Verfahren zur Herstellung von 11-Oxy-steroiden Die Erfindung bezieht sich auf ein Ver fahren zur Herstellung von 11-Oxy-steroiden durch Oxydation von Steroiden, die in 11-Stel- lung eine Methylengruppe enthalten.
Dieses Verfahren besteht darin, dass man diese Steroide einer biochemischen Oxydation unter aeroben Bedingungen mittels Enzymen unterwirft, die von Pilzarten der Ordnung Mucorales erzeugt werden. Hierbei können die Ausgangssteroide der Einwirkung eines lebenden Stammes solcher Pilzarten oder der Einwirkung oxydierender Enzyme, welche aus diesen Pilzarten erhalten werden können, unterworfen werden.
Es ist bereits bekannt, Sauerstoff in die 11-Stellung eines Steroides einzuführen, jedoch wurde dies nur durch technisch hoch entwickelte organische Synthesen mit vielen Zwischenstufen erreicht. Demzufolge war die Gesamtausbeute von in der 11-Stellung oxy dierten Steroiden viel zu klein und die Un kosten einer solchen Erzeugung waren ausser ordentlich gross, wenn nicht vollkommen un tragbar.
Dies stellte ein unüberwindliches Hindernis für die Bestrebung der pharma zeutischen Chemiker dar, gewisse in der 11- Stellung oxydierte Steroide einem grösseren Kreis von Personen, welche an bestimmten Krankheiten leiden, zur Verfügung zu stellen, da diese Krankheiten nur von gewissen, in der 11-Stellung oxydierten Steroiden günstig beeinflusst werden können, deren hohe Her- stellungskosten jedoch und die unzulängliche Versorgung des Marktes eine allgemeine Ver breitung dieser Heilmittel verhinderten.
Unter den Medikamenten, welche aus in der 11-Stel- lung oxydierten Steroiden bestehen, seinen Corticosteron, 11-Dehydro-corticosteron, 11 Dehydro-17-Oxy-corticosteron (Compound E, Cortison) und 17-Oxy-corticosteron (Com- pound F) erwähnt.
Es ist daher von grösster Wichtigkeit, eine zufriedenstellendere Methode zu finden, um Steroide herzustellen, welche in der 11-Stellung eine Hydroxyl-(Oxy-)gruppe (-OH) enthalten, wie sie in vielen wert vollen Steroiden vorkommt und ausserdem leicht durch bekannte Oxydationsverfahren in eine Ketogruppe umwandelbar ist. Bisher konnte diesbezüglich trotz grösstem Aufwand an Mitteln und Zeit kein nennenswerter Er folg verzeichnet werden.
Die Erfindung ermöglicht nun auch die Herstellung solcher Steroide, welche zumin dest in der 11-Stellung des Steroidringsystems eine Hydroxylgruppe enthalten, in guter Aus beute. Die Oxydation der Steroide zumindest in der 11-Stellung kann vor allem durch Pilze der Familie Mucoraceae, welche der Ordnung Mucorales angehört, insbesondere der Gat tung Rhizopus oder durch sie erzeugte oxy dierende Enzyme stattfinden.
Ausserdem er möglicht das erfindungsgemässe Verfahren, Verbindungen herzustellen, welche durch kein anderes Verfahren erzeugt werden können und daher von sehr grossem Wert für die Her stellung von in 11-Stellung oxydierte Steroide enthaltenden Heilmitteln sind.
Es -wurde festgestellt, dass die genannten Ausgangssteroide, welche das Cyclopentano- poly hy drophenanthren-Ringsystem enthalten, insbesondere 10,13 - Dimethyl - cyclopentano- polyhydrophenanthren, leicht und mit hoher Ausbeute in die entsprechenden 11-Oxy- Steroide umgewandelt werden können, indem das Steroid der Einwirkung eines Pilzes der Ordnung Mucorales,
oder der von diesen Pil zen inner- oder ausserzellular gebildeten oxy dierenden Enzymen unterworfen wird. Dieses Verfahren bietet eine wirksame, wirtschaft- liehe und kommerziell zufriedenstellende Mög lichkeit zur Einführung der OH-Gruppe in die 11-Stellung eines Steroids der genannten Art.
Dadurch ist eine neue und einfache Her- stellungsmöglichkeit von in 11-Stellung eine Hydroxylgruppe enthaltenden Steroidheil- mitteln gegeben, welche, wie bereits erwähnt, für die Chemie, Pharmazie und Medizin, ins besondere für solche Patienten, die an physio logischen Veränderungen leiden, welche aus- sehliesslich durch derartige Heilmittel günstig beeinflusst werden können, von grösster Wich tigkeit ist.
In vereinzelten Fällen können auch andere Stellungen des Steroidmoleküls durch die Ein- wirkLing der Pilze oder deren Enzyme Ver änderungen erfahren, jedoch sind solche Um Wandlungen nicht immer als unerwünscht zu betrachten, da die Einführung von Sauer stoff in andere Stellungen des Steroidmoleküls wertvolle therapeutische Stoffe oder Zwischen produkte ergeben kann, z. B. solche, welche eine Hydroxylgruppe in 17-Stellung besitzen.
Im Falle, dass die Einführung solcher zusätz licher Gruppen nicht erwünscht ist, können dieselben nach bekannten Methoden leicht wieder entfernt werden. Hydroxylgruppen, welche im Steroidmolekül, das in der 11-Stel- lung oxydiert werden soll, schon vorhanden sind, können, im Falle, dass es wünschenswert ist, ausserordentlich hohe Ausbeuten von in der 11-Stellung oxydierten Steroiden anzu streben, durch Umwandlungen, wie, z.
B. mit- tels Verestern, Veräthern, Halogenierung oder dergleichen vor den verschiedenen Einwirkun gen, inbegriffen die Wirlulng der oxydieren den Pilze oder deren oxydierende Enzyme, geschützt werden, wobei die erhaltenen Grup pen sich in Hydroxylgruppen zurückverwan deln lassen müssen. Eine solche Vorbehand- lung ist aber nicht Vorbedingung, um Sauer stoff in die 11-Stellung von Steroiden mittels des erfindungsgemässen Verfahrens einführen zu können.
Die Steroide, auf welche das erfindungs gemässe Verfahren anwendbar ist, werden durch die Art oder Anzahl der in ihrem Mole kül anwesenden Substituenten nicht einge schränkt. Für die Herstellung von 11-Oxy- Steroiden ist die Anwendbarkeit der Steroide lediglich durch das Vorhandensein einer Me- thylengruppe in 11-Stellung bestimmt.
Der Grundkörper kann Substituenten oder Kom binationen von Substituenten in der 1-, 2-, 3-, 4-, 5-, 6-, 7-, 8-, 9-, 10-, 11-, 12-, 13-, 14-, 15-, 16- und 17-Stellung haben, insbesondere 7.0,13-Dimethylgruppen, 3,7- oder 12-Keto-, Hydroxyl- oder Acyloxygriippen. Es können Seitenketten in 17-Stellung vorhanden sein, wovon die Progesteron- und Corticosteron- (Ketol-)Seitenketten besonders erwähnt wer den sollen.
In der 17-Stellung kann auch eine Ketogruppe vorhanden sein, oder es kann sich eine Hydroxylgruppe oder dergl. dort befin den. Ausserdem können Doppelbindungen an der 4-, 5-, 6-, 7-, 8-, 16(17)- und andern Stel lungen (ausser den 9(11)- und 11(12)-Stellun- gen) sowie Kombinationen von Doppelbindun gen im Ringsystem vorkommen. Auch Doppel bindungen, welche durch Anlagerung von Halogenen oder Halogenwasserstoffen abge- sättigt wurden, können vorhanden sein.
Ebenso können Additionsprodukte von dienophilen Verbindungen, wie etwa Maleinsäure, Malein- säureanhydrid oder Maleinsäureester mit Steroiden, welche eine konjugierte Doppelbin dung, z. B. an 5,7-Stellungen, besitzen, gebil det werden. Das Ringsystem kann auch andere Substituenten oder Kombinationen von Sub- stituenten mit Doppelbindungen usw. enthal ten, welche zu zahlreich sind, um gesondert erwähnt werden zu können und wovon viele bereits in der Steroidchemie bekannt sind.
Als Vertreter der Steroide, welche mittels dieses Verfahrens oxydiert werden können, seien z. B. folgende genannt: Progesteron, 17-Oxy-progesteron, Pregnenolon, Acyloxy- pregnenolone wie etwa Pregnenolonacetat, 1.1-Desoxy-corticosteron, 11- Desoxy-17 - oxy- corticosteron und Acyloxyderivate davon, wie etwa Acetoxyderivate, 21-Oxy-pregnenolon und 21-Acyl-, z.
B. Acylester davon 17,21- Dioxy-pregnenolon und dessen 17,21-Diacyl- oxyderivate, z. B. das Diaeetoxyderivat, Androstendion, Androstan-17-ol, 5-Androsten- 3-ol-17-on und - 3-Acyl-, z.
B. Acetylester davon, 5-Androsten-3-ol-17-on und 3-Acyl-, Acetylester davon; Ergosterin, Stigmasterin, Stigmastanol und 3-Acy 1-, z.
B: 3-Acetylester davon; Ergostenon, Stigmastenon, Stigmasta- non, Cholestenon, Cholsäure, Desoxychol- säure, Lithocholsäure, Cholansäure, Noreholan- säure, Bisnorcholansäure, Cholensäure, Nor- eholensäure,
Bisnorcholensäure und die 3-Oxy-, 3-Keto-, 3,7-Dioxy-, 3,7-Diketo-, 3,7,12-Trioxy-, 3,7,12-Triketo-Verbindungen, Ester, Thiolester und andere Derivate der vorher erwähnten Säuren und dergleichen.
Unter den zahlreichen Familien der Ord nung Mucorales, wie sie in dem Werk Mor- phology and Taxonomy of Fungi von Bessy, erschienen bei The Blachiston Company in Philadelphia im Jänner 1952 im 7.
Kapitel beschrieben ist, können die Gattungen der Familie Mucoraceae für die biochemische Oxydation am besten verwendet werden und von diesen wieder können die Rhizopus- und Mucorgattungen am besten gebraucht werden. Von den Arten dieser Gattungen seien z. B.
folgende erwähnt: die Rhizopusarten micro- sporus, circinans, oligosporus, arrhizus, cohnii, cryzae und nigricans, und synonyme Arten, welche mit den genannten Arten trotz anderer Benennung tatsächlich identisch sind und die typischen Mucorarten mucedo, griseocyanus, hiemalis,
hiemalis var. albus, rouxi, adven- titius, christianiensis, circinelloides, dubius, genevensis, javanicus, microsporus, parasiticus und dgl.
Während Arten der -Gattungen aus den Familien der Ordnung der Mikroorga nismen, welche alle zusammen nach dem ge nannten Werk als Mucorales bezeichnet wer den und insbesondere jene der Familie Muco- raceae als oxydierende Pilze im allgemeinen wirksam sind, können aus wirtschaftlichen und Produktivitätsgründen Arten der Gat tungen Rhizopus bevorzugt werden und von dieser Gattung kann die Art arrhizus, auf welche später des öfteren unter der Bezeich nung RI3-176 Bezug genommen werden wird, gewählt werden,
-um bei der Erzeugung von 1l.-Oxy-steroiden optimale Ausbeuten zu erhal ten, obwohl in manchen Fällen, unter beson deren Umständen, . andere Gattungen und andere Arten in vorteilhafter Weise benützt werden können. Arten der erwähnten Gattun gen sind besonders reichhaltig an oxydieren den Enzymen, wodurch sie bei entsprechender Zucht in der Lage sein können, die genannten Ausgangssteroide in der 11-Stellung in einem industriell in Frage kommenden Massstab zu oxydieren.
Trotzdem Arten gewisser Gattungen, der Rhzopusgattung insbesondere und der Mucor- gattung, welche beide der Familie 1VIucoraceae angehören, in den meisten Fällen für die Barzeugung im grossen von 11-Oxy-steroiden vorgezogen würden und Während wirtschaft liche Beweggründe sogar die praktischen Ver fahren auf die Anwendung gewisser Arten und Stämme, welche besonders physiologische Eigenschaften besitzen, einschränken können,
können andere Familien und Gattungen der Ordnung Mucorales ebenfalls zur Umwand lung von Steroiden der genannten Art in die entsprechenden 11-Oxy-steroide in einem in dustriell bedeutsamen Ausmass verwendet wer den.
Beispielsweise seien andere Gattungen der Familie Mucoraceae und ihnen angehörige Arten aus dem Buch von I3. Zycha Krypto- gamenflora der Mark Brandenburg , Band VIa, 1-264 (1934), zusammengestellt:
Parasitella (P. simplex), Zygorhynchus (Z. heterogamus), Circinella (C. spinosa), Actinomucor (A. repens), Pirella (P. circinans), Absidia (A. reflexa), Spinellus (S.
Sphaeresporus), Phycomyoes (Ph. Blakeslecanus), Sporodinia (Sp. grandis), Pilaira (P. anomala), Pilobolus (P. crystalliniis), Dicoccum (D. asperum).
Andere Familien der Ordnung Mucorales samt ihren Gattungen und sie vertretende Arten sind: Thamnidieae Thamnidium (Th. elegans), Dieranophora (D. fulva), Chaetostylum (C. Fresenii), Heliostylum (H. piriforme), Chaetocladium (Ch. Brefeldii); Choanephoreae:
Blakesleea (B. trispora), Choanephora (Ch. cucurbitarum), Rhopalomyces (Rh. elegäns), Cunninghamella (C. elegans), Thamnocephalis (Th. qLladritpedata); Cephalideae:
Piptocephalis (P. presenians), Syneephalis (S. reflexa), Spinalis (Sp. radians), Syncephalastrum (S. racemosLim), Dispira (D. cornuta), Coemansia (C. pectinata), Kickxella (K. alabastrina) ;
Mortierelleae Mortierella (M. pusilla), Haplosporangium (H. bisporale), Dissophora (D. decumbens);
Endogonaceae Endogone (E. reniformis), Seleroeystis (S. coromiodes), Glaziella (C. vesiculosa). 6 Unter den Arten der R.hizopusgattungen, welche wie erwähnt im erfindungsgemässen Verfahren bevorzugt angewendet werden kön nen, sind nach H. Zycha, Krypt. der Mark Brandenburg , Band VIa, 110-120 (1935) viele allgemein bekannte Arten synonym.
So ist Rhizopus microsporus auch unter Namen wie Rh. ininimus, Mucor speciosus, Rh. specio- sus und Rh. equinus bekannt;
Rhizopus circi- nans ist auch bekannt als Rh. reflextis; Rhizo- pus oligosporus ist auch bekannt als Rh. Dela- inar oder Rh. Tamari; Rhizopus arrhizus ist bekannt als Rh. nodosus, Rh. racemoses, Rh.
maydis, Miicor arrhizus, Mucor norvegicus, Rh. pusilltis, Rh. bovigus, Rh. Cambodja, Rh.
chinensis und Rh. tritici; Rhizopus Cohnii ist bekannt auch als Rh. suinus; Rhizopus Oryzae ist auch bekannt als Rh. japonicus oder Rh. toniknensis; Rzizopus nigricans ist auch be kannt als Mucor stolonifer, Rh. niger, Rh.
artocarpi, Mucor niger, Rh. nigricans var. minor oder Rh. nigricans var. luxurians; und Rhizopus echinatus wird als selbständige Art bezweifelt und dürfte mit Rhizoptis nigricans synonym sein.
Die Pilzorganismen können von bekannten Quellen, wie etwa von den Northern Regional Research Laboratories, Peoria, Illinois, oder American Type Culture Collection, Washing ton, D. C., oder Centraalbureau voor Schimmel- cultur Baarn, Holland, bezogen werden. An dernfalls können auch natürliche, dem Mikro biologen bekannte Quellen verwendet werden.
Die Isolierung der Pilze von natürlichen Quellen kann nach dein Mikrobiologen be kannten Verfahren erfolgen. Sterile Nähr böden können aus verschiedenen Kohlehydra ten und Stickstoff enthaltenden Stoffen her gestellt lind mit 20/e Agar zu einem Gel ver festigt werden. Der Stickstoff kann verschie densten Ursprunges sein und kann z. B. aus organischen Nitraten, Amnioniumsalzen oder Proteinauszügen stammen. Die Nährböden können durch Dampfdruck oder im Auto klaven in mit Wattebausehen verschlossenen Kolben oder Reagenzgläseim sterilisiert wer den, um dann unter sterilen Bedingungen in Petrischalen umgefüllt z11 werden.
Diese kön nen entweder mit durch Pilze infizierten Steroidlösungen geimpft oder Staub bzw. offener Luft ausgesetzt werden. Auf diesen Platten entwickeln sich Pilze, unter welchen Kolonien von Mucorales, besonders die Mucor- aceae-Arten Mucor und Rhizopus, leicht durch einen geschulten Mikrobiologen erkannt werden können. Aus den Kolonien können die Organismen ausgesucht und entweder auf einen gleichen Nährboden in Reagenzgläsern oder auf irgendeinem andern, dem Wachstum der Pilze zuträglichen Nährboden übertragen werden.
Kräftige Lüftung wirkt unabhängig von der Nährbodenart fördernd auf ein starkes Wachstum der Organismen. Mit der Orga- nismenkultur, welche aus Sammlungen bezo gen oder natürlichen Ursprunges sein kann, kann nun ein das Wachstum der Pilze för dernder bakteriologischer Nährboden beschickt werden.
Für diesen Zweck kann der Nähr boden von Peterson und Murray mit gutem Erfolg verwendet werden und im folgenden, in den Aufstellungen lind Beispielen wird, wenn nicht anders erwähnt, stets der Nähr boden von Peterson und Murray Anwendung finden. Ein solcher Nährboden enthält z. B.
auf einen Liter Leitungswasser, das dazu dient, um Spuren von Elementen und anorga nischen Salzen zu liefern, folgende Zusätze:- 5 5 ems 112aisquellwasser, 20 g im Handel erhält- lichen.Laetalbuminauszug Lind 50 mg im Han del erhältliche Dextrose. Der pH--#Vert dieses Nährbodens oder anderer, welche Verwendung finden können, kann gewöhnlich vor dem Ein impfen der Pilzorganismen auf ungefähr 5;5 bis 5,9 gestellt werden.
Erhitzen unter Druck von etwa 0,7 kg/em2 während 30 Minuten kann eine Erniedrigung des pi-I-Wertes von ungefähr 6,5 auf ungefähr 5,5 bis 5,9 bewir ken und diese Verminderung des pH-Wertes muss bei der Einstellung des PH-Wertes des Nährbodens vor der Erhitzung berVieksiehtigt werden, um nach Beendigung dieser Mass nahme optimale 1\rachstumsbedingungen zu erhalten. Nach 24 Stunden Pilzwachstum auf dem Nährboden kann man feststellen, dass der j)ri-'v#Tert des Nährbodens stark gesunken ist, gewöhnlich auf ungefähr 3,5 bis 4,2.
Vorzugs weise in diesem Wachstumsstadium der Pilze kann das zu oxydierende Steroid hinzugegeben, oder die Pilzfermentationsflüssigkeit, welche zur fermentativen Oxydation der Steroide be nützt wird, von den Pilzkulturen getrennt werden. Das Impfen des das Pilzwachstum erhal tenden Nährbodens mit ausgewählten Pilzen der Mucoralesordnungkann in irgendeiner entsprechenden, in der Mikrobiologie üblichen Weise erfolgen. Zum Beispiel kann das Imp fen in geeigneter Weise mit Sporen der Orga nismen erfolgen, jedoch wäre ein Impfen, bei welchem vegetatives Myzelium verwendet wird, ebenfalls erfolgreich.
Das Wachstum der Pilze kann Letter Aufrechterhaltung einer Incubationstemperatur, welche der Zimmer temperatur; z. B. 20 bis 25 C entspricht, gut gefördert werden, jedoch wäre auch ein rela tiv grosses Temperaturintervall möglich. Zum Beispiel wurden Temperaturen von ungefähr 1.5 C bis ungefähr 45 C für die Zucht der Pilzorganismen als zufriedenstellend befun den.
Die Zeitdauer des Pilzwachstums, welche notwendig ist, bevor das zu oxydierende Steroid der Pilzeinwirkung oder der Einwir kung der Pilzenzyme ausgesetzt wird, scheint nicht entscheidend zu sein. Beispielsweise kann das in der 11-Stellung zu oxydierende Steroid entweder gleichzeitig mit dem Impfen des Nährbodens mit ausgewählten Mucorales- arten oder zu irgendeiner Zeit, z. B. 24 Stun den später, zugeführt werden.
Bei der Aus übung des- Verfahrens wurde gefunden, dass das zu oxydierende Steroid ohne nachteilige Wirkung auf das erhaltene Ergebnis, sogar 5 Tage nach dem Impfen des Nährbodens mit ausgewählten Mucoralesarten zu den Pilzkul turen in der Nährbodenlösung hinzugefügt werden kann. Nach einer bevorzugten Arbeits weise kann man die Zugabe des Ausgangs- steroides zur Fermentationsflüssigkeit nach einer 16-24stündigen Zeitdauer des Pilz wachstums tätigen, da in diesem Stadium des Pilzwachstums die Enzymbildung voll ent wickelt zu sein scheint.
Auch im Falle, dass die Oxydation nur mittels der das oxydierende Enzym enthaltenden Fermentationsflüssigkeit vorgenommen werden soll, muss mindestens dieses Wachstumsstadium erreicht sein, ehe die Fermentationsflüssigkeit wie üblich und vor teilhaft abgetrennt wird. Die Art der Zugabe der zu oxydierenden Steroide zu den oxydierenden Pilzen, zum Pilznährboden oder zur Fermentationsflüssig- keit scheint nicht entscheidend zu sein.
Die Zugabe kann in irgendeiner entsprechenden Weise stattfinden, die einen innigen Kontakt der Steroide mit den Pilzen und/oder den Enzymen der Pilze herstellt, wie etwa durch Züchten der Pilzorganismen in Gegenwart von fein zerkleinerten Steroidkristallen, durch Dispergierung der Steroide in der ganzen Nährbodenflüssigkeit oder in sonst ähnlicher Weise. Zu diesem Zweck können oberflächen aktive Mittel, Dispersionsmittel oder Auf- sehwemmungsmittel, wie etwa käuflich erhält liche Mittel, wie z.
B. die Markenprodid"te Span , Tween , Aerozol , Nacconol oder dergleichen verwendet werden. Das Steroid kann jedoch vorzugsweise in der Form einer mit Wasser mischbaren organischen Lösung, wie etwa in Form einer Lösung in Aceton, Alkohol oder sogar einer Ätherlösung, welche sieh in Wasser nur wenig löst, den Pilzen, dem Nährboden oder der Fermentationsflüs- sigkeit hinzugefügt und sodann die Nähr bodenlösung mit dem Steroid gut durchmischt werden,
so dass sich eine Suspension oder Dispersion feiner Steroidteilchen bildet und eine sehr grosse Berührungsfläche des zu oxy dierenden Steroides mit den oxydierenden Pilzen oder deren Enzymen hergestellt wird. Es können entweder Submers- oder Ober flächenkulturmethoden gut verwendet wer den, Submerskulturen werden jedoch vorgezo gen. Für die Oxydation des Steroides bedarf es jedenfalls aerober Bedingungen.
Man kann auch die Fermentationsflüssigkeit einer Pilz zucht absondern, dem Steroid oder dessen Lösung beimischen und die Mischung aeroben Bedingungen unterwerfen, um die Oxydation der Steroide durchzuführen.
Die Temperatur, welche während der oxy dierenden Einwirkung der Pilze auf die Steroide eingehalten wird, braucht nicht not wendigerweise eine andere, als während der Zeit, wo die Steroide noch nicht zugemischt waren, zu sein. Sie soll sich lediglich inner halb solcher Grenzen bewegen, in welcher das Leben oder ein aktives Wachstum der Pilz organismen aufrechterhalten bleibt. Die Incu- bationstemperatur während der oxydierenden Einwirkung der Pilze auf die Steroide kann demzufolge z. B. zwischen ungefähr 15 C und ungefähr 45 C betragen, wobei Zimmertem peratur, z. B. 20 bis 25 C, wegen der hierbei auftretenden optimalen Wirkung der Pilz organismen oder deren Enzyme den Vorzug geniesst.
Die Pilzorganismen können vorzugsweise unter aeroben Bedingungen gezüchtet werden, wobei die Wachstumsstärke sich als von der Belüftungsstärke abhängig ergibt. Trotzdem jede Art einer aeroben Zucht zufriedenstel- lend ist, kann gewöhnlich eine starke Belüf tung, wie etwa durch Rühren und loder Durch blasen von Luft durch die Nährflüssigkeit vorgenommen werden, um maximales Pilz wachstum zu erlangen, wobei offenbar die Zeit, welche zur Bildung der 11-Oxy-steroide notwendig ist, vermindert wird.
Der Umwand lungsgrad des Ausgangssteroides in das ent sprechende 11-Oxy-steroid ergibt sieh somit als abhängig entweder von der Belüftungsstärke oder vom Ausmass des Pilzwachstums zur Zeit, wo das Steroid zugegeben wird, da festge stellt wurde, dass Umwandlungen, welche ent weder die Pilzkulturen oder die Fermenta- tionsflüssigkeit allein verwenden, schneller vor sich gehen, wenn die Belüftungsstärke grösser ist und auch dann, wenn der Pilz vor dem Zusatz des zu oxydierenden Steroides sich 16 bis 24 Stunden entwickeln konnte.
Dies deutet darauf hin, dass das oxydierende Enzymsystem nach 16- bis 24stündigem Wachstum. vollentwickelt ist und dass eine Belüftung entweder die Umwandlung bzw. die Umwandlungsgesehwindigkeit durch Ver grösserung der Wachstumsgeschwindigkeit der Pilzorganismen mit entsprechend besserer Entwicklung des oxydierenden Enzymsystems erhöht, oder dass die Belüftung lediglich durch Vergrösserung der Sauerstoffzufuhr die Oxy dation fördert.
Die vorhergehenden theore tischen Auslegungen sind nur als Erläuterun gen aufzufassen, ohne eine Einschränkung des Erfindungsgegenstandes zu beinhalten, da die Oberflächenkulturmethode ohne Rühren oder andere Belüftungsarten allein verwendbar ist und ausserdem das Steorid der mit dem Impfen mit Pilzorga nismen zugegeben werden kann, ohne die-Ver- wendbarkeit der Methode zu beeinträchtigen.
Wichtig ist nur, dass die biochemisehe Oxyda tion des Steroids unter aeroben Bedingungen stattfindet.
Die Zeit, welche zur Biooxydation des Steroids durch die oxydierenden Pilzorga nismen oder deren oxydierende Enzyme not wendig ist, kann nicht genau angegeben wer den, da verschiedene Umstände in Betracht gezogen werden müssen. Ungefähr 1 bis 72 Stunden wurden als hinreichend befunden, um durch Einwirkung von oxydierenden Pilzen oder deren oxydierenden Enzymen auf ein Steroid der genannten Art dasselbe in das entsprechende 11-Oxy-steroid umzuwandeln.
Es bestehen jedoch Anzeichen dafür, dass die Oxydation des Steroides im wesentlichen sofort nach der Zugabe desselben zur Fermen tationsflüssigkeit eines vollentwickelten oxy dierenden Pilzes oder dessen oxydierender Enzyme beginnt, wobei eine Pilzzucht nach 4- bis 24stündigem Wachstum als voll ent wickelt bezeichnet wird, was in gewissem' Masse auch von der Belüftungsstärke abhängt.
Wenn das Steroid zum Nährboden gleichzeitig mit dem Impfen mit den Pilzorganismen zu gegeben wird, ist zwecks hohen Umsetzungs-- grades der Ausgangssteroide eine längere Fer- mentationsdauer angezeigt, wobei, wie schon früher erwähnt, anzunehmen ist, däss dieser Umstand der Tatsache zuzuschreiben ist, dass das oxydierende Enzymsystem der Pilze erst nach einer gewissen Dauer des Pilzwachstums vollentwickelt ist.
Dementsprechend _werden, falls das Steroid gleichzeitig mit dem Impfen dem Nährboden zugegeben wird, gewöhnlich Fermentationszeiten von 8 bis 72 Stunden eingehalten, wobei die Länge der Fermenta- tionsdauer umgekehrt proportional der Be lüftungsstärke ist. Anderseits, falls das Steroid den Pilzen, dem Nährböden oder den Enzymen der Pilze in der Fermentationsflüssigkeit nach längerem Wachstum der Pilzorganismen, z. B.
nach 16 bis 24 Stunden ohne wesentliche Be lüftung oder nach 2 bis 4 Stunden bei starker Belüftung zugegeben wird, beginnt die Um wandlung des Ausgangssteroids in das ent sprechende 11-Oxy-steroid sofort, und im Laufe von 1 bis 72 Stunden oder je nach der Belüftungsstärke, sogar in kürzeren oder län geren Zeiten, werden hohe Ausbeuten erzielt. Es sei erwähnt, dass bei längerer Einwirkungs dauer der oxydierenden Pilze oder von deren Enzymen auf die Ausgangssteroide eine er höhte Umwandlung in mehrfach oxydierte Abkömmlinge stattfinden kann, dass das Steroid in der 11-Stellung jedoch auf jeden Fall oxydiert wird.
Nach der Vollendung der oxydierenden Fermentationsreaktion kann das gebildete 1.1.-Oxy-steroid vom Fermentationsreaktions- gemisch in irgendeiner zweekentsprechenden Weise abgetrennt werden.
Eine besonders vor teilhafte Art, die oxydierten Steroide abzu trennen, kann darin bestehen, das Gemisch der Fermentationsreaktion zu extrahieren, insbesondere die Fermentationsflüssigkeit und die 1Vlyzelien in den Fällen, wo das Steroid direkt zur Pilzkultur hinzugefügt würde, und zwar mittels mit Wasser nicht mischbaren organischen Lösungsmitteln, wie etwa halo- genierten Kohlenwasserstoffen, z. B. Methylen- chlorid, Äthylenchlorid oder Chloroform, ver schiedenen Ätherarten und dergleichen.
Die Extrakte können dann, nachdem sie zuerst mit N atriumbikarbonat und nachher mit destilliertem Wasser gewaschen worden sind, vereint werden, und zusammen durch einen Luftstrom, im Vakuum, oder auf eine ähn- liehe Weise getrocknet werden, um dann zwecks Auskristallisierung die festen Rück stände in etwas frischem organischem Lösungs mittel, z. B. iii Methylenchlorid oder andern, schon vorher erwähnten Lösungsmitteln, auf zunehmen. Eine zusätzliche Umkristallisierung kann, wenn erwünscht, aus organischen Lö sungsmitteln, z. B.
Methanol, stattfinden. Die kristalline Substanz kann mittels bekannter Methoden, wie etwa durch Elementaranalyse; durch den Schmelzpunkt, ein Infrarot- und Ultraviolettabsorptionsspektrum, - durch ein Röntgenbeugungsdiägramm, eine Mikrover brennung und andere Methoden identifiziert werden. Man kann auch das kristalline Mate rial oder Extrakte nicht kristallinen Materials, welche durch die Biooxydation hergestellt wurden, mittels der Papierchromatogramm- Methode nach Zaffaroni identifizieren.
Ein besonders brauchbares Verfahren zur Trennung von nach dem erfindungsgemässen Verfahren hergestellten Oxydationsprodukten ist die Chromatographie der Extrakte oder festen Substanzen anhand einer aus Alumi niumoxyd (A1203) oder andern Substanzen bestehenden Adsorptionssäule, wobei z. B. Benzol als Lösungsmittel verwendet wird und verschiedene Lösungsmittel oder Mischungen davon zum Entwickeln des Chromatogramm.es dienen, wie aus den Chromatogrammen der Beispiele zu ersehen ist.
Die festen Substan zen werden durch Verdampfung der Extrak tionsflüssigkeit erhalten und können noch umkristallisiert werden. Diese Methode ist zur Identifizierung der durch die Oxydation ge bildeten Stoffe besonders geeignet, da, wenn erwünscht, jede Fraktion der Säule nach der Methode nach Zaffaroni geprüft werden kann.
Durch ein Papierchromatogramm nach Zaffa- roni können so kleine Mengen wie zehn bis vierzig y der Substanz geprüft, die chemischen Stoffe identifiziert und Fraktionen, die die gleichen chemischen Stoffe enthalten, vereint und die Verbindung aus den vereinten Frak tionen kristallisiert werden.
Die Methode von Zaffaroni, soweit sie in der Beschreibung erwähnt wird, ist eine ver hältnismässig neue, jedoch schon gut einge führte Methode zur Identifizierung gewisser organischer Stoffe, nämlich der den Neben- nierenrindenhormonen verwandten Verbin dungen, wobei diese analytische Methode zum Teil auf der Polarität der zu prüfenden Stoffe fusst. Die Literaturangaben zu dieser Arbeits methode sind folgende:
Burton, Zaffaroni und Keutmann, A New Analytical Method for Adrenal Cortical Hormones , Seience 110, 442 (1949);
und Zaffaroni, Burtön und Keut- mann, Seience 111,<B>6</B> (1950). An, diesen Stel- len können Einzelheiten über diese Methode nachgelesen werden.
Die folgenden Beispiele sollen lediglich als Erläuterungen gewertet werden.
<I>Beispiel 1</I> Oxydation von Progesteron Zu 4 Liter einer 32 bis 48 Stunden alten Zucht der Pilzkultur RII-1.76 wurde 1 g Progesteron, gelöst in 50 eins Aceton, hinzu gegeben und damit eine Suspension in der Nährbodenflüssigkeit der Kultur hergestellt. Die Kultur wurde dann bei Zimmertempera tur 48 Stunden lang unter Belüftung ausge brütet. Zu diesem Zweck wurde die 4 Liter umfassende, beimpfte Kulturflüssigkeit in einer 20-Literflasche, welche mithin 16 Liter Luft enthält, auf einer. Schüttelmaschine ge schüttelt.
Nach Verlauf dieser Zeit betrug der pH-Wert des Nährbodens ungefähr 3,5 und die Fermentationsflüssigkeit und das Myze lium wurden nacheinander dreimal mit einem Liter, einmal mit zwei Liter und einmal mit einem Liter Methylenchlorid extrahiert. Die Methylenchloridextrakte wurden vereinigt und zweimal mit je 400 cm3 einer 2 /aigen wässrigen Natriumbikarbonatlösung und drei mal mit je 500 cm3 destilliertem Wasser ge waschen.
Das Methylenchlorid wurde im Va- kuiim abdestilliert -Lind der trockene Rück stand in 50 eins Methylenehlorid aufgenom men. Die Lösung wurde in ein Becherglas von 100 cm3 gebracht und mittels eines Luft stromes verdampfen gelassen. Der feste Rück stand, welcher 1,585 g wog, wurde in 5 cm3 heissem Methanol aufgelöst und langsam auf Zimmertemperatur abgekühlt. Es fielen 75 mg Kristalle mit einem Schmelzpunkt von 245 bis 249 C aus.
Diese Kristalle erhielten die Be zeichnung U-I. Die Kristalle wurden in 5 cm3 Methanol gelöst, in ein Zentrifugen glas filtriert, worauf nach Kühlung 23 mg U-I-Kristalle mit einem Schmp. von 246 bis 248 C ausfielen.
Bei Anwendung der schon erwähnten Papierchromatogramm - Methode nach Zaffaroni, unter Benützung von Di- äth#Tlenglykolmonoäthyläther als stationäre Phase und Methyleyelohexan als bewegliche Phase, erzeugten diese Kristalle eine einzige Spur, welche stärker polar als Progesteron war. Mikroverbrennungen zeigten die Auf nahme zweier Sauerstoffatome in das Proge- steronmolekül an, wie aus folgendem ersicht lich ist:
Analyse
EMI0009.0004
Berechnet <SEP> für <SEP> Progesteron <SEP> C <SEP> 80,23 <SEP> H <SEP> 9,55
<tb> Berechnet <SEP> für <SEP> Dioxyprogesteron <SEP> C <SEP> 72,8 <SEP> H <SEP> 8;7
<tb> Gefunden <SEP> für <SEP> U-1 <SEP> C <SEP> 72,8 <SEP> H <SEP> 8,6 Der Stoff U-I zeigte bei Infrarotanaly se mehr als eine Hydroxylgruppe auf, behielt anderseits die ursprüngliche 3-Keto-, d4- und 20-Keto-Struktur des Progesterons, wie aus der Infrarotanalyse ersichtlich war, bei.
Die Acetylierung des Stoffes U-I, bei welcher 0,3 eins Pyridin und 0,3 cm3 Essig säureanhydrid für 9,0 mg U-I verwendet wurden, das.
Ganze 16 Stunden bei Zimmer temperatur verweilte, 12,5 eins Wasser zuge setzt bekam und nach abermals einer Stunde Verweilzeit bei Zimmertemperatur und zwecks Auskristallisierung abgekühlt wurde, ergab 6,7 mg kristallisierten Diacetats mit einem Schmp. 154-1550 C, welches mit U-II be zeichnet wird. Infrarotuntersuchungen dieses Stoffes zeigten die Abwesenheit der Ilydroxyl- gruppen und die Anwesenheit neuer Acetoxy- gruppen an.
Die Mutterlauge des ersten kristallinen Stoffes U-I, welcher 1,5 g wog, wurde durch Lüftung vom Lösungsmittel befreit, in 50 eins Benzol .gelöst und über A1203 chromatogra- phiert, wie aus Tabelle I zu- ersehen ist. 50 g mit Säure gewaschenen Aluminiumoxyds, ge trocknet bei 450 C, wurden als Adsorbens ver wendet und die Säule wurde mit Teilen von je 100 eins Lösungsmittel entwickelt.
Auf Grund von Untersuchungen mittels Papier ehromatograminen nach Zaffaroni wurde ge funden, dass die Fraktion A nur eine Spur ergab, welche stärker polar als Progesteron, jedoch weniger polar als ein zweiter Stoff, nämlich U-I, war und in den Fraktionen 21 bis 33 auftrat. Die Fraktion A wurde in 2 eins heissem 11Iethanol gelöst und filtriert. Nach Auskühlen über Nacht wurden 171 mg Kristalle eines Stoffes, welcher mit U-III bezeichnet wurde und einen Schmp. von<B>166-1670</B> C besass, erhalten.
Nach einer Umkristallisierung in 3 cms Methanol erhielt man 98;7 mg von U-III mit Schmp. 166-1670 C und einer spezi fischen Drehung des polarisierten Lichtes von [a]D = + 1759 (C = 1,0127 in Chloroform). Mikroverbrennungen liessen auf die Aufnahme eines Sauerstoffatoms in das Progesteron molekül schliessen.
Analyse Berechnet für Monooxyprogesteron
EMI0009.0051
C <SEP> 76,4 <SEP> H <SEP> 9,10
<tb> U-III <SEP> gefunden <SEP> C <SEP> 76,66 <SEP> H <SEP> 8,92 Infrarotuntersuchungen von LT-III zeigten die Anwesenheit einer Hydroxylgruppe am ur sprünglichen Progesteronmolekül.
EMI0009.0056
<I>Tabelle <SEP> Z</I>
<tb> Gewicht <SEP> des
<tb> Fraktion <SEP> Lösungsmittel <SEP> Rückstandes <SEP> Papierchromatogrammuntersuchung
<tb> Nr.
<SEP> in <SEP> mg
<tb> 1 <SEP> Benzol <SEP> 0 <SEP> Keine <SEP> Spur
<tb> 2 <SEP> Benzol <SEP> 1.82,0
<tb> 3 <SEP> Benzol <SEP> + <SEP> 5 <SEP> % <SEP> Äther <SEP> 123,0
<tb> 4 <SEP> Benzol <SEP> + <SEP> 5 <SEP> <B>%</B> <SEP> Äther <SEP> 246,6 <SEP> Keine <SEP> Spur
<tb> 5 <SEP> Benzol <SEP> + <SEP> 10 <SEP> 'Ihm <SEP> Äther <SEP> 162,9
<tb> 6 <SEP> Benzol <SEP> + <SEP> 10 <SEP> /m <SEP> Äther <SEP> 18,0
EMI0010.0001
Die Hydroxylgruppe in U-III liegt in 11-Stellung, wie durch Oxydation einer Lö sung von 30 mg des Stoffes U-III in 0,5 cm3 Eisessig mit 5 mg Chromoxyd (Cr03)
in 1 cm3 Eisessig und 5 mm3 Wasser, das man. dann eine Stunde bei Zimmertemperatur stehenliess, festgestellt wurde. Einige Trop fen Methanol wurden dann hinzugefügt und nach 10 Minuten wurde das Methanol auf 45 cm3 mit Wasser verdünnt, die Lösung drei- mal mit je 15 cm3 Methylenchlorid extrahiert und schliesslich das Methylenehlorid abge dampft.
Der Rest wurde aus 0,5 emj hIethanol mit einer Ausbeute von 19 mg umkristalli siert und das so erhaltene Triketon U-VI be sitzt einen Sclunp. von 172-175 C und eine spezifische Drehung von [a125 = + 227 in Chloroform. Die Struktur wurde durch Infra- rotuntersuchungen festgestellt, wobei sich, her ausstellte, dass die neuen Ketogruppen sich lediglich in 1-, 7-, 11- und 12-Stellung befin den können. Es ist kein natürliches oder syn thetisches 1-Ketosteroid bekannt.
Die physi kalischen Konstanten des Oxyprogesterons U-II stimmen mit jenen des 12-cu-Oxyproge- sterons nicht überein [Schmp. 200-203 C; [a117 = -1- 205 (C =1,0 in Aceton), Wett stein, Helv. Chim. Acta, 31, 1963 (1945) ], oder mit 12-f-Oxyprogesteron [Schmp.164-167 C, nach Abkühlen Wiederschmelzen bei 195 bis 198 C, [a]17 = -I- 205 (C = 0,502 in Aceton), sseichstein, C.
A. 36, 2261 (1942) ], somit kom men nur noch die 7- und 11-Stellung für die neue Ketogruppe des Stoffes U-VI in Frage.
Ein Vergleich der physikalischen Konstan ten deutet darauf hin, dass das Triketon (Stoff U-VI) ein 11-Keto-progesteron ist. [Schmp. 172-175 C; [a]17 = -I- 238 (C = 0;9 in Aceton), Reichstein, Helv. Chim. Acta, 23, 684 (1940); und ebenda 26, 721 (1942) ].
Ein Vergleich mit reinem 11-Keto-progesteron mittels Infrarotanalyse, Röntgenbeugungs- diagramm Papierchromatographien nach Zaffaroni und Schmelzpunktbestimmungen ergaben, dass der Stoff U-VI mit reinem 11- Keto-progesteron identisch ist.
Die physikalischen Konstanten des Stoffes U-III stimmen mit denjenigen von 11ss-Oxy- progesteron (Schmp. 187-188 C; [a]17 = -h 222-225 (C = 1,75 in Aceton), Shapples und Reich stein, C. A. 36 2261 (1940) ] nicht -überein. Demzufolge muss U-III ein 11a-Oxy-proge- steron sein, da U-VI zeigt, dass sich das ein geführte Sauerstoffatom in der 11-Stellung befindet.
20 mg des Stoffes U-III wurden mit 0,6 cm3 Essigsäureanhydrid in 0,6 ems Pyridin acetyliert. Nach 16stündigem Stehen bei Zimmertemperatur wurden 25 em3 Wasser hinzugefügt. Nach einer Stunde wurde die Mischung zwecks Kristallisation gekühlt. Die entstandenen Kristalle wurden mit Wasser gewaschen und getrocknet; die Ausbeute be trug 16,1 mg des Monoacetates U-V mit einem Sehmp. von 175-177 C.
Die Infrarotanalyse zeigte die Abwesenheit der Hydroxylgruppe und die Anwesenheit einer neuen Acetoxy- gruppe an.
Mikroelementaranalyse Berechnet für Monoacetoxyprogesteron
EMI0011.0067
C <SEP> 74,0 <SEP> H <SEP> 8,85
<tb> Gefunden <SEP> C <SEP> 74,33 <SEP> H <SEP> 8,78 <I>Beispiel 2</I> Oxydation von Progesteron Einer 24 Stunden alten Zucht der Pilz kultur RH-176- in 4 Liter Nährbodenlösung- wurde 1 g Progesteron, gelöst in 50 em3 Aceton hinzugefügt. Nach 24stündigem Aus brüten und Schütteln in Gegenwart-von Luft wurde die Fermentationsflüssigkeit, wie in Beispiel 1 beschrieben, extrahiert.
Die Methy- lenchloridauszüge wurden zweimal mit je 300 cm3 2 1/aiger Natriumbikarbonatlösung und zweimal mit je 500 cms destilliertem Wasser gewaschen, die zusammengelegten Auszüge mit möglichst wenig wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und 6 ems dieser Lösung, welche 2 mg des ursprünglichen Progesteron entsprechen, wurden für Papier- chromatogrammuntersuchungen nach Zaffa- roni, unter Benützung derselben Lösungs mittel wie in Beispiel 1,
verwendet. Die Unter suchungen wiesen auf einen hohen Umwand lungsgrad in 11a Oxy-progesteron hin. Der restliche Methylenchloridatiszug wurde in einem Luftstrom zur Trockene abgedampft. Die festen Rückstände (1,584 g) wurden in 100 cm3 Benzol gelöst, und ein unlöslicher Anteil von 145 mg abfiltriert. Der Schmelz punkt dieses Stoffes betrug 190-230 C.
Durch - Auflösen des unlöslichen Anteils (145 mg) unter Erwärmung in 20 em3 Aceton, Eindampfen der Lösung auf 10 cm3 und Ab kühlung wurden 90 mg des Stoffes U-I, Schmp. 230-240 C, erhalten. Durch ein Pa- pierchromatogramm nach Zaffaroni und die Schmelzpunktbestimmung wurden die gebilde ten Kristalle als eine Dioxyverbindung, der Stoff U-I, identifiziert.
Das Filtrat, welches 1,439 g feste: Körper enthielt, würde über eine A1203 Säule (Tabelle II) in-der in Bei- spiel 1 angegebenen Weise chromatographiert, wobei Teile von je 100 cm3 Lösungsmittel zum Entwickeln der Säule verwendet wurden.
Die Fraktion B der chromatographischen Trennung (Tabelle II), welche 571 mg Ila.- Oxy-progesteron (Stoff U-III) enthielt, wurde in 20 em3 Methanol gelöst, 20 eins Wasser hinzugefügt, erwärmt und im Kühl schrank abgekühlt. Nach Zusatz von weiteren 20 em3 Wasser wurde weiter gekühlt.
Durch die Auskristalli- sation erhielt man 11a-Oxy-progesteron (Stoff U-III) mit Schmp. 165-166 C, welches trok- ken ein Gewicht von 300 mg aufwies.
Eine Zusammenstellung einiger Biooxy- dationsergebnisse ist in Tabelle III (l. Teil und 2. Teil) angegeben.
EMI0012.0023
EMI0013.0001
<I>Tabelle <SEP> 1I</I> <SEP> -(Fortsetzung)
<tb> Gewicht <SEP> des
<tb> hraktion <SEP> Lösungsmittel <SEP> Rückstandes <SEP> Papierchromatokrammuntersuchung
<tb> Nr. <SEP> in <SEP> mg <SEP> 30 <SEP> Aceton <SEP> -h <SEP> 10 <SEP> % <SEP> MeOH <SEP> 0
<tb> 31 <SEP> Aceton <SEP> -h <SEP> 50 <SEP> 1/a <SEP> Me0H <SEP> 1
<tb> 32 <SEP> Aceton <SEP> -f- <SEP> 50 <SEP> 1/o <SEP> MeOH <SEP> 23
<tb> 33 <SEP> Me0H <SEP> 9
EMI0013.0002
<I>Tabelle <SEP> III</I> <SEP> (1. <SEP> Teil)
<tb> Fermentation
<tb> Progesteron <SEP> Vol.
<SEP> der <SEP> Brutdauer
<tb> Versuch <SEP> zugefügt <SEP> Nährbodenlösung <SEP> Stunden
<tb> mg <SEP> Liter
<tb> 26611CM179 <SEP> 1000 <SEP> 4 <SEP> 48
<tb> 266HCM195 <SEP> 1200 <SEP> 4 <SEP> 67
<tb> 266HCM206PA <SEP> 1000 <SEP> 4 <SEP> 24
<tb> 266HCM206PB <SEP> 1000 <SEP> 4 <SEP> 30
<tb> 2661ICM212 <SEP> 3000 <SEP> 10 <SEP> 24
EMI0013.0003
<I>Tabelle <SEP> III</I> <SEP> (2.
<SEP> Teil)
<tb> Fraktionen <SEP> auf <SEP> der <SEP> <B>A1203</B> <SEP> Säule <SEP> enthalten
<tb> lla-Oxy- <SEP> Dioxy- <SEP> Andere
<tb> Versuch <SEP> Progesteron <SEP> progesteron <SEP> progesteron <SEP> Umwandlungs- mg <SEP> [U-IIIl <SEP> [U-I<B>]</B> <SEP> produkte
<tb> mg <SEP> mg
<tb> 266HCM179 <SEP> 0 <SEP> 391 <SEP> 142 <SEP> 18
<tb> 266HCM195 <SEP> 0 <SEP> 507 <SEP> 222 <SEP> 95
<tb> 2661-ICM206PA <SEP> 0 <SEP> 571 <SEP> 225 <SEP> 94
<tb> 266HCM206PB <SEP> 0 <SEP> 471. <SEP> 265 <SEP> 120
<tb> 266HCM212 <SEP> 1520 <SEP> 1260 <SEP> 76 <I>Beispiel 3</I> Oxydation von Progesteron Eine 1-em3-Aufschwemmung von Sporen.
(coinidia) einer 5 Tage alten '10-cm3-Kultur des Pilzes Rhizopus arrhizus in einer Nähr bodenplatte, bestehend aus Malz, Agar und Edamine , in einer sterilen physiologischen Salzlösung wurde zum Impfen von 150 em3 einer sterilen Nährbodenlösung, bestehend aus 21/o Edamine , 5'% Dextrose und 0,5 /o Maisquellwasser in Leitungswasser, verwen det.
Diese, 150 cms einnehmende Pilzkultur, -wurde 24 Stunden lang geschüttelt und einer Lüftung unterworfen, wodurch ein starkes vegetatives Wachstum gefördert wurde. 100 cm3 dieser vegetativen Pilzzucht wurde zu 4 Liter steriler Nährlösung hinzugefügt, dieselbe 24 Stunden geschüttelt und belüftet, dann wurde 4 g Progesteron, gelöst in 40 cm. Methanol, zugefügt und die Belüftung fort gesetzt.
Nach 24 Stünden 45 Minuten wurde die Nährlösung mittels Extraktion mit Me- thylenchlorid, wie in Beispiel 1, abgesondert, wobei insgesamt 4 Liter Methylenchlorid wer- wendet wurden. Die Methylenchlöridlösung wurde aufgearbeitet und konzentriert, wobei 4,38g Rückstände erhalten wurden.
Dieses 'Material wurde nach der in Beispiel 1 be schriebenen Weise chromatographiert und ergab folgende Fraktionen:
EMI0014.0006
Fraktionen <SEP> Zusammensetzung <SEP> Gewicht <SEP> (g)
<tb> Benzol <SEP> unlöslich <SEP> Dioxy-progesteron <SEP> [U-I] <SEP> 0,635
<tb> 14-16 <SEP> Progesteron <SEP> 0,694
<tb> 20-22 <SEP> 11a-Oxy-progesteron <SEP> [U-III <SEP> ] <SEP> 1,994
<tb> 23-25 <SEP> Nachzügler <SEP> (Mono <SEP> -f- <SEP> Dioxy stoffe) <SEP> 0,437 Die das 11a-Oxy-progesteron enthaltende Fraktion wurde in 15 cm3 warmem Methanol gelöst, 2 cm3 Wasser hinzufügt und die Lö sung filtriert.
Nach Abkühlen über Nacht irden 1,15 g eines kristallinen Stoffes mit Schmp. 163-166 C erhalten. Die Ausbeute an kristallinischem 11a-Oxy-progesteron be trug 29,1/a. Ein kleiner zusätzlicher Ertrag wurde auch noch erhalten.
<I>Beispiel 4</I> Oxydation von 11-Desoxy-17-oxy-corticosteron (Stoff S) in der 11-Stellung Eine 16 Stunden alte Pilzkultur RH-176, welcher 1 g des Stoffes S, gelöst in 50 cm3 Jllethanol, zugegeben wurde, wurde 4 Stunden bei Zimmertemperatur unter Luftzutritt be brütet.
Die Fermentationsflüssigkeit, welche einen. pH-'\Vert von 3,8 besass, wurde zuerst mit 2 Liter Methylenchlorid und dann noch dreimal mit<B>je</B> einem Liter Methylenehlorid extrahiert. Die Extrakte wurden vereinigt und je zweimal mit 500 cm3 einer 2 a/oigen Na triumbikarbonatlösung gewaschen. Die Aus züge wurden vereinigt und dann zweimal mit je 500 cm3 destilliertem Wasser ge waschen. Die gewaschenen Methvjenchlorid- auszüge wurden mit möglichst wenig wasser freiem Natriumsulfat getrocknet und dann im Luftstrom verdampft.
Ein kleiner aliquo- ter Teil des Rückstandes wurde Papier- ehromatogrammimtersuehungen unterworfen, wobei sich herausstellte, dass eine neue, lang sam wandernde Spur neben einer andern er schien. Der -gesamte feste Rückstand, der 1,5286g wog, wurde in Benzol gelöst und über A1203 chromatographiert, wie aus Ta belle IV zu ersehen ist.
Eine der langsam wandernden Spuren bildet den Hauptanteil der Fraktion C des Chromatogrammes und diese wurde daher zur Gewinniuig des Stoffes verwendet, der sich von der Ausgangs substanz, der Verbindung S, unterschied. Die Fraktion C, welche 376,5 mg wog, wurde in 2 em3 heissem Methanol gelöst und filtriert. Mittels eines Stickstoffstromes wurde das Volumen auf 1,5 cm3 vermindert, wonach Kri stalle ausfielen.
Diese wogen 152 mg und besassen einen Schmp. von 198-210 C. Nach Umkristalli- sierung in 1 cm3 heissem Methanol erhielt man 35,6 mg Substanz mit Schmp: 223-226 C. Nochmaliges Umkristallisieren der letzten Sub stanz ergab reine Kristalle mit Schmp. 222 bis 225 C. Diese Verbindung enthielt Sauer stoff in der 11-Stellung des Steroidring- systems und war mit 11a,17a,21-Trioxy-4- pregnen-3,20-dion identisch.
Analyse Berechnet für 17-Oxy-corticosteron
EMI0014.0057
C <SEP> 69,5 <SEP> H <SEP> 8,28
<tb> Gefunden <SEP> C <SEP> 69;66 <SEP> 11 <SEP> 8,20
EMI0015.0001
<I>Beispiel 5</I> Oxydation der 11-Stellung von 17a-Oxy- progesteron Eine 24 Stunden alte Pilzkultur RH-176, welcher 1,0 g 17a-Oxy-progesteron, gelöst in 50 cm3 Methanol, zugegeben wurden, wurde 48 Stunden bei Zimmertemperatur unter Luft- zutritt unter Bedingungen, wie sie in Bei spiel 1 angegeben sind, bebrütet. .
Die Fermentationsflüssigkeit (pH = 3,6) wurde zuerst mit zwei Liter Methylenchlorid und dann noch dreimal mit' je 1 Liter dessel ben Lösungsmittels extrahiert. Die Extrakte wurden vereinigt und zweimal .mit. 500 cm3 2 obiger Natriumbikarbonatlösung gewaschen. Die- Auszüge- wurden-- vereinigt und zweimal mit je 500 cm3 destilliertem Wasser gewaschen.
Der gewaschene Methylenchloridauszug wurde sodann zeit möglichst wenig wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und das Methylen- chlorid unter Vakuum abdestilliert. Ein klei ner aliquoter Teil des Rückstandes zeigte bei Papierchromatogrammuntersuchungen das Vorhandensein von drei Spuren an, welche nicht dem 17a-Oxy-progesteron zugeordnet werden konnten.
Der gesamte feste Rück stand, welcher 1,8849g wog, wurde in Benzol gelöst und über A1203 chromatographiert, wie aus Tabelle V zu ersehen ist. Ein die eine Spur ergebender Stoff überwog in Fraktion B, woraus 307 mg feste Substanz aus 1 em3 heissem Methanol auskristallisiert wurden. Nach Abkühlung wurden 61 mg Kristalle mit einem Schmp. von 178-210 C erhalten. Eine Umkristallisierung aus 0,5 em3 Methanol ergab 25 mg Kristalle mit Sehmp. 2.19-222 C.
Nochmaliges Umkristallisieren lieferte reine Kristalle, welche einen Schmp. von 220 bis 223 C besassen. Diese Verbindung enthielt Sauerstoff in der 11-Stellung des Steroidring- systems und wurde als 11a,17a-Dioxy-proge- steron identifiziert.
Analyse; Berechnet für 11a,17a-Dioxy-progesteron
EMI0016.0036
C <SEP> 72,8 <SEP> H <SEP> 8,60
<tb> Gefunden <SEP> C <SEP> 73,01 <SEP> H <SEP> 8,65
EMI0016.0037
EMI0017.0001
<I>Beispiel 6</I> Oxydation von 11-Desoxy-corticosteron Eine 64 Stunden alte Pilzkultur RH-176,. welcher 1,0 g 11-Desoxy-corticosteron in 4 Liter Nährsubstrat zugegeben wurden, wurde 54 Stunden bei Zimmertemperatur unter Bedin gungen, wie in Beispiel 1 angegeben, bebrütet.
Die Fermentationsflüssigkeit samt Myzelium wurde zuerst einmal mit 2 Liter Methylen- chlorid und dann dreimal mit je 1 Liter Methylenchlorid extrahiert. Die Methylen- ehloridauszüge wurden vereinigt, zweimal mit je 500 cms 2'%iger Natriumbikarbonatlösung und schliesslich zweimal mit je 500 ems destil liertem Wasser gewaschen.
Der Methylen- chloridauszug wurde mittels eines Luftstromes zur Trockne verdampft und der feste Rück stand in 50 cm3 Methylenchlorid aufgenom men. Die Lösung wurde in ein 100 ems fassen des Becherglas umgeleert und im Luftstrom verdampft. Die festen Rückstände, welche 1,4218g wogen, wurden in Benzol gelöst und über A120, chromatographiert, wie aus Ta belle VI ersichtlich ist.
Die Fraktion B liess auf die Bildung dreier langsam wandernder Verbindungen schliessen, wobei eine Spur die stärkste war. Ein Teil dieser Fraktion besass eine biologische Wirksamkeit, welche eine un- gefähr 5 %ige Umwandlung in bezug auf Corticosteron anzeigte, gewertet nach der Rattenleberglykogenprobe von Papst und Mit arbeitern, Endocrinology, 41, 55 (1947).
Die restliche Substanz, 200 mg, wurde aus 1. em3 Methanol umkristallisiert und lieferte 26 mg Kristalle mit Sehmp: 180-189 C. Zweimaliges Umkristallisieren dieser Substanz ergab 8 mg Kristalle mit Schmp. 190-192 C. Infrarotuntersuchungen liessen auf die Ein führung einer neuen Hydroxylgruppe in '11-Desoxy-corticosteron durch die Einwirkung der Pilzorganismen RH-176 schliessen. Das Endprodukt wurde als das 11a,21-Dioxy-4- pregnen-3,20-dion erkannt.
EMI0017.0050
EMI0018.0001
<I>Beispiel</I> Oxydation von Progesteron 150 mg Progesteron, gelöst in ungefähr 3 em3 Aceton, wurde zu 150 cm3 Nährboden lösung (wie vorher beschrieben), welche 60 mg Markenprodukt Tween 40 enthielt, gleich zeitig mit dem Impfen des Nährbodens mit RH-176 hinzugegeben. Das beimpfte Nährsub strat wurde, -wie in ...
Beispiel 1 angegeben, unter Schütteln bQlüftet, wobei eine 1-Liter- flasche verwendet wurde. 1NTach 72 Stunden hatte die vollständige Umwandlung des Proge- sterons stattgefunden und eine 30 %ige Um- wandlung in 11a-Oxy-progesteron (Stoff U-III)
wurde durch ein Papierchromatogramin festgestellt, wobei ein Carbitol-Methylcyclo- hexan-Lösungsmittelsystem zum Nachweis der Progesteronausnützung und ein Toluol-Pro- pylenglycol-System zur Feststellung des Um- wandlungsgrades und der erhaltenen Verbin dungstypen verwendet wurden.
<I>Beispiel 8</I> Oxydation von Progesteron Eine 5 Tage alte aerobische Zucht von RH-176 in 150 cm3 Nährbodenlösung wurde nach Zugabe von 150 mg Progesteron, gelöst in..3._cm3 Aceton, unter Belüftungsbedingun- gen, wie sie in Beispiel 7 beschrieben sind, be brütet, wobei die Konzentration 1 mg je cm3 betrug.
Nach 32 Stunden war kein Proge steron mehr nachweisbar, die Umwandlung in die Stoffe U-I und U-III war vollständig, und dabei betrug die Umwandlung in U-III, 11a-Oxy-progesteron ungefähr 501/o, wie durch ein Papierchromatogramm festgestellt werden konnte, wobei ein Carbitol-Methyl- eyclohexan-Lösungsmittelsystem zum Nach- weis der Progesteronausnützung und ein Toluol-Propylenglykolsystem zur Feststellung des Umwandlungsgrades und der erhaltenen Verbindungstypen verwendet wurden.
Beispiel <I>9</I> - Oxydation von Progesteron In ähnlicher Weise wurde eine 41 Stun den alte, 2 Liter umfassende Pilzzucht von RH-176, welcher 1 g Progesteron, gelöst in 40 ems Aceton, zugemischt waren, 30 Stunden lang einer Lüftung unterworfen. Die Lüftung erfolgte in der Weise, dass ein Luftstrom von 0,1. Liter pro Minute unter heftigem Rühren mit einem Rührer (etwa 250 U/min) durch die Nährflüssigkeit hindurchgeleitet wurde.
Es wurde 11a-Oxy-progesteron (Stoff U-III) mit einer Ausbeute von 47'%- durch Extra- hierung der. Fermentationsflüssigkeit und des ,Myzeliums erhalten. Die Ausbeute an der.
Dioxyverbindung (Stoff U-I) betrug unge fähr 26,5'0/a, wobei die Ausbeute nach ehro- matographischer Trennung mittels einer Alu miniumoxydsäule und vor der Umkristallisie- rung bestimmt -wurde. Die erhaltenen Sub stanzen wurden in der in Beispiel 1 angege benen Weise mit guter Ausbeute umkristalli siert.
<I>Beispiel ZO</I> Oxydation von Progesteron Zu 150 em3 einer 24 Stunden @ alten RI-I- 176-Kultur wurden 30 mg Progesteron, gelöst in 3 cm3 Aceton, hinzugegeben und unter den in Beispiel 7 angegebenen Bedingungen 24 Stunden belüftet.
Die Umwandlung von Progesteron in 11a-Oxy-progesteron (Stoff U-III) betrug ungefähr 60%, korrigiert in bezug auf nicht umgewandeltes Progesteron durch ein Papierchromatogrämm, bei einer Gesamtausbeute von ungefähr 37%,
wobei ein Carbitol-Methylcyclohexan-Lösungsmittel- svstem zum Nachweis von Progesteron und ein Toluol-Propylenglykolsystem zur Differenzie rung der Umwandlungsprodukte verwendet wurden.
Beispiel <I>11</I> Oxydation von Progesteron Das obige Beispiel wurde mit 150 ems Nährbodenlösung wiederholt, wobei wieder mit RH-176 geimpft wurde und 300 mg Progesteron, in 3 cm3 Aceton gelöst, hinzu gegeben wurde. Die Konzentration betrug 2 g Progesteron auf 1 Liter Nährboden. Auch nach 72 Stunden konnte mittels Papierehro- matogramm-und Beobachtung des Pilzwachs tums nachgewiesen werden, dass ein hinzu gefügtes Progesteron noch immer umgewan delt werden kann, jedoch waren die Ausbeu ten von U-III und U-I kleiner als üblich.
In ähnlicher Weise wurde Progesteron zum Nährboden a) gleichzeitig - mit dem Impfen des Nährbodens mit RH-176, b) 24 Stunden nach dem Impfen und e) 5 Tage nach dem Impfen des Nährbodens hinzugefügt und jeweils gemäss Beispiel 1 belüftet, ohne dabei eine wesentliche Änderung der Arten der ge bildeten Stoffe feststellen zu können; und zwar waren immer Dibxy-progesteron (U-I) und 11a-Oxy-progesteron (U-III) vorhanden.
<I>Beispiel 12</I> Oxydation von 11-Desoxy-corticosteron Der Arbeitsgang von Beispiel'1 wurde mit einer 24 Stunden alten Kultur von RH-176 wiederholt und einige neue, in 11-Stellung oxydierte Verbindungen 'wurden hergestellt, wie aus einem Papierehromatogramm nach Zäffaroni mit Diäthylenglykolmonoäthyläther- als stationäre Phase und Methylcyelohexan als bewegliche Phase ersichtlich war.
Bei der Identifizierung erwies sieh eine davon als 11-epi-Corticosteron mit einem Schmp. von 159 (korr); [a,] 20 = -f- 149 (in Essigester).
<I>Beispiel 13</I> Oxydation der 11-Stellung von 3-Oxy- pregnan-20-on In der gleichen Weise wie bei der oben angegebenen Oxydation der 11-Stellung des Steroidringsystems von 17a-Oxy-progesteron wird 3-Oxy-pregnan-20-on in der 11-Stellung des Ringsystems durch Einwirkung einer Kultur von RH-176 oxydiert, wobei 3a,11a- . Dioxy-pregnan-20-on erhalten wird. .
<I>Beispiel</I> 14 Oxydation von Steroiden in der 11-Stellung 300 cm.3 der üblichen, aus 2'%. Edamine , 5% Dextrose.--und-Maisquellwasser bestehen- den Nährbodenlösung mit einem pH von 6,5 wurde mit Sporen der Organismen RH-176 geimpft und 24 Stunden unter Lüftung ge schüttelt.
Von diesem Nährboden wurden An teile von je 20 cm3 in sterile, 100 cm3 fassende Kolben gefüllt und .jedem Kolben wurden ungefähr je 6 mg folgender Steroidsubstan- zen, gelöst .in höchstens 0,3 cm3 Aceton, hin zugefügt, wobei eine feine Suspension der Steroide in der Nährbodenflüssigkeit erzeugt wird. Die Kolben wurden mit ihrem Inhalt 24 Stunden geschüttelt und sodann der Inhalt extrahiert, um die Änderungen mittels eines PapierchromatogTammes bestimmen zu kön nen.
In der folgenden Tabelle VII sind die behandelten Steroide, der px-Endwert und die Endstoffe angegeben.
EMI0020.0015
<I>Tabelle <SEP> VII</I>
<tb> Steroide <SEP> P$ <SEP> Endwert' <SEP> Endstoffe
<tb> 1. <SEP> Androstendion <SEP> 3,75 <SEP> lla-Oxy-androstendion
<tb> 2. <SEP> Cholestenon <SEP> 4,12 <SEP> lla-Oxy-cholestenon
<tb> 3. <SEP> Ergosteron <SEP> 3,9 <SEP> lla-Oxy-ergosteron
<tb> 4. <SEP> Pregnenolonacetat <SEP> 3,9 <SEP> 7,11-Dioxy-pregnenolon
<tb> 5.
<SEP> Stigmastadienon <SEP> 3,0 <SEP> Ila-Oxy-stigmastadienon
<tb> Knapp <SEP> vor <SEP> der <SEP> Extraktion Alle diese Verbindungen sind in der 11- Stellung des Steroidringsystems durch die Einwirkung von RH-176 oxydiert. <I>Beispiel 15</I> Oxydation der 11-Stellung in Progesteron Zum Impfen von 150 cms eines üblichen, aus Edamine , Ghikose, Maisquellwasser und Leitungswasser bestehenden Nährbodens wurde 1 cms einer aus 10 em3 bestehenden Koch..
salzlösungsaüfschwemmung von Sporen einer Schrägkultur von RH-176 aus der Sammlung verwendet. Nach 24stündigem Schütteln wur den 5 cm3 davon verwendet, um 150 cms eines sterilen Nährbodens folgender Zusam mensetzung zu impfen: 0,3 g primäres Kaliilm- phosphat (KH2P04), 1,5 g Ammoniiunnitrat (NH4N03), 0,25g Magnesiumsulfatheptahydrat (l-TgS04. 7I320) mit Leitungswasser auf 1 Liter gebracht.
Nach Sterilisierung des Nährbodens bei 120 betrug der pil-Wert des Nährbodens 4,3.
Nach einer 24stündigen Lüftungsdauer, wodurch ein starkes Wachstum hervorgerufen würde, kam eine Lösung von 60 mg Proge steron in 3 cm3 Methanol zur Pilzkultur dazu. Nach weiteren 24 Stunden Lüftung wurde die Fermentationsflüssigkeit mit Methylenchlorid extrahiert. Wie aus papierchromatographi- schen Untersuchungen ersichtlich werde, war der UmwandlungsgTad in lla-Oxy-progesteron. (U-III) und weiter oxydierten Derivaten hoch.
Die extrahierte Substanz (U-III) war kristal lin und schwächer gefärbt als bei komplizier ter zusammengesetzten Nährböden. <I>Beispiel 16</I> Oxydation von Steroiden in der 11-Stellung Die verwendeten Organismen wurden in einer Nährbodenlösung folgender Zusammen setzung gezüchtet: 20 g Edamine , 5 cm?, Maisquellwasser, 50 g Dextrose, mit Leitungs wasser auf 1 Liter aufgefüllt, auf PH 6,5 ein gestellt und dann auf 120 C 20 Minuten lang sterilisiert.
Die Kulturen wurden mittels stark sporen- beladener Schrägkulturen beimpft,- die 10 % getrockneten Malzextrakt und 211-/o. Agar ent hielten. Alle Kolben enthielten durchschnitt lich je 30 em3 des Nährbodens.
Die Kolben würden unter Luftzutritt 24 Stunden lang bei Zimmertemperatur ge schüttelt. Eine gewisse Menge der Steroide wurde in Form einer 2 1/oigen Acetonlösung (Substanzgewicht je Volumteile - Lösungs mittel) hinzugefügt und der Kolben weitere 24 Stunden bei Zimmertemperatur geschüttelt. Auf 30 cm-' kamen 6 mg Steroide.
Das Fermentationsgemisch, bestehend aus Nährbodenlösung, dem Steroid und den Orga nismen wurde dreimal mit Methylenchlorid extrahiert, und zwar mit Lösungsmittelvolu- men, welche gleich gross wie das Volumen der wässrigen Lösung waren.
Der Aaszug wurde in einem Scheidetrichter von der- wässrigen Lösung getrennt und mit 2% Natriumbikar- bonatlösung und destilliertem Wasser ge waschen. Das Lösungsmittel wurde bis zur Trockene abgedampft und der Rückstand durch Papierchromatographie geprüft.
In der nachfolgenden Tabelle VIII sind die verwendeten Organismen und die Steroid substanz angegeben.
EMI0021.0022
<I>Tabelle <SEP> VIII</I>
<tb> Steroid <SEP> : <SEP> Progesteron
<tb> Organismen <SEP> American <SEP> Type <SEP> Culture
<tb> Collection <SEP> Nr.
<tb> 1. <SEP> Mucor <SEP> rouxi. <SEP> 4857
<tb> 2. <SEP> Mucor <SEP> griseocyanus <SEP> (-I-) <SEP> 1207a
<tb> 3. <SEP> Mucor <SEP> griseocyanus <SEP> (-) <SEP> 1207b
<tb> 4. <SEP> Mucor <SEP> hiemalis <SEP> var. <SEP> albus <SEP> 6800
<tb> 5. <SEP> Mucor <SEP> hiemalis <SEP> 8690
<tb> 6. <SEP> Mucor <SEP> mucedo <SEP> 9836
<tb> 7. <SEP> Mucor <SEP> mucedo <SEP> 9635
<tb> B. <SEP> Mucor <SEP> mucedo <SEP> 7941
<tb> 9. <SEP> Mucor <SEP> nigricans <SEP> 10404
<tb> 10. <SEP> Rhizopus <SEP> nigricans <SEP> 7577
<tb> 1.1.
<SEP> Rhizopus <SEP> nigricans <SEP> (-f-) <SEP> 6227a
<tb> 12. <SEP> Rhizopus <SEP> nigricans <SEP> (-) <SEP> 6227b
<tb> 13. <SEP> Rhizopus <SEP> chnensis <SEP> (-) <SEP> 1227b
<tb> 14. <SEP> Rhizopus <SEP> japonicus <SEP> 8446
<tb> 15. <SEP> R.hizopus <SEP> oryzae <SEP> 10260
<tb> 16. <SEP> Rhizopus <SEP> oxyzae <SEP> 9363
<tb> Steroid <SEP> :
<SEP> 11-Desoxy-17a-oxy-corticosteron
<tb> 17. <SEP> Mucor <SEP> rouxi <SEP> 4857
<tb> 18. <SEP> Mucor <SEP> griseocyanus <SEP> (-i-) <SEP> 1207a
<tb> 19. <SEP> Mizeor <SEP> griseocyanus <SEP> (-) <SEP> 1207b Versuche über die Einwirkung der in der Tabelle VIII angegebenen Organismen auf 11-Desoxy-corticosteron, 17-Oxy-progesteron und 11-Desoxy-17-oxy-corticosteron ergaben ähnliche Resultate, nämlich die Einführung einer Hydroxylgruppe in die 11-Stellung 'des Steroidringsystems.
In ähnlicher Weise wird bei Einwirkung der im folgenden aufgezählten Pilzorganismen auf Progesteron, 11-Desoxy-corticosteron, 11- Desoxy -17 - oxy-corticosteron und 17-Oxy- progesteron dasselbe Ergebnis erhalten:
Mucor_ genevensis, plumbeus, parasiticus, dubius, javanicus, adventitius, microsporus, roucianus, racem.osus; Rhizopus reflexus, shanghaiensis, tritici, schnii, delamar, tonkinensis, kazanensis;
Phycomyces blakeslecanus, theobromatus; Ab- sidia gläuca; Zygorhynchus moelleri,
hererö- gamus und Syncephalis nodosa. <I>Beispiel 17 ' -</I> Oxydation von Progesteron unter Verwendung von Filtraten der Fermentationsflüssigkeit von RH-176 Eine 72 Stunden alte Kultur wurde fil triert und daraus 160 em3 Filtrat der Fermen tationsflüssigkeit mit einem PH-Wert von 4,1 erhalten.
Das Myzelium wurde in einem Waring -Mischer unter Zusatz einer 0,9 /oigen Kochsalzlösung 15 Minuten lang zerkleinert und abzentrifngiert, wobei 100 cm3 Flüssigkeit abgetrennt wurden und welche in zwei gleiche Teile geteilt wurde. Ein Teil wurde bei pH 4,65- belassen, der andere mit halbmolarer Na2HP04 Lösung auf pH 6,76 gestellt.
Der Myzeliumrückstand wurde zu, sammen mit etwas zugegebener Kochsalzlösung in einen eigenen Kolben geschüttet. Zu jedem Kolben wurde Progesteron (30 mg je cms Aceton) in der im folgenden angegebenen.
Weise hinzugegeben
EMI0022.0021
Fraktion <SEP> Progesteron menge
<tb> S <SEP> I <SEP> = <SEP> überstehende <SEP> Flüssigkeit
<tb> pg <SEP> 6,76 <SEP> 30 <SEP> mg
<tb> S <SEP> II <SEP> = <SEP> überstehende <SEP> Flüssigkeit
<tb> pa <SEP> 4,65 <SEP> 30- <SEP> mg
<tb> R <SEP> = <SEP> Myzeliumrückstände <SEP> 60 <SEP> mg
<tb> BF <SEP> - <SEP> unverdünnte <SEP> Fermenta tionsflüssigkeit <SEP> pa. <SEP> 4,1 <SEP> 30 <SEP> mg Die mit Wattebauschen verschlossenen Kol ben wurden 17 -Stunden lang bei Zimmer temperatur geschüttelt und in der in Bei spiel 1 angeführten Weise mit Methylen- chlorid extrahiert.
Papierchromatogramme mit aliquoten, 300 y wiegenden Mengen von Steroiden zeigten, bei Verwendung eines Carbitol -, Methylcyclohexan-Lösungsmittel- sy stems, dass S I eine sehr geringe Umwand- hLug in höher oxydierte Substanzen ergab, S II eine beachtliche und BF eine noch grössere Umwandlung hervorriefen, dass aber die Myzeliumrückstände eine vollständige Um wandhing ergaben.
<I>Beispiel' 18</I> Oxydation von 11-Desoxy-corticosteronacetat In einem 5 Liter fassenden, mit Rührwerk versehenen Glasfermenter wurden 3 Liter Nährboden (Dextrose 50 g, Maisquellwasser, Caseinpepton 20 g, dest. Wasser 1000 cm') mit Sporen des Pilzes Rhizopus nigricans Ehrenberg (bestimmt nach H. Zycha, Krypto- gamenflora der Mark Brandenburg, Band VIa (Pilze, II,
Mucorineae) Leipzig, 1939 und G. Lindau, Die mikroskopischen Pilze , Ber lin, 1922) geimpft. Die Ausgangskulturen für die Impfung waren jeweils 5 Tage alt und wurden auf Malzextrakt mit Maisquellwasser (Schrägagar) vorgezüchtet. Durch den be- impften. .Nährboden wurde bei 24 C unter Rührung sterile Luft mit einer Geschwindig keit von 500 Liter/min. geleitet. Zur Schaum verhütung wurden 6 cm3 Spermöl zugegeben.
Naeh 24stündigem Wachstum wurden 1,5 g Desoxycorticosteronacetat, gelöst in 7,5 cm3 Benzylalkohol zugegeben, und es wurde da nach weitere 24 Stunden bei gleicher Belüf tung gerührt. Zur Gewinnung des Reaktions produktes wird der Inhalt des Fermenters dreimal mit insgesamt 4 Liter Methylen- chlorid ausgeschüttelt. Das Methylenchlorid wird zweimal mit jeweils 500 cm3 2 o/oiger Natriumbicarbonatlösung und danach zwei mal mit je 1 Liter Wasser gewaschen.
Es wird nun einer Destillation unterworfen, wobei ein öliger Rückstand zurückbleibt. Um Wasser reste zu entfernen, wird der Destillations- rückstand nochmals mit Methylenchlorid ver setzt und letzteres wieder abdestilliert.
Zur Bestimmung der Ausbeute der Reak tionsprodukte wurde der Gesamtrückstand ge wogen. Ein abgewogener Teil wurde in einem bekannten Volumen Chloroform aufgelöst. Ein aliquoter Teil wird mit einer Mikrometer- Syringe auf Propylenglykol-getränktes Papier (Schleicher & Schüll Nr. 2043b) aufgetragen und mit Toluol einer absteigenden Papier chromatographie unterworfen. Das unver änderte Desoxy-corticosteronacetat wandert.
auf dem Papier sehr schnell aus (etwa an der Toluolgrenze), während Oxydationsprodukte sehr nahe dem Ausgangsfleck verbleiben. Die Sichtbarmachung und Bestimmung der Sub stanzen in den Flecken erfolgte durch Be handlung des getrockneten Papiers mit alka lischem Triphenyltetrazoliumchlorid (2 ohige Lösung mit gleichem Volumen ln-Natron- lauge) und nachfolgendem Erwärmen bei 45 C Trockenschrank. Danach wird das Pa pier mit Wasser gespült und wieder getrock net.
Die sich mit reduzierenden Substanzen bildenden roten Flecke können nun heraus geschnitten, mit Methylglykol eluiert und kolorimetriert werden. Zum Vergleich wurde eine Eichkurve mit Desoxy-corticosteronacetat in der Weise aufgenommen, dass verschiedene Mengen dieser Substanz auf Papier aufgetra- men und der gleichen Behandlung unterworfen wurden, wie das Papier mit der Analyse.
Die Extinktion von Flecken, die mit Corticosteron erhalten wurden, war etwa die gleiche wie die des Desoxy-corticosteronacetates, deshalb ge nügte es, Desoxy-corticosteronacetat als Eich substanz zu verwenden. Zur Sicherheit wurde jedes Papierchromatogramm dreimal gemacht und der Mittelwert aus den Ergebnissen ge nommen.
Nach dieser Methode vorgenommene Be stimmungen des oxydierten Produktes ergaben eine Ausbeute von 60-70 % des verwendeten Desoxy-corticosteronacetates.
Die Reaktionsprodukte wurden nun präpa- rativ isoliert. Zu diesem Zwecke wurde das erhaltene Öl mit einem Gemisch von Benzol- Petroläther \(1 :1) gelöst und die Lösung an 25 g saurem A1203 chromatographiert. Mit Benzol, Äther und Chloroform als Elutions- mittel wurden in üblicher Weise die einzelnen Fraktionen isoliert.
Die Hauptfraktion befand sich in den. Chloroformlösungen. Das Rohprodukt war bereits kristallisiert und wog rund 0,6 g; daraus liess sich durch Kristallisation aus Essig ester und Äther (1,5:5) das 11-Epi-cortico- steron isolieren. Schmelzpunkt 159 (korr.) ; [alD = -f- i49 (in Essigester).
Die Substanz gab keine Schmelzpunktdepression mit synthe tisch hergestelltem Epi-corticosteron.. Die Ultrarotspektren beider Substanzen wären identisch.