Procédé de transformation de la spiramycine <B>I</B> en spiramycine II ou III ou en leur mélange La présente invention a pour objet un procédé de transformation de la spiramycine I en spiramycine II ou III ou leur mélange.
On sait que la spiramycine, antibiotique composé de trois constituants de propriétés très voisines, les spiramycines I, II et III, est produite par la culture d'un Streptomyces : S. ambofaciens (dont un spéci men a été déposé au NRRL à Péoria, Illinois, Etats- Unis d'Amérique, où il a été affecté de l'indicatif NRRL 2420), ou de ses mutants, dans des milieux de culture appropriés.
La constitution exacte de ces spiramycines n'est pas encore connue avec certitude, mais on sait (Paul & Tchelitcheff - Bull.- Soc. Chim. France, p. 443, 1957) que les spiramycines II et III sont respective ment les dérivés acétylé et propionylé de la spiramy- cine I. On sait aussi que les spiramycines II et III peuvent être cristallisées, ce qui peut faciliter leur purification et constitue un avantage important pour l'emploi pharmaceutique.
Un second avantage des spiramycines II et III est la toxicité moindre de ces formes de spiramycines, ainsi qu'il ressort du tableau suivant où figurent les doses (exprimées en g/kg) des trois spiramycines qui provoquent la mort de 50 % des souris traitées par voie sous-cutanée (DL5,g/kg s.c.)
EMI0001.0035
Produits <SEP> DLso <SEP> (g/kg <SEP> s.c.)
<tb> Spiramycine <SEP> I <SEP> <B>------------</B> <SEP> ...<B>----------</B> <SEP> 1,01
<tb> Spiramycine <SEP> II <SEP> <B>------ <SEP> -------------- <SEP> --------</B> <SEP> 1,52
<tb> Spiramycine <SEP> III <SEP> <B>...
<SEP> - <SEP> ...................</B> <SEP> 2,04 Enfin l'activité antimicrobienne in vitro et in vivo des spiramycines II et III est au moins égale à celle de la spiramycine I. On a déjà montré que, par des conditions parti culières de fermentation, notamment par des modifi cations dans la composition des milieux de culture, on pouvait agir sur la proportion des trois spiramy- cines présentes dans le produit élaboré par les Strep tomyces ambofaciens NRRL 2420.
Cependant avec les milieux habituels utilisés pour la préparation de la spiramycine, que ce soient des milieux à base de substances complexes mal définies ou des milieux purement synthétiques, la teneur en spiramycine I de la spiramycine produite reste assez importante. Il en résulte que l'obtention de spiramycines II et III exemptes de spiramycine I est assez difficile et se fait avec un rendement peu satisfaisant.
On a trouvé qu'en opérant dans des conditions appropriées S. ambofaciens ou ses mutants était capa ble de transformer la spiramycine I en spiramycine II et en spiramycine III par un processus enzymatique d'acétylation ou de propionylation.
Ces résultats sont obtenus selon le procédé de l'invention en effectuant la fermentation sur un mi lieu contenant de la spiramycine I en présence d'un agent d'acétylation et/ou de propionylation suivant que l'on veut obtenir de la spiramycine II ou de la spiramycine III ou leur mélange.
Comme agents d'acétylation on peut utiliser l'aci de acétique, ses sels, ses esters, l'acétamide. On peut également utiliser tout composé susceptible de donner naissance, après transformation par S. ambofaciens, à un radical acétylé comme par exemple l'acide buty rique et ses dérivés. Pour des raisons de commodité on emploie de préférence l'acide acétique ou l'acétate de sodium à une concentration comprise entre 0,1 et 30 g/1 dans le milieu de transformation.
Comme agents de propionylation on peut utiliser l'acide propionique, ses sels, ses esters, la propiona- mide, le propanol. On peut également utiliser tout composé susceptible de donner naissance, après son métabolisme par S. ambofaciens, à un radical pro- pionyle, comme l'acide valérianique ou ses sels.
Pour des raisons de simplicité, on emploie par exemple de préférence l'acide propionique ou ses sels ou la pro- pionamide à une concentration comprise entre 0,1 et 30 g/1 dans le milieu, la concentration optimum étant au voisinage de 2-15 g/1. Suivant les besoins on peut ajouter l'agent acylant en solution dans l'eau ou dans un solvant organique comme le méthanol, l'étha nol, l'acétone, le benzène, l'éther,
le dichloréthane. On peut également fractionner en plusieurs additions successives la quantité d'agent acylant à ajouter, sans qu'il en résulte des modifications importantes de la transformation recherchée.
Il a fallu préciser les différents facteurs qui favo risent la transformation biochimique de la spiramy- cine I en spiramycine II ou III et réaliser cette trans formation d'une manière pratique. Il faut en particu lier cultiver S. ambofaciens dans des conditions qui permettent à la fois son développement et l'élabora tion du système enzymatique. Il convient aussi d'utili ser la capacité transformatrice acquise par la culture en se plaçant dans les conditions requises pour la transformation recherchée.
A cette fin, on peut cultiver S. ambofaciens dans un milieu de culture renfermant dès le départ la spi- ramycine 1 à transformer ainsi que tous les facteurs nécessaires à la production du système enzymatique et à la transformation, par ce système, de la spira- mycine I présente en spiramycine II et 111.
Mais il a été trouvé particulièrement avantageux, pour réali ser la présente invention, de cultiver dans une pre mière phase S. ambofaciens dans des conditions telles qu'il élabore le système enzymatique acylant. Dans une deuxième phase, on utilise la capacité transforma trice acquise par le champignon en mettant son my célium en présence de la spiramycine I et des élé ments nécessaires à la transformation : substances susceptibles de fournir des radicaux acétyle ou pro- pionyle et les activateurs.
La culture de S. ambofaciens en vue de l'élabora tion du système enzymatique acylant peut être effec tuée sur des milieux très divers, en particulier sur les milieux qui sont utilisés habituellement pour la pré paration de la spiramycine : milieux complexes ou milieux synthétiques. Cependant la quantité et la qua lité du système enzymatique acylant peuvent varier dans une large mesure suivant la composition du milieu employé.
Aussi, pour obtenir un mycélium possédant une capacité élevée de transformation de la spiramycine I en spiramycine II et III, est-il pré férable de sélectionner très soigneusement les divers produits entrant dans la composition du milieu.
Il a été trouvé particulièrement avantageux d'em ployer un milieu synthétique ne renfermant qu'une source énergétique glucidique, une source d'azote am moniacal et des substances neutralisantes. On utilise de préférence le glucose ou l'amidon à des doses va- riant de 1 à 100 g/1, l'optimum étant compris entre 40 et 60 g/1. Parmi les sels ammoniacaux, on em ploie le chlorure, le sulfate ou le nitrate, la quantité d'azote ammoniacal pouvant varier entre 0,1 et 10 g/1, l'optimum étant situé entre 2 et 4 g/1.
Le pH de départ de la culture de S. ambofaciens doit être ajusté entre 5 et 9 de préférence entre 6,5 et 7,5 pour obtenir une bonne capacité de transfor mation de la spiramycine I.
Pour éviter une évolution du pH, dans le milieu de culture, vers des valeurs trop basses, qui pour raient être néfastes à une bonne production du sys tème enzymatique acylant, il convient d'ajouter dans le milieu de culture des substances neutralisantes au moment opportun et en quantité adéquate pour main tenir le pH à la valeur désirée.
On peut employer à cet usage des agents alcalins tels que les hydro- xydes et les carbonates des métaux alcalins et alcalino- terreux, en solution ou en suspension dans l'eau ; on peut aussi ajouter dès le départ de la culture une substance neutralisante de réserve telle que les car bonates insolubles de métaux alcalinoterreux. On em ploie de préférence le carbonate de calcium à des doses comprises entre 1 et<B>50</B> g/1, la dose optimum étant au voisinage de 25 g/1.
Il convient également de cultiver S. ambofaciens, dans des conditions de température bien définies, pour obtenir l'élaboration maximum du système en zymatique acylant. On pourra par exemple effectuer la culture entre 20 et 35,, mais de préférence à 23-27.
La culture de S. ambofaciens peut être effectuée dans les conditions habituellement requises pour la conduite des fermentations aérobies et plus spéciale ment dans tout appareil permettant à la fois une bonne dispersion de l'air nécessaire à la respiration du streptomyces et une bonne homogénéisation de la culture.
II a été trouvé que la capacité transformatrice des cultures de S. ambofaciens varie avec l'âge de la culture. Au début de celle-ci la capacité transforma trice est pratiquement proportionnelle à la quantité de mycélium présente dans la culture. Au bout d'un certain temps, la capacité transformatrice se fixe à une valeur maximum puis décroit ensuite, alors que le mycélium continue sa croissance. Dans la prati que il se trouve que le mycélium possède la capacité transformatrice maximum après 30 à 150 heures de culture, le plus souvent entre 40 et 100 heures, ce temps optimum dépendant essentiellement des con ditions générales de la culture.
Après avoir préparé, ainsi qu'il vient d'être dé crit, une culture de S. ambofaciens ou de ses mutants, en vue de l'élaboration du système enzymatique acy- lant qui transforme la spiramycine I en spiramycine Il et 111, il convient ensuite de placer le même strep tomyces dans des conditions judicieusement choisies pour utiliser ses capacités transformatrices et effec tuer la transformation recherchée. On peut alors ap porter à la culture, telle qu'elle a été obtenue, en même temps que la spiramycine I à transformer, les éléments nécessaires à cette-- transformation : les agents acylants et les activateurs.
On peut aussi iso ler, par tout moyen approprié, le mycélium de S. ambofaciens et le replacer ensuite dans un milieu adéquat de transformation contenant la spiramycine I, les agents acylants et les activateurs.
Or il a été trouvé que la proportion des produits de transformation de la spiramycine I varie d'une façon importante suivant la nature des radicaux acy les présente dans le milieu de transformation. En effet, les radicaux acyles à 3 atomes de carbone se fixent plus facilement sur la spiramycine I que sur les radicaux à 2 atomes de carbone. Chaque fois que les deux types de radicaux sont présents simultané ment dans le milieu de transformation, il y a utilisa tion préférentielle des radicaux à 3 atomes de car bone pour transformer la spiramycine I en spiramy- cine III.
On conçoit qu'il soit alors possible d'orienter spécifiquement la transformation de la spiramycine I en spiramycine III par l'apport judicieux de subs tances capables de fournir un excès de radical pro- pionyle. On conçoit aussi que la transformation spé cifique de la spiramycine I en spiramycine II ne puisse s'effectuer qu'en l'absence, dans le milieu de transformation, de toute substance susceptible de fournir le radical propionyle. Comme S.
ambofaciens élabore avec une très grande facilité et dans les mi lieux les plus divers les substances capables de four nir le radical propionyle, la transformation spécifi que de la spiramycine I en spiramycine II ne peut s'effectuer que dans des conditions très particulières.
Si l'on utilise directement comme milieu de trans formation les cultures effectuées en vue de l'élabo ration du système acylant, on obtient alors par l'addi tion d'agent propionylant de la spiramycine III pra tiquement pure. Mais par addition d'agent acétylant on transforme la spiramycine I seulement en un mé lange de spiramycine II et III, en raison de la pré sence dans le milieu de petites quantités d'agent pro- pionylant.
Si l'on sépare le mycélium de S. ambofaciens du milieu qui a servi à élaborer le système enzymati que acylant, il est alors possible d'orienter beaucoup plus spécifiquement la transformation de la spiramy- cine I. Il suffit en effet d'apporter au mycélium en plus des activateurs éventuels, les substances capables de fournir les radicaux acyles. Suivant la nature de ces dernières on obtient alors la spiramycine II, la spiramycine III ou un mélange des deux.
Ce procédé est particulièrement avantageux pour la production de la spiramycine II qui ne peut être obtenue qu'en présence de substances capables de fournir le radi cal acétyle, à l'exclusion de toute substance capable de fournir un radical propionyle en particulier de celles pouvant provenir du métabolisme de S. ambo- faciens.
La spiramycine I peut être employée à l'état pur, ou en mélange avec les spiramycines II et III, un tel mélange pouvant être obtenu par les procédés habi- tuels de fabrication de la spiramycine brute. On peut employer la spiramycine à l'état de base ou de sel et l'ajouter au milieu de transformation à l'état solide ou dissous.
Pour des commodités de manipulation, on peut employer par exemple la spiramycine à l'état de base en dissolution dans l'eau, le méthanol, l'étha nol, l'éther, l'acétone, le benzène, le dichloréthane. On peut également l'employer à l'état de sel et plus spécialement de chlorhydrate, de sulfate, d'acétate et de propionate, en solution aqueuse.
Il est préférable que la concentration des solu tions de spiramycine ajoutées dans le milieu de trans formation soit telle qu'il n'y ait pas une dilution trop importante de ce dernier milieu. La concentration finale en spiramycine I dans ce milieu de transforma tion peut varier entre 1 et 50 g/1 mais il est parti culièrement avantageux d'employer une concentra tion en spiramycine I voisine -de 5-20 g/1. Cette con centration peut être atteinte par une seule addition de spiramycine I ou par plusieurs additions fraction nées, sans qu'il en résulte des variations importantes dans le produit de transformation recherché.
Ainsi qu'il ressort des considérations précédentes, une culture de S. ambofaciens possédant le système enzymatique acylant additionné éventuellement d'agents acylants, permet à elle seule de réaliser la transformation enzymatique de la spiramycine I, ob jet de la présente invention.
L'addition de nombreux sels minéraux ou organi ques n'apporte pas de variations importantes dans la quantité de spiramycine I transformée. Cependant, il a été trouvé que certains anions et cations avaient un effet favorable sur la transformation de la spi- ramycine I en spiramycine II et III, soit en accé lérant la transformation, soit en augmentant la quan tité de spiramycine transformée.
Parmi les anions jouant le rôle d'activateur de la réaction enzymatique se trouve le chlore. On peut ajouter celui-ci sous forme de chlorures de .métaux alcalins, alcalinoterreux ou autres, à la condition que le métal ne soit pas un inhibiteur de la transforma tion. La quantité de chlore apportée au milieu sous forme de chlorure peut être comprise entre 0,1 et 20 g/l, la dose optimum se situant au voisinage de 1 à 3 g/1.
Parmi les cations susceptibles d'améliorer la réac tion de transformation, le magnésium, le fer et le cobalt sont particulièrement actifs, ce. dernier métal se comportant comme l'activateur de choix de la réac tion enzymatique d'acylation. On peut ajouter ces métaux sous forme de chlorure, sulfate, nitrate ou de tout autre sel ne gênant pas la réaction enzymati que.
On peut employer par exemple le magnésium et le fer à doses comprises entre 0,1 et 500 mg/1 dans le milieu de transformation, l'optimum se situant vers 5 à 10 mg/l. On peut employer le cobalt à des doses comprises entre 0,1 et 1000 mg/1 l'optimum se situant entre 10 et 400 mg/1.
Pour obtenir la transformation de la spiramycine I en spiramycine II et III, dans les meilleures condi- tuons possibles, il est donc nécessaire d'ajouter à la culture de S. ambofaciens possédant le système enzy matique acylant, la spiramycine I à transformer, les agents acylants et les activateurs.
L'addition de ces différents éléments peut être simultanée, mais elle peut être séparée dans le temps. Dans ce dernier cas il y a cependant intérêt à ajou ter la spiramycine I après les agents acylants et les activateurs si l'on veut orienter correctement la trans formation.
Enfin il a été trouvé avantageux dans certains cas d'ajouter, en même temps que la spiramycine I, les agents acylants et les activateurs, une source éner gétique, comme le glucose ou l'amidon.
Cela est im portant notamment dans le cas où l'on sépare le my célium de S. ambofaciens de son milieu de culture et où on le replace dans un milieu ne contenant que la spiramycine, les agents acylants et les activateurs. On peut ainsi ajouter le glucose ou l'amidon à une dose comprise entre 1 et 50 g/1, l'optimum se situant vers 10 g/1.
Dans le cas où l'on utilise, comme milieu de trans formation, la culture d'élaboration du système enzy matique acylant, l'addition des différents éléments se fait dans un milieu de culture de pH bien déterminé, généralement compris entre 5,0 et 8,0 et plus spéciale- ment entre 6,0 et 7,0.
Il peut être avantageux, pour effectuer la transformation dans les meilleures con ditions possibles, de modifier, dans certains cas, le pH de la culture au moment de l'addition des divers éléments. On emploie alors dans ce but diverses subs tances acides ou alcalines dont le choix est principale ment guidé par leurs propriétés inhibitrices éventuel les de la réaction de transformation. On utilise par exemple, les acides chlorhydrique, sulfurique, nitri que, acétique, propionique, citrique, les hydroxydes de sodium, de potassium, d'ammonium, de calcium, de baryum.
Dans le cas où l'on effectue la transformation en séparant le mycélium de S. ambofaciens du milieu d'élaboration du système enzymatique et en repla çant le mycélium en présence de la spiramycine, des agents acylants, des activateurs et des substances éner gétiques, il est également avantageux de se placer dans des conditions de pH bien définies. On peut ainsi régler le pH de 3,0 à 8,0 à l'aide des agents acidifiants ou alcalinisants précédemment cités.
On peut également régler le pH à l'aide de milieux tam pon, comme les mélanges acide acétique-acétate, aci de propionique-propionate, acide citrique-citrate, acide phtalique-phtalate.
Enfin, quel que soit le mode de transformation choisi, il peut être avantageux de corriger les varia tions éventuelles de pH qui se produisent au cours de la transformation par des additions appropriées d'agents acidifiants ou alcalinisants ou de mélange- tampon.
Pour la transformation de la spiramycine I en spiramycine II et III par S. ambofaciens on main- tient de préférence la culture de cet organisme dans des conditions parfaitement aérobies, on utilise de préférence la culture d'élaboration du système enzy matique ou le mycélium séparé de cette culture. II est donc avantageux, après addition des différents élé ments de maintenir le milieu de transformation dans des conditions d'aération et d'agitation voisines de ce qu'elles étaient pour la culture d'élaboration.
La température à laquelle s'effectue la transfor mation enzymatique acylante a, dans les conditions habituelles de travail, assez peu d'importance. On peut se placer à un.. température comprise entre 150 et 40o, la température optimum étant au voisinage de 25,).
La transformation de la spiramycine I en spira- mycine II et III est une transformation relativement rapide et en 24 heures une partie importante de la spiramycine I a déjà été transformée.
Pour l'obtention d'un rendement de transforma tion maximum, il convient cependant de maintenir dans certains cas un contact suffisant entre le sys tème enzymatique acylant, la spiramycine et les au tres éléments et plusieurs jours peuvent être alors né cessaires pour que l'évolution complète du système ait lieu.
Après avoir transformé ainsi qu'il vient d'être dé crit la spiramycine I en spiramycine II et III, celles- ci peuvent être séparées par des méthodes connues telles que distribution à contre-courant, chromato graphie sur alumine ou autres adsorbants, cristalli sation fractionnée.
Si on désire simplement connaître les proportions relatives des différentes spiramycines en cours ou en fin de transformation, il est commode d'appliquer la méthode de caractérisation par chro matographie sur papier aux milieux de transforma tion et de comparer les chromatogrammes obtenus à des chromatogrammes témoins correspondant à des quantités connues des différentes spiramycines isolées à l'état pur.
Les exemples 1 à 3 illustrent la transformation de spiramycine I produite in situ dans le milieu de fermentation utilisé pour la transformation, alors que les exemples 4 à 16 illustrent la transformation de spiramycine I, produite dans une fermentation séparée.
<I>Exemple 1</I> Un erlenmeyer de 2 litres est chargé avec 250 cm3 du milieu suivant
EMI0004.0072
Corn-steep <SEP> (50 <SEP> % <SEP> extrait <SEP> sec) <SEP> ...... <SEP> 40 <SEP> g
<tb> Glucose <SEP> .... <SEP> ....... <SEP> .......... <SEP> ... <SEP> 20 <SEP> g
<tb> Chlorure <SEP> de <SEP> sodium <SEP> . <SEP> ... <SEP> . <SEP> . <SEP> 5 <SEP> g
<tb> Sulfate <SEP> de <SEP> magnésium <SEP> .. <SEP> ..... <SEP> . <SEP> 1 <SEP> g
<tb> Eau <SEP> de <SEP> ville <SEP> <B>.... <SEP> ...... <SEP> ............... <SEP> ......... <SEP> .. <SEP> 1000</B> <SEP> cm3 Le pH est ajusté à 6,8 par de la soude et la charge est complétée par
EMI0004.0073
Carbonate <SEP> de <SEP> calcium <SEP> <B>------------ <SEP> -------</B> <SEP> . <SEP> .
<SEP> 5 <SEP> g
<tb> Huile <SEP> de <SEP> soja <SEP> <B>--------------- <SEP> ----- <SEP> ------------</B> <SEP> . <SEP> 4 <SEP> cm3 Ce milieu est stérilisé 45 minutes à 120 . Après refroidissement, on ensemence avec une culture sur gélose de la souche de Streptomyces ambofaciens NRRL 2420. La culture est mise à agiter sur une table à secousses pendant 48 heures.
D'autre part, des erlenmeyers de 300 cm3 sont chargés avec 50 cm3 du milieu suivant
EMI0005.0007
Corn-steep <SEP> (50 <SEP> % <SEP> extrait <SEP> sec) <SEP> ...... <SEP> 35 <SEP> g
<tb> Glucose <SEP> <B>...............</B> <SEP> .<B>--------------------------------</B> <SEP> 50 <SEP> g
<tb> Chlorure <SEP> de <SEP> sodium <SEP> .........-.............. <SEP> 20 <SEP> g
<tb> Phosphate <SEP> monopotassique <SEP> ............
<SEP> 2 <SEP> g
<tb> Sulfate <SEP> de <SEP> magnésium <SEP> <B>-------------</B> <SEP> .<B>----- <SEP> ----</B> <SEP> 1 <SEP> g
<tb> Eau <SEP> de <SEP> ville <SEP> -....<B>....</B> <SEP> .<B>............</B> <SEP> .<B>..................</B> <SEP> 1000 <SEP> cm3 Le pH est ajusté à 6,8 avec de la soude. On ajoute alors
EMI0005.0008
Carbonate <SEP> de <SEP> calcium <SEP> 5 <SEP> g On ajoute ensuite de la propionamide dans les proportions indiquées dans le tableau ci-dessous qui rassemble les résultats obtenus.
Les erlenmeyers sont stérilisés 20 minutes à 120e puis, après refroidissement, ensemencés avec 4 cm3 ide la culture en erlenmeyer die 2 litres, et mis à agiter à 25e sur table à secousses.
Les dosages et l'analyse de l'antibiotique sont effectués aux 6, 7 et Sème jours de culture afin de déterminer l'activité maximum et les proportions respectives des 3 spira- mycines.
EMI0005.0015
Teneur
<tb> du <SEP> <B>milieu <SEP> en</B> <SEP> Activité <SEP> Proportion <SEP> en <SEP> poids <SEP> des
<tb> propionamide <SEP> maximum <SEP> spiramycines
<tb> g/1 <SEP> mcg/cm3 <SEP> /o
<tb> I <SEP> II <SEP> III
<tb> 0 <SEP> 285 <SEP> 51 <SEP> 26 <SEP> 23
<tb> 1 <SEP> 205 <SEP> 27 <SEP> 18 <SEP> 55
<tb> 2 <SEP> 175 <SEP> 24 <SEP> 10 <SEP> 66
<tb> <I>4 <SEP> 150</I> <SEP> 15 <SEP> 7 <SEP> 78 <I>Exemple 2</I> Dans un fermenteur de 170 litres on charge
EMI0005.0016
Corn-steep <SEP> (50 <SEP> % <SEP> extrait <SEP> sec) <SEP> 4,
800 <SEP> kg
<tb> Glucose <SEP> <B>............. <SEP> ......................</B> <SEP> ... <SEP> 2,400 <SEP> kg
<tb> Chlorure <SEP> de <SEP> sodium <SEP> .................. <SEP> 0,600 <SEP> kg
<tb> Sulfate <SEP> de <SEP> magnésium <SEP> <B>_. <SEP> ---------</B> <SEP> 0,120 <SEP> kg
<tb> Eau <SEP> de <SEP> ville <SEP> ._..<B>.................... <SEP> .....</B> <SEP> 100 <SEP> litres Le pH est ajusté à 6,8 par de la soude et la charge est complétée par
EMI0005.0017
Carbonate <SEP> de <SEP> calcium <SEP> 0,600 <SEP> kg
<tb> Huile <SEP> de <SEP> soja <SEP> <B>...........................
<SEP> ..</B> <SEP> 0,480 <SEP> 1 Le milieu est stérilisé à 120e pendant 45 minutes. Après mise en température à 25e, le milieu est ense mencé avec 250 cm2 d'une culture en erlenmeyer agité de S. ambofaciens. La culture en fermenteur est aérée et agitée pen dant 25 heures et sert à ensemencer la culture pro ductrice. Celle-ci est effectuée en fermenteur de 30 litres chargé avec le milieu suivant Autolysat de levure<B>..................
.....</B> 300 g Glucose ...... ......................................... 750 g Propionamide <B>...........................</B> _...... 30 g Chlorure de sodium<B>............ ...........</B> 300 g Sulfate de magnésium<B>...... ...........</B> 15 g Phosphate monopotassique ...... 15 g Eau de ville<B>....................</B> .<B>---------</B> __ 16,5 litres Le pH est ajusté à 6,5 par de la soude.
La charge est complétée avec
EMI0005.0030
Carbonate <SEP> de <SEP> calcium <SEP> <B>....</B> <SEP> .<B>------</B> <SEP> .<B>------</B> <SEP> 75 <SEP> g
<tb> Huile <SEP> de <SEP> soja <SEP> <B>.....</B> <SEP> -<B>...............</B> <SEP> .......<B>.......</B> <SEP> 60 <SEP> cm3 Le milieu est stérilisé pendant 40 minutes à 120 . Après refroidissement le volume est de 15 litres et le pH de 6,8.
Le milieu est alors ensemencé par transfert de 2 litres de culture inoculum en fermenteur de<B>170</B> litres, puis agité par une turbine tournant à 550 t/min aéré avec 1 m3/heure d'air et maintenu à 25e: Dès le début de l'opération le pH descend régu lièrement pour atteindre 5,6 vers 60 heures : cette phase correspond exactement à la consommation du glucose. Le pH remonte ensuite lentement jusqu'à 90 heures (6,2) puis très brutalement: il passe à 7 à 100 heures.
L'activité finale du moût est de 645 mcg/cm3. La proportion respective en poids des trois spiramycines produites est la suivante
EMI0005.0039
<B>1</B>: <SEP> 12% <SEP> II: <SEP> 13% <SEP> <B>111</B>: <SEP> 75% Une opération réalisée parallèlement sur le même milieu mais sans propionamide a donné en 120 heu res, une activité de 760 mcg/cm3, avec la répartition suivante
EMI0005.0042
I: <SEP> 24 <SEP> % <SEP> <B>Il:</B> <SEP> 53 <SEP> % <SEP> III <SEP> : <SEP> 23 <SEP> % <I>Exemple 3</I> La culture inoculum est effectuée comme dans l'exemple II.
La culture productrice est effectuée cette fois en fermenteur de 800 litres, chargé avec le mi lieu suivant
EMI0005.0046
Amidon <SEP> <B>...... <SEP> ............................ <SEP> ......</B> <SEP> 16 <SEP> kg
<tb> Chlorure <SEP> d'ammonium <SEP> <B>... <SEP> ........</B> <SEP> 1,600 <SEP> kg
<tb> Propionamide <SEP> .............................. <SEP> 1,600 <SEP> kg
<tb> Chlorure <SEP> de <SEP> potassium <SEP> ...<B>.......</B> <SEP> . <SEP> 1,200 <SEP> kg
<tb> Chlorure <SEP> de <SEP> sodium <SEP> <B>...- <SEP> .............</B> <SEP> 6,800 <SEP> kg
<tb> Phosphate <SEP> monopotassique <SEP> <B>------</B> <SEP> 2 <SEP> kg
<tb> Sulfate <SEP> de <SEP> magnésium <SEP> <B>....... <SEP> ....</B> <SEP> 0,400 <SEP> kg
<tb> Acide <SEP> citrique <SEP> <B>......... <SEP> - <SEP> ...........
<SEP> .......</B> <SEP> 0,400 <SEP> kg
<tb> Sulfate <SEP> de <SEP> zinc <SEP> à <SEP> 7 <SEP> OH2 <SEP> ............ <SEP> 40 <SEP> g
<tb> Chlorure <SEP> de <SEP> cobalt <SEP> à <SEP> 6 <SEP> OH, <SEP> 0,12 <SEP> g
<tb> Eau <SEP> de <SEP> ville <SEP> <B>... <SEP> ................................</B> <SEP> 370 <SEP> litres Le pH est ajusté à 6,7 par addition de 1450<I>ce</I> de soude à 360 Bé. La charge est complétée par
EMI0006.0002
Carbonate <SEP> de <SEP> calcium <SEP> <B>..................</B> <SEP> 2 <SEP> kg
<tb> Huile <SEP> de <SEP> soja <SEP> <B>........</B> <SEP> .<B>.......</B> <SEP> .<B>...................</B> <SEP> 1600 <SEP> ce Le milieu est stérilisé par barbotage de vapeur 40 minutes à 1200.
Après refroidissement le volume est de 400 litres et le pH de 6,7. Le milieu est alors ensemencé par transfert de 40 litres de culture inocu- lum en fermenteur de 170 litres, puis agité par une turbine tournant à 205 t/min, aéré avec 15 m3/heure d'air et maintenu à 25o. Après 150 heures de culture l'activité du moût est maximum: 660 meg/cm3. La proportion respective en poids des trois spiramycines produites est la suivante
EMI0006.0012
1: <SEP> 17% <SEP> 11: <SEP> 8% <SEP> III:
<SEP> 75% <I>Exemple 4</I> Un erlenmeyer de 2 litres est chargé avec 250 cm3 du milieu suivant
EMI0006.0016
Corn-steep <SEP> (50 <SEP> % <SEP> d'extrait <SEP> sec) <SEP> <B>......</B> <SEP> 40 <SEP> g
<tb> Amidon <SEP> <B>.................</B> <SEP> ....__<B>--------------------</B> <SEP> . <SEP> 20 <SEP> g
<tb> Chlorure <SEP> de <SEP> sodium <SEP> <B>....</B> <SEP> .<B>--------</B> <SEP> ....<B>-------</B> <SEP> 5 <SEP> g
<tb> Sulfate <SEP> de <SEP> magnésium <SEP> <B>........</B> <SEP> .<B>...............</B> <SEP> 1 <SEP> g
<tb> Phosphate <SEP> monopotassique <SEP> <B>............</B> <SEP> 2 <SEP> g
<tb> Eau <SEP> de <SEP> ville <SEP> .....<B>.........</B> <SEP> .._...<B>....</B> <SEP> ...... <SEP> q.s.p.
<SEP> 1000 <SEP> ce Le pH est ajusté à 6,8 par de la soude et l'on ajoute au milieu
EMI0006.0017
Carbonate <SEP> de <SEP> calcium <SEP> <B>- <SEP> - <SEP> -----------</B> <SEP> 5 <SEP> g Ce milieu est stérilisé 45 minutes à 1200. Après refroidissement on ensemence avec une culture sur gélose de la souche S. ambofaciens. La culture est mise à agiter sur une table à secousses pendant 48 heures à 250.
Par ailleurs, des erlenmeyers de 300 ce sont chargés avec 40 ce du milieu suivant
EMI0006.0021
Corn-steep <SEP> (50 <SEP> % <SEP> d'extrait <SEP> sec) <SEP> 45 <SEP> g
<tb> Glucose <SEP> .__..._._..-<B>........................</B> <SEP> .<B>.........</B> <SEP> 50 <SEP> g
<tb> Carbonate <SEP> de <SEP> calcium <SEP> <B>-</B> <SEP> 25 <SEP> g
<tb> Eau <SEP> de <SEP> ville <SEP> <B>....</B> <SEP> .....<B>..........</B> <SEP> ......<B>.....</B> <SEP> q.s.p. <SEP> 1000 <SEP> <I>ce</I> Le pH du milieu est ajusté à 7,0 avec de la soude.
Le milieu est ensuite stérilisé 30 minutes à 120 . Après refroidissement, on ensemence le contenu de chaque erlenmeyer avec 4 ce de la culture inocu- lum précédente. La culture est mise à agiter sur une table à secousses à 250. Après 48 heures le dévelop pement du champignon est excellent.
On ajoute alors à chaque erlenmeyer 20 ce d'une solution aqueuse stérile contenant 12 g/1 de @spiramycine I pure à l'état de base et 6 g/1 de propionate de sodium.
On maintient l'agitation de la culture pendant 24 heures, puis on mélange le contenu de tous les erlenmeyers. L'analyse chromatographique du bouillon montre que ce dernier renferme 2,6 g/1 de spiramycine I non transformée et 1,4 g/1 d'un mélange contenant 20 % de spiramycine II et 80 % de spiramycine III.
<I>Exemple 5</I> Des erlenmeyers de 300 ce sont chargés avec 40 ce du milieu suivant
EMI0006.0043
Extrait <SEP> de <SEP> levure <SEP> 30 <SEP> g
<tb> Glucose <SEP> ...................... <SEP> . <SEP> .. <SEP> <B>........ <SEP> 50</B> <SEP> g
<tb> Carbonate <SEP> de <SEP> calcium <SEP> .... <SEP> .. <SEP> .............. <SEP> 25 <SEP> g
<tb> Eau <SEP> de <SEP> ville <SEP> ... <SEP> <B>------ <SEP> ------</B> <SEP> .. <SEP> q.s.p. <SEP> 1000 <SEP> cm3 Le pH du milieu est ajusté à 7,0 avant l'addition de carbonate de calcium.
Le milieu est ensuite stéri lisé 30 minutes à 120o. Après refroidissement le con tenu de chaque erlenmeyer est ensemencé avec 4 cm' d'une culture inoculum préparée dans les conditions décrites à l'exemple 4. La culture est mise à agiter sur une table à secousses à 25o. Après 48 heures de développement, on ajoute dans chaque erlenmeyer 20 ce d'une solution aqueuse stérile contenant 12 g/1 de spiramycine I pure à l'état de base et 6 g/1 de propionate de sodium. On laisse incuber la culture sur la table à secousses pendant 3 jours.
Après ce temps, le contenu des erlenmeyers est mélangé. L'analyse chromatographique du bouillon de culture montre qu'il y a encore 2,1 g/1 de spiramycine I non transformée et 1,9 g/1 de spiramycine I transformée en un mélange contenant 6 % de spiramycine II et 94 % de spiramycine III.
<I>Exemple 6</I> Des erlenmeyers de 300 cm3 sont chargés avec 40 ce du milieu suivant
EMI0006.0061
Chlorure <SEP> d'ammonium <SEP> .. <SEP> .. <SEP> 6 <SEP> g
<tb> Glucose <SEP> .. <SEP> . <SEP> ............. <SEP> . <SEP> ...25 <SEP> g
<tb> Carbonate <SEP> de <SEP> calcium <SEP> .... <SEP> ... <SEP> .... <SEP> ....... <SEP> 20 <SEP> g
<tb> Eau <SEP> de <SEP> ville <SEP> .. <SEP> ................ <SEP> ... <SEP> .... <SEP> q.s.p. <SEP> 1000 <SEP> ce Ces erlenmeyers sont stérilisés, ensemencés et cul tivés dans les conditions décrites à l'exemple 5.
Après 48 heures de culture, on ajoute à chaque erlenmeyer 20 ce d'une solution aqueuse stérile contenant 9 g/1 de spiramycine I pure à l'état de base, et 21 g/1 de propionamide.
Après 3 jours d'incubation l'analyse chromato- graphique du bouillon montre que 1,86 g/1 de spi- ramycine I ont été transformés en un mélange con tenant 55 % de spiramycine II et 45 % de spiramy- cine III. Il reste par ailleurs 1,14 g/1 de spiramycine I non transformée.
<I>Exemple 7</I> Une culture de S. ambofaciens est effectuée dans les conditions décrites à l'exemple 6. La solution qui contient la spiramycine base renferme en outre 6 g/1 de propionate de sodium. On trouve, d'après la chro matographie sur papier du bouillon de culture, qu'il reste 0,96 g/1 de spiramycine I non transformée et que 2,04 g/1 de spiramycine 1 ont été transformés en un mélange contenant 11 % de spiramycine II et 89 % de spiramycine III.
<I>Exemple 8</I> Des erlenmeyers de 300 ce sont chargés avec 40 ce du milieu suivant
EMI0007.0002
Chlorure <SEP> d'ammonium <SEP> ..<B>-----------</B> <SEP> .. <SEP> 10 <SEP> g
<tb> Glucose <SEP> .<B>---------------</B> <SEP> .<B>..................</B> <SEP> ...<B>.....</B> <SEP> 50 <SEP> g
<tb> Carbonate <SEP> de <SEP> calcium <SEP> ....................... <SEP> 25 <SEP> g
<tb> Eau <SEP> de <SEP> ville <SEP> ...<B>--------------------- <SEP> -----</B> <SEP> q.s.p. <SEP> 1000 <SEP> <I>ce</I> Ces erlenmeyers sont stérilisés, ensemencés et cul tivés dans les conditions décrites à l'exemple 5.
Après 48 heures de culture, on ajoute dans chaque erlen- meyer 20 cm3 d'une solution aqueuse stérile renfer mant 12 g/1 de spiramycine I pure à l'état de base et 6 gll de propionate de sodium. Les erlenmeyers sont alors divisés en quatre lots. Le premier lot reste tel quel. Dans les trois autres lots sont ajoutés res pectivement du sulfate de magnésium, du sulfate fer reux et du chlorure de cobalt, les additions de ces sels étant telles que chaque métal se trouve à la con centration de 1 millimolécule par litre dans le mi lieu de transformation.
Après 3 jours d'incubation, les erlenmeyers de chaque lot sont mélangés entre eux et leur contenu est analysé par chromatographie sur papier. Les résultats de l'analyse sont les sui vants
EMI0007.0014
Quantité <SEP> de
<tb> Activateur <SEP> spiramycine <SEP> I <SEP> Proportions <SEP> des <SEP> spiramycines
<tb> transformée <SEP> /o
<tb> g/1 <SEP> II <SEP> III
<tb> 0 <SEP> 1,88 <SEP> 21 <SEP> 79
<tb> magnésium <SEP> 2,12 <SEP> 28 <SEP> 72
<tb> fer <SEP> 2,32 <SEP> 30 <SEP> 70
<tb> cobalt <SEP> 2,80 <SEP> 27 <SEP> 73 <I>Exemple 9</I> Des erhnmeyers de 300 cm-3 sont chargés, stérili sés, ensemencés et cultivés dans les conditions décri tes à l'exemple 8.
Après 48 heures de culture les er- lenmeyers sont divisés en deux lots. Chaque erlen- meyer du premier lot reçoit 20 cm3 d'une solution aqueuse stérile renfermant 12 g/1 de spiramycine I pure à l'état de base et 6 g/1 de propionate de sodium. Chaque erlenmeyer du second lot reçoit 20 cm' de la même solution à laquelle ont été ajoutés 30 g/1 de chlorure de sodium.
Chaque lot d'erlenmeyers est traité comme précédemment et le résultat de l'ana lyse chromatographique est le suivant
EMI0007.0029
Quantité <SEP> de
<tb> CINa <SEP> spiramycine <SEP> <B>I</B> <SEP> Proportions <SEP> des <SEP> spiramycines
<tb> g/1 <SEP> transformée <SEP> /a
<tb> g(1 <SEP> II <SEP> III
<tb> 0 <SEP> 1,88 <SEP> 21 <SEP> 79
<tb> 10 <SEP> 2,60 <SEP> 23 <SEP> 77 <I>Exemple 10</I> Des erlemneyers de 300 cm3 sont chargés avec 50 ce du milieu suivant
EMI0007.0033
Chlorure <SEP> d'ammonium <SEP> <B>........... <SEP> ......</B> <SEP> 10 <SEP> g
<tb> Glucose <SEP> <B>, <SEP> ..................... <SEP> <SEP> .......................
<SEP> _</B> <SEP> 50 <SEP> g
<tb> Carbonate <SEP> de <SEP> calcium <SEP> <B>-------------- <SEP> ---------</B> <SEP> 25 <SEP> g
<tb> Eau <SEP> de <SEP> ville <SEP> <B>.............. <SEP> ....... <SEP> _ <SEP> .....</B> <SEP> q.s.p. <SEP> 1000 <SEP> cm3 Ces erlenmeyers sont stérilisés, ensemencés et cul tivés dans les conditions décrites à l'exemple 5.
Après 52 heures de culture, chaque erlenmeyer reçoit 1 cm-3 d'une solution à 15 % de propionate de sodium, puis on divise les erlemneyers en deux lots. Chaque erlenmeyer du premier lot reçoit 2 cm2 d'une solution à 15 % de spiramycine I pure, à l'état de base dans le méthanol. Chaque erlenmeyer du se cond lot reçoit une solution de même composition mais dans l'acétone. On laisse la culture incuber 72 heures sur la table à secousses.
Le contenu des erlen- meyers d'un même lot est réuni et analysé chromato- graphiquement. Les résultats de la transformation sont les suivants
EMI0007.0049
Quantité <SEP> de
<tb> spiramycine <SEP> <B>I</B> <SEP> Proportions <SEP> des <SEP> spiramycines
<tb> Solvant <SEP> transformée <SEP> "/o
<tb> g/1 <SEP> II <SEP> III
<tb> Méthanol <SEP> 3,48 <SEP> 24 <SEP> 76
<tb> Acétone <SEP> 3,36 <SEP> 27 <SEP> 73 <I>Exemple 11</I> Des erlemneyers de 300 cm3 sont chargés comme dans l'exemple précédent,
stérilisés 30 minutes à l20 et ensemencés chacun avec 6 cms d'une culture inocu- lum préparée comme il est dit dans l'exemple 4. Les erlenmeyers sont mis en incubation sur une table à secousses à 250. Les erlemneyers sont divisés en 3 lots.
Après 48 heures de culture, chaque erlenmeyer du premier lot reçoit 2 cm3 d'une solution à 15 % dans le méthanol de spiramycine 1 pure à l'état de base et 1 cm3 d'une solution aqueuse à 15 % de propionate de sodium. Les mêmes additions sont fai tes dans chacun des erlemneyers des deux autres lots, mais respectivement après 72 et 96 heures de cul ture. La culture est, dans chaque cas, poursuivie trois jours après l'addition de spiramycine. Le contenu des erlemneyers d'un même lot est analysé par chro matographie sur papier.
Le tableau suivant indique les résultats de l'analyse
EMI0007.0069
Addition <SEP> Quantité <SEP> de
<tb> de <SEP> spiramycine <SEP> I <SEP> Proportions <SEP> des <SEP> spiramycines
<tb> spiramycine <SEP> transformée <SEP> "/o
<tb> heures <SEP> g/1 <SEP> II <SEP> III
<tb> 48 <SEP> 3,00 <SEP> 16 <SEP> 84
<tb> 72 <SEP> 3,06 <SEP> 18 <SEP> 82
<tb> 96 <SEP> 1,62 <SEP> 28 <SEP> 72 <I>Exemple 12</I> Des erlenmeyers de 300 cm3 sont chargés avec 50 cm3 du milieu suivant
EMI0008.0005
Nitrate <SEP> d'ammonium <SEP> _._.....<B>........</B> <SEP> .._..... <SEP> 13 <SEP> g
<tb> Glucose <SEP> <B>........</B> <SEP> .<B>.................</B> <SEP> -<B>................</B> <SEP> ....
<SEP> 50 <SEP> g
<tb> Carbonate <SEP> de <SEP> calcium.....,-, <SEP> ................ <SEP> 25 <SEP> g
<tb> Eau <SEP> de <SEP> ville <SEP> ....<B>....</B> <SEP> .<B>.......</B> <SEP> ..._.......... <SEP> q.s.p. <SEP> 1000 <SEP> cm3 Les erlenmeyers sont stérilisés 30 minutes à 120 , refroidis et ensemencés avec 5 cm3 d'une culture inoculum dont la préparation est décrite à l'exemple 4.
Après trois jours de culture à 250 sur une table à secousses, on ajoute dans, chaque erlemneyer 5 cm3 d'une solution aqueuse renfermant 100 g/1 de spira- mycine I pure à l'état de base, 38 gIl d'acide pro pionique, 10 g/1 de chlorure de cobalt hexahydraté et dont le pH a été ramené à 6,5 par addition de soude.
On laisse la culture se poursuivre trois jours supplémentaires et on analyse le contenu des erlen- meyers par chromatographie sur papier. 8,70 g/:1 de spiramycine I ont été transformés en un mélange contenant 9 % de spiramycine II et 91 % de spira- mycine III.
<I>Exemple 13</I> Des erlenmeyers de 300 cm3 sont chargés avec 50 cm3 du milieu suivant
EMI0008.0030
Nitrate <SEP> d'ammonium <SEP> .......<B>............</B> <SEP> .... <SEP> 20 <SEP> g
<tb> Amidon <SEP> <B>...........</B> <SEP> __........<B>........</B> <SEP> .<B>..............</B> <SEP> . <SEP> 60 <SEP> g
<tb> Carbonate <SEP> de <SEP> calcium <SEP> ........................ <SEP> 25 <SEP> g
<tb> Eau <SEP> de <SEP> ville <SEP> ......... <SEP> .............. <SEP> q.s.p. <SEP> 1000 <SEP> <I>ce <SEP> -</I> Les erlenmeyers sont stérilisés, ensemencés et mis à incuber dans les conditions décrites à l'exemple 5.
Après 96 heures de culture, on ajoute dans chaque erlenmeyer 5 cm3 d'une solution aqueuse contenant 140 gIl d'une spiramycine brute à l'état de base (composée respectivement de 59, 27 et 14 % de spi- ramycine I, II et III), 56 g/1 d'acide propionique, 0,5 g/1 de chlorure de cobalt hexahydraté et rame née à pH 6,5 à l'aide de lessive de soude.
On laisse la culture se poursuivre pendant 3 jours et on ana lyse chromatographiquement le contenu des erlen- meyers. Sur les 8,26 g/1 de spiramycine I ajoutés, 6,30 g/1 ont été transformés en un mélange contenant 13 % de spiramycine II et 87 % de spiramycine III.
<I>Exemple 14</I> Deux erlenmeyers de 300 cm3 sont chargés avec 50 cm3 du milieu suivant
EMI0008.0052
Chlorure <SEP> d'ammonium <SEP> <B>............ <SEP> .....</B> <SEP> 10 <SEP> g
<tb> Glucose <SEP> <B>................................................</B> <SEP> 50 <SEP> g
<tb> Carbonate <SEP> de <SEP> calcium <SEP> ...<B>.....................</B> <SEP> 25 <SEP> g
<tb> Eau <SEP> de <SEP> ville <SEP> <B>..................... <SEP> ........</B> <SEP> q.s.p. <SEP> 1000 <SEP> cm3 Les erlenmeyers sont stérilisés, ensemencés et mis à incuber dans les conditions décrites à l'exemple 5.
Après 72 heures de culture, le contenu des erlen- meyers est centrifugé et on élimine le liquide surna- geant. La moitié du culot de centrifugation est remis en suspension dans 50 cm3 d'une solution aqueuse placée dans un erlenmeyer de 300 cm3 et contenant 6 g/1 de spiramycine I pure à l'état de base, 2,3 g/1 d'acide propionique, 1 g/1 de chlorure de cobalt he- xahydraté et ramenée à pH 6,5 par addition de les sive de soude.
L'autre moitié du culot de centrifuga tion est remis en suspension dans 50 cm3 d'une solu tion aqueuse de même composition mais renfermant en plus 10 g/1 de glucose.
Les deux erlenmeyers contenant la suspension de mycélium sont mis à incuber à 25o sur une table à secousses pendant 2 jours. Après ce temps le contenu de chacun des erlenmeyers est analysé par chromato graphie.
Les résultats de la transformation sont les suivants
EMI0008.0072
Quantité <SEP> de
<tb> spiramycine <SEP> <B>I</B> <SEP> Proportions <SEP> des <SEP> spiramycines
<tb> transformée <SEP> o/o
<tb> <B><I>gIl</I> <SEP> <U>il</U> <SEP> III</B>
<tb> Sans <SEP> glucose <SEP> 2,22 <SEP> 14 <SEP> 86
<tb> Avec <SEP> glucose <SEP> 3,70 <SEP> 14 <SEP> 86 <I>Exemple 15</I> Un erlenmeyer de 300 cm3 est chargé avec 50 cm@ du milieu suivant
EMI0008.0076
Chlorure <SEP> d'ammonium..................... <SEP> 10 <SEP> g
<tb> Glucose <SEP> ._<B>--------- <SEP> --------</B> <SEP> .<B>------</B> <SEP> -..........<B>-----</B> <SEP> 50 <SEP> g
<tb> Carbonate <SEP> de <SEP> calcium <SEP> <B>----------------</B> <SEP> ..._.
<SEP> 25 <SEP> g
<tb> Eau <SEP> de <SEP> ville <SEP> <B>----------------- <SEP> ------------</B> <SEP> q.s.p. <SEP> 1000 <SEP> <I>ce</I> L'erlenmeyer est stérilisé, ensemencé et mis à incuber dans les conditions décrites à l'exemple 5. Après 72 heures de culture, le contenu de l'erlen- meyer est centrifugé et le liquide surnageant est éli miné.
Le culot de centrifugation est remis en sus pension dans 50 cm; d'une solution tampon chargée dans un erlenmeyer de 300 cm3. Cette solution tam pon contient 9,85 g/1 d'acide acétique cristallisable, et 4,9 gIl d'acétate de sodium. Elle a un pH de 4. Elle contient en outre 6,45 g/1 -de chlorhydrate de spiramycine I pure et 1 g/1 de chlorure de cobalt hexahydraté. L'erlenmeyer contenant la suspension de mycélium est mis à incuber à 25o sur une table à secousses pendant 80 heures.
On analyse alors par chromatographie sur papier le contenu de l'erlen- meyer. On trouve ainsi que 2,40 gIl de spiramycine I ont été transformés en un mélange contenant 90 % de spiramycine II et 10 % de spiramycine <B>111.</B>
<I>Exemple 16</I> Dans un fermenteur de 170 litres on charge suc cessivement
EMI0008.0097
Corn-steep <SEP> (50 <SEP> % <SEP> d'extrait <SEP> sec) <SEP> 4800 <SEP> g
<tb> Amidon <SEP> <B>....................... <SEP> ------------------------</B> <SEP> 2400 <SEP> g
<tb> Chlorure <SEP> de <SEP> sodium <SEP> ........................ <SEP> 600 <SEP> g
<tb> Sulfate <SEP> de <SEP> magnésium <SEP> <B>------ <SEP> --- <SEP> -------</B> <SEP> 120 <SEP> g
<tb> Phosphate <SEP> monopotassique <SEP> 240 <SEP> g
<tb> Eau <SEP> de <SEP> ville <SEP> <B>......................... <SEP> ..........</B> <SEP> 100 <SEP> 1 Le pH est ajusté à 6,7 avec 750 cm2 de lessive de soude à 400 g/1 NaOH. On ajoute ensuite
EMI0009.0003
Carbonate <SEP> de <SEP> calcium <SEP> <B>...
<SEP> --------------------</B> <SEP> 600 <SEP> g
<tb> Huile <SEP> de <SEP> soja <SEP> .................................... <SEP> 60 <SEP> em3
<tb> Antimousse <SEP> au <SEP> silicone <SEP> .................. <SEP> 60 <SEP> cm3 Le fermenteur et son contenu sont stérilisés par barbotage de vapeur 40 minutes à 1220, ce qui amè ne le volume final à 120 litres. Après refroidisse ment et mise en température à 250, le fermenteur est ensemencé avec les 250 cm3 d'une culture inocu- lum préparée comme il a été dit dans l'exemple 4. Le milieu est ensuite agité par une hélice tournant à 350 t/min et aéré par 5 m3/h d'air.
Après 23 heu res de culture le développement de S. ambofaciens est abondant.
On charge par ailleurs dans un fermenteur de 30 litres
EMI0009.0010
Chlorure <SEP> d'ammonium <SEP> <B>---- <SEP> -------------</B> <SEP> 150 <SEP> g
<tb> Glucose <SEP> hydraté <SEP> <B>.................... <SEP> ---------</B> <SEP> 750 <SEP> g
<tb> Eau <SEP> de <SEP> ville <SEP> <B>..................................</B> <SEP> .<B>----</B> <SEP> _ <SEP> 14 <SEP> 1 Le fermenteur et son contenu sont stérilisés 40 minutes à 1220. Après refroidissement et mise en température à 25 , on ajoute 375 g de carbonate de calcium en suspension stérile dans 2 litres d'eau, ce qui amène le volume du milieu à 15 litres. Le pH est alors de 7,5.
On ensemence avec 1,5 litre de la culture inocu- lum en fermenteur de 170 litres, décrite précédem ment et âgée de 23 heures. On agite le milieu avec une hélice tournant à 550 t/min et on aère à raison d'un in-/h d'air. Après 48 heures de culture, S. am- bofaciens présente un bon développement et le mi lieu de culture a un pH de 6,5.
On ajoute alors au milieu une solution aqueuse composée de
EMI0009.0020
Spiramycine <SEP> base <SEP> <B>-------------------- <SEP> ---------</B> <SEP> 150 <SEP> g
<tb> Propionate <SEP> de <SEP> sodium <SEP> _....<B>-----------</B> <SEP> 19 <SEP> g
<tb> Chlorure <SEP> de <SEP> cobalt <SEP> hexahydraté <SEP> 17 <SEP> g
<tb> Solution <SEP> N <SEP> d'acide <SEP> propionique <SEP> 300 <SEP> cm3
<tb> Eau <SEP> distillée <SEP> <B>.... <SEP> .....</B> <SEP> ........... <SEP> .... <SEP> 1000 <SEP> cm3 La spiramycine base employée est un produit brut qui contient respectivement 65, 23 et 12 % de spiramycine I, II et III.
On poursuit la culture dans les mêmes conditions de température, d'agitation et d'aération pendant 90 heures. On vidange alors le fermenteur et on obtient 13,75 litres de bouillon. La chromatographie sur pa pier du bouillon montre que toute la spiramycine I a été transformée en un mélange de spiramycine II et III, leurs proportions respectives étant de 29 et 71 % dans le produit final. L'extraction du bouillon per met d'obtenir 122 g de spiramycine base composée de 25 % et 75 % de spiramycines II et III.