CA2406566A1 - Mutants de bacteries lactiques surproducteurs d'exopolysaccharides - Google Patents

Abstract

La présente invention a pour objet des mutants de bactéries lactiques surproducteurs d'exopolysaccharides à la suite d'une mutation dans le gène codant l'.alpha.-phosphosglucomutase. Ces mutants sont utilisables notamment pour la préparation de produits fermentés ou la production d'exopolysaccharides.

Description

MUTANTS DE BACTÉRIES LACTIQUES SURPRODUCTEURS
D'EXOPOLYSACCHARIDES
L'invention est relative à la régulation de la production d'hétéropolysaccharides exocellulaires par des bactéries lactiques.
De manière générale, les polysaccharides sont très utilisés comme additifs dans l'alimentation, mais aussi dans les cosmétiques et les produits pharmaceutiques, par exemple en tant qu'agents épaississants et/ou gélifiants, stabilisateurs de texture, succédanés de matière grasse, etc.
Parmi les polysaccharides utilisés de la sorte, on citera notamment ceux produits par des microorganismes en particulier des bactéries, tels que des dextranes, les xanthanes, les gellanes, pullulanes etc.
De nombreuses espèces de bactéries lactiques, notamment des lactocoques tels que Lactococcus lactis, des Leuconostoc tels que Leuconostoc mesenteroide, des streptocoques tels que Streptococcus thermophilus, et des lactobacilles tels que Lactobacillus casei, Lactobacillus sake, Lactobacillus rhamnosus, Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus, Lactobacillus helveticus, etc. produisent des polysaccharides.
Ceux-ci peuvent être regroupés en 2 catégories .
les homopolysaccharides, tels que les dextranes, qui résultent de la polymérisation d'un seul sucre, et les hétéropolysaccharides, de structure complexe, associant des unités de base constituées de 2 ou plusieurs sucres différents (fréquemment le D-galactose, le D-glucose et le L-rhamnose).
Les hétéropolysaccharides des bactéries lactiques sont habituellement désignés sous le terme général d'EPS
(pour exopolysaccharides), qui sera également utilisé ci-après. Ils jouent un rôle majeur dans l'élaboration de la texture, de la perception en bouche et de la rhéologie des produits laitiers fermentés. En outre, il a été observé que certains d'entre eux possédaient des activités biologiques par lesquelles ils pourraient exercer divers effets

2 bénéfiques sur la santé. [pour revue, cf. DE VUYST, et DEGEEST, FEMS Microbiology Reviews, 23, 153-177, (1999)].
Toutefois, la quantité d'hétéropolysaccharides produits par les bactéries lactiques est en général faible (de l'ordre de 10 à 200 mg par litre de produit fermenté).
Pour améliorer la texture, les fabricants de produits fermentés rajoutent d'autres agents texturants comme des stabilisateurs (amidons modifiés, carragheen, guar, pectine, gélatine...). Cependant, ces ajouts ne sont pas toujours autorisés (par exemple dans le yaourt nature), et affectent généralement le goût et l'arôme du produit. Une production optimisée d'hétéropolysaccharides exocellulaires (EPS) dans le produit est donc préférable.
Étant donné l'importance des EPS dans les industries agro-alimentaires, évoquée précédemment, de nombreux travaux ont porté sur des méthodes permettant d'augmenter leur production par optimisation des procédés biotechnologiques en agissant sur la température, le pH et la composition du milieu. Ces approches sont cependant parfois difficiles à appliquer dans le cadre de certains procédés agro-alimentaires comme la fabrication de produits laitiers fermentés pour lesquels le milieu et les conditions de fermentation sont propres à chaque type de produit. Ces contraintes de fabrication limitent donc l'utilisation des méthodes classiques d'optimisation des procédés pour améliorer la production des EPS. Une alternative à ces méthodes serait d'utiliser des souches adaptées à ces procédés, c'est-à-dire capables de produire des EPS en plus grande quantité, et/ou dont la production d'EPS puisse être contrôlée dans les conditions de production des produits fermentés.
L'une des limitations principales de la production d'EPS par les bactéries lactiques pourrait provenir d'une compétition entre la biosynthèse de ces EPS et d'autres voies métaboliques pour l'utilisation des sucres disponibles. En effet, alors que les homopolysaccharides sont principalement produits par des enzymes extracellulaires spécifiques à partir de substrats présents dans le milieu, la

3 synthèse des hétéropolysaccharides s'effectue au moins en partie à l'intérieur de la cellule. En particulier la formation des précurseurs (sucres nucléotidiques) des hétéropolysaccharides, constitués par des sucres activés par réaction avec des nucléotides triphosphate pourrait faire intervenir des enzymes intracytoplasmiques qui participent également à d'autres voies métaboliques, et notamment à la glycolyse. Or, du fait du métabolisme fermentaire des bactéries lactiques, les réactions de la glycolyse sont plus actives que celles ayant trait à la synthèse des EPS.
Les Inventeurs se sont fixé pour but l'obtention de mutants de bactéries lactiques dont on puisse contrôler et notamment augmenter la capacité à utiliser des sucres disponibles dans le milieu, et en particulier le galactose, pour produire des EPS.
Dans ce but, ils ont recherché les gènes impliqués dans la synthèse des sucres nucléotidiques précurseurs des EPS, et/ou les gènes intervenant au carrefour des voies de la glycolyse et de la biosynthèse des EPS. Parmi ces derniers, ils se sont intéressés plus particulièrement aux gènes de la phosphoglucomutase (PGM), qui intervient dans la transformation des dérivés métaboliques du galactose en intermédiaires de la glycolyse, et de la glucose-1-phosphate uridyl transférase, qui catalyse la formation des sucres nucléotidiques, précurseurs des EPS.
DE VUYST, et DEGEEST, (publication précitée) émettent l'hypothèse que la phosphoglucomutase pourrait jouer un rôle important de liaison entre la glycolyse et la biosynthèse des EPS, et que le détournement vers cette enzyme d'une partie du flux carboné pourrait permettre d'augmenter la production d'EPS. Toutefois, ils soulignent également qu'il reste à savoir si ceci est effectivement réalisable.
I1 a été récemment rapporté [HARDY et al., J
Bacteriol., 1854-1863, (2000)] que l'inactivation chez Streptococcus pneumoniae d'un gène [GENBANK AF165218] codant une phosphoglucomutase entraînait une diminution drastique de la production des EPS formant la capsule bactérienne, et était en outre fortement préjudiciable à la viabilité

4 cellulaire, bien que cette bactérie possède un autre gène pgm .
L' existence d' une a-PGM et d' une (3-PGM a été
rapportée chez L. Lactis ; toutefois, seul le gène corrrespondant à la (3-PGM a été isolé [QIAN et al., Microbiology, 143, 855-865, (1997)]. Aucun gène susceptible de coder une a-PGM de bactérie lactique n'a été caractérisé
génétiquement jusqu'à présent.
Les Inventeurs sont maintenant parvenus à cloner et caractériser un gène pgm, codant une a-PGM de Streptococcus thermophilus.
Ce gène est représenté dans la liste de séquences en annexe sous le numéro SEQ ID N0: 1, et le polypeptide correspondant est représenté sous le numéro SEQ ID N0: 2.
La présente Invention a pour objet une séquence d'acide nucléique codant une a-PGM dont la séquence en acides aminés a au moins 70s d'identité ou au moins 85~ de similarité, de préférence 80% d'identité ou au moins 90~ de similarité, avantageusement au moins 90~ d'identité ou au moins 95 ~ de similarité, et de~ mànière tout à fait préférée au moins 95 ~ d' identité ou au moins 99 ~ de similarité, avec l'a-PGM représentée par la séquence SEQ ID NO: 2, ainsi que tout fragment de plus de 20 pb de ladite séquence.
Le pourcentage d'identité d'une séquence avec une séquence de référence est défini ici comme le pourcentage de résidus de cette séquence qui sont identiques avec ceux de la séquence de référence lorsque les 2 séquences sont alignées pour une correspondance maximale entre les positions des résidus. Un polypeptide dont la séquence en acides aminés possède au moins X~ d'identité avec une séquence de référence peut ainsi comprendre jusqu'à 100-X modifications pour 100 acides aminés de la séquence de référence. Ces modifications incluent la délétion, la substitution, ou l'insertion de résidus d'acides aminés, consécutifs ou non.
Le pourcentage de similarité d' une séquence avec une séquence de référence est défini ici comme le pourcentage de résidus de cette séquence qui sont identiques avec ceux de la séquence de référence ou qui n'en diffèrent que par une substitution conservative, lorsque les 2 séquences sont alignées pour une correspondance maximale entre les positions des résidus. On entend par "substitution conservative" la substitution d'un résidu d'acide aminé par un autre résidu

5 possédant des caractéristiques physicochimiques (taille, charge, ou polarité) similaires, qui ne changent pas les propriétés fonctionnellés de la protéine. Un polypeptide dont la séquence en acides aminés possède au moins X~ de similarité avec une séquence de référence peut ainsi comprendre jusqu'à 100-X modifications non-conservatives pour 100 acides aminés de la séquence de référence. Ces modifications incluent la délétion, 1a substitution non-conservative, ou l'insertion de résidus d'acides aminés, consécutifs ou non.
Les polypeptides présentant ainsi les pourcentages d'identité ou de similarité les plus importants avec la séquence SEQ ID N0: 2, identifiés par recherche sur la base de données ~~GENBANK nr" en utilisant le logiciel BLASTp [ALTSCHUL et al., Nucleic Acids Res., 25, 3389-3402, (1997)], avec les paramètres par défaut, sont les suivants .
- la protéine ybbT~ de Bacillus subtilis . 57~
d'identité, et 69~ de similarité ;
- la protéine femD de Staphylococcus aureus . 53%
d'identité, et 69% de similarité ;
- la phosphoglucomutase hypothétique de Streptomyces coelicolor . 42% d'identité, et 55~ de similarité ;
- l'homologue de mrsA de Pseudomonas syringae .
41~ d'identité, et 54~ de similarité ;
- l'homologue de mrsA de Mycobacterium leprae .
41~ d'identité, et 54~ de similarité ;
Aucune homologie significative avec le gène pgm de L. lattis décrit par QIAN et a1. (publication précitée) n'a été observée. Le pourcentage d'identité avec le gène pgm de S. pneumoniae décrit par HARDY et al. (publication précitée) est inférieur à 31~.
Les Inventeurs ont effectué la mutagenèse dirigée du gène pgm de S. thermophilus, et ont constaté, que, de

6 PCT/FRO1/01198 manière surprenante, l'inactivation totale ou partielle de ce gène entraînait une augmentation de la production d'EPS.
La présente invention a également pour objet un mutant de bactérie lactique surproducteur d'EPS dans lequel le gène pgm de l'alpha-phosphoglucomutase est totalement ou partiellement inactivé.
Ladite bactérie lactique sera de préférence une bactérie mésophile ou thermophile, choisie parmi les streptocoques et les lactobacilles. A titre d'exemple, il peut s'agir de Lactococcus lactis, Streptococcus thermophilus, Leuconostoc mesenteroide, Lactobacillus casei, Lactobacillus delbrueckii, Lactobacillus sake, etc.
L'inactivation du gène pgm peut être obtenue en effectuant une ou plusieurs mutations au niveau de la séquence codant pour l'a-PGM, et/ou au niveau de séquences contrôlant son expression.
On peut notamment utiliser des techniques de mutagenèse dirigée, connues en elles-mêmes de l'homme de l'art, et qui permettent d'introduire dans un gène une mutation définie, à l'emplacement souhaité.
On peut ainsi, par exemple, inactiver le gène pgm en introduisant à l'intérieur de la séquence codante, ou des séquences de régulation, une séquence exogène, par exemple un transposon.
Avantageusement, on peut également effectuer le remplacement, par recombinaison homologue, de la séquence sauvage du gène pgm par la séquence mutée. Dans ce cas on effectue à l'intérieur d'une séquence identique à celle de la région du gène que l'on souhaite muter, une ou plusieurs modification par insertion, délétion, ou substitution, d'un ou plusieurs nucléotides, consécutifs ou non.
Selon un mode de réalisation préféré de la présente invention, la séquence mutée est insérée dans un vecteur permettant l'intégration par recombinaison (simple crossing-over) entre le fragment d'ADN bactérien cloné dans le vecteur et la région homologue dû génome bactérien.
L'excision des séquences du vecteur peut s'effectuer à la suite d'un second événement de recombinaison (double

7 crossing-over), qui aboutit à la substitution de la forme sauvage chromosomique par la forme modifiée.
Des vecteurs permettant l'intégration d'une séquence exogène dans le chromosome d'une bactérie lactique sont connus en eux-mêmes, et disponibles pour la plupart des espèces de bactéries lactiques ; il peut par exemple s'agir de vecteurs non-réplicatifs, de vecteurs réplicatifs instables ou à réplication conditionnelle, de vecteurs portant des séquences d'insertion, etc..
On peut également, dans certains cas, effectuer la transformation directe de la bactérie avec l'ADN portant la séquence mutée que l'on souhaite insérer.
Des mutants du gène pgm conformes à l'invention peuvent aussi être obtenus par mutagenèse aléatoire (par exemple par mutagenèse chimique ou par radiations) ; il peut aussi s'agir de mutants naturels sélectionnés à partir de cultures de bactéries lactiques par criblage sur la base de leurs propriétés phénotypiques.
En effet, les mutants dans lesquels l'a-PGM est partiellement ou totalement inactive ont une croissance normale sur lactose, et une croissance très ralentie sur glucose ou galactose seul. De tels mutants peuvent donc, qu'il s'agisse de mutants naturels, ou qu'ils soient issus d'une mutagenèse, être sélectionnés directement sur la base de cette propriété.
La présence de mutations dans le gène pgm., et la nature de ces mutations peut être vérifiée facilement par des techniques classiques de biologie moléculaire, à l'aide d'amorces ou de sondes ou de souches d'acide nucléique dérivées de la séquence SEQ ID N0: 1.
On peut aussi si on le souhaite, augmenter ou diminuer à volonté la production d'EPS en fonction, par exemple, des conditions de culture, en plaçant le gène pgm sous contrôle transcriptionnel d'un promoteur inductible.
. Les inventeurs ont en outre cloné et caractérisé
le gène galU qui code la glucose-1-phosphate uridyl transférase de S. thermophilus. Ce gène est représenté dans la liste de séquences en annexes sous le numéro SEQ ID NO: 3.

8 La protéine GalU codée par ce gène est représentée sous le numéro SEQ ID N0: 4.
La présente Invention a également pour objet une séquence d'acide nucléique codant une glucose-1-phosphate uridyl transférase dont la séquence en acides aminés a au moins 90~ d'identité ou au moins 95~ de similarité, et avantageusement au moins 95~ d'identité ou au moins 99% de similarité, avec la glucose-1-phosphate uridyl transférase représentée par la séquence SEQ ID N0: 4.
Les polypeptides présentant ainsi les pourcentages d'identité ou de similaritë les plus importants avec la séquence SEQ ID N0: 4, identifiés par recherche sur la base de données "GENBANK nr" en utilisant le logiciel BLASTp [ALTSCHUL et al., Nucleic Acids Res., 25, 3389-3402, (1997)] sont les suivants .
- la glucose-1-phosphate uridyltransférase de Streptococcus mutans . 87~ d'identité, et 93~ de similarité ;
- la protéine GalU de Streptococcus pneumoniae .
87~ d'identité, et 93~ de similarité ;
- l'UDP-glucose pyrophosphorylase de Streptococcus pyogenes . 84% d'identité, et 90% de similarité ;
- la protéine Cap3C de Streptococcus pneumoniae .
76~ d'identité, et 88~ de similarité ;
- l'UDP-glucose pyrophosphorylase de Bacillus subtilis . 55~ d'identité, et 74~ de similarité.
La surexpression du gène galU permet d'accroitre la synthèse des EPS, en augmentant la quantité de leurs précurseurs.
La présente invention a donc également pour objet un mutant de bactérie lactique surproducteur d'EPS dans lequel le gène galU est surexprimé.
Un tel mutant peut notamment être obtenu en introduisant dans une bactérie lactique une ou plusieurs copies de ce gène, et/ou en remplaçant son promoteur par un promoteur fort. De préférence, ledit mutant est obtenu à
partir d' une bactérie lactique possédant également une a.-PGM
partiellement ou totalement inactive.

9 Des souches mutantes conformes à l'invention peuvent notamment être obtenues à partir de S. thermophilus, et en particulier à partir de souches de S. thermophilus sélectionnées pour leur capacité de croissance sur galactose.
En effet, chez cette bactérie, un autre facteur limitant pour la synthèse d'EPS peut provenir du fait qu'un grand nombre de souches n'utilisent pas efficacement le galactose, que ce soit pour leur croissance ou la synthèse des EPS.
Lés inventeurs ont constaté que des souches gal+
de S. thermophilus, sélectionnées pour leur capacité de croissance sur galactose pouvaient synthétiser une quantité
plus importante d'EPS. A partir de ces souches capables d'utiliser le galactose pour leur croissance, on peut effectuer une seconde sélection des souches produisant les colonies d'aspect plus volumineux, ce qui traduit une synthèse plus importante d'EPS.
L'utilisation de ces souches gal+ de S. thermophilus, comme matériel de départ pour la production de mutants conformes à l'invention, améliore donc encore la capacité de ceux-ci à produire des EPS.
Des souches de bactéries lactiques conformes à
l'invention peuvent avantageusement être utilisées pour la fabrication de produits fermentés, notamment de produits alimentaires, dont on souhaite contrôler, et en particulier augmenter, la teneur en EPS, ainsi que pour la production d'EPS.
La présente invention sera mieux comprise à
l'aide du complément de description qui va suivre, qui se réfère à des exemples d'obtention et d'utilisation de souches de bactéries lactiques conformes à l'invention.
EXEMPLE 1 . SÉLECTION DE SOUCHES DE S. THERMOPHII~US UTILISANT
LE GALACTOSE PLUS EFFICACEMENT POUR LA SYNTHESE DES EPS
A) Des souches capables d'utiliser efficacement le galactose ont été sélectionnées à partir de cultures de levains industriels de S. thermophilus des collections RHODIA
et DANONE . RD488 (JIM7446) (collection RHODIA) et ext 1.5 (JIM7459) (collection DANONE).

Pour cela, une culture de 12 heures en milieu M17 [TERZAGHI et SANDINE, Appl. Microbiol., 29, 807-813, (1975)]
contenant 1~ de lactose, est déposée sur boîtes M17 agar contenant 1~ de galactose et incubée à 42°C pendant 2 jours.
5 Les colonies ainsi obtenues sont striées sur boîte M17 agar contenant l~ de galactose et incubées à 42°C pendant la nuit.
Les colonies poussant ainsi sur M17 galactose sont récupérées et mises à pousser en M17 liquide contenant 1% galactose à
42°C pendant 6 heures avant d'être mises en colléction.

10 D'autres milieux comme le milieu chimiquement défini décrit par [SISSLER et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 96, no. 16, 8985-8990, (1999)], où la source de sucre peut être contrôlée, peuvent être aussi utilisés pour cette sélection.
Pour vérifier que les souches obtenues sont bien capables de mieux utiliser le galactose, les croissances de ces souches et de leurs parents sont comparées.
Les croissances sont réalisées comme suit . des précultures de la nuit dans 10 ml de milieu BELLIKER
(Laboratoires DIFCO) auquel est ajouté 10 g d'extrait de bceuf/1 (DIFCO), et contenant 1~ de galactose sont diluées 100 fois et mises à pousser dans 2 ml de milieu M17 contenant 2~ de sucre (saccharose, lactose, glucose ou galactose) pendant 4 heures à 42°C. Elles sont ensuite inoculées à 2~
dans 200 u1 de milieu M17 contenant 1~ de sucre. La croissance des souches est alors suivie au BIOSCREEN
(LASBSYSTEMS).
La Figure 1 représente la croissance sur différents sucres, de la souche industrielle JIM7459 (1A) et d'un mutant gal+ sélectionné à partir de cette souche (1B).
B) On peut effectuer une sélection supplémentaire à partir de souches déjà capables d'utiliser le galactose pour leur croissance. Il est alors recherché des clones produisant des colonies d'aspect plus volumineux sur les boîtes. Ces souches utilisent le galactose encore plus efficacement.
La Figure 2 représente la croissance sur différents sucres, d'un mutant gal+ (2A) sélectionné comme décrit en A ci-dessus, à partir d'une culture d'une souche

11 industrielle (JIM7446, collection DANONE), et d'un mutant gal++ (2B) sélectionné à partir d'une culture de ce mutant gal+, sur la base de la taille des colonies.
Après croissance de ces différentes souches en milieu chimiquement défini, ou en milieu M17, le culot bactérien des mutants gal+ est plus filamenteux que celui des souches sauvages, ce qui peut refléter une différence dans la production d'EPS entre les mutants obtenus et leur souche parentale. La production d'EPS de ces souches a été
déterminée à partir de culture dans 80 ml de milieu chimiquement défini [SISSLER et al., Proc. Natl. Acad. Sci.
USA, 96, no. 16, 8985-8990, (1999)].
Après croissance, les cultures sont centrifugées à 16000 g pendant 10 min à 4°C. Le culot cellulaire est éliminé, et le surnageant est précipité (2 volumes d'éthanol 100 pour un volume de surnageant) pendant 24 heures à 4°C.
Après précipitation, une centrifugation est effectuée à
16000 g pendant 15 minutes à 4°C. Le surnageant est éliminé
et le culot est resuspendu dans 60 ml d'eau. Une dialyse est effectuée contre l'eau pendant 4 jours en changeant l'eau 3 à
4 fois par jour. Les EPS sont dosés par la méthode au phénol/acide sulfurique [DUBOIS et al., Analytical Chemistry, 28, 350-356, (1956) ] .
Les résultats obtenus dans le cas de la souche 7446 Gal+, et d'un mutant de cette souche capable d'utiliser plus efficacement le galactose sont indiqués dans le Tableau I ci-après.
Tableau i SOUCHES EPS m /I

7446 Gal+ 4 7446 Gal++ g Après croissance en présence de galactose, les souches utilisant mieux le galactose produisent des quantités accrues d'EPS.

12 EXEMPLE 2: CLONAGE DU GENS PGM DE STREPTOCOCCUS THERMOPHILUS
ET CONSTRUCTION DE MUTANTS DANS LESQUELS CE GENE EST
INACTIVE.
Clonage du gène Le gène pgm de Streptococcus thermophilus peut être obtenu par PCR inverse [OCHMAN et al., Biotechnology (NY), 8, no. 8, 759-760, (1990)] à partir de l'ADN
chromosomique de S. thermophilus. L'ADN chromosomique de S. thermophilus est digéré avec des enzymes de restriction (BamHI, EcoRI, HindIII, NcoI, PsI, XhI) puis les produits de coupure sont circularisés puis amplifiés par PCR en utilisant les amorces complémentaires au brin opposé OST15, OST16, OST23 à OST26 (Tableau II).
Tableau II
Amorce Squence Les bandes obtenues sont extraites du gel et séquencées. La séquence du fragment cloné, comprenant le gène pgm et ses régions flanquantes est représentée dans la liste de séquences en annexe sous le numéro SEQ ID N0: 1.
La taille du cadre ouvert de lecture du gène pgm de Streptococcus thermophilus est de 1350 pb.
Construction de mutants du gène pgm Pour diminuer l'activité du gène pgm, les Inventeurs ont adopté une stratégie d'inactivation par insertion d'un vecteur dans le gène par recombinaison homologue. La stratégie générale d'inactivation est représentée par la Figure 3. Dans un premier temps, des plasmides à réplication thermosensible, contenant des fragments internes au gène pgm ont été construits à partir du vecteur à réplication thermosensible pG+host [BISInIAS et al., J. Bacteriol., 175, 11, 3628-3635, (1993) ; Demande PCT
WO/181164]. Deux fragments PCR produits avec les oligonucléotides OST29+OST31 et OST28+OST31, et représentant

13 respectivement 650 et 835 bp du gène pgm, ont été clonés dans pG+host, générant les plasmides pST28 et pST29.
Tableau III
Amorce S uence Le fragment de 650 bp porté par pST28 est central au gène, il est donc. attendu que son insertion produise une inactivation totale du gène. Le fragment de 835 bp porté par pST29 contient la partie située en 5' du gène avec le codon de démarrage de traduction, mais en absence de son site de fixation au ribosome. Il est attendu que l'insertion de pST29 dans le chromosome provoque une diminution très importante de la traduction de pgm en ne permettant qu'une expression de base très faible.
Les plasmides pG+host, pST28 et pST29 ont été
introduits par transformation dans les souches de S. thermophilus JIM7446 et JIM7459 à 30°C, puis intégrés par simple crossing-over comme schématisé sur la Figure 3.
L'intégration par simple crossing-over a été réalisée selon le protocole décrit par BISWAS et al. [publication précitée, (1993)] avec les modifications suivantes .
Les souches de Streptococcus thermophilus contenant le plasmide pG+host ou ses dérivés sont mises à
pousser de nuit à 30°C en présence d'érythromycine, puis diluées 50 fois dans le même milieu. Elles sont ensuite transférées à 42°C pendant 6 heures. Les échantillons sont alors dilués et étalés d'une part à 42°C sur boîtes M17 contenant l'érythromycine pour détecter les événements d'intégration, et d'autre part à 30°C sur boîtes M17 sans antibiotique pour détecter le nombre total de cellules viables. La fréquence d'intégration par cellule est calculée en faisant le rapport de ces comptages. Les fréquences d'intégration de ces plasmides sont respectivement de 3. 5 x 10-3, 3 x 10-3 et 10-2 pour pG+host, PST28 et pST29. Des clones issus de chacune de ces intégrations ont été isolés pour donner les souches STJ3, STJ1 et STJ2 respectivement.

14 Les souches STJ1 (pST28), STJ2 (pST29) et STJ3 (pG+host) ont été mises à pousser sur boîtes de milieu chimiquement défini contenant du glucose et du galactose ou sur boîtes des mêmes milieux contenant soit du glucose seul, soit du galactose seul. Les résultats obtenus sont indiqués dans le Tableau IV.
Tableau IV
Souches plasmidesCroissance sur Croissance sur Croissance sur MCD MCD MCD

Glu Gal Er Glu E Gal Er STJ1 ST28 Normale Ne ousse as Ne ourse as STJ2 ST29 Normale Ne ousse as Ne ourse as STJ3 G+host Normale Normale Normale Les clones STJ1 et STJ2 ne poussent donc pas sur glucose ou galactose seul, mais normalement en lactose ou sur un mélange glucose et galactose. Ceci montre que le métabolisme du glucose et du galactose a bien été découplé
dans cette souche et que le gène dont l'activité a été
affectée est bien pgm.
Ces résultats montrent que le gène inactivé code bien pour une enzyme connectant la voie des EPS et la glycolyse. Il code donc probablement pour l'a-PGM dont la séquence n'était pas encore caractérisée expérimentalement chez les bactéries lactiques.
Dosage des EPS produits par la souche- de-- Streptococcus thermophilus STJ2 portant une mutation dans 1e gène pgm Le dosage des EPS est effectué comme décrit à
l'exemple 1 ci-dessus.
La production d'EPS de la souche affectée dans l'expression du gène pgm est de 20 mg/l. Cette production, comparée aux 8 mg/1 obtenu pour la souche parentale 7446 Gal++ correspond donc à une augmentation de deux fois et demi.
EXEMPLE 3 . PRODUCTION D'EPS PAR DES MUTANTS DU GENE pgm DERIVES DE SOUCHES INDUSTRIELLES
Le plasmide pST29 décrit à l' exemple 2 ci-dessus a été utilisé pour transformer les souches industrielles (collection DANONE) Ext 1.1 (JIM7455) et Ext 1.10.(JIM7464).
Ces souches produisent des EPS de composition différente (1-glu:2-gal:1-galNac pour Extl.l et 3-gal:l-rha pour Ext1.10), et qui sont également différents de celui produit par la souche JIM7446 (3-glu:4-gal).
Après électroporation, les cellules sont étalées à 30°C pendant 12H puis les boites sont mises à 42°C afin de 5 forcer l' intégration du plasmide pST29 dans le gène pgm par recombinaison homologue entre les séquences pgm présentes sur le plasmide et celles présentes sur le chromosome. Des colonies de bactéries mutées capables de pousser à 42°C en présence d'érythromycine ont été obtenues. Ces bactéries sont 10 de plus capables de pousser sur MCD (milieu chimiquement défini), en présence de glucose et de galactose, mais pas en présence de glucose seul ou de galactose seul.
Les souches transformées ou non, ont été
cultivées en 10 ml de MCD lactose 2%, casitone 1.5~, urée

15 10 mM, en présence d'érythromycine (5 ~g/ml) pour les souches transformées par le plasmide pST29. Les EPS produïts par les différentes souches ont été dosés après 67H30 de culture à
42°C. Les résultats obtenus sont présentés dans le tableau V
ci-dessous.
2 0 Tableau V
Souche ODsoo pH mg EPS/i mg EPS/I/OD
7455 (Ext1.1) 1,566 4,6 12,5 8 7455 :: pST29 0,98 4,6 14,68 16 7464 (Ext 1.10) 1,29 4,24 23,6 18,29 7464 :: pST29 0,99 4,2 44 44 On constate que les souches dont le gène pgm est inactivé conformément à l'invention produisent, à biomasse égale, 2 à 2,5 fois plus d'EPS que les souches d'origine.
EXEMPLE 4 . CONSTRUCTION D'UN MUTANT DU GENS pgm PAR DOUBLE
CROSSING OVER
Un vecteur dénommé pSTJ6, contenant un gène pgm inactivé par mutation interne a été construit par amplification PCR inverse en utilisant 1e plasmide pST29 comme matrice, et les amorces suivantes, dérivées de la séquence du gène pgm par des mutations ponctuelles, induisant notamment la création d'un site NsiI .
GACATGCATCGCTTGTCGATTAGCCAGAAGGTC
GCGATGCATGTCATTAAGCTGATGGGCGTCGAAG

16 Les mutations introduites dans les amorces sont soulignées ;
le site NsiI créé est indiqué en italiques.
Lé produit de PCR est clivé par NsiI et religué
sur lui-même pour donner le vecteur pSTJ6.
Ce vecteur est introduit par transformation dans la souche JIM7446 de S. thermophilus.
Les colonies sont étalées à 30 °C pendant 12 H, puis mises à pousser à 42 °C pendant 24 H, afin de forcer l'intégration du vecteur dans le chromosome par un premier crossing-over par recombinaison entre les séquences pgm présentes sur le plasmide et celles présentes sur le chromosome. Les colonies ainsi obtenues, résistantes à
l'érythromycine et capables de pousser à 42 °C, sont ensuite mises à pousser à 30°C afin de favoriser l'excision des séquences du plasmide pG+host par un deuxième crossing-over par recombinaison entre les séquences pgm présentes de part et d'autre des séquences de pG+host. pG+host est ensuite éliminé de la cellule par une étape de croissance à 42 °C en absence de sélection par l'érythromycine. La souche ainsi obtenue ne contient plus de séquences du vecteur pG+host, et en particulier, elle ne contient pas de gène de résistance aux antibiotiques.
Elle ne diffère de la souche d'origine JIM7446 de S. thermophilus que par la présence des mutations dans une portion du gène pgm. La séquence initiale et la séquence mutée de cette partie du gène pgm sont indiquées ci-après ;
les mutations sont soulignées.
Séquence initiale .
GCTGAAGGACTTGGAACGCTTGTCGATTATCCA
Séquence mutée .
GCTTAATGACATGCATCGCTTGTCGATTAGCCA
La souche mutée possède le phénotype caractéristique des mutants pgm, décrit dans les exemples 2 et 3 ci-dessus. Elle est capable de pousser sur MCD en présence de glucose et de galactose mais pas en présence de glucose seul ou de galactose seul. L'augmentation de la production d'EPS par cette souche par rapport à la souche parentale est comparable à celle observée dans le cas des

17 souches transformées par pST29, décrites dans les exemples 2 et 3.
EXEMPLE 5 . CONSTRUCTION DE MUTANTS SURPRODUISANT GAI~U
Clonage du gène galU codant pour la Glucose-1- hosphate Uridyl Transférase L' ensemble du gène galU peut être obtenu par PCR
inverse [OCHMAN et al., (1990), publication précitée] à
partir de l'ADN chromosomique de S. thermophilus, en utilisant des amorces complémentaires au brin opposé (OST13, OST14, OST21 et OST22) (Tableau VI).
Tableau VI
Amorce S uence Les bandes obtenues sont extraites du gel et séquencées.
La séquence du fragment cloné, comprenant le gène galU est représentée dans la liste de séquences en annexe sous le numéro SEQ ID N0: 3.
La taille du gène galU est de 914 pb.
Surexpression de GalU
Le gène galU (avec son terminateur et son site de liaison des ribosomes) a été amplifié avec les oligonucléotides OST44 et OST45 (Tableau VI) et cloné en aval du promoteur p45 [SIBAKOV et al., Appl. Environ. Microbiol., 57, 341-348, (1991)] de L. lactis dans le site Apal.
Tableau VI
Amorce Squence Un fragment Smal du plasmide résultant, portant P45 suivi de galU a été purifié et inséré dans le site Smal du vecteur pGKV259 se répliquant chez S. thermophilus. Le plasmide pGKV259 [VAN DER VOSSEN et al., Appl. Environ.
Microbiol., 53, 2452-2457, (1987)] exprimant le gène galU
sous contrôle du promoteur p45 est appelé pSTJ4 (Figure 4).
Ce plasmide est introduit par transformation dans la souche

18 S. thermophilus JIM7446, JIM7459 ou dans la souche contenant une mutation dans le gène pgm (STJ2).

LISTE DE SÉQUENCES
<110> INRA
COMPAGNIE GERVAIS DANONE
RHODIA CHIMIE
ANBA, Jamila HAGEGE, Juliette CHAILLOU, Stéphane BESANCON-YOSHPE, Iris FREMAUX, Christophe MENGAUD, Jérôme RENAULT, Pierre <120> MUTANTS DE BACTÉRIES LACTIQUES SURPRODUCTEURS D'EXOPOLYSACCHARIDES
<130> MJPcb539-104 <140>
<141>
<150> FR 0004971 <151> 2000-04-18 <160> 4 <170> PatentIn Ver. 2.1 <210> 1 <211> 5853 <212> ADN
<213> Streptococcus thermophilus <220>
<221> CDS
<222> (2169)..(3092) <400> 1 aagataccca tagtagtttt tatagtcagg gtttaattgt tatcataaaa agtagtgatt 60 gtagcctcaa aatagtttga attcatggta taatagaaac tgttaaaaaa ttaaaagaaa 120 gtgtgatgag tatgggatta ctttcgtcca ttgacgttga tttttggcgg tcactttttg 180 atagtccgct gagggttctt gtcaatagtt tggacatatt gattgttgct tttttaattt 240 atcggtttat tagggctctg agaggaacaa aaatcatgac cctagtccaa ggggtagtct 300 tatttatttt tgtaaagatt atctctgatt ttattggatt cacgacgatt tcttatttga 360 tgaatcaagt catcaattat ggtgctattg cagcagtcgt tatttttgcg ccagaacttc 420 gttcggcact tgagacattt ggacggacac ctcagcattt tttgcaaaat aaagaggtca 480 gttcagatga gaaattggtt caggcttttg tcaaggccgt caagtatatg agcccgcgta 540 agattggagc cttggtttct attgaacaaa ctcagacttt acaagaacag attgcgacag 600 ggattccgct aagatgcagt ggtgactggg gaacttctaa taaatatctt cataccaaat 660 acgccgcttc atgatggtgc agtaattata agagataata aggttacaac agcttgttct 720 tatctgccat tatcagagtc taataagatt tccaaagaat ttgggacaag acacagggct 780 gctattggtc tttcggaaca aacagatgca ctaacctttg ttgtctctga ggaa~cgggt 840 gcgatttcca ttgcgtacaa gggcaatttt ttgcacgacc tctcagttca agaatttgaa 900 catgagttaa gtcttatctt gttgaaagag caggaaccac gtcagttatt ctttcaacgt 960 tggattggag gtggtgaaaa atgaagcgtc tagtaagatt tttcacaaat gatcgcttgt 1020 ggcagatggt agttgccctc ttccttgctg tcacactctt tttcacagca tggtcgggga 1080 atacacaaaa taaaaataat agctcaattg catccaatac tttcacgaaa accgttgagt 1140 cggtacctgt ggatatcaaa tacgatagtg ataagtactt tatcagtggc tattcctatg 1200 atgctgaggt ctatctaaca gcgacgacac aattagcctt gacaactgaa acaacaagtg 1260 acacacgtca ttttaagttg gttgcagatt tatcaaattt tggcccaggg acaagtcatg 1320 ttcctattca ggttaagaat ttaccggatg gaatgtctgc ccaagtatca ccatcgacct 1380 tgacagcaac tataggtaaa aaagctagta agacatttga tgtagttgca aatatcacac 1440 cggataagtt ggctaatggc tatgaagtga aaaaggttag cttggatgaa accaaggtag 1500 aggtgacctc aagtgaggat atcatcaatc aaattgatca cgttcaagca gtcttggaag 1560 gcgatgacaa cttgtctgat gattatgatg gtaacttggt tcttcaagca gtttcgtcta 1620 atggaacgat tttagctagt tcaatttccc cagctaaggt tcatgccaag attagtttga 1680 gaaaattgag taaatcagtt ccagttaagc tagagttgac tggcgataag gctagcaatg 1740 tgtctagtat cagttatagt tttgatcgtg gtcatgtgac cattgttggt agtcaagaag 1800 ccatggataa aattgatagc atcacagtcc ctgtagacat tagccaagta actaaagata 1860 catcgaaaac cttagagcta aaagcagaag gtgttacagt gcagccaagt actgtgaagg 1920 ttaacttgaa agtcacgcaa aagtgaggga gttacatttt catcaaattg agatataata 1980 gattgggttg agaggaatag tctcataata atgtaaccaa ttaataatat tttaaaacaa 2040 gggttgaaca tattggtgca atcttataca gctagattat ctagataggt tcactagatt 2100 agattgactc ttgctaatgg catcaaagtt taaggaggat ttagtgcaca ggcactaata 2160 gtaaattt atg gga aag tat ttt gga aca gac ggt gtt cgt gga gaa gca 2210 Met Gly Lys Tyr Phe Gly Thr Asp Gly Val Arg Gly Glu Ala aac gtt gag ctt acg cct gaa ttg gct ttt aaa tta ggt cgt ttt ggt 2258 Asn Val Glu Leu Thr Pro Glu Leu Ala Phe Lys Leu Gly Arg Phe Gly ggt tat gtg ctt agt caa cat gaa act ggc cgt cct aaa gtt ttt gtg 2306 Gly Tyr Val Leu Ser Gln His Glu Thr Gly Arg Pro Lys Val Phe Val gct cgt gat aca cgt att tct ggt gag atg tta gaa tct gct ttg gta 2354 Ala Arg Asp Thr Arg Ile Ser Gly Glu Met Leu Glu Ser Ala Leu Val 50 55 60 .
gcg gga ctt ctc tca gta ggt atc gaa gtc tat aaa ctt ggg gta ctt 2402 Ala Gly Leu Leu Ser Val Gly Ile Glu Val Tyr Lys Leu Gly Val Leu gcg aca cca ggt gta tca tac ttg gta cgt aca gaa aat gct agt gct 2450 Ala Thr Pro Gly Val Ser Tyr Leu Val Arg Thr Glu Asn Ala Ser Ala ggt gta atg att tca gct agt cac aat cca gca ctt gac aat gga atc 2498 Gly Val Met Ile Ser Ala Ser His Asn Pro Ala Leu Asp Asn Gly Ile aaa ttc ttt ggt gga gat ggc ttt aaa tta gat gat gca cgt gaa gcg 2546 Lys Phe Phe Gly Gly Asp Gly Phe Lys Leu Asp Asp Ala Arg Glu Ala gaa att gaa gct ctc cta gat gcc gca gaa gat act ctt cca cgc cca 2594 Glu Ile Glu Ala Leu Leu Asp Ala Ala Glu Asp Thr Leu Pro Arg Pro tca gct gaa gga ctt gga acg ctt gtc gat tat cca gaa ggt ctt cgt 2642 Ser Ala Glu Gly Leu Gly Thr Leu Val Asp Tyr Pro Glu Gly Leu Arg aaa tac gaa aaa ttc ttg gtg act act ggt ctt gac ctc ggt ggt atg 2690 Lys Tyr Glu Lys Phe Leu Val Thr Thr Gly Leu Asp Leu Gly Gly Met aag gtt gcc ttg gat gct gct aac ggt gcg gct gcg gta tct gct cgt 2738 Lys Val Ala Leu Asp Ala Ala Asn G1y Ala Ala Ala Val Ser Ala Arg aat att ttc ctt gac ttg aat gca gaa atc gct gtt att ggt gat caa 2786 Asn Ile Phe Leu Asp Leu Asn Ala Glu Ile Ala Val Ile Gly Asp Gln cct gat ggc ctt aat atc aat gct ggt gta ggt tct aca cat cca gag 2834 Pro Asp Gly Leu Asn Ile Asn Ala G1y Val Gly Ser Thr His Pro Glu caa ttg cag gcc tta gtt aga gaa tct ggt tca gca atc ggt ctt gcc 2882 Gln Leu Gln Ala Leu Val Arg Glu Ser Gly Ser Ala Ile Gly Leu Ala ttt gat ggt gtc agt gac cgt ctc att gcc gtt gat gaa aat gac gat 2930 Phe Asp Gly Val Ser Asp Arg Leu Ile Ala Val Asp Glu Asn Asp Asp attgtc gatggtgac aaggtgatg tatatcatt ggtaaatac ttgtct 2978 IleVal AspGlyAsp LysValMet TyrIleIle GlyLysTyr LeuSer caaaaa ggtgagtta gctaaaaac accattgtt acaacagtt atgtca 3026 GlnLys GlyGluLeu AlaLysAsn ThrIleVal ThrThrVal MetSer aatctt ggtttccac aaggctctc gcccgtgaa ggtattaac aagact 3074 AsnLeu GlyPheHis LysAlaLeu AlaArgGlu GlyIleAsn LysThr gtgatc tgctgttgg tgaccgttacgtt gttgaagata 3122 tgcgtatata ValIle 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<213> Streptococcus thermophilus <400> 2 Met Gly Lys Tyr Phe Gly Thr Asp Gly Val Arg Gly Glu Ala Asn Val Glu Leu Thr Pro Glu Leu Ala Phe Lys Leu Gly Arg Phe Gly Gly Tyr Val Leu Ser Gln His Glu Thr Gly Arg Pro Lys Val Phe Val Ala Arg Asp Thr Arg Ile Ser Gly Glu Met Leu Glu Ser Ala Leu Val Ala Gly Leu Leu Ser Val Gly Ile Glu Val Tyr Lys Leu Gly Val Leu Ala Thr Pro Gly Val Ser Tyr Leu Val Arg Thr Glu Asn Ala Ser Ala Gly Val Met Ile Ser Ala Ser His Asn Pro Ala Leu Asp Asn Gly Ile Lys Phe Phe Gly Gly Asp Gly Phe Lys Leu Asp Asp Ala Arg Glu Ala Glu Ile Glu Ala Leu Leu Asp Ala Ala Glu Asp Thr Leu Pro Arg Pro Ser Ala Glu Gly Leu Gly Thr Leu Val Asp Tyr Pro Glu Gly Leu Arg Lys Tyr Glu Lys Phe Leu Val Thr Thr Gly Leu Asp Leu Gly Gly Met Lys Val Ala Leu Asp Ala Ala Asn Gly Ala Ala Ala Val Ser Ala Arg Asn Ile Phe Leu Asp Leu Asn Ala Glu Ile Ala Val Ile Gly Asp Gln Pro Asp Gly Leu Asn Ile Asn Ala Gly Val Gly Ser Thr His Pro Glu Gln Leu Gln Ala Leu Val Arg Glu Ser Gly Ser Ala Ile Gly Leu Ala Phe Asp Gly Val Ser Asp Arg Leu Ile Ala Val Asp Glu Asn Asp Asp Ile Val Asp Gly Asp Lys Val Met Tyr Ile Ile Gly Lys Tyr Leu Ser G1n Lys Gly Glu Leu Ala Lys Asn Thr Ile Val Thr Thr Va1 Met Ser Asn Leu Gly Phe His Lys Ala Leu Ala Arg Glu Gly Ile Asn Lys Thr Val Ile Cys Cys Trp <210> 3 <211> 4151 <212> ADN
<213> Streptococcus thermophilus <220>
<221> CDS
<222> (2091)..(3005) <400> 3 aagcttggaa aaacagatta gatgaacttt acagaaggta ttactgctaa tatgttcgtc 60 aaccttgcta tcttgggcta tatgctcctc aaagaagagt ctgccaagat tttcattgcc 120 ctatcagcta tcttcatgtt tgtctttttg gtgaatgaac acttgattgc aaactttgca 180 tctttcatgt tactcggttt caacggtatc cgtgatgctg tggacaattt cacattagca 240 aatattctac atcagtgggt aatcgttttc ttcggcaact ggattggtag cggtattttc 300 attggtttgg catactcttg gctcaataaa accaaaacaa ctcacatcga ttaggaggct 360 agatgcgtca aaagatattt atcaaacaaa cttgccgagc tcttctactg tattttatat 420 gcctaaccat tgcagttgcg attgatttaa tcttttttaa agtcaaaaac atgtaccaca 480 cacctgcctt ggtggctatc ttttcgggct gggtttattt agggctaatc caaaagacca 540 aacaatttgg agctgttacc tgccttggtc tcttcatgtc catcttcttc tttacctctg 600 gtcactttgt cctaaccttc cttccaagtt tgctggctgg ccttggcgct gacttactcg 660 ccaagaaggg caactatgag aactatgaga atgataaagt aaatctactt tcctatatgg 720 tcttttctct gggaaacttg gcacctatag tgaccatgtg gctagctcct aaagcctaca 780 gtgcacaact cttagctaaa ggcaaaacac aagattaggt agaccaagtt 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ggctatggag 1680 acaacgctaa ggcagccata attactcgag gactggcaga aatcactcgt cttggtgtaa 1740 aactcggagc tgaccctttg acttacagcg gtctatctgg cgttggcgac ctcatcgtta 1800 ctggaacttc tatccattca cgtaactggc gtgccggata tgcgcttggt cgtggcgaaa 1860 aactagaaga cattgaacgt aacatgggta tggttatcga aggaatttca accactaagg 1920 ttgcctacga aatcgctcaa gaacttggcg tctacatgcc aattacaaca gcaatctaca 1980 aatctatcta tgagggtgct gatatcaagg aatctattct caatatgatg tccaatgaat 2040 tgcgctctga aaatgaatgg gataaaaaat aaaaaatcta aggagttctc atg aaa 2096 Met Lys aat caa aaa gtt aga aaa gct gtc atc ccc gct gga gga ctt gga aca 2144 Asn Gln Lys Val Arg Lys Ala Val Ile Pro Ala Gly G1y Leu Gly Thr cgc ttt tta cca gct act aaa gca ttg gcc aaa gaa atg ttt cca atc 2192 Arg Phe Leu Pro Ala Thr Lys Ala Leu Ala Lys Glu Met Phe Pro Ile gtt gac aaa cca acc atc caa ttt atc gtt gaa gaa gct ctt aag tct 2240 Val Asp Lys Pro Thr Ile Gln Phe Ile Val Glu Glu Ala Leu Lys Ser ggt att gaa gat atc ttg gtt gtt acc ggt aaa tca aaa cgc tct atc 2288 Gly Ile Glu 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<213> Streptococcus thermophilus <400> 4 Met Lys Asn Gln Lys Val Arg Lys Ala Val Ile Pro Ala Gly Gly Leu Gly Thr Arg Phe Leu Pro Ala Thr Lys Ala Leu Ala Lys Glu Met Phe Pro Ile Val Asp Lys Pro Thr Ile Gln Phe Ile Val Glu Glu Ala Leu Lys Ser Gly Ile Glu Asp Ile Leu Val Val Thr Gly Lys Ser Lys Arg Ser Ile Glu Asp His Phe Asp Ser Asn Phe Glu Leu Glu Tyr Asn Leu Glu Gln Lys Gly Lys Thr Asp Leu Leu Lys Leu Val Asn Asp Thr Thr Ser Ile Asn Leu His Phe Ile Arg Gln Ser His Pro Arg Gly Leu Gly Asp Ala Val Leu Gln Ala Lys Ala Phe Val Gly Asn Glu Pro Phe Val Val Met Leu Gly Asp Asp Leu Met Asp Ile Thr Asn Asp Lys Ala Val Pro Leu Thr Lys Gln Leu Ile Asn Asp Tyr Glu Glu Thr His Ala Ser Thr Ile Ala Val Met Pro Val Ser Ser Glu Glu Val Ser Ala Tyr Gly Val Ile A1a Pro Gln Gly Lys Gly Glu Asn Gly Arg Tyr Ser Val Glu Thr Phe Val Glu Lys Pro Asn Pro Glu Asp Ala Pro Ser Asp Leu Ala Ile Ile Gly Arg Tyr Leu Leu Thr Pro Glu Ile Phe Gly Ile Leu Glu Asn Gln Glu Pro Gly Ala Gly Asn Glu Val Gln Leu Thr Asp Ala Ile Asp Thr Leu Asn Lys Thr Gln Arg Val Phe Ala Arg Val Phe Thr Gly Asp Arg Tyr Asp Val Gly Asp Lys Phe Gly Phe Met Lys Thr Ser Ile Asp Tyr Ala Leu Lys His Pro Gln Ile Lys Asp Asp Leu Lys Gln Tyr Leu Ile Glu Leu Gly His Lys Leu Glu Gly Lys Pro Thr Lys Lys Gly

Claims (7)

REVENDICATIONS

1) Mutant de bactérie lactique surproducteur d'exopolysaccharides, dans lequel le gène pgm de l'alpha-phosphoglucomutase est totalement ou partiellement inactivé.

2) Mutant selon la revendication 1, dans lequel le gène galU est surexprimé.

3) Mutant selon une quelconque des revendications 1 ou 2, caractérisé en ce que ladite bactérie lactique est Streptococcus thermophilus.

4) Mutant selon la revendication 3, caractérisé
en ce qu'il est obtenu à partir d'une souche de Streptococcus thermophilus capable d'utiliser le galactose.

5) Utilisation d'un mutant de bactérie lactique selon une quelconque des revendications 1 à 4 pour la fabrication d'un produit fermenté.

6) Utilisation d'un mutant de bactérie lactique selon une quelconque des revendications 1 à 4 pour la production d'un exopolysaccharide.

7) Acide nucléique codant une .alpha.-phosphoglucomutase dont la séquence en acides aminés a au moins 70% d'identité ou au moins 85% de similarité avec l'.alpha.-phosphoglucomutase représentée par la séquence SEQ ID NO: 2.