CH358431A

CH358431A - Verfahren zur Herstellung neuer Oktapeptide

Info

Publication number: CH358431A
Authority: CH
Inventors: Robert Prof Dr Schwyzer; Beat Dr Iselin; Heini Dr Kappeler; Werner Dr Rittel; Bernhard Dr Riniker
Original assignee: Ciba Geigy
Priority date: 1957-02-08
Filing date: 1957-02-08
Publication date: 1961-11-30

Description

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Verfahren zur Herstellung neuer Oktapeptide Gegenstand der Erfindung ist ein Verfahren zur Herstellung von Oktapeptiden mit Hypertensinwir- kung. Beim Hypertensin handelt es sich bekanntlich um ein Hormon mit blutdrucksteigender Wirkung, das zuerst aus Rinderblut gewonnen wurde.

Die Konstitutionsaufklärung ergab, dass Hypertensin ein lineares Dekapeptid ist mit der Aminosäuresequenz L-Aspara- ginsäure, L-Arginin, L-Valin, L-Tyrosin, L-Valin, L-Histidin, L-Prolin, L-Phenylalanin, L-Histid'in, hLeucin. In der Folge wurden noch zwei weitere Hypertensine aufgefunden: Hypertensin I, das im Pferdeblut vorkommt und statt des 5.

Aminosäurerestes (Valin) den Rest des Isoleucins enthält, und Hypertensin 1I, ein Oktapeptid, das im Aufbau dem Hypertensin I entspricht, jedoch die beiden letzten Aminosäurereste nicht enthält (vgl. z. B. Skeggs et a1., J. Exp. Med., Band 100 [l954], 363; ibid., Band 103 [l956], 301; W. S. Peart, Bioch. J., Band 62 [1956], 520).

Es wurde nun gefunden, dass Oktapeptide mit der Aminosäuresequenz L-Asparagin, L-a-(Amino-nieder- alkyl)-amino-essigsäure, L-a-Amino-niederalkyl-essig- säure, L-Tyrosin, L-a-Amino-niederalkyl-essigsäure, L= Histidin, L-Prolin, L-Phenylalanin und ihre Salze ebenfalls eine sehr gute hypertensive Wirkung aufweisen.

Reste der a-Amino-niederalkvl-essigsäure sind vor allem Valyl, Leucyl, iso-Leucyl, ferner Norvalyl, Norleucyl sowie Alanyl. Als a-(Amino-niederalkyl)- amino-essigsäuren kommen in Betracht Arginin, Ly- sin, Omithin, a,#,"-Diaminobuttersäure oder Citrullin. Es hat sich gezeigt, dass Oktapeptid'e, in denen die in den natürlichen Hypertensinen vorkommenden Amino- säuren Arginin,

Valin und Isoleucin durch andere Aminosäuren, beispielsweise Lysin oder Leucin, ersetzt sind, auch eine Hypertensinwirkung aufweisen. Dies ist von technischer Bedeutung, weil die genann- ten Oktapeptide im Vergleich zu den bereits bekannten Peptiden leichter und somit billiger zugänglich sind. Ebenso bedeutet die Verwendung eines Okta- peptids, das statt des Asparaginsäurerestes den Aspa- raginrest enthält, schor. verfahrenstechnisch einen Fortschritt.

Die genannten Oktapeptide können auch als Zwischenprodukte zur Herstellung anderer wirksamer Verbindungen verwendet werden. So kann beispielsweise der Amidrest des Asparagins in die Carboxyl- gruppe übergefiihrt werden; geht man vom L-Aspara- ginyl -L- arginyl-L-valyl-L-tyrosyl-L-isoleucyl-L-histi- dyl-L-prolyl-L-phenylalanin aus, so erhält man Hy- pertensin II, womit erstmals die Synthese dieses Hormons beschrieben ist.

Die Überführung der den Asparaginrest aufweisenden Peptide in entsprechende Peptide mit dem Asparaginsäurerest kann durch Behandlung mit wäss- rigen oder alkoholischen Alkalien, z. B. Natronlauge in Methanol, oder auch mit wässrigen oder alkoholischen Mineralsäuren erfolgen.

Es besteht eine grosse Anzahl von Möglichkeiten, die neuen Peptide herzustellen. Das erfindungsgemässe Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, dass man eine L-Asparaginyl-L-a- (amino-niederalkyl)-a-aminoessig- säure, eine L-a.-Amino-niederalkylessigsäure, L-Tyro- sin, eine L-a-Amino-niederalkylessigsäure, L-Histidin, L-Prolin und L-Phenylalanin unter intermediärem Schutz von Amino- bzw. Carboxylgruppen miteinander durch Kondensation vereinigt.

Wenn erwünscht, kann die Carbonylamidgruppe des Asparaginrestes in eine freie Carboxylgruppe übergeführt werden.

Wenn das zu synthetisierende Oktapeptid als 2. Aminosäure Arginin enthält, geht man vorteilhaft vom L-Asparaginyl-nitro-L-a ginin aus und konden-

siert dieses mit einem I,

- a-Amino-niederalkyl-acetyl- L-tyrosyl-L-a-amino -niederalkyl- acetyl-L-histidyl-L- prolyl-L-phenylalanyl-ester zum gewünschten Okta- peptid. Man kann aber auch ein L-Asparaginyl-nitro- L-arginin mit L-a-Amino-niederalkyl-acetyl-L-tyrosin zu einem Asparaginyl-nitro-L-arginyl-L-a-amino-nie- deralkyl-acetyl-L-tyrösin kondensieren und dieses mit einem L-a-Amino-niederalkyl-acetyl-L-histidyl-L-pro- lyl-L-phenylalaninester zum Oktapeptid umsetzen.

Ferner ist es möglich, L-a-Amino-niederalkyl-acetyl- L-tyrosyl-L-a-amino-niederalkyl-acetyl-histidin mit einem L-Asparaginyl-nitro-L-arginin zu acyheren und das erhaltene L-Asparaginyl-nitro-L-arginyl-L-a- amino-niederalkyl-acetyl-L-tyrosyl-L- a-amino-nieder- alkyl-acetyl-histidin mit L-Prolyl-L-phenylalanin zum Oktapeptid umzusetzen. Die bei der Acylierung erwähnten Zwischenprodukte können nach verschiedenen Möglichkeiten erhalten werden.

So lässt sich vorerst L-a-Amino-nieder- alkyl-essigsäure mit L-Tyrosin zum L-a-Amino-nie- deralkyl-acetyl-L-tyrosin, mit L-Histidin zum L-a- Amino-niederalkyl-acetyl-L-histidin und schliesslich L-Prolin mit L-Phenylalanin-ester zum L-Prolyl-L- phenylalanin-ester kondensieren.

Das so erhaltene L-a-Amino-niederalkyl-acetyl-L-histidin wird dann mit dem L-a-Amino-niederalkyl-acetyl-L-tyrosin zum L-a-Amino-niederalkyl-acetyl-L-tyrosyl-L-a-amino- niederalkyl-acetyl-L-histidin acyliert. Man kann aber auch die L-a-Amino-niederalkyl-essigsäure mit dem L-a-Amino-niederalkyl-acetyl-L-tyrosin zur L-a- Amino-niederalkyl-acetyl-L-tyrosyl-L-cc-amino-nieder- alkyl-essigsäure und diese dann mit L-Histidin kondensieren. Als Aminoschutzgruppen kommen insbesondere mittels Hydrolyse oder Reduktion abspaltbare Reste, wie z.

B. der Carbobenzyloxyrest, in Frage. Die Acy- lierung kann beispielsweise durch Umsetzung einer Säure mit dem entsprechenden Phosphitamid, wie z. B. mit dem entsprechenden Diäthylphosphitamid, durch Reaktion einer Säure mit dem Amin in Gegenwart eines Carbodiimids, wie in Anwesenheit des 1- Cyclohexyl-3-(2-morpholinyl-[4]-äthyl)-carbodiimids- und insbesondere durch Umsetzung eines Amins mit einem aktivierten Ester, in dem als aktivierender Sub- stituent in der Alkoholkomponente vorteilhaft die Cyan- oder Nitrogruppe vorhanden ist, erfolgen.

Die Umwandlung einer geschützten Aminogruppe in eine freie Aminogruppe sowie die Überführung einer funktionellen abgewandelten Carboxylgruppe in eine freie Carboxylgruppe im Verlaufe des Verfahrens zur Herstellung der verschiedenen Polypeptid'e und insbesondere in den verfahrensgemäss erhaltenen Oktapeptiden kann nach an sich bekannten Methoden durch Behandlung mit hydrolysierenden bzw. mit hydrierenden Mitteln erfolgen.

In den erhaltenen Verfahrensprodukten können freie Carboxylgruppen funktionell abgewandelt, insbesonders in Ester bzw. Amide übergeführt werden. Ferner ist es möglich, freie Aminogruppen zu substituieren, wie z. B. zu alkylieren oder acylieren. Die Verfahrensprodukte lassen sich auch in Form ihrer Salze gewinnen bzw. verwenden.

Eine spezielle Ausführungsform des erfindungsgemässen Verfahrens, wie sie im ersten Beispiel beschrieben ist, wird im folgenden Formelschema unter 3 bis 7 dargestellt. 1. N-Carbobenzyloxy-L-asparaginyl-nitro-L-arginin- zethyiester (1I1).
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EMI3.1
2. N-C'arbobenzyloxy-L-asparaginyl-nitro-L-arginin (IV).
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3. N-Carbobenzyloxy-L-asparaginyl-nitro-L-arginyl-L-val)"l-L-tyrosin-methylester (V1).
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4. N-Carbobenzyloxy-L-asparaginyl-nitro-L-arginyl-L-valyl-L-tyrosin (VII).
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S. N-Carbobenzyloxy-L-asparaginyl-nitro-L-arginyl-L-valyl-L-tyrosyl-L-isoleucyl-L-hi,stidyl-L-prolyl-L- phenylalanin-methylester (IX).
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6.

L-Asparaginyl-L-arginyl-L-valyl-L-tyrosyl-L-isoleucyl-L-histidyl-L-prolyl-L-phenylalanin-methyl- ester (X).
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7. L-Asparaginyl-L-arginyl-L-valyl-L-tyrosyl-L-isoleucyl-L-histidyl-L-prolyl-L-phenylalanil (XI).
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Die verfahrensgemäss erhaltenen Oktapeptide können als Zwischenprodukte zur Herstellung von Arzneimitteln oder auch als Heilmittel Verwendung finden.

1n den nachfolgenden Beispielen sind die Temperaturen in Celsiusgraden angegeben.

Beispiel 1 a) N-Carbobenzyloxy-L-asparaginyl-nitro-L-argi- fiyl-L-valyl-L-tyrosin-methylester (V1).

3,72 g (13 mMol) frisch bereiteter L-Valyl-L-tyro- sin-methylester (V) und 5,47 g (11,8 mMol) Carbo- benzyloxy-L-asparaginyl-nitro-L-arginin (IV) (vgl. Patent Nr. 356122) werden in 35 cm3 Dimethylform- amid gelöst und 2,52 g (12,3 mMol) 1,3-Dicyclohexyl- carbodiimid zugegeben.

Nach 24 Stunden bei 21 wird der ausgeschiedene Dicyclohexylharnstoff abge- nutscht und das Filtrat bei 0,1 mm Hg und 45 Badtemperatur vollständig vom Dimethylformamid befreit. Das hinterbleibende Öl wird zuerst mit Petrol- äther, dann unter Eiskühlung mit verdünnter Bikar- bonat-Lösun!i, Wasser, verdünnter Salzsäure und Wasser gewaschen, wobei das anfänglich ölige Produkt langsam körnig wird.

Das Rohrprodukt (8,79 g) wird zur weiteren Reinigung aus heissem Methanol umgefällt und das in Methanol unlösliche Pulver mit heissem Aceton verrieben. Dabei werden 2,91 g (33 %) Carbobenzyloxy-L-asparaginyl-nitro-L-arginyl- L-valyl-L-tyrosin-methylester (V1) vom Smp. 202 bis 206 erhalten [a]D = -4 4 (c = 0,94 in Dime- thylformamid).

b) N-Carbobenzyloxy-L-asparaginyl-nitro-L-argi- nyl-L-valyl-L-tyrosin (V11).

2,58 g (2,5 mMol) N-Carbobenzyloxy-L-aspara- ginyl - nitro -L- arginyl - L-valyl-L-tyrosin-methylester (V1) werden in 30 em3 Dimethylformamid und inner- halb 15 Minuten insgesamt 100 cm3 1;1()-n. Natronlauge in mehreren Anteilen zugegeben, wobei darauf geachtet wird, dass das pH der Lösung 11 nicht überschreitet.

Nach Zugabe der Lauge wird weitere 15 Minuten bei pH 11 belassen, dann durch Zugabe von festem C02 auf pH = 8 gebracht und die Lösung zuerst bei 11 mm und 45 Badtemperatur vom Wasser, dann bei 0,1 mm vom Dimethylformamid befreit. Der Rückstand wird in 30 cm3 Wasser gelöst, von einer Spur Flocken abfiltriert und das klare Filtrat unter Kühlung mit 2-n. Salzsäure angesäuert. Das ausgeschiedene, zähe Produkt wird beim Verreiben (unter Eiskühlung) fest.

Das Rohprodukt (2,14 g) wird in heissem Methanol gelöst und durch Zugabe von Aceto- nitril ausgefällt. Es werden 1,77 g (70 %) Carbobenz- oxy-L-asparaginyl-nitro-L- arginyl-L-valyl-L-tyrosin (VII) als Pulver erhalten, Smp. etwa 175-l83 (Aufschäumen); [a]23 = 0 4 (c = 0,4 in Methanol).

c) N-Carbobenzyloxy-L-asparaginyl-nitro-L-argi- nyl-L-valyl-L-tyrosyl -L- isoleucyl-L-histidyl-L-prolyl- L-phenylalanin-methylester (IX).

1,88 g (2,58 mMol) Carbobenzyloxy-L-asparagi- ryl-nitro-L-arginyl-L-valyl-L-tyrosin (VII) und 1,31 g (2,50 mMol) frisch bereiteter L-Isoleucyl-L-histidyl- L-prolyl-L-phenyl-alanin-methylester (VIII) werden in 15 cm3 Dimethylformamid gelöst und eine Lösung von 0,62 g (2,62 mMol) 1-Cyclohexyl-3-morpholinyl- äthyl-carbodiimid zugegeben.

Die Lösung wird 21 Stunden bei 20 belassen, hierauf das Dimethylform- amid im Hochvakuum entfernt und das zurückbleibende Öl mit Wasser unter Eiskühlung zerrieben, wobei es allmählich körnig wird. Das Pulver wird mehrmals mit Wasser, dann mit verdünnter Bikarbonat- Lösung und Wasser gewaschen und getrocknet.

Das Rohprodukt (3,70 g) wird zur weiteren Reinigung mit Aceton und Methanol gewaschen und ergibt 0,68 g N-Carbobenzyloxy-L-asparaginyl-nitro-L-a gginyl-L-

valyl-L-tyrosyl-L-isoleucyl-L-histidyl - L-prolyl-L-phe- nylalanin-methylester (IX), Smp. = 190-205 ; [a] D __ -29 4 (c = 0,52 in Dimethylformamid). Das Produkt ist schwer löslich in den gebräuchlichen organischen Lösungsmitteln, ausser in Dimethylform- amid; löslich in sehr verdünnter Salzsäure.

d) L-Asparcaginyl-L-argi:zyl-L-valyl-L-tyrosyl-L- isoleucyl-L-histidyl-L -prolyl-L-phenylalanin-methyl- ester (x).

370 mg (0,3 mMol) Carbobenzyloxy-L-asparagi- nyl-nitro-L-arginyl-L-valyl-L-tyrosyl-L-isoleucyl-L- histidyl-L-prolyl-L-phenylalanin-methylester (X) werden in 15 cm3 Methanol suspendiert und durch Zugabe von 1,0 cm3 1,24-n. (4 Äq.) Salzsäure in Methanol in Lösung gebracht.

Eine Spur Flocken wird durch Filtration entfernt und die Lösung in Gegenwart von 100 mg Palladiumkohle (10% Pd) bei Zimmertem- peratur und Normaldruck hydriert (unter Verwendung eines zweiten, mit verdünnter Natronlauge gefüllten Hydriergefässes zur Absorption des entwickelten CO2). Die Hydrierung ist nach 13 Stunden und Aufnahme von etwas mehr als der berechneten Menge Wasserstoff beendet. Die Lösung wird hierauf vom Katalysator abfiltriert und im Vakuum zur Trockne eingedampft.

Der Rückstand (Harz) wiegt 310 mg (berechnet für ein Gemisch aus äquimolaren Mengen Trihydrochlorid und Ammoniumchlorid = 360 mg). Das Produkt (X) wird ohne Reinigung weiterverarbeitet. Es ist leicht löslich in Wasser, aber schwer löslich in wässrigem Alkali; löslich in Methanol, unlöslich in Äther.

e) L-Asparaginyl-L-caz-ginyl-L-valyl-L-tyrosyl-L- isoleiicyl-L-histidyl-L-prolyl-L-phenylalanin. Zur Lösung von 256 mg (25 Mol) L-Asparaginyl- L-arginyl - L-valyl - L-tyrosyl-L-isoleucyl-L-histidyl-L- prolyl-L-phenylalanin-methylester in 12,0 cm,' 66 % Methanol wird in mehreren Anteilen 0,1-n. Natronlauge zugegeben, bis der p11-Wert der Lösung während 20 Minuten bei 10,5-11,0 bleibt (total 18 cm3 0,1-n.

Natronlauge zugegebep).Nach insgesamt 30 Minuten wird durch Zugabe von etwas festem CO2 auf pH = 8 gebracht, eine flockige Fällung (25 mg) durch Filtration entfernt und das Filtrat im Vakuum von Methanol befreit. Die wässrige Lösung (Volumen 15 cm3) wird mit einigen em3 verdünnter Sodalösung versetzt und bei pH = 9 viermal mit je 100 cm3 wassergesättigtem n-Butanol ausgeschüttelt. Die Butanol-Auszüge werden einmal mit 8 cm,' verdünnter Natriumsulfatlösung gewaschen, mit Natriumsulfat getrocknet und geben beim Eindampfen 195 mg Rohprodukt.

Dieses wird dreimal mit je 5 cm3 trockenem n-Butanol gewaschen, wodurch sich 30 mg leichter lösliche Anteile entfernen lassen. Die Hauptmenge (135 mg) L-Asparaginyl- L-arginyl-L-valyl-L-tyrosyl-L-isoleucyl-L-histidyl-L- prolyl-L-phenylalanin ist in trockenem Butanol schwer löslich und wird in Form eines farblosen, feinkörnigen Beschlages erhalten. Das Produkt ist löslich in Wasser und Methanol. Das Rohprodukt (135 mg) wird einer 32stufigen multiplikativen Verteilung (Craig-Grundprozess) im System n-Butanol-Wasser unterworfen. Die Hauptmenge (75 mg) des wirksamen Materials befindet sich in den Fraktionen 9-21 mit einem Maximum bei Fraktion 15 (G = 0,89).

Die Fraktionen 0-8 enthalten 45 mg einer langsamer wandernden, inaktiven Verunreinigung; die Fraktionen 22-32 enthalten etwa 20 mg inaktives Material. Eine Probe der Substanz aus Fraktion 15 wirkt an der Ratte in der Versuchsanordnung von Peart3) zweimal so stark wie Noradrenalin (0,25 ;"/kg in 0,1 cm' physiologischer Kochsalz-Lösung intravenös entsprechen 0,5 ,, Nora- drenalin).

Das Material aus den Fraktionen 9-21 wird vereinigt und nochmals gleich wie oben verteilt. Aktivität findet sich wiederum in den Fraktionen 9-22, welche insgesamt 32 mg Material enthalten (Maximum in Fraktion 16). Die Fraktionen 0-8 enthalten noch 20 mg inaktives Material, die Fraktionen 23-32 noch etwa 15 mg inaktives Material.

Eine Probe der Substanz aus Fraktion 16 erweist sich im obigen Test als fünf- bis zehnmal stärker wirksam als Noradrenalin.

Das Material aus den Fraktionen 9-22 wird wie- der vereinigt und im System n-Butanol-4 % Essigsäure in 30 Schritten verteilt (Craig-Grundprozess). Nach Beendigung des 30.

Verteilungsschrittes wird der pH aller Fraktionen durch Zugabe von etwas methanoli- scher Ammoniak-Lösung auf 5,5-6,0 gebracht, die Lösungen bei 40 o/a und vermindertem Druck zur Trockene verdampft und die Eindampfrückstände zur Entfernung von Ammoniumacetat 8 Stunden bei 50 und 0,01 mm Hg getrocknet. Die Fraktionen 0-6 enthalten insgesamt 30 mg Substanz (Maximum bei Fraktion 1, K == 0,051); die Fraktionen 7-30 enthalten keine wägbaren Anteile. Die experimentell gefundene Gewichtsverteilungskurve in den Fraktionen 0-6 stimmt mit der theoretisch berechneten überein.

Eine Probe der Substanz aus Fraktion 1 zeigt im oben angegebenen Test von PeartO) eine fünfmal stärkere Wirksamkeit als Noradrenalin. Das so gereinigte L-Asparaginyl - L-arginyl - L-valyl - L-tyrosyl-L-isoleu- cyl-L-histidyl-L-prolyl-L-phenylalanin wird in Form eines farblosen Pulvers erhalten; Smp. (nach Trocknen im Hochvakuum) 195-205 (Zers.). Im Papier- chromatogramm zeigt es in den Systemen Äthanol-n- Butanol-H,O-Diäthylamin (100: 100 - 50: 20), n-Bu- tanol- Aceton-H.,0-Diäthylamin (100:

100:50:20), Äthanol-n-Butanol-H=O (100:100:50), n-Butanol- Eisessig-H20 (100: 10, ges. mit H.=0) und sec. Bu- tanol-3 %NH3 (120-44) auf Whatmann Nr. 1 die RF-Werte 0,37; 0,31; 0,18; 0,15 und 0,24. Die Flek- ken zeigen die Pauly-Reaktion: auf dem Papier sind keine ninhydrin-positiven Substanzen nachweisbar.

Die ss-Carbonamidgruppe des Asparaginylrestes kann beispielsweise wie folgt zur Carboxylgruppe verseift werden: 5 mg L-Asparaginyl-L-arginyl-L-valyl-L-tyrosyl- L-isoleucyl-L-histidyl-L-prolyl-L-phenylalanin (XI)

werden in 0,1 ml konz. HCl gelöst und 100 Minuten bei 39 stehengelassen. Dann wird die Lösung im Hochvakuum zur Trockene verdampft, der Rückstand pulverisiert und bei 40 im Hochvakuum getrocknet.

Das entstandene L-Asparagyl-L-arginyl-L-valyl-L- tyrosyl-L-isoleucyl-L-histidyl-L-prolyl-L-phenylalanin (Hypertensin II) kann durch Craig-Verteilung oder Chromatographie an eine Zellulose-Säule mit geeigneten Lösungsmittelspektren, z. B. Butanol-Methanol- 0,33 m NH4COOH (3:1:4; pH = 6,5) oder sek. Butanol-3 Oh, NH3 (120: 44) von nichtverseiftem Ausgangsmaterial abgetrennt werden.

Wasserlösliches, farbloses Pulver, R, = 0,2 im System sek. Butanol- 3 % NH3 (130: 44).

Der als Ausgangsstoff verwendete L-Valyl-L-tyro- sin-methylester kann wie folgt hergestellt werden: 1. N-Carbobenzyloxy-L-valyl-L-tyrosin-fnethyl- ester.

Eine Lösung von 68,1 g (0,275 Mol) Carboben- zyloxy-L-valin und 50,9 g (0,261 Mol) L-Tyrosin- methylester in 1 Liter Tetrahydrofuran werden versetzt mit 59,2 g 1,3-Dicyclohexyl-carbodlimid und die Lösung 16 Stunden bei 2111 belassen. Hierauf wird der ausgeschiedene Dicyclohexylharnstoff abgenutscht (46,0 g entspr. 77 % d. Th.) (Smp. 218-224 ) und das Filtrat zur Trockne verdampft.

Der Rückstand (zähes Öl) wird mit 300 cm3 heissem Petroläther zerrieben, bis Kristallisation eintritt. Die Kristalle werden abgenutscht, mit viel heissem Petroläther gewaschen. Umkristallisation aus Aceton-Petrolätber ergibt ins- gesamt 91 g (81%) Carbobenzyloxy-L-valyl-L-tyro- sin-methylester (V) Smp. 144-147 , [u]D = + 19 4 (c = 1,06 in Chloroform).

Aus der Petroläther-Lösung sowie aus der Mutterlauge obiger Kristalle werden insgesamt 17 g eines Nebenproduktes gewonnen, Smp. 128-130 (aus Petroläther). Es handelt sich dabei um 1-(Carbobenz- oxy-I, valyl)-1,3-dicyclohexyl-harnstoff. 2. L-Valyl-L-ty;-osifa-methylester (V). a) L-Valyl-I,- tyrosin-methylester-hydrobromid: 20,0 g (0,0468 Mol) Carbobenzoxy-L-valyl-L-tyrosin- methylester werden gelöst in 200 cm3 einer 1,1-n. Lösung von Bromwasserstoff in Eisessig.

Nach einer Stunde bei 21 wird das Gemisch im Vakuum bei 45 ssadtemperatur zur Trockne eingedampft und das hinterbleibende Öl mit viel Äther zerrieben, wobei es erstarrt. Der Rückstand wird mit Äther gewaschen; man erhält 17,26 g (98 %) L-Valyl-L-tyrosin-methyl- ester-hydrobromid; Smp. 206-208 . Beim Umkri- stallisieren aus Methanol-Äther werden Nadeln vom Smp. 208-209 erhalten; [ab = -I-31 4 (c = 1,08 in Methanol).

r,) L - Valyl - L - tyrosin - methylester: 5,63 g (15 rnMol) des unter a) erhaltenen Hydrobromids werden suspendiert in 80 cm3 Essigester und 2,1 em3 (15 mMol) Triäthylamin zugegeben. Die ausgefallenen Kristalle von Triäthylaminhydrobromid werden nach 10 Minuten abgenutscht (2,68 g entspr. 99 % d. Th.) und das Filtrat zur Trockne verdampft.

Der zurückbleibende L-Valyl-L-tyrosin-methylester (Harz 4,61 g) wird sofort wie angegeben weiterverarbeitet.

Der unter c) als Ausgangsmaterial verwendete L-Isoleucyl-L-histidyl-L-prolyl-L-phenylalanin-methyl- ester (VIII) kann wie folgt hergestellt werden: 3. N-Carbobenzyloxy-L-isoleucyl-L-histidin-me- thylester-hydrochlorid.

Zu einer Lösung von 44,0 g (0,26 Mol) L-Histi- din-methylester in 50 ml Acetonitril werden 55,5 g (0,27 Mol) Dicyclohexyl-carbodiimid, gelöst in 100 ml Essigester, und 71,5 g (0,27 Mol) N-Carbobenzyloxy- L-isoieucin, gelöst in 700 ml Essigester, zugefügt. Es tritt sofort leichte Erwärmung und bald darauf Abscheidung von kristallinem Dicyclohexylharnstoff ein. Es wird kurze Zeit mit Eis gekühlt,

so dass die Temperatur nicht über etwa + 30 steigt. Nach einigen Minuten entsteht aus dem Gemisch eine gallertige Masse, die über Nacht bei Raumtemperatur belassen wird.

Das Gemisch wird filtriert, der Rückstand noch zweimal mit je 50 ml Essigester zerrieben, abgesaugt und bei 90 im Vakuum getrocknet. Aus dem so erhaltenen Gemenge von Dipeptid und Dicyclohexyl- harnstoff wird ersteres mit einer Lösung von 25 ml konz. Salzsäure in 20 ml Wasser und 80 ml Methanol als Hydrochlorid herausgelöst und der Rückstand noch zweimal mit je 2 ml konz. Salzsäure in 10 ml Wasser und 20 ml Methanol nachgewaschen.

Die vereinigten Filtrate werden im Vakuum zur Trockne eingedampft und aus Methanol-Essigester kristallisiert. Man erhält 52,6 g Dipeptid-Hydrochlorid (= 44,6 % d. Th.) vom Smp. 170-172 , unter Zersetzung.

Aus den Mutterlaugen werden durch weiteres Eindampfen und Verdünnen mit Essigester noch 39,1g Hydro- chlorid (33,1% d. Th.) vom Smp. 160-165 (Zers.) gewonnen. 4. N - Carbobenzyloxy - L - isoleucyl - L - histidin- hydrazid.

2,5 g (0,0053 Mol) N-Carbobenzyloxy-L-isoleu- cyl-L-histidinmethylester-hydrochlorid-monohydrat werden in 10 ml abs. Methanol mit 1,5 ml Hydrazin- hydrat 1 Stunde am Rückfluss gekocht. Das Lösungsmittel wird im Vakuum weitgehend abgedampft und der Verdampfungsrückstand mit 100 ml Eiswasser versetzt. Die anfänglich ölige Ausfällung kristallisiert nach kurzem Stehen bei 0 . Das Carbobenzyloxy-di- peptid-hydrazid wird abfiltriert, mit viel Wasser gewaschen und im Vakuum über Phosphorpentoxyd und Schwefelsäure getrocknet.

Die Rohausbeute ist 1,82 g (83 %), einmaliges Umkristallisieren aus siedendem Wasser ergibt 1,6 g analysenreines Produkt; F. = 186 bis 187; [a] D = -51 4 (c = 1,327 in 1-n. Salzsäure) _ - 22 4 (c = 0,558 in Methanol).

Das Hydrazid ist leicht löslich in Methanol, Ätha- nol, Aceton, Essigester und 1-n. Salzsäure, schwer

löslich in heissem Wasser und unlöslich in Benzol, Äther und Petroläther.

5. N-Carbobenzyloxy-L-prolyl-L-phenylalanirz- methvlester.

Zur Lösung von 1 g (0,004 Mol) kristallinem N- Carbobenzyloxy-L-prolin in 15 ml absolutem Tetra- hydrofuran gibt man bei -10 0,61 ml (0,0044 Mol) Triäthylamin und nach 5 Minuten bei der gleichen Temperatur 0,42 ml (0,0044 Mol) Chlorameisen- säiireäthylester. Das Triäthylamin-hydrochlorid fällt sofort als weisser kristalliner Niederschlag aus.

Die gleichzeitig bereitete und vom Triäthylamin- hydrochlorid filtrierte Lösung vom L-Phenylalanin-me- thylester, aus 1,1 g (0,0051 Mol) Phenylalaninmethyl- esterhydrochlorid und 0,71 ml (0,0055 Mol) Triäthyl- amin wird ebenfalls auf -10 gekühlt und zur Lösung des gemischten Anhydrids gegeben.

Nach zweistündigem Stehen bei Zimmertemperatur filtriert man vom Niederschlag ab und verdampft das Lösungsmittel im Vakuum bei 40-45 . Den wasserklaren Rückstand nimmt man in Essigester auf, wäscht viermal mit je 5 ml 1-n. HCl-Lösung, zweimal mit Wasser, viermal mit je 2 ml 2-n. Natriumhydrogenkarbonat- lösung und zum Schluss mit Wasser neutral. Die Essib esterlösung hinterlässt nach Eindampfen und Trocknen 1,8 g gelbliches Öl, das noch wenig Lösungsmittel enthält.

Der rohe Carbobenzyloxy-L-prolyl-L-phenyl- alaninmethylester wird sofort zum L-Prolyl-L-phenyl- alanin-methylester decarbo-benzoxyliert.

6. L-Prolyl-L-phenylalanin-methylester.

2,46 g (0,006 Mol) Carbobenzyloxy-L-prolyl-L- phenylalanin-methylester werden in 40 ml Methanol gelöst, mit 6 Äquivalenten methanolischer Salzsäure und 0,6 g Palladiumkohle (10 % Pd) versetzt und bei Raumtemperatur und Normaldruck hydriert (gebildetes CO, in NaOH absorbiert). Nach Aufnahme von etwas mehr als der berechneten Menge Wasserstoff kommt die Hydrierung zum Stillstand.

Die vom Katalysator abfiltrierte Lösung wird im Vakuum eingedampft und der Rückstand in wenig Aceton aufgenommen. Bei Zugabe von Äther scheidet sich das Hy- drochlorid des L-Prolyl-L-phenylalanin-methylesters kristallin aus; Ausbeute: 1,62 g (86 0/0). Nach zweimaligem Umkristallisieren aus Aceton-Äther schmilzt die Substanz bei 157-158 ; [a]D =-410 1 (c = 4,15 in H20).

Zur Überführung in den freien Ester wird eine Lösung von 1,10 g (0,0035 Mo1) des Hydrochlorids in 1 ml Wasser mit Essigester überschichtet und bei 0 unter kräftigem Schütteln mit gesättigter Kaliumcarbonat-Lösung versetzt. Der Essigester-Auszug wird getrocknet, im Vakuum eingedampft und der Rückstand bei 0,1 mm Hg getrocknet. Der erhaltene L-Pro- lyl-L-phenylalanin-methylester (0,98 g) ist ein in Wasser und Äther leicht lösliches Öl, das direkt für weitere Umsätze geeignet ist. 7. N-Carboben-1yloxy-L-isoleucyl-L-histidyl-L- prolyl-L-phenylalanin-tnethylester.

Die Lösung von 1,49 g (0,035 Mol) n-Carboben- zyloxy-L-isoleucyl-L-histidinhydrazid in 15 ml 1-n. Salzsäure wird einmal mit wenig Essigester extrahiert, die Essigesterphase nochmals mit 3 ml 1-n. Salzsäure gewaschen und die vereinigten salzsauren Lösungen im Scheidetrichter mit Essigester überschichtet und mit Eis auf 0 abgekühlt.

Hierauf tropft man langsam 275 mg (0,004 Mol) Natriunmitrit in 5 ml Eiswasser dazu, lässt 3 Minuten reagieren und stellt die salzsaure Azidlösung mit 3 ml gesättigter Kaliumcarbonatlösung phenolphthalein-alkalisch. Die wässrige Lösung wird noch zwei weitere Male unter Eiskühlung mit viel Essigester extrahiert und die organischen Phasen mit Wasser neutral gewaschen.

Die eiskalte, über Natriumsulfat getrocknete Azid- lösung filtriert man in die frisch bereitete, auf 0 gekühlte und vom Triäthylaminhydrochlorid befreite Lösung von L-Prolyl-L-phenylalanin-methylester; hergestellt aus 1,24g (0,004 Mol) L-Prolyl-L-phenylala- nin-methylester-hydrochlorid und 0,55 ml (0,004 Mol) Triäthylamin in 15 ml abs. Essigester.

Man lässt 18 Stunden bei 0-5 und 2 Stunden bei Zimmertemperatur reagieren, dampft das Lösungsmittel bei 40 im Vakuum auf die Hälfte ein und wäscht mit 1-n. Salzsäure, eiskalter 2-n. Sodalösung und mit Wasser neutral; trocknet über Natriumsulfat und verdampft den Essigester im Vakuum.

Die Ausbeute ist 2 g (85 %) gelblich amorpher Carbobenzyloxy-tetrapeptidester. Die 36stufige Ver- teilung zwischen 80 % igem Methanol :Chloroform Tetrachlorkohlenstoff = 1 : 1 : 1 ergibt 1,6 g reinen N-Carbobenzyloxy-L-isoleucyl-L-histidyl-L-prolyl-L- phenylalaninmethylester. Die Analysenfraktion zeigt nach einmaligem Umfällen aus Methanol-Wasser F = 105-110 ;

[a] D = -56 4 (c = 0,971 in Methanol).

Der N-Carbobenzyloxy-tetrapeptidester ist in den meisten organischen Lösungsmitteln, ausser Äther und Petroläther, gut löslich.

B. L-Isoleucyl-L-histidyl-L-pi-olyl-L-phenylalanin- methylester.

a) Dihydrobromid: 1,72 g (2,61 mMol) N-Carbo- benzyloxy- L- isoleucyl - L-histidyl - L-prolyl-L-phenyl- alaninmethylester werden versetzt mit 8,3 em3 1,1-n. Bromwasserstoff in Eisessig, worauf alsbald Lösung eintritt. Nach zweistündigem Stehen bei 21 wird der Eisessig bei 0,1 mm Hg und 25 vollständig abdestil- liert und das zurückbleibende Harz mit Äther zerrieben, wobei es körnig wird.

Das rohe L-Isoleucyl-L- histidyl-L-prolyl-L-phenyl-alanin-methylester-dihydro- bromid wiegt 1,79 g, Smp. 130-l40 .

@) freier Ester: 1,96g (2,85 mMol) L-Isoleucyl- L-histidyl-L-prolyl-L-phenylalanin-methylester-dihy- drobromid wird in wenig Wasser gelöst, eine geringe Trübung durch Waschen mit etwas Essigester entfernt, die wässrige Lösung mit 50 cm3 Chloroform ver-

setzt und unter Eiskühlung gesättigte Pottaschelösung zugegeben, bis der pH der wässrigen Phase = 10 ist.

Der ausgeschiedene Ester löst sich beim Umschütteln g'.att in der Chloroformphase. Die Chloroformlösung wird einmal mit wenig gesättigter Natriumsulfatlösung \ewaschen; Pottasche- und Natriumsulfatlösung werden mit weitern 30 cm3 Chloroform nachgewaschen. Die Chloroformlösungen hinterlassen nach Trocknen mit Natriumsulfat und Eindampfen 1,31g L-Isoleu- cyl-L -histidyl-L-prolyl-L-phenylalanin-methylester (VIII) als Harz, das sofort weiterverarbeitet wird. Ausbeute 88 0/0.

Beispiel 2 a) A'-Cai-bobenzyloxy-L-asparaginyl-nitro-L-argi- ttyl-L -valyl-L-tyrosyl-L-valyl-L-histidyl-L-prolyl-L- hhenylalanin-inethyleYter.

Eine Lösung von 467 mg (1 mMol) N-Carboben- zyloxy-L-asparaginyl-nitro-L-arginin und 272 mg (0,35 mMol) I-- Valyl-L-tyrosyl-L-valyl-L-histidyl-L- prolyl-L-phenylalanin-methylester in 2,5 ml Dimethyl- formamid wird mit 237 mg (1 mMol) 1-Cyclohexyl- 3-morpholinyläthyl-carbodiimid versetzt. Nach 24stündigem Stehen bei Zimmertemperatur wird die Reaktionslösung bei 0,1 mm Hg und 35 vom Dime- thvlformamid befreit.

Der Rückstand wird mit Eiswasser verrieben und das abgeschiedene feste Material mit Wasser gewaschen und im Vakuum bei 30 getrocknet. Das Rohprodukt wird mit Aceton verrieben, darauf mit siedendem Aceton extrahiert und schliesslich mit eiskaltem Methanol gewaschen. Das so gereinigte Material (289 mg, 67 %) ist ein schwach gelbliches Pulver vom F. 207-210 .

Zur weiteren Reinigung wird die Substanz im Gegenstrom zwischen n-Butanol und 0,1 1/aiger Essigsäure über 30 Schritte verteilt (K = 4,17). Die Fraktionen 23-28 liefern 132 mg reines Produkt, und die ein Nebenprodukt enthaltenden Fraktionen 17-22 (74 mg) ergeben nach nochmaliger Verteilung weitere 34 mg reines Material; total 166 mg (39 0/0). Nach zweimaligem Umfällen aus Methanol schmilzt die Substanz bei 214-216 ; [a] D = -27 2 (c = 2,22 in Dimethylformamid). b) L-Asparaginyl-L-argiiiyl-L-valyl-L-tyrosyl-L- vcrlyl-L-histi,-lyl-L-prolyl-L- phenylalanin-niethylester.

85 mg (0,07 mMol) N-Carbobenzyloxy-L-aspara- ginyl-nitro-I: arginyl-L-valyl-L-tyrosyl-L-valyl-L-histi- dyl-L-prolyl-L-phenylalanin-methylester werden in 10 ml Methanol suspendiert, durch Zugabe von 0,3 m Äqui'valenten methanolischer Salzsäure in Lösung gebracht und in Gegenwart von 0,3 g Palladiumkohle (100g0 Pd) bei Zimmertemperatur und Normaldruck während 15 Stunden in einer Wasserstoffatmosphäre geschüttelt. Die neutrale Lösung wird vom Katalysator abfiltriert und im Vakuum eingedampft.

Das halbfeste Reaktionsprodukt wird mit Aceton gewaschen und ergibt nach Umfällen aus Methanol-Äther 51 mg (63 0/0) Tri-Hydrochlorid des Octapeptid-methylesters. c) L-_.4sparaginyl-L-arginyl-L-valyl-L-tyrosyl-L- val yl-L-liistid yl-L-prolyl-L-phenylalanin.

a) 48 mg (0,042 mMol) L-Asparaginyl-L-arginyl- L-valyl-L-tyrosyl-L-valyl-L-histidyl-L-prolyl-L-phenyl- alanin-methylester-tri-hydrochlorid werden in 0,5 ml Methanol suspendiert und innert 1 Stunde allmählich mit 0,3 ml 1-n. Natronlauge (etwa 7 Äquivalente) ver- setzt, so dass die Lösung stets ein pH zwischen 10,5 und 11,5 zeigt.

Nach weiteren 30 Minuten wird die Lösung im Vakuum bei Raumtemperatur vom Methanol befreit, mit 1-n. Essigsäure auf pH 7,4 eingestellt und lyophilisiert. Das als Rückstand erhaltene Gemisch von freiem Peptid und anorganischen Salzen (79 mg) wird durch Gegenstromverteilung im System Butanol/0,1-n. Ammoniumhydroxyd fraktioniert. Das reine Oktapeptid wird als farbloses Pulver erhalten, das in Wasser und Methanol löslich ist, schwerer in Äthanol und unlöslich in Aceton.

13) 400 mg roher Oktapeptid-methylester (enthaltend etwa 3 Mol HCl + 1 Mal NH4C1) werden in 4 ml Methanol gelöst (klare, braungelbe Lösung) und nach Zugabe von 8 ml 1-n. K"C03 in H,0 bei Raumtemperatur während 1 Stunde gerührt. Zuletzt wird die Lösung, welche ein wenig braune Flocken als Bodensatz enthält, mit 4-n. HCl auf pH = 6 neutralisiert, mit Aceton-CO, gefroren und über Nacht im Hochvakuum lyophilisiert. Man erhält dabei 930 mg eines bräunlichen Pulvers, das neben dem Peptid etwa 590 mg KCl enthält.

Die gesamte Menge wird über 30 Stufen verteilt im System n-Butanol-0,33 m NH4COOH (Ammo- niumformiat) in H,0 (pH 6,5). Phasenvolumen je I 0 ml.

Das freie Oktapeptid zeigt G = 0,17 und wird aus den vereinigten Röhrcheninhalten 0-8 isoliert durch dreimaliges Extrahieren mit je 400 ml eines Butanol-Methanol-Gemisches (3: 1) und zweimaliges Waschen der organischen Lösung mit je 30 ml 5 0/0 NH4COOH (Ammoniumformiat) in H20. Nach Eindampfen bei 45 (11 mm Hg) und Trocknen im Hochvakuum (8 Stunden bei 40 ) erhält man insgesamt 190 mg eines weissen, in Wasser leicht löslichen Pulvers, das im biologischen Test an der nierenlosen Ratte eine 20mal stärkere Wirkung als Noradrenalin zeigt.

Im Papierchroinatogramm erweist sich die Substanz als einheitlich, mit einem R,-Wert = 0,19 im System sek. Butanol-3 % NH3 (120: 44).

Als zweite Fraktion erhält man bei der Verteilung aus den Rohren 18-30 (G = 42) noch 140 mg un- verseiftes Ausgangsmaterial zurück (-Oktapeptid- methylester). R,-Wert im obigen System = 0,30.

y) 500 mg Oktapeptid-methylester [gleiches Ausgangsmaterial wie bei a)] werden in 2 ml HCl konz. gelöst und 100 Minuten bei 39 stehengelassen. Dann wird die Lösung im Hochvakuum zur Troclme eingedampft. der Rückstand fein pulverisiert und nochmals einige Stunden bei 40 im Hochvakuum getrock-

net. Man erhält so 510 mg eines hellbraunen Rohproduktes, das an der nierenlosen Ratte bereits die 20fache Wirkung von Noradrenalin aufweist.

Zur Reinigung werden 300 mg davon in 2 ml Wasser gelöst, mit 2-n. NaOH auf pH 6 neutralisiert und über 30 Stufen verteilt im System n-Butanol- Methanol-0,33 m NH4COOH - 3:1:4 (pH 6,5), mit je 10 ml Phasenvolumen. Aus den Röhrchen 5 bis 14 können durch Aufarbeitung wie unter a) 170 mg Hydrolysat als farblose, in Wasser lösliche Substanz gewonnen werden, die sich an der nierenlosen Ratte als 20- bis 25mal aktiver als Noradrenalin erweist. Im Papierchromatogramm tritt im System sek. Butanol - 3 0/a NH3 (120: 44) eine Aufspaltung in zwei Verbindungen ein, mit den Rf-Werten 0,13 und 0,19.

Der zweite Fleck zeigt die grössere Farb- intensität mit Ninhydrin.

Die Verbindung mit dem Rf-Wert 0,13 stellt das L-Asparagyl-L-arginyl-L-valyl-L-tyrosyl-L-valyl-L- histidyl-L-prolyl-L-phenylalanin dar, während es sich bei der Verbindung mit dem Rf-Wert 0,19 um das Oktapeptid mit dem Asparaginylrest handelt.

Die Röhrchen 15-19 der Craig-Verteilung enthalten 55 mg Mischfraktion, während aus Röhrchen 20-29 22 mg Ausgangsmaterial regeneriert werden können (R, = 0,30).

Ausser durch Craig-Verteilung über viele Stufen lassen sich die beiden Hydrolyseprodukte (Asparagi- nyl- und Asparagyl-Verbindungen) auch durch Chro- matographie an eine Säule aus Papierpulver mit geeigneten Lösungsmittelsystemen, z. B. BuOH-MeOH NH4COOH, vollständig voneinander trennen.

Der als Ausgangsmaterial verwendete L-Valyl-L- tyrosyl-L-valyl-L-histidyl-L-prolyl-L-phenylalanin- methylester kann wie folgt hergestellt werden: 1. N-Curbobenzyloxy-L-valyl-L-tyrosin-äthylester. Eine Lösung von 50,2 g (0,2 Mol) Carbobenzyl- oxy-L-valin und 41,8 g (0,2 Mol) L-Tyrosinäthylester in 400 ml Acetonitril wird mit 45,3 g (0,22 Mol) 1,3- Di-cyclohexyl-carbodiimid versetzt und 5 Stunden bei Zimmertemperatur stehengelassen.

Das ausgeschiedene Gemisch von Di-cyclohexyl-harnstoff und dem Reaktionsprodukt wird abfiltriert und das Dipeptid- derivat aus diesem Gemisch mit Essigester extrahiert. Die ursprüngliche Reaktionslösung wird im Vakuum eingedampft, der Rückstand in Essigester gelöst, diese Lösung mit 2-n. Salzsäure, 2-n. Natrium-hydrogencar- bonat-Lösung und Wasser gewaschen, getrocknet und mit der obigen Essigesterlösung des ursprünglich ausgeschiedenen Reaktionsprodukts vereinigt.

Der beim Eindampfen im Vakuum erhaltene Rückstand kristal- lisiert bei Zugabe von Äther und liefert 74,5 g (84%) Carbobenzyloxy-L-valyl-L-tyrosin-äthylester vom F. 142-145 . Durch Umkristallisieren aus Aceton-Äther werden 68,6 g reines Material vom F. 148-149 erhalten; [a]24 - -f- 33 1 (c = 3,96 in Chloroform).

2. N-Carbobenzyloxy-L-valyl-L-tyr-osin.

70,7 g (0,16 Mol) Carbobenzyloxy-L-valyl-L-tyro- sin-äthylester werden in 300 ml Methanol gelöst und unter Rühren innert 15 Minuten bei etwa 10 mit 400 ml 1-n. Natronlauge versetzt. Die klare Reaktionslösung wird 2 Stunden bei Raumtemperatur ste- hengelassen, dann im Vakuum von Methanol befreit und wenig festes Material abfiltriert. Beim Ansäuern des Filtrats mit verdünnter Salzsäure scheidet sich das Carbobenzyloxy-L-valyl-L-tyrosin in kristalliner Form aus und wird abfiltriert, mit Wasser gewaschen und im Vakuum bei 50 getrocknet;

F. = 161-163 . [a] D = + 26 1 (c = 4,01 in Pyridin). Die Ausbeute beträgt 64.01 Q (97 0/0). 3. N-CarbobenZylo.xy-L-valyl-L-histidin-tnetlayl- ester. Eine Lösung von 25,1 g (0,1 Mol) Carbobenzyl- bxy-L-valin und 16,7 g (0,1 Mol) L-Histidin-methyl- ester in 100 ml Acetonitril wird bei etwa 10 mit 26,1 g 1-Cyclohexyl-3-morpholinyläthyl-carbodiimid (0,11 Mol) versetzt und bei Zimmertemperatur stehengelassen.

Nach etwa 1 Stunde beginnt die Abschei- dung eines gelatineartigen Produkts, das nach 15 Stunden abfiltriert und mit Acetonitril gewaschen wird: 30,8 g (77 0/a); F. = 152-156 . Der aus Ace- ton-Äther umkristallisierte Carbobenzyioxy-L-valyl- L-histidin-methylester schmilzt bei 161-163 ; [a]21 = -22 2o (c = 2,04 in Äthanol).

4. L-Valyl-L-histidinmethylester.

10 g (0,025 Mol) Carbobenzyloxy-L-valyl-L-histi- dinmethyleste.r werden in 100 ml Methanol gelöst, mit einer Lösung von 0,03 Mol Salzsäure-Gas in Methanol versetzt und in Gegenwart von 2 g Palladium- kohle (10 % Pd) bei Zimmertemperatur und Normal- druck hydriert (gebildetes CO.= gleichzeitig in Natronlauge absorbiert). Nach Aufnahme der berechneten Menge Wasserstoff kommt die Hydrierung nach 1 Stunde zum Stillstand.

Der Katalysator wird abfil- triert und die Reaktionslösung im Vakuum eingedampft. Das als Öl (8,7 g) erhaltene Hydrochlorid der Base wird in wenig Wasser gelöst und nach Überschichten der Lösung mit Essigester unter Umschüt- teln bei 0 mit gesättigter Pottasche-Lösung stark alkalisch gestellt. Die das Reaktionsprodukt enthaltende Essigesterphase wird getrocknet und im Vakuum eingedampft, und der als öliger Rückstand erhaltene L-Valyl-L-histidinmethylester (6,5 g) wird direkt weiter umgesetzt. 5. N-Carbobertzyloxy-L-valyl-L-tyrosyl-L-valyl-L- histidin-nzethylester.

Eine Lösung von 9,94 g (0,024 Mol) Carboben- zyloxy-L-valyl-L-tyrosin in 100 ml Acetonitril wird mit 6,64 g (0,28 Mol) 1-Cyclohexyl-3-morpholinyl- äthyl-carbodiimid und darauf mit 6,5 g (0,024 Mol)

L-Valyl-hhistidin-methylester versetzt. Nach 15 Stunden wird das ausgeschiedene Reaktionsprodukt abfiltriert und mit Acetonitril gewaschen.

Das Rohpro- dukt (11,2 g = 70 %) vom F. 208-211 wird in 500 ml heissem Methanol gelöst, die Lösung auf 100 ml eingeengt und mit dem gleichen Volumen Äther versetzt. Der ausgeschiedene reine Carbobenzyl- oxy- L-valyl -L-tyrosyl - L-valyl-L-histidin-methylester schmilzt bei 222-224 .

Nach Gegenstromverteilung im Svstem Methanol-Wasser 4: 1/Chloroform-Tetra- chlorkohlenstoff 1 : 1 zeigt die Substanz den F. 224 bis 226e und [ri]D -# -31" -_@- 2 (c -= 2,09 in Eisessig).

6. N-Carbobenzyloxy-L-valyl-L-tyrosyl-L-valyl-L- hi.StIChil. Eine Suspension von 3,32 g (0,005 M01) Carbo- benzyloxy-L-valyl-L-tyrosyl-L-valyl-L-histidin-methyl- ester in 30 ml Methanol wird bei etwa 10' mit 15 ml 1-n. Natronlauge versetzt, worauf das Ausgangsmaterial rasch in Lösung geht. Die Reaktionslösung wird 2 Stunden bei Raumtemperatur stehengelassen, darauf im Vakuum vom Methanol befreit und - nach Abtrennung einiger Flocken durch Filtration - mit 20 ml 2-n. Essigsäure angesäuert.

Das ausgeschiedene ga:ertige Material wird abzentrifugiert, mehrmals in Wasser suspendiert und wiederum abzentrifugiert und schliesslich mit Aceton und Methanol gewaschen und im Vakuum bei 40 getrocknet. Das Carbobenzyl- oxy-L-valyl-L-tyrosyl-L-valyl-L-histidin wird in einer Ausbeute von 2,74 g (84 0/a) erhalten und schmilzt nach Waschen mit siedendem Methanol bei 236 bis 238 ; [rX]D =---10 2 (c - 2,10 in Eisessig).

Die Substanz. ist unlöslich in allen gebräuchlichen organischen Lösungsmitteln ausser in Dimethylformamid und Eisessig. 7. N-Carbobenzyloxy-L-valyl-L-tyrosyl-L-valyl-L- histidyl-L-prolyl-L-phenylalanih-methylester.

1,95 g (0,003 Mol) Carbobenzyloxy-L-valyl-I,- tyrosyl-L-valyl-L-histidin werden in 10 ml Dimethyl- formamid suspendiert und mit 0,83 g (0,003 Mol) I_ - Prolyl - L -- phenylalanin - methylester und 0,84 g (0,0035 Mol) 1 - Cyclohexyl - 3 - morpholinyl - äthyl- carbodiimid versetzt. Nach 1 Stunde ist das Ausgangsmaterial vollständig gelöst.

Die Reaktionslösung wird über Nacht bei Zimmertemperatur stehengelassen, dann bei 0,1 mm Hu vom Dimethylformamid befreit und der Rückstand mit Eiswasser versetzt. Das ausgeschiedene feste Material wird zweimal mit 2-n. Salzsäure gewaschen (wobei das Reaktionsprodukt ein Hydrochlorid bildet, das in Wasser löslich ist, jedoch nicht in 2-n. Salzsäure), durch Behandlung mit 0,5-n. Kaliumearbonat-Lösung wieder in die basische Form übergeführt, mehrmals mit Wasser gewaschen und im Vakuum bei 35 getrocknet. Das erhaltene Rohprodukt (2,40 g) wird in 100 ml Aceton aufgenommen, von unlöslichem Material (0,30 g) abfiltriert und im Vakuum eingedampft.

Der Rückstand ergibt nach Verreiben mit Essigester 1,57 g (58 0/a) festes Mate- rial-vom F. 151-156 . .

1 g dieser Substanz wird zur weiteren Reinigung durch Gegenstromverteilung im System Methanol- Wasser 4:1/Chloroform-Tetrachlorkohlenstoff 1:1 über 48 Schritte verteilt. Die Hauptmenge des Materials (0,84 g) befindet sich in Fraktionen 15-28 mit einem Gewichtsmaximum in Fraktion 21 (K = 0,78). Diese Fraktionen ergeben nach Umfällen aus Aceton 0,66 g amorphes Material vom F. 158-162 . Nach nochmaligem Umfällen aus viel Aceton zeigt die Substanz F. 161-163 und [a]D = -56 2 (c 1,38 in Äthanol).

B. L-Valyl-L-tyrosyl-L-valyl-L-histidyl-L-prolyl- L-phenylalanin-methylester.

635 mg (0,7 mMol) Carbobenzyloxy-L-valyl-L- tyrosyl-L-valyl-L-histidyl-L-prolyl-L-phenylalanin- methylester werden mit 1 ml Eisessig verrieben, bis eine einheitliche Lösung entsteht, und mit 1,9 ml 1,6-n. Bromwasserstoff (3 mMol) in Eisessig versetzt. Beim Stehen bei Zimmertemperatur beginnt sich das Reaktionsprodukt nach 10 Minuten als Öl auszuscheiden. Das Gemisch wird während 2,5 Stunden geschüttelt und darauf bei 0,1 mm Hg und 30 vollständig eingedampft. Der Rückstand ergibt nach Waschen mit Äther und Aceton 648 mg Di-Hydrobromid des Hex_a- peptid-methylesters als fast farbloses Pulver.

Zur überführung in den freien Ester wird eine Lösung von 562 mg (0,6 mMol) dieser Substanz in 2 ml Wasser bei 0 mit gesättigter Kaliumcarbonat- Lösung stark alkalisch gestellt und viermal mit je 20 rnl kaltem Chloroform extrahiert. Die Chloroform- Auszüge werden mit wenig Wasser gewaschen, getrocknet und im Vakuum eingedampft. Der ölige Rückstand liefert beim Verreiben mit Äther 272 mg (59 %) des Peptidesters als schwach gelbes Pulver, das direkt weiter umgesetzt wird.

Beispiel 3 a) N-f'arbobenZyloxy-L-asparaginyl-nitro-L-argi- izyl-L-valyl - L- tyro syl - L-leucyl-L-histidyl-L-prolyl-L- pl7eti.ylalaniya-methvlester.

760 mg (0,96 mMol) L-Valyl-L-tyrosyl-L-leucyl- L-histidyl-L-prolyl-L-phenylalanin-methylester und 1,35 g (2,88 mMol) N-Carbobenzyloxy-L-asparaginyl- nitro-L-arginin in 10 ml Dimethylfprmamid versetzt man mit 690 mg (2,9 mMol) 1-Cyclohexyl-3-(mor- pholinyläthyl)-carbodiimid und lässt 2 Tage bei Zimmertemperatur reagieren. Hierauf wird das Dimethyl- formamid im Hochvakuum entfernt und das zurückbleibende Öl fünfmal mit je 5 ml Wasser unter Eiskühlung verrieben, wobei es teilweise flockig wird.

Das Rohprodukt, 2,4 g, wird zur weiteren Reinigung wiederholt mit viel eiskaltem Aceton und Methanol gewaschen und ergibt 250 mg Carbobenzyl'oxy- oktapeptidester. Aus den Aceton- und Methanol-Aus- zügen werden noch weitere 180 mg Carbobenzyloxy- oktapeptidester gewonnen.

Der rohe Carbobenzyloxy-L-asparaginyl-nitro-L- ar,inyl-L-valyl-L-tyrosyl-L-leucyl-L-histidyl-L-prolyl- l= phenylalanin-methylester (430 mg) zeigt F. = 175 bis 190" und wird direkt für die Weiterverarbeitung benützt.

b) L-Asparaginyl-L-ar,-ihyl-L-valyl-L-tyrosyl-L- leiicyl-L-histidyl-L-proly l-L-phenylalanin-methylester. 410 mg (0,33 mMol) Carbobenzyloxy-asparaginyl- nitro-L-arginyl-L-valyl-L-tyrosyl-L-leucyl-L-histidyl- L-prolyl-L-phenylalanin-methylester werden in 10 ml Methanol suspendiert und durch Zugabe von 1 ml 1,39-n. (4-Äquivalente) Salzsäure in Methanol, in Lösung gebracht. Man filtriert die flockigen Verunreinigungen ab und hydriert die Lösung in Gegenwart von 250 mg Pd-Kohle (10 % Pd) unter Normalbedingungen.

(Das gebildete CO z wird in einem 2-Hyd'rier- gefäss mit verdünnter Natronlauge absorbiert.) Nach Stunden und Aufnahme von etwas mehr als der berechneten Menge Wasserstoff ist die Hydrierung beendet. Der Katalysator wird abfiltriert und die Lösung im Vakuum bei 40' zur Trockne eingedampft. Man erhält 360 mg Harz (406 mg berechnet für Tri- hydrochlorid und die äquimolare Menge Ammon- chlorid).

Das Produkt wird ohne weitere Reinigung weiterverarbeitet. Es ist in Wasser und Methanol gut löslich. c) L-Asparaginyl-L-arginyl-L-valyl-L-tyrosyl-L- leiieyl-L-histidyl-L-prolyl-L-phenylalanin.

360 mg rohes L-Asparaginyl-L-arginyl-L-valyl-L- tyrosyl - L-leucyl - L-histidyl - L-prolyl-L-phenylalanin- ester-trihydrochlorid werden in 10 ml 66 "/aigem Methanol gelöst und in Portionen mit 1/10-n. Natronlauge versetzt, so dass der pH-Wert der Lösung während 20 Minuten bei l0,5-11 bleibt (Totalverbrauch an 1,1,0-n- NaOH = 18,5 ml). Hierauf bringt man die Lösung mit festem CO, auf pH 7-8 und filtriert von den ausgeschiedenen Verunreinigungen ab (10 bis 20 mg), dampft das Methanol im Vakuum bei 351' weitgehend ab und stellt die Lösung mit 2-n.

Sodalösung auf pH 9.

Die wässrige Lösung wird viermal mit je 100 ml wassergesättigtem n-Butanol ausgezogen, die Butanol- auszü-e einmal mit 10 ml Natriumsulfatlösung gewaschen und über Natriumsulfat getrocknet. Der Ver- dampfungsrückstand wird dreimal mit je 3 ml trok- kenem Butanol gewaschen, wodurch sich 50 mg leicht lösliche Anteile entfernen lassen.

Man erhält 190 mg L-Asparaginyl-L-arginyl-L- valyl -L-tyrosyl-L-leucyl-L-histidyl-L-prolyl-L-phenyl- alanin als feines, leicht grau gefärbtes Pulver, das in Wasser und Methanol gut löslich ist.

Eine Probe des Rohproduktes zeigt an der Ratte eine gleich starke Wirkung wie Noradrenalin.

Die Carbonamidgruppe des Asparaginylrestes kann wie folgt abgespalten werden: 2,08 g (l,75 mMol) einmal aus Methanol/Aceton umgefälltes L-Asparaginyl-L-arginyl-L-valyl-L-tyrosyl-L-leucyl-L-histidyl-L-prolyl-L-phenylalanin-me- thylester-trihydrochlorid erwärmt man in konz. HCl während 85 Minuten auf 37'. Nach etwa 10-l5 Minuten tritt klare Lösung ein. Die Salzsäure wird rasch unter vermindertem Druck bei 25 abgedampft und der Rückstand über Kaliumhydroxyd und Phosphor- pentoxyd im Hochrakuum getrocknet.

Die Ausbeute ist 2 g amorphes L-Asparagyl-L- ar,inyl-L-valyl-L-tyrosyl-L-leucyl-L-histidyl-L-prolyl- L-phenylalanin-trihydrochlorid, das noch mit Ammo- niumchlorid verunreinigt ist.

1,26 g des Rohproduktes werden in 20 ml Ätha- nol gelöst und das Peptid mit 120 ml Aceton wieder ausgefällt. Zwei weitere Umfällungen ergeben 1,08 g weisses, körniges Oktapeptid-trihydrochlorid. Im Tierversuch zeigt das umgefällte Produkt die gleiche Aktivität wie Noradrenalin (Test nach Peart) und die doppelte Wirkung an der nierenlosen Ratte.

Eine Probe (200 mg) des umgefällten L-Aspara- gyl-L-arginyl-L-valyl-L-tyrosyl-L-leucyl-L-histidyl-L- prolyl - L - phenylalanin - trihyd,rochlorids wird nach Craig über 30 Stufen zwischen n-Butanol und 0,3 cm-3 Ammoniumacetat 1 : 1 (pH = 6,5-7) verteilt. G = 0,67. Die Lösungen dampft man im Vakuum bei 40 ein und sublimiert das Ammoniumacetat im Hochvakuum bei 40 während 30 Minuten ab.

Die Fraktionen 7-16 (Maximum Fraktion 12) zeihen im Peart-Test die gleiche Aktivität wie das un- verteilte Produkt.

Die Ammoniak- und Gesamtstickstoffbestimmun- gen zeigen, dass das Asparagin bei der sauren Ver- seifung zur Hauptsache zur Asparaginsäure verseift wurde. Qualitative Halogenproben zeigen, dass das Oktapeptid als Mono- oder Dihydrochlorid vorliegt.

Der als Ausgangsmaterial verwendete L-Valyl-L- tyrosyl-L-leucyl-L -histidyl-L-prolyl-L-phenylalanin- methylester kann wie folgt hergestellt werden: 1. N-Carboben@yloxy-L-leucyl-L-histidin-methyl- ester.

Zu einer Lösung von 16,9 g (0,1 Mol) L-Histidin- methylester und 21,6 g (0,105 Mol) Dicyclohexyl- carbodiimid in 100 ml abs. Essigester und 20 ml Aceto- nitril werden 26,5 g (0,1. Mol) N-Carbobenzyloxy-L- leucin, gelöst in 200 ml abs. Essigester, auf einmal zugegeben und das bald zu. einer Gallerte erstarrende Gemisch während 30 Minuten bei Raumtemperatur geschüttelt.

Nach Stehenlassen über Nacht wird aus der krümeligen Masse das Lösungsmittel so gut wie möglich abgesaugt (unter mehrmaligem Zerreiben des Filterrückstandes mit ein wenig frischem Essigester) und im Vakuum bei 90 getrocknet. Man erhält 47,8 g eines Gemisches von Dicyclohexylharnstoff und Di- peptid, aus welchem letzteres mit 3 Portionen von je 50 ml kaltem Methanol herausgelöst wird. Die vereinigten Extrakte enthalten noch geringe Mengen von Dicyclohexyl-harnstoff und werden durch Lösen in Methanol und erneutes Ausfällen mit Essigester-Pe- troläther gereinigt.

Man erhält 29,3g N-Carbobenzyl- oxy-L-leucyl-L-histidin-methylester (70,5 % d. Th.) vom Smp. 131-132 .

Aus dem Filtrat des Reaktionsgemisches werden durch Extraktion mit 2-n. Salzsäure noch 4,0 g Di- peptid (9,5 0/0 d. Th.) vom Smp. etwa 120-125 gewonnen, das durch Umfällen aus Methanol-Essigester- Petroläther weiter gereinigt werden kann.

2. N-Carbobenzyloxy-L-leucyl-L-histidin-hydrazid. 10 g (0,024 Mol) N-Carbobenzyloxy-L-leucyl-L- histidin-methylester, in 40 ml abs. Äthanol gelöst, versetzt man mit 3 ml Hydrazinhydrat und lässt währen 2 Tagen bei Zimmertemperatur reagieren. Das Lösungsmittel wird bei 40 im Vakuum abgedampft und der Rückstand mit 100 ml Wasser verrieben. Nach dreistündigem Stehen bei 0 filtriert man vom kristallinen Niederschlag ab, wäscht portionenweise mit 20 ml Wasser nach und trocknet das rohe Hy- drazid über Schwefelsäure und P,0..

Die Kristallisation aus 100 ml siedendem Wasser gibt 6,8 g (68 %) reines Carbobenzyloxy-L-leucyl-L- histidin-hydrazid, F. = 168-169 , [a122 = -27 4 (c = 0,808 in Methanol) und [a]D = -52 4 (c = 0,733 in 1-n. HCl).

Das Hydrazid ist in kaltem Äthanol und Methanol sowie in kalter 1-n. Salzsäure gut löslich, dagegen nur in warmem Aceton; in Essigester ist es unlöslich.

3. N-Carbobezzwyloxy-L-leucyl-L-histidyl-L-prolyl- L-phenylalanin-rzzethylester.

Die Lösung von 6,6g (0,0158 Mol) N-Carboben- zyloxy-L-leucyl-L-histidin-hydrazid in 50 ml 1-n. Salzsäure wird einmal mit wenig Essigester extrahiert, die Essigesterlösung nochmals mit 5 ml 1-n. Salzsäure gewaschen und die vereinigten Salzsäurelösungen mit frischem Essigester überschichtet und auf 0 gekühlt.

Hierauf versetzt man langsam mit einer auf 0 gekühlten Lösung von 1,14 g (0,0165 Mol) Natriumnitrit in 5 ml Wasser, belässt 5 Minuten und stellt die salzsaure Azidlösung mit 9 ml gesättigter Natrium- carbonatlösung phenolphthalein-alkalisch. Die wäss- rige Phase wird noch zwei weitere Male unter Eiskühlung mit viel Essigester extrahiert, dann die Essigesterlösungen mit Wasser neutral gewaschen und über Natriumsulfat getrocknet.

Aus 5 g (0,016 Mol) L-Prolyl-L-phenylalanin-me- thylester-hydrochlorid, in 50 ml trockenem Essigester suspendiert, wird durch Zugabe von 2,25 ml (0,0162 Mol) Triäthylamin die Lösung des freien l.-Prolyl-I: phenylalaninmethylesters gewonnen. Diese Lösung kühlt man auf 0 ab und versetzt sie mit der nach obiger Vorschrift bereiteten Azidlösung.

Nach 18stündigem Stehen bei 0-5 und 2 Stunden bei Zimmertemperatur dampft man im Vakuum bei 40 1!-, des Lösungsmittels ab, wäscht mit 1-n. Salzsäure, eiskalter 2-n. Sodalösung und mit Wasser neutral. Die Salzsäure-, Soda- und Wasserauszüge werden in zwei weiteren Scheidetrichtern nochmals mit viel Essigester gewaschen.

Nach dem Verdampfen des Essigesters erhält man 9,17 g (87 0/0) N-Carbobenzyloxy-L-leucyl-L- histidyl-L-prolyl-L-phenylalanin-methylester als amorphes Pulver.

Die multiplikative Verteilung nach Craig über 36 Stufen von 1,32 g Carbobenzyloxytetrapeptidester zwi- schen 80 % igem Methanol und Chloroform: Tetra- chlorkohlenstoff 1 : 1 ergibt 1,2 g reines Produkt. Die Analysenfraktion zeigt nach einmaligem Umkristallisieren aus Methanol-Wasser F. = 110-115 [a] D _ -57 - 4 (c = 1,031 in Methanol).

Der N-Carbobenzyloxy-L-leucyl-L-histidyl-L-pro- lyl-L-phenylalanin-methylester ist in Alkohol, Methanol, Aceton, Essigester und ganz verdünnter Salzsäure gut löslich; in Petroläther und Äther dagegen unlöslich.

4. L-Leucyl-L-histidyl-L-prolyl-L-phenylalanin- methylester.

3,4 g (0,005 Mol) Carbobenzyloxy-L-leucyl-L- histidyl-L-prolyl-L-phenylalanin-methylester in 30m1 abs. Methanol werden unter Zugabe von 2 Äquivalenten methanolischer Salzsäure in Gegenwart von 600 mg Palladiumkohle (10 0/a0 Pd) bei Zimmertemperatur bis zum Stillstand hydriert. Nach etwa 13/4 Stunden ist ein wenig mehr als die berechnete Menge aufgenommen. Der Katalysator wird abfiltriert und die Lösung bei 40 im Vakuum eingedampft.

Der Rückstand wird in 5 ml eiskaltem Wasser gelöst, mit 50 ml gekühltem Chloroform überschichtet und mit gesättigter Kaliumcarbonatlösung phenolphthalein- alkalisch gestellt. Die wässrige Lösung wird noch zwei weitere Male mit je 20 ml Chloroform extrahiert, die organischen Phasen mit konz. Natriumsulfatlösung gewaschen und über Natriumsulfat getrocknet. Nach Verdampfen des Lösungsmittels bleiben 2,68 g amorpher Tetrapeptidester zurück, die direkt für die weitere Umsetzung verwendet werden.

5. N-Carbobenzyloxy-L-valyl-L-tyroYyl-L-leucyl- L-hi.stidyl-L-prol yl-L-phenylalanin-methylester.

Die Lösung von 2,1 g (0,005 Mol) N-Carboben- zyloxy-L-valyl-L-tyrosin in 10 ml trockenem Aceto- nitril versetzt man mit 1,16 g (50/0 Überschuss) Di- cyclohexylcarbodiimid und der Lösung von 2,68 g (0,005 Mol) L-Leucyl-L-histidyl-L-prolyl-L-phenyl- alanin-methylester in 10 ml Acetonitril. Dabei scheidet sich der Dicyclohexylharnstoff momentan aus. Nach etwa 5 Stunden beginnt die Abscheidung des N - Carbobenzyloxy - hexapeptidesters als gallertige Masse.

Man lässt 20 Stunden bei Zimmertemperatur stehen und dampft anschliessend das Acetonitril bei 40 unter vermindertem Druck ab. Den Verdamp- fungsrückstand digeriert man mit 10 ml eiskaltem Methanol und wäscht fünf weitere Male mit je 1 ml gekühltem Methanol nach. Das Methanol wird im Vakuum abgedampft und der Rückstand in Chloroform dreimal mit 2-n. Salzsäure (fünf- und zweimal 2 ml), fünfmal mit je 2 ml eiskalter Natriumbicarbo- natlösung und mit Wasser neutral gewaschen.

Die über Natriumsulfat getrocknete Lösung wird auf die Hälfte eingeengt und einmal: kurz mit Aktivkohle aufgekocht.

Vollständiges Abdampfen des Lösungsmittels gibt 4,2 g rohen N-Carbobenzyloxy-hexapeptidester, der noch mit wenig Dicyclohexylharnstoff verunreinigt ist. Der rohe Carbobenzoxyester wird in wenig kaltem Aceton gelöst, vom restlichen Dicyclo'hexylharn- stoff abfiltriert und mit viel Äther wieder ausgefällt.

Man erhält 3,7 g (79 0!0) N-Carbobenzyloxy-L- valyl-L-tyrosyl-L-leucyl-L-histidyl-L-prolyl-L-phenyl- alanin-methylester.

Das Analysenpräparat zeigt nach zwei weiteren Reinigungen aus Aceton/Äther F. = 142-147/149" [a] D ---- -600 i- 40 (c = 1,291 in Methanol). 6. L-Valyl-L-tyrosyl-L-leucyl-L-Izistidyl-L-prolyl- I -phenylalanin-methylester.

Zu 970 mg (- 0,001 Mol) N-Carbobenzyloxy-L- valyl-L-tyrosyl-L-leucyl-L-histidyl-L- prolyl-L-phenyl- alanin-methylester gibt man 6 ml einer ungef. 2-n. Lösung von Bromwasserstoff in Eisessig. Dabei ballt sich die Substanz zu einer klebrigen Masse zusammen. Nach einstündigem Rühren mit einem Magnet- rührer tritt klare Lösung ein; man lässt noch eine weitere Stunde bei Zimmertemperatur reagieren, dampft anschliessend den Eisessig im Vakuum bei 400 ab und verreibt den Rückstand zweimal mit abs. Äther.

Das körnige Dihydrobromid des L-Valyl-L-tyrosyl-L-leu- cyl-L-histidyl-L-prolyl-L-phenylalanin-methylesters löst man in 10 ml Wasser, zieht die wässrige Lösung einmal mit wenig Essigester aus, wäscht die Essigesterphase noch einmal mit 2 ml Wasser und befreit die vereinigten Wasserlösungen im Vakuum von gelöstem Essigester. Mit 2-n. Na-bicarbonatlösung stellt man die gekühlte Lösung auf pH 8, filtriert vom abgeschiedenen Hexapeptidester ab und wäscht mit Eiswasser neutral.

Das getrocknete Produkt (730 mg =: 89 0l0) zeigt F. = 130-1400 und lässt sich aus Chloro- form/Äther reinigen. [a]D = -530 40 (c = 0,636 in Methanol).

Beispiel 4 a) N-Carbobenzyloxy-L-asparaginyl-(Ne-carbo- benzyloxy)-L-lysyl-L-valyl-L-tyrosyl-L-leucyl-L-histi- dyl-L-prolyl-L-phenylalanin-methylester.

330 mg (0,42 mMol) L-Valyl-L-tyrosyl-L-leucyl- L-histidyl-L-prolyl-L-phenylalanin-methylester (vgl. Beispiel 3) und 445 mg (0,84 mMol) N-Carbobenzyl- oxy-L-asparaginyl-(NE-carbobenzyloxy)-L-lysin werden in 3 cm3 Dimethylformamid gelöst, 200 mg (0,84 mlvlol) 1-Cyclohexyl-3-morph@olinyläthyl-carbo- diimid zugegeben und das Reaktionsgemisch 21 Stunden bei 220 belassen.

Dann wird im Hochvakuum bei 450 zur Trockne verdampft und das hinterbleibende Öl mit kleinen Portionen Wasser, sehr verdünnter Ammoniaklösung und Wasser gewaschen, wobei es allmählich erstarrt. Das Pulver wird abgenutscht, getrocknet (520 mg) und weiterhin mit Aceton und schliesslich mit Methanol gewaschen, wobei sich N- Carbobenzyloxy- L-asparaginyl - (N±-carbobenzyloxy)- L-lysyl-L-valyl-L-tyrosyl-L-leucyl-L-histidyl-L-prolyl- L-phenylalanin-methylester in Form eines grauen, me- thanolunlöslichen Pulvers gewinnen lässt. Smp. etwa 190-205 .

Das Pulver wird in Dimethylformamid gelöst und mit Äther gefällt, wobei 130 mg Flocken vom Smp. 210-215 erhalten werden. Ausbeute 24(1/o d. Th. Das geschützte Oktapeptid ist in den meisten gebräuchlichen Lösungsmitteln schwer löslich, in Dimethylformamid aber leicht löslich.

b) L-Asparaginyl-L-lysyl-L-valyl-L-tyrosyl-L-leu- cyl -L - histidyl -L- prolyl -L-phenylalanin-methylester- trihydrobromid.

53 mg (41 icMol) N-Carbobenzyloxy-L-aspara- ginyl-(N=-carbobenzyloxy)-L-lysyl-L-valyl-tyrosyl- L - leucyl - L - histidyl - L- prolyl-L-phenylalaninmethyl- ester vom Smp. 210-215 werden versetzt mit 0,3 em3 2,5-n. HBr in Eisessig und das Gemisch unter Feuchtigkeitsausschluss 11/2 Stunden bei 21 gehalten, wobei das Material langsam in Lösung geht.

Zum Schluss wird das HBr-Eisessig-Gemisch am Hochvakuum bei 250 Badtemperatur vollständig entfernt und das hinterbleibende Harz mit Aceton gewaschen, wobei es zu einem körnigen Pulver erstarrt. Das äusserst hygroskopische Produkt wird genutscht, mit wenig Aceton gewaschen. Nach dem Trocknen werden 50 mg rohes L-Asparaginyl-L-lysyl-L-valyl-L- tyrosyl - L - leucyl - L-histidyl-L-prolyl-L-phenylalanin- methylester-trihydrobromid vom Smp. etwa 180 bis 2200 (Zersetzung) erhalten. Das Rohprodukt wird ohne weitere Reinigung weiterverarbeitet.

Beim Prüfen auf blutdrucksteigernde Wirkung an Ratten zeigt das Produkt an der nierenlosen Ratte ein,: sofortige, deutlich hypertensinähnliche Steigerung des Blutdruckes. Die Stärke der Wirkung ist, verglichen mit Noradrenalin, etwa 1/10-1/15.

c) L-Asparaginyl-L-lysyl-L-valyl-L-tyt-osyl-L-leu- cyl-I -histidyl-L-prolyl-L-phenylalanirt.

34 mg (27 ;.,Mol) L-Asparaginyl-L-lysyl-L-valyl-L- tyrosyl - L - leu cyl - L-histidyl-L-proiyl-L-phenylalanin- methylester-trihydrobromid vom Smp. 180-2200 werden gelöst in 1 cm3 Methanol und tropfenweise 0,1-n. NaOH zugegeben, bis der pH-Wert der Lösung während 15 Minuten bei 10-10,5 bleibt. Insgesamt werden 1,81 cm3 0,1-n. NaOH zugegeben (6,7 Äquivalente).

Hierauf wird durch Einblasen von CO, auf pH = 8 gebracht, das Methanol im Vakuum entfernt, das pH der wässrigen Lösung durch Zugabe von wenig Sodalösung auf 8,5-9,0 gebracht und die wässrige Lösung mit 3 Portionen wassergesättigtem n-Butanol (30, 20, 20 cm3) extrahiert. Die Butanol-Auszüge werden einmal mit 3 cm31/2gesättigten Na,S04 Lösung gewaschen, mit Na,S04 getrocknet und geben beim Eindampfen 18 mg rohes L-Asparaginyl-L-lysyl-L- valyl-L-tyrosyl-L-leucyl-L-histidyl-L-prolyl-L-phenyl- alanin als farblosen, feinkörnigen Beschlag.

Das Rohprodukt wird in dreimal 3 cm3 Wasser aufgenommen, wobei sich 4 mg wasserschwerlösliche Verunreinigunaen abtrennen lassen. Die wässrigen Lösungen vereinigt und eingedampft geben 14 mg Rückstand. Dieser wird mit dreimal 1 cm3 trockenem n-Butanol gewa-

sehen, wobei sich noch 1 mg n-Butanol leichter lösliche Anteile entfernen lassen.

Das als Ausgangsmaterial verwendete N-Carbo- benzyloxy-L-asparaginyl- (N--carbobenzyloxy)-L-lysin kann wie folgt hergestellt werden: 1. N-CarbobenZyloxy-L-asparaginyl-(Nf-carboben- zyI o xy )-L -lysin-methylester.

Zu einer auf 0 gekühlten Lösung von 12,0 g (0,041 Mol) N,-Carbobenzyloxy-L-lysin-methylester und 8,6 cm3 (0,061 Mol) Triäthylamin in 60 cm3 absolutem Toluol wird innert 15 Minuten unter Feuch- tigkeitsausschluss die ebenfalls auf 01 gekühlte Lösung von 7,4 g 90 0!o Diäthylchlorphosphit (0,048 Mol) in 20 cm, absolutem Toluol eingetropft.

Das Reaktionsgemisch wird sodann 2 Stunden bei Zimmertemperatur gehalten; hierauf wird vom ausgeschiedenen Tri- @:thylamin-hydrochlorid abgenutscht, mit wenig absolutem To:uol nachgewaschen und das Toluolfiltrat im Vakuum zur Trockne verdampft, wobei das Diäthyl- phosphitamid des N--Carbobenzyloxy-L-lysin-methyl- esters als zähes Harz erhalten wird (Gewicht 17,0 g).

Es wird in 60 cm3 Diäthylphosphit gelöst, 10,9 g trok- kenes. feingepulvertes N-Carbobenzyloxy-L-asparagin (0,041 Möl) zugegeben und das Gemisch 1 Stunde auf 80" erwärmt, wobei das N-Carbobenzyloxy-L- asparagin nach wenigen Minuten in Lösung geht. Nach 1 Stunde wird das Diäthylphosphit unter vermindertem Druck vollständig abdestilliert, das zurückbleibende Harz in viel Essigester aufgenommen und die Essigesterlösung mit verdünnter Salzsäure, Wasser, verdünnter Sodalösung und Wasser gewaschen.

Die Essigesterphase hinterlässt nach Trocknen mit Na,SO4 und Eindampfen 13,0 g rohen N-Carbo-ben- zyloxy - L- asparaginyl - (N@ - carbobenzyloxy) - L-lysin- methylester als gallertige Masse. Nach zweimaligem Umfällen aus Methanol-Äther werden 8,5 g des Produktes als flockiger Niederschlag erhalten; Smp. 152 bis 161 , Ausbeute 38 % der Theorie.

2. N-Carbobenzyloxy-L-asparaginyl-(N±-carboben- @yloxy)-L-lysin.

5,00 g (0,0092 Mol) N-Carbobenzyloxy-L-aspara- ginyl-(NF-carbobenzyloxy)-L-lysin-methylester vom Schmelzpunkt 152-161 werden gelöst in 60 cm3 Dimethylformamid und portionenweise 0,1-n. Natronlauge zugegeben, bis der pH-Wert der Lösung während 20 Minuten bei l0-10,5 bleibt (insgesamt 140 cm3 0,1-n. NaOH zugegeben). Hierauf wird durch Zugabe von etwas festem C02 auf pH = 8 gebracht und das Dimethyl-formamid- Wasser-Gemisch erst im Vakuum, dann im Hochvakuum auf ein kleines Volumen eingeengt.

Der Rückstand wird mit Wasser versetzt, wobei das Natriumsalz von N-Carbobenzyloxy-L-asparaginyl-(NE- carbobenzyloxy)-L-lysin als dicke, gallertige Masse ausfällt. Es wird durch Zugabe von viel Wasser (etwa 200 cm3) in Lösung gebracht, von etwas Ungelöstem abfiltrie.rt und das Filtrat unter Eiskühlung mit konz. HCl tropfenweise auf pH = 1 gebracht.

Die flockige Fällung wird abgenutscht, mit Eiswasser gewaschen, getrocknet und Methanol-Äther zweimal umkristallisiert; es werden 3,2g N-Carbobenzyloxy-L-asparagi- nyl-NF-carbobenzyloxy)-L-lysin (feine Nadeln) vom Smp. 17.5-181 erhalten (Ausbeute 740/0 der Theorie). Das Produkt ist löslich in sehr verdünnten Alka- lien, mit 2-n. Natronlauge oder Sodalösung entsteht ein gallertiges, schwerlösliches Natriumsalz. Beispiel S a) N-Carbobenzyloxy-L-asparaginyl-nitro-L-argi- nyl-L-lettcyl-L-t),rosyl-L-isoleucyl-L-histidyl-L-prolyl- L-phenylalanin-methylester.

Zur Lösung von 802 mg (1 miMol) L-Leucyl-tyro- syl - L - isoleu cyl- L- histidyl - L-prolyl-L-phenylalanin- methylester in 6 ml frischdestilliertem Dimethylform- amid gibt man 360 mg (1,5 mMol) Dicyclohexyl- carbodümid und nach kurzer Zeit 710 mg (1,5 mMol) N-Carbobenzyloxy-L-asparaginyl-nitro-L-arginin in 6 mg Dimethylformamid. Man lässt über Nacht bei Zimmertemperatur reagieren,

filtriert vom Dicyclo- hexylharnstoff ab und dampft das Lösungsmittel im Hochvakuum bei 40 ab. Den schaumigen Rückstand trocknet man noch eine weitere Stunde bei 40 und 0,01 mm Hg, zerreibt ihn anschliessend mit viel Essigester und trocknet das pulverige Produkt wieder im Hochvakuum. Zur weiteren Reinigung wird das Rohprodukt wiederholt mit viel Aceton und eiskaltem Methanol gewaschen. Man gewinnt 280 mg (22 %) N-Carbobenzyloxy-octapeptid-methylester; F. = 204 bis 206 .

b) L-Asparaginyl-L-arginyl-L-leucyl-L-tyrosyl-L- isoleucyl - L- histidyl -L-prolv l-L-pheny[aIanin-methyl- ester-trihydrochlorid.

210 mg (0,22 mMol) N-Carbobenzyloxy-L-aspara- ginyl-nitro-L-arginyl-L-leucyl-L-tyrosyl-L-isoleucyl-L- histidyl-L-prolyl-L-phenylalanin-meth@ylester werden in 30 m1 abs. Methanol in Gegenwart von 4 Äquivalenten Salzsäure und 200 mg Pd-Kohle (10 0/0 Pd) unter Normalbedingungen hydriert. (Das gebildete C02 wird in einem zweiten Hydriergefäss mit verdünnter Natronlauge absorbiert.) Nach etwa 17 Stunden ist etwas mehr als die berechnete Menge Wasserstoff aufgenommen.

Der Katalysator wird abfiltriert, die Lösung bei 40 auf ein kleines Volumen eingedampft und mit viel Äther versetzt. Dabei scheidet sich das Trihydrochlorid des Oktapeptidesters neben Ammo- niumchlorid als weisses körniges Produkt ab. Ausbeute 240 mg (270 mg berechnet für Trihydrochlorid und äquimolare Menge Ammoniumchlorid).

Das Produkt wird ohne weitere Reinigung weiterverarbeitet. Es ist in Methanol, Äthanol und Wasser gut löslich.

Die Carbonamidgruppe des Asparaginylrestes kann wie folgt in die Carboxylgruppe übergeführt werden: 100 mg L-Asparaginyl-L-arginyl-L-leucyl-L-tyro- syl-L-isoleucyl-L-histidyl-L-prolyl-L-phenylalanin- methylester werden in 2 ml konz. reiner Salzsäure

85 Minuten bei 37 gehalten. Die Salzsäure wird rasch im Vakuum bei 25 abgedampft und der Rückstand über Natriumhydroxyd und Phosphorpentoxyd getrocknet.

Zur Reinigung löst man das schaumige Rohprodukt unter gelindem Erwärmen in 1,5 ml Äthanol und fällt das Oktapeptid-trihydrochlorid mit 8 ml Aceton aus. Abzentrifugieren und Nachwaschen mit 2 Portionen zu 2 ml Aceton ergeben 90 mg L-Aspara,-yl- L-arginyl-L-leucyl-L-tyrosyl-L-isoleucyl-L-histidyl-L- prolyl-L-phenylalanin-trihydrochlorid.

An der nierenlosen Ratte zeigt es die 20fache Aktivität von Noradrenalin.

Durch Craig-Verteilung oder Chromatographie an Papierpulver in geeigneten Lösungsmittelgemischen (z. B. Butanol-Methanol-0,33 m NH4-COOH oder sek.-Butanol-3 0,10 NH; 120:44) kann L-Asparagyl L-arginyl-1,- leucyl-L-tyrosyl-L-isoleucyl-L-histidyl-L proiyl-L-phenylalanin von L-Asparaainyl-L-ar,-inyl-L- leucyl-L-tyrosyl-L-isoleucyl-L-histidyl-L-prolyl-L-phe- nylalanin getrennt werden.

Der als Ausgangsstoff verwendete. L-Leucyl-L- tyrosyl - L - isoleucyl - L - histidyl-L-prolyl-L-phenylala- nin-methylester kann wie folgt hergestellt werden: 1. N-Cnrbobenzyloxy-L-leucyl-L-tyrosin-methyl- ester.

940 mg (3,5 mMol) N-Carbobenzyloxy-L-leucin löst man in 10 ml absolutem Tetrahydrofuran, gibt 800 mg (10 %, 1Jberschuss) Dicyclohexyl-carbodiimid zu und anschliessend 690 mg (3,5 mMol) Tyrosin- methylester, gelöst in 15 m1 abs. Tetrahydrofuran. Man lässt über Nacht reagieren, filtriert vom ausgeschiedenen Dicyclohexylharnstoff ab und dampft das Lösungsmittel im Vakuum bei 40 ab.

Den Verdamp- fungsrückstand wäscht man in Essigester mit 1-n. Salzsäure, Wasser, 2-n. Natriumbicarbonatlösung und Wasser neutral; trocknet die Essigesterlösung über Natriumsulfat und verdampft das Lösungsmittel im Vakuum. Man isoliert 1,4 g (90%) rohen Carbobenz- oxy-dipeptidester. Zweimaliges Umfällen des Roh- esters aus Essigester/Petroläther ergibt reinen,

aber amorphen N-Carbobenzyloxy-L-leucyl-Lrtyrosin-me- thylester. [apD = -14 -i_- 4 (c = 1,108 in Methanol).

Der gleiche nach der gemischten Anhydrid- methode hergestellte Carbobenzyloxy-L-leucyl-L-tyro- sin-methylester zeigt [a]D =-11 2 (c = 1,631 in Äthanol).

2. N-Carbobenzyloxy-L-leucyl-L-tyrosin.

Zu 2,37 g (5,3 mMol) N-Carbobenzyloxy-L-leu- cyl-L-tyrosin-methylester gibt man 13,5 ml 1-n. NaOH, schüttelt bis zur vollständigen Lösung durch (5 Minuten) und verseift 1 Stunde bei Zimmertemperatur. Die alkalische Lösung wird einmal mit 5 ml Essigester ausgezogen, die organische Phase noch einmal mit wenig Wasser gewaschen und die vereinigten wässrigen Lösungen am Vakuum während 10 Minuten vom Essigester befreit. Mit 13,5 ml 1-n. HCl wird das Carbobenzoxydipeptid als klebrige Masse ausgefällt, die im Eiskasten erstarrt, bei Zimmertemperatur aber wieder zerfliesst.

Man dekantiert von der Mutterlauge ab, wäscht den gummiartigen Rückstand dreimal gut mit Wasser durch und trocknet über KOH und Phosphorpentoxyd im Hochvakuum. Man erhält 1,9 g (800/0 amorphes Carbobenzyloxy-L-leucyl-L- tyrosin, das nicht kristallisiert erden konnte.

Die multiplikative Verteilung (Craig-Grundprozess) über 30 Stufen zwischen 80 % igem Methanol als Ober- phase und Chloroform: Tetrachlorkohlenstoff 1 : 1 als untere Phase (K = 1,54) ergibt ebenfalls ein nichtkristallines Produkt.

3. N-Carbobenzyloxy-L-leucyl-L-tyroYyl-L-isoletr- cyl-L-histidyl-L-prolyl-L-phenylalartin-nietlaylester. Die Lösung von 1,03 g (2,4 mMol) N-Carboben- zyloxy-L-leucyl-L-tyrosin in 10 ml trockenem Aceto- nitril versetzt man mit 520 mg (5 0/0 Überschuss) Di- cyclohexylcarbodiimid und der Lösung von 1,38 g (2,5 mMol) L-isoleucyl-L-histidyl-L-prolyl-L-phenyl- alaninmethylester (vgl. Beispiel 1) in 10 ml Aceto- nitril. Dabei scheidet sich der Dicyclohexylharnstoff momentan aus.

Nach etwa 6 Stunden beginnt die Abscheidung des N-Carbobenzoxy-hexapeptidesters als gallertige Masse. Man lässt 2 Tage bei Zimmertemperatur in der Dunkelheit stehen und dampft anschlie- ssend das Acetonitril bei 40 unter vermindertem Druck ab. Den Rückstand dige:riert man mit 5 ml eiskaltem Methanol, filtriert vom Dicyclohexylharnstoff ab und wäscht drei weitere Male mit je 1 ml eiskaltem Methanol nach. Das Methanol wird am Vakuum abgedampft und der Rückstand in Chloroform dreimal mit 2 ml 2-n. Salzsäure, fünfmal mit 2 ml eiskalter Natriumbicarbonatlösung und mit Wasser gewaschen.

Die über Natriumsulfat getrocknete Lösung wird kurz mit wenig Aktivkohle aufgekocht, filtriert und das Chloroform vollständig abgedampft. Einmaliges Umfällen aus Chloroform"Äther ergeben 1,7 g (76 0/0) Carbobenzoxyhexapeptid-methylester.

Das Analysenpräparat zeigt nach dreimaligem Umfällen aus Chloroform/Äther F. = 139-141 , [a] D = -51 4o (c = 1,87 in Methanol). 4. L-Leucyl-L-tyrosyl-L-isoleucyl-L-histidyl-L- prolyl-L-phenylalanitt-metltylester.

1,2 g (1,28 mMol) N-Carbobenzyloxy-L-leucyl-L- tyrosyl - L-isoleucyl - L- histidyl - L-prolyl-L-phenylala- nin-methylester werden in 20 ml abs. Methanol, die 2 Äquivalente Salzsäure enthalten, in Gegenwart von 300 mg Pd-Kohle (10 % Pd) hydrogenolytisch gespal- ten. Nach 2 Stunden ist etwas mehr als die berechnete Menge Wasserstoff aufgenommen.

Die vom Katalysator befreite Lösung dampft man im Vakuum bei 40 zur Trockne ein, löst den Rückstand in 10 ml eiskaltem Wasser und gibt zur klaren Lösung 2,6 mMol Natriumcarbonat, gelöst in 10 ml Wasser. Der ausgeschiedene Hexapeptidester wird mit 25 ml und

zweimal mit 10 ml n-Butanol/Chloroform 1 : 1 extrahiert, die wässrigen Phasen dreimal mit 5 ml Wasser gewaschen, über Natriumsulfat getrocknet und im Vakuum auf ein kleines Volumen eingeengt. Durch Zugabe von viel Äther fällt der Hexapeptidester quantitativ aus. Einmaliges Umfällen aus Chloroform/Äther ergibt 840 mg (81 1/o-) amorphes Produkt, F. = 130 bis 140 .

Das Produkt ist für die Weiterverarbeitung genügend rein.

Claims

PATENTANSPRUCH Verfahren zur Herstellung neuer Oktapeptide der Formel EMI17.9 worin R1 eine Amino-niederalkylgruppe und R2 eine Niederalkylgruppe bedeutet, dadurch gekennzeichnet, dass man eine L-Asparaginyl-L-a-(amino-niederalkyl)- amino-essiasäure, eine L-a-Aminoniederalkyl-essig- säure, L-Tyrosin, eine L-a-Amino-niederalkyl-essig- säure, L-Histidin, L-Prolin und L-Phenylalanin unter intermediärem Schutz von Amino- bzw.

Carboxyl- gruppen miteinander durch Kondensation vereinigt. UNTERANSPRÜCHE 1. Verfahren nach Patentanspruch, dadurch gekennzeichnet, dass man ein L-Asparaginyl-nitro-L- arginin, dessen a-Aminogruppe durch eine mittels hydrierender Mittel abspaltbare Gruppe geschützt ist, in Gegenwart eines Carbodiimids mit einem L-Valyl- L-tyrosyl-L-valyl-L-histidyl-L-prolyl-L-phenylalanin- ester kondensiert. 2.

Verfahren nach Patentanspruch, dadurch gekennzeichnet, dass man ein L-Asparaginyl-nitro-L- arginin, dessen a-Aminogruppe durch eine mittels hydrierender Mittel abspaltbare Gruppe geschützt ist, in Gegenwart eines Carbodiimids mit einem L-Valyl- L-tyrosin-ester umsetzt, den erhaltenen Tetrapeptid- ester mittels eines alkalischen Mittels in die freie Säure überführt und das Tetrapeptid in Gegenwart eines Carbodiimids mit einem L-Isoleucyl-L-histidyl- L-prolyl-L-phenylalaninester kondensiert. 3.

Verfahren nach Patentanspruch und den Unteransprüchen 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, dass man im erhaltenen Oktapeptid die Carbonylamid- gruppe des Asparaginrestes zur Carboxylgruppe verseift.