CH299101A

CH299101A - Verfahren zur Herstellung eines Lactoflavin-monophosphorsäureesters.

Info

Publication number: CH299101A
Authority: CH
Inventors: F Hoffmann- Aktiengesellschaft
Original assignee: Hoffmann La Roche
Priority date: 1950-07-15
Filing date: 1951-06-15
Publication date: 1954-05-31

Description

Verfahren zur Herstellung eines Lactoflavin-monophosphorsäureesters. Die Erfindung betrifft ein neuartiges Verfahren zur Herstellung eines Lactoflavin- nionophosphorsäureesters und zur Isolierung des bekannten Lactoflavin-5'-monophosphor- säureesters aus den Mischungen desselben mit andern Isomeren des Lactoflavin-monophos- pliorsäureesters, welche bei der Herstellung desselben entstehen.

Gegenstand des vorliegenden Patentes ist ein Verfahren zur Herstellung des Lacto- flavin-5'-monophosphorsäureesters, dadurch gekennzeichnet, dass Dihydrolactoflavin mit einer Chlorphosphorsäure phosphoryliert, das Reaktionsprodukt zum monophosphorylierten Dihydrolactoflavin hydrolysiert, dieses durch Oxydation in das phosphorylierte Lactoflavin umwandelt und aus dem erhaltenen Isomeren, Gemisch das 5'-Isomere isoliert wird.

Der Ausdruck Chlorphosphorsäure , wie er hier gebraucht wird, bezeichnet zwei Ver bindungen, das heisst Monochlorphosphor- säure und Dichlorphosphorsäure, deren Fbr- meln die folgenden sind: (HO)2POC1 und HOPOCl2. Die Bildung dieser zwei Verbin dungen erfolgt durch Umsetzung zwischen Phosphoroxyehlorid und Wasser oder zwi schen Phosphoroxychlorid und Phosphor säure.

Die Chlorphosphorsäuren werden leicht durch Umsetzen von Phosphoroxychlorid mit 1-2 Mol Wasser gewonnen. Die Reaktion nimmt folgenden Verlauf
EMI0001.0032

POCls <SEP> -I- <SEP> 1E120 <SEP> ) <SEP> F10POC1z <SEP> -I- <SEP> FICl
<tb> POCls <SEP> -I- <SEP> 2 <SEP> H20 <SEP> ---> <SEP> (HO)aPOCI <SEP> -I- <SEP> 2 <SEP> HCl Die zwei Verbindungen bilden sich auch bei der Umsetzung von Phosphoroxychlorid mit ortho-Phosphorsäure. Beispielsweise kann ein geeignetes Chlorphosphorsäure-Reagens durch langsamen Zusatz von 61,3 g (0,4 Mo1) Phosphoroxychlorid zu 19,6 g (0,2 Mol)

wasserfreier ortho-Phosphorsäure, wobei ge rührt und auf Raumtemperatur gekühlt wer den muss, erhalten werden. Die Reaktions mischung wird während etwa 1 Stunde ge rührt. Um eine möglichst hohe Ausbeute an Chlorphosphorsäure zu gewinnen, lässt man das Produkt über Nacht stehen. Die Warte- zeit ist jedoch nicht unerlässlich, denn die Chlorphosphorsäure bildet sich leicht und in guter Ausbeute, sobald Phosphoroxychlorid mit Wasser oder Phosphorsäure reagiert.

Es versteht sich, dass die Phosphorsäure auch wässerig sein kann, in welchem Fall beide Reaktionen zur Bildung der Chlorphosphor säure beitragen, .das heisst eine Reaktion zwi schen dem Phosphoroxychlorid und Wasser, und eine Reaktion zwischen dem' Phosphor- oxychlorid und der ortho-Phosphorsäure. Die Chlorphosphorsäure kann selbstverständlich auch in Gegenwart des zu phösphorylierenden Körpers gebildet werden, wobei sie dann so fort mit letzterem reagiert.

Die Produkte der Phosphorylierung mit der Chlorphosphorsäure umfassen die mono- (chlorphosphorsauren Salze und die mono- (dichlorphosphorsauren) Salze der Dihy dro- lactoflavinester . mit Phosphorsäure, Poly phosphorsäuren, chlorenthaltende Phosphor säure und chlorenthaltende Polyphosphor säuren. Cyclische Phosphorsäureester der Zwischenprodukte können auch gebildet wer den.

Der Grad der Phosphorylierung ist ab hängig von der Zeitdauer, während der die Ausgangsverbindungen mit der Chlorphos phorsäure reagieren können. Die hier ange gebenen Reaktionen stellen eine Synthese mit hypothetischen Zwischenprodukts-Strukturen dar. Obwohl das vorangehende und das nach stehende Reaktionsschema auf dem gründen, was als der wahrscheinlichste Reaktionsver- lauf angesehen wird, versteht es sich, dass die Erfindung keinesfalls auf irgendeine Reak tionstheorie oder Zwischenprodukts-Struktur beschränkt ist.

Im Falle der Dichlorphosphorsäure kann die Reaktion wie folgt formuliert werden:
EMI0002.0021
Das obige monochlorphosphorylierte Produkt kann weiter chlorphosphoryliertwerden,
EMI0002.0024

je <SEP> nach <SEP> Reaktionszeit <SEP> wie <SEP> folgt:
<tb> 0 <SEP> 0
<tb> fi <SEP> i(a) <SEP> -i- <SEP> HOPOC12 <SEP> RO-P-O-P-OH <SEP> HOPOC12 <SEP> (b)
<tb> C1 <SEP> C1
<tb> 0 <SEP> -0
<tb> und/oder <SEP> RO-P-O-P-CI <SEP> HOPOC12 <SEP> (c)
<tb> OH <SEP> Cl Die Verbindungen (b) und (c) können weiter phosphoryliert werden.

Im Falle der MonochlorphosphorsäLtre sind die entsprechenden Reaktionen die folgenden
EMI0002.0027
Nach weiterer Behandltmg mit Monochlorphosphorsäure ergibt. sich folgendes:
EMI0002.0030
Die Verbindung (e) kann weiter phosphoryliert werden. In den obigen Formeln bedeutet ROH Di- hydrolactoflavin.

Die Hydrolyse der Zwischenprodukte der Reaktion mit den Chlorphosphorsäuren be wirkt je nachdem zuerst die Abspaltung der salzbildenden HOP0C.12 oder (H0)2P0C1, gefolgt von der Freisetzung des Monophos- phorsäureesters, welcher entsprechend als ROPO(OH)2 bezeichnet werden kann. Der Phosphorylierungsgrad ist belanglos, da das Endprodukt der Hydrolyse in jedem Falle der Monophosphorsäureester des Zwischen produktes ist.

Das Hauptprodukt ist ein 5'-Ester, doch besteht eine kleine Menge aus den andern Isomeren, das heisst den 2'-, 3' und V-Isomeren. Obwohl die vorgenannten Estersalze der Zwischenprodukte isoliert werden können, z. B. um sie zu reinigen, ist es nicht erforder lich, .diese Isolierung vorzunehmen, bevor man dieselben in Lactoflavin-monophosphorsäure- ester umwandelt. Die durch Phosphorylierung erhaltene Reaktionsmischung kann einfach in mehrere Volumen Wasser gegossen und für einige Stunden stehengelassen werden.

Wäh rend dieser Zeit hydrolysieren die restlichen nicht -umgesetzten Chlorphosphorsäuren voll ständig zu Phosphorsäure und Salzsäure, und die Zwischenestersalze erleiden ebenfalls eine Hydrolyse, welche zu den Monophosphorsäure- estern des Dihydrolactoflavins führt. Die letz teren können dann leicht in Lactoflavin- monophosphorsäure überführt werden.

So kann der durch Hydrolyse, während der er sich in Lösung befindet, erhaltene Dihydro- lactoflavin-monophosphorsäureester, beispiels weise mit Wasserstoffperoxyd, zum stabilen Lactoflavin-monophosphorsäureester oxydiert werden.

Wie oben hervorgehoben, entstehen neben dem Hauptprodukt, nämlich dem Lactoflavin- 5'-monophosphorsäureester, eine kleine Menge der Lactoflavin-2'-, -3'- oder -4'-monaphos- phorsäureester. Von diesen Isomeren des Lactoflavin-monophosphorsäureesters ist allein der 5'-Isomere biologisch voll wirksam. Es ist daher wünschenswert, diese Substanz in reiner Form, frei von den andern Isomeren, zu ge winnen.

Die Eigenschaften der verschiedenen Isomeren sind allerdings so weitgehend ähn- lich,-dass die Abtrennung des 5'-Isomeren von den andern schwierig ist.

Es ist festgestellt worden, dass die Di- äthanolamin-, und Morpholinsalze des Lacto- flavin-5'-monophosphorsäureesters in ihren Löslichkeitseigenschaften so weit verschieden sind von den entsprechenden Salzen der an dern Isomeren, dass die Abtrennung des ge wünschten 5'-Isomeren in reiner Form zweck mässig über diese Aminsalze erfolgt.

Diese neuen Diäthanolamin- und Morpholinsalze des Lactoflavin-5'-monophosphorsäureesters sind auch an sich physiologisch wertvolle Verbin dungen, denn sie enthalten den biologisch aktiven 5'-Isomeren in einer leicht löslichen, nicht toxischen Form, die sich für therapeu tische Verwendung eignet. Diese Salze können mühelos in den freien 5'-Monophosphorsäure- ester durch einfaches Ansäuern ihrer wässe rigen Lösung, z. B. mit einer Mineralsäure, umgewandelt werden, wobei der 5'-Ester in reiner Form kristallisiert.

Die den Lactoflavin-5'-monophosphorsäure- ester und die andern Isomeren enthaltende Mischung wird z. B. einfach mit Diäthanol- amin oder Morpholin umgesetzt, wobei sich eine Mischung der entsprechenden Aminsälze der Isomeren des Lactoflavin-monophosphor- säureesters bildet.

Die Aminsalze des Lacto- flavin-5'-monophosphorsäureesters werden so dann von der Mischung abgetrennt, bäispiels- weise durch fraktionierte Kristallisation. Letztere kann so durchgeführt. werden, dass ein mit Wasser mischbares Lösungsmittel, wie Äthanol, Isopropanol oder Aceton, einer wässerigen Lösung der -Mischung der Amin salze der Isomeren zugesetzt wird.

Die ent sprechenden Aminsalze der andern Isonieren bleiben in der Mutterlauge in Lösung, Die abgetrennten Diäthanolamin- und Morpholin- salze des .Lactoflavin-5'-monophosphorsäure- esters werden dann leicht durch Behandlung rnit einer geeigneten Säure in den freien Laetoflavin-5'-monophosphorsäureester umge wandelt.

Während der Umsetzung der Mischung der Isomeren des Lactoflavin-monophosphor- säureesters mit den vorgenannten Aminen bilden sich entweder die Mono- oder die Di- äminsalze, oder Mischungen derselben, - je nach Menge des verwendeten Amins.

Bei der Titration mit Diäthanolamin oder Morpholin zeigt die potentiometrische Titrationskurve des Lactoflavin-monophosphorsäureesters ein scharfes Knie bei ungefähr pH 4, in dem Augenblick, wo ein Mol des Amins pro Mol des Lactoflavin-monophosphorsäureesters ad diert worden ist.

Wenn ein weiteres Mol Amin -zugesetzt wird, steigt das pH langsam auf etwa 7; wo ein kaum wahrnehmbares Knie in der Kurve zeigt, dass das zweite 1M1 Amin in dem Di-salz nur sehr schwach gebunden ist. Beim Zusatz eines mit Wasser mischbaren Lösungsmittels, z.

B. Äthanol, Isopropanol oder Aceton, zur wässerigen Lösung der Aminsalze, fällt ein Salz aus, das je nach dem pH, an dem die Ausfällung erfolgt, aus dem Mono- oder Diaminsalz, oder einer Mi schung derselben, besteht. Bei einem PH von etwa 4 ist das ausgefällte Salz praktisch aus schliesslich ein Monoaminsalz, während bei einem pH von mindestens etwa 9 das ausge fällte Salz zur Hauptsache ein Diaminsalz ist.

Bei dazwischenliegenden p11-Werten werden Mischungen der Mono- und Diaminsalze er halten, wobei allerdings bei pH 7 zur Haupt sache das Monoaminsalz gewonnen wird.

Unabhängig davon, ob das Mono- oder Di- aminsalz oder Mischungen derselben erhalten werden, erlaubt die-fraktionierte Kristallisa tion die Abtrennung des entsprechenden Aminsalzes .des gewünschten V-Isomeren des Lactoflavin-monophosphorsäureesters. Infolge ihrer Stabilität werden indessen die Mond aminsalze bevorzugt.

Gemäss einer empfehlenswerten Ausfüh rungsform dieses Isolierungsverfahrens für den 5'-Isomeren wird eine wässerige Lösung, die sowohl den Lactoflavin-5'-monopliosphor- säureester und die andern Isomeren enthält, auf ein pH von mindestens etwa 4 und mit Vorteil innerhalb eines p,1-Intervalles von etwa 4-10 mittels Diätlisnolamin oder Mor- pholin gebracht, worauf die Lösung mit einem mit Wasser mischbaren Lösungsmittel, z. ss. ;

Äthanol, Isopropanol oder Aceton, fraktio niert kristallisiert wird, um die entsprechen den Salze des Lactoflavin-5'-nioi@ophosphor- säureesters zu gewinnen.

Wie oben hervor gehoben, werden entweder die Mono- oder Di= ; aminsalze oder Mischungen derselben erhal ten, je nach dem verwendeten PH- Die Diäthanolamin- und Morpholinsalze des Lactoflavin - 5'- monophosphorsäureesters können durch Behandlung mit einer geeigne-, ten Säure in den freien Lactoflavin-5'-moiio- phosphorsäureester übergeführt werden.

Da bei ist zu beachten, dass bei den Monosalzen wenigstens ein Äquivalent der Säure und bei den Di-salzen wenigstens zwei Äquivalente , verwendet werden.

Beispiel: Zu 61,3 g (0,4 Mol) Phosphoroxychlorid werden langsam, unter gutem Schütteln und Kühlen auf Zimmertemperatur, 7,2 g (0,4 Mol) -, Wasser zugegeben. Die Mischung wird ge rührt, bis die Entwicklung von Chlorwasser stoff beendet ist, und während ungefähr 1.6 Stunden stehengelassen.

Dann werden 3,78 g Dihydrolactoflavin unter Rühren zugesetzt. Letzteres löst sich nach kurzer Zeit auf unter Entwicklung von Chlorwasserstoff. Die Lö sung wird während 5 Stunden bei Raum temperatur gerührt und hernach in 600 em3 @Vasser gegossen.

Der so erhaltenen Lösung i von Dihydrolactoflavin - monophosphorsäur e- ester wird so viel Wasserstoffperoxyd zuge geben, dass Oxydation eintritt, was ersichtlich ist am Farbwechsel auf typisch gelb und am Erscheinen der typischen Fluoreszen7 des i Lactoflavin - monophosphorsäureesters. Nach Stehen kristallisiert der Lactoflavin-mono- phosphorsäureester aus. Die Verbindung schmilzt bei ungefähr 195 C.

Deren Analyse stimmt auf die Formel C17H19N406P03H2. , Die optische Drehung einer 2 /aigen Lösung in konzentrierter Salzsäure ist. [a]181- -I-44,5 . Bei potentiometrischer Titration mit Natrium- hydroxyd zeigt die Titrationskurve nach Zu gabe von einem genauen Äquivalent Alkali , bei pH 4,5 ein wohldefiniertes Knie. Ein zweites Knie bei pH 8,5 zeigt die Kurve nach Zugabe eines zweiten Äquivalenten Alkali.

2,0 g der so erhaltenen Lactoflavin-5'- nionophosphorsäureester und andere Lacto- i'lavin-moiiophosphorsäureester-isomere enthal tenden Mischung werden in 20 cm3 Wasser aufgeschlämmt Lind mit so viel Diäthanolamin -ersetzt, dass das PH auf 8,8 steigt und Auf lösung erfolgt. Die Lösung wird von -tuigelö- stem Material filtriert. Durch Zusatz einer kleinen Menge Essigsäure wird das pn auf -1,8 gebracht. Man gibt 5 Volumen Äthanol zu.

Der dadurch erzeugte Niederschlag wird abfiltriert und in 10 Teilen Wasser durch Zusatz von Diäthanolamin bei einem pH von 8,0 wieder gelöst. Die Lösung wird von ein wenig ungelöstem Material abfiltriert. Das p$ wird durch Zusatz von Essigsäure auf 4,8 gebracht. Beim Versetzen mit 5 Volumen Äthanol fällt das Monodiäthanolaminsalz des Lactoflavin-monophosphorsäureesters aus. Das Produkt -wird abfiltriert, mit Äthanol ge waschen und getrocknet.

Es besteht im wesent lichen aus reinem Lactoflavin-5'-monophos- phorsäureester - monodiäthanolaminsalz. Eine Mischung der Monodiäthanolaminsalze der andern Isomeren ist in der Mutterlauge ent- halten und kann daraus durch Verdampfen im Vakuum isoliert werden.

Das Lactoflavin - 5' - monophosphorsäure- ester-monodiäthanolaminsalz wird als gut wasserlösliehes gelbes Pulver erhalten, wel ches 2 Moleküle Kristallwasser enthält. Das px seiner wässerigen Lösung ist ungefähr 4 bis 5.

Die Verbindung wird beim Erhitzen dunkel und schmilzt bei 201-203 C unter Zersetzung. ' 5 g des Monodiäthanolaminsalzes des Lactoflavin-monophosphorsäureesters werden in 75 cm3 Wasser gelöst und mit 7 ems kon zentrierter .Salzsäure versetzt. Lactoflavin-5'- monophosphorsäureester fällt aus und wird abfiltriert.

Claims

PATENTANSPRUCH: Verfahren zur Herstellung des Lacto- flavin - 5' - monophosphorsäureesters, dadurch gekennzeichnet, dass Dihydrolactoflavin mit einer Chlorphosphorsäure phosphoryliert, das Reaktionsprodukt zum monophosphorylierten Dihydrolactoflavin hydrolysiert,

dieses durch Oxydation in das phosphorylierte Lactoflavin umwandelt und aus dem erhaltenen Isomeren- Gemisch das 5'-Isomere isoliert wird.