CH299110A

CH299110A - Verfahren zur Herstellung eines Lactoflavin-monophosphorsäureesters.

Info

Publication number: CH299110A
Authority: CH
Inventors: F Hoffmann- Aktiengesellschaft
Original assignee: Hoffmann La Roche
Priority date: 1950-07-15
Filing date: 1951-06-15
Publication date: 1954-05-31

Description

Verfahren zur Herstellung eines Lacto$avin-monophosphorsäureesters. Die Erfindung betrifft ein neuartiges Verfahren zur Herstellung eines Lactoflavin- monophosphorsäureesters und zur Isolierung des bekannten Lactoflavin-5'-monophosphor- säureesters aus den Mischungen desselben mit andern Isomeren des Lactoflavin-monophos- phorsäureesters, welche bei der Herstellung desselben entstehen.

Gegenstand des vorliegenden Patentes ist ein Verfahren zur Herstellung des Lacto- flavin - 5'- monophosphorsäureesters, dadurch gekennzeichnet, dass 1- D -1' - Ribitylamino- 3,4-dimethyl-benzol mit einer Chlorphosphor säure phosphoryliert, das Reaktionsprodukt zum monophosphorylierten 1- D -1' - Ribityl- amino-3,4-dimethyl-benzol hydrolysiert,

dieses mit einem Aryl-diazoniumsalz zum phosphory- lierten 1-D-1'-Ribitylamino-6-arylazo-3,4-dime- thyl-benzol gekuppelt und dieses zum phos- phorylierten 1-D-1'-Ribitylamino-6-amino-3,4- dimethyl-benzol reduziert,

das Reduktionspro dukt mit Alloxan ziun phosphorylierten Lacto- flavin kondensiert und aus dem erhaltenen Isomeren-Gemisch das 5'-Isomere isoliert wird.

Der Ausdruck Chloiphosphorsäure , wie er hier gebraucht wird, bezeichnet zwei Ver bindungen, bindimgen, d. h. Monochlorphosphorsäure und Dichlorphosphorsäure, deren Formeln die fol genden sind: (HO)2POC1 und HOPOC12, Die Bildung dieser zwei Verbindungen erfolgt durch Umsetzung zwischen Phosphoroxy-. Chlorid und Wasser oder zwischen Phosphor- oxychlorid und Phosphorsäure.

Die Chlorphosphorsäuren werden leicht durch Umsetzen von Phosphoroxychlorid mit 1 bis 2 Mol Wasser gewonnen. Die Reaktion nimmt folgenden Verlauf:
EMI0001.0052

POC13 <SEP> -f- <SEP> H20 <SEP> > <SEP> HOPOC12 <SEP> -!- <SEP> HCl
<tb> POC13 <SEP> -I- <SEP> 2H20 <SEP> ->- <SEP> (HO)2POC1+ <SEP> 2 <SEP> HCl Die zwei Verbindungen bilden sich auch bei der Umsetzung von Phosphoroxychlorid mit ortho-Phosphorsäure. Beispielsweise kann ein geeignetes Chlorphosphorsäure-Reagens durch langsamen Zusatz von 61,3 g (0,4 Mol) Phosphoroxychlorid zu 19,6 g (0,

2 Mol) was serfreier ortho-Phosphorsäure, wobei gerührt und auf Raumtemperatur gekühlt werden muss, erhalten werden. Die Reaktionsmischung wird während etwa 1 Stunde gerührt. Um eine möglichst hohe Ausbeute an Chlorphos phorsäure zu gewinnen, lässt man das Pro- Bukt über, Nacht stehen. Die Wartezeit ist jedoch nicht unerlässlich, denn die Chlorphos phorsäure bildet sich leicht und in guter Aus beute, sobald Phosphoroxychlorid mit Wasser oder Phosphorsäure reagiert.

Es versteht sich, dass die Phosphorsäure auch wässerig sein kann, in welchem Fall beide Reaktionen zur Bildung der Chlorphosphorsäure beitragen, d. h. eine Reaktion- zwischen dem Phosphor- oxychlorid und Wasser, und eine Reaktion zwischen dem Phosphoroxychlorid und der ortho-Phosphorsätire. Die Chlorphosphorsäure kann selbstverständlich auch in Gegenwart des zu phosphorylierenden Körpers gebildet werden, wobei sie dann sofort mit letzterem reagiert.

Die Produkte der Phosphorylierung mit der Chlorphosphorsäure umfassen die mono (chlorphosphorsauren) Salze der Phosphor säureester und Chlorpbosphorsäureester von 1-D-I'-Ribitylamino-3,4-dimethyl-benzol, Poly phosphorsäuren, chlorenthaltende Phosphor säure und chlorenthaltende Polyphosphorsäu ren. Cyclische Phosphorsäureester der Zwi- schenprodukte können auch gebildet werden.

Der Grad der Phosphorylierung ist abhängig von der Zeitdauer, während der die Aus- gangsverbindungen mit der Chlorphosphor säure reagieren können. Die hier angegebenen Reaktionen stellen eine Synthese mit hypo thetischen Zwischenprodukts-Struktur dar. Obwohl das vorangehende und das nachste hende Reaktionsschema auf dem gründen, was als der wahrscheinlichste Reaktionsverlauf angesehen wird, versteht es sich, dass die Er findung keinesfalls auf irgendeine Reaktions theorie oder Zwischenprodukts-Struktur be schränkt ist.

Im Falle der Dichlorphosphorsäure kann die Reaktion wie folgt formuliert werden:
EMI0002.0017
o Das obige monochlorphosphorylierte Produkt kann weiter chlorphosphorvliert werden, je nach Reaktionszeit wie folgt:
EMI0002.0023
Die Verbindungen (b) und (c) können weiter phosphoryliert werden.

Im Falle der 14Ionochlorphosphorsäure sind die entsprechenden Reaktionen die folgenden:
EMI0002.0028
Nach weiterer Behandlung mit Monochlorphosphorsäure ergibt sich folgendes:
EMI0002.0030
Die Verbindung (A) kann weiter phos- phoryliert werden.

In den obigen Formeln bedeutet ROH 1-D-1'-R.ibitylamino-3,4-dimethyl-benzol. Die Hydrolyse der Zwischenprodukte der Reaktion mit .den Chlorphosphorsäuren be wirkt je nachdem zuerst die Abspaltung der. salzbildenden HOPOC12 oder (HO)2POC1, gefolgt von der Freisetzung des TNIonophos- phorsäureesters, welcher entsprechend als ROPO(OH)2 bezeichnet werden kann.

Der Phosphorylierungsgrad ist belanglos, da das Endprodukt der Hydrolyse in jedem Fall der Monophosphorsäureester des Zwischen produktes ist. Das Hauptprodukt ist ein 5'-Ester, doch besteht eine kleine Menge aus den andern Isomeren, d. h. den 2'-, 3'- und 4'-Isomeren.

Obwohl die vorgenannten Estersalze des Zwischenproduktes isoliert werden können, z. B. um sie zu reinigen, ist es nicht erforder lich, diese Isolierung vorzunehmen, bevor man dieselben in Lactoflavin-monophosphorsäure- csterumwandelt. Die durch Phosphorylierung des Zwischenproduktes erhaltene Reaktions mischung kann einfach in mehrere Volumen Wasser gegossen und für einige Stunden stehengelassen werden.

Während dieser Zeit hy droly Bieren die restlichen nicht umgesetzten Chlorphosphorsäuren vollständig zu Phos phorsäure und Salzsäure, und die Zwischen- estersalze erleiden ebenfalls eine Hydrolyse, welche zu den Monophosphorsäureestern des Zwischenproduktes führt.

Die so erhaltenen Monophosphorsäureester von 1-D-1'-Ribityl- amino-3,4-dimethyl-benzol können leicht mit Aryldiazoniumsalzen zu den Monophosphor- säureestern des 1-D-1'-Ribitylamino-6-arylazo- #,4-dimethyl-benzols gekuppelt werden und diese zu den Monophosphorsäureestern des l =D-1.' -Ribitylamino-6-amino-3,4-dimethyl-ben- zols reduziert werden,

welche durch Konden sation mit Alloxan die Lactoflavin-monoplios- phorsäureester liefern.

Das Reduktionsprodukt kann auch mit Alloxan, welches in sitzt aus der alloxan- abgebenden Verbindung Alloxantin erhalten wird, kondensiert werden. Entsprechend können Mischungen von Alloxan .und Allo- xantin verwendet werden.

Wie oben hervorgehoben, entstehen neben dem Hauptprodukt, nämlich dem Lactoflavin- 5'-monophosphorsäureester, eine kleine Menge der Lactoflavin-2'-, 3'- oder 4'-monophosphor- säureester. Von diesen Isomeren des Lacto- flavin-monophosphorsäureesters ist allein der 5'-Isomere biologisch voll wirksam. Es ist da her wünschenswert, diese Substanz in reiner Form, frei von den andern Isomeren, zu ge winnen.

Die Eigenschaften der verschiedenen Isomeren .sind allerdings so weitgehend ähn lich, dass die Abtrennung des 5'-Isomeren von den andern schwierig ist.

Es ist festgestellt worden, dass die Diätha- nolamin- und Morpholinsalze des Lactoflavin- 5'-monophosphorsäureesters in ihren Löslich keitseigenschaften so weit verschieden sind von den entsprechenden Salzen der andern Isomeren, dass die Abtrennung des gewünsch ten 5'-Isomeren in reiner Förm zweckmässig über diese Aminsalze .erfolgt.

Diese neuen Diäthanolamin- und Morpholinsalze des Lacto- flavin-5'-monophosphorsäureesters sind auch an sich physiologisch wertvolle Verbindungen, denn sie enthalten den biologisch -aktiven 5'-Isomeren in einer leicht löslichen, nicht toxischen Form, die sich für therapeutische Verwendung eignet. Diese Salze können miihe- los in .den freien 5'-Monophosphorsäizreester durch einfaches Ansäuern ihrer wässerigen Lösung, z.

B. mit einer Mineralsäure, umge wandelt werden, wobei der 5'-Ester in reiner Form kristallisiert.

Die den Lactoflavin-5'-monophosphorsäure- ester und die andern Isomeren enthaltende Mischung wird z. B. einfach mit Diäthanol- amin oder Morpholin umgesetzt, wobei sich eine Mischung der entsprechenden Aminsalze der Isomeren des Lactoflavin-mönop.hosphor- säureesters bildet.

Die Aminsalze des Lacto- flavin-5'-monophosphorsäureesters werden so dann von der Mischung abgetrennt, beispiels weise durch fraktionierte Kristallisation. Letz tere kann so durchgeführt werden, dass ein mit Wasser mischbares Lösungsmittel, wie Äthanol, Isopropanol oder Aceton, einer wäs serigen Lösung der Mischung der Aniinsalze der Isomeren zugesetzt wird.

Die entsprechen- den Aminsalze der andern Isomeren bleiben in der 1VIutterlauge in Lösung. Die Diäthanol- amin- imd Morpholinsalze des Lactoflavin-5'- monophosphorsäureesters werden leicht durch Behandlung mit einer geeigneten Säure in den freien LactofIavin-5'-monophospliorsäiireester umgewandelt.

Während der Umsetzung der Mischung der Isomeren des Lactoflavin-monophosphor- wäureesters mit. den vorgenannten Aminen bilden sieh entweder .die Mono- oder Diamin- sa.lze oder Mischungen derselben,

je nach Menge des verwendeten Amins. Bei der Titration mit Diäthanolamin oder Morpholin zeigt die potentiometrische Titrationskurve des Lactoflavin-iuonophosphorsäiireesters ein scharfes Knie bei ungefähr pH 4 in dem Augenblick, wo ein Mol des Amins pro Mol des Lactoflavin-monophosphorsäureesters addiert worden ist.

Wenn ein weiteres Mol Amin. zu gesetzt wird, steigt das pH langsam auf etwa 7, wo ein kaiun wahrnehmbares Knie in der Kurve zeigt, dass das zweite 1M1 Ainin in dem Di-salz nur sehr schwach gebunden ist. Beim Zusatz eines mit Wasser mischbaren Lösungs mittels, z.

B. Äthanol,- Isopropanol oder Ace ton, zur wässerigen Lösung der Aminsalze, fällt ein Salz aus, das je nach dem p$, an dem die Ausfällung erfolgt, aus @ dem Mono- oder Diaminsalz, oder einer Mischung der selben, besteht.

Bei einem pH von etwa 4 ist das ausgefällte Salz praktisch ausschliesslich ein Monoaminsalz, während bei einem pH von mindestens etwa 9 das ausgefällte Salz zur Hauptsache ein Diaminsalz ist.

Bei dazwi schenliegenden pn-Werten werden Mischungen der Mono- und Diaminsalze erhalten, wobei allerdings bei p,1 7 zur Hauptsache das Mono aminsalz gewonnen wird. Unabhängig davon, ob das Mono- oder das Diaminsalz oder Mi- schuuigen derselben erhalten werden,

erlaubt die fraktionierte Kristallisation die Abtren nung des entsprechenden Aminsalzes des ge wünschten 5'-Isomeren des Lactoflavin-mono- phosphorsäureesters. Infolge ihrer Stabilität werden indessen die Monoaininsalze bevor zugt.

Gemäss einer empfehlenswerten Ausfüh- rungsform dieses Isolierverfahrens für den 5'-Isomeren wird eine wässerige Lösung, die sowohl den Lactoflavin-5'-monophosphorsäuire- ester und die andern Isomeren enthält, auf ein pg von mindestens etwa 4 und mit Vor teil innerhalb eines pH-Iiitervalls von etwa 4 bis 10 mittels Diäthanolamin oder Morpholin gebracht, .worauf die Lösung mit.

einem mit. Nasser mischbaren Lösungsmittel, z. B. Ätha nol, Isopropanol oder Aceton, fraktioniert kristallisiert wird, um die entsprechenden Salze des Lactoflavin-5'-monophosphorsäure- esters zu gewinnen. Wie oben hervorgehoben, werden entweder die Mono- oder Diaminsalze oder Mischungen derselben erhalten, je nach dem verwendeten pii.

Die Diäthanolamin- und Morpholinsalze des Lactoflavin - 5' - monophosphorsäureesters können durch Behandlung mit einer geeigne ten Säure in den freien Lactoflavin-5'-mono- phosphorsäureester übergeführt werden. Da bei ist zu beachten, dass bei den- Monosalzen wenigstens ein Äquivalent der Säure und bei den Disalzen wenigstens zwei Äquivalente ver wendet werden.

Beispiel: 7,2g (0,4 Mol) Wasser werden langsam, unter gutem Schütteln und unter Kühlen auf Zimmertemperatur, mit 61,3 g (0,4 Mol) Phosphoroxyehlorid langsam versetzt. Die Mi schung wird gerührt, bis die Entwicklung von Chlorwasserstoff beendet ist und während ungefähr 16 Stunden stehengelassen. Dann werden unter Rühren 5,1 g (0,02 Mol) 1-D-1'- R.ibitylamino - 3,4 - dimethy 1- Benzol (R.ibity1- xylidin) zugegeben.

Letzteres löst sich unter Entwicklung von Chlorwasserstoff auf. Die Lösung wird während 6 Stunden bei Zimmer temperatur geschüttelt. Unter Kühlen werden 500 eins wasserfreier Äther zugefügt. Ein Öl scheidet sich ab. Nach Verrühren mit. frischem ,Äther wird es fest. Diese Substanz wird niit 250 em3 Wasser gekocht, um Hydrolyse zum be ständigen lIonophosphorsäureester zu bewir- ken. Die dadurch erhaltene wässerige Lösung wird im Vakuum auf ein kleines Volumen ein geengt, und mehrere Teile Aceton werden zuge geben.

Der Monophosphorsäureester des 1-D-1'- ss,ibitylamino-3,4-dimethy 1-benzols scheidet sich als ölige Masse ab, die beim Stehen hart wird. Es wird abfiltriert, mit Aceton und Äther ge waschen und im Vakuum getrocknet. Die Ver bindung ist sehr hygroskopisch und im Gegen satz zum Ribitylxylidin selbst bei Zimmer temperatur sehr wasserlöslich.

Bei der poten- tiometrisehen Titration mit Natr iumhydroxyd zeigt sie, nach dem Zusatz von zwei Äquivalen ten Alkali, ein Knie bei ungefähr PH 9- -Wird für die Herstellung des Lactoflavin- monophosphorsäiireesters der Monophosphor säureester des Ribitylxylidins verwendet, so ist es nicht notwendig, die Verbindung in fester Form zu isolieren.

Durch Wiederholen des .Pliosphorylierungsprozesses und Zugeben der Phosphorylierungsreaktionslösung in mehrere Volumen Wasser (an Stelle von Äther) und Neutralisieren der erhaltenen Lösung auf Lin- gefä.hr PH 3 mit Ätznatron erhält man eine wässerige Lösung der Verbindung, die sich zur Umwandlung in den Lactoflavin-mono- phosphorsäureester eignet.

Der wässerigen Lösung des erhaltenen Monophosphorsäureesters des Ribitylxylidins wird eine gleichwertige Menge Benzoldiazo- niumchloridlösung, die durch Diazotieren von Anilin mittels Natriumnitrit in Gegenwart von Salzsäure hergestellt wurde, zugegeben. Die Temperatur wird zwischen 10 und 20 C ge halten. In tmgefähr 5 Minuten scheiden sich rote Kristalle von Monophosphorsäureester des 1-D-1'-Ribitylamino-3,4-dimethyl-6 - phenjazo- benzols ab.

Durch gelegentlichen Zusatz von Natriumacetat wird das pH während ungefähr 6 Stunden auf ungefähr 3 gehalten. Die roten Kristalle werden abfiltriert -und mit gesättig ter Natriumchloridlösung gewaschen, bis sie von anorganischen Phosphaten befreit sind; hernach werden sie mit Luftgetrocknet.

Diese Mischung von Natriumchlorid und von Mono phosphorsäureester des 1-D-1'-Ribitylamino- 3,4-dimethyl-6-phenylazo-benzols ist ohne wei tere Reinigung zur Umwandlung in den iVTonophosphorsäureester des Lactoflavins ztt gebrauchen. Der reine Monophosphorsäure ester des 1-D-1'-Ribitylainino-3,4-dimethyl-6- phenylazo-benzols wird durch Extraktion der Mischung mit Butylalkohol, Einengen auf ein kleines Volumen und Fällen mit Äther, erhal ten.

Bei der potentiometrischen Titration mit Natriumhydroxyd zeigt die Titrationskurve des so erhaltenen Produktes ein scharfes Knie bei ungefähr pH 9, d. h. nach Zugabe von 2 Mol. Alkali.

Ein reines Bariumsalz wird durch Sus pension der Natriumchlorid-l-D-1'-ribityl- amino-3,4- dimethyl-6-phenylazo -Benzol - mono phosphorsäureester-Mischung in Wasser, Ein stellen des pH mit Natriumhydroxyd auf 9, um die Auflösung zu bewirken, und Zugabe von Bariumchloridlösung erhalten.

Das abgeschie dene unlösliche Bariumsalz des Monophosphor- säureesters wird abfiltriert, mit Wasser chlo- ridfrei, dann mit Alkohol und Äther gewa schen und getrocknet. Die Substanz enthält 5,53 /o Phosphor.

3,0 g Bariumsalz des Monophosphorsäure- esters des 1-D-1'-Ribitylamino-3,4-dimethyl-6- phenylazo-benzols werden in 50 cm3 Wasser suspendiert. 5 cms n-Schwefelsäure werden zugegeben, um den Ester zu befreien. 1,0 g Palladiiuukohle-Katalysator werden zugesetzt und die Mischung bei 70 C unter einem Druck von 35 Atmosphären während 2 Stunden hydriert.

Der Katalysator und das Barium sulfat werden abfiltriert. Die erhaltene Lö sung ist nun praktisch farblos, was die voll ständige Reduktion des Monophosphorsäure- esters von 1-D-1'-Ribitylamino-3,4-dimethyl- 6-phenylazo-benzol anzeigt.

Die Lösung wird mit Natriumhydroxyd alkalisch gemacht und das gebildete Wasser und Anilin im Valium abdestilliert. Nach Zusatz von Alkohol zum Rückstand scheidet sich das Natriumsalz des Monophosphorsäureesters von 1-D-1'-Ribityl- amino-3,4-dimethyl-6-amino-benzols aus.

Die Suspension in Alkohol des Natriuml- salzes des Monophosphorsäilreesters des 1-D-1'- Ribitylamino -3,4-dimethyl-6 - amino - Benzols wird mit konzentrierter Salzsäure angesäuert imd unter hückfluss erhitzt. 2 g Alloxantin werden zugegeben und die Mischung unter Rückfla ss und Rühren während 5 Stunden gekocht.

Es entsteht die typische gelbe Farbe und Fluoreszenz des Lactoflavin-monophos- phorsäureesters. Die Lösung wird gekühlt, mit Wasser versetzt und nicht umgesetztes Allo- xantin durch Filtration entfernt. Der Ester wird auf Fullererde adsorbiert und gut. mit Wasser gewaschen.

Er wird mit Natriiun- hydroxyd eluiert, wobei eine von anorgani schen Phosphaten völlig freie Lösung des Na triumsalzes von Lactoflavin - monophosphor- säureester entsteht. Daraus gewinnt man den freien Ester durch Umsetzen mit Säure.

2,0 g der so erhaltenen Lactoflavin-5'- monophosphorsäureester und andere Lactofla- vin-monophosphorsäureester - isomere enthal tenden Mischung werden in 20 cm3 Wasser aufgeschlämmt und mit so viel Diäthanolamin versetzt, dass das pg auf 8,8 steigt und Auf lösung erfolgt. Die Lösung wird von unge löstem Material filtriert. Durch Zusatz einer kleinen Menge Essigsäure wird das p$ auf 4,8 gebracht. Man gibt 5 Volumen Äthanol zu.

Der dadurch erzeugte Niederschlag wird ab filtriert und in 10 Teilen Wasser durch Zu satz von Diäthanolamin bei einem pH von 8,0 wieder gelöst. Die Lösung wird von ein wenig ungelöstem Material abfiltriert. Das p$ wird durch Zusatz von Essigsäure auf 4,8 gebracht. Beim Versetzen mit 5 Volumen Äthanol fällt das Monodiäthanolaminsalz des Lactoflavin- monophosphorsäureesters aus. Das Produkt wird abfiltriert, mit Äthanol gewaschen 'und getrocknet.

Es besteht im wesentlichen aus rei nem Lactoflavin-5'-monophosphorsäureester- monodiäthanolaminsalz. Eine Mischung der Monodiäthanolaminsalze der andern Isomeren ist in der Mutterlauge enthalten und kann daraus durch Verdampfen im Vakuum iso liert werden.

Das Lactoflavin -5'- monophosphorsäure- ester-monodiäthanolaminsalz wird als gut was serlösliches gelbes Pulver erhalten, welehes 2 Moleküle Kristallwasser enthält. Das px sei ner wässerigen Lösung ist ungefähr 4 bis 5. Die Verbindung wird beim Erhitzen dunkel und schmilzt bei 201 bis 203 C unter Zer setzung.

5 g des Monodiäthanolaminsalzes des Laeto- flavin - monophosphor säureesters werden in 7 5 cm3 Wasser gelöst und mit 7 eins konzen trierter Salzsäure versetzt. Laetofla.vin-5'- monophosphorsäureester fällt aus und wird abfiltriert.

Claims

PATENTANSPRUCH: Verfahren zur Herstellung des Lactoflav in- 5'-monophosphorsäureesters, dadurch gekenn zeichnet, dass 1-D-1'-Ribitylamino-3,4-dime- thyl-benzol mit einer Chlorphosphorsäure phosphoryliert, das Reaktionsprodukt zum monophosphorylier ten 1- D -1' - Ribitylamino- 3,4-dimethyl-benzol hydrolisiert,

dieses mit einem Aryldiazoniumsalz zum phosphorylier- ten 1-D-1'-Ribitylamino-6-arylazo-3,4-dimethyl- benzol gekuppelt und dieses zum phospho- rylierten 1-D-1'-Ribitylamino-6-amino-3,4-di- methyl-benzol reduziert,

das Reduktionspro dukt mit Alloxan zum phosphorylierten Lacto- flavin kondensiert und aus dem erhaltenen Isomeren-Gemisch das 5'-Isomere isoliert wird. UNTERANSPRUCH: . Verfahren nach Patentanspruch, dadurch gekennzeichnet, dass man das Reduktionspro dukt mit Alloxan, welches in situ aus der allo- xan-abgebenden Verbindung Alloxantin er halten wird, kondensiert.