ES2318884T3

ES2318884T3 - Enzima formadora de sacrido no reductor, enzima liberadora de trehalosa y proceso para producir sacridos usando las enzimas.

Info

Publication number: ES2318884T3
Application number: ES99307220T
Authority: ES
Inventors: Takuo Yamamoto; Kazuhiko Maruta; Michio Kubota; Shigeharu Fukuda; Toshio Miyake
Original assignee: Hayashibara Seibutsu Kagaku Kenkyujo KK; Hayashibara Biochemical Laboratories Co Ltd
Current assignee: Hayashibara Seibutsu Kagaku Kenkyujo KK
Priority date: 1998-09-11
Filing date: 1999-09-13
Publication date: 2009-05-01
Anticipated expiration: 2019-09-13
Also published as: US7575900B2; EP0990704A3; KR100729498B1; ATE417110T1; JP2000228980A; KR20000023095A; BRPI9904104B1; US7582463B2; DE69940045D1; EP0990704B1; BR9904104A; DK0990704T3; US20070281346A1; CN1180081C; JP3958884B2; EP0990704A2; US20070218529A1; CN1271203C; US7186535B1; CN1252442A

Abstract

Una enzima de formación de sacáridos no reductores y una enzima de liberación de trehalosa, que tienen una temperatura óptima en una gama de temperatura media, es decir, una temperatura de aproximadamente 40 o 45ºC pero inferior a 60ºC, y un pH óptimo en una gama de pH ácido, es decir un pH inferior a 7. Los dos tipos de enzimas pueden obtenerse en una cantidad deseada, por ejemplo, cultivando en un medio de cultivo de nutriente microorganismos capaces de producir las enzimas o por tecnología de ADN recombinante.

Description

Enzima formadora de sacárido no reductor, enzima liberadora de trehalosa y proceso para producir sacáridos usando las enzimas.

La presente invención se refiere a una enzima formadora de sacárido no reductor y a una enzima liberadora de trehalosa.

El documento EP-A-0674005 describe ADN que codifica una enzima, que forma sacáridos no reductores que tienen una estructura de trehalosa como una unidad terminal.

El documento EP-A-0671740 describe un ADN que codifica una enzima que libera trehalosa de sacáridos no reductores.

La trehalosa es un disacárido que consiste en dos moles de glucosa unidos por sus restos reductores y se encuentra ampliamente en la naturaleza, por ejemplo, en microorganismos, hongos, algas, insectos, crustáceos, etc. Ya que el sacárido se ha conocido desde hace tiempo como un sacárido útil sustancialmente libre de capacidad de reducción y que tiene una acción de retención de humedad satisfactoria, se ha considerado el uso en amplios campos incluyendo alimentos, cosméticos y farmacéuticos. Sin embargo, no se ha establecido producción eficaz del sacárido y esto limita el uso de trehalosa a pesar de su destacada expectación. Por tanto, se espera en gran medida el suministro de trehalosa con un coste menor.

Como un propósito para tal expectación, los presentes inventores ya han establecido un proceso para producir enzimáticamente trehalosa a partir de material de almidones mediante sus estudios energéticos. El proceso se caracteriza por una etapa de someter hidrolizados de almidón parciales reductores a la acción de un enzima formadora de sacárido no reductor, que forma un sacárido no reductor que tiene una estructura de trehalosa como una unidad terminal a partir de hidrolizados de almidón parciales reductores y a la acción de una enzima liberadora de trehalosa que actúa sobre un sacárido no reductor que tiene una estructura de trehalosa como una unidad terminal para hidrolizar el sitio entre una parte de la estructura de trehalosa y una parte del resto. Estas enzimas y los procesos de las mismas se describen en las Patentes Japonesas Kokai Nº 143.876/95, 213.283/95, 322.883/95, 298,880/95, 66.187/96, 66.188/96, 73.504/96, 84.586/96 y 336.388/96, solicitadas por el mismo solicitante que la presente invención. Por tanto, se consiguió una producción de bajo coste de trehalosa.

Durante los estudios, se observó un hallazgo original de que la enzima formadora de sacárido no reductor se puede aplicar para una producción novedosa de sacáridos no reductores que pueda superar las desventajas convencionales que se basan en hidrolizados de almidón parciales reductores. Como un problema, los hidrolizados de almidón parciales reductores tales como dextrinas y maltooligosacáridos tienen las propiedades ventajosas de que se pueden usar como edulcorantes y fuentes de sacáridos de suplemento energético, pero como un desmérito, son altamente reactivos con sustancias debido a su capacidad de reducción y son susceptibles a reacción de pardeamiento cuando coexisten con aminoácidos y/o proteínas y a deteriorar rápidamente su calidad. Para superar un problema de este tipo, solamente se conoce un método para convertir hidrolizados de almidón parciales reductores en alcoholes de azúcar usando un método de hidrogenación a alta presión, etc. Sin embargo, con el uso real, el método necesita mucho calor e instrumentos construidos teniendo en consideración la seguridad en vista del uso de hidrógeno, dando como resultado un mayor coste y mucha complejidad de trabajo. Por el contrario, la enzima formadora de sacárido no reductor que se ha mencionado anteriormente, como se ha mencionado previamente, actúa sobre hidrolizados de almidón parciales reductores y forma un sacárido no reductor que tiene una estructura de trehalosa como una unidad terminal, y la reacción avanza en un estado relativamente moderado debido a su reacción enzimática. Usando la acción de la enzima, los presentes inventores han establecido un proceso eficaz novedoso para sacáridos no reductores usando la enzima, que puede superar las desventajas convencionales de hidrolizados de almidón parciales reductores. Debido a estas observaciones, el desarrollo de usos aplicables para trehalosa y sacáridos no reductores se ha favorecido en diversos campos, y esto diversifica los usos de estos sacáridos y, ahora, aumenta marcadamente las demandas de los sacáridos en una amplia diversidad de campos.

En estas circunstancias se ha esperado en esta técnica un proceso más eficaz para producir trehalosa y sacáridos no reductores que tengan una estructura de trehalosa. Una clave para una expectación de este tipo es establecer una enzima formadora de sacárido no reductor y una enzima liberadora de trehalosa con diversas condiciones óptimas y proporcionar una amplia diversidad de fuentes para tales enzimas útiles en la producción de los sacáridos. Por tanto, una enzima óptima se puede seleccionar de diversos tipos de enzimas dependiendo de las condiciones óptimas de otras enzimas útiles en combinación con las anteriores enzimas para producir los sacáridos deseados, así como en instalaciones y usos finales de los sacáridos producidos, dando como resultado una producción eficaz de los sacáridos. Las enzimas formadoras de sacárido no reductor conocidas convencionalmente se pueden agrupar en las que tienen temperaturas óptimas de temperaturas relativamente menores de aproximadamente 40ºC o menos y las que tienen temperaturas óptimas de temperaturas relativamente superiores de aproximadamente 60ºC o más. Por otro lado, las enzimas liberadoras de trehalosa conocidas convencionalmente se pueden agrupar en las que tienen temperaturas óptimas en un intervalo de temperaturas relativamente menor, aproximadamente 45ºC o menos, y las que tienen temperaturas óptimas en un intervalo de temperaturas relativamente superior, aproximadamente 60ºC o más. Sin embargo, cualquier enzima formadora de sacárido no reductor y una enzima liberadora de trehalosa que tenga una temperatura óptima en un intervalo de temperaturas medio, aproximadamente 50ºC, hasta ahora no se ha descrito.

Entre las enzimas relacionadas con sacáridos usadas en la producción de sacáridos a partir de materiales de almidón, las enzimas como un grupo principal tienen una temperatura óptima en un intervalo de temperaturas medio. Tales enzimas pueden requerirse en el proceso para producir la trehalosa y los sacáridos no reductores que se han mencionado anteriormente; la enzima formadora de sacárido no reductor y la enzima liberadora de trehalosa, que tienen una temperatura óptima en un intervalo de temperaturas medio, hasta ahora no se han establecido, de tal forma que hasta ahora no se ha realizado ningún proceso para producir sacáridos con un rendimiento suficiente usando cualquiera o ambas de estas enzimas junto con las enzimas relacionadas con sacáridos anteriores. Dependiendo de las instalaciones para producir sacáridos y los usos finales de los mismos, se han requerido enzimas que tienen una temperatura óptima en un intervalo de temperaturas medio en sus reacciones enzimáticas. Es demasiado decir que se ha establecido un proceso para producir sacáridos con un rendimiento satisfactoriamente alto usando una enzima formadora de sacárido no reductor y una enzima liberadora de trehalosa. Como se ha descrito anteriormente, el establecimiento de una enzima formadora de sacárido no reductor y una enzima liberadora de trehalosa que tienen una temperatura óptima en un intervalo de temperaturas medio y un proceso para producir sacáridos que comprenden sacáridos no reductores tiene una gran demanda.

En vista de esto, un objetivo de la presente invención es proporcionar una enzima formadora de sacárido no reductor que tenga una temperatura óptima en un intervalo de temperaturas medio.

Un segundo objetivo de la presente invención es proporcionar un ADN que codifique la enzima formadora de sacárido no reductor.

Un tercer objetivo de la presente descripción es proporcionar un proceso para producir la enzima formadora de sacárido no reductor.

Un cuarto objetivo de la presente invención es proporcionar una enzima liberadora de trehalosa que tenga una temperatura óptima en un intervalo de temperaturas medio.

Un quinto objetivo de la presente invención es proporcionar un ADN que codifique la enzima liberadora de trehalosa.

Un sexto objetivo de la presente descripción es proporcionar un proceso para producir la enzima liberadora de trehalosa.

Un séptimo objetivo de la presente descripción es proporcionar un microorganismo capaz de producir la enzima formadora de sacárido no reductor y/o la enzima liberadora de trehalosa.

Un octavo objetivo de la presente descripción es proporcionar un proceso para producir sacáridos que comprendan sacáridos no reductores, que use la enzima formadora de sacárido no reductor y/o la enzima liberadora de trehalosa.

Para abordar los anteriores objetivos, los presentes inventores han explorado de forma extensa microorganismos en tierras. Como resultado se ha aislado un microorganismo en una tierra en Ako-shi, Hyogo, Japón. Los presentes inventores han aislado de forma separada la enzima formadora de sacárido no reductor deseada y la enzima liberadora de trehalosa a partir del microorganismo y han identificado sus propiedades, descubriendo que ambas enzimas tienen una temperatura óptima en un intervalo de temperaturas medio. La identificación del microorganismo confirmó que era un microorganismo novedoso del género Arthrobacter y se denominó Arthrobacter sp. S34. El microorganismo se depositó el 6 de agosto de 1998 en el Instituto Nacional de Biociencia y Tecnología Humana, Higashi 1-1-3, Tsukuba-shi, Ibaraki, Japón y se aceptó que se mantuviera por el instituto con el número de acceso de FERM BP-6450.

Los presentes inventores continuaron estudiando ADN aislados que codifican las enzimas que se han identificado anteriormente del microorganismo, Arthrobacter sp. S34, FERM BP-6450, descodificaron las secuencias de nucleótidos y determinaron las secuencias de aminoácidos de las enzimas. Los inventores confirmaron que Arthrobacter sp. S34, FERM BP-6450, y los transformantes, en los que los ADN obtenidos en los anteriores se habían introducido de un modo habitual, produjeron cantidades deseadas de enzimas. También se confirmó que las enzimas obtenidas de este modo se pueden usar ventajosamente para producir sacáridos que comprenden trehalosa y sacáridos no reductores que tienen una estructura de trehalosa en un intervalo de temperaturas medio. La presente invención se realizó basándose en estas observaciones.

La presente invención proporciona una enzima formadora de sacárido no reductor purificada, que forma un sacárido no reductor que tiene una estructura de trehalosa como una unidad terminal a partir de un hidrolizado de almidón parcial reductor, que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 1 o una que tiene al menos el 80% de homología con la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 1, seleccionándose la secuencia de aminoácidos de tal forma que la enzima tiene una temperatura óptima de 45ºC o más pero inferior a 60ºC cuando se ensaya en la condición de tampón fosfato 20 mM a pH 6,0.

La presente invención también proporciona ADN aislado que tiene la secuencia de nucleótidos de la SEC ID Nº: 7, un mutante del mismo en el que una o más bases de la SEC ID Nº: 7 se sustituyen por otras bases en base a la degeneración del código genético sin alterar la secuencia de aminoácidos codificada por la secuencia de nucleótidos de la SEC ID Nº: 7 o una secuencia de nucleótidos complementaria a la misma.

La presente invención también proporciona una enzima formadora de sacárido no reductor purificada, que se puede obtener mediante la expresión del ADN descrito en el anterior párrafo.

La presente invención también proporciona enzima liberadora de trehalosa purificada, que hidroliza específicamente un sacárido no reductor que tiene una estructura de trehalosa como una unidad terminal en un sitio entre una parte de la estructura de trehalosa y una parte del resto, que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 9 o que tiene al menos el 80% de homología con la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 9, seleccionándose la secuencia de aminoácidos de tal forma que la enzima tiene una temperatura óptima de 50ºC o más pero inferior a 60ºC cuando se ensaya en la condición de tampón fosfato 20 mM a pH 6,0.

La presente invención también proporciona un ADN aislado que tiene la secuencia de nucleótidos de la SEC ID Nº: 17, un mutante del mismo en el que una o más bases se sustituyen por bases en base a la degeneración del código genético sin alterar la secuencia de aminoácidos codificada por la secuencia de nucleótidos de la SEC ID Nº: 17 o una secuencia de nucleótidos complementaria a la misma.

La presente invención también proporciona enzima liberadora de trehalosa purificada, que se puede obtener mediante la expresión del anterior ADN.

Además, la presente descripción proporciona un proceso para producir la enzima formadora de sacárido no reductor, caracterizado por que comprende las etapas de cultivar un microorganismo capaz de producir la enzima y recoger la enzima producida del cultivo y un proceso para producir la enzima liberadora de trehalosa, caracterizado por que comprende las etapas de cultivar un microorganismo capaz de producir la enzima y recoger la enzima producida del cultivo.

La presente descripción también proporciona un proceso para producir sacáridos, que comprende las etapas de dejar que cualquiera o ambas de las anteriores enzimas actúe sobre hidrolizados de almidón parciales reductores para producir sacáridos no reductores y recoger los sacáridos no reductores o composiciones de sacáridos que tienen una capacidad de reducción relativamente baja y que contienen los sacáridos no reductores.

La invención se describirá a continuación con más detalle solamente a modo de ejemplo, con referencia a los siguientes Ejemplos y dibujos adjuntos, en los que:

La Figura 1 es una figura que muestra la influencia de la temperatura sobre la actividad de una enzima formadora de sacárido no reductor de Arthrobacter sp. S34, FERM BP-6450, de acuerdo con la presente invención;

La Figura 2 es una figura que muestra la influencia del pH sobre la actividad de una enzima formadora de sacárido no reductor de Arthrobacter sp. S34, FERM BP-6450, de acuerdo con la presente invención;

La Figura 3 es una figura que muestra la influencia de la temperatura sobre la estabilidad de una enzima formadora de sacárido no reductor de Arthrobacter sp. S34, FERM BP-6450, de acuerdo con la presente invención;

La Figura 4 es una figura que muestra la influencia del pH sobre la estabilidad de una enzima formadora de sacárido no reductor de Arthrobacter sp. S34, FERM BP-6450, de acuerdo con la presente invención;

La Figura 5 es un mapa de restricción del ADN recombinante pGY1 de acuerdo con la presente invención. La línea en negrita muestra la secuencia de nucleótidos de Arthrobacter sp. S34, FERM BP-6450. La flecha negra dentro de la línea en negrita muestra una secuencia de nucleótidos que codifica la presente enzima formadora de sacárido no reductor, mientras que la flecha oblicua muestra una secuencia de nucleótidos que codifica la presente enzima liberadora de trehalosa;

La Figura 6 es un mapa de restricción del ADN recombinante pGY2 de acuerdo con la presente invención. La línea en negrita muestra la secuencia de nucleótidos de Arthrobacter sp. S34, FERM BP-6450. La flecha negra dentro de la línea en negrita muestra una secuencia de nucleótidos que codifica la presente enzima formadora de sacárido no reductor;

La Figura 7 es un mapa de restricción del ADN recombinante pGY3 de acuerdo con la presente invención. La flecha negra muestra la secuencia de nucleótidos, que codifica la presente enzima formadora de sacárido no reductor, de Arthrobacter sp. S34, FERM BP-6450;

La Figura 8 es una figura que muestra la influencia de la temperatura sobre la actividad de una enzima liberadora de trehalosa de Arthrobacter sp. S34, FERM BP-6450, de acuerdo con la presente invención;

La Figura 9 es una figura que muestra la influencia del pH sobre la actividad de una enzima liberadora de trehalosa de Arthrobacter sp. S34, FERM BP-6450, de acuerdo con la presente invención;

La Figura 10 es una figura que muestra la influencia de la temperatura sobre la estabilidad de una enzima liberadora de trehalosa de Arthrobacter sp. S34, FERM BP-6450, de acuerdo con la presente invención;

La Figura 11 es una figura que muestra la influencia del pH sobre la estabilidad de una enzima liberadora de trehalosa de Arthrobacter sp. S34, FERM BP-6450, de acuerdo con la presente invención;

La Figura 12 es un mapa de restricción del ADN recombinante pGZ2 de acuerdo con la presente invención. La línea en negrita muestra la secuencia de nucleótidos de Arthrobacter sp. S34, FERM BP-6450. La flecha oblicua dentro de la línea en negrita muestra una secuencia de nucleótidos que codifica la presente enzima liberadora de trehalosa; y

La Figura 13 es un mapa de restricción del ADN recombinante pGZ3 de acuerdo con la presente invención. La flecha oblicua muestra la secuencia de nucleótidos de Arthrobacter sp. S34, FERM BP-6450.

La presente invención se refiere a una enzima formadora de sacárido no reductor y una enzima liberadora de trehalosa. La presente descripción también proporciona un proceso para producir un sacárido usando cualquiera o ambas de las enzimas. La expresión "enzima formadora de sacárido no reductor" como se denomina en la presente invención representa una enzima que tiene una acción de formación de un sacárido no reductor que tiene una estructura de trehalosa como una unidad terminal a partir de hidrolizados de almidón parciales reductores. La expresión "enzima liberadora de trehalosa" como se denomina en la presente invención representa una enzima que hidroliza específicamente un sacárido no reductor que tiene una estructura de trehalosa como una unidad terminal y un grado de polimerización de glucosa de al menos 3 en un sitio entre la parte de trehalosa y la parte restante. La expresión "un intervalo de temperaturas medio" como se denomina en la presente descripción representa un intervalo de temperaturas central en temperaturas de reacción que se usan convencionalmente para producir sacáridos a partir de materiales de almidón mediante una reacción enzimática. En la mayoría de los casos de tales procesos se usan diferentes temperaturas de reacción de aproximadamente 10ºC a aproximadamente 100ºC y alrededor de las temperaturas. La enzima formadora de sacárido no reductor de acuerdo con la presente invención tiene una acción como una enzima de este tipo y tiene una temperatura óptima de 45ºC o más pero inferior a 60ºC cuando se ensaya en la condición de tampón fosfato 20 mM a pH 6,0. La enzima formadora de sacárido no reductor de acuerdo con la presente descripción tiene una acción como una enzima de este tipo y tiene una temperatura óptima en un intervalo de temperaturas medio, preferiblemente un intervalo de temperaturas superior a 40ºC pero inferior a 60ºC, y más preferiblemente tiene un pH óptimo en un intervalo de pH ácido además de la temperatura óptima. La enzima liberadora de trehalosa de acuerdo con la presente invención tiene una acción como una enzima de este tipo y tiene una temperatura óptima de 50ºC o superior pero inferior a 60ºC cuando se ensaya en la condición de tampón fosfato 20 mM a pH 6,0. La enzima liberadora de trehalosa de acuerdo con la presente descripción tiene una acción como una enzima de este tipo y tiene una temperatura óptima en un intervalo de temperaturas medio, preferiblemente un intervalo de temperaturas superior a 45ºC pero inferior a 60ºC, y más preferiblemente tiene un pH óptimo en un intervalo de pH ácido además de la temperatura óptima. Estas presentes enzimas no se deben limitar a sus orígenes y fuentes.

La actividad de la presente enzima formadora de sacárido no reductor se ensaya del siguiente modo: se añade un ml de una solución de enzima a cuatro ml de maltopentaosa al 1,25% p/v como un sustrato en tampón fosfato 20 mM (pH 6,0), y la solución de mezcla se incuba a 50ºC durante 60 min. La mezcla de reacción se calienta a 100ºC durante 10 min para suspender la reacción enzimática, y la mezcla de reacción se diluye de forma precisa 10 veces con agua desionizada, seguido de determinación del poder reductor de la solución diluida por el método de Somogyi-Nelson. Como un control, una solución de enzima, que se ha calentado a 100ºC durante 10 min para inactivar la enzima, se trata de forma similar a lo indicado anteriormente. Una actividad unitaria de la presente enzima se define como la cantidad de enzima que elimina el poder reductor de ese un \mumol de maltopentaosa por minuto cuando se determina con el ensayo que se ha mencionado anteriormente. La temperatura óptima de la enzima como se denomina en la presente invención se determina de acuerdo con el ensayo; se ensaya ajustando la temperatura de reacción enzimática a diferentes temperaturas incluyendo 50ºC, dejando que una cantidad pre-establecida de la enzima actúe sobre el sustrato a las diferentes temperaturas de acuerdo con el ensayo y determinando el nivel de reducción de poder reductor a las temperaturas de acuerdo con el ensayo, seguido de comparación de los niveles de reducción determinados entre sí y determinando la temperatura óptima de la presente enzima que mostró una temperatura máxima.

La actividad de la presente enzima liberadora de trehalosa se ensaya del siguiente modo: un ml de una solución de enzima se añade a cuatro ml de maltotriosiltrehalosa al 1,25% p/v, es decir, \alpha-maltotetraosil-\alpha-D-glucósido, como un sustrato, en tampón fosfato 20 mM (pH 6,0) y la solución de mezcla se incuba a 50ºC durante 30 min, seguido de suspensión de la reacción enzimática mediante la adición de la solución de cobre de Somogyi y ensayando el poder reductor mediante el método de Somogyi-Nelson. Como un control, se ensaya de forma similar usando una solución de enzima que se había inactivado calentando a 100ºC durante 10 min. Una actividad unitaria de la presente enzima se define como la cantidad de enzima que aumenta el poder reductor de un \mumol de glucosa por minuto cuando se determina con el ensayo que se ha mencionado anteriormente. La temperatura óptima de la enzima como se indica en la presente invención se determina de acuerdo con el ensayo; se ensaya ajustando la temperatura de reacción enzimática a las diferentes temperaturas incluyendo 50ºC, dejando que una cantidad pre-establecida de la enzima actúe sobre el sustrato a las temperaturas de acuerdo con el ensayo y determinando el nivel aumentado de poder reductor a las diferentes temperaturas de acuerdo con el ensayo, seguido de comparación de los niveles aumentados determinados entre sí y determinando la temperatura óptima de la presente enzima que mostró una temperatura
máxima.

Para explicar la presente enzima formadora de sacárido no reductor en base a la secuencia de aminoácidos, la enzima tiene la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 1 en su totalidad y tiene las secuencias de aminoácidos de las SEC ID Nº: 2 a 6 como secuencias de aminoácidos parciales en algunos casos. Además de estas enzimas que tienen la totalidad de las secuencias de aminoácidos que se han identificado anteriormente, la presente invención incluye otros tipos de enzimas que comprenden una parte de una cualquiera de las secuencias de aminoácidos seleccionadas de las mismas o que tienen tanto la acción como la presente enzima formadora de sacárido no reductor como la temperatura óptima que se ha identificado anteriormente. Los ejemplos de las secuencias de aminoácidos de tales enzimas son las que contienen, dentro de las secuencias de aminoácidos, una secuencia de aminoácidos parcial o un resto aminoacídico que está relacionado con la expresión de las propiedades de la presente enzima formadora de sacárido no reductor y donde uno o más aminoácidos se sustituyen por aminoácidos diferentes, añadidos y/o delecionados de las mismas diferentes de la secuencia de aminoácidos parcial anterior o el resto aminoacídico. Los ejemplos de las secuencias de aminoácidos sustituidas con diferentes aminoácidos como se indican en la presente descripción incluyen los que tienen menos del 30% y preferiblemente menos del 20% de las secuencias de aminoácidos que componen la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 1 que se sustituyen por otros aminoácidos que tienen propiedades similares y estructuras a los respectivos que se tienen que sustituir. Los ejemplos de grupos de tales aminoácidos son un grupo de ácido aspártico y ácido glutámico como aminoácidos ácidos, uno de lisina, arginina e histidina como aminoácidos básicos, uno de asparagina y glutamina como aminoácidos de tipo amida, uno de serina y treonina como hidroxiaminoácidos y uno de valina, leucina e isoleucina como aminoácidos de cadena ramificada. Los ejemplos de otras secuencias de aminoácidos de la presente enzima que contiene una parte de una cualquiera de las secuencias de aminoácidos seleccionadas de las SEC ID Nº: 1 a 6 son los que pueden tener una estéreo-estructura sustancialmente similar a la de la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 1, es decir, sustitución, deleción y/o adición del aminoácido o aminoácidos se introducen en la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 1. La estéreo-estructura de proteínas se puede estimar explorando bases de datos disponibles en el mercado para estéreo-estructuras de proteínas que tengan secuencias de aminoácidos relacionadas con la pretendidas y que tengan estéreo-estructuras descritas, haciendo referencia a las estéreos-estructuras exploradas y usando software disponibles en el mercado para visualizar estéreo-estructuras. La secuencia de aminoácidos que se ha identificado anteriormente de la presente enzima formadora de sacárido no reductor tiene una homología de al menos el 57%, preferiblemente al menos el 70% y más preferiblemente al menos el 80% con la SEC ID Nº: 1. En particular, la secuencia de aminoácidos que se ha identificado anteriormente de la presente enzima formadora de sacárido no reductor de acuerdo con la presente invención tiene al menos el 80% de homología con la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 1.

Como se ha descrito anteriormente, la enzima formadora de sacárido no reductor no se debe restringir a un origen/fuente específico. Los ejemplos de tales son las obtenidas de microorganismos, es decir, los del género Arthrobacter, Arthrobacter sp. S34, FERM BP-6450, y sus mutantes. Los mutantes se pueden obtener tratando un modo habitual Arthrobacter sp. S34, FERM BP-6450, con mutágenos conocidos tales como N-metil-N'-nitro-N-nitrosoguanidina, metanosulfatonato de etilo, ultravioleta y transposón; seleccionando los mutantes deseados capaces de producir una enzima formadora de sacárido no reductor y que tenga una temperatura óptima a temperaturas en un intervalo de temperaturas medio y habitualmente a temperaturas en el intervalo de más de 40ºC pero inferior a 60ºC. La enzima de Arthrobacter sp. S34, FERM BP-6450, tiene habitualmente las secuencias de aminoácidos de las SEC ID Nº: 1 a 6. Otras enzimas formadoras de sacárido no reductor de microorganismos de Arthrobacter sp. S34, FERM BP-6450 mutantes y otros microorganismos comprenden la totalidad o una parte de una cualquiera de las secuencias de aminoácidos de las SEC ID Nº: 1 a 6. Los ejemplos concretos de otras enzimas incluyen enzimas recombinantes que actúan como la presente enzima formadora de sacárido no reductor y tienen una temperatura óptima a temperaturas en un intervalo de temperaturas medio y habitualmente a temperaturas de más de 40ºC pero inferior a 60ºC. Las enzimas recombinantes se pueden obtener aplicando la tecnología de ADN recombinante para el ADN que codifica la presente enzima formadora de sacárido no reductor y tienen la totalidad o una parte de una cualquiera de las secuencias de aminoácidos de las SEC ID Nº: 1 a 6.

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La mayoría de las enzimas formadoras de sacárido no reductor de acuerdo con la presente invención tienen las siguientes propiedades fisicoquímicas:

(1): Acción

: Formación de un sacárido no reductor que tiene una estructura de trehalosa como una unidad terminal a partir de un hidrolizado de almidón parcial reductor que tiene un grado de polimerización de glucosa de 3 o superior;

(2): Peso molecular

: Aproximadamente 75.000 \pm 10.000 daltons en un gel de dodecil sulfato sódico-poliacrilamida para electroforesis (SDS-PAGE);

(3): Punto isoeléctrico (pI)

: Aproximadamente 4,5 \pm 0,5 en isoelectroforesis usando anfolito;

(4): Temperatura óptima

: Aproximadamente 50ºC cuando se incuba a pH 6,0 durante 60 min;

(5): pH óptimo

: Aproximadamente 6,0 cuando se incuba a 50ºC durante 60 min;

(6): Estabilidad térmica

: Estable hasta una temperatura de aproximadamente 55ºC cuando se incuba a pH 7,0 durante 60 min; y

(7): Estabilidad a pH

: Estable a pH de aproximadamente 5,0 a aproximadamente 10,0 cuando se incuba a 4ºC durante 24 horas.

La presente enzima formadora de sacárido no reductor se puede obtener en una cantidad pre-establecida mediante el último presente proceso descrito para producir la misma.

La presente invención proporciona un ADN que codifica la presente enzima formadora de sacárido no reductor. Una ADN de este tipo muy útil para producir la enzima en forma de una proteína recombinante. En general, el ADN incluye los que codifican la enzima independientemente de su origen/fuente. Los ejemplos de un ADN de este tipo son los que contienen la totalidad o una parte de la secuencia de nucleótidos de la SEC ID Nº: 7 o las complementarias a las mismas. El ADN que comprende la totalidad de la secuencia de nucleótidos de la SEC ID Nº: 7 codifica la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 1. Los ADN, que contienen la totalidad o una parte de la secuencia de nucleótidos de la SEC ID Nº: 7, incluyen los que tienen una secuencia de aminoácidos en relación a la expresión de las propiedades de la presente enzima formadora de sacárido no reductor y tienen una secuencia de nucleótidos correspondiente a la secuencia de aminoácidos y la secuencia de nucleótidos de la SEC ID Nº: 7 con una sustitución, deleción y/o adición introducida de una o más bases mientras que conserva la secuencia de nucleótidos relacionada con la expresión de las propiedades de la presente enzima formadora de sacárido no reductor. Los ADN de acuerdo con la presente invención deben incluir los que tienen una o más bases sustituidas por diferentes en base a la degeneración del código genético. También los ADN de acuerdo con la presente descripción incluyen los que comprenden las secuencias de nucleótidos que codifican la presente enzima formadora de sacárido no reductor y que comprenden además una o más secuencias de nucleótidos diferentes adicionales seleccionadas del grupo que consiste en secuencias de unión a ribosoma tales como un codón de inicio, codón de terminación y secuencia de Shine-Dalgarno; secuencias de nucleótidos que codifican péptidos señal, secuencias de reconocimiento para enzimas de restricción apropiadas; secuencias de nucleótidos para regular la expresión de genes para promotor y potenciadores; y terminadores, que se usan todos generalmente en la tecnología de ADN recombinante para producir proteínas recombinantes. Por ejemplo, ya que una parte de y la totalidad de la secuencia de nucleótidos de la SEC ID Nº: 8 funcionan como secuencias de unión a ribosoma, los ADN a los que la parte de y la totalidad de la secuencia de nucleótidos de la SEC ID Nº: 8 se ligan cadena arriba de las secuencias de nucleótidos que codifican la presente enzima formadora de sacárido no reductor se pueden usar de forma arbitraria para producir la enzima como una proteína recombinante.

Como se ha descrito anteriormente, los ADN que codifican la presente enzima formadora de sacárido no reductor no se deben limitar a sus orígenes/fuentes, y se pueden preparar explorando ADN de diferentes fuentes en base a la hibridación con un ADN que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica al menos una parte de la secuencia de aminoácidos de la enzima, por ejemplo, la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 1. Son ejemplos reales de estas fuentes microorganismos del género Arthrobacter, y preferiblemente, Arthrobacter sp. S34, FERM BP-6450, y sus mutantes, que producen todos la enzima formadora de sacárido no reductor. Para seleccionar los microorganismos se pueden usar métodos convencionales usados en este campo para explorar o clonar ADN tales como métodos de exploración de genotecas recombinantes, método de PCR y sus métodos modificados. Como resultado de la exploración, los ADN deseados se pueden obtener recogiendo de un modo habitual ADN con la hibridación esperada confirmada. Generalmente, los ADN obtenidos de este modo comprende una parte o la totalidad de la secuencia de nucleótidos de la SEC ID Nº: 7. Por ejemplo, un ADN que comprende la totalidad de la secuencia de nucleótidos de la SEC ID Nº: 7 se obtiene generalmente a partir de Arthrobacter sp. S34, FERM BP-6450. Se pueden obtener ADN que comprenden una parte de la secuencia de nucleótidos de la SEC ID Nº: 7 explorando de forma similar ADN de microorganismos como fuentes diferentes de la anterior cepa, capaces de producir la presente enzima formadora de sacárido no reductor. Tales ADN se pueden preparar seleccionando ADN, que codifican las enzimas que tienen las propiedades de la presente enzima, de ADN en los que se ha introducido una sustitución, adición y/o deleción de una o más bases de los ADN que se han mencionado anteriormente usando uno o más métodos de introducción de mutación convencionales. Los ADN también se pueden obtener aplicando síntesis química convencional en base a la secuencia de nucleótidos que codifica la presente enzima formadora de sacárido no reductor, por ejemplo, una de la SEC ID Nº: 7. Una vez obtenidos, los ADN de acuerdo con la presente invención se pueden amplificar de forma sencilla hasta el nivel deseado aplicando o usando el método de PCR y vectores que se pueden replicar de forma autónoma.

El presente ADN que codifica la enzima formadora de sacárido no reductor incluye los que están en forma de ADN recombinante en los que los ADN se han introducido en vectores apropiados. Los ADN recombinantes se pueden preparar de forma relativamente sencilla mediante tecnología de ADN recombinante en general si están disponibles solamente los ADN. Se puede usar cualquier tipo de vector en la presente invención siempre que sean replicables de forma autónoma en hospedadores apropiados. Son ejemplos de tales vectores pUC18, pBluescript II SK(+), pKK223-3, \lambdagt\cdot\lambdaC etc., que usan Escherichia coli como un hospedador; pUB110, pTZ4, pc194, p11, \phi1, \phi105, etc., que usan microorganismos del género Bacillus; y pHY300PLK, pHV14, TRp7, YEp7, pBS7, etc., que usan dos o más microorganismos como hospedadores. Los métodos para insertar el presente el ADN en tales vectores en la presente invención pueden ser los usados generalmente de forma convencional en este campo. Un gen que contiene el presente ADN y un vector que se puede replicar de forma autónoma se digieren en primer lugar con una enzima de restricción y/o disgregador ultrasónico, después se ligan los fragmentos de ADN resultantes y los fragmentos de vector. La ligación se facilita mediante el uso de enzimas de restricción que actúan específicamente sobre la escisión del ADN, especialmente KpnI, AccI, BamHI, BstXI, EcoRI, HindIII, NotI, PstI, SacI, SalI, SmaI, SpeI, XpaI, XhoI, etc. Para ligar fragmentos de ADN y vectores, en primer lugar se pueden hibridar si es necesario, después someter a la acción de una ADN ligasa in vivo o in vitro. El ADN recombinante obtenido de este modo se puede replicar sin limitación sustancial en un hospedador apropiado.

El presente ADN que codifica la enzima formadora de sacárido no reductor incluye además transformantes en los que se ha introducido el ADN en vectores apropiados. Los transformantes se pueden preparar de forma sencilla introduciendo el ADN o el ADN recombinante obtenido anteriormente en hospedadores apropiados para transformar los mismos. Como hospedadores se pueden usar microorganismos y células de plantas y animales que se usan convencionalmente en este campo y se seleccionan dependiendo de los vectores en el ADN recombinante. Los microorganismos como hospedadores incluyen los de los géneros Escherichia coli, Bacillus y Arthrobacter y otros actinomicetos, levaduras, hongos, etc. Para introducir el presente ADN en estos microorganismos hospedadores se pueden usar el método de célula competente convencional y el método de protoplasto. El presente ADN, que codifica la enzima formadora de sacárido no reductor introducido en los transformantes de la presente invención, puede estar presente de forma separada de cromosomas o en una forma incorporada en cromosomas. El ADN incorporado en los cromosomas del hospedador tiene un carácter de conservarse de forma estable en los mismos y se puede usar ventajosamente para producir la presente proteína recombinante.

La presente enzima formadora de sacárido no reductor se puede obtener en una cantidad deseada mediante un proceso para producir la enzima caracterizado por que comprende las etapas de cultivar microorganismos capaces de producir la enzima y recoger la enzima producida del cultivo. Los microorganismos usados en el proceso se pueden usar independientemente del género o la especie siempre que produzcan la enzima. Los ejemplos de tales microorganismos son microorganismos del género Arthrobacter, Arthrobacter sp. S34, FERM BP-6450 y mutantes de los mismos, así como transformantes que se pueden obtener introduciendo el presente ADN que codifica la enzima en hospedadores apropiados.

Se puede usar cualquier medio de cultivo nutriente para cultivar el proceso para producir la presente enzima formadora de sacárido no reductor mientras que los microorganismos que se han mencionado anteriormente se desarrollen en el mismo y produzcan la enzima sin restricción a ningún medio de cultivo nutriente específico. Generalmente, el medio de cultivo nutriente contiene fuentes de carbono y nitrógeno y, si es necesario, se pueden añadir minerales. Los ejemplos de las fuentes de carbono son sacáridos tales como dextrinas, almidones, hidrolizados de almidón parciales, glucosa, etc., y son sustancias que contienen sacáridos tales como melazas y extractos de levadura y ácidos orgánicos tales como ácido glucorónico y ácido succínico. La concentración de las fuentes de carbono se selecciona dependiendo de los tipos usados, habitualmente del 30% p/v y preferiblemente del 15% p/p o menos. Los ejemplos de las fuentes de nitrógeno usadas de forma apropiada en la presente invención son sustancias que contienen nitrógeno inorgánico tales como sales de amonio, nitrato, etc.; sustancias que contienen nitrógeno orgánico tales como urea, agua de macerado de maíz, caseína, peptona, extracto de levadura, extracto de carne, etc. Dependiendo del uso, se usa selectivamente entre ingredientes inorgánicos tales como sales de calcio, magnesio, potasio, sodio, ácido fosfórico, manganeso, cinc, hierro, cobre, molibdeno, cobalto, etc.

Las condiciones de cultivo usadas para producir la presente enzima se pueden usar selectivamente de condiciones apropiadas adecuadas para desarrollar los respectivos microorganismos usados. Por ejemplo, en el caso de usar microorganismos del género Arthrobacter incluyendo Arthrobacter sp. S34, FERM BP-6450, la temperatura de cultivo está habitualmente en el intervalo de 20-50ºC y preferiblemente 25-37ºC; el pH de cultivo está habitualmente en el intervalo de pH 4-10, y preferiblemente pH 5-9; y el tiempo de cultivo está en el intervalo de 10-150 horas. Con estas condiciones, los microorganismos se cultivan en condiciones aerobias. Cuando se usan transformantes preparados introduciendo en hospedadores apropiados el presente ADN que codifica la presente enzima formadora de sacárido no reductor, los transformantes se cultivan en condiciones aerobias en condiciones seleccionadas de las condiciones de cultivo tales como las temperaturas de cultivo de 20-65ºC, el pH de cultivo de 2-9 y el tiempo de cultivo de 1-6 días, aunque varían dependiendo del género, las especies, las cepas o los tipos de microorganismos y vectores. Los cultivos obtenidos de este modo contienen generalmente la presente enzima en fracciones celulares. En el caso de cultivar transformantes obtenidos usando como hospedadores los microorganismos del género Bacillus, los cultivos resultantes pueden contener la presente enzima en fracciones de sobrenadante dependiendo de los vectores usados para transformar los hospedadores. El contenido de la presente enzima en los cultivos obtenidos de este modo es habitualmente 0,01-1.000 unidades por ml del cultivo, aunque varía dependiendo del género, las especies o las cepas de los microorganismos y las condiciones de cultivo usados.

La presente enzima formadora de sacárido no reductor se recupera de los cultivos resultantes. El método de recogida no está limitado; la presente enzima se puede obtener separando y recogiendo una cualquiera de las fracciones de células y sobrenadantes del cultivo que se observan con una actividad principal de la enzima y, si es necesario, someter la fracción recogida a un método de purificación apropiado para recoger una fracción purificada que contenga la enzima. Para la separar las fracciones de células y sobrenadantes de cultivo de los cultivos se pueden usar arbitrariamente métodos de separación de sólido-líquido convencionales tales como centrifugación y filtración usando filtros pre-recubiertos y membranas de fibra plana y hueca. Las fracciones deseadas se recuperan de las fracciones separadas de células y sobrenadante de cultivo. Para la fracción de células, las células se rompen en un dispositivo para romper células que después se separan en un extracto celular y una fracción celular insoluble, seguido de recuperación de cada una de las fracciones deseadas. La fracción celular insoluble se puede solubilizar mediante métodos convencionales, si es necesario. Como un método para romper células se puede usar arbitrariamente una cualquiera de técnicas de ultrasonicación, tratamiento con enzimas que lisan la pared celular tales como lisozima y glucanasa y aplicación de presión mecánica. Para romper las células, los cultivos se pueden tratar directamente con una cualquiera de las anteriores técnicas y, después, las mezclas resultantes se tratan con uno cualquiera de los métodos de separación de sólido-líquido anteriores para recoger una fracción líquida. De este modo se puede obtener un extracto celular de forma arbitraria.

Los métodos usados para purificar más la presente enzima formadora de sacárido no reductor incluyen los convencionales para purificar enzimas relacionadas con sacáridos en general tales como precipitación con sales, diálisis, filtración, concentración, cromatografía de filtración en gel, cromatografía de intercambio iónico, cromatografía hidrófoba, cromatografía de fase inversa, cromatografía de afinidad, electroforesis en gel y electroforesis de punto isoeléctrico. Estos métodos se pueden usar en combinación, dependiendo de los propósitos. A partir de las fracciones resultantes separadas mediante estos métodos se recogen fracciones con una actividad deseada ensayada mediante el método para enzima formadora de sacárido no reductor para obtener la presente enzima formadora de sacárido no reductor purificada hasta un nivel deseado. De acuerdo con los métodos en los ejemplos descritos más adelante, la presente enzima se puede purificar hasta un nivel electroforéticamente homogéneo. Como se ha descrito anteriormente, el presente método proporciona la presente enzima formadora de sacárido no reductor en forma de un cultivo, fracción celular, fracción del sobrenadante del cultivo, alterador de células, extracto celular, fracción celular soluble e insoluble, fracción de enzima parcialmente purificada y fracción de enzima purificada. Estas fracciones pueden contener otro tipo de la presente enzima liberadora de trehalosa. La enzima formadora de sacárido no reductor obtenida de este modo se puede inmovilizar de un modo habitual antes del uso. Los métodos para la inmovilización son, por ejemplo, el método de unión a intercambiadores iónicos, unión/adsorción covalente a y sobre resinas y membranas y el método de inmovilización por captura usando sustancias de alto peso molecular. La enzima formadora de sacárido no reductor obtenida de este modo se puede usar arbitrariamente en procesos para producir sacáridos que incluyen el presente proceso descrito en último lugar para producir sacáridos. Particularmente, ya que la presente enzima formadora de sacárido no reductor tiene una temperatura óptima en un intervalo de temperaturas medio y tiene preferiblemente un pH óptimo en un intervalo de pH ácido, se puede usar ventajosamente para producir sacáridos cuando se usa en combinación con la presente enzima liberadora de trehalosa que se ha descrito en último lugar, una enzima de desramificación de almidón que tiene un pH óptimo en un intervalo de pH ácido y ciclomaltodextrina glucanotransferasa que actúa de forma eficaz en un intervalo de temperaturas medio.

Para explicar la presente enzima liberadora de trehalosa en base a la secuencia de aminoácidos, la enzima tiene la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 9 en su totalidad y tiene las secuencias de aminoácidos de las SEC ID Nº: 10 a 16 como secuencias de aminoácidos parciales en algunos casos. Además de estas enzimas que tienen la totalidad de las secuencias de aminoácidos que se han identificado anteriormente, la presente descripción incluyó otros tipos de enzimas que comprenden una parte de una cualquiera de las secuencias de aminoácidos seleccionadas de las mismas o que tienen tanto la acción de la presente enzima liberadora de trehalosa como la temperatura óptima que se ha identificado anteriormente. Son ejemplos de las secuencias de aminoácidos de tales enzimas las que contienen, dentro de las secuencias de aminoácidos, una secuencia de aminoácidos parcial o un resto aminoacídico que se relaciona con la expresión de las propiedades de la presente enzima formadora de sacárido no reductor y donde uno o más aminoácidos se sustituyen por aminoácidos diferentes, añadidos a las mismas y/o deleccionados de las mismas diferentes de la secuencia de aminoácidos parcial anterior o el resto aminoacídico. Los ejemplos de secuencias de aminoácidos sustituidas por diferentes aminoácidos como se indican en la presente descripción incluyen las que tienen menos del 30% y, preferiblemente menos del 20% de las secuencias de aminoácidos que componen la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 9 sustituido por otros aminoácidos que tienen propiedades y estructuras similares a las que se tienen que sustituir. Los ejemplos de grupos de tales aminoácidos son un grupo de ácido aspártico y ácido glutámico como aminoácidos ácidos, uno de lisina, arginina e histidina como aminoácidos básicos, uno de asparagina y glutamina como aminoácidos de tipo amida, uno de serina y treonina como hidroxiaminoácidos y uno de valina, leucina e isoleucina como aminoácidos de cadena ramificada. Los ejemplos de otras secuencias de aminoácidos de la enzima que contienen una parte de una cualquiera de las secuencias de aminoácidos seleccionadas de las SEC ID Nº: 9 a 16 son las que pueden tener una estéreo-estructura sustancialmente similar a la de la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 9, es decir, sustitución, delección y/o adición de aminoácido o aminoácidos que se introducen en la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 9. La estéreo-estructura de proteínas se puede estimar explorando bases de datos disponibles en el mercado para estéreo-estructuras de proteínas que tienen secuencias de aminoácidos relacionadas con las pretendidas y que tienen estéreo-estructuras descritas, haciendo referencia a las estéreo-estructuras exploradas y usando software disponible en el mercado para visualizar estéreo-estructuras. La secuencia de aminoácidos que se ha identificado anteriormente de la presente enzima liberadora de trehalosa tiene una homología de al menos el 60%, preferiblemente al menos el 70% y más preferiblemente al menos el 80% con la SEC ID
Nº: 9.

En particular, la secuencia de aminoácidos que se ha identificado anteriormente de la presente enzima liberadora de trehalosa de acuerdo con la presente invención tiene una homología de al menos el 80% con la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 9.

Como se ha descrito anteriormente, la enzima liberadora de trehalosa no se debe limitar a ningún origen/fuente específico. Los ejemplos de tales son las obtenidas de microorganismos, es decir, los del género Arthrobacter, Arthrobacter sp. S34, FERM BP-6450 y mutantes de los mismos. Los mutantes se pueden obtener tratando de un modo habitual Arthrobacter sp. S34, FERM BP-6450 con mutágenos conocidos tales como N-metil-N'-nitro-N-nitrosoguanidina, metanosulfonato de etilo, ultravioleta y transposón; seleccionando los mutantes deseados capaces de producir una enzima formadora de sacárido no reductor y que tienen una temperatura óptima a temperaturas en un intervalo de temperaturas medio y, habitualmente a temperaturas en el intervalo de más de 45ºC pero inferior a 60ºC. La enzima de Arthrobacter sp. S34, FERM BP-6450 tiene habitualmente las secuencias de aminoácidos de las SEC ID Nº: 9 a 16. Otras enzimas formadoras de sacárido no reductor de microorganismos de mutantes de Arthrobacter sp. S34, FERM BP-6450 y otros microorganismos comprenden la totalidad o una parte de una cualquiera de las secuencias de aminoácidos de las SEC ID Nº: 9 a 16. Los ejemplos concretos de otras enzimas incluyen enzimas recombinantes que actúan como la presente enzima liberadora de trehalosa y tienen una temperatura óptima a temperaturas en un intervalo de temperaturas medio y habitualmente a temperaturas superiores a 45ºC pero inferiores a 60ºC. Las enzimas recombinantes se pueden obtener aplicando la tecnología de ADN recombinante al ADN que codifica la presente enzima liberadora de trehalosa y que tengan la totalidad o una parte de una cualquiera de las secuencias de aminoácidos de las SEC ID Nº: 9 a 16.

La mayoría de las enzimas liberadoras de trehalosa de acuerdo con la presente invención tienen las siguientes propiedades fisicoquímicas:

(1): Acción

: Hidroliza específicamente un sacárido no reductor que tiene una estructura de trehalosa como una unidad terminal en un sitio entre una parte de la estructura de trehalosa y una parte del resto;

(2): Peso molecular

: Aproximadamente 62.000 \pm 5.000 daltons en una electroforesis en gel de dodecil sulfato sódico-poliacrilamida (SDS-PAGE);

(3): Punto isoeléctrico (pI)

: Aproximadamente 4,7 \pm 0,5 en isoelectroforesis usando anfolito;

(4): Temperatura óptima

: De aproximadamente 50ºC a aproximadamente 55ºC cuando se incuba a pH 6,0 durante 30 min;

(5): pH óptimo

: Aproximadamente 6,0 cuando se incuba a 50ºC durante 30 min;

(6): Estabilidad térmica

: Estable hasta una temperatura de aproximadamente 50ºC cuando se incuba a pH 7,0 durante 60 min; y

(7): Estabilidad a pH

: Estable a pH de aproximadamente 4,5 a aproximadamente 10,0 cuando se incuba a 4ºC durante 24 horas.

La presente enzima liberadora de trehalosa se puede obtener en una cantidad pre-establecida mediante el presente proceso descrito en último lugar para producir la misma.

La presente invención proporciona un ADN que codifica la presente enzima liberadora de trehalosa. Un ADN de este tipo es bastante útil para producir la enzima en forma de una proteína recombinante. En general, el ADN incluyen el que codifica la enzima independientemente de su origen/fuente. Son ejemplos de un ADN de este tipo los que contienen la totalidad o una parte de la secuencia de nucleótidos de la SEC ID Nº: 17 o la complementaria a la misma. El ADN que comprende la totalidad de la secuencia de nucleótidos de la SEC ID Nº: 17 codifica la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 9. Los ADN, que contienen la totalidad o una parte de la secuencia de nucleótidos de la SEC ID Nº: 17, incluyen las que tienen una secuencia de nucleótidos correspondiente a una secuencia de aminoácidos relacionada con la expresión de las propiedades de la presente enzima formadora de sacárido no reductor y que tienen la secuencia de nucleótidos de la SEC ID Nº: 17 con una sustitución, delección y/o adición introducida de una o más bases mientras que conserva la secuencia de nucleótidos relacionada con la expresión de las propiedades de la presente enzima liberadora de trehalosa. Los ADN de acuerdo con la presente invención deben incluir aquellos en los que una o más bases están sustituidas por diferentes en base a la degeneración del código genético. Además, los ADN de acuerdo con la presente invención incluyen los que comprenden las secuencias de nucleótidos que codifican la presente enzima liberadora de trehalosa y que comprenden además una o más secuencias de nucleótidos diferentes adicionales seleccionadas del grupo que consiste en las secuencias de unión a ribosoma tales como un codón de inicio, codón de terminación y secuencia de Shine-Dalgarno; secuencias de nucleótidos que codifican péptidos señal, secuencias de reconocimiento para enzimas de restricción apropiadas; secuencias de nucleótidos para regular la expresión de genes para promotor y potenciadores; y terminadores, que se usan todos generalmente en tecnología de ADN recombinante para producir proteínas recombinantes. Por ejemplo, ya que una parte de y la totalidad de la secuencia de nucleótidos de la SEC ID Nº: 8 funciona como secuencias de unión a ribosomas, los ADN a los que se liga la parte de y la totalidad de la secuencia de nucleótidos de la SEC ID Nº: 8 cadena arriba de las secuencias de nucleótidos que codifican la presente enzima liberadora de trehalosa, se pueden usar arbitrariamente para producir la enzima como una proteína recombinante.

Como se ha descrito anteriormente, los ADN que codifican la presente enzima liberadora de trehalosa no se deben restringir a sus orígenes/fuentes y se pueden preparar explorando ADN de diferentes fuentes en base a la hibridación con un ADN que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica al menos una parte de la secuencia de aminoácidos de la enzima, por ejemplo, la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 9. Son ejemplos reales de estas fuentes los microorganismos del género Arthrobacter y, preferiblemente Arthrobacter sp. S34, FERM BP-6450 y sus mutantes, que producen todos la enzima formadora de sacárido no reductor. Para seleccionar los microorganismos se usan métodos convencionales usados en este campo para explorar o clonar ADN tales como métodos de exploración de genotecas recombinantes, método de PCR y sus métodos modificados. Como resultado de la exploración, los ADN deseados se pueden obtener recogiendo de un modo habitual ADN confirmado con la hibridación esperada. Generalmente, los ADN obtenidos de este modo comprenden una parte o la totalidad de la secuencia de nucleótidos de la SEC ID Nº: 17. Por ejemplo, un ADN que comprende la totalidad de la secuencia de nucleótidos de la SEC ID Nº: 17 se obtiene generalmente a partir de Arthrobacter sp. S34, FERM BP-6450. Los ADN que comprenden una parte de la secuencia de nucleótidos de la SEC ID Nº: 17 se pueden obtener explorando de forma similar ADN de microorganismos como fuentes diferentes de la anterior cepa, capaces de producir la enzima liberadora de trehalosa. Tales ADN se pueden preparar seleccionando ADN, que codifican las enzimas que tienen las propiedades de la enzima, a partir de ADN en los que se ha introducido una sustitución, adición y/o delección de una o más bases de los ADN que se han mencionado anteriormente usando uno o más métodos de introducción de mutación convencionales. Los ADN también se pueden obtener aplicando síntesis química convencional en base a la secuencia de nucleótidos que codifica la presente enzima liberadora de trehalosa, por ejemplo, una de la SEC ID Nº: 17. Una vez obtenidos, los ADN de acuerdo con la presente invención se pueden amplificar de forma sencilla hasta el nivel deseado aplicando o usando el método de PCR y vectores que se pueden replicar de forma autónoma.

El presente ADN que codifica la enzima liberadora de trehalosa incluye el que está en forma de ADN recombinantes en los que el ADN se ha introducido en vectores apropiados. Los ADN recombinantes se pueden preparar de forma relativamente sencilla mediante tecnología de ADN recombinante, en general, si solamente están disponible los ADN. Se puede usar cualquier tipo de vector en la presente invención siempre que se puedan replicar de forma autónoma en hospedadores apropiados. Son ejemplos de tales vectores pUC18, pBluescript II SK(+), pKK223-3, \lambdagt\cdot\lambdaC, etc., que usan Escherichia coli como un hospedador; pUB110, pTZ4, pC194, \rho11, \phi1, \phi105, etc., que usan microorganismos del género Bacillus; y pHY300PLK, pHV14, TRp7, YEp7, pBS7, etc., que usan dos o más microorganismos como hospedadores. Los métodos para insertar el presente ADN en tales vectores en la presente invención pueden ser los usados generalmente de forma convencional en este campo. Un gen que contiene el presente ADN y un vector que se puede replicar de forma autónoma se dirigieren en primer lugar con una enzima de restricción y/o disgregador ultrasónico, después se ligan los fragmentos de ADN resultantes y los fragmentos de vector. La ligación se facilita mediante el uso de enzimas de restricción que actúan específicamente sobre la escisión del ADN, especialmente, KpnI, AccI, BamHI, BstXI, EcoRI, HindIII, NotI, PstI, SacI, SalI, SmaI, SpeI, XbaI, XhoI, etc. Para ligar los fragmentos de ADN y los vectores, en primer lugar se pueden hibridar si es necesario, después someter a la acción de una ADN ligasa in vivo o in vitro. El ADN recombinante obtenido de este modo se puede replicar sin limitación sustancial en un hospedador apropiado. El presente ADN que codifica la enzima liberadora de trehalosa incluye además transformantes en los que el ADN se ha introducido en vectores apropiados. Los transformantes se pueden preparar de forma sencilla introduciendo el ADN o el ADN recombinante obtenido anteriormente en hospedadores apropiados para transformar los mismos. Como hospedadores se pueden usar microorganismos y células de plantes y animales, que se usan convencionalmente en este campo y se seleccionan dependiendo de los vectores en el ADN recombinante. Los microorganismos como hospedadores incluyen los de los géneros Escherichia, Bacillus y Arthrobacter y otros actinomicetos, levaduras, hongos, etc. Para introducir el presente ADN en estos microorganismos hospedadores se puede usar el método de células competentes convencional y el método de protoplasto. El presente ADN que codifica la enzima liberadora de trehalosa introducida en los transformantes en la presente invención puede estar presente de forma separada de los cromosomas o en una forma incorporada en los cromosomas. El ADN incorporado en los cromosomas del hospedador tiene un carácter de estar retenido de forma estable en los mismos y se puede usar ventajosamente para producir la presente proteína recombinante.

Las anteriores técnicas usadas para obtener los presentes ADN incluyendo ADN recombinantes y transformantes y las técnicas para obtener los ADN y las proteínas recombinantes se usan comúnmente en la técnica; por ejemplo, J. Sumbruck et al., en "Molecular Cloning A Laboratory Manual", 2ª edición, publicado por Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989), que describe de forma detallada métodos para obtener ADN deseados y aplicaciones para el uso en la producción de los ADN obtenidos. Por ejemplo, la Patente Japonesa Nº 2.576.970 describe un método para estabilizar un ADN transformado, que usa como un hospedador un microorganismo defectuoso en un gen pretendido. La Patente Japonesa Kokai Nº 157.987/88 describe un vector que expresa de forma eficaz un ADN pretendido en microorganismos del género Bacillus. La Patente Japonesa Kohyo Nº 502.162/93 describe un método para introducir de forma estable un ADN deseado en un cromosoma bacteriano. La Patente Japonesa Kohyo Nº 506.731/96 describe un método de producción eficaz de una enzima que hidroliza almidón usando tecnología de ADN recombinante. Las Patentes Japonesas Kohyo Nº 500.543/97 y 500.024/98 describen un sistema de vector-hospedador que usa hongos para la producción eficaz de proteínas recombinantes. Estos métodos usados convencionalmente en la técnica se pueden aplicar de forma arbitraria para la presente invención.

En la técnica, cuando los ADN deseados están disponibles mediante los anteriores métodos, se han proporcionado comúnmente transformantes en los que los ADN se introducen en plantas y animales apropiados, es decir, plantas y animales transgénicos. El presente ADN, que codifica la enzima formadora de sacárido no reductor y la enzima liberadora de trehalosa en forma de un ADN introducido en hospedadores apropiados, también incluye las plantas y los animales transgénicos. Para obtener los animales transgénicos, se obtiene como una totalidad mediante un proceso que comprende el ADN que codifica cada una de las presentes enzimas sola o junto con otro ADN deseado tal como un promotor y potenciador en un vector apropiado seleccionado dependiendo de la especie del animal hospedador, introduciendo el ADN recombinante resultante en un óvulo fertilizado o célula madre embrionaria del animal hospedador mediante un método tal como microinyección y electroporación o mediante un método de infección usando virus recombinantes que contienen el ADN recombinante. Los ejemplos de los animales hospedadores son roedores experimentales convencionales tales como ratones, ratas y hámsteres; y mamíferos usados convencionalmente como animales domésticos tales como cabras, ovejas, cerdos y vacas, que tienen todos la ventaja de poderse criar de forma sencilla. Las células resultantes con el ADN introducido se trasplantan a la trompa uterina o el útero de un animal hembra pseudogestante de la misma especie que las células. Después de esto, los animales transgénicos, a los que se ha introducido el ADN que codifica las presentes enzimas aplicando el método de hibridación o PCR, se obtienen de recién nacidos de un modo natural o por cesárea. Por tanto, el presente ADN se puede obtener en forma de un animal transgénico. Con referencia a animales transgénicos, se describen de forma detallada en "Jikken-Igaku-Bessatsu-Shin-Idennshi-Kogaku-Handbook" (Handbook of Genetic Engineering), págs. 269-283 (1996), editado por Masami MATSUMURA, Hiroto OKAYAMA y Tadashi YAMAMOTO, publicado por Yodosha Co., Ltd., Tokio, Japón. El método para obtener plantas transgénicas comprende, por ejemplo, proporcionar un plásmido como un vector de un microorganismo del genero Agrobacterium infeccioso para plantas, introducir el ADN que codifica cualquiera de las presentes enzimas en el vector e introducir el ADN recombinante resultante en cuerpos vegetales o protoplastos o recubrir partículas de metal pesado con un ADN que incluye una secuencia de nucleótidos que codifica cualquiera de las presentes enzimas e inyectar directamente las partículas recubiertas en cuerpos vegetales o protoplastos usando una pistola de partículas. Aunque se pueden usar diversos tipos de plantas como plantas hospedadoras, incluyen generalmente plantas comestibles tales como patata, soja, trigo, tabaco, arroz, maíz, tomate, lechuga, alfalfa, manzana, melocotón, melón, etc. Aplicando el método de hibridación o PCR a los cuerpos vegetales y protoplastos transformados anteriores, se seleccionan los transformantes que contienen el ADN deseado. Los protoplastos transformados se pueden regenerar en cuerpos vegetales cuando el presente ADN está en forma de plantas transgénicas. Las técnicas de plantas transgénicas se describen de forma general en Genetic Engineering, editado por Jane K. Setlow, publicado por Plenum Publishing Corporation, NY, USA, Vol 16, págs. 93-113 (1994). El ADN en forma de los animales y plantas transgénicos que se han mencionado anteriormente se puede usar como fuentes de la presente enzima formadora de sacárido no reductor y/o enzima liberadora de trehalosa y se puede usar como plantas comestibles y animales que contienen trehalosa o sacárido no reductor que tiene una estructura de trehalosa.

La presente enzima liberadora de trehalosa se puede obtener en una cantidad deseada mediante el presente proceso para producir la enzima que se caracteriza por que comprende cultivar un microorganismo capaz de producir la enzima en un medio de cultivo nutriente y recoger la enzima producida del cultivo resultante. Se puede usar cualquier microorganismo en el presente proceso independientemente de su género y especie siempre que produzca la presente enzima liberadora de trehalosa. Son ejemplos de tales microorganismos los del género Arthrobacter, Arthrobacter sp. S34, FERM BP-6450 y mutantes de los mismos, así como transformantes que se pueden obtener introduciendo el presente ADN que codifica la enzima en microorganismos hospedadores apropiados.

Se puede usar cualquier medio de cultivo nutriente para cultivar el proceso para producir la presente enzima liberadora de trehalosa siempre que los microorganismos que se han mencionado anteriormente se desarrollen en el mismo y produzcan la enzima sin limitación a un medio de cultivo nutriente específico. Generalmente, el medio de cultivo nutriente contiene fuentes de carbono y nitrógeno y, si es necesario, se pueden añadir minerales. Los ejemplos de las fuentes de carbono son sacáridos tales como dextrinas, almidones, hidrolizados de almidón parciales, glucosa, etc. y son sustancias que contienen sacáridos tales como melazas y extractos de levadura y ácidos orgánicos tales como ácido glucorónico y ácido succínico. La concentración de las fuentes de carbono se selecciona dependiendo de los tipos usados, habitualmente del 30% p/v y preferiblemente del 15% p/p o menos. Los ejemplos de las fuentes de nitrógeno usadas de forma apropiada en la presente invención son sustancias que contienen nitrógeno inorgánico tales como sales de amonio, nitrato, etc.; sustancias que contienen nitrógeno orgánico tales como urea, agua de macerado de maíz, caseína, peptona, extracto de levadura, extracto de carne, etc. Dependiendo del uso, se usa de forma selectiva entre ingredientes inorgánicos tales como sales de calcio, magnesio, potasio, sodio, ácido fosfórico, manganeso, cinc, hierro, cobre, molibdeno, cobalto, etc.

Las condiciones de cultivo usadas para producir la presente enzima liberadora de trehalosa se pueden usar selectivamente de condiciones apropiadas adecuadas para desarrollar los respectivos microorganismos usados. Por ejemplo, en el caso de usar microorganismos del género Arthrobacter incluyendo Arthrobacter sp. S34, FERM BP-6450, la temperatura de cultivo está habitualmente en el intervalo de 20-50ºC y preferiblemente 25-37ºC; el pH de cultivo está habitualmente en el intervalo de pH 4-10 y preferiblemente pH 5-9; y el tiempo de cultivo está en el intervalo de 10-150 horas. Con estas condiciones, los microorganismos se cultivan en condiciones aerobias. Cuando se usan transformantes preparados por introducción en hospedadores apropiados del presente ADN que codifica la enzima liberadora de trehalosa, los transformantes se cultivan en condiciones aerobias en condiciones seleccionadas de las condiciones de cultivo tales como las temperaturas de cultivo de 20-65ºC, el pH de cultivo de 2-9 y el tiempo de cultivo de 1-6 días, aunque varían dependiendo del género, las especies, las cepas o los tipos de microorganismos y vectores. Los cultivos obtenidos de este modo contienen generalmente la enzima en fracciones celulares. En el caso de cultivar transformantes obtenidos por el uso como hospedadores los microorganismos del género Bacillus, los cultivos resultantes pueden contener la enzima en fracciones de sobrenadante dependiendo de los vectores usados para transformar los hospedadores. El contenido de la enzima en los cultivos obtenidos de este modo está habitualmente entre 0,01-3.000 unidades por ml del cultivo, aunque varía dependiendo del género, la especie o las cepas de los microorganismos y las condiciones de cultivo usadas.

La presente enzima liberadora de trehalosa se recoge de los cultivos resultantes. El método de recogida no está limitado; la enzima se puede obtener separando y recogiendo una cualquiera de las fracciones de células y sobrenadantes de cultivo que tienen una actividad principal de la enzima y, si es necesario, sometiendo la fracción recogida a un método de purificación apropiado para recoger una fracción purificada que contenga la enzima. Para separa las fracciones de células y sobrenadantes de cultivo de los cultivos, se pueden usar arbitrariamente métodos de separación de sólido-líquido convencionales tales como centrifugación y filtración usando filtros pre-recubiertos y membranas de fibra plana y hueca. Las fracciones deseadas se recogen de las fracciones separadas de células y sobrenadante de cultivo. Para la fracción de células, las células se rompen en un alterador de células que se separa después en un extracto celular y una fracción celular insoluble, seguido de recuperación de cualquiera de las fracciones deseadas. La fracción celular insoluble se puede solubilizar mediante métodos convencionales, si es necesario. Como un método para romper las células se puede usar arbitrariamente una cualquiera de las técnicas de ultrasonicación, tratamiento con enzimas que lisan la pared celular tales como lisozima y glucanasa y aplicación de presión mecánica. Para romper las células, los cultivos se pueden tratar directamente con una cualquiera de las anteriores técnicas y, después, las mezclas resultantes se tratan con uno cualquiera de los anteriores métodos de separación de sólido-líquido para recoger una fracción líquida. Por tanto, se puede obtener arbitrariamente un extracto celular.

Los métodos usados para purificar más la presente enzima liberadora de trehalosa incluyen los convencionales para purificar enzimas relacionadas con sacáridos en general tales como precipitación con sales, diálisis, filtración, concentración, cromatografía de filtración en gel, cromatografía de intercambio iónico, cromatografía hidrófoba, cromatografía de fase inversa, cromatografía de afinidad, electroforesis en gel y electroforesis de punto isoeléctrico. Estos métodos se pueden usar en combinación dependiendo de los propósitos. Para las fracciones resultantes separadas mediante estos métodos, se recogen fracciones con una actividad deseada ensayada mediante el método para la enzima liberadora de trehalosa para obtener la enzima purificada hasta un nivel deseado. De acuerdo con los métodos en los ejemplos que se describen más adelante, la presente enzima se puede purificar hasta un nivel eletroforéticamente homogéneo. Como se ha descrito anteriormente, el presente método proporciona la presente enzima liberadora de trehalosa en forma de un cultivo, fracción celular, fracción de sobrenadante de cultivo, alterador de células, extracto celular, fracción celular soluble e insoluble, fracción de enzima parcialmente purificada y fracción de enzima purificada. Estas fracciones pueden contener otro tipo de la presente enzima formadora de sacárido no reductor. La presente enzima liberadora de trehalosa obtenida de este modo se puede inmovilizar de un modo habitual antes del uso. Los métodos para la inmovilización, son, por ejemplo, el método de unión a intercambiadores iónicos, unión/adsorción covalente a y sobre resinas y membranas y método de inmovilización por captura usando sustancias de alto peso molecular. La enzima liberadora de trehalosa obtenida de este modo se puede usar arbitrariamente en procesos para producir sacáridos que incluyen el presente proceso descrito en último lugar para producir sacáridos. Particularmente, ya que la enzima liberadora de trehalosa tiene una temperatura óptima en un intervalo de temperaturas medio y tiene preferiblemente un pH óptimo en un intervalo de pH ácido, se puede usar ventajosamente para producir sacáridos cuando se usa en combinación con la presente enzima liberadora de trehalosa que se ha descrito en último lugar, enzima de desramificación de almidón que tiene un pH óptimo en un intervalo de pH ácido y ciclomaltodextrina glucanotransferasa que actúa de forma eficaz a temperaturas en un intervalo de temperaturas medio.

La presente descripción proporciona un proceso para producir sacáridos que comprenden sacáridos no reductores usando las presentes enzimas que se han mencionado anteriormente; comprendiendo el proceso las etapas de permitir que la enzima formadora de sacárido no reductor y/o la enzima liberadora de trehalosa actúen sobre hidrolizados de almidón parciales reductores para formar sacáridos no reductores y recoger los sacáridos no reductores resultantes o composiciones de sacáridos con una capacidad de reducción menor. En el proceso, el uso de uno o más tipos diferentes de enzimas formadoras de sacárido no reductor y enzimas liberadoras de trehalosa diferentes de las presentes enzimas y otras enzimas relacionadas con sacáridos no se deben excluir de la presente invención. Los hidrolizados de almidón parciales reductores usados en el proceso se pueden usar independientemente de sus orígenes/fuentes. Los sacáridos no reductores indicados en la presente invención incluyen sacáridos no reductores en general tales como trehalosa y los que tienen una estructura de trehalosa.

Los hidrolizados de almidón parciales reductores usados en el presente proceso para producir sacáridos se pueden obtener, por ejemplo, licuando almidones o sustancias amiláceas mediante métodos convencionales. Los almidones incluyen almidones terrestres tales como almidón de maíz, almidón de arroz y almidón de trigo; y almidones subterráneos tales como almidón de patata, almidón de batata y almidón de tapioca. Para licuar estos almidones se suspenden generalmente en agua en suspensiones de almidón, preferiblemente, las que tienen una concentración de al menos el 10% p/p y más preferiblemente las que tienen una concentración de aproximadamente el 20 a aproximadamente el 50% p/p y se tratan con tratamientos mecánicos, con ácidos y/o enzimáticos. Se usa un grado relativamente menor de licuación satisfactoriamente, preferiblemente, DE (equivalente de dextrosa) menor de 15 y más preferiblemente DE menor de 10. Cuando se licuan con ácidos, los almidones se tratan con ácido clorhídrico, ácido fosfórico, ácido oxálico, etc. y, después, las mezclas resultantes se neutralizan con carbonato de calcio, óxido de calcio, carbonato de sodio, etc. hasta pH deseados antes del uso. Para licuar los almidones con enzimas se usan satisfactoriamente \alpha-amilasa, particularmente y \alpha-amilasa de licuación termoestable. Los almidones licuados obtenidos de este modo se pueden someter además a la acción de \alpha-amilasa, amilasa formadora de maltotriosa, amilasa formadora de maltotetraosa, amilasa formadora de maltopentaosa, amilasa formadora de maltohexanosa, etc., y las mezclas de reacción resultantes se pueden usar como los hidrolizados de almidón parciales reductores. Las propiedades de las enzimas relacionadas con almidón se describen de forma detallada en Handbook of Amylases and Related Enzymes, págs. 18-81 y págs. 125-142 (1988), publicado por Pergamon Press.

Los hidrolizados de almidón parciales reductores obtenidos de este modo se someten a la acción de la presente enzima formadora de sacárido no reductor y/o enzima liberadora de trehalosa y, si es necesario, se someten además a la acción de una o más enzimas relacionadas con almidón tales como \alpha-amilasa, \beta-amilasa, glucoamilasa, enzimas de desramificación de almidón tales como isoamilasa y pululanasa, ciclomaltodextrina glucanotransferasa, \alpha-glucosidasa y \beta-fructofuranosidasa. Las condiciones usadas para las reacciones enzimáticas son las adecuadas para las enzimas usadas; se seleccionan habitualmente de pH 4-10 y temperaturas de 20-70ºC y preferiblemente pH 5-7 y temperaturas de 30-60ºC. Particularmente, los sacáridos no reductores se pueden producir de forma eficaz mediante reacciones enzimáticas a temperaturas en un intervalo de temperaturas medio, es decir, temperaturas de más de 40ºC pero menos de 60ºC o más de 45ºC pero menos de 60ºC y pH de condiciones de pH ligeramente ácidas o ácidas. El orden en el que se permite que las enzimas actúen sobre hidrolizados de almidón parciales reductores no está limitado; una avanza o sigue después de otra o se puede permitir que varias enzimas actúen arbitrariamente sobre sustratos de forma simultánea.

La cantidad de enzimas se ajusta de forma apropiada dependiendo de las condiciones enzimáticas y los tiempos de reacción y los usos finales de sacáridos no reductores o composiciones de sacáridos menos reductores que contienen los mismos. Para la presente enzima formadora de sacárido no reductor y enzima liberadora de trehalosa, la primera se usa en una cantidad de aproximadamente 0,01 a aproximadamente 100 unidades/g de sólido de hidrolizados de almidón parciales reductores y la última se usa en una cantidad de aproximadamente 1 a aproximadamente 10.000 unidades/g de sólidos de hidrolizados de almidón parciales reductores. La ciclomaltodextrina glucanotransferasa se usa en una cantidad de aproximadamente 0,05 a aproximadamente 500 unidades/g de hidrolizados de almidón parciales reductores, d.s.b. Las mezclas de reacción obtenidas con estas enzimas contienen habitualmente trehalosa, \alpha-glucosiltrehalosa, \alpha-maltosiltrehalosa, \alpha-maltotriosiltrehalosa, \alpha-maltotetraosiltrehalosa o \alpha-maltopentaosiltrehalosa. En el anterior proceso, cuando se usan en combinación, la presente enzima formadora de sacárido no reductor y enzima liberadora de trehalosa junto con una enzima de desramificación de almidón y ciclomaltodextrina glucanotransferasa producen característicamente una gran cantidad de trehalosa y un peso molecular relativamente menor de sacárido no reductor que tiene una estructura de trehalosa.

A partir de las mezclas de reacción resultantes se recogen sacáridos no reductores y composiciones de sacáridos con una menor capacidad de reducción. En estas etapas de producción, usadas convencionalmente para procesos se pueden seleccionar apropiadamente sacáridos. Las mezclas reacción resultantes se someten a filtración y centrifugación para eliminar sustancias insolubles y después, las soluciones resultantes se purifican mediante decoloración con un carbón vegetal activado, se precipitan con intercambiadores iónicos en forma H y OH y se concentran en productos de jarabe. Si es necesario, los productos de jarabe se pueden purificar adicionalmente hasta sacáridos no reductores con una pureza relativamente alta; en la purificación se pueden usar uno o más métodos, por ejemplo, fraccionamientos cromatográficos en columna tales como cromatografía en columna de intercambio iónico, cromatografía en columna usando un carbón activado o un gel de sílice; sedimentación de separación usando ácidos orgánicos tales como acetona y alcohol, separación usando membranas con una capacidad de separación apropiada; y tratamientos alcalinos para descomponer y eliminar los sacáridos reductores remanentes. En particular, la cromatografía en columna de intercambio iónico se puede usar de forma adecuada en la presente invención como una preparación a escala industrial de los sacáridos objeto. Se pueden preparar arbitrariamente sacáridos no reductores con una pureza mejorada mediante, por ejemplo, cromatografía en columna usando una resina de intercambio catiónico fuertemente ácida como se describe en las Patentes Japonesas Kokai 23.799/83 y 72.598/83 para eliminar sacáridos concomitantes. En este caso se puede emplear cualquier método de lecho fijo, lecho móvil y de semi-movimiento.

Si es necesario, los sacáridos no reductores resultantes o un sacárido relativamente poco reductor que contenga los sacáridos no reductores se pueden hidrolizar mediante amilasas tales como \alpha-amilasa, \beta-amilasa, glucoamilasa y \alpha-glucosidasa para controlar sabor dulce y poder reductor o para disminuir su viscosidad; y los productos obtenidos de este modo se pueden tratar además con procesamientos en los que los sacáridos reductores remanentes se hidrogenan hasta alcoholes de azúcar para disminuir su poder reductor. Particularmente se puede preparar de forma sencilla trehalosa dejando que glucoamilasa o \alpha-glucosidasa actúe sobre los sacáridos no reductores o los sacáridos relativamente poco reductores que contienen los sacáridos no reductores. Se puede obtener una fracción de alto contenido en trehalosa dejando que glucoamilasa o \alpha-glucosidasa actúe sobre estos sacáridos para formar una mezcla de trehalosa y glucosa y sometiendo la mezcla a los métodos de purificación que se han mencionado anteriormente, tales como cromatografía en columna usando intercambiadores iónicos para eliminar glucosa. La fracción de alto contenido en trehalosa se puede purificar y concentrar arbitrariamente hasta un producto de jarabe. Si es necesario, el producto de jarabe se puede concentrar hasta una solución supersaturada, seguido de cristalización de trehalosa cristalina hidratada o anhidra y recuperando el cristal resultante.

Para producir trehalosa cristalina hidratada se pone en una solución de aproximadamente el 65-90% p/p de trehalosa con una pureza de aproximadamente el 60% p/p o más en un cristalizador y, si es necesario, en presencia de un cristal de siembra del 0,1-20% p/v, se enfría gradualmente con agitación a una temperatura de 95ºC o inferior y preferiblemente a una temperatura de 10-90ºC para obtener una masa cocida que contiene trehalosa cristalina hidratada. Se puede usar arbitrariamente un método de cristalización continuo para realizar la cristalización en condiciones de concentración al vacío. Se pueden emplear métodos convencionales tales como separación, pulverización en bloque, granulación en lecho fluidizado y secado por pulverización en la invención para preparar a partir de la masa cocida trehalosa cristalina hidratada o sacáridos cristalinos que contienen el cristal de trehalosa.

En el caso de separación, las masas cocidas se someten habitualmente a una centrifuga de tipo cesta para separar la trehalosa cristalina hidratada de un licor madre y, si es necesario, la trehalosa cristalina hidratada se lava por pulverización con una pequeña cantidad de agua fría para facilitar la preparación de trehalosa cristalina hidratada con una mayor pureza. En el caso de secado por pulverización, los sacáridos cristalinos sin o sustancialmente libres de higroscopicidad se preparan de forma sencilla pulverizando las masas cocidas con una concentración del 70-85% p/p, en una base de sólidos seca (d.s.b.) y una cristalinidad de aproximadamente el 20-60%, d.s.b., de una boquilla por una bomba a alta presión; secando los productos resultantes con aire calentado a 60-100ºC que no funde los polvos cristalinos resultantes; y envejeciendo los polvos resultantes durante aproximadamente 1 a aproximadamente 20 horas con soplado sobre los mismos de aire calentado a 30-60ºC. En el caso de pulverización en bloque, los sacáridos cristalinos sin o sustancialmente libres de higroscopicidad se preparan de forma sencilla dejando las masas cocidas con un contenido de humedad del 10-20% p/p y una cristalinidad de aproximadamente el 10-60%, d.s.b., reposar durante aproximadamente 0,1 a aproximadamente 3 días para cristalinizar y solidificar todos los contenidos en bloques; y pulverizando o cortando los bloques resultantes.

Para producir trehalosa cristalina anhidra, la trehalosa cristalina hidratada obtenida anteriormente se seca a presión normal o disminuida a temperaturas de 70-160ºC, y preferiblemente a 80-100ºC; o una solución de trehalosa de concentración y contenido relativamente altos con un contenido en humedad de menos del 10% se pone en un cristalizador, se agita en presencia de un cristal de siembra a temperaturas de 50-160ºC y preferiblemente 80-140ºC para producir una masa cocida que contiene trehalosa cristalina anhidra y tratando la masa cocida con métodos tales como pulverización en bloque, granulación en lecho fluidizado y secado por pulverización a temperaturas relativamente altas y condiciones de secado.

Los sacáridos no reductores o la composición de sacáridos, que contienen los mismos con una capacidad de reducción relativamente baja, obtenidos de este modo son bajos en capacidad de reducción y satisfactorios en estabilidad; no se pardean, forman olores desagradables ni deterioran los otros materiales siguientes cuando se mezclan y procesan con otros materiales, por ejemplo, sustancias que contienen aminoácidos tales como aminoácidos, oligopéptidos y proteínas. Incluso con una capacidad de reducción relativamente baja, los sacáridos que se han identificado anteriormente tienen una viscosidad relativamente baja y los que tienen un grado de polimerización de glucosa promedio relativamente bajo tienen una calidad y sabor dulce relativamente altos. Estos sacáridos se pueden usar arbitrariamente en los campos de alimentación, cosméticos y farmacéuticos, etc., como se describe en las Patentes Japonesas Kokai Nº 66.187/96, 66.188/96, 73.482/96, 73.506/96, 73.504/96, 336.363/96, 9.986/97, 154.493/97, 252.719/97, 66.540/98 y 168.093/98; y las Solicitudes de Patente Japonesa Nº 236.441/97, 256.219/97, 268.202/97, 274.962/97, 320.519/97, 338.294/97, 55.710/98, 67.628/98, 134.553/98 y 214.375/98, que se solicitaron todas por el mismo solicitante de la presente solicitud.

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Los siguientes ejemplos describen con más detalle la presente invención:

Ejemplo 1

Microorganismo capaz de producir enzima formadora de sacárido no reductor y enzima liberadora de trehalosa

Los presentes inventores exploraron ampliamente tierras para aislar un microorganismo capaz de producir enzima formadora de sacárido no reductor y enzima liberadora de trehalosa. Como resultado, aislaron un microorganismo con una propiedad de este tipo de una tierra en Ako, Hyogo, Japón e identificaron los microorganismos de acuerdo con el método como se describe en "Biseibutsu-no-Bunrui-to-Dotei" (Clasificación e Identificación de Microorganismos) editado por Takeji Hasegawa, publicado por Japan Scientific Societies Press, Tokio, Japón (1985). Los resultados fueron los siguientes:

Resultados de morfología celular

(1): Características de células cuando se incuban a 37ºC en un caldo de agar nutriente

: Habitualmente existe una forma de bacilo de 0,4-0,5 x 0,8-1,2 \mum; existentes en una forma única pero existentes de forma poco común en una forma polimórfica;

: Sin motilidad;

: Asporogénicos;

: No ácido-resistente; y

: Tinción gram: positiva.

(2): Características de células cuando se incuban a 37ºC en agar nutriente EYG

: Muestran un ciclo de desarrollo de bacilos y cocos.

Resultados de Propiedades de Cultivo

(1): Características de colonia formada cuando se incuba a 37ºC en placa de caldo agar nutriente.

Forma:: colonia circular que tiene un diámetro de aproximadamente 1-2 mm después de 2 días de incubación;

: Borde: Entero;

: Proyección: Convexa;

: Brillo: Brillo húmedo;

: Superficie: Plana; y

: Color: Semi-transparente o crema.

(2): Característica de colonia formada cuando se incuba a 37ºC en tubo inclinado de agar nutriente

: Crecimiento: Satisfactorio; y

: Forma: Helicoidal.

(3): Características de colonia formada cuando se incuba a 37ºC en tubo inclinado de agar con extracto de levadura y peptona

: Crecimiento: Satisfactorio; y

: Forma: Helicoidal.

(4): Características de colonia formada cuando se cultiva a 27ºC en un caldo de gelatina nutriente

: No licua gelatina.

Resultados de Propiedades Fisiológicas

(1): Ensayo de rojo metilo: Negativo

(2): Ensayo VP: Positivo

(3): Formación de Indol: Negativo

(4): Formación de sulfuro de hidrógeno: Negativo

(5): Hidrólisis de almidón: Positivo

(6): Licuación de gelatina: Negativo

(7): Utilización de ácido cítrico: Positivo

(8): Utilización de fuente de nitrógeno inorgánico: utiliza nitrato pero no sales de amonio

(9): Formación de pigmento: No

(10): Ureasa: Negativo

(11): Oxidasa: Negativo

(12): Catalasa: Positivo

(13): Intervalo de crecimiento: crece a pH de 4,5-8,0 y temperaturas de 20-50ºC; y temperaturas óptimas de 30-45ºC.

(14): Requerimientos de oxígeno: Aerobio

(15): Utilización de fuentes de carbono

: L-Arabinosa: Asimilada

: D-Glucosa: Asimilada

: D- Fructosa: No asimilada

: D-Galactosa: No asimilada

: L-Ramnosa: No asimilada

: D-Xilosa: No asimilada

: D-Manosa: Asimilada

: Rafinosa: No asimilada

: Trehalosa: No asimilada

: Sacarosa: No asimilada

: Maltosa: No asimilada

: Lactosa: No asimilada

: D-Dulcitol: No asimilado

: D-Manitol: No asimilado

: Ácido glucónico: Asimilado

: Ácido Succínico. Asimilado

: Ácido nicotínico: No asimilado

: Ácido L-maleico: Asimilado

: Ácido acético: Asimilado

: Ácido láctico: Asimilado

(16): Formación de ácido de azúcares

: L-Arabinosa: Ligeramente formada

: D-Glucosa: Ligeramente formada

: D-Fructosa: No formada

: D-Galactosa: Ligeramente formada

: L-Ramnosa: Ligeramente formada

: D-Xilosa: Ligeramente formada

: Glicerol: Ligeramente formado

: Rafinosa: No formada

: Trehalosa: Ligeramente formada

: Sacarosa: Ligeramente formada

: Maltosa: Ligeramente formada

: Lactosa: No formada

(17): Utilización de aminoácidos

: No utiliza L-glutamato sódico, L-aspartato sódico, L-histidina y L-arginina.

(18): Ensayo de descarboxilasa sobre aminoácido

: Negativo frente a L-lisina, L-ornitina y L-arginina.

(19): ADNasa: Negativo

(20): Tipo N-acilo de pared celular: Acetilo

(21): Diaminoácido principal de pared celular: Lisina

(22): % en mol de guanina (G) más citosina (C) de ADN: 71,2%.

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Estas propiedades bacteriológicas se compararon con las de microorganismos conocidos con referencia a Bergey's Manual of Systematic Bacteriology, Vol. 2 (1984). Como resultado se describió que el microorganismo identificado era uno novedoso del género Arthrobacter. En base a los resultados, los presentes inventores denominaron este microorganismo "Arthrobacter sp. S34". Los microorganismos se depositaron y aceptaron el 6 de agosto de 1998, con el número de entrada de FERM BP-6450 en y por el Microorganism Depository, National Institute of Bioscience and Human-Technology Agency of Industrial Science & Technology, Ministry of International Trade & industry, 1-3, Higashi, 1 chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken 305-8566, Japón.

La homología del ADN entre el microorganismo identificado y las cepas tipo del género Arthrobacter, depositados en la Colección Americana de Cultivos Tipo (ATCC), un depósito internacional de microorganismo en EEUU, se examinó de acuerdo con el método de hibridación ADN-ADN en Bergey's Manual of Systematic Bacteriology, Vol. 1 (1984). Se cultivaron respectivamente doce cepas tipo mostradas en la Tabla 1 a continuación de un modo habitual y se recuperaron las células proliferadas a partir de los cultivos resultantes. Se cultivó Arthrobacter sp. S34, FERM BP-6450, por el método de cultivo por siembra en el Ejemplo 2-1 descrito más adelante, seguido de recogida de las células proliferadas. De acuerdo con el método convencional, se obtuvieron ADN de cada cepa tipo de microorganismos, se digirieron alícuotas de dos microgramos de los ADN con una enzima de restricción, Pst I. Las mezclas digeridas resultantes se aplicaron respectivamente de forma puntual sobre "Hybond-N+", una membrana de nylon comercializada por Amersham International, Arlington Heights, IL, EEUU, y se trató de forma habitual con una base, se neutralizó y se secó para fijar los ADN sobre la membrana de nylon. Se proporcionó un microgramo del ADN obtenido de Arthrobacter sp. S34, FERM BP-6450, y se digirió con Pst I. Usando dCTP [\alpha-^{32}P] comercializado por Amersham International, Arlington Heigthts, IL, EEUU y "READY-TO-GO DNA-LABELLING KIT", un kit de marcado de ADN comercializado por Pharmacia LKB Biotechnology AB; Uppsala, Suecia, el producto de digestión se marcó con un isótopo para obtener una sonda. La sonda y el ADN anterior fijado sobre película de nylon se hibridaron durante dos horas con condiciones de agitación a 65ºC en "RAPID HYBRIDIZATION BUFFER", un tampón para hibridación comercializado por Amersham Corp., Div., Amersham International, Arlington Heights, IL, EEUU. La película de nylon se lavó después de la hibridación de un modo habitual, se secó y se sometió a autorradiografía de un modo habitual. Las señales de hibridación observadas sobre la radiografía se analizaron con "IMAGE MASTER", un sistema de análisis de imágenes comercializado por Pharmacia LKB Biotechnology AB, Uppsala, Suecia, seguido de expresión numéricamente de la intensidad de las señales para la hibridación. En base a los números se calcularon las intensidades relativas (%) de los puntos para los ADN obtenidos de las cepas tipo teniendo en cuenta la intensidad de señal de un punto para el ADN de Arthrobacter sp. S34, FERM BP-6450, como 100 y se usó como índice para la homología de ADN entre el microorganismo y las cepas tipo. Los resultados están en la Tabla 1.

TABLA 1

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1

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Como se muestra en la Tabla 1, la intensidad de señal de hibridación para el punto de ADN de la cepa tipo Arthrobacter ramosus, ATCC 13727, era tal alta como el 98,6%. Los datos mostraron que Arthrobacter sp. S34, FERM BP-6450 tenía la mayor homología con la cepa tipo Arthrobacter ramosus, ATCC 13727, entre las 12 cepas tipo usadas en este Ejemplo. Los resultados anteriores muestran que Arthrobacter sp. S34, FERM BP-6450 es un microorganismo novedoso muy relacionado con la cepa tipo Arthrobacter ramosus, ATCC 13727.

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Ejemplo 2

Enzima formadora de sacárido no reductor

Ejemplo 2-1

Preparación de enzima

Se preparó un medio de cultivo nutriente, que consistía en "PINE-DEX #4" al 1,0% p/v, una dextrina comercializada por Matsutani Chemical Ind., Tokio, Japón, peptona al 0,5% p/v, extracto de levadura al 0,1% p/v, fosfato monosódico al 0,1% p/v, hidrógeno fosfato dipotásico al 0,06% p/v, sulfato de magnesio al 0,05% p/v y agua y se ajustó a pH 7,0. Se pusieron alícuotas de aproximadamente 100 ml en matraces Erlenmeyer de 500 ml que después se sometieron a autoclave a 120ºC durante 20 min y se enfriaron, seguido de una inoculación de un inóculo de Arthrobacter sp. S34, FERM BP-6450 y un cultivo a 37ºC durante 48 horas en condiciones de agitación de 260 rpm para obtener un cultivo de siembra.

Excepto por contener el 0,05% de p/v de "KM-75", un antiespumante comercializado por Shin-Etsu Chemical, Co., Ltd, Tokio, Japón, aproximadamente 20 l del mismo medio de cultivo nutriente que el usado en el cultivo de siembra se puso en un fermentador de 30 l, se esterilizó, se enfrió a 37ºC y se inoculó con un % p/v del cultivo de siembra al medio, seguido de una incubación a 37ºC y pH de 5,5-7,5 durante aproximadamente 72 horas en condiciones de agitación en aerobiosis.

Una parte del cultivo resultante se muestreó, centrifugó para separar en células y un sobrenandante de cultivo. Las células se rompieron ultrasónicamente y centrifugaron para recoger el sobrenadante de un extracto celular. El ensayo para actividad de enzima formadora de sacárido no reductor en cada sobrenadante de cultivo y extracto celular mostró que el primero mostró una actividad de enzima relativamente baja y el último mostró aproximadamente 0,1 unidades con respecto a un mililitro de cultivo.

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Ejemplo 2-2

Purificación de la enzima

Aproximadamente 80 l de un cultivo, obtenidos de acuerdo con el método en el Ejemplo 2-1, se centrifugaron a 8.000 rpm durante 30 min para obtener aproximadamente 800 g de células por peso húmedo. Las células se suspendieron en dos litros de tampón fosfato 10 M (pH 7,0) y se trataron con "MODEL UH-600", un homogeneizador ultrasónico comercializado por SMT Co., Tokio, Japón. La solución resultante se centrifugó a 10.000 rpm durante 30 min para obtener solamente 2 l de sobrenadante de cultivo. Al sobrenadante de cultivo se añadió y disolvió sulfato de amonio para dar un grado de saturación de 0,07 y la mezcla se dejó reposar a 4ºC durante 24 horas y centrifugó a 10.000 rpm durante 30 min para obtener un precipitado. El precipitado obtenido de este modo se disolvió en tampón fosfato 10 mM (pH 7,0) y se dializó frente a una preparación fresca del mismo tampón que anteriormente durante 48 horas, seguido de centrifugación de la solución interna dializada a 10.000 rpm durante 30 min para eliminar sustancias insolubles. Aproximadamente un litro de la solución resultante se sometió a una cromatografía en columna de intercambio de usando una columna llena con aproximadamente 1,3 l de "SEPABEADS FP-DA13 GEL" un intercambiador aniónico comercializado por Mitsubishi Chemical Industries LTd., Tokio, Japón. La etapa de elución se realizó usando un tampón de gradiente lineal de tampón fosfato 10 mM (pH 7,0) que contenía la sal que aumentaba de 0 M a 0,6 M. El eluato de la columna se fraccionó y las fracciones se ensayaron respectivamente para actividad de enzima formadora de sacárido no reductor. Como resultado, se observó actividad de enzima marcadamente en fracciones eluídas con tampón que tenía una concentración salina de aproximadamente 0,2 M, seguido de combinación de las
fracciones.

Se añadió sulfato de amonio a la solución resultante para dar una concentración de 1 M, y la mezcla se dejó reposar a 4ºC durante 12 horas, se centrifugó a 10.000 rpm durante 30 min para recoger un sobrenadante. El sobrenadante obtenido de este modo se sometió a cromatografía en columna hidrófoba usando una columna llena con "BUTYL TOYOPEARL 650M GEL", un gel hidrófobo comercializado por Tosoh Corporation, Tokio, Japón. El volumen de gel usado fue de aproximadamente 300 ml y se usó después de equilibrado con tampón fosfato 10 mM (pH 7,0) que contenía sulfato de amonio 1 M. La etapa de elución se realizó usando un tampón de gradiente lineal de tampón fosfato 10 mM (pH 7,0) que contenía sulfato de amonio que disminuía de 1 M a 0 M durante el suministro. El eluato de la columna se fraccionó y las fracciones se ensayaron respectivamente para actividad de enzima formadora de sacárido no reductor. Como resultado, la actividad de enzima se observó de forma marcada en fracciones eluídas con tampón que tenía una concentración salina de aproximadamente 0,75 M, seguido de combinación de las
fracciones.

La solución resultante se dializó frente a tampón fosfato 10 mM (pH 7,0), y la solución interna dializada resultante se centrifugó a 10.000 rpm durante 30 min para recoger un sobrenadante, seguido de sometimiento del sobrenandante a cromatografía en columna de intercambio iónico usando una columna llena con aproximadamente 40 ml de "DEAE TOYOPEARL 650S GEL", un intercambiador aniónico comercializado por Tosoh Corporation, Tokio, Japón. La etapa de elución se realizó usando una solución salina acuosa lineal que aumentaba de 0 M a 0,2 M durante el suministro. Se fraccionó el eluato de la columna y las fracciones se ensayaron respectivamente para actividad de enzima formadora de sacárido no reductor. Como resultado se observó actividad de enzima marcadamente en fracciones eluídas con tampón que tenía una concentración salina de aproximadamente 0,15 M, seguido de combinación de las fracciones. La solución resultante se sometió además a cromatografía en columna de filtración en gel usando una columna llena con aproximadamente 380 ml de "ULTROGEL® AcA44 GEL", un gel para cromatografía en columna de filtración en gel comercializada por Sepracor/IBF s.a. Villeneuve la Garenne, Francia, seguido de recogida de las fracciones con la actividad de enzima deseada. El nivel de la actividad de enzima formadora de sacárido no reductor, actividad específica y rendimientos en las etapas anteriores de purificación están en la Tabla 2.

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(Tabla pasa a página siguiente)

2

La solución eluída y recogida de la anterior cromatografía de filtración en gel se sometió de un modo habitual a electroforesis usando gel de poliacrilamida al 7,5% p/v y dio como resultado una única banda de proteína. Los datos muestran que el eluato de la cromatografía de filtración en gel era una muestra purificada de una enzima formadora de sacárido no reductor purificada hasta una forma electroforéticamente homogénea.

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Ejemplo 2-3

Propiedad de enzima

Ejemplo 2-3(a)

Acción

Se preparó una solución acuosa al 20% que contenía glucosa, maltosa, maltrotriosa, maltotetraosa, maltopentaosa, maltohexaosa o maltoheptaosa como un sustrato para enzima, se mezcló con dos unidades/g de sustrato, d.s.b., de una muestra purificada de una enzima formadora de sacárido no reductor obtenida mediante el método en el Ejemplo 2-2, y se hizo reaccionar enzimáticamente a 50ºC y pH 6,0 durante 48 horas. La mezcla de reacción se precipitó con sales y analizó en cromatografía líquida de alto rendimiento (abreviada en lo sucesivo en este documento "HPLC") usando dos columnas de "MCI GEL CK04SS COLUMN", comercializado por Mitsubishi Chemical Industries Ltd., Tokio, Japón, que se realizó en series, seguido de determinación de la composición de sacáridos de la mezcla de reacción. Las condiciones y los aparatos usados en la HPLC eran los siguientes: la columna se mantuvo a 85ºC usando "CO-8020", un horno de columna comercializado por Tosoh Corporation, Tokio, Japón. Se suministró agua como una fase móvil a un caudal de 0,4 ml/min. El eluato se analizó en "RI-8020", un refractómetro diferencial comercializado por Tosoh Corporation, Tokio, Japón. Los resultados están en la Tabla 3.

TABLA 3

3

Como es evidente a partir de los resultados en la Tabla 3, cada producto de reacción consistía esencialmente en el sustrato remanente y un sacárido no reductor formado de forma reciente de \alpha-glucosiltrehalosa, \alpha-maltosiltrehalosa, \alpha-maltotriosiltrehalosa, \alpha-maltotetraosiltrehalosa o \alpha-maltopentaosiltrehalosa (en la Tabla 3, se expresa como glucosiltrehalosa, maltosiltrehalosa, maltotriosiltrehalosa, maltotetraosiltrehalosa o maltopentaosiltrehalosa). No se detectaron sustancialmente otros sacáridos en la mezcla de reacción. Teniendo en cuenta y evaluando el porcentaje de sacárido no reductor en cada producto de reacción como un rendimiento de producción, se mostró que el rendimiento de \alpha-glucosiltrehalosa que tenía un grado de polimerización de glucosa de 3 era relativamente bajo y el rendimiento de las que tenían un grado de polimerización de glucosa de 4 o más tales como \alpha-maltosiltrehalosa, \alpha-matotriosiltrehalosa, \alpha-maltotetraosiltrehalosa y \alpha-maltopentaosiltrehalosa era tan alto como aproximadamente el 85% o más. No se observó formación de sacárido no reductor a partir de glucosa y maltosa.

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Ejemplo 2-3 (b)

Peso molecular

Se sometió una muestra purificada de una enzima formadora de sacárido no reductor, obtenida mediante el método en el Ejemplo 2-2, a SDS-PAGE usando gel de poliacrilamida al 10% p/v de un modo habitual en paralelo con marcadores moleculares comercializados por Japan Bio-Rad Laboratories, Tokio, Japón. En comparación con las posiciones de los marcadores moleculares después de electroforesis, la enzima formadora de sacárido no reductor mostró un peso molecular de aproximadamente 75.000 \pm 10.000 daltons.

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Ejemplo 2-3(c)

Punto isoeléctrico

Una muestra purificada de una enzima formadora de sacárido no reductor, obtenida mediante el método en el Ejemplo 2-2, se sometió a isoelectroforesis usando un gel de poliacrilamida que contenía "AMPHOLINE" al 2% p/v, un anfolito, comercializado por Pharmacia LKB Biotechnology AB, Uppsala, Suecia. Después de la isoelectroforesis, la medición del pH del gel mostró que la enzima formadora de sacárido no reductor tenía un punto isoeléctrico de aproximadamente 4,5 \pm 0,5.

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Ejemplo 2-3(d)

Temperatura y pH óptimos

Usando una muestra purificada de una enzima formadora de sacárido no reductor, obtenida mediante el método en el Ejemplo 2-2, se examinó la influencia de la temperatura y el pH sobre la actividad de la enzima formadora de sacárido no reductor. Cuando se examinó la influencia de la temperatura, se realizó de forma similar al ensayo para actividad enzimática excepto porque se hizo reaccionar la enzima a diferentes temperaturas. En el examen de la influencia del pH, se realizó de forma similar al ensayo para la actividad enzimática excepto porque se hizo reaccionar la enzima a diferentes pH usando tampones 20 mM apropiados. En cada examen se calculó un valor relativo (%) de un nivel disminuido de poder reductor de sustrato en cada sistema de reacción hasta su actividad enzimática relativa correspondiente (%). La Figura 1 muestra un resultado de la influencia de la temperatura y la Figura 2, de su pH. Las abscisas en las Figuras 1 y 2 muestran las temperaturas de reacción y los pH de reacción, respectivamente. Como se muestra en la Figura 1, la temperatura óptima de la enzima era de aproximadamente 50ºC cuando se incubó a pH 6,0 durante 60 min. Como también se muestra en la Figura 2, el pH óptimo de la enzima era un pH de aproximadamente 6,0 cuando se incubó a 50ºC durante 60 min.

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Ejemplo 2-3(e)

Estabilidades Térmicas y a pH

Usando una muestra purificada de una enzima formadora de sacárido no reductor obtenida mediante el método en el Ejemplo 2-2, se examinaron las estabilidades térmicas y a pH de la enzima. La estabilidad térmica se examinó diluyendo la muestra con tampón fosfato 20 mM (pH 7,0), incubando las diluciones a temperaturas pre-establecidas durante 60 min, enfriando las diluciones incubadas y determinando la actividad enzimática remanente en las diluciones de acuerdo con el método para el ensayo de la actividad enzimática. La estabilidad a pH de la enzima se examinó diluyendo la muestra con tampones 50 mM con pH diferentes apropiados, incubando las diluciones a 4ºC durante 24 horas, ajustando las diluciones a pH 6 y determinando la actividad enzimática remanente en las diluciones de acuerdo con el método del ensayo para la actividad enzimática. Los resultados de las estabilidades térmicas y a pH de la enzima se muestran respectivamente en las Figuras 3 y 4. Las abscisas en las Figuras 3 y 4 muestran las temperaturas de incubación y los pH para la enzima, respectivamente. Como se muestra en la Figura 3 la enzima era estable hasta aproximadamente 55ºC y era estable a pH en el intervalo de aproximadamente 5,0 a aproximadamente 10,0 como se muestra en la Figura 4.

Estos resultados evidencian que la enzima formadora de sacárido no reductor, obtenida mediante el método en el Ejemplo 2-2, es la presente enzima formadora de sacárido no reductor que tiene una temperatura óptima en un intervalo de temperaturas medio.

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Ejemplo 2-4

Secuencia de aminoácido parcial

Una parte de una muestra purificada de una enzima formadora de sacárido no reductor, obtenida mediante el método en el Ejemplo 2-2, se dializó frente a agua destilada para obtener aproximadamente 80 \mug de una muestra en peso como una proteína para analizar la secuencia de aminoácidos N-terminal. Usando "PROTEIN SEQUENCER MODEL 473A", un secuenciador de proteína comercializado por Applied Biosystems, Inc., Foster City, Estados Unidos, se analizó la secuencia de aminoácidos N-terminal hasta 20 restos aminoacídicos del extremo N. La secuencia de aminoácidos N-terminal descrita era la secuencia de aminoácidos parcial de la SEC ID Nº: 4. Una parte de una muestra purificada de una enzima formadora de sacárido no reductor, obtenida mediante el método en el Ejemplo 2-2, se dializó con tampón Tris-HCl 10 mM (pH 9,0) y se concentró de un modo habitual hasta una solución de aproximadamente un mg/ml usando "ULTRACENT-30", una membrana de ultrafiltración comercializada por Tosoh Corporation, Tokio, Japón. A 0,2 ml del concentrado se añadieron 10 \mug de "TPCK-TRYPSIN", un reactivo de tripsina comercializado por Wako Pure Chemical Industries, Ltd., Tokio, Japón, se dejó reaccionar a 30ºC durante 22 horas para digerir la enzima para formar péptidos. Los péptidos se separaron sometiendo la mezcla de reacción a HPLC de fase inversa usando "COLUMNA \mu BONDASPHERE C18" que tiene un diámetro de 3,9 mm y una longitud de 150 mm, un producto de Waters Chromatography Div., MILLIPORE Corp., Milford, Estados Unidos. La etapa de elución se realizó a temperatura ambiente suministrando a la columna una solución acuosa que contenía trifluoroacetato a 0,1% v/v y acetonitrilo aumentando del 24 a 48% v/v durante 60 min durante el suministro a un caudal de 0,9 ml/min. Los péptidos eluídos de la columna se detectaron controlando la absorbancia a una longitud de onda de 210 nm. Dos péptidos, que se separaron bien de los demás, es decir, "S5" eluyó a un tiempo de retención de aproximadamente dos horas y "S8" se eluyó a un tiempo de retención de aproximadamente 30 minutos, se separaron, se secaron respectivamente al vacío y se disolvieron en soluciones de acetonitrilo acuosas al 50% v/v que contenían 50 \mul de trifluoroacetato al 0,1% v/v. Las soluciones de péptidos se sometieron al secuenciador de proteínas para analizar hasta 20 residuos aminoacídicos. Para los péptidos "S5" y "S8" se obtuvieron las secuencias de aminoácidos de las SEC ID Nº: 5 y 6.

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Ejemplo 3

ADN que codifica enzima formadora de sacárido no reductor

Ejemplo 3-1

Construcción y exploración de la genoteca

Excepto por la temperatura de ajuste y el tiempo para el cultivo que se ajustaron respectivamente a 27ºC y 24 horas, Arthrobacter sp. S34, FERM BP-6450 se cultivó de forma similar al Ejemplo 2-1.

El cultivo se centrifugó para eliminar las células que se suspendieron después en una cantidad adecuada de solución salina tamponada con sal Tris-EDTA (denominada en lo sucesivo en este documento un "tampón TES") (pH 8,0), se mezcló con lisozima en una cantidad del 0,05% p/v a la suspensión celular en volumen, seguido de una incubación a 37ºC durante 30 min. La mezcla resultante se congeló dejando reposar a -80ºC durante una hora y después se mezcló y agitó suficientemente con una mezcla de tampón TES y fenol precalentado a 60ºC, se enfrió y se centrifugó para recoger el sobrenadante formado. Al sobrenadante se añadió etanol frío y después se recogió el sedimento formado, se disolvió en una cantidad adecuada de tampón SSC (pH 7,1), se mezcló con 7,5 \mug de ribonucleasa y 125 \mug de proteasa y se incubó a 37ºC durante una hora. La mezcla resultante se mezcló y agitó con cloroformo/alcohol isoamilo, se dejó reposar, seguido de recogida de la capa superior formada, añadiendo etanol frío a la capa y recogiendo el sedimento formado. El sedimento se lavó con etanol frío 70 v/v, se secó al vacío para obtener un ADN, seguido de disolución en tampón SSC (pH 7,1) para dar una concentración de aproximadamente un mg/ml y congelando a -80ºC.

Se proporcionaron cincuenta microlitros del ADN, se mezclaron con aproximadamente 50 unidades de KpnI como una enzima de restricción y se incubaron a 37ºC durante una hora para digerir el ADN. Tres microgramos del ADN digerido y 0,3 microgramos del "pBluescript II SK (+)", un vector plasmídico comercializado por Stratagene Cloning Systems, California, Estados Unidos, se pesaron, sometieron a la acción, se ligaron usando "DNA LIGATION KIT", comercializado por Takara Shuzo Co., Ltd., Tokio, Japón, de acuerdo con el protocolo adjunto al kit. De acuerdo con el método de célula competente convencional se transformaron 100 \mul de "Epicurian Coli XL1-Blue", un cepa de Escherichia coli comercializada por Stratagene Cloning Systems, California, Estados Unidos, con el producto ligado. De este modo se obtuvo una genoteca.

La genoteca obtenida de este modo se inoculó en un medio de placa con nutrientes agar (pH 7,0) que contenía 10 g/l de tristona, 5 g/l de extracto de levadura, 5 g/l de cloruro sódico, 75 mg de sal sódica de ampicilina y 50 mg/l de 5-bromo-4-cloro-indolil-\beta-galactósido y se incubaron a 37ºC durante 18 horas. Aproximadamente 5.000 colonias blancas formadas en el medio se fijaron de un modo habitual sobre "HYBOND-N-+", una película de nylon comercializada por Amersham Corp., Div. Amersham Internacional, Arlington Heights, IL, Estados Unidos. En base a los 1-8 restos aminoacídicos en la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 5 mostrada en el Ejemplo 2-4, se sintetizó químicamente un oligonucleótido que tenía la secuencia de nucleótidos de la SEC ID Nº: 18 y se marcó de un modo habitual con [\gamma-^{32}P] ATP y polinucleótido quinasa T4 para obtener una sonda. Usando la sonda, las colonias, que se habían fijado sobre la película de nylon y obtenidas previamente, se exploraron por el método de hibridación de colonias convencional. La hibridación se realizó a 65ºC durante 16 horas en una solución para hibridación que contenía SSC 6x, solución de Denhart 5x y 100 mg/l de ADN de esperma de salmón desnaturalizado. La anterior película de nylon se lavó después de la hibridación con SSC 6x a 65ºC durante 30 minutos y se lavó además con SSC 2x que contenía SDS al 0,1% p/v a 65ºC durante dos horas. La película de nylon resultante se sometió de un modo habitual a autorradiografía y después, en base a las señales observadas en la autorradiografía, se seleccionó una colonia que hibridó fuertemente con la sonda y se denominó "GY1" como un transformante.

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Ejemplo 3-2

Descodificación de la secuencia de nucleótidos

De acuerdo con el modo convencional, el transformante GY1 se inoculó en un caldo L (pH 7,0) que contenía 100 \mug/ml de ampicilina en una forma sódica y se cultivó a 37ºC durante 24 horas en condiciones con agitación. Después de la finalización del cultivo, las células que habían proliferado se recogieron del cultivo por centrifugación y se trataron con el método de base-SDS convencional para extraer un ADN recombinante. El ADN recombinante se denominó pGY1. Usando la anterior sonda, el ADN recombinante, pGY1, se analizó con técnica convencional de transferencia de Southern y en base a los datos analíticos se construyó un mapa de restricción como se muestra en la Figura 5. Como se muestra en la Figura 5 se mostró que el ADN recombinante, pGY1, contenía una secuencia de nucleótidos que consistía en bases de aproximadamente 5.500 pares de bases (pb) de Arthrobacter sp. S34, FERM BP-6450, expresado con una línea en negrita y que el ADN recombinante contenía una secuencia de nucleótidos que codificaba la presente enzima formadora de sacárido no reductor, como se indica con una flecha negra dentro del área de la línea en negrita, en el área que consiste en bases de aproximadamente 4.000 pb entre dos sitios de reconocimiento para una enzima de restricción, EcoRI. En base al resultado, el ADN recombinante, pGY1, se digirió completamente con EcoRI y después se separó un fragmento de ADN de aproximadamente 4.000 pb y se purificó usando electroforesis en gel de agarosa convencional. El fragmento de ADN y "pBluescript II SK (+)", un vector plasmídico comercializado por Stratagene Cloning Systems, California, Estados Unidos, que se había digerido previamente con EcoRI, se ligaron con el método de ligación convencional. Con el producto ligado se transformó "XL1-BLUE", una cepa de Escherichia coli comercializada por Stratagene Cloning Systems, California, Estados Unidos, para obtener un transformante. Se extrajo un ADN recombinante del transformante de un modo habitual, confirmando de un modo habitual que contenía el fragmento de ADN que se ha mencionado anteriormente que consistía en aproximadamente 4.000 pb y se denominó "pGY2". El transformante con "pGY2" introducido se denominó "GY2".

El análisis de la secuencia de nucleótidos del ADN recombinante pGY2 con el método didesoxi convencional mostró que contenía la secuencia de nucleótidos de la SEC ID Nº: 19 que consistía en las bases de 3252 pb obtenidas de Arthrobacter sp. S34, FERM BP-6450. La secuencia de nucleótidos codifica la secuencia de aminoácidos como se muestra en paralelo en la SEC ID Nº: 19. Comparando las secuencias de aminoácidos de las SEC ID Nº: 4 a 6 como secuencias de aminoácidos parciales de la presente enzima formadora de sacárido no reductor confirmada en el Ejemplo 2-4, las secuencias de aminoácidos de las SEC ID Nº: 4 a 6 coincidían perfectamente con los aminoácidos 2-21, 619-638 y 98-117 en la SEC ID Nº: 19. Estos datos indican que la presente enzima formadora de sacárido no reductor obtenida en el Ejemplo 2 consiste en los aminoácidos 2-757 de la SEC ID Nº: 19 o tiene la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 1 y que la enzima de Arthrobacter sp. S34, FERM BP-6450 está codificada por una secuencia de nucleótidos de las bases 746-3013 de la SEC ID Nº: 19 o codificada por la secuencia de nucleótidos de la SEC ID Nº: 7. La estructura del ADN recombinante pGY2 está en la Figura 6.

La secuencia de aminoácidos que se ha identificado anteriormente de la presente enzima formadora de sacárido no reductor obtenida por el método en el Ejemplo 2 y las secuencias de aminoácidos de enzimas conocidas que tienen una actividad formadora de sacárido no reductor se compararon usando "GENETYX-MAC, VER. 8", un programa informático disponible en el mercado comercializado por Software Development Co., Ltd., Tokio, Japón, de acuerdo con el método de Lipman, David J. en Science, Vol. 227, págs. 1.435-4.441 (1985) para calcular su homología (%). Las enzimas usadas como enzimas conocidas eran las de Arthrobacter sp. Q36 y Rhizobium sp. M-11 descritas en la Patente Japonesa Kokai Nº 322.883/95; Sulfolobus acidocaldarius, ATCC 33909, descrito en la Patente Japonesa Kokai Nº 84.586/96; y Sulfolobus solfataricus KM1 descrito en Sai-Kohyo Nº WO 95/34642. Como se ha descrito en las anteriores publicaciones, las enzimas convencionales tienen temperaturas óptimas diferentes de un intervalo de temperaturas medio. La información de las secuencias de aminoácidos de las enzimas convencionales se puede obtener de GeneBank, una base de datos de ADN producida por el Instituto Nacional de Salud (NIH), Estados Unidos, con los números de entrada D63346, D64128, D78001 y D83245. Las homologías obtenidas están en la tabla 4.

TABLA 4

4

Como se muestra en la Tabla 4, la presente enzima formadora de sacárido no reductor en el Ejemplo 2 mostró la mayor homología de aminoácidos del 56,9% con la enzima de Rhizobium sp. M-11 entre enzimas convencionales con temperaturas óptimas fuera de un intervalo de temperaturas medio. Los datos indican que la presente enzima formadora de sacárido no reductor comprende generalmente una secuencia de aminoácidos con una homología de al menos el 57% con la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 1. El resultado de comparación de la secuencia de aminoácidos mostró que la enzima en el Ejemplo 2 y los cuatro tipos identificados anteriormente de enzimas convencionales tienen secuencias de aminoácidos comunes de las SEC ID Nº: 2 y 3. La enzima en el Ejemplo 2 tiene secuencias de aminoácidos parciales de las SEC ID Nº: 2 y 3 ya que se corresponden con los aminoácidos 84-89 y 277-282 en la SEC ID Nº: 1. Los cuatro tipos de enzimas usados como referencias tienen las anteriores secuencias de aminoácidos parciales que se colocan en sus partes correspondientes. En base al hecho de que cualquiera de la presente enzima en el Ejemplo 2 y las enzimas como referencias tienen una actividad común de formación de sacáridos no reductores que tienen una estructura de trehalosa como una unidad terminal a partir de hidrolizados de almidón parciales reductores, se indicó que las secuencias de aminoácidos parciales de las SEC ID Nº: 2 y 3 se correlacionaban con la expresión de una actividad enzimática de este tipo. Estos resultados muestran que la presente enzima formadora de sacárido no reductor se puede caracterizar por que comprende las secuencias de aminoácidos de las SEC ID Nº: 2 y 3 y tiene una temperatura optima en un intervalo de temperaturas medio.

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Ejemplo 3-3

Transformante con ADN introducido

En base a los extremos 5' y 3' de la secuencia de nucleótidos de la SEC ID Nº: 7 se sintetizó químicamente un oligonucleótido de las secuencias de nucleótidos de las SEC ID Nº: 20 y 21 de un modo habitual. Como cebadores con sentido y antisentido se mezclaron 85 ng de cada uno de los oligonucleótidos y 100 ng del ADN recombinante pGY2 en el Ejemplo 3-2 como un molde en un tubo de reacción y la mezcla se mezcló con 1,25 unidades de "PYROBEST", una muestra de ADN polimerasa termoestable comercializada por Takara Shuzo Co., Ltd., Tokio, Japón, junto con 5 \mul de un tampón fijado con la muestra y 4 \mul de una mezcla de dNTP. La mezcla resultante se llevó hasta un volumen de 50 \mul con agua destilada esterilizada para realizar la PCR. La temperatura para la PCR se controló de un modo tal que la mezcla se trató con 25 ciclos de incubaciones sucesivas de 95ºC durante un minuto, 98ºC durante 20 segundos, 70ºC durante 30 segundos y 72ºC durante cuatro minutos y se incubó finalmente a 72ºC durante 10 min. Un ADN como un producto de PCR se recogió de un modo habitual para obtener un ADN de aproximadamente 2.300 pb. El ADN obtenido de este modo se mezcló con "pKK223-3", un vector plasmídico comercializado por Pharmacia LKB Biotechnology AB, Uppsala, Suecia, que se había escindido previamente con una enzima de restricción, EcoRI y unido por extremos romos por "DNA BLUNTING KIT" comercializado por Takara Shuzo Co., Ltd., Tokio, Japón, y se ligó por el método de ligación convencional. Después de esto, el producto ligado se trató de un modo habitual para obtener un ADN recombinante con el anterior ADN introducido que consistía en bases de aproximadamente 2.300 pb. La descodificación del ADN recombinante mostró que comprendía una secuencia de nucleótidos a la que se añadieron respectivamente dos secuencias de nucleótidos de 5'-ATG-3' y 5'-TGA-3' a los extremos 5' y 3' de la secuencia de nucleótidos de la SEC ID Nº: 7. El ADN se denominó "pGY3". La estructura del ADN recombinante pGY3 está en la Figura 7.

El ADN recombinante pGY3 se introdujo de un modo habitual en una cepa LE 392 de Escherichia coli, ATCC 33572, que se había hecho competente de un modo convencional para obtener un transformante. Se aplicó el método convencional de base-SDS para el transformante para extraer un ADN y después se confirmó que el ADN extraído era pGY3 de un modo habitual y se denominó "GY3". Por tanto, a un transformante se introduce un ADN que codifica la presente enzima formadora de sacárido no reductor.

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Ejemplo 3-4

Transformante con ADN introducido

En base a una secuencia de nucleótidos cadena abajo del extremo 3' de un promotor en "pKK223-3", un vector plasmídico comercializado por Pharmacia LKB Biotechnology AB, Uppsala, Suecia, se sintetizó un oligonucleótido que tenía las secuencias de nucleótidos de las SEC ID Nº: 22 y 23 de un modo convencional y se fosforilaron sus extremos 5' usando polinucleótido quinasa T4. El oligonucleótido fosforilado se hibridó, ligó con "pKK223-3", un vector plasmídico comercializado por Pharmacia LKB Biotechnology AB, Uppsala, Suecia, que se había escindido previamente con enzimas de restricción de EcoRI y PstI, mediante el método de ligación convencional. De acuerdo con el método convencional, el producto ligado se introdujo en una cepa de Escherichia coli que después se cultivó y trató con el método de base-SDS para extraer un ADN. El ADN obtenido de este modo tenía una estructura similar a un vector plasmídico "pKK223-3" y tenía sitios de reconocimiento para enzimas de restricción de EcoRI, XbaI, SpeI y PstI cadena abajo del promotor. Los presentes inventores denominaron el ADN un vector plasmídico
"pKK4".

De forma similar al Ejemplo 3-3 se realizó PCR excepto por el uso de oligonucleótidos con las secuencias de nucleótidos de las SEC ID Nº: 24 y 25, que se habían sintetizado químicamente en base a las secuencias de nucleótidos parciales 5'- y 3'-terminales de la SEC ID Nº: 7. Se recogió un ADN como un producto de PCR de un modo habitual para obtener un ADN de aproximadamente 2.300 pb. El ADN obtenido de este modo se escindió con enzimas de restricción, XbaI y SpeI y el anterior vector plasmídico pKK4, que se había escindido con XbaI y SpeI, se ligaron por el método de ligación convencional. Después de esto, el producto ligado se trató de un modo habitual para obtener un ADN recombinante con la secuencia de nucleótidos de la SEC ID Nº: 7. El ADN recombínate se denominó
"pKGY1".

Usando el método de extensión por solapamiento, en el que se aplicaron dos etapas de PCR para y descrito por Horthon, Robert M. en Methods in Enzymology, Vol. 217, págs. 270-279 (1993), se modificó una secuencia de nucleótidos en la parte superior del extremo 5' de la SEC ID Nº: 7 en el anterior ADN pKGY1. Se realizó PCR como una primera etapa de PCR-A de forma similar al Ejemplo 3-3 excepto por el uso, como cebadores con sentido y antisentido, de oligonucleótidos de las secuencias de nucleótidos de las SEC ID Nº: 26 y 27, que se habían sintetizado químicamente en base a la secuencia de nucleótidos del vector plasmídico pKK4; y como un molde, el anterior ADN recombinante pKGY1. En paralelo se realizó PCR como una primera etapa de PCR-B de forma similar al Ejemplo 3-3 excepto por el uso, como cebadores con sentido y antisentido, de oligonucleótidos de las secuencias de oligonucleótidos de las SEC ID Nº: 28 y 29, que se habían sintetizado químicamente respectivamente de un modo habitual en base a la secuencia de nucleótidos de la SEC ID Nº: 7; y como un molde, el anterior ADN recombinante pKGY1. Se recogió un ADN como un producto de la primera etapa de PCR-A de un modo habitual para obtener un ADN de aproximadamente 390 pb. Se recogió un ADN como un producto en la primera etapa de PCR-B de un modo convencional para obtener un ADN de aproximadamente 930 pb.

Se realizó PCR, como una segunda etapa de PCR-A, de forma similar al Ejemplo 3-3 excepto por el uso como un molde de una mezcla de ADN, es decir, un producto de la primera PCR-A y la primera etapa de PCR-B; como un cebador con sentido, la secuencia de oligonucleótidos de la secuencia de nucleótidos de la SEC ID Nº: 26; y como un cebador antisentido, el oligonucleótido de la secuencia de nucleótidos de la SEC ID Nº: 30, que se había sintetizado químicamente de un modo convencional en base a la secuencia de nucleótidos de la SEC ID Nº: 7. Se recogió el ADN como un producto en la PCR de un modo habitual para obtener un ADN de aproximadamente 1.300 pb.

El ADN como un producto en la segunda PCR-A se escindió con enzimas de restricción de EcoRI y BsiWI, y el ADN formado que consistía en bases de aproximadamente 650 pb se recogió de un modo habitual. Se recogió un ADN de aproximadamente 6.300 pb, que se formó después de la escisión del anterior ADN recombinante pKGY1 con enzimas de restricción de EcoRI y BsiWI, de un modo habitual. Estos ADN se ligaron de un modo habitual, y el producto ligado se trató de un modo convencional para obtener un ADN recombinante que comprendía un ADN de aproximadamente 650 pb obtenido de la segunda etapa de PCR-A. La descodificación del ADN por el método didesoxi convencional mostró que el ADN recombinante obtenido comprendía una secuencia de nucleótidos, en la que la secuencia de nucleótidos de la SEC ID Nº: 8, una secuencia de nucleótidos representada por 5'-ATG-3' y una secuencia de nucleótidos representada por 5'-TGA-3' se realizaron en el orden que se ha indicado anteriormente desde el extremo 5' al extremo 3'. El ADN recombinante obtenido de este modo se denominó "pGY4". La estructura de pGY4 es sustancialmente igual que el ADN recombinante pGY3 excepto por que pGY4 comprende la secuencia de nucleótidos de la SEC ID Nº: 8.

El ADN recombinante pGY4 se introdujo de un modo convencional con "BMH71-18mutS", una célula competente de Escherichia coli comercializada por Takara Shuzo Co., Ltd., Tokio, Japón, para obtener un transformante. El transformante se trató con el método de base-SDS para extraer un ADN que se identificó después con pGY4 de un modo convencional. Por tanto, a un transformante se introduce un ADN que codifica la presente enzima formadora de sacárido no reductor.

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Ejemplo 4

Preparación de enzima formadora de sacárido no reductor

Ejemplo 4-1

Preparación de enzima usando microorganismo del género Arthrobacter

De acuerdo con el método en el Ejemplo 2-1 se cultivó Arthrobacter sp. S34, FERM BP-6450, por un fermentador durante aproximadamente 72 horas. Después del cultivo, el cultivo resultante se concentró con una membrana de SF para obtener aproximadamente ocho litros de una suspensión celular. La suspensión celular se trató con "MINI-LABO", un disgregador de células a alta presión, comercializado por Dainippon Pharmaceutical Co., Ltd., Tokio, para romper las células. La solución resultante se centrifugó para obtener aproximadamente 8,5 l de un sobrenadante. Cuando se midió para actividad formadora de sacárido no reductor en el sobrenadante, mostró aproximadamente 0,1 unidades de la actividad enzimática con respecto a un mililitro del cultivo. Se añadió sulfato de amonio al sobrenadante para llevar hasta un grado de saturación de aproximadamente 0,7 para la precipitación con sales y el sedimento se recogió por centrifugación, se disolvió en tampón fosfato 10 mM (pH 7,0) y se dializó frente a una preparación fresca del mismo tampón. Excepto por el uso de aproximadamente 2 l de una resina de intercambio iónico, la solución interna dializada resultante se suministró a cromatografía en columna de intercambio iónico usando "SEPABEADS FP-DA13 GEL", un intercambiador aniónico comercializado por Mitsubishi Chemical Industries Ltd., Tokio, Japón como se describe en el Ejemplo 2-2, para recoger fracciones con enzima formadora de sacárido no reductor. Las fracciones se combinaron, dializaron frente a una preparación fresca del mismo tampón pero que contenía sulfato de amonio 1 M y la solución interna dializada resultante se centrifugó para recoger el sobrenadante formado. Excepto por el uso de aproximadamente 300 ml de gel, el sobrenadante se suministró a cromatografía en columna hidrófoba de acuerdo con el método descrito en el Ejemplo 2-2 para recoger fracciones con enzima formadora de sacárido no reductor. Después, se confirmó que la enzima obtenida tenía una temperatura óptima superior a 40ºC pero inferior a 60ºC, es decir, una temperatura en un intervalo de temperaturas medio, y un intervalo de pH ácido inferior a 7.

Por tanto, se obtuvieron aproximadamente 2.600 unidades de la presente enzima formadora de sacárido no reductor.

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Ejemplo 4-2

Preparación de enzima usando transformante

Se pusieron cien ml de una solución acuosa que contenía 16 g/l de polipeptona, 10 g/l de extracto de levadura y 5 g/l de cloruro sódico en un matraz Erlenmeyer de 500 ml, se sometieron a autoclave a 121ºC durante 15 min, se recogieron, ajustaron asépticamente a pH 7,0 y se mezclaron asépticamente con 10 mg de ampicilina en una sal sódica para obtener un medio nutriente líquido. Al medio nutriente se inoculó el transformante GY2 en el Ejemplo 3-2 y se incubó a 37ºC durante aproximadamente 20 horas en condiciones de aerobiosis con agitación para obtener un cultivo de siembra. Siete litros de un medio que tenía la misma composición que la usada en el cultivo de siembra se prepararon como en el caso del cultivo de siembra y se pusieron en un fermentador de 10 l y se inocularon con 70 ml del cultivo de siembra, seguido de la incubación durante aproximadamente 20 horas en condiciones de aerobiosis con agitación. Del cultivo resultante se recogieron células por centrifugación de un modo habitual. Las células recogidas se suspendieron en tampón fosfato (pH 7,0), se rompieron mediante el tratamiento de ultrasonicación y se centrifugaron para eliminar sustancias insolubles, seguido de recogida de un sobrenadante para obtener un extracto celular. El extracto se dializó frente a tampón fosfato 10 mM (pH 7,0). La solución interna dializada resultante se recogió y se confirmó que mostraba una actividad de enzima formadora de sacárido no reductor, tenía una temperatura óptima en un intervalo de temperaturas medio, es decir, una temperatura de más de 40ºC pero menos de 60ºC y tenía un pH óptimo en un intervalo de pH ácido, es decir, un pH inferior a 7.

Por tanto, se obtuvo la presente enzima formadora de sacárido no reductor. En el cultivo de este ejemplo se produjeron aproximadamente 0,2 unidades/ml de cultivo de la enzima.

Como un control se cultivó "XL1-BLUE", una cepa de Escherichia coli comercializada por Stratagene Cloning Systems, California, Estados Unidos en las mismas condiciones que anteriormente en un medio de cultivo nutriente con la misma composición que la usada anteriormente excepto por que no contenía ampicilina. De forma similar a anteriormente se obtuvo y dializó un extracto celular. No se detectó actividad de enzima formadora de sacárido no reductor en la solución interna dializada resultante, indicando que el transformante GY2 es útil para producir la presente enzima formadora de sacárido no reductor.

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Ejemplo 4-3

Preparación de enzima usando transformante

El transformante GY3 en el Ejemplo 3-3 se cultivó de forma similar al Ejemplo 4-2 excepto por que se usó un medio de cultivo nutriente líquido que consistía en maltosa al uno % p/v, polipeptona al tres % p/v, "MEAST PIG" al uno % p/v, un producto de Asahi Breweries, Ltd., Tokio, Japón, hidrógeno fosfato dipotásico al 0,1% p/v, 100 \mug/ml de ampicilina y agua. El cultivo resultante se trató con ultrasonicación para romper células y la mezcla resultante se centrifugó para eliminar sustancias insolubles. Cuando se ensayó para actividad de enzima formadora de sacárido no reductor en el sobrenadante resultante, el cultivo contenía aproximadamente 15 unidades/ml de cultivo de la enzima. De acuerdo con el método en el Ejemplo 2-2, la enzima en el sobrenadante se purificó, confirmando que la muestra purificada resultante mostraba una actividad de enzima formadora de sacárido no reductor, tenía una temperatura óptima en un intervalo de temperaturas medio, es decir, una temperatura de más de 40ºC pero inferior a 60ºC y tenía un pH óptimo en un intervalo de pH ácido, es decir, un pH inferior a 7. Por tanto, se obtuvo la presente enzima formadora de sacárido no reductor.

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Ejemplo 4-4

Preparación de enzima usando transformante

Se cultivó el transformante GY4 en el Ejemplo 3-4 de forma similar al Ejemplo 4-2 excepto por que se usó un medio de cultivo nutriente líquido que consistía en maltosa al dos % p/v, peptona al cuatro % p/v, extracto de levadura al uno % p/v, dihidrógeno fosfato sódico al 0,1% p/v, 200 \mug/ml de ampicilina y agua. El cultivo resultante se trató con ultrasonicación para romper células y la mezcla resultante se centrifugó para eliminar sustancias insolubles. Cuando se ensayó para actividad de enzima formadora de sacárido no reductor en el sobrenadante resultante, el cultivo contenía aproximadamente 60 unidades/ml de cultivo de la enzima. De acuerdo con el método en el Ejemplo 2-2, la enzima en el sobrenadante se purificó, confirmando que la muestra purificada resultante mostraba una actividad de enzima formadora de sacárido no reductor, tenía una temperatura óptima en un intervalo de temperaturas medio, es decir, una temperatura de más de 40ºC pero inferior a 60ºC y tenía un pH óptimo en un intervalo de pH ácido, es decir, un pH inferior a 7. Por tanto, se obtuvo la presente enzima formadora de sacárido no reductor.

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Ejemplo 5

Enzima liberadora de trehalosa

Ejemplo 5-1

Producción de enzima

De acuerdo con el método en el Ejemplo 2-1 se cultivó en un fermentador Arthrobacter sp. S34, FERM BP-6450. Después, de acuerdo con el método en el Ejemplo 2-2 se muestreó el cultivo resultante, seguido de separación de la muestra en células y un sobrenadante. A partir de las células se obtuvo un extracto celular. Cuando se ensayó para actividad liberadora de trehalosa del sobrenadante y el extracto celular, el primero mostró escasamente la actividad de enzima, mientras que el último mostró aproximadamente 0,3 unidades/ml de cultivo de la enzima.

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Ejemplo 5-2

Preparación de enzima

Aproximadamente 80 l de un cultivo, preparados de acuerdo con el método en el Ejemplo 2-1, se centrifugaron a 8.000 rpm durante 30 min para obtener aproximadamente 800 g de células de peso húmedo. Dos l de las células en húmedo se suspendieron en tampón fosfato 10 mM (pH 7,0) y se trataron con "MODEL UH-600", un homogeneizador ultrasónico comercializado por MST Co., Tokio, Japón. La suspensión resultante se centrifugó a 10.000 rpm durante 30 min, seguido de una recogida de aproximadamente dos litros de un sobrenadante. El sobrenadante se mezcló con sulfato de amonio para llevar hasta un grado de saturación de 0,7, se dejó reposar a 4ºC durante 24 horas y se centrifugó a 10.000 rpm durante 30 min para obtener un precipitado que se precipitó con sulfato de amonio. El precipitado se disolvió en tampón fosfato 10 mM (pH 7,0) se dializó frente a una preparación reciente del mismo tampón durante 48 horas y se centrifugó a 10.000 rpm durante 30 min para eliminar sustancias insolubles. Aproximadamente un litro de la solución interna dializada resultante se suministró a cromatografía en columna de intercambio iónico usando aproximadamente 1,3 l de "SEPABEADS FP-DA13 GEL", un intercambiador aniónico comercializado por Mitsubishi Chemical Industries Ltd., Tokio, Japón. La etapa de elución se realizó usando un tampón fosfato 10 mM lineal (pH 7,0) que contenía sal que aumentaba de 0 M a 0,6 M durante el suministro. El eluato de la columna se fraccionó y las fracciones se ensayaron cada una para actividad de enzima liberadora de trehalosa. Como resultado, la actividad de enzima se observó marcadamente en fracciones eluídas con tampón que tenía una concentración salina de aproximadamente 0,2 M, seguido de combinación de las fracciones.

Se añadió sulfato de amonio a la solución combinada para llevar hasta una concentración de 1 M y la mezcla se dejó reposar a 4ºC durante 12 horas, se centrifugó a 10.000 rpm durante 30 min para recoger un sobrenadante. El sobrenadante se sometió a cromatografía en columna hidrófoba usando una columna llena con "BUTYL TOYOPEARL 650M GEL", un gel hidrófobo comercializado por Tosoh Corporation, Tokio, Japón. Antes del uso, el volumen del gel se ajustó a aproximadamente 300 ml y se equilibró con tampón fosfato 10 ml (pH 7,0) que contenía sulfato de amonio 1 M. La etapa de elución se realizó usando una solución acuosa de gradiente lineal de amonio que disminuía de 1 M a 0 M durante el suministro. El eluato de la columna se fraccionó y las fracciones se ensayaron respectivamente para actividad de enzima liberadora de trehalosa. Como resultado, la actividad enzimática se observó marcadamente en fracciones eluídas con tampón que tenía una concentración de amonio de aproximadamente 0,5 M, seguido de combinación de las fracciones.

Las fracciones se combinaron, se dializaron frente a tampón fosfato 10 mM (pH 7,0) y la solución interna dializada se centrifugó a 10.000 rpm durante 30 min. Después, el sobrenadante resultante se recogió y sometió a "DEAE-TOYOPEARL 650S GEL", un intercambiador aniónico comercializado por Tosoh Corporation, Tokio, Japón. La etapa de elución se realizó usando una solución acuosa de gradiente lineal de sal que aumentaba de 0 M a 0,2 M durante el suministro. El eluato de la columna se fraccionó y las fracciones se ensayaron respectivamente para actividad de enzima liberadora de trehalosa. Como resultado, la actividad enzimática se observó marcadamente en fracciones eluídas con tampón que tenía una concentración de amonio de aproximadamente 0,15 M, seguido de combinación de las fracciones. La solución combinada se sometió a cromatografía de filtración en gel usando aproximadamente 380 ml de "ULTROGEL® AcA44 RESIN", un gel para cromatografía en columna de filtración en gel comercializado por Sepracor/IBF s.a. Villeneuve la Garenne, Francia, seguido de recogida de las fracciones con una actividad marcada de la enzima. El contenido, la actividad específica y el rendimiento de la enzima en cada etapa están en la
Tabla 5.

5

Cuando se sometió a electroforesis en gel de poliacrilamida al 7,5% p/v de un modo convencional, la solución eluída y recogida de la anterior cromatografía de filtración en gel dio una única banda de proteína. Los datos indican que el eluato de la cromatografía de filtración en gel obtenida anteriormente era una enzima liberadora de trehalosa purificada hasta un nivel electroforéticamente homogéneo.

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Ejemplo 5-3

Propiedad de enzima

Ejemplo 5-3(a)

Acción

Uno cualquiera de los sacáridos que consisten en \alpha-glucosiltrehalosa, \alpha-maltosiltrehalosa, \alpha-maltotriosiltrehalosa, \alpha-maltotetraosiltrehalosa y \alpha-maltopentaosiltrehalosa como sacáridos no reductores que tienen una estructura de trehalosa obtenida mediante el método en el anterior Ejemplo 8-3 descrito; y maltotriosa, maltotetraosa, maltopentaosa, maltohexaosa y maltoheptaosa como sacáridos reductores se disolvió en agua en una solución al 2% p/v como una solución de sustrato acuosa para el sustrato. Cada solución de sustrato acuosa se mezcló con dos unidades/g de sustrato, d.s.b., de una muestra purificada de enzima liberadora de trehalosa obtenida por el método en el Ejemplo 5-2 y se hizo reaccionar enzimáticamente a 50ºC y pH 6,0 durante 48 horas. De acuerdo con el método en el Ejemplo 2-3(a), el producto de reacción se analizó en HPLC después de precipitación con sales para calcular la composición de sacáridos de cada uno de los productos de reacción. Los resultados están en la Tabla 6. En la Tabla 6, \alpha-glucosiltrehalosa, \alpha-maltosiltrehalosa, \alpha-maltotriosiltrehalosa, \alpha-maltotetraosiltrehalosa y \alpha-maltopentaosiltrehalosa se expresaron respectivamente como glucosiltrehalosa, maltosiltrehalosa, maltotriosiltrehalosa, maltotetraosiltrehalosa y maltopentaosiltrehalosa.

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(Tabla pasa a página siguiente)

6

Como es evidente a partir de los resultados de la Tabla 6, la enzima liberadora de trehalosa, obtenida mediante el método en el Ejemplo 5-2, hidrolizó específicamente de forma no reductora un sacárido, que tiene una estructura de trehalosa como una unidad terminal y un grado de polimerización de glucosa de al menos tres, en un sitio entre una parte de la estructura de trehalosa y una parte del resto para formar trehalosa y un sacárido reductor que tiene un grado de polimerización de glucosa de uno o más. La enzima no actúa sobre maltooligosacáridos tales como maltotriosa y sacáridos inferiores.

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Ejemplo 5-3(b)

Peso molecular

Una muestra purificada de una enzima liberadora de trehalosa, obtenida mediante el método en el Ejemplo 5-2, se sometió junto con marcadores moleculares comercializados por Japan Bio-Rad Laboratories, Tokio, Japón, a SDS-PAGE convencional usando gel de poliacrilamida al 10% p/v. Después de la electroforesis, la posición de la muestra sometida a electroforesis en el gel se comparó con la de los marcadores, mostrando que la muestra tenía un peso molecular de aproximadamente 62.000 \pm 5.000 daltons.

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Ejemplo 5-3(c)

Punto isoeléctrico

Una muestra purificada de una enzima liberadora de trehalosa, obtenida mediante el método en el Ejemplo 5-2, se sometió de un modo habitual a isoelectroforesis usando un gel de poliacrilamida que contenía "AMPHOLINE" al 2% p/v, un anfolito comercializado por Pharmacia LKB Biotechnology AB, Uppsala, Suecia. La medición del pH del gel después de la electroforesis mostró que tenía un punto isoeléctrico de aproximadamente 4,7 \pm 0,5.

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Ejemplo 5-3(d)

Temperatura y pH óptimos

Una muestra purificada de una enzima liberadora de trehalosa, obtenida mediante el método en el Ejemplo 5-2, se examinó con respecto a la influencia de la temperatura y el pH sobre la actividad de la enzima. La influencia de la temperatura se examinó de acuerdo con el ensayo para la actividad de enzima excepto por que se hizo reaccionar la enzima a diferentes temperaturas. La influencia del pH se examinó de acuerdo con el ensayo para la actividad de enzima excepto por que se hizo reaccionar la enzima a diferentes pH usando tampones 20 mM apropiados. En cada procedimiento, se calcularon los valores relativos (%) del nivel aumentado de poder reductor en cada sistema y se consideró como actividad de enzima relativa (%). Los resultados de la influencia de la temperatura y el pH están respectivamente en la Figuras 8 y 9. Las abscisas en las Figuras 8 y 9 muestran las temperaturas y los pH de reacción para la enzima, respectivamente. Como se muestra en la Figura 8, la temperatura óptima de la enzima era de aproximadamente 50 a aproximadamente 55ºC cuando se incubó a pH 6,0 durante 30 min, mientras que el pH óptimo de la enzima era un pH de aproximadamente 6,0 cuando se incubó a 50ºC durante 30 min.

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Ejemplo 5-3(e)

Estabilidad a temperatura y pH

Una muestra purificada de una enzima liberadora de trehalosa, obtenida mediante el método en el Ejemplo 5-2, se examinó con respecto a la estabilidad a temperatura y pH. La estabilidad de temperatura se examinó diluyendo la muestra con tampón fosfato 20 mM (pH 7,0), incubando las diluciones a diferentes temperaturas durante 60 min, enfriando las diluciones resultantes y ensayando la actividad de enzima que quedaba en las diluciones. La estabilidad a pH se estudió diluyendo la muestra con tampones 50 mM (pH 7,0) con diferentes pH, incubando las diluciones a 4ºC durante 24 horas, ajustando a pH 6 y ensayando la actividad de enzima que quedaba en las diluciones. Los resultados de la estabilidad a temperatura y pH están respectivamente en las Figuras 10 y 11. Las abscisas en las Figuras 10 y 11 muestran temperaturas y pH a las que se mantuvo la enzima, respectivamente. Como se muestra en la Figura 10, la enzima era estable hasta aproximadamente 50ºC, mientras que la enzima era estable a pH en el intervalo de aproximadamente 4,5 a aproximadamente 10,0.

Los resultados que se han descrito anteriormente en este documento indican que la enzima liberadora de trehalosa, obtenida mediante el método en el Ejemplo 5-2, es la presente enzima que tiene una temperatura óptima en un intervalo de temperaturas medio.

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Ejemplo 5-4

Secuencia de aminoácidos parcial

Una parte de una muestra purificada de una enzima liberadora de trehalosa, obtenida mediante el método en el Ejemplo 5-2, se dializó frente a agua destilada y se preparó en una muestra que contenía aproximadamente 80 ng de proteína para el análisis de aminoácidos N-terminal. Usando "PROTEIN SEQUENCER MODEL 473A", un secuenciador de proteína comercializado por Applied Biosystems, Inc., Foster City, Estados Unidos, se analizó la secuencia de aminoácidos N-terminal hasta 20 restos aminoacídicos del extremo N. La secuencia de aminoácidos N-terminal descrita era la secuencia de aminoácidos parcial de la SEC ID Nº: 14.

Una parte de una muestra purificada de una enzima liberadora de trehalosa, obtenida mediante el método en el Ejemplo 5-2, se dializó frente a tampón Tris-HCl 10 mM (pH 9,0) y se concentró de un modo habitual para dar una concentración de aproximadamente un miligramo por mililitro usando "ULTRACENT-30", una membrana de ultrafiltración comercializada por Tosoh Corporation, Tokio, Japón. A 0,2 ml del concentrado se añadieron 10 \mug de un reactivo lisil endopeptidasa comercializado por Wako Pure Chemical Industries, Ltd., Tokio, Japón y la mezcla se incubó a 30ºC durante 22 horas para digerir la enzima y para formar péptidos. La mezcla de reacción se sometió a HPLC de fase inversa usando una columna de "NOVA-PAK C18 COLUMN", de diámetro 4,5 mm y longitud 150 mm, comercializada por Waters Chromatography Div., Millipore Corp., Milford, MA, Estados Unidos, para separar los péptidos a temperatura ambiente. La etapa de elución se realizó usando un gradiente lineal de una solución de ácido trifluoroacético acuosa al 0,1% v/v que contenía acetonitrilo aumentando del 24% v/v al 48% v/v durante 60 min durante el suministro a un caudal de 0,9 ml/min. El eluato de péptidos de la columna se controló midiendo a una longitud de onda de 210 nm. Dos péptidos, denominados "RT18" con un tiempo de retención de aproximadamente 18 minutos y "RT33" con un tiempo de retención de aproximadamente 33 minutos y bien separados de otros, se recogieron, secaron al vacío y se disolvieron respectivamente en una solución de acetonitrilo acuosa al 50% v/v que contenía 200 \mul de ácido trifluoroacético al 0,1% v/v. Las soluciones de péptidos se sometieron a un secuenciador de proteína para analizar hasta 20 restos aminoacídicos del extremo N de cada péptido. Las secuencias de aminoácidos de la SEC ID Nº: 15 y 16 de los péptidos RT18 y RT3 respectivamente.

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Ejemplo 6

ADN que codifica enzima liberadora de trehalosa

Ejemplo 6-1

Construcción y exploración de la genoteca

De acuerdo con el Ejemplo 3-1 se construyó una genoteca de Arthrobacter sp. S34, FERM BP-6450 y después se sometió a exploración aplicando el método de hibridación de colonias en las condiciones usadas en el Ejemplo 3-1 excepto por el uso como una sonda de un oligonucleótido, que tenía una secuencia de nucleótidos que codifica la presente enzima liberadora de trehalosa, preparado por los siguientes procedimientos; la sonda se preparó de un modo habitual marcando con un isótopo de [\gamma-^{32}P] ATP y polinucleótido quinasa T4, teniendo el oligonucleótido la secuencia de nucleótidos de la SEC ID Nº: 31, que se había sintetizado químicamente en base a una secuencia de aminoácidos que consiste en los aminoácidos 12-20 de la SEC ID Nº: 15 descrita en el Ejemplo 5-4. Se seleccionó un transformante que hibridó intensamente con la sonda.

De acuerdo con el método en el Ejemplo 3-2 se extrajo un ADN recombinante del transformante y se analizó con una técnica convencional de transferencia de Southern usando la anterior sonda. Un mapa de restricción realizado en base a los datos analíticos se hizo coincidir con el del ADN recombinante pGY1 obtenido en los Ejemplos 3-1 y 3-2. Como se muestra en la Figura 5 se mostró que el presente ADN recombinante en este Ejemplo contenía una secuencia de nucleótidos, que codificaba la presente enzima liberadora de trehalosa como se indicó con una flecha oblicua, dentro de una región que consistía en bases de aproximadamente 2.200 pb colocadas entre los sitios de reconocimiento de enzimas de restricción, PstI y KpnI. Usando el ADN recombinante pGY1 se procedió a descodificar la secuencia de nucleótidos de ADN que codifica la presente enzima liberadora de trehalosa.

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Ejemplo 6-2

Descodificación de secuencia de nucleótidos

El ADN recombinante pGY1, obtenido mediante el método en el Ejemplo 3-2, se digirió completamente de un modo convencional con una enzima de restricción, PstI. El fragmento de ADN de aproximadamente 3.300 pb formado en la mezcla resultante se eliminó en una electroforesis en agarosa convencional y se recogió el fragmento de ADN formado de aproximadamente 5.200 pb. El fragmento de ADN se sometió de un modo habitual a reacción de ligación y el producto ligado se usó para transformar "XL1-BLUE", una cepa de Escherichia coli comercializada por Stratagene Cloning Systems, California, Estados Unidos. Del transformante resultante se extrajo un ADN recombinante por un método convencional. Se confirmó que el ADN recombinante tenía una región que consistía en las bases de aproximadamente 2.220 pb y comprendía una secuencia de nucleótidos que codifica la presente enzima liberadora de trehalosa y se denominó "pGZ2". Un transformante con pGZ2 introducido se denominó un ADN recombinante pGZ2.

El análisis por método didesoxi convencional para la secuencia de nucleótidos del ADN recombinante pGZ2 mostró que contenía una secuencia de nucleótidos que consistía en 2.218 pb como se muestra en la SEC ID Nº: 32 obtenida de Arthrobacter sp. S34, FERM BP-6450. La secuencia de nucleótidos podría codificar la secuencia de aminoácidos en la SEC ID Nº: 32. La secuencia de aminoácidos se comparó con las de las SEC ID Nº: 14 a 16 como secuencias de aminoácidos parciales de la presente enzima liberadora de trehalosa confirmada en el Ejemplo 5-4. Como resultado, las secuencias de aminoácidos de las SEC ID Nº: 14, 15 y 16 se hicieron coincidir respectivamente con los aminoácidos 1-20, 298-317 y 31-50 de la secuencia de aminoácidos en la SEC ID Nº: 32. Los datos indican que la enzima liberadora de trehalosa en el Ejemplo 5 comprende la secuencia de aminoácidos en la SEC ID Nº: 32 o la de la SEC ID Nº: 9 y que la enzima de Arthrobacter sp. S34, FERM BP-6450 está codificada por las bases 477-2.201 en la SEC ID Nº: 32 o la secuencia de nucleótidos de la SEC ID Nº: 17. La Figura 12 muestra la estructura del ADN recombinante que se ha mencionado anteriormente pGZ2.

La anterior secuencia de aminoácidos de la presente enzima liberadora de trehalosa, obtenida mediante el método en el Ejemplo 5 y otras convencionales de enzimas que tienen una actividad de enzima liberadora de trehalosa se compararon entre sí de acuerdo con el método en el Ejemplo 3-2 para determinar su homología (%). Como enzimas convencionales, se usaron las obtenidas de Arthrobacter sp. Q36 descrito en la Patente Japonesa Kokai Nº 298.880/95; Rhizobium sp. M-11 descrito en la Patente Japonesa Kokai Nº 298.880/95; Sulfolobus acidocaldarius, ATCC 33909; y Sulfolobus solfataricus KM1 descrito en Sai-Kohyo Nº WO 95/34642. Todas estas enzimas tienen temperaturas óptimas fuera de un intervalo de temperaturas medio. Las secuencias de aminoácidos de estas enzimas están disponibles en GeneBank, una base de datos de ADN producida por el Instituto Nacional de Salud (NIH), Estados Unidos, con los números de acceso D63346, D64130, D78001 y D83245. La información de su homología está en la Tabla 7.

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TABLA 7

7

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Como se muestra en la Tabla 7, la presente enzima liberadora de trehalosa en el Ejemplo 5 mostró la mayor homología de aminoácidos del 59,9% con la enzima de Arthrobacter sp. Q36 entre enzimas convencionales con temperaturas óptimas fuera de un intervalo de temperaturas medio. Los datos indican que la presente enzima liberadora de trehalosa comprende generalmente una secuencia de aminoácidos con una homología de al menos el 60% con la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 9. El resultado de comparación de la secuencia de aminoácidos mostró que la enzima en el Ejemplo 5 y los cuatro tipos identificados anteriormente de enzimas convencionales tienen secuencias de aminoácidos comunes de las SEC ID Nº: 10 y 13. La enzima en el Ejemplo 5 tiene secuencias de aminoácidos parciales de las SEC ID Nº: 10 a 13 como se encuentra en los aminoácidos 148-153, 185-190, 248-254 y 285-291 en la SEC ID Nº: 9. Los cuatro tipos de enzimas usadas como referencias tienen las anteriores secuencias de aminoácidos parciales que se colocan en sus partes correspondientes. Basándose en el hecho de que cualquiera de la presente enzima en el Ejemplo 5 y las enzimas como referencias tienen comúnmente una actividad de formación de hidrolizar específicamente un sacárido no reductor, que tiene una estructura de trehalosa como una unidad terminal y un grado de polimerización de glucosa de al menos tres, en un sitio entre una parte de la estructura de trehalosa y una parte del resto, se indicó que las secuencias de aminoácidos parciales de las SEC ID Nº: 10 a 13 se correlacionaban con la expresión de una actividad de enzima de este tipo. Estos resultados muestran que la presente enzima liberadora de trehalosa se puede caracterizar por que comprende las secuencias de aminoácidos de las SEC ID Nº: 10 a 13 y tiene una temperatura óptima en un intervalo de temperaturas medio.

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Ejemplo 6-3

Transformante con ADN introducido

En base a las secuencias de nucleótidos 5'- y 3'-terminales de la SEC ID Nº: 17 se sintetizaron químicamente oligonucleótidos de las bases de las SEC ID Nº: 33 y 34 de un modo habitual. Como cebadores con sentido y antisentido se mezclaron 85 ng de cada uno de los oligonucleótidos y 100 ng del ADN recombinante pGZ2 en el Ejemplo 6-2 como un molde en un tubo de reacción mientras que se añadieron otros componentes de acuerdo con el Ejemplo 3-3. La temperatura para la PCR se controló de un modo tal que la mezcla se trató con 25 ciclos de incubaciones sucesivas de 95ºC durante uno minuto, 98ºC durante 20 segundos, 70ºC durante 30 segundos y 72ºC durante cuatro minutos y se incubó finalmente a 72ºC durante 10 min. Se recogió un ADN como un producto de PCR de un modo habitual para obtener un ADN de aproximadamente 1.700 pb. El ADN obtenido de este modo se mezcló con "pKK233-3", un vector plasmídico comercializado por Pharmacia LKB Biotechnology AB, Uppsala, Suecia, que se había escindido previamente con una enzima de restricción, EcoRI, y se unió por extremo romos mediante "DNA BLUNTING KIT" comercializado por Takara Shuzo Co., Ltd., Tokio, Japón y se ligó por método de ligación convencional. Después de esto, el producto ligado se trató de un modo habitual para obtener un ADN recombinante con el anterior ADN introducido que consistía en bases de aproximadamente 1.700 pb. La descodificación del ADN recombinante por el método didesoxi convencional mostró que comprendía una secuencia de nucleótidos a la que se había añadido una secuencia de nucleótidos de 5'-TGA-3' al extremo 3' de la secuencia de nucleótidos de la SEC ID Nº: 17. El ADN se denominó "pGZ3". La estructura del ADN recombinante pGZ3 está en la
Figura 13.

El pGZ3 recombinante se introdujo de un modo habitual en una cepa LE 392 de Escherichia coli, ATCC 33572, que se había hecho competente de un modo convencional, para obtener un transformante. Se aplicó el método convencional de base-SDS al transformante para extraer un ADN y se denominó "GZ3" identificando el transformante como pGZ3. Por tanto, se obtuvo un transformante, con la presente enzima liberadora de trehalosa introducida.

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Ejemplo 6-4

Transformante con ADN introducido

Se realizó la PCR de forma similar al Ejemplo 6-3 excepto por el uso, como cebadores con sentido y antisentido, de oligonucleótidos que tienen secuencias de nucleótidos de las SEC ID Nº: 35 y 36, respectivamente, que se habían sintetizado químicamente en base a las secuencias de nucleótidos 5' y 3'-terminales de la SEC ID Nº: 17. Se recogió un ADN como un producto de PCR de un modo habitual para obtener un ADN de aproximadamente 1.700 pb. El ADN obtenido de este modo se escindió con enzimas de restricción, XbaI y SpeI, y "pKK4", un vector plasmídico obtenido mediante el método en el Ejemplo 3-4, que se había escindido previamente con enzima de restricción, XbaI y SpeI, se ligaron de un modo habitual. Después de esto, el producto ligado se trató de un modo habitual para obtener un ADN recombinante que comprendía la secuencia de nucleótidos de la SEC ID Nº: 17. El ADN recombinante obtenido de este modo se denominó "pKGZ1".

Una secuencia de nucleótidos en la parte superior del extremo 5' de la SEC ID Nº: 17 contenido en el ADN recombinante pKGZ1 se modificó de forma similar al Ejemplo 3-4; se realizó PCR como primera PCR-C de forma similar al Ejemplo 3-3 excepto por el uso de ADN recombinante anterior pKGZ1 como un molde y los oligonucleótidos de las SEC ID Nº: 26 y 37, como cebadores con sentido y antisentido, que se había sintetizado químicamente de un modo habitual en base a la secuencia de nucleótidos del vector plasmídico pKK4. En paralelo se realizó PCR como una primera PCR-D de forma similar al Ejemplo 3-3 excepto por el uso del anterior ADN recombinante pKGZ1 como un molde y los oligonucleótidos de las SEC ID Nº: 38 y 39, como cebadores con sentido y antisentido, que se había sintetizado químicamente de un modo habitual en base a las secuencias de nucleótidos de las SEC ID Nº: 38 y 39. Se recogió un ADN como un producto de PCR-C de un modo habitual para obtener un ADN de aproximadamente 390 pb, mientras que se recogió otro ADN como producto de PCR-D de forma similar a anteriormente para obtener un ADN de aproximadamente 590 pb.

Se realizó PCR como una segunda PCR-B de un modo similar al Ejemplo 3-3 excepto por el uso de la mezcla de ADN obtenida como productos en la primera PCR-C y primera PCR-D, un oligonucleótido de la SEC ID Nº: 26 usado en la primera PCR-C como cebador con sentido y un oligonucleótido de la SEC ID Nº: 39 usado en la primera PCR-D como un cebador antisentido. Se recogió un ADN como un producto de PCR de un modo habitual para obtener un ADN de aproximadamente 950 pb.

El ADN como un segundo producto de PCR-B se escindió con una enzima de restricción, EcoRI, y el ADN formado de aproximadamente 270 pb se recogió de un modo convencional. El ADN recombinante pKGZ1 se escindió con una enzima de restricción, EcoRI, y el ADN formado de aproximadamente 5.100 pb se recogió de forma similar a anteriormente. Estos ADN se ligaron de un modo habitual y se trataron de una manera habitual para obtener un ADN recombinante que comprendía un ADN de aproximadamente 270 pb del segundo producto de PCR-B. La descodificación del ADN recombinante por el método didesoxi convencional mostró que contenía la secuencia de nucleótidos de la SEC ID Nº: 8, uno de la SEC ID Nº: 17 y uno representado por 5'-TGA-3' en el orden indicado desde el extremo 5' al 3'. El ADN recombinante obtenido de este modo se denominó "pGZ4". El ADN recombinante pGZ4 tenía sustancialmente la misma estructura que el ADN recombinante pGZ3 obtenido en el Ejemplo 6-3 excepto porque tenía la secuencia de nucleótidos de la SEC ID Nº: 8.

El ADN recombinante pGZ4 se introdujo en "BMH71-18mutS", una célula competente de Escherichia coli comercializada por Takara Shuzo Co., Ltd., Tokio, Japón, para obtener un transformante. Usando el método convencional de base-SDS se extrajo un ADN del transformante y se confirmó que era pGZ4 de acuerdo con el modo convencional. Se denominó "GZ4". Por tanto, se obtuvo un transformante con un ADN introducido que codifica la presente enzima liberadora de trehalosa.

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Ejemplo 7

Preparación de enzima liberadora de trehalosa

Ejemplo 7-1

Preparación de enzima usando microorganismos del género Arthrobacter

Un cultivo de siembra de Arthrobacter sp. S34, FERM BP-6450, se inoculó en medio de cultivo nutriente y se incubó por un fermentador durante aproximadamente 72 horas de acuerdo con el método en el Ejemplo 2-1. Después de la incubación, el cultivo resultante se filtró y concentró con una membrana de SF para obtener aproximadamente ocho litros de suspensión celular que después se trató con "MINI-LABO", un alterador de células a presión superalta comercializado por Dainippon Pharmaceutical Co., Ltd., Tokio, Japón, para romper células. El alterador de células se centrifugó para recoger obtener aproximadamente 8,5 l de sobrenadante como un extracto celular. La determinación del extracto celular para la actividad de enzima liberadora de trehalosa mostró que el cultivo contenía aproximadamente 0,3 unidades/ml de cultivo de la actividad de enzima. Al extracto celular se añadió sulfato de amonio para dar un grado de saturación de 0,7 para realizar la precipitación y después se centrifugó para obtener el precipitado. El precipitado se disolvió en tampón fosfato 10 mM (pH 7,0) y se dializó frente a una preparación reciente del mismo tampón. La solución interna dializada se sometió a cromatografía de intercambio iónico usando "SEPABEADS FP-DA13 GEL" comercializado por Mitsubishi Chemical Co., Ltd., Tokio, Japón, de acuerdo con el método en el Ejemplo 5-2 excepto porque el volumen de resina usado del intercambiador iónico era de aproximadamente dos litros, seguido de recogida de fracciones que tenían actividad de enzima liberadora de trehalosa. Las fracciones se combinaron y dializaron frente a una preparación reciente del mismo tampón pero que contenía sulfato de amonio 1 M y después, la solución dializada se centrifugó para obtener el sobrenadante formado. El sobrenadante se sometió a una cromatografía en columna hidrófoba usando "BUTYL TOYOPEARL 650M GEL", un gel hidrófobo comercializado por Tosoh Co., Ltd., Tokio, Japón, de acuerdo con el método en el Ejemplo 5-2 excepto porque se usaron aproximadamente 350 ml del gel y después se recogieron fracciones con una actividad de enzima liberadora de trehalosa. Se confirmó que la enzima recogida tenía una temperatura óptima en un intervalo de temperaturas medio, es decir, temperaturas superiores a 45ºC pero inferiores a 60ºC y un pH óptimo en un intervalo de pH ácido, es decir, un pH inferior
a 7.

Por lo tanto, se obtuvieron aproximadamente 6.400 unidades de la presente enzima liberadora de trehalosa.

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Ejemplo 7-2

Preparación de enzima usando microorganismos del género Arthrobacter

Un cultivo de siembra de Arthrobacter sp. S34, FERM BP-6450, se inoculó en un medio de cultivo nutriente de acuerdo con el método en el Ejemplo 7-1. A un l del cultivo resultante se añadieron 100 mg de "OVALBÚMINA LISOZIMA", una preparación de lisozima, comercializada por Nagase Biochemicals, Ltd., Kyoto, Japón. Después se suspendió la aerobiosis y las células se rompieron manteniendo el cultivo durante 24 horas a la misma temperatura y condiciones de agitación usadas en el cultivo. El alterador de romper de células se sometió a una centrifugación continua a 10.000 rpm, seguido de recogida de un sobrenadante como un extracto celular. De acuerdo con el método en el Ejemplo 7-1, el extracto celular se trató con precipitación con sales y el sedimento se dializó. La solución interna dializada resultante se sometió a cromatografía de intercambio iónico usando "SEPABEADS FP-DA13 GEL", un producto de Mitsubishi Chemical Co., Ltd., Tokio, Japón, de acuerdo con el método en el Ejemplo 7-1 para recoger fracciones con una actividad de enzima liberadora de trehalosa. Las fracciones combinadas contenían aproximadamente 16.500 unidades de la presente enzima liberadora de trehalosa y aproximadamente 5.500 unidades de la presente enzima formadora de sacárido no reductor. Por tanto, se obtuvo una preparación de enzima que contenía los presentes dos tipos de enzimas.

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Ejemplo 7-3

Producción de enzima usando transformante

En un matraz Erlenmeyer de 500 ml se pusieron 100 ml de solución acuosa que contenía 16 g/l de polipeptona, 10 g/l de extracto de levadura y 5 g/l de cloruro sódico, y el matraz se sometió a autoclave a 121ºC durante 15 min, se enfrió, ajustó asépticamente a pH 7,0 y se mezcló asépticamente con 10 mg de ampicilina en una sal sódica para obtener un medio de cultivo nutriente. El transformante "GZ2" obtenido en el Ejemplo 6-2 se inoculó en el medio líquido, seguido de la incubación a 37ºC durante aproximadamente 20 horas y condiciones de aerobiosis con agitación para obtener un cultivo de siembra. Se prepararon siete litros de una preparación fresca del mismo medio que el usado en el cultivo de siembra de forma similar y se pusieron en un fermentador de 10 l, se inocularon con 70 ml del cultivo de siembra y se cultivaron durante aproximadamente 20 horas en condiciones de aerobiosis con agitación. Las células se recogieron por centrifugación del cultivo resultante de un modo habitual. Las células recogidas se suspendieron en tampón fosfato 10 mM (pH 7,0) y se sometieron a ultrasonicación para romper las células. La mezcla resultante se centrifugó para eliminar sustancias insolubles, seguido de recogida de un sobrenadante como un extracto celular. El extracto celular se dializó contra tampón fosfato 10 mM (pH 7,0). La solución interna dializada se recogió y se confirmó que tenía una temperatura óptima en un intervalo de temperaturas medio, es decir, temperaturas superiores a 45ºC pero inferiores a 60ºC y un pH óptimo en un intervalo de pH ácido, es decir, un pH inferior a 7.

Por tanto, se obtuvo la presente enzima liberadora de trehalosa. En este ejemplo se obtuvieron aproximadamente 0,5 unidades/ml de cultivo de la enzima liberadora de trehalosa.

Como un control se cultivó "XL1-Blue" una cepa de Escherichia coli comercializada por Stratagene Cloning Systems, California, EEUU, en las mismas condiciones de cultivo que las usadas anteriormente en una preparación fresca del mismo medio de cultivo que anteriormente pero sin ampicilina, seguido de recogida y dialización de un extracto celular de forma similar a anteriormente. No se observó actividad de enzima liberadora de trehalosa, indicando que el transformante GZ2 se puede usar ventajosamente para producir la presente enzima liberadora de trehalosa.

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Ejemplo 7-4

Producción de enzima usando transformante

El transformante GZ3 en el Ejemplo 6-3 se cultivo de forma similar al Ejemplo 7-3 excepto por el uso de un medio de cultivo nutriente líquido (pH 7,0) que consistía en maltosa al uno % p/v, polipeptona al tres % p/v, "MEAST PIG" al uno % p/v comercializado por Asahi Breweries, Ltd., Tokio, Japón, hidrógeno fosfato dipotásico al 0,1% p/v, 100 \mug/ml de ampicilina y agua. El cultivo resultante se trató con ultrasonicación para romper células y la mezcla se centrifugó para eliminar sustancias insolubles. La medición de la actividad de enzima liberadora de trehalosa en el sobrenadante resultante mostró que contenía aproximadamente 70 unidades/ml de cultivo de la enzima. De acuerdo con el método en el Ejemplo 5-2, el sobrenadante se purificó y se confirmó que la muestra purificada tenía una temperatura óptima en un intervalo de temperaturas medio, es decir, temperaturas superiores a 45ºC pero inferiores a 60ºC y un pH óptimo en un intervalo de pH ácido, es decir, un pH inferior a 7. Por tanto, se obtuvo la presente enzima liberadora de trehalosa.

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Ejemplo 7-5

Producción de enzima usando transformante

El transformante GZ4 en el Ejemplo 6-4 se cultivó de forma similar al Ejemplo 4-4. El cultivo resultante se trató con ultrasonicación para romper células y la mezcla se centrifugó para eliminar sustancias insolubles. La medición de la actividad de enzima liberadora de trehalosa en el sobrenadante resultante mostró que contenía aproximadamente 250 unidades/ml de cultivo de la enzima. De acuerdo con el método en el Ejemplo 5-2, el sobrenadante se purificó y se confirmó que la muestra purificada tenía una temperatura óptima en un intervalo de temperaturas medio, es decir, temperaturas superiores a 45ºC pero inferiores a 60ºC y un pH óptimo en un intervalo de pH ácido, es decir, pH inferior a 7. Por tanto, se obtuvo la presente enzima liberadora de trehalosa.

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Ejemplo 8

Producción de sacárido

Ejemplo 8-1

Producción de jarabe de sacárido no reductor

Se gelatinizó una suspensión de almidón de patata al 6% p/p mediante calentamiento, se ajustó a pH 4,5 y 50ºC, se mezcló con 2.500 unidades/g de almidón, d.s.b. y se reaccionar enzimáticamente durante 20 horas. La mezcla de reacción se ajustó a pH 6,5, se sometió a autoclave a 120ºC durante 10 min, se enfrió a 40ºC, se mezcló con 150 unidades/g de almidón, d.s.b., de "TERMAMYL 60L", una muestra de \alpha-amilasa comercializada por Nordisk Industri A/S, Copenhagen, Dinamarca, y sometió a una reacción enzimática durante 20 horas mientras que se mantenía a la temperatura. La mezcla de reacción se sometió a autoclave a 120ºC durante 20 min, se enfrío a 53ºC, se ajustó a pH 5,7, se mezcló con una unidad por gramo de almidón, d.s.b., de una enzima formadora de sacárido no reductor obtenida mediante el método en el Ejemplo 4-1 y se sometió a una reacción enzimática durante 96 horas. La mezcla de reacción obtenida de este modo se calentó a 97ºC durante 30 min para inactivar la enzima remanente, se enfrió, filtró, purificó de un modo habitual por decoloración con un carbón vegetal activado y se precipitó con intercambiadores iónicos y se concentró para obtener un jarabe de aproximadamente el 70% p/p con un rendimiento de aproximadamente el 90% con respecto al material de almidón, d.s.b.

El producto, que tenía un DE bajo de 24 y que contiene \alpha-glucosiltrehalosa, \alpha-maltosiltrehalosa, \alpha-maltotriosiltrehalosa, \alpha-maltotetraosiltrehalosa y \alpha-maltopentaosiltrehalosa en una cantidad respectiva del 11,5, 5,7, 29,5, 3,5 y 2,8% d.s.b, tenía un sabor dulce débil y de alta calidad y una viscosidad y una capacidad de retención de humedad satisfactorias. Se puede usar arbitrariamente como un edulcorante, agente que mejora el sabor, agente que mejora la calidad, estabilizante, carga, adyuvante o excipiente en composiciones en general, tales como alimentos, cosméticos y farmacéuticos.

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Ejemplo 8-2

Producción de jarabe que contiene sacárido no reductor

A la suspensión de almidón de maíz al 33% p/p se añadió carbonato cálcico para dar una concentración final del 0,1% p/p y después, la mezcla se ajustó a pH 6,5 y se mezcló con el 0,2% p/p por almidón, d.s.b., de "THERMAMYL 60L", una muestra de \alpha-amilasa de licuación comercializada por Novo Nordisk Industri A/S, Copenhagen, Dinamarca, y se hizo reaccionar enzimáticamente a 95ºC durante 15 min para licuar el almidón. El almidón licuado se sometió a autoclave a 120ºC durante 10 min, se enfrió a 53ºC, se mezcló con una unidad/g de almidón, d.s.b., de enzima formadora de maltotetraosa de una cepa de Pseudomonas stutzeri comercializada por Hayashibara Biochemical Laboratories Inc., Okayama, Japón y dos unidades/g de almidón, d.s.b., de una enzima formadora de sacárido no reductor obtenida mediante el método el Ejemplo 4-2 y se hizo reaccionar enzimáticamente durante 48 horas. La mezcla de reacción se mezcló con 15 unidades de "\alpha-AMYLASE 2A", una muestra de \alpha-amilasa comercializada por Ueda Chemical Co., Ltd., Osaka, Japón y después se incubó a 65ºC durante dos horas, se sometió a autoclave a 120ºC durante 10 minutos y se enfrió. La mezcla resultante se filtró y se purificó de un modo habitual mediante tratamientos de coloración usando un carbón vegetal activado y precipitación usando intercambiadores iónicos y se concentró hasta un jarabe de aproximadamente el 70% p/p, d.s.b., con un rendimiento de aproximadamente el 90% con respecto al material de almidón, d.s.b.

El producto, que tenía un DE bajo de 18,5 y que contiene \alpha-glucosiltrehalosa, \alpha-maltosiltrehalosa, \alpha-maltotriosiltrehalosa, \alpha-maltotetraosiltrehalosa y \alpha-maltopentaosiltrehalosa en una cantidad respectiva del 9,3, 30,1, 0,9, 0,8 y 0,5%, d.s.b., tiene un sabor dulce débil y de alta calidad y una viscosidad y capacidad de retención de humedad satisfactorias. Se puede usar arbitrariamente como un edulcorante, agente que mejora el sabor, agente que mejora la calidad, estabilizante, carga, adyuvante o excipiente en composiciones en general, tales como alimentos, cosméticos y farmacéuticos.

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Ejemplo 8-3

Producción de sacárido no reductor

Una solución acuosa al 20% p/p de cualquiera de los hidrolizados de almidón parciales reductores de maltotriosa, maltotetraosa, maltopentaosa, maltohexaosa y maltoheptaosa, que se producen todos por Hayashibara Biochemical Laboratories Inc., Okayama, Japón, se mezclan con dos unidades/g de hidrolizado de almidón parcial reductor de una muestra purificada de enzima formadora de sacárido no reductor obtenida mediante el método en el Ejemplo 2-2 y se someten a una reacción enzimática a 50ºC y pH 6,0 durante 48 horas. Cada uno de los hidrolizados de almidón parciales reductores que se han identificado anteriormente formaron respectivamente \alpha-glucosiltrehalosa, \alpha-maltosiltrehalosa, \alpha-maltotriosiltrehalosa, \alpha-maltotetraosiltrehalosa y \alpha-maltopentaosiltrehalosa como sacáridos reductores. Los sacáridos en cada mezcla de reacción se fraccionaron de un modo convencional mediante los siguientes tratamientos sucesivos: inactivación de la enzima remanente por calentamiento, filtración, decoloración, precipitación, concentración y cromatografía en columna usando "XT-1016" (forma Na^{+}), una resina de intercambio catiónico de ácido fuerte de metal alcalino con un grado de polimerización del 4%, comercializada por Tokyo Organic Chemical Industries, Ltd., Tokio, Japón. Las condiciones usadas en la cromatografía en columna eran las siguientes: la temperatura de columna interna se ajustó en 55ºC, el volumen de carga de una solución de sacárido en la resina era de aproximadamente el 5% v/v y el caudal del agua calentado a 55ºC como un lecho móvil se ajustó a SV (velocidad espacial) 0,13. Se recogió un eluato de cada columna, que contenía al menos el 95% p/p de cualquiera de los sacáridos no reductores que se han identificado anteriormente, d.s.b., con respecto a la composición de sacárido. A cada eluato recogido se añadió hidróxido sódico para dar una concentración de 0,1 N y la mezcla se calentó a 100ºC durante 2 horas para descomponer los sacáridos reductores remanentes. Las mezclas de reacción obtenidas de este modo se decoloraron respectivamente con un carbón vegetal activado, se precipitaron con intercambiadores iónicos en forma Habitualmente y OH, se concentraron, secaron al vacío y pulverizaron hasta \alpha-glucosiltrehalosa, \alpha-maltosiltrehalosa, \alpha-maltotriosiltrehalosa, \alpha-maltotetraosiltrehalosa y \alpha-maltopentaosiltrehalosa en forma de polvo con una pureza de al menos el 99,0 % p/p, d.s.b.

Los productos que contienen sacáridos no reductores altamente purificados y que tiene un DE menor se pueden usar arbitrariamente como un agente que mejora el sabor, agente que mejora la calidad, estabilizante, carga, adyuvante, o excipiente en composiciones en general, tales como alimentos, cosméticos y farmacéuticos.

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Ejemplo 8-4

Producción de polvo cristalino que contiene sacárido no reductor

Se preparó una solución acuosa al 20% p/p de maltopentaosa comercializada por Hayashibara Biochemical Laboratories Inc., Okayama, Japón, se mezcló con dos unidades/g de maltopentaosa, d.s.b., de una enzima formadora de sacárido no reductor obtenida mediante el método en el Ejemplo 4-3 y se hizo reaccionar enzimáticamente a 50ºC durante 48 horas, dando como resultado un conversión de aproximadamente el 75% de maltopentaosa en \alpha-maltotriosiltrehalosa. La mezcla de reacción se calentó a 97ºC durante 30 min para inactivar la enzima remanente y después se enfrió, se filtró y purificó por decoloración usando un carbón vegetal activado y precipitó usando intercambiadores iónicos.

Después de esto, la solución resultante se concentró en una solución de aproximadamente el 75% p/p con respecto a los contenidos sólidos, se mezcló con un cristal de \alpha-maltotriosiltrehalosa de aproximadamente el 0,01% p/p como un cristal de siembra y se dejó reposar durante 24 horas. Después, el cristal de \alpha-maltotriosiltrehalosa cristalizado se recogió por una centrifuga, se lavó con una pequeña cantidad de agua fría y se secó de un modo habitual para obtener un polvo cristalino con un contenido relativamente alto del sacárido no reductor con un rendimiento de aproximadamente el 50% con respecto a los sólidos del material, d.s.b.

El producto, que tiene un sabor dulce relativamente bajo y un DE extremadamente bajo inferior a 0,2 y que contiene al menos el 99,0% p/p de \alpha-maltotriosiltrehalosa como un sacárido no reductor, se puede usar arbitrariamente como un agente que mejora el sabor, agente que mejora la calidad, estabilizante, carga, adyuvante o excipiente en composiciones en general, tales como alimentos, cosméticos y farmacéuticos.

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Ejemplo 8-5

Proceso para producir trehalosa cristalina hidratada

Se suspendió almidón de maíz en agua en una suspensión de almidón al 30% p/p que después se mezcló con carbonato cálcico en una cantidad del 0,1% p/p. La mezcla se ajustó a pH 6,0 y después se mezcló con 0,2% p/p por almidón, d.s.b., de "THERMAMYL 60L", una muestra de \alpha-amilasa de licuación comercializada por Novo Nordisk Industri A/S, Copenhagen, Dinamarca y se hizo reaccionar enzimáticamente a 95ºC durante 15 min para gelatinizar y licuar el almidón. La mezcla resultante se sometió a autoclave a 120ºC durante 30 min, se enfrío a 51ºC, se ajustó a pH 5,7 y se hizo reaccionar enzimáticamente a la misma temperatura durante 64 horas, después se mezcló con 300 unidades/g de almidón, d.s.b., de una muestra de isoamilasa comercializada por Hayashibara Biochemical Laboratories Inc., Okayama, Japón; dos unidades/g de almidón, d.s.b., de una muestra de ciclomaltodextrina glucanotransferasa comercializada por Hayashibara Biochemical Laboratories Inc., Okayama, Japón; dos unidades de una enzima formadora de sacárido no reductor obtenida mediante el método en el Ejemplo 4-1; y 10 unidades/g de almidón, d.s.b., de una enzima liberadora de trehalosa obtenida mediante el método en el Ejemplo 7-1. La mezcla de reacción se calentó a 97ºC durante 30 min para inactivar la enzima remanente y después se enfrió a 50ºC, se mezcló con 10 unidades/g de almidón, d.s.b., de "GLUCOZYME", una muestra de glucoamilasa comercializada por Nagase Biochemical, Ltd., Kyoto, Japón, y se sometió a una reacción enzimática durante 24 horas. La mezcla de reacción obtenida de este modo se calentó a 95ºC durante 10 min para inactivar las enzimas remanentes, se enfrió, filtró, purificó por decoloración usando un carbón vegetal activado y precipitando usando intercambiadores iónicos y se concentró hasta una solución de aproximadamente el 60% p/p con respecto a los contenidos de sólidos o un jarabe que contenía trehalosa al 84,1% p/p, d.s.b. El jarabe se concentró hasta dar una concentración de aproximadamente el 83% p/p, d.s.b., y el concentrado se puso en un cristalizador, se mezcló con trehalosa cristalina hidratada a aproximadamente el 0,1% p/v hasta el jarabe y se agitó durante aproximadamente dos horas para cristalizar el sacárido. Los cristales resultantes se recogieron por centrífuga, se lavaron con una pequeña cantidad de agua para eliminar las melazas, se secaron con aire calentado a 45ºC para obtener trehalosa cristalina hidratada con una pureza de al menos el 99% en un rendimiento de aproximadamente el 50% con respecto al material de almidón, d.s.b.

El producto está sustancialmente libre de higroscopicidad y es fácilmente manejable, se puede usar arbitrariamente como un edulcorante, agente que mejora el sabor, agente que mejora la calidad, estabilizante, carga, adyuvante o excipiente en composiciones en general, tales como alimentos, cosméticos y farmacéuticos.

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Ejemplo 8-6

Proceso para producir polvo cristalino que contiene trehalosa cristalina anhidra

Usando el método en el Ejemplo 8-5 se preparó trehalosa cristalina hidratada y el sacárido se secó al vacío usando una secadora al vacío rotatoria encamisada. El secado se realizó a 90ºC y 300-350 mmHg durante aproximadamente siete horas. Después del secado, las anteriores temperatura y presión volvieron a temperatura ambiente y presión normal antes de recoger el producto o un polvo cristalino que contenía trehalosa cristalina anhidra de al menos el 90% p/p, d.s.b.

Ya que la trehalosa cristalina anhidra absorbe humedad en materiales hidratados y cambia por sí misma a trehalosa cristalina hidratada, el producto rico en el sacárido se puede usar arbitrariamente como desecante seguro no perjudicial para deshidratar o secar composiciones incluyendo productos alimentarios, cosméticos y farmacéuticos, así como materiales e intermedios de los mismos. El producto con un sabor dulce débil y de alta calidad se puede usar arbitrariamente como un edulcorante, agente que mejora el sabor, agente que mejora la calidad, estabilizante, carga, adyuvante o excipiente en composiciones en general, tales como alimentos, cosméticos y farmacéuticos.

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Ejemplo 8-7

Proceso para producir jarabe de trehalosa

Se mezcló una suspensión al 27% p/p de almidón de tapioca con carbonato cálcico para dar una concentración final del 0,1% p/p, se ajustó a pH 6,0, se mezcló con 0,2% p/p por almidón, d.s.b., de "THERMAMYL 60L", una muestra de \alpha-amilasa de licuación comercializada por Novo Nordisk Industri A/S, Copenhagen, Dinamarca y se hizo reaccionar enzimáticamente a 95ºC durante 15 min para gelatinizar y licuar el almidón. La mezcla resultante se sometió a autoclave a una presión de 2 kg/cm^{2} durante 30 min, se enfrió hasta 53ºC, se ajustó a pH 5,7 y se hizo reaccionar enzimáticamente a la misma temperatura durante 72 horas, después se mezcló con 500 unidades/g de almidón, d.s.b., de "PROMOZYME 200L" una muestra de pululanasa comercializada por Novo Nordisk Industri A/S, Copenhagen, Dinamarca; una unidad/g de almidón, d.s.b., de cepa de Pseudomonas stutzeri comercializada por Hayashibara Biochemical Laboratories Inc., Okayama, Japón; aproximadamente dos unidades/g de almidón, d.s.b., de una enzima formadora de sacárido no reductor y aproximadamente seis unidades/g de almidón, d.s.b., de una enzima liberadora de trehalosa, obtenida mediante el método en el Ejemplo 7-2. La mezcla de reacción obtenida de este modo se calentó a 97ºC durante 15 min, se enfrió y filtró para obtener un filtrado. El filtrado se purificó de un modo habitual por decoloración usando un carbón vegetal activado y precipitando usando intercambiadores iónicos y se concentró hasta un jarabe de aproximadamente el 70% p/p con respecto a los contenidos de sólidos con un rendimiento de aproximadamente el 92% con respecto al material, d.s.b.

El producto, que comprende trehalosa al 35,2%, \alpha-glucosiltrehalosa al 3,4%, glucosa al 1,8%, maltosa al 37,2%, maltotriosa al 9,1% y oligosacáridos superiores a maltotetraosa al 13,3% tiene un sabor dulce débil y de alta calidad, capacidad de reducción y viscosidad relativamente menores y una capacidad de retención de humedad adecuada; se puede usar arbitrariamente como un edulcorante, agente que mejora el sabor, agente que mejora la calidad, estabilizante, carga, adyuvante o excipiente en composiciones en general, tales como alimentos, cosméticos y farmacéuticos.

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Ejemplo 8-8

Una parte en peso de "EX-I", una amilosa comercializada por Hayashibara Biochemical Laboratories, Inc., Okayam, Japón, se disolvió en 15 partes en peso de agua por calentamiento y la solución se calentó hasta 53ºC y se ajustó a pH 5,7. A la solución resultante se añadieron dos unidades/g de amilosa, d.s.b., de una enzima formadora de sacárido no reductor, obtenida en el Ejemplo 4-3 y seis unidades/g de amilosa, d.s.b., de una enzima liberadora de trehalosa, obtenida por el método en el Ejemplo 7-4, seguido de una incubación durante 48 horas. La mezcla de reacción se calentó a 97ºC durante 30 min para inactivar la enzima remanente y después se ajustó a pH 5,0, se mezcló con 10 unidades/g de amilosa, d.s.b., de "GLUZCOZYME", una muestra de glucoamilasa comercializada por Nagase Biochemicals, Ltd., Kyoto y se hizo reaccionar enzimáticamente durante 40 horas. La mezcla de reacción obtenida de este modo se calentó a 95ºC durante 10 min para inactivar las enzimas remanentes, se enfrió, filtró, purificó por decoloración usando un carbón vegetal activado y precipitó usando intercambiadores iónicos y se concentró hasta una solución de aproximadamente el 60% en p/p con respecto a los contenidos de sólidos o un jarabe que contenía el 82,1% p/p de trehalosa, d.s.b.

De forma similar al Ejemplo 8-3, el jarabe se sometió a cromatografía en columna, seguido de recogida de una fracción que contenía trehalosa aproximadamente al 98% p/p, d.s.b. La fracción se concentró al vacío en condiciones de calentamiento hasta un jarabe de aproximadamente el 85% p/p con respecto a los contenidos de sólidos. El jarabe se mezcló con trehalosa cristalina hidratada como un cristal de siembra y aproximadamente el 2% p/v del jarabe, se agitó a 120ºC durante cinco minutos, se distribuyó en cubetas de plástico y se secó a 100ºC al vacío para cristalizar el sacárido. Después de esto, los contenidos en una forma de bloque se desprendieron de las cubetas y se cortaron con un cortador para obtener un producto sólido, que contenía trehalosa cristalina anhidra con una cristalinidad de aproximadamente el 70% y que tenía un contenido de humedad de aproximadamente el 0,3% p/p con un rendimiento de aproximadamente el 70% con respecto al material de amilosa, d.s.b. El producto sólido se pulverizó de un modo habitual en un polvo cristalino que contenía trehalosa cristalina anhidra.

Ya que la trehalosa cristalina anhidra absorbe humedad de materiales hidratados y cambia a trehalosa cristalina hidratada, el producto rico en trehalosa cristalina anhidra se puede usar arbitrariamente como un desecante seguro no perjudicial para deshidratar o secar composiciones incluyendo productos alimentarios, cosméticos y farmacéuticos, así como materiales e intermedios de los mismos. El producto con un sabor dulce débil y de alta calidad se puede usar arbitrariamente como un edulcorante, agente que mejora el sabor, el agente que mejora la calidad, estabilizante, carga, adyuvante o excipiente en composiciones en general, tales como alimentos, cosméticos y farmacéuticos.

Como se ha descrito anteriormente, la presente invención se realizó en base a la observación de una enzima formadora de sacárido no reductor novedosa y una enzima liberadora de trehalosa novedosa, que tienen una temperatura óptima en un intervalo de temperaturas medio y preferiblemente tienen un pH óptimo en un intervalo de pH ácido. Estas enzimas de acuerdo con la presente invención se pueden obtener en una cantidad deseada, por ejemplo, cultivando microorganismos capaces de producir las enzimas. Los presentes ADN que codifican cualquiera de las enzimas son bastantes útiles para producir tales enzimas como proteínas recombinantes. En el caso de usar transformantes con los ADN introducidos, las enzimas de acuerdo con la presente invención se pueden producir en una cantidad deseada. Las presentes enzimas se pueden usar para la producción de sacáridos no reductores que tienen una estructura de trehalosa, que incluye trehalosa, en un intervalo de temperaturas medio y/o un intervalo de pH ácido. Particularmente, cuando se usan las presentes enzimas en combinación con otras enzimas relacionadas con sacáridos que tienen una temperatura óptima en un intervalo de temperaturas medio y/o un pH óptimo en un intervalo de pH ácido, se pueden producir sacáridos deseados de forma bastante eficaz. Las enzimas de acuerdo con la presente invención son las que tienen secuencias de aminoácidos descritas; se pueden usar de forma segura para producir los sacáridos no reductores a usar en productos alimentarios y farmacéuticos. Los sacáridos no reductores y sacáridos reductores, que contienen los mismos y que tienen una menor capacidad de reducción, producidos por la presente invención, tienen un sabor dulce débil y de alta calidad y, mucho más preferiblemente, tienen una capacidad de reducción poco sustancial o una capacidad de reducción reducida en un amplio margen. Por lo tanto, los sacáridos se pueden usar arbitrariamente en composiciones en general, tales como alimentos, cosméticos y farmacéuticos con menor riesgo de coloración y deterioro.

La presente invención con estas propiedades y características ventajosas insondadas es una invención útil que contribuiría en gran medida a esta técnica.

Para el propósito de esta solicitud, las secuencias indicadas son las siguientes.

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(1) INFORMACIÓN PARA SEC ID Nº: 1:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 756

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID Nº: 1:

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8

9

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(2) INFORMACIÓN PARA SEC ID Nº: 2:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 6

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(v): TIPO DE FRAGMENTO: fragmento interno

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID Nº: 2:

10

\vskip1.000000\baselineskip

(3) INFORMACIÓN PARA SEC ID Nº: 3:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 6

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(v): TIPO DE FRAGMENTO: fragmento interno

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID Nº: 3:

11

\vskip1.000000\baselineskip

(4) INFORMACIÓN PARA SEC ID Nº: 4:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 20

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(v): TIPO DE FRAGMENTO: fragmento N-terminal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID Nº: 4:

12

\vskip1.000000\baselineskip

(5) INFORMACIÓN PARA SEC ID Nº: 5:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 20

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(v): TIPO DE FRAGMENTO: fragmento interno

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID Nº: 5:

13

\vskip1.000000\baselineskip

(6) INFORMACIÓN PARA SEC ID Nº: 6:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 20

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(v): TIPO DE FRAGMENTO: fragmento interno

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID Nº: 6:

14

\vskip1.000000\baselineskip

(7) INFORMACIÓN PARA SEC ID Nº: 7:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 2268

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): hebra: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID Nº: 7:

15

\vskip1.000000\baselineskip

(8) INFORMACIÓN PARA SEC ID Nº: 8:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 28

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): hebra: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID Nº: 8:

16

\vskip1.000000\baselineskip

(9) INFORMACIÓN PARA SEC ID Nº: 9:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 575

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID Nº: 9:

17

18

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(10) INFORMACIÓN PARA SEC ID Nº: 10:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 6

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(v): TIPO DE FRAGMENTO: fragmento interno

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID Nº: 10:

19

\vskip1.000000\baselineskip

(11) INFORMACIÓN PARA SEC ID Nº: 11:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 6

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(v): TIPO DE FRAGMENTO: fragmento interno

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID Nº: 11:

20

\vskip1.000000\baselineskip

(12) INFORMACIÓN PARA SEC ID Nº: 12:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 7

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(v): TIPO DE FRAGMENTO: fragmento interno

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID Nº: 12:

21

\vskip1.000000\baselineskip

(13) INFORMACIÓN PARA SEC ID Nº: 13:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 7

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(v): TIPO DE FRAGMENTO: fragmento interno

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID Nº: 13:

22

\vskip1.000000\baselineskip

(14) INFORMACIÓN PARA SEC ID Nº: 14:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 20

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(v): TIPO DE FRAGMENTO: fragmento N-terminal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID Nº: 14:

23

\vskip1.000000\baselineskip

(15) INFORMACIÓN PARA SEC ID Nº: 15:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 20

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(v): TIPO DE FRAGMENTO: fragmento interno

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID Nº: 15:

24

\vskip1.000000\baselineskip

(16) INFORMACIÓN PARA SEC ID Nº: 16:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 20

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: aminoácido

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: péptido

\vskip0.800000\baselineskip

(v): TIPO DE FRAGMENTO: fragmento interno

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID Nº: 16:

25

\vskip1.000000\baselineskip

(17) INFORMACIÓN PARA SEC ID Nº: 17:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 1725

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): hebra: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID Nº: 17:

26

\vskip1.000000\baselineskip

(18) INFORMACIÓN PARA SEC ID Nº: 18:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 23

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): hebra: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID Nº: 18:

\vskip1.000000\baselineskip

27

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(19) INFORMACIÓN PARA SEC ID Nº: 19:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 3252

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): hebra: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN genómico

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): FUENTE ORIGINAL.

\vskip0.500000\baselineskip

(A): ORGANISMO: Arthrobacter sp.

\vskip0.500000\baselineskip

(B): AISLADO INDIVIDUAL: S34 (FERM BP-6450)

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: 5'UTR

\vskip0.500000\baselineskip

(B): LOCALIZACIÓN: 1..742

\vskip0.500000\baselineskip

(C): MÉTODO DE IDENTIFICACIÓN: E

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: mat_peptide

\vskip0.500000\baselineskip

(B): LOCALIZACIÓN: 743..3013

\vskip0.500000\baselineskip

(C): MÉTODO DE IDENTIFICACIÓN: E

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID Nº: 19:

\vskip1.000000\baselineskip

28

29

30

31

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(20) INFORMACIÓN PARA SEC ID Nº: 20:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 26

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): hebra: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID Nº: 20:

\vskip1.000000\baselineskip

32

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(21) INFORMACIÓN PARA SEC ID Nº: 21:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 25

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): hebra: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID Nº: 21:

\vskip1.000000\baselineskip

33

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(22) INFORMACIÓN PARA SEC ID Nº: 22:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 50

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): hebra: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID Nº: 22:

\vskip1.000000\baselineskip

34

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(23) INFORMACIÓN PARA SEC ID Nº: 23:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 42

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): hebra: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID Nº: 23:

\vskip1.000000\baselineskip

35

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(24) INFORMACIÓN PARA SEC ID Nº: 24:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 33

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): hebra: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID Nº: 24:

\vskip1.000000\baselineskip

36

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(25) INFORMACIÓN PARA SEC ID Nº: 25:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 33

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): hebra: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID Nº: 25:

\vskip1.000000\baselineskip

37

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(26) INFORMACIÓN PARA SEC ID Nº: 26:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 22

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): hebra: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID Nº: 26:

\vskip1.000000\baselineskip

38

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(27) INFORMACIÓN PARA SEC ID Nº: 27:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 29

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): hebra: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID Nº: 27:

\vskip1.000000\baselineskip

39

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(28) INFORMACIÓN PARA SEC ID Nº: 28:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 31

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): hebra: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID Nº: 28:

\vskip1.000000\baselineskip

40

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(29) INFORMACIÓN PARA SEC ID Nº: 29:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 22

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): hebra: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID Nº: 29:

\vskip1.000000\baselineskip

41

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(30) INFORMACIÓN PARA SEC ID Nº: 30:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 22

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): hebra: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID Nº: 30:

\vskip1.000000\baselineskip

42

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(31) INFORMACIÓN PARA SEC ID Nº: 31:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 26

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): hebra: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID Nº: 31:

\vskip1.000000\baselineskip

43

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip1.000000\baselineskip

(32) INFORMACIÓN PARA SEC ID Nº: 32:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 2218

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): hebra: doble

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN genómico

\vskip0.800000\baselineskip

(vi): FUENTE ORIGINAL:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): ORGANISMO: Arthrobacter sp.

\vskip0.500000\baselineskip

(B): AISLADO INDIVIDUAL: S34 (FERM BP-6450)

\vskip0.800000\baselineskip

(ix): CARACTERÍSTICA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: mat_peptide

\vskip0.500000\baselineskip

(B): LOCALIZACIÓN: 477..2201

\vskip0.500000\baselineskip

(C): MÉTODO DE IDENTIFICACIÓN: E

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE/CLAVE: 3S'UTR

\vskip0.500000\baselineskip

(B): LOCALIZACIÓN: 2202..2218

\vskip0.500000\baselineskip

(C): MÉTODO DE IDENTIFICACIÓN: E

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID Nº: 32:

\vskip1.000000\baselineskip

44

45

46

\vskip1.000000\baselineskip

(33) INFORMACIÓN PARA SEC ID Nº: 33:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 25

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): hebra: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID Nº: 33:

47

\vskip1.000000\baselineskip

(34) INFORMACIÓN PARA SEC ID Nº: 34:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 25

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): hebra: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID Nº: 34:

48

\vskip1.000000\baselineskip

(35) INFORMACIÓN PARA SEC ID Nº: 35:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 36

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): hebra: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID Nº: 35:

49

\vskip1.000000\baselineskip

(36) INFORMACIÓN PARA SEC ID Nº: 36:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 36

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): hebra: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID Nº: 36:

50

\vskip1.000000\baselineskip

(37) INFORMACIÓN PARA SEC ID Nº: 37:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 28

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): hebra: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID Nº: 37:

51

\vskip1.000000\baselineskip

(38) INFORMACIÓN PARA SEC ID Nº: 31:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 28

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): hebra: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID Nº: 38:

52

\vskip1.000000\baselineskip

(39) INFORMACIÓN PARA SEC ID Nº: 39:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 22

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): hebra: única

\vskip0.500000\baselineskip

(D): TOPOLOGÍA: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE SECUENCIA: SEC ID Nº: 39:

53

Claims

1. Una enzima formadora de sacárido no reductor purificada, que forma un sacárido no reductor que tiene una estructura de trehalosa como una unidad terminal de un hidrolizado de almidón parcial reductor, que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 1 o una que tiene una homología de al menos el 80% con la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 1, seleccionándose la secuencia de aminoácidos de tal forma que la enzima tiene una temperatura óptima de 45ºC o más pero inferior a 60ºC cuando se ensaya en la condición de tampón fosfato 20 mM a
pH 6,0.

2. La enzima de la reivindicación 1, que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 2 ó 3.

3. La enzima de la reivindicación 1, que tiene la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las SEC ID Nº: 4 a 6.

4. La enzima de la reivindicación 1, que tiene las siguientes propiedades fisicoquímicas:

(1): Acción

(2): Peso molecular

: Aproximadamente 75.000 \pm 10.000 daltons en electroforesis en gel de dodecil sulfato sódico-poliacrilamida (SDS-PAGE);

(3): Punto isoeléctrico (pI)

: Aproximadamente 4,5 \pm 0,5 en isoelectroforesis usando anfolito;

(4): Temperatura óptima

: Aproximadamente 50ºC cuando se incuba a pH 6,0 durante 60 min;

(5): pH óptimo

: Aproximadamente 6,0 cuando se incuba a 50ºC durante 60 min;

(6): Estabilidad térmica

(7): Estabilidad a pH

5. Un ADN aislado que tiene la secuencia de nucleótidos de la SEC ID Nº: 7, un mutante del mismo en el que una o más bases de la SEC ID Nº: 7 se sustituyen por otras bases en base a la degeneración del código genético sin alterar la secuencia de aminoácidos codificada por la secuencia de nucleótidos de la SEC ID Nº: 7 o una secuencia de nucleótidos complementaria a la misma.

6. El ADN de la reivindicación 5, que tiene la secuencia de nucleótidos de la SEC ID Nº: 8.

7. Una enzima formadora de sacárido no reductor purificada, que se puede obtener mediante la expresión del ADN de la reivindicación 5 o la reivindicación 6.

8. Una enzima liberadora de trehalosa purificada, que hidroliza específicamente un sacárido no reductor que tiene una estructura de trehalosa como una unidad terminal en un sitio entre una parte de la estructura de trehalosa y una parte del resto, que tiene la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 9 o una que tiene una homología de al menos el 85% con la secuencia de aminoácidos de la SEC ID Nº: 9, seleccionándose la secuencia de aminoácidos de tal forma que la enzima tiene una temperatura óptima de 50ºC o más pero inferior a 60ºC cuando se ensaya en la condición de tampón fosfato 20 mM a pH 6,0.

9. La enzima de la reivindicación 8, que tiene la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las SEC ID Nº: 10 a 13.

10. La enzima de la reivindicación 8, que tiene la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las SEC ID Nº: 14 a 16.

11. La enzima de la reivindicación 8, que tiene las siguientes propiedades fisicoquímicas:

(1): Acción

(2): Peso molecular

: Aproximadamente 62.000 \pm 5.000 daltons en electroforesis en gel de dodecil sulfato sódico-poliacrilamida (SDS-PAGE);

(3): Punto isoeléctrico (pI)

: Aproximadamente 4,7 \pm 0,5 en isoelectroforesis usando anfolito;

(4): Temperatura óptima

(5): pH óptimo

: Aproximadamente 6,0 cuando se incuba a 50ºC durante 30 min;

(6): Estabilidad térmica

(7): Estabilidad a pH

12. Un ADN aislado que tiene la secuencia de nucleótidos de la SEC ID Nº: 17, un mutante del mismo en el que una o más bases se sustituyen por otras bases en base a la degeneración del código genético sin alterar la secuencia de aminoácidos codificada por la secuencia de nucleótidos de la SEC ID Nº: 17 o una secuencia de nucleótidos complementaria a la misma.

13. El ADN de la reivindicación 12, que tiene la secuencia de nucleótidos de la SEC ID Nº: 18.

14. Una enzima liberadora de trehalosa purificada, que se puede obtener mediante la expresión del ADN de la reivindicación 12 o la reivindicación 13.

15. La enzima de la reivindicación 1 o la reivindicación 8, que se obtiene de un microorganismo.

16. La enzima de la reivindicación 15, en la que dicho microorganismo es del género Arthrobacter.

17. La enzima de la reivindicación 16, en la que dicho microorganismo es uno seleccionado del grupo que consiste en Arthrobacter sp. S34 y mutantes del mismo capaces de producir dicha enzima.

18. El ADN de la reivindicación 5 o la reivindicación 12, que se ha insertado en un vector que se puede replicar de forma autónoma.

19. El ADN de la reivindicación 18, que se ha introducido en un hospedador apropiado.

20. Un proceso para producir la enzima de la reivindicación 1 o la reivindicación 8, que comprende las etapas de:

cultivar un microorganismo, capaz de formar dicha enzima, en un medio de cultivo nutriente para formar dicha enzima; recoger la enzima forma del cultivo resultante, en el que el microorganismo comprende ADN que codifica la enzima formadora de sacárido no reductor de acuerdo con la reivindicación 1 o la enzima liberadora de trehalosa de acuerdo con la reivindicación 8.

21. El proceso de la reivindicación 20, en el que dicho microorganismo es del género Arthrobacter.

22. El proceso de la reivindicación 21, en el que dicho microorganismo es uno seleccionado del grupo que consiste en Arthrobacter sp. S34 y mutantes del mismo capaces de producir dicha enzima.

23. El proceso de la reivindicación 20, en el que dicho microorganismo es un transformante preparado en su totalidad introduciendo el ADN de la reivindicación 5 o la reivindicación 12 en un hospedador apropiado.

24. El proceso de la reivindicación 20, que comprende además las etapas de:

tratar el cultivo resultante con una enzima de lisis de células; y

recoger la enzima del resultante.

25. El proceso de la reivindicación 20, que contiene una etapa de recoger la enzima producida mediante una o más técnicas seleccionadas del grupo que consiste en diálisis, precipitación con sales, filtración, concentración, sedimentación de separación, cromatografía de filtración en gel, cromatografía de intercambio iónico, cromatografía hidrófoba, cromatografía de fase inversa, cromatografía de afinidad, electroforesis en gel e isoelectrofocalización.

26. Un microorganismo seleccionado del grupo consiste en Arthrobacter sp. S34 y mutantes del mismo capaces de producir la enzima de la reivindicación 1 o la reivindicación 8.

27. Un proceso para producir un sacárido, que comprende las etapas de:

someter un hidrolizado de almidón parcial reductor a la acción de la enzima de la reivindicación 1 o la reivindicación 7 y, opcionalmente la reivindicación 8 o la reivindicación 14, para formar un sacárido no reductor; y

recoger el sacárido no reductor producido o la composición de sacáridos que comprende dicho sacárido no reductor de la mezcla resultante.

28. El proceso de la reivindicación 27, en el que dicho hidrolizado de almidón parcial reductor es uno que tiene un grado de polimerización de glucosa de 3 o superior y que se puede obtener sometiendo almidón o sustancia amilácea a la acción de un ácido y/o hidrolasa de almidón.

29. El proceso de la reivindicación 27, en el que una o más enzimas seleccionadas del grupo que consiste en \alpha-amilasa, \beta-amilasa, glucoamilasa, enzima de desramificación de almidón, ciclomaltodextrina glucanotransferasa y \alpha-glucosidasa se dejan actuar adicionalmente sobre hidrolizado de almidón parcial reductor en la etapa de formación del sacárido no reductor.

30. El proceso de la reivindicación 27, en el que dicho sacárido no reductor es un miembro seleccionado del grupo que consiste en trehalosa, \alpha-glucosiltrehalosa, \alpha-maltosiltrehalosa, \alpha-maltotriosiltrehalosa, \alpha-maltotetraosiltrehalosa y \alpha-maltopentaosiltrehalosa.

31. El proceso de la reivindicación 27, en el que dicha trehalosa está en forma de un cristal hidratado o anhidro.