Verfahren zur Einführung von Hydroxylgruppen in Steroide Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Einführung von llydroxylgruppen in Steroide durch aerobe Fermentation eines My celiums in Gegenwart des Steroids, bei dem eine kritische Abstim mung des Verhältnisses der Reaktionsteilneh mer und Kontrolle der Reaktionszeit die nach- herige Reinigung des oxydierten Steroids er leichtern.
Dieses Verfahren ist eine weitere Ausbildung des im schweiz. Patent Nr. 329191 beschriebenen Verfahrens und ist dadurch gekennzeichnet, dass man pro Gramm des Steroids mindestens 0,5 g My celium, als Trockenprodukt berechnet, verwendet und das erhaltene oxydierte Steroid isoliert. Nach dem Verfahren gemäss vorliegender Erfindung gelingt es, in wirksamer, wirtschaftlicher und technisch befriedigender Weise Hydroxyl- gruppen z. B. in die 11-Stellung von 11-Des- oxvsteroiden einzuführen.
Vor allem kommen Pilze der Gattung llucorales in Betracht. Das Verfahren ist hauptsächlich für die Überführung von in 11.-Stellung unsubstituierten Steroiden in 11- Oxysteroide wichtig. Neben der 11.-Oxygruppe werden bisweilen gleichzeitig in andern Stel lungen Hydroxylgruppen eingeführt. Dies ist unter Umständen nicht unerwünscht, da die Einführung von Hydroxylgruppen in andere Stellungen des Steroidkernes ebenfalls zu wertvollen therapeutischen Produkten oder Zwischenprodukten führen kann, z.
B. sol- eben, die eine Oxy gruppe in 17-Stellung auf weisen. Falls solche zusätzliche Gruppen nicht erwünscht sind, kann man diese leicht wieder entfernen. Falls im Molekül des zu oxydieren den Steroids Oxygruppen vorhanden sind, die sich zur Ketogruppe oxydieren lassen, kann man sie, gegebenenfalls (z.
B. wenn sehr hohe Ausbeuten an Sauerstoff in 11-Stellung ent haltendem Produkt erwünscht sind), gegen den Angriff durch die oxydierenden Pilze schützen, indem man sie zum Beispiel durch Veresterung, Verätherung, Halogenierung oder dergleichen in eine Gruppe überführt, die sich wieder in die Oxy gruppe zurück verwandeln lässt.
Als Ausgangsstoff kommen die verschie densten Steroide in Betracht, vor allem aber solche, die in 11-Stellung unsubstituiert sind.
Die Steroide können verschiedene Substi- tuenten enthalten, z. B. in Stellung 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 12, 13, 14, 15, 16 oder 17, insbesondere auch Methylgruppen in Stellung 10 und 13, Keto-, Oxy- oder Acyloxygruppen in den Stellungen 3, 7 oder 12; 17-Seiten- ketten, von denen die Progesteron- und Cor- ticosteron-(Ketol-)seitenketten besonders er wähnt seien;
eine 17-Ketogruppe, eine 17-Oxy- gruppe; ferner können auch eine oder mehrere Doppelbindungen in Stellung 4, 5, 6., 7, 8, 9(11), 1l(12), 16(17) und andern Stellungen oder Doppelbindungen, die durch Anlagerung von Halogen oder Halogenwasserstoff abge- sättigt wurden, vorhanden sein. Auch Dien- Addukte, z. B. Maleinsäureester-Addukte, von Steroiden mit einem System konjugierter Dop pelbindungen, z. B. in 5,7-Stellung, kommen in Betracht.
Die An- und Abwesenheit einer Doppelbindung in 9(11)- oder 11(12)- Stellung des Kernes ist kein kritischer Fak tor für das Verfahren, obschon man Steroide mit einer 11-Methylengruppe, das heisst Steroide, die am Kohlenstoffatom 11 zwei Wasserstoffatome besitzen, aus Gründen der Wirtschaftlichkeit und zur Vermeidung un nötiger Umwandlungen von gesättigten in ungesättigte Verbindung bevorzugt; die Fer- mentierung kann jedoch an sich mit gleicher Leichtigkeit mit gesättigten oder ungesättig ten Verbindungen durchgeführt werden.
Beispiele für Steroide, die als Ausgangs stoffe in Betracht kommen, sind z. B.: Progesteron, 9(11)- oder 11(12)-Dehydroprogesteron, 7,9 (11) -Bisdehydroprogesteron, 17-Oxyprogesteron, 17a-Progesteron, Testosteron, Pregnenolone, 3-Oxy-5-pregnen-20-on, Pregnenolon, 3ss-Oxy-5,16-pregnadien-20-on, Acyloxypregnenolone, wie Pregnenolon-acetat, 3-Oxy-5,6-oxydo-pregnan-20-on (a- oder ss-oxydo),
3-Oxy-5-chlor-pregnan-20-on, 5,6-Oxydo-pregnan-3,20-dion (a- oder ss-oxydo), 4-Brom- und 4-Chlor-pregnan-3,20-dion, 5-Chlor-pregnan-3,20-dion, 3-Keto-pregnan-20-ol, 3-Keto-allopregnan-20-ol, 3ss-Oxy-16,17-oxydo-21-acetoxy-5-pregnen- 20-on, 3ss-Oxy-16,17-oxydo-5-pregnen-20-on, 3ss-Oxy-5,6,21-tribrom-16,17-oxydo- pregnan-20-on, 3ss-Oxy-16-brom-17-Oxy-5-pregnen-20-on,
3ss-Oxy-16-chlor-17-oxy-5-pregnen-20-on, 3ss-Oxy-5(6),16 (17) -dioxydo-pregnan-20-on, 3ss-Oxy-5(6),16 (17) -dioxYdo-21-brom- pregnan-20-on, 3ss-Oxy-5(6),16(17)-dioxydo 2l-acetoxy- pregnan-20-on, 3ss-Oxy-5 (6),16 (17) -dioxydo=?1-oxy- pregnan-20-on, 11-Desoxycorticosteron, d9(11)- oder 411(1')-Desoxyeortieosteron,
11-Desoxy-17-oxy-eorticosteron und Acyloxyderivate, wie das Acetoxy derivat, 21-Ox,7-pregnenolon und 21-Acylderivate, z. B. das Acetat, 17,21-Dioxy-pregnenolon und 17,21-Diacy loxy-derivate derselben, z.
B. das Diacetoxy-derivat, Androstendion, Androstan-17-ol, 9(11)- oder 11(12)-Dehydroandrostendion, 3-Oxy-9 (11)- oder -1 1. (12 )-pr egnen-20-one, 3,21-Dioxy-9 (11) - oder -11(12)-pregnen- 20-one, 3,17,21-Trioxy-9(11)- oder -11(12)-pregnen- 20-one,
4-Androsten-3-ol-17-on und seine 3-Acy 1- derivate, z. B. das Acetat, 5-Androsten-3-ol-17-on und seine 3-Acyl- derivate, z. B. das Acetat, Ergosterol, Stigmasterol, Stigmastanol und die 3-Acy lderivate, z. B.
Acetate, derselben; Ergostenon, Stigmastenon, Stigmastanon, Cholestenon, Cholsäure, Desoxy eholsäur e, Lithocholsäure, Cholansäure, Noreholan- säure, Bisnorcholansäure, Cholensäure, Norcholensäure, Bisnorcholensäure, und 3-Oxy-, 3-Keto-, 3,7-Dioxy-,
3,7-Diketo-, 3,7,12-Trioxy-, 3,7,12-Triketo-Derivate, 9(11)- oder 11(12)-un-esättigte Ester, Thiolester, sowie andere Derivate dieser Säuren.
Zweckmässig verwendet man Steroide mit bis zu 22 Kohlenstoffatomen im Kohlenstoff- skelett des Steroidkernes, insbesondere solche mit einer zwei Kohlenstoffatome enthaltenden Seitenkette in 17-Stellung und einer Methylen- gruppe in 11-Stellung. Die 10-Nor-methyl-, 13-Nor-methyl und die 10,
1.3-Bisnor-methyl- Formen aller der obengenannten Steroide eignen sich ebenfalls für den vorliegenden Fermentierungsprozess. Falls die 11-Stellung bereits oxydiert oder substituiert ist, kann das vorherrschende Produkt zusätzlich in anderer Stellung oxydiert sein.
Die 16-Dehydroform aller genannten Steroide lässt sich ebenfalls verwenden. In alle diese Stoffe lassen sich vor allem. durch Mueorales-Pilze, insbesondere Rliizopus und Cunningliamella, speziell Rhizo- pus nigrieans, Rhizopus arrhizus und Cunning- haniella blakesleeana, Hydroxylgruppen ein führen.
Besonders die Stämme Rhizopus arrhizus, ATCC (American Type Culture Collections) <B>111</B>45, hier oft als RH 176 bezeichnet, und R.hizopus nigrieans, ATCC 6227b, ergeben sehr gute Ausbeuten an den gewünschten Oxy- steroiden. Doch kann man in gewissen Fällen unter besonderen Umständen andere Gattun gen und Arten ebenfalls mit Vorteil verwen den.
Für die Erfindung geeignete Pilze (auch Mutanten) sind erhältlich zum Beispiel bei den Northern Regional Research Laboratories, Peoria, Illinois, oder bei der American Type Culture Collection (ATCC), '\Vashington, D. C. oder beim Centraalbureau voor Schimmeleultur Baarn, Holland. Man kann sie aber auch aus natürlichen Quellen unter Verwendung be kannter mikrobiologischer Methoden erhalten.
Die Nährmedien, in denen die Pilze gezüchtet werden, sollten Quellen für assimilierbaren Kohlenstoff, Stiekstoff und Mineralstoffe ent halten. Auch unter schlechteren als optimalen Bedingungen kann ein beträchtliches Wachs tum und Entwicklung stattfinden.
Als Quellen für assimilierbaren Kohlen stoff können Kohlehydrate, wie Stärken, gela tinierten Stärken, Dextrin, Zucker, Melassen, wie Rohr-, Rüben- und Sorgliumzuekermelas- sen, Glukose, Fruktose, Mannose, CTalaktose, 3laltose, Saeeharose, Lactose, Pentosen, Amino- säuren, Peptone oder Proteine und ferner Kohlendioxyd, Glyeerin, Alkohole, Essigsäure,
Natriuinacetat, Citronensäure, Natriumcitrat, niedere und höhere Fettsäuren oder Fette verwendet werden.
Ein Brei aus mexikanischen Yourswurzeln kann ebenfalls als Medium für die Fermentie- rung verwendet werden. . Als Quelle von assimilierbarem Stickstoff. kommen lösliche oder unlösliche pflanzliche oder tierische Proteine, Sojamehl, Lactalbu- ; min, Casein, Eialbumin, Peptone, Polypeptide oder Aminosäuren, Harnstoff, Ammonium salze oder an Basenaustauschharze, z. B. Zeolite, adsorbiertes Ammoniak in Betracht.
Molke, Rückstände aus der Alkoholdestilla tion aus Maismaische, aus der Stärkefabrika tion herrührende Einweichflüssigkeit für Mais oder Hefeextrakt sind ebenfalls geeignet.
Als Mineralstoffe kann das Medium von Natur aus vorhandenes oder zugesetztes assi- milierbares Calzium, Kobalt, Kupfer, Gallium, Eisen, Magnesium, Mangan, Molybdän, Ka lium, Scandium und Vanadium enthalten.
Schwefel kann durch Sulfate, Alkylsulfonate, Sulfoxylate, Sulfinate, Sulfide, freien Schwe fel, Thiosulfat, Methionin, Cystin, Cystein, Thiamin oder Biotin geliefert werden.
Phos phor kann in Form von ortho-, meta- oder pyrophosphorsauren Salzen oder Estern, Phytin, Phytat, Glycerophosphat, Natrium- nucleinat, Casein oder Ovovitellin, vorteil haft in einer etwa<B>0,001-</B> bis 0,07-, vorzugs weise 0,015-- bis 0,02-molaren Konzentration zugegen sein. Spuren von Bor und Iod kön nen erwünscht sein.
Andere zusätzliche Wachstumsfaktoren, wie Vitamine, Auxine und Stimuliermittel, kön nen ebenfalls zugesetzt werden. Während zum Beispiel R.hizopus nigricans sich selbst mit Vitaminen versorgt, erfordert der Organismus Phycomyces blakesleeanus Thiamin oder eine Mischung von Thiamin-Pyrimidin und Thiamin-Thiazol oder 4-Methyl-5- (ss-oxy- äthyl)-thiazol als Wachstumsfaktor.
Man kann Suspendiermittel oder Mycel- träger, wie Filtererden, Filterhilfen, fein ver teilte Cellulose, Holzschnitzel, Bentonit, Cal- ziumkarbonat, Kohle, Aktivkohle oder andere suspendierbare feste Stoffe, Methylcellulose, Carboxymethylcellulose oder Alginate zu setzen, um die Fermentation, Belüftung und Filtration zu erleichtern.
Während des aeroben Wachstums verschie dener Mucorales, insbesondere Rhizopus, Mucor und Mortierella, wird Fett syntheti- siert. Diese Fettsynthese kann gesteuert wer den, indem man die Menge der den Pilzen zur Verfügung stehenden Kohlehydrate her absetzt und ein Medium verwendet, in dem die Energiequelle vorwiegend aus Protein oder Proteinhydrolysat besteht.
Das pH der Lösung wird gewöhnlich auf etwa 4,5-5,9 eingestellt, bevor man mit dem Pilzorganismus beimpft. Man kann aber auch höhere oder niedrigere p11-Werte anwenden. Erhitzt man im Autoklaven 30 Minuten auf 4,5 kg/cm2 Druck, um aseptische Verhältnisse zu schaffen, so sinkt das pH von 6,5 auf etwa 5,5-5,9, und dieser Rückgang sollte in Rech nung gezogen werden, wenn man das pu. vor der Sterilisation einstellt, so dass man nach derselben optimale Bedingungen für das Wachstum hat.
Man kann auch Antibiotica oder Antiseptica wie zum Beispiel Penicillin oder Sulfite zusetzen, um das Wachstum von fremden Organismen zu hindern oder zu ver zögern.
Die Beimpfung des Nährmediums mit dem Pilz, z. B. der Gattung Mueorales, kann in jeder geeigneten Weise erfolgen. Gewöhnlich verwendet man dazu Sporen des Organismus, doch kann man auch lebendes Mycelium ver wenden. Das Inokulat kann vor, während oder nach dem Verdünnen zum Beispiel in einem Waring-Mischer vermischt, homogeni siert oder sonst gut dispergiert werden. Die Entwicklung des Pilzes erfolgt leicht bei etwa Zimmertemperatur (20-28 C) ; doch ist ein verhältnismässig grosser Temperaturbereich von z.
B. etwa 15-45 C anwendbar. Bei den niedrigeren Temperaturen ist das Wachstum allerdings langsamer.
Die Dauer der Kultivierung, bevor man das Ausgangssteroid der Einwirkung des Pilzes aussetzt, ist nicht kritisch. So kann man das Steroid entweder vor der Sterilisa tion, bei der Beimpfung des Mediums oder einige Zeit, z. B. 24-48 Stunden, später zusetzen. In der Praxis hat es sich- gezeigt, dass man das Steroid sogar noch 5 Tage nach der Beimpfung zusetzen kann, ohne dass die Wirkung beeinträchtigt würde. Nach 24stündiger Kultur des Pilzes ist das p1.1 des Nährmediums beträchtlich abgefallen, in der Regel auf etwa 3,5-5,2, je nach dem Puffergehalt desselben.
Für die Umwandlung hat sich ein pH von etwa 3,0-6,8 als geeignet erwiesen. Vorzugsweise setzt man das Steroid in diesem Zeitpunkt der Kultur zu. Die be vorzugte Arbeitsweise besteht darin, das Steroid dem Kulturmedium nach einer Be- brütungszeit von 0 bis 16, 24 oder 48 Stunden zuzusetzen, da in diesem Stadium die Oxy da- tionswirkung oder der oxydierende Enzy m- mechanismus voll entwickelt, scheint.
Das Steroid wird wie gesagt in solchen Mengen zugesetzt, dass pro g desselben min destens 0,5 g Mycelium, als Trockenprodukt berechnet, im Medium vorhanden sind, z. B. bis zu etwa 0,6 g/1 oder sogar 0,8 g/l. Höhere Konzentrationen hemmen die oxy dative Wir kung etwas. Das Steroid kann in gereinigter oder roher Form oder auch zum Beispiel in Form einer Mischung mit Fett, oder Lösungs mittel zugesetzt werden.
Die Art der Zugabe des Ausgangssteroids ist nicht kritisch und kann in jeder geeigneten Weise erfolgen, die einen innigen Kontakt des Steroids mit dem Fermentiermedium gewährleistet. So kann man den Mikroorganismus in Gegenwart der feinzerkleinerten Steroidkristalle züchten, das Steroid im Pilzmedium dispergieren und der gleichen.
Zu diesem Zweck kann man ober flächenaktive Stoffe, Dispergiermittel oder Suspendiermittel wie die Markenprodukte Spans (Hexitolanhydridester langkettiger Fettsäuren, zum Beispiel Sorbitanmonolaurat), Tweens (Polyoxyalkylenester von Hexitol- anhydridestern langkettiger Fettsäuren), Aerosole (dioctyl-sulfobernsteinsaures Na trium), Naccanols (Alkylarylsulfonate) zusetzen.
Wenn das Fermentationsmedium feste Teilchen enthält, können diese mit Steroid überzogen, imprägniert oder gemischt sein. Vorzugsweise setzt man aber das Steroid dem Pilzmedium oder der Fermentations- flüssigkeit in Form einer Lösung in einem wasserlöslichen organisehen Lösungsmittel, wie Ketonen, Aceton, Alkoholen, Methanol, Ätha- nol, Isopropanol, Benzylalkohol oder selbst @Uher, der in Wasser nur wenig löslich ist, zu,
und mischt gründlich, so dass sich eine Suspen sion oder Dispersion feiner Steroidpartikel bildet, und ein maximaler Kontakt des Me diums mit dem zu oxydierenden Steroid ge währleistet ist. Das Steroid oder seine Lösung können mit Wasser, Medium oder anderem wässrigem Material homogenisiert werden, um eine feine Dispersion zu erreichen. Die Kultur kann submers oder an der Oberfläche statt finden, doch wird die submerse Kultur be vorzugt.
Die Temperatur während der Oxydation des Steroids muss von derjenigen vor der Steroidzugabe nicht verschieden sein, sie soll nur in einem Bereich gehalten werden, in dem die oxydierende Wirkung des Pilzorganismus erhalten bleibt.
Die Wirksamkeit der Hydroxylierung längt von der Belüftung ab. Am besten wird eine gesteuerte Belüftung durch Bewegung und/oder Durchblasen von Luft durch das Kulturmedium angewendet. Die Oxy dations- geschwindigkeit des Steroids hängt ab vom Ausmass der Belüftung und dem Ausmass des Pilzwachstums im "Momente des Steroidzu satzes. Es wurde gefunden, dass die Umwand lung schneller verläuft, wenn das Ausmass der Belüftung gut kontrolliert wird und der Pilz vor Zugabe des Steroids 16-24 vorkultiviert wird.
Die Belüftung kann auch durch Ober flächenkultur, mit oder ohne zusätzliche Be lüftung, z. B. durch Schütteln, erfolgen. Bei Durchführung der Fermentierung unter sub- rnersen Bedingungen kann die Belüftung er folgen, indem man durch das Medium Luft blasen in feiner und/oder grober Form hin durehleitet. Aerobe Bedingungen kann man nicht nur durch Zufuhr von Luft herbeifüh ren, sondern auch durch Verwendung ande rer Sauerstoffquellen, wie Mischungen von Sauerstoff und Stickstoff oder Wasserstoff superoxyd.
Bei Verwendung von Wasserstoff superoxyd oder wenn die Belüftung kräftig ist, kann man allenfalls Katalase zusetzen, um eine Zerstörung der oxydativen WirkLing des Pilzes zu verhindern. Das Wasserstoffsuperoxyd kann auch durch Ultraviolettbestrahlung in situ gebildet werden.
Bei Verwendung von Luft zur Belüftung erfolgt die Luftzufr-dir v orteilhafterweise in einer Menge von 6 bis 8 Millimol pro Stunde pro Liter Sulfit, be stimmt nach der Methode von Cooper, Fern strom und Miller, Ind. Eng. Chem., 36, 501 (1944).Optimale Resultate erhält man, wenn die Sauerstoffaufnahme, nach der genannten Methode bestimmt, 7 Millimol pro Liter pro Stunde beträgt. Unter gewissen Umständen ist es erwünscht, bei der Kultur des Pilzes und der Oxydation der Steroide verschiedene Belüftungsgeschwindigkeiten einzuhalten.
Die Belüftung wird zweckmässig durch Anwen dung von Überdruck von zum Beispiel 2,1 Ata oder mehr oder Unterdruck von zum Beispiel 0,7 Ata gesteuert. Durch Zusatz von Kataly satoren, wie Askorbinsäure, Glutaminsäure, Zitronensäure, Milchsäure, Tyrosin und Tryptophan, wird die Sauerstoffaufnahme er leichtert. Übermässige oder ungenügende Be lüftung setzen die Ausbeute an oxydiertem Steroid herab.
Man kann auch das Schäumen verhin dernde Mittel zusetzen, wie z. B. Glycer idöle und Wachse, Sojaöl, Ricinusöl, Specköl, Olein, sulfonierte Öle, sulfoniertes Ricinusöl, sulfo- niertes Olivenöl, bromiertes Bicinusöl, Mine ralöl, Ölsäure, Specköl plus 3 % Octadecanol oder Dioctylphenylphosphonid in Mengen von 0,1-0,5 %.
Mittels geeigneter Vorrichtungen kann man den Schaum zusammen mit der darin enthaltenen Luft wieder in die Mi schung zurückführen, um die Belüftung zu erleichtern.
Man kann die fermentative Hydroxylie- rung der Steroide unter Bestrahlung mit akti- nischem, z. B. sichtbarem oder ultraviolettem, Licht in nicht tödlicher Dosierung oder unter abwechselnder Belichtung und Dunkelheit durchführen. In gewissen Fällen, wie bei Phyeomyces blakesleeanus wirkt starkes Licht hemmend.
Die zur biologischen Einführung der Hydroxylgruppe in die Steroide erforderliche Zeit wechselt, je nach dem gewünschten Er gebnis, etwa. von einer bis zu 70 Stunden. Die Oxydation beginnt praktisch sofort nach Zusatz zur Kultur eines vollkultivierten Pilzes. Ein Pilz ist in der Regel nach einer Zeit von 4-24 Stunden, je nach dem Grade der Be lüftung, vollkultiviert.
Wenn man das Steroid gleichzeitig mit der Beimpfung dem Fermen tationsmedium zusetzt, sind für einen hohen Umwandlungsgrad längere Zeiten, einschliess lich der Wachstumsperiode erforderlich, was wahrscheinlich darauf beruht, dass die oxydie rende Wirkung des Enzymsystems des Pilzes erst nach einer gewissen Kulturzeit voll ent wickelt ist. Dementsprechend kann man bei Zusatz des Steroids gleichzeitig mit der Be- impfting mit Zeiten von 8-72 Stunden rech nen.
Setzt man anderseits das Steroid der Fermentierungsflüssigkeit nach einer vorange gangenen aeroben Kultur, z. B. nach 16 bis 24 Stunden, zu, so beginnt die Umwandlung des Desoxysteroids in das Oxysteroid sogleich und man erhält innert 1-72, vorzugsweise 24 Stunden oder noch weniger, hohe Ausbeu ten.
Es ist zu bemerken, dass, wenn man das Desoxysteroid der oxydierenden Wirkung des Pilzes oder seiner Enzyme während längerer Zeit aussetzt, eine etwas stärkere Umwand lung in Polyoxyderivate stattfindet; doch wird in jedem Falle eine Hydroxylgruppe ge wöhnlich in 11-Stellung eingeführt.
Die quantitative Bestimmung des Myce- liums als Trockensubstanz erfolgt durch Trocknen eines aliquoten Teils bis zur Ge wichtskonstanz bei 60 C und 736 mm Hg. Gleiche Resultate erhält man, wenn man ohne Vakuum bei 60 C trocknet. Das ermittelte Trockengewicht variiert etwa je nach der Art und Weise der Isolierung des Myceliums. Filtriert man das Medium durch Filterpapier, wird unlösliches Material zusammen mit dem Mycelium zurückgehalten, während bei der Filtration durch ein feines Drahtnetz oft nicht das gesamte Mycelium zurückbleibt.
So können Verschiedenheiten des Filtermaterials das gefundene Mycelgewicht bis zu 1 g/1 beeinträchtigen. Wechselnde Mengen des Be- impfungsmaterials ergaben, auf trockener Basis berechnet, 0,8-6,0 g Mycelium in 24 Stunden pro Liter, während nach 48 Stun- den das Mycelgewieht 1-11 g/1 betrug. Bei gleicher Beimpfung, Medium, Zeit, Tempera tur und Belüftung sind die Ergebnisse sehr gut reproduzierbar.
Unter optimalen Kultur bedingungen, Zusatz des Steroids nach 24stün- diger Pilzkultur und einer Umwandlungszeit von 48 Stunden erhält man etwa 7 g trockenes Mycelium pro Liter Medium.
Ein Zusatz von 0,5 g Steroid, z. B. Proge steron, pro Liter zu einer 24stündigen Kultur des Pilzes im Fermentationsmedium, gefolgt von einer weiteren 24stündigen Umwandlungs- periode, ergab eine weniger als 2 o/aige Um wandlung von Progesteron in Oxyprogesteron mit gleichzeitiger Bildung von 1 g l@lycelitim pro Liter, auf Trockenbasis berechnet.
Erhöhte man die Konzentration des My celiums auf 3,7 g/1, so wurden 401/o des Steroids umge wandelt, und eine noch höhere Beimpfung, die eine Konzentration etwa 6 g/1 My celiuni nach 30stündiger Umwandlung ergab, führte zu einer etwa 86 o/oigen Umwandlung des Steroids in Oxysteroid.
Mit einer Menge von mindestens 0,5 g/1 1llycel auf Trockenbasis, bei mindestens 3stün- diger Fermentation erhält man befriedigende, leicht durch Kristallisation zu reinigende Oxysteroide. Bessere Ergebnisse erhält man bei einer Fermentationsdauer von mindestens 5 Stunden. Bei einer Konzentration des Steroidsubstrates von bis zu 2 g/1 des Me diums und 1-20 g/1 l@lycelium (auf Trocken basis) ist eine Umwandlungsperiode von 5 bis 72 Stunden erwünscht.
Nach Beendigung der oxy dativ en Fermen- tierung können die hydroxy lierten Steroide, z. B. 11-Oxy-steroide, in irgendeiner geeigne ten Weise aus der Fermentationslösung isoliert werden. In den meisten Fällen hat das um gewandelte Steroid die gleiche Anzahl Koh- lenstoffatome im Kohlenstoffskelett wie das Ausgangsmaterial.
Eine besonders bevorzugte Art der Gewinnung der Oxysteroide besteht in der Extraktion des Reaktionsgemisches (Fermentationsflüssigkeit -I- lly cel) mit einem mit Wasser nicht mischbaren Lösungsmittel, wie einem Halogenkohlenwasserstoff, z. B. t4lethylenchlorid, Äthylenchlorid, Chloroform, Äther, Ester, Amylacetat oder dergleichen.
Eine andere geeignete Extraktionsmethode be stellt darin, die Zellen von der Fermentations- flüssigkeit abzutrennen und diese getrennt mit einer mit Wasser mischbaren oder nicht misch baren Flüssigkeit, z. B. Aceton, zu extrahie ren, während man die vom My cel befreite Fermentierungsflüssigkeit mit in Wasser niehtlöslichen Lösungsmitteln extrahiert. Die Zellen können vor oder während der Extrak tion zum Beispiel durch Wärmeeinwirkung oder mittels Chemikalien aufgeschlossen wer den. Wenn man zum Aufschluss der Zellen Wärme verwendet, so kann man das Lösungs mittel, z.
B. Methylenchlorid, als Dampf oder Flüssigkeit in das Gemisch einführen, wodurch die Extraktion mit hohem Wirkungsgrad ver läuft. Die Oxy Steroide können auch über Deri vate, wie z. B. Ester oder Harnstoffaddukte, isoliert werden. Die Extrakte können, zweck mässig nachdem sie nacheinander mit einer alkalischen oder Natriumbikarbonatlösung und Wasser gewaschen wurden, vereinigt wer den, wonach man das Lösungsmittel mit einem Strom von Luft, Sauerstoff oder im Vakuum oder dergleichen vertreibt und den Rüekstand in frischem organischem Lösungsmittel auf nimmt, um ihn umzukristallisieren oder zu reinigen.
Fette und Steroide können über Harnstoffanlagerungsprodukte, die entstehen, wenn man die rohen festen Produkte mit Harn stofflösungen zusammenbringt, voneinander getrennt werden. Eine weitere Kristallisation kann gewünsehtenfalls aus organischen Lö sungsmitteln, z. B. Alkohol, erfolgen. Das kristalline Produkt kann nach dazu bekann ten Methoden identifiziert werden, z. B. durch Elementaranalyse, Schmelzpunkt, Infrarot spektrum, Röntgendiagramm, Ultraviolett spektrum, Mikroverbrennung u. a.. m. Ferner kann man das kristalline Material oder Extrakte aus nichtkristallinem Material nach den Methoden der Papierchromatographie identifizieren, charakterisieren und isolieren.
Aus der Fermentationslösung kann man ausser den Oxy Steroiden vorteilhaft noch andere Fer- mentat.ionsprodukte, wie Citronensäure, Fu- marsäure, Glueonsäure, Ttacönsäure, Milch säure, Enzyme und verschiedene Antibiotica als Nebenprodukte gewinnen.
Der Zusatz von Steroid in der obengenannten Konzentration und Zeiten zu den Medien und unter Bedin gungen, wie sie zur Herstellung von F'umar- säure in den USA-Patenten Nr. 2326986 von Waksman und Nr. 2327191 von Kane und Mitarb. oder zur Herstellung von Milch säure, USA-Patent Nr. 2132712, beschrieben sind, gestattet die Herstellung von Oxystero- iden sowie wertvoller Säuren als Nebenpro dukte.
Die in den Heterofermentierungspro- zessen gebildeten Oxysteroide können aus dem Fermentationsgemisch vor oder nach Beendi gung der Fermentierung von den Nebenpro dukten abgetrennt werden. Nach Entfernung des Oxysteroids, z. B. mit Methylenchlorid oder Triglyceridöl, kann man die Fermentie- rung bis zu ihrem Ende weitergehen lassen.
<I>Beispiel 1:</I> Dioxyprogesteron Zu 4 1 einer 32-48 Stunden alten Kultur von RH 176 (Rhizopus arrhizus-Stamm) gibt man 1 g Progesteron in 50 em3 Aceton, so dass eine Suspension des Steroids entsteht. Die Kultur wird dann bei Zimmertemperatur 48 Stunden bebrütet. Nach dieser Zeit beträgt das pl, des Mediums 3,5.
Die Fermentations- flüssigkeit und das Mycelium werden nachein ander mit je drei Liter, dann mit zwei Liter und wiederum mit einem Liter Methylen- chlorid extrahiert. Die Methylenchlorid- extrakte werden vereinigt, zweimal mit je 400 em3 2 /oiger Natriumbikarbonatlösung und dreimal mit je 500 cm3 destilliertem Wasser gewaschen.
Das Lösungsmittel wird im Va kuum zur Trockne verdampft und die festen Stoffe in 50 cm3 Methylenchlorid aufgenom men. Die Lösung wird in ein 100-cm3-Becher- glas gegeben und mittels eines Luftstromes verdampft. Der Rückstand (1,585 g) wird in 5 em3 heissem Methanol gelöst und langsam auf Zimmertemperatur abkühlen gelassen. Man erhält 75 mg Kristalle vom Smp. 245 bis 249 C. Diese Kristalle werden im folgen den mit U-I bezeichnet.
Man löst sie in 5 em3 Methanol und filtriert in ein Zentrifia- gierröhr. Nach dem Abkühlen erhält man 23 mg der U-I-Kristalle. Die Papierchroma- tographie dieser Kristalle nach Zaffaroni unter Verwendung von Diäthylenglykolmono- äthyläther als stationäre Phase und Methyl- cy elohexan als mobile Phase ergibt einen ein zigen Fleck, der polarer ist als Progesteron.
Die Mikroverbrennung weist daraufhin, dass zwei Hydroxylgruppen an das Progesteron molekül angelagert wurden.
Analyse Ber. für Progesteron: C 80,23; H 9,55 Dioxyprogesteron: C 72,8; H 8,7 U-I gefunden: C 72,8; H 8,6. Die Verbindung U-I zeigt bei der Infra- rotanalyse mehr als eine Oxygruppe, behält aber, wie das Infrarotspektrum ebenfalls zeigt, die ursprüngliche 3-Keto-d4- und 20-Keto- struktur des Progesterons bei.
Die Acetylierung der Verbindung U-I mit 0,3 cm3 Pyridin und 0,3 cm3 Essigsäureanhydrid für 9,0 mg der Verbindung, wobei man die Mischung 16 Stunden bei Zimmertemperatur stehen lässt, 12,5 em3 Wasser zusetzt und nach einstündigem Stehen bei Zimmertemperatur kühlt, um die Kristallisation zu bewirken, ergibt 6,7 mg kristallines Diacetat vom Smp. l45-148 C und 154-155 C, das als U-II, 6,11-Diacetoxy-progesteron, bezeichnet wird.
Die Infrarotunterstichung bestätigt die Ab wesenheit der Hydroxy lgruppe und die An wesenheit neuer Acetoxygruppen.
Die vereinigten Mutterlaugen, die noch 1,5 g feste Anteile der ersten kristallinen Ver bindung U-I enthalten, werden durch Be lüftung vom Lösungsmittel befreit, in 50 cm3 Benzol gelöst und über Tonerde (A1203) wie in Tabelle I gezeigt, chromatographiert. Man verwendet dazu 50g mit Säure gewaschene, bei 45 C getrocknete Tonerde als Adsorptions- mittel und entwickelt die Säule mit 100-cm3- Portionen Lösungsmittel.
Die angegebene Lö- sungsmittelzttsammensetzung bezieht sich auf das gesamte Volumen des gemischten Lösungs mittels in jeder Portion oder Fraktion. Im Papierchromatogramm zeigt die Fraktion A (19 und 20 in Tabelle I) nur eine Stelle, die polarer ist als Progesteron, aber weniger polar als die Verbindung U-1, die in den Frak tionen 21-33 auftritt.
Fraktion A wird in 2 cm-' heissem Metha- nal gelöst und filtriert. Nach Kühlen über Nacht erhält man 171 mg Kristalle einer als U-III bezeichneten Verbindung, die bei 166 bis 167 C schmilzt.
Nach dem Umkristallisie- ren aus 98,7 mg U-III, 11a-Oxy-progesteron, Smp. I.66-167 C; [a] D = + 175,9 (c =1,0127 in Chloroform). Mikroverbrennungen bestäti gen die Anlagerang von einem Atom Sauer stoff an Progesteron.
Analyse Ber. für C2113.03: C = 76,40;H = 9,10 U-III gef.: C = 76,66;H = 8,92. Die Infrarotanaly se zeigt die Anwesenheit einer Hydroxylgruppe und des ursprüng lichen Progesteronmoleküls.
Die Stellung der Oxygruppe in U-III wird als 11-Stellung ermittelt, indem man 30 mor U-III in 0,5 cm3 Eisessig unter Verwendung von 1 em3 Eisessig, der 5 mg Cr03 und 0,005 cm3 Wasser enthält, durch einstündiges Stehenlassen oxydiert.
Dann gibt man einige Tropfen Methanol zu und verdünnt nach 10 Minuten mit Wasser auf 45 cm3, extrahiert die Lösung dreimal mit je 15 cm3 Methylen- ehlorid und verdampft dann das Methylen- ehlorid. Der Rückstand wird aus 0,5 cm3 Me thanol umkristallisiert, wobei man 19 mg eines Triketons, U-IV, vom Smp. 172-175 C;
[a] D = -I-158 in Chloroform und -f-143 in Aceton erhält. Die Triketonstruktur wird durch die Inlra.rotanalyse bestätigt. Weitere Untersuchungen im Infrarotspektrum zeigen, dass die neue Ketogruppe offenbar nur in den Stellungen 1, 7, 11 oder 12 vorhanden sein kann. Es ist aber kein natürliches oder syn thetisches 1-Keto-steroid bekannt.
Die physi kalischen Konstanten des Oxyprogesterons U-III stimmen mit denjenigen des 12a-Oxy- progesterons nicht. überein (Smp. 200-203 C, [a1'7 = + 205 (c = 1,0 in Aceton) ; Wett:
stein, Helv. Chim. Acta., 31, 1963 [1945] ), auch nicht mit denjenigen von 12p)'-Oxy-proge- steron (Smp. 164--167 C, schmilzt nach dem Abkühlen bei 195-198 C wieder; [a] D = + 205 [c = 0,502 in Aceton] ; Reiehstein C. A. 36, 2261 [1942] ). Es bleiben also für die neue Ketogruppe der Verbindung U-VI mir noch die 6- und 11-Stellung übrig.
Ein Vergleich der physikalischen Konstan ten ergibt, dass das Triketon (Verbindung U-VI) 11-Keto-progesteron ist (Smp.l72 bis 175 C; [a]D = -f- 258 8 [c = 0,9 in Aceton]; Reichstein, Helv. Chim. Acta, 23, 684 [1940] ; ibid. 26, 721 [1942] ).
Ein Vergleich des Produktes mit echtem 11-Ketoprogesteron durch Infrarotspektren, Röntgendiffraktion, Papierehromatographie und Schmelzpunkts- untersttchungen erweist die Identität der Ver bindungen.
Die physikalischen Konstanten und Infra- rotspektren der Verbindung U-III stimmen mit denjenigen von 11fl-Oxy-progesteron (Smp. 187-188 ; [a] D = -!- 222-225 [c = 1,75 in Aceton] ; Shoppee und Reichstein, Helv. Chim. Acta, 24, 351-60 [1941]) nicht überein.
Da U-VI zeigt, dass der eingeführte Sauerstoff in 11-Stellung ist, muss U-III 11a-Oxy-proge- steron sein.
20 mg der Verbindung U-III werden unter Verwendung von 0,6 cm3 Pyridin und 0,6 cm3 Essigsäureanhydrid acetyliert. Nach 16 Stun den Stehen bei Zimmertemperatur werden 25 cms Wasser zugesetzt. Nach einer Stunde wird gekühlt, um die Kristallisation herbei zuführen, die gebildeten Kristalle werden mit Wasser gewaschen und getrocknet. Man erhält 16,1 mg eines Monoacetates, 11a-Acetoxy- progesteron, U-V, vom Smp. 175-177 C.
Die Infrarotanalyse zeigt die Abwesenheit der Hydroxylgruppe und die Anwesenheit einer neuen Acetoxygruppe an.
Analyse Ber. für C23H3204: C 74,00; H 8,85, Gef.: C 74,33; H 8,78.
EMI0009.0056
<I>Tabelle <SEP> I</I>
<tb> A120 <SEP> Chromatographie <SEP> von <SEP> biologisch <SEP> umgewandeltem <SEP> Progesteron
<tb> (unter <SEP> Verwendung <SEP> des <SEP> Organismus <SEP> RH <SEP> 176)
<tb> Eluierte
<tb> Fraktion <SEP> Lösungsmittel <SEP> Feststoffe <SEP> Papierchromatographie
<tb> mg
<tb> 1 <SEP> Benzol <SEP> 0
<tb> 2 <SEP> Benzol <SEP> 182,2 <SEP> Keine <SEP> Flecken
<tb> 3 <SEP> Benzol <SEP> plus <SEP> 5 <SEP> % <SEP> Äther <SEP> 123,0
<tb> 4 <SEP> Benzol <SEP> plus <SEP> 5% <SEP> Äther <SEP> 246,6
<tb> 5 <SEP> Benzol <SEP> plus <SEP> 10% <SEP> Äther <SEP> 162,9 <SEP> Keine <SEP> Flecken
<tb> 6 <SEP> Benzol <SEP> plus <SEP> 10% <SEP> Äther <SEP> 18,
0
<tb> 7 <SEP> Benzol <SEP> plus <SEP> <B>10%</B> <SEP> Äther <SEP> 11,2
<tb> 8 <SEP> Benzol <SEP> plus <SEP> <B>500/9</B> <SEP> Äther <SEP> 128,2 <SEP> Keine <SEP> Flecken
<tb> 9 <SEP> Benzol <SEP> plus <SEP> 50% <SEP> Äther <SEP> 33,6
<tb> 10 <SEP> Äther <SEP> 16,1
<tb> 11 <SEP> Äther <SEP> 15,4
<tb> 12 <SEP> Äther <SEP> plus <SEP> 5% <SEP> CHCIs <SEP> 3,8
<tb> 13 <SEP> Äther <SEP> plus <SEP> 5% <SEP> CHC13 <SEP> 2,0
<tb> 14 <SEP> Äther <SEP> plus <SEP> 10% <SEP> CHC13 <SEP> 3,4
<tb> 15 <SEP> Äther <SEP> plus <SEP> 10% <SEP> CHC13 <SEP> 3,6
<tb> 16 <SEP> Äther <SEP> plus <SEP> 50% <SEP> CHC13 <SEP> 3,5
<tb> 17 <SEP> Äther <SEP> plus <SEP> 50% <SEP> CHC13 <SEP> 2,1
<tb> 18 <SEP> CHCl3 <SEP> 2,5
EMI0010.0001
<I>Tabelle <SEP> I</I> <SEP> (Fortsetzung)
<tb> Eluierte
<tb> Fraktion <SEP> Lösungsmittel <SEP> Feststoffe <SEP> Papierchromatographie
<tb> mg
<tb> Fraktion <SEP> A <SEP> (19 <SEP> -f- <SEP> 20)
<tb> 19 <SEP> CHC13 <SEP> 222,6 <SEP> Nur <SEP> ein <SEP> Fleck, <SEP> der <SEP> polarer <SEP> ist <SEP> als
<tb> 20 <SEP> CHC13 <SEP> plus <SEP> 50/a <SEP> Aceton <SEP> 167,9 <SEP> Progesteron.
<SEP> Mischung <SEP> von <SEP> 2 <SEP> Flek lien, <SEP> 1 <SEP> gleich <SEP> wie <SEP> Fraktion <SEP> 20, <SEP> der
<tb> andere <SEP> polarer <SEP> als <SEP> Fraktion <SEP> 20
<tb> 21 <SEP> CHC13 <SEP> plus <SEP> 5 <SEP> % <SEP> Aceton <SEP> 23,5
<tb> 22 <SEP> CHC13 <SEP> plus <SEP> 10% <SEP> Aceton <SEP> 17,3
<tb> 23 <SEP> CHC13 <SEP> plus <SEP> 10% <SEP> Aceton <SEP> 8,7 <SEP> Nur <SEP> langsamst <SEP> bewegender <SEP> Fleck
<tb> 24 <SEP> CHC13 <SEP> plus <SEP> 50% <SEP> Aceton <SEP> 30,9
<tb> 25 <SEP> CHC13 <SEP> plus <SEP> 50% <SEP> Aceton <SEP> 6,1
<tb> 26 <SEP> Aceton <SEP> 13;
0 <SEP> Nur <SEP> langsamst <SEP> bewegender <SEP> Fleck
<tb> 27 <SEP> Aceton <SEP> 8,4
<tb> 28 <SEP> Aceton <SEP> plus <SEP> 5% <SEP> Methanol <SEP> 25,0
<tb> 29 <SEP> Aceton <SEP> plus <SEP> 5% <SEP> Methanol <SEP> 4,6
<tb> 30 <SEP> Aceton <SEP> plus <SEP> 10% <SEP> Methanol <SEP> 7,4
<tb> 31 <SEP> Aceton <SEP> plus <SEP> 10% <SEP> Methanol <SEP> 1,4
<tb> 32 <SEP> Aceton <SEP> plus <SEP> 50% <SEP> Methanol <SEP> 8,1
<tb> 33 <SEP> Aceton <SEP> plus <SEP> 50% <SEP> Methanol <SEP> 5,3 <I>Beispiel 2:</I> Oxy-progesteron Zu einer 24stündigen Kultur des Orga nismus RH 176 (Rhizopus-arrhizus-Stamm) in 4,0 1 Medium gibt man 1 g Progesteron in 50 cm3 Aceton.
Nach 24 Stunden Bebrüten und Schütteln mit Luft wird die Fermenta- tionslösung wie im Beispiel 1 extrahiert. Die Methylenchloridextrakte werden zweimal mit 300 em3 2%iger Natriumbikarbonatlösung und zweimal mit 500 em3 destilliertem Wasser gewaschen und die vereinigten Extrakte über möglichst wenig wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet.
6 cm3 dieser Lösung, entsprechend 2 mg des ursprünglichen Progesterons, werden unter Verwendung der gleichen Lösungs mittel wie im Beispiel 1 papierehromatogra- phiseh untersucht. Es gibt sieh daraus, dass starke Umwandlung in 11a-Oxy-progesteron. stattgefunden hat. Der restliche Methylen- chloridextrakt wird im Luftstrom zur Trockne verdampft.
Der feste Rückstand (1,584 g) wird in 100 cm3 Benzol gelöst und eine un lösliche Fraktion von 145 mg abfiltriert. Der Schmelzpunkt dieser Verbindung ist 190 bis 230 C.. Aus der unlöslichen Fraktion erhält man insgesamt 90 mg kristalline Verbindung U-1 vom Smp. 230-240 C durch Auflösen von 145 mg derselben in 20 cm3 Aceton, Ein engen der Lösung auf 10 cm3 und Kühlen.
Bei der Papierchromatographie nach Zaffa- roni und der Schmelzpunktsbestimmung er weisen sich die Kristalle als die Dioxyverbin- dung, 6,11-Dioxy-progesteron, Verbindung U-I. Das 1,439 g festes Material enthaltende Filtrat wird über einer Tonerdesäule (A1203) nach der im Beispiel 1 beschriebenen Technik chromatographiert (Tabelle II)
. Zur Ent wicklung der Säule verwendet man 100-cm3- Portionen der Lösungsmittel. Die Fraktion B der chromatographischen Trennung (Tabelle II) enthält 571 mg 11a-Oxy-progesteron (Ver bindung U-III) und wird in 20 em3 Methanol gelöst, dann mit 20 cm3 Wasser versetzt, er wärmt und im Kühlschrank gekühlt. Man gibt weitere 20 em3 Wasser zu und setzt die Küh lung fort.
Es tritt Kristallisation ein, und man erhält 300 mg trockene Kristalle des 11a-Oxy- progesterons (Verbindung U-III) vom Smp. 165-166 C.
Eine Zusammenstellung einer Anzahl biolo gischer Oxydationen findet sich in Tabelle III.
EMI0011.0007
<I>Tabelle <SEP> II</I>
<tb> A1203 <SEP> Chromatogramm <SEP> von <SEP> biologisch <SEP> umgewandeltem <SEP> Progesteron
<tb> unter <SEP> Verwendung <SEP> des <SEP> Organismus <SEP> RH <SEP> 176
<tb> Eluierte
<tb> Fraktion <SEP> Lösungsmittel <SEP> Feststoffe <SEP> Papierchromatogramm
<tb> mg
<tb> 1 <SEP> Benzol <SEP> 208
<tb> 2 <SEP> Benzol <SEP> 12
<tb> 3 <SEP> Benzol <SEP> plus <SEP> 5% <SEP> Äther <SEP> 4
<tb> 4 <SEP> Benzol <SEP> plus <SEP> 5% <SEP> Äther <SEP> 14
<tb> 5 <SEP> Benzol <SEP> plus <SEP> 10% <SEP> Äther <SEP> 37
<tb> 6 <SEP> Benzol <SEP> plus <SEP> 10% <SEP> Äther <SEP> 19
<tb> 7 <SEP> Benzol <SEP> plus <SEP> 50% <SEP> Äther <SEP> 7
<tb> 8 <SEP> Benzol <SEP> plus <SEP> 50% <SEP> Äther <SEP>
19
<tb> 9 <SEP> Äther <SEP> 4
<tb> 10 <SEP> Äther <SEP> 16
<tb> 17. <SEP> Äther <SEP> plus <SEP> 5% <SEP> CHC13 <SEP> 8
<tb> 1.2 <SEP> Äther <SEP> plus <SEP> 5 <SEP> 0/a <SEP> <B>CHCI3</B> <SEP> 4
<tb> 13 <SEP> Äther <SEP> plus <SEP> 10% <SEP> <B>CHCI3</B> <SEP> 0
<tb> 14 <SEP> Äther <SEP> plus <SEP> 10% <SEP> <B>CHCI3</B> <SEP> 0
<tb> 15 <SEP> Äther <SEP> plus <SEP> 50% <SEP> CHC13 <SEP> 4
<tb> 16 <SEP> Äther <SEP> plus <SEP> 50% <SEP> <B>CHCI3</B> <SEP> 2
<tb> 17 <SEP> CHCl3 <SEP> 11 <SEP> Fraktion <SEP> B <SEP> (19 <SEP> + <SEP> 20)
<tb> 18 <SEP> <B>CHCI3</B> <SEP> 265 <SEP> Einziger <SEP> Fleck <SEP> von <SEP> 11a-Oxy-proge 19 <SEP> CHCl3 <SEP> plus <SEP> <B>5()
/o</B> <SEP> Aceton <SEP> 235 <SEP> steron <SEP> plus <SEP> Spuren <SEP> von <SEP> drei <SEP> andern
<tb> 20 <SEP> CHC13 <SEP> plus <SEP> <B>51/o</B> <SEP> Aceton <SEP> 60 <SEP> sich <SEP> langsamer <SEP> bewegenden <SEP> Ver 21 <SEP> CHC13 <SEP> plus <SEP> 10% <SEP> Aceton <SEP> 16 <SEP> bindungen
<tb> Mischung <SEP> von <SEP> bioxy-progesteron
<tb> 22 <SEP> <B>CHCI3</B> <SEP> plus <SEP> 10% <SEP> Aceton <SEP> 22 <SEP> und <SEP> zwei <SEP> stärker <SEP> polaren <SEP> Verbin dungen
<tb> 23 <SEP> <B>CHCI3</B> <SEP> plus <SEP> 50% <SEP> Aeeton <SEP> 27 <SEP> I <SEP> Gleich <SEP> wie <SEP> Fraktion <SEP> 22,
<SEP> aber <SEP> weni 24 <SEP> CHCl3 <SEP> plus <SEP> 50% <SEP> Aceton <SEP> 37 <SEP> ger <SEP> der <SEP> 2 <SEP> Flecken <SEP> von <SEP> 22 <SEP> und <SEP> mehr
<tb> eines <SEP> dritten <SEP> und <SEP> vierten
<tb> 25 <SEP> Aceton <SEP> 29 <SEP> Verbindung <SEP> weniger <SEP> polar <SEP> als <SEP> die
<tb> 26 <SEP> Aeeton <SEP> 43 <SEP> 2 <SEP> Flecken <SEP> in <SEP> 22, <SEP> aber <SEP> polarer <SEP> als
<tb> 11a-Oxy-progesteron
<tb> 27 <SEP> Aceton <SEP> plus <SEP> 5% <SEP> Methanol <SEP> 16
<tb> 28 <SEP> Aceton <SEP> plus <SEP> 5% <SEP> Methanol <SEP> 24
EMI0012.0001
<I>Tabelle <SEP> II</I> <SEP> (Fortsetzung)
<tb> Eluierte
<tb> Fraktion <SEP> Lösungsmittel <SEP> Feststoffe <SEP> Papierchromatogramm
<tb> mg
<tb> 29 <SEP> Aceton <SEP> plus <SEP> 10% <SEP> Methanol <SEP> 4
<tb> 30 <SEP> Aceton <SEP> plus <SEP> 10% <SEP> Methanol <SEP> 0
<tb> 31 <SEP> Aceton <SEP> plus <SEP> 501/o <SEP> Methanol <SEP> 1
<tb> 32 <SEP> Aceton <SEP> plus <SEP> 501/o <SEP> Methanol <SEP> 23
<tb> 33 <SEP> Methanol <SEP> 9
<tb> <I>Tabelle <SEP> III</I>
<tb> Fermentation <SEP> Aus <SEP> der <SEP> A1203-Säule <SEP> gewonnene <SEP> Fraktionen
<tb> Eingesetztes <SEP> Volumen <SEP> ngesetztes <SEP> der <SEP> Inkubations- <SEP> Progesteron <SEP> lla-Oxy- <SEP> Dioxy- <SEP> Andere
<tb> Lmwandlungs Progesteron <SEP> zeit <SEP> progesteron <SEP> progesteron
<tb> mg <SEP> Mischung <SEP> h <SEP> mg <SEP> mg <SEP> mg <SEP> produkte
<tb> 1 <SEP> mg
<tb> 1000 <SEP> 4 <SEP> 48 <SEP> 0 <SEP> 391 <SEP> 142
<SEP> 18
<tb> 1200 <SEP> 4 <SEP> 67 <SEP> 0 <SEP> 507 <SEP> 222 <SEP> 95
<tb> 1000 <SEP> 4 <SEP> 24 <SEP> 0 <SEP> 571 <SEP> 225 <SEP> 94
<tb> 1000 <SEP> 4 <SEP> 30 <SEP> 0 <SEP> 471 <SEP> 265 <SEP> 120
<tb> 3000 <SEP> 10 <SEP> 24 <SEP> 1520 <SEP> 1260 <SEP> 76 <I>Beispiel 3:</I> 11-Oxy-steroide In gleicher Weise, wie oben angegeben, wurden die in Tabelle IV genannten Steroide in 11-Stellung oxydiert. Die Einzelheiten fin den sich in der Tabelle IV.
<I>Beispiel 4</I> 300 cm3 eines Nährmediums, das 21/o Edamin, 5% Dextrose und Macerierungsflüs- sigkeit von Mais enthält und das PH 6,5 be sitzt, werden mit Sporen des Organismus RH 176 beimpft und 24 Stunden unter aero- ben Bedingungen bewegt.
Von diesem Medium gibt man Proben von je 20 cm3 in sterile 100-em3-Kolben und gibt zu jeder Probe etwa 6 mg der folgenden Steroidsubstrate in höch stens 0,3 em3 Aceton gelöst, so dass eine feine Suspension des Steroids entsteht. Nach 24 Stunden wird der Kolbeninhalt extrahiert, um die Änderung mittels Papierchromatogramm festzustellen. In Tabelle V sind die behandel ten Steroide sowie das prr gerade vor Beginn der Extraktion angegeben.
EMI0013.0001
EMI0014.0001
EMI0015.0001
EMI0016.0001
EMI0017.0001
<I>Tabelle <SEP> V</I>
<tb> Steroid <SEP> End-p.
<tb> 1. <SEP> 4-Androsten-3,17-dion <SEP> 3,75
<tb> 2. <SEP> Cholestenon <SEP> 4,12
<tb> 3. <SEP> Ergosteron <SEP> 3,9
<tb> 4. <SEP> Ergosterol <SEP> 3,6
<tb> 5. <SEP> 3f,21-Diaeetoxy-5-pregnen-20-on <SEP> 3,75
<tb> 6. <SEP> 3ss-Acetoxy-5-pregnen-20-on <SEP> 3,9
<tb> 7. <SEP> Stigmasta-4,22-dien-3-on <SEP> 3,4
<tb> B. <SEP> Dehydroergosteryl-dioxido-Malein säureanhydrid-Addukt <SEP> 3,85
<tb> 9. <SEP> 3-Acetoxy-5,7,9(11) <SEP> -pregnatrien 20-on-Maleinsäureanhydrid-Addukt <SEP> 3,8 <I>Beispiel 5:
</I> 11-Oxy-steroide Die Mikroorganismen werden in einem Medium gezüchtet, das 20 g Edamin, 5 cm3 Maismaeerationsflüssigkeit, 50 g Dextrose, mit Leitungswasser auf 1 1 verdünnt, enthält, und dessen pli auf 6,5 eingestellt wurde, bevor man es bei 120 C etwa 20 Minuten sterili sierte.
Die Nährmedien werden mit Kulturen der Organismen beimpft, die aus Sporen auf einem Medium, das 10 1/o getrockneten Malzextrakt und 2 % Agar enthielt, gezüchtet wurden. Jeder Kolben enthielt 30 cm3 des Mediums.
Die Kolben werden unter aeroben Bedin gungen 24 Stunden bei Zimmertemperatur ge schüttelt, und dann eine gewisse Menge Steroidsubstrat in Form einer 2 Gewichts prozent pro Volumen Aceton enthaltenden Lösung zugesetzt und bei Zimmertemperatur weitere 24 Stunden geschüttelt. Man verwen det für je 30 em3 Medium 6 mg Steroid.
Die Mischung wird dann dreimal mit Methylenchlorid extrahiert, wobei man jedes mal ein gleiches Volumen Methylenchlorid verwendet wie das der wässrigen Phase. Der Extrakt wird abgetrennt, mit 2 o/oiger Na triumbikarbonatlösung und destilliertem Was ser gewaschen. Die Lösungsmittelschicht wird eingedampft und der Rückstand nach der Methode der Papierstreifenchromatographie geprüft. Die eingesetzten Steroide wurden alle durch den verwendeten Organismus oxydiert. Tabelle VI zeigt den geprüften Pilz und das verwendete Steroidsubstrat.
EMI0017.0020
<I>Tabelle <SEP> VI</I>
<tb> Steroid: <SEP> Progesteron
<tb> Amerikan.
<tb> Organismus <SEP> Kulturtyp Sammlung
<tb> Nr.
<tb> 1. <SEP> Mucor <SEP> rouxii <SEP> 4857
<tb> 2. <SEP> Mucor <SEP> griseo-cyanus <SEP> (-h) <SEP> 1207a
<tb> 3. <SEP> Mucor <SEP> griseo-cyanus <SEP> (-) <SEP> 1207b
<tb> 4. <SEP> Mucor <SEP> hiemalis <SEP> var. <SEP> albus <SEP> 6800
<tb> 5. <SEP> Mucor <SEP> hiemalis <SEP> 8690
<tb> 6. <SEP> Mucor <SEP> mucedo <SEP> 9836
<tb> 7. <SEP> Mucor <SEP> mucedo <SEP> 9635
<tb> B. <SEP> Mucor <SEP> mucedo <SEP> 7941
<tb> 9. <SEP> Rhizopus <SEP> nigricans <SEP> 10404
<tb> 10. <SEP> Rhizopus <SEP> nigricans <SEP> 7577
<tb> 11. <SEP> Rhizopus <SEP> nigricans <SEP> (-I-) <SEP> 6227a
<tb> 12. <SEP> Rhizopus <SEP> nigricans <SEP> (-) <SEP> 6227b
<tb> 13. <SEP> Rhizopus <SEP> chinensis <SEP> (-) <SEP> 1227b
<tb> 14.
<SEP> - <SEP> Rhizopus <SEP> japonicus <SEP> 8446
<tb> 15. <SEP> Rhizopus <SEP> oryzae <SEP> 10260
<tb> 16. <SEP> Rhizopus <SEP> oryzae <SEP> 9363
<tb> Steroid: <SEP> 11-Desoxycorticosteron
<tb> 17. <SEP> Mucor <SEP> rouxii <SEP> 4857
<tb> 18. <SEP> Mucor <SEP> griseo-cyanus <SEP> (-I-) <SEP> 1207a
<tb> 19. <SEP> Mucor <SEP> griseo-cyanus <SEP> (-) <SEP> 1207b Die Prüfung der vorerwähnten Organis men mit 11-Desoxycorticosteron, 17-Oxyproge- steron und 11-Desoxy-17-oxycorticosteron gibt gleiche Resultate, das heisst Einführung einer Hydroxylgruppe in den Steroidkern.
Desgleichen erhält man das gleiche Ergeb nis bei Behandlung von Progesteron, 11-Des- oxycorticosteron, 11- Desoxy -17 - oxycortico- steron und 17-Oxyprogesteron mit folgenden Pilzen:
Mucor genevensis, plumbeus, parasi- ticus, dubius, javanicus, adventitius, micro- sporus, rouxianus, racemosus;
Rhizopus re- flexus, shanghaiensis, tritici, cohenii, delemar, tonkinensis, kazanensis; Phycomyces blakes- leeanus, theobromatus; Absidia glauca;
Zygo- rhynchus moelleri, heterogamus und Synce- phalus nodosa. <I>Beispiel 6:
</I> 11a-Oxy-progesteron Ein Medium wird aus 20 g Edamin (enzy matisch abgebautes Lactalbumin), 3 g Macera- tionsflüssigkeit von Mais und 50 g Dextrose, mit Leitungswasser auf 1 1 verdünnt und auf PH 4,3-4,5 eingestellt, hergestellt. 12 Liter dieses sterilisierten Mediums werden mit Rhizopus nigricans (-);
ATCC Nr. 6227b beimpft und 24 Stunden bei 28 C kultiviert, indem man so belüftet und rührt, dass die Sauerstoffaufnahme 6,3-7 Millimol pro Liter Na2S03 pro Stunde, nach der Methode von Cooper, Fernstrom und Miller, Ind. Eng. Chem., 36, 504 (1944), bestimmt, beträgt. Zu diesem Medium gibt man dann 6 g Progesteron in 150 cm3 Aceton, so dass eine Suspension des Steroids im Medium entsteht. Nach weiteren 24 Stunden Kultivierung unter den gleichen Temperatur- und Belüftungsbedingungen werden Flüssigkeit und Mycelium extra hiert.
Das Mycelium wird abfiltriert, zweimal mit etwa seinem Volumen Aceton ausgewaschen und dann zweimal mit etwa seinem Volumen Methylenehlorid extrahiert. Die Aceton- und Methylenchloridextrakte werden der Flüssigkeit zugesetzt und die Mischung nacheinander zweimal mit ihrem halben Volumen Methylenchlorid, dann zwei mal mit je einem Viertelvolumen Methylen- chlorid extrahiert.
Die vereinigten Methylen- ehloridextrakte werden mit einem Zehntel ihres Volumens 2 o/oiger Natriumbikarbonat- lösung und dann zweimal mit je einem Zehn telvolumen Wasser gewaschen. Nach dem Trocknen der Methylenchloridlösungen mit etwa 3-5 g wasserfreiem Natriumsulfat pro Liter und Filtrieren wird das Lösungsmittel abdestilliert. Der Rückstand wird in möglichst wenig Methylenehlorid aufgenommen, filtriert und das Lösungsmittel verdampft.
Die erhal tenen rohen Kristalle werden getrocknet und dann fünfmal mit je 5 cm3 Äther pro Gramm Rohkristalle gewaschen; Ausbeute 5,072 g Kristalle vom Smp. 165-168 C. Nach Um kristallisieren aus Methanol erhält man 311 mg 11a-Oxy-progesteron vom Smp. 166-168 C, [a]D = + 180 (c = 1,0127 in Chloroform); k242 46,72.
Analyse: Ber. für C21H3003: C 76,40;<B>1-1</B> 9,10 Gefunden: C 76,77; H 8,92 <I>Beispiel i</I> 11a,17a,21-Trioxy-4-pregnen-3,20-dion (Verbin dung epi-F) aus 17a,21-Dioxy-4-pregnen- 3,20-dion (Verbindung S) Nach dem Verfahren des Beispiels 6 erhält man nach 96stündiger Behandlung von 2 g 17a,21-Dioxy-4-pregnen-3,>0-dion mit Rhizopus nigricans ATCC 6227b und Extraktion 4,988 g eines halbkristallinen Extraktes.
Dieser ge trocknete Extrakt wird viermal mit je 6 cm3 eiskaltem Methylenehlorid verrieben. Es ver bleiben 630 mg unlösliche Kristalle vom Smp. 194-199 C. Nach dem Un-AzristalllSie- ren aus 3 cm3 Methanol und 10 cm3 Äther erhält man 404 mg Kristalle vom Smp. 205 bis 210 C.
Zwei weitere Umkristallisationen aus den gleichen Lösungsmitteln ergeben 132 mg 11a,17a,21-Trioxy-4-pregnen-3,20-dion mit dem konstanten Smp. 209-212 C und 217 bis 219 C je nach der Kristallform [a]D = -f- 113 (e = 1,568 in Methanol). Analyse Ber. für C21113005: C 69,58; H 8,35 Gefunden: C 69,26; H 8,34 Man kann auch 17a-Oxy-21-acetoxy-4- pregnen-3,20-dion mit gleich gutem Ergebnis als Ausgangsmaterial verwenden.
Die Oxydation von 1.1a,17a,21-Trioxy-4- pregnen-3,20-dion mit Cr03 in Eisessig mit. anschliessender Extraktion mit Äther und Waschen mit. Wasser ergibt Androsteron vom Smp. 217-220 C.
Analyse Ber. für C10112403: C 75,96; H 8,05 Gefunden: C 75,61; H 8,10 Das 11,21-Diacetat der Verbindung epi-F schmilzt bei 198-202 ; [a]D = + 115 (c = 1,145 in Chloroform), k240 33,33. Das Infrarotspektrum bestätigt die Struktur.
Analyse Ber. für C25112407 : C 67,24;<B>1V7,67</B> Gefunden: C 67,43; H 7,94 <I>Beispiel 8:</I> 14a-Oxy-progesteron Unter den gleichen Fermentations- und Extraktionsbedingungen wie im Beispiel 6 gibt man zu 12 1 des Mediums, das eine 20stün- dige Kultur von Mucor parasitious, ATCC 6176, enthält, 3 g Progesteron in möglichst wenig Alkohol.
Nach weiterer 48stündiger Kultur ergibt die Extraktion der Flüssigkeit und des My eels 1,667 g eines öligen Rück standes, der in 150 cm3 Benzol gelöst und über 220 g Tonerde (mit Säure gewaschen und bei 120 C getrocknet) chromatographiert wird, wobei man je 200 cm3 Portionen der aus Tabelle VII ersichtlichen Lösungsmittel verwendet.
EMI0019.0015
<I>Tabelle <SEP> VII</I>
<tb> Eluat Fraktion <SEP> Lösungsmittel <SEP> Feststoffe
<tb> in <SEP> mg
<tb> 1 <SEP> Benzol <SEP> 73,0
<tb> 2 <SEP> Benzol <SEP> 26,5
<tb> 3 <SEP> Benzol <SEP> plus <SEP> 5% <SEP> Äther <SEP> 28,0
<tb> 4 <SEP> Benzol <SEP> plus <SEP> <B>51/9</B> <SEP> Äther <SEP> 21,5
<tb> 5 <SEP> Benzol <SEP> plus <SEP> 20% <SEP> Äther <SEP> 35,0
<tb> 6 <SEP> Benzol <SEP> plus <SEP> 201/o <SEP> Äther <SEP> 27,5
<tb> 7 <SEP> Benzol <SEP> plus <SEP> 50% <SEP> Äther <SEP> <B>17,0</B>
<tb> 8 <SEP> Benzol <SEP> plus <SEP> 50% <SEP> Äther <SEP> 6,5
<tb> 9 <SEP> Äther <SEP> 4,5
<tb> 10 <SEP> Äther <SEP> 5,0
<tb> 1.1 <SEP> Äther <SEP> plus <SEP> 5% <SEP> CHC13 <SEP> 7,5
<tb> 12 <SEP> Äther <SEP> plus <SEP> 50/a <SEP> <B>CHCI3</B> <SEP> 9,5
<tb> 13 <SEP> Äther <SEP> plus <SEP> 101/o <SEP> <B>CHCI3</B> <SEP> 1839,
0
<tb> 7.4 <SEP> Äther <SEP> plus <SEP> 10% <SEP> <B>CHCI3</B> <SEP> 605,5
<tb> 15 <SEP> Äther <SEP> plus <SEP> 20% <SEP> <B>CHCI3</B> <SEP> 356,0
<tb> 16 <SEP> Äther <SEP> plus <SEP> 20% <SEP> CHC13 <SEP> 336,5
<tb> 17 <SEP> Äther <SEP> plus <SEP> 50% <SEP> <B>CHCI3</B> <SEP> 331,0
<tb> 18 <SEP> Äther <SEP> plus <SEP> 50% <SEP> CHC13 <SEP> 269,5
<tb> 19 <SEP> Äther <SEP> plus <SEP> 50% <SEP> <B>C1-1C13</B> <SEP> 94,0
<tb> 20 <SEP> <B>CHCI3</B> <SEP> 68,0
<tb> 21 <SEP> <B>CHCI3</B> <SEP> 22,0
<tb> 22 <SEP> CHCl3 <SEP> 15,0
<tb> 23 <SEP> CHCl3 <SEP> plus <SEP> 5 <SEP> % <SEP> Aceton <SEP> 18,0
<tb> 24 <SEP> <B>CHCI3</B> <SEP> plus <SEP> 5 <SEP> % <SEP> Aceton <SEP> 8,0
<tb> 25 <SEP> <B>CHCI3</B> <SEP> plus <SEP> <B>10</B> <SEP> % <SEP> Aceton <SEP> 12,
5
EMI0019.0016
Eluat Fraktion <SEP> Lösungsmittel <SEP> Feststoffe
<tb> in <SEP> mg
<tb> 26 <SEP> <B>CHCI3</B> <SEP> plus <SEP> 10% <SEP> Aceton <SEP> 9,0
<tb> 27 <SEP> <B>CHCI3</B> <SEP> plus <SEP> 50% <SEP> Aceton <SEP> 26,5
<tb> 28 <SEP> CHCl3 <SEP> plus <SEP> 50% <SEP> Aceton <SEP> 29,5
<tb> 29 <SEP> Aceton <SEP> 62,0
<tb> 30 <SEP> Methanol <SEP> 77,0 Die Fraktion 13 wird in 20 cm3 Aceton gelöst und filtriert, um unlösliches suspen diertes Material abzutrennen. Das klare Fil trat wird konzentriert und tropfenweise Äther zugesetzt, bis die Kristallisation beginnt. Beim Kühlen scheiden sich 585,5 mg Kristalle vom Smp. 182-l94 ' C ab.
Eine Portion von 85 mg dieser Kristalle wird während 2 Tagen bei 165 C in einem Vakuum von 0,05 mm Hg sublimiert, wobei 5 mg eines öligen Rückstandes verbleiben. Das Sublimat wird aus 3 cm3 Aceton durch Zusatz von Hexan umkristallisiert und man erhält 14a-Oxy-progesteron vom Smp. 195 bis 200,5 C, [a123 = + 188 (c = 1,036 in Chloro form).
Analyse Ber. für CziH3o04: C 76,40; H 9,15 Gefunden: C 77,02; H 9,55 <I>Beispiel 9:</I> 14-Oxy-progesteron Unter sonst gleichen Bedingungen wie im Beispiel 6 gibt man zu 5 1 eines Mediums, das eine 24 Stunden bei 25 C gezüchtete Kul tur von. Mucorgrieseo cyanus, ATCC 1207a, enthält, 5 g in möglichst wenig Äthanol ge löstes Progesteron. Nach einer Kultur von weiteren 24 Stunden ergibt die Extraktion 4,815 g feste Produkte. Diese werden mit Skellysolve B verrieben, wonach 3,322 g zurückbleiben, die mit Äther von Fett befreit werden.
Der in Äther unlösliche Rückstand wird über 85 g aktivierter Tonerde (mit Salz säure gewaschen, mit Wasser gespült und 4 Stunden bei 120 C getrocknet) chromato- graphiert, wobei man je 170 cm3 Lösungs mittel gemäss Tabelle VIII verwendet.
EMI0020.0001
<I>Tabelle <SEP> VIII</I>
<tb> Eluat Fraktion <SEP> Lösungsmittel <SEP> Feststoffe
<tb> in <SEP> mg
<tb> 1 <SEP> Benzol <SEP> 1,1
<tb> 2 <SEP> Benzol <SEP> 0,4
<tb> 3 <SEP> Benzol <SEP> plus <SEP> 5 <SEP> % <SEP> Äther <SEP> <B>3,9-</B>
<tb> 4 <SEP> Benzol <SEP> plus <SEP> 5 <SEP> % <SEP> Äther <SEP> 1,3
<tb> 5 <SEP> Benzol <SEP> plus <SEP> 10 <SEP> % <SEP> Äther <SEP> 6 <SEP> Benzol <SEP> plus <SEP> 10 <SEP> % <SEP> Äther <SEP> 96,0
<tb> 7 <SEP> Benzol <SEP> plus <SEP> 50 <SEP> % <SEP> Äther <SEP> 259,6
<tb> 8 <SEP> Benzol <SEP> plus <SEP> 50 <SEP> % <SEP> Äther <SEP> 21.5,8
<tb> 9 <SEP> Äther <SEP> 143,5
<tb> 10 <SEP> Äther <SEP> 84,3
<tb> 11 <SEP> Äther <SEP> plus <SEP> 5% <SEP> CHCI3 <SEP> 104,4
<tb> 12 <SEP> Äther <SEP> plus <SEP> 5% <SEP> CHCI3 <SEP> 66,9
<tb> 13 <SEP> Äther <SEP> plus <SEP> 10% <SEP> CHCI3 <SEP> 18,
5
<tb> 14 <SEP> Äther <SEP> plus <SEP> <B>100/a</B> <SEP> CHCI3 <SEP> 8,1
<tb> 15 <SEP> Äther <SEP> plus <SEP> <B>500/9</B> <SEP> CHCI3 <SEP> 2,4
<tb> 16 <SEP> Äther <SEP> plus <SEP> 501/o <SEP> CHCI3 <SEP> 11,6
<tb> 17 <SEP> Äther <SEP> plus <SEP> 501/o <SEP> CHCI3 <SEP> 13,2
<tb> 18 <SEP> Äther <SEP> plus <SEP> <B>50%</B> <SEP> CHCI3 <SEP> 9,4
<tb> 19 <SEP> CHC13 <SEP> 39,0
<tb> 20 <SEP> CHCl3 <SEP> 474,4
<tb> 21 <SEP> CHC13 <SEP> 81,6
<tb> 22 <SEP> CHCI3 <SEP> 40,5
<tb> 23 <SEP> CHC13 <SEP> plus <SEP> 5 <SEP> % <SEP> Aceton <SEP> 2-1,1
<tb> 24 <SEP> Aceton <SEP> 22,7
<tb> 25 <SEP> Methanol <SEP> 65,2 Die eluierten Feststoffe der Fraktion 22 geben beim Umkristallisieren aus Aceton 20 mg Kristalle vom Smp. 230-238 C.
Die eluierten Feststoffe der Fraktionen 19 und 20 werden vereinigt und aus Aceton umkristallisiert, wobei man 382,5 mg Kristalle vom Smp. 179-l88 C erhält. Diese werden aus 2 em3 Methanol umkristallisiert und man erhält 14-Oxy-progesteron vom Smp. 180 bis 1ö7 C, [a]D = + 200 (c = 0,4857 in Chloro form).
Analyse Ber. für C21113003: C 76,40; H 9,15 Gefunden<B>0</B> 76,50; 11 9,31. <I>Beispiel 10</I> 14-Oxy-desoxycorticosteronacetat Unter sonst gleichen Bedingungen wie im Beispiel 6 gibt man zu 4 1 eines Mediums, das eine 24stündige Kultur von Mucor griseo- cyanus ATCC 1207a enthält, 1,13g Desoxy- corticosteronacetat in 100 em3 Aceton. Nach 24 Stunden Umwandlungszeit ergibt die Extraktion 2,5 g öliger Kristalle.
Diese wer den erschöpfend mit Skelly solo e B und dann mit Äther extrahiert, wonach 0,64 g braune Kristalle zurückbleiben. Diese werden in 12 cm3 heissem Methanol gelöst, filtriert und abgekühlt, wobei man<B>0,2989</B> g weisse Kristalle von 14a-Oxy-desoxycorticosteron erhält, die bei 173 C weich werden und bei 175-176 C schmelzen und in Mineralöl und Chloroform charakteristische Infrarotspektren aufweisen.
EMI0020.0029
Analyse
<tb> Ber. <SEP> für <SEP> C21H3004: <SEP> C <SEP> 72,83; <SEP> 1I <SEP> 8,73
<tb> (Bei <SEP> 50 <SEP> C <SEP> getrocknet) <SEP> gef. <SEP> : <SEP> C <SEP> 70,37; <SEP> H <SEP> 8,70
<tb> C <SEP> 70,64; <SEP> H <SEP> <B>8,57</B>
<tb> (Bei <SEP> l_00 <SEP> C <SEP> getrocknet) <SEP> gef.: <SEP> C <SEP> 71,14; <SEP> H <SEP> 8,62 Der mit Skelly solve B und Äther ausge laugte Rohextrakt kann auch aus Aceton um kristallisiert werden, um l4a-Oxy-desoxy- cortieosteron vom Smp. 167 bis 170,.5 C [a]" = + 190 (c = 0,3341 in Chloroform) zu erhalten.
Analyse: Ber. für C..1113004: C 72,83; H 8,73 Gefunden: C 72,83; H 8,48. Das 21-Acetat des 14-Oxj--desoxyeortico- sterons schmilzt bei 160-162 C. Seine Struk tur wird durch das Infrarotspektrum bestätigt. <I>Beispiel 11</I> Einführung einer Oxygruppe in 10-Normethylprogesteron Unter den gleichen Kultur- und Extrak tionsbedingungen wie im.
Beispiel 6 gibt man zu 3 1. einer 24stündigen Kultur von Rhizopus nigricans, ATCC 6227b, 1 g 10-Normet.hyl- progesteron (19-Normethylprogesteron) in möglichst wenig Äthanol gelöst. Nach 24stün diger Umwandlung ergibt die Extraktion 1,83 g eines rohen öligen Rückstandes. Die Reinigung desselben erfolgt durch viermaliges Waschen mit je 5 ems Diäthyläther, wobei kristallines hydroxyliertes 10-Normethylproge- steron zurückbleibt.
Man kann die Kristalle auch in 3,5 ems heissem Methanol lösen, filtrie ren und das Produkt beim Abkühlen kristal lisieren lassen.
Hydroxyliertes 10-Normethylprogesteron erhält man auch mit Rhizopus arrhizus (ATCC 11145), Mucor griseo-eyanus, Mitcor parasitieus oder Helicostylum piriforme an. Stelle von Rhizopus nigrieans.
Weitere Mikroorganismen, die gemäss den Beispielen mit Erfolg verwendet werden kön nen, um Oxygruppen in Steroide, insbesondere 71-Desoxysteroide, einzuführen, die jedoch nicht unbedingt gleiche Ergebnisse liefern wie die der Gattung Mucorales, sind verschie dene Stämme von Penieillium, z. B. P-100, Aspergilli, z.
B. Aspergillus niger, Neurospora sitophila, Neurospora erassa, Oospora lactis, Polyoporus abietinus, Etomophthorales (Ento- inoplitlioi-a eoronata). Der Fermentations- prozeli mit Penicillium, wie er im USA-Patent Nr. 2458495 beschrieben ist, z.
B. unter Ver wendung vom Penieillium ehrysogenum Thom oder andern Penieilliumarten, wie P. cy clo- pium, P. nigricans, P. notatum und P. roque- forti, eignet sieh für die gleichzeitige Oxyda tion von Steroiden und die Produktion von Fermentierungsprodukten des Penicilliums.