Verfahren zur HersteHung von Estern eines neuen Wirkstoffes aus Nebennieren Es ist kürzlich über die Isolierung und teinda,rstellung einer biologisch hochwirksa- T jnen Verbindung aus Nebennieren berichtet-.
worden (Experientia <B>-</B> Vol. IX/9, <B>1953 --</B> Seite<B>333).</B> Die Konstitution dieses Wirkstoff ies wurde erst päter '[E.xpeiientia <B>10, 132</B> (1954)] aufgeklärt, wobei sich herausstellte, dass es sieh -um ein Steroid mit einer Aldehyd-. gruppe in 18-Stellung handelte, weswegen die <B>Z-,</B> Verbindung auch Aldosteron getauft wurde.
Die Konstitution des Aldosterons wird durch die beiden folgenden, miteinander offenbar im Gleichgewicht stehenden Formeln wieder gegeben, wobei bei den meisten Umsetzungen die Halbacetalforin reagiert:
EMI0001.0020
Gegenstand dex vorliegenden Erfindung ist nun die Herstellung von Estern des neuen WUrkstoffes, wobei die Oxygruppen vollstän dig oder teilweise verestert sein können.
Die Säurereste können solche beliebiger organi- seher und anorganischer Säuren sein, wie ali- phatischer, alieyelischer, araliphatiseher, aro- matiseher oder heteroeyeliseher Carbon-, Thion- earbon-, Thiolearbon- oder Sulfonsäuren, vor- zugsw-eise der Ameisensätire, Essigsäure,
Chloressigsäuren, Trifluoressigsäure, Propion- slure, Buttersäuren, Valeriansäuren, Tri- methylessigsäure, Diäthylessigsäure, Capron- säLiren, Oenanthsäuren, Caprylsä-Liren, Pal- mitinsäuren, Crotonsäare, Undecansäure, Un- cleeylensä-Lire,
Oxalsäure, Bernsteinsäure, Pi- melinsäure, Maleinsäure, Milchsäure, Carb- aminsäuren, Alkoxycarbonsä-Liren, fl-Cyclopen- tylpropionsäure, Benzoesäure, Phenylessig- säure, Phenylpropionsäuren, Trimethylgallus- säLtre, Phthalsäure, Furaii-2-earbonsä-Lire,
Iso- nicotinsäure, 3/Iethans-Lilfonsä-Lire, Toluolsulion- säure, Schwefelsäuren oder Phosphorsäuren.
Die Veresterung kann in an sich bekann ter Weise erfolgen. Als Veresterungsmittel .dienen. zum Beispiel die vorstehend genann- ten Säuren als solche oder ihre Halogenide, Anhydride oder Thiolderivate sowie Ketone; auch Umesterung kommt in Betracht.
Je nach den angewendeten Mitteln arbeitet man in Gegenwart von sauren oder basisehen Kon- densationsmitteln bzw. Katalysatoren, bei spielsweise Sulfonsäuren, Mineralsäuren, wie ChlorwasserstoffsiLuren oder Schwefelsä-Liren, oder organischen Basen, insbesondere tertiären Aminen.
Durch geeignete Wahl der Reaktions bedingungen und Menge der Mittel gelingt es, die vorhandenen Oxygrupen vollständig oder auch nur partiell zu verestern. Falls man par tielle Ester herstellen will, so kann man auch zuerst vollständig verestern und nachträglich einen Teil der veresterten Oxyor-Lippe wieder in freie Oxygi-appen überführen.
Dies erfolgt zum Beispiel durch chemische oder enzyma tische Hydrolyse, beispielsweise unter Ver- wendLing saurer oder basischer Mittel, oder, insbesondere im Falle araliphatischer Säure reste, auch durch HyArierung. Aus den auf diese Weise oder auch direkt erhaltenen, nur partiell veresterten Derivaten lassen sich durch anschliessende Veresterung mehrfach veresterte Derivate, insbesondere auch ge mischte Ester, -herstellen.
Die Verfahrensprodukte stellen für die Therapie mit Nebennierenrindenhormonen einen grossen Fortschritt dar und können als Heilmittel Verwendung finden oder als Zwi schenprodukte ni deren Herstellung dienen.
In den nachstehenden Beispielen sind die Temperaturen in Celsiusgraden angegeben. <I>Beispiel<B>1</B></I> 20 mg Aldosteron werden in<B>0,3</B> CM3 trok- kenem Pyridin gelöst, bei<B>00</B> mit 200 mg Acet- anhydrid versetzt und 2 Tage bei 2511 stehen- -gelassen. Dann wird in reinem Älther gelöst, mehrmals mit<B>je 1,5</B> ems kalter, verdünnter Salzsäure, Wasser,
Natriumbicarbonatlös-ung und Wasser gewaschen, über Natriumsulfate getrocknet und im Vaku-Lun eingedampft. Den Rückstand<B>(23</B> mg) ehromatographiert man all 1,2<B>g</B> Aluminiumoxyd der Aktivität II. Die ersten Eluate mit Benzol-Petroläther <B>(1 : 1)</B> werden verworfen, die letzten<B>-</B> sowie diej eni- geil mit Benzol enthalten das Polyacetat des Wirkstoffes, das daraus in Form eines farb losen Glases gewonnen wird.
Die nach der Hydroxamat-Methode <B>[A.</B> Zaffaroni, Recent Progress in Hormone Researchsscl. <B>8, S. 78 ff.</B> (1953)] durchgeführte Acyloxybestimmung weist, -unter der Voraussetzung eines ungefäh ren Molekulargewichtes von 430, auf das Vor liegen von 2 Acetoxygruppen hin.
Das in Schwefelkohlenstoff aufgenommene IMpektrum der Verbindung zeigt im Dop- pelbindungsbereieli bei<B>5,67 y, 5,75</B> /,t, <B>5,93</B> it und 6,17,u sowie im Fingersprintbereich u. a. bei<B>9,36</B> u,<B>9,52</B> u,<B>9,98</B> u,<B>10,23 g,</B> 10,41 <B>10,55</B> #t, <B>11,08</B> y und<B>11,58</B> it ausgeprägte Ban den, hingegen keine solchen mehr im Ily- droxylbereich.
Zur Reinigung des beschriebenen Acetates kann statt der Chroma-tographie an Alumi niumoxyd auch eine Verteilungsehromatogra- phie an Kieselgur verwendet werden. Dabei benützt man als stationäre Phase Wasser- Methanol <B>(1 : 1)</B> und als mobile Phase Ben- zol-Petrolät.her (2:<B>3).</B>
Zu derselben Verbindung gelangt man auch, wenn man den neuen Wirkstoff statt mit Acetanhydrid mit Acetylehlorid oder mit Keten acetyliert, oder wenn man eines der in den Beispielen 2 und 4 beschriebenen partiel len Acetate unter den angegebenen Bedingun gen nachaeetyliert.
Analog lässt sich zum Beispiel auch das entsprechende Polyisobutyrat oder Poly-ben- zoat des neuen Wirkstoffes herstellen. <I>Beispiel 2</I> 20 mg Aldosteron werden in wenig Aee- toll gelöst, mit etwas abs. Benzol versetzt und durch Abdampfen im Vakuum bei<B>500</B> gut getrocknet.
De r Rückstand wird in<B>0,15</B> em3 trockenem Pyridin gelöst, mit<B>10</B> mg Acet- anhydrid vermischt und<B>7</B> Stunden bei 2011 stehengelassen. Dann wird im Vakuum bei <B>500</B> eingedampft, der Rückstand in<B>5</B> em3 Chloroforni-Ätlier-Gemisch <B>(1 - 3)</B> gelöst und bei<B>00</B> mehrmals mit<B>je 1</B> ems 0,5-n. Salzsäure, Sodalösung und Wasser gewaschen.
Die Waschflüssigkeiten passieren jeweils einen zweiten Scheidetrichter mit<B>3</B> em3 Chloroform- Äther, wo sie nochmals geschüttelt werden. Die vereinigten Auszüge werden über wenig Natriumsulfat getrocknet und bei<B>501></B> einge dampft. Der Rüekstand (etwa<B>22,5</B> mg) wird mit<B>0,1</B> erns Aceton lind<B>1</B> em3 Äther versetzt und bei 011 kristallisiert.
Man erhält farblose, zu kugeligen Drusen vereinigte Kristalle vom <B>F. =</B> 190-192o, die alkalische Silberdiainin- lösung bei 200 rasch und stark reduzieren.
Mit Hilfe der Hydroxamat-Methode lässt sich in dieser Verbindung eine Acetoxygruppe nachweisen.
Das in Chloroform aufgenommene IR- Spektrum zeigt charakteristische Banden u.a. bei<B>2,78</B> (freie Hydroxylgruppe!), bei<B>5,72 '</B> /i, <B>5,82</B> ji, 5,97,u und 6,16,a im Doppelbindungs- bereich und bei<B>8,83 y,</B> 9,41,u,<B>9,66</B> p-, 10,00,u, 10,18,u, 10,41<B>p, 11,15</B> u und 11,55,a im Fin- gersprintbereieli.
Aus den Mutterlaugen der reinen Kristalle lässt sieh durch Chromatographie an Alumi niumoxyd oder Magnesiumsilikat oder durch Verteilungsehromatographie neben wenig Poly acetat des -Wirkstoffes noch etwas der reinen, partiell acetylierten Verbindung gewinnen.
An Alumini-Limoxyd -wird das Polyacetat mit reinem Benzol und Benzol-Äther <B>(1 . 1)</B> eluiert. Das partielle Acetylierungsprodukt folgt mit reinem Äther sowie mit Äther-Essinsäure- äthylester oder Äther-Methanol.
In analoger Weise können auch die mit Propionsäure, Trimethylessigsäure, #Cyclopen- tylpropionsäure, Phenylessigsäure oder Ben- zoesäure partiell veresterten Verbindungen er halten werden.
<I>Beispiel<B>3</B></I> <B>10</B> mg der im Beispiel 2 beschriebenen par- tiel acetylierten Verbindung vom F.<B>= 190</B> bis <B>1920</B> werden in<B>50</B> mg trockenem Pyridin ge löst und mit<B>6</B> mg Benzoylchlorid in wenig Ohloroforin bei<B>00</B> versetzt.
Nach 12stündigem Stehen bei 2411 arbeitet man wie im Beispiel<B>1</B> beschrieben auf -und reinigt das rohe Acetat- Benzoat durch Chromatograpliie an Alumi niumoxyd unter Verwendung von Petroläther, ZD Benzol -und Äther als Elutionsmittel,
Das mit Petrolätlier-Benzol-Gemisch el-nierte amorphe Acetat-Benzoat gibt bei der Bestimmung der cl Acylgruppen nach der Hydroxamat-Methode einen auf ein Menoaectat-Monobenzoat gut stimmenden Wert.
In analoger Weise lassen sich auch das Acotat-Valerat und das Acetat-Trimethylace- tat gewinnen.
<I>Beispiel 4</I> <B>10</B> mg Aldosteron werden wie in Beispiel<B>1</B> angegeben acetyliert und a-Lifgearbeitet. Zur partiellen Verseifung lässt man das amorphe Rohprodukt mehrere Tage in einem feuchten Lösungsmittel, wie wasserhaltigem Äther oder Aceton, stehen und engt dann im Vakuum ein.
Der Rückstand wird einer Verteilungs- ehromatographie an Kieselgur unterzogen un ter Verwendung von Benzol-Petroläther (2:<B>3)</B> als mobile Phase und Methanol-Wasser <B>(1 -</B> l# als stationäre Phase.
Hierbei erhält man ein amorplies O'xy-acetat. Die nach der Hy- droxamat-Methode bestimmte Anzahl der Acetoxygruppen ergab, berechnet für ein Mo- Jekulargewicht <B>388,5,</B> einen auf. -ein Monoace-. tat gut stimmenden Wert.
Im IR-Spektrum in Chloroformlösung treten -unter anderem die für die Hydroxylgrupp# und die für die Acetoxygruppe (im Doppelbindungsbereic11,1) typischeu Banden auf.
Die partielle Verseilung des Polyacetates und anderer, auch gemischter Polyester, kann auch mit Kaliumbiearbonat in wässerig-metha- nolischem -T#Iediuni unter milden Bedingungen durchgeführt werden, ferner mittels enzyma tischer Methoden.
In analoger Weise werden zum Beispiel das Oxy-propionat -und das Oxy-beDzoat des neuen 'Wirkstoffes gewonnen.
Die beschriebenen partiellen und Polyace tate sowie der.freieWirkstoff selbst geben bei ein- bis zweistündigern Kochen mit 10/eiger methanoliseher oder wässeriger Salzsäure oder durch ein- bis zweitägiges Stehenlassen bei 200 ein Gemisch von Verbindungen, aus dem sieh mittels Aceton-Äther farblose Nadeln vom <I>F.</I><B>=</B> 218-9-240 kristallisieren lassen.
Sie sind im Vakuum von<B>0,05</B> mm bei etwa 16011 unzer- setzt sublimierbar, <I>Beispiel<B>5</B></I> <B>5</B> mg des im Beispiel 4 beschriebenen par tiellen Acetates des neuen Wirkstoffes wer den in<B>25</B> mg trockenem Pyridin gelöst, bei 01' mit<B>2,8</B> mg Trimethylessigsäure#chlorid in wenig Chloroform versetzt und 24 Stunden bei<B>250</B> stehengelassen. Nach der üblichen Anfarbeitung und Chromatographie, wie sie in Beispiel<B>1</B> beschrieben ist,
erhält man das gemischte Trimethylacetat-acetat. Die Acyl- gruppen-Bestimmung nach der Hydroxamat- 'Wetliode spricht für das Vorliegen eines sol- eben Diesters.
In analoger Weise lassen sich züm Beispiel auch das Valerat, Benzoat '. Oenanthat, Unde-- cylenat oder Cyclopentylpropionat des im Bei spiel 4 beschriebenen Oxy-aeetates herstellen.
Das Aldosteron lässt sich beispielsweise wie folgt gewinnen.- 500 <B>kg</B> frische oder tiefgekühlte Rinder- Nebennieren werden nach<B>-</B>einem der bekann ten Verfahren, vorzugsweise nach Cartland und Kuizenga <B>[J.</B> Biol. Chem. <B>116, 57 (1936) ]</B> extraliiert. Je nach der -Qualität der Drüsen erhält man so<B>100-500 g</B> Rohextrakt, der so dann durch Verteilung zwischen wässerigem Alkohol, z.
B. 301/oigem Methanol, und Petrol- äther gründlich entlettet wird. Die wässerige Phase extrahiert man nach Entfernen des<B>Al-</B> kohols (alle Operationen erfolgen bei einer Temperatur von weniger als 501') viermal mit dem. gleichen VolLimen eines Gemisches von Äther-Chloroform (2<B>: 1</B> oder<B>3 : 1;</B> die Lö- sangsmittel müssen vorher gründlich gereinigt würden).
Die vereinigten Äther-Chloroform- Lös-Lmgen werden als solche oder nach Wa- sehen mit verdünnter Salzsäure und Hydro- gen-carbonat-Lösung und Trocknen über Na triumsulfat im Vakutun eingedampft. Man er hält auf diese Art<B>23-30 g</B> gereinigten Ex trakt.
Der genannte Extrakt wird auf einer gro ssen Säule einer Verteilungschromatographie unterworfen, wobei als stationäre Phase die 100-200fache Menge Kieselg-Lir#-#Vasser im Gewichtsverhältnis<B>1 : 1</B> und als mobile Phase Petroläther, Benzol und Chloroform dienen. Die Laufgeschwindigkeit der Eliaate soll etwa <B>90-100</B> em3 pro Stunde betragen, das Volu men jeder Fraktion 1000-1200 cm,.
Die durch Eindampfen im Vakaum gewonnenen Rückstände der einzelnen Fraktionen, aus denen zum Teil einige der bekannten Cortico- steroide bereits kristallisiert anfallen, werden papierehromatogra.phiseh analysiert. Die neue Verbindung lässt sich dabei zum Beispiel mit Hilfe der R.r-Werte, der UV-Absorption und des Reduktiansvermögens gegen Silberdiamiii- Lösung in solchen Fraktionen lokalisieren, welche durch Eluation mit Benzol-Petroläther <B>7: 3</B> bis<B>9: 1</B> erhalten -werden.
Die betreffen den Fraktionen (300-400 mg) werden hier auf vereinigt und an einer zweiten Säule aus gereinigtem Cell-Lilosepulver durch Verteilung zwischen 601/eigem wässerigem Methanol und Petrolät,her-Toluol-Gemisch (1:2 bis<B>1:3)</B> aufgetrennt. Das Gewichtsverhältnis von Sub stanz zu Cellulose beträgt dabei etwa<B>1 : 100</B> und dasjenige von stationärer Phase zu Cel- lulose <B>1 :</B> 2. Zum Durchlauf einer einzelnen Fraktion (40 ems) benötigt man etwa<B>5</B> Stun den.
Die: durch Eindampfen erhaltenen Frak tionen werden wiederum papierehromatogra- phisch analysiert. Aus den ausgewählten und vereinigten Fraktionen lässt sieh das Aldoste- ron nun mittels Aceton-Äther, vorteilhaft in Gegenwart von wenig Wasser, kristallisieren.
Durch Umkristallisieren gewinnt man farblose Kristalle des Elektrocortins in Form des Hy- drates vom doppelten Schmelzpunkt 104 bis 112 und 153-15811, die sich als einheitlich er weisen Lind eine hohe biologische Wirksamkeit auf den Mineralstoffwechsel besitzen.
Die C,11.-Bestimmung des im Hoehvakuum bei<B>501></B> getrockneten Präparates lieferte die folgen den Werte: Kohlenstoff<B>69,68</B> '/o, Wasserstoff 8,39 %; berechnet für C#>,I-I2805: Kohlenstoff 69,971/9, Wasserstoff<B>7,83</B> %. Die übrigen Ei genschaften der getrockneten Verbindung wei chen nicht wesentlich von denjenigen des Hy- drates ab.