmídeo comercializado pela Stratagene Cloning Systems, Califórnia, USA, foi pesado, submetido à ação, foram ligados empre-gando-se "DNA LIGATION KIT", comercializado por Takara Shuzo Co., Ltd., Tokyo, Japan, de acordo com o protocolo afixado para o kit. De acordo com o método celular competente convencional, 100 od de "Epicurian Coli XL1-Blue", uma linhagem do Escherichia coli comercializada por Stratagene Cloning Systems, Califórnia, USA, foi transformada com o produto ligado. Dessa maneira uma biblioteca de gene foi obtida.

[00163] A biblioteca de gene dessa maneira obtida foi inoculada em um veículo de placa nutriente de ágar (pH 7,0) contendo 10 g/l, 5 g/l de extrato de levedura, 5 g/l de cloreto de sódio, 75 mg de sal de sódio de ampicilina, e 50 mg/l e 5-bromo-4-cloro-indolil-p-galactosídeo, e incubado a 370 durante 8 horas. Cerca de 5.000 colônia s brancas formadas sobre o veículo foram de uma maneira usual fixada em "HYBOND-N-+" uma película de náilon comercializada por Amersham Corp., Div. Amersham International, Arlington Heights, IL, USA. Baseado em 1-8 resíduos aminoácidos na sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 5 revelada no Exemplo 2-4, um oligonucleotídeo tendo a sequência de nucleotídeo de SEQ ID NO: 18 foi quimicamente sintetizado, e de uma maneira usual rotulado com [ γ - 32P] ATP e T4 cinase de polinucleotí-deo para obter uma sonda. Empregando-se uma sonda, as colônias, que foram fixadas sobre a película de náilon e previamente obtidas, foram analisadas por método de hibridízação de colônia convencional. A hibridízação foi realizada em δδ'Ο durante 30 min utos em uma solução para hibridízação contendo 6 x SSC, 5 x solução Denhalt, e 1000 mg/l de DNA de esperma salmão desnaturado. A película de náilon acima após a hibridízação foi lavada com 6 x SSC a 65G durante 30 minutos, e ainda lavado com 2 x SSC contendo 0,1 peso/volume % SDS a ôõG durante duas horas. A película de náilon resultante foi de uma maneira usual submetida à auto-radiografia, e então, baseado nos sinais observados na auto-radiografia, uma colônia que fortemente hi-bridizou com a sonda foi selecionada e denominada "GY1" como um transformante. EXEMPLO 3-2 Descodificacão de sequência de nucleotídeo [00164] De acordo com método convencional, o transformante GY1 foi inoculado para caldo L (pH 7,0) contendo 100 ocg/ml de ampicilína em uma forma de sódio, e cultivada a 370 durante 2 4 horas sob condições de agitação. Após a conclusão da cultura, as células proliferadas foram coletadas da cultura por centrifugação e tratada com método SDS alcalino convencional para extrair um DNA recombinante. O DNA recombínante foi denominado, O DNA recombinante foi denominado pGY1. Empregando-se a sonda acima, o DNA recombinante, pGY1, foi analisado em técnica de mancha do Sul convencional, e baseado nos dados analíticos um mapa de restrição foi construído conforme mostrado na Figura 5. Conforme exibido na Figura 5, foi revelado que o DNA recombinante, pGY1, continha uma sequência consistindo de cerca de 5.500 pares de base (bp) de Arthrobacter sp. $34, FERM BP- 6450, expressos com uma linha em negrito, e que o DNA recombinante continha uma sequência de nucleotídeo codificando a presente enzima de formação de sacarídeo não redutor, conforme indicado com uma seta preta dentro da área da linha em negrito, na área consistindo de bases de cerca de 4.000 bp entre dois sítios de reconhecimento por uma enzima de restrição, EcoRI. Baseado no resultado, o DNA recombinante, pGY1, foi completamente digerido com EcoRI, e então um fragmento de DNA de cerca de 4.000 bp foi separado e purificado empregando eletroforese de gel de ágarose convencional. O fragmento e "pBluescript II SK (+)", um vetor de plasmídeo comercializado pela Stratagene Cloning Systems, Califórnia, USA, que foi previamente digerido com EcoRI, foi ligado com método de ligação convencional. Com o produto ligado, "XL1-BLUE", uma linhagem de Escherichia coli comercializada pela Stratagene Cloning Systems, Califórnia, USA, foi transformada para obter um transformante. Um DNA recombinante foi extraído do transformante de uma maneira usual, confirmando de um modo usual que continha o fragmento de DNA supracitado consistindo de cerca de bases de 4.000 bp, e denominando-o "pGY2". O transformante com "pGY2" foi denominado "GY2".

[00165] A análise da sequência de nucleotídeo do DNA recombinante pGY2 em método dideóxi convencional revelou que continha a sequência de nucleotídeo de SEQ ID NO: 19 consistindo de bases de 3252 bp derivadas de Arthrobacter sp. S34, FERM BP-6450. A sequência de nucleotídeo codifica a sequência de aminoácido conforme mostrado em paralelo na SEQ ID NO: 19. Comparando-se as sequências de aminoácido de SEQ ID NOs: 4 a 6 como sequências de aminoácido parcial da presente enzima de formação de sacarídeo não redutor confirmada no Exemplo 2-4, as sequências de aminoácido de SEQ ID NOs: 4 a 6 foram perfeitamente coincididas com os aminoácidos 2-21, 619-638, e 98-117 na SEQ ID NO: 19. Estes dados indicam que a presente enzima de formação de sacarídeo não redutor no Exemplo 2 consiste dos aminoácidos 2-757 de SEQ ID NO: 19, ou tem a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 1, e que a enzima de Arthrobacter sp. S34, FERM BP-6450 é codificada por uma sequência de nucleotí-deo de bases 746-3013 de SEQ ID NO: 19, ou codificada pela sequência de nucleotídeo de SEQ ID NO: 7. A estrutura do DNA recombinante pGY2 está na Figura 6.

[00166] A sequência de aminoácido acima identificada da presente enzima de formação de sacarídeo não redutor obtida pelo método do Exemplo 2, e as sequências de aminoácido de enzimas conhecidas tendo uma atividade de formação de sacarídeo não redutor comparadas empregando-se "GENETYX-MAC, VER. 8", um programa de computador comercialmente disponível comercializado pela Software De-velopment Co., Ltd., Tokyo, Japão, de acordo com o médodo pela Lipman, David J. em Science, volume 227, pp. 1.435 - 1.441 (1995) para calcular suas homologia (%). As enzimas empregadas conforme enzimas conhecidas foram aquelas Arthrobacter sp. Q36 e Rhizobium sp. M-11, descritas na Patente Japonesa Kokai n° 322.883; Sulfolobus acidocaldarius, ATCC 33909, descrita na Patente Japonesa Kokai n° 84.586/96; e Sulfolobus solfataricus KM1 descrita em Sai-Kohyo n° WO 95/34642. Conforme descrito nas publicações acima, as enzimas convencionais têm temperaturas ideais de outra maneira uma faixa de temperatura média. A informação de sequências de aminoácido é obtenível do GeneBank, uma base de dados de DNA produzida pelo National Institutes of Health (NIH), USA. As homologias obtidas estão na Tabela 4. TABELA 4 Comparação de origem de enzima para se- Homologia em sequência de aminoácido (*) quência de aminoáci- do Rhizobium sp. M-11 (D78001) 56,9% Arthrobacter sp. Q36 (D63343 56,6% Sulfolobus solfataricus KM1 (D64128) 33,2% Sulfolobus acidocaldarius, ATCC 33909 31,4% (D83245) [00167] Os numerais em parênteses são números de acesso ao GeneBank.

[00168] Como mostrado na Tabela 4, a presente enzima de formação de sacarídeo não redutor no Exemplo 2 mostrou a maior homologia de aminoácido de 56,9% com a enzima de Rhizobium sp. M-11 entre enzimas convencionais com temperaturas ideais de uma faixa de temperatura média. Os dados indicam que a presente enzima de formação de sacarídeo não redutor geralmente compreende uma sequência de aminoácido com uma homologia de pelo menos 57% com a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 1. O resultado da comparação sobre sequência de aminoácido revelou que a enzima no Exemplo 2 e os quatro tipos acima identificados de enzimas convencionais têm sequências de aminoácido comuns de SEQ ID NOs: 2 e 3. A enzima no Exemplo 2 tem sequências de aminoácido parciais de SEQ ID NOs: 2 e 3 como elas correspondem a aminoácidos 84 - 89 e 277 a 282 na SEQ ID N° 1. Os quatro tipos de enzimas empregados como referências têm as sequências de aminoácido parciais acima que são posicionadas em suas partes correspondentes. Com base no fato de que qualquer das enzimas presentes no Exemplo 2 e as enzimas como referências têm uma atividade comum de formação de sacarídeos não redutores tendo uma estrutura de trealose como uma unidade de terminação de hidrolisados parciais de amido redutor, foi indicado que as sequências de aminoácido parciais de SEQ ID NOs: 2 e 3 correlacionadas com a expressão de uma tal atividade de enzima. Estes resultados mostram que a presente enszima de formação de sacarídeo não redutor pode ser caracterizada pelo fato de que compreende as sequências de aminoácido de SEQ ID NOs; 2 e 3, e tem uma temperatura ideal em uma faixa de temperatura média. EXEMPLO 3-3 Transformante introduzido com DNA

[00169] Com base términos 5'- e 3'- da sequência de nucleotídeo de SEQ ID NO: 7, um oligonucleotídeo das sequências de nucleotídeo de SEQ ID NOs: 20 e 21 foram quimicamente sintetizados de uma maneira usual. Como iniciadores de sentido e anti-sendo, 85 ng de cada dos oligonucleotídeos e 100 ng do DNA recombinante pGY2 no Exemplo 3-2 como um padrão foram misturados em um tubo de reação, e a mistura foi adicionada com 1,25 unidades de "PYROBEST", uma espécime de polimerase de DNA termoestável comercializado pela Takara Shuzo Co., Ltd., Tokyo, Japão, junto com 5 od de um tampão afixado com a espécime e 4 od de uma mistuda de dNTP. A mistura resultante foi levada em um volume de 50 od com água destilada esterilizada para executar PCR. A temperatura para PCR foi controlada em um tal modo que a mistura foi tratada com 25 ciclos de sucessivas incubações de 95*C durante um minuto, 90Ό durante 20 segundos, 7 0Ό durante 30 segundos, e 72Ό durante quatro minutos, e finalmente incubada em 72*C durante 10 minutos. Um DNA como um produto PCR foi coletado de um maneira usual para obter cerca de 2.300 bp de DNA. O DNA dessa maneira obtido foi misturado com "pKK223-3", um vetor de plasmídeo comercializado pela Pharmacia LKB Biotechnology AB, Uppsala, Sweden, que foi previamente dividido com um enzima de res- trição, EcoRI, e aliviado pelo "DNA BLUNTING KIT" comercializado pela Takara Shuzo Co., Ltd., Tokyo, Japão, e ligado por método de ligação convencional. A seguir, o produto ligado foi tratado de uma maneira usual para obter um DNA recombinante introduzido com o DNA acima consistindo de bases de cerca de 2.300 bp. A Descodificação do DNA recombinante mostrou que é compreendido uma sequência de nucleotídeo que duas sequências de nucleotídeo de 5'-ATG-3' e 5'-TGA-3' foram respectivamente adicionadas aos términos do 5'- e 3'- da sequência de nucleotídeo de SEQ ID NO: 7. O DNA foi denominado "pGY3". A estrutura do DNA recombinante pGY3 estava na Figura 7.

[00170] O DNA pGY3 recombinante foi de uma maneira usual introduzido em uma linhagem do Escherichia coli LE 392, ATCC 33572, que foi capacitada de modo convencional, a obter um transformante. O método SDS alcalino convencional foi aplicado para o transformante ex-tratir um DNA, e então o DNA extraído foi confirmado ser pGY3 de uma maneira usual e denominada "GY3". Dessa maneira um transformante introduzido com um DNA codificando a presente enzima de formação de sacarídeo não redutor. EXEMPLO 3-4 Transformante introduzido com DNA

[00171] Com base em uma sequência de nucleotídeo no a jusante de término 3'- de um promotor em "pKK223-3", um vetor de plasmídeo comercializado pela Pharmacia LKB Biotechnology AB, Uppsale, Swe-den, oligonucleotídeo tendo as sequências de nucleotídeo de SEQ ID NOs: 22 a 23 foram sintetizados de maneira convencional, e fosforila-dos seus términos 5'- empregando cinase de polinucleotídeo T4. O oligonucleotídeo fosforilado foi anelado, ligado com "pKK223-3", um vetor de plasmídeo comercializado pela Pharmacia LKB Biotechnology AB, Uppsale, Sweden, que foi previamente dividido com enzimas de restrição de EcoRI e Pstl, por método de ligação convencional. De acordo com método convencional, o produto ligado foi introduzido em uma linhagem Escherichia coli que foi então cultivado e tratado com método de SDS alcalino para extrair um DNA. O DNA dessa maneira obtido tinha uma estrutura similar a um vetor de plasmídeo "pKK223-3", e tinha sítios de reconhecimento por enzimas de restrição de EcoRI, Xbal, Spel, e Pstl no a jusante do promotor. Os presente inventores denominaram o DNA um vetor de plasmídeo "pKK4".

[00172] Similarmente como no Exemplo 3-3, o PCR foi feito exceto quanto a empregar oligonucleotídeo com as sequências de nucleotídeo de SEQ ID NOs: 24 e 25, que foram quimicamente sintetizadas com base nas sequências de nucleotídeo parciais de terminal 5' e 3' de SEQ ID NO: 7. Um DNA como um produto PCR foi coletado de maneira usual para obter cerca de 2.300 bp de DNA. O DNA dessa maneira obtido foi dividido com enzimas de restrição, Xbal e Spel, e o plasmí-dio de vetor pKK4 acima, foram ligados pelo método de ligação convencional. A seguir, o produto ligado foi tratado de um modo usual para obter um DNA recombinante com a sequência de nucleotídeo de SEQ ID NO: 7. O DNA recombinante foi denominado "pKGY1".

[00173] Empregando o método de extensão por sobreposição, cujas duas etapas PCR foram ajustadas para e reportadas por Horthon, Ro-bert M. em Methods in Enzymology, Vol. 217, pp. 270 a 279 (1993), uma sequência de nucleotídeo na parte superior do término 5' da SEQ ID NO: 7 no DNA pKGY1 acima foi modificada. O PCR como uma primeira etapa PCR-A foi feita similrmente como no Exemplo 3-3 exceto quanto ao emprego como iniciadores de sentido e anti-sentido, oligonucleotídeo das sequências de nucleotídeo de SEQ ID NOs: 26 e 27, que foram quimicamente sintetizadas com base na sequência de nucleotídeo de vetor pKK4 de plasmídeo; e como um padrão do DNA pKGY1 recombinante acima mencionado. Em paralelo, o PCR como uma primeira etapa PCR-B foi feito similarmente como no Exemplo 3-3 exceto quanto ao emprego como iniciadores de sentido e anti-sentido, oligonucleotídeo das sequências de nucleotídeo de SEQ ID NOs: 28 e 29, que foram respectiva quimicamente sintetizados de uma maneira usual com base na sequência de nucleotídeo de SEQ ID NO: 7; como um padrão do DNA pKGY1 recombinante acima mencionado. Um DNA como um produto da primeira etapa PCR-A foi coletado de uma maneira usual para obter cerca de 390 bp de DNA. Um DNA como um produto na primeira etapa PCR-B foi coletado de maneira usual para obter cerca de 930 bp de DNA.

[00174] O PCR, como uma segunda etapa PCR-A, foi feito similarmente como no Exemplo 3-3 exceto para emprego como um padrão de uma mistura de DNA, isto é, um produto do primeiro PCR-A e a primeira etapa PCR-B; como um iniciador de sentido a sequência de oligonucleotídeo da sequência de nucleotídeo de SEQ ID NO: 26; e como um iniciador de anti-sentido o oligonucleotídeo da sequência de nucleotídeo de SEQ ID NO: 30, que foram quimicamente sintetizado de maneira convencional com base na sequência de nucleotídeo de SEQ ID NO: 7. O DNA como um produto no PCR foi coletado de um modo usual para obter cerca de 1.300 bp de DNA.

[00175] O DNA como um produto no segundo PCR-A foi dividido com enzimas de restrição de EcoRI e BsiWI, e o DNA formado consistindo de bases de cerca de 650 bp foi coletado de uma maneira usual. Cerca de 6.300 bp de DNA, que foi formado após a divisão do DNA pKGY1 recombinante acima com enzimas de restrição de EcoRI e BsiWI, foi coletado de uma maneira convencional. Estes DNAs foram ligados de uma maneira usual, e o produto ligado foi tratado de maneira convencional para obter um DNA recombinante compreendendo cerca de 650 bp de DNA derivado da segunda etapa PCR-A. A desco-dificação do DNA por método de dideóxi convencional revelou que o DNA recombinante obtido compreendeu uma sequência de nucleotídeo na qual a sequência de nucleotídeo de SEQ ID NO: 8, uma sequência de nucleotídeo representada por 5’-ATG-3\ e uma sequência de nucleotídeo representada por 5-TGA-3' foram colocadas em cascata na ordem como indicado acima do término 5' para o término 3'. O DNA re-combínante dessa maneira obtido foi denominado "pGY4", A estrutura de pGY4 é substancialmente a mesma como o DNA pGY3 recombí-nante exceto para aquele pGY4 compreende a sequência de nucleotídeo de SEQ ID NO: 8.

[00176] O DNA recombinante pGY4 foi introduzido de maneira convencional com "BMH71-18mut8", uma célula competente de Escheri-chia coíi comercializada pela Takara Shuzo Co,, Ltd., Tóquio, Japão para obter um transformante. O transformante foi tratado com método SDS alcalino para extrair um DNA que foi então identificado com pGY4 de maneira convencional. Dessa maneira um transformante introduzido com um DNA codificando a presente enzima de formação de sacarídeo não redutor. EXEMPLO 4 Preparação de enzima de formação de sacarídeo não redutor EXEMPLO 4-1 Preparação de enzima empregando micro-orqanismo do gênero Ar-throbacter [00177] De acordo com o método no Exemplo 2-1, o Arthrobacter sp, $34, FERM BP-6450, foi cultivado por um fermentador durante cerca de 72 horas. Após a cultivação, a cultura resultante foi concentrada com uma membrna SF para produzir cerca de oito litros de uma suspensão celular. A suspensão celular foi tratada com "ΜΙΝΙ-LABO", um destrutor celular de pressão superelevada comercializado pela Dainip-pon Pharmaceutical Co,, Ltd., Tóquio, para romper as células. A solução resultante foi centrifugada para obter cerca de 8,5 litros de um so-brenadante. Quando medido quanto a atividade de formação de saca- rídeo não redutor no sobrenadante, ela exibiu cerca de 0,1 unidade da atividade de enzima com respeito a um mililitro da cultura.

[00178] Sulfato de amônio foi adicionado ao sobrenadante para levar a um grau de saturação de cerca de 0,7 para precipitação por saturação, e o sedimento foi coletado por centrifugação, dissolvido em 10 mM de tampão de fosfato (pH 7,0), e dialisado junto a preparação recente do mesmo tampão. Exceto empregando cerca de 2 litros de uma resina de troca de íon, a solução íntima dialisada resultante foi alimentada para a cromatografia de coluna de troca de íon empregando-se "SEPABEADS FP-DA13 GEL", um cambiador de ânion comercializado pela Mitsubishi Chemical Industries Ltd., Tóquio, Japão, conforme descrito no Exemplo 2-2, para coletar frações com enzima de formação de sacarídeo não redutor. As frações foram agrupadas, dialísadas junto a uma preparação recente do mesmo tampão, porém contendo 1 M de sulfato de amônio, e a solução íntima dialisada resultante foi centrifugada para coletar o sobrenadante formado. Exceto empregando cerca de 300 ml de gel, o sobrenadante foi alimentado para cromatografia de coluna hidrofóbica de acordo com o método descrito no Exemplo 2-2 para coletar frações com enzima de formação de sacarídeo não redutor. Então foi confirmado que a enzima obtida tinha uma temperatura ideal acima de 40Ό, porém abaixo de 60Ό, isto é, uma temperatura em uma faixa de temperatura média, e uma faixa de pH ácido de menos do que 7.

[00179] Dessa maneira cerca de 2,600 unidades da presente enzima de formação de sacarídeo não redutor foram obtidas. EXEMPLO 4-2 Preparação de enzima empregando transformante [00180] Cem ml de uma solução aquosa contendo 16 g/l de polipep-tona, 10 g/l de extrato de levedura, 4 5 g/l de cloreto de sódio foram colocados em um frasco Erlenmeyer de 500 ml, autoclavado a 121Ό durante 15 minutos, resfriados, ajustados assépticamente a pH 7,0, e adicionados assépticamente com 10 mg de ampicilina em um sal de sódio para obter um veículo nutriente líquido. O veículo nutriente foi inoculado com o transformante GY2 no Exemplo 3-2, e incubado a 37*C durante cerca de 20 horas sob condições de agi tação por aera-ção para obter uma cultura de semente. Sete litros de um veículo tendo a mesma composição conforme empregada na cultura de semente foram preparados como no caso da cultura de semente e colocado em um fermentador de 10 litros, e inoculado com 70 ml da cultura de semente, seguido pela incubação durante cerca de 20 horas sob condições de agitação por aeração. Das células de cultura resultantes foram coletadas por centrifugação de uma maneira usual. As células coletadas foram suspensas em tampão de fosfato (pH 7,0), rompidas pelo tratamento de ultra-sonicação, e centrifugadas para remover substâncias insolúveis, seguido coletando-se um sobrenadante para obter um extrato celular. O extrato foi dialisado em relação a 10 mM de tampão de fosfato (pH 7,0). A solução íntima dialisada resultante foi coletada e confirmou-se que ela exibiu uma atividade de enzima de formação de sacarídeo não redutor, tinha uma temperatura ideal em uma faixa de temperatura média, isto é, uma temperatura de acima de 40Ό, porém abaixo de 60Ό, e tinha um pH ideal em uma faixa de pH ácido, isto é, um pH de menos do que 7. Dessa maneira, a presente enzima de formação de sacarídeo não redutor foi obtida. Na cultura deste exemplo, cerca de 0,2 unidade/ml de cultura da enzima foi produzida.

[00181] Como um controle, "XL1-BLUE", uma linhagem de Escheri-chia coli comercializada pela Stratagene Cloning Systems, Califórnia, USA, foi cultivada sob as mesmas condições como acima em um veículo de cultura nutriente da mesma composição conforme empregado no acima exceto que ela não continha nenhuma ampicilina. Similarmente como acima, um extrato celular foi obtido e dialisado. Nenhuma atividade de enzima de formação de sacarídeo não redutor foi detectada na solução íntima dialisada resultante, significando que o transfor-mante GY2 é útil na produção da presente enzima de formação de sacarídeo não redutor. EXEMPLO 4-3 Preparação de enzima empregando transformante [00182] O transformante GY3 no Exemplo 3-3 foi cultivado similar-mente como no Exemplo 4-2 exceto empregando um veículo de cultura nutriente líquido (pH 7,0) consistindo de um peso/volume % de mal tose, três peso/volume de polipeptona, um peso/volume % de "MEAST PIG", um produto de Asahi Erewaries, Ltd., Tóquio, Japão, 0,1 peso/volume % de fosfato de hidrogênio de dipotássio, 100 od/ml de am-picilina, e água. A cultura resultante foi tratada com ultra-sonicação para romper células, e a mistura resultante foi centrifugada para remover substâncias insolúveis. Quando testada uanto a atividade de enzima de formação de sacarídeo não redutor no sobrenadante resultante, a cultura conteve cerca de 15 unidades/ml de cultura da enzima. De acordo com o método no Exemplo 2-2, a enzima no sobrenadante foi purificada, confirmando que a espécime purificada resultante exibiu uma atividade de enzima de formação de sacarídeo não redutor, teve uma temperatura ideal em uma faixa de temperatura média, isto é, uma temperatura de acima de 40^, porém abaixo de 60Ό, e te ve um pH ideal em uma faixa de pH ácido, isto é, um pH de menos do que 7. Dessa maneira a presente enzima de formação de sacarídeo não redutor foi obtida. EXEMPLO 4-4 Preparação de enzima empregando transformante [00183] O transformante GY4 no Exemplo 3-4 foi similarmente cultivado como no Exemplo 4-2 exceto quanto a empregar um veículo de cultura nutriente líquido consistindo de dois peso/volume % maltose, quatro peso/volume % de peptona, um peso/volume % de extrato de levedura, 0,1 peso/volume de fosfato de dihidrogênio de sódio, 200 oc g/ml ampicilina, e água. A cultura resultante foi tratada com ultra-sonicação para romper células, e a mistura resultante foi centrifugada para remover substâncias insolúveis, Quando testada quanto a atividade de enzima de formação de sacarídeo não redutor no sobrenadante resultante, a cultura conteve cerca de 60 unidades/ml de cultura da enzima. De acordo com o método no Exemplo 2-2, a enzima no sobrenadante foi purificada, confirmando que a espécime purificada resultante exibiu uma atividade de enzima de formação de sacarídeo não redutor, tinha uma temperaura ideal em uma faixa de temperatura média, isto é, uma temperatura de acima de 40Ό, porém abaixo de 6 Ο'Ο, e tinha um pH ideal em uma faixa de pH ácido, isto é, um pH de menos do que 7, Dessa maneira a presente enzima de formação de sacarídeo não redutor foi obtida. EXEMPLO 5 Enzima de liberação de trealose EXEMPLO 5-1 Produção de enzima [00184] De acordo com o método no Exemplo 2-1, o Aríhrobacter sp. S34, FERM BP-6450, foi cultivada por um fermentador. Portanto, de acordo com o método no Exemplo 2-2, a cultura resultante foi amostrada, seguido pela separação da amostra em células e um sobrenadante. Das células foi obtido um extrato celular Quando testado quanto a atividade de liberação de trealose do sobrenadante e o extrato celular, o primeiro raramente exibiu a atividade de enzima, enquanto que o último exibiu cerca de 0,3 unídade/mi de cultura da enzima. EXEMPLO 5-2 Preparação de enzima [00185] Cerca de 80 litros de uma cultura, preparada de acordo com o método no Exemplo 2-1, foram centrifugados a 8.000 rpm durante 30 minutos para obter cerca de 800 g de células em peso úmido. Dois litros das céluls úmidas foram suspensos em 10 mM de tampão de fosfato (pH 7,0) e tratados com "MODEL UH-600", um homogeneizador ultra-sônico comercializado pela MST Co., Tóquio, Japão. A suspensão resultante foi centrifugada a 10.000 rpm durante 30 minutos, seguido uma coleção de cerca de dois litros de um sobrenadante. O so-brenadante foi misturado com sulfato de amônio para levar a um grau de saturação de 0,7, permitido permanecer a 4Ό durante 24 horas, e centrifugado a 10.000 rpm durante 30 minutos para obter um precipitado por saturação com sulfato de amônio. O precipitado foi dissolvido em 10 mM de tampão de fosfato (pH 7,0), dialisado em relação à preparação recente do mesmo tampão durante 48 horas, e centrifugado a 10.000 rpm durante 30 minutos para remover substâncias insolúveis. Cerca de um litro da solução íntima dialisada resultante foi alimentado para a cromatografia de coluna de troca de íon empregando-se cerca de 1,3 litro de "SEPABEADS FP-DA13 GEL", um cambiador de ânion comercializado pela Mitsubishi Chemical Industries Ltd., Tóquio, Japão. A etapa de eluição foi realizada empregando-se em 10 mM de tampão de fosfato linear (pH 7,00) contendo diminuição de sal de 0 M a 0,6 M durante a alimentação. O eluído da coluna foi fracionado, e as frações cada qual foram testadas quanto a atividade de enzima de liberação de trealose. Como um resultado, a atividade de enzima foi extraordinariamente encontrada em frações eluídas com tampão tendo uma concentração de sal de cerca de 0,2 M, seguido por agrupamento das frações.

[00186] Sulfato de amônio foi adicionado à solução agrupada para apresentar uma concentração de 1 M, e a mistura foi permitida permanecer a 4Ό durante 12 horas, centrifugada a 10.000 rpm durante 30 minutos para coletar um sobrenadante. O sobrenadante foi submetido à cromatografia de coluna hidrofóbica empregando um pacote de coluna com "BUTYL TOYOPEARL 650 M GEL", um gel hidrofóbico comercializado pela Tosoh Corporation, Tóquio, Japão. Antes do uso, o volume de gel foi estabelecido em cerca de 300 ml e equilibrado com 10 mM de tampão de fosfato (pH 7,0) contendo 1 m de sulfato de amônio. A etapa de eluição foi realizada empregando-se uma solução aquosa gradiente linear de amônio diminuindo de 1 M para 0 M durante a alimentação. O eluído da coluna foi fracionado, e as frações foram respectivamente testadas quanto a atividade de enzima de liberação de trealose. Como um resultado, a atividade de enzima foi extraordinariamente constatada em frações eluídas com tampão tendo uma concentração de amônio de cerca de 0,5 M, seguido por agrupamento das frações.

[00187] As frações foram agrupadas, dialisadas em relação a 10 mM de tampão de fosfato (pH 7,0), e as solução íntima dialisada foi centrifugada a 10.000 rpm durante 30 minutos. Então o sobrenadante resultante foi coletado e submetido a "DEAE-TOYOPEARL 650 g GEL", um cambiador de ânion comercializado pela Tosoh Corporation, Tóquio, Japão. A etapa de eluição foi realizada empregando-se uma solução aquosa gradiente linear de sal aumentando de 0 M a 0,2 M durante a alimentação. O eluído da coluna foi fracionado, e as frações foram respectivamente testadas quanto a atividade de enzima de liberação de trealose. Como resultado, a atividade de enzima foi extraordinariamente constatada em frações eluídas com tampão tendo uma concentração de amônio de cerca de 0,15 M, seguido por agrupamento das frações. A solução agrupada foi submetida à cromtografia de filtragem de gel empegando-se cerca de 380 ml de "ULTROGEL® AcA44 RESIN", um gel para cromatografia de coluna de filtragem de gel comercializado pela Sepracor/IBF s. a. Villeneuve Ia Garenne, França, seguido coletando frações com uma atividade extraordinária da enzi- ma. O conteúdo, atividade específica, e produção da enzima em cada etapa estão na Tabela 5, TABELA 5 Etapa Atividade de Atividade Produ- enzima de libe- específica ção ração de trea- (mg/proteína (%) lose {unidade) ) Extrato celular 24,000 - 100 Solução íntima dialisada 22,500 0,6 94 após precipitação por saturação com sulfato de amônio Eluído de coluna SEPABE- 15,600 2,0 65 ADS

Eluído de coluna hidrofóbica 6,400 25,3 27 Eluído de coluna TOYOPE- 4,000 131 17 ARL

Eluído após filtragem de gel 246 713 1,0 [00188] Quando eletroforesada em 7,5 peso/volume % gel de polia-crilamida de modo convencional, a solução eluída e coletada da cro-matografia de filtragem de gel acima forneceu uma banda de proteína única. Os dados indicam que o eluído da cromatografia de filtragem de gel obtido no acima foi uma enzima de liberação de trealose purificada até um nível eletroforeti ca mente homogêneo. EXEMPLO 5-3 Propriedade de Enzima EXEMPLO 5-3 fa) Acão [00189] Qualquer um dos sacarídeos consistindo de a- glucosiltrealose, α-maltosiltrealose, α-maltotriosiltrealose, α-maltotetraosiltrealose, e α-maltopentaosiltrealose como sacarídeos não redutores tendo uma estrutura de trealose obtida pelo método do último Exemplo 8-3 descrito; e maltotriose, maltotetraose, maltopenta-ose, maltohexaose, e maltoheptaose, com sacarídeos redutíveis foi dissolvido em água em uma solução de 2 peso/volume % como uma solução de substrato aquosa para substrato. Cada solução de substrato aquosa foi adicionada com duas unidades/g de substrato em sólido de uma espécime purificada de enzima de liberação de trealose obtida pelo método no Exemplo 5-2, e enzimaticamente reagida a 50*C e pH 6,0 durante 48 horas. De acordo com o método no Exemplo 2-3(a), o produto de reação foi analisado em HPLC após dessalinização para calcular a composição de sacarídeo de cada dos produtos de reação. Os resultados estão na Tabela 6. Na Tabela 6, α-glucosiltrealose, a-maltosiltrealose, a-maltotriosiltrealose, α-maltotetraosiltrealose, e a-maltopentaosiltrealose foram respectivamente expressas como glucosiltrealose, maltosiltrealose, maltotriosiltrealose, maltotetraosiltrealose, e maltopensaosiltrealose. TABELA 6 Substrato Produto de rea- Tempo de Composição eluição (minu- ção (%) to) glucosiltrealose trealose 48,5 16,8 glucose 57,2 8,2 glucosiltrealose 43,3 75,0 maltosiltrealose trealose 48,5 44,1 maltose 50,8 44,4 maltosiltrealose 38,9 11,5 maltotriosiltrealose trealose 48,5 40,5 maltotriose 46,2 59,0 matlotriosiltrea- 35,4 0,5 lose maltotetraosiltrealose trealose 48,5 35,0 maltotetraose 42,1 64,2 maltotetrasiltre- 32,7 0,3 alose maltopensaosiltrealose trealose 48,5 29,5 maltopentaose 38,2 70,2 maltopentaosil- 30,2 0,3 trealose maltotriose maltotriose 46,2 100,0 maltotetraose maltotetraose 42,1 100,0 maltopentaose maltopentaose 38,2 100,0 maltohexaose maltohexaose 35,2 100,0 maltoheptaose maltoheptaose 32,6 100,0 [00190] Como evidente dos resultados na Tabela 6, a enzima de liberação de trealose, obtida pelo método no Exemplo 5-2, um sacarí-deo especificamente hidrolisado, não redutor, tendo uma estrutura de trealose como uma unidade de terminação e um grau de polimerização de glicose de, pelo menos, três em um sítio entre uma parte da estrutura de trealose e uma parte do restante para formar trealose e um saca-rídeo redutor tendo um grau de polimerização de glicose de um ou mais. Ao mesmo tempo que a enzima não atua em maltooligossacarí-deos tais como maltotriose e sacarídeos inferiores. EXEMPLO 5-3 fb) Peso Molecular [00191] Uma espécime purificada de uma enzima de liberação de trealose obtida pelo método no Exemplo 5-2, foi submetida junto com marcadores moleculares comercializados pela Japan Bio-Rad Laboratories, Tóquio, Japão, em SDS-PAGE convencional empregando 10 peso/volume % de gel de poliacrilamida. Após a eletroforese, a posição da espécime eletroforesada sobre o gel foi comparada com aquelas dos marcadores, revelando que a espécime tinha um peso molecular de cerca de 62.000 ± 5,000 Dáltons, EXEMPLO 5-3 fc) Ponto Isoelétrico [00192] Uma espécime purificada de uma enzima de liberação de trealose obtida pelo método do Exemplo 5-2, foi de uma maneira usual submetida à isoeletroforese empregando um gel de poliacrilamida contendo 2 peso/volume % "AMPHOLINE", um anfólito comercializado pela Pharmacia LKB Biotechnology AB, Uppsale, Swesden. A medição de pH do gel após eletroforese, teve um ponto isoelétrico de cerca de 4,7 ±0,5. EXEMPLO 5-3 (ú) Temperatura e pH Ideais [00193] Uma espécime purificada de uma enzima de liberação de trealose obtida pelo método no Exemplo 5-2, foi examinada sobre a influencia da temperatura e pH sobre a atividade de enzima, A influência de temperatura foi examinada de acordo com o teste quanto a atividade de enzima exceto durante a reação da enzima em diferentes temperaturas. A influência de pH foi examinada de acordo com o teste quanto a atividade de enzim exceto durante a reação da enzima em pHs diferentes usando tampões de fosfato 20 mM apropriados. Em cada procedimento, os valores relativos (%) do nível aumentado de poder de redução constatado em cada sistema foram calculados e relacionados como atividade de enzima relativa (%). Os resultados da influência de temperatura e pH estão respectivamente nas Figuras. 8 e 9. Os eixos transversais nas Figuras. 8 e 9 exibem as temperaturas de reação e pHs para a enzima, respectivamente. Como mostrado na Figura 8, a temperatura Ideal da enzima foi de cerca de 50 a cerca de 55Ό quando incubada em pH 6,0 durante 30 minutos, enquanto o pH ideal da enzima foi um pH de cerca de 6,0 quando incubado a 500 durante 30 minutos. EXEMPLO 5-3 fe) Estabilidade em temperatura e pH

[00194] Uma espécime purificada de uma enzima de liberação de trealose, obtida pelo método no Exemplo 5-2, foi examinada sobre a estabilidade de temperatura e pH, A estabilidade de temperatura foi examinada diluindo-se a espécime com 20 mM de tampão de fosfato (pH 7,0), incubando-se as diluições em diferentes temperaturas durante 60 minutos, resfriando-se as diluições restantes, e testando a atividade de enzima permanecida nas diluições. A estabilidade de pH foi estudada diluindo-se a espécime com 50 mM de tampões (pH 7,0) com diferentes pHs, incubando-se as diluições a 4C durante 24 horas, ajustado em pH 6, e testando-se a atividade de enzima permanecida nas diluições. Os resultados da estabilidade de temperatura e pH estão respectivamente nas Figuras. 10 e 11. Os eixos transversais nas Figuras 10 e 11 exibem temperaturas e pHs nos quais a enzima foi mantida, respectivmente. Conforme exibido na Figura 10, a enzima foi estável até em cerca de 5013, ao mesmo tempo a enzima foi estável em pHs na faixa de cerca de 4,5 a cerca de 10,0.

[00195] Os resultados descritos anteriormente indicam que a enzima de liberação de trealose, obtida pelo método no Exemplo 5-2, na presente enzima que tem uma temperatura ideal em uma faixa de temperatura média. EXEMPLO 5-4 Sequência de aminoácido parcial [00196] Uma porção de uma espécime purificada de uma enzima de liberação de trealose, obtida pelo método do Exemplo 5-2, foi dialisada em relação à água destilada e preparada em uma amostra contendo cerca de 80 ng de proteína para a análise de aminoácido N-terminal. Empregando "PROTEIN SEQUENCER MODEL 473A", um seqüencia-dor de proteína comercializado pela Applied biosystems, Inc., Foster City, USA, a sequência de aminoácido N-terminal foi analisada até 20 resíduos de aminoácido do N-término. A sequência de aminoácido N-terminal revelada foi a sequência de aminoácido parcial de SEQ ID NO: 14.

[00197] Uma porção de um espécime purificado de uma enzima de liberação de trealose, obtida pelo método no Exemplo 5-2, foi dialisada contra tampão de 10 mM Tris-HCI (ph 9,0) e de uma maneira usual concentrada para fornecer uma concentração de cerca de um miligrama por mililitro empregando-se "ULTRACENT-30", uma membrana de ultrafiltragem comercializada pela Tosoh Corporation, Tóquio, Japão. Em 0,2 ml do concentrado foram adicionados 10 oog de um reagente de endopeptidase delisila comercializado pela Wako Pure Chemical In-dusries, Ltd., Tóquio, Japão, e a mistura foi incubada a 30Ό durante 22 horas para digerir a enzima e para formar peptídeos. A mistura de reação foi submetida à HPLC de fase reversa empregando-se uma coluna de "NOVA-PAK C18 COLUMN", 4,5 mm em diâmetro e 150 mm em comprimento, comercializado pela Waters Chromatography Div., Millipore Corp., Milford, MA, USA, para separar os peptídeos sob temperatura ambiente. A etapa de eluição foi realizada empregando-se um gradiente linear de um 0,1 % volume/volume de solução de ácido triflu-oroacético aquosa contendo acetonitrila aumentando de 24 volume/ volume % para 48 % volume/volume durante 60 minutos durante a alimentação em um taxa de fluxo de 0,9 ml/minuto. Os peptídeos eluídos da coluna foram monitorados medindo-se em um comprimento de onda de 210 nm. Dois peptídeos, denominados "RT18" com um tempo de retenção de cerca de 18 minutos e "RT33" com um tempo de retenção de cerca de 33 minutos e bem separados dos outros, foram coletados, secos em vácuo, e dissolvidos respectivamente em uma solução de acetonitrila aquosa de 50 % volume/volume, contendo 200 =d de 0,1 % volume/volume de ácido trifluoroacético. As soluções de peptídeos foram submetidas a um seqüenciador de proteína para analisar até 20 resíduos de aminoácidos do N-término de cada peptídeo. As sequências de aminoácidos de SEQ ID NOs: 15 e 16 dos peptídeos T18 e RT33, respectivamente. EXEMPLO 6 DNA codificando enzima de liberação de trealose EXEMPLO 6-1 Construção e análise de biblioteca de gene [00198] De acordo com o Exemplo 3-1, uma biblioteca de gene de Arthrobacter sp. S34, FERM BP-6450 foi construída, e então submetida à análise aplicando-se o método de hibridização de colônia sob as condições do Exemplo 3-1 exceto quanto a usar como uma sonda um oligonucleotídeo, tendo uma sequência de nucleotídeo codificando a presente enzima de liberação de trealose, preparada pelo seguinte procedimento; A sonda foi de uma maneira usual preparada rotulando-se com um isótopo de cinase de polinucleotídeo [γ-32Ρ] ATP e T4 o olí-gonucleotídeo tendo a sequência de nucleotídeo de SEQ ID NO: 31, que foi quimicamente sintetizada com base em uma sequência de amí-noácido consistindo de aminoácidos 12 - 20 de SEQ ID NO: 15 revelada no Exemplo 5-4. Um transformante que fortemente hibridizou com a sonda foi selecionado.

[00199] De acordo com o método no Exemplo 3-2, um DNA recom-binante foi extraído do transformante e analisado em técnica de mancha do Sul convencional empregando-se a sonda acima. Um mapa de restrição preparado com base nos dados analíticos foi coincidido com aquele do DNA pGY1 recombinante obtido nos Exemplos 3-1 e 3-2, Conforme mostrado na Figura 5, foi revelado que o presente DNA recombinante neste exemplo continha uma sequência de nucleotídeo, que codificou a presente enzima de liberação de trealose como indicado com uma seta oblíqua, dentro de uma região consistindo de bases de cerca de 2.200 bp posicionadas entre sítios de reconhecimento pelas enzimas de restrição, Pstl e Kpní. Empregando-se o DNA pGY1 recombinante, foi prosseguida a decodificação da sequência de nucleotídeo de DNA codificando a presente enzima de liberação de trealose. EXEMPLO 6-2 Decodificacão de sequência de nucleotídeo [00200] O DNA pGY1 recombinante, obtido pelo método no Exemplo 3-2, foi de maneira convencional completamente digerido com uma enzima de restrição, Pstl. O fragmento de DNA de cerca de 3.300 bp formado na mistura resultante foi removido em eletroforese de ágarose, e o fragmento de DNA formado de cerca de 5.200 bp foi coletado. O fragmento de DNA foi de uma maneira usual submetido à reação de ligação, e o produto ligado foi empregado para transformar "XL1-BLUE", uma linhagem do Escherichia coii comercializada pela Stratag-ne Cloning Systems, Califórnia, USA, Do transformante resultante, um DNA recombinante foi extraído por método convencional. O DNA recombinante foi confirmado para ter uma região consistindo de bases de cerca de 2.200 bp compreendendo uma sequência de nucleotídeo codificando a presente enzima de liberação de trealose, e denominada "pGZ2". Um transformante introduzido com pGZ2 foi denominado um DNA pGZ2 recombinante, [00201] Análise de método de dideóxi convencional para a sequência de nucleotídeo do DNA pGZ2 recombinante revelou que continha uma sequência de nucleotídeo compreendendo de 2.218 bp de bases conforme mostrado na SEQ ID NO: 32 derivada de Arthrobacter sp. S34, FERM BP-6450. A sequência de nucleotídeo poderia codificar a sequência de aminoácido na SEQ ID NO: 32. A sequência de aminoá-cido foi comparada com aquela da SEQ ID NOs: 14 a 16 como sequências de aminoácido parcial da presente enzima de liberação de trealose confirmada no Exemplo 5-4. Como um resultado, as sequências de aminoácido de SEQ ID NOs: 14, 15 e 16 foram respectivamente coincididas com aminoácidos 1-20, 298-317, e 31-50 da sequência de aminoácido na SEQ ID NO: 32. Os dados indicam que a enzima de liberação de trealose no Exemplo 5 compreende a sequência de aminoácido na SEQ ID NO: 32 ou uma da SEQ ID NO: 9, e aquela da enzima de Arthrobacter sp. S34, FERM BP-6450, é codificada pelas bases 477-2.201 na SEQ ID NO: 32 ou a sequência de nucleotídeo de SEQ ID NO: 17. A Figura 12 exibe a estrutura do DNA pGZ2 recombi-nante supracitado.

[00202] A sequência de aminoácido acima da presente enzima de liberação de trealose, obtida pelo método do Exemplo 5, e outros métodos convencionais de enzimas tendo uma atividade de enzima de liberação de trealose foram comparadas com cada um de acordo com o método no Exemplo 3-2 para determinar suas homologias (%). Como enzimas convencionais, aquelas derivadas de Arthrobacter sp. Q36 foram descritas pela Patente Japonêsa Kokai n° 298.880/95; Rhizo-bium sp. M-11, descritas na Patente Japonesa Kokai n° 298.880/95; Sulfolobus acidocaldarius, ATCC 33909; e Sulfolobus solfatarious KM1 descrita em Sai-Kohyo n° W095/34642. Todas estas enzimas têm temperaturas ideais fora de uma faixa de temperatura média. As sequências de aminoácido destas enzimas são disponíveis da GenBank, uma base de dados de DNA produzida pelo National Institutes of Health (NIH), USA, sob o número de acessão de D63343, D64130, D78001, e D83245. A informação de sua homologia está na Tabela 7. TABELA 7 Comparação de origem de enzima para a se- Homologia em sequência de aminoácido (*) quência de aminoáci- do Arthrobacter sp. 036 Q36 (D63343) 59,9% Rhizobium sp. M-11 (D78001) 59,1% Sulfolobus solfataricus KM1 (D64130) 37,7% Sulfolobus acidocaldarius, ATCC 33909 36,0% (D83245) *: Numerais em parênteses são números de acesso para o GeneBank.

[00203] Conforme mostrado na Tabela 7, a presente enzima de liberação de trealose no Exemplo 5 exibiu uma homologia de aminoácido de 59,9% com a enzima de Arthrobacter sp. Q36 entre enzimas convencionais com temperaturas ideais fora de uma faixa de temperatura média. Os dados indicam que a presente enzima de liberação de trealose geralmente compreende uma sequência de aminoácido com uma homologia de pelo menos 60% com a sequência de aminoácido de SEQ ID NO: 9. O resultado de comparação sobre a sequência de aminoácido revelou que a enzima no Exemplo 5 e os quatro tipos acima identificados de enzimas convencionais têm sequências de aminoácido comuns de SEQ ID NOs: 10 e 13. A enzima no Exemplo 5 tem sequências de aminoácido parcial de SEQ ID NOS: 10 a 13 como encontrado nos aminoácidos 148-153, 185-190, 248-254 e 285-291 em SEQ. Os quatro tipos de enzimas empregadas como referências têm as sequências de aminoácido parcial acima que são posicionadas em suas partes correspondentes. Com base no fato de que qualquer das enzimas presentes no Exemplo 5 e as enzimas como referências têm comu-mente uma atividade de especificamente hidrolisar um sacarídeo não redutor tendo uma estrutura de trealose como uma unidade de termi- nação e um grau de polimerização de glicose de, pelo menos, três em um sítio entre uma parte da estrutura de trealose e uma parte do restante, foi indicado que as sequências de aminoácido parcial de SEQ ID NOs: 10 a 13 correlacionassem a expressão de uma tal atividade de enzima. Estes resultados mostram que a presente enzima de liberação de trealose pode ser caracterizada pelo fato de que compreende as sequências de aminoácido de SEQ ID NOs: 10 a 13 e tem uma temperatura ideal em uma faixa de temperatura média. EXEMPLO 6-3 Transformante introduzido com DNA

[00204] Com base nas sequências de nucleotídeo terminais 5'- e 3'-de SEQ ID NO: 17, os oligonucleotídeos das bases de SEQ ID NOs: 33 e 34 foram quimicamente sintetizadas de uma maneira usual. Como iniciadores de sentido e anti-sentido, 85 ng de cada dos oligonucleotídeos e 100 ng do DNA pGZ2 recombinante no Exemplo 6-2 como um padrão foram misturados em um tubo de reação ao mesmo tempo que adicionando outros reagentes de acordo com o Exemplo 3-3. A temperatura para PCR foi controlada de uma tal maneira que a mistura foi tratada com 25 ciclos de incubações sucessivas de 95*C durante um minuto, 981C durante 20 segundos, 70*C durante 30 s egundos, e 72*C durante quatro minutos, e finalmente incubada a 72°C durante 10 minutos. Um DNA como um produto PCR foi coletado de uma maneira usual para obter cerca de 1.700 bp DNA. O DNA dessa maneira obtido foi misturado com "pKK233-3", um vetor de plasmídeo comercializado pela Pharmacia LBB Biotechnology AB, Uppsale, Sweden, que foi previamente dividido com a enzima de restrição, EcoRI, e embotado pelo "DNA BLUNTING KIT" comercializado pela Takara Shuzo Co., Ltd., Tóqui, Japão, e ligado por método de ligação convencional. A seguir, o produto ligado foi tratado de uma maneira usual para obter um DNA recombinante introduzido com o DNA acima consistindo de bases de cerca de 1.700 bp. Decodificação do DNA recombinante por método de dideóxi convencional mostrou que ele compreende uma sequência de nucleotídeo na qual uma sequência de nucleotídeo de 5'-TGA-3'foi adicionada ao término 3'- da sequência de nucleotídeo de SEQ ID NO: 17. O DNA foi denominado "pGZ3". A estrutura do DNA recombinante pGZ3 estava na Figura 13.

[00205] O pGZ3 recombinante foi de uma maneira usual introduzido em uma linhagem do Escherichia coli LE 392, ATCC 33572, que foi capacitada de maneira convencional, para obter um transformante. O método SDS alcalino convencional foi aplicado para o transformante extrair um DNA e denominado "GZ3" identificando-se o transformante como pGZ3. Dessa maneira um transformante, introduzido com a presente enzima de liberação de trealose, foi obtido. EXEMPLO 6-4 Transformante introduzido com DNA

[00206] PCR foi feito similarmente como no Exemplo 6-3 exceto quanto a usar, como iniciadores de sentido e anti-sentido, oligonucleo-tídeos tendo sequências de nucleotídeo de SEQ ID NOs: 35 e 36, respectivamente, que foi quimicamente sintetizado com base nas sequências de nucleotídeo terminais 5'e 3'de SEQ ID NO: 17. Um DNA como um produto PCR foi coletado de uma maneira usual para obter cerca de 1.700 bp de DNA. O DNA dessa maneira obtido foi dividido com enzimas de restrição, Xbal e Xpel, e "pKK4", um vetor de plasmídeo obtido pelo método no Exemplo 3-4, que foi previamente dividido com enzima de restrição, Xbal e Spel, foram ligados de uma maneira usual. A seguir, o produto ligado foi tratado de uma maneira usual para obter um DNA recombinante compreendendo a sequência de SEQ ID NO: 17. O DNA recombinante dessa maneira obtido foi denominado "pKGZ1".

[00207] Uma sequência de nucleotídeo na parte superiror do térmi- no 5' da SEQ ID NO: 17 contida no DNA pKGZ1 recombinante foi modificada similarmente como no Exemplo 3-4; PCR como uma primeira PCR-C foi realizada similarmente como no Exemplo 3-3 exceto quanto a empregar o DNA pKGZ1 recombinante acima como um padrão e oli-gonucleotfdeos de SEQ ID NO: 26 a 37, como iniciadores de sentido e anti-sentido, que foram quimicamente sintetizados de uma maneira usual com base na sequência de nucleotídeo do vetor pKK4 de plas-mídeo. Em paralelo, PCR como uma primeira PCR-D foi realizada similarmente como no Exemplo 3-3 exceto quanto a usar o DNA pKGZ1 recombinante acima como um padrão e oligonucleotídeos de SEQ ID NOs: 38 e 39, como iniciadores de sentido e anti-sentido, que foram quimicamente sintetizados de uma maneira usual com base nas sequências de nucleotídeo de SEQ ID NOs: 38 e 39. Um DNA como um produto PCR-C foi coletado de uma maneira usual para obter cerca de 390 bp de DNA, ao mesmo tempo que outro DNA como um produto PCR-D foi coletado similarmente como acima para obter cerca de 590 bp de DNA.

[00208] PCR como um segundo PCR-B foi realizado similarmente como no Exemplo 3-3 exceto quanto a empregar a mistura de DNA obtida como produtos no primeiro PCR-C e primeiro PCR-D, um oligonu-cleotídeo de SEQ ID NO: 26 empregado no primeiro PCR-C como um iniciador de sendo, e um oligonucleotídeo de SEQ ID NO: 39 empregado no primeiro PCR-D como um iniciador anti-sentido. Um DNA como um produto PCR foi coletado de uma maneira usual para obter cerca de 950 bp de DNA.

[00209] O DNA como um segundo produto PCR-B foi dividido com uma enzima de restrição, EcoRI, e o DNA formado de cerca de 270 bp foi coletado de maneira convencional. O DNA pKGZ1 recombinante foi dividido com um enzima de restrição, EcoRI, e o DNA formado de cerca de 6.100 bp foi coletado similarmente como acima. Estes DNAs fo- ram ligados como usual e tratados de uma maneira usual para obter um DNA recombinnte compreendendo cerca de 270 bp de DNA do segundo produto PCR-B. Decodificação do DNA recombínante por método de dideóxi convencional revelou que ele continha a sequência de nucleotídeo de SEQ ID NO; 8, uma da SEQ ID NO: 17, e uma representada pela 5-TGA-3 na ordem como indicado do término 5’ ao 3'- O DNA recombínante dessa maneira obtido foi denominado "pGZ4". O DNA pGZ4 recombínante tinha substancialmente a mesma estrutura como o DNA pGZ3 recombínante obtido no Exemplo 6-3 exceto que ele tinha a sequência de nucleotídeo de SEQ ID NO: 8.

[00210] O DNA pGZ4 recombínante foi introduzido em "BMH71-18mutS’\ uma célula competente de Escherichia coli comercializada pela Takara Shuzo Co., Ltd., Tóquio, Japão, para obter um transfor-mante. Empregando o método SDS alcalino convencional, um DNA foi extraído do transformante e confirmado ser pGZ4 de acordo com modo convencional. Ele foi denominado "GZ4”. Dessa maneira um transformante introduzido com um DNA codificando a presente enzima de liberação de trealose. EXEMPLO 7 Preparação de enzima de liberação de trealose EXEMPLO 7-1 Frepracão de enzima empregando micro-orqanismos do gênero Ar-throbacter [00211] Uma cultura de semente de Arthrobacter sp. S34, FERM BP-6450, foi inoculada em um veículo de cultura nutriente e incubado por um fermentador durante cerca de 72 horas de acordo com o método do Exemplo 2-1. Após a incubação, a cultura resultante foi filtrada e concentrada com uma membrana SF para obter cerca de oito litros de suspensão celular que foi então tratada com ’’ΜΙΝΙ-LABO", um destru-tor celular de pressão super elevada comercializado pela Dainippon Pharmaceutical Co., Ltd., Tóquio, Japão, para romper células. O rompimento celular foi centrifugado para coletar e obter cerca de 8,5 L de sobrenadante como um extrato celular. A determinação do extrato celular quanto a atividade de enzima de liberação de trealose revelou que a cultura continha cerca de 0,3 unidade/ml de cultura da atividade de enzima. Ao extrato celulr foi adicionado sulfato de amônio para fornecer um grau de saturação de 0,7 para realizar precipitação por saturação, e então centrifugado para obter o precipitado. O precipitado foi dissolvido em 10 mm de tampão de fosfato (pH 7,0), e dialisado contra uma preparação recente do mesmo tampão. A solução íntima dialisada foi submetida à cromatografia de troca de íon empregando "SEPABE-ADS FP-DA13 GEL" comercializado pela Mitsubishi Chemical Co., Ltd., Tóquio, Japão, de acordo com o método do Exemplo 5-2 exceto que o volume de resina empregado do cambiador de íon foi de cerca de dois litros, seguido coletando-se frações tendo uma atividade de enzima de liberação de trealose. As frações foram agrupadas e diali-sadas contra uma preparação recente do mesmo tampão, porém contendo 1M de sulfato de amônio, e então a solução dialisada foi centrifugada para obter o sobrenadante formado. O sobrenadante foi submetido a uma cromatografia de coluna hidrofóbica empregando-se "BU-TYL TOYOPEARL 650M GEL", um gel hidrofóbico comercializado pela Tosoh Co., Ltd., Tóquio, Japão, de acordo com o método no Exemplo 5-2 exceto que cerca de 350 ml do gel foram empregados, e então as frações com uma atividade de enzima de liberação de trealose foram coletadas. A enzima coletada foi confirmada para ter uma temperatura ideal em uma faixa de temperatura média, isto é, temperaturas acima de 451C porém abaixo de 6010 e um pH ideal em uma f aixa de pH ácido, isto é, um pH de menos do que 7.

[00212] Dessa maneira, cerca de 6.400 unidades da presente enzima de liberação de trealose foram obtidas. EXEMPLO 7-2 Preparação e enzima empregando micro-orqanismo do gênero Ar-throbacter [00213] Uma cultura de semente de Arthrobacter sp. S34, FERM BP-6450, foi inoculada em um veículo de cultura nutriente de acordo com o método do Exemplo 7-1, Em um litro da cultura resultante foram adicionados 100 mg de "LISOZIMA, DE GEMA DE OVO", uma preparação de lisozima, comercializada pela Nagase Biochemicals, Ltd., Kyoto, Japão. Então a aeração foi suspensa, e as células foram rompidas mantendo-se a cultura durante 24 horas sob as mesmas condições de temperaura e agitação, conforme empregado na cultura. O rompimento celular foi submetido a uma centrífuga contínua a 10.000 rpm, seguido por coletagem de um sobrenadante como um extrato celular De acordo com o método no Exemplo 7-1, o extrato celular foi tratado com precipitação por saturação, e o sedimento foi dialisado. A solução íntima dialisada resultante foi submetida à cromatografía de troca de íon empregando-se "SEPABEADS FP-DA13 GEL", um produto da Mitsubishi Chemical Co., Ltd., Tóquio, Japão, de acordo com o método no Exemplo 7-1 para coletar frações com uma atividade de enzima de liberação de trealose. As frações agrupadas continham cerca de 16.500 unidades da presente enzima de liberação de trealose e cerca de 5.500 unidades da presente enzima de formação de sacarídeo não reduto r. Dessa maneira uma preparação de enzima contendo os dois tipos presentes de enzimas foi obtida. EXEMPLO 7-3 Produção de enzima empregando transformante [00214] Em um frasco Erlenmeyer de 500 ml foram colocados 100 ml de uma solução aquosa contendo 16 g/litro de polipeptona, 10 g/litro de extrato de levedura, e 5 g/l de cloreto de sódio, e o frasco foi auto-clavado a 121Ό durante 15 minutos, resfriado, asse pticamente ajusta- do a pH 7,0, e asséptica mente misturado com 10 mg de ampicilina em um sal de sódio para obter um veículo de cultura nutriente. O transfor-mante "GZ2" obtido no Exemplo 6-2 foi inoculado no veículo líquido, seguido pela incubação a 37Ό durante cerca de 20 horas sob condições de agitação por aeração para obter uma cultura de semente. Sete litros de uma preparação recente do mesmo veículo conforme empregados na cultura de semente foram similarmente preparados e colocados em um fermentador de 10 litros, inoculados com 70 ml da cultura de semente, e cultivados durante cerca de 20 horas sob condições de agitação por aeração. As células foram coletadas centrifugando-se a cultura resultante de maneira usual. As células coletadas foram suspensas em 10 mM de tampão de fosfato (pH 7,0) e ultra-sonicadas para romper as células. A mistura resultante foi centrifugada para remover as substâncis insolúveis, seguido coletando-se um sobrenadante como um extrato celular. O extrato celular foi dialisado contra 10 mM de tampão de fosfato (pH 7,0). A solução íntima dialisada foi coletada e confirmada para ter uma temperatura ideal na faixa de temperatura média, isto é, temperaturas acima de 45*0, porém ab aixo de 60*0 e um pH ideal em uma faixa de pH ácido, isto é, um pH de menos do que 7. Dessa maneira a presente enzima de liberação de trealose foi obtida. Neste exemplo, cerca de 0,5 unidade/ml de cultura da enzima de liberação de trealose foi obtida.

[00215] Como um controle, "XL1-Blue", uma linhagem do Escheri-chia coli comercializada pela Stratagene Cloning Systems, Califórnia, USA, foi cultivada sob as mesmas condições de cultura conforme empregado no acima em uma preparação recente do mesmo veículo de cultura conforme acima, porém livre de ampicilina, seguido coletando-se e dialisando-se um extrato celular similarmente como acima. Nenhuma atividade de enzima de liberação de trealose foi observada, significando que o transformante GZ2 pode ser vantajosamente em- pregado na produção da presente enzima de liberação de trealose. EXEMPLO 7-4 Produção de enzima empregando transformante [00216] O transformante GZ3 no Exemplo 6-3 foi cultivado similarmente como no Exemplo 7-3 exceto quanto a empregar um veículo de cultura nutriente líquido (pH 7,0) consistindo de um peso/volume % de maltose, três peso/volume % de polipeptona, um peso/volume % de "MEAST PIGir comercializado pela Asahi Breweries, Ltd., Tóquio, Japão, 0,1 peso/volume % de fosfato de hidrogênio de dipotássio, 100 ac g/ml de ampicilina, e água. A cultura resultante foi tratada com ultra-sonicação para romper células, e a mistura foi centrifugada para remover as substâncias insolúveis. A medição da atividade de enzima de liberação de trealose no sobrenadante resultante revelou que ele continha cerca de 70 unidades/ml de cultura da enzima. De acordo com o método no Eexemplo 5-2, o sobrenadante foi purificado e confirmado que a espécime purificada tinha uma temperatura ideal em uma faixa de temperatura média, isto é, temperaturas acima de 45G porém abaixo de GOG e um pH ideal em uma faixa de pH áci do, isto é, um pH de menos do que 7.

[00217] Portanto a presente enzima de liberação de trealose foi obtida. EXEMPLO 7-5 Produção de enzima empregando transformante [00218] O transformante GZ4 no Exemplo 6-4 foi cultivado similarmente como no Exemplo 4-4. A cultura resultante foi tratada com ultra-sonicação para romper células, e a mistura foi centrifugada para remover as substâncias insolúveis. A medição da atividade de enzima de liberação de trealose no sobrenadante resultante revelou que ele continha cerca de 250 unidades/ml de cultura da enzima. De acordo com o método do Exemplo 5-2, o sobrenadante foi purificado e confirmou que a espécime purificada tinha uma temperatura ideal em uma faixa de temperatura média, isto é, temperaturas acima de 45Ό porém abaixo de 6CTC e um pH ideal em uma faixa de pH ácido, isto é, um pH de menos do que 7. Portanto a presente enzima de liberação de trealose foi obtida, EXEMPLO 8 Produção de Sacarídeo EXEMPLO 8-1 Produção de xarope de sacarídeo não redutor [00219] 6 peso/volume de uma suspensão de amido de batata foram geiatinizados por aquecimento, ajustado a pH 4,5 e 50Ό, misturado com 2.500 unidades/g de amido em sólido, e enzímaticamente reagido durante 20 horas. Durante 10 minutos, resfriada a 40*0, misturada com 150 unidades/g de amido em sólido de 'TERMAMYL 60L", um espécime de α-amilase comercializado pela Novo Nordisk Industries A/S, Copenhagen, Denmark, e submetida a uma reação enzimática durante 20 horas, ao mesmo tempo que mantendo na temperatura. A mistura de reação foi autoclavada a 120Ό durante 20 minutos, resfriada a 53Ό, ajustada a pH 5,7, misturada com uma unidade por grama de amido em solido de uma enzima de formação de sacarídeo não redutor obtida pelo método no Exemplo 4-1, e submetida a uma reação enzimática durante 96 horas, A mistura de reação dessa maneira obtida foi aquecida a 97*0 durante 30 minutos para inativar a enzima restante, resfriada, filtrada, purificada de um modo usual por descoloração com um carvão vegetal ativado e dessalinização com cambiadores de íon, e concentrada para obter cerca de 70 % peso/peso de xarope em uma produção de cerca de 90Ό para o amido de material, d.s.b, [00220] O produto, que tem um DE baixo de 24 e contém a-glucosiltrealose, α-maltosi Itrealose, a-maltotriosiltreaiose, a-maltotetraosiltrealose, e α-maltopentaosiltrealose em quantidade res- pectiva de 11,5, 5,7, 29,5, 3,5, e 2,8%, d.s.b., tem uma doçura de qualidade suave e elevada, e uma viscosidade satisfatória e capacidade de reter umidade. Ele pode ser arbitrariamente empregado como um adoçante, agente para melhorar o sabor, agente para melhorar a qualidade, estabilizador, enchedor, auxiliar ou excipiente em composições em geral tais como alimentos, cosméticos e farmacêuticos. EXEMPLO 8-2 Produção de xarope contendo sacarídeo não redutor [00221] A uma suspensão de amido de milho de 33 % peso/peso foi adicionado carbonato de cálcio para dar uma concentração final de 0,1% peso/peso, e então a mistura foi ajustada a pH 6,5, misturado com 0,2% peso/peso por amido, d.s.b., de "TERMAMYL 60L\ uma li-quefação de espécime de α-amilase comercializado pela Novo Nordisk Industrí A/S, Copenhagen, Denmark, e enzímaticamente reagida a 950 durante 15 minutos para liquefazer o amido. O amido liquefeito foi autoclavado a 120*0 durante 10 minutos, resfriado a 53Ό, misturado com uma unidade/g de amido, d.s.b., de uma enzima de formação de maltotetraose de uma linhagem de Pseudomonas stutzeri comercializada pela Hayashibara Biochemical Laboratories Inc., Okayama, Japão, e duas unidades/g de amido, d.s.b., de uma enzima de formação de sacarídeo não redutor obtido pelo método no Exemplo 4-2, e enzi-maticamente reagido durante 48 horas. A mistura de reação foi misturada com 15 unidades de "α-AMYLASE ZA", um espécime de a-amilase comercializado pela Ueda Chemical Co., Ltd., Osaka, Japão, e então incubada a 65*0 durante duas horas, autoclavada a 1200 durante 10 minutos, e resfriada. A mistura resultante foi filtrada, e de uma maneira usual purificada por tratamentos de coloração empregando um carvão vegetal ativado e de dessalinização empregando cambiadores de íon, e concentrada em cerca de 70 % peso/peso de xarope, d.s.b., em uma produção de cerca de 90% com respeito ao amido de materi- al, d.s.b.

[00222] O produto, que tem um DE baixo de 18,5 e contém <x-glucosiltrehlose, a-maltosíltrealose, a-maltotríosiltrealose, o-maltotetraosíltreaiose, e α-maltopentaosiltrealose em quantidade respectiva de 9,3, 30,1, 0,9, 0,8, e 0,5%, d.s.b,, tem uma doçura de qualidade suave e elevada, e uma viscosidade satisfatória e capacidade de reter umidade, Ele pode ser arbitrariamente empregado como um adoçante, agente para melhorar o sabor, agente para melhorar a qualidade, estabilizador, enchedor, auxiliar ou excipiente em composições em geral tal como alimentos, cosméticos, e farmacêuticos. EXEMPLO 8-3 Produção de sacar ideo não redutor [00223] Uma solução aquosa de 20 % peso/peso de qualquer dos hidrolígados parciais de amido redutor de maltotriose, maltotetraose, maltopentaose, maltohexaose, e maltoheptaose, que são todos produzidos pela Hayashíbara Biochemical Laboratories Inc., Okayama, Japão, misturados com duas unidades/g de hidrolisado parcial de amido redutor de um espécime purificado de enzima de formação de sacarí-deo não redutor obtido pelo método do Exemplo 2-2, e submetido a uma reação enzimática a 500 e pH 6,0 durante 48 ho ras. De cada dos hidrolisados parciais de amido redutor acima identificados foram respectivamente formadas glucosiltrehlose, a-maltosíltrealose, a-maltotríosiltrealose, α-maltotetraosiltrealose, e a- maltopentaosiltrealose como sacarídeos redutíveis. Os sacarídeos em cada mistura de reação foram de maneira convencional fracionados pelos seguintes tratamentos sucessivos: Inativação da enzima restante aquecendo-se, filtragem, descoloração, dessalinização, concentração, e cromatografia de coluna empregando "XT-1016 {forma Na+)'\ uma resina de troca de cátion de ácido forte de metal alcalino com um grau de polimerização de 4Ό, comercializada pela Tokyo Organic Chemical Industries, Ltd., Tokyo, Japan. As condições empregadas na cromato-grafia de coluna foram as seguintes: A temperatura de coluna interna foi estabelecida a 55*C, o volume de carga de uma solução de sacarí-deo para uma resina foi de cerca de 5% volume/volume, e a taxa de fluxo de água aquecida a 55Ό como um leito móvel foi estabelecida a SV (velocidade de espaço) 0,13. Um eluído de cada coluna, que continha pelo menos 95% peso/peso de qualquer dos sacarídeos não redu-tores acima identificados, d.s.b,, com respeito à composição de saca-rídeo, foi coletado, Para cada eluído coletado foi adicionado hidróxido de sódio para fornecer uma concentração de 0,1 N, e a mistura foi aquecida a 100*0 durante duas horas para decompor os sacarídeos redutíveis restantes. As misturas de reação dessa maneira obtidas foram respectivamente descoloradas com um carvão vegetal ativado, dessalgadas com cambiadores de íon em forma H e OH, concentradas, secas em vácuo, e pulverizadas em a-glucosiltrehlose, a-maltosiltrealose, a-maltotriosiltrealose, α-maltotetraosiltrealose, e a-maltopentaosiltrealose poeirentas com uma pureza de pelo menos 99,0% peso/peso, d.s.b.

[00224] Os produtos, contendo sacarídeos não redutores altamente purificados e tendo um DE mais inferior, podem ser arbitraríamente empregados como um agente para melhorar o sabor, agente para melhorar a qualidade, estabilizador, enchedor, auxiliar, ou excipiente em composições em geral tais como alimentos, cosméticos, e farmacêuticos. EXEMPLO 8-4 Produção de pó cristalino contendo sacarídeo não redutor [00225] Uma solução aquosa de 20 % peso/peso de maltopentaose comercializada pela Hayashibara Biochemical Laboratories Inc., Oka-yama, Japão, foi preparada, misturada com duas unidades/g de mal to- pentaose, d.s.b,, de uma enzima de formação de sacarídeo não redutor pelo método no Exemplo 4-3, e enzímaticamente reagida a 50Ό durante 48 horas, resultando em uma conversão de cerca de 75% de maltopentaose em α-maltotriosiltrealose. A mistura de reação foi aquecida a 97"C durante 30 minutos para inativar a enzima restante, e então resfriada, filtrada, e purificada pela descoloração empregando um carvão vegetal ativado de dessalinização empregando cambiado-res de íon.

[00226] A seguir, a solução resultante foi concentrada a 60Ό em vácuo em uma solução de cerca de 75% peso/peso com respeito a conteúdos sólidos, misturados com cerca de 0,01 peso/volume de cristal de a-maItotriosiItreaIose como cristal arenoso, e permitido permanecer durante 24 horas. Então o cristal de α-maltotriosiltrealose cristalizado foi coletado por uma centrífuga, lavado com uma pequena quantidade de água gelada, e seco de uma maneira usual para obter um pó cristalino com um conteúdo relativamente elevado do sacarídeo não redutor em uma produção de cerca de SOO para os só lidos de material, d.s.b.

[00227] O produto, tendo uma doçura relativamente baixa e um DE de menos de 0,2 extremamente baixo e contendo pelo menos 99,0 peso/peso de α-maltotriosiltrealose como um sacarídeo não redutor, pode ser arbitra ri a mente empregado como um agente para melhorar o sabor, agente para melhorara qualidade, estabilizador, enchedor, auxiliar ou excipíente em composições em geral tais como alimentos, cosméticos, e farmacêuticos. EXEMPLO 8-5 Processo para produção de trealose cristalina hidratada [00228] Amido de milho foi suspenso em água em uma suspensão de amido de 30 % peso/peso que foi então misturado com carbonato de cálcio em uma quantidade de 0,1 % peso/peso. A mistura foi ajus- tada a pH 6,0, e então adicionada com 0,2 % peso/peso por amido, d.s.b., de "TERMAMYL 60L", uma espécime de α-amilase de liquefa-ção comercializada pela Novo Nordisk Industri A/S, Copenhagen, Denmark, e enzimaticamente reagida a 95Ό durante 1 5 minutos para gelatinizar e liquefazer o amido.

[00229] A mistura resultante foi autoclavada a 120°C durante 30 minutos, resfriada a 51Ό, ajustada a pH 5,7, e enzimaticamente reagida na mesma temperatura durante 64 horas após mistura com 300 unida-des/g de amido, d.s.b., de um espécime de isoamilase comercializada pela Hayashibara Biochemical Laboratories slnc., Okayama, Japão; duas unidades/g de amido, d.s.b., de uma espécime de glucanotransfe-rase de ciclomaltodextrina comercializada pela Hayashibara Biochemical Laboratories Inc., Okayama, Japão; duas unidades de uma enzima de formação de sacarídeo não redutor obtido pelo método do Exemplo 4-1; e 10 unidades/g de amido, d.s.b., de uma enzima de liberação de trealose obtida pelo método do Exemplo 7-1. A mistura de reação foi aquecida a 97Ό durante 30 minutos para inativar a enzima restante, e então resfriada a 50*0, misturada com 10 unidades/g rama de amido, d.s.b., de "GLUCOZYME", uma espécime de glucoamilase comercializada pela Nagase Biochemicals, Ltd., Kyoto, Japão, e submetida a uma reação enzimática durante 24 horas. A mistura de reação dessa maneira obtida foi aquecida a 95*C durante 10 minutos para inativar as enzimas restantes, resfriada, filtrada, purificada por descoloração empregando um carvão vegetal ativado e dessalinização empregando-se cambiadores de íon, e concentrada em cerca de 60 % peso/peso de solução com respeito a conteúdos sólidos ou a xarope contendo 84,1 % peso/peso de trealose, d.s.b. O xarope foi concentrado até fornecer uma concentração de cerca de 83 % peso/peso, d.s.b., e o concentrado foi colocado em um cristalizador, misturado com cerca de 0,1 pe-so/volume % de trealose cristalina hidratada ao xarope, e agitada du- rante cerca de duas horas para cristalizar o sacarídeo. Os cristais resultantes foram coletados por uma centrífuga, lavados com uma pequena quantidade de água para remover melaço, secos por ar aquecido a 45^ para obter trealose cristalina hidratada com uma pureza de pelo menos 99% em uma produção de cerca de 50% do amido de material, d.s.b.

[00230] Uma vez que o produto é substancialmente livre de higros-copicidade e facilmente manuseável, ele pode ser arbitraríamente empregado como um adoçante, agente para melhorar o sabor, agente para melhorar a qualidade, estabilizador, enchedor, auxiliar ou excipiente em composições em geral tais como alimentos, cosméticos e farmacêuticos. EXEMPLO 8-6 Processo para produção de dó cristalino contendo trealose cristalina anidra [00231] Empregando o método do Exemplo 8-5 a trealose cristalina hidratada foi preparada, e o sacarídeo foi seco em vácuo empregando um secador a vácuo rotativo com invólucro. A secagem foi conduzida a 90Ό e 300 - 350 mmHg durante cerca de sete horas. Após a secagem, a temperatura e pressão acima foram retornadas para a temperatura ambiente e a pressão normal antes de coletar o produto ou um pó cristalino contendo pelo menos 90 % peso/peso de trealose cristalina anidra, d.s.b.

[00232] Uma vez que a trealose cristalina anidra absorve umidade em matérias hidratadas e muda em si na trealose cristalina hidratada, o produto rico no sacarídeo pode ser arbitrariamente empregado como um dessecante seguro não prejudicial para desidratar ou secar composições incluindo produtos alimentícios, cosméticos e farmacêuticos, bem como materiais e intermediários deles. O produto com uma doçura de qualidade suave e elevada pode ser arbitrariamente empregado como um adoçante, agente para melhorar o sabor, agente para melhorar a qualidade, estabilizador, enchedor, auxiliar ou excipiente em composições em geral tais como alimentos, cosméticos, e farmacêuticos. EXEMPLO 8-7 Processo para produção de xarope de trealose [00233] Uma suspensão de 27 % peso/peso de amido de tapioca foi misturada com carbonato de cálcio para fornecer uma concentração final de 0,1% peso/peso, ajustado a pH 6,0, misturado com 0,2% peso/peso por amido, d.s.b., de "TERMAMYL 6QL", um espécime de a-amilase de liquefação comercializado pela Novo Nordisk Industri A/S, Copenhagen, Denmark, e enzimaticamente reagido a 95Ό durante 15 minutos para gelatinizar e liquefazer o amido. A mistura resultante foi autoclavada em uma pressão de 2 kg/cm2 durante 30 min, resfriada a 53^, ajustada a pH 5,7, e enzimaticamente reagida na mesma temperatura durante 72 horas após misturada com 500 unidades/g de amido, d.s.b., de "PROMOZYME 2G0L", um espécime de pululanase comercializado pela Novo Nordisk Industri A/S, Copenhagen, Denmark; uma unidade/g de amido, d.s.b., de linhagem de Pseudomonas stutzeri comercializada pela Hayashibara Biochemical Laboratories Inc., Okaya-ma, Japão; cerca de duas unidades/g de amido, d.s.b., de uma enzima de formação de sacarfdeo não redutor e cerca de seis unídades/g de amido, d.s.b., de uma enzima de liberação de trealose, obtida peio método do Exemplo 7-2. A mistura de reação dessa maneira obtida foi aquecida a 97Ό durante 15 minutos, resfriada e filtrada para obter um filtrado. O filtrado foi de uma maneira usual purificado por descoloração empregando um carvão vegetal ativado e dessalinização empregando cambiadores de ion, e concentrado em cerca de 70 % peso/peso de xarope com respeito aos conteúdos sólidos em uma produção de cerca de 92% para o material, d.s.b.

[00234] O produto, compreendendo 35,2% de trealose, 3,4% de a-glucosiltrealose, 1,8% de glicose, 37,2% de maltose, 9,1% de maltotri-ose, e 13,3% de oligossacarídeos maiores do que maltotetraose, tem uma doçura de qualidade suave e elevada, redutibilidade e viscosidade relativamente inferior, e capacidade de reter umidade adequada; pode ser arbitraríamente empregado como adoçante, agente para melhorar o sabor, agente para melhorar a qualidade, estabilizador, enche-dor, auxiliar ou excipiente em composições em geral tais como alimentos, cosméticos, e farmacêuticos. EXEMPLO 8-8 Processo para produção de pó cristalino contendo trealose cristalina anidra [00235] Uma parte em peso de "EX-I", uma amilose comercializada pela Hayashibara Biochemical Laboratories Ina, Okayama, Japão, foi dissolvida em 15 partes por peso em água aquecendo-se, e a solução foi aquecida a 53Ό e ajustada a pH 5,7. À solução resultante foram adicionadas duas unidades/g de amilose, d.s.b., de uma enzima de formação de sacarídeo não redutor, obtida no Exemplo 4-3, e suas unidades/g de amilose, d.s.b., de uma enzima de liberação de trealose, obtida pelo método do Exemplo 7-4, seguido por uma incubação durante 48 horas. A mistura de reação foi aquecida a 97Ό durante 30 minutos para inativar a enzima remanescente, e então ajustada em pH 5,0, misturada com 10 unidades/g de amilose, d.s.b., de "GLU-COZYME", um espécime de glucoamílase comercializado pela Bio-chemicals Nagase, Ltd., Kyoto, e enzimaticamente reagida durante 48 horas. A mistura de reação dessa maneira obtida foi aquecida a 95*0 durante 10 minutos para inativar as enzimas restantes, resfriadas, filtradas, purificadas por descoloração empregando um carvão vegetal ativado e dessalinização empregando cambiadores de íon, e concentrada em cerca de 60 % peso/peso de solução com respeito a conteú- dos sólidos ou um xarope contendo 82,1 % peso/peso de trealose, d.s.b.

[00236] Similarmente como no Exemplo 8-3, o xarope foi submetido à cromatografia de coluna, seguido por coletagem de uma fração contendo cerca de 98 % peso/peso de trealose, d.s.b. A fração foi concentrada em vácuo sob condições de aquecimento em cerca de 85 % peso/peso de xarope com respeito a conteúdos sólidos. O xarope foi misturado com trealose cristalina hidratada como um cristal arenoso em cerca de 2 peso/volume % do xarope, agitado a 120 °C durante cinco minutos, distribuída em tonéis de plástico, e seco a 100*0 em vácuo para cristalizar o sacarídeo. A seguir, os conteúdos em uma forma de bloco foram destacados dos tonéis e cortados com um cortador para obter um produto sólido, contendo trealose cristalina anidra com uma cristalinidade de cerca de 70% e tendo um conteúdo de umidade de cerca de 0,3 % peso/peso em uma produção de cerca de 70% para a amilose de material, d.s.b. O produto sólido foi pulverizado de uma maneira usual em um pó cristalino contendo trealose cristalina anidra.

[00237] Uma vez que a trealose cristalina anidra absorve umidade de matérias hidratadas e muda em trealose cristalina hidratada, o produto rico em trealose cristalina anidra pode ser arbitrariamente empregado como um dessecante seguro não prejudicial ao desidratado ou composições secas incluindo produtos alimentares, cosméticos e farmacêuticos, bem como materiais e intermediários deles. O produto com uma doçura de qualidade suave e elevada pode ser arbitrariamente empregado como adoçante, agente para melhorar o sabor, agente para melhorar a qualidade, estabilizador, enchedor, auxiliar ou excipi-ente em composições em geral tais como alimentos, cosméticos, e farmacêuticos.

[00238] Como acima descrito, a presente invenção foi feita com base na verificação de uma nova enzima de formação de sacarídeo não redutor e uma nova enzima de liberação de trealose, que tem uma temperatura ideal em uma faixa de temperatura média e preferivelmente tem um pH ideal em uma faixa de pH ácido. Estas enzimas de acordo com a presente invenção podem ser obtidas em uma quantidade desejada, por exemplo, cultivando-se micro-organismos capazes de produzir as enzimas. Os presentes DNAs que codificam qualquer das enzimas são bastante úteis na produção de tais enzimas como proteínas recombinantes. Em casos de empregar transformante introduzido com os DNAs, as enzimas de acordo com a presente invenção podem ser produzidas em uma quantidade desejada. As presentes enzimas podem ser empregadas na produção de sacarídeos não redutores tendo uma estrutura de trealose, que inclui trealose, em uma faixa de temperatura média e/ou uma faixa de pH ácido. Particularmente, quando empregadas as presentes enzimas em combinação com outras enzimas relacionadas com sacarídeos tendo uma temperatura ideal em uma faixa de temperatura média e/ou um pH ideal em uma faixa de pH ácido, os sacarídeos desejados podem ser produzidos bastante eficientemente. As enzimas de acordo com a presente invenção são enzimas com sequências de aminoácidos reveladas; elas podem ser seguramente empregadas para produzir sacarídeos não redutores para serem empregados em produtos alimentares e farmacêuticos. Os sacarídeos não redutores e sacarídeos redutíveis, que contêm o mesmo e têm uma menor redutibilidade, produzidos pela presente invenção têm uma doçura de qualidade suave e elevada, e mais preferivelmente têm uma redutibilidade insubstancial ou uma redutibilidade reduzida por uma larga margem. Portanto, os sacarídeos podem ser arbitrariamente empregados em composições em geral tais como alimentos, cosméticos, e farmacêuticos com menor temor de coloração e deterioração.

[00239] A presente invenção com estas propriedades e características vantajosas insondáveis é uma invenção útil que contribuiría enor- memente para esta técnica.

[00240] Ao mesmo tempo que foi descrito o que está presentemente considerado serem as modalidades preferidas da invenção, entendeu-se que várias modificações podem ser feitas aqui, e pretende-se abranger nas reivindicações anexas todas as tais modificações quando caem dentro do real espírito e escopo da invenção.

Claims

1. Processo para produção de um sacarídeo não redutor, caracterizado pelo fato de que compreende as etapas de: (a) submeter um hidrolisado parcial de amido redutor à ação de uma enzima de formação de sacarídeo não redutor purificada de SEQ ID NO: 1 e uma enzima de liberação de trealose purificada de SEQ ID NO: 9 a uma temperatura controlada artificialmente de 500 ou superior mas abaixo de 600, para formar um saca rídeo não redutor; (b) dessalinizar o sacarídeo não redutor formado na etapa (а) em uma cromatografia de coluna de troca de íon; e (c) coletar o sacarídeo não redutor resultante ou uma composição de sacarídeo compreendendo o referido sacarídeo não redutor; em que a referida enzima de formação de sacarídeo não redutor purificada tem as seguintes propriedades físico-químicas: (1) Ação Formar um sacarídeo não redutor tendo uma estrutura de trealose como uma unidade terminal de um hidrolisado parcial de amido redutor tendo um grau de polimerização de glicose de 3 ou mais; (2) Peso Molecular 75.000 ± 10.000 dáltons em eletroforese em gel de poliacri-lamida-dodecil sulfato de sódio (SDS-PAGE); (3) Ponto Isoelétrico (pl) 4,5 ± 0,5 em isoeletroforese empregando anfólito; (4) Temperatura Ideal 50*0 quando incubada em pH 6,0 por 60 min; (5) pH Ideal 6.0 quando incubada a 50*0 por 60 min; (б) Estabilidade térmica Estável até uma temperatura de 55*0 quando incubad a em pH 7,0 por 60 min; e (7) Estabilidade em pH Estável em pHs de 5,0 a 10,0 quando incubada a 40 por 24 horas; e em que a referida enzima de liberação de trealose purificada tem as seguintes propriedades físico-químicas: (1) Ação Especificamente hidrolisa um sacarídeo não redutor tendo uma estrutura de trealose como uma unidade terminal em um sítio entre uma parte da estrutura de trealose e uma parte das restantes; (2) Peso Molecular 62.000 + 5.000 dáltons em eletroforese em gel de poliacri-lamida-dodecil sulfato de sódio (SDS-PAGE); (3) Ponto Isoelétrico (pl) 4,7 + 0,5 em isoeletroforese empregando anfólito; (4) Temperatura Ideal 50*C a 55*0 quando incubada em pH 6,0 por 30 min; (5) pH Ideal 6.0 quando incubada em 50*C por 30 min; (6) Estabilidade térmica Estável até uma temperatura de 50Ό quando incubad a em pH 7,0 por 60 min; e (7) Estabilidade de pH Estável em pHs de 4,5 a 10,0 quando incubada a 4*C por 24 horas; e em que o referido sacarídeo não redutor é um ou mais membros selecionados do grupo consistindo em trealose, a-glucosiltrealose, α-maltosiltrealose, a-maltotriosiltrealose, α-maltotetraosiltrealose, e a-maltopentaosiltrealose.

2. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a referida enzima de formação de sacarídeo não re-dutor e a referida enzima de liberação de trealose são obtidas de um micro-organismo do gênero Arthrobacter.

3. Processo de acordo com a reivindicação 2, caracterizado pelo fato de que o referido micro-organismo do gênero Arthrobacter é Arthrobacter sp. S34, FERM BP-6450.

4. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que o referido hidrolisado parcial de amido redutor é um tendo um grau de polimerização de glicose de 3 ou mais e sendo obtenível submetendo-se o amido ou substância amilácea à ação de um ácido e/ou uma hidrolase de amido.

5. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que uma ou mais enzimas selecionadas do grupo consistindo em a-amilase, β-amilase, glucoamilase, enzima desramificadora de amido, glucanotransferase de ciclomaltodextrina, e a-glucosidase são ainda permitidas a atuarem no hidrolisado parcial de amido redutor na etapa (a).

6. Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que a referida trealose está na forma de um cristal hidratado ou anidro.