Verfahren zur Herstellung eines namentlich auf Küken antirhachitisch wirkenden Präparates. Die Erfindung betrifft die Herstellung eines namentlich auf Küken antirhachitisch wirkenden Präparates.
Es bestehen bekanntlich zwei in der Natur vorkommende Sterine, die durch Be strahlung mit Ultraviolettlicht antirhachitisch wirksam gemacht werden, und zwar einer seits Ergosterin pflanzlicher Herkunft, das so lange als das einzige Provitamin D be trachtet wurde, und anderseits Cholesterin tierischer Herkunft.
Trotz der allgemeinen Erkenntnis, dass nicht das Cholesterin selbst aktiviert wird, sondern eine dasselbe in sehr geringen Spuren begleitende Verunreinigung (Provitamin), sind bisher alle Versuche, die ses Cholesterinprovitamin auszuscheiden oder selbst in erheblichem Masse zu konzentrieren, gescheitert.
In der diesbezüglichen Literatur werden viele Angaben bezüglich des Prozent satzes an Provitamin in dem in der Natur vorkommendem Chloresterin erwähnt; es er gibt sich daraus, dass Chlorestin mit einem höheren Provitamingehalt als 0,1 % sehr sel ten vorkommt.
Der höchste Gehalt, der er wähnt wird, beträgt 0,325o; er wurde von Menschick und Page (Hoppe Seyler "Zeit- schrift für physiologische Chemie", Band 211, 1962, Seite 246) in dem Dotter aus den Eiern einer mit grossen Mengen Ergosterin gefütterten Henne gefunden.
Die Aktivier- barkeit eines Chloresterinmusters wird nicht durch die chemischen Eigenschaften be kundet; sein Schmelzpunkt oder seine opti sche Rotation, der Schmelzpunkt und die op tische Rotation seiner Ester, usw.
- gege benenfalls untersucht nach geeigneter Reini gung zur Entfernung von andern Unreinig- keiten als Sterine - entsprechen denjenigen eines durch besondere Behandlung unaktivier- bar gemachten Chloresterinmusters. Ein akti- vierbares Cholesterinpräparat ist daher als Cholesterin im gewöhnlichen chemischen Sinne zu betrachten und vor der Einführung der jetzt allgemein bekannten spektographi- sehen Prüfung
bestanden keine Mittel (ausser der biologischen Prüfung) zur Unterschei dung eines aktivierbaren Cholesterins von einem unaktivierbaren Cholesterin. Diese ,,pektographische Prüfung macht es möglich, einen Unterschied zu machen zwischen wirk lichen Reinigungsverfahren und Verfahren, durch welche die Aktivierbarkeit teilweise verloren geht.
Die Aktivierbarkeit von Cholesterin ist in letzter Zeit infolge Waddell's Arbeit ("Journal of Biol. Chem.. Band 105, Juli 1934, Seite 711-739) von besonderem In teresse geworden. Waddell hat gefunden, dass auf der Vergleichsgrundlage einer glei chen Anzahl von Ratteneinheiten durch Be strahlung aktiviertes Cholesterin auf Küken viel wirksamer als bestrahltes Ergosterin ist. Zur Vorbeugung oder Heilung der Schwäche der Füsse der Küken ist die erforderliche Anzahl von Ratteneinheiten bestrahltes Ergo sterin das 30- bis 50fache desjenigen des durch Bestrahlung aktivierten Cholesterins.
Es wurde gefunden, dass in dieser Hinsicht durch Bestrahlung aktiviertes Cholesterin Lebertran gleichwertig ist. Infolge des oben erwähnten niedrigen Provitamingehaltes von Cholesterin ist Wadd esl's Entdeckung jedoch für praktische Zwecke ohne Bedeutung.
Waddel's Präparate von bestrahltem Chole- sterin hatten ,je Milligramm eine Aktivität von nur fünf internationalen Ratteneinheiten -Vitamin D; und sogar das obenerwähnte be sondere Cholesterin von Menschick und Page sollte nur in einem Masse von 30 internatio nalen Ratteneinheiten je :Milligramm akti- vierbar sein.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung von namentlich auf Küken antirhachitisch wirk samen Präparaten durch Bestrahlung von an dern Sterinen tierischer Herkunft als das in der obenerwähnten Literatur beschriebene oder das im Handel vorkommende Chole sterin, die durch Bestrahlung insbesondere für Küken antirhachitisch aktiviert werden können.
Die erfindungsgemäss verwendeten Sterine kommen in wirbellosen Tieren vor und insbesondere in den Porifera, Annelida, Arthropoda, Mullusca und Echinodermata. Nach Verseifung der aus wirbellosen Tieren erhaltenen Fettsubstanz, Extraktion und Re- kristallisation des unverseifbaren Stoffes (wenn dafür Sorge getragen wird, dass die angewendeten Reinigungsverfahren das Pro- v itamin D nicht zerstören)
- wird eine Ste- rinfraktion erhalten, die aus einem Gemisch von Sterinen besteht, die Cholesterin ent halten können oder nicht.
Es ist höchst überraschend, dass diese Ste- ringemische nicht nur aktivierbar sind, son dern auch Anlass zum Entstehen von akti vierten Stoffen geben, die auf Küken wesent lich wirksamer sind als bestrahltes Ergo sterin.
Es ist ausserdem sehr überraschend, dass diese Aktivierbarkeit zu einem beson ders auf Küken wirksames Vitamin D nicht auf Cholesterin beschränkt ist und dass sich die festgestellte hohe Aktivierbarkeit in vie len Fällen nur in Steringemischen vorfand, die eine erhebliche Menge eines andern Ste rins als Cholesterin enthalten; es ist tatsäch lich merkwürdig, dass Cholesterin offenbar durchaus nicht vorhanden zu sein braucht, wenn nur das Steringemisch aus wirbellosen Tieren stammt.
Da der gemäss der Erfindung benutzte Grundstoff im Überfluss in der Natur vor handen ist. und seine Gewinnung verhältnis mässig geringe Kosten mit sich bringt, ist es jetzt möglich, auf kommerzieller Grundlage künstliches Vitamin D herzustellen. das sich als Futter für Geflügel eignet.
Es sei bemerkt, dass früher die Bestrah lung des ungereinigten unverseifbaren Teils von Helix pomatia zur Erzielung eines anti- rhachitisch wirksamen Präparates beschrie ben wurde.
(Siehe "Comptes Rendues de la S@eanoe de 1'Aead6mie des Seienees", 1g29, Seite 1701-l702.) Dies hat jedoch nicht im geringsten zu der Lösung des Problems bei getragen, mit dem zahlreiche Forscher sich viele Jahre befasst haben und dessen Lösung der Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist. Diese Bestrahlung des ungereinigten un- verseifbaren Teils von Helix pomatia wird daher von dem vorliegenden Patent ausge schlossen.
Zahlreiche Forscher haben sich mit dem Problem der Beschaffenheit der in wirbel losen Tieren vorkommenden Sterinen befasst. In manchen Fällen wurde das Vorhandensein von Cholesterin festgestellt, in vielen andern Fällen wurden, andere Sterine als Cholesterin gefunden.
(Bergmann ["Journ. of Biol. Chem.", Band 104, 1984, Seite 317 und 553] fand zwei verschiedene Sterine, Ostreasterin I und Ostreasterin II, in Austern [ostrea virginica] und legte das Vorhandensein von Ostreasterin I in andern zweischaligen Schaltieren, wie Muscheln [Modiola] und Gienmuscheln [Venus mercenaria],
sowie in den Gastropoda, wie Fulgur carica und Ful- gur canaliculata dar. Doree ["Biochemical Journal", Band 4, 1909, Seite 72] fand an dere Sterine als Cholesterine in Seidenwür mern [Bombyx mori], in Kakerlaken [Blatts orientalis], in Seesternen [Asterias rubens],
in verschiedenen Schwämmen [Cliona celata, Ephydatia, fluviatilis] und vielleicht in Re- genwürmern [Lumbricus Terrestris]. Henze [Hoppe Seyler "Zeitschrift für physiolo gische Chemie", Band 55, 1908, Seite 427] fand ein neues Sterin, Spongosterin, in einer andern Schwammart [Suberites domuncula].)
Ob eine aus wirbellosen Tieren erhaltene Sterinfraktion ein Steringemisch enthält und von dem bisher bekannten Cholesterin ver schieden ist, lässt sich durch allgemein be kannte Verfahren feststellen, z. B. durch Be stimmung des Schmelzpunktes und des Dre hungsvermögens oder des Absorptionsspek trums der wiederholt rekristallisierten Sterin fraktion oder, nach deren Reinigung, durch Niederschlagen mit Digitonin und darauf- f olgendes Zerlegen.
Da die erfindungsgemäss verwendeten Grundstoffe lebende Organismen sind, ist der Provitamingehalt bei verschiedenen Indivi duen derselben Art selbstverständlich nicht konstant, sondern verschieden je nach der Entwicklungsstufe (Alter), den Lebensver hältnissen, der Jahreszeit, dem Klima, dem Futter usw.
Um einen allgemeinen Eindruck über den Wert von aus wirbellosen Tieren hergestell ten Steringemischen als Provitaminquelle zu geben, zeigt nachstehende Tabelle die auf spektroskopischem Wege ermittelte, in der Sterinfraktion von 29 verschiedenen, aus den Porifera, Echinodermata, Annelida,
Molusca und Arthropoda beliebig gewählten Tieren enthaltenen Provitaminmenge.
EMI0003.0075
Phylum <SEP> Provitamingehalt
<tb> des <SEP> Sterins <SEP> in <SEP> /o
<tb> POR.IFERA
<tb> ,Schwamm, <SEP> Halyehondxna <SEP> panicea <SEP> 0,6
<tb> ECHINODERMATA
<tb> Seestern, <SEP> A6terias <SEP> rubens <SEP> 0,7
<tb> " <SEP> Astropecten <SEP> irregularis <SEP> 0,45
<tb> ANNELIDA
<tb> <I>1. <SEP> Chaetopoda</I>
<tb> ,Seewurm, <SEP> Arenicola <SEP> piecatorum <SEP> . <SEP> 1,2
<tb> Regenwurm, <SEP> Lumbricirs <SEP> terrestris <SEP> 11-16
<tb> - <SEP> Tubifex <SEP> 17-25
<tb> <I>2. <SEP> Hirudinea</I>
<tb> Blutegel, <SEP> Himdo <SEP> medicinales <SEP> 4,2
EMI0004.0001
MOLLUSCA
<tb> <I>1.
<SEP> Gastropoda</I>
<tb> Erdschnecke, <SEP> Limax <SEP> agrestis <SEP> 3,,2
<tb> Wellhornschnecke, <SEP> Buccinum <SEP> un.datum <SEP> . <SEP> . <SEP> , <SEP> . <SEP> 10
<tb> Kreiselschnecke, <SEP> Littorina <SEP> littorea <SEP> 5-26
<tb> <I>2. <SEP> Lamellibranchiata</I>
<tb> Muschel, <SEP> Mytilus <SEP> edulis <SEP> . <SEP> 4-16
<tb> Auster, <SEP> Ostrea <SEP> edulis <SEP> 3
<tb> Schwanmuschel, <SEP> Anodonta <SEP> cygnea <SEP> $
<tb> <I>3. <SEP> Cephalopoda</I>
<tb> Tintenfisch, <SEP> Loligo <SEP> vulgaris <SEP> . <SEP> 0,7
<tb> ARTHROPODA
<tb> <I>1. <SEP> Crustacea</I>
<tb> Krebs, <SEP> Homarus <SEP> vulgaris <SEP> 0,D5
<tb> Krabbe, <SEP> Cancer <SEP> pagurus <SEP> . <SEP> 2,7
<tb> Chin. <SEP> Wollhandkrabbe, <SEP> Eriocheir <SEP> sinensie <SEP> 0,3
<tb> Garnele. <SEP> Crangon <SEP> vulgaris <SEP> . <SEP> 0,3
<tb> <I>2.
<SEP> Insecta</I>
<tb> a) <SEP> Coleoptera
<tb> Mehlwurm, <SEP> Tenebnio <SEP> molitor <SEP> . <SEP> 10-11
<tb> Wasserkäfer, <SEP> Dyetiscus <SEP> mar"ginalis <SEP> 4
<tb> Maikäfer, <SEP> Melolontha <SEP> vulgaris <SEP> 0:5
<tb> Spanische <SEP> Fliege, <SEP> Lytta <SEP> vesicatoria <SEP> . <SEP> 2,2
<tb> b) <SEP> Orthoptera
<tb> Heuschreckeneier. <SEP> Carausius <SEP> morosus <SEP> . <SEP> 2,5
<tb> Heuschrecke <SEP> (fam. <SEP> Acridiidae) <SEP> 2,7
<tb> Kakerlak, <SEP> Blatta <SEP> orientalis <SEP> . <SEP> 2,3
<tb> c) <SEP> Lopidoptera
<tb> Seidenraupeneier, <SEP> Bombyx <SEP> mori <SEP> . <SEP> 1,2
<tb> d) <SEP> Hymenoptera
<tb> Honigbiene, <SEP> Apis <SEP> melläfiea <SEP> 0,45
<tb> e) <SEP> D.iptera
<tb> Fliegenmaden. <SEP> Musca <SEP> domestiea <SEP> . <SEP> 0,7
<tb> Mücke, <SEP> Gyronomus <SEP> .
<SEP> 6,1, Bei der Herstellung von Provitamin D enthaltenden unverseifbaren Lipoiden bezw. Sterinen aus wirbellosen Tieren werden bei der bekannten Empfindlichkeit des Provita- mins für verschiedene Einflüsse zweck mässig Vorkehrungen zum Schutze des Pro vitamins getroffen. Es sind insbesondere be- reits bei der Vorbehandlung der zu extra hierenden Stoffe vor der Fettextraktion z. B.
ein lange andauerndes Kochen mit Wasser und Trocknen mit Dampf zu vermeiden. Wei tere Reinigungsverfahren, wie lange an dauerndes Extrahieren mit Äther, lange an dauerndes Kochen mit Essigsäureanhydrid, Bromierung, Behandlung mit Rohlzkohle und dergl., welche das Provitamin leicht zer stören könnten, sind zu vermeiden.
Als ein geeignetes präparatives Ver fahren, bei dem die erwähnten schädlichen Handlungen unterlassen werden, sei bei spielsweise das Folgende geschildert.
Die zu behandelnde gemahlene Masse wird entweder im Vakuum nur bei mässig er höhter Temperatur (z. B. etwa 50 bis<B>80'</B> C) getrocknet oder nach Zermahlen und Zer reiben mit Sand, mit Na_S04, mit Alkohol oder mit Aceton getrocknet. Aus dem auf diese Weise vorbehandelten Grundstoff wird dann das Fett extrahiert, wobei zweckmässig niedrig siedende Fettlösungsmittel, wie Äther oder Petroläther verwendet und zweckmässig halogenhaltige Extraktionsmittel wie Chloro form oder Tetrachlorkohlenstoff vermieden werden, da diese zur Bildung von Salzsäure Anlass geben können.
Eine einigermassen lange andauernde Berührung mit Äther ist zweckmässig zu vermeiden, da er häufig Per oxyde enthält oder teilweise bei dessen Ver wendung die Bildung von Peroxyden schwer zu verhindern ist. Ist der Grundstoff mit Hilfe von Alkohol oder Aceton getrocknet worden, so kann darin ein Teil des Fettes ge löst sein, das durch Eindampfung des Lö sungsmittels im Vakuum gewonnen werden kann. Die Fettlösung vTird durch Filtrierung von gegebenenfalls suspendierten Eiweiss bestandteilen befreit und das Lösungsmittel durch Destillation entfernt.
Das Fett wird dann auf übliche Weise verseift, wobei zweckmässig wieder sehr hohe Temperaturen vermieden werden, und z. B. eine Lösung von NaOH oder KOH in -wenigstens 80 % igem Al kohol verwendet wird.
Die Seifenlösung kann gewünschtenfalls durch Destillation von einem Teil des Alkohols befreit werden, worauf der unverseifbare Teil entweder da durch erhalten werden kann, dass die Seifen lösung mit Wasser verdünnt und dann der unverseifbare Teil mit Hilfe von Äther oder Petroläther extrahiert wird, oder dass in der wässerigen Seifenlösung durch Behandlung mit einem Kalksalz die Kalkseifen geschlagen und die zusammen mit den Xalkseif en nieder geschlagenen unverseifbaren Bestandteile, z. B. mit Aceton, aus ihnen extrahiert wer den.
Aus dem auf diese Weise erhaltenen unverseifbaren Teil kann oft die Sterinfrak- tion durch Umkristallisierung z. B. aus Al kohol abgeschieden werden. Zur weiteren Reinigung kann mit Erfolg eine Umkristalli- sierung mit Methylalkohol angewendet wer den, in dem bestimmte verunreinigende, z. B. ölartige Stoffe oder farbige Lipoidbestand- teile sehr wenig löslich sind und auf diese Weise entfernt werden können.
Insbesondere in denjenigen Fällen, in denen die unverseif- baren Bestandteile erhebliche Mengen von Farbstoffen, wie Carotinoide enthalten, kann unter dem Einfluss von Licht und Luft ein Teil des Provitamins verloren gehen; es ist also gewünscht, auch diesem Umstand Rech nung zu tragen.
Es ist vorteilhaft, bei der Bestimmung des Provitamingehaltes das bekannte Absorp- tionsspektrumverfahren anzuwenden. Es ist auf diese Weise möglich, auf optischem Wege in einem genügend reinen Präparat die Menge des Kükenprovitamins in befrie digender Übereinstimmung mit der biologi schen Kontrolle zu bestimmen, und zwar durch iVergleiehung mit der Menge von pflanzlichem Ergosterin, welche die gleiche Absorption herbeiführt.
Da nun in gleichem Masse absorbierende Mengen, des Küken- provitamins und des Ergosterins bei Bestrab- lung mit Ultraviolettlicht unter gleichen Ver hältnissen eine nahezu gleiche antirhachi- tisch.e Aktivität für Ratten, das heisst eine nahezu gleiche Anzahl von internationalen Einheiten erhalten,
ist die Menge des Küken provitamins dadurch für die Praxis in be- friedigendem Masse bestimmt.
Wenn man ein Präparat mit einer höchst möglichen Anzahl von Einheiten je Milli gramm des umgesetzten Provitamins herzu stellen wünscht, empfiehlt es sich, die akti- vierende Strahlung auf das Wellenlängen gebiet zwischen 270 mit und 300 mu zu beschränken und höchstens<B>60%</B> des Pro vitamins umzuwandeln. . Es werden nachstehend einige Ausfüh rungsbeispiele gegeben.
Beispiel <I>1:</I> 4,1 kg Salzwassermuscheln (Mytilus edu- lis) wurden nach Entfernung der Schalen in einer Hackfleischmühle zermahlen und im Vakuum bei etwa<B>50'</B> C getrocknet.
Die getrocknete Masse wurde dreimal mit ins gesamt 3,5 Liter Petroläther (Siedepunkt 40 bis<B>60'</B> C) extrahiert, der Petroläther- auszug wurde mit Wasser gewaschen, mit Na_SO, getrocknet, filtriert und der Petrol- äther durch Destillation entfernt. Es wurden auf diese Weise 45 g Fett erhalten.
Die Fett masse wurde dadurch verseift, dass sie wäh rend zwei Stunden mit 200 cm' 96%igem Alkohol und 20 g KOH in 20 cm' Was ser an einem Rückflusskühler gekocht wur den. Nach Abkühlung wurde die Seifen lösung in 1 Liter destilliertes Wasser aus gegossen und die wässerige Seifenlösung wurde fünfmal mit insgesamt 1,1 Liter Äther ausgeschüttelt. Die ätherische Lösung wird fünfmal mit jedesmal 100 cm3 destilliertem Wasser ausgeschüttelt, mit Na=S04 getrock net und filtriert.
Es blieb nach Abdestilla- tion des Äthers eine feste rotgelbe Masse mit einem Gewicht von 7,5 g zurück. Dieser rohe unverseifbare Teil des Muschelfettes wurde in 50 cm' 96%igem Alkohol, dann in 25 ein' 96 % igem Alkohol und schliesslich in 100 cm' )Tethylalkohol gelöst und jedesmal um- kristallisiert. Die auf diese Weise hergestellte Sterinfraktion hatte ein Gewicht von 2,
5 g und bestand aus einer lichtgelben kristallini schen Masse. Es wurde durch Messung des Absorptionsspektrums dieser Kristalle fest gestellt, dass die charakteristischen Absorp tionsbänder des Provitamins in einer Stärke vorhanden waren, die einem Ergosteringehalt des Stoffes von 16 % entspricht. Wie be reits angegeben, ist es vorteilhaft, die Äther behandlungen möglichst kurz dauern zu lassen.
150 Milligramm der gewonnenen Kri stalle wurden in peroxydfreiem Äther gelöst und diese Lösung wurde unter stetigem Rüh- ren im Vakuum mit dem von einer Xylol- lösung filtrierten Licht einer Quarzqueck- silberlampe bestrahlt, bis etwa, 40 bis 50@ 5o des vorhandenen Provitamins umgewandelt worden war.
Die bestrahlte Lösung wurde, immer noch im Vakuum, in 200 cm' Arachis- öl eingeführt und der Äther im Vakuum ab gedampft. Die antirhaehitische Wirkung der Ollösung wurde an Ratten untersucht, im Vergleich zu der internationalen Normal lösung von Vitamin D und an Küken im Vergleich zu einem Lebertran, der 100 inter nationale Ratteneinheiten Vitamin D ent hielt.
Es ergab sich aus dem Rattenversuch, dass die 011ösung 1000 internationale [Vitamin D-Einheiten je Kubikzentimeter des Vitamins D enthielt. Es ergab sich aus dem Küken versuch, dass die Ollösung um zehnmal stärker als der benutzte Lebertran war.<B>150</B> Milli gramm Muschelsterin ergaben also insge samt etwa 200 000 internationale Einheiten Vitamin D, das heisst etwa 1330 internatio nale Einheiten je Milligramm.
In einem weiteren Beispiel wurde ein etwas anderes Verfahren angewendet. Die Muscheln wurden 5 Minuten in einer grossen Menge kochendes Wasser eingetaucht gehal ten. Dann wurden die Schalen entfernt und das Fleisch wurde während 10 Stunden in einem sich drehenden Vakuumextraktor ge trocknet, wobei die Temperatur bis auf etwa 80 C am Ende dieses Vorganges gesteigert wurde.
Das getrocknete Fleisch wurde dann mit Petroläther (Siedepunkt 40 bis 60 C) vollkommen extrahiert; die Auszüge wurden vereinigt und der Petroläther wurde ab- destilliert. Das erhaltene Fett wurde mit einer alkoholischen KOH-Lösung (5 Teile KOH, 10 Teile Fett, 90 Teile 80%iger Al kohol)
verseift und der unverseifbare Anteil wurde mit Hilfe von Petroläther aus dieser Seifenlösung extrahiert. Der nach Verdamp fung des Lösungsmittels erhaltene unverseif- bare Teil wurde umkristallisiert, zunächst aus 3 Teilen 9iG % igem Alkohol,
dann aus etwa 4 Teilen Petroläther (Siedepunkt 40 bis 60 C) und schliesslich aus 5 Teilen 96 % igem Alkohol. Die Ausbeute war ein praktisch weisses 11 % Provitamin enthaltendes Sterin gemisch, in einer Menge von 1,4 g (0,l5 g Provitamin) je Kilogramm Muschelfleisch. Beispiel <I>2:</I> 25 kg Kreiselschnecken (Littorina littorea) wurden in einer Hammermühle zermahlen.
Die erhaltene Masse wurde zweimal mit 96 % igem Alkohol (insgesamt 40 Liter) gut gerührt. Die auf diese Weise von Wasser be freite Masse wurde mit P.etroläther einige Male extrahiert und der Alkohol wurde nach Verdünnung bis zu 50 % mit Petroläther aus geschüttelt. Nach Waschen, Trocknen und Abdestillieren wurden 100 Gramm Fett er halten.
Das Fett wurde mit 50 g KOH in 50 g Wasser und 400 cm' 96 % igem Alkohol während 2 Stunden an einem Rückflusskühler verseift, die Seifenlösung wurde mit 2 Liter Wasser verdünnt und der unverseifbare Teil wurde mit Hilfe von Äther extrahiert. Er gebnis 17 g. Aus diesem unverseifbaren Teil wurde durch Umkristallis.ierung aus Alkohol und aus Methylalkohol (U) ,die,Sterin.fraktion erhalten. Ergebnis 3,85 g.
Aus dem Absorp tionsspektrum ergab sieh, dass dieses Präparat etwa 5 % Provitamin enthielt.
590 mg dieses Präparates wurden be strahlt, bis<B>30%</B> des Provitamins umgewan delt worden war; der bestrahlte Stoff wurde auf die in Beispiel 1 beschriebene Weise in 250 ,cmg Arachisöl eingeführt. Es wurde ge funden, dass die antirhachitische Aktivität auf Ratten 815 internationale Einheiten je Kubikzentimeter betrug.
Für die Küken prüfung wurde diese Lösung mit dem Futter in einer Menge vermischt, die 75 internatio- nalen Einheiten (Vitamin D je 100 g Futter entsprach. Es ergab sich, dass im Vergleich zu einer gleich grossen Menge Vitamin D in der Form von Lebertran das aus Kreisel schnecken hergestellte Präparat vollkommen wirksam war.
Bei dem in diesem Versuch erreichten Umwandlungsgrad hatten 590 mg dieses Präparates also 204 000 internationale Einheiten Vitamin D oder rund 350 inter nationale Einheiten je Milligramm geliefert. $eisinel <I>3:</I> 524g Mehlwürmer ((Tenebrio molitor) wurden in einer Hackfleischmühle zermahlen und gemäss Beispiel 2 mit Alkohol und Pe- troläther (Siedepunkt 40 bis<B>60'</B> C) behan delt.
Das Fett (44,5 g) wurde mit 22 g gOH in 22 cm' Wasser und 150 cm3 96%igem Alkohol verseift und der unverseifbare Teil wurde mit Äther extrahiert, wobei 1,08 g Rohprodukt erhalten wurde. Bei einmaligem Umkristallisieren aus Alkohol und viermaIi- gem Umkristallisieren aus Methylalkohol blieb eine s@chwerlösliche butterartige Sub stanz zurück; die Sterinfraktion (0,14 g) wurde in Form eines nahezu weissen Kristall pulvers erhalten.
Aus dem Absorptionsspek- trum ergab sich, dass der Provitamingehalt dieses Sterins etwa<B>10%</B> betrug.
62,7 mg dieses Präparates wurden be strahlt, bis<B>30%</B> ides Provitamins umgewan delt worden war. Der bestrahlte Stoff wurde auf die im. Beispiel 1 beschriebene Weise in 250 cm' Arachisöl eingeführt. Es stellte sich heraus, dass die an Ratten untersuchte anti- rhachitische Aktivität 180 internationale Einheiten je Kubikzentimeter betrug.
Für eine Kükenprüfung wurde diese Lösung mit dem Futter vermischt in einer Menge, die 90 internationalen Einheiten Vitamin D je 100 g entsprach; diese Menge erwies sich im Ver gleich zu Lebertran als vollkommen wirksam. Bei dem in diesem Versuch erzielten Um wandlungsgrad hatten 62,7 mg dieses aus Mehlwürmern hergestellten Präparates mit hin 45 000 internationale Einheiten Vitamin D oder 720 internationale Einheiten je Milli gramm geliefert.
<I>Beispiel</I> .4: 404 g Regenwürmer (Lumbricus) wurden in einer Hackfleischmühle zermahlen und mit Alkohol und Petroläther (Siedepunkt 40 bis<B>60'</B> C) auf die im Beispiel 2 angegebene Weise behandelt. Der Extrakt, 4,3 g, wurde mit 2,2 g gOH in 2,2 cm3 Wasser und 16 cm' Alkohol verseift. Aus dieser Masse wurde durch Extraktion mit Äther 0,9 g erhalten, was nach Umkristallisieren aus Alkohol und Methylalkohol eine Sterinfraktion (weisse Kristalle) mit einem Gewicht von 0,3 g er gab.
Der auf spektrographischem Wege be stimmte Provitamingehalt betrug 11 % . In einem andern Fall wurde aus 9.7 kg Regen würmern eine Sterinfraktion von 12,5 g mit etwa<B>16%</B> Provitamin erhalten.
62,4 mg des beschriebenen Präparates wurden bestrahlt, bis<B>30%</B> des Provitamins umgewandelt worden war; der bestrahlte Stoff wurde auf die im Beispiel 1 beschrie bene Weise in 250 cm' Arachisöl eingeführt. Es stellte sich heraus, dass die auf Ratten untersuchte antirhachitische Aktivität 200 internationale Einheiten je Kubikzentimeter betrug. Für die Prüfung auf Küken wurde diese Lösung mit dem Futter in einer Menge vermischt, die 100 internationalen Einheiten Vitamin D je<B>100</B> g Futter entsprach. Es zeigt sich, dass diese Menge im Vergleich zu Lebertran vollkommen wirksam war.
Bei dem bei diesem Versuch erzielten Umwandlungs- grad hatten 62,4 mg dieses aus Regenwür mern hergestellten Präparates mithin 50 000 internationale Einheiten Vitamin D oder 800 internationale Einheiten je Milligramm ge liefert.
Beispiel <I>5:</I> 500 g Blutegel (Hirudinea) wurden in einer Hackfleischmühle zermahlen und ge mäss Beispiel 2 mit Alkohol und Petroläther (Siedepunkt 40-60' C) behandelt. Der Ex trakt, 7.4 g, wurde mit 3.7g KOH in 3,7 cm' Wasser und 25 cm' Alkohol verseift und er gab einen unverseifbaren Teil mit einem Ge wicht von 1,5 g.
Nach Umkristallisieren aus Alkohol und Methylalkohol wurde eine aus weissen Kristallen bestehende Sterinfraktion mit einem Gewicht von 0,68 g Erhalten, deren auf spektographischem Wege bestimmter Provitamingehalt 4,2 % betrug.
179 mg dieses Präparates wurden be strahlt, bis 40% des Provitamins umgewan delt worden war: der bestrahlte Stoff wurde auf die im Beispiel 1 beschriebene Weise in 250 cm' Arachisöl eingeführt. Es wurde ge funden, dass die auf Ratten untersuchte anti- rhachitische Aktivität 300 internationale Einheiten je Kubikzentimeter betrug. Für die Prüfung auf Küken wurde diese Lösung mit dem Futter in einer 150 internationalen Einheiten je<B>100</B> g Futter entsprechenden Menge vermischt; es stellte sich heraus, dass diese Menge im Vergleich zu Lebertran voll kommen wirksam war.
Bei dem in diesem Versuch erreichten Umwandlungsgrad hatten 179 mg dieses aus Blutegel hergestellten Prä parates mithin 75 000 internationale Ein heiten Vitamin D oder 420 internationale Einheiten je Milligramm geliefert. Beispiel <I>6:</I> 5 kg Nordseeschwämme (Halichondria panicea) wurden in einer Hackfleischmühle zermahlen und auf die im Beispiel 2 ange gebene Weise mit Alkohol und Petroläther (Siedepunkt 40 bis 60 C) behandelt.
Der Extrakt, 26,7 g, ergab bei Verseifung mit 14 g KOH in 14 cm' Wasser und<B>100</B> cm' Alkohol und nach Extraktion mit Äther einen unverseifbaren Rückstand von 7,7 g. Hieraus wurde durch Umkristallisieren aus Alkohol und Methylalkohol 3,85 g Sterin, hellgelbe Kristalle, erhalten. Aus dem Ab sorptionsspektrum ergab sich, dass der Pro vitamingehalt<B>0,6%</B> betrug.
1245 mg dieses Präparates wurden be strahlt, bis l5 % des Provitamins umgewan delt worden war. Der bestrahlte Stoff wurde auf die im Beispiel 1 beschriebene Weise in 250 cm' Arachisöl eingeführt. Es wurde ge funden, dass die auf Ratten untersuchte anti- rhachitische Aktivität 100 internationale Ein heiten je Kubikzentimeter betrug. Für die Prü fung auf Küken wurde die Lösung mit dem Futter in einer 100 internationalen Einheiten Vitamin D je 100 g Futter entsprechenden Menge vermischt. Es stellte sich heraus, dass im Vergleich zu Lebertran diese Menge voll kommen wirksam war.
Bei dem in diesem Versuch. erreichten Umwandlungsgrad hatten 1245 mg dieses aus Schwämmen hergestell ten Präparates mithin 25 000 internationale Einheiten je Milligramm geliefert. <I>Beispiel 7:</I> 6,8 kg Seesterne (Asterias rubens) wurden in einer Haekfleisehmühle zermahlen und ge- mä13 Beispiel 2 mit Alkohol und Petroläther behandelt. Der Extrakt, 115 g, wurde mit 60 g KOH in 60 cm'' Wasser und 400 cm' Alkohol verseift, mit Äther extrahiert und ergab einen unverseifbaren Rückstand mit einem Gewicht von 18 g.
Aus diesem Rück stand wurden durch zweimaliges 1J mkristalli- sieren aus Alkohol 5,5 g hellrosafarbige Kri- talle erhalten. Aus dem Absorptionsspek trum ergab sich, dass der Provitamingehalt 0,7 % betrug. 1015 mg dieses Präparates wurden bestrahlt, bis 15 % des Provitamins umgewandelt worden war; der bestrahlte Stoff wurde auf die im Beispiel 1 beschrie bene Weise in 250 cm' Arachisöl eingeführt.
Es wurde gefunden, dass die auf Ratten untersuchte antirhachitische Aktivität 100 internationale Einheiten je Kubikzentimeter betrug. Für die Prüfung auf Küken wurde die Lösung mit dem Futter in einer<B>100</B> internationalen Einheiten Vitamin D je 100 g Futter entsprechenden Menge vermischt. Es stellte sich heraus, dass im Vergleich zu Le bertran diese Menge vollkommen wirksam war. Bei :dem in diesem Versuch erreichten Umwaüdlung@sgrad hatten 1015 mg dieses aus Seesternen hergestellten Präparates mit hin 25 000 internationale Einheiten Vitamin D oder 25 internationale Einheiten je Milli gramm ,geliefert.