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ANTIBIOTIQUES'ET PROCEDE POUR.LEUR PREPARATION.
L'invention est relative à des nouveaux composés chimiques utiles comme agents thérapeutiques à cause de leurs propriétés antibiotiques. plus particulièrement, l'invention est relative à deux nouveaux produits antibiotiques auxquels on a attribué arbitrairement les noms d'Antibiotique C et Antibiotique D. '
L'antibiotique C est un composé basique cristallin, qui fond à
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environ 182 à 1840C et qui ne contient que les éléments carbone, hydrogène, oxygène et azote. Il possède une rotation optique (o()26 d'environ + 180,9 dans le méthanol, un poids moléculaire d'environ 552 en D solution :dans lecamphre et une formule empirique probable C26H37o8X5 basée sur des données analytiques t 56,85% de carbone, 6,96% dehydrogène et 12,82% deazote.
Il se caractérise en outre en ce qu'il présente des maxima d'absorption dans l'ultra-violet à 256 et 311,5 millimicrons avec un El% de respectivement 358 et 291 dans l'acide chlorhydrique 0,1 N, à 250 et 320,5 millimi-
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crcns avec un El% de respectivement 270 et 536 dans un tampon de phosphate au pH 7, p et à 1 cm 330 millimicrons avec un E% de 626 dans l'hydroxyde de sodium<o,1 N. Les bandes d'absorption les plus intenses dans le spectre d'absorption infrarouge de l'antibiotique C sont celles qui sont localisées à ou au voisinage de 5,98, 6.09? 6o2L,,9 7.995 9.16s 9.50 et 9.62. microns.
Un autre groupe de bandes d'absorption caractéristiques d'intensité modérée se situe dans la région de 9,8 à 12,7 microns. Sous forme de 'base libre, l'antibiQtique C est assez difficilement soluble dans l'eau froide et aisément soluble dans 1?eau chaude dont il se sépare par refroidissement. on peut l'extraire de solutions aqueuses par le n-butanol, car il est aisément soluble dans cet alcool aussi bien que dans d'autres alcools aliphàtiques inférieurs.mais il est insoluble dans l'éther éthylique.
L'antibiotique C forme un chlorhydrate aisément soluble dans l'eau et le méthanol. on le précipite de ce dernier solvant par addition d'éther
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éthylique. A une concentration de 3,12 a 15,6 microgrammescm3 l'antibiotique C cristallin inhibe complètement la croissance du Mvcobacteri tuber-
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culosis var. hominis H37RV.
L'antibiotique C donne des résultats négatifs aux essais de Molisch, au biuret, de Sakaguchi., à la ninhydrine, au chlorure ferrique et de Fehling. Il donne un résultat positif à l'identification du groupement arylamino ave c
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le réactif d'Ehrlich et un résultat positif à l'essai de Bratton Mars'ta7l.. pour le même groupement. L'indice Rf, en utilisant la technique d'ascension, dans l'acétate d'éthyle (3), l'eau (3) et l'acide acétique (1) pour l'anti-
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biotique C est de p,16, L'indice Rf dans le n-butanol (la), l'acide acéti- que (1) et l'eau (4) est de 0,28.
L'antibiotique C est précipité de sa solution aqueuse par un grand nombre des agents de précipitation usuels des bases, par exemple l'a-
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cide p-hydroxyazobenzéne-p=sia3.fonique, l'acide picrique, l'orangé II, l'aci- de flavianique, l'acide p-nitrobenzèneazochromotropique, le Rouge Congo, le Jaune Millins 3G. Les précipités formés sont des corps solides ou des gommes insolubles dans l'eau, solubles pour la plupart dans des alcools inférieurs ou dans le méthyl cellosolve.
L'antibiotique D est un solide basique amorphe, couleur tan pâ- le,ne contenant que les éléments carbone, hydrogène, oxygène et azote. Il est très soluble dans l'eau et le méthanol, est soluble dans l'éthanol chaud et se sépare de ce dernier solvant par refroidissement. Il est insoluble dans l'acétone,l'éther éthylique, l'acétate d'éthyle et le benzène. Il est en outre caractérisé en ce qu'il présente des maxima d'absorption dans l'ul-
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traviolet à 37,, millimicrons avec un El% de 123 dans l'acide chlorhydrique 0,1 N, à 302 millimicrons avec un ÉliÎo' 1 cm de 125 dans un tampon de phosphate au pH 7?0 et à 321,5 millimicrons avec un El% de 143 dans l'hydroxyde de sodium Oel N, A une concentration de 12,5 cm microgrammes/cm3, l'antibiotique D inhibe complètement la croissance du Xycobacterium tuberculosis var. hominis E37 Rv.
L'antibiotique D a un indice Rf de 0,0 dans l'acétate d'é- thyle (3), l'eau (3) et l'acide acétique (1) et un indice Rf de 0,19 dans
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le n-butanol (10). l'acide acétique (1) et l'eau (4). L'antibiotique D don- ne également des résultats négatifs aux essais avec le réactif d'Ehrlich et les réactifs de Bratton-Marshall. on peut le précipiter de solutions aqueuses par de nombreux agents de précipitation usuels des bases, par exemple
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l'acide p-hydroxyazobenzéne-p-sulfonique, l'acide picrique, l'orangé II, l'acide flavianique, l'acide p-nitrobenzèneazochromotropique, le Rouge Congo, le Jaune Millins 3G. Les précipités qui se forment sont des solides ou gommes qui sont solubles pour la plupart dans des alcools inférieurs et dans le méthyl cellosolve.
Les antibiotiques C et D sont très actifs contre certaines bactéries résistant aux acides, qui sont des agents de la tuberculose. Les activités des antibiotiques C et D contre le Mycobactérium tuberculosis var. hominis H37Rv sont environ égales à celles de plusieurs autres antibioti-
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ques connus tels que la viomycine, la streptothricire, et le néomycine, et supérieure à celle de l'auréomycine. Ces nouveaux antibiotiques sont également fortement actifs au point de vue bactériostatique contre des bactéries gramme-positives aussi bien que contre certaines bactéries gramme-négatives.
Quelques exemples des bactéries gramme-positives générateurs de
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maladie sont le Di"plococcus pneumoniae. le streptococcus hemolyticus et le Micrococcus pyogeners var. aureus. parmi les bactéries gramme-négatives contre lesquelles ces produits présentent leur action bactériostatique se trouvent des bactéries pathogènes telles que l'Hemophilus pertussis et l'Escherichia Colin Le tableau I représente de façon plus éclantante les spectres antibiotiques remarquables des antibiotiques C et D comparés aux spec- tres d'antibiotiques connus produits par des actinomycètes.
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1 A v L àà A U le
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Activité antibactérienne d-ar-tibiotiques C et D et des antibiotiques+ examinés en cliniques et produits par des Actinomycètesc
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<tb> Anti- <SEP> Anti- <SEP> Auréo- <SEP> chlor- <SEP> Néo- <SEP> strep- <SEP> Strep- <SEP> Terra- <SEP> VioTypes <SEP> de <SEP> bactéries <SEP> bioti- <SEP> bioti- <SEP> myci- <SEP> amphé-- <SEP> myci- <SEP> tomy- <SEP> tothri-
<tb>
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cu.e C que D ne nicol ne cine cine mycine - glycine TYPES GRAMME-POSITIFS Diplococcus pneumoniaen 1,0 10 0,05 z0 100 25 2,5 1,0 50
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<tb> Micrococcus <SEP> pyrogenes <SEP> var.
<SEP> aureus <SEP> 25 <SEP> 5PO <SEP> 0,1 <SEP> 5,0 <SEP> 0,75 <SEP> 2,5 <SEP> 5,0- <SEP> 0,75 <SEP> Plus <SEP> de
<tb> 10 <SEP> 100
<tb>
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streptococcus hemolyticus 5,0 2,5 0,1 1,0 50 50 50 à plus 0,75 Plus de
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<tb> de <SEP> 100 <SEP> 100
<tb> TYPES <SEP> RESISTANT <SEP> AUX <SEP> ACIDES.
<tb>
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Mycobacterilm tuberculosis var. hominis 3,1 12, 25- 6,25- 6,25- 6,25 1z, 5 25 6,25H37RVa 15,6 100 12,5 as, 5 50 12 5 M.ycobacterium s¯ ATCC 607 Culture parente 25 12,5 12,5 50 0,39 0,39 3,12 0,78 1,56 Résistante à l'auréomycine 25 12,5 200 0,39 Os39 6,25 25 6,25
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<tb> Résistante <SEP> à <SEP> la <SEP> néomycine <SEP> 25 <SEP> 12,5 <SEP> 12,5 <SEP> plus <SEP> de <SEP> 0,39 <SEP> 3,12 <SEP> 1,56 <SEP> 1,56
<tb> 12,5
<tb> Résistante <SEP> à <SEP> la <SEP> streptomycine <SEP> 50 <SEP> 25 <SEP> 25 <SEP> 0,19 <SEP> plus <SEP> de <SEP> 6,25 <SEP> 0,78 <SEP> 0,78
<tb>
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Résistante à la Streptothricine 25 25 6,25 39 100 2 . 25 1 6 ï2'- .........
bzz25 0, 6, 5 5 1,56 3, Résistante à la Terramycine 50 12,5 200 0,39 0,39 6,25 50 z25 Résistante à la Viomycï.ze 25 12,5 25 0,19 3,12 6,25 3,12 12,5 TYPES GRAMME-NEGATIFS Aerobacter aeroenes >loo 25 0,1 0,5 0,5 2,5 0,75- 1,0 25 Lscherichia coli zs 5 Escherichia coli i 100 3 loo 0,75 z95 ,5 10 5,0 5,0 i 100 Hemophilus pertussis 5,0 1,0 0,2 0,2 z,0 z,0 7,5 093 50 Klebsiella pneumoniae > 100 > 100 0,5 1,0 0,25 0,5 0,5 2,5 10 µµbrio¯gomma loo 5Q 0,1 l,0 10 z5 10- 1,0 100 ¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯ 25 + Ceux qui ne sont pas inscrits sur ce tableau manquent d'activité anti-tuberculaire notable,
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Conformément à la présente invention, on produit les antibiotiques C et D par la culture aérobique de cultures d'un actinomycete du genre Streptomyces,
désigné par le numéro de laboratoire C1730. Ce microorganisme existe entre autres dans le sol. On peut obtenir des cultures par le mélange de cultures des bactéries spécifiques inhibées par les antibiotiques C et D avec de l'agar aqueux et en ajoutant de la terre contenant le Streptomyces C1730, Après incubation du mélange pendant un à dix jours, apparaissent des colonies de l'actinomycete désiré et d'autres antagonistes. on sélectionne les colonies de streptomyces C1730, on les transfère dans un milieu de culture frais et on les sépare ultérieurement sous forme de culture pure par les procédés usuels.
Une culture vivante de ce microorganisme a été déposée au Bureau de Culture de la Compagnie PAREE DAVIS & COMPANY à Détroit, Michigan sous le n 04918.
Au microscope, l'organisme est un actinomycète aérobique qui forme un mycélium aérien fragile ramifié, rarement ou pas du tout cloisonné; il donne naissance à des chaînes de conidia unicellulaires, et est par conséquent un élément du genre streptomyces, Quand on le cultive sur un milieu de glucose-tryptone-agar, le mycélium primaire jeune humide apparaît incolore à jaunâtre, tournant plus tard au gris. Le mycélium secondaire aérien est d'abord blanc et tourne plus tard au gris, peu ou pas de pigments n'apparaissent dans l'agar. Les colonies de surface sont circulaires, dressées, plissées ou à nervures radiales avec une marge entière ou ondulée.
Le mycélium primaire humide est vitreux et ramifié à foison. Le mycélium aérien secondaire est également ramifié à foison. Des ramifications primaires, secondaires, et parfois tertiaires apparaissent et peuvent être alternées,opposées ou occasionnellement verticillées. Le mycélium aérien est onduleux, et forme fréquemment des boucles terminales ou des spirales détachées. Les parties extrêmes de ces ramifications aériennes se subdivisent en chaînes conidiales de 15 à 55 microns de longueur. Les conidia sont vitreux, sphéroïdes à ovoïdes, ayant en moyenne 0,85 microns de diamètre (gamme de 0,5 à 1,2) et 1,3 microns de longueur (gamme de 0,8à 1.8).
Le Tableau II indique les différences caractéristiques entre le streptomyces C1730 et d'autres actinomycetes producteurs d'antibiotiqaes aux points de vue de l'aspect et de la susceptibilité actinophage.
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Aspect, sur giucose-%ryp%one-agar et susceptibilité actinophage des streptomyces C1730 et autres variétés antibiotiques de Streptomyces.
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Variétés de Antibiotique 9 E L i u m Substrat Susceptibilité Streptomyces produit Forme du Couleur du Couleur Couleur for- au 2, griseub mycélium aérien et de mée dans aérophag.
¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯aérien aérien et l'envers 1-'Agar SaC1730 Antibiotiques onduleux, Blanc à Incolore à Aucune 0
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<tb> C <SEP> & <SEP> D <SEP> boucles <SEP> et <SEP> gris <SEP> Jaunâtre <SEP> à
<tb> spirales <SEP> Gris
<tb>
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a.autibiotieus Actinomycine Droit Blanc à Noir Noir 0 Gris a.aureofaciens Auréomycine Droit Blanc à jaune à Aucune 0
EMI5.5
<tb> Gris <SEP> Tan
<tb> S.floridae <SEP> Viomycine <SEP> Droit <SEP> à <SEP> lé- <SEP> Blanc <SEP> à <SEP> pourpre <SEP> Aucune <SEP> +
<tb> gèrement <SEP> Lavande <SEP> à
<tb> ondulé <SEP> Vert <SEP> grisâtre
<tb>
EMI5.6
Sfradiae Néomycine Droit,
bou- Blanc à ro- Incolore Aucune 0
EMI5.7
<tb> Fradicine <SEP> cles <SEP> et <SEP> spi- <SEP> se <SEP> coquilla- <SEP> à <SEP> Tan
<tb> raies <SEP> occa- <SEP> ge
<tb> sionnelles
<tb>
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e.griseus Streptomycine Droit à lé- Blanc à rose Incolore à Aucune +
EMI5.9
<tb> Actidione <SEP> gèrement <SEP> on- <SEP> clair <SEP> à <SEP> vert <SEP> Brun <SEP> clair <SEP> à
<tb> dulé <SEP> grisâtre <SEP> clair <SEP> Lavande
<tb> S.griseus <SEP> Griséine <SEP> Droit <SEP> à <SEP> lé- <SEP> Blanc <SEP> à <SEP> Rose <SEP> Incolo- <SEP> Aucune <SEP> 0
<tb> gèrement <SEP> on- <SEP> clair <SEP> à <SEP> Vert <SEP> re <SEP> à <SEP> Tan
<tb> dulé <SEP> grisâtre <SEP> clair
<tb> S.lavendulae <SEP> Streptothrici- <SEP> Droit, <SEP> bou- <SEP> Blanc <SEP> à <SEP> Noir <SEP> Noir <SEP> 0
<tb>
EMI5.10
ne,Lavendulhie,
cles et spi- Rose à
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<tb> Streptoline <SEP> raies <SEP> occa- <SEP> Lavande
<tb> sionnelles
<tb> S.rimosus <SEP> Terramycine <SEP> Spirales <SEP> Blanc <SEP> jaune <SEP> Aucune <SEP> 0
<tb>
EMI5.12
.g.SP,,- A105 Actinorubine Spirales Blanc à Rose à Aucune 0
EMI5.13
<tb> Rose <SEP> à <SEP> Rouge
<tb> Gris
<tb>
EMI5.14
S.venezuelae Chloramphénicol Droit Blanc à Noir Noir 0
EMI5.15
<tb> ¯¯¯¯ <SEP> ¯¯¯ <SEP> Gris
<tb>
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' SELMAN A,Gd.AKMAN, ;r,.Bact.k.6" 300,1943 + = susceptible 0 = non susceptible.
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L'organisme liquéfie la gélatine'lentement sans former de pigment, et peptonise le lait de tournesol, d'ordinaire avec une réaction basique. En milieu synthétique de Gottlieb, l'organisme utilise de nombreuses sources de carbone, comprenant le 1-arabinose, le dextrose, le d-fructose, le d-galactose, l'i-inositol, le lactose, le maltose, le d-mannitol, le rhamnose, l'amidon, et le d-xylose; moins bien l'inuline, le raffinose, le d-sorbitol, et le sucrose, et il n'utilise pas le dulcitol. L'organisme utilise des sources d'azote inorganiques et organiques.
Le Tableau III donne une comparaison de l'aptitude du streptomyces 01730 et des différents actinomycetes antibiotiques connus à utiliser diffé- rentes sources de carbone quand il grandit sur un milieu composé d'agar, de sels inorganiques et de la source de carbone essayée.
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U'M-Llsa'Mon a1nyaraes ae caroone par -Le Trej2T,2Xces u-utiu et a-awres -vai-.LU(,V5 Luit,.Lbiotiques de ptomycesélevés sur agar synthétique 2. o = aucune croissance ô + = faible croissance ; z croissance notable a +++ = bonne croissance : ++++ = croissance très intense.
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<tb>
SOURCE <SEP> DE <SEP> CARBONE.
<tb>
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Variétés Antibioti- ¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯.¯¯¯¯¯¯¯¯¯¯ de Strep- ques pro> 1-ara- Dul- d- d-ga- i-ino- Inu- Lac- Mal- d-man- Raf- Rham- d-wsor- Su- d-xy7'
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<tb> tomyces <SEP> duits <SEP> bino- <SEP> ci- <SEP> fruc- <SEP> lac- <SEP> sitol <SEP> line <SEP> tose <SEP> tose <SEP> nitol <SEP> fi- <SEP> nose <SEP> bitol <SEP> . <SEP> cro- <SEP> lose <SEP> toi <SEP> tose <SEP> tose <SEP> nose <SEP> se <SEP> se
<tb>
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S.C.
Antibiotiques ++++ 0 ++++ ++++ +++ pu à ,++ ++++ +++ 0 ++++ 0 à 0 +++
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<tb> 1730 <SEP> C <SEP> & <SEP> D <SEP> à <SEP> lèg. <SEP> à <SEP> à <SEP> à <SEP> lég. <SEP> à <SEP> à
<tb> ++++ <SEP> + <SEP> ++++ <SEP> ++++ <SEP> ++ <SEP> + <SEP> ++ <SEP> ++++
<tb> S.antibio- <SEP> Actinomycine <SEP> + <SEP> 0 <SEP> +++ <SEP> +++ <SEP> .++++ <SEP> 0 <SEP> ++++ <SEP> ++++ <SEP> ++++ <SEP> 0 <SEP> +++ <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> ++
<tb> ticus
<tb> S.aureofa- <SEP> Auréomycine <SEP> ++++ <SEP> 0 <SEP> ++++ <SEP> ++++ <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> ++ <SEP> +++ <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> 0 <SEP> ++++ <SEP> ++
<tb> ciens
<tb>
EMI7.7
S.floridae viomycine 0 à 0 ++++ ++++ 0 0 à + â' ++++ ++++ 0 0 0 à 0 à ++++
EMI7.8
<tb> ++ <SEP> + <SEP> ++ <SEP> + <SEP> +
<tb>
EMI7.9
S.fradiae Néomycine, ++++ 0 0 à. ++++ 0 0 â, lég.
++ 0 0 0 0 a 0 +++
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<tb> Fradicine <SEP> + <SEP> + <SEP> + <SEP> à <SEP> à <SEP> lég,
<tb> + <SEP> +++ <SEP> +
<tb>
EMI7.11
sgriseus streptomycine, 0 a 0 ++++ ++++ 0 0 a , 0 ++++ ++++ 0 0 l' 0 à l' 0 à ++++
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<tb> Actidione <SEP> lég, <SEP> lég. <SEP> à <SEP> lég. <SEP> lég.
<tb>
+ <SEP> + <SEP> +++ <SEP> + <SEP> +
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S.,-riseus Griséine ++++ 0 ++++ +++ 0. 0 à 0 ++++ ++++ 0 ++++ 0 à o à ++++
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<tb> lég, <SEP> à <SEP> lég. <SEP> lég.
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+ <SEP> +++ <SEP> + <SEP> +
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S.lavendu- Streptothri- 0 0 0 à lég. 0 0 à 0 ++++ 0 0 0 à 0 0 0 à
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<tb> lae <SEP> cine,Lavenduline <SEP> à <SEP> ++++ <SEP> . <SEP> + <SEP> à <SEP> lég, <SEP> à <SEP> + <SEP> ++++
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Streptoline ++++ ++++ + +++ S. rimo su-a Terramycine ++++ 0 ++++ ++++ ++++ 0 ++++ ++++ ++++ + 0 ++++ 0 lég, +
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<tb> S.sp. <SEP> Actinorubine <SEP> ++++ <SEP> 0 <SEP> ++++ <SEP> ++++ <SEP> +++ <SEP> ++++ <SEP> ++++ <SEP> ++++ <SEP> ++++ <SEP> ++++ <SEP> ++++ <SEP> lég. <SEP> ++++ <SEP> ++++
<tb> A <SEP> 105 <SEP> +
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S.venezue- Chloramphénicol ++++ 0 ++++ ++++ 0 0 + ++++ 0 0 ++++ 0 0 ++++
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<tb> lae
<tb>
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. 2)JcGo PRIDHAM & Dai GOTTLIEB, J. Bacta569 08'1.
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Comme dit plus haut, on produit les antibiotiques C et D par la culture aérobique d'une culture de Streptomyces C1730. on l'effectué d'ordinaire par inoculation dans un milieu de culture approprié-de Strep- tomyces C1730 et incubation du mélange dans des conditions aérobiques à environ 20 à 40 C pendant environ deuxà quinze jours. Dans le cas d'un milieu nutritif aqueux, on sépare la matière solide existant dans le mélange de culture et on sépare les antibiotiques désirés du liquide de culture par les procédés décrits dans la suite.
Quand on utilise un milieu nutritif solide, on lave convenablement le milieu de culture au moyen d'un solvant d'antibiotiques tel que de l'eau ou du méthanol et on sépare les antibiotiques désirés de l'extrait, pendant la phase d'incubation, on maintient de préférence la température au voisinage de 22 à 29 C. Quand on utilise des milieux nutritifs aqueux, le pH initial doit être compris entre 6 et 8,2 et de préférence du côté alcalin entre environ pH 7,3 et pH 7,7. pour l'inoculation du milieu nutritif, on peut utiliser des suspensions de spores, sous-cultures ou milieu de cultures de Streptomyces C1730. on peut cultiver le microorganisme dans le milieu nutritif aqueux de différentes fagons.
On peut par exemple cultiver le microorganisme dans des conditions aérobiques sur la surface du milieu, ou bien on peut le cultiver en dessous de la surface du milieu, c'est-à-dire à l'état submergé, si on introduit en même temps de l'oxygène. Le procédé préféré de production des antibiotiques C et D à grande échelle .comprend l'utilisation de cultures submergées ou profondes de Streptomyces C1730. suivant cette réalisation de l'invention, on inocule à un milieu de culture aqueux stérile du Streptomyces C1730 et on le soumet à l'incubation en agitant et aérant à une température comprise entre 20 et 40 C, de préférence voisine de 25 à 35 C, pendant environ un à quatre jours.
Dans ces conditions, l'organisme se développe sous forme de nombreuses particules plus ou moins séparées dispersées dans toute la masse du milieu, contrastant avec la pellicule plus ou moins continue présente sur la surface du milieu dans le procédé de culture en surface. Grâce à cette distribution de l'organisme dans la masse du milieu, on peut cultiver en une fois de grands volumes du milieu nutritif inoculé dans les grands réservoirs et cuves utilisés d'habitude dans l'industrie de la fermentation, on a trouvé que des fermentateurs à cuves fixes,-munis d'appareils d'agitation et d'aération convenables, aussi bien que des fermentateurs à tambour rotatif horizontal sont particulièrement intéressants à ce point de vue.
Toutefois, pour la préparation de quantités plus petites d'antibiotiques ou de cultures des microorganismes, on peut opérer cette culture submergée dans de petits flacons secoués ou agités au moyen de dispositifs mécaniques convenables.
Onpeut effectuer l'agitation et l'aération du milieu de culture de différentes façons, on peut produire l'agitation à l'aide d'une hélice ou d'un appareil d'agitation mécanique analogue, en faisant tourner ou en secouant le fermentateur lui-même, au moyen de divers appareils de pompage, ou en faisant passer de l'air ou d'autres gaz contenant de l'oxygène à travers le milieu, on peut effectuer l'aération par injection d'air, ou d'autres gaz contenant de l'oxygène, dans le mélange de fermentation à-travers des tubes ouverts, des tubes perforés, des milieux de diffusion poreux tels que des tiges de carbone, carborundum, verre aggloméré, etc...
ou bien on peut le produire par pulvérisation, projection ou déversement du moût dans ou à travers une atmosphère contenant de l'oxygène. Le gaz contenant de l'oxygène doit être exempt de spores, bactéries et autres agents de contamination avant d'être introduit dans le milieu de culture. On peut aboutir très avantageusement à ce résultat par filtration à travers un lit de charbon de bois activé. Le degré d'aération aboutissant à la production optimum des antibiotiques C et D dépend du reste quelque peu du genre de cuve employé, de la vitesse et du genre d'agitation, du pH, de la température et d'autres conditions du milieu.
En tous cas, le gaz contenant de l'oxygène doit être fourni avec un débit suffisant pour maintenir une légère pression positive dans le fermentateur et supprimer ainsi la possibilité de contamination de la culture par l'air extérieur, on a trouvé que dans des appareils fermen-
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tateurs du type à cuve de 30 litres, un débit de dix à quinze litres d'air par minute donne de bons résultats quand on l'utilise avec un agitateur mécanique genre turbiné à six palettes de 10 cm (quatre pouces) de diamètre, tournant à 100-200 tours par minute, contre quatre chicanes verticales périphériques de 25 sur 400 mm (1 pouce sur 16 pouces), on peut utiliser un grand nombre de milieux de culture dans la phase de croissance.
Ces milieux doivent renfermer une source de carbone assimilable, une matière protéinique, des sels minéraux et des traces d'aliments variés, vitamines et autres stimulants de croissance qui existent d'ordinaire comme impuretés dans les autres constituants du milieu, pour la production optimum d'antibiotique C et D, le milieu nutritif doit également contenir une source de graisse, par le terme source'de carbone assimilable on entend ici également des alcools polyhydriques et des mono-di-et polysaccharides, tandis que le terme matière protéinique comprend une protéine non-modifiée ou des produits de dégradation de protéines, en particulier des produits tels que ceux provenant de l'hydrolyse de protéines, ces produits de dégradation de protéines comprennent des protéases, peptones, polypeptides, peptides et amino-acides.
Comme sources de carbone assimilable, on peut utiliser l'arabino- se, le fructose, le galactose, le lactose, le maltose, le rhamnose, le xylose, la glycérine, le mannitol, le rhamnitol etc. on peut utiliser des matières à base d'hydrates de carbone complexes telles que des amidons, dextrines, résidus de fermentation et de distillerie, composés solides d'eau de macération de mais, liqueur de macération de mais, résidus de fermentation secs, etc...@ parmi les matières protéiniques qu'on peut utiliser dans les différents milieux, on citera l'extrait de boeuf, la caséine hydrolysée par des acides, la peptone de boeuf, la farine oléagineuse de fèves de soya, des résidus de fermentation séchés, de la farine de fèves de soya dégraissée et partiellement hydrolysée,
des mélanges d'acides aminés provenant de sources naturelles ou synthétiques, de l'urée, des purines et analogues. L'utilisa- tion de farine oléagineuse de fèves de soya ou de dérivés de protéines de soya comme constituant du milieu est désirable, parce qu'un tel constituant fournit une petite quantité de graisse à utiliser par le microorganisme.
On peut satisfaire aux principales exigences minérales du milieu en ajoutant 0,1 à 0,5 % d'un ou de plusieurs sels inorganiques tels que chlorure de sodium, carbonate de calcium, phosphate bipotassique, phosphate monopotassique, etc.. Les autres constituants du milieu nutritif, c'est-à-dire des vitamines, agents stimulants la croissance, etc... sont généralement présents en quantité suffisante dans les sources assimilables plus impures de carbone et/ou des matières protéiniques.
La séparation des antibiotiques C et D de la culture brute peut être réalisée par un certain nombre de moyens différents. Quand on utilise un milieu de culture solide dans la phase de'croissance, on extrait le mycélium par un solvant des antibiotiques C et D, tel que l'eau; et on sépare les produits de l'extrait comme décrit plus loin.
Quand on utilise un milieu de culture liquide, dans la phase de croissance, on peut filtrer le mélange pour enlever le mycélium ou bien on peut régler le pH du mélange par un acide à environ 2 à 4 et séparer ensuite le mycélium par filtration. pour obtenir les antibiotiques à partir des extraits ci-dessus, on peut appliquer l'extraction par solvant, en utilisant comme solvants des alcools aliphatiques inférieurs non miscibles à l'eau tels que le n-butanol, ou bien par des procédés d'adsorption et d'élution, en utilisant comme adsorbants respectivement du carbone activé ou des échangeurs d'ions, et comme éluants du méthanol acidifié ou de l'ammoniaque aqueux.
Les procédés ci-dessus donnent un concentré brut qu'on peut purifier davantage par fractionnement au moyen de solvants organiques, par exemple par dissolution dans le méthanol et précipitation fractionnée par l'éther éthylique, ou bien par précipitation par un acide arylsulfonique suivie de régénération à partir du sel de colorant ainsi formé.
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On peut effectuer la séparation des antibiotiques Q et D du concentré brut purifié d'un certain nombre de façons, par exemple,on peut obtenir de l'antibiotique C sous forme de solide cristallisé'par recristallisation du résidu de concentration de l'effluant aqueux. ou bien, on peut traiter une solution aqueuse du concentré brut contenant à la fois les antibiotiques C et D par l'ammoniaque pour précipiter l'antibiotique C par frac- tionnemento Enfin, on peut obtenir l'antibiotique C à partir d'une solution aqueuse des'deux antibiotiques par addition d'acétate de potassium pour effectuer la précipitation par réglage du pH et dessalage. on utilise efficacement les liqueurs mères provenant:de l'un quelconque des procédés de séparation ci-dessus pour obtenir l'antibiotique D.
La chromatographie sur cellulose fournit une séparation avantageuse de l'antibiotique D. On adsorbe ce dernier produit par la cellulose à partir de sa solution dans un mélange d'acide acétique, acétate d'éthyle et eau. L'élution au moyen d'eau donne une liqueur effluante à partir de laquelle on peut obtenir facilement l'antibiotique D par concentration.
L'inventionest illustrée par les exemples suivants : EXEMPLE 1.- on introduit un mélange qui consiste en 180 gr. d'amidon de mais en poudre, 180 gr. de caséine hydrolysée par un' acide, 90 gr. de farine oléagineuse de fèves de sôya, 90 gr. de chlorure de sodium et une quantité suffisante d'eau pour former un volume de 18 litres, dans un fermentateur de 30 litres du type à cuve fixe en verre muni d'un couvercle en acier inoxydable et d'un impulseur à turbine. Le fermentateur est doublé de verre et porte quatre chicanes intérieures verticales de 25 sur 400 mm (1 pouce sur 16 pouces). Le fermentateur est également muni de dispositifs pour introduire trois courants d'air dans le sillage de l'impulseur.
On règle le pH du mélange dans le fermentateur à 7,5 au moyen d'une solution 10 N d'hydroxyde de sodium. On ajoute au mélange dans l'appareil de fermentation 72 gr. d'un mélange de saindoux brut et d'huiles minérales contenant des mono- et biglycérides et 18 gr. de carbonate de calcium. on stérilise le fermentateur et le milieu sous une pression de vapeur d'eau de 1.4 Kg/cm2 (20 livres) pendant deux heures. on refroidit le fermentateur et son contenu puis on l'enlève de l'autoclave, on inocule au milieu, de façon aseptique, 10 cm3 d'une suspension de spores de streptomyces C1730 pré- parée en secouant un milieu de culture de Streptomyces C1730 sur du glucosetryptone-agar, vieux de sept jours, avec 10 cm3 de solution aqueuse à 0,01% de savon de Marseille.
Après l'inoculation, on soumet le mélange de culture à l'incubation à 24 à 26 C pendant 64 heures. Au cours de l'incubation, on fait passer de l'air stérile par le diffuseur annulaire avec un débit de 0,9 à 1,16 litres d'air par litre de milieu par minute, et on fait tourner l'agitateur à une vitesse d'environ 200 tours par minute.
On suit le cours de la production d'antibiotique pendant l'incu- bation en prélevant des échantillons de temps en temps et en les soumettant à l'essai contre l'Escherichia coli. Au bout de 64 heures, chaque millilitre de culture équivaut à 920 microgrammes de standard quand on l'essaie contre l'Escheridia coli. Le standard est un concentré des antibiotiques C et D ayant une puissance telle qu'une solution de 2,5 mierogrammes de standard par cm3 produise une inhibition de 50% d'Escheridia coli.
On combine les "bières" provenant de plusieurs fermentations effectuées comme décrit ci-dessus, à la fin de l'incubation, on règle le pH du milieu à 2.47 à l'aide d'acide sulfurique, on enlève le mycélium par filtration, et on le lave complètement à l'eau.
On règle le filtrat et les eaux de lavage combinés (volume 41,1 litres) -au pH 7,la et on les extrait au moyen de six portions de 10 litres de n-butanol. on concentre les extraits combinés de n-butanol dans un évaporateur éclair, à une température inférieu- re à 29 C jusque 10,6 litres. on sépare par filtration un précipité jaune pâle essentiellement inerte qui se forme pendant la concentration, on extrait
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le filtrat par 8 portions de 1 1/2 litre d'acide chlorhydrique aqueux 0,01 N. on traite les extraits acides combinés par une quantité suffisante d'échangeur d'ions résineux (étage basique) pour enlever l'excès d'acide et on concentre la solution dans un évaporateur éclairà 30 C jusque 1,5 litres.
On sèche ce volume de solution à l'état congelé et le résidu, qui pèse 20,08 gr. donne un essai de 452 microgrammes de standard par mgr. contre l'Escherichia coli . pour purifier davantage le concentré brut, on en ajoute 5,0 gr. à 25 ml de méthanol absolu. on sépare environ 1,4 gr. d'un corps solide blanc insoluble et on lave au moyen de quatre portions de 5 ml. de méthanol absolu. On dilue les liquides surnageants combinésà 50 ml, au moyen de ne- thanol absolu. On ajoute 100 ml. d'éther éthylique, on sépare par centrifugation le précipité brun-jaune qui se forme, on le lave à l'éther éthylique et on le sèche dans le vide.
La production est de 2,4 gr. et le produit donne un essai de 900 microgrammes de standard par mgr. contre l'Escheridia coli, Le produit brut purifié consiste en un mélange des sels de chlorhydrates des deux antibiotiques et est très soluble dans l'eau. pour séparer l'antibiotique C du concentré brut purifié, on fait passer 500 mgr. de ce dernier, dissous dans 65 ml d'eau (pH 4,9) à travers une colonne qui renferme un échangeur d' ions résineux au stade basique ou hydroxyle. on lave alors la colonne à l'eau jusqu'à ce que le liquide sortant ne donne plus de réaction avec le réactif d'Ehrlich. on concentre le liquide sortant par séchage à l'état congelé pour obtenir un produit soluble dans 25 ml d'eau chaude.
Le refroidissement de la solution à 0-1 C donne un précipité gélatineux qu'on fait recristalliser à partir d'eau chaude pour produire une masse cristalline d'antibiotique C sous forme d'aiguilles qui fondent à 180-182 C. Le spectre d'absorption ultraviolet donne les mesures suivantes :
EMI11.1
<tb>
<tb> 0,1 <SEP> N <SEP> HCl <SEP> Lambda <SEP> = <SEP> 257 <SEP> millimicrons <SEP> E1 <SEP> cm1% <SEP> = <SEP> 368
<tb> id. <SEP> = <SEP> 311,5 <SEP> id, <SEP> id. <SEP> = <SEP> 292
<tb> Tampon <SEP> de <SEP> phosphate <SEP> id. <SEP> = <SEP> 249 <SEP> id. <SEP> id. <SEP> = <SEP> 266
<tb> au <SEP> pH <SEP> 7,0 <SEP> id. <SEP> = <SEP> 321 <SEP> . <SEP> id, <SEP> id. <SEP> = <SEP> 535
<tb> 0,1 <SEP> N <SEP> NaOH <SEP> id. <SEP> = <SEP> 329 <SEP> id, <SEP> id.
<SEP> = <SEP> 639
<tb>
L'indice Rf (technique par ascension) pour l'antibiotique C dans l'acétate d'éthyle (3), eau (3), acide acétique (1) est de 0,16; dans le n-butanol (la), acide acétique (1), eau (4), il est de 0,28.
L'antibiotique C donne un essai positif de Bratton-Marshall et un essai positif au réactif d'Ehrlich. Il donne un essai de 814 microgrammes/mgr. de standard contre l'Escheridia coli. pour séparer l'antibiotique D, on dissout 150 mgr. du concentré brut purifié dans un mélange de trois parties d'acétate d'éthyle, 3 parties d'eau et 1 partie d'acide acétique. On introduit la solution à un débit de 3-4 ml par heure dans une colonne contenant 35 gr. d'une cellulose dénommée "Solka Floc". On développe alors la colonne au moyen de solvant frais et on recueille des fractions de 3 ml, à des intervalles d'une heure.
Quand les fractions sortantes deviennent négatives au réactif d'Ehrlich, on élue . la colonne par 100 ml. de solvant puis par l'eau, On sèche l'éluat (environ 100 ml) à l'état congelé pour produire une poudre brune. La dissolution de ce produit dans du méthanol et sa précipitation par l'éther éthylique donnent une poudre tan clair qui donne 1070 microgrammes/mg de standard contre l'Escherièhia coli. L'indice Rf dans l'acétate d'éthyle (3), l'eau (3), l'acide acétique (1) est de 0,0 tandis que l'indice Rf dans le n-bu- tanol (la), l'acide acétique (1), l'eau (4) est de 0,19. L'antibiotique solide D présente une activité prononcée quand on le soumet à l'essai contre le Mycobacterium tuberculosis var. hominis H37Rv.
Les spectres d'absorption de l'antibiotique D pour différentes valeurs du pH ne présentent qu'un seul maximum; ' à 314 (millimicrons., 1' Et% est de 123 dans l'acide chlorhydrique 0,1 N, à 302 millimicrons, l'E1 cm1% est de 125 dans un tampon de phosphate au pH 7,0, et à 321,5 millimicrons, l'E1 cm1% est de
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143 dans l'hydroxyde de sodium 0,1 N.
F.XF--MPT.E 2 n- on introduit dans chaque élément d'un certain nombre de flacons d'Erlenmeyer de 1 litre un mélange qui consiste en 1,5 gr, de cérélose, 1,5 gr. de glycérine, 0,9 gr. de caséine partiellement hydrolysée, 0,75 gr. de peptone, 0,3 gr. de levure de brasserie, 0.75 gr. de résidus solides de macération de mais, 0,75 gr. de farine oléagineuse de fèves de soya, 1,5 gr. de résidu de fermentation de butanol-acétone, 1,5 gr. de chlorure de sodium, 0.3 gr.
de carbonate de calcium et une quantité d'eau suffisante pour porter le volume à 300 ml. on recouvre les flacons de gaze de coton et on stérilise sous une pression de vapeur d'eau de 1.265 Kg/cm2 (18 livres) pendant vingt-cinq minutes, puis on inocule de façon aseptique à chaque flacon, 1 cm3 de suspension de spores de Streptomyces 01730 préparée en partant d'une culture de Streptomyces C1730 sur glucose-tryptone-agar, vieille de 30 jours, On secoue les-flacons sur une machine à secouer du type rotatif, tournant à 150 tours par minute pendant quatre jours, pendant la période d'incubation, on maintient la température à 22-24 C. A la fin de la période d'incubation, la "bière" de culture a un pH de 6,7 environ.
Un essai contre le Staphylococcus aureus, montre que la bière de culture renferme une quantité suffisante d'antibiotique C et d'antibiotique D pour produire une inhibition de 63% de croissance de l'organisme d'essai à une dilution de 1 pour cent. on sépare par filtration le mycélium du bouillon contenu dans les flacons ci-dessus et on règle le pH du filtrat de 8,6 à 7,17 au moyen d'acide sulfurique 3 N. On sépare l'antibiotique.de 100 ml. de filtrat par quatre extractions par des portions de 25 ml. de n-butanol. on évapore à siccité les extraits d'alcool combinés, à moins de 45 C pour obtenir les antibiotiques C et D sous forme d'un concentré brut.
On dissout 1,0 gr. de concentré brut dans 20 cm3 d'eau. on ajoute une solution de 550 mg d'acide p-hydroxyazobenzène-p-sulfonique dans 11 cm3, qui provoque la formation immédiate d'un précipité gommeux. on centrifuge le mélange et on décante le liquide qui surnage, on lave.le résidu gommeux à l'eau, et on le fait recristalliser à partir de 6 ml. d'éthanol absolu et 9 ml. d'eau, On sépare par centrifugation le précipité qui se forme par refroidissement, on le lave convenablement à l'eau et on le sèche dans le vide. Il pèse 570 mgr. on dissout alors le complexe de colorant dans 10 ml. de méthanol et on le précipite sous forme d'une poudre jaune-orange en ajoutant 30 ml. d'éther éthylique, Il pèse 475 mgr.
On dissout 450 mg, de ce complexe de colorant dans 20 ml. de méthanol à 50% et on ajoute une solution aqueuse d'acétate de baryum jusqu'à ce que la précipitation de p-hydroxyazobenzène-p-sulfonate de baryum soit complète, on sépare le précipité par centrifugation et on ajoute au liqui- de surnageant 1 ml. d'excès d'acide sulfurique 2 N après avoir séparé la totalité des ions de baryum sous forme de sulfate de baryum, on sépare ce dernier par centrifugation. on fait passer le liquide jaune clair surnageant à travers une colonne d'échangeur d'ions en résine synthétique (étage basique), Le liquide jaune clair sortant a un pH de 7,6.
on lave la colonne à l'eau jusqu'à ce que les èaux de lavage ne donnent plus de résultat au réactif d'Ehrlich. Le liquide sortant et les eaux de lavage donnent, par séchage à l'état congelé une poudre jaune clair, pesant 173 mg, qui donne à l'essai 1150 microgrammes de standard par mg. contre l'Escherichia coli. on ajoute à 49 mg., de concentré brut purifié contenant les deux antibiotiques C et D, 1 ml. d'eau et suffisamment d'hydroxyde d'ammonium 1N pour porter le pH à 9.0. Il se forme un précipité blanc qu'on sépare par centrifugation.
On lave le solide à 1?eau froide et on le fait recristalliser à partir de méthanol aqueux pour obtenir des aiguilles colorées En jaune clair, qui fondent à 180-182 C, identiques à l'antibiotique C obtenu dans l'Exemple 1.
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On peut séparer l'antibiotique D de la liqueur ammoniacale aqueu- se qui surnage, par le procédé de chromatographie sur cellulose décrit dans l'Exemple 1.
' EXEMPLE 3. on introduit un mélange qui consiste en 180 gr. de glycérine, 90 gr. de farine oléagineuse de fèves de soya, 180 gr. de caséine hydrolysée -. par un acide, 90 gr. de chlorure de sodium et une quantité d'eau suffisante pour porter le volume total à 18 litres, dans un appareil de fermentation . de 30 litres du type à cuve fixe en verre muni d'un couvercle d'acier inôxydable et d'un impulseur genre turbine. L'appareil de fermentation est doublé de verre et porte quatre chicanes verticales intérieures de 25 x 400 mm, (1 x 16 pouces). L'appareil de fermentation est muni d'un dispositif permettant d'introduire trois courants d'air dans le sillage de l'impulseur.
On règle à 7,5 le pH du milieu dans l'appareil de fermentation au moyen d'une solution d'hydroxyde de sodium 10 N. on ajoute au mélange dans l'appareil de fermentation 180 gr. de saindoux comme agent antimousse et 18 gr. de carbonate de calcium, on stérilise l'appareil de fermentation et le milieu sous une pression de vapeur d'eau de 1.4 Kg/cm2 (20 livres) pendant deux heures. on refroidit l'appareil de fermentation et son contenu et on les enlève de l'autoclave. on inocule au milieu, de façon aseptique, 10 mlo d'une suspension de spores de streptomyces C1730 préparée en remuant un milieu de culture de streptomyces C1730 sur glucose-tryptone-agar, vieux de sept jours, avec 10 ml. d'une solution aqueuse à.
0,01% de savon de Marseille.
Après inoculation, on soumet le milieu de culture à l'incubation à 25 C pendant quatre-vingt huit heures. Au cours de l'incubation, on fait passer de l'air stérilisé par le diffuseur annulaire à un débit de 0,3 à 1,0 litre d'air par litre de milieu par minute et on fait tourner l'agitateur à une vitesse d'environ 200 tours par minute. on suit le cours de la production d'antibiotique pendant l'incubation en prélevant des échantillons de temps en temps et en les soumettant à l'essai contre l'Escherichia coli. Au bout de quarante heures., chaque millilitre de culture équivaut à 188 microgrammes de standard quand on le soumet à l'essai contre l'Escheridia coli.
Au bout de soixante quatre heures, chaque millilitre équivaut à 410 microgr.; et au bout de quatre-vingt huit heures, chaque millilitre équivaut à 636 microgr. de standard.
On filtre la culture brute acidifiée pour enlever le mycélium et on règle le filtrat au pH 7. 0 par de l'hydroxyde de sodium dilué, on ajoute à une colonne contenant 600 cm3 d'une résine d'échange de cations dans le cycle hydrogène, 7,5 litres de filtrat de bouillie au pH 7,0. Après lavage de la colonne à l'eau, on sépare quantitativement les antibiotiques de la colonne par élution par de l'hydroxyde d'ammonium 5 N. On peut obtenir les antibiotiques à partir de l'éluat sous forme d'un concentré brut qui peut être purifié par les procédés décrits dans les Exemples 1 et 2.
On peut séparer l'antibiotique C de ce concentré brut purifié par le procédé suivant : on ajoute à 500 mgr. de concentré brut purifié dans 7 ml. d'eau, une solution concentrée d'acétate de potassium 'contenant 50 gr. dans 25 ml. d'eau, jusqu'à ce que le pH de la solution totale soit de 8,1. Il se forme un précipité gommeux qui se solidifie après repos pendant un temps court.
On sépare le solide par filtration et on le lave à fond par trituratio n sous l'eau. Le solide lavé et séché dans le vide pèse 160 mgr. et, après recris- 'tallisation à partir de méthanol aqueux il donne une masse d'aiguilles, fondant à 178-179 C, identique à l'antibiotique C.
On obtient l'antibiotique D à partir du concentré brut purifié par le procédé décrit dans l'Exemple 1.
EXEMPLE @
On introduit un mélange consistant en 180 gr. de glycérine, 90 gr.
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de farine oléagineuse de fèves de soya, 180 gr, de caséine hydrolysée'par un acide, 90 gr. de chlorure de sodium et une quantité d'eau suffisante pour porter le volume total à 18 litres, dans un appareil de fermentation de 30 litres du type à cuve fixe en verre muni d'un couvercle en acier inoxydable et d'un impulseur genre turbine. L'appareil de fermentation est doublé de verre et porte quatre chicanes intérieures verticales de'25 x 400 mm (1 x 16 pouces). L'appareil de fermentation est muni d'un dispositif permettant d'introduire 3 courants d'air dans le sillage de l'impulseur. on règle à 7,5 le pH du milieu dans l'appareil de fermentation au moyen d'une solution d'hydroxyde de sodium 10 N.
On ajoute au mélange dans l'appareil de fermentation 180 gr. de saindoux comme agent antimousse et 18 gr. de carbonate de calcium, on stérilise l'appareil de fermentation et le milieu sous une pression de 1.4 Kg/cm2 (20 livres) de vapeur d'eau pendant deux heures. On refroidit l'appareil de fermentatiôn et son contenu et on les retire de l'autoclave, on inocule de façon aseptique au milieu 10 ml. d'une suspension de spores de streptomyces C1730 préparée en remuant un milieu de culture de Streptomyces C1730 sur glucos.e-tryptone- agar, vieux de sept jours avec 10 ml d'une 'solution aqueuse à 0,01% de savon de Marseille.
Après inoculation au milieu de culture, on soumet celuici à l'incubation à 25 C pendant quatre-vingt huit heures, Au cours de l'incubation, on fait passer de l'air stérilisé par le diffuseur annulaire à un débit de 0,3 à 1,0 litres d'air par litre de milieu par minute et on fait tourner l'agitateur à une vitesse d'environ 200 tours par minute. on suit le cours de la production d'antibiotique pendant l'incubation en prélevant des échantillons de temps en temps et en les soumettant à l'essai contre l'Escheridia coli.
Au bout de quarante heures, chaque millilitre de culture équivaut à 188 microgr. de standard quand on l'essaie contre l'Escheridia coli: au bout'de soixante heures, chaque millilitre équivaut à 410 microgr, et au bout de quatre-vingt huit heures, chaque millilitre équivaut à 636 microgr. de standard. on règle à 7,5 le pH de 100 cm3 de filtrat au moyen d'une solution aqueuse d'hydroxyde de sodium et on remue pendant 20 minutes avec 300 mgr. de carbone activé. On filtre la suspension et on remue le gâteau de carbone avec 25 cm3 de méthanol acidifié contenant 0,05 cm3 d'acide chlorhydrique 5 N pour 100 cm3 de méthanol. On filtre le mélange et on répète l'élution.
On combine les extraits de méthanol;, on les concentre dans le vide et le concentré obtenu contient environ 50% de l'activité du bouillon initial.
On peut séparer les antibiotiques C et D du mélange de culture par l'un quelconque des procédés décrits dans les exemples précédents.
EXEMPLE 5.
On introduit dans chaque élément d'un certain nombre de flacons d'Erlenmeyer de 500 ml, un mélange qui consite en 1,0 gr. de glycérine, 0,5 gr. de farine oléagineuse de fèves de soya, 0,5 gr. de peptone du commerce, 0,5 gr. de chlorure de sodium et une quantité d'eau suffisante pour porter le volume à 100 ml. On règle le pH des contenus des flacons à 7,5 au moyen de solution d'hydroxyde de potassium 10 N et on ajoute 0,1 gr. de carbonate de calcium. On recouvre les flacons de gaz de coton et on stérilise sous une pression de 1.05 Kg/cm2 (15 livres) de vapeur d'eau pendant vingt minutes, puis on inocule à chaque flacon 1 ml. d'une suspension de spores provenant d'un milieu de culture sur glucose-tryptone-agar, vieux de sept jours.
On remue les flacons dans une machine à remuer du type rotatif tournant à 160 tours par minute, pendant six jours. on maintient la température à 24-26 C pendant la période d'incubation. Au bout de la période d'incubation, le bouillon de culture a un pH de 8,3. Dans un essai contre l'Escheridia coli, un millilitre de bouillon équivaut à 800 microgr, de standard.
On peut séparer les antibiotiques C et D du bouillon de culture par un quelconque des procédés décrits dans les Exemples 1,2 et 3.
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EXEMPLE 6. on règle à 7,5 au moyen d'une solution d'hydroxyde de potassium 10 N, le pH d'un mélange qui consiste en 1,0 g,, de glycérine, 0,5 gr, de' farine oléagineuse de fèves de soya, 0,5 gr. de levure de brasserie dont on a enlevé l'amertume, 0,5 gr. de chlorure de sodium et une quantité d'eau suffisante pour porter le volume à 100 ml.-et on ajoute 0,1 gr. de carbonate de calciume on introduit le mélange dans chacun des éléments d'un certain nombre de flacons Erlenmeyer de 500 ml. on recouvre les flacons de gaze de coton et on stérilise sous une pression de vapeur d'eau de 1,05 kgr/cm2 (15 livres) puis on inocule dans chaque flacon 1 ml.
d'une suspension de spores de Streptomyces C1730 provenant d'un milieu de culture sur glucosetryptone-agar vieux de trente cinq jours, On remue les flacons sur une machine agitatrice rotative tournant à 160 tours par minute, pendant cinq jours. pendant la période d'incubation, on maintient la' température de 24 à 26 C.
A la fin de la période d'incubation, le bouillon de culture a un pH de 8,2.
Soumis à l'essai contre l'Escheridia coli, un millilitre de ,ce bouillon équivaut à 710 mgr. de standard. on peut séparer les antibiotiques C et D du bouillon de culture par l'un quelconque des procédés décrits dans les exemples 1, 2 et 3.
EXEMPLES on rend alcalin à un pH de 7,3 au moyen d'une solution 10 N d'hydroxyde de.sodium,un milieu.nutritif qui consiste en 1,25 gr. de glycérine, 0,75 gr. de caséine hydrolysée par des acides, 1,25 gr. de résidus solides' de macération de mais, 1,25 gr. de chlorure de sodium et une quantité d'eau suffisante pour porter le volume à 250 ml. Après addition de 0,25 gr. de carbonate de calcium, on introduit le milieu dans un flacon de Fernbach muni d'un bouchon de coton et on stérilise par de la vapeur à une pression de 1,265 Kgr/cm2 (18 pouces) pendant vingt cinq minutes. On inocule au milieu 2 ml. d'une suspension de spores de Streptomyces C1730 provenant d'un milieu de culture sur glucose-tryptone-agar vieux de sept jours, On soumet le mélange résultat à l'incubation à 29 C pendant onze jours.
Au bout de ce temps, le bouillon de culture a une activité qui équivaut à 273 microgrammes de standard par millilitre de bouillon soumis à un essai contre l'Esche- ridia coli. on peut séparer les antibiotiques C et D du.bouillon de culture par l'un quelconque des procédés décrits dans les exemples 1, 2 et 3.
REVENDICATIONS.