<B>Procédé de</B> préparation <B>d'un nouvel</B> antibiotique L'invention se rapporte à un procédé de préparation d'un nouvel antibiotique. Dans la description qui suit, ce nouvel antibiotique sera dénommé antibiotique C , à titre de simplification.
L'antibiotique C est un composé basique cristallin, fondant à 182-184 C, et qui ne contient que les éléments carbone, hydrogène, oxygène et azote. Son pouvoir rotatoire, (a) D, est de -I- 180,9() dans le méthanol, son poids moléculaire en solution dans du cam phre est d'environ 552 et sa formule empirique probable est CzrH3708N5, basée sur les données analytiques :
56,85 % de carbone, 6,96 % d'hydrogène et 12,82 % d'azote. Il est en outre caractérisé par le fait qu'il présente des maxima d'absorption dans l'ultraviolet à 256 et 311.5 my avec un E i m de 358 et 291, res pectivement, dans l'acide chlorhydrique 0,1 N, à 250 et 320,
5 my avec un E i 0m0 de 270 et 536, respectivement, dans un tampon au phos phate de<I>pH 7,0,</I> et à 330 mu avec un Ei 0mo de 626 dans de la soude caustique 0,1 N.
Les bandes d'absorption les plus intenses dans le spectre d'absorption infrarouge de l'antibioti que C sont celles situées à ou près de 5,98, 6,09, 6,24, 7,99, 9,16, 9,50 et 9,62,u. Un autre groupe de bandes d'absorption caracté ristiques d'intensité modérée se trouve dans la région de 9,8 à 12,7,u. A l'état de base libre, l'antibiotique C est assez peu soluble dans l'eau froide et facilement dissous dans l'eau chaude, d'où il peut être séparé par refroidis sement.
On peut l'extraire de ses solutions aqueuses avec du n-butanol, du fait qu'il est bien soluble dans cet alcool, de même que dans d'autres alcools aliphatiques inférieurs ; il est insoluble dans l'éther éthylique.
L'antibiotique C donne un chlorhydrate bien soluble dans l'eau et le méthanol. Il est précipité de ce dernier solvant par addition d'éther éthylique. A une concentration de 3,12 à 15,6 ,ug/cm3, l'antibiotique C cristallisé em pêche complètement la croissance du Myco- bcccterium tuberculosis var. hominis <I>H</I> 37 Rv.
L'antibiotique C donne des réactions néga tives aux essais pour les groupes carbohydrate, protéine, polypeptide, phénolique, énolique, guanidine monosubstituée, cétonique, aldéhy- dique et a-aminoacide, il donne une réaction positive pour le groupement arylamine avec le réactif d'Ehrlich, et une réaction Bratton- Marshall positive, pour le même groupement.
Son R f (en utilisant la technique ascen dante) est de 0,16 dans un mélange de solvants composé de 3 parties en poids d'acétate d'éthyle, de 3 parties en poids d'eau et d'une partie en poids d'acide acétique. Par contre, son R f est 0,28 dans un mélange de solvants composé de 10 parties en poids de n-butanol, d'une partie en poids d'acide acétique et de 4 parties en poids d'eau.
L'antibiotique C est précipité de ses solu tions aqueuses par plusieurs des agents usuels de précipitation de bases, entre autres l'acide p-hydroxyazobenzène-p-sulfonique, l'acide pi crique, l'Orange II, l'acide flavianique, l'acide p-nitro-benzèneazochromotropique, le rouge
EMI0002.0005
TABLE <SEP> I
<tb> Activité <SEP> antibactérienne <SEP> de <SEP> l'antibiotique <SEP> C
<tb> <I>Espèces <SEP> Ante- <SEP> Espèces <SEP> Anti-</I>
<tb> <I>de <SEP> bactéries <SEP> biotique <SEP> C <SEP> de <SEP> bactéries <SEP> biotique <SEP> C</I>
<tb> ESPÈCES <SEP> Résistant <SEP> à <SEP> la <SEP> néomycine <SEP> 25
<tb> GRAM-POSITIVES <SEP> Résistant <SEP> à <SEP> la
<tb> <I>Diplococcus <SEP> pneumoniae</I> <SEP> 1,
0 <SEP> streptomycine <SEP> 50
<tb> <I>Micrococcus <SEP> pyogenes</I> <SEP> var. <SEP> Résistant <SEP> à <SEP> la
<tb> <I>aureus</I> <SEP> 25 <SEP> streptothricine <SEP> 25
<tb> <I>Streptococcus <SEP> hemolyticus</I> <SEP> 5,0 <SEP> Résistant <SEP> à <SEP> l'antibiotique
<tb> produit <SEP> par <SEP> S. <SEP> rimosus <SEP> 50
<tb> ESPÈCES <SEP> RÉSISTANT <SEP> Résistant <SEP> à <SEP> l'antibiotique
<tb> AUX <SEP> ACIDES <SEP> produit <SEP> par <SEP> S. <SEP> puniceus <SEP> 25
<tb> <I>Mycobacterium <SEP> tuberculoses</I> <SEP> <B>3,1-</B>
<tb> var. <SEP> ESP<B>ESPÈCES</B>
<tb> <I>homlnls</I> <SEP> l5,6
<tb> H <SEP> 37 <SEP> Rv. <SEP> GRAM-NÉGATIVES
<tb> <I>Mycobacterium <SEP> sp.
<SEP> Aerobacter <SEP> aerogenes</I> <SEP> > <SEP> 100
<tb> ATCC <SEP> 607 <SEP> <I>Escherichla <SEP> col!</I> <SEP> > <SEP> 100
<tb> Culture <SEP> mère <SEP> <I>25 <SEP> Hemophllus <SEP> pertussis</I> <SEP> 5,0
<tb> Résistant <SEP> à <SEP> la <SEP> chlortétra- <SEP> <I>Klebsiella <SEP> pneumoniae</I> <SEP> > <SEP> 100
<tb> cycline <SEP> <I>25 <SEP> Vibrio <SEP> comma</I> <SEP> 100 Congo, le jaune Milling 3G. Les précipités qui se forment sont des solides ou gommes in solubles dans l'eau, mais solubles, pour la plu part, dans les alcools inférieurs ou dans le méthyl-cellosolve.
L'antibiotique C est très actif contre cer taines bactéries résistantes aux acides , qui sont les agents causant la tuberculose. L'acti vité de l'antibiotique C contre le Mycobacte- rium <I>tuberculoses</I> var. hominis <I>H</I> 37 Rv, est à peu près égale à celle de plusieurs antibioti- ques connus tels que celui produit par le Strep tomyces puniceus, la streptothricine, et la néo mycine, et supérieures à celles de la chlorté- tracycline. Ce nouvel antibiotique est aussi for tement actif, au point de vue bactériostatique,
contre les bactéries gram-positives de même que certaines bactéries gram-négatives.
La table I montre de façon plus frappante le spectre antibiotique remarquable de l'anti biotique C. Le procédé selon l'invention de préparation de ce nouvel antibiotique est caractérisé en ce qu'on inocule un milieu nutritif stérile avec le microorganisme<I>Streptomyces C 1730,</I> en ce qu'on cultive le milieu nutritif inoculé dans des conditions aérobies à une température de 20 à 40,) C pendant une période de 1 à 15 jours et en ce qu'on isole du milieu de culture un antibiotique basique fondant sous forme cristallisée et pure à 182-184 C.
Cet anti biotique est soluble dans les acides dilués et dans les alcools aliphatiques inférieurs : il est peu soluble dans l'eau froide, facilement dis sous dans l'eau chaude et insoluble dans l'éther éthylique ; il est précipité de ses solu tions aqueuses avec formation de sels colorés par les agents usuels de précipitation pour les bases, tels que l'acide p-hydroxyazobenzène- p-sulfonique, l'acide picrique et l'Orange II. Il possède une activité antibiotique contre Mycobacterium tuberculosis var. hominis <I>H</I> 37 Rv.
Le<I>Streptomyces C 1730</I> est un actino- mycète du genre<I>Streptomyces.</I> Ce microorga nisme se trouve entre autres dans les sols. On peut obtenir des cultures en mélangeant des cultures des bactéries spécifiques inhibées par l'antibiotique C avec de l'agar aqueux et en y ajoutant un sol contenant le<I>Streptomyces</I> <I>C 1730</I> désiré. Après incubation du mélange pendant un à dix jours, il apparaît des colo nies de l'actinomycète désiré et d'autres anta gonistes.
Les colonies du<I>Streptomyces C 1730</I> sont séparées des autres et transférées dans un milieu nutritif frais, puis isolées comme cul tures pures selon les méthodes usuelles. Une culture vivante de ce microorganisme a été déposée au Bureau de Culture Parke, Davis & Cie, à Détroit, Michigan, sous N 04918.
Examiné au microscope, cet organisme est un actinomycète aérobie qui forme un faible mycélium aérien ramifié, rarement ou pas cloisonné, et qui donne naissance à des chaî nes de conidies unicellulaires : il est donc un membre du genre<I>Streptomyces.</I> Lorsqu'il a crû sur un milieu glucose-thryptone-agar, le jeune mycélium primaire humide apparaît in colore à jaunâtre, devenant ensuite gris : le mycélium secondaire aérien est d'abord blanc, et devient ensuite gris. Il n'apparaît que peu ou pas de pigments dans l'agar. Les colonies en surface sont circulaires, exhaussées, ridées ou à crêtes radiales, avec un bord continu ou ondulé. Le mycélium primaire humide est hyalin et excessivement ramifié.
Il présente des embranchements primaires, secondaires et quelquefois tertiaires, qui peuvent être alternés, opposés et parfois verticillés. Le mycélium aérien est ondulé et forme souvent des bou- cles terminales ou des spires lâches. Les por tions distales de ce mycélium aérien se subdi visent en chaînes de conidies d'une longueur de 15 à 55 microns. Les conidies sont hyalines, sphéroïdales à ovoïdales, d'un diamètre moyen de 0,85 microns (compris entre 0,5 et 1,2), et d'une longueur moyenne de 1,3 microns (entre 0, 8 et 1, 8).
Cet organisme liquéfie lentement la géla tine, sans formation de pigments, et peptonise le lait tournesolé usuellement avec une réaction basique. En milieu synthétique (de Gottlieb), l'organisme utilise de nombreuses sources de carbone y compris le 1-arabinose, le dextrose, le d-fructose, le d-galactose, ri-inosite, le lac tose, le maltose, la d-mannite, le rhamnose, l'amidon et le d-xylose ;
il utilise moins facile ment l'inuline, le raffinose, la d-sorbite et le sucrose, et ne peut utiliser la dulcite. Cet orga nisme utilise les sources d'azote organiques et inorganiques.
Lorsqu'on exécute le présent procédé à l'aide de milieux nutritifs aqueux, la matière solide présente dans le mélange de culture est enlevée et l'antibiotique cherché est isolé à partir du liquide de culture par les méthodes décrites dans la suite. Lorsqu'on emploie un milieu nutritif solide, le mélange de culture est bien lavé avec un solvant de l'antibiotique, tel que l'eau ou le méthanol, et l'antibiotique cherché est isolé à partir de cet extrait. Durant la phase d'incubation, on maintient la tem pérature de préférence dans le voisinage de 22 à 290 C. Lorsque l'on utilise des milieux nutritifs aqueux, le<I>pH</I> initial est d'ordinaire entre 6 et 8,2, et de préférence du côté alcalin entre 7,3 et 7,7.
Pour l'inoculation du milieu nutritif, on peut employer des suspensions de spores, des sub-cultures ou des cultures en tube couché du<I>Streptomyces C 1730.</I>
La culture du microorganisme en milieu nutritif aqueux peut être effectuée de bien des manières différentes. Par exemple, le micro organisme peut _ être cultivé dans des condi tions aérobies à la surface du milieu, ou bien il peut être cultivé au-dessous de ladite sur face, c'est-à-dire en condition submergée, à condition de fournir en même temps de l'oxy- gène.
La méthode préférée pour produire l'an tibiotique C sur une large échelle est celle à culture submergée ou en profondeur du <I>Streptomyces C 1730.</I> Selon cette manière d'exécuter l'invention, un milieu nutritif aqueux stérile est inoculé avec du<I>Streptomyces</I> <I>C 1730</I> et incubé avec agitation et aération à une température entre 200 et 40o C, de pré férence au voisinage de 25,) à 35o C, pendant un à quatre jours. Dans ces conditions, l'orga nisme se développe en nombreuses particules plus ou moins séparées, réparties dans tout le milieu, en contraste avec la pellicule plus ou moins continue présente à la surface du milieu, dans la méthode de culture en sur face.
Grâce à cette distribution de l'organisme dans tout le milieu, on peut cultiver en une seule fois de grands volumes du milieu nutri tif inoculé dans de grands réservoirs et cuves utilisés ordinairement dans l'industrie de fer mentation. Des foudres de fermentation sta tionnaires munis de moyens convenables d'agi tation et d'aération, de même que des tambours rotatifs horizontaux, sont particu lièrement avantageux à ces fins. Cependant, pour la préparation de petites quantités de l'antibiotique ou de cultures du microorga nisme, cette méthode de culture submergée peut être exécutée dans de petites bouteilles qui sont secouées ou agitées par des moyens mécaniques convenables. L'agitation et l'aération du mélange de culture peuvent être obtenues de diverses ma nières.
L'agitation peut être produite par un propulseur ou par un dispositif mécanique semblable d'agitation, par rotation ou secouage du récipient lui-même, par différents disposi tifs de pompage, ou par passage à travers le milieu d'air ou d'autres gaz contenant de l'oxygène. L'aération peut être produite en injectant dans le mélange en fermentation de l'air ou autres gaz contenant de l'oxygène à travers des tuyaux ouverts, des tuyaux perfo rés, des organes poreux de diffusion tels que des bougies de charbon, du carborundum, du verre aggloméré et semblables ; elle peut aussi être produite en pulvérisant, projetant ou ver- sant le mélange à travers une atmosphère contenant de l'oxygène.
Le gaz contenant l'oxygène est débarrassé de spores, de bacté ries ou autres agents de contamination avant d'être introduit dans le mélange de culture. Ceci peut être obtenu très commodément en le filtrant à travers un lit de noir animal activé. L'intensité d'aération assurant un rendement maximum en antibiotique C dépendra, il va de soi, quelque peu du genre de réservoir em ployé, de l'intensité et du genre de l'agitation, du<I>pH,</I> de la température et d'autres condi tions de ce genre. En tout cas, le gaz conte nant de l'oxygène est de préférence fourni en quantité suffisante pour maintenir une faible pression positive dans le récipient et éliminer ainsi toute possibilité de contamination de la la culture par rentrée d'air extérieur.
Avec des récipients du type à réservoir de 30 litres de capacité, une quantité de 10 à 15 litres d'air par minute donne de bons résultats, quand on l'utilise avec un propulseur mécanique type turbine à six pales, de 10 cm de diamètre, tournant à 100-200 tours à la minute en regard de quatre déflecteurs périphériques ver ticaux de 2,5 cm sur 40.
On peut employer une grande variété de milieux nutritifs. De tels milieux contiennent d'ordinaire une source de carbone assimilable, une substance protéinique, des sels minéraux et des traces de diverses substances nutritives, vitamines et autres stimulants de croissance, qui se trouvent en général comme impuretés dans les autres constituants du milieu. Pour une production maximum de l'antibiotique C, le milieu nutritif contiendra aussi avantageu sement une source de graisse.
Comme source de carbone assimilable, on comprend ici les alcools polyhydroxyliques, et les mono-, di- et polysaccharides, tandis que par matière protéinique , on comprend des protéines non modifiées et des produits de dégradation des protéines, en particulier ceux de l'hydrolyse de protéines. De tels produits de dégradation sont les protéases, les peptones, les polypep tides, les peptides et les aminoacides.
Comme source de carbone assimilable, on peut employer l'arabinose, le fructose, le ga- lactose, le lactose, le maltose, le rhamnose, le xylose, la glycérine, la marmite, la rhamnite et semblables, de même que des matières com plexes à base d'hydrates de carbone, telles que les amidons, la dextrine, les lavasses de fermen tation et de distillation, les céréales solides trempées à l'eau, des liquides de trempage de céréales, des résidus séchés de fermentation et autres semblables.
Parmi les matières protéiniques utilisables dans les divers milieux, on peut citer l'extrait de b#uf, la caséine hydrolysée à l'acide, la peptone de boeuf, la farine de tourteau de soya, des résidus secs de fermentation, la fa rine de fèves de soya, soluble à l'eau, dégrais sée et partiellement hydrolysée, des mélanges d'acides aminés provenant de sources natu relles ou synthétiques, l'urée, les purines et semblables. L'emploi de farine de tourteau de soya ou de dérivés de protéines de soya comme constituants du milieu est avantageux et four nit une faible quantité de graisse, utilisable par le microorganisme.
On peut satisfaire aux principaux besoins en constituants minéraux par addition de 0,1 à 0,5 % d'un ou plusieurs sels inorganiques tels que le chlorure de sodium, le carbonate de calcium, le phosphate dipotassique, le phospate monopotassique et semblables.
Les autres constituants du milieu nutritif, c'est-à- dire les vitamines, les stimulants de croissance et semblables, sont généralement présents en quantités suffisantes dans les sources de car bone assimilable impures et/ou les matières protéiniques.
L'antibiotique C peut être isolé du mé lange brut de culture par de nombreuses voies différentes. Lorsqu'on a utilisé un _ milieu de culture solide, le mycélium est traité pour ex traction avec un dissolvant de l'antibiotique C tel que l'eau, et le produit est isolé de l'extrait comme décrit dans la suite. Quand on a em ployé un milieu de culture liquide, le mélange peut être filtré pour enlever le mycélium, ou bien on peut amener le<I>pH</I> du mélange avec un acide à environ 2 à 4, et éliminer ensuite le mycélium par filtration.
Pour obtenir l'antibiotique à partir des extraits ainsi formés, on peut procéder par extraction par solvant, avec des alcools ali phatiques inférieurs miscibles à l'eau, tels que le n-butanol, ou par les méthodes d'adsorption et élution, en employant du charbon activé ou des échangeurs d'ions comme adsorbants et du méthanol acidifié ou de l'ammoniaque aqueuse, respectivement, comme éluants.
Les méthodes ci-dessus conduisant à l'ob tention de concentrats bruts, lesquels peuvent ensuite être purifiés par fractionnement avec des solvants organiques, par exemple par dis solution dans du méthanol et précipitation fractionnée avec de l'éther éthylique, ou par précipitation avec un acide arylsulfonique sui vie d'une régénération à partir du sel colorant ainsi formé.
La séparation de l'antibiotique C à partir des concentrats bruts purifiés peut être effec tuée de diverses façons. Par exemple, l'anti biotique C peut être obtenu comme solide cristallisé par recristallisation du résidu de concentration de l'effluent aqueux. Ou bien une solution aqueuse du concentrat brut peut être traitée par de l'ammoniaque pour précipiter fractionnairement l'antibiotique C.
Cet anti biotique C veut encore être obtenu d'une solution aqueuse du concentrat par addition d'acétate de potassium, pour produire une précipitation par ajustement du<I>pH</I> et par relargage.
A côté dé l'antibiotique C, il se forme tou jours dans le milieu de culture ün autre anti biotique, dénommé antibiotique D. Ce dernier constitue un sous-produit de valeur, suscep tible d'être également récupéré et purifié en vue de son utilisation en thérapeutique.
L'invention est illustrée par les exemples suivants <I>Exemple 1</I> Un mélange formé de 180 g d'amidon de blé en poudre, 180 g de caséine hydrolysée à l'acide, 90 g de farine de tourteau de soya, 90 g de chlorure de sodium, et d'eau en suffi sance pour faire un volume de 18 litres, est mis dans un récipient de verre type cuve sta- tionnaire, pourvu d'une calotte d'acier inoxy dable et d'un propulseur à turbine. Le réci pient est revêtu de verre et possède quatre déflecteurs intérieurs verticaux de 2,5 cm sur 40. Il est équipé pour introduire trois courants d'air dans les eaux du propulseur.
On règle le<I>pH</I> du mélange dans le réci pient à 7,5 avec une solution de soude caus tique 10 N. On additionne le mélange de 72 g de saindoux brut et d'huiles végétales conte nant des mono- et di-glycérides et 18 g de carbonate de calcium. Le récipient et le milieu de culture sont stérilisés sous 1,35 atm de vapeur pendant deux heures, puis le récipient et son contenu sont refroidis et sortis de l'auto clave.
Le milieu est inoculé aseptiquement avec 10 cm3 d'une suspension de spores de<I>Strepto-</I> <I>myces C 1730</I> préparée en secouant une cul ture en tube couché de<I>Streptomyces C 1730</I> de 7 jours sur glucose-tryptone-agar avec 10 cmd d'une solution aqueuse de savon blanc dit de Castille, à 0,01 %.
Après inoculation, le mélange de culture est incubé à 24-26 C pendant 24 heures. Pendant l'incubation, on fait passer de l'air stérile à travers l'anneau de diffusion à raison de 0,9 à 1,16 litres d'air à la minute par litre du milieu, et on fait tourner l'agitateur à une vitesse d'environ 200 tours à la minute.
On suit la production d'antibiotique durant l'incubation en prélevant de temps en temps des échantillons et en les essayant par rapport <I>à</I> l'Escherichia coli. Au bout de 64 heures, chaque millilitre de culture équivaut à 920 ,u- de l'étalon, dans l'essai par rapport<I>à</I> l'Esche- richia coli. L'étalon est un concentrat de l'antibiotique C d'une activité telle qu'une solution de 2,5 ,
cig de l'étalon par cm3 pro- duit une inhibition de 50 % de l'Escherichia coli.
Les bières de plusieurs fermentations effec tuées comme décrit ci-dessus, sont combinées à la fin de la période d'incubation. Le<I>pH</I> du mélange est amené à 2,47 avec de l'acide sul furique, et le mycélium est enlevé par filtration et lavé à fond avec de l'eau. Le filtrat et les eaux de lavage combinés (41,1 litres) sont amenés à un<I>pH</I> de 9,10 et extraits avec six portions de 10 litres de n-butanol. Les ex traits au n-butanol combinés sont concentrés à<B>10,6</B> litres dans un évaporateur à une tem pérature au-dessous de 29 C. Un précipité jaune pâle, sensiblement inerte, qui se forme pendant cette concentration, est éliminé par filtration.
Le filtrat est extrait avec 8 portions de 1,5 litre d'acide chlorhydrique aqueux 0,01 N. Les extraits acides combinés sont traités avec suffisamment d'un échangeur d'ions résineux (phase basique) pour éliminer l'excès d'acide, et la solution est concentrée à l'éva porateur à 300 C, jusqu'à 1,5 litre. Cette solu tion est alors séchée à l'état congelé, et le résidu, du poids de 20,08 g, contient, d'après l'essai avec l'Escherichia coli, <I>452</I> icg de l'éta lon par mg.
Pour purifier encore ce concentrat brut; on en ajoute 5,0 g à 25 cm3 de méthanol absolu. Il se sépare environ 1,4 g d'un solide insoluble blanc, que l'on lave avec quatre portions de 5 cm3 de méthanol absolu. Les liquides sur- nageants combinés sont dilués à 50 cm3 avec du méthanol absolu. On ajoute alors 100 cm3 d'éther éthylique et le précipité jaune brun qui se forme est séparé par centrifugation, lavé avec de l'éther éthylique, et séché dans le vide.
Le rendement est de 2,4 g et le produit contient, selon l'essai avec l'Escheri- chia coli, 900 ,ug de l'étalon par mg. Ce pro duit brut purifié est très soluble dans l'eau.
Pour isoler l'antibiotique C de ce concen- trat brut purifié, on fait passer 500 mg de ce dernier, dissous dans 65 ml d'eau<I>(pH 4,9)</I> à travers une colonne contenant un échangeur d'ions résineux, à la phase basique. La co lonne est alors lavée à l'eau jusqu'à ce que le liquide qui en sort ne donne plus de réac tion avec le réactif d'Ehrlich. Le , liquide ef fluent est concentré par séchage à l'état congelé et l'on obtient un produit soluble dans 25 ml d'eau chaude. Le refroidissement de cette solution à 0-10 C produit un précipité gélatineux, que l'on fait recristalliser à partir d'eau chaude, et l'on obtient un corps cristal lin formé d'antibiotique C, sous forme d'ai- guilles, de PF 180-1280 C.
Le spectre d'ab sorption dans l'ultraviolet est le suivant
EMI0007.0003
Le R f (technique ascendante) pour l'anti biotique C ainsi obtenu est de 0,16 dans un mélange de solvants composé de 3 parties en poids d'acétate d'éthyle, de 3 parties en poids d'eau et d'une partie en poids d'acide acétique. Par contre, son Rf est 0,28 dans un mélange de solvants composé de 10 parties en poids de n-butanol, d'une partie en poids d'acide acétique et de 4 parties en poids d'eau.
Cet antibiotique C donne une réaction Bratton-Marshall positive, et une réaction posi tive avec le réactif d'Ehrlich. Son activité en regard de l'Escherichia coli correspond à 814 /Lg/mg de l'étalon.
<I>Exemple 2</I> Un mélange formé de 1,5 g de cérélose, 1,5 g de glycérine, 0,9 g de caséine partielle ment hydrolisée, 0,75 g de peptone, 0,3 g de levure de brasserie, 0,75 g de céréales solides trempées à l'eau, 0,75 de farine de tourteau de soya, 1,5 g de résidus de fermentation butanol-acétonique, 1,5 g de chlorure de so dium, 0,3 g de carbonate de calcium et suffi samment d'eau pour porter le volume à 300 cm3, est mis dans plusieurs flacons d'Erlenmeyer de 1 litre.
Les flacons sont cou verts par de la gaze de coton et stérilisés sous 1,25 atm de vapeur pendant 25 minutes, puis chaque flacon est inoculé aseptiquement avec 1 cm3 d'une suspension de spores<I>de</I> Strepto- myces <I>C 1730</I> préparée à l'aide d'une culture en tube couché de trente jours sur glucose- tryptone-agar. Les flacons sont secoués sur une machine secoueuse du type rotatif, à 150 tours par minute, pendant quatre jours. La température pendant la période d'incubation est maintenue à 22-240 C.
A la fin de cette période d'incubation, la bière de culture a un <I>pH</I> d'environ 6,7. En l'essayant par rapport au Staphylococcus aureus, on a constaté que cette bière de culture produit une inhibition de 63 % de la croissance de l'organisme d'essai à une dilution de 1 à 100.
Le mycélium est séparé par filtration du bouillon contenu dans les flacons ci-dessus mentionnés, et le<I>pH</I> du filtrat est amené de 8,6 à 7,17 avec de l'acide sulfurique 3 N. L'antibiotique est retiré de 100 cm3 du filtrat par quatre extractions avec des portions de 25 cm3 de n-butanol. Les extraits alcooliques combinés sont évaporés à siccité à moins de 4.5o C et l'on obtient un concentrat brut.
1,0 g de ce concentrat brut est dissous dans 20 cm3 d'eau. On ajoute alors une solu tion de 550 mg d'acide p-hydroxyazobenzène- p-sulfonique dans 11 cm3 d'eau, ce qui pro voque la formation immédiate d'un précipité gommeux. Le mélange est centrifugé, et le liquide surnageant, décanté. Le résidu gom meux est lavé à l'eau et recristallisé à partir de 6 cm3 d'éthanol absolu et 9 cm3 d'eau. Le précipité qui se forme par refroidissement est retiré par centrifugation, bien lavé à l'eau, et séché dans le vide (poids: 570 mg).
Le complexe de couleur est alors dissous dans 10 cm3 de méthanol et précipité sous forme de poudre jaune orange par addition de 30 cm3 d'éther éthylique (poids : 475 mg).
450 mg de ce complexe coloré sont dissous dans 20 cm3 de méthanol à 50 /o, et on y ajoute une solution aqueuse d'acétate de baryum jusqu'à ce que la précipitation de p-hydroxyazobenzène-p-sulfonate de baryum soit complète. Le précipité est éliminé par cen trifugation et, au liquide surnageant, on addi tionne 1 cm3 en excès d'acide sulfurique 2 N après que tout ion baryum a été éliminé comme sulfate de baryum. Ce dernier est enlevé par centrifugation. Le liquide jaune clair surnageant est alors envoyé à travers une colonne d'échangeur d'ions en résine synthé tique (phase basique). Le liquide effluent jaune clair a un<I>pH</I> de 7,6.
La colonne est lavée à l'eau jusqu'à ce que les eaux de lavage ne réagissent plus avec le réactif d'Ehrlich. L'effluent et les eaux de lavage donnent, par séchage à partir de l'état congelé, une poudre légèrement jaune (poids : 173 mg) d'une acti vité par mg de 1150 itg de l'étalon, quand on l'essaie par rapport<I>à</I> l'Escherichia coli.
A 49 mg du concentrat brut purifié, on ajoute 1 cm3 d'eau et assez d'hydroxyde d'am monium pour porter le<I>pH</I> à 9,0. Il se forme un précipité blanc que l'on sépare par centri fugation. Le solide est lavé à l'eau chaude et recristallisé à partir de méthanol aqueux à 10 0/0, ce qui donne des aiguilles légèrement colorées en jaune, PF 180-182o C, identiques à l'antibiotique C obtenu à l'exemple 1.
<I>Exemple 3:</I> Un mélange formé de<B>180</B> g de glycérine, 90 g de farine de tourteau de soya, 180 g de caséine hydrolysée à l'acide, 90 g de chlo rure de sodium et assez d'eau pour avoir un volume total de 18 litres, est introduit dans un récipient de verre type cuve stationnaire pourvu d'une calotte en acier inoxydable et d'un propulseur type turbine. Le récipient est revêtu de verre et possède quatre déflec teurs intérieurs verticaux de 2,5 cm sur 40. II est équipé pour introduire trois courants d'air dans les eaux du propulseur.
Le<I>pH</I> du mélange est réglé à 7,5 avec une solution 10 N de soude caustique. On ajoute au mélange 180 g de saindoux pour empêcher la formation d'écume et 18 g de carbonate de calcium. Le récipient et le mi lieu de culture sont stérilisés sous 1,35 atm de vapeur pendant deux heures. Le récipient et son contenu sont refroidis et sortis de l'autoclave.
Le milieu est inoculé aseptique- ment avec 10 ml d'une suspension de spores de<I>Streptomyces C 1730</I> préparée en agitant une culture en tube couché de 7 jours sur glucose-tryptone-agar avec 10 cm3 d'une solu- tion aqueuse à 0,01 % de savon blanc dit de Castille.
Après inoculation, le mélange de culture est incubé à 25,, C pendant 88 heures. Pendant l'incubation, on fait passer de l'air stérile à travers l'anneau de diffusion à raison de 0,3 à 1,0 litre à la minute par litre du milieu, et fait tourner l'agitateur à environ 200 tours par minute.
On suit la production d'antibiotique du rant l'incubation, en prélevant de temps en temps des échantillons et en les essayant par rapport<I>à</I> l'Escherichia coli. Au bout de qua rante heures, chaque millilitre de culture équivaut à 188 ,ug <I>de</I> l'étalon dans l'essai avec l'Escherichia coli <I>;</I> après soixante heures, cha que millilitre équivaut à 410 ,ug ; et au bout de 88 heures, chaque millilitre est l'équivalent de 636 11g de l'étalon.
La culture brute acidifiée est filtrée pour éliminer le mycélium et le filtrat est amené à un<I>pH</I> de 7,0 avec de la soude caustique diluée. A une colonne contenant 600 cm3 d'une résine échangeuse de cations dans le cycle de l'hydrogène, on ajoute 7,5 litres du filtrat- bouillon de<I>pH 7,0.</I> Après lavage de la colonne avec de l'eau, la fraction antibiotique est com plètement évacuée de la colonne par élution avec de l'ammoniaque aqueuse 5 N. La frac tion antibiotique peut être obtenue à partir de cet éluat comme concentré brut, purifiable par les méthodes décrites aux exemples 1 et 2.
L'antibiotique C peut être isolé de ce concentrat brut purifié, de la façon suivante A 500 mg du concentrat brut purifié, dans 7 cm3 d'eau, on ajoute une solution concen trée d'acétate de potassium (50 g dans 25 cm3 d'eau) jusqu'à ce que le<I>pH</I> de la solution totale soit de 8,1. Il se forme un précipité gommeux qui se solidifie en peu de temps. Le solide est séparé par filtration et lavé à fond par trituration sous l'eau. Ce solide, après la vage et séchage sous vide, pèse 160 mg et par recristallisation à partir de méthanol aqueux, donne un produit en aiguilles, PF 178-1790 C, identique à l'antibiotique C obtenu dans les autres exemples.
<I>Exemple 4:</I> 100 cm3 de bouillon filtré, obtenu dans des conditions analogues à celles de l'exemple 3 et dont le<I>pH a</I> été amené à 7,5 avec une solu tion aqueuse de soude caustique, sont agités pendant 20 minutes avec 300 mg de charbon activé. La suspension est filtrée et le gâteau de charbon est agité avec 25 cm3 de méthanol acidifié (contenant 0,05 cm3 d'acide chlorhy drique 5 N par 100 cm3 de méthanol). Le mélange est filtré et l'élution est répétée.
Les extraits au méthanol sont réunis et concentrés dans le vide ; le concentrat brut contient envi ron 50% de l'activité du bouillon original.
L'antibiotique C peut être isolé à partir du bouillon de culture par chacune des métho des décrites dans les exemples précédents. <I>Exemple 5 ;</I> Un mélange formé de 1,0 g de glycérine, 0,5 g de farine de tourteau de soya, 0,5 g de peptone du commerce, 0,5 g de chlorure de sodium, et d'eau en suffisance pour porter le volume à<B>100</B> ml, est mis dans plusieurs flacons d'Erienmeyer. Les contenus de ces fla cons sont réglés<I>à pH</I> de 7,5 avec une solution 10 N de potasse caustique et on y ajoute 0,1 g de carbonate de calcium.
Les flacons sont re couverts avec de .la gaze de coton et stérilisés sous 1,02 atm de vapeur pendant 20 minutes ; chaque flacon est alors inoculé avec 1 cm3 d'une suspension de spores d'une culture en tube couché de vingt-sept jours sur glucose- tryptone-agar. Les flacons sont secoués sur une machine secoueuse du type rotatif, à 160 tours par minute, pendant six jours. La tempé rature est maintenue à 24-26 C pendant la période d'incubation. A la fin de cette période, le bouillon de culture a un<I>pH</I> de 8,3.
Essayé par rapport<I>à</I> l'Escherichia coli, un millilitre de bouillon est équivalent à 800 ,ug de l'étalon.
L'antibiotique C peut être isolé de ce bouillon de culture par chacune des méthodes décrites aux exemples 1, 2 et 3.
Des résultats analogues peuvent être obte nus en remplaçant la peptone par de la le vure de brasserie débarrassée de ses substances amères. <I>Exemple 6:</I> Un milieu nutritif formé de 1,25 g de glycérine, 0,75 g de caséine hydrolysés à l'acide, 1,25 g de céréales solides trempées à l'eau, 1,25 g de chlorure de sodium, et d'assez d'eau pour porter le volume à 250 cm3, est rendu alcalin à un<I>pH</I> de 7,3 avec une solu tion 10 N de soude caustique. Après addition de 0,25 g de carbonate de calcium, le mélange est mis dans un flacon de Fernbach bouché avec un tampon de coton, et stérilisé sous pression de vapeur de 1,25 atm, pendant 25 minutes.
Le milieu est inoculé avec 2 cm3 d'une suspension de spores de<I>Streptomyces</I> <I>C 1730</I> provenant d'une culture en tube couché de 7 jours sur glucose -tryptone-agar. Le mélange résultant est incubé à 29 C pendant 11 jours. Au bout de ce temps, le bouillon de culture a une activité, déterminée par rapport<I>à</I> l'Escherichia coli, équivalent à 273 ,ug de l'étalon, par millilitre de bouil lon.
L'antibiotique C peut être isolé à partir du bouillon de culture par chacune des méthodes décrites aux exemples 1, 2 et 3.