CH498865A

CH498865A - Verfahren zur Herstellung von Derivaten der 7-Aminocephalosporansäure

Info

Publication number: CH498865A
Application number: CH323068A
Authority: CH
Inventors: Cole Martin; Fullbrook Paul
Original assignee: Beecham Group Ltd
Priority date: 1967-03-07
Filing date: 1968-03-05
Publication date: 1970-11-15
Also published as: FR7545M; DE1670320A1; BE711649A; GB1193302A; NL6802902A

Description

Verfahren zur Herstellung von Derivaten der 7-Aminocephalosporansäure
Die vorliegende Erfindung betrifft die Herstellung von neuen Derivaten der 7-Aminocephalosporansäure, welche antimicrobielle Wirksamkeit und Widerstandsfähigkeit gegenüber -Lactamase (Penicillinase oder Cephalosporinase) aufweisen.

Die neuen Verbindungen haben die Formel
EMI1.1

In dieser Formel ist R Phenyl oder ein heterocyclischer Rest, A Wasserstoff, Alkanoyloxy, Benzoyloxy, Hydroxy oder ein Pyridiniumrest. M ist Wasserstoff, ein ungiftiges Kation oder eine Anionische Ladung. A und M können zusammen auch eine einen Lactonring schliessende Kohlenstoff- Sauerstoffbindung darstellen.

Ungiftige Salze (falls M ein Kation ist) sind z.B. die Salze von Natrium, Kalium, Calcium und Aluminium, Ammonium und substituiertem Ammonium, ferner z.B.

Salze solcher ungiftiger Amine, wie Trialkylamine, einschliesslich Triäthylamin, Procain, Dibenzylamin, N-Ben zyl-ss-phenäthylamin, I-Ephenamin, N,N1-Dibenzyläthylendiamin, Dihydroabietylamin und N,N1-Bisdehydroabietyläthylendiamin.

Vorzugsweise bedeutet in der Formel I R einen 3 -Thienylrest und A den Pyridiniumrest, wogegen M eine anionische Ladung ist.

Das erfindungsgemässe Verfahren ist dadurch gekennzeichnet, dass man eine Aminoverbindung der Formel II
EMI1.2
mit einer Säure der Formel III
EMI1.3
oder einem reaktiven Derivat hiervon umsetzt, worin X eine Hydroxygruppe oder ein Chloratom oder die Gruppe OR' bedeutet, wobei in der letzteren R' Alkyl, Aryl, Benzyl oder substituiertes Benzyl ist und in erhaltenen Verbindungen mit den Gruppen -COCI oder COOR' diese in die Carboxylgruppe überführt.

Geeignete reaktive Derivate sind z.B. die Säurehalogenide, sowie die reaktiven Zwischenprodukte, welche aus der Säure III und einem Carbodiimid oder Carbonyldiimidazol gebildet werden können.

Die Ausgangsverbindungen der Formel II sind in bekannter Weise erhältlich und es lassen sich darin A und M nach bekannten Verfahren austauschen, z.B. durch Behandlung der Acetoxy-Verbindung mit Pyridin, wobei die Pyridinium-Verbindung entsteht, oder durch catalytische Hydrierung, wobei Decephalosporansäure erhalten wird.

Wenn zur Acylierung das Disäuremonohalogenid entsprechend der Formel III verwendet wird, wird das Endprodukt I unmittelbar erhalten. Wenn dagegen in der Verbindung der Formel III X der Rest OR' ist, kann der Rest R' durch übliche hydrogenolytische oder hydrolytische Methoden abgespalten werden, vorzugsweise jedoch vermittels enzymatischer Verfahren.

Geeignete enzymatische Behandlungsweisen zur Entfernung des Restes R' schliesst die Verwendung ein von Pancreatin, 51-Chymotrypsin oder eines Enzyms, wie es aus einem Esterase erzeugenden Stamm von Aspergillus sp., Sepedonium sp., Alcaligenes bookeri und Alcaligenes dentrificans, Pseudomonas pyocyanea oder Escherichia coli., erhalten werden kann.

Geeignete Esterase erzeugende Stämme sind Aspergillus niger BRL 822, Sepedonium sp., BRL 820, Alcaligenes bookeri BRL 1174, (NCIB 8155; NCTC 6535; ATCC 9128), Alcaligenes faecalis BRL 1238, Alcaligenes dentrificans BRL 1192 (NCTC 8582), Pseudomonas pyocyanea A und R59 und Escherichia coli K12 und BRL 1873 (NCIB 8581; ATCC 9723).

Die erfindungsgemäss herstellbaren Verbindungen können mit pharmazeutischen Trägern in bekannter Weise formuliert werden.

Beispiel I
1,38 g = 0,00511 Mol Monobenzyl-phenylmalonat wurden mit 5 ml Thionylchlorid gemischt und in einem Wasserbad 1 Std. auf 750C erhitzt. Das überschüssige Thionylchlorid wurde unter vermindertem Druck abgedampft. Der Rückstand wurde mit 5 ml trockenem Benzol gemischt und erneut zur Trockne eingedampft, zur Entfernung des restlichen Thionylchlorids. Der schliesslich erhaltene Rückstand wurde in 25 ml trockenem Aceton gelöst und unter Rühren zu einer Lösung von 1,39 g = 0,00511 Mol 7-Aminocephalosporansäure in einem Gemisch von 25 ml Wasser, 5,11 ml n-Natronlauge, 7.66 ml n Natriumbicarbonatlösung und 12,5 ml Aceton, welches auf 120C abgekühlt worden war, hinzugefügt.

Das Reaktionsgemisch wurde bei Zimmertemperatur 2 Std. lang gerührt. Die erhaltene Lösung wurde mit 3mal 20 ml Äther extrahiert und die Extrakte wurden verworfen. Die wässrige Schicht wurde mit 50 ml Äthyl acetat überschichtet und mit n Salzsäure auf den Wert pH = 1,5 angesäuert. Die organische Schicht wurde ab- getrennt und die wässrige Schicht mit 2mal 50 ml zusätzlichem Äthylacetat extrahiert. Die vereinigten Äthylacetat-Extrakte wurden mit 20 ml Wasser gewaschen und mit n Natnumbikarbonatlösung bis zum pH-Wert 7 extrahiert. Der neutrale wässrige Extrakt wurde mit 40 ml Isopropanol verdünnt und kristallisieren gelassen.

Das erhaltene feste Produkt wurde abfiltriert, mit Isopropanol gewaschen und über Phosphorpentoxyd im Vakuum getrocknet. Dabei wurden 1,17 g = 41,9% Ausbeute cremefarbener Kristalle von Natrium-7[a-(ben- zyloxycarbonyl) phenyl-acetamido]-cephalosporanat erhalten, dessen Reinheit im Hydroxylamin-Test auf 65,7% bestimmt wurde mit Bezug auf einen Cephalothin-Standard. Eindampfen der Mutterlauge unter vermindertem Druck und bei reduzierter Temperatur ergab nach dem Trocknen über Phosphorpentoxyd im Vakuum eine weitere Menge von 0,9 g entsprechend 32,3% cremefarbe- ner nicht kristalliner fester Substanz.

Beispiel 2
Ein Reaktionsgemenge, enthaltend 5 mg/ml Natrium -7-[z-(bnzyloxycarbonyl) -phenylacetamido] -cephalospor- anat und 1 mg/ml sc-Chymothypsin in M/20 pH 7 Phosphat-Puffer wurde bei 370C inkubiert. Das Reaktionsgemisch wurde vermittels Papierchromatographie unter Verwendung von Methyl-äthyl-keton/Wasser als Lösungsmittelsystem untersucht. Dabei ergab sich vollständige Umwandlung innerhalb 2 Stunden des Esters in 7-frj-Carboxyphenylacetamido] - cephalosporansäure (Rf O). Der Ester hatte ein Rf von ungefähr 0,9.

Eine Probe, welche nach 4stündiger Reaktionszeit zum Sieden gebracht und chromatographiert worden war, zeigte die Bildung des Decarboxylierungsproduktes (7-[Phenylacetamido]-cephalosporansäure Rf 0,23), welches sich während der enzymatischen Reaktion nicht gebildet hatte.

Beispiel 3
250 mg 7-[a-(Benzyloxycarbonyl)-phenylacetamido]- -cephalosporansäure (77% Reinheit) wurde in destilliertem Wasser gelöst u. der pH-Wert auf 7,0 eingestellt, bevor mit 50 ml Wasser verdünnt wurde. 50 mg a-Chymothypsin wurden in destilliertem Wasser gelöst u. der pH Wert auf 7,0 eingestellt, worauf auf 50 ml verdünnt wurde. Die Enzym- und Substratlösungen wurden gemischt und 5 Std. lang bei 370C gerührt, während der pH-Wert durch automatische Zugabe von n/10 Natronlauge auf 7,0 gehalten wurde. Das gesamte Reaktionsgemisch wurde zur Trockne eingedampft und gefriergetrocknet, worauf 120 mg einer hellgelben festen Substanz von 42% im Hydroxylamin-Test bestimmter Reinheit im Vergleich zu einem Cephalothin-Standard erhalten wurde.

Die antibakterielle Aktivität dieses Präparates von Na trium - 7 - (K - carboxyphenylacetamXdo) - cephalosporanat wurde vermittels eines Standards in in-vitro-Testen festgestellt.

Die papierchromatographische Prüfung einer Lösung von 10 mg/ml ergab eine Zone von 7-(Z-C:arboxyphenyl- acetamido)-cephalosporansäure mit Rf 0,05 (Butanol/ Äthanol/Wasser, 4/1/5, als Lösungsmittelsystem) jedoch kein Ausgangsmaterial mehr. Das Produkt war verunreinigt mit etwas 7-(Phenylacetamido)-cephalosporansäure (Rf 0,35), welche im Ausgangsprodukt ebenfalls zugegen war.

Beispiel 4
4,14 g = 0,015 Mol Monobenzyl-3-thienylmalonat wurden gemischt mit 15 ml Thionylchlorid und im Wasserbad bei 70 bis 750C 1 Std. lang erwärmt. Das überschüssige Thionylchlorid wurde unter vermindertem Druck abgedampft und der Rückstand verdünnt mit 5 ml trockenem Benzol, worauf zur Entfernung des restlichen Thionylchlorids erneut eingedampft wurde. Der schliesslich zurückbleibende Rückstand wurde in 75 ml trockenem Aceton gelöst und auf einmal zu einer Lösung von 4,08 g = 0,015 Mol 7-Aminocephalosporansäure in einem Gemisch von 15 ml n Natriumhydroxyd, 75 ml Wasser, 22,5 ml n Natriumbicarbonat und 37,5 ml Aceton, welches zuvor auf 120 abgekühlt worden war, aufgelöst. Das Reaktionsgemisch wurde 2 Stunden lang bei Zimmertemperatur gerührt. Die erhaltene Lösung wurde 3mal mit je 40 ml Äther extrahiert, worauf die Extrakte verworfen wurden.

Die wässrige Schicht wurde mit 50 ml Äthylacetat überschichtet und mit n Salzsäure auf den pH-Wert 1,5 angesäuert. Die organische Schicht wurde abgetrennt und die wässrige Schicht mit weiteren 2mal 50 ml Äthylacetat extrahiert. Die vereinigten Äthylacetatextrakte wurden mit 20 ml Wasser gewaschen und mit n Natriumbikarbonatlösung extrahiert bis zur Erreichung des pH-Wertes 7. Der neutrale wässrige Extrakt wurde unter vermindertem Druck und bei reduzierter Temperatur eingedampft, worauf der erhaltene Rückstand über Phosphorpentoxyd im Vakuum getrocknet wurde. Erhalten 6,83 g Natrium-7[x-(benzyloxycarbonyl)-3-thienyl- acetamido]-cephalosporanat mit einer Reinheit von 82,5'wo als cremefarbene nicht-kristalline feste Substanz.

Beispiel 5
Ein Reaktionsgemisch, bestehend aus 5 mg/ml Na trium-7-[z - (benzyloxycarbonyl) -3- thienylacetamido]-ce phalosporanat und 1 mg/ml umkristallisiertes,K-Chymo- trypsin in 0,1 M Phosphatpuffer vom pH-Wert 7 wurde bei 370C inkubiert. Das Reaktionsgemisch wurde vermittels Papierchromatographie (Whatman No. 1, 40C, absteigend) geprüft, unter Verwendung eines Lösungsmittelsystems als Kopfphase aus n-Butanol/Äthanol/ Wasser 4/1/5 v/v. Dabei zeigte sich, dass der Ester vollständig umgewandelt worden war in 7-(,oc-Carboxy-3- -thienylacetamido)-cephalosporansäure, Rf 0,02 innerhalb 2 Stunden.

Der Ester hatte einen Rf von 0,5 und war verunreinigt mit einer sehr geringen Menge von 7-(3-Thienylacetamido)-cephalosporansäure vom Rf 0,25, welche sich im Verlauf der enzymatischen Reaktion nicht vermehrte.

Eine nach 3 Stunden gezogene Probe zeigte nach 2 Minuten langem Sieden und nach Chromatographieren eine geringe Grössenzunahme der Zone bei Rr 0,25 und eine Abnahme der Zone bei Rf 0,02, was beweisend ist für die Decarboxylierung der 7-(-Carboxy-3-thienyl- acetamido)-cephalosporansäure in 7-(3-thienylacetamido)-cephalosporansäure.

Beispiel 6
Ein Reaktionsgemisch, bestehend aus 1 g Natrium 7-[1Sc-(benzoyloxycarbonyl)-3-thienylacetamido]-cephalos- poranat und 0,3 g umkristallisiertes oc-Chymotrypsin in
100 ml destilliertem Wasser wurde auf pH-Wert 7 eingestellt und 6 Stunden lang bei 370C gerührt. Während dieser Zeit wurde der pH-Wert durch fortlaufende Zugabe von 0,1-n Natronlauge konstant gehalten, was innerhalb 5 Stunden erforderlich war, worauf keine weitere Aufnahme während der nächsten Stunde nötig war. Dies wies auf eine vollständige Ent-Esterung des Ausgangsproduktes zu 7-(z-Carboxy-3 -thienyl-acetamido)-cepha- losporanat hin. Es wurde dies bestätigt vermittels Popierchromatographie, wie in Beispiel 5 beschrieben.

Das Reaktionsgemisch wurde auf 50C abgekühlt und Aceton langsam hinzugegeben, bis eine schliessliche Konzentration von 50% erhalten wurde. Das ausgefallene Enzym wurde abzentrifugiert (30 Min. bei 35000 g) und die überstehende Lösung gefriergetrocknet, wobei 0,73 g Natrium-7-(a-Carboxy-3-thienylacetamido)-cephalosporanat erhalten wurden. Die Reinheit des Produktes betrug 50%, bestimmt vermittels colorimetrischem Hydroxylamin Test unter Verwendung von Natrium-7-(2-thienylacetamido)-cephalosporanat als Standard.

Beispiel 7
Ein Reaktionsgemisch, bestehend aus 100 mg Na trium-7-z-carboxy -3- thienylacetamido)-cephalosporanat, hergestellt gemäss Beispiel 6, in 5 ml entionisiertem Wasser und 0,8 ml Pyridin wurde auf den pH-Wert 6,4 eingestellt unter Verwendung eines 0,4 M Acetatpuffers vom pH-Wert 4,6. Das Reaktionsgemisch wurde bei
370C 3 Tage lang in einer Atmosphäre von 95% Stickstoff, 5% Kohlendioxyd inkubiert. Hernach wurde zur Trockne unter vermindertem Druck eingedampft, wobei 7-(X-Carboxy-3-thienylacetamido) - 3-( 1 -pyridylmethyl)-3 - cephem-4-carboxylsäure-betain erhalten wurde. Die feste Substanz wurde unmittelbar wieder im Wasser aufgelöst zu einer Lösung von 10 mg/ml zwecks Prüfung auf antibakterielle Wirksamkeit und für die U.V. Spectroskopie.

Die Absorption bei 238 ma und 255 mu im Vergleich zu einer Lösung von 7-(2-Thienylacetamido)-3-(1 -pyridyl- methyl)-3-cephem-4-carboxyl-säurebetain derselben Konzentration ergab, dass die Reinheit im Bereich von 25 bis 35% liegt. Das Produkt wurde ferner vermittels des Spektrums seiner antibakteriellen Wirksamkeit in bezug auf diejenige des Ausgangsmaterials geprüft. Die Resultate hiervon sind in der folgenden Tabelle zusammengestellt.

TABELLE minimale inhibitorische
Konzentration (yt,g/ml) Organismen
Produkt Produkt gemäss gemäss
Beispiel 6 Beispiel 7 Escherichia coli 37 25 50 Salmonella typhi 25 125 Shigella Flexneri 25 125 Pseudomonas pyocyanea A > 500 125 Klebsiella aerogenes 25 125 Proteus mirabilis 889 50 125 Proteus morganii 50 50 Proteus rettgeri 25 125 Proteus vulgaris 125 5 Bacillus subtilis 25 5 Staphylococcus aureus (Oxford) 25 5 Staphylococcus aureus (Russel) 125 25
Beispiel 8
2,18 g = 0,007 Mol Mono-2,2,2-trichloräthyl-phenylmalonat wurden in das Säurechlorid umgewandelt, welches seinerseits umgesetzt wurde mit 1,904 g = 0,007 Mol 7-Aminocephalosporansäure gemäss der Arbeitsweise des Beispiel 4.

Erhalten wurden dabei 2,3 g (39,2%) Natrium-7-[s-(2,2,2-trichloräthoxycarbonyD -phe- nylacetamido]-cephalosporanat in Form einer cremefarbenen nicht-kristallinen festen Substanz.

Beispiel 9
2,56 g = 0,01 Mol Monophenyl-phenylmalonat wurden in das Säurechlorid übergeführt und mit 2,72 g 0,01 Mol 7-Aminocephalosporansäure gemäss der Arbeitsweise des Beispiels 4 umgesetzt. Dabei wurden erhalten 2,21 g (41,6%) Natrium-7-[x-(phenoxycarbonyl)- - phenylacetamido] - cephalosporanat als crèmefarbene nicht-kristalline feste Substanz.

Claims

PATENTANSPRUCH

Verfahren zur Herstellung von Derivaten der 7-Aminocephalosporansäure der Formel EMI3.1 worin R Phenyl oder ein heterocyclischer Rest ist, A Wasserstoff, Alkanoyloxy- Benzoyloxy, Hydroxy oder einen Pyridiniumrest bedeutet und M Wasserstoff, ein ungiftiges Kation oder eine anionische Ladung darstellt, oder A und M zusammen eine einen Lactonring schliessende Kohlenstoff-Sauerstoffbindung sind, dadurch gekennzeichnet, dass man eine Aminoverbindung der Formel EMI4.1 mit einer Säure der Formel EMI4.2 oder einem reaktiven Derivat hiervon umsetzt, worin X eine Hydroxygruppe oder ein Chloratom oder die Gruppe OR' bedeutet, wobei in der letzteren R' Alkyl, Aryl, Benzyl oder substituiertes Benzyl ist und in erhaltenen Verbindugen mit der Gruppen -COCI oder -COOR' diese in die Carboxylgruppe überführt.

UNTERANSPRÜCHE 1. Verfahren nach Patentanspruch, dadurch gekennzeichnet, dass als reaktives Derivat einer Säure der Formel III ein Säurehalogenid, das Säureanhydroxid oder ein Mischanhydrid verwendet wird.

2. Verfahren nach Patentanspruch, dadurch gekennzeichnet, dass der Rest R' durch enzymatische Hydrolyse abgespalten wird.

3. Verfahren nach Unteranspruch 2, dadurch gekennzeichnet. dass als Enzym Pancreatin, a-Chymotrypsin oder ein aus einem Esterase-produzierenden Stamm von Aspergillus sp., Sepedonium sp., Alvaligenes bookeri, Alcaligenes denitrificans, Pseudomonas pyocyanea oder Escherichia coli erhaltenes Enzym verwendet wird.