Verfahren zur Herstellung von 11-Oxy-steroiden
Es ist bereits bekannt, in ein Steroidmolekül, insbesondere in dessen 11-Stellung, Sauerstoff einzuführen, um für die Herstellung von Arzneimitteln wertvolle Zwischenprodukte oder Arzneimittel selbst zu erhalten, die eine sauerstoffhaltige Funktion, insbesondere in 11-Stellung des Moleküls, aufweisen, wie u. a. Corticosteron, 17a-Oxy-11-dehydro-corti- costeron (Cortison) und 17a-Oxycorticosteron (Cortisol). Dies erfolgte bisher durch organisch-chemische Synthese unter Anwendung einer beträchtlichen Anzahl von Verfahrensschritten.
Es wurde nun ein Verfahren zur Herstellung von 11-Oxy-steroiden durch Oxydation von Steroidem, die in 11-Stellung eine Methylgruppe enthalten, gefunden ; das erfindungsgemässe Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, dass man das Steroid einer biochemischen Oxydation unter aeroben Bedingungen mittels Enzymen unterwirft, die von einer Pilzart der Gattung Aspergillus erzeugt werden, und das entstandene 11-Oxy-steroid isoliert.
Dieses Verfahren stellt eine wirksame, ökonomische und kommerziell befriedigende Methode zur Oxydation von Steroiden dar, welche in 11-Stellung eine Methylengruppe enthalten. Die erhaltenen 11 Oxy-steroide sind, wie bereits gesagt, für die Chemie, Pharmacie und Medizin, speziell für die Behandlung physiologischer Abnormitäten, von grösster Bedeutung.
Durch die Einwirkung des Pilzes können ausser in der 11-Stellung auch noch in andern Stellungen des Steroidmoleküls Oxygruppen eingeführt werden, was jedoch nicht unerwünscht ist, da hiebei wertvolle therapeutische Produkte oder Zwischenprodukte entstehen können, z. B. solche, die in 17-Stellung eine Hydroxylgruppe aufweisen. Falls solche zusätzliche Hydroxylgruppen jedoch nicht erwünscht sind, hat man Methoden, um solche Gruppen leicht wieder zu entfernen. Hydroxylgruppen, die sich zu Ketogruppen oxydieren lassen, können gewünschtenfalls, z. B. wenn man ausserordentlich hohe Ausbeuten an 11-Oxy-Steroid zu erhalten wünscht, vor dem Angriff verschiedener Art, einschliesslich dem Angriff durch die oxydierenden Pilze, durch Veresterung, Veräthe- rung, Halogenierung und dergleichen geschützt werden.
Die für das Verfahren verwendbaren Steroide sind in bezug auf Art und Anzahl der Substituenten nicht weiter beschränkt und müssen nur in 11-Stellung eine Methylengruppe aufweisen.
Substituenten oder Kombinationen von Substituenten in 1-, 2-, 3-, 4-, 5-, 6-, 7-, 8-, 9-, 10-, 12-, 13-, 14-, 15-, 16-und 17-Stellung, besonders 10, 13 Dimethylgruppen, 3-, 7-oder 12-Keto,-Oxy-oder -Acyloxygruppen, 17-Seitenketten, von denen die Progesteron-und Corticosteron-Seitenketten besondere Erwähnung verdienen, eine 17-Ketogruppe, eine 17-Oxygruppe und dergleichen, sowie Doppelbindun- gen in 4-, 5-, 6-, 7-, 8-, 16 (17)-Stellung und andern Stellungen oder Kombinationen solcher Stellungen, ausser der 11-Stellung im Kern ; aber auch durch Anlagerung von Halogen oder Halogenwasserstoff an Doppelbindungen des Steroidmoleküls eingeführte Halogensubstituenten und andere in der Steroidchemie zum Teil bekannte Substituenten oder Kombinationen von Substituenten können vorhanden sein.
Ebenso sind Addukte von Dienophilen, wie Maleinsäure, Maleinsäureanhydrid oder Maleinsäureestem mit Steroiden mit konjugierten Doppelbindungen, z. B. mit 5, 7-Dienen, im erfindungsgemässen Verfahren als Ausgangsstoff verwendbar.
Beispiele für Verbindungen, die nach dem Verfahren der Erfindung biochemisch oxydiert werden können, sind : Progesteron, 17a-Oxy-progesteron, Testosteron, Pregnenolon, 3ss-Oxy-5, 16-pregnadien20-on, Acyl-pregnenolone wie Pregnenolonacetat, 3-Oxy-5, 6-oxido-pregnan-20-on (a-oder ss-oxido3, 3-Oxy-5-chlor-pregnan-20-on, 5, 6-Oxido-pregnan-320-dion (a-oder ss-oxido), 4-Brom-und 4-Chlorpregnan-3, 20-dion, 5-Chlor-pregnan-3, 20-dion, 3 Keto-pregnan-20-ol, 3-Keto-allopregnan-20-ol, 3ss- Oxy-16, 17-oxido-21-acetoxy-5-pregnen-20-on, 3fui- Oxy-16, 17-oxido-5-pregnen-20-on, 3ss-Oxy-5, 6,
21tribrom-16, 17-oxido-pregnan-20-on, 3ss-Oxy-16- brom-17-oxy-5-pregnen-20-on, 3 B-Oxy-16-chlor-17- oxy-pregnen-20-on, 3 ss-Oxy-5 (6), 16 (17)-dioxido-pregnan-20-on, 3, B-Oxy-5 (6), 16 (17)-dioxido-21-brompregnan-20-on, 3ft-Oxy-5 (6), 16 (17)-dioxido-21-acetoxy-pregnan-20-on, 3ss-Oxy-5 (6), 16 (17)-dioxido-21 oxy-pregnan-20-on, 11-Desoxy-corticosteron, 11-Desoxy-17-oxy-corticosteron und dessen Acylderivate, wie das Acetylderivat, 21-Oxy-pregnenolon und 21-Acyl-, zum Beispiel-Acetylester desselben, 17, 21-Dioxy-pregnenolon und dessen 17, 21-Diacyl- derivate, zum Beispiel das Diacetylderivat, Androsten-3, 17-dion, Androstan-17-ol,
4-Androsten-3 ol-17-on und 3-Acyl-, z. B. Acetylester desselben ; Ergosterol, Stigmasterol, Stigmastanol und 3-Acyl-, z. B. Acetylester derselben ; Ergosteron, Stigmastenon, Stigmastanon, Cholestenon, Cholsäure, Desoxycholsäure, Lithocholsäure, Cholansäure, Norcholansäure, Bisnorcholansäure, Cholensäure, Norcholensäure, Bisnorcholensäure und 3-Oxy-3-keto-, 3, 7-Dioxy-, 3, 7-Diketo-, 3, 7, 12-Trioxy-, 3, 7, 12-Triketo-, Ester, Thiolester und weitere Derivate dieser Säuren und dergleichen.
Zweckmässig wird ein Steroid mit bis einschliesslich 22 Kohlenwasserstoffatomen im Kohlenstoffskelett oder ein solches mit einer zwei Koh lenstoffatome enthaltenden Seitenkette in 17-Stellung verwendet. Die 10-Normethyl-, 13-Normethyl-und 10, 13-Bisnormethylformen der oben genannten Steroide fallen ebenfalls in die Klasse der Steroide, die nach dem erfindungsgemässen Verfahren biochemisch oxydiert werden können. Die 16-Dehydroform der oben genannten Steroide lässt sich ebenfalls verwenden. Weiterhin lassen sich D-Homosteroide, die auch als Perhydrochrysene bekannt sind, verwenden, wie z. B.
D-Homo-4-androsten-3, 17a-dion, D-Homotestosteron, D-Homo-17aa-methyltestosteron, D Homo-17a/-methyl-testosteron, 17a-Methyl 17a-oxy D-homo-4-androsten-3, 17-dion sowie ihre 4, 5-Dehydroderivate, D-Homoandrosteron (3a-oder 3ss-D- Horno-androstan-17a-on) und D-Homo-epidehydroandrosteron (3ss-Oxy-D-homo-5-androsten-17a-on34 Alle diese sind der biochemischen Oxydation mit Aspergilluspilzen gemäss vorliegender Erfindung zu gänglich.
Die Gattung Aspergillus gehört zur Familie der Aspergillales (Plectascales). Die Klassifizierung und Definition des hier verwendeten Aspergillus ist diejenige von Thom, C. und Church, M. G., The Asper gilli Williams und Wilkins Company, Baltimore, 1926 und umfasst gewisse Species, die früher unter Eurotium gruppiert wurden.
Species der Gattung Aspergillus, die sich für die Fermentierung von Steroiden als geeignet erweisen, umfassen die Aspergillus clavatus-Gruppe, A. clavatus, A. clavellus, A. fusco-cinereus, A. ginganteus, A. pseudo-clavatus ; die A. glaucus-Gruppe, A. amstelodami, A. chevalieri, A. disjuntus, A. echinulatus, A. fontoynonti, A. herbariorum major-Reihe, A. herbariorum-Reihe var. violaceus, A. herbariorum minor-Reihe, A. medius, A. mutabilis, A. repandus, A. repens, A. ruber, A. scheelei, A. sejunctus, A. umbrosus ;
Zwischenspecies verwandt zu A. glaucus, A. conicus, A. gracilis, A. penicilloides, A. varians ; die A. fumigatus Gruppe, A. fischeri, A. fumigatus ; die A. nidulans Gruppe, A. nidulans ; die A. versicolor-Gruppe, A. sydorvi, A. versicolor ; die A. terreus-und A. ustus Gruppen, A. gratioti, A. insuetus, A. terreus, A. ustus ; die A. flavipes-Gruppe, A. flavipes ; die A. candidus Gruppe, A. alliaceus, A. candidus, A. cinnamomeus, die von Schiemann als eine Mutationsform von A. niger erhalten wurde, A. okazakii ; die A. niger- Gruppe, A. atropurpureus, A. carbonarius, A. fumaricus, A. japonicus, A. luteoniger, A. nanus, A. niger, A. phoenicis, A. pulchellus, A. pulverulentus, A. schiemanni, A. violaceofuscus, A. wentii ; die A. ochraceus Gruppe ;
A. citrisporus, A. ochraceus, A. ostanius, A. quericinus, A. sulphureus, A. terricola, A. terricola var. americana ; die A. tamarii-Gruppe, A. erythrocephalus, A. penicillopsis, A. tamarii ; die A. flavusoryzae-Gruppe, A. flavus, A. oryzae, A. parasiticus ; A. niveo-glaucus, A. awomori, A. aereus, A. gymo- sarde und A. luteovirescens. Von den aufgezählten Species ist der Aspergillus niger für das Verfahren der vorliegenden Erfindung speziell bevorzugt.
Die Kultur der Pilze erfolgt in oder auf einem Medium, das für die Entwicklung der Pilze günstig ist. Man kann feste Medien verwenden, doch werden solche bevorzugt, welche eine Bebrütung gro sser Mengen unter aeroben Bedingungen gestatten.
Feuchte, feste kleinteilige Materialien wie Kleie, Getreidekörner, Getreideschrot, Holzschnitzel, Schälspäne, Sägemehl, Maishülsen, Fasermaterial wie Kopra, Kastanien oder Lupinensamen lassen sich verwenden. Diese können mit Alkohol, Äther oder andern organischen Lösungsmitteln extrahiert werden, um vor der Fermentierung unerwünschte Verunreinigungen und das Wachstum hemmende Stoffe zu entfernen. Die Träger können gewünschtenfalls Wachstumsfaktoren und Nährmedien enthalten und können in Schichten oder Schalen mit oder ohne zusätzliche Belüftung in Türmen, wie bei der Herstellung von Weinessig, oder unter Bewegung, wie z. B. in einer rotierenden Trommel, angewendet werden. Flüssige Medien, wie z. B.
Bierwürze, eignen sich ebenfalls zur Verwendung unter aeroben Bedingungen oder genauer unter aeroben, submersen Fermentationsbedingungen. Zweckmässigerweise sollten die Medien ausser dem hiernach erwähnten Kohlenstoff noch assimilierbaren Stickstoff oder Mine ralstoffe enthalten, obschon bereits unter Bedingun gen, die schlechter sind als die optimalen, beträcht- liches Wachstum stattfinden kann.
Zweckmässigerweise sollten die Medien assimilierbaren, nicht steroiden Kohlenstoff enthalten ; dieser kann aus Kohlehydraten, Stärke, gelatinierten Stärken, Dextrinen, Zucker, Melassen des Rohr-, Rüben-oder Sorghumzuckers, aus Glucose, Fructose, Mannose, Gelactose, Maltose, Saccharose, Lactose, Pentosen, Aminosäuren, Peptonen oder Proteinen stammen. Kohlensäure, Glycerin, Alkohole, Essigsäure, Natriumacetat, Citronensäure, Natriumcitrat, niedere Fettsäuren, höhere Fettsäuren oder Fette sind Beispiele für andere Stoffe, welche assimilierbaren Kohlenstoff für den Energiebedarf der Pilze liefern.
Manchmal sind Mischungen verschiedener Kohlen stoffquellen besonders vorteilhaft.
Der assimilierbare Stickstoff kann aus löslichen oder unlöslichen vegetabilischen oder animalischen Proteinen, Sojamehl, Lactalbumin, Casein, Eiweiss, Peptonen, Polypeptiden oder Aminosäuren, Harnstoff, Ammonsalzen, Ammoniak auf Basenaustauschharzen oder Zeolithen, Ammoniumchlorid, Natriumnitrat, Kaliumnitrat, Morpholin herrühren.
Molke, Schlempenkonzentrate, Maisquellwasser oder Hefeextrakt haben sich als nützlich erwiesen.
Als Mineralstoffe kann das Medium von Natur aus vorhandenes oder zugesetztes verfügbares Calcium, Kobalt, Kupfer, Gallium, Eisen, Magnesium, Molybdän, Kalium, Scandium, Uran, Vanadium und Bor enthalten. Schwefel kann durch Sulfate, Alkylsulfonate, Sulfoxylate, Sulfamate, Sulfinate, freien Schwefel, Hyposulfit, Persulfat, Thiosulfat, Methionin, Cystin, Cystein, Thiamin oder Biotin zur Ver fügung gestellt werden. Phosphor, vorzugsweise fünf- wertiger, in Konzentrationen von 0, 001-0, 07 Mol und speziell 0, 015-0, 02 Mol pro Liter kann als Ortho-, Meta-oder Pyrophosphat, Salze oder Ester, Phytin, Phytinsäure, Phytate, Glycerophosphate, Natriumnucleinat, Casein oder Ovovitellin zugegen sein.
Spuren von Bor und Jod können vorteilhaft sein. Es ist erwünscht, das Bor in Form von Borsäure oder Natriumborat speziell nach der Keimung und dem ersten Wachstum der Mikroorganismen zuzugeben.
Je nach Wunsch oder Bedarf kann man auch für das Vorhandensein anderer Wachstumsfaktoren, Vitamine, Auxine, und wachstumsfördernde Stoffe sorgen.
Obschon man feste und flüssige Medien verwenden kann, werden die flüssigen bevorzugt, da sie das Zellwachstum begünstigen.
Suspensionsmittel oder Träger für das Mycel, wie Filtererden, Filterhilfsmittel, feinzerteilte Cellulose, Holzschnitzel, Bentonit, Calciumcarbonat, Kohle, Aktivkohle oder andere suspendierbare feste Stoffe, Methylcellulose, Carboxymethylcellulose oder Alginate können zugesetzt werden, um die Fermentation, Belüftung und Filtration zu erleichtern.
Die gewählte Pilzart der Gattung Aspergillus wächst im Licht oder in der Dunkelheit auf einem Medium, das Kohlenstoff in Form von zum Beispiel Kohlehydraten, wie Zucker oder Stärke, ferner Stickstoff, in Form von zum Beispiel löslichen oder unlöslichen Proteinen, Peptonen oder Aminosäuren und Mineralstoffen, wie Phosphate und Magnesiumsulfat sowie andere bekannte erwünschte oder gün- stige Zusätze zur Verfügung stellt. Das Medium kann vor der Beimpfung einen pli zwischen etwa 2, 8 und 8, 8 oder höher oder niedriger aufweisen. Ein pli von etwa 3-7 wird für die Züchtung der Pilze bevorzugt. Niedrige pH-Werte verhindern die bakterielle Verunreinigung und erleichtern die Sterilisation.
Ein pg von beispielsweise 2-3 gestattet eine wirksame Sterilisation der Medien durch 30 Minuten andauerndes Erhitzen auf 100 C, während bei einem pii von 4-4, 5 die Sterilisation gegebenenfalls bei überatmosphärischem Druck durchzuführen ist. Statt dessen oder gleichzeitig kann man bakterielle Verunreinigungen auch durch die Anwesenheit eines Antiseptikums oder Antibiotikums, wie Benzoate, Sulfite, Pencillin oder Circulin, hintanhalten.
Die Beimpfung des Nährmediums mit dem ge wählten Pilz der Gattung Aspergillus kann in irgendeiner geeigneten Weise erfolgen. Diese Mikroorganismen wachsen in einem grossen Temperaturbereich von etwa 8 bis etwa 45 C, vorzugsweise bei etwa Zimmertemperatur oder zwischen etwa 20 und 33 C.
Die Entwicklungsdauer der Pilzkultur vor der Zugabe des Steroids scheint nicht kritisch zu sein.
So kann man das Steroid dem Nährmedium entweder schon vor der Wärme-oder sonstigen Sterilisation oder im Moment der Beimpfung mit der gewählten Pilzart der Gattung Aspergillus, aber auch einige Zeit, z. B. 24-48 Stunden, nachher zugeben. Das zu oxydierende Steroid kann in irgendeiner geeigneten Konzentration zugesetzt werden, obschon aus praktischen Gründen Konzentration bis zu etwa 0, 6 g pro Liter oder sogar 0, 8 g pro Liter anwendbar sind. Je nach dem speziellen Steroid kann man noch höhere Konzentrationen verwenden, doch wird dann das Wachstum des Mycels etwas gehemmt. Es kann entweder gereinigtes Steroid, ein steroidhaltiges Rohmaterial oder ein vorwiegend Steroid enthaltendes Rohmaterial verwendet werden. Eine Mischung von Steroid und Fett oder Lösungsmittel kann zum Beispiel verwendet werden.
Die Zugabe des zu oxydierenden Steroides kann in irgendeiner geeigneten Weise erfolgen, vorzugsweise derart, dass eine grosse Kontaktfläche des Steroides mit der oxydierenden Aktivität des Pilzes entsteht, indem man entweder das Steroid für sich allein, in einem Dispergiermittel verteilt oder in einem mit Wasser mischbaren, organischen Lösungsmittel gelöst mit dem Pilzmedium vermischt und homogenisiert, wodurch eine Suspension oder Dispersion des Steroids entsteht. Man kann sowohl die submerse als auch die Oberflächenkultur anwenden, erstere wird jedoch bevorzugt. Ferner kann man steroidfermentierende Enzyme aus einer Kultur des Pilzes abtrennen und mit dem Steroid oder einer Lösung bzw. Dispersion desselben ver mischen und die Mischung unter aeroben Bedingungen halten, um das Steroid zu fermentieren.
Die Temperatur während der Fermentierung des Steroids kann die gleiche sein wie bei der Incubation des Pilzes. Man muss sie nur in solchen Grenzen halten, dass das Leben, das aktive Wachstum oder die Enzymaktivität des Pilzes erhalten bleiben.
Obschon jede Form der aeroben Bebrütung für die gewählte Pilzkultur oder die Fermentierung des Steroidsubstrates anwendbar ist, hängt die Wirksamkeit der Steroidfermentierung von der Belüftung ab. Man steuert deshalb in der Regel die Belüftung zum Beispiel durch Bewegung und/oder durch Einblasen von Luft durch das Fermentationsmedium.
Die Belüftung kann durch Oberflächenkultur oder unter submersen Fermentationsbedingungen erfolgen.
Aerobe Bedingungen erreicht man nicht nur durch Verwendung von Luft als Sauerstoffträger, sondern auch durch Verwendung anderer Quellen oder Gemische, die Sauerstoff in freier oder abspaltbarer Form besitzen. Verwendet man Luft als Belüftungsmedium, so ist ein günstiger Belüftungsgrad etwa 4 bis 20 Millimol Sauerstoff pro Stunde und Liter, bestimmt nach der Methode von Cooper, Fernstrom und Miller, Ind. Eng. Chem. 36, 504 (1944). In den Ausführungsbeispielen beträgt die gleichzeitig mit Rühren durchgeführte Belüftung 4, 8 und 20 Millimol Sauerstoff pro Stunde und Liter mit Rühr- geschwindigkeiten von 176, 250 und 360 Umdrehungen pro Minute.
Unter gewissen Bedingungen ist es erwünscht, in der Pilzkultur-und Entwicklungsstufe eine andere Belüftungsgeschwindigkeit zu verwenden als in der Steroidfermentierungsstufe. Die Belüftung kann durch Anwendung von Vberdruck oder von Unterdruck, z. B. 2, 1 Atmosphären oder 0, 7 Atmosphären, absolut modifiziert werden. Die Sauerstoffaufnahme kann durch die Anwesenheit ver schiedener Katalysatoren, wie Ascorbinsäure, Glut aminsäure, Citronensäure, Milchsäure, Tyrosin oder Tryptophan, begünstigt werden.
Die für die Fermentierung der Steroide erforderliche Zeit wechselt je nach der Art des Vorgehens etwas. Wenn das Steroidsubstrat schon bei der Beimpfung des Nährmediums mit dem Pilz zugegen ist, kann die Fermentierung 8-72 Stunden dauern. Gibt man jedoch das Substrat erst nach einer aeroben Wachstumsperiode von zum Beispiel 16 oder 24 Stunden bei optimaler Temperatur zur Nährlösung, so beginnt die Umwandlung des Steroidsubstrates sogleich, und man erhält hohe Ausbeuten innerhalb von 1 bis 72 Stunden, wobei im allgemeinen 24 Stunden befriedigen.
Die Steroide können in einem Arbeitsgang oder in mehreren aufeinanderfolgenden Arbeitsgängen behandelt werden, wobei von den in den verschiedenen Arbeitsgängen verwendeten Mikroorganismen einer Aspergillus ist, und man erhält so andere wertvolle Produkte, die nach bekannten Methoden, einschliesslich der Verwendung von Enzymen, wie zum Beispiel Amylase, Invertase, Lipase, Maltase, Protease, proteolytische Enzyme, Lab, Urease und Säuren, wie zum Beispiel Citronensäure, Fumarsäure, Gluconsäure, Itakonsäure und Oxalsäure, aufgearbeitet werden können. Diese Fermen tierungsprodukte können von der Fermentierungsflüssigkeit gleichzeitig, vor oder nach Beendigung der Fermentierung, getrennt werden.
Nach Beendigung der Steroidfermentierung wird das entstandene fermentierte Steroid aus der Reak tionsmischung gewonnen. Eine besonders vorteilhafte Methode besteht darin, die Reaktionsmischung einschliesslich der Fermentierflüssigkeit und des Mycels mit einem wasserunlöslicnen, organischen Lösungs- mittel für Steroide zu extrahieren. Solche Lösungs- mittel sind zum Beispiel Methylenchlorid, Athylenchlorid, Trichloräthylen, Äther, Amylacetat und dergleichen. Man kann die Fermentierflüssigkeit vom Mycel trennen und beide getrennt extrahieren. Das Mycel kann entweder mit in Wasser mischbaren Lösungsmitteln oder mit in Wasser nicht mischbaren Lösungsmitteln extrahiert werden. Aceton eignet sich besonders gut.
Die vom Mycel befreite Fermentierflüssigkeit kann man mit in Wasser nicht mischbaren Lösungsmitteln behandeln. Die Extrakte kann man vor oder nach dem Auswaschen mit Alkalilösungen, wie zum Beispiel Natriumbikarbonat, vereinigen und dann zum Beispiel über wasserfreiem Natriumsulfat trocknen. Das gereinigte fermentierte Steroid wird durch Umkristallisieren aus organischen Lösungsmitteln oder auf chromatographischem Wege isoliert.
Die folgenden Beispiele sollen die Erfindung noch näher erläutern.
Beispiel 1
Eine Lösung, enthaltend 20g Edamin (enzy- matisch abgebautes Lactalbumin), 3 g Maisquellwasser und 50 g technische Dextrose pro Liter Leitungswasser, wird mit Salzsäure und Natronlauge auf PH 6, 4 eingestellt. In einem mit Rührer und Sprenkler ausgestatteten Kolben von etwa 19 Liter Inhalt gibt man 12 Liter dieser Lösung und sterilisiert. Nach der Sterilisation beträgt der PH 5, 75. Diese sterilisierte Lösung wird nun mit Sporen von Aspergillus nidulans (ATCC Nr. 10074) beimpft und die Belüftung auf 1 Liter Luft pro Minute und die Drehzahl des Rührers auf 200 Umdrehungen pro Minute eingestellt. 48 Stunden später werden 3 g 21-Acetoxy-4-pregnen-3, 20-dion (11-Desoxy-corticosteronacetat) in 100 cm3 Aceton gelöst, zugegeben. Der pjj beträgt nun 4, 9.
Nach 24 Stunden wird die Fermentierung abgebrochen. Am Schluss der Umsetzung beträgt der pEl-Wert 4, 8.
Das Mycel wird von der Flüssigkeit durch Abquetschen auf Gaze getrennt und dann zweimal mit je einem seinem Volumen entsprechenden Volumen Aceton, dann zweimal mit je einem etwa seinem Volumen entsprechenden Volumen Methylenchlorid extrahiert. Die Extrakte werden mit der wässerigen Fermentierungslösung vereinigt und das Ganze viermal mit je 3 Liter Methylenchlorid extrahiert. Die vereinigten Methylenchloridextrakte werden zweimal mit je einem Zehntel ihres Volumens 2 /oiger wäss- riger Natriumbicarbonatlösung und dann zweimal mit dem gleichen Volumen Wasser gewaschen. Der Methylenchloridextrakt wird mit wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und auf einem Dampfbad stark konzentriert.
Der vom Lösungsmittel befreite, konzentrierte Extrakt ist eine dunkelbraune harzige Masse, die 7, 039 g wiegt. Man löst sie in 430 cm3 Athylen- dichlorid und chromatographiert über 240 g Flori sib (synthetisches Aluminiumoxyd), wobei man mit 430-cm3-Portionen Lösungsmittel eluiert, wie in Tabelle I angegeben. Die papierchromatographische Analyse der Fraktionen wurde unter Verwendung des Toluol-Propylenglycol-Systems durchgeführt, und die Ergebnisse sind in den Spalten 4 und 5 der Tabelle enthalten. Dabei wurden aliquote, 160-Mikrogramm-Eluatfeststoffe der nebenstehenden Fraktionen in gelöster Form enthaltende Teile verwendet.
In Fraktion 24 findet sich im Vergleich zu den benachbarten Fraktionen 23 und 25 ein Maximum an Eluatfeststoffen von 329, 8 mg. Diese Feststoffe werden in überschüssigem Methylenchlorid gelöst, filtriert, um Unlösliches zu entfernen und bis zum Verbleiben eines harzigen Rückstandes eingedampft.
Diesen löst man in 1 cm3 Athylacetat und kühlt, wobei Kristallisation stattfindet. Die Rohkristalle schmelzen bei 140-162C. Die gleich behandelte Fraktion 21 gibt Kristalle vom Smp. 151-158 C.
Die Infrarotabsorptionsspektralanalyse bestätigt das Produkt als lla, 21-Dioxy-4-pregnen-3, 20-dion (11 Epicorticosteron). Die Fraktionen 20-24 vom Gewicht 1, 097 g werden in Methylenchlorid vereinigt, mit 3 g Magnesob (ein Magnesiumsilikat) entfärbt, filtriert und zur Trockne eingedampft. Der Rückstand wird in 3 cm3 siedendem Athylacetat gelöst.
Nach dem Abkühlen auf Zimmertemperatur leitet man die Kristallisation ein. Man filtriert und wäscht dreimal mit je einem cm3 kaltem Athylacetat und dann mit Ather. Die aus lla, 21-Dioxy-4-pregnen- 3, 20-dion bestehenden Kristalle schmelzen bei 153 bis 158 C und haben einen [a]D20 von +166 (c= 0,746 in Chloroform). Ausbeute 15,5%.
Chromatographische Analysentabelle
EMI5.1
<tb> <SEP> 21-oxy-4-pregnen-lla, <SEP> 21-Dioxy-4- <SEP>
<tb> Eluierte <SEP> 3,20-dion <SEP> pregnen-3, <SEP> 20-dion
<tb> Fraktion <SEP> Lösungsmittel
<tb> <SEP> Feststoffe <SEP> mg <SEP> (Desoxy-corti- <SEP> (11-Epicorticoste
<tb> <SEP> costeron,) <SEP> ron, <SEP> 1) <SEP>
<tb> <SEP> 1 <SEP> Athylendichlorid <SEP> (3 <SEP> Vol.) <SEP> 633, <SEP> 6
<tb> <SEP> 2 <SEP> Äthylendichlorid <SEP> (1 <SEP> Vol.) <SEP> 63, <SEP> 1
<tb> <SEP> 3 <SEP> Athylendichlorid-Aceton <SEP> 25 <SEP> : <SEP> 1 <SEP> 32, <SEP> 4
<tb> <SEP> 4 <SEP> do. <SEP> 180, <SEP> 8
<tb> <SEP> 5 <SEP> Athylendichlorid-Aceton <SEP> 15 <SEP> :
<SEP> 1 <SEP> 120, <SEP> 1
<tb> <SEP> 6 <SEP> do. <SEP> 252
<tb> <SEP> 7 <SEP> Äthylendichlorid-Aceton <SEP> 12 <SEP> : <SEP> 1 <SEP> 297, <SEP> 2
<tb> <SEP> 8 <SEP> do. <SEP> 311, <SEP> 9 <SEP> 70
<tb> <SEP> 9 <SEP> Athylendichlorid-Aceton <SEP> 10 <SEP> : <SEP> 1 <SEP> 266, <SEP> 7
<tb> <SEP> 10 <SEP> do. <SEP> 264, <SEP> 9
<tb> <SEP> 11 <SEP> Äthylendichlorid-Aceton <SEP> 8 <SEP> : <SEP> 1 <SEP> 165, <SEP> 1
<tb> <SEP> 12 <SEP> do. <SEP> 175
<tb> <SEP> 13 <SEP> do. <SEP> 128
<tb> <SEP> 14 <SEP> do. <SEP> 95, <SEP> 6
<tb> <SEP> 15 <SEP> Athylendichlorid-Aceton <SEP> 5 <SEP> :
<SEP> 1 <SEP> 70, <SEP> 4
<tb> <SEP> 16 <SEP> do. <SEP> 81, <SEP> 9
<tb> <SEP> 17 <SEP> do. <SEP> 61, <SEP> 0
<tb> <SEP> 18 <SEP> do. <SEP> 53
<tb> <SEP> 19 <SEP> Athylendichlorid-Aceton <SEP> 2 <SEP> : <SEP> 1 <SEP> 42, <SEP> 3 <SEP>
<tb> <SEP> 20 <SEP> do. <SEP> 180 <SEP> 1 <SEP> 90
<tb> <SEP> 21 <SEP> do. <SEP> 273 <SEP> 80
<tb> <SEP> 22 <SEP> do. <SEP> 179, <SEP> 5 <SEP> Spur <SEP> 80
<tb> <SEP> 23 <SEP> Aceton <SEP> 135
<tb> <SEP> 24 <SEP> do. <SEP> 329, <SEP> 8 <SEP> - <SEP> 70
<tb> <SEP> 25 <SEP> do. <SEP> 72, <SEP> 5
<tb> <SEP> 26 <SEP> do. <SEP> 39, <SEP> 9
<tb> <SEP> Total <SEP> 4504, <SEP> 7
<tb>
Beispiel 2
In der gleichen Weise wie im Beispiel 1 stellt man unter Verwendung von Aspergillus niger (ATCC Nr.
10577) und 17a-Oxy-progesteron als Ausgangssteroid, das 11 a, 17a-Dioxy-progesteron her.
Beispiel 3
In der gleichen Weise wie im Beispiel 1 stellt man unter Verwendung von Aspergillus niger (ATCC Nr. 10577) und 17a, 21-Dioxy-progesteron als Ausgangssteroid das lla, 17a, 21-Trioxy-progeste- ron her.
Beispiel 4
In der gleichen Weise wie im Beispiel 1 stellt man unter Verwendung von Aspergillus niger (ATCC Nr. 10577 und Pregnan-3, 20-dion als Aus gangssteroid das 11 a-Oxypregnan-3, 20-dion her.
Beispiel 5
In der gleichen Weise wie im Beispiel 1 stellt man unter Verwendung von Aspergillus niger und 21-Oxy-4-pregnen-3, 20-dion das 11a, 21-Dioxy-4- pregnen-3, 20-dion her.
Beispiel 6
Auf die im Beispiel 1 angegebene Weise erhält man in einem auf pH 6, 35 eingestellten Nährmedium, das mit Aspergillus niger (ATCC Nr. 10577) beimpft ist und Progesteron enthält, ohne Vorkultur nach 48 Stunden Rühren mit 360 U/min und einer Belüftung von 20 Millimol Sauerstoff pro Liter und Stunde lla-Oxy-progesteron.
Beispiel 7
Auf die im Beispiel 1 angegebene Weise wird ein auf einen pH-Wert von 5, 3 eingestelltes Nährmedium mit Aspergillus ventii (ATCC Nr. 10583) beimpft und 48 Stunden kultiviert. Hernach gibt man 12 g in möglichst wenig Aceton gelöstes Progesteron zu, und nach 24stündiger Fermentierung bei einer Rührgeschwindigkeit von 250 U/min gewinnt man das gebildete lIu-Oxy-progesteron.
Beispiel 8
Auf die im Beispiel 1 angegebene Weise wird ein auf einen pH-Wert von 6, 0 eingestelltes Nährmedium mit Aspergillus fischeri (ATCC Nr. 1020) beimpft und 48 Stunden kultiviert. Dann gibt man 3 g 21 Acetoxy-4-pregnen-3, 20-dion (11-Desoxy-corticosteron-acetat) in möglichst wenig Aceton gelöst zu und isoliert, nach 24stündiger Fermentierung bei einer Drehzahl von 250 U/min, das gebildete 11a, 21-Dioxy-4-pregnen-3, 20-dion (Epicorticosteron).
Beispiel 9
In analoger Weise wie im Beispiel 8 arbeitet man mit Aspergillus clavatus (ATCC Nr. 9598).
Beispiel 10
In analoger Weise wie im Beispiel 8 arbeitet man mit Aspergillus nidulans (ATCC Nr. 10074).
Beispiel 11
In analoger Weise wie im Beispiel 8 wird der pH-Wert des Mediums auf 5, 9 eingestellt, mit Aspergillus ustus (ATCC Nr. 10032) beimpft und das in guter Ausbeute entstandene 1 la, 21-Dioxy-4-pregnen- 3, 20-dion (Epicorticosteron) isoliert.
Beispiel 12
12 Liter eines Mediums folgender Zusammensetzung : 5 g Sojamehl, 20 g Cerelosep (Handelsdextrose), 5 g entbitterter Brauerhefeextrakt, 5 g NaCl und 5 g einbasisches Kaliumphosphat, verdünnt mit Leitungswasser auf 1000 cm3, werden auf pH 6, 6 eingestellt, sterilisiert, mit Aspergillus niger (ATCC Nr. 10577) beimpft und 48 Stunden kultiviert. Nun setzt man 3 g in möglichst wenig Aceton gelöstes Progesteron zu und kultiviert weitere 48 Stunden mit einer Rührgeschwindigkeit von 250 U/min. Das entstandene 11 a-Oxy-progesteron wird wie im Beispiel 1 isoliert, wobei aliquote Teile der Steroidlösung der Papierchromatographie unterworfen werden.
Beispiel 13
In gleicher Weise wie im Beispiel 12 verwendet man hier Aspergillus itaconius (ATCC Nr. 10021) zur Herstellung von 1la-Oxy-progesteron.
Beispiel 14
In gleicher Weise wie im Beispiel 12 stellt man den pil-Wert des Nährmediums auf 3, 7 und beimpft mit Aspergillus niger (ATCC Nr. 6275) zur Herstellung von lla-Oxy-progesteron.
Beispiel 1S
In gleicher Weise wie im Beispiel 12 stellt man den pH-Wert des Nährmediums auf 6, 5 und beimpft mit Aspergillus clavatus (ATCC Nr. 10058). Sogleich darauf wird Progesteron in der Kultur dispergiert.
Nach 48 Stunden Fermentierung mit einer Rühr- geschwindigkeit von 176 U/min wird das entstehende fermentierte Steroid, das lla-Oxy-progesteron enthält, isoliert.
Beispiel 16
In analoger Weise wie im Beispiel 12 stellt man den pH-Wert des Mediums auf 3, 7 und beimpft mit Aspergillus ustus. Sogleich danach gibt man Progesteron zu der Kultur. Nach 48stündiger Fermentierung bei einer Rührgeschwindigkeit von 250 Umdrehungen pro Minute wird das gebildete fermentierte Steroid lla-Oxy-progesteron isoliert.
Beispiel 17
12 Liter eines Mediums, das im Liter Leitungswasser folgende Bestandteile enthält : 50 g Cerelosep (Handelsdextrose), 30 g Saccharose, 2 g Ammoniumnitrit, 1 g einbasisches Kaliumphosphat, 0, 5 g Ma gnesiumsulfat, 0, 01 g Ferrosulfat, 0, 2 g Zinksulfat, 0, 1 g Mangansulfat und 2 g Hefeextrakt werden auf pli 6, 65 eingestellt, sterilisiert und 48 Stunden mit Aspergillus ventii (ATCC Nr. 10583) kultiviert.
Dann gibt man 3 g in möglichst wenig Aceton ge löstes Progesteron zu und fermentiert weitere 48 Stunden bei einer Rührgeschwindigkeit von 250 U/ min. Die entstandenen fermentierten Steroide werden wie im Beispiel 1 isoliert. Man erhält lla-Oxy- progesteron.
Beispiel 18
Man arbeitet wie im Beispiel 17 unter Verwendung von Aspergillus ochraceus (ATCC Nr. 1009) und gibt sogleich nach der Beimpfung Progesteron dazu. Nach 48 Stunden wird das 11 a-Oxy-progeste- ron enthaltende fermentierte Steroid isoliert.
Beispiel 19
In gleicher Weise wie im Beispiel 17 gibt man zu einer 48stündigen Kultur von Aspergillus flavus (ATCC Nr. 9170) in einem Nährmedium, das vor der Sterilisation auf Pll 4, 5 eingestellt war, Progesteron und fermentiert 48 Stunden bei einer Rührgeschwin- digkeit von 360 U/min, wonach man das entstandene fermentierte Steroid, das lla-Oxy-progesteron, durch Extraktion und Chromatographie gewinnt.
Beispiel 20
Analog wie im Beispiel 17 gibt man zu einer 48stündigen Kultur von Aspergillus flavus (ATCC Nr. 9170) in einem vor der Sterilisation auf pg 4, 5 eingestellten Nährmedium Progesteron und fermentiert 48 Stunden mit einer Rührgeschwindigkeit von 260 U/min. Das entstandene lla-Oxy-progesteron wird durch Extrahieren und Chromatographie gewonnen.
Beispiel 21
12 Liter eines Mediums, das pro Liter Leitungswasser folgende Bestandteile enthält : 20 g Maisquellwasser, 20 g Dextrin, 1 g einbasisches Kaliumphosphat, 2 g Natriumnitrat, 0, 5 g Magnesiumsulfat. 0, 2 g Kaliumchlorid, 0, 01 g Ferrosulfat und 2 g Natriumacetat, werden auf pl, 3, 90 eingestellt, sterilisiert und 48 Stunden mit Aspergillus flavus (ATCC Nr. 9170) kultiviert. Dann gibt man 3 g in möglichst wenig Aceton gelöstes Progesteron zu und fermentiert weitere 48 Stunden bei einer Rührgeschwindigkeit von 250 U/min. Das entstandene lla-Oxy-progesteron wird wie im Beispiel 1 extrahiert und isoliert.
Beispiel 22
12 Liter des gleichen Mediums wie im Beispiel 21 werden mit Aspergillus ustus (ATCC Nr. 10032) beimpft und sogleich 3 g in möglichst wenig Aceton gelöstes Progesteron zugesetzt. Man fermentiert weitere 48 Stunden bei einer Rührgeschwindigkeit von 176 U/min und isoliert das lla-Oxy-progesteron wie im Beispiel 1.
Beispiel 23
12 Liter Raulinsches Nährmedium, das im Liter destilliertem Wasser 50 g Dextrose, 3 g Weinsäure, 3 g Ammoniumnitrat, 0, 4 g zweibasisches Ammoniumphosphat, 0, 5 g Kaliumcarbonat, 0, 2 g Ammoniumsulfat, 0, 05 g Zinksulfat, 0, 05 g Ferrosulfat, 1 g Natriumacetat und 0, 3 g Magnesiumcarbonat enthält, werden auf PH 3, 95 eingestellt, sterilisiert und 48 Stunden mit Aspergillus niger (ATCC Nr. 10549) kultiviert. Dann setzt man 3 g in möglichst wenig Aceton gelöstes Progesteron zu. Nach 48stündiger biochemischer Oxydation bei einer Rührgeschwindig- keit von 250 U/min wird das entstandene 11a-Oxy- progesteron wie im Beispiel 1 extrahiert und isoliert.
Beispiel 24
12 Liter des gleichen Mediums wie in Beispiel 23 werden mit Aspergillus nidulans (ATCC Nr. 10074) beimpft und sofort mit einer Lösung von 3 g Prog esteron in möglichst wenig Aceton versetzt. Nach 48stündiger Fermentierung werden die entstandenen Steroide extrahiert und wie im Beispiel 1 das lla- Oxy-progesteron isoliert. ¯
Beispiel 25
In analoger Weise wie im Beispiel 24 erhält man unter Verwendung eines vor der Sterilisation auf PH 4, 5 eingestellten, mit Aspergillus luchunesis (ATCC Nr. 10061) beimpften Mediums und Fer mentierung bei einer Rührgeschwindigkeit von 250 Umdrehungen pro Minute lla-Oxy-progesteron.