CH299111A

CH299111A - Verfahren zur Herstellung eines Lactoflavin-monophosphorsäureesters.

Info

Publication number: CH299111A
Authority: CH
Inventors: F Hoffmann- Aktiengesellschaft
Original assignee: Hoffmann La Roche
Priority date: 1950-07-15
Filing date: 1951-06-15
Publication date: 1954-05-31

Description

Verfahren zur Herstellung eines Lactoflavin-monophosphorsäureesters. Die Erfindung betrifft ein neuartiges Ver fahren zur Herstellung eines Lactoflavin- monophosphorsäureesters und zur Isolierung des bekannten Lactoflavin-5'-monophosphor- säureesters aus den Mischungen desselben mit andern Isomeren des Lactoflavin-monophos- phorsäureesters, welche bei der Herstellung desselben entstehen.

Gegenstand des vorliegenden Patentes ist ein Verfahren zur Herstellung des Lactofla- vin-5'-monophosphorsäitreesters, dadurch ge kennzeichnet, dass ein 1-D-1'-Ribitylamino-6- arylazo-3,4-dimethyl-benzol mit einer Chlor phosphorsäure phosphoryliert, das Reaktions produkt zum monophosphorylierten 1-D-1' Ribitylamino - 6 - arylazo - 3,4 - dimethyl - Benzol hydrolisiert,

dieses mit Barbitursäure zum phosphorylierten Lactoflavin kondensiert und aus dem erhaltenen Isomeren-Gemisch das 5'-Isomere isoliert wird.

Der Ausdruck Chlorphosphorsäure , wie er hier gebraucht Wird, bezeichnet zweiVer- bindungen, d. h. Monoehlorphosphorsäureund Dichlorphosphorsäure, deren Formeln die fol genden sind: (HO)2POC1 und HOPOC12. Die Bildung dieser zwei Verbindungen- erfolgt durch Umsetzung zwischen Phosphoroxy- ehlorid und Wasser oder -zwischen Phosphor- oxychlorid und Phosphorsäure.

Die Chlorphosphorsäuren werden leicht durch Umsetzen von Phosphoroxychlorid mit 1 bis 2 Mol Wasser gewonnen. Die Reaktion nimmt folgenden Verlauf POC13 -I- 1E120 HOPOC12 -i- HCl P0013 -I- 2H20 (HO)

2POCl -I- 2 HCl Die zwei Verbindungen bilden sich auch bei der Umsetzung von Phosphoroxychiorid mit ortho-Phosphorsäure. Beispielsweise kann ein geeignetes Chlorphosphorsäure-Reagens durch langsamen Zusatz von 61,3 g (0,4 Mol) Phosphoroxyehlorid zu 19,6 g (0;2 Mol) was= serfreier ortho-Phosphorsäure, wobei gerührt und auf Raumtemperatur gekühlt werden mI.ss, erhalten werden.

Die Reaktionsmischung @v ird während 1 Stunde gerührt. Um eine möglichst hohe Ausbeute an Chlorphosphor säure zu gewinnen, lässt man das Produkt über Nacht stehen. Die Wartezeit ist jedoch nicht unerlässlieh, denn die Chlorphosphor säure bildet sich leicht und in guter Ausbeute, sobald Phosphoroxychlorid mit Wasser oder Phosphorsäure reagiert. Es versteht sich, dass die Phosphorsäure auch wässerig sein kann, in welchem Fall beide Reaktionen zur Bil dung der Chlorphosphorsäure beitragen, d. h.

eine Reaktion zwischen dem Phosphoroxy- chlorid und Wasser, und eine Reaktion zwi schen dem Phosphoroxyehlorid und der ortho- Phosphorsäure. Die Chlorphosphorsäure kann selbstverständlich auch in Gegenwart des zu phosphorylierenden Körpers gebildet werden, wobei sie dann sofort mit letzterem reagiert.

Die Produkte :der Phosphorylierung mit der Chlorphosphorsäure umfassen die mono (chlorphosphorsauren) Salze der Phosphor säureester und Chlorphosphorsäureester von 1- D -1' - R.ibitylamino - 6 - arylazo-3,4-dimethyl- benzol, Polyphosphorsäuren, chlorenthaltende Phosphorsäure und chlorenthaltende Poly phosphorsäuren. Cyclilcche Phosphorsäure ester der Zwischenprodukte können auch ge bildet werden. Der Grad der Phosphorylie- rung ist abhängig von der Zeitdauer, während der die Ausgangsverbindungen mit der Chlor phosphorsäure reagieren können.

Die hier an gegebenen Reaktionen stellen eine Synthese mit hypothetischen Zwischenprodukts-Struk- turen dar. Obwohl das vorangehende und das nachstehende Reaktionsschema auf dem grün den, was als der wahrscheinlichste Reak tionsverlauf angesehen wird, versteht es sich, dass die Erfindung keinesfalls auf irgend eine Reaktionstheorie oder Zwischenprodukts Struktur beschränkt ist.

Im Falle der Dichlorphosphorsäur e kann die Reaktion wie folgt formuliert werden:
EMI0002.0016
Das obige monochlorphosphorylierte Produkt kann weiter chlorphosphoryliert wer den, je nach Reaktionszeit wie folgt:
EMI0002.0020
Die Verbindungen (b) und (c) können wei ter phosphoryliert werden: Im Falle der Monochlorphosphorsäure sind die entsprechenden Reaktionen die folgenden:
EMI0002.0024
Nach weiterer Behandlung mit 1VIonochlorphosphorsäure ergibt sich folgendes:

EMI0002.0026
Die Verbindung (e) kann weiter phospho- ryliert werden.

In den obigen Formeln bedeutet ROH 1. - D -1' - Ribitylamino - 6 - arylazo-3,4-dimethyl- benzol.

Die Hydrolyse der Zwischenprodukte der Reaktion mit den Chlorphosphorsäuren be wirkt je nachdem zuerst die Abspaltung der salzbildenden HOPOCl2 oder (OH)2POCl, gefolgt von der Freisetzung des Monophos- phorsäureesters, welcher entsprechend als ROPO(OII)2 bezeichnet werden kann. Der Phosphorylierungsgrad ist belanglos, da das Endprodukt der Hydrolyse in jedem Falle der Monophosphorsäureester des Zwischen produktes ist.

Das Hauptprodukt ist: ein 5'-Ester, .doch besteht eine kleine Menge aus den andern Isomeren, d. h. den 2'-, 3'- und 4'-Isomeren.

Obwohl die vorgenannten Estersalze des Zwischenproduktes isoliert werden können, z. B. um sie zu reinigen, ist es nicht erfor derlich, diese Isolierung vorzunehmen, bevor man dieselben in Lactoflavin-monopbosphor- säureester umwandelt. Die durch Phospho- rylierung des Zwischenproduktes erhaltene Reaktionsmischung kann einfach in mehrere Volumen Wasser gegossen und für einige Stunden stehengelassen werden.

Während dieser Zeit hydrolysieren die restlichen nicht umgesetzten Chlorphosphorsäuren vollständig zu Phosphorsäure und Salzsäure, und die Zwischenestersalze erleiden ebenfalls eine Hydrolyse, welche zu den Monophosphor- säureestern des Zwischenproduktes führt. Die so erhaltenen Monophosphorsäureester des 1. - D -l'- Ribitylamino - 6 - arylazo-3,4-dimethyl- benzols können mit Barbitursäure zu den Laetoflavin-monophosphorsäureestern konden siert werden.

Wie oben hervorgehoben, entstehen neben dem Hauptprodukt, nämlich dem Lactoflavin- 5'-monophosphorsäureester, eine kleine Menge der Laetoflavin-2'-, -3'- oder -4'-monophosphor- säureester. Von diesen Isomeren des Lacto- flavin-monophosphorsäureesters ist allein der 5'-Isomere biologisch voll wirksam. Es ist da her wünschenswert, diese Substanz in reiner Form, frei von den andern Isomeren, zu ge winnen.

Die Eigenschaften der verschiedenen Isomeren sind allerdings so weitgehend ähn lich, dass die Abtrennung des 5'-Isomeren von den andern schwierig ist.

Es ist festgestellt worden, dass die Diätha- nolamin- und Morpholinsalze des Lactöflavin- 5'-monophosphorsäureesters in ihren Löslich keitseigenschaften so weit verschieden sind von den entsprechenden Salzen der andern Isomeren, dass die Abtrennung des gewünsch ten 5'-Isomeren in reiner Form zweckmässig über diese Aminsalze erfolgt.

Diese neuen Diäthanolaminsalze und Morpholinsalze des Lactoflavin-5'-monophosphorsäureesters sind auch an sich physiologisch wertvolle Verbin dungen, denn sie enthalten den biologisch .akti ven 5'-Isomeren in einer leicht löslichen, nicht toxischen Form, die sich für therapeutische Verwendung eignet. Diese Salze können mühe los in den freien 5'-Monophosphorsäureester durch einfaches Ansäuern ihrer wässerigen Lösung, z. B. mit einer Mineralsäure, umge= wandelt werden, wobei der 5'-Ester in reiner Form kristallisiert.

Die den Lactoflavin-5'-monophosphorsäure- ester und die andern Isomeren enthaltende Mischung wird z. B. einfach mit Diäthanol- amin oder Morpholin umgesetzt, wobei sich eine Mischung der entsprechenden Aminsalze der Isomeren des Lactoflavin-monophosphor- säureesters bildet.

Die Aminsalze des Lacto- i flavin-5'-monophosphorsäureesters werden so dann von der Mischung abgetrennt, beispiels weise durch fraktionierte Kristallisation. Letz tere kann so durchgeführt werden, dass ein mit Wasser mischbares Lösungsmittel, wie Äthanol, Isopropanol oder Aceton, einer wäs serigen Lösung der Mischung der Aminsalze der Isomeren zugesetzt wird. Die entsprechen den Aminsalze der andern Isomeren bleiben in der Mutterlauge in Lösung.

Die Diäthanol- amin- und Morpholinsalze des Lactoflavin-5'- monophosphorsäureesters werden leicht durch Behandlung mit einer geeigneten Säure in den freien Lactoflavin-5'-monophosphorsäureester umgewandelt.

s Während der Umsetzung der Mischung der Isomeren des Lactoflavin-monophosphorsäure- esters mit den vorgenannten Aminen bilden sich entweder die Mono- oder die Diaminsalze oder Mischungen derselben,

je nach Menge des verwendeten Amins. Bei der Titration mit Diäthanolamin oder Morpholin zeigt die po- tentiometrische Titrationskurve des Laeto- flavin-monophosphorsäureesters ein scharfes Knie bei ungefähr p$ 4, in dem Augenblick, wo ein -,Kol des Amins pro Mol des Lactofla- vin-monophosphorsäureesters addiert worden ist.

Wenn ein weiteres Mol Amin zugesetzt. wird, steigt das pH langsam auf etwa 7, wo ein kaum wahrnehmbares Knie in der Kurve zeigt, dass das zweite Mol Amin in dem Disalz nur sehr schwach gebunden ist. Beim Zusatz eines mit Wasser mischbaren Lösungsmittels, z.

B. Äthanol, Isopropanol oder Aceton, zur wässerigen Lösung der Aminsalze, fällt ein Salz aus, das je nach dem p$, an dem die Ausfällung erfolgt, aus dem Mono- oder Diaminsalz oder einer Mischung derselben besteht. Bei einem pg von etwa 4 ist das aus gefällte Salz praktisch ausschliesslich ein Mono aminsalz, während bei einem pg von minde stens etwa 9 das ausgefällte Salz zur Haupt sache ein Diaminsalz ist.

Bei dazwischenliegen den pH-Werten werden Mischungen der Mono- und Diaminsalze erhalten, wobei allerdings bei pH 7 zur Hauptsache das Monoaminsalz gewon nen wird.

Unabhängig davon, ob das Mono- oder Diaminsalz oder Mischungen derselben erhalten werden, erlaubt die fraktionierte Kri- stallisation die Abtrennung des entsprechenden Aminsalzes des gewünschten 5'-Isomeren des Lactoflavin-monophosphorsäureesters. Infolge ihrer Stabilität werden indessen die Mono- aminsalze bevorzugt.

Gemäss einer empfehlenswerten Ausfüh rungsform dieses Isolierungsverfahrens für den 5'-Isomeren, wird eine wässerige Lösung, die sowohl den Lactoflavin-5'-monophosphor- säureester und die andern Isomeren enthält, auf ein PH von mindestens etwa 4 und mit Vorteil innerhalb eines PH-Intervalls von etwa 4 bis 10 mittels Diäthanolamin oder Morpho- lin gebracht, worauf die Lösung -mit einem mit Wasser mischbaren Lösungsmittel, z. B.

Äthanol, Isopropanol oder Aceton, fraktioniert kristallisiert wird, um die entsprechenden Salze des Lactoflavin-5'-monophosphorsäure- esters zu gewinnen. Wie oben hervorgehoben, werden entweder die Mono- oder Diaminsalze oder Mischungen derselben erhalten, je nach dem verwendeten p$.

Die Diäthanolamin- und Morpholinsälze des Lactoflavin-5'-monophosphorsäureesters können durch Behandlung mit einer geeigne ten Säure in den freien Lactoflavin-5'-mono- phosphorsäureester übergeführt werden. Dabei ist zu beachten, dass bei den Monosalzen wenigstens ein Äquivalent der Säure und bei den Disalzen wenigstens 2 Äquivalente ver wendet werden.

Beispiel: - 14,4 g (0,8 Mol) Wasser werden langsam, Letter starkem Schütteln und Kühlen auf Raumtemperatur, zu 122,6 g (0,8 Mol) Phos- phoroxychlorid zugegeben. Die Mischung wird gerührt, bis die Entwicklung von Chlorwasser stoff beendet ist, und über Nacht stehengelas sen. Unter Rühren werden hernach 7,18 g (0,8 Mol) 1-D-1'-Ribitylamino-3,4-dimethyl- 6-phenylazo-benzol zugefügt. Letzteres löst sich unter Entwicklung von Chlorwasserstoff auf. Die Lösung wird während 6 Stunden bei Zimmertemperatur geschüttelt.

Sie wird dann langsam in 300 eins Wasser gegossen. Die Temperatur steigt auf 80-85 C und bewirkt dabei die Hydrolyse zum beständigen Mono phosphorsäureester des 1-D-1'-Ribitylamino- 3,4-dimethyl-6-phenylazo-benzols. Die Lösung wird gekühlt und auf p$ 2,5 durch vorsichtige Zugabe von Natriumhydroxyd eingestellt. Der Monophosphorsäureester des 1-D-1'-Ribityl- amino-3,4-dimethyl-6-phenylazo-benzols kri stallisiert aus.

Er wird abfiltriert und mit gesättigter Natriumchloridlösung gewaschen, bis er frei von anorganischen Phosphaten ist; dann wird er an der Luft getrocknet. Im Gegensatz zur verwandten unphosphorylierten Verbindung ist der Monophosphorsäureester in wässeriger Natriumhydroxydlösung äusserst löslich.

Eine Lösung von 0,01 Mol Mononatrium salz des Monophosphorsäureesters des 1-D-1' Ribitylamino-3,4-dimethyl-6-phenylazo-benzols in 94 eins Wasser wird durch Zusatz von 0,01. Mol Natriumhydroxyd zu einer wässeri gen Suspension von 0,01 Mol der freien Ester- natriumchloridmisehung bereitet. Dieser Lö sung werden 30g Natriumehlorid zugegeben.

Das bewirkt die Abscheidung des Mono natriumsalzes des Monophosphorsäureesters des 1-D-1'-Ribitylamino-3,4-dimethyl-6-phenyl- azo-benzols, das abfiltriert, mit gesättigter Natriumchloridlösung gewaschen und an der Luft getrocknet wird.

Das trockene Produkt wird mit 3 g Barbitursäure in einer Mischung ton 62 em3 Dioxan und 12 em3 Eisessig wäh rend 61/2 Stunden unter Rüekfluss zum Sieden erhitzt.

Die Reaktionsmischung wird gekühlt und von nicht umgesetzten Materialien abfil- triert. Das Filtrat zeigt die typische Fluores zenz des Lactoflavin-monophosphorsäitreesters. Die Substanz wird durch Zusatz von Barium chloridlösung und Filtration des erzielten Niederschlages des sehwerlöslichen Bariumsal- zes des Lactoflavin-monophosphorsäureesters isoliert. Alls diesem Salz gewinnt man den freien Ester durch Umsetzen mit Säure.

2,0 g der so erhaltenen Lactoflavin-5'-mono- phosphorsäureester und andere Lactoflavin- isomere enthaltenden Mischung werden in 20 ein- Wasser aufgeschlämmt und mit so viel Diäthanolamin versetzt, dass das pH auf 8,8 steigt und Auflösung erfolgt. Die Lösung wird von ungelöstem Material filtriert. Durch Zu satz einer kleinen Menge Essigsäure wird das pH auf 4,8 gebracht. Man gibt 5 Volumen Äthanol zu.

Der dadurch erzeugte Nieder schlag wird abfiltriert und in. 10 Teilen Was ser durch Zusatz von Diäthanolamin bei einem pH von 8,0 wieder gelöst. Die Lösung wird von ein wenig ungelöstem Material abfiltriert. Das p$ wird durch Zusatz von Essigsäure auf 4,8 gebracht. Beim Versetzen mit 5 Volumen Äthanol fällt das Monodiäthanolaminsalz des Lactoflavin-monophosphorsäureesters aus. Das Produkt wird abfiltriert, mit Äthanol gewa schen und getrocknet.

Es besteht im wesent lichen aus reinem Lactoflavin-5'-monophos- phorsäureester-monodiäthanolaminsalz. Eine Mischung der Monodiäthanolaminsalze der andern Isomeren ist in der Mutterlauge ent halten und kann daraus durch Verdampfen im Vakuum isoliert werden.

Das Lactoflavin - 5' - monophosphorsäure- ester-monodiäthanolaminsalz wird als gut was serlösliches gelbes Pulver erhalten, welches 2 Moleküle Kristallwasser enthält. Das pH seiner wässerigen Lösung ist ungefähr 4 bis 5. Die Verbindung wird beim Erhitzen dunkel und schmilzt bei 201 bis 203 C unter Zer setzung.

5 g des Monodiäthanolaminsalzes des Lacto- flavin - monophosphorsäureesters werden in 75 em3 Wasser gelöst und mit 7 eins konzen trierter Salzsäure versetzt. Lactoflavin-5'- monophosphorsäureester fällt aus und _ wird abfiltriert.

Claims

PATENTANSPRUCH: Verfahren zur Herstellung des Lactofla- vin-5'-monophosphorsäureesters, dadurch ge kennzeichnet, dass ein 1-D-1'-Ribitylamino-6- arylazo-3,4-dimethyl-benzol mit einer Chlor phosphorsäure phosphoryliert, das Reaktions produkt zum monophosphorylierten 1-D-1'- Ribitylamino - 6 - arylazo - 3,4 - dimethyl - Benzol hydrolysiert,

dieses mit Barbitursäure zum phosphorylierten Lactoflavin kondensiert und aus dem erhaltenen Isomeren-Gemisch das 5'-Isomere isoliert wird.