CH299109A

CH299109A - Verfahren zur Herstellung eines Lactoflavin-monophosphorsäureesters.

Info

Publication number: CH299109A
Authority: CH
Inventors: F Hoffmann- Aktiengesellschaft
Original assignee: Hoffmann La Roche
Priority date: 1950-07-15
Filing date: 1951-06-15
Publication date: 1954-05-31

Description

Verfahren zur Herstellung eines Lacto$avin-monophosphorsäureesters. Die Erfindung betrifft ein neuartiges Verfahren zur Herstellung eines Lactoflavin- monophosphorsäureesters und zur Isolierung des bekannten Lactoflavin-5'-monophosphor- säureesters aus den Mischungen desselben mit andern Isomeren de's Lactoflavin-monophos- phorsäureesters, welche bei der Herstellung desselben entstehen.

Gegenstand des vorliegenden Patentes ist ein Verfahren zur Herstellung des Lactofla- vin-5'-monophosphorsäureesters, dadurch ge kennzeichnet, dass ein 1-D-1'-Ribitylamino- 3,4-dimethyl-benzol mit einer Chlorphosphor säure phosphoryliert, das Reaktionsprodukt zum monophosphorylierten 1-D-1'-Ribityl- amino-3,4-dimethyl-benzol hydrolysiert,

dieses mit einem Aryl-diazoniumsalz zum phospho- rylierten 1-D-1'-Ribitylamino-6-arylazo-3,4-di- methyl-benzol gekuppelt, dieses mit Barbitur- säure --tun phosphorylierten Lactoflavin kon densiert und aus dem erhaltenen Isomeren- Gemisch das 5'-Isomere isoliert wird.

Der Ausdruck Chlorphosphorsäure , wie er hier gebraucht wird, bezeichnet zwei -Ver bindungen, d. h. Monochlorphosphorsäure -Lund Dichlorphosphorsäure, deren Formeln die fol genden sind: (HO)2POC1 und HOPOC12. Die Bildung dieser zwei Verbindungen erfolgt durch Umsetzung zwischen Phosphoroxy- chlorid und Wasser oder zwischen Phosphor- exychlorid und Phosphorsäure.

Die Chlorphosphorsäuren werden leicht durch Umsetzen von Phosphoroxychlorid mit 1 bis 2 Mol Wasser gewonnen. Die Reaktion nimmt folgenden Verlauf:
EMI0001.0049

POC13 <SEP> + <SEP> H20 <SEP> > <SEP> ' <SEP> HOPOCI2 <SEP> -I- <SEP> HCI
EMI0001.0050

POC13 <SEP> -I- <SEP> 2H20 <SEP> --->- <SEP> (HO)2POC1+ <SEP> 2 <SEP> HCl Die zwei Verbindungen bilden sich auch bei der Umsetzung von Phosphoroxychlorid mit ortho-Phosphorsäure. Beispielsweise kann ein geeignetes Chlorphosphorsäure-Reagens durch langsamen Zusatz von 61,3 g (0,4 lol)

Phosphoroxychlorid zu 19,6 g (0,2 Mol) was serfreier ortho-Phosphorsäure, wobei gerührt und auf Raumtemperatur gekühlt werden muss, erhalten werden. Die Reaktionsmischung wird während etwa 1 Stunde gerührt. Um eine möglichst hohe Ausbeute an Chlorphos- phorsäure zu gewinnen, lässt man das Pro- dakt über Nacht stehen. Die Wartezeit ist jedoch nicht unerlässlich, denn die Chlor phosphorsäure bildet sich leicht und in guter Ausbeute, sobald Phosphoroxychlorid mit Wasser oder Phosphorsäure reagiert.

Es ver steht sich, dass die Phosphorsäure auch wässe- . rig sein kann, in welchem Fall beide Reaktio nen zur Bildung der Chlorphosphorsäure bei tragen, d. h. eine Reaktion zwischen dem Phosphoroxychlorid und Wasser, -Lind eine Reaktion zwischen dem Phosphoroxychlorid und der ortho-Phosphorsäure. Die Chlorphos phorsäure kann selbstverständlich auch in Gegenwart des zu phosphorylierenden Kör pers gebildet werden, wobei sie dann sofort mit letzterem reagiert.

Die Produkte der Phosphorylierung mit der Chlorphosphorsäure umfassen die mono (chlorphosphorsauren) Salze der Phosphor säureester und Chlorphosphorsäureester von 1-D-1'-Ribitylamino-3,4-dimethylbenzol, Poly phosphorsäuren, chlorenthaltende Phosphor säure und chlorenthaltende Polyphosphorsäu ren. Cyclische Phosphorsäureester der Zwi schenprodukte können auch gebildet werden. Der Grad der Phosphoryliertmg ist abhängig von der Zeitdauer, während der die Ausgangs verbindungen mit der Chlorphosphorsäure reagieren können.

Die hier angegebenen Reak tionen stellen eine Synthese mit hypothetischen Zwischenproduktstrukturen dar. Obwohl das vorangehende und das nachstehende Reak tionsschema auf dem gründen, was als der wahrscheinlichste Reaktionsverlauf angesehen wird, versteht es. sich, dassr die Erfindung kei nesfalls auf irgendeine Reaktionstheorie oder Zwischenprodukts-Struktur beschränkt ist.

Im Falle der Dichlorphosphorsäure kann die Reaktion wie folgt formuliert werden:
EMI0002.0015
Das obige monochlorphosphorylierte Produkt kann weiter chlorphosphoryliert werden,
EMI0002.0018

je <SEP> nach <SEP> Reaktionszeit <SEP> wie <SEP> folgt: <SEP> _
<tb> 0 <SEP> 0
<tb> (a) <SEP> --F <SEP> HOPOC12 <SEP> RO-P-O-P-OH <SEP> - <SEP> HOPOC12 <SEP> (b)
<tb> Cl <SEP> Cl
<tb> 0 <SEP> 0
<tb> und/oder <SEP> RO-P-O-P-Ci <SEP> HOPOC12 <SEP> (c)
<tb> OH <SEP> C1 Die Verbindungen (b) und (c) können weiter phosphoryliert werden.

Im Falle der Monochlorphosphorsäure sind die entsprechenden Reaktionen die folgenden
EMI0002.0021
Nach weiterer Behandlung mit Monochlorphosphorsäure ergibt sich folgendes:
EMI0002.0023
Die Verbindung (e) kann weiter phospho= ryliert werden.

In den obigen Formeln bedeutet ROH 1-D-1'-Ribitylamino-3,4-dimethyl-benzol. Die Hydrolyse der Zwischenprodukte der Reaktion mit den Chlorphosphorsäuren be wirkt je nachdem zuerst die Abspaltung der salzbildenden HOPOC12 oder (HO)2POC1, gefolgt von der Freisetzung des Monophos- phorsäureesters, welcher entsprechend als ROPO(OH)2 bezeichnet werden kann. Der Phosphorylierungsgrad ist belanglos, da das Endprodukt der Hydrolyse in jedem Falle der Monophosphorsäureester des Zwischenproduk tes ist.

Das Hauptprodukt ist ein 5'-Ester, doch besteht eine kleine Menge aus den andern Isomeren, d. h. den 2'-, 3'- und 4'-Isomeren.

Obwohl die vorgenannten Estersalze des Zwischenproduktes isoliert werden können, z. B. um sie zu reinigen, ist es nicht erforder- lieh, diese Isolierung vorzunehmen, bevor man dieselben in Lactoflavin-monophosphorsäure- ester umwandelt. Die durch Phosphorylierung des Zwischenproduktes erhaltene Reaktions mischung kann einfach in mehrere Volumen Wasser gegossen und für einige Stunden stehengelassen werden.

Während dieser Zeit hydrolysieren die restlichen nicht umgesetzten Chlorphosphorsäuren vollständig zu Phosphor säure und Salzsäure, und die Zwischenester salze erleiden ebenfalls eine Hydrolyse, wel che zu den Monophosphorsäureestern des Zwi schenproduktes führt.

Die so erhaltenen Mono phosphorsäureester von 1-D-1'-Ribitylamino- 3,4-dimethyl-benzol können leicht mit Aryl- diazoniumsalzen zu den Monophosphorsäure- estern des 1-D-1'-Ribitylamino-6-arylazo-3,4- dimethyl-benzols gekuppelt werden, und diese werden mit Barbitursäure zu den Lactoflavin- monophosphorsäureestern kondensiert.

Wie oben hervorgehoben, entstehen neben dem Hauptprodukt, nämlich dem Lactoflavin- 5'-monophosphorsäureester, eine kleine Menge der Lactofiavin-2'-, -3'- oder -4'-monophosphor- säureester. Von diesen Isomeren des Lactofla- vin-monophosphorsäureesters ist allein der 5'-Isomere biologisch voll wirksam. Es ist da her wünschenswert, diese Substanz in reiner Form, frei von den andern Isomeren, zu ge winnen.

Die Eigenschaften der verschiedenen Isomeren sind allerdings so weitgehend ähn lich, dass die Abtrennung des 5'-Isomeren von den andern schwierig ist.

Es ist festgestellt worden, dass die Diätha- nolamin- und Morpholinsalze des Lactoflavin- 5'-monophosphorsäureesters in ihren Löslich- keitseigenschaften so weit verschieden sind von den entsprechenden Salzen der andern Isomeren, dass die Abtrennung des gewünsch ten 5'-Isomeren in reiner Form zweckmässig über diese Aminsalze erfolgt.

Diese neuen Diäthanolamin- und Morpholinsalze des Lacto- flavin-5'-monophosphorsäureesters sind auch an sich physiologisch wertvolle Verbindungen, denn sie enthalten den biologisch aktiven 5'-Isomeren in einer leicht löslichen, nicht toxischen Form, die sich für therapeutische Verwendung eignet. Diese Salze können mühe los in den freien 5'-Monophosphorsäureester durch einfaches Ansäuern ihrer wässerigen Lösung, z. B. mit einer Mineralsäure, umge wandelt werden, wobei der 5'-Ester in reiner Form kristallisiert.

Die den Lactoflavin-5'-mQnophosphorsäure- ester und die andern Isomeren enthaltende Mischung wird z. B. einfach mit Diäthanol- amiri oder Morpholin -umgesetzt, wobei sich eine Mischung der entsprechenden Aminsalze der Isomeren des Lactoflavin-monophosphor- säureesters bildet.

Die Aminsalze des Laeto- flavin-5'-monophosphorsäureesters werden so dann von der Mischung abgetrennt, beispiels weise durch fraktionierte Kristallisation. Letz tere kann so durchgeführt werden, dass ein mit Wasser mischbares Lösungsmittel, wie Äthanol, Isopropanol oder Aceton, einer wäs serigen Lösung der Mischung der Aminsalze der Isomeren zugesetzt wird. Die entsprechen den Aminsalze der andern Isomeren bleiben in der Mutterlauge in Lösung.

Die Diäthanol- amin- und Morpholinsalze des Lactoflavin-5'- monophosphorsäureesters werden leicht durch Behandlung mit einer geeigneten Säure in den freien Lactoflavin-5'-monophosphorsäureester umgewandelt. Während der Umsetzung der Mischung der Isomeren des Lactoflavin-monophosphor- säureesters mit den vorgenannten Aminen bil den sieh entweder die Mono- oder Diaminsalze oder Mischungen derselben, je nach Menge des verwendeten Amins.

Bei der Titration mit Diäthanolamin oder Morpholin zeigt die poten- tiometrische Titrationskurve des Laetoflavin- monophosphorsäureesters ein scharfes Knie bei ungefähr PH 4 in dem Augenblick, wo ein Hol des Amins pro Mol des Lactoflavin-mono- phosphorsätireesters addiert worden ist.

Wenn ein weiteres Mol Amin zugesetzt wird, steigt das pH langsam auf etwa 7, wo ein kaum wahrnehmbares Knie in der Kurve zeigt, dass das zweite Mol Amin in dem Di-salz nur sehr schwach gebunden ist. Beim Zusatz eines mit Wasser mischbaren Lösungsmittels, z. B. Äthanol, Isopropanol oder Aceton, zur wässe rigen Lösung der Aminsalze, fällt ein Salz aus, das je nach dem pH, an dem die Ausfäl lung erfolgt, aus dem Mono- oder Diaminsalz, oder einer Mischung derselben, besteht.

Bei einem pA von etwa 4 ist das ausgefällte Salz praktisch ausschliesslich ein Monoaminsalz, während bei einem pH von mindestens etwa 9 das ausgefällte Salz zur Hauptsache ein Di- aminsalz ist. Bei dazwischenliegenden pH-Wer ten werden Mischungen der Mono- und Di- aminsalze erhalten, wobei allerdings bei pH 7 zur Hauptsache das Monoaminsalz gewonnen wird.

Unabhängig davon, ob das Mono- oder das Diaminsalz oder Mischungen derselben erhalten werden, erlaubt die fraktionierte Kristallisation die Abtrennung des entspre chenden Aminsalzes des gewünschten 5'-Iso- meren des Lactoflavin-monophosphorsä-tire- esters. Infolge ihrer Stabilität werden indessen die Monoaminsalze bevorzugt.

Gemäss einer empfehlenswerten Ausfüh- ruingsform dieses Isolierungsverfahrens für den 5'-Isomeren wird eine wässerige Lösung, die sowohl den Lactoflavin-5'-monophosphor- säureester und die andern Isomeren enthält, auf ein p,1 von mindestens etwa 4 -und mit Vorteil innerhalb eines PH-Intervalls von etwa 4-10 mittels Diäthanolamin oder Morpholin gebracht,

worauf die Lösung mit einem mit Wasser mischbaren Lösungsmittel, z. B. Ätha- nol, Isopropanol oder Aceton, fraktioniert kristallisiert wird; um die entsprechenden Salze des Lactoflavin-5'-monophosphorsäure- esters zu gewinnen. Wie oben hervorgehoben, werden entweder die Mono- oder Diaminsalze oder Mischungen derselben erhalten, je nach dem verwendeten pH.

Die Diäthanolamin- und Morpholinsalze des Laetoflavin-5'-monophosphorsäureesters können durch Behandlung mit einer geeigne ten Säure in den freien Lactoflavin-5'-mono- phosphorsäureester übergeführt werden. Dabei ist zu beachten, dass bei den Monosalzen wenig stens ein Äquivalent der Säure und bei den Disalzen wenigstens zwei Äquivalente verwen det werden.

Beispiel: 7,2 g (0,4 Mol) Wasser werden langsam, unter gutem Schütteln und unter Kühlen auf Zimmertemperatur, mit 61,3 g (0,4 Mol) Phosphorozychlorid langsam versetzt. Die Mischung wird gerührt., bis die Entwicklung von Chlorwasserstoff beendet ist, und während ungefähr 16 Stunden stehengelassen. Dann werden unter Rühren 5,1 g (0,02 Mol) 1-D-1'- Ribitylamino-3,4-dimethyl-benzol (Ribityl- Yylidin) zugegeben. Letzteres löst sich unter Entwicklung von Chlorwasserstoff auf.

Die Lösung wird während 6 Stunden bei Zimmer temperatur geschüttelt. Unter Kühlen wer den 500 cm3 wasserfreier Äther zugefügt. Ein Öl scheidet sich ab. Nach Verrühren mit fri schem Äther wird es fest. Diese Substanz wird mit 250 em3 Wasser gekocht, um Hydrolyse zum beständigen. Monophosphorsäureester zu bewirken. Die dadurch erhaltene wässerige Lösung wird im Vakuum auf ein kleines Vo lumen eingeengt, und mehrere Teile Aceton werden zugegeben. Der Monophosphorsäure ester des 1.-D-1'-Ribitvjamino-3,4-dimethyl- benzols scheidet sieh als ölige Masse ab, die beim Stehen hart wird.

Es wird abfiltriert, mit Aceton und Äther gewaschen und im Va kuum getrocknet. Die Verbindung ist sehr hygroskopisch und im Gegensatz zum Ribityl- Yylidin selbst bei Zimmertemperatur sehr was serlöslich. Bei der potentiometrischen Titra- tion mit Natriumhydroxyd zeigt sie, nach dem Zusatz von zwei Äquivalenten Alkali, ein Knie bei ungefähr pA 9.

Wird für die Herstellung des Lactoflavin- monophosphorsäureesters der Monophosphor Säureester des Ribitylxylidins verwendet, so ist es nicht notwendig, die Verbindung in fester Form zu isolieren.

Durch Wiederholen des Phosphorylierungsprozesses und Zugeben der Pliosphorylierungsreaktionslösung in mehrere Volumen Wasser (an Stelle von Äther) und Neutralisieren der erhaltenen Lösung auf un gefähr pH 3 mit Ätznatron erhält man eine wässerige Lösung der Verbindung, die sich zur Umwandlung in den Lactoflavin-mono- pliosphorsäureester eignet.

Der wässerigen Lösung des erhaltenen Monophosphorsäureesters des Ribitylxylidins wird eine gleichwertige Menge Benzoldiazo- niumchloridlösung, die durch Diazotieren von Anilin mittels Natriumnitrit in Gegenwart von Salzsäure hergestellt wurde, zugegeben. Die Temperatur wird zwischen 10 und 20 C ge halten. In ungefähr 5 Minuten scheiden sich rote Kristalle von Monophosphorsäureester des 1-D-1'-Ribitylamino-3,4-dimethyl-6-phenyl- azo-benzols ab.

Durch gelegentlichen Zusatz von Natriumacetat wird das p$ während unge fähr 6 Stunden auf ungefähr 3 gehalten. Die roten Kristalle werden abfiltriert und mit gesättigter Natriumchloridlösung gewaschen, bis sie von anorganischen Phosphaten befreit. sind; hernach werden sie mit Luft getrocknet. Diese Mischung von Natriumchlorid und von Monophosphorsäureester des 1-D-1'-Ribityl- amino-3,4-dimethyl-6-phenylazo-benzols ist ohne weitere Reinigung zur Umwandlung in den Monophosphorsäureester des Lactoflavins zu gebrauchen.

Der reine Monophosphorsäure ester des 1-D-1'-Ribitylamino-3,4-dimethyl-6- phenylazo-benzols wird durch Extraktion der Mischung mit Butylalkohol, Einengen auf ein kleines Volumen und Fällen mit Äther, erhal ten. Bei der potentiometrischen Titration mit Natriumhydroxyd zeigt die Titrationskurve des so erhaltenen Produktes ein scharfes Knie bei ungefähr PH 9, d. h. nach Zugabe von 2 11fo1 Alkali.

Eine Lösung von 0,01 Mol Mononatrium salz des Monophosphorsäureesters des 1-D-1' R-ibitylamino-3,4-dimethyl-6-phenylazo-benzols in 94 em3 Wasser wird durch Zusatz von 0,01 Mol Natriumhydroxyd zu einer wässe rigen Suspension von 0,01 Mol der freien Esternatriumchloridmischung bereitet. Dieser Lösung werden 30g Natriumchlorid zugege ben.

Das bewirkt die Abscheidimg des Mono natriumsalzes des Monophosphorsäureesters des 1-D-1'-Ribitylamino-3,4-dimethyl-6-phenyl- a.zo-benzols, das abfiltriert, mit gesättigter Na- tr iumchloridlösung gewaschen und an der Luft getrocknet wird. Das trockene Produkt wird mit 3 g Barbitursäure in einer Mischung von 62 ein- Dioxan und 12 cm3 Eisessig wäh rend 61/2 Stunden unter Rücldluss zum Sieden erhitzt.

Die Reaktionsmischung wird gekühlt und von nicht -umgesetzten Materialien ab filtriert. Das Filtrat zeigt die typische Fluo reszenz des Lactoflai-in-monophosphorsäure-, esters. Die Substanz wird durch Zusatz von Bariumchloridlösimg -und Filtration des er zielten Niederschlages des schwerlöslichen Bariumsalzes des Lactoflavin-monophosphor- säureesters isoliert. Aus diesem Salz gewinnt man den freien Ester durch Umsetzung mit Säure.

2,0 g der so erhaltenen Lactoflavin-5'- monophosphorsäureester und andere Lacto- flavin-monophosphorsäureester-isomere enthal tenden Mischling werden in 20 cm3 Wasser aufgeschlämmt und mit so viel Diäthanolamin versetzt, dass das pH auf 8,8 steigt und'Auf- lösung erfolgt. Die Lösung wird von ungelö stem Material filtriert. Durch Zusatz einer kleinen Menge Essigsäure wird das pn auf 4,8 gebracht. Man gibt 5 Volumen Äthanol zu.

Der dadurch erzeugte Niederschlag wird ab filtriert -und in 10 Teilen Wasser durch Zu satz von Diäthanolamin bei einem pH von 8,0 wiedergelöst. Die Lösung wird von ein wenig ungelöstem Material abfiltriert. Das pH wird durch Zusatz von Essigsäure auf 4,8 gebracht. Beim Versetzen mit 5 Volumen Äthanol fällt das Monodiäthanolaminsalz des Lactoflavin- monophosphorsäureesters aus. Das Produkt wird abfiltriert, mit Äthanol gewaschen und getrocknet.

Es besteht im wesentlichen aus reinem Lactoflavin-5'-monophosphorsäure- ester-monodiäthanolaminsalz. Eine Mischung der Monodiäthanolaminsalze der andern Iso- meren ist in der Mutterlauge enthalten und kann daraus durch Verdampfen im Vakuum isoliert werden.

Das Lactoflavin-5'-monophosphorsäure- ester-monodiäthanolaminsalz wird als gut was serlösliches gelbes Pulver erhalten, welches 2 Moleküle Kristallwasser enthält. Das pH seiner wässerigen Lösung ist ungefähr 4 bis 5. Die Verbindung wird beim Erhitzen dunkel und schmilzt bei 201 bis 203 C unter Zer setzung.

5 g des Monodiäthanolaminsalzes des Lactofla-%-in-monophosphorsäureesters werden in 7 5 cm3 Wasser gelöst und mit 7 cm3 kon- zentrierter Salzsäure versetzt. Lactoflav in-5'- monophosphor säureester fällt aus und wird abfiltr ier t.

Claims

PATENTANSPRUCH: Verfahren zur Herstellung des Lactofla- vin-5'-monophosphorsäiireesters, dadurch ge kennzeichnet, dass 1-D-1'-Ribitylamino-3,4-di- methyl-benzol mit.

einer Chlorphosph örsäurc phosphoryliert, das Reaktionsprodukt zum monophosphorylierten 1-D-1'-Ribitylamino-3,4- dimethyl-benzol hydrolysiert, dieses mit einem Aryl-diazoniumsalz zum phosphorylierten 1 - D -1' - Ribitylamino - 6 - arylazo-3,4-dimethyl- benzol gekuppelt,

dieses mit Barbitursäure zum phosphorylierten Lactoflavin kondensiert und aus dem erhaltenen Isomeren-Gemisch das 5'-Isomere isoliert wird.