Verfahren zur Herstellung von immunisierenden Impfstoffen
Diese Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Herstellung von immunisierenden Impfstoffen.
Es ist bekannt, Vakzine herzustellen, indem man infektiöse Mikroorganismen, z. B. infektiöse Virusarten, mit partiell inaktivierenden Mitteln, z. B.
Phenol, Formaldehyd oder Wasserstoffsuperoxyd, behandelt, oder indem man dieselben der Wirkung von Hitze oder von ultraviolettem Licht aussetzt, wobei man die infektiösen Eigenschaften derselben zerstört, während ihre antigenen Eigenschaften erhalten bleiben. Diese inaktivierenden Mittel weisen jedoch verschiedene Nachteile auf. Sie zerstören manchmal die antigene Struktur der Mikroorganismen, z. B. der Virusarten, zu sehr und es ist oft schwierig, die vollständige Vernichtung der infektiösen Eigenschaften der Mikroorganismen sicherzustellen. Es ist ferner möglich, dass gewisse infektiöse Mikroorganismen, welche durch die Behandlung mit einem Inaktivierungsmittel, z. B. Formaldehyd, inaktiviert werden, ihre infektiösen Eigenschaften wiedererlangen und so entweder während der Lagerung oder nach der Verabreichung als Vakzin an einen Patienten wieder krankheitserregende Mittel werden.
Es ist ferner auch möglich, dass Inaktivierungsmittel, wie z. B. Formaldehyd oder die Wirkung von ultraviolettem Licht zur Aggregatbildung von Mikroorganismen Veranlassung geben und solche Aggregate unbehandelte Teilchen von infektiösen Mikroorganismen beibehalten.
Es wurde nun gefunden, dass diese Nachteile behoben werden, wenn man bei der Herstellung von immunisierenden Impfstoffen eine bestimmte Klasse von Verbindungen als Inaktivierungsmittel verwendet.
Das erfindungsgemässe Verfahren zur Herstellung von immunisierenden Impfstoffen besteht darin, dass man eine Verbindung der Formel 1:
EMI1.1
worin R einen Methyl-, thyl-, n-Propyl oder Isopropylrest bedeutet, auf infektiöse Mikroorganismen und/oder deren Antigene einwirken lässt.
Als infektiöse Mikroorganismen kommen z. B.
Virusarten, wie z. B. das Pferdeencephalomyelitisvirus, das Lansing (an Mäuse adaptierte) Poliomyelitisvirus, Rickettsien, wie z. B. Burnetti, und Bakterien, wie z. B. Staphylococcus albus, in Frage.
Die als Ausgangsmaterial dienenden infektiösen Mikroorganismen und/oder Antigene davon können in einer wässerigen Suspension, welche Schutzmittel, wie Puffer, z. B. Natriumhydrogenphosphat, enthalten kann, oder mit tierischem Gewebe, wie z. B.
Gehirnmasse von Meerschweinchen oder Mäusen oder Rückenmarkmaterial, vermischt, vorliegen.
Als eine besonders geeignete Verbindung gemäss Formel I sei z. B. das N-Acetyl-äthylenimin erwähnt.
Diese Verbindung wird gewöhnlich zu den infektiösen Mikroorganismen oder deren Antigenen, die vorzugsweise als eine wässerige Suspension bei niederer Temperatur, z. B. zwischen ungefähr 0 und ungefähr 370 C, vorliegen, zugegeben. Man erhält so ein Produkt, welches eine hohe Ausbeute von nichtinfektiöser, nichttoxischer Antigensubstanz ergibt. Es kann auch bei höheren Temperaturen gearbeitet werden, wodurch aber die Ausbeute vermindert wird.
Die Zeit, die dabei notwendig ist, um die Infektionsfähigkeit der infektiösen Mikroorganismen oder die Giftigkeit deren Antigene zu unterdrücken, ist von verschiedenen Umständen abhängig, wie z. B. von der Natur der verwendeten Mikroorganismen oder deren Antigene, von der Konzentration der Verbindung gemäss Formel I, von der Anfangskonzentration der verwendeten infektiösen Mikroorganismen oder Antigene, von der Konzentration des animalischen Gewebes, welches anwesend sein kann, und von der Temperatur, bei welcher das erfindungsgemässe Verfahren ausgeführt wird.
Gewöhnlich verwendet man als Ausgangsmaterial eine 20-Gew./Vol.0/o-Suspension von infektiösen Mikroorganismen und tierischem Gewebe in steriler wässeriger Salzlösung. Die Verbindung gemäss Formel I, z. B. das N-Acetyläthylenimin, wird gewöhnlich in Form einer Lösung in sterilem, destilliertem Wasser verwendet. Die Konzentration dieser Verbindung ist vorzugsweise zwischen den Grenzen von ungefähr 0,005 Vol./Vol.o/o und ungefähr 1 Vol./ Vol.O/o in bezug auf das vereinigte Volumen der wässerigen Suspension der Mikroorganismen oder deren Antigen und der Lösung der Verbindung.
Unter obigen Bedingungen ist die Zeit, die notwendig ist, um Inaktivierung in bezug auf das Infektionsvermögen der infektiösen Mikroorganismen oder in bezug auf die Giftigkeit von deren Antigenen bei einer Temperatur zwischen ungefähr 18 bis ungefähr 22 oder 37O C hervorzurufen im allgemeinen in der Grössenordnung von ungefähr einer Stunde bis ungefähr 12 Stunden.
Die so erhaltenen wässerigen Zubereitungen, welche das nichtinfektiöse und nichttoxische Antigenmaterial enthalten, können der Gefriertrocknung unterworfen werden. Man erhält so ein Trockenpräparat, welches stabil ist und unter Vakuum gelagert werden kann. Den wässerigen Zubereitungen kann auch eine sterile wässerige Saccharoselösung vorzugsweise in ungefähr 5 Gew./Vol.o/o zugemischt werden, und die so erhaltenen Mischungen können der Gefriertrocknung unterworfen und dann unter Vakuum gelagert werden. Die Trockenpräparate behalten während der Lagerung ihre antigenen Eigenschaften bei und sind nach Zusatz von sterilem, destilliertem Wasser oder steriler Salzlösung als Vakzine gebrauchsfertig.
Erfindungsgemäss hergestellte Präparate, z. B. ein mit N-Acetyl-äthylenimin behandelter Poliomyelitis- oder Influenzavirus, können für medizinische-, veterinärärztliche Zwecke oder als Diagnostiziermittel verwendet werden.
Beispiel 1
Mit Pferdeencephalomyelitisvirus (New Jerseystamm) infiziertes Meerschweinchengehirn wird mit sterilem Sand unter sterilen Bedingungen zerkleinert und dann in eine 20-gew./vol.0/oige Suspension übergeführt, indem man eine sterile 0,85-gew./ vol.0/oige Natriumchloridlösung zusetzt. Die so erhaltene Suspension wird 15 Minuten lang bei 4000 Umdrehungen pro Minute zentrifugiert, und die überstehende Flüssigkeit vorsichtig entfernt. Die so erhaltene Flüssigkeit wird weitere 5 Minuten lang bei 4000 Umdrehungen pro Minute zentrifugiert und die überstehende Flüssigkeit vorsichtig entfernt.
Diese überstehende Flüssigkeit wird mit einem gleichen Volum 2-vol./vol.o/oiger steriler Lösung von N-Acetyl-äthylenimin in gekühltem, destilliertem Wasser gemischt und die so erhaltene Mischung unter gelegentlichem, schwachem Schütteln 90 Minuten lang auf ungefähr 18-22 C gehalten.
Eine Probe des so erhaltenen Präparates wurde intrazerebral 12 Mäusen (0,03 cm pro Maus) eingeimpft, um auf Anwesenheit von lebendem Virus zu prüfen; alle Mäuse blieben gesund. Das erhaltene Präparat kann mit 1j4 Volumteil einer 5-gew. l vol.0/o iger sterilen Saccharoselösung versetzt und die Mischung, in Anteilen von 2 cm3 in Ampullen verteilt, 24 Stunden lang einer Gefriertrocknung unterworfen werden. Die Trockenampullen werden dann bei 20 C gelagert. Zum Gebrauch werden 2 cm3 steriles, destilliertes Wasser zugesetzt, wobei rasche Lösung unter Bildung einer klaren Flüssigkeit eintritt.
Proben davon können auf Infektionsfähigkeit und Giftigkeit geprüft werden, indem man je 20 Mäusen, 0,5 cm3 intraperitonäal in 3 getrennten Versuchen einspritzt, so dass jede Maus insgesamt 1,5 cm3 in einer Zeitperiode von 7 Tagen zwischen jeder Einspritzung erhält. Es wurde gefunden, dass keine Infektionsfähigkeit und Giftigkeit vorhanden ist; alle Mäuse überleben und sind noch nach 4 Monaten bei guter Gesundheit.
Eine zweite Gruppe von 20 Mäusen erhält das Vakzin und wird dann nach folgender Technik mit lebendem Virus geprüft. Zwanzig, vor kurzem entwöhnten Mäusen mit einem Durchschnittsgewicbt von 12-15 g werden je 0,5 cm3 des Vakzins intraperitonäal in drei getrennten Versuchen eingespritzt, so dass jede Maus insgesamt 1,5 cm erhält und zwischen jeder Einspritzung 7 Tage liegen. 7 Tage nach der letzten Behandlung mit Vakzin werden die Mäuse intrazerebral mit lebendem Virus geimpft, wobei die Menge der Dosis so bemessen ist, dass sie die 30fache Menge der Dosis beträgt, die bei intrazerebraler Verabreichung bei Mäusen 100010 ig zum Tode führt. Es wird gefunden, dass 40 /e der Mäuse diese Infektion mit lebendem Virus überleben.
In einem Kontrollversuch, wobei nicht mit Vakzin behandelte Mäuse verwendet werden, beträgt die Letalität 100 /o.
Beispiel 2
Das im Beispiel 1 beschriebene Verfahren wird wiederholt, wobei an Stelle einer 2-vol./vol.0/o igen Lösung von N-Acetyl-äthylenimin eine 0,5-vol./ vol.0/oige Lösung von N-Acetyl-äthylenimin verwendet wird. Die so erhaltene Mischung wird 3 Stunden lang unter gelegentlichem, schwachem Schütteln bei ungefähr 18-22"C gehalten.
Eine Probe des so erhaltenen Präparates wird 12 Mäusen (0,03 cm3 pro Maus) intrazerebral eingeimpft, um auf Anwesenheit von lebendem Virus zu prüfen. Es wird kein lebendes Virus gefunden, da alle Mäuse bei guter Gesundheit den Versuch überleben. Zum Präparat kann ¸ Volumteil einer 5-gew./vol.0/o igen, sterilen, wässerigen Saccharoselösung gegeben werden. Die so erhaltene Mischung wird in Anteilen von je 2 cm3 in Ampullen verteilt, 24 Stunden der Gefriertrocknung unterworfen und dann unter Vakuum geschlossen. Die Vakzinpräparate werden bei 20 C gelagert.
Bei Gebrauch werden 2 cm3 steriles destilliertes Wasser zugesetzt, wobei rasche Lösung unter Bildung einer klaren Flüssigkeit eintritt. Proben dieser Flüssigkeit werden auf Infektionsfähigkeit und Giftigkeit geprüft, indem man je 20 Mäusen 0,5 cm3 intraperitonäal in drei getrennten Versuchen einspritzt, so dass jede Maus insgesamt 1,5 cm3 in einer Zeitperiode von 7 Tagen zwischen jeder Einspritzung erhält. Es wird gefunden, dass keine Infektionsfähigkeit und Giftigkeit vorhanden ist.
Eine zweite Gruppe von 20 Mäusen erhält das Vakzin und wird dann mit folgender Technik mit lebendem Virus geprüft. Zwanzig vor kurzem entwöhnten Mäusen mit einem Durchschnittsgewicht von 12-15 g werden je 0,5 cm des Vakzins intraperitonäal in drei getrennten Versuchen eingespritzt, so dass jede Maus insgesamt 1,5 cm3 erhält und zwischen jeder Einspritzung 7 Tage liegen. 7 Tage nach der letzten Behandlung mit Vakzin werden die Mäuse intrazerebral mit einer 30fachen LDloo an lebendem Virus geimpft. Es wird gefunden, dass 50"/0 der Mäuse diese Infektion überleben. In einem Kontrollversuch, wobei nicht mit Vakzin behandelte Mäuse verwendet werden, ist die Letalität 1000/o.
Beispiel 3
Das im Beispiel 1 beschriebene Verfahren wird wiederholt, indem man anstatt einer 2-vol./vol.'/oigen Lösung von N-Acetyl-äthylenimin eine 0,25-vol./ vol.0/oige Lösung davon verwendet und die Mischung unter gelegentlichem- schwachem Schütteln 3 Stunden lang bei 370 C hält.
Das so erhaltene Präparat enthält kein lebendes Virus mehr, wie durch intrazerebrale Einimpfung einer Probe des Präparates an Mäusen gezeigt werden kann. Wie in Beispiel 1 und 2 beschrieben wurde, kann ein Trockenampullen-Präparat hergestellt und dessen Wirksamkeit an Mäusen geprüft werden.
Beispiel 4
Das im Beispiel 1 beschriebene Verfahren wird wiederholt, indem statt einer 2-vol./vol. s/o igen N-Acetyl-äthyleniminlösung eine 0,1 -vol./vol ./o ige Lösung davon verwendet wird. Die so erhaltene Mischung wird unter gelegentlichem schwachem Schütteln 4 Stunden lang bei 37O C gehalten. Das so erhaltene Präparat kann, wie oben beschrieben, einer Gefriertrocknung unterworfen und das getrocknete Produkt mit sterilem, destilliertem Wasser wieder aufgefüllt werden, um ein Vakzin zu erhalten.
Wenn dieses Vakzin Mäusen eingeimpft wird, welche dann mit lebenden Virus nach der in Beispiel 1 und 2 beschriebenen Technik behandelt werden, so wird gefunden, dass 100ovo der Mäuse die Infektion mit dem lebenden Virus überleben. In einem Kontrollversuch mit Mäusen, die keine Vakzinbehandlung erfahren haben, beträgt die Letalität 1000/0.
Beispiel 5
Mit Lansing (an Mäuse adaptiertes) Poliomyelitisvirus infiziertes Gehirn und Rückenmark wird mit sterilem Sand unter sterilen Bedingungen zerkleinert und dann durch Zusatz einer 0, 85-gew./vol. /oigen sterilen wässerigen Natriumchloridlösung in die Form einer 20-gew./vol.0/oigen Suspension gebracht.
Diese erhaltene 20-gew./vol.0/oige Lösung wird bei 4000 Umdrehungen pro Minute 30 Minuten lang zentrifugiert und die überstehende Flüssigkeit sorgfältig entfernt. Die so erhaltene überstehende Flüssigkeit wird weitere 5 Minuten lang bei 4000 Umdrehungen pro Minute zentrifugiert und die überstehende Flüssigkeit sorgfältig entfernt. Diese wird mit einem gleichen Volumen einer 2-vol./vol. /oigen sterilen Lösung von N-Acetyl-äthylenimin in gekühltem, destilliertem Wasser gemischt, und die so erhaltene Mischung während 2 Stunden unter gelegentlichem, schwachem Schütteln auf ungefähr 18 bis 220 C gehalten.
Das erhaltene Präparat kann, wie in Beispiel 1 und 2 beschrieben, in ein Trockenampullen-Präparat übergeführt und die Wirksamkeit an Mäusen geprüft werden.
Beispiel 6
Das im Beispiel 5 beschriebene Verfahren wird wiederholt, anstatt einer 2-vol./vol.o/oigen Lösung von N-Acetyl-äthylenimin wird eine 0,5-vol./vol.o/oige Lösung davon verwendet. Die so erhaltene Mischung wird 6 Stunden lang unter gelegentlichem. schwachem Schütteln ungefähr bei 1 8220 C gehalten.
Das erhaltene Präparat kann lyophilisiert und die Wirksamkeit des Präparates an Mäusen getestet werden.
Beispiel 7
Das im Beispiel 5 beschriebene Verfahren wird wiederholt, aber an Stelle einer 2-vol./vol. /o igen N-Acetyläthyleniminlösung wird eine solche von 0,25 Vol./Vol. /o verwendet. Die so erhaltene Mischung wird 4 Stunden lang unter gelegentlich schwachem Schütteln bei ungefähr 37 C gehalten.
Das so erhaltene Präparat enthält kein lebendes Virus mehr und es kann unter Lyophilmachung getrocknet werden. Das so erhaltene getrocknete Material kann durch Zusatz von sterilem destilliertem Wasser gebrauchsfertig gemacht werden. Wenn die so erhaltene klare Flüssigkeit Mäusen intraperitonäal eingespritzt wird, so wird gefunden, dass sie frei von Infektionsmöglichkeiten und Giftigkeit ist, da alle Mäuse in guter Gesundheit mehrere Monate später überleben.
Beispiel 8
Das in Beispiel 5 beschriebene Verfahren wird wiederholt, indem statt einer 2-vol.lvol.olcuigen N-Acetyl-äthyleniminlösung eine solche von 0,1 Vol./ Vol.O/o verwendet wird. Die so erhaltene Mischung wird 4 Stunden lang unter gelegentlichem schwachem Schütteln bei 37o C gehalten.
Das Präparat kann, wie in Beispiel 1 und 2 beschrieben wurde, in ein Trockenampullen-Präparat übergeführt und dessen Wirksamkeit an Mäusen getestet werden.
Beispiel 9
Das im Beispiel 5 beschriebene Verfahren wird wiederholt, statt der 2-vol./vol.o/oigen N-Acetyl äthyleniminlösung wird eine solche von 0,05 Vol./ Vol.01o verwendet. Die so erhaltene Mischung wird 12 Stunden lang unter gelegentlichem schwachem Schütteln bei 37 C gehalten.
Das erhaltene Präparat kann, wie in Beispiel 1 und 2 beschrieben, in ein Trockenampullen-Präparat übergeführt und dessen Wirksamkeit an Mäusen getestet werden.
Beispiel 10
Das im Beispiel 5 beschriebene Verfahren wird wiederholt, indem man statt einer 2-vol./vol.o/oigen Lösung von N-Acetyl-äthylenimin eine solche von 0,025 Vol./Vol.o/o verwendet. Diese Mischung wird unter gelegentlichem schwachem Schütteln 12 Stun den lang auf 37O C gehalten.
Das so erhaltene Präparat kann, wie in Beispiel 1 und 2 beschrieben wurde, in ein Trockenampullen Präparat übergeführt und dessen Wirksamkeit an Mäusen geprüft werden.
Beispiel 11
Eine ursprünglich aus der menschlichen Haut isolierte vollausgewachsene Kultur von Staphylococcus albus wird zentrifugiert. Die Bakterienzellen werden in steriler 0,85-gew./vol.6/o iger Natriumchloridlösung suspendiert, zentrifugiert und dann nochmals in steriler 0,85-gew./vol.0/oiger wässeriger Natriumchloridlösung suspendiert, so dass man eine Zellsuspension von optimaler Dichte von 1,6 erhält, wenn ein Muster in einer 1 -em-Spectrophoto- meterzelle bei Licht von einer Wellenlänge von 5800 Ä geprüft wird.
Zu 4 Teilen dieser so erhaltenen Zellsuspension wird 1 Teil einer l-vol./ vol.9/o igen Lösung von N-Acetyl-äthylenimin in Eiswasser zugesetzt und die erhaltene Mischung 24 Stunden lang unter gelegentlichem schwachem Schütteln bei 37O C gehalten.
Eine Probe des so erhaltenen Präparates wird in eine bakterielle Nährlösung und ebenso in ein bakterielles Agar-Agar-Nährmedium in einer Zuchtschale eingeimpft. Es werden keine lebenden Bakterien gefunden, wie in jedem Falle aus dem Fehlen von bakteriellem Wachstum bei 370 C innerhalb von 6 Tagen ersichtlich ist.
Zu dem Präparat kann i4 Volumteil einer 5-gew./vol. /o igen wässerigen Saccharoselösung zugesetzt und die Mischung in Anteilen von 2 cm in Ampullen verteilt, innerhalb 18 Stunden lyophili- siert und dann unter Vakuum verschlossen werden.
Das Vakzin-Präparat wird bei 18-22"C gelagert.
Jede Ampulle wird durch Zusatz von 2 cm3 sterilem destilliertem Wasser gebrauchsfertig gemacht, wobei rasch Lösung eintritt. Proben dieses Materials werden auf die Anwesenheit von lebendem Virus geprüft, indem man dieselben in eine bakterielle Nährlösung einspritzt, welche dann 6 Tage lang bei 37O C bebrütet wird. Die Abwesenheit von lebensfähigen Bakterien zeigt sich dadurch, dass unter diesen Bedingungen kein bakterielles Wachstum eintritt. Das gebrauchsfertig gemachte Vakzin wird Kaninchen subkutan eingespritzt. In keinem Falle zeigen diese toxische Symptome. Zwei Vakzininjektionen von 0,5 cm3 pro Kaninchen werden in der ersten Woche gegeben und zwei Injektionen von 1,0 cm3 pro Kaninchen werden in der zweiten Woche gegeben.
Das Serum dieser Kaninchen sowie von Kaninchen, welche keine Vakzinbehandlung erfahren haben, wird gesammelt. Der Antikörpertiter des Serums wird geschätzt durch die Agglutinationsreaktion mit einer Suspension der gleichen lebenden Bakterien. Es wird ein beträchtliches Anwachsen der Antikörper-Agglutination im Vergleich mit dem nicht mit Vakzin behandelten Kaninchenserum gefunden.
Beispiel 12
24 Stunden nach der Infektion mit kleinen Mengen von Influenza A-Virus werden die Chorion Allantois-Membranen von 30 Hühnereiern, die seit 12 befruchtet waren, entnommen. Die vereinigten Membranen werden dann dreimal abwechselnd auf 700 C gefroren und dann bei 37O C aufgetaut, worauf 30 cm einer N/l00 phosphatgepufferten Salzlösung zugesetzt wird. Nach Vermischung werden die Membranen 5 Minuten lang bei 3000 Umdrehungen pro Minute zentrifugiert und der über den Membranen befindliche Extrakt entfernt. Ein Muster dieses Extraktes wird auf seine Infektionsfähigkeit auf befruchtete Hühnereier geprüft.
Mengen von 1 cm3 infizieren bei einer Verdünnung von 10-6,2 50 /o dieser Eier, das heisst, der Extrakt enthält pro cm3 10-6,2 für 500/0 Eier ansteckende Dosen (E. 1. D50 egg infectivity doses). Zu einem Muster dieses Membranextraktes wird so viel N-Acetyl-äthylenimin zugesetzt, dass eine Endkonzentration von 1 Vol./Vol.o/o an Acetyl-äthylenimin erzielt wird und diese Mischung dann 4 Stunden lang bei 300 C eingelagert. Bei einer Verdünnung von 1:10 infiziert der so behandelte Extrakt von 10 mit 1 cm3 geimpften Eiern kein einziges Ei. Der unverdünnte Extrakt wirkt in Eiern toxisch.
Wenn aber das Virus durch Adsorption an die roten Blutkörperchen von Meerschweinchen abgetrennt wird und in eine 0, 85 loige Natriumchloridlösung ausgewaschen wird, so wird von 10 mit 1 cm3 geimpften Eiern keines infiziert. Wenn die unbehandelten und die mit Acetyläthylenimin behandelten Extrakte parallel durch die übliche Methode (Salk Mustertest) geprüft werden, so findet man, dass sie die gleiche Fähigkeit besitzen, die roten Blutkörperchen von Meerschweinchen zu agglutinieren.
(Die Hämoglutinintiter sind 101,0 und 102 95 Hämoglutinineinheiten pro cm3, welche bei der verwendeten Technik nicht wesentlich verschieden sind.) Wenn dieselben an dem gleichen Muster eines menschlichen Reconvalescentenserums geprüft werden, welches Antikörper zu dem löslichen Antigen von Influenza-A-Typus besitzt, so findet man wieder, dass die unbehandelten und die mit Acetyl äthylenimin behandelten Extrakte nicht zu unterscheidende Mengen an löslichen Antigen besitzen, gemessen an der Complement-Fixierung (103905 und resp. 103,2 lösliche Antigeneinheiten pro cm3).
Bei der Diagnose der menschlichen Influenzainfektion werden die Serum-Antikörper in bezug auf ihre Bindekraft mit dem Hämoglutinin oder mit dem löslichen Antigen des Influenzavirus gemessen.
Die nichtinfektiösen mit Acetyläthylenimin behandelten Influenzavirus-Präparate, die, wie oben beschrieben, erhalten werden, können für diesen Zweck gebraucht werden.