Procédé de préparation d'un nouvel antibiotique L'invention est relative à un procédé de préparation d'un nouvel antibiotique utile, que l'on propose d'appeler anisomycine et qui est vendu sous la marque Flagecidin . L'anti biotique peut se présenter sous la forme d'un produit dilué, d'un concentras brut et à l'état cristallisé pur. Il est particulièrement utile pour combattre des micro-organismes patho gènes, plus spécialement des champignons et des protozoaires.
Le procédé selon l'invention pour la prépa ration de ce nouvel antibiotique ayant un point de fusion de 140 - 1410 C, des maximums d'absorption dans l'ultra-violet à 224, 277 et 283,5 m#t et des pointes caractéristiques dans son spectre infrarouge aux fréquences 3545, 3450, 3320, 2890, 2800, 1725, 1610, 1582, 15<B>1</B>5, 1470, 1447, 1380, 1320, 1302, 1242, <B>1178,</B> 1036 et 962 cm-' est caractérisé en ce qu'on cultive une espèce de Streptomyces pro duisant cet antibiotique, dans des conditions d'aérobiose submergée.
Comme micro-organisme du genre Strepto myces produisant ce nouvel antibiotique, on peut utiliser le Streptomyces griseolus ou le Streptomyces roseochromogenus. Deux non- velles souches, particulièrement appropriées, de ces micro-organismes ont été identifiées par culture dans des milieux types utilisés normale ment pour une telle identification et leurs ca ractéristiques ont été comparées à celles dé crites dans le traité de Bergey Manual of Déterminative Bacteriology , 6e édition (1948).
La nouvelle souche de S. griseolus est désignée par le No- 14576-4 dans la collection des cul tures de Chas. Pfizer & Co., Inc., Brooklyn, N.Y. Une culture de cette souche fut déposée à l' American Type Culture Collection Washington, D.C. et ajoutée sous le No ATCC <I>11796</I> à sa collection permanente de micro organismes.
La nouvelle souche de S. roseo- chromogenus est désignée par le No 15855-4, dans la collection des cultures de Chas. Pfizer & Co., Inc., Brooklyn, N.Y.
Les caractéristiques de la nouvelle souche de S. griseolus sont indiquées dans le tableau 1 ci-dessous. A moins qu'on ne le spécifie au trement, les résultats sont basés sur six essais de culture identiques inoculés pendant deux semaines.
Les couleurs accompagnées de la lettre R sont celles indiquées dans le traité de Ridgway Color Standards and Nomencla ture .
EMI0002.0001
<U>Tableau <SEP> I</U>
<tb> <I>Streptomyces <SEP> griseolus, <SEP> ATCC <SEP> 11796</I>
<tb> Milieu <SEP> Degré <SEP> de <SEP> Mycélium <SEP> aérien <SEP> et <SEP> sporulation <SEP> Pigment <SEP> Remarques
<tb> croissance <SEP> soluble
<tb> glucose <SEP> modéré <SEP> sporulation <SEP> modérée <SEP> : <SEP> presque <SEP> aucun <SEP> environ <SEP> brun <SEP> crémeux <SEP> ;
<SEP> spores
<tb> asparagine <SEP> brun <SEP> Benzo <SEP> (R) <SEP> gram-positifs, <SEP> mesurant
<tb> agar <SEP> 1-1,3 <SEP> (1,3) <SEP> X <SEP> <B>0,65 <SEP> (1,0)</B> <SEP> X <SEP> 1,3 <SEP> @,
<tb> en <SEP> spirales
<tb> gélatine <SEP> modéré <SEP> colonies <SEP> d'un <SEP> blanc <SEP> cireux <SEP> aucun <SEP> liquéfaction <SEP> modérée
<tb> crème <SEP> ; <SEP> aucune <SEP> sporulation <SEP> ;
<tb> aucun <SEP> mycélium <SEP> aérien
<tb> lait <SEP> écrémé <SEP> modéré <SEP> anneau <SEP> blanc <SEP> crémeux <SEP> rose <SEP> aucune <SEP> coagulation; <SEP> hydrolyse;
<tb> (280) <SEP> corail <SEP> le <SEP> <I>pH</I> <SEP> change <SEP> de <SEP> 6,4 <SEP> à <SEP> 6,9
<tb> (R)
<tb> glucose <SEP> bon <SEP> mycélium <SEP> aérien <SEP> blanc <SEP> ;
<SEP> brun <SEP> envers <SEP> brun <SEP> moyen
<tb> agar <SEP> sporulation <SEP> rosâtre
<tb> agar <SEP> pauvre <SEP> mycélium <SEP> aérien <SEP> mince <SEP> et <SEP> brun <SEP> envers <SEP> blanc <SEP> crémeux
<tb> nutritif <SEP> plat <SEP> ; <SEP> sporulation <SEP> très
<tb> ï <SEP> clair
<tb> maléate <SEP> de <SEP> pauvre <SEP> mycélium <SEP> aérien <SEP> blanc;
<SEP> aucun <SEP> maléate <SEP> de <SEP> calcium <SEP> digéré;
<tb> calcium <SEP> à <SEP> aucune <SEP> sporulation <SEP> envers <SEP> blanc <SEP> crémeux
<tb> modéré
<tb> agar <SEP> pauvre <SEP> sporulation <SEP> pauvre, <SEP> presque <SEP> aucun <SEP> envers <SEP> blanc <SEP> crémeux <SEP> à <SEP> gris
<tb> synthétique <SEP> gris <SEP> souris <SEP> pâle <SEP> (R) <SEP> clair
<tb> agar <SEP> modéré <SEP> sporulation <SEP> modérée <SEP> presque <SEP> brun <SEP> envers <SEP> brun <SEP> clair
<tb> d'Emerson <SEP> gris <SEP> souris <SEP> (R) <SEP> clair
<tb> cellulose <SEP> aucun
<tb> bouillon <SEP> modéré <SEP> aucune <SEP> réduction <SEP> des <SEP> nitrates
<tb> nitrate
<tb> dextrose
<tb> rondelles <SEP> bon <SEP> sporulation <SEP> plus <SEP> foncée <SEP> que <SEP> brun
<tb> de <SEP> pommes <SEP> gris <SEP> souris <SEP> (R)
<SEP> moyen
<tb> de <SEP> terre <SEP> à <SEP> foncé
<tb> amidon <SEP> modéré <SEP> sporulation <SEP> presque <SEP> brun <SEP> aucun <SEP> croissance <SEP> superficielle <SEP> jaune <SEP> ;
<tb> agar <SEP> Benzo <SEP> (R) <SEP> envers <SEP> brun <SEP> clair <SEP> ; <SEP> zone <SEP> étroite
<tb> d'hydrolyse La nouvelle souche de S. griseolus diffère des souches déjà décrites du même micro-organisme de différentes manières qui sont indiquées dans le tableau suivant.
EMI0003.0001
<U>Tableau <SEP> II</U>
<tb> Milieu <SEP> S. <SEP> griseolus <SEP> ATCC <SEP> 11796 <SEP> Description <SEP> de <SEP> Bergey
<tb> gélatine <SEP> colonies <SEP> d'un <SEP> blanc <SEP> cireux <SEP> crème <SEP> (dans <SEP> pellicules <SEP> jaunâtres <SEP> et <SEP> floconneuses <SEP> avec
<tb> des <SEP> cuvettes <SEP> de <SEP> Pétri) <SEP> sédiment <SEP> (dans <SEP> des <SEP> bâtonnets <SEP> de
<tb> gélatine)
<tb> agar <SEP> sporulation <SEP> pauvre <SEP> presque <SEP> gris <SEP> souris <SEP> mycélium <SEP> aérien <SEP> d'abord <SEP> gris <SEP> et
<tb> synthétique <SEP> (R) <SEP> ; <SEP> croissance <SEP> pauvre <SEP> devenant <SEP> ensuite <SEP> d'un <SEP> gris <SEP> neutre <SEP> et
<tb> pâle <SEP> ;
<SEP> croissance <SEP> superficielle <SEP> limitée
<tb> presque <SEP> entièrement <SEP> à <SEP> du <SEP> mycélium
<tb> aérien
<tb> glucose <SEP> croissance <SEP> bonne <SEP> ; <SEP> mycélium <SEP> aérien <SEP> croissance <SEP> étalée <SEP> ; <SEP> partie <SEP> centrale <SEP> de
<tb> agar <SEP> blanc <SEP> ; <SEP> aucune <SEP> sporulation <SEP> couleur <SEP> crème <SEP> prononcée <SEP> et <SEP> devenant
<tb> foncée
<tb> lait <SEP> de <SEP> (sur <SEP> du <SEP> lait <SEP> écrémé <SEP> à <SEP> 280) <SEP> croissance <SEP> croissance <SEP> abondante <SEP> ; <SEP> pellicules <SEP> roses <SEP> ;
<tb> tournesol <SEP> modérée; <SEP> anneau <SEP> blanc <SEP> crémeux; <SEP> peptonisé <SEP> ; <SEP> devient <SEP> alcalin, <SEP> coagulé
<tb> pigment <SEP> soluble <SEP> d'un <SEP> rose <SEP> corail <SEP> (R) <SEP> ;
<tb> aucune <SEP> coagulation <SEP> ;
<SEP> hydrolyse <SEP> ; <SEP> le <SEP> <I>pH</I>
<tb> devient <SEP> alcalin
<tb> bouillon <SEP> aucune <SEP> réduction <SEP> en <SEP> nitrites <SEP> nitrites <SEP> obtenus
<tb> dextrose
<tb> nitrate
EMI0003.0002
<U>Tableau <SEP> III</U>
<tb> <I>Caractéristiques <SEP> de <SEP> la <SEP> nouvelle <SEP> souche <SEP> de <SEP> Streptomyces <SEP> roseochromogenus <SEP> (No <SEP> 15855 <SEP> - <SEP> 4)</I>
<tb> Milieu <SEP> Degré <SEP> de <SEP> Mycélium <SEP> aérien <SEP> et <SEP> sporulation <SEP> Pigment <SEP> Remarques
<tb> <B><U>#</U></B> <SEP> croissance <SEP> soluble
<tb> Plaques <SEP> modéré <SEP> mycélium <SEP> aérien <SEP> blanc <SEP> ; <SEP> jaune <SEP> aucun <SEP> colonie <SEP> légèrement <SEP> élevée <SEP> ;
<tb> glucose <SEP> cireux <SEP> le <SEP> long <SEP> du <SEP> bord <SEP> d'une <SEP> surface <SEP> plissée <SEP> ;
<SEP> envers <SEP> entre
<tb> asparagine <SEP> colonie <SEP> ; <SEP> sporulation <SEP> presque <SEP> jaune <SEP> abricot <SEP> (R) <SEP> et <SEP> jaune <SEP> de
<tb> fauve <SEP> vinacé <SEP> pâle <SEP> (R) <SEP> cadmium <SEP> (R) <SEP> ; <SEP> spirales
<tb> présentes <SEP> ; <SEP> spores <SEP> ellipsoïdales,
<tb> gram-positives, <SEP> <B>0,66-0,95(0,95)</B>
<tb> X <SEP> 0,95-1,3 <SEP> (1,3) <SEP> #t; <SEP> sporulation
<tb> fauve <SEP> vinacé <SEP> pâle <SEP> (R) <SEP> à <SEP> roux
<tb> vinacé <SEP> (R), <SEP> où <SEP> cette <SEP> sporulation
<tb> forme <SEP> des <SEP> amas;
<SEP> colonies <SEP> d'une
<tb> couleur <SEP> brun <SEP> clair <SEP> sans <SEP> spores
<tb> plaques <SEP> de <SEP> bon <SEP> mycélium <SEP> aérien <SEP> blanc <SEP> brun <SEP> bonne <SEP> liquéfaction
<tb> gélatine <SEP> foncé
<tb> lait <SEP> écrémé <SEP> I <SEP> pauvre <SEP> anneau <SEP> jaune <SEP> clair <SEP> à <SEP> brun <SEP> plus <SEP> aucune <SEP> coagulation <SEP> ; <SEP> aucune
<tb> (28 ) <SEP> à <SEP> moyen <SEP> clair <SEP> hydrolyse <SEP> ; <SEP> le <SEP> <I>pH</I> <SEP> change <SEP> de
<tb> modéré <SEP> qu'avel- <SEP> 6,5 <SEP> à <SEP> 6,9
<tb> lave <SEP> (R)
<tb> I <SEP> I
EMI0004.0001
Milieu <SEP> Degré <SEP> de <SEP> Mycélium <SEP> aérien <SEP> et <SEP> sporulation <SEP> pigment <SEP> Remarques
<tb> croissance <SEP> soluble
<tb> glucose <SEP> modéré <SEP> brun <SEP> clair, <SEP> cireux <SEP> ;
<SEP> mycélium <SEP> brun <SEP> envers <SEP> brun <SEP> clair
<tb> agar <SEP> aérien <SEP> blanc <SEP> à <SEP> la <SEP> partie <SEP> moyen
<tb> supérieure <SEP> de <SEP> la <SEP> souche <SEP> ;
<tb> aucune <SEP> sporulation
<tb> agar <SEP> pauvre <SEP> brun <SEP> clair, <SEP> cireux <SEP> brun <SEP> envers <SEP> brun <SEP> clair
<tb> nutritif <SEP> à <SEP> clair <SEP> à
<tb> modéré <SEP> moyen
<tb> agar <SEP> pauvre <SEP> sporulation <SEP> presque <SEP> roux <SEP> aucun <SEP> envers <SEP> presque <SEP> incolore
<tb> synthétique <SEP> vinacé <SEP> (R)
<tb> maléate <SEP> de <SEP> pauvre <SEP> sporulation <SEP> presque <SEP> fauve <SEP> (R) <SEP> aucun <SEP> envers <SEP> presque <SEP> incolore
<tb> calcium
<tb> rondelles <SEP> modéré <SEP> mycélium <SEP> aérien <SEP> blanc <SEP> à <SEP> gris <SEP> brun
<tb> de <SEP> pommes <SEP> clair;
<SEP> sporulation <SEP> depuis <SEP> fauve <SEP> clair
<tb> de <SEP> terre <SEP> clair <SEP> vinacé <SEP> (R) <SEP> à <SEP> roux
<tb> vinacé <SEP> (R)
<tb> plaques <SEP> pauvre <SEP> blanc <SEP> crémeux, <SEP> cireux <SEP> ; <SEP> pas <SEP> aucun <SEP> hydrolyse <SEP> pauvre <SEP> à <SEP> modérée
<tb> d'amidon <SEP> de <SEP> sporulation
<tb> bouillon <SEP> modéré <SEP> pas <SEP> de <SEP> réduction <SEP> en <SEP> nitrites
<tb> dextrose <SEP> i
<tb> nitrate
<tb> agar <SEP> modéré <SEP> brun <SEP> clair, <SEP> cireux;
<SEP> sporulation <SEP> envers <SEP> brun <SEP> clair
<tb> fauve <SEP> vinacé <SEP> (R) <SEP> à <SEP> fauve
<tb> vinacé <SEP> clair <SEP> (R)
<tb> I Les caractéristiques susdites correspondent presque entièrement à la description du Strep tomyces roseochromogenus dans le traité de Bergey.
Bien qu'on sache qu'une autre souche de S. roseochromogenus forme l'antibiotique ro- séomycine , il a été clairement établi que l'anisomycine est différente de la roséomycine, comme il résulte des particularités indiquées ci-après.
Il est évident que l'invention n'est pas li mitée à des organismes qui répondent complè tement à la description faite ci-dessus, celle-ci n'ayant été donnée qu'à titre illustratif. Elle englobe notamment l'usage des espèces mu tantes obtenues à partir des organismes décrits en ayant recours à divers moyens, par exemple une exposition aux rayons X ou aux rayons ultraviolets, l'utilisation de gaz de moutarde et analogues.
L'antibiotique anisomycine est particulière ment actif contre les protozoaires et champi gnons pathogènes. Le tableau ci-dessous montre l'activité antibiotique de l'anisomycine déter minée par des essais effectués avec divers fongi. Ces essais ont lieu en ensemençant du bouillon nutritif, contenant des concentrations différentes de l'antibiotique pur avec l'orga nisme particulier spécifié et en observant les concentrations pour lesquelles aucune crois sance ou une croissance effective a lieu.
L'anti biotique est utilisé avec des concentrations de 1, 10, 50, 100, 500 et 1000 microgrammes/mil- lilitre (mcg/ml). Chaque essai a lieu dans des conditions normalisées.
EMI0005.0001
<U>Tableau <SEP> IV</U>
<tb> <I>a) <SEP> Activité <SEP> de <SEP> l'anisomycine <SEP> obtenue <SEP> au <SEP> moyen <SEP> du <SEP> S. <SEP> griseolus</I>
<tb> <I>envers <SEP> des <SEP> champignons <SEP> pathogènes</I>
<tb> Concentration <SEP> de <SEP> l'antibiotique <SEP> en <SEP> mcg/ml
<tb> Organisme <SEP> croissance <SEP> aucune <SEP> croissance
<tb> Microsporum <SEP> canis <SEP> <B>......</B> <SEP> 10 <SEP> 100
<tb> Microsporum <SEP> audouini <SEP> 10 <SEP> 100
<tb> Histoplasma <SEP> capsulatum <SEP> . <SEP> .
<SEP> 10 <SEP> 100
<tb> Cryptococcus <SEP> neoformans. <SEP> 1 <SEP> 10
<tb> Trichophyton <SEP> .......... <SEP> 100 <SEP> 500
<tb> Phialophora <SEP> verrucosa <SEP> . <SEP> . <SEP> 100 <SEP> 500
<tb> Blastomyces <SEP> dermatiditis. <SEP> . <SEP> 500
<tb> Sporotrichum <SEP> schenkii <SEP> 500
<tb> Trichophyton <SEP> violaceum <SEP> . <SEP> . <SEP> 500
<tb> Hormodendron <SEP> compactum <SEP> 500
<tb> Blastomyces <SEP> brasiliensis <SEP> . <SEP> . <SEP> 500
EMI0005.0002
<I>b) <SEP> Activité <SEP> de <SEP> l'anisomycine <SEP> obtenue <SEP> au <SEP> moyen <SEP> du <SEP> S. <SEP> roseochromogenus</I>
<tb> <I>envers <SEP> des <SEP> champignons <SEP> pathogènes</I>
<tb> Concentration <SEP> de <SEP> l'antibiotique <SEP> en <SEP> mcg/ml
<tb> Organisme <SEP> croissance <SEP> aucune <SEP> croissance
<tb> M. <SEP> canis <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> .
<SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> 50 <SEP> IP <SEP> 100
<tb> M. <SEP> audouini <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> 10 <SEP> 50
<tb> H. <SEP> capsulatum <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> 50 <SEP> IP <SEP> 100
<tb> Crypt. <SEP> neoformans <SEP> <B>...</B> <SEP> . <SEP> 1 <SEP> 10
<tb> T. <SEP> sulfureum <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> <B>------ <SEP> 10 <SEP> <I>50</I></B>
<tb> Ph. <SEP> verrucosa <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> . <SEP> 100 <SEP> 500
<tb> B. <SEP> dermatiditis <SEP> <B>--------</B> <SEP> 100 <SEP> 1000
<tb> Sp. <SEP> schenkii <SEP> <B>---- <SEP> -----</B> <SEP> 100 <SEP> 1000
<tb> T. <SEP> violaceum <SEP> <B>--- <SEP> ------</B> <SEP> 100 <SEP> 1000
<tb> H. <SEP> compactum <SEP> <B>---</B> <SEP> .
<SEP> <B>----</B> <SEP> 100 <SEP> 1000
<tb> B. <SEP> brasiliensis <SEP> . <SEP> . <SEP> 100 <SEP> 1000
<tb> IP <SEP> indique <SEP> une <SEP> inhibition <SEP> partielle. L'activité anti-fongi de l'antibiotique ani- somycine est illustrée, en outre, par le tableau V, celui-ci montrant la concentration minimum de l'antibiotique à laquelle la croissance de souches différentes de Candida Albicans ne se produit pas. Cette concentration, exprimée en mcg/ml, est appelée concentration inhibi- toire minimum .
Une méthode normalisée est utilisée, analogue à celle décrite ci-dessus à propos du tableau<I>IV.</I> L'activité anti-fongi de l'anisomycine chez les humains n'a pas encore été démontrée.
EMI0006.0001
<U>Tableau <SEP> V</U>
<tb> <I>a) <SEP> Activité <SEP> de <SEP> l'anisomycine <SEP> b) <SEP> Activité <SEP> de <SEP> l'anisomycine</I>
<tb> <I>obtenue <SEP> au <SEP> moyen <SEP> du <SEP> S. <SEP> griseolus <SEP> obtenue <SEP> au <SEP> moyen <SEP> du <SEP> S. <SEP> roseochromogenus</I>
<tb> <I>contre <SEP> le <SEP> Candida <SEP> Albicans <SEP> contre <SEP> le <SEP> Candida <SEP> Albicans</I>
<tb> Candida <SEP> Albicans <SEP> Concentration <SEP> inhibitoire <SEP> Candida <SEP> Albicans <SEP> Concentration <SEP> inhibitoire
<tb> souche <SEP> No <SEP> minimum <SEP> souche <SEP> No <SEP> minimum
<tb> 8 <SEP> 3,12 <SEP> IP <SEP> 8 <SEP> 3,12
<tb> 9 <SEP> 6,25 <SEP> IP <SEP> 9 <SEP> 6,25
<tb> 11 <SEP> 3,12 <SEP> 11 <SEP> 3,12
<tb> 13 <SEP> 12,5 <SEP> 13 <SEP> 6,25
<tb> IP <SEP> indique <SEP> une <SEP> inhibition <SEP> partielle.
L'activité antiprotozoaire de l'antibiotique anisomycine est déterminée en inoculant des tubes contenant des concentrations différentes de l'antibiotique avec des protozoaires patho gènes typiques, Trichomonas vaginalis et En- damoeba histolytica et en observant le degré de mobilité et/ou de croissance des micro organismes après une incubation pendant 48 heures.
A titre comparatif, les mêmes essais ont été faits avec l'antibiotique dénommé fumagil- line, qui est connu pour son activité antipro- tozoaire. Les résultats de ces essais sont indi qués dans le tableau<I>VI</I> qui montre les degrés d'activité contre les Trichomonas en se basant sur la mobilité et la croissance observées avec des lamelles préparées à partir de tubes incubés avec les concentrations spécifiées.
EMI0006.0012
<U>Tableau <SEP> VI</U>
<tb> <I>a) <SEP> Activité <SEP> antiprotozoaire <SEP> de <SEP> l'anisomycine <SEP> obtenue <SEP> au <SEP> moyen <SEP> du <SEP> S. <SEP> griseolus</I>
<tb> Activité <SEP> à <SEP> des <SEP> concentrations <SEP> de
<tb> Antibiotique <SEP> Protozoaire <SEP> 7,8 <SEP> mcg/ml <SEP> 3,9 <SEP> mcg/ml <SEP> 1,9 <SEP> mcg/ml
<tb> Anisomycine <SEP> Trichomonas <SEP> 4 <SEP> -I- <SEP> 3 <SEP> -f- <SEP> 2+
<tb> Anisomycine <SEP> Endamoeba <SEP> -f Fumagilline <SEP> Trichomonas <SEP> 3 <SEP> -f- <SEP> - <SEP> Fumagilline <SEP> '\ <SEP> Endamoeba <SEP> - <SEP> - <SEP> <B>*</B> <SEP> Aucune <SEP> activité <SEP> n'est <SEP> observée <SEP> en <SEP> dessous <SEP> de <SEP> 15,6 <SEP> mcg/ml.
<tb> <I>b) <SEP> Activité <SEP> antiprotozoaire <SEP> de <SEP> l'anisomycine <SEP> obtenue <SEP> au <SEP> moyen <SEP> du <SEP> S.
<SEP> roseochromogenus</I>
<tb> Activité <SEP> à <SEP> des <SEP> concentrations <SEP> de
<tb> Antibiotique <SEP> Protozoaire <SEP> 7,8 <SEP> mcg/ml <SEP> 3,9 <SEP> mcglml <SEP> 1,9 <SEP> mcg/ml
<tb> Anisomycine <SEP> Trichomonas <SEP> 4 <SEP> -f- <SEP> 4 <SEP> -I- <SEP> 4
<tb> 4 <SEP> -t- <SEP> 3 <SEP> -F- <SEP> 2+
<tb> Anisomycine <SEP> Endamoeba <SEP> -I- <SEP> -f- <SEP> -h Pour déterminer l'activité contre le Trichomo nas, le chiffre 4 -I- indique une activité inhi- bitoire complète des antibiotiques essayés, c'est-à-dire une mobilité et une croissance nulles du micro-organisme ; le chiffre 3 -f- indique une activité marquée de l'antibiotique ou une mobilité et/ou une croissance réduite ;
le chiffre 2 -I- indique une activité modérée ; -I- indique une activité légère et (-) indique une activité nulle. L'activité contre l'Endamoeba est déter minée en comparant le nombre de cellules dans des tubes de repère au nombre de cellules dans des tubes contenant les antibiotiques avec les concentrations indiquées, les tubes marqués par le signe (-I-) ayant une activité inhibitoire complète et ceux marqués par le signe (-) n'ayant aucune activité.
ll résulte du tableau ci-dessus que l'antibio tique anisomycine est fortement actif contre le Trichomonas et l'Endamoeba. Par ailleurs, les résultats montrent que l'antibiotique est beaucoup plus actif contre ces organismes que la fumagilline.
On n'a observé aucune activité de l'antibio tique anisomycine contre les mycobactéries saprophytiques quand des concentrations de l'antibiotique allant jusqu'à 100 mcg/ml sont essayées contre les espèces M. ranae, phlei, smegmatis, No 607, berolinense et butyricum. Une légère activité seulement est observée contre divers micro-organismes gram-positifs et gram-négatifs.
On a constaté que l'antibiotique anisomy- cine ne possède qu'un degré de toxicité relati vement bas quand il est utilisé pour des essais avec des animaux. Par exemple l'indice LDo, quand l'antibiotique est administré, par voie intraveineuse, à des souris, en solution aqueuse, est d'environ 2 mg/20 g de souris.
Suivant un mode préféré de réalisation de l'invention, l'antibiotique anisomycine est pro duit pendant la culture du micro-organisme S. griseolus <I>ATCC-11796</I> ou du micro-orga nisme S. roseochromogenus N 15855-4 dans un milieu nutritif aqueux à une température d'environ 24-300, dans des conditions d'aéro biose submergée et sous agitation.
Des milieux nutritifs qui sont utiles pour ces méthodes contiennent un hydrate de carbone, tel que du sucre, de l'amidon, de la farine de blé, ou de la glycérine, une source d'azote organique, telle que la caséine, la farine de soja, la farine d'arachides, le gluten de blé, la farine de graines de coton, la lactalbumine, un produit de digestion enzymatique de la caséine, du tryptone. Une source d'activateurs de la culture, telle que des résidus de la distillation, d'hydrates de carbone fermentés, de l'extrait de levure, des résidus de la fermentation de mélasses ainsi que des sels minéraux, tels que du chlorure de sodium, du sulfate de ma gnésium et des oligo-éléments, tels que le cuivre, le zinc et le fer, peuvent également être utilisés avec des résultats favorables.
S'il se produit une formation excessive de mousses au cours de la fermentation, des agents anti- mousse, tels que des huiles végétales, peuvent être ajoutés au milieu de fermentation. Le<I>pH</I> de la fermentation tend à rester constant mais si des variations se produisent, on peut également ajouter au milieu un agent tampon, tel que le carbonate de calcium.
Un inoculum pour la préparation de l'anti biotique anisomycine par la culture du S. gri- seolus ou S. roseochromogenus peut être obtenu en utilisant des cultures de souches sur des mi lieux tels que l'agar d'Emerson ou du bouillon de viande avec de la lactose. La culture peut être utilisée pour inoculer des flacons secoués ou des cuves à inoculum pour la culture sub mergée. Suivant une variante, les cuves à ino- culum peuvent être ensemencées à l'aide de cultures obtenues dans des flacons secoués.
La culture du micro-organisme atteint générale ment son maximum après environ deux ou trois jours. Toutefois, en faisant varier les appareils utilisés, le degré d'aération, le degré d'agita tion, etc., on peut agir sur la vitesse à laquelle l'activité maximum est atteinte. En général, on continue la fermentation jusqu'à ce que le mi lieu présente une activité antimicrobienne substantielle, une période comprise entre 24 heures et 4 jours étant suffisante dans la plupart des cas. L'aération du milieu dans les cuves pour une culture submergée se fait avec un débit d'environ un demi à deux volumes d'air libre par volume de bouillon et par minute.
L'agitation peut se faire à l'aide d'agitateurs de genres appropriés qui sont bien connus de ceux qui s'occupent des industries de fermentation. Des conditions aseptiques doivent, bien en tendu, être maintenues pendant le transfert de l'inoculum et pendant la croissance du micro organisme.
Après la croissance du micro-organisme, le mycélium, qui est généralement très abon dant et fin, peut être séparé du bouillon de fermentation à l'aide de divers appareils tels que des filtres-presses, centrifuges, etc. Ensuite, l'antibiotique peut être séparé du bouillon -de fermentation par plusieurs méthodes diffé rentes. Suivant une variante, tout le bouillon peut être utilisé tel quel ou il peut être séché. L'antibiotique peut être purifié davantage de différentes manières.
Il peut être extrait, par exemple, d'une solution aqueuse à un<I>pH</I> neutre ou légèrement alcalin, compris de pré férence entre environ 6 et environ 10, en se servant de divers solvants organiques non mis cibles à l'eau, comprenant des éthers, des hydrocarbures aromatiques, des esters, des cétones, des alcools inférieurs, des hydrocar bures halogénés et des mélanges de ceux-ci. A titre d'exemple on cite l'éther diéthylique, le benzène, l'acétate d'éthyle, l'acétate de butyle, la méthyl-isobutyl-cétone, le butanol et le chlo roforme. L'antibiotique peut être extrait de la plupart des solutions dans un solvant par de l'eau acidifiée ayant, de préférence, un<I>pH</I> in férieur à environ- 2;5.
Si on le désire, l'extrait dans le solvant peut être concentré avant d'être extrait à nouveau par l'eau acidifiée. En réglant le<I>pH</I> à la neutralité ou l'alcalinité, l'antibio tique peut être extrait à nouveau dans un des solvants indiqués plus haut. Après séchage du solvant et concentration de la solution, l'anti biotique cristallise sous la forme de longues aiguilles blanches. Le produit peut être recris- tallisé en refroidissant une solution de ce pro duit dans un butanol chaud, de l'acétate d'éthyle, du benzène et du bichlorure d'éthylène.
D'autres méthodes de récupération, qui sont évidentes, comprennent l'absorption sur du charbon de bois avec lavage subséquent, le traitement par des résines échangeuses d'ions et la chromatographie sur des colonnes d'alumine.
L'antibiotique anisomycine est un composé basique et organique blanc qui est soluble dans des acides aqueux dilués tout en étant modéré ment soluble dans l'eau. Il est très soluble dans plusieurs solvants organiques tels que le métha nol, l'éthanol, l'acétone, le dioxane et le chlo roforme. Il est insoluble dans l'hexane, le cyclohexane, le tétrachlorure de carbone et l'éther. Le composé conserve sa stabilité pen dant plusieurs heures à la température ambiante dans une zone étendue de<I>pH.</I> Par contre, il est très instable en étant chauffé dans une solu tion acide.
Il est stable à l'état sec ou en étant dissous dans des solvants, secs. L'antibiotique cristallisé a un point de fusion d'environ 140- 141o. Il présente trois maximums d'absorption dans l'ultraviolet, respectivement à 224, 277 et 283,5 m#x (3,34 mg dans ml de méthanol). Quand il est dissous dans le chloroforme, l'an tibiotique présente plusieurs pointes caracté ristiques dans son spectre infrarouge, les pointes les plus significatives se présentant aux fré quences suivantes (en cm-1) : 3545, 3450, 3320, 2890, 2800, 1725, 1610, 1582, 1515, 1470, 1447, 1380, 1320, 1302, 1242, 1178, 1036 et 962.
La fi-. 1 montre le spectre infra rouge du nouvel antibiotique, sous forme de base libre pour les fréquences comprises entre 5000 et<B>1100</B> cm-', les abscisses inférieures correspondant à ces fréquences exprimées en microns et les abscisses supérieures en cm-' (I/cm-1) alors que les ordonnées donnent la transmittance en o/o. La fig. 1 A montre le même spectre mais pour des fréquences com prises entre 1100 et 625 cm-'. La base, dissoute dans du méthanol (0,10/0) après l'établissement de l'équilibre, a un [a]25 = - 30,0 .
Lorsque la base est dissoute dans du chloroforme (0,1 0/0) elle présente un pouvoir rotatoire [a]25 = - 450 3o.
Un échantillon d'anisomycine obtenu à par tir de S. griseolus et cristallisé hors de l'acétate d'éthyle, a été séché pendant trois heures à 56o, sans perte de poids. L'antibiotique est en suite analysé et on constate qu'il comprend les éléments suivants, en o/o en poids : carbone 63,55 ; hydrogène 7,27 ; azote 5,20 et oxy gène (par différence) 23,98.
Le poids moléculaire de l'antibiotique ani- somycine obtenu à partir du S. roseochromo- genus, ce poids ayant été déterminé par la mé thode ébullioscopique, correspond à 276.
Un échantillon de cette anisomycine, qui a été cristallisé hors de l'acétate d'éthyle, est sé ché pendant trois heures à 56 sans perte de poids. L'antibiotique cristallisé et séché est ensuite analysé et on trouve qu'il comprend les éléments suivants, en % en poids : carbone 63,51 ; hydrogène 7,21 ; azote 5.22 et oxygène (par différence) 24,06.
Les analyses ci-dessus correspondent à la formule empirique probable CIAON04 pour l'antibiotique basique. L'antibiotique anisomycine se distingue nettement des autres antibiotiques par ses pro priétés, ce qui est mis en évidence par les pro priétés indiquées ci-dessus et par des mesures faites sur papier chromatographique. Des sels utiles de l'antibiotique peuvent être préparés par des méthodes bien connues des spécialistes, par exemple par traitement de la base avec un acide approprié en solution aqueuse ou dans des conditions anhydres.
Par exemple, le chlor- hydrate peut être préparé en dissolvant la base dans l'acétone et en faisant passer de l'acide chlorhydrique gazeux dans la solution. D'autres acides, tels que l'acide sulfurique ou phosphorique, peuvent être utilisés pour pré parer des sels d'acides de l'antibiotique.
L'invention est illustrée par les exemples suivants <I>Exemple 1</I> On prépare un milieu nutritif avec les ma tières suivantes dans un litre d'eau.
Glucose ( Cérélose )<B>-------</B> .<B>....</B> 10 g Amidon de blé . . . . . . . . . . . . . . . . . . 10 Caséine hydrolysée ( N-Z Amine B ) 5 Résidus de fermentation de mélasse produit marque Curbay BG . . 5 Farine de soja<B>............ . -----<I>15</I></B> Chlorure de sodium . . . . . . . . . . . . . . 1 Après avoir réglé le<I>pH</I> du mélange à 7 à l'aide d'hydroxyde de potassium, on ajoute un gramme de carbonate de calcium et on fait passer de la vapeur d'eau dans le mélange pen dant environ 30 à 45 minutes pour stériliser celui-ci.
Une culture de la nouvelle souche de S. griseolus est transférée dans 100 ml du mi lieu susdit dans un flacon d'Erlenmeyer de 300 ml et on secoue le flacon pendant 45 heures jusqu'à ce qu'une bonne croissance soit obtenue. On prépare un inoculum pour la fer mentation d'une quantité plus grande en trans férant le contenu du flacon susdit, dans des conditions aseptiques, dans un litre du même milieu contenu dans un flacon de 3 litres que l'on secoue pendant 48 heures.
On prépare et on stérilise 190 litres du mi lieu nutritif comme indiqué plus haut et ce mi- lieu est inoculé avec l'inoculum ainsi préparé. L'organisme est ensuite cultivé dans des con ditions d'aérobiose submergée et sous agitation, pendant une période de trois jours. Le<I>pH</I> du bouillon de fermentation est réglé à environ 2 avec de l'acide sulfurique concentré, le bouil lon est filtré avec du produit marque Super- cel pour en séparer le mycélium. Ensuite, on règle le<I>pH</I> du filtrat à 9 avec de l'hydroxyde de sodium concentré et on l'extrait deux fois avec 57 litres de chloroforme.
Les extraits de chloroforme combinés sont concentrés et extraits avec de l'eau acidifiée à <I>pH 2</I> avec de l'acide sulfurique. Ensuite, la solution aqueuse acidifiée est concentrée et son <I>pH</I> est réglé à 9 en y ajoutant de l'hydroxyde de sodium: L'antibiotique est extrait à nouveau avec du chloroforme que l'on évapore jusqu'à réduire le volume à 50 m1. Après addition d'un volume égal de cyclohexane et après une nou velle évaporation, on provoque la cristallisa tion de l'antibiotique brut et on le récupère par filtration.
L'antibiotique brut est purifié en le dissolvant dans l'acétate d'éthyle, en traitant la solution obtenue avec du charbon actif et en évaporant l'acétate d'éthyle ce qui donne l'an tibiotique anisomycine sous la forme de longs cristaux blancs.
<I>Exemple 11:</I> Une souche de S. roseochromogenus sur de l'agar d'Emerson est cultivée, dans des condi tions contrôlées, en vue d'obtenir des spores dont on se sert pour inoculer un milieu nutritif ayant la composition suivante Glucose ( Cérélose ) . . . . . . . . . . . . 10 g Farine de soja<B>......</B> .<B>.......</B> .. .. 10 Chlorure de sodium . . . . . . . . . . . . 5 Résidus de fermentation de mélasses produit marque Curbay BG . . 5 Amidon de blé . . . . . . . . . . . . . . . . . .
10 Ce mélange de matières nutritives est dilué avec de l'eau jusqu'à avoir un volume d'un litre, on règle le<I>pH à 7</I> avec de l'hydroxyde de po- tassium, on ajoute 0,1 % de carbonate de cal- cium qui agit comme tampon et on soumet l'ensemble à la stérilisation par la chaleur. Le milieu est ensuite refroidi et les spores sont ajoutés dans des conditions aseptiques. La cul ture de l'organisme a lieu dans des flacons secoués à environ 280 pendant une période de deux jours.
Le mélange de bouillon et de mycélium ainsi formé est utilisé pour inoculer 57 litres d'un milieu de fermentation stérile ayant, en substance, la même composition que celui indi qué plus haut. On soumet le mélange à une agitation et à une aération dans des conditions stériles pendant deux jours à environ 28(). En suite en sépare le mycélium à l'aide de produit marque Supercel et on concentre le bouil lon dans le vide jusqu'à ce qu'il ait un volume de 11,5 litres. Ce concentrat est extrait plu sieurs fois avec de l'acétate d'éthyle.
Les phases de solvant mélangées, dont la quantité correspond à environ 57 litres, sont concentrées sous vide jusqu'à avoir un volume de 1,5 litre et le concentrat est secoué 5 fois avec des por tions de 100 ml d'acide chlorhydrique 0,1 N. Le<I>pH</I> de la solution acide, contenant l'antibio tique, est réglé à 9,0 avec de l'hydroxyde de sodium et la solution est ensuite extraite dix fois avec des portions de 250 ml d'éther. L'éther est séparé dans le vide et l'eau restante est enlevée par distillation azéotropique avec du benzène.
Après concentration du distillat et après séparation du benzène, l'antibiotique cris tallise et peut être séparé par filtration. L'anti biotique est cristallisé à nouveau par dissolution dans de l'acétate d'éthyle chaud, par traite ment subséquent avec du charbon actif et par refroidissement de la solution obtenue. Le pro duit, cristallisé sous la forme de longues aiguilles blanches, est filtré, séché et essayé comme in diqué plus haut. Ce produit est très actif contre les protozoaires et champignons pathogènes.
On constate que l'antibiotique ainsi préparé est identique à celui obtenu comme décrit dans l'exemple 1 en se basant sur les spectres d'ab sorption dans l'infrarouge et l'ultraviolet, sur des mesures faites au papier chromatographique et sur le point de fusion mixte des produits mé langés. Ceci a été confirmé par les spectres microbiens et par d'autres caractéristiques phy siques et chimiques obtenues au cours d'essais faits avec des produits dérivés de souches du S. roseochromogenus et du S. griseolus dont question plus haut.
Les légères différences exis tant entre les résultats d'essai indiqués plus haut se trouvent entre les limites d'erreurs expé rimentales et n'affectent aucunement la con clusion de produits identiques.