CA1221090A

CA1221090A - Procede pour la preparation de sulfates de xylanes et les sulfates de xylanes ainsi obtenus

Info

Publication number: CA1221090A
Application number: CA000449345A
Authority: CA
Inventors: Jacqueline Lansen; Jean-Pierre Maffrand; Alain Bayol; Jean-Marie Pereillo; Eric Vallee
Original assignee: ANIC; Sanofi SA
Current assignee: ANIC; Sanofi SA
Priority date: 1983-03-24
Filing date: 1984-03-12
Publication date: 1987-04-28
Also published as: GR79831B; IL70846A0; ATE24520T1; ES530266A0; JPS6063203A; KR840008376A; DE3461808D1; PT78179B; AU2441284A; NZ207622A; FR2543145B1; AU561588B2; DK55784D0; EP0125152B1; US4699900A; FR2543145A1; DK55784A; KR860001394B1; ZA842176B; ES8500962A1

Abstract

L'invention concerne un procédé pour la préparation par fractionnement de sulfates de xylanes d'une masse molaire apparente comprise entre 7000 et 12000. L'invention concerne également les sulfates de xylanes ainsi obtenus, lesquels sont notamment utiles en tant qu'agents anti-thrombotique et hypolipémiant.

Description

~'ZlV90 La présente invention concerne un procédé pour la préparation de sulfates de xylanes, et les sulfates de xylanes ainsi obtenus. Ces sulfates sont utiles en médecine humaine et vétérinaire.
Il est classique, lorsqu'on désire obtenir en thé-rapeutique une action anti-coagulante et anti-thrombotique, d'utiliser généralement l'héparine. Cette dernière, qui est une substance d'extraction animale appartenant à la classe des mucopolysaccharides acides est ainsi administrée en cli-nique, comme agent anti-coagulant, par exemple en hémodialyse rénale, et comme agent anti-thrombotique dans la prévention et le traitement des thromboses veineuses profondes et dans le traitement des thromboses artérielles et des embolies pulmonaires. Cependant, cette thérapeutique présente d'assez sérieux inconvénients, liés d'une part aux risques d'hémor-ragie qu'elle provoque, et d'autre part au fait qu'on observe fréquemment, lors de son administration, des thrombopénies accompagnées dans certains cas de complications thromo-emboliques et éventuellement associées à des thromboses, ainsi qu'un certain nombre d'autres effets secondaires (chocs, alopécies, ostéoporoses).
On connait, par ailleurs, un autre polysaccharide sulfaté, appelé dans la littérature SP 54 ou PZ 68, qui présente une efficacité clinique comparable à l'héparine.
Ce composé, qui est obtenu par hémisynthèse à
partir du bois du hêtre, présente en outre la caractéristi-que d'être d'un coût très inférieur à celui de l'héparine.
Il se présente sous la forme d'un mélange de sulfates de xylanes de différents poids moléculaires. Ce produit est cependant mal défini et on trouve à son sujet dans la lit-térature différentes caractéristiques analytiques.
Ainsi, VINAZZER et al. reportent successivement un poids moléculaire moyen de 2000 (Thromb. Res, 1980, 20, 57-68) puis de 3000 (thromb. Res, 1982, 27, 341-352).
C.O. ESQUIVEL et al. (Thromb Res, 1982, 28, 389-399) decri-~1~

1~f ,1~)9 - la -vent un poids moléculaire moyen de 4000 ; enfin C. SORIA et al.
(Thromb Res 1980, 19, 455-463) signalent un poids moléculaire moyen de 6000.
Cette disparité dans les poids moléculaires moyens, est sans doute due aux méthodes d'analyse et aux standards utilisés ainsi qu'à l'absence de précision sur la nature (apparente, en poids, en nombre) de la masse molaire /

~lZ~()9~

La demanderesse a trouvé que ce produit, qul répond ~ la formule statistique dévelopée suivante :

_ _ ~ 0~ \

1 D ~ ~ n dans laquelle R représente le groupe -S03 Na ou l'hydrogène dans des propor-tions telles que le degré de sulfatation (D.S.) soit de 1,51 est défini par les caractères analytlques suivants :
Ma - tmassss moléculaires moyennes apparentes ) : 6000 Mn ~ ~massss mol~culaires moyennes en nombre) : 5400 Mw ~ (masses moléculalres moyennes en poids) : 7000 Par degré de sulfatation, on désigne le nombre de groupes -S03 Na par motif monomère de xylose.
Ces déterminations de masses moléculaires ont été confirmées par une mesure de la masse molaire par dosage de formol après oxydation des extrémités réductrices : M ~ 6300.
Ls produit SP 54 est encore défini par les caractéristiques suivantes :
Dispersion : D ~ Mw/Mn = 1,29 % d'acides uroniques : 5,8 % de pentoses : 35,5 La présente invention concerne de nouvelles fractions de sulfates de xylanes, répondant encore à la formule (I) mais définies par une masse molaire apparente comprise entre 7000 à 12000 et par les autres caractéristiques sui-vantes : - le degré de sulfatation est compris entre 1,5 et 2,0 - le pourcentage en acide uronlque est compris entre 0 et 10 - le pourcentage en pentose est compris entre 30 et 40.

Les caractères analytiques ci-dessus ont été déter-minées d'après les méthodes ci-après:
1 - Détermination de la masse moléculaire : Elle est réalisée par chromatographie d'exclusion à travers deux colo~nes de silice poreuse placées en série. L'appareil utilisé est celui de HEWLETT PACKARD 1081 B équipé d'un réfractomètre * *
WATERS R 401 et d'un injecteur HP 79841 A . L'ensemble est thermostaté à 30C. La phase mobile est préparée selon BARTH
H.G. et SMITH D.A. (J.Chromatogr, 1981, 206 410-415) et modifiee en ajoutant du polyéthylène glycol pour éviter les interactions de type pont hydrogène. Les masses moléculaires moyennes en nom~re ~Mn), en poids (Mw) et apparente (Ma) sont calculées à partir d'un étalonnage réalisé à l'aide d'oligosaccharides neutres et de Dextrans.

2 - Masse moléculaire moyenne en nombre par libération de formol Xylane : La détermination de la masse moléculaire absolue moyenne en nombre est réalisée par la méthode de VASKOVSKI V.E.
et ISAY S.V. (Anal Biochem, 1969, 30, 25-31) après réduction par le borohydrure de sodium.
Polysulfate de xylane : La détermination absolue de la masse moléculaire moyenne en nombre est réalisée comme pour les xylanes mais après désulfatation du produit.

3 - Le degré de dispersion (D) est défini par le rapport Mw/Mn

4 Dosag_ des acides uroniques : Laméthode employée est celle au carbazole de BITTER T. et MUIR H.M. (Anal Biochem, 1962, 4, 330-334)~ ,

5 - Microdosage du soufre : Après minéralisation en fiole de SHONIGER W. (Mikrochim Acta, 1956, 1, 869-876), le soufre est dosé conductrimétriquement par perchlorate de baryum.
Le degré de sulfatation (D.S.) est défini par 5 fois le rapport _ (moles).

6 - Dosage des pentoses : La méthode employée est celle à
l'orcinol et au chlorureferrique en milieu chlorhydrique (MEJBAUM W. - Z. Physiol. Chem, 1979, 258, 117) en prenant * (marque de commerce) lU~

- 3a -le xylose comme étalon.
L'invention comprend également un procédé de pré-paration des fractions de l'invention de la formule I ci-dessus, caractérisée en ce que le produit SP 54 est soumis directement à des fractionnements qui peuvent être obtenus, soit par chromatographie sur colonne, soit par ultra-filtra-tion.
/

9o Ce fractionnement peut etre effectué également sur les xylanes obtenus après désulfatatlDn du SP 54.
Selon cette variante, le sel de pyridlnlum du SP 54 est soumis à une désulfatation par traitemen~ avec du dlméthyl-sulfoxyde addltlonné
5de 3 % à 10 % d'eau, à des températures comprlses entre 50G C et 100 C.
Le xylane D~tenu, qui répond à la formule développée sulvante :
_ , 0~ ~ \~
o~ o~ i oe ~ I I ) ,00~

C~30 la n est défini par les caractéristiques ci-après :
Ma ~ 30DO - Mn = 1950 - Mw = 3500 -D = 1,61 Masse moléculaire ~dosage chimique) M = 2000 Degré de sulfatation (D.S.) = O
Pourcentage d'acides uroniques : 16,5 ~ en poids ~exprimé en acide glucuronique)Pourcentage de pentoses : 79,5 % en poids lexprimé en xylose monomère).
Le xylane est alors fractionné par solubilisation et/ou par chroma-tographie sur colonne, ou ultra-filtration. On choisit ensuite les fractions recherchées qui, par sulfatation, conduisent aux composés de l'invention.
Cette sulfatation est effectuée solt par l'acide chlorosulfonique sn présence de pyridine et éventuellement de diméthylformamide(D.M.F.),soit par le complexe trioxyde de soufre-triméthylamine dans le diméthylformamide.
Les exemples non limitatifs suivants illustrent l'invention.
La matière de départ SP 54 utilisée dans ces exemples est celle dont les caractéristiques analytiques ont été définies ci-dessus, et les caractéris-tiques analytiques des produits finaux ont été déterminées selon les mêmes mé-thodes.

1V~O

Exemple 1 : Désulfatation du polysulfate de xylane (SP 54)Une solution de 60 g de polysulfate de xylane SP 54 (sel de sodium) dans 80 ml d'eau distillée est éluée avec de l'eau distillée sur une colonne de 500 ml de résine échangeuse de cations (IRN 77 - Forme H ). Les éluats acides sont direc-tement recueillis dans un récipient contenant 32 ml de pyridine et placés dans un bain de glace.
La solution obtenue est lyophilisée. Le sel de pyridinium du polysulfate de xylane est récupéré sous forme de poudre blanche : m = 68 g. Une solution de 36 g de ce sel de pyri-dinium dans 100 ml de diméthylsulfoxyde à 5% d'eau est chauffée pendant 4 heures à 80C. Après refroidissement, le milieu réactionnel est versé dans 600 ml de méthanol. Le précipité formé est recueilli par filtration, lavé avec de l'éthanol, puis redissoùs dans 100 ml d'eau distillée. Le pH de cette solution est ajusté à 7,0 par addition de soude N. Puis cette solution est dessalée en trois opérations sur une colonne préparative de gel Séphadex G 15 (longueur 45 cm, diametre 10 cm), éluée avec de l'eau distillée. Les frac-tions de têtes qui contiennent le polymère désulfaté,exempt de sulfate minéral sont recueillies puis lyophilisées~
On recueille 11,3 g de xylane désulfaté.
Caractéristiques analytiques ____________________________ Mn = 1950 Mw = 3500 D = 1,81 Ma = 3000 Masse moléculaire (dosage chimique) = 2000 Degré de sulfatation = nul Pourcentage d'acides uroniques = 16,5% en poids (exprimé en acide glucuronique).

Pourcentage de pentoses = 79,5% en poids (exprimé en xylose monomère) * (marque de commerce) Exemple 2 : Fractionnement du Xylane par solubilisation puis sulfatation.

Fractionnement du xylane ______________~_________ On ajoute en petites portions, sous agitation magnétique, 150 g de xylane (exemple 1) dans 1400 ml d'eau distillée maintenue à 50C.
On laisse revenir la suspension à température ambiante.
1) la fraction de xylane insoluble est séparée par centri-fugation puis remise en suspension dans l'eau et lyophilisée.
Poids 44,1 g : rendement en poids : 29,4 ~.
Pourcentage d'acides uroniques : 15,76% en poids (exprimé en acide glucuronique).
2) La fraction soluble du xylane (surnageant) est lyophilisée à son tour. On récupère 86,5 g de poudre de couleur crème.
Rendement en poids : 57,7~.
Pourcentage d'acides uroniques : 17,02~ en poids (exprimé en acide glucUronique).
Sulfatation de la fraction de xylane insoluble dans l'eau à
10~ poids/volune ________________ Dans un tricol de 500 ml, on dissout sous atmosphère d'azote et agitation magnétique 12 g du xylane ci-dessus dans un mé-lange de 65 ml de pyridine anhydre et 65 ml de diméthyl-formamide anhydre.
On ajoute goutte à goutte dans la solution maintenue à 0C, 28,3g (16,2 ml) d'acide chlorosulfonique. Après la fin de l'addition le milieu réactionnel est chauffé à 75C pendant 4 h 30. Après refroidissement le mélange est ensuite versé
dans 1200 ml de méthanol. Le précipité formé est filtré
et dissous dans 100 ml d'eau distillée. La solution (pH 3,95) est basifiée avec de la soude N jusqu'à pH 8,9. On évapore et le résidu est repris avec 50 ml d'eau distillée. Le pH
est contrôlé (7,6) puis la solution est versée dans 1300 ml de méthanol. Le précipité formé est filtré, repris avec 100 ml d'eau puis la solution ainsi obtenue est traitée avec ~' lZ~l()9~1~

- 6a -30 g de noir animal à 75C pendant 1 heure.
On filtre et répete l'opération avec 30 g de noir animal.
La solution finale est filtrée sur Millipore 0,5 micron, puis lyophilisée. On obtient 18,2 g d'une poudre de couleur marron.
Caractéristiques analytiques Mn = 7690 Mw = 10890 D = 1,42 Ma = 9470 Degré de sulfatation = 1,72 Pourcentage d'acides uroniques = 4,98% en poids (exprimé en acide glucuronique) Pourcentage de pentose = 30,4% en poids (exprimé en xylose monomère) .~ _ * (marque de commerce) ~10~
Exemple 3 : Fractionnement du xylane par solubillsatlon pUi5 sulfatation Fractionnement du x~lane 3D g de xylane ~exemple 1) sont mls en suspension dans 240 ml d'eau distillée.
Le milieu est port~ à pH 12 par sddltion de 6 ml de soude 6 N et abandonné
une nuit sous agitation et atmosphère d'azote.
La fraction de xylane lnsoluble est recueillie par centrifugation.
Les culots sont repris avec de l'eau et les suspensions obtenues sont lyophilisées.
Poids 7,3 g Pourcentage en acides uroniques : 12,6 % ~exprimé en acide glucuronique) Réaction de sulfatation du xylane insoluble à eH 12 _________________ __ _ _ _ ______________ ____ On dissout, sous atmosphère d'azote, 7 g de xylane ci-dessus clans un melange de 25 ml de pyridine anhydre et 25 ml de DMF anhydre.
La solution refroidie à 0 C est additionnée goutte à goutte de 16,4 g d'acide chlorosulfonique. Après la fin de l'addition, le mélange réactionnel est chauffeà 75 C pendant 4 h 30.
Après refroidissement, la solution est versée dans B50 ml de méthanol. Le sel de pyridinium du sulfate de xylane est filtré, rincé avec de l'acétone, et dissous dans 80 ml d'eau (pH 2,85). La solution est basifiée jusqu'à pH 8,1 avec de la soude N, puis évaporée sous vide. Le résidu est repris avec 30 ml d'eau tpH 4,5). On ramène le pH à 11 avec de la soude N et verse la solution dans 1200 ml de méthanol.
Le précipité crème est filtré, lavé avec de l'éther puis séché sous vide.
Poids obtenu 5 g.
Cara~téristigues analytigues ____________ ________ __ ___ Mn = 7550 Mw = 10270 D = 1,33 Ma = 9120 Degré de sulfat-ation = 1,59 Pourcentage d'acides uroniques = 6,10 % en poids ~exprimé en acide glucuronique)3û Pourcentage de pentoses = 31,3 % en poids ~exprimé en xylose monomère).

~LZ~11)9C~

Exemple 4 : Fractionnement par chromatographie du xylane soluble dans l'eau obtenu à l'exemple 2 puis sulfatation.
Fractionnement du xylane ________________________ Le produit de départ utilisé dans ce fractionnement est constitué par la fraction de xylane soluble dans l'eau comme décrit dans l'exemple 2, que l'on obtient par congela-tion et lyophilisation du filtrat.
On chromatographie 4 g de xylane soluble à 10% sur 2 colonnes (longueur : 75 cm, diamètre 6,0 cm) garnies de silice poreuse Sphérosil XOA 400 (granulométrie 40-100 mesh, porosité 80 A), adaptées à un appareil de chromatographie préparative WATERS Prep 500 en utilisant comme éluant de l'acide acétique à 2% dans de l'eau distillée ; le détecteur est un réfractomètre différentiel.
La courbe réponse obtenue par réfractométrie est découpée en 6 parties et les fractions liquides correspon-dantes sont lyophilisées. On recommence l'opération cinq fois et on rassemble les fractions homologues.
Bilan cumulé des 6 opérations ____________________ ________ Fraction 1 - 1,15 g Fraction 2 - 3,47 g Fraction 3 - 3,55 g Fraction 4 - 7,60 g Fraction 5 - 5,70 g Fraction 6 - 0,30 g Réaction de sulfatation de la fraction 2 ________ _______________________________ On suspend, sous atmosphère d'azote sec, 3,40 g de xylane (fraction 2 ci-dessus), dans 30 ml de diméthylforma-mide anhydre.
On ajoute 14 g (103 mmoles) de complexe trioxyde de soufre-triméthylamine et l'on chauffe le milieu réaction-nel pendant 6 heures à 75C. Après refroidissement, le milieu réactionnel est évaporé à sec sous vide. Le résidu obtenu est repris avec 52 ml de soude 2N et la solution obtenue est * (marque de commerce) . ~, à nouveau évaporée à sec. Le résidu est dissous dans 70 ml d'eau distillée, et le pH (initialement à 5,6) est ramené à
8,0 par addition de 15 ml de soude 2N après évaporation à
sec, le résidu est repris avec 70 ml d'eau et la solution obtenue (pH7) est filtré sur millipore 5 y, puis chromato-graphièe sur 2 colonnes de silice poreuse (éluant : eau distillée) afin d'éliminer les sels minéraux.
La fraction d'éluant correspondant au sulfate de xylane est lyophilisée.
On obtient 5,30 g de poudre crème.
Caractéristiques analytiques Mn = 9260 Mw = 10380 D = 1,12 Ma = 9790 Degré de sulfatation = 1,78 Pourcentage d'acides uroniques = 8,25% en poids (exprimé en acide glucuronique).
Pourcentage de pentoses = 32% en poids (exprimé en xylose monomère).

Exemple _ : Fractionnement par ultrafiltration du xylane soluble dans l'eau obtenu à l'exemple 2, puis sulfatation.

Fractionnement du xylane ________________________ On dissout 25 g de la fraction soluble de xylane dans l'eau, comme décrit à l'exemple 2, dans 1000 ml d'eau distillée. Cette solution est traitée dans un système d'ul-trafiltration équipée d'une cartouche de fibres creuses H lP10-8 de marque AMICON (seuil de coupure 10.000 daltons) à une pression inférieure ou égale à 1 Bar.
L'opération est terminée lorsque 5000 ml d'eau distillée ont été consommés par le système.
Le rétentat d'ultrafiltration est alors soutiré
du système, puis lyophilisé.
On recueille après séchage 4,4 g de poudre crème (rendement : 17,6% par rapport à la quantité initiale).
* (marque de commerce) 9 ~

- 9a -Réaction de sulfatation On suspend, sous atmosphère d'azote sec, 3 g du xylane précédemment isolé, dans 30 ml de diméthylformamide anhydre. On ajoute à la suspension, en plusieurs opérations,

7,90 g (56,7 mmoles) de complexe trioxyde desoufre-triméthyl-amine. Puis le mélange réactionnel est chauffé à 75C pen-dant 5 h 30.
Après refroidissement, on ajoute 80 ml de soude N puis on évapore à sec sous vide de la trompe à eau.
Le résidu est repris avec 30 ml d'eau distillée, on remonte le p~ de la solution obtenue de 5 à 12 par addition de 20 ml de soude N, puis on concentre sous vide. Le résidu d'évaporation est repris par 30 ml d'eau distillée et le pH de la solution obtenue est 9. On ajoute alors de l'acide 15 chlorhydrique N pour raMener le pH à 7, puis la solution est dessalée par élution sur une colonne (L=90 cm 0 = 4,4 cm) de Sephadex G 15 (détection réfractométrique).
La fraction d'éluat contenant les polysulfates de xylane est recueillie puis lyophilisée.

* (marque de commerce) On r~cupLre apres séchage 50U5 vide poussé, à temp~rature ambiante, 4,3 g de poudre blanche.
Caractéristiques analytiques Mn = 9035, Mw = 10550, D = 1,17, Ma ~ 9840, degré de sulfatation : 1,64 Exemple 6 : Fractionnement par ultrafiltration du xylane obtenu à l'exemple 2 puis sulfatation.

Fractionnement du xylane ___________________ ____ Une solution de 15 g de la fraction du xylane soluble dans l'eau obtenue selon l'exemple 2, dans 1500 ml d'eau distillée est ultra-filtrée sur un système équipé d'une cartouche de fibres creuses de seuil de coupure 500D
(type H 1P5-20 marque AMICON ), sous une pression ~ 1 Bar avec apport cDntinu d'eau distillée.
L'opération est terminée lorsque 8000 ml d'eau distillée ont été
utilisés.
Après concentration de la solution retenue par les fibres creuses elle est soutirée du système, puis lyophilisée.
On récupère 4,5 g (30 % de la quantite initiale) de poudre de couleur crème.

Reaction de sulfatation On suspend, sous atmosphère d'azote sec, 4 g du xylane obtenu ci-dessus dans 60 ml de diméthylformamide anhydre. On additionne en plusieurs opérations 10,5 g ~7,5 mmoles) de complexe trioxyde de soufre-triméthylamine, et on chauffe à 80 C pendant 6 heures. Après retour à température ambiante, le milieu réactionnel est additionné de 80 ml de soude N, puis évaporé à sec sous vide~
Le résidu est repris par 50 ml d'eau distillée. Le pH de la solution obtenue est porté de 6,25 à 12,4 par addition de 5 ml de soude N. La snlution est évaporée à sec, sous vide, puis le résidu est repris par 50 ml d'eau distillée. Le pH est ramené de 10,7 à 7,35 par addition de ~,35 ml d'acide chlorhydrique N. La solution est alors ultra-filtrée sur un système équipé de fibres creuses de seuil de coupure 5000 (type H 1P5-20, marque AMICON) afin d'~liminer les sels minéraux résiduels, sous une pression inférieure ou égale a 1 ~ar.
La solution retenue par le système est lyophilisée. nn récupère 6,7 g de poudre blanche.

9o Ceractérlstlques analytlques ~ ~ B340, Mw = 11 31D, D = 1,36, Ma = 9250 Degré de sulfatation ~ 1,55 Pourcentage d'acides uroniques : 9,12 % en poids texprimé en acide glucuroniquP) Pourcentage de Pentoses : 38,3 ~0 en poids texprimé en xylose monomrre) Exemple 7 : Fractionnement par précipitation de la fraction de xylane soluble dans l'eau obtenue à l'exemple 2 pUi5 sulfatation.

Fractionnement du xylane On dissout sous agitation magnétique, 40 g de la fraction de xylane soluble dans l'eau obtenue selon l'exemple 2 dans 400 ml d'eau distillée.
On ajoute à cette solution, en maintenant l'agitation, 200 ml d'éthanol à 95.
Après une demi-heure d'agitatlon, la suspension obtenue est centrifugée.
Les culots de centrifugation sont décantés, repris par de l'eau et récupérés par lyophilisation. On obtient 2,4 g de produit de couleur crème.

Reaction de sulfatation On suspend sous agitation magnétique et atmosphère d'azote sec, 2 g de la fraction de xylane obtenu ci-dessus dans 25 ml de diméthylfor-mamide anhydre.
On ajoute à ce mélange 5,25 g tO,037 moles) de complexe trioxyde de soufre-triméthylamine, et l'on chauffe à 75C pendant 5 heures 30.
Après retour à température ambiante, on ajoute au milieu réactionnel 33 52 ml de soude N, et l'on évapore à sec sous vide. Le residu ainsi obtenu est repris par 40 ml d'eau distillée, et le pH de la solution obtenue est porté de 6 à 13 par addition de 10 ml de soude N. On évapore à sec sous vide et le résidu est repris par 40 ml d'eau dis-tillée. Cette solution est ramenée à pH 7 avec de l'acide chlorhydrique N puis filtrée sur Millipore ~u , et enfin éluée sur une colonne de Sephadex C15 pour éliminer les residus mlnéraux.
La fractlon d'éluat correspondant au polysulfate de xylane est recueillie et lyophilisée.
On obtient 3,75 g de poudre blanche.
Caractéristiques analyti~ues Mn = 10 040, Mw = 11 800, D= 1,1B, Ma= 10 685 Degré de sulfatation = 1,72 Exemple 8 : Fractionnement par solubilisation du xylane obtenu à

l'exemple 1 puis sulfatation Fractionnement du xylane ___________________ __ _ On ajoute, sous agitation magnétique, 150 g de xylane obtenu selon le procédé décrit à l'exemple 1 dans 1000 ml d'eau distillée thermos-tatée à 50 C. Après 8 heures d'agitation, on laisse revenir à tempé-rature ambiante, et la fraction insoluble est récupérée par centrifu-gation~
Les culots de centrifugation repris par un peu d'eau distillée sont rassemblés et lyophilises.
On récupère 38,3 g de poudre de couleur crème.

Réaction du sulfatation ____ __________________ On met en suspension, sous agitation magnétique et sous atmosphère d'azote sec, 5 g de xylane obtenu ci-dessus, dans 50 ml de diméthylfor-mamide anhydre. La suspension est additionnée de 13,5 g [94,5 mmoles) de complexe trioxyde de soufre-triméthylamine et l'on chauffe le milieu ~actionnel à 75C pendant 8 heures, Après retour à température ambiante le mélange est basifié avec 150 ml de soude N jusqu'à pH 8 puis évaporé
3~ à sec sous vide. Le résidu est repris avec 50 ml d'eau distillée et le pH de la solution est ramené de 8,3 à 5,85 par addition.de 0,9 ml d'acide chlorhydrique N.
La solution est alors ultrafiltrée sur un système à fibres creuses équipé d'une cartouche à seuil de coupure 5000 Daltons, de type H 1-P5-20, marque AMICON~, sous une pression inférieure ou égale à
1 Bar, afin d'éliminer les sels minéraux.

Le rétentat est ensulte lyDphilisé.
On recueille 7,9 g de poudre crème.
Caractéristiques analytiques Mn = 667D, Mw = 11 43D, De 1,72, Ma= 9390 Degré de sulfatation : 1,79 Pourcentage d'acides uroniques : 5,1 ~ en poids (exprimé en acide Flucuronique~
Pourcentage de Pentoses : 39,2 % en poids (exprimé en xylDse monomère) Exemple 9 : Fractionnement du polysulfate de xylane [SP 54) par chroma-tographie.

Une colonne de chromatographie[L = 60 cm, 0 = 4,4 cm) est remplie de Cellulose échangeuse d'ions (WHATMAN DE 52) préalablement conditionnée avec un mélange tampon (AcONa 0,2 M, AcOH 0,06 M) à pH 6,5.
Le débit de l'éluant est controlé par une pompe péristaltique et l'analyse des éluats est réalisé par un détecteur U.V. (~ = 254nm).
On injecte sur la colonne 20 g de polysulfate de xylane (SP 54), dissous dans 60 ml de tampon initial, puis on élue avec le meme tampon jusqu'à
stabilisation du produit sur le gel échangeur.
On élue ensuite avec une succession de solutions de chlorure de sodium, de concentrations croissantes.
Les fractionsd'éluat correspondant à chaque solution éluante sont recueillies et lyophilisées.
Succession d'éluants utilisés :
0,3 M NaC1 - F1 0,4 M NaC1 - F2 0,5 M NaC1 - F3 0,6 M NaC1 - F4 0,7 M NaC1 - F5 0,8 M NaC1 - F6 0,9 M NaC1 - F7 1,0 M NaC1 - F5 1,2 M NaC1 - F9 *(marque de commerce) - 14 _ Chaque fractiDn est dessalée, par chromatographle sur colonne de sllice poreuse (éluant : eau distillée) et la fractlon correspondant aux sulfates de polysaccharides purifiés est récupérée par lyophilisation.
L'opératlon est recommencée plusieurs fois pour pouvoir obtenir des quantités suff~santes de chaque produit, par rassemblement des fractions homologues.
Bilan global de qwatre opérations :
F1 4,2 g ttampon 0,3 M NaC1) F2 5,3 g (tampDn 0,4 M NaC1) 1û F3 4,65 g (tampon 0,5 M NaC1) F4 5,25 g (tampon 0,6 M NaC1) F5 6,45 g (tampon 0,7 M NaC1) F6 6 9 30 g (tampon 0,8 M NaC1) F7 6,65 g (tampon 0,9 M NaC1) FB 3,3 g (tampon 1,0 M NaC1) F9 0,65 g (tampon 1,2 M NaC1) Caractéristiques analytiques des fractions sélectionnées :
% acides Mn Mw Disp. Ma D.S. uroniques % Pentoses F6 B120 9090 1,28790 1,58 5,38 38,04 F7 1û500 12050 1,1410960 1,71 4,70 38,66 F8 1132012660 1,1211500 1,69 4,68 3B,04 F9 1174013240 1,1211940 1,71 2,06 35,49 Exemple 10 : Fractionnement du polysulfate de xylane (SP 54) par ultra-filtration.

Une solution de 30 g de polysulfate de xylane (SP54) dans 600 ml d'eau distillée est ultrafiltrée dans un système équipé d'une membrane AMICON
5YM5 (seuil de coupure 5000) et d'une réserve d'eau distillée.
La pression de travail est assurée par de l'azote sous 4 Bars. Après avoir recueilli 8ûO ml d'ultrafiltrat, le contenu de la cellule est récupéré
et lyophilisé.

12~1090 On obtient 11,75 g de poudre blanche (solt 39,1 % du poids lnltial).
Caractéristiques analytiques :
Mn = 7180, MW = 9500, D = 1,32: Ma= 7B9O
Degré de sulfatation : 1,71 Exemple 11 : Fractionnement du polysulfate de xylane (SP 543 par chroma--tographie.

On injecte 3 g de polysulfate de xylane (SP 54)dans 10 ml d'eau distillée sur un système chromatographique composé de deux colonnes en série tL= 75 cm, 0= 6 cm) garnies de silice poreuse Spherosil XOA 400 (granu-lométrie 40-100 mesh, porosité 80 A) avec un débit d'éluant (eau distil-lée) de 4û ml/mn.
La détection est assurée par un réfractomètre différentiel.
La partie d'éluant contenant le polysulfate de xylane est fractionnée en quatre volumes.
L'opération est recommencée 15 fois et les fractions homologues sont regroupées et lyophilisées.
Bilan des 16 opérations :
F1 5,9 g (rendement en poids 12,3 %) F2 5,7 g (rendement en poids 12 %) F3 13,6 g (rendement en poids 28,3 %) F4 15,74 g (rendement en poids 32,8 %) Caractéristiques analytiques de la fraction de plus haut poids molécu-laire (fraction 1) Mn = 9370, Mw = 11 180, D= 1,19, Ma = 9B40 Degré de sulfatation = 1,73 Exemple 12 : fractionnement du polysulfate de xylane (SP 54) par ultrafiltration.

On soumet une solution de 20 g de polysulfate de xylane (SP 54) dans 300 ml d'eau distillée à une ultrafiltration sur un système équipé de fibres creuses de seuil de coupure 5000 Daltons (type H 1 P5-20 marque AMICON), snus une pression inférieure ou égale à 1 Bar.

3 9 ~

Après que le système ait absDrbé 150D ml d'eau distillée, la solutlon des hauts poids moléculaires retenus par les flbres creuses est soutirée du système et lyophillsée.
On recueille 6,7 g de poudre blanche lrendernent : 33,5 % de la quantité
lnitiale).
Caractéristiques analytiques MN = 7160, Mw = BB20, D = 1,23, Ma = 7390 Degré de sulfatation = 1,71 Exemple 13 : Fractionnement du polysulfate de xylane (SP 54) par ultra-filtration.

On soumet une solution de 60 g de polysulfate de xylane [SP 54) dans 1000 ml d'eau distillée à une ultrafiltration sur un système équipé de fibres creuses de seuil de coupure 10 DOO ~type H 1 P10-8, marque AMICON), sous une pression inferieure ou égale à 1 Bar.
Après que le système ait absorbé 5000 ml d'eau distillée, la solution des hauts poids moléculaires retenue par les fibres creuses est soutirée du système et lyophilisée.
On recueille 3,6 g de poudre blanche ~rendement = 6 % en poids de la quantitié initiale).
Caractéristiques analytiques :

Mn = 9500, Mw = 11 720, D = 1,20 Degré de sulfatation = 1,63 Exemple_14 ; Fractionnement du polysulfate de xylane ~SP 54) par ultrafiltration.
Une solution de 30 g de polysulfate de xylane [SP 54) dissous dans SOO ml de NaN03 1M est ultrafiltrée sur le système déjà utilisé dans l'exemple 10, équipé d'une membrane identique de seuil de coupure 5000 [type SYM5 marque AMICON), mais la réserve d'éluant est remplie avec une solution de nitrate de sodium 1M.

~Zl~J90 La pression de travail est assurée par de l'azote sous 4 Bars.
Après avoir recueilli 1600 ml d'ultrafiltrat, le contenu de la cellule est récupéré, puis injecté en plusieurs opérations, sur une colonne préparative (L=45 cm, 0 = 10 cm), garnie de Sephadex G25 , éluee à l'eau distillée, afin d'élirniner le nitrate de sodium.
Les fractions éluant contenant les polymères purifiés sont rassemblées et lyophilisées.
On recueille 6,87 g de poudre blanche (rendement : 22,9 % en poids de la quantité initiale).
Caractéristiques analytiques:

Mn = 9850, Mw = 11815, D = 1,20 Degré de sulfatation = 1,70 Exemple 15 : Fractionnement du polysulfate de xylane (SP 54) par ultrafiltration.
Une solution de 1,2 Kg de polysulfate de xylane (SP 54) dans 18 litres d'eau déminéralisée (concentration en polds 6,66%) est ultrafiltree dans un système équipé d'une cartouche de fibres creuses ROMICON 22-20 PM-5 (Longueur 63 cm, surface développée des filtres 2,4 cm3) et d'une admission d'eau déminéralisée permettant de garder constant, pendant l'opé-ration, le volume de la solution à traiter.
La pompe de recirculation de la solution est réglée pour assurer une pression moyenne de 1,45 Bar et un débit moyen de perméat de 150 ml par minute. Lorsque 42 litres d'ultra-filtrat(2,5 volumes par rapport au volume de solution initiale) ont été obtenus, on soutire le rétentat du système et rince le corps de pompe et l'intérieur des fibres creuses avec 3 litres d'eau déminéralisée.
La solution (21 litres) constituée par le retentat et la solution de rinçage est alors retraitée par le système équipé
cette fois d'une cartouche de fibres creuses ROMIC()N 30-20 PM-10 (longueur 63 cm surface développée des fibres 2,8 cm ).

* (marque de commerce) ~:' 10~

- 17a -Dans un premier temps la solution est concentrée de moitié
(Recueil de 10,5 litres d'ultrafiltrat). Puis l'admission d'eau est ouverte et l'on ultrafiltre à volume de rétentat constant sous 1,4 Bar de pression jusqu'à obtention d'un volume total d'ultrafiltrat de 52 litres (ultrafiltrat de concentration compris). Ce perméat final de 52 litres est alors concentré jusqu'à 22 litres sur le même système équlpé
d'une cartouche ROMICON 15-43 PM2 (Longueur 63 cm, surface développée des fibres 1,4 cm2) puis lyophilisée.

* (marque de commerce) ~Z~ ()9~
On recueille 315 ~ de poudre blanche lRendement 26,2 ~. en poids de la quantlté
lnitiale ).
Caractérlstlques analytlques :
Mn ~ 6700 Mw ~ 7B50 D - 1,17 Ma ~ 7500 Degré de sulfatatlon = 1,75 Les résultats des essais pharmacologiques, qul sont rapportés ci-après, ont permis de mettre en évidence les intéressantes propriétés des produits de l'invention, c'est-à-dire les différentes fractions qui ont été obtenueS à partir du SP 54.
L'invention a donc encore pour oo~et un médicament ayant en particulier des propriétés anti-thrombotique et hypolipémiante carac-térisé en ce qu'il contient, à titre de principe actif, au moins une des fractions préparées par le procédé de l'invention et répondant à la formule (I)-L'étude pharmacologique a porté sur les actions anticoagu-lante, anti-thrombotique, fibrinolytique, lipolytique et le temps de saignement , ces études ont été effectuées comparativement, d'une part à l'héparine, et d'autre part au SP 54.
- L'action anticoagulante est déterminée par le temps de céphaline activé
~CAE~ J., LARRIEU M.J., SAMAMA M. In : L'hémDstase : méthodes d'explora-tion et diagnostic pratique. Ed. : l'Expansion Scientifique Française, 1975. p. 169).
Le temps de céphaline activé (TCA), mesure la recalcification du plasma déplaquetté en présence d'un optimum de lipides lcéphaline) et de célite qui active de manière standardisée les facteurs de la phase de contact lles facteurs XII, XI, IX). Il mesure donc la formation de prothrombi-nase endogène à l'exception des facteurs plaquettaires rernplacés par la cephaline.

O
- L'action ant~thrombDt~que est ap~réciée par l'actlvlté anti Xa (YIN E.T., WESSLER S., BUTLER J.V. - J Lab Clin Me~, 1973, ~1, 298-31n) Le temps de yin mesure ]'action neutralisante du SP 54 et de ses frac-tions vis à vis du facteur Xa en présence d'un excès d'antithrombine III
et facteur Xa.
L'activlté antithrombotique est aussi testée à l'aide d'un modèle de thrombose expérimentale sur fil de sDie introduit dans un shunt artério-veineux chez le rat (UMETSU T., SANAI K. - Thromb Haemost, 197~, 39, 74-~3).
-L'activité fibrinolytique est mesurée par le temps de ]yse des euglobu-lines plasmatiques (KLUFT C. - Haemostasis, 1976, 5, 136).
Le temps de Iyse des euglobulines plasmatiques est une méthode sensibili-sée permettant d'apprécier l'action fibrinolytique globale du SP 54 et de ses fractiDns en l'absence des inhibiteurs physiologiques de la fibri-nolyse, éliminés par dilution et acidification du plasrna.
- L'action lipolytique est mesurée par l'activité lipoprotéine lipase cir-culante (NIKKILA E.A., HUTTUNEN J.K., EHNHOLM C. - Métabolism, 1977, 26, 179).
La détermination de l'activité lipoprotéine lipase circulante est une me-sure indirecte de l'impact du SP 54 et de ses fractions sur le catabolis-me des triglycérides (pouvoir clarifiant). L'activité enzymatique est déterminée par sa capacité d'hydrolyser le substrat 14C-trioleine en 14C-acide oléique.
- Le temps de saignement est déterminé après section transversale de la -queue du rat (STELLA L., DDNATI M.B., DE GAETANO C. - 1~hromb Res, 1975, 7, 709-716).
Pour ces différentes expérimentations, des rats mâles (Sprague Dawley) d'un poids de 200 g à 300 g ont été utilisés.
Ces animaux sont anesthésiés au pentobarbital (50 mg/Kg) par la voie intrapéritonéale et les produits à tester sont administrés par la voie intraveineuse tveine du pénis). ~uinze minutes après l'administration des produits, les échantillons sanguins sonl prelevés cl l;aorte abdomi-nale et rendus incoagulables par une solution de citrate trisodique à
3,6 p. 1ûO (1 volume d'anticoagulant pour 9 volumes de sang) ou de l'hé-parine (25U/ml de sang).
Immédiatement après le prélèvement sanguin, les échantillons sont cen-trifugés à 2000 x g pendant 15 minutes à 4C. pour la préparation du plasma citraté qui est uti]isé pour les différents dos~ges.

-` ` 12~109Q

Les r~sultats sDnt rassemblés dans les tableaux 1 et 2 ~ leur analyse statistique a été effectu~e :
a) selcn 1~ test de S~UDEN- (grDupe de cnmparaisun : S~ 54) b) selcn le test U de MANN et WHI~NEY (groupe de cDmparaiscn :
témcins).
NS : nDn significatif : p 0,05 : p 0,01 p 0,001 /

_ _ COAGULATION SANGUINE (a) PRODUITS Ma T.C.A. ANTI-Xa 2,5 mg/kg/IV 5 mg/kg/IV 5 mg/kg/rV
% prolongation % prolongati.on % prolonga-. _ _ tion HEPARINE 20 000 1 178 incoagulable 506 _ Exemple 2 9 470 129 X 298 X 57 Exemple 3 9 120 155 ~ 512 ~ 183 _ Exemple 4 9 790 178 ~ 442 ~ 91 ~
. __ Exemple 5 9 840 ~ 214 ~ 1 090 X~ 79 Exemple 6 9 260 168 ~ 1 100 ~ 112 Exemple 7 10 685 190 ~ 591 ~ 70 Exemple 8 9 380 134 ~ 461 ~ 76 _ _ Exemple 9 F6 8 790 102 (NS) 180 (NS) 67 _ ~
Exemple 9 F710 960 186 ~ 442 ~ 74 __ _ Exemple 9 F811 500 212 ~ 631 ~ 104 ~
- I
Exemple 9 F9 11 940 243 ~ 723 ~ 112 X~
_ Exemple 10 7 890 158 ~ 486 X~ 80 ~ .
Exemple 11 9 840 248 X~ 844 ~ 68 Exemple 12 7 390 149 (NS) I 369 ~ 67 _ .
Exemple 13 10 780 281 X~ 1 100 X~ 126 ~
_ _ _ _ I
Exemple 14 10 190 173 ~ 634 X~ 84 ~K
__ Exemple 15 7 500 171 ~ 352 (NS) 41 Tableau 1 ,~

lZ~lOgO

_ FIBRINOLYSE LIPOPROTEINE THROMBOSE TEMPS DE
LIPASE FIL DE SO:[E SAIGNEMENT
(a) (a) (b) (b) PRODUITS Ma2,5mg/kg/IV 2,5mg/kg/IV 5 mg/kg/IV 5 mg/kg/rV
d'activa- % de libéra- ~ d'inhibi- Facteur d'al-tion tion tion longement SP 54 6 000 48 59 _ 53 ~ X 1,6 HEPARINE20 000 40 64 - 57 ~ ~X 10 .
Exemple 29 470 57 ~ 84 ~ - 58 ~ X 1,8 X
_ Exemple 39 120 57 ~ 105 ~ - 85 ~ X 4,2 Exemple 49 790 65 ~ 101 ~ _ 96 Exemple 59 840 61 ~ 86 ~ - 86 _ _ Exemple 69 260 50 (NS) 97 ~ - 26 (NS) X 3,0 Exemple 710 685 37 ~ 84 ~
_ _ _ _ _ Exemple 89 380 46 (NS) 77 ~ -100 ~ >X 10 Exemple 9 F6 8 790 36 ~ 64 (NS) _ Exemple 9 F7 10 960 41 ~ 77 ~X
_~
Exemple 9 F8 11 500 60 ~ 92 ~X~ - 42 ~ X 1,4 (NS) _ _ Exemple 9 F9 11 940 62 ~ 115 ~
_ Exemple 107 890 58 ~ 160 ~ - 85 ~ X 2,1 X
_ Exemple 119 840 63 ~ 78 ~ - 79 ~ X 2,7 X
__.
Exemple 127 390 42 (NS) 96 ~
_____ ______ . .__ Exemple 1310 780 48 (NS) 94 ~
_ _ _____ _ --._ ____ _ _ .__ _ _ _ Exemple 14 10 190 35 ~ 85 ~
__ _ __ _ _ __ _. . . _ _ ____ . . __ ___ Exemple 15 7 500 41 (NS) 38 X - 54 ~ X 2,2 X
. .

Tableau 2 ~zz~ug~

Les travaux qui viennent d'être rapportés ont mis en évidence les intéressantes propriétés anti-thrombotique et hypolipémiante des produits de l'invention.
En effet, bien que produisant une action anti-thrombotique importante, l'effet anticoagulant du médicamentde l'invention est faible, réduisant ainsi notamment les risques d'hémorragie qui accompagnent ce type de médicaments.
Lemédicament de l'invention peut être présenté
sous des formes administrables par les voies orale, parenté-rale, rectale et locale.
Chaque dose unitaire contient avantageusement de0,010 g à 0,250 g, les doses administrables journellement pouvant varier de 0,010 g à 0,500 g en fonction de l'âge et de la gravité de l'affectation traitée.
On donnera ci-après à titre d'exemple non limitatif quelques formulations pharmaceutiques du médicament de l'invention 1 - comprimés Fraction n 2 ...................... 0,050 g Excipient ........... q.s.p......... 1 comprimé
2 - Gélules Fraction n 6....................... 0,075 g Excipient............ q.s.p......... 1 gélule 3 -ampoules injectables Fraction n 8...................... 0,100 g Solvant isotonique .. q.s.p......... 1 ampoule de 2 ml 4 - Pommade Fraction n 10 .................... 0,150 g Excipient............ q.s.p......... 1 tube de 30 g Par leur action sur les différents stades de la coagulation sanguine et de la fibrinolyse, ces médicaments peuvent être utilisés avec profit, en cures prolongées et repétées dans le traitement préventif ou curatif d'accidents thrombo-emboliques veineux ou artériels dans les cas de - 23a -phlébites, embolies pulmonaires et autres situations clini-ques du même type, angines de poitrine, infarctus du myocarde, artérites chroniques des membres inférieurs, troubles cir-culatoires superflciels et ulcères des jambes.
Ils peuvent également être utilisés pour prévenir les thromboses dans les circuits extra-corporels (hémodialyses rénales).

.

1~1090 En outrz, leur action sur la lipoprotelne-llpase (facteur c13-rifiant) les rend partlcullèrement utiles dans le traltement des dysllpé-mies a~hérogènes.
Enfin, ces médlcaments peuvent également être utillsés avec proflt dans le traitement de certaines maladles inflammatoires, telles que

Claims

Les réalisations de l'invention, au sujet desquel-les un droit exclusif de propriété ou de privilège est revendiqué, sont définies comme il suit:

1. Procédé pour la préparation de sulfates de xylanes ayant un degré de sulfatation compris entre 1,5 et 2,0, une masse molaire apparente comprise entre 7000 et 12000, un pourcentage en acides uroniques compris entre 0 et 10 et un pourcentage en pentoses compris entre 30 et 40, caractérisé en ce que le polysulfate de xylane SP 54, dont la masse moléculaire apparente est inférieure à 7000, - soit est soumis à des fractionnements par chromatographie sur colonne, - soit est soumis à des fractionnements par chromatographie sur colonne après désulfatation du SP 54, les fractions obtenues étant ensuite sulfatées de nouveau.

2. Procédé selon la revendication 1, caracté-risé en ce que polysulfate de xylane SP 54, dont la masse moléculaire apparente est inférieure à 7000, est soumis à des fractionnements par chromatographie sur colonne.

3. Procédé selon la revendication 1, caracté-risé en ce que le fractionnement est obtenu par ultra-filtration.

4. Procédé selon la revendication 1, caracté-risé en ce que le fractionnement est effectué après désulfatation du SP 54 et que les fractions alors obtenues sont ensuite sulfatées de nouveau.

5. Procédé selon la revendication 4, caracté-risé en ce que la désulfatation est effectuée par traite-ment avec du diméthyl-sulfoxyde additionné de 3 p.100 à
10 p. 100 d'eau à des températures comprises entre 50°C
et 100°C.

6. Procédé selon la revendication 1, 4 ou 5, caractérisé en ce que la sulfatation est effectuée soit par l'acide chlorosulfonique en présence de pyridine et de diméthylformamide, soit par le complexe trioxyde de soufre-triméthylamine dans le diméthylformamide.

7. Sulfates de xylanes ayant un degré de sulfatation compris entre 1,5 et 2,0, une masse molaire apparente comprise entre 7000 et 12000, un pourcentage en acides uroniques compris entre 0 et 10 et un pourcen-tage en pentoses compris entre 30 et 40, chaque fois qu'ils sont préparés par un procédé selon la revendication 1, 2 ou 4 ou ses équivalents chimiques manifestes.