DD149467A5 - Verfahren zur herstellung eines neuartigen,wirkstoffre4{hen heparinhaltigen rohstoffes - Google Patents
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Abstract
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines neuartigen, wirkstoffreichen heparinhaltigen Rohstoffes konstanter Zusammensetzung, der einen niedrigen Fett- und Keimgehalt aufweist und ohne morphologische Veraenderungen oder Aenderungen des Wirkstoffgehaltes gelagert werden kann. Erfindungsgemaesz werden die heparinhaltigen Organe notwendigenfalls zerkleinert, dann in waeszrigem Medium bei 10 bis 50 Grad C, 0,5 bis 15 h lang gelagert, aus der auf diese Weise vorbehandelten Suspension wird bei 75 bis 100 Grad C ein wasserunloeslicher Heparin-Eiweisz-Komplex ausgefaellt, dieser wird durch weitere Waermebehandlung aggregiert, d. ausgeflockte Niederschlag wird abgetrennt u.bei zweckmaeszig weniger als 100 Grad C bis zum Erreichen eines Trockensubstanzgehaltes von 90 bis 95% zu einem kruemeligen Produkt getrocknet.
Description
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines neuartigen heparinhaltigen Rohstoffes aus tierischen Organen. Mit dem Verfahren kann die industrielle Herstellung des Heparin3 bedeutend verbessert werden. :
Charakteristik der bekannten technischen" Lösungen:
Das Heparin ist infolge seiner bekannten blutgerinnung^« hemmenden Wirkung ein wichtiges Arzneimittel. Seine synthetische Herstellung gelang bisher nicht und deshalb wird der Rohstoff der industriellen Heparinherstellung unverändert von an Heparin reichen tierischen Organen, zum Beispiel Dünndarm (Schwein, Rind, Schaf) und Lunge, gebildet. Auch
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der Wirkstoffgehalt von an Heparin reichen tierischen Or-
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ganen liegt nur in der Größenordnung von 10 bis 10 ">, ist demnach außerordentlich gering. Das Isolieren derart geringer Wirkstoffmengen aus einer großen Ballaststoffmenge, ist 3Chon an sich problematisch, aber noch größere Schwierigkeiten verursacht es, wenn die Begleitstoffe während der Lagerung und des Transportes der Rohmaterialien ihre Eigenschaften ändern, sich zum Beispiel zersetzen.
Pur eine wirtschaftlich industrielle Herstellung bestehen demnach die Forderungen, daß der Heparingehalt der Organe bis zu ihrer Aufarbeitung voll erhalten bleiben soll, und daß die die Hauptmasse der Organe ausmachenden inaktiven Substanzen ihre physikalischen, chemischen und morphologischen Eigenschaften nicht verändern. Sine Änderung der Eigenschaften der inaktiven Stoffe kann bei der Aufarbeitung der heparinhaltigen Rohstoffe (zum Beispiel bei der
Extraktion) Aufarbeitungs- und Reinigungsprobleme verursachen, die die wirtschaftliche Produktion eines qualitativ hochwertigen Produktes unmöglich machen.
Es ist daher zweckmäßig, die obigen Forderungen bereits bei der Vorbereitung des Materials (Sammeln und Lagern) zu berücksichtigen.
Trotz der Wichtigkeit des Sammelns und Lagerns heparinhaltiger Organe gibt es überraschend wenig Patentliteratur zu diesem Thema. So gehen zum Beispiel die ungarischen Patentschriften Nr. 148 776 und 149 392 und die US-Patentschrift Nr. 2 587 924 auf das Thema einj jedoch nur am Rande. Die Bedeutung, die eine entsprechende Behandlung des Rohstoffes beim Sammeln und Lagern hat, kann auf Grund der folgenden Überlegungen leicht eingesehen werden:
Die im physiologischen Gleichgewicht befindlichen, lebenden
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Organe enthalten das Heparin in unterschiedlicher Form, hauptsächlich an verschiedene Eiweiße gebunden. Nach dem Schlachten der Tiere besteht das physiologische Gleichgewicht der lebenden Organe und Gewebe nicht länger, und die hydrolysierenden, in erster Linie proteolytischen Enzyme der überlebenden Gewebe beginnen sofort, ihre autolytische Wirkung auszuüben, deren Polge ein ungerichteter Zerfall der begleitenden Ballaststoffe ist, der fallweise von einer Zersetzung des Wirkstoffes begleitet sein kann. Zum anderen erfolgt beim Sammeln und Lagern der tierischen Organe was meistens nicht unter sterilen Bedingungen vorgenommen werden kann - eine mikrobiologische Verseuchung, als deren Polge eiweiß- und wirkstoffzersetzende Enzyme freiwedern. Deren Wirkung ist mit der oben beschriebenen autolytischen Zersetzung identisch. In der US-Patentschrift Nr. 2 884 (Spalte 1, Zeilen 51-53) wird darauf hingewiesen, daß die tierischen Organe beim Lagern einen unangenehmen Geruch annehmen, sich eine auch auf das Endprodukt auswirkende Verfärbung einstellt und die Ausbeute sinkt.
In industriellem Maßstäbe sind drei verschiedene Saminel- und Lagermethoden für heparinhaltige Organe üblich:
1) Schnellgefrieren und Tiefkühllagerung der Organe in natürlichem Zustand;
2) Wärmedenaturieren der Organe, anschließend Schnellgefrieren und Tiefkühllagerung (vor dem Denaturieren werden die Organe meistens mit Wasser versetzt und gemahlen).
3) Der mit Wasser versetzte Mahlbrei der Organe (im Falle von Muscota wird nicht gemahlen, die bei der Darmreinigung erhaltene verdünnte wäßrige Suspension wird teilweise entwässert) wird mit Chemikalien, im allgemeinen mit verschiedenen anorganischen Salzen, konserviert.
Die Methoden 1 und 2 sind energie-, investitions- und arbeiskräfteaufwendig. Es ist erforderlich, schnell eine Tempe-
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ratur von -180C zu erreichen und aufrechtzuerhalten, und zwar bei der Lagerung und während des Transportes, bis zum Beginn der Aufarbeitung, d.h. es muß eine sicher funktionierende Kühlkette vorhanden sein. Dadurch ist der Investitionsaufwand hoch. Die Arbeitskräfteaufwendigkeit ist dadurch gegeben, daß zum Verladen, Verpacken, dem Transport der 77-85 % Wasser enthaltenden Organe, derner zur Vorbereitung der Fabrikation (Mahlen im gefrorenen Zustand) eine beträchtliche Arbeitskräftekapazität erforderlich ist. Die dritte Methode, das Konservieren mit Chemikalien, ist zweifellos weniger energieaufwendig als die anderen Methoden, jedoch wachsen infolge des hohen Wassergehaltes (86-90 %) des gesammelten Materials Transportvolumen und. Kosten in hohem Maße an. Die nur für diesen Zweck verwendbaren pseziellen Transport- und Lagerungsgeräte werden von den verwendeten Chemikalien stark korrodiert. Um die Transport- und Lagerungskosten zu verringern, wird nur ein Teil der in Porm verdünnter wäßriger Suspensionen anfallenden Organaubstanzen (zum Beispiel der bei der Darmreinigung anfallende wäßrige Mucosa-Brei), und zwar der verhältnismäßig viel Trockensubstanz und'Wirkstoff enthaltende Teil gesammelt. Auf diese Weise ist jedoch die pro Tier sammelbare Organ- und Heparinmenge geringer, und um eine indentische Menge Heparingehalt zu sammeln, müssen in mehreren Schlachthöfen Vorrichtungen angelegt werden.
Alle drei der beschriebenen Sammelmethoden haben den großen Nachteil, daß beim Sammeln und Lagern nur annähernd bakteriostatische Verhältnisse erreicht v/erden können, was die Punktion der Enzyme nicht oder nur zum Teil ausschließt. Jeder technologische Pehler (zum Beispiel eine zeitweilige Unterbrechung der Kühlkette, eine größere anfängliche Bakterienzahl, Infektion usw.) führt zu einem Verschwinden des bakteriostatischen Zustandes, zu verszärkter und unlenkbarer Enzymtätigkeit und daher zu steigender Wirkstoffzer-
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setzung, Organveränderung, d.h. letzten Endes zu Aufarbeitungsproblemen.
Die sich aus der Veränderung der Zusammensetzung ergebenden Probleme werden durch den hohen naturlichen Fettgehalt der Organe noch größer.
Die Nachteile der Sammelmethoden könnten beseitigt werden durch Anwendung der in der Praxis nicht realisierbaren Methode, das frieche Organ sofort zu Heparin oder einem gut lagerbaren Zwischenprodukt aufzuarbeiten. Auch ein sofortiges Trocknen der frischen Organe (mit den bekannten schonenden Methoden wie Entwässerung mit Lösungsmitteln, Gefrier- oder "Zerstäubungstrockung) wäre eine Lösung, das erhaltene Organpulver wäre wesetnlich stabiler. Aus wirtschaftlichen Gründen (hohe Kosten der Lösungsmittel bzw. hohe Investitions- und Betriebskosten) erwiesen sich diese Wege jedoch nur im Labormaßstab als gangbar (Methodes of Biochemical Anal.: Vol. 24, S. 244 (1977), Methodes of Biochemical Anal·: Vol. 6, S. 269; Meth. of Carbon. Chein,: VoI, 7, S. 90 /1976/).
Es kann demnach festgestellt werden, daß für die erste Phase der industriellen Heparinheratellung, d.h. das Sammeln und Lagern der-heparinhaltigen Organe vor der Verarbeitung, keine optimale Lösung vorhanden ist, weil die Zusammensetzung der Organe und damit ihr Wirkstoffgehalt innerhalb weiter Grenzen variiert. Die patentierten Verfahren zur industriellen Heparinherstellung weisen daher ein den den Wirkstoff extrahierenden Aufschlußmethoden technologische Schritte auf, die dazu dienen, die Aufarbeitung des eben zur Verfugung stehenden Organs durchschnittlicher Qualität so zweckmäßig wie möglich zu gestalten. Daraus folgt, daß die Technologien infolge der schwankenden Organgqualität nicht am optimalsten realisiert werden können.
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Ziel der Erfindung iat die industriemäßige, kontinuierliche Herstellung eines neuartigen heparinhaltigen Rohstoffes, bei der der eingesetzte Heparingehalt optimal genutzt werden kann, die in den tierischen Organen befindlichen inaktiven Stoffe (Fett, anorganische Salze, Polypeptide, llukleotide, Nukleoside usw.) zum großen Teil entfernt werden können, wodurch eine bisher unerreichte Wirkstoff konzentration gewährleistet wird. Die chemische, physikalische und morphologische Zusammensetzung des entstehenden Produktes ist konstant. Das Produkt bewahrt bei Raumtemperatur auch ohne spezielle Lagerungsbedingungen seine Zusammensetzung über unbegrenzte Zeit; auch die Keimzahl, die infolge der angewendeten Bedingungen sehr niedrig ist, bleibt konstant. Aus diesem neuartigen Rohstoff kann mit den bekannten Methoden zur Heparingewinnung ein Endprodukt pharmazeutischer Qualität hergestellt werden, wobei infolge der unveränderten Zusammensetzung, des hohen Heparingehaites und der geringen Begleitstoffmenge, ferner infolge des geringen' Fettgehaltes die Aufarbeitungstechnologie besser optimierbar ist. Der neuartige Rohstoff hat einen definierten Korngrößenbereich, 13t amorph, auch in wäßrigem Medium formbeständig und weist eine hohe spezifische Oberfläche auf. Daher können in erster Linie in der Extraktionsphase der industriellen Heparinherstellung weitere Vorteile, zum Beispiel die Möglichkeit der Extraktion im Gegenstrom, erreicht werden.
Gegenstand der Erfindung ist demnach ein Verfahren zur Herstellung von neuartigen, wirkstoffreichen heparinhaltigen Rohstoffen kpnstanter Zusammensetzung, die einen niedrigen
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Fett- und Keimgehalt aufweisen und ohne morphologische Veränderungen oder Änderungen des Wirkstoffgehaltes gelagert werden können. Für das Verfahren ist kennzeichnend, daß man die heparinhaltigen Organe - notwendigenfalls nach einer Zerkleinerung - in wäßrigem Medium bei 10-500C 0,5-15 Stunden lang lagert, aus der vorbehandelten Suspension bei 75-10O0C einen wasserunlöslichen Heparin-Eiweiß-Komplexauüfällt, diesen durch weitere Wärmebehandlung aggregiert, den ausgeflockten Niederschlag abtrennt und bei zweckmäßig weniger als 1000C bis zum Erreichen eine3 Trokkensubstanzgehalte3 von 90-95/·? zu einem krümeligen Produkt trocknet.
Als Ausgangsstoff werden zweckmäßig Schweinedünndarm, die Dünndarmschleimhaut vom Schwein (Mucosa), Sero3a und Rinderlunge verwendet, jedoch sind auch alle sonstigen heparinhaltigen Organe, wie Rinderdünndarm, Schafsdünndarm, Rindermilz, sonstige Innereien, Leber usw. geeignet. Bei der Verwendung von Mucosa sind Zerkleinern und Verdünnen mit V/asser nicht erforderlich. Die übrigen Organe werden auf 4-6 mm Größe zerkleinert und zu einer wäßrigen Suspension verarbeitet, die das Heparin und die Eiweiße gelöst beziehungsweise auch in Form kolloid gelöster Teilchen enthält. Der Trockensubstanzgehalt der wäßrigen Suspension wird auf 1,5-17 % eingestellt. Zum Verdünnen wird zweckmäßig 36-420C warmes Wasser verwendet, v/eil in diesem Falle bei der Vorbereitung nur wenig oder überhaupt nicht von außen erwärmt zu werden braucht. Die entstandene Suspension wird im Fall von Ausgangsstoffen mit üblichem Heparingehalt im allgemeinen 2-6 Stunden lang bei 30-50oC vorbehandelt. Nach dieser Vorbehandlung wird der Heparin-Eiweiß-Komplex entweder durch plötzliches unmittelbares Einblasen von Dampf oder durch längere Wärmebehandlung ausgefällt, wobei die Hauptmasse des Heparins an den filtrierbaren Eiweißen gebunden wird. Die Wärmebehandlung dauert im kontinuierlichen System bei
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850C oder höheren Temperaturen wenigstens 2 Minuten, bei diskontinuierlicher Arbeitsweise 15 Minuten oder länger. Durch das Ausfällen und die Wärmebehandlung der Eiweiße wird eine für das Filtrieren und Abtrennen günstige Teilchengröße erreicht, auch werden die virulenten Keime abgetö.tet. Der ausgefällte Niederschlag wird in einer beliebigen, vorzugsweise einer gravitativ arbeitenden mechanischen Abtrennvorrichtung abgetrennt und hat einen Trockensubstanzgehalt von etwa 20-25 %. Die mechanische Abtrenn-r Vorrichtung sollte nach Möglichkeit über eine sich kontinuierliche erneuernde Filterfläche verfügen, jedoch können auch kontinuierliche oder diskontinuierliche Flächenfilter, Bogenfilter, Zentrifugen, Schneckenaeparatoren usw. verwendet werden. Das austretende Filtrat wird verworfen. Es enthält 5-35 % des ursprünglichen Trockensubstanzgehaltes, und zwar in Abhängigkeit von den Bedingungen der gerichteten Wärmebehandlund nicht denaturierbare Eiweiße, Peptide, Hukleinsäurederivate, Fette, Lipoide und mineralische Salze. Das abgetrennte Heparinkonzentrat wird im Trockner unter 100 C bis zu einem Trockensubstanzgehalt von 90-95 % getrocknet, wobei ein in seiner Hauptmasse au3 Teilchen der Größe von 0,2-1,6 mm bestehendes amorphes, fettarmes Konzentrat großer spezifischer Oberfläche gewonnen wird, das über lange Zeit hinweg gelagert werden kann und insbesondere für die kontinuierliche oder diskontinuierliche Gegenstromextraktion geeignet ist.
Es wurde erkannt (und wird in Beispiel 1 auch' experimentell bewiesen), daß in den frischen heparinhaltigen Organen bezogen auf den Heparingehalt in großem Überschuß Eiweiße vorhanden sind, die befähigt sind, das gelöste Heparin und die Heparin-Eiweiß-Komplexe so an sich zu binden, daß sie nach der an sich bekannten irreversiblen Wärmedenaturierung abtrennbar sind. Die Menge dieser zum Binden des Heparins geeigneten Eiweiße nimmt durch die Autolyse und mit der Zeit ab, weil die bindefähigen Eiweiße zu durch Wärme nicht de-
2t
naturierbaren, zum Binden ungeeigneten Polypeptidfraktionen zersetzt werden.
Perner wurde erkannt (und wird in Beispiel 2 experimentell bewiesen), daß durch eine gerichtete und kontrollierte kurze Autolyse, sowohl die im Überschuß vorliegenden heparinbindenden Eiweiße wie auch die sonstigen Eiweiße in den Organen zu durch Wärme nicht denaturierbaren Fragmenten zersetzt werden können, wobei jedoch überraschenderweise die zum Binden von Heparin fähigen Eiweiße viel langsamer zersetzt werden als die sonstigen Eiweiße und außerdem nach der Autolyse ITukleotide, Nukleoside und sonstige die Fabrikation störende Begleit3toffe mit dem Piltrat entfernt werden können. Dacäirch ist es möglich, ein Ausgangsmaterial zu gewinnen, in dem das Heparin bereits angereichert voröiegt. Das neue Ausgangsmaterial enthält 20-25 % Trockensubstanz und praktisch das gesamte Heparin des Ausgangsstoffes, ferner abhängend von den Parametern der Autolyse auf den Trockensubstanzgehalt des Ausgangsmaterials bezogen 5-35 % weniger Begleitstoffe, die die Gewinnung des Heparin3 stören. Aus diesem Material kann das Heparin mit den üblichen Extraktionsmethoden herausgelöst werden.
Schließlich wurde erkannt, daß die V/ärmeempfindlichkeit der erhaltenen Rohstoffe geringer ist als die des Heparins. Deswegen kann auf teuere schonende Methoden wie Lyophilisieren, Zerstäubungstrocknung oder Entwässern mit Lösungsmittel, verzichtet werden. Die in der Organsubstanz ausgebildeten Heparin-Eiweiß-Bindungen schützen den Hepraingehalt derart, daß e3 möglich ist, die Organsubstanz mehrere Stunden lang bei über 10O0C zu halten.
Die Vorteile des Verfahrens können folgendermaßem zusammengefaßt werden:
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1) Es kann ein neuartiges heparinhaltiges· Rohstoffkonzentrat mit einem Trockensubstanzgehalt von 90-95 % hergestellt werden, das ohne Änderung der Zusammensetzung und des Wirkstoffgehaltes lange Zeit bei Raumtemperatur gelagert werden kann.
2) Der Heparingehalt der Organe kann mit optimaler Ausbeute gewonnen werden.
3) Die notwendigen Arbeitsgänge können ohne besonderen Raum-, Energie- und Investitionsaufwand in die organaufarbeitenden Maschinenreihen eingefügt werden.
4) Das hergestellte Heparinkonzentrat enthält wenig KoLae, v/onig Lipoide und wenig Fett.
5) Konsistenz und Teilchengröße sind für die weitere Verarbeitungstechnologie außerordentlich günstig, das an die nativen Eiweiße gebundene und durch Wärmeeinwirkung isolierte Heparin kann leicht wieder herausgelöst werden.
6) Die konstante Zusammensetzung des neuartigen heparinhaltigen Konzentrates eröffnet günstige Möglichkeiten für die Vereinfachung und Optimierung der Aufarbeitungstechnologie.
7) Der Transport des Rohstoffes ist auch über große Entfernungen rentabel.
8) Bei kontinuierlicher Arbeitsweise ist der Arbeitskräftebedarf des Verfahrens gering.
Gemäß einer bevorzugten Ausführung3form der erfindungsgemäßen Verfahrens werden die heparinhaltigen tierischen Organe, wenn erforderlich, mit einem industriellen Fleischwolf auf eine Stückengröße von 4-6 mm vorzerkleinert und dann mit Wasser einer Temperatur von 18-5O0C auf eine Konzentration von 1,5-17 % verdünnt. Dann wird die wäßrige Organsuspension mit einer Pumpe in die für die Vorautolyee benutzte Vorrichtung gefördert, wo sie bei 30-5O0O 2-6 Stunden verbleibt. Anschließend wird bei Temperaturen von 82-1000C die Wärmebehandlung in Form einer kurzen Dampfinjektion vor-
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genommen. Die wäßrige Organsuspension wird im kontinuierlichen System bei schwacher Strömung 2-6 Minuten lang in einem isolierten Rohrabschnitt geführt, wobei sich ein gut filtrierbarer krümeliger Niederschlag abscheidet, der das gesamte Heparin enthält. Die flüssige Phase, die nur inaktive, störende Stoffe enthält, kann mittels Schwerkraft, zum Beispiel durch Siebe, abgetrennt werden. Das erhaltene Rohmaterial enthält wenigstens 23 c/o Trockensubstanz. Zweckmäßig wird eine Filtervorrichtung rait sich ständig erneuernder Filterfläche verwendet, wodurch die Entfettung intensiver ist al3 bei diskontinuierlichen Verfahren. Die Effiziens kann durch eine eingebaute Waschvorrichtung noch gesteigert werden. Der isolierte Rohstoff kann ohne Kühlung und Einfrieren gelagert werden, wenn er in dem Maße, wie er anfällt, sofort getrocknet wird. Beim Trocknen wird die Temperatur des Dampfes, der Luft und der aus der Vorrichtung austretenden feuchten Luft so geregelt, daß bei einer Eintrittstemperatur von 80-1800C und einer AuQtrittstemperatur von 50-1100C innerhalb verhältnismäßig kurzer Trockenzeit ein Heparinkonzentrat von etwa 92 % Trockenstoffgehalt und einer krümeligen Konsistenz mit 0,2-1,6 mm Teilchendurchmesser erhalten wird. In diesem Konzentrat sind die Enzyme blockiert, es sind wenig Mikroorganismen enthalten, das Konzentrat ist fettarm und bei den in Frage kommenden Temperaturen unbegrenzt haltbar. 7/egen des geringen Wassergehaltes können sich die Mikroorganismen nicht vermehren, Lagerung und Transport sind wirtschaftlich. Der Heparingehalt de3 Konzentrates hängt vom Heparingehalt des Ausgangsmaterials ab. Geht man von der Schleimhaut des Schweinedünndarmes aus, die wesentlich weniger Ballaststof- · fe enthält als andere Ausgangsmaterialien, so erhält man ein Konzentrat mit einem V/irkstoffgehalt von 0,15 kg/10-5 IE8 Aus diesem Konzentrat kann das Heparin unter günstigeren Bedingungen herausgelöst werden, als dies bei den bisherigen Extraktionsmethoden der. Fall ist. Das beschriebene
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Verfahren kann - unter Beibehaltung seiner Vorteile auch diskontinuierlich ausgeführt werden.
Die Erfindung wird im folgenden an Hand von Ausführungsbeispielen näher erläutert.
In diesem Beispiel wird gezeigt, daß in frischen tierischen Organen die Konzentration der heparinbindenden Eiweiße grosser ist als die des Heparins. 1,0 kg frische Schweinedünndarmschleimhaut mit 1β, Ο Gew.-/o Trockensubstanzgehalt wird mit 1,0 Liter V/asser verdünnt. In dem V/asser wurde vorher reines pulverförmiges Heparin in einer Konzentration von 82 ΙΕ/ml aufgelöst. Die Suspension wird unter Rühren auf 850C erwärmt. Man läßt 5 Minuten lang abstehen und trennt dann die denaturierte 0rgansub3tanz mit einem Sieb ab. Eine von den 1380 ml Filtrat genommene Probe hat die Heparinkonzentration von 1,4 IR/ml, d.h. von den eingebrachten 82 000 IE Heparin sind etwa 80 000 IE an die denaturierte Organsubetanz gebunden worden.
Läßt man die frische Schweinedünndarmschleimhaut bei Raumtemperatur eineinhalb Tage stehen und verdünnt dann 1 kg mit 1 Liter Wasser, dessen Heparinkonzentration 41 IE/ml beträgt und nimmt dann die Denaturierung bei 850C auf die beschriebene Weise vor, so erhält man 1440 ml Piltrat einer Heparinkonzentration von 2,1 ΙΕ/ml. Daraus Iäß3t sich berechnen, daß die heparinbindende Fähigkeit von aus 1,0 kg Schweindünndarmschleimhaut erhaltener denaturierter Organr substanz durch 1 1/2 tägige Autolyse auf 38 000 IE absinkt.
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Beispiel 2 .
In diesem Beispiel wird gezeigt, daß durch Entfernung der Ballastsubstanzen ohne Heparinverlust ein Rohprodukt von bisher unerreichter V/irkstoffkonzentration hergestellt werden kann. Dabei wird ausgenutzt, daß.bei der Vorautolyse die Zersetzungsgeschwindigkeit der kein Heparin bindenden Organteile größer ist als die der das Heparin beim Denaturieren bindenden Eiweiße.
3 x 2 kg frischer Schweinedünndarm mit 17,3 Gew.-% Trockeneubstanzgehalt werden mit je drei Liter Wasser verdünnt. Die Temperatur wird auf 29,5 0C eingestellt. Die erste Probe wird ohne Autoylse, die zweite nach 6 Stunden Autolyse, die dritte nach 18 Stunden Autolyse aufgearbeitet. Dabei wird die Organsuspension unter Rühren auf 930C erwärmt und dann nach 5 Minuten Abstehen filtriert. Gewicht und Trockensubstanzgehalt der abfiltrierten denaturierten Organsubstanz sowie Volumen, Trockensubstanzgehalt und Heparinkonzentration des Piltrats werden bestimmt.
Die nicht autolysierte Probe ergibt 1,37 kg denaturierte 0rgan3sub3tanz mit 22,8 % Trockensubstanzgehalt und 3670 ml Piltrat mit 0,82 % Trockensubstanzgehalt und einer Heparinaktivität von unter 1,25 ΙΕ/ml. Die 6 Stunden lang autolysierte Probe ergibt 1,18 kg denaturierte Organsubstanz mit 23,2 % Trockensubstanzgehalt und 3780 ml Piltrat mit 1,72 % Trockensubstanzgehalt und einer Heparinaktivität von 1,25 ΙΕ/ml. Die 18 Stunden lang autolysierte Probe schließlich ergibt 0,99 kg denaturierte Organsubstanz mit 24,1 % Trockensubstanzgehalt und 3980 ml Piltrat mit einem Trokkensubstanzgehält von 2,43 % und einer Heparinaktivität von weniger als 1,25 IE/ml.
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Da keine Heparinverluate auftreten, kann ein an Heparin wesentlich konzentrierteres Rohprodukt erhalten werden. Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 zusammengafßt.
Material Nasse Or- Trocken- Gesamt- Gesamt- Heparin-
. gansub- gehalt trocken- heparin- geh./g
stanz (g) (%) geh. g geh. IE Trockensubstanz
Darm, un-
behandelt 2000 17,3 346 118 000 342
denatu- -
riert 1370 22,8 312 118 000 380
nach 6 h
Autolyse 1130 23,2 274 118 000 343
nach 18 h
Autolyse 990 24,1 238 118 000 500
In diesem Beispiel wird gezeigt, daß in diskontinuierlicher Arbeitsweise die Dünndarmschleirahaut nach dem Denaturieren verlustfrei getrocknet werden kann.
260 kg des an der Darmreinigungsmaschine anfallenden, 6,4 % Trockensubstanz enthaltenden wäßrigen Dünndarmschleimhautbreis werden gesammelt und homogenisiert. Für weitere vergleichende Messungen wird eine Probe von 10 kg genommen (Probe A). Dann wird die Suspension in einem zur Direkteinleitung von Dampf geeigneten Apparat innerhalb kurzer Zeit auf 85 C erwärmt. Bai Erreichen der Endtemperatur wird das Rühren verlangsamt, schließlich wird das Gemisch bei 85 G 15 Minuten lang stehen gelaasen, wobei der Denaturationsprozeß vollständig abläuft.
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Aus dem Apparat wird das in Form eines krümeligen Niederschlages koagulierte Material auf ein Sieb der Lochweite 1,2 mm gelassen. Gelbe, heparinhaltige Teilchen werden abgetrennt. Nach dem Filtrieren läßt man das abfiltrierte Material eine Stund lang stehen beziehungsweise rührt zur besseren Entwässerung manchmal auf. 62 kg heparinhaltiges Koagulat werden erhalten, welches weniger Fett enthält als das Ausgangsmaterial, obowohl während des Filtrierens ein Teil-des Fettes an der großen Oberfläche de3 Niederschlages wieder gebunden wird. Das Koagulat hat einen Trockensubstanzgehalt von 23,4 %· '
Das Filtrat hat eine Heparinaktivität von "weniger als 0,9 IE/ral und einen Trockensubstanzgehalt von 0,88 %, Das Filtrat enthält nur Fett, unlösliches und gelöstes Eiweiß, wenig Peptid und Polypeptid, anorganische Salze und einige sonstige inerte Komponenten,
Während der Verarbeitung werden die Proben B, Ü und D von je 10 kg genommen.
Die Probe B wird auf einer Filterpresse in einer Schichtdicke von 1,5 crn gepreßt. 7,4 kg Produkt mit 30,3 % Trokkensubstanzgehalt werden erhalten. Mit steigender Schichtdicke sinkt der Wirkungsgrad des Pressens ab.
Die Probe C wird in zwei gleiche Teile geteilt (C1 und C2). Die Probe C1 wird in 0,5 cm Schichtdicke in einem Ventiöatortrockenschrank bei 900C eineinhalb Tage lang getrocknet. 1,31 kg eines getrockneten Produktes von 88 % Trockensubstanzgehalt werden erhalten. Dieses wird durch Mahlen zerkleinert und als Probe C11 bezeichnet. Die andere Hälfte der Probe C (die Probe C2) wird nicht getrocknet.
Die Proben A, C2 und C11 werden extrahiert. Ziel der Ver-
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-is-
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suche ist der Vergleich der extrahierbaren Heparinmengen.
Urn den zahlenmäßigen Vergleich zu erleichtern, wird von jeder Probe so viel aufgearbeitet, wie 468 g Trockensubstanz entspricht. Daher gelangen von der Probe A 7,31 kg, von der Probe C2 (23,4 % Trockengehalt) 2,0 kg und
von der Probe
532 g zur Aufarbeitung.
Um die Exträktionsmaßnahmen vergleichbar zu machen, werden gleiche Tröckensubstanzgehalte und Reagensverhältnisse eingestellt. Das Volumen wird mit Leitungswasser auf 8,0 Liter eingestellt. Die Probe A benötigt dazu 69O ml, die Probe C:2 6000 ml und die Probe C11 7470 ml Leitungswasser.
Zu dem wäßrigen Gemisch werden unter ständigem Rühren 385 g Araraoniumsulfat gegeben, dann wird das Gemisch auf 60 erwärmt. Der pH-wert wird mit Hatriumhydroxyd auf 10,0 eingestellt. Zwecks Einstellung des Extraktionsgleichgewichtes wird die Temperatur von 600C noch 2 .Stunden lang eingehalten. Nach 2,5 Stunden wird unter Rühren der pH-Wert durch Zusatz von festem Ammoniumchlorid auf 8,2 vermindert. Dann wird das Gemisch aufgekocht, nach 5-minütigem Kochen 10 Minuten 3tehen gelassen und dann die ausgeschiedene Organsubstanz auf einem Metallsieb der Maschenweite 1 mm von der Extraktionsbrühe abgetrennt. Von der Organsubstanz wird eine Probe genommen, deren Trockensubstanzgehalt wird bestimmt, damit errechnet werden kann, wieviel Extraktionsbrühe in dem Organrückstand bleibt.
In den einzelnen Proben werden folgende Heparingehalte und folgende Ballaststoffverhältnisse gefunden:
ProbeA:
Heparingehalt BallaststoffVerhältnisse
126 000 IE
52,2 kg Organsubstanz/
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Probe Cg:
Heparingehalt 148 000 IE
Ballaststoffverhältnis 13j5 kg Organsubstanζ/MIE
Probe C-,-^:
Heparingehalt 162 500 IE
Ballaststoffverhältnis 3,27 kg Organsubοtanζ/MIE
Eine vergleichende Analyse dieser Ergebnisse wird im Anschluß an Beispiel 4 in der Tabelle 2 gegeben.
Die an der Darrareinigungsraaschine anfallende, im Durchschnitt 6,3 % Trockensubstanzgehalt aufweisende Dünndarmschleimhaut wird mit einer Förderpumpe in einem isolierten Rohrabschnitt in Strömung gehalten. In der Vorrichtung wird die Verweilzeit auf 1,5 Stunden, die Temperatur auf 410C eingestellt.
Die auf diese Weise autolysierte Suspension wird mit Hilfe der in der ungarischen Patentanmeldung ITr. RI-703 besehriebenen Vorrichtung kontinuierlich aufgearbeitet. In dem Schnellerhitzer der Vorrichtung wird die Suspension durch unmittelbare Dampfeinleitung auf 900C erwärmt und dann in einem zu der Vorrichtung gehörenden wärmeisolierten, spiralförmigen Rohrabschnitt bei schwacher Strömung 7,5 Minuten lang wärmebehandelt. Die koagulierenden Teilchen werden mittels einer Austragspirale entfernt und auf einer Filtertrommel abgetrennt. Durch die Austragspirale wird der heparinhaltige Rohstoff kontinuierlich aus der Filtereinheit entfernt.
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Das abgetrennte Produkt wird über ein Dosiersystem in eine mit den Filtern in Verbindung stehende Trockenvorrichtung eingespeist« Die Trockenvorrichtung hat die Form eines liegenden Zylinders, ist innen mit Rührblättern und Rollen ausgerüstet und wird von außen mit Dampf, von innen mit heißer Luft geheizt. Die heiße Luft wird in einem speziellen Lufterhitzer hergestellt; in dem aus der Umgebung angesaugte Luft durch Dampfheizung auf 142 C erhitzt wird. Die Temperatur der austretenden feuchten Luft wird auf 82-S8°C eingestellt.
Der Ausgangsstoff wird mit einer Geschwindigkeit von 600 l/h in die Vorrichtung eingespeist. IJach 6 Stunden Betrieb sind 178 kg fast fettfreies Produkt mit einer Mikroorganismenzahl von 10 -10 /g und einem Trockensubstanzgehalt von 90,4 % hergestellt worden. V/enigstens 80 c/o des Produktes fallen in den Korngrößebereich von 1,6-0,2 mm. Das Produkt ist bei Raumtemperatur unbegrenzt lagerbar.
Von dem Piltrat werden halbstündlich Proben genommen, deren Trockensubstanzgehalt, Heparingehalt und wichtigere chemische Komponenten bestimmt werden. Der durchschnittliche Trockenoubstanzgehalt liegt bei 1,41 %, die Heparinaktivität bei 0,92 IE/ral. Da3 Filtrat enthält beträchtliche Mengen Fett, weniger Eiweiß als das gemäß Beispiel 1 abgetrennte Filtrat, jedoch mehr Peptide, Polypeptide, anorganische Salze und inerte Verunreinigungen als Jenes.
Durch die Autolyse kann ein an Heparin reicheres Rohprodukt hergestellt werden. Von dem getrockneten Produkt wird die Probe E genommen und unter den in Beispiel 3 angegebenen Bedinungen extrahiert.
Die Zusammensetzung der Proben gemäß den Beispielen 3 und sowie die Ertebnisse der einzelnen Versuche werden in der Tabelle 2 zusammengefaßt.
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Um einen exakten Vergleich zu ermöglichen, wurden zwei Heparingehalte und drei Ballaststoffverhältnisse berechnet. Die Berechnung von zwei Heparingehaltswerten ist deshalb erforderlich, weil die angewendete Extraktionsmethode eine einfache diskontinuierliche Extraktion war, bei der nach der Abtrennung der, Extraktionsbrühe eine gewisse Menge Extrakt in dem abgetrennten Organrückstand verbleibt. Dieser Heparinanteil ist im Prinzip mittels wiederholter Extraktion erfaßbar. Der unter 9 angegebene V/ert ist der tatsächlich gewonnene, auf Grund des Volumens der Extraktbrühen berechnete Wert, während unter 13 als sog. theoretischer Wert derjenige V/ert angegeben ist, der sich unter Berücksichtigung auch des Extraktgehaltes der Organrückstände ergibt. Unter
12 sind die Extraktbrühegehalte der einzelnen Organrückstände angegeben. Aus diesen Daten i3t ersichtlich, daß mit steigendem Trockensubstanzgehalt de3 Ausgangstoffes der absolute Gehalt des 0rganrück3tandes an Extraktbrühe geringer wird, d.h. auch bei mehrfacher Extraktion mit kleineren Verlusten zu rechnen ist. Die unter IO angegebenen Ballaatstoffverhältnisse wurden aus dem tatsächlich eingebrachten Gewicht (5) und dem gewonnenen Heparin (9) berechnet. Die unter 11 angegebnen Werte hingegen sind auf 100 % Trockengehalt (6) bezogen. Das unter 11 angegebene 30g. theoretische Ballastatoffverhältnis ist aus dem theoretischen Heparingehalt (13) und dem 100 ^igen Trockenoub3tanzgehalt (6) berechnet. Durch Vergleich der Daten der Zeilen 6 und
13 ist der mit einer gegebenen Methode aus den unterschiedlichen Produkten extrahierbare Heparingehalt ersichtlich. Aus der Tabelle ist ersichtlich, daß bei den ohne Autolyse aufgearbeiteten Produkten das Ballastverhältnis der denaturierten und getrockneten Produkte fast gleich und mit dem der rohen Dünhdarmschleiinhaut verglichen nur um 10 % günstiger ist. Nach dem Denaturieren kann mit dem FiItrat eine beträchtliche Menge inerte Substanz entfernt werden. Bei Vorautolyse kann da3 Heparin viel stärker angereichert werden, auf frisches Organ bezogen um etwa 30 %,
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Aus den Tabellen ist ersichtlich, daß der durch Autolyse, Denaturieren und Trocknen gewonnene Rohstoff auf gleichen Trockengehalt bezogen wesentlich mehr Heparin enthält als der ohne Autolyse erzeugte Rohstoff. Ferner zeigen die Daten, daß das Trocknen keine Heparinschädigung verursacht.
Der neuartige Rohstoff kann mit beliebigen Extraktionsmethoden aufgearbeitet werden. Das erhaltene Heparin entspricht den Anforderungen des Arzneimittelbuches.
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Parameter
Probe A
Probe C,
Probe C
11
Probe E .
| 2. | LIa te rial typ % | kg » S | Mucosa roh | 4 | Uucosa turiert | 23, | dena- | Mucose denatu riert u. ge trocknet | 88, | 0 | Mucose denaturiert u. getrocknet |
| 3. | Vorautolyse | - | 31 | - | 2, 468 | - | o, 468 | 532 | + | ||
| 4. | Trockensubstanz (%) | 6, | 4 | 90,4 | |||||||
| 5. 6. | Aufgearbeitete !.!enge, davon Trockensubstanz | 7, 468 | 0 | 0,518 468 . | |||||||
7. Volumen der Extraktions()
| brühe (ml) | 6120 | 6600 | 7030 | 712Ό | |
| 8. | Heparinkonzentration (IS/ml) | 20,6 | 22,5 | 23,1 | 28,6 |
| 9. | Gesamtheparingehalt der Sxtraktionsbrühe (ΙΞ) | 126 000 | 148 000 | 162 000 | 204 000 |
| 10. | Ballaststoffverhält | ||||
| nis auf· das ursprüng liche Gewicht bezogen (kg/MIE) | 58,2 | 13,5 | 3,27 | 2,54 | |
| 11. | auf 100 % Trockensub stanz (kg/LIIE) | 3,72 | 3,16 | 2,88 | 2,29 |
121 Extraktionsbrühegehalt
des Organrückstandes (ml) 1740
1340
860
900
Tabelle 2 (Portsetzung)
Parameter
Probe A Probe C2 Probe C
11
Probe E
13. Theoretischer Heparingehalt
(IE) I62
500 182 000
229
14. Theoretisches Ballaststoffverhältnis auf 100 %
Trockensubstanz (kg/MIE) 2,89 2,62
2,57
2,04
Claims (11)
1. Verfahren zur Herateilung eines neuartigen, wirkstoffreichen heparinhaltigen Rohstoffes konstanter Zusammensetzung, der einen niedrigen Fett- und Keimgehalt aufweist und ohne morphologische Verän&derung oder Änderung des Wirkstoffgehaltes gelagert werden kann, gekennzeichnet dadurch, daß man die heparinhaltingen Organe, gegebenenfalls nach Zerkleinerung, in einem wäßrigen Medium bei 10 bis 500C 0,5 bis 15 Stunden lang lagert, aus der vorbehandelten Suspension bei 75 bis 1000C einen wasserunlöslichen Heparin-Eiweiß-Komplex ausfällt, diesen durch weitere Wärmebehandlung aggregiert, den ausgeflockten Niederschlag abtrennt und bei zweckmäßig weniger al3 10O0C bis zum Erreichen eines Trockensubstansgehaltes von 90 bis 95 % zu einem krümeligen Produkt trocknet.
2. Verfahren nach Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß man auf eine Stückgröße von 4 bis 6 mm zerkleinerte tierische Organe verwendet.
3. Verfahren nach Punkt 1 oder 2, gekennzeichnet dadurch, daß die Organe in Form einer wäßrigen Suspension mit 1,5 bis 17 % Trockensubstanzgehalt behandelt werden.
4. Verfahren nach Punkt 1 bis 3, gekennzeichnet dadurch, daß die als Ausgangsstoff verwendeten zerkleinerten tierischen Organe gewünschtenfalls mit Wasser der Temperatur j6 bis 420C verdünnt werden.
5. Verfahren nach Punkt 1 bis 4, gekennzeichnet dadurch, daß man die Vorbehandlung 4 bis 6 Stunden lang bei 30 bis 500C vornimmt.
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6« Verfahren nach Punkt 1 bis 5» gekennzeichnet dadurch, daß man die vorbehandelte Suspension in einem kontinuierlichen System in kurzer Zeit auf 75 bis 1000C erhitzt und bei dieser Temperatur einer 12 bis 15 Minuten dauernden Wärmebehandlung unterzieht.
7. Verfahren nach Punkt 1 bis 5> gekennzeichnet dadurch, daß man diskontinuierlich arbeitet, die Suspension in der kürzestmö'glichen Zeit auf 75 bi3 1000C erhitzt und bei dieser Temperatur einer 12 bis 15 Minuten dauernden V/Urmebehandlung unterzieht.
8. Verfahren nach Punkt 1 bi3 6, gekennzeichnet dadurch, daß man den "durch vrärmebehandlung abgetrennten Heparin-Biweiß-Komplex in einer gravitativen mechanischen Abtrennvorrichtung mit einem Trockensubstanzgehalt von 20 bis 25 % abtrennt und das inaktive Piltrat verwirft«
9. Verfahren nach Punkt 8, gekennzeichnet dadurch, daß man eine mechanische Abtrennvorrichtung mit sich ständig erneuernder Filterfläche und geschlossenem Dampfraum verwendet,
10. Verfahren nach Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, daß man eine kontinuierliche Trockenvorrichtung verwendet.
11. Verfahren nach Punkt 1, gekennzeichnet dadurch, .daß man einzelne Schritte des Verfahrens diskontinuierlich durchführt.
-H-
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