CH348158A

CH348158A - Procédé pour transformer un 11-désoxy-stéroïde en 11-oxy-stéroïde correspondant

Info

Publication number: CH348158A
Authority: CH
Inventors: Israel Feldman Louis; Shardlow Allen William
Original assignee: American Cyanamid Co
Priority date: 1955-06-16
Filing date: 1956-06-15
Publication date: 1960-08-15
Also published as: BE548668A

Description


  Procédé pour     transformer    un     11-désoxy-stéroïde     en     11-oxy-stéroïde    correspondant         Récemment,    plusieurs stéroïdes     contenant        un     groupe     hydroxyle    en position 11 sont devenus des  agents thérapeutiques importants dans le traitement  des maladies.     Parmi    ces stéroïdes figure le     composé     F de Kendall.

   On a mis au point des procédés pour  préparer cette substance à partir des     11-désoxy-          stéroïdes,    mais malheureusement les intermédiaires  appropriés sont rares, et les procédés destinés à intro  duire un groupe hydroxyle en position 11 sont peu  satisfaisants pour diverses raisons.  



  Il apparaît que le procédé de la présente inven  tion représente un progrès par rapport aux procédés  antérieurs d'oxydation des stéroïdes en position 11,  parce qu'il évite des réactions secondaires et donne  des rendements élevés.  



  Le procédé suivant l'invention     pour    transformer  un     11-désoxy-stéroïde    en     11-oxy-stéroïde    correspon  dant consiste à soumettre le     11-désoxy-stéroïde    à       l'action    de     fermentation    oxydante d'un ou plusieurs  champignons du genre<I>Botrytis.</I>  



  On cultive, par exemple, dans des conditions  aérobies un champignon du genre     Botrytis    tel que le  <I>Botrytis</I>     cinerea,    le     Botrytis        peoniae    et/ou d'autres  espèces de<I>Botrytis,</I> dans un     milieu    nutritif approprié,  et on le laisse agir sur la substance S ou un ester  de celle-ci tel que l'acétate, ou un     11-désoxy-stéroïde     apparenté. Pendant la croissance de l'organisme dans  des     conditions    favorables, un groupe hydroxyle est  introduit en position 11. Le mécanisme exact de cette  oxydation est obscur, mais elle résulte d'enzymes  produits par     l'organisme    lorsqu'il se développe.

   Un  milieu nutritif approprié contient une source soluble  de carbone, de l'azote et des matières minérales pou-         vant        servir    comme sources de carbone:     l'amidon    de  maïs, la mélasse, le maltose, le dextrose, le     sucrose,     le     xylose,    le galactose, le glycérol, le     mannitol    et di  vers acides     organiques    tels que l'acide citrique,  l'acide malique, l'acide acétique et divers produits  naturels contenant des hydrates de carbone, par  exemple la liqueur de macération de maïs, la farine  de soja,

   la farine de graines de coton et beaucoup  d'autres matières     accessibles    que l'on a     utilisées    an  térieurement     comme    source de carbone dans des pro  cessus de fermentation.  



  Peuvent     servir    comme sources d'azote par exem  ple la liqueur de macération de- maïs, la farine de  soja, la     farine    de graines de coton, etc., et diverses  autres     substances    telles que l'extrait de     boeuf,    la ca  séine, la levure, les protéines digérées par     enzymes,     et les produits de dégradation tels que les peptones,  les     aminoacides    .et beaucoup d'autres matières     pro-          téiniques        accessibles    que l'on a     trouvées    appropriées  à des processus de fermentation, pour entretenir la  croissance des champignons.

   Diverses sources inor  ganiques d'azote, notamment l'urée, les sels d'am  monium, les nitrates, etc., peuvent aussi être incluses  dans     1e        milieu,    comme source d'azote     assimilable,     pour     donner    un substrat favorable au développement  de l'organisme.  



  Une grande partie des matières minérales néces  saires à la     fermentation    sont présentes déjà dans les  matières que -l'on utilise comme sources de carbone  et d'azote. Il y en a également dans l'eau     utilisée     dans le processus. Mais en général, il est à conseiller  d'ajouter en plus des substances fournissant des ions  phosphate,     sulfate,        chlorure,    sodium, potassium,           magnésium,    fer, calcium, cobalt, manganèse et divers  autres.  



  On peut ajouter le     11-désoxy-stéroïde    au     milieu     avant l'inoculation ou bien un ou deux jours après.  Pour préparer des inocula, on peut procéder de       manière    suivante<B>:</B> on prend 5 à 10     cm3    d'eau stérili  sée     dans    laquelle on met, en suspension,

   la     croissance     superficielle d'une culture     inclinée    en tube     d'agar-          agar.    La suspension résultante de spores et de mycé  lium     sert    à inoculer deux ou trois lots de 100     cm3     de     milieu    stérilisé dans des fioles     Erlenmeyer    de  500 cm,', comme indiqué dans les     exemples    ci-après.  Après     inoculation,    on fait incuber les     flacons    sur un  dispositif secoueur à mouvement alternatif à     21o    C  pendant environ 2 à 4 jours.

   Le     contenu    de 2 ou 3  de ces flacons     sert    à     inoculer    12 litres de     milieu    sté  rile dans une bouteille de 20 litres.  



  Les champignons du genre     Botrytis    croissent à  toutes températures de 5 à     30o    C et c'est     dans    cet       intervalle    de     température    qu'à lieu de préférence  l'oxydation.  



       Durant    le processus de fermentation, on peut as  surer l'aération en envoyant de l'air stérilisé à tra  vers le     milieu    à raison d'environ     1/3à    2 volumes  d'air par volume de     milieu    et par minute. On agite  en général mécaniquement pour     maintenir    en suspen  sion le mycélium et les autres matières insolubles. On  peut ajouter de temps en temps des agents     anti-          mousse    tels que la     silicone,    les huiles de glycéri  des, etc.  



  Le stéroïde à oxyder peut être ajouté au milieu  de la fermentation soit sous forme de poudre. Ainsi  on peut dissoudre le stéroïde dans du méthanol ou  dans d'autres solvants     miscibles    à l'eau et l'ajouter  au     milieu    de fermentation. Le stéroïde se disperse  dans tout le milieu sous forme de suspension fine et  devient facilement accessible à l'organisme en vue  de l'oxydation. La quantité de stéroïde ajoutée à la  fermentation peut varier considérablement, mais elle  est généralement de l'ordre de     '/1o    à 1 g par     litre    de       milieu.     



  Lorsque l'oxydation est terminée, on peut isoler  le     11-oxy-stéroïde    obtenu du     milieu    de fermentation  en ajoutant à celui-ci de l'acétone.  



  Dans les fermentations sur grande échelle, on  peut récupérer le ou les produits bruts dans la li  queur de fermentation par une simple extraction par  solvant, en utilisant un solvant approprié non mis  cible à l'eau, tel qu'un hydrocarbure inférieur chloré,  un alcool, un ester, une cétone, etc. On peut opérer  une nouvelle     purification    et on peut     séparer    les pro  duits stéroïdes d'avec les extraits par des méthodes  connues. La séparation des mélanges de stéroïdes  peut se faire en faisant usage de la chromatogra  phie.  



  On peut identifier les stéroïdes présents dans la  liqueur de     fermentation    extraite décrite ci-dessus par  chromatographie sur bande de papier de la manière  suivante: le système solvant     utilisé    est un mélange       eau-méthanol-benzène    que l'on prépare en agitant         environ        50        %        d'eau        et        50        %        de        méthanol        avec        du     benzène dans un entonnoir séparateur,

   puis en lais  sant les deux couches se séparer. On place une por  tion de la couche     inférieure    dans un plateau ouvert  sur le fond d'un grand cylindre en verre. La couche  supérieure est la phase mobile, et elle     sert    à remplir  la     cavité    en forme de caniveau à l'intérieur du cylin  dre. On prépare une solution étalon de stéroïde en  dissolvant 10 mg de chacun des stéroïdes. suivants  dans 10     cm3    de chlorure de méthylène    Substance S de Reichstein       Cortisone          Hydrocortisone          11-épi-hydrocortisone       On peut également" inclure d'autres stéroïdes dans  la solution étalon lorsque c'est nécessaire.  



  On chromatographie simultanément au moins une  solution de stéroïde chaque fois que l'on essaie une  solution inconnue. On applique exactement 0,025<I>ce</I>  de la solution étalon de stéroïde sur la bande de pa  pier, à la ligne de     départ,    à 10 cm de l'extrémité su  périeure de la bande, que l'on replie par-dessus le  bord du caniveau et que l'on plonge dans la phase  mobile contenue dans celui-ci. On développe alors la  bande pendant 2 à 4 heures à 370 C. De même, on  applique 0,1     cm3    de la solution inconnue sur une au  tre bande que l'on plie alors dans le même cani  veau et que l'on développe avec la bande étalon au  stéroïde. Le caniveau     permet    de développer de nom  breuses bandes simultanément.

   Après avoir dévelop  pé convenablement les bandes de papier, on les en  lève de l'appareil et on les sèche à l'air. Après sé  chage, on pulvérise les bandes avec une solution al  caline de bleu     tétrazolium,    qui produit de la couleur  avec les stéroïdes qui contiennent une chaîne latérale       cétole.    On aligne des bandes ayant subi le dévelop  pement coloré, avec au moins une bande   étalon      ,     et on les apprécie. On peut     identifier    les différents  stéroïdes par leurs positions sur les bandes.  



  <I>Exemple 1</I>  
EMI0002.0073     
  
     /o <SEP> en <SEP> poids
<tb>  Liqueur <SEP> de <SEP> macération <SEP> de <SEP> maïs <SEP> <B>.... <SEP> 1,25</B>
<tb>  Mannitol <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> 1,0
<tb>  (NHi)2HP04 <SEP> <B>....... <SEP> . <SEP> ------- <SEP> 1</B> <SEP> 0,2
<tb>  KH,P04 <SEP> ...'................... <SEP> 0,15
<tb>  K,HP04 <SEP> <B>...... <SEP> - <SEP> ---------- <SEP> . <SEP> . <SEP> -</B> <SEP> 0,05
<tb>  MgS01.7H.;

  ,,O <SEP> <B>...</B> <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> 0,025
<tb>  NaCl <SEP> ........................ <SEP> 0,2
<tb>  Solution <SEP> <B>de</B> <SEP> sels <SEP> Wisconsin <SEP> A-Z <SEP> . <SEP> . <SEP> 0,1
<tb>  Eau: <SEP> q. <SEP> s.
<tb>  PH <SEP> :

   <SEP> 6,5 <SEP> - <SEP> 7,0       On prend 12 litres du milieu ci-dessus contenant  3 g de substance S de Reichstein, stérilisée dans une  bouteille de 20 litres, et on les inocule avec 200     cm3     d'une     culture        mycélienne    de 3 jours de     Botrytis        cine-          rea        (culture        Lederle    No N-51).

   On conduit la fermen  tation à     28     C pendant 240 heures, et au bout de ce      temps les analyses sur bandes de papier indiquent       une        conversion        en        hydrocortisone        de        201%        environ.     



  On filtre le mélange de fermentation résultant, et  on. lave le     mycélium    avec 2 litres,     d'acétone.    On réu  nit cet extrait à la liqueur de fermentation et on     6va-          pore        l'acétone    sous pression réduite. On extrait alors  la liqueur par 4 volumes, successifs de 2 litres de  chlorure de méthylène ; on réunit les extraits et on  les lave à deux reprises avec une solution saline sa  turée. Après séchage sur du sulfate de sodium anhy  dre, on évapore l'extrait sous pression réduite, et on  obtient 4 g d'un résidu huileux.  



  On dissout alors le     désidu    dans une     portion;    de la       phase        solvant        du        système:        acétate        d'éthyle,        4%        en     poids ; éther de pétrole (point d'ébullition. 90 - 1000,  2     %        en        poids;        méthanol,    3     %        en        poids;        eau,    2     0/0     en poids ;

   et on place sur une colonne formée de  220g de terre d'infusoires et     110g    de la phase  aqueuse du système ci-dessus. On réunit les fractions       éluées    contenant le stéroïde et on évapore jusqu'à  siccité sous pression réduite.

   La     cristallisation    du  résidu par le mélange acétone-éther de pétrole  (60 -     70 )    donne des, cristaux fondant à     213-216o        C,     [a =     1Û    =     -I-        1621)        (éthanol)    spectre ultraviolet       ?,    éthanol     max.    = 240 - 241     [,    (e 16 300). Le spectre  d'absorption d'infrarouge est identique à celui d'un  échantillon authentique de     A-1-prégnène-11P,    17a,     21-          triol-3,20-dion.e    (hydrocortisone).

      <I>Exemple 2</I>    On prend 100     cm-1    de milieu tel que décrit     ci-          dessus    à l'exemple 1, dans un flacon     Erlenmeyer    de  500 c<I>e</I>, et on inocule avec 1     cm3    d'une suspension  de spores de<I>Botrytis</I>     cinerea    (culture     Lederle          N,>N-51,

      sur agar-agar     TSA    (l'agar-agar     TSA    est for  mé     de        3%        de        bouillon        de        soja        trypticase        (Laboratoire          Biologique        de        Baltimore),    5     %        de        glycérine,        0,

  3        0/0          d'extrait        de        boeuf        et        1,5        %        d'agar-agar).        Au        bout        de     58 heures d'agitation à 280 C, on utilise 1     cm3    de  cet     inoculum    pour inoculer des tubes:

   de     secoueuse     de 100     cm3    contenant 10     cm3    de milieu stérile     comme     dans l'exemple 1, et 2 mg de     substance    S de Reich  stein. On fait incuber un tube pendant 96 heures,  et au bout de ce temps les chromatographies sur  papier indiquent la présence d'environ 1 mg     d'hydro-          cortisone        (rendement        50        %).     



  <I>Exemple 3</I>  
EMI0003.0096     
  
    1% <SEP> en <SEP> poids
<tb>  Cérélose <SEP> <B>............ <SEP> - <SEP> .........</B> <SEP> 1,0
<tb>  Extrait <SEP> de <SEP> levure <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> 0,1
<tb>  NaCl <SEP> <B>................. <SEP> - <SEP> ... <SEP> ....</B> <SEP> 0,25
<tb>  Extrait <SEP> de <SEP> boeuf <SEP> .... <SEP> .. <SEP> . <SEP> .. <SEP> .. <SEP> . <SEP> <B>...</B> <SEP> 0,4
<tb>  Peptone <SEP> .................... <SEP> 0,4
<tb>  Eau:

   <SEP> q. <SEP> s.
<tb>  pfl <SEP> ajusté <SEP> à <SEP> 7 <SEP> par <SEP> NaOH       On met 12 litres du milieu ci-dessus dans une  bouteille de 20 litres équipée d'un agitateur et d'un  aérateur et on inocule avec     300cm3    d'une culturemy-         célienne    de 3 jours de<I>Botrytis</I>     cinerea        (cultureEderle     No N-51-61). On conduit la     fermentation    à 210 C.  On ajoute dans la bouteille 3 g de substance S de  Reichstein avant de passer à l'autoclave.  



  La fermentation est suivie périodiquement par un  titrage sur bande de papier, et on récolte la     bouteille     au bout de 72 heures, lorsque le titrage montre une  conversion pratiquement complète de la substance S  de Reichstein.  



  Après un traitement comme celui-ci décrit à  l'exemple 1, on obtient 7,92 g d'un résidu     gommeux.     On     fractionne    ce résidu sur de la terre d'infusoires       en        utilisant        le        système    :

       acétate        d'éthyle    3     %        en          poids;        éther        de        pétrole    2     %        en        poids;        méthanol     3     %        en        poids    ;

       eau    2     %        en        poids        pour        donner        2,2        g     d'un     solide    cristallin. Quand on chromatographie à  nouveau ce solide sur le même système de fraction  nement, on sépare le stéroïde désiré, soit 1,043 g,  fondant entre 200 et 216,50 C (rendement 33,3 0/0).  La     cristallisation    par le mélange     acétone-éther    de  pétrole donne le composé F pur, point de     fusion     217 - 2180 C. Le spectre infrarouge est identique à  celui d'un échantillon authentique.

      <I>Exemple 4</I>    Dans une autre expérience dans des conditions  comparables à celles de l'exemple 2, en utilisant le  milieu de l'exemple 3, on remplace la substance S de  Reichstein par l'acétate de la substance de Reich  stein, et on obtient un rendement similaire en hydro  cortisone, comme l'indique l'analyse     chromatogra-          phique.    On utilise le<I>Botrytis</I>     cinerea    (culture     Le-          derle    N  N-51-61) comme microorganisme et on       conduit    la fermentation à 210 C.

      <I>Exemple 5</I>  Dans une autre expérience dans des conditions  similaires à celles utilisées dans l'exemple 4, la  <I>Botrytis</I>     cinerea,    la<I>Botrytis</I>     peoniae    et trois autres  espèces de Botrytis convertissent la     substance    S de  Reichstein en hydrocortisone, comme le montre  l'analyse     chromatographique.

Claims

REVENDICATION Procédé pour transformer un 11-désoxy-stéroïde, en 11-oxy-stéroïde correspondant, caractérisé en ce qu'on soumet le 11-désoxy-stéroïde à l'action de fer mentation oxydante d'un ou plusieurs champignons du genre Botrytis. SOUS-REVENDICATIONS 1. Procédé suivant la revendication, caractérisé en ce que le 11-désoxy-stéroïde traité est la substance S de Reichstein ou un de ses esters. 2.

Procédé suivant la revendication et la sous- revendication 1, caractérisé en ce qu'on inocule àvec un champignon de l'espèce Botrytis cinerea un mi lieu nutritif contenant du carbone assimilable, de l'azote, des sels minéraux, et le 11-désoxy-stéroïde. 3. Procédé suivant la revendication et les sous revendications 1 et 2, caractérisé en ce qu'on em ploie le Botrytis cinerea ou le Botrytis peoniae. 4.

Procédé selon la revendication et les sous revendications 1 à 3, caractérisé en ce qu'on con duit la fermentation oxydante entre 5 et 300 C, de préférence vers<B>200-C.</B> 5. Procédé suivant la revendication et les sous- revendications 1 à 4, caractérisé en ce qu'on intro- duit le 11-désoxy-stéroïde sous forme de poudre ou sous forme d'une solution dans un solvant organique miscible à l'eau. 6.

Procédé suivant la revendication et legs sous- revendications 1 à 5, caractérisé en ce qu'on ajoute 0,1 à 1 g de 11 désoxy-stéroïde par litre de milieu de fermentation.