DD159720A5 - Verfahren zur herstellung von androstansteroiden - Google Patents
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Abstract
Es wird ein Verfahren zur Herstellung von Androstansteroiden durch mikrobiologische Umwandlung eines Sterolsubstrats mit einem Mikroorganismus des Genus Mycobacterium beschrieben, bei dem ein Medium verwendet wird, das mindestens 0,1 Gew.-% Eigelb, als Trockengewicht gerechnet, enthaelt.
Description
ANWENDUNGSGEBIET DER ERFINDUNG
Die Erfindung betrifft ein" Verfahren zur Herstellung von Androstansteroiden durch mikrobiologische Umwandlung eines Sterolsubstrats'und insbesondere eine Verbesserung des Kulturmediums, das bei der fermentetiven Herstellung von Androstansteroiden verwendet wird.
CHARAKTERISTIK DER BEKANNTEN TECHNISCHEN. LÖSUNGEN
Es ist gut bekannt, daß man Androstansteroide durch mikrobiologische. Umwandlung eines Sterols (oder Sterins)mit einem Mikroorganismus des Genus Mycobacterium (nachfolgend auch als "M." abgekürzt bezeichnet) herstellen kann. Diese Methode leidet jedoch an dem Nachteil, daß die Ausbeute des gewünschten Steroids nicht zufriedenstellend und die Umsetzungsgeschwindigkeit niedrig sind.
Es ist weiterhin bekannt, daß man bdi der Steroid-Fermentierung, bei der Progesteron in der 11oc-Stellung mit Hilfe des Pilzes Rhizopus nigricans hydroxyliert wird, das Substrat (d.h. Progesteron) mit höheren Konzentrationen einsetzen kann, wenn man es in Form einer Mischung m'it rohem Eigelb im Verlaufe der Inkubation zusetzt, im Vergleich zu jenen Fällen, da man Progesteron als Acetonlösung ohne die Anwendung von rohem Eigelb einsetzt (siehe die veröffentliche japanische Patentanmeldung Nr. 9765/1957) .
%
ZIEL DER ERFINDUNG
Das Ziel der Erfindung besteht darin, ein Verfahren anzugeben, mit dem es gelingt, Androstansteroide mit höherer Geschwindigkeit und größeren Ausbeuten herzustellen.
DARLEGUNG DES WESENS DER ERFINDUNG '
Die Aufgabe der Erfindung besteht nun darin, ein Verfahren zur Herstellung von Androstansteroiden durch mikrobiologische Umwandlung eines Sterolsubsträts insbesondere unter Verwendung eines Mikroorganismus des Genus Mycobacterium derart zu verbessern, daß bei erhöhter Produktivität eine größere Ausbeute des gewünschten Steroids erreicht werden kann.
Diese Aufgabe wird nun erfindungsgemäß dadurch gelöst, daß man ein.Kulturmedium verwendet, daß mindestens 0,1 Gew.-% Eigelb bzw. Eidotter, als Trockengewicht gerechnet, enthält.
Die Androstansteroide, die mit Hilfe des erfindungsgemäßen Verfahrens hergestellt werden können, schließen Androst-4-en-3,17-dion (nachfolgend abgekürzt als "4AD" bezeichnet), Androsta-1,4-dien-3, 17-dion ("ADD") , 9oc-Hydroxyandrost-4-en-3, 17-dion ("9«k_-OH-4AD" ) , Dehydroepiandrosteron ("DHA"), Dehydrotestosteron ("DHT"), Testosteron ("TSN") und irgendwelche anderen Androstansteroide ein, von denen bekannt ist, daß sie durch mikrobiologische Umwandlung eines Sterolsubstrats oder Sterinsubstra.ts mit einem Mikroorganismus des Genus Mycobacterium hergestellt werden können. Von diesen Androstansteroiden sind Androst-4-en-3,17-dion, Androsta-1,4-dien-3,1 7-dion und 9oc.-Hydroxyandrqst-4-er.-3,1 7~dion von besonderer Bedeutung als Zwischenprodukte für die Synthese von verschiedenen Steroiden.
Als Mikroorganismus kann man bei dem erfindungsgemäßen Verfahren irgendeinen Mikroorganismus des Genus der Gattung Mycobacterium verwenden,. der dazu in der Lage ist, das gewünschte Andröstansteroid zu bilden. Vorzugsweise verwendet man als Mikroorganismus eine Mutante, die nur wenig oder keine Enzyme bildet oder aufweist, die das Andröstansteroid abbauen.
Beispiele für solche Mutanten und das davon als Hauptprodukt gebildete Andröstansteroid sind in der nachfolgenden Tabelle I aufgeführt.
TABELLE I
| Andröstan steroid | Mikroorganismus |
| A D D | M. parafortuitum Komplex MCI-0801 " MCI-0802 M. vaccae MCI-1102 MCI-1.103 " MCI-1115 M. diernhoferi MCI-1298 MCI-1299 M. sp. NRRL B-3683 |
| 4 A D | M. parafortuitum Komplex MCI-0807 M. Sp. NRRL B-3805 |
| 90C-OH-4AD | M. vaccae MCI-1104 " /. MCI-1117 M. parafortuitum MCI-1297 M. fortuitum NRRL Β-81.Ϊ9 |
Als Sterol bzw. Sterin kann man bei dem erfindungsgemäßen Verfahren als Substrat irgendwelche Sterole, ihre C-3-Ester- oder C-3-Äther-Derivate und die Zwischenprodukte bilden, die bei der Oxidation dieser Verbindungen anfallen.
Sterole besitzen an dem C-3-Atom (dem Kohlenstoffatom in der 3-Stellung) eine Hydroxylgruppe,, normalerweise eine Doppelbindung an dem C-5-Atom, eine Seitenkette mit 8 bis 10 Kohlenstoffatomen an dem C-17-Atom und in gewissen Fällen eine Doppelbindung an dem C-7-, C-8-, C-9-(11)-Atom oder dergleichen des Perhydrocyclopentanophenanthrenkerns, wenngleich der Cyclopentanophenanthrenkerri auch gesättigt sein kann*
Beispiele für solche Sterole bzw. Sterine sind Cholesterin, Stigmasterin, Campesterin, ß-Sitosterin, Ergosterin, Brassicasterin, Fucosterin, Lanosterin, .Agnosterin, Dihydrolanosterin, Dihydroagnosterin undcx-sitosterin. Besonders bevorzugt sind Cholesterin, Campesterin, und ß-Sitosterin.
Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren kann man als Ausgangsmaterial auch C-3-Esterderivate der 3ß~Hydroxylgruppe der Sterole mit anorganischen Säuren, beispielsweise Schwefelsäure oder organischen Säuren, beispielsweise Fettsäuren, verwenden. Beispiele für solche C-3-Esterderivate sind Cholesteryloleat, CholesterylpaImitat und Cholesterylsulfat.
Weiterhin kann man bei dem erfindungsgemäßen Verfahren als Ausgangsmaterial auch C-3-A'therderivate einsetzen, die man beispielsweise durch die Addition von Alkylenoxiden an die 3ß-Hydroxylgruppe von Sterolen erhält. Ein Beispiel eines solchen C-3-A'therderivats ist der Polyoxyäthylen-. cholesteryläther. '
-S
Es versteht sich von selbst, daß man bei dem erfindungsgemäßen Verfahren als Ausgangsmaterialien Wollwachs und Lanolin, die jeweils die oben beschriebenen C-3-Esterderivate der Sterole enthalten, cholesterinhaltigen WoIlalkohol, den man durch. Hydrolyse von Lanolin erhält und das C-3-Ätherderivat Polyoxyäthylenlanolinalkoholäther, den man durch Umsetzung von Wollalkohol mit Ähtylenoxid erhält, verwenden kann.
Man kann als Ausgangsmaterial bei dem erfindungsgemäßen Verfahren auch Sterole enthaltende Naturprodukte und weiterverarbeitete Materialien verwenden, wie das Abfall-Öl, das beim Reinigen von Fischöl oder.Tintenfischöl durch Waschen mit Alkali anfällt, desodorierten Abschaum und Schlamm von pflanzlichen ölen und Tallöl.
Weiterhin kann man bei dem erfindungsgemäßen Verfahren als Ausgangsmaterial (Substrate) die Zwischenprodukte einsetzen, die bei der Oxidation'von Sterolen bzw. Sterinen oder ihren C-3-Ester- oder -Äther-Derivaten anfallen. Diese Oxidationszwischenprodukte schließen die 4-en-3-onr-Derivate oder 1,4-Dien-3-pn-Derivate von Sterolen und deren C-3-Ester- oder C-3-Ätherderivate ein, wie beispielsweise Cholest-4-en-3-on, Cholesta-4,22-dien-3-on, 3ß-Hydroxy-23,24-bisnorchol-5-en-22-säure, 3-Oxo-23,24-bisnorchol-4-en-22-säure (nachfolgend abgekürzt als "4BN" bzeichnet), 3-Oxopregna-4,17(20)-dien-2 0-carbonsäure, 3-Oxopregna-4,17(20)-dien-20-carbonsäuremethylester, Cholsäure, Lithocholsäure und dergleicheni
Das wesentliche Merkmal der Erfindung liegt darin, ein Medium zu verwenden, das mindestens 0., 1 Gew.-% Eigelb bzw. Eidotter, als Trockengewicht gerechnet, enthält.
Das Eigelb oder Eidotter kann in roher, trockener und gefrorener Form vorliegen. Es kann von dem Eiklar abgetrennt sein. Alternativ kann man das ganze Ei, bei dem das Eigelb nicht von dem Eiklar abgetrennt ist, verwenden, wobei man in diesem Fall normalerweise die Eischale entfernt. Für technische Anwendungszwecke verwendet man das Eigelb vorzugsweise als Trockeneigelb.
Der Gehalt des Eigelbs in dem Medium muß mindestens 0,1 Gew.-%, ausgedrückt als Trockeneigelb, betragen, wobei eine Menge von nicht mehr als 3 Gew.-% Eigelb im allgemeinen zufriedenstellended ist. Wenn die Menge-des Eigelbs zu gering ist ergibt sich kein wesentlicher Effekt der Eigelbzugabe. Auf der anderen Seite ist die Anwendung einer übermäßig großen Menge Eigelbs nicht bevorzugt, da dies zu einer inhibierenden Wirkung, auf den Mikroorganismus führen kann.
Im allgemeinen beträgt der Wassergehalt des rohen Eigelbs 45 bis 50 Gew.-%.
Neben dem Eigelb enthält das bei dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendete Kulturmedium Kohlenstoffquelleri, Stickstoffquellen und anorganische Substanzen in den erforderlichen Mengen. ·
Beispiele für Kohlenstoffquellen sind Kohlenwasserstoffe, wie η-Paraffine, (X-Olefine und Xylol; Alkohole wie Methanol, Äthanol, Glycerin und höhere Alkohole; organische Säuren, wie Bernsteinsäure, Essigsäure und höhere Fettsäuren und deren Salze; Glyceride, öle und Fette, wie. Sojaöl und Baumwo.llsamenöl; und Kohlenhydrate, wie Stärke, Maltose, Saccharose, Glucose und Rhamnose.
Natürliche Nährstoffquellen, die Kohlenstoffquellen, Stickstof fquellen und andere Nährstoffe enthalten können in das Kulturmedium eingearbeitet werden. Beispiele für solche
natürlichen Nährstoffquellen sind Melassen, einschließlich Hightest-Melassen und Xylose-Melassen; Bagasse, Maiskolben, Alfalfa, Maisquellwasser, lösliche Destillationsrückstände, Mieki (eine wäßrige Lösung einer Aminosäuremischung, die durch Hydrolyse von Sbjaölkuchen mit HCl anfällt), Fischmehl, Kleie, Fleischextrakt, Hefe, Hefeextrakt, Kartoffelextrakt, Malzextrakt, Gluten, Pepton, Glutamate, Asparagin, Glycin, Casein, Caseinhydrolysate und Magermilch; Pflanzenölkuchen, wie Sojaölkuchen, Rapssamenrückstand, Sesamölkuchen, Leinsamenölkuchen und Baumwollsamenölkuchen; und Ölssamen und Ölfrüchte, wie ganze Sojabohnen, Rapssamen, Sesamsamen, Leinsamen 'und Baumwollsämen.
Beispiele für anorganische Substanzen sind Stickstoffquellen, wie Amraoniumsulfat, Ammoniumchlorid und dergleichen, Kalium- und Phosphor-Quellen., wie Dikaliumhydrogenphosphat; Salze von Eisen, Kupfer, Magnesium, Mangan, Kobalt, Zink, Calcium und dergleichen; und Aschen von Naturprodukten, wie Melassen. Erforderlichenfalls kann man-auch andere Additive, beispielsweise Vitaraine, zusetzen.
Die Zusammensetzung des Kulturmediums hängt von dem verwendeten Mikroorganismus ab. Kohlenstoffquellen, Stickstof fquellen, Kalium, Phosphor und Magnesium sind kritische Bestandteile des Kulturmediums.
Erforderlichenfalls kann man g.ut bekannte Antischaummittel, beispielsweise Polyoxyalkylenglykol in das Kulturmedium einarbeiten, wenngleich dies nicht immer erforderlich ist. .
Vorzugsweise versetzt man das Medium mit einem oberflächenaktiven Mittel, da dieses als Emulgator für die
Sterole wirken kann. Bevorzugte oberflächenaktive Mittel sind nichtionische oder anionische oberflächenaktive Mittel, beispielsweise Polyoxyäthylensorbitanmonostearat, Sorbitanmonopalmitat und Polyäthylenglycolmonostearat.
Die Inkubationstemperatur liegt im allgemeinen im Bereich von 20 bis 4 00C und noch bevorzugter im Bereich von etwa 25 bis 35°C.
Im allgemeinen stellt man den pH-Wert des Kulturmediums auf einen Wert im Bereich von 5 bis 10 und vorzugsweise im Bereich 6 bis 9 ein. Da der erfindungsgemäß verwendete Mikroorganismus vorzugsweise der Gattung Mycobacterium angehört, kann man auch ein Kulturmedium mit einem hohen pH-Wert einsetzten, da der Mikroorganismus unter diesen Bedingungen stabil ist.
Im allgemeinen wird das als Ausgangsmaterial für das erfindungsgemäße Verfahren verwendete Sterol zusammen mit dem Medium sterilisiert, wenngleich man es auch in einer Portion oder in mehreren Portionen nach Beginn der Inkubation dem · Medium zusetzen kann. Im letzteren Fall gibt man'das'Sterol nach der Sterilisation durch trockene Wärme oder feuchte Wärme entweder direkt oder in Form einer Lösung in einem geeigneten Lösungsmittel, wie Dimethylformamid oder in Form einer feindispergierten Dispersion, die man durch eine Ultraschallbehandlung gebildet hat, zu dem Medium. Vorzugsweise gibt man gleichzeitig ein oberflächenaktives Mittel zu, da hierdurch eine schnelle Emulgierung des Sterolsubstrats bewirkt wird.
Die. Inkubationszeit ist nicht kritisch. Im allgemeinen steigt die Menge des gebildeten Androstansteroids zwei Tage nach der Zugabe des als Ausgangsmaterial eingesetzten Sterols sehr schnell an. Dann nimmt die Menge des gebil-
deten Androstansteroids-mit der ablaufenden Inkubationszeit nach und nach zu. Eine Inkubationszeit von mehr als 20 Tagen ist jedoch technisch nur von geringem Wert.
Nach Beendigung der Inkubation oder des Fermentationsvorgangs kann man das Androstansteroid, das sich in der Fer-. mentationsbrühe angesammelt hat, sammeln, isolieren und reinigen, wozu man herkömmliche Verfahrensweisen anwendet. Beispielsweise kann man die Kulturbrühe mit einigen Volumen eines mit Wasser nicht mischbaren organischen Lösungsmittels, wie Äthylacetat, extrahieren. Dann destilliert man den Extrakt zur Entfernung des Lösungsmittels, unterwirft die zurückbleibende Steroidmischung. einer säulenchromatographischen Trennung unter Verwendung von porösem Harz, Kieselgel, Aluminiumoxid oder dergleichen als Adsorptionsmittel und Petroläther, Benzol, Chloroform, 'Äther, Aceton, Methanol, Äthylacetat oder dergleichen als EIutionsmittel, um in dieser Weise das gewünschte Androstansteroid zu isolieren.
Im allgemeinen kann man jedoch die Inkubatiönsbedingungen und das Extraktionslösungsmittel derart auswählen, daß der durch Lösungsmittelextraktion der Fermentationsbrühe er-' haltene Extrakt überwiegend das gewünschte Androstansteroid enthält. In diesen Fällen kann man reine Kristalle des Androstansteroids ohne die Anwendung einer chromatographischen Behandlung durch einfaches Destillieren des Extrakts zur Entfernung des Lösungsmittels und durch wiederholtes Umkristallisieren des Rückstandes aus Aceton, Hexan, Cyclohexan oder dergleichen gewinnen.
Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren wird im Vergleich zu der Umsetzung, eines eigelbfreieri Mediums die Abspaltung der Seitenkette des Sterols begünstigt, so daß das ge-
wünschte Androstansteroid mit einer wesentlich gesteigerten Geschwindigkeit gebildet wird. Gleichzeitig wird die Ausbeute des Androstansteroids, bezogen auf das als Ausgangsmaterial eingesetzte Sterol erhöht. Weiterhin ist es wegen der gesteigerten Abbaugeschwindigkeit des als Ausgangsmaterial eingesetzten Sterols möglich, das Sterol mit höheren Konzentrationen zuzuführen, im Vergleich zu den Fällen, da kein Eigelb zugesetzt wird. Diese günstigen Effekte führen zu einer wesentlichen Steigerung der Produktivität im Hinblick auf das Androstansteroid, so daß damit das beanspruchte Verfahren einen erheblichen kommerziellen Wert darstellt.
Das bei dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendete Eigelb ist sehr billig im Vergleich zu dem Produkt, was ein weiteres vorteilhaftes Merkmal der Erfindung darstellt.
Das folgende Ausführungsbeispiel dient der weiteren Erläuterung der Erfindung, die hierdurch jedoch nicht eingeschränkt werden soll.
In den einzelnen Beispielen erfolgt die Analyse der Androstansteroide gaschromatographisch.
Man bereitet ein Impfmedium (pH = 7,2) der folgenden Zusammensetzung:
1,0 Gew.-% Glucose
1,0 Gew.-% Fleischextrakt
1,0 Gew.-% Pepton, und
Wasser als Rest.
Man. beschickt einen 500 ml-Schüttelkolben mit 100 ml des Impfmediums. Dann sterilisiert man den Kolben und den Kolbeninhalt durch Erhitzen im Autoklaven während 15 Minuten auf eine Temperatur von 12O0C. Man impft das Medium mit einer öse M. parafortuitum MCI-1297 an und inkubiert das angeimpfte Medium während 48 Stunden bei einer Temperatur von 300C auf einer hin-und-h'erbewegten Schütteleinrichtung mit einer Schüttelamplitude von 7 cm und einer Schüttelfrequenz von 120 Hüben pro Minute.
Man beschickt jeweils zwanzig 500 ail-Schüütelkolben, die in zwei Gruppen zu jeweils 10 Kolben*. aufgeteilt,wer-^. den, mit 50 ml eines Hauptfermentationsmediums (pH = 7,0) der folgenden Zusammensetzung:
5,0 Gew.-% pulverisierte ganze Sojabohnen
1,5 Gew.-% Hefe .
0,15 Gew.-% K2HPO4
0,5 Gew.-% Sojaöl
0,1 Gew.-% MgSO4-7H2O
0,1 ' Gew.-% Siliconöl (""KM-70" der Firma Shin-etsu Chemical Co., Ltd.)
2,0 Gew.-% Cholesterin
1,0 Gew.-% Trockeneigelb und
Wasser als Rest. ,
Man sterilisiert die Kolben und die Kolbeninhalte durch Erhitzen im Autoklaven während 20 Minuten auf eine Temperatur von 120 0C. Dann impft man einen jeden Kolben mit 2 ml der in der obigen Weise bereiteten Impfkulturbrühe an. Man bewirkt die Hauptfermentation bei einer Temperatur von 300C auf.einer hin-und her-bewegten Schütteleinrichtung mit einer Amplitude von 7 cm und einer Schüttelfrequenz von 120 Hüben pro Minute. Man unterbricht die Inkubation der .Kolben der ersten Gruppe und der zweiten Gruppe nach
Ablauf von 140 bzw. 210 Stunden seit dem Beginn der Inkubation. Dann extrahiert man die vereinigte Fermentationsbrühen einer.jeden Gruppe zweimal mit. jeweils 1 1 Äthylacetat.
Nach der Filtration des'vereinigten Extrakts zur Entfernung von unlöslichen Anteilen, wie Zellen, bestimmt man den Steroidgehalt des Filtrats durch gaschromatographische Analyse. Die Analyse zeigt, daß die Extrakte der ersten bzw. zweiten Gruppe 1,65 g bzw.-1,85 des gebildeten θχ-Hydroxyandrost-4-en-3, 17-dions (9oc-OH-4AD) enthalten.
Man wiederholt die' obige Verfahrensweise mit dem gleichen Hauptfermentationsmedium mit dem Unterschied, daß man kein Eigelb zugibt. Man unterbricht die Inkubation der ersten und zweiten Gruppe (wobei jede Gruppe 10 Kolben umfaßt, indem man insgesamt 20 Kolben verwendet) nach Ablauf von 140 Stunden bzw. 210 Stunden nach Beginn der Inkubation, worauf man die Fermentationsbrühe in gleicher Weise extrahiert. Die Analyse des Extrakts im Hinblick auf den Steroidgehalt zeigt, daß die Extrakte der ersten,bzw. der zweiten Gruppe 0,94 g bzw. 1,38 g 9wt-Hydroxyandrost-4-en-3,17-dion enthalten.
Man bereitet ein Impfmedium (pH = 7,2) der folgenden Zusammensetzung :
1,0' Gew.-% Glucose 1,0 Gew.-% Fleischextrakt 1,0 Gew.-% Pepton und Wasser als Rest.
Al
Man beschickt einen 500 ml-Schüttelkolben mit 100 ml des Impfmediums. Dann sterilisiert man den Kolben und den Kolbeninhalt durch Erhitzen im Autoklaven während 15 Minuter auf eine Temperatur von 12O0C. Man impft das Medium mit einer öse M. vaccae MCI-II04 an und inkubiert das angeimpfte Medium während 48 Stünden bei einer Temperatur von 300C auf einer hin-und-her-bewegten Schütteleinrichtung mit einer Amplitude von 7 cm und einer Schüttelfrequenz von 120 Hüben pro Minute.
Dann impft man jeweils zwei 500 ml-Schüttelkolben, die jeweils 50 ml eines Hauptfermentationsmediums (pH = 7,0, durch Erhitzen im Autoklaven während 20 Minuten auf 12O0C . sterilisiert) der folgenden Zusammensetzung enthalten:
| 4,0 | Gew.-% | pulverisierte entfettete Sojabohnen |
| 2,0 | Gew.-% | Hefe |
| 1,0 | Gew.-% | Sojaöl |
| 1,0 | Gew.-% | Reiskleie |
| 0,2 | Gew.-% | NaNO3 . |
| 0,1 | Gew.-% | K2HPO4 _ |
| 0,1 | Gew.-% | MgSO4-7H2O |
| 1,5 | Gew,-% | Cholesterin |
| 0,5 | Gew.-% | Trockeneigelb und |
Wasser als Rest
mit 20 ml der in der obigen Weise bereiteten Impfkulturbrühe an. Dann führt man die Hauptfermentation bei 30 0C auf einer hin-und-her-bewegten Schüttelei.nrichtung mit eine Amplitude von 7 cm und' einer Schüttelfrequenz von 100 Hüber pro Minute durch. Man führt die Fermentation während 144 Stunden in dem einen Kolben und während 192 Stunden in dem anderen Kolben durch. Dann extrahiert man die erhaltenen Fermentationsbrühen jeweils zweimal mit 100 ml Äthylacetat •Die Analyse der Extrakte zeigt, daß sie 95 ml bzw. 115 mg
Ö I £ I 'if.
- 3=5 -9oc-Hydroxyandrost-4~en-3, 17-dion
enthalten
Man wiederholt die oben angegebene Verfahrensweise mit dem gleichen Hauptfermentationsmedium, mit dem Unterschied, daß man kein Eigelb zusetzt.· In gleicher Weise unterbricht man die Fermentation nach 144 Stunden bzw. 192 Stunden nach Beginn der Fermentation. Die Analyse der Extrakte im Hinblick auf ihren Steroidgehalt zeigt, daß sie 52 ml bzw. 98 ml 9oc~Hydroxyandrost-4-en-3,17-dion enthalten.
Beispiel 3 .
Man wiederholt die Maßnahmen des Beispiels 2, mit dem Unterschied, daß man anstelle von Cholesterin als Substrat rohes ß-Sitosterin,(einer 8:1:1-Mischung aus ß-Sitosterin, Campesterin und <«.-Sitosterin) , eine 2:1-Mischung aus ß-Sitosterin und Campesterin, Stigmasterin, · Cholest-4-en-3-on, Cholesteryloleat bzw. 3-Oxo-23,24-bisnorchol-4-en-22-säure (4BN) als Substrat verwendet und die Hauptfermentation während 140 Stunden durchführt. Die in der erhaltenen Fermentationsbrühe angesammelten Mengen an- %e-Hydroxyandrost-4-en-3,17-dion (9i*_-OH-4AD) sind in der nachstehenden Tabelle II zusammengestellt.
| Gebildete Menge an | Ja | 9<XrOH-4AD | |
| . Sterol | (mg) | " 57 | |
| Zugabe von | 62 . .! | Eigelb | |
| . | 10 | Nein | |
| Rohes ß-Sitosterin | .43 | 38 | |
| ß-Sitosterin + Campesterin | 5 i | 39 | |
| Stigmasterin | 12 | 7 | |
| Cholest-4-en-3-on | 22 | ||
| Cholesteryloleat | 4 | ||
| 4BN | 6 |
Man bereitet ein Impfmedium (pH = 7,2) der folgenden Zusammensetzung:
1,0 Gew.-% Glucose 1,0 Gew.-% Fleischextrakt 1,0 Gew.-% Pepton' und Wasser als Rest.
Man beschickt einen 500 ml-Schüttelkolben mit 100 ml des Impfmediums. Dann sterilisiert man den Kolben und den Kolbeninhalt durch Erhitzen im Autoklaven während 15 Minuten auf eine Temperatur von 12Q0C. Man impft das Medium mit einer öse M. parafortuitum Komplex MCI 0801 an und inkubiert das angeimpfte Medium während 48 Stunden bei einer Temperatur von 300C auf einer hin-und-herbewegten Schütteleinrichtung mit einer Auslenkung von 7 cm und einer Schüttelfrequenz von 120 Hüben pro Minute.
Dann impft man zehn 500 ml-Schüttelkolben, die jeweils 50 ml eines Hauptfermentationsmediums (pH = 7,0, durch Erhitzen während 20 Minuten im Autoklaven auf12O0C-sterilisiert) der folgenden Zusammensetzung enthalten:
| 4,0 | • Gew.-ί |
| 0,2 | Gew.-' |
| 0,2 | Gew.-ί |
| 0,1 | Gew.-' |
| 1,0 | Gew.-' |
| I pulversierte ga | |
| i NaNO3 | |
| i; K2HPO4 | |
| 's MgSO4 -7H2O | |
| h Cholesterin und |
Wasser als Rest
mit jeweils 2 ml der in der obigen Weise hergestellten Impfkulturbrühe an. Weitere zehn 500 ml-Schüttelkolben, die jeweils 50 ml des Hauptfermentationsmediums (pH = 7,0, in gleicher Weise sterilisiert) der gleichen Zusammensetzung, mit dem Unterschied, daß es zusätzlich 1,0 Gew.-%
- ψη -
Trockeneigelb enthält, enthalten, werden mit jeweils 2 ml der gleichen Impfkulturbrühe angeimpft. Dann führt man die Hauptferraentation bei 30 0C auf einer hin-und-herbewegten Schütteleinrichtung mit einer Amplitude von 7 cm und einer Schüttelfrequenz von 120 Hüben pro Minute durch und unterbricht die Fermentation bei 5 Kolben nach 112 Stunden und bei den anderen 5 Kolben nach 170 Stunden. Dann extrahiert man die vereinigten Fermentationsbrühen der ersten 5 Kolben bzw. der zweiten 5 Kolben mit jeweils zwei 1 1-Portionen Äthylacetat.
Nach der Filtration des Extrakts zur Entfernung unlöslicher Anteile bestimmt man den Androsta-1,4-dien-3,17-dion (ADD) -Gehalt des Filtrats durch gaschromatographische Analyse. Die hierbei erhaltenen Ergebnisse sind in der nachstehenden Tabelle III zusammengestellt.
TABELLE III Gebildete ADD-Menge
(g)
| Inkubationszeit (h) Zugabe von Eigelb | 112 | 170 |
| Nein | 0,16 | 0,48 |
| Ja- | 0,47 | 0,61 |
Man bereitet ein Impfmedium CpH = 7,2) der folgenden Zusammensetzung:
1,0 Gew.-% Glucose
1,0 Gew.-% Fleischextrakt
1,0 Pepton und Wasser als Rest.
4- 4L 1 . _ i_o
Man beschickt einen 500 ml-Schüttelkolben rait 100 ml des Impfmediums. Dann sterilisiert man den Kolben und den Kolbeninhalt durch Erhitzen im Autoklaven während 15 Minuten auf eine Temperatur von 12O0C. Man impft das Medium mit einer öse M. parafortuitum Komplex MCI 0802 an und inkubiert das angeimpfte Medium während 48 Stunden bei einer Tempe- ' ratur von 300C auf einer hin-und-her-bewegten Schütteleinrichtung mit einer Auslenkung von 7 cm und einer Schüttelfrequenz von 120 Hüben pro Minute,
Man impft jeweils zwei 6 1-Schüttelkolben, die jeweils 800 ml eines Hauptfermentationsmediums (pH =7,0, sterilisiert durch Erhitzen im Autoklaven während 20 Minuten auf 1200C) der folgenden Zusammensetzung enthalten:
2,0 Gew.-% pulverisierte ganze Sojabohnen 2,0 Gew.-% Hefe
4,0 Gew.-% Glycerin
0,2 Gew.-% NaNO3
0,2 Gew.-% K2HPO4
0,1 . Gew.-,% MgSO4-7H2O
1,5 Gew.-% Cholesterin und Wasser als Rest,
und jeweils zwei 6 1-Schüttelkolben, die jewils 800 ml eines Hauptfermentationsmediums (pH = 7,0, in der gleichen Weise sterilisiert) der oben angegebenen Zusammensetzung, mit dem Unterschied, daß es zusätzlich 1,5 Gew-.-% Trcckeneigelb enthält, enthalten, mit 20 ml der Impfkuiturbrühe an. Man bringt die Hauptfermentation, bei 300C auf einer hin-und-her-bewegten Schütteleinrichtung mit einer Auslenkung von 7 cm und einer Schüttelfrequenz von 100 Hüben pro Minute in Gang und setzt sie während 130 Stunden in den einen Kolben und während 180 Stunden in den anderen Kolben fort. Jede der in dieser Weise erhaltenen Fermentationsbrühen extrahiert man mit 2,4 1 Äthylacetat. Dann bestimmt man den Gehalt der Extrakte an Androsta-1,4-dien-3,17-dion (ADD) gaschromatographisch. Die hierbei erhaltenen Ergebnisse sind in
der nachstehenden Tabelle IV zusammengestellt.
TABELLE IV Gebildete ADD-Menge (g)
| Inkubationszeit (h) Zugabe von Eigelb | ' 130 | 180 |
| Nein | 1,65 | 2,65 |
| Ja | 2,65 | 3,27 |
Man bereitet ein Impf medium (pH = 7,2·) der folgenden Zusammensetzung:
1,0 Gew.-% Glucose 1,0 Gew.-% Fleischextrakt 1/0 Gew.-% Pepton und· Wasser als Rest.
Man beschickt einen 500 ml-Schüttelko.lben mit 100 ml des Impfmediums. Dann sterilisiert man den· Kolben und den Kolbeninhalt durch Erhitzen im"Autoklaven während 15 Minuten auf eine Temperatur von 1200C. Dann impft man das Medium mit einer öse M. parafortuitum Komplex MCI 0807 an und ihkubiert das angeimpfte Medium während 48 Stunden bei einer Temperatur von 300C auf einer hinund-her-bewegten Schütteleinrichtung mit einer Auslenkung von 7 cm und einer Schüttelfrequenz von 120 Hüben pro Minute.
- 2Ό -
Man impft einen 500 ml-Schüttelkolben der 100 ml eines Hauptfermentationsmediums (pH = 7,0, sterilisiert durch Erhitzen im Autoklaven während 20 Minuten auf 1200C) der folgenden Zusammensetzung:
4,0 Gew.-% ganze pulverisierte Sojabohnen 0,2 Gew.-% NaNO3
0,2 Gew.~% K2HPO4
0,1 Gew.-% MgSO.-7H-O
2,0 Gew.-% Cholesterin
unterschiedliche Anteile Eigelb und Wasser als Rest
enthält, mit 2 ml der Impfkulturbrühe an.
Man setzt die Hauptfermentation während 110 Stunden bei 300C in einer hin-und-her-bewegten Schütteleinrichtung mit einer Auslenkung von 7 'cm und einer Schüttelfrequenz von 120 Hüben pro Minute fort und extrahiert die erhaltenen Fermentationsbrühen zweimal mit jeweils 200 ml Äthylacetat.
Man filtriert die vereinigten Extrakte zur Entfernung unlöslicher Anteile, wie Zellen,und analysiert das Filtrat gaschromatographisch auf seinen Gehalt an Androst-4-en-3,17· dion (4AD). Die hierbei erhaltenen Ergebnisse sind in der nachstehenden Tabelle V zusammengestellt.
- 24 TABELLE V
| Trockeneigelb-Gehalt • (Gew.-%) | Gebildete 4AD-Menge (g) |
| 0 | 0,20 |
| 0,1 | 0,29 |
| 0,2 | 0,31 |
| 0,3 | 0,39 |
| 0,5 | 0,45 |
| 0,7 | 0,50 |
| 1,0 | 0,50 |
| 1,5 | 0,48 |
| 2,0 | 0,42 |
| 3,0 | 0,40 |
| 4,0 | 0,30 |
| 7,0 | 0,25 |
Man bereitet ein Impfmedium (pH = 7,2) der folgenden Zusammensetzung:
1,0 Gew.-% Glucose 1,0 Gew.-% Fleischextrakt 1,0 Gew.-% Pepton und Wasser als Rest.
Man beschickt einen 500 ml-Schüttelkolben mit 100 ml des Impfmediums. Dann sterilisiert man den Kolben und den Kolbeninhalt durch Erhitzen im Autoklaven während 15 Minuten auf eine Temperatur von 120°C. Man impft das Medium mit einer öse M. parafortüitum Komplex MCI 0807 an und inkubiert das angeimpfte Medium während einer Zeitdauer von 48 Stunden bei einer Temperatur von 300C auf
einer hin-und-her-bewegten Schütteleinrichtung mit einer Auslenkung von 7 cm und einer Schüttelfrequenz von 120 Hüben pro Minute.
Man impft zwei 6 1-Schüttelkolben, die jeweils 800 ml eines Hauptfermentationsmediums (pH = 7,0, sterilisiert durch Erhitzen im Autoklaven während.20 Minuten auf 1200C) der folgenden Zusammensetzung enthalten:
2,0 Gew.-% pulverisierte entfettete Sojabohnen 2,0 Gew.-% Hefe .
1,0 Gew.-% Trockeneigelb
0,2 Gew.-% NaNO3 ·
0,2 Gew.-% K2HPO4
0,1 Gew.-% MgSO4-7H2O
2,0 Gew.-% Cholesterin und
Wasser als' Rest
mit 20 ml der Impfkulturbrühe an.
Das in dem einen. Kolben enthaltene Fermentationsmedium enthält kein Eigelb. Man führt die Hauptfermentation bei 3O0C auf einer hin-und-her-bewegten Schütteleinrichtung mit einer Auslenkung von 7 cm und einer Schüttelfrequenz von 100 Hüben pro Minute durch. Während der Fermentation zieht man in Intervallen 20 ml-Proben, die man jeweils mit 60 ml Äthylacetat extrahiert und analysiert. Der Gehalt der Extrakte an Androst-4-en-3,17-dion (4AD) ist in der nachstehenden Tabelle VI angegeben.
- 2=3 TABELLE VI
| 4AD-Menge | (mg) | 27 | |
| Inkubationszeit (h) | Zugabe von Eigelb Nein ja | 57 | |
| 48 | 7 | 82 | |
| 72 | 20 | 100 | |
| 96 | 37 | 105 | |
| 120 | 52 | 105 | |
| 144 | 77 | 100 | |
| 168 | 90 | ||
| . 192 | 95 |
Man wiederholt die Verfahrensweise des Beispiels 6 mit dem Unterschied, daß man das Trockeneigelb durch rohes Eigelb ersetzt. Die hierbei erhaltenen Ergebnisse sind in der nachstehenden Tabelle VII zusammengestellt.
| Gehalt an rohem Eigelb (Gew.-%) | Gebildete 4AD-Menge (g) |
| 0 | 0,20 |
| 0,2 | 0,30 |
| • 0,5 | 0,39 |
| 1,0 | 0,4 4 |
| 2,0 | 0,50 |
| ,4,0 | 0,41 |
| 8,0 | 0,27 |
Man wiederholt die Maßnahmen des Beispiels 6, mit dem Unterschied, daß man das Trockeneigelb durch Vollei (dessen Schale entfernt worden ist) ersetzt. Die erhaltenen Ergebnisse sind in der nachstehenden Tabelle VIII zusammengestellt. ,
| Gehalt an Vollei (%) | Gebildete 4AD-Menge (g) |
| 0 | 0,20 |
| 0,5 | 0,29 |
| 1,0 | 0,35 |
| • 1,5 | 0,40 |
| 3,0 | 0,47 |
| 5,0 | 0,50 |
| 10,0 | 0,38 |
Man bereitet ein Impfmedium (pH = 7,2) der folgenden Zusammensetzung:
1,0 Gew.-% Glucose
1,0 Gew.-% Fleischextrakt
1,0 Gew.-% Pepton und
Wasser als Rest.
Man beschickt einen 500 ml-Schüttelkolben mit 100 ml des Impfmediums. Dann sterilisiert man den Kolben und den Kolbeninhalt durch Erhitzen im Autoklaven während 15 Minuten auf eine Temperatur von 1200C. Man impft das Medium mit einer öse M. fortuitum NRRL B-8119 an und inkubiert das angeimpfte Medium während 48 Stunden bei einer Temperatur
A«
von' 3O0C auf einer hin-und-her-bewegten Schütteleinricht'ung mit einer Auslenkung von 7 cm und einer Schüttelfre quenz von 120.Hüben pro Minute.
Mit jeweils 20 ml der Impfkulturbrühe beimpft ^n jeweils zwei 6 1-Schüttelkolben, die jeweils 800 ml eines Hauptfermentationsmediums (pH =7,0, sterilisiert durch Erhitzen im Autoklaven während 20 Minuten auf 1200C) der folgenden Zusammensetzung:
4,0 Gew.-% pulverisierte ganze Sojabohnen 0,8 Gew.-% Sojaöl 0,2 Gew.-% NaNO3
0,2 Gew.-% K2HPO4
• 0,1 Gew.-% MgSO.-7H2O
1,5 Gew.-% Cholesterin und
Wasser als·Rest . .
enthalten und jeweils zwei 6 1-Schüttelkolben, die jeweils 800 ml eines Hauptfermentationsmediums (pH = 7,0, in gleicher Weise· sterilisiert) der oben angegebenen Zusammensetzung, abgesehen davon, daß das Medium mit 1,0 Gew.-% Trockeneigelb versetzt worden ist, enthalten. Man bewirkt die Hauptfermentation bei 300C auf einer hin-und-her-bewegten Schütteleinrichtung mit einer Auslenkung von 7 cm und einer Schüttelfrequenz von 100 Hüben pro Minute während Stunden in dem einen Kolben bzw. während 168 Stunden in dem anderen Kolben. Jede in dieser Weise erhaltene Fermentationsbrühe wird mit 2,4 1 Äthylacetat extrahiert.
Dann bestimmt man den Gehalt der Extrakte an 9<>6-Hydroxyandrost-4-en-3,17-dion (9c»c-OH-4AD) gaschromatographisch. Die hierbei erhaltenen Ergebnisse sind in der nachstehenden Tabelle IX zusammengestellt.
8 - 2=7 -·
TABELLE XI Gebildete 4AD-Menge (g)
| Inkubationszeit (h) Zugabe von Eigelb | 120 | 168 |
| Nein | 1,68 | 3,85 |
| Ja | 3,51 | 4, 10 |
TABELLE IX Gebildete 9oc-OH-4AD-Menge (g)
| Inkubationszeit (h) Zugabe von Eigelb | 120 | 168 |
| Nein | 1,75 | 2,77 |
| Ja | 2,88 | 3,28 |
Man "wiederholt die Verfahrensweise des Beispiels 10, mit dem Unterschied, daß man M. fortuitum NRRL B-8119 durch M.'sp. NRRL B-3683 ersetzt. Der Gehalt der erhaltenen Extrakte Androsta-1,4-dien-3,17-dion (ADD)· ist in der nachstehenden Tabelle X angegeben.
TABELLE X Gebildete ADD-Menge (g)
| Inkubationszeit (h) Zugabe von Eigelb | 120 | 168 |
| Nein | 2,01 | 3,12 |
| Ja | 2,64 | 3,25 |
Man wiederholt die Maßnahmen des Beispiel 10, mit dem Unterschied, daß man M. sp. NRRL B-3805 anstelle von M. fortuitum NRRL B-8119 verwendet. Die in dieser Weise erzielten Gehalte ah Androst-4-en-3,17-dion (4AD) in den erhaltenen Extrakten sind in der nachstehenden Tabelle XI angegeben.
Claims (3)
- ja; ERFINDUNGSANSPRUCH/^.Verfahren zur Herstellung von Androstansteroiden durch mikrobiologische Umwandlung eines Sterolsubstrats, dadurch gekennzeichnet, daßman ein Kulturmedium verwendet, das mindestens 0,1 Gew.-%• Eigelb, als Trockengewicht gerechnet, enthält.
- 2.Verf ahren nach Punkt 1, dadurchgekennzeichnet , daß man die mikrobiologische Umwandlung mit einem Mikroorganismus des Genus Mycobacterium bewirkt.3-Verfahren nach den Punkten 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, . daß man als Androstansteroid Androst-4-en-3,17-dion, Androsta-1,4.-dien-3,17-dion und/oder 9©o-Hydroxyandrost-4-en-3, 17-dion herstellt.i*.Verfahren nach den Punkten 1 bis -3,- dadurchg e k e n.n zeichnet , daß man als Sterolsubstrateinen Vertreter aus der Sterole, deren C-3-Esterderivate, . deren C-3-Ä'therderivate und die dur-ch Oxidation, davon gebildeten Zwischenprodukte umfassenden Gruppe verwendet.S. Verfahren nach einem der Punkte 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet', daß manals Mikroorganismus eine Mutante verwendet, die keine oder nur wenig das Androstansteroid abbauende Enzyme bildet oder aufweist.ί· Verfahren nach einem der Punkte'1 bis 5,dadurch gekennzeichnet, daß manals Mikroorganismus eine Mutante verwendet, die dem Mycobacterium parafortuitum Komplex angehört.·?. Verfahren nach einem der Punkte 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß man als Mikroorganismus eine Mutante von Mycobacterium vaccae verwendet.^. Verfahren nach einem de'r · Punkte 1 bis 6 dadurch gekennzeichnet, daß man einen Mikroorganismus aus der Gruppe verwendet, die Mycobacterium parafortuitum Komplex MCI 0801 und MCI 0802 umfaßt, und als Androstansteroid Androsta-1,4-dien-3,17-dion herstellt.S.Verfahren nach einem der Punkte. 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß man als Mikroorganismus Mycobacterium parafortuitum Komplex MCI 0807 verwendet und als Androstansteroid Androst-4-en-3,17-dion bildet.//Ö.Verfahren nach einem der Punkte 1 bis 5 oder 7, dadurch gekennzeichnet, daß der verwendete Mikroorganismus aus der Gruppe ausgewählt ist, die Mycobacterium vaccae MCI 1104 -und.MCI 1117 umfaßt, und als Androstansteroid 9<XrHydroxyandrost-4-en-.. 3,17-dion bildet.
- 44.Verfahren nach einem der Punkte 1 bis 5, dadu-rch gekennzeichnet,daß man als Mikroorganismus Mycobacterium sp. NRRL B-3683 verwendet und als Androstansteroid Androsta-1,4-dien-3,17-dion bildet. 'ΛΑ.Verfahren nach einem der Punkte 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß man als Mikroorganismus Mycobacterium sp. NRRL B-3805 verwendet und als Androstansteroid Androst-4-en-3,17-dion bildet.
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