Procédé, pour la préparation d'un tripeptide
La présente invention est relative à un. procédé pour la préparation d'un wipeptide, terme intermédiaire de la synthèse de l'ocytocine, hormone nonapeptidique dont la formule de constitution suivante :
EMI1.1
a ÚtÚ dÚmontrÚe par Du Vigneaud et collaborateurs, J. Am. Chem. Soc., 1954, 76, 3115.
Le tripeptide dont la prÚparation fait l'objet de la prÚsente invention est la S,N-ditrityl-L-cystÚinyl-L-tyro syl-L-isoleucine, composé de formule II suivante :
EMI1.2
Comme on le voit, ce composé préfigure une portion du cycle polypeptidique de la molécule de l'ocytocine et représente un intermédiaire de grande valeur pour la synthèse de cette hormone du lobe postérieur de l'hypophyse.
Les avantages de la préparation de la S, N ditrityl-L-cystéinyl-L-tyrosyl-L-isoleucine selon l'in- vention résident entre autres dans l'utilisation comme matière première, de la S, N-ditrityl-cystÚine, produit d'accès aisé du fait d'un blocage identique à l'azote et au soufre qui peut être facilement clivé par des réactifs simples et dans des installations courantes.
La grande simplicité du procédé de l'invention, remarquable par la répétition de techniques identiques et l'excellence des rendements, le rend particulièrement apte à l'industrialisation.
Selon le procédé de l'invention, on dissout dans un solvant un sel de S, N-ditrityl-L-cystÚine et un sel d'un ester de la L-tyrosine, ajoute un léger excès de dicyclohexylcarbodiimide, détruit, après réaction, l'excédent de dicyclohexylcarbodiimide, filtre, évapore à sec, isole 1'ester de la S, N-ditrityl-L-cystÚinyl
L-tyrosine, le saponifie en présence d'un agent alcalin dans un solvant approprié, isole la S, N-ditrityl-L cystéinyl-L-tyrosine, dissout dans un solvant un sel de ladite S, N-ditrityl-L-cystéinyl-L-tyrosine et un sel d'un ester de la L-isoleucine, ajoute un léger excès de dicyclohexylcarbodiimide, détruit, après réaction, l'excédent de dicyclohexylcarbodiimide, filtre, éva- pore à sec, isole 1'ester de la S, N-ditrityl-L-cystÚinyl L-tyrosyl-L-isoleucine,
le saponifie en présence d'un agent alcalin dans un solvant et isole la S, N-ditrityl L-cystéinyl-L-tyrosyl-L-isoleucine.
Selon un mode préféré de réalisation du procédé selon l'invention, on dissout dans le chlorure de méthylène le sel de diéthylamine de la S, N-ditrityl
L-cystéine, le chlorhydrate du L-tyrosinate d'éthyle et un excès d'environ 10 ouzo de dicyclohexylcarbodiimide, détruit après réaction l'excédent de ce dernier réactif par addition d'acide acétique, isole le S, N ditrityl-L-cystéinyl-L-tyrosinate d'éthyle suivant les méthodes habituelles, le saponifie par traitement au reflux de la potasse méthanolique, forme le sel de triéthylamine de la S,
N-ditrityl-L-cystéinyl-L-tyrosine qu'on fait réagir sur le L-isoleucinate de méthyle en présence de dicyclohexylcarbodiimide au sein du chlorure de méthylène comme indiqué ci-avant pour obtenir, après traitement usuels, le S, N-ditrityl-L cystéinyl-L-tyrosyl-L-isoleucinate de méthyle d'où l'on passe par saponification dans la potasse méthanolque, à la S, N-ditrityl-L-cystéinyl-L-tyrosyl-L-iso- leucine.
Le mode opératoire décrit dans l'exemple qui suit peut évidemment être utilisé au départ d'aminoacides racémiques ou énantiomorphes. On peut également faire varier les températures de réactions, modifier la nature des solvants, employer d'autre esters que ceux mentionnés ou préparer les matières premières par d'autres voies que celles préconisées ici, et saponifier par toute autre méthode connue. Il est aussi possible d'utiliser un autre carbodiimide disubstitué.
Les points de fusion ont été déterminés sur bloc de
Maquenne.
Exemple
PrÚparation du S,N-ditrityl-L-cystÚinyl-L-tyrosinate
d'éthyle
EMI2.1
Condensation du S, N-ditrtyl-L-cystéinate de diéthyl-
amine sur le chlorhydrate du L-tyrosinate
d'éthyle
On dissout dans 100 cm3 de chlorure de mé thylène un mélange constitué par 20 g de S, N ditrityl-L-cystéinate de diéthylamine et 7, 6 g de chlorhydrate du L-tyrosinate d'éthyle, ajoute 6, 7 g de dicyclohexylcarbodiimide en solution dans 20 cmS de chlorure de méthylène, abandonne deux heures à la température ambiante puis chauffe deux heures aux environs de 35o C. On ajoute 2 cm3 d'acide acétique cristallisable, laisse reposer trente minutes à la température du laboratoire, filtre,
lave la solution obtenue à 1'eau tout en ajoutant de l'acide chlorhydrique N jusqu'à pH 2 puis encore à l'eau, la sèche sur sulfate de magnésium et l'éva- pore à sec sous vide. On cristallise le résidu dans 30 cml d'éther pour obtenir 19, 6 g (83 /o) de S, N ditrityl-L-cystéinyl-L-tyrosinate d'éthyle, F 135 C, puis 1830 C avec resolidification intermédiaire, (an = +77¯¯ 1 (c = 2%, chloroforme). Le produit, qui n'a pas encore été décrit, se présente sous forme de petits prismes rectangulaires incolores, solubles dans le benzène et le chloroforme, peu solubles dans l'alcool et l'acétone, très peu solubles dans l'éther et insolubles dans l'eau.
Analyse : C52H4804N2S=796, 98
Calculé : C 78, 36 /o H 6, 07 /o N 3, 52 /o S 4, 02 /o O 8, 03 /o
Trouvé : C 78, 3 /o H 6, 0 /o N 3, 6 /o S 4, 0 /o 08, 2 < '/o
Pour la préparation du S, N-ditrityl-L-cystÚinate de diéthylamine, on procède comme suit :
dans une solution refroidie à 0O C, de 25 g de chlorhydrate de
L-cystéine, [a] D0= +5, 5O (c= 1 /o, acide chlorhydrique N), dans 480 cm3, d'eau, on introduit, sous courant d'azote et agitation mécanique, 480 cm3 d'éther et 80 cm3 de diéthylamine puis refroidit à -5o C. Sans interrompre l'agitation, on introduit 120 g de chlorure de trityle et poursuit l'agitation pendant trois heures. On ajoute encore 200 cm3 de chloroforme, décante la phase aqueuse, lave la phase organique avec 300 cm3 d'eau, la sèche sur sulfate de magnésium, ajoute 100 cm3 d'alcool contenant 1 cm de diéthylamine et chasse le chloroforme par distillation.
On ajoute à la solution alcoolique ainsi obtenue 100 cm3 d'éther et essore 55 g de sel de diéthyl- amine de la S, N-ditrityl-L-cysteine, [a] D = + 71 1 (c = 2 /o, chloroforme). Les eaux mères fournissent encore un deuxième jet qui porte le rendement global à 70 g.
Saponification du S, N-ditrityl-L-cystéinyl-L-tyrosinate
d'éthyle
On introduit 19 g de S, N-ditrityl-L-cystÚinyl-Ltyrosinate d'éthyle dans 80 cm3 de méthanol, ajoute 16 cm3 de potasse méthanolique 3 N, 50 cm3 d'eau et chauffe au reflux pendant quelques minutes. On ajoute alors 600 cm3 d'eau, puis sous vive agitation 49 cm3 d'acide chlorhydrique N, extrait par 3 fois 300 cm3 d'éther, réunit les extraits éthérés qu'on lave à l'eau, sèche sur sulfate de magnésium et Úvapore à sec sous vide.
On cristallise le résidu dans 20 cm3 d'éthanol et obtient 14, 9 g, 82 O/o, de
S, N-ditrityl-L-cystéinyl-L-tyrosine, F 146-1480 C, [a] = + 87, 50 + 1 (c = 2"/o, chloroforme). Le produit qui est nouveau se présente sous forme de petits prismes rectangulaires incolores solubles dans le chloroforme, peu solubles dans l'alcool, l'éther, l'acÚtone, le benzène, insolubles dans l'eau.
Analyse : CaoH4404N2S = 768, 93
Calculé : C78, 09 /o H5, 77 /o N3, 64 /o S4, 17 /o
Trouve : 78, 1 /o 5, 8% 3, 8 /o 4, 3 O/o Préparation du S,N-ditrityl-L-cystÚinyl-L-tyrosyl-L-isoleucinate de mÚthyle
EMI3.1
a) Préparation du S, N-dtrityl-L-cystéinyl-L-tyrosi-
nate de triéthylamine
On dissout 2 g de S, N-ditrityl-L-cystÚinyl-L-tyrosine dans 4 cm'de chloroforme, ajoute 0, 37 cm3 de triéthylamine puis 25 cm3 d'Úther de pétrole (30 75 C), centrifuge, décante et cristallise dans l'Úther.
On obtient ainsi 2, 2 g (97 a/o) de S, N-ditrityl-L cystéinyl-L-tyrosinate de triéthylamine [α]20D = +77¯ 1 (c = 2 /o, chloroforme). b) Condensation du S, N-ditrityl-L-cystéinyl-L-tyro-
sinate de triéthylamine sur le chlorhydrate du L
isoleucinate de méthyle
On dissout 7, 5 g de sel de triéthylamine du S, N ditrityl-L-cystéinyl-L-tyrosinate de triéthylamine et 1, 7 g de chlorhydrate du L-isoleucinate de méthyle préparé selon Smith, Spackman et Poglase, J. Biol.
Chem., 1952, 199, 803, dans 30 cm3 de chlorure de méthylène, ajoute 2, 1 g de dicyclohexylcarbodiimide en solution dans 10 cm3 de chlorure de méthylène et abandonne trois heures à la température ambiante.
On ajoute 2 cmg d'acide acétique cristallisable, laisse reposer trente minutes à la température ambiante, filtre, lave la solution organique à 1'eau tout en ajoutant de l'acide chlorhydrique N jusqu'à obtention d'un pH = 2 dans les eaux de lavage, lave à l'eau, sèche sur sulfate de magnésium et évapore à sec sous vide. Le résidu est repris dans 20 cm3 d'éther de pétrole (30-75O C). On essore, lave à l'éther de pétrole et obtient ainsi, après séchage, 7, 7 g, soit un rendement quantitatif, de S, N-ditrityl-L-cystÚinyl
L-tyrosyl)-L-isoleucinate de méthyle. Ce produit, qui n'a pas encore été décrit, se présente sous forme d'une poudre incolore soluble dans la plupart des solvants organiques, insoluble dans l'éther de pétrole.
Sa ponif ication d u S, N-d itrityl-L-cystéinyl-L-tyrosyl-L-
isoleucinate de méthyle
On dissout à chaud, dans 30 cm3 de méthanol, 7, 7 g de S, N-ditrityl-L-cystÚinyl-L-tyrosyl-L-isoleucinate de méthyle. On introduit 6, 2 cm3 de potasse méthanolique 3 N et 19, 5 cm3 d'eau, porte cinq minutes à l'ébullition, ajoute 230 cm3 d'eau et 18 cm3 d'acide chlorhydrique N. On extrait par deux fois 300 cm3 d'éther, sèche la solution éthérée sur sulfate de magnésium et évapore à sec sous vide.
Le résidu est repris dans 20 cm3 d'acétone ; on filtre et évapore à sec sous vide pour obtenir une huile qui durcit rapidement par trituration sous l'eau.
On essore, lave à l'eau, sèche sous vide et obtient ainsi 5, 8 g (76 10/o) de S, N-ditrityl-L-cystéinyl-L-tyro- syl-L-isoleucine. Ce produit, qui n'a pas encore été décrit, se présente sous forme d'une poudre blanche soluble dans l'alcool, l'éther, l'acétone, le benzène et le chloroforme, insoluble dans l'eau. Il fond à environ 143-145"C, [a] = + 50" 1 (c = 2 4)/o, éthanol).
Process, for the preparation of a tripeptide
The present invention relates to a. process for the preparation of a wipeptide, an intermediate term in the synthesis of oxytocin, a nonapeptide hormone having the following constitutional formula:
EMI1.1
has been demonstrated by Du Vigneaud and collaborators, J. Am. Chem. Soc., 1954, 76, 3115.
The tripeptide the preparation of which is the subject of the present invention is S, N-ditrityl-L-cystÚinyl-L-tyro syl-L-isoleucine, compound of the following formula II:
EMI1.2
As can be seen, this compound foreshadows a portion of the polypeptide cycle of the oxytocin molecule and represents a valuable intermediate for the synthesis of this hormone of the posterior lobe of the pituitary gland.
The advantages of the preparation of S, N ditrityl-L-cysteinyl-L-tyrosyl-L-isoleucine according to the invention lie, inter alia, in the use as a starting material of S, N-ditrityl-cystÚine, product of easy access due to an identical blocking with nitrogen and sulfur which can be easily cleaved by simple reagents and in current installations.
The great simplicity of the process of the invention, remarkable for the repetition of identical techniques and the excellence of the yields, makes it particularly suitable for industrialization.
According to the process of the invention, a salt of S, N-ditrityl-L-cystÚine and a salt of an ester of L-tyrosine are dissolved in a solvent, a slight excess of dicyclohexylcarbodiimide is added, destroyed, after reaction, excess dicyclohexylcarbodiimide, filters, evaporates to dryness, isolates the ester of S, N-ditrityl-L-cystÚinyl
L-tyrosine, saponifies it in the presence of an alkaline agent in a suitable solvent, isolates S, N-ditrityl-L cysteinyl-L-tyrosine, dissolves a salt of said S, N-ditrityl-L-cysteinyl in a solvent -L-tyrosine and a salt of an ester of L-isoleucine, adds a slight excess of dicyclohexylcarbodiimide, destroys, after reaction, the excess of dicyclohexylcarbodiimide, filters, evaporates to dryness, isolates the ester of S , N-ditrityl-L-cystÚinyl L-tyrosyl-L-isoleucine,
saponifies it in the presence of an alkaline agent in a solvent and isolates S, N-ditrityl L-cysteinyl-L-tyrosyl-L-isoleucine.
According to a preferred embodiment of the process according to the invention, the diethylamine salt of S, N-ditrityl is dissolved in methylene chloride.
L-cysteine, the hydrochloride of ethyl L-tyrosinate and an excess of about 10 ouzo of dicyclohexylcarbodiimide, after reaction destroys the excess of the latter reagent by adding acetic acid, isolates the S, N ditrityl-L- ethyl cysteinyl-L-tyrosinate according to the usual methods, saponifies it by refluxing methanolic potash, forms the triethylamine salt of S,
N-ditrityl-L-cysteinyl-L-tyrosine which is reacted with methyl L-isoleucinate in the presence of dicyclohexylcarbodiimide in methylene chloride as indicated above to obtain, after usual treatment, the S, N- Methyl ditrityl-L-cysteinyl-L-tyrosyl-L-isoleucinate from which one passes by saponification in methanolic potash, to S, N-ditrityl-L-cysteinyl-L-tyrosyl-L-isoleucine.
The procedure described in the example which follows can obviously be used starting from racemic or enantiomorphic amino acids. It is also possible to vary the reaction temperatures, modify the nature of the solvents, use esters other than those mentioned or prepare the starting materials by means other than those recommended here, and saponify by any other known method. It is also possible to use another disubstituted carbodiimide.
The melting points were determined on a block of
Maquenne.
Example
Preparation of S, N-ditrityl-L-cystÚinyl-L-tyrosinate
ethyl
EMI2.1
Condensation of diethyl S, N-ditrtyl-L-cysteinate
amine on L-tyrosinate hydrochloride
ethyl
A mixture consisting of 20 g of diethylamine S, N ditrityl-L-cysteinate and 7.6 g of ethyl L-tyrosinate hydrochloride is dissolved in 100 cm3 of methylene chloride, added 6.7 g of dicyclohexylcarbodiimide in solution in 20 cmS of methylene chloride, leave for two hours at room temperature then heat for two hours at around 35o C. 2 cm3 of crystallizable acetic acid are added, leave to stand for thirty minutes at laboratory temperature, filter,
washing the solution obtained with water while adding N hydrochloric acid to pH 2 and then again with water, dried over magnesium sulphate and evaporated to dryness under vacuum. The residue is crystallized from 30 cml of ether to obtain 19.6 g (83 / o) of ethyl S, N ditrityl-L-cysteinyl-L-tyrosinate, F 135 C, then 1830 C with intermediate resolidification, ( an = + 77¯¯ 1 (c = 2%, chloroform). The product, which has not yet been described, is in the form of small colorless rectangular prisms, soluble in benzene and chloroform, poorly soluble in l alcohol and acetone, very sparingly soluble in ether and insoluble in water.
Analysis: C52H4804N2S = 796.98
Calculated: C 78, 36 / o H 6, 07 / o N 3, 52 / o S 4, 02 / o O 8, 03 / o
Found: C 78, 3 / o H 6, 0 / o N 3, 6 / o S 4, 0 / o 08, 2 <'/ o
For the preparation of diethylamine S, N-ditrityl-L-cystÚinate, the procedure is as follows:
in a solution cooled to 0O C, 25 g of hydrochloride
L-cysteine, [a] DO = +5, 5O (c = 1 / o, N hydrochloric acid), in 480 cm3 of water, are introduced, under a stream of nitrogen and mechanical stirring, 480 cm3 of ether and 80 cm3 of diethylamine then cooled to -5 ° C. Without interrupting the stirring, 120 g of trityl chloride are introduced and stirring continued for three hours. Another 200 cm3 of chloroform are added, the aqueous phase decanted, the organic phase washed with 300 cm3 of water, dried over magnesium sulfate, added 100 cm3 of alcohol containing 1 cm of diethylamine and the chloroform was removed by distillation.
100 cm3 of ether are added to the alcoholic solution thus obtained and 55 g of diethylamine salt of S, N-ditrityl-L-cysteine, [a] D = + 71 1 (c = 2 / o, filtered off). chloroform). The mother liquors still provide a second spray which brings the overall yield to 70 g.
Saponification of S, N-ditrityl-L-cysteinyl-L-tyrosinate
ethyl
19 g of ethyl S, N-ditrityl-L-cystÚinyl-Ltyrosinate are introduced into 80 cm3 of methanol, 16 cm3 of 3N methanolic potassium hydroxide, 50 cm3 of water and refluxed for a few minutes are added. Then 600 cm3 of water are added, then with vigorous stirring 49 cm3 of N hydrochloric acid, extracted with 3 times 300 cm3 of ether, the ethereal extracts are combined which are washed with water, dried over magnesium sulfate and Evaporate to dryness under vacuum.
The residue is crystallized from 20 cm3 of ethanol and 14.9 g, 82 O / o, of
S, N-ditrityl-L-cysteinyl-L-tyrosine, F 146-1480 C, [a] = + 87, 50 + 1 (c = 2 "/ o, chloroform). The product which is new is in the form small colorless rectangular prisms soluble in chloroform, poorly soluble in alcohol, ether, acetone, benzene, insoluble in water.
Analysis: CaoH4404N2S = 768.93
Calculated: C78, 09 / o H5, 77 / o N3, 64 / o S4, 17 / o
Found: 78, 1 / o 5, 8% 3, 8 / o 4, 3 O / o Preparation of methyl S, N-ditrityl-L-cystyrinyl-L-tyrosyl-L-isoleucinate
EMI3.1
a) Preparation of S, N-dtrityl-L-cysteinyl-L-tyrosi-
triethylamine nate
2 g of S, N-ditrityl-L-cystÚinyl-L-tyrosine are dissolved in 4 cm3 of chloroform, 0.37 cm3 of triethylamine then 25 cm3 of petroleum Úther (3075 C), centrifuge, decant and crystallizes in Úther.
In this way 2.2 g (97 a / o) of triethylamine S, N-ditrityl-L cysteinyl-L-tyrosinate [α] 20D = + 77¯ 1 (c = 2 / o, chloroform) is obtained. b) Condensation of S, N-ditrityl-L-cysteinyl-L-tyro-
triethylamine sinate on L hydrochloride
methyl isoleucinate
7.5 g of triethylamine salt of S, N ditrityl-L-cysteinyl-L-tyrosinate of triethylamine and 1.7 g of methyl L-isoleucinate hydrochloride prepared according to Smith, Spackman and Poglase, J. Biol.
Chem., 1952, 199, 803, in 30 cm3 of methylene chloride, add 2.1 g of dicyclohexylcarbodiimide dissolved in 10 cm3 of methylene chloride and leave for three hours at room temperature.
2 cmg of crystallizable acetic acid are added, left to stand for thirty minutes at room temperature, filtered, the organic solution washed with water while adding N hydrochloric acid until a pH = 2 is obtained in the washing water, washed with water, dried over magnesium sulphate and evaporated to dryness under vacuum. The residue is taken up in 20 cm3 of petroleum ether (30-75O C). It is filtered off, washed with petroleum ether and thus obtains, after drying, 7.7 g, ie a quantitative yield, of S, N-ditrityl-L-cystÚinyl
Methyl L-tyrosyl) -L-isoleucinate. This product, which has not yet been described, is in the form of a colorless powder soluble in most organic solvents, insoluble in petroleum ether.
Its ponif ication of S, N-d itrityl-L-cysteinyl-L-tyrosyl-L-
methyl isoleucinate
Methyl S, N-ditrityl-L-cystÚinyl-L-tyrosyl-L-isoleucinate is dissolved in 30 cm3 of methanol. 6.2 cm3 of 3 N methanolic potassium hydroxide and 19.5 cm3 of water are introduced, bring to the boil for five minutes, 230 cm3 of water and 18 cm3 of N hydrochloric acid are added. Extraction is carried out twice with 300 cm3 ether, the ethereal solution dried over magnesium sulfate and evaporated to dryness in vacuo.
The residue is taken up in 20 cm3 of acetone; it is filtered and evaporated to dryness under vacuum to obtain an oil which hardens quickly by trituration under water.
It is filtered off, washed with water, dried under vacuum and thus obtains 5.8 g (76 10 / o) of S, N-ditrityl-L-cysteinyl-L-tyrosyl-L-isoleucine. This product, which has not yet been described, is in the form of a white powder soluble in alcohol, ether, acetone, benzene and chloroform, insoluble in water. It melts at about 143-145 "C, [a] = + 50" 1 (c = 2 4) / o, ethanol).