CH343390A

CH343390A - Verfahren zur fermentativen Oxydation von Steroiden

Info

Publication number: CH343390A
Authority: CH
Inventors: Charles Murray Herbert; Corners Hickory; Dietrich Meister Peter
Original assignee: Upjohn Co
Priority date: 1954-06-07
Filing date: 1955-06-01
Publication date: 1959-12-31

Description


      Verfahren    zur     fermentativen    Oxydation von Steroiden    Vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein Ver  fahren zur Einführung einer     Oxygruppe    mindestens  in     17-Stellung    von in     17-Stellung    mindestens     1-H-          Atom    aufweisenden Steroiden, das dadurch gekenn  zeichnet ist, dass man die     Stereoide    unter     aeroben          Bedingungen    der oxydierenden Einwirkung von Pilzen  der Gattung     Trichothecium    oder     Cephalothecium    oder  entsprechenden Enzymen aussetzt.

   Die     Hydroxylie-          rung    erfolgt wie gesagt stets zum mindesten in     17-          Stellung,    doch kann zusätzlich noch an andern Stellen,  z. B. in     11-Stellung,    eine     Hydroxylierung    stattfinden.  



  Die als Ausgangsstoffe zu verwendenden Steroide  können     Substituenten    mehr oder weniger beliebiger  Art, Zahl und Stellung aufweisen, insbesondere     Me-          thylgruppen    in 10- und/oder     13-Stellung,    sowie auch  Doppelbindungen in einer oder mehreren der Stel  lungen 4, 5, 6, 7, 8, 9 (11), 11 (12), 16 (17), 17 (20) oder  andern Stellungen, ferner z. B. auch durch Anlagerung  von Halogen oder Halogenwasserstoff geschützte  Doppelbindungen.

   Besonders wertvolle     Ausgangs-          steroide    sind diejenigen, welche im     Kohlenstoffskelett     bis zu 22     Kohlenstoffatome    und mehr aufweisen,  speziell diejenigen, die eine     Ketogruppe    in     20-Stellung     enthalten.

   Seitenketten in     17-Stellung,    die besonderes  Interesse besitzen, sind     -COCH3,        -COCH20H    und       -CO-CH,    O     Acyl;    das     Acylradikal    leitet sich zweck  mässigerweise von einer     Carbonsäure    ab, wobei die  Länge des     Acylrestes    nicht kritisch ist; doch ver  wendet man in der Regel     Carbonsäuren    mit 1-9     Koh-          lenstoffatomen.    Das     21-Acetat    ist ein praktisches Bei  spiel für einen geeigneten Ester.  



  E. A.     Bessey,         Morphology        and        Taxonomy    of       Fungi     Seiten 589 und 615,     Blakiston,    Philadelphia,  1950, beschreibt das dem     Trichothecium    nahe ver  wandte     Cephalothecium    als kopfförmige     Conidien     besitzend,     während    beim     Trichothecium    die     Conidien       einzeln an der Spitze der     Conidiophoren    sind.

   Sowohl       Cephalothecium    als     Trichothecium    bilden etwa birnen  förmige, glasartige oder     blassrosa    Sporen, die zwei  zellig sind, wobei die Grundzelle kleiner ist als die  Endzelle. Die Arten-Bezeichnungen     Cephalothecium     und     Trichothecium    werden in der Fachwelt oft auch  als synonym angesehen. Die Gattungen     Trichothecium     und     Cephalothecium    gehören der Familie     Hyaldi-          dymae    und der Ordnung     Moniliales    an.

   Unter den  für den vorliegenden Zweck geeigneten Pilzarten seien  erwähnt:  
EMI0001.0064     
  
    Cephalothecium <SEP> roseum <SEP> ATCC <SEP> 8685,
<tb>  Trichothecium <SEP> arrhenopum,
<tb>  Trichothecium <SEP> canadium,
<tb>  Trichothecium <SEP> roseum <SEP> NRRL <SEP> 1665,
<tb>  Trichothecium <SEP> plasmoparae, <SEP> und
<tb>  Trichothecium <SEP> polybrochum.       Die Kultivierung der     Pilze    kann auf irgendeinem  flüssigen oder festen Medium erfolgen, das für deren  Wachstum günstig ist, wobei man z. B. das im     US-          Patent    Nr. 2602769 beschriebene Verfahren anwenden  kann. Flüssige Medien sind für     submerse    Kultivierung  besonders geeignet.

   Die Medien enthalten zweck  mässigerweise Quellen für     assimilierbaren    Kohlen  stoff und Stickstoff sowie Mineralstoffe.  



       Assimilierbarer    Kohlenstoff kann aus Kohlen  hydraten, Stärken,     gelatinisierten    Stärken,     Dextrinen,     Zuckern,     Rohrzuckermelasse,    Rüben- oder     Sorghum-          Melasse,    Glukose, Fructose,     Mannose,        Galactose,          Maltose,        Saccharose,        Lactose    oder     Pentosen    stammen.

    Andere Stoffe, die     assimilierbaren    Kohlenstoff für  den Energiebedarf und das Wachstum der     Pilze    lie  fern, sind beispielsweise     Aminosäuren,        Peptone,    Pro  teine, Glycerin, Essigsäure,     Natriumacetat,        Citronen-          säure,        Natriumcitrat,    niedrige Fettsäuren, höhere Fett-      Säuren, Seifen oder Fette. Manchmal sind für ein  ausgeglichenes Wachstum Mischungen verschiedener       Kohlenstoffquellen    vorteilhaft.  



       Assimilierbarer    Stickstoff kann von löslichen oder  unlöslichen     pflanzlichen    oder tierischen Proteinen,  Sojamehl,     Lactalbumin,    Casein, Eiweiss, Molken,  dem löslichen Anteil von     Schlempe,        Maiseinweich-          flüssigkeit,    Hefeextrakt,     Peptonen,        Polypeptiden,          Aminosäuren,        Ammoniumsalzen,    z. B.     Ammonium-          tartrat    oder     Ammoniumsulfat,    Nitraten, z. B.

   Na  trium- oder     Ammoniumnitrat,    oder     Acetamid    stam  men.  



  Als Mineralbestandteile kann das Medium ent  weder bereits vorhandenes oder zugesetztes     Calzium,     Kobalt, Gallium, Eisen, Magnesium,     Molybdän    und  Kalium enthalten. Schwefel kann durch Sulfate,       Alkylsulfonate,    Sulfide, freien Schwefel,     Cystin,        Thi-          amin    oder     Biotin    beschafft werden.

   Phosphor, beson  ders in etwa 0,001- bis 0,07-, vorzugsweise 0,015- bis       0,12molarer    Konzentration, kann in Form von       Ortho-,        Meta-    oder     Pyrophosphaten,    Salzen oder  Estern,     Phytin,        Phytat,        Glycerophosphat,        Natrium-          nucleinat    oder Casein vorhanden sein. Spuren von  Bor und Jod sind manchmal erwünscht.  



  Andere zusätzliche Wachstumsfaktoren, Vitamine,       Auxine    und das Wachstum anregende Stoffe können  je nach Bedarf zugegeben werden.  



  Kohlenhydrate und Fette sind für das Wachstum  der     Pilze    nicht wesentlich; doch sind     Kohlenhydrate     eine billige Energiequelle für die     Pilze.    Die     Mitver-          wendung    von     Aminosäuren    oder Proteine, für sich  oder gemeinsam, ist von Vorteil.  



       Suspensionsmittel,        Mycelträger    oder     Emulgier-          mittel    wie Filtererden, Filterhilfen, fein zerkleinerte       Cellulose,        Holzschnitzel,        Bentonit,        Calziumkarbonat,     Kohle, Aktivkohle oder andere     suspendierbare    feste  Stoffe,     Methylcellulose,        Carboxymethylcellulose    oder       Alginate    können zugesetzt werden, um die     Fermen-          tierung,    Belüftung und Filtration zu erleichtern.  



  Das     pH    des Mediums ist nicht besonders kritisch  solange ein Wachstum stattfindet, doch können saure  Bedingungen erwünscht sein, um bakterielle Ver  unreinigungen zu verhindern. Die mikrobiologische  Verunreinigung kann     hintangehalten    oder vermieden  werden, wenn man antiseptische oder antibiotische  Mittel, wie z. B.     Benzoate,        Sulfite,    Penicillin,     Circulin     oder     Neomycin,    zusetzt.  



  Die     Beimpfung    des Nährmediums kann in jeder  geeigneten Weise erfolgen. Die in Frage stehenden       Pilze    wachsen gut bei etwa 20 C, und das Wachstum  der     Pilze    wird leicht gefördert, wenn man eine     Be-          brütungstemperatur    von etwa 15-30 C einhält, doch  sind auch niedrigere oder höhere, nicht über etwa  50 C liegende Temperaturen anwendbar.  



  Das     Steroid    kann entweder vor oder nach einer  thermischen oder sonstigen Sterilisation des Mediums,  vor oder während der     Beimpfung    des Mediums oder  später, z. B. nach einer     24-48stündigen    Wachstums  periode,     zugesetzt    werden.

   Sein Zusatz kann in  jeder beliebigen Konzentration erfolgen, doch be-    wirkt eine Konzentration von mehr als 2 g     Steroid     pro Liter je nach dem     Steroid    eine Verzögerung,  aber nicht eine Verhinderung der     Mycelentwick-          lung.    Der Zusatz des zu fermentierenden     Steroids     kann in irgendeiner geeigneten Weise erfolgen, ins  besondere so, dass zwischen dem     Steroid    und der  oxydierenden Aktivität des Pilzes eine grosse Kontakt  fläche entsteht.

   Dazu kann man das     Steroid    entweder  allein oder mit einem     Dispergiermittel        dispergieren     oder in einem mit Wasser mischbaren organischen  Lösungsmittel auflösen, so dass nach dem Vermischen  der Steroidlösung mit dem Pilzmedium eine Suspen  sion des     Steroids    entsteht. Man kann entweder Ober  flächenkultur oder, vorzugsweise,     submerse    Kultur  anwenden.

   Man kann auch die das     Steroid    fermen  tierenden Enzyme aus einer Kultur des Pilzes abtren  nen und mit einer Lösung oder Dispersion des     Steroids     vermischen und die Mischung     aeroben    Bedingungen  aussetzen, um die Fermentation des     Steroids    zu be  wirken.  



  Die Temperatur während der Fermentation des       Steroids    kann die gleiche sein, wie sie     fier    die Kultur  des Pilzes als geeignet gefunden wurde. Sie muss nur  in einem solchen Bereich gehalten werden, um das  Leben, das aktive Wachstum oder die- Enzymwirkung  des Pilzes zu erhalten.  



  Die Wirksamkeit der Steroidfermentation hängt  von der Belüftung ab. Deshalb wird die Belüftung in  der Regel gesteuert, z. B. durch Bewegung und/oder  Durchblasen von Luft durch das     Fermentations-          medium.    Man kann nicht nur Luft zur Einführung  von Sauerstoff verwenden, sondern auch andere  Quellen, die Sauerstoff in freier oder     freisetzbarer     Vorm enthalten. Ein weiter Bereich der Belüftungs  geschwindigkeit, der sich leicht feststellen lässt, ist  anwendbar.

   Verwendet man Luft als Belüftungs  mittel, ist eine zweckmässige Belüftungsgeschwindig  keit etwa 4-20     Millimol    Sauerstoff pro Liter pro  Stunde, bestimmt nach der Methode von Cooper,       Vernstrom    und     Miller,        Ind.    Eng.     Chem.,    36, 504  (1944). Unter gewissen Bedingungen ist es erwünscht,  während des Entwicklungsstadiums des     Pilzes    mit  andern Belüftungsgeschwindigkeiten zu arbeiten als  während der Fermentation des     Steroids.    Die Belüftung  wird zweckmässig durch Anwendung von Über- oder  Unterdruck, z. B. 2,1     kg/cm2    oder 0,7     kg/cm2    (absolut),  gesteuert.

   Die Sauerstoffaufnahme kann durch die  Anwesenheit verschiedener Katalysatoren, wie Ascor  binsäure,     Glutaminsäure,        Citronensäure,    Milchsäure,       Tyrosin    oder     Tryptophan,    im Medium erleichtert  werden.  



  Die zur Fermentation des     Steroids    erforderliche  Zeit wechselt je nach der Arbeitsweise etwas. Wenn  das     Steroid    zur Zeit der     Beimpfung    des Mediums vor  handen ist, kann man Perioden von 8-72 Stunden an  wenden. Setzt man jedoch das     Steroid    dem     Pilz    zu,  wenn dieser schon ein wesentliches     aerobes    Wachs  tum hinter sich hat, z. B. 16-24 Stunden bei optimaler  Temperatur, so setzt die Umwandlung des     Steroid-          substrates    sofort ein und man erhält in einer bis 72      Stunden hohe Ausbeuten, wobei 24 Stunden im all  gemeinen befriedigend sind.

   Neben den oxydierten  Steroiden können bei der Fermentation andere wert  volle Produkte entstehen, die sich nach bekannten  Methoden abtrennen lassen. Diese Nebenprodukte  der Fermentation können aus der     Fermentations-          brühe    entweder vor oder nach der Beendigung der  Fermentation der Steroide abgetrennt werden. So  entstehen z.

   B. bei der Fermentation eines     Steroids    mit       Trichothecium        roseum    neben dem oxydierten     Steroid          Antibiotica,    nämlich das antibakterielle     Rosein    und  das     fungicide        Trichothecin,    die durch Extraktion mit  Chloroform oder Äther und anschliessende     Chromato-          graphie    gewonnen werden können.  



  Eine besonders vorteilhafte Methode zur Isolierung  der fermentierten Steroide aus der     Fermentations-          mischung    besteht darin, das gesamte     Fermentations-          gemisch    (Flüssigkeit und     Mycel)    mit einem in Wasser  nichtlöslichen Lösungsmittel für das     Steroid    zu extra  hieren, z. B. mit     Methylenchlorid,        Äthylenchlorid,          Trichloräthylen,    Äther,     Amylacetat    und dergleichen.

    Man kann auch die     Vermentationsflüssigkeit    vom       Mycel    abtrennen und getrennt mit geeigneten Lösungs  mitteln extrahieren. Das     Mycel    kann mit in Wasser  löslichen oder unlöslichen Lösungsmitteln extrahiert  werden, z. B. mit Aceton. Die vom     Mycel    befreite       Fermentationsflüssigkeit    kann mit in Wasser un  löslichen Lösungsmitteln extrahiert werden.

   Man kann  die Extrakte entweder vor oder nach dem Waschen  mit einer alkalischen Lösung, wie     Natriumbikarbonat,     vereinigen, dann     zweckmässigerweise    über wasser  freiem Natriumsulfat trocknen und das gereinigte  fermentierte     Steroid    durch     Umkristallisieren    aus orga  nischen Lösungsmitteln oder durch     Chromatographie     erhalten.  



  Die nach dem Verfahren gemäss der Erfindung er  hältlichen     17-Oxy-steroide    sind wertvolle chemische  Zwischenprodukte sowie an sich physiologisch aktiv.  Sie besitzen eine Antipilz- und     Emulgierwirkung.    Sie  lassen sich zum Stabilisieren von Emulsionen ver  wenden, wo bisher     lipophile    Stoffe verwendet wurden.    <I>Beispiel l</I>  Ein Medium, das 12 g Feststoffe aus Maisein  weichflüssigkeit und 10 g Glucose enthält und mit  Leitungswasser auf einen Liter verdünnt wurde, wird  auf     px    4,5 eingestellt und durch Hitze sterilisiert.

    12 Liter dieses Mediums wird mit Sporen von     Tri-          chothecium        roseum    Link     NRRL    1665 (synonym mit       Cephalothecium        roseum        ATCC    8685) beimpft und  unter Bewegung und Belüftung mit     0,51/min.    48 Stun  den kultiviert. Dann wurden 4,8 g     11-Desoxycorti-          costeron-21-acetat,    gelöst in 150 ml Aceton, zugesetzt  und die     Fermentierung    während 48 Stunden fort  gesetzt. In diesem Zeitpunkt hat die Kulturflüssigkeit  ein     prr    von 5,85.

   Sowohl die Flüssigkeit als auch das       Mycelium    werden 4mal mit je 3 Liter     Methylen-          chlorid    extrahiert. Die     Methylenchloridextrakte    wer  den vereinigt und zweimal mit je     1/1o        Volumteil          2 /aiger    wässriger     Natriumbikarbonatlösung,    dann    zweimal mit je     1/1o        Volumteil    Wasser gewaschen.  Der     Methylenchloridextrakt    wird dann über wasser  freiem Natriumsulfat getrocknet und auf dem Dampf  bad auf ein kleines Volumen eingeengt. Es verbleiben  7,65 g Rückstand.  



  Der Rückstand wird in 500     cm3        Äthylendichlorid     wieder gelöst und mit 400 g      Florisil     (Marken  produkt)     chromatographiert,    wobei man     650-cm3-Por-          tionen        Eluierungsmittel,    wie in Tabelle I angegeben,  verwendet.  



       Chromatographische    Analyse  
EMI0003.0068     
  
    <I>Tabelle <SEP> I</I>
<tb>  Eluatfeststoffe
<tb>  Fraktion <SEP> Lösungsmittel <SEP> in <SEP> mg
<tb>  1 <SEP> Äthylendichlorid <SEP> 544,2
<tb>  2 <SEP> do. <SEP> <B>318,3</B>
<tb>  3 <SEP> Äthylendichlorid-Aceton <SEP> 15:1 <SEP> 446,8
<tb>  4 <SEP> do. <SEP> 42,0
<tb>  5 <SEP> Äthylendichlorid-Aceton <SEP> 12:1 <SEP> 87,4
<tb>  6 <SEP> do. <SEP> 81,5
<tb>  7 <SEP> do. <SEP> 50,7
<tb>  8 <SEP> Äthylendichlorid-Aceton <SEP> 10:1 <SEP> 33,7
<tb>  9 <SEP> do. <SEP> 27,9
<tb>  10 <SEP> Äthylendichlorid-Aceton <SEP> 8:1 <SEP> 27,6
<tb>  11 <SEP> do. <SEP> 26,7
<tb>  12 <SEP> do. <SEP> 46,9
<tb>  13 <SEP> Äthylendichlorid-Aceton <SEP> 5:1 <SEP> 63,5
<tb>  14 <SEP> do. <SEP> 153,2
<tb>  15 <SEP> do. <SEP> 142,4
<tb>  16 <SEP> Äthylendichlorid-Aceton <SEP> 3:

  1 <SEP> 236,2
<tb>  17 <SEP> do. <SEP> 213,8
<tb>  18 <SEP> Äthylendichlorid-Aceton <SEP> 1:1 <SEP> 541,9
<tb>  19 <SEP> do. <SEP> 259,7
<tb>  20 <SEP> Aceton <SEP> 272,8       Die     Eluatrückstände    der Fraktionen 12-15 werden  vereinigt, in 60     em3        Äthylenchlorid    gelöst und noch  mals über 35 g       Vlorisil         chromatographiert,    wobei  man zur     Elution    zwei Portionen von, je 35     cm3    der  folgenden Lösungsmittel in der angegebenen Reihen  folge verwendet:

       Äthylendichlorid,        Äthylendichlorid-          Aceton    12:l, 10:1, 8:1, 5:1, 1:1 und eine Portion  Aceton verwendet. Die erste     Äthylendichlorid-Aceton-          Fraktion    1:1     eluiert    118 mg Kristalle, die vorwiegend  aus     6ss,17a,21-Trioxy-4-pregnen-3,20-dion    bestehen.  Zweimaliges     Umkristallisieren    aus Methanol liefert  26,5 mg     6ss,17a,21-Trioxy-4-pregnen-3,20-dion    vom       Smp.    229-233 C. Das     Infrarotspektrüm    bestätigt die  Struktur.  



  Die Rückstände der     Eluatfraktionen    16-20 wer  den vereinigt, in 100     cm3        Äthylendichlorid    wieder ge  löst und nochmals über 125 g      F\lorisil         chromato-          graphiert,    wobei als     Eluierungsmittel        220-cm3-Portio-          nen    in folgender Reihenfolge verwendet werden:

         Äthylendichlorid,        Äthylendichlorid-Aceton    8:1, zwei  mal     Äthylendichlorid-Aceton    5:1, zweimal     Äthylen-          dichlorid-Aceton    3:1, dreimal     Äthylendichlorid-Ace-          ton    2:1, dreimal     Äthylendichlorid-Aceton    1:1, zwei-      mal Aceton. Das zweite     Äthylendichlorid-Aceton-          Eluat    1:1 wird eingedampft, wobei man 84,8 mg eines  Öls erhält, das aus     Äther-Aceton    umkristallisiert wird.

    Die Kristalle werden durch Dekantieren gewonnen  und dann einmal aus 0,5     cm3    Methanol umkristalli  siert, wobei man 15,5 mg kristallines     lla,17a,21-          Trioxy-4-pregnen-3,20-dion    vom     Smp.    206-2l1 und  dem für     lla,17a,21-Trioxy-4-pregnen-3,20-dion    cha  rakteristischen     Infrarotspektrum    erhält.    <I>Beispiel 2</I>  Man arbeitet wie im Beispiel 1 unter Verwendung  von Progesteron als Ausgangsstoff anstelle des     Des-          oxycorticosteron-21-acetats    und erhält     17a-Oxyprog-          esteron.     



  <I>Beispiel 3</I>  Man arbeitet wie im Beispiel 1, verwendet jedoch  als     Ausgangssteroid        11-Keto-progesteron    und erhält       11-Keto-17a-oxyprogesteron.       <I>Beispiel 4</I>  Man arbeitet wie im Beispiel 1, verwendet aber       llss-Oxy-progesteron    als Ausgangsmaterial und erhält       llss,17a-Dioxy-progesteron.     



  <I>Beispiel 5</I>  Man arbeitet nach einem der Beispiele 1-4 und  erreicht die gleichen Ergebnisse, wenn man das Nähr  medium des Beispiels 1 durch 12 Liter eines Mediums  ersetzt, das 40 g Glukose, 15 g Stärke, 5 g     Ammo-          niumnitrat,    3 g     Äthylamin,    1 g     Kaliumphosphat          (KH,P04),    0,5g     Magnesiumsulfat        (MgS04-7H20),     0,01 g     Ferrosulfat        (FeS04    -     7H20),    0,01 g Zinksulfat       (ZnS04.        zH20),    0,

  01 g     Mangansulfat        (MnS04-4H20),     0,01g     Cuprisulfat        (CuS04    -     5H20),    0,02g     Cobalt-          nitrat        [Co(No3)z.        6H20],    und 0,01 g     Natriumfluorid          (NaF),    mit Leitungswasser von     Kalamazoo    auf einen  Liter verdünnt und auf     p$    5 eingestellt, enthält.  



  <I>Beispiel 6</I>  Man arbeitet, wie in den Beispielen 1, 2, 3 und 4  beschrieben, und erhält die gleichen Ergebnisse wie  dort, wenn man das Nährmedium durch 12 Liter eines  Mediums ersetzt, das erhalten wurde aus 2 g     Ammo-          niumtartrat,    1 g     Kaliumphosphat        (K2HP04),    0,5 g       Kaliumchlorid        (KCl),    0,5 g     Magnesiumsulfat        (MgS04.          7H20),    0,1g     Verrosulfat,    50 g Glucose und 10 g Mais  einweichflüssigkeit, mit Leitungswasser auf 1 Liter  verdünnt und auf     pH    4 mit Phosphorsäure eingestellt,  ersetzt.  



  <I>Beispiel 7</I>  Ersetzt man in den Beispielen 1, 2, 3 und 4 das       Nährmedium    durch 12 Liter eines Mediums, das er  halten wurde durch Verdünnen von 15 g     Hefeauto-          lysat    und 10 g     Saccharose    mit Leitungswasser auf einen  Liter, so erhält man die gleichen Ergebnisse.  



  <I>Beispiel 8</I>  In den vorangehenden Beispielen 1-7 kann man  den     Pilz        Cephalothecium        roseum    durch     Trichothecium            candidum,        Trichotheeium        plasmoparae,        Trichothecium          polybrochum    oder     Trichothecium        arrhenopum    er  setzen, um die     Hydroxylgruppe    in     17-Stellung    ein  zuführen.

    
EMI0004.0072     
  
    <I>Tabelle <SEP> 1I</I>
<tb>  Eluatfeststoffe
<tb>  Fraktion <SEP> Lösungsmittel <SEP> <U>in <SEP> mg</U>
<tb>  1 <SEP> Äthylendichlorid <SEP> 789
<tb>  2 <SEP> do. <SEP> 215
<tb>  3 <SEP> Äthylendichlorid-Aceton <SEP> 25:1 <SEP> 755
<tb>  4 <SEP> do. <SEP> 187
<tb>  5 <SEP> Äthylendichlorid-Aceton <SEP> 15:1 <SEP> 90
<tb>  6 <SEP> do. <SEP> 105
<tb>  7 <SEP> Äthylendichlorid-Aceton <SEP> 12:1 <SEP> 531
<tb>  8 <SEP> do. <SEP> 615
<tb>  9 <SEP> do. <SEP> 315
<tb>  10 <SEP> Äthylendichlorid-Aceton <SEP> 10:1 <SEP> 489
<tb>  11 <SEP> do. <SEP> 412
<tb>  12 <SEP> do. <SEP> 285
<tb>  13 <SEP> Äthylendichlorid-Aceton <SEP> 8:

  1 <SEP> 395
<tb>  14 <SEP> do. <SEP> 295     
EMI0004.0073     
  
    <I>Tabelle <SEP> III</I>
<tb>  Fraktion <SEP> Lösungsmittel <SEP> Eluatfeststoffe
<tb>  in <SEP> mg
<tb>  1 <SEP> Äthylendichlorid <SEP> 635,5
<tb>  2 <SEP> do. <SEP> 178,5
<tb>  3 <SEP> Äthylendichlorid-Aceton <SEP> 15:l <SEP> 255,5
<tb>  4 <SEP> do. <SEP> 89,5
<tb>  5 <SEP> Äthylendichlorid-Aceton <SEP> 12:1 <SEP> 55,0
<tb>  6 <SEP> do. <SEP> 26,5
<tb>  7 <SEP> Äthylendichlorid-Aceton <SEP> 10:1 <SEP> 15,5
<tb>  8 <SEP> do. <SEP> 67,0
<tb>  9 <SEP> Äthylendichlorid-Aceton <SEP> 8:1 <SEP> 221,5
<tb>  10 <SEP> do. <SEP> 289,0
<tb>  11 <SEP> do. <SEP> 263,5
<tb>  12 <SEP> Äthylendichlorid-Aceton <SEP> 5:1 <SEP> 512,0
<tb>  13 <SEP> do. <SEP> 501,5
<tb>  14 <SEP> do. <SEP> 368,0
<tb>  15 <SEP> Äthylendichlorid-Aceton <SEP> 3:

  1 <SEP> 478,5
<tb>  16 <SEP> do. <SEP> 211,0
<tb>  17 <SEP> do. <SEP> 206,0       <I>Beispiel 9</I>    Man stellt ein Medium her, das 50 g Dextrose       (Cerelose)    2 g     KH1P04,    0,5 g     M9S04,    0,3 g     ZnS04,     0,35 g     K2S04,    7,5 g Hefeextrakt, mit Brunnenwasser  auf einen Liter verdünnt, enthält und auf     p$    5,7 ein  gestellt ist. 12 Liter dieses sterilisierten Mediums  werden mit     Trichotetium        roseum        (Cephalothecium          roseum)    beimpft und unter Belüftung 72 Stunden  kultiviert.

   Dann werden 6 g Progesteron in     200        cm3     Äthanol gelöst, der Kultur zugesetzt und die Fer  mentation unter Belüftung weitere 48 Stunden fort  gesetzt.  



  Die Extraktion des Kulturmediums, welches das       Mycelium    enthält, mit     Methylendichlorid    ergibt 10 g      eines öligen Rückstandes, von dem ein     aliquoter    Teil  durch     Papierchromatographie    getrennt wird, wobei  man 11     a,17a-Dioxy-progesteron    erhält.  



  Der ölige Rückstand wird in 300     cm3        Äthylen-          dichlorid    gelöst und über 480 g      Florisil         chromato-          graphiert,    wobei man     700-cm3-Portionen    Lösungs  mittel, entsprechend Tabelle     II,    verwendet.

   Die festen  Fraktionen 11-14 werden mit Äther verrieben, die  Mutterlaugen     abdekantiert    und die kristallinen Rück  stände vereinigt und     zweimal    aus 10     cm3    Methanol  umkristallisiert, wobei man 426 mg 11a,     17a-Di-          hydroxy-progesteron    vom     Smp.    218-222 C und einer  optischen Drehung     [a]D    =     -E-    74  (Konzentration  0,98 in Chloroform) sowie dem charakteristischen       Infrarotspektrum    erhält.  



  <I>Beispiel 10</I>  Arbeitet man wie im Beispiel 9, verwendet jedoch  anstelle von Progesteron     11-Dehydrocorticosteron,    so  ergibt die Fermentation und Extraktion mit     Methylen-          dichlorid    7,35 g eines öligen Extraktes. Dieser Extrakt  wird in 300     cm3        Äthylendichlorid    gelöst und über  320 g      Florisil         chromatographiert,    wobei man 490  cm3-Portionen Lösungsmittel, entsprechend Tabelle       III,    verwendet. Die festen Rückstände der Fraktionen  15, 16 und 17 werden vereinigt und zweimal aus Aceton  umkristallisiert, wobei man 216,5 mg     Cortison    enthält.

    <I>Beispiel 11</I>  Arbeitet man nach Beispiel 9 und verwendet an  stelle von Progesteron     Corticosteron        (llss,21-Di-          hydroxy-4-pregnen-3,20-dion),    so erhält man     17-          Hydroxy-corticosteron        (llss,17a,21-Trihydroxy-4-          pregnen-3,20-dion)    und     Cortison    (17a,     21-Dihydroxy-          4-pregnen-3,11,20-trion).     



  <I>Beispiel 12</I>  Arbeitet man nach Beispiel 9 unter Verwendung  von     17a,21-Dihydroxy-4-pregnen-3;20-dion    anstelle  von Progesteron, so erhält man     lla,17a,21-Tri-          hydroxy-4-pregnen-3,20-dion.

Claims

PATENTANSPRUCH Verfahren zur Einführung einer Oxygruppe min destens in 17-Stellung von Steroiden, dadurch ge kennzeichnet, dass man ein Steroid, das am Kohlen stoffatom 17 wenigstens ein Wasserstoffatom enthält, mit einem Pilz der Gattung Trichothecium oder Cephalothecium oder entsprechenden Enzymen unter aeroben Bedingungen in einem wässrigen Medium in Kontakt bringt. <B>UNTERANSPRÜCHE</B> 1. Verfahren nach Patentanspruch, dadurch ge kennzeichnet, dass man das Medium bewegt und das entstandene oxydierte Steroid isoliert. 2.

Verfahren nach Patentanspruch und Unter anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Nähr medium eine nicht Steroide Quelle für assimilierbaren Kohlenstoff aufweist, und dass das zu oxydierende Steroid in seinem Kohlenstoffskelett bis 22 Kohlen stoffatome aufweist. 3. Verfahren nach Patentanspruch und Unter anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Nähr medium assimilierbares Phosphat und Kohlenhydrat enthält, und dass das zu oxydierende Steroid in 17- Stellung eine Seitenkette mit 2 Kohlenstoffatomen aufweist. 4.

Verfahren nach Patentanspruch und den Unter ansprüchen 1 und 3, dadurch gekennzeichnet, dass das Steroid eine Ketogruppe in 20-Stellung enthält. 5. Verfahren nach Patentanspruch und den Unter ansprüchen 1 und 3, dadurch gekennzeichnet, dass ein Steroid der Formel EMI0005.0063 verwendet wird, worin R Wasserstoff oder Methyl, R' Wasserstoff, eine a- oder ss-Oxygruppe oder eine Oxogruppe und R" Wasserstoff, eine Oxy- oder eine Acyloxygruppe bedeutet,

und das oxydierte Steroid isoliert. 6. Verfahren nach Unteranspruch 5, dadurch ge kennzeichnet, dass man ein Steroid der genannten Formel verwendet, worin R" Wasserstoff bedeutet. 7. Verfahren nach Unteranspruch 5, dadurch ge kennzeichnet, dass man ausgehend von Progesteron 17a-Hydroxy-progesteron herstellt. B. Verfahren nach Unteranspruch 7, dadurch ge kennzeichnet, dass man mit Trichothecium roseum arbeitet. 9.

Verfahren nach Unteranspruch 5, dadurch ge kennzeichnet, dass man ausgehend von 11-Keto-pro- gesteron I1-Keto-17a-hydroxy-progesteron herstellt. 10. Verfahren nach Unteranspruch 9, dadurch ge kennzeichnet, dass man mit Trichothecium roseum arbeitet. 11. Verfahren nach Unteranspruch 5, dadurch ge kennzeichnet, dass man ausgehend von lla-Oxy- progesteron 11a, 17a-Dioxy-progesteron herstellt. 12.

Verfahren nach Unteranspruch 11, dadurch gekennzeichnet, dass man mit Trichothecium roseum arbeitet. 13. Verfahren nach Unteranspruch 5, dadurch ge kennzeichnet, dass man ausgehend von llss-Oxy- progesteron llss,17a-Dioxy-progesteron herstellt. 14. Verfahren nach Unteranspruch 13, dadurch gekennzeichnet, dass man mit Trichothecium roseum arbeitet. 15.

Verfahren nach Patentanspruch, dadurch ge kennzeichnet, dass man von einem 17-Glycolylsteroid ausgeht und den Pilz in einem Medium kultiviert, das assimilierbares Phosphat und Kohlenhydrat enthält. 16. Verfahren nach Patentanspruch, dadurch ge kennzeichnet, dass man von einem 21-Acyloxy-20- keto-steroid ausgeht und den Pilz in einem Medium kultiviert, das assimilierbares Phosphat und Kohlen hydrat enthält. 17.

Verfahren nach Patentanspruch, dadurch ge kennzeichnet, dass man von 17-Desoxy-cortison-21- estern ausgeht und die entstehenden Cortison-21- ester isoliert. 18. Verfahren nach Unteranspruch 17, dadurch ge kennzeichnet, dass man mit Trichothecium roseum arbeitet. 19.

Verfahren nach Patentanspruch, dadurch ge kennzeichnet, dass man Trichothecium roseum unter aeroben Bedingungen in einem Nährmedium züchtet, das ein Steroid enthält, das am Kohlenstoffatom 17 eine Seitenkette mit 2 Kohlenstoffatomen sowie eine 20-Ketogruppe enthält, und das entstandene oxydierte Steroid isoliert.