Verfahren zur Reinigung von wasserlöslichen Metallsalzen des Penicillins. Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Reinigung von wasserlöslichen Metallsalzen des Penicillins.
Bei der üblichen Herstellungsmethode wird das Penicillin mittels eines organischen Lösungsmittels aus der Nährlösung extra hiert und das so extrahierte Penicillin in ein Metallsalz, im allgemeinen in das Natrium- oder Calciumsalz, umgewandelt. Zur Reini gung wird die wässrige Lösung meist ange säuert, das Penicillin erneut extrahiert und dann in wässriger Lösung in das gewünschte Salz übergeführt, aus welcher Lösung das feste Salz gewonnen wird.
Die auf diese Weise hergestellten Metallsalze des Penicil lins sind immer von zum Teil gefärbten Ver unreinigungen begleitet., die nicht nur be wirken, dass das Präparat eine geringe und veränderliche Stabilität aufweist, sondern auch, dass unangenehme Nebenwirkungen, wie z. B. Schmerzen beim Einspritzen, hervor gerufen werden. Reine Penicillinnatrium- oder .-ea.leiurnsalze sind weisse Verbindungen, die eine grössere Stabilität aufweisen und beim Einspritzen weniger Schmerzen verur sachen als die oben erwähnten Rohprodukte.
Die Reinigung von Penicillin oder dessen Metallsalzen, d. h. die Abtrennung der ak tiven Substanzen von den Verunreinigungen, welche diese im allgemeinen begleiten, ist eine schwere und mühselige Operation.
In der sehweit. Patentschrift Nr. 271517 wird ein Verfahren zur Reinigung von was- serlöslichen Metallsalzen des Penicillins be schrieben, welches dadurch gekennzeichnet ist, dass man ein wasserlösliches Metallsalz des Penicillins mit einer starken Säure an säuert, die angesäuerte Lösung mit einem inerten organischen Lösungsmittel extrahiert, die so erhaltene Lösung von rohem Penicillin mit einer primären organischen Base der all gemeinen Formel RNHZ, worin Reinen Koh lenwasserstoffrest mit höchstens 8 Kohlen stoffatomen bedeutet, und mit einem nicht unterhalb 10,2 liegenden pI,
H-Wert behan delt und das Penicillinsalz der genannten Base zur Ausfällung bringt, worauf dieses Salz wiederum in das wasserlösliche Metall salz des Penicillins übergeführt wird.
Der pI,H-W ert einer Base lässt sich durch die folgende Gleichung definieren: PIiH - 1'1 -<B>PU</B> worin phb den Logarithmus der reziproken Dissoziationskonstante der Base bedeutet; Ga. der pl;b-Wert einer stärkeren Base gerin ger ist als jener einer schwächeren Base, ist der pI,H-Wert einer stärkeren Base höher als jener einer schwächeren Base.
Im Verlaufe weiterer Untersuchungen wurde gefunden, dass die rohen Penicillin salze, wie z. B. das Natrium- oder Calcium- salz, leicht, in praktisch reine Salze von pri mären, nachstehend näher bezeichneten Ba sen übergeführt werden können, und. zwar ohne Bildung es freien Penieillins. Dies hat zur Folge, dass die Verwendung von Lö sungsmitteln von der Art von Methyl- isobutylketon vermieden werden kann.
Die so erhaltenen Penicillinsalze der primären, organischen Basen können leicht in die Me- tallsalze,-z. B. in die Natrium- oder Calcium- salze übergeführt werden.
Gegenstand des Patentes ist somit ein Verfahren zur Reinigung von wasserlöslichen Metallsalzen des Penicillins, welches dadurch gekennzeichnet ist, .dass man -das zu reini gende Penicillinsalz in wässriger Lösung mit einem Salz einer primären organischen Base der Formel R.NH., worin R einen den Cyclo- hexanring enthaltenden Kohlenwasserstoff rest mit insgesamt höchstens 8 Kohlenstoff atomen bedeutet., und mit einem nicht unter halb 10,
2 liegenden pitH-W ert zur Umsetzung bringt und hierauf das entstandene Penicil- linsalz der genannten Base wiederum in das ursprüngliche .Salz des Penicillins überführt. Beispiele von geeigneten Basen sind Cyclo- hexylamin mit einem pI;A-Wert von 10,6-1 und Methylcyclohexylamin mit einem pI,H- Wert von ungefähr 10,6.
Die wässrige Reaktionslösung enthält vor teilhafterweise, aber nicht notwendigerweise ein Aussalzmittel; das durch .doppelte Um setzung gebildete Aminsalz des Penicillins fällt dann ohne weiteres aus. Dieses Salz lässt sich, gewünschtenfalls nach Reinigung, leicht in die ursprünglichen Penicillinmetallsalze (z. B. in das Natrium- oder Calciumsalz), die viel reiner als das ursprüngliche Penicillin metallsalz sind, überführen.
Als Aminsalze kommen solche mit starken oder mässig starken Säuren in Betracht. Salze, welche bei ,der Umsetzung eine zerstö rende Wirkung .auf das Penicillin oder des sen Salze ausüben, sind natürlich zu ver meiden. Besonders geeignet sind Salze mit starken Mineralsäuren, wie z. B. .Salzsäiure.
Das Salz der primären organischen Base kann z. B. einer wässrigen Lösung des Peni- cillinsalzes in praktisch reiner Form oder in Form einer konzentrierten, wässrigen Lösung zugesetzt werden. Zweckmässig wird die Um setzung bei einem pli-Wert von 6-7 .durch- geführt; zur Einstellung des PH-Wertes kann, je nachdem, eine Säure, wie z. B. Phosphor säure, oder eine anorganische Base, wie z. B. Natriumhy droxyd, zugesetzt werden.
Als Ausgangsmaterial wird zweckmässig eine gekühlte wässrige Lösung des rohen Penicillinmetallsalzes (z. B. des Natrium oder Calciumsalzes) verwendet. Die Aktivität des Penicillinsalzes sollte nicht kleiner als 400 Oxfordeinheiten pro mg sein. Die Kon zentration des Penicillins in der wässrigen Lö- sung beträgt bevorzugterweise 2-10 % Ge- wieht/Volumen.
Als Aussalzmittel wird vorzugsweise ein Salz verwendet, dessen Lösung neutral ist. Bevorzugt wird die Verwendung von z. B. Natriumchlorid, Natriumsulfat, Kalium chlorid und dergleichen; Ammoniumsalze sind nicht geeignet. Salze, die auf das Peni cillin oder .dessen Salze eine zerstörende Wir kung ausüben, sollten natürlich nicht ver wendet werden. Die Menge des in der Lösung vorhandenen Aussalzmittels wird zweck mässig so bemessen, dass die Lösung annä hernd gesättigt ist.
Wenn man das Ca.leiumsalz reinigen will, so sollte das .Salz der Base vor dem Aussalz- mittel zugesetzt werden, .da sonst. unter Um ständen bereits das Caleiumsalz des Peni cillins ausg-efäl.lt wird.
Das erfindungsgemässe Verfahren kann beispielsweise wie folgt durchgeführt werden Die wässrige Lösung des zu reinigenden Penicillinsalzes wird unter Rühren und Küh len mit einer dem vorhandenen Penicillin min destens äquivalenten 11enge des Salzes der primären organischen Base, entweder in Form der im wesentlichen reinen Substanz oder in Form einer konzentrierten wässrigen Lösung, versetzt. Das Gemisch wird auf ein PH von 6 bis 7 eingestellt, indem unter Rüh ren vorsichtig eine Säure, wie z. B. Phos phorsäure, oder eine anorganische Base, wie z.
B. Natriumhy droxyd, zugesetzt. wird. Die ses Gemisch wird. gerührt und gekühlt, bis keine weitere Fällung mehr eintritt. Das Reaktionsprodukt, nämlich das rohe Penh- i cillinsalz der verwendeten primären organi- sehen Base, wird durch Filtrieren oder Zen trifugieren isoliert. Es kann mit einer klei nen Menge einer annähernd gesättigten Lö sung einer gussalzenden Substanz gewaschen werden.
Die letztere sollte eine neutrale, wässrige Lösung bilden. Das Reaktions produkt wird durch fortgesetztes Filtrieren und Zentrifugieren so vollständig als mög lich vom Wasser befreit.
Das feuchte Produkt kann auf versehie- dene Arten behandelt werden. Das zurück gehaltene Wasser kann dadurch weitgehend aus dem Produkt entfernt werden, dass dieses während mehreren Stunden über einem Trocknungsmittel, wie z. B. Phosphorpent'- oxyd, in einem evakuierten Exsikkator ge halten wird. Wenn das Produkt trocken ist, so kann es mit Aceton oder Methyläthyl- keton gewaschen werden. Das auf diese Weise gewaschene oder auch das nicht gewaschene Produkt. kann hierauf z.
B. wie folgt umkri stallisiert werden: Das getrocknete Produkt wird mit etwas mehr Chloroform erwärmt, als nötig ist, um bei 300 C das organische Material zu lösen. Das warme Gemisch wird rasch abfiltriert, um das ungelöste anorganische Material zu entfernen. Das Filtrat. wird mit so viel Ace ton oder Methy läthy lketon versetzt, dass beim Kühlen das gereinigte Penicillinsalz der pri mären organischen Base ausfällt.
Das feuchte Material kann aber auch ohne vorheriges Trocknen umkristallisiert werden. Zu diesem Zweck wird es z. B. direkt in Chloroform gelöst und die Lösung von den wenigen Tropfen der wässrigen Phase be freit. Beim Verdünnen mit 2 oder 3 Volu mina. Aceton oder Methyläthylketon kristalli siert. das gereinigte Salz der primären Base aus. Es ist zu bemerken, dass auch andere Lö- sungsmittelkombinationen für das Umkri- stallisieren verwendet. werden können.
Wenn das auf diese Weise erhaltene Produkt nicht den gewünschten Reinheitsgrad aufweist, so kann der oben beschriebene Reiniglings, prozess wiederholt werden.
Eine weitere Möglichkeit besteht darin, da.ss das feuchte Material in einer kleinen Menge Äthylalkohol gelöst wird, z. B. so, dass 3-5 ein' auf 1 Megaeinheit des ursprünglich verwendeten Penicillins kommen.
Nachdem eventuell vorhandene Spuren :des Aussal- zungsmittels, wenn ein solches verwendet wurde, durch Filtrieren entfernt sind, kann das gereinigte Penicillinsalz der organischen Base gefällt werden, indem die alkoholische Lösung mit der etwa 3-5fachen Volumen menge Diäthyl-, Diisopropyl- oder Dibutyl- äther versetzt wird.
Das gereinigte Produkt kann mittels ver schiedener Methoden leicht wieder in die nun reinen Penicillinmetallsalze (z. B. in das Na trium- oder Calciumsalz) übergeführt wer den. Es kann beispielsweise unter raschem Rühren ein Gemisch aus Äther oder Chloro form und wässriger Phosphorsäure zugesetzt werden, welches Gemisch mindestens eine der im umzuwandelnden Salz enthaltenen Menge der organischen Base äquivalente Menge Phosphorsäure enthält. Der organische Ex trakt wird abgetrennt, die wässrige Lösung auf ein pH von 2,5 eingestellt und mit einer weiteren Menge .des organischen Lösungsmit tels extrahiert.
Die Extrakte werden hierauf vereinigt und .das Gemisch mit einer wäss- rigen Lösung des betreffenden Metall hydroxyds extrahiert, welche Lösung eine der im Salz der organischen Base vorhan denen Penicillinmenge (freie Säure) äquiva lente Menge an Metallhydroxyd enthält. Der wässrige Extrakt kann im gefrorenen Zu stand getrocknet werden (Trockenverfahren, welches darauf beruht, dass eine gefrorene Lösung einem Vakuum unterworfen wird, wobei das Eis unter Umgehung der flüssigen Phase sich direkt verflüchtigt).
Die in den folgenden Beispielen verwen deten Abkürzungen haben folgende Bedeu tung; ME=Megaeinheit (1000000 Oxford einheiten) und OE=Oxfordeinheiten. <I>Beispiel 1:</I> Rohes Penieillinnatrium, enthaltend 2,5 ME (910 OE/mg), wird in 32 cm0 bei 00 C mit Natriumnitrat gesättigtem Wasser gelöst. Es wird eine 50 /oige wäl3rige Lösung von Cyelohexylaminhydrochlorid in einer der doppelten Menge an vorhandenem Penicillin äquivalenten Menge zugesetzt.
Die Lösung wird auf ein PH von 6 eingestellt und vor dem Filtrieren etwa eine halbe Stunde stehen gelassen. Die Fällung wird mit einigen ciu@ gesättigter Natriumnitratlösung gewaschen.
Das feuchte Produkt wird zusammen mit 25 cm@ Chloroform leicht erwärmt und die Lösung durch ein trockenes Filter filtriert, um einige Tropfen noch vorhandener, wäss- riger Lösung zu entfernen. Das Filtrat wird mit 75 cm3 Aceton versetzt. Das Gemisch wird etwa 1 Stunde im, Kühlschrank stehen gelassen und dann filtriert. Eine weitere Menge wird durch Einengen des Filtrates unter vermindertem Druck und durch Kri- stallisierenlassen erhalten.
Die Ausbeute be trägt 1,53 g (erste Fraktion) und 0,1 g (zweite Fraktion) an praktisch reinem Peni- cillincyclohexylaminsalz.
Dieses Salz wird in Penicillinnatrium übergeführt, indem es mit Eiswasser (1 Vo lumenteil) und Chloroform (2 Volumenteile) verrührt wird. Es wird genügend 10 o/oige Phosphorsäure unter Rühren zugesetzt, um das pjl auf 2,1 zu bringen. Der Choroform- extrakt wird mit Wasser und so viel ln-Na- triumhydroxydlösung gerührt, dass das PH auf 5,9 steigt. Nach der Trennung wird mit einer weiteren kleinen Menge Natrium- hydroxycllösung gerührt, um das pH auf 7,4 einzustellen.
Die wässrigen Lösungen werden vereinigt und im gefrorenen Zustand ge trocknet. Der entstandene, feste Körper wird aus Aceton umkristallisiert, wobei rasch reines Penicillinnatrium auskristallisiert.
Beispiel<I>2:</I> Rohes Penicillinnatrium, enthaltend 2 ME (1100 OE/mg), in 21,5 c & Wasser wird bei etwa<B>00</B> C mit Natriumnitrat gesättigt. Diese Lösung wird mit 1 cm' Methyleyelohexyl- amin, welches vorher mit starker Salzsäure neutralisiert wird, versetzt.
Das Gemisch, welches ein pH von 6,3 aufweist, wird wäh rend 2 Stunden im Kühlschrank stehengelas- sen, bevor es filtriert wird, Das feste Pro- Bukt wird getrocknet, indem es über Nacht in einem Vakuumexsikkator gehalten wird; hierauf wird es mit Aeeton gewasehen und erneut getrocknet.
Das Gewicht dieses Pro duktes beträgt 0,85 g. Es wird in 15 em3 warmem Chloroform gelöst, die Lösung fil triert und mit 45 em Methyläthyl.keton ver setzt. Das Gemisch wird während einer hal ben Stunde im Kühlschrank gekühlt und dann filtriert. Der feste Körper wird mit wenig Methyläthy lketon gewaschen und hierauf getrocknet. Das umkristallisierte Methylcyclohexylaminsalz des Penicillins wiegt 0,45 g.
Die Überführung dieses Salzes in das Penicillinnatrium kann in der glei chen Weise wie in Beispiel 1 erfolgen.
Beispiel <I>3:</I> Eine Lösung von rohem Penieillinnatrium (20 ME; 1100 OE/mg) in 215 em3 Wasser wird bei etwa.<B>00</B> C mit Natriumchlorid ge sättigt. Das Gemisch wird mit 20 ein' 50 o/oiger, wässriger Lösung von Cyclohexyl- a.min-hydrochloricl versetzt, so dass es ein PH von 6,2 aufweist.
Dann wird bei<B>00</B> C wäh rend 1 Stunde stehengelassen. Das Gemisch wird hierauf im Vakuum filtriert und das feste Produkt dureh Absaugen möglichst gut getrocknet. Das Produkt wird in 100 cm3 @Ithylalkohol gelöst und die Lösung durch Filtrieren von Natriumchloridspuren befreit.
400 em3 Isopropyläther werden zugesetzt, worauf das Penieilliney clohexylaminsalz rasch in feinen Nadeln auskristallisiert. Nach halb stündigem .Stehen bei etwa. 1011 C werden die Kristalle abfiltriert. Das Filtrat wird im Va kuum zur Troekne eingedampft., der Rück stand in 30 em3 Chloroform. gelöst und die Lösung mit 80 em3 llethyläthylketoii ver setzt.
Das (lemisch wird in einer Kälte mischung abgekühlt und hierauf filtriert. Das Salz wird mit llethyläthylketon gewa schen. Die Ausbeute an reinem Penicillin eyelohexylaminsalz beträgt 11,2 g bei der ersten Fraktion und 2,85 g bei der zweiten Fraktion. 24 % des ursprüngliehen Penicil- lins bleiben in der wässrigen Mutterlauge zurück.
Das entstandene Penicillin-cyclohexyl- aminsalz lässt sich in. der in Beispiel 1 be schriebenen Weise wieder in das Penicillin natrium überführen.