CH505800A - Verfahren zur mikrobiologischen Herstellung von 17-Oxo-steroiden - Google Patents

Description

  Verfahren zur mikrobiologischen Herstellung von 17-Oxo-steroiden    In der schweizerischen     Patentschrift    Nr. 485 689  wird ein Verfahren für die Herstellung von     17-Oxo-          steroiden    beschrieben.

   Dieses Verfahren besteht darin,  dass man Steroide herstellt, welche in der 17-Stellung  keinen kohlenstoffhaltigen Substituenten enthalten, und  zwar durch mikrobiologische Umwandlung von Steroi  den, die einen gesättigten oder ungesättigten, aliphati  schen Rest mit mindestens 8 Kohlenstoffatomen in     17-          Stellung    enthalten, unter Verwendung eines Mikroor  ganismus der Gattung Mycobacterium, wobei das ge  nannte     Verfahren        dadurch    gekennzeichnet ist, dass     als     Ausgangssteroide mit einem gesättigten oder ungesättig  ten, aliphatischen Rest mit mindestens 8 Kohlenstoff  atomen in 17-Stellung solche Steroide verwendet wer  den, deren Ringsystem durch die :

  mikrobiologische Um  wandlung mit Mikroorganismen der Gattung     Mycobac-          terium    angegriffen wird, und dass der Angriff des Ring  systems durch     Durchführung    :der     mikrobiologischen     Umwandlung in Gegenwart eines anorganischen     Inhi-          bitors    verhindert wird. Als Inhibitoren werden insbe  sondere anorganische     tonen    verwendet.  



  Es wurde nun festgestellt, dass man das besagte  Verfahren nicht nur mittels Enzymen der Gattung     My-          cobacterium,    sondern auch mittels Enzymen anderer       Mikroorganismen,    welche das     Ringsystem        dieser    be  stimmten Art von     Steroiden        anzugreifen        vermögen,          durchführen    kann.

   Somit bezieht sich die vorliegende  Erfindung auf ein Verfahran für die Herstellung von       Steroiden    mit der     Grundstruktur    :des       10,13-Dimethyl-cyclopentanoperhydrophen-          anthrens,     welche am Kohlenstoffatom in 3-Stellung eine Oxo-,  Hydroxy-, Alkoxy- oder Acyloxygruppe und am Koh  lenstoffatom in der 17-Stellung eine Oxogruppe auf  weisen, wobei man so vorgeht, dass man Steroide der  vorgenannten gleichen Grundstruktur, welche am Koh  lenstoffatom in 3-Stellung ein Oxo-, Hydroxy-,     Alk-          oxy-    oder Acyloxygruppe und am Kohlenstoffatom in  der 17-Stellung eine ss-orientierte, aliphatische Kohlen  wasserstoffgruppe mit mindestens 8 Kohlenstoffatomen    aufweisen,

       in    Gegenwart     eines        organischen        Ions    als In  hibitor mikrobiologisch     umwandelt,    und zwar     mittels     Enzymen von Mikroorganismen, welche das obenge  nannte -Grundskelett in Abwesenheit eines Inhibitors an  greifen würden, mit der Ausnahme von     Enzymen    der  Mikroorganismen der Gattung Mycobacterium.  



  Sämtlichen nach dem Verfahren gemäss vorliegen  der :Erfindung verwendeten     Mikroorganismen    .ist die  Eigenschaft zu eigen, dass sie, sofern kein Inhibitor  vorhanden ist, das Grundskelett des  Dimethyl-cyclopentanoperhydrophenanthrens       anzugreifen    vermögen. Zu diesem Zweck     eignen    sich  insbesondere die Arten der Gattungen Nocardia und  Arthrobacter.  



       Geeignete        Ausgangsmaterialien    sind     beispielsweise     Cholesterin, ss-Sitosterin, Stigmasterin, 4-Cholesten-3-on  und Campesterin, welche der Klasse der 3-Keto- bzw.  3-Hydroxysteroiden mit einer aliphatischen Seitenkette  von mindestens 8 Kohlenstoffatomen in der 17-Stellung  angehören. Derivate dieser Sterine können ebenfalls ver  wendet werden, so z. B. die Ester, wie     beispielsweise     Cholesterylbetainat-chlorid, Cholesterylacetat,  Cholesterylhemi-succinat, oder substituierte Sterine, wie  z. B. 5α-Chlorcholestanol, oder -Sterine, in denen im  A-Ring einer oder mehrere weitere Substituenten sind.  



  Dank der Anwesenheit eines Inhibitors im Reak  tionsmedium, in welchem die mikrobiologische Um  wandlung :der Steroide stattfindet, bleibt das Grund  skelett des Steroids intakt, während lediglich die ali  phatische Seitenkette in -der 17-Stellung beeinträchtigt  wird. Zu diesem Zweck eignen sich     insbesondere    an  organische Ionen, wie z. B. das Nickel-Ion, das Ko  balt-Ion, das Cadium-Ion :und :das Selenit-Ion.  



  Von besonderem     Interesse    ist die     mikrobiologische     Herstellung von 1,4-Androstadien-3,17-dion und     4-          Androsten-3,17-dion.     



  Die Ketogruppe in der 17-Stellung lässt sich, wenn  keine Substituenten am 16-Kohlenstoffatom vorhanden       sind,    leicht mittels der     Zimmerman-Reaktion    .feststel-      len (W. Zimmerman, Hoppe Seylers Z. Physiol.  Chemie 233 (1935) 257).  



  Das Androstadien-3,17-dion ist ein wertvolles Pro  dukt, das als Ausgangsmaterial für die     Herstellung    von  Verbindungen mit androgener, östrogener, anabolischer  und empfängnisverhütender Wirksamkeit     dienen    kann.  



  Das neue     Verfahren    macht es unter anderem mög  lich, natürlich vorkommendes     Cholesterin,    das als sol  ches nur in begrenztem Umfang     verwendet    wird,     in     ein Zwischenprodukt von grossem Wert umzuwandeln.  



  Für die praktische     Durchführung    des erfindungsge  mässen     Verfahrens        werden    die genannten     Mikroorganis-          men    zweckmässig in einem Medium gezüchtet, das eine  anorganische oder     :organische        Stickstoffquelle,    wie z. B.  Aminosäuren, Ammoniumsalze, Alkalimetallnitrate und  Erdalkalimetallnitrate oder Pepton, enthält. Maisquell  wasser, Hefeextrakt, Baumwollsamenmehl, Sojabohnen  mehl, die sogenannten  distillers solubles  und derglei  chen sind ebenfalls sehr geeignet.

   Assimilierbare Koh  lenstoffquellen, wie Zucker, Stärke, mehrwertige Al  koholate, können in dem Medium vorhanden sein, doch  genügt in den meisten Fällen die     Anwesenheit    einer or  ganischen     Stickstoffquelle.        überdies        enthält    ein geeigne  tes Medium auch die übliche Menge von     Salzen,    wie  z. B. Alkali- oder Erdalkalimetallphosphaten, -sulfaten  oder -chloriden. Spurenelemente liegen für gewöhnlich  bei Verwendung von     Leitungswasser    in hinreichenden  Mengen vor.  



  Bei     Verwendung    von     natürlichen,    aus einem kom  plizierten Gemisch bestehenden     Stickstoffquellen,    wie  z. B. Maisquellwasser, kann oft der Zusatz von     Mineral-          salzen    unterbleiben.  



  Die Medien werden im allgemeinen in     der    üblichen  Weise     sterilisiert;    sie weisen nach     dieser        Behandlung     normalerweise einen     pH-Wert    von 4 bis 8,5 und eine  Azidität von etwa 7 auf.  



  Wenn die     Zellen    in dem     Medium    unter     dauernder     Belüftung     hirnreichend    gewachsen     sind,    so kann das  Steroid, z. B. das Cholesterin oder das ss-Sitosterin, ent  weder in     einem    geeigneten     Lösungsmittel,    wie z. B.  N,N-Dimethylformamid, gelöst oder in Form einer fei  nen Suspension in     Wasser    zugegeben werden.  



  Die Menge des zuzusetzenden Inhibitors hängt von  den Umständen ab. Wenn die     Konzentration    zu ge  ring ist, wird das Steroid vollständig zu Substanzen  von niedrigem Molekulargewicht abgebaut. Ist die Kon  zentration zu hoch, so wird die Umwandlung des  Steroids weitgehend gehemmt, und der Mikroorganis  mus wird sogar häufig abgetötet. Bei Verwendung von  NiSO4 . 7H20 reicht eine Konzentration von 10 bis  1000 mg pro Liter aus, obwohl Umstände     vorliegen     können, in denen eine niedrigere oder höhere Kon  zentration erwünscht ist. Wenn Kobaltchlorid, Cad  miumsulfat oder Natriumselenit verwendet wird, liegt  die Konzentration vorzugsweise     ebenfalls        in    dem oben  erwähnten Bereich.  



  Der Zeitpunkt des Zugebens der Steroide liegt etwa  zwischen 0 und 72 Stunden nach der Animpfung; be  friedigende     Resultate    werden auch bei späterem Zu  setzen erhalten. Vorzugsweise geschieht das     Zusetzen     jedoch 24 bis 48 Stunden .nach der Animpfung der  Kultur, wenn die Mikroorganismen     hinreichend    ge  wachsen sind. Ein sehr frühes Zugeben, z. B. unmittel  bar nach der Animpfung, bleibt möglich.

   Der     Inhibi-          tor    wird im allgemeinen gemeinsam mit dem Steroid  zugegeben, da die Bakterien nichtgetötet werden, wenn  der Inhibitor in einer geeigneten Konzentration zuge-    geben     wind.    Dies kann     leicht    an     Kulturen,    die durch  Aufstreichen der Kultur nach Zusetzen von Steroid und  Inhibitor auf ein geeignetes Kulturmedium erhalten wur  den,     festgestellt    werden.  



  Die Umwandlung des Steroids findet in der Re  gal unter dauernder Belüftung bei einer Temperatur       bei    einer     Temperatur     zwischen 20 und 45  C statt; das     Verfahren    geht aber  auch     bei        niedrigeren        oder        höheren    Temperaturen vor  sich.

   Man führt die Reaktion vorzugsweise bei 30  C  ,durch; es ist jedoch nicht notwendig, dass die Tempera  tur während der Phasen des     Kulturwachstums    und     des          Abbauprozesses    die     gleiche        ist.        Der        Mikroorganismus     kann zunächst während 24 Stunden bei 26  C zum  Wachsen ,gebracht werden, wonach die Temperatur  nach Zusetzen von Steroid und Inhibitor auf 30  C er  höht     werden    kann.  



  Die Umwandlung des zugegebenen Steroids dauert       etwa    1 bis 7 Tage. In der Regel nimmt die Menge  des     gewünschten    Endproduktes indessen nach 3 Ta  gen nicht weiter zu. Ein     wesentliches    Hauptprodukt, das  im Fall von Sterinen ohne weitere Substitution im     A-          Ring    gebildet wird, ist 1,4-Androstadien-3,17-dion ne  ben geringen Mengen 4-Androsten-3,17-dion; die Aus  beuten hängen unter anderem vom Belüften ab. Die  beschriebenen Umstände     führen    zu einem erwünsch  ten Überwiegen von 1,4-Androstadien-3,17-dion gegen  über 4-Androsten-3,17-dion.

   Die gebildeten Steroide       können    aus der     Kulturflüssigkeit    durch Extrahieren mit       einer    mit     Wasser    nichtmischbaren     Flüssigkeit,    wie z. B.  Methylisobutylketon, Äthylacetat, Methylenchlorid oder       Chloroform,        erhalten    werden. Diese     Extrakte    werden  zur Trockne eingedampft; der Rückstand     wird        zwecks     Entfernung von     nichtumgewandeltem    Substrat, wie z. B.  Cholesterin oder Stigmasterin, mit einem organischen  Lösungsmittel     extrahiert.     



  Die     zurückbleibende    feste Substanz kann     dann    durch  Chromatographie und Umkristallisation weiter gereinigt  und     in    die Komponenten zerlegt werden.  



  Da geeignete Mikroorganismen zwingenderweise       Enzyme    bilden, welche das     Ringsystem    der genann  ten Steroidsubstrate, welche in 17-Stellung eine ali  phatische Gruppe mit mindestens 8 Kohlenstoffatomen  haben, anzugreifen vermögen, ist es möglich, geeignete  Mikroorganismen nach einem allgemeinen Prinzip fest  zustellen, indem man diese geeigneten Organismen aus       natürlichen        Quellen,    wie z. B. aus dem Boden, aus  dem Dünger, aus an der Oberfläche     liegendem    Was  ser usw., einengt.

   Zu diesem Zweck verwendet man       ein        Kulturmedium,    welches als einzige     Kohlenstoffquelle          Cholesterin    neben     einigen    Salzen enthält.

   Das     Kultur-          medium    wird mit     Gartengrund,    Dünger usw.     ange-          impft    und hierauf bei einer geeigneten Temperatur,     bei-          spielsweise    bei     einer    solchen von 10 bis 40  C, ge  züchtet,

       obwohl    auch höhere -oder     niedrigere    Tempera  turen nicht     auszuschliessen        sind.    Die Kultur kann auf  einer vibrierenden oder     rotierenden        Schüttelmaschine          geschüttelt        werden.        Gewünschtenfalls        :kann    man auch       Restkulturen    zum Konzentrieren der gewünschten Mi  kroorganismen verwenden.

   Auch hat :es sich als mög  lich erwiesen, das Medium in halbfester Form     (Agar-          Agar)        zu        verwenden    und den     gewünschten        Mikroor-          ganismus    in     Petrischalen    zu konzentrieren. Es     kann     angezeigt     sein,    den Boden einige Monate oder Wochen  vor     seiner    Verwendung     mit        Cholesterin    oder     einer    Koh  lenwasserstoffmischung zu vermischen.

   So erhält man  die Art     Nocardla,    Stamm     CBS    Nr. 226.67, aus     einem     Boden, welcher mit einem Abfallschmieröl vermischt           worden    war.     Das    Medium, welches man für die Kon  zentration verwenden kann, hat beispielsweise die fol  gende Zusammensetzung:

    
EMI0003.0002     
  
    Ammoniumnitrat <SEP> 1 <SEP> g
<tb>  Na2HPO4 <SEP> 1 <SEP> g
<tb>  Cholesterin <SEP> 1 <SEP> g
<tb>  Leitungswasser            Die        so        konzentrierten        Mikroorganismen    sind be  fähigt, mach der Züchtung in     einem        geeigneten        Kultur-          medium    einen gesättigten oderungesättigten aliphati  schen Rest mit mindestens 8 Kohlenstoffatomen anzu  greifen.

   Wird dieser Abbau in Gegenwart eines     Inhi-          bitors    gemäss dieser Erfindung durchgeführt, so, wird  der Abbau des Ringsystems des Steroids unterdrückt,  und man erhält ein Steroid mit 19 Kohlenstoffatomen,  wie z. B. das 3,17 Dioxo-1,4-anidrostadien. Auf diese  Weise konnte eine Anzahl von Nocardia-Arten isoliert       werden,    welche     Cholesterin        anzugreifen    und abzubauen  und daher das gewünschte Steroid mit 19 Kohlenstoff  atomen nach der Zugabe der anorganischen     Inhibito-          ren    der obgenannten Art zu bilden vermögen.

   Ins  besondere die Art Nocardia, der Stamm CBS Num  mer 224.67 und Nocardia, Stamm CBS Nr. 225.67,       scheinen    sich für das     erfindungsgemässe        Verfahren    be  sonders zu     eignen.     



  <I>Beispiel 1</I>  Eine Impfkultur der Art Nocardia, Stamm CBS  Nr. 225.67, wird durch Impfen     einer    Kultur     dieses     Mikroorganismus -auf Pepton-Glucose-Agar hergestellt  und während drei Tagen bei 30 C     in    einem Medium       bebrütet,    das aus einer Lösung von 10 g Hefeextrakt  ( DIFCO ) in 1 Liter Leitungswasser vom pH-Wert  6,8, das vorher     während    30 Minuten -bei 110  C steri  lisiert     worden    ist, besteht. Das Medium wird in     500-          cm3-Kolben    eingebracht, wobei jeder Kolben 500 cm3  des     Mediums    enthält.  



  Die Kultur wird während 48 Stunden bei<B>301C</B>  auf einer rotierenden     Schüttelapparatur    bei     einer        Ge-          schwindigkeit    von 250     Umdrehungen        pro        Minute    mit  einem     Schüttelweg    von     21/2    cm geschüttelt, wonach  der     Mikroorganismus        hinreichend    gewachsen ist, um       weiter    geimpft     zu    werden.  



  Das Hauptfermentationsmedium wird durch Ver  dünnen von je 3 g Maisquellflüssigkeit (berechnet als       Trockensubstanz)    mit     Leitungswasser    auf 1 Liter, Lö  sen von 3 g Glucose     meiner    Flüssigkeit und anschlie  ssendes     Einstellen    des Mediums auf     einen        pH-Wert     von 7 mit verdünnter Natriumhydroxydlösung herge  stellt. Dieses Medium wird     in    12 Kolben     während    30  Minuten bei 1l0  C     sterilisiert.    Jeder der     verwendeten     Zweiliterkolben enthält 1 Liter Medium.

   Die Kolben  werden nun     mit        einer        Impfkultur,    wie sie oben be  schrieben ist, geimpft, wobei in. jeden Kalben 50 cms       eingebracht    werden. Die Impfung beträgt also 5 %.  



  Die Kolben werden     während    24     Stunden    bei 30  C  wie oben     beschrieben    geschüttelt.  



  Das Substrat,     nämlich    das     Cholesterin,        wird    in ei  nem Mörser unter Zugabe von 0,1 %  Tween 80  ent  haltendem Wasser pulverisiert. Diese     Suspension        wird     den vorgenannten Kulturen in solcher Menge     zugegeben,     dass jeder Kolben 1 g Cholesterin enthält. Gleichzeitig  wird eine sterile Lösung von 500 Mg CoCl2.6H2O in  Wasser in jeden Kolben gegeben, was     etwa.    125 mg  Kobalt Ionen entspricht. Die     Kolben    werden     dann    wei  ter unter den gleichen Bedingungen geschüttelt.

   Schon    nach 12 bis 24     Stunden    nach dem     Hinzugeben    von  Cholesterin kann das Vorhandensein von     3,17-Dioxo-          1,4-androstadien    und 3,17-Dioxo-4-androsten durch  Dünnschichtchromatographie nachgewiesen werden. Zu  diesem Zwecke extrahiert man einige cm3 der Kultur  flüssigkeit mit einem gleichen Volumen Äthylacetat und  führt die Chromatographie des Extraktes unter Ver  wendung von Silikagel mach der Methode von Stahl  durch. Man kann auch DC-Fertigplatten Kieselgel F254  (Merek A. G.) verwenden.

   Die Eluierungsflüssigkeit be  steht aus     einem        Gemisch    von Chloroform und     Äthyl-          acatat    in einem Volumverhältnis von 100 : 1.  



  Nach 3 Tagen Schütteln werden die     Inhalte        der     12 Kolben     vereinigt    und das Gemisch dreimal mit  20 % seines Volumens Methylisobutylketon extrahiert.  Der Extrakt wird unter vermindertem Druck zur     Trok-          kene    eingedampft und ;der Rückstand mit 80 cm3 sie  dendem Methanol extrahiert. Dadurch wird das nicht  umgewandelte Cholesterin entfernt. Aus dem Rückstand  können 5,2 g Cholesterin gewonnen werden.

   Der Me  thanolextrakt enthält das gewünschte     Androstadien-          dion.    Nach dem Eindampfen zur Trockene wird der  Rückstand in 30 cm3 Benzol aufgenommen, worauf  diese Lösung über eine Säule chromatographiert wird,  die 150 g Aluminiumoxyd (Al2O3 nach Woelm, neutral,  Aktivitätsstufe III) enthält.  



  Die Säule wird eluiert mit einem -Gemisch aus  Benzol und Aceton (10:1). Durch Dünnschichtchro  matographie wurden die das 1,4-Androstadien-dion ent  haltenden Fraktionen festgestellt     und    diese Fraktionen       vereinigt    und eingedampft.  



  Der     Rückst'an'd    (710 mg) wird aus einem     Gemisch     von Aceton und Heptan (1:3) umkristallisiert. Auf  diese Weise werden 640 mg Rohprodukt erhalten.     Der          Schmelzpunkt    beträgt 139,5 bis 140,5 C. Eine Probe  von äusserst reinem Androstadien-dion schmilzt bei 141  bis 142 C. Eine Mischung dieser     beiden        kristallinen     Produkte zeigt keine Schmelzpunktserniedrigung. Die  Infrarotspektren der beiden Proben sind identisch. Die  Ausbeute an kristallinem Produkt, bezogen auf das  verwendete Cholesterin, beträgt 12,9 %.  



  <I>Beispiel 2</I>  Analog dem Verfahren .des Beispiels 1 wird     eine     Kultur der Art Arthrobacter, Stamm CBS Nr. 220.67,       erzeugt.     



  Die     Umwandlung    erfolgt in diesem     Falle    in drei  500-cm3-Kolben, von denen jeder 100 cm3 Medium  enthält. Auch hier wird wiederum eine     Impfkultur    von  5 % verwendet, bezogen auf die Menge des Hauptfer  mentationsmediums.

   Die Kolben werden in der übli  chen Weise bei 30  C geschüttelt. 24 Stunden nach dem       Impfen    werden jedem Kolben 200 mag     Cholesterin    und  ferner 50 mg NiSO4. 7H2O zugegeben, wonach mit  ,dem     Schütteln        fortgefahren        wird.    Nach 3- bis     4tägiger     Inkubation enthalten die     drei    Kolben zusammen     eine     Menge     @an        3,17-Dioxo-1,4-and#rostadien,    die     zwischen     70,2     und    117 mg variiert.

   In den     meisten    Fällen     bilden     sich geringe Mengen von     3,17-Dioxo-4-androsten,    je  doch     verschwindet    der grösste Teil     dieser        Verbindung     nach einem mehrtätigen Schütteln.  



  Die     Ausbeute    variiert zwischen 16,0 und 25;6 %,  bezogen auf das     zugefügte        Cholesterin.     



  <I>Beispiel 3</I>  Nach den Angaben     von        Beispiel    2     verwendet    man       eine        Kultur    von der Art     Arthrobacter,    Stamm     CBS         Nr. 221.67. In jeden Kalben gibt man 400 mg Chol  esterin und 50 mg CoCl2-.6H2O hinzu. Nach     4tägi-          gem        Schütteln.    bei     30     C kann man aus jedem Kolben  aus der in Beispiel 1 beschriebenen Weise 52 mag     3,17-          Dioxo-1,4-androstadien    isolieren.

   Die Menge an 3,17  Dioxo-4-androsten ist praktisch 0.     Die    Menge an nicht  umgesetztem Cholesterin beträgt in jedem Kolben  290 mg. Demnach werden in jedem Kolben höchstens  110 mg Cholesterin umgewandelt, so dass sich theore  tisch nicht mehr als 80 mg 3,17-Dioxo-1,4-andmostadien  bilden kann. Daraus lässt sich schliessen, dass die Um  wandlung in einer Ausbeute von 65 %, bezogen auf  umgewandeltes Cholesterin, und von 17,8<B>%,</B> -bezogen  auf das     zugesetzte        Cholesterin,        stattgefunden    hat.  



  <I>Beispiel 4</I>  Ähnlich wie     in    Beispiel 3 verwendet     man    die Art  Arthrobacter, Stamm CBS Nr. 222.67. Das Isolieren  und     Reinigen    erfolgt nach den Angaben von Beispiel  1, wobei man ein, Ausbeute von 29 mg     3,17-Dioxo-          1,4-androstadien    in jedem Kolben nach 4tägigem  Schütteln erzielt. Die     Ausbeute    beträgt     10%,    bezogen  auf das zugesetzte     Cholesterin.     



  <I>Beispiel 5</I>       Man    verfährt wie in Beispiel 4, .d. h. man ver  wendet den Mikroorganismus der Art Arthrobacter,  Stamm CBS Nr. 222.67, mit dem Unterschied jedoch,  dass man jedem Kolben 50 mg NiSO4.7H2O zusetzt.  24 Stunden nach der Zugabe von     Cholesterin        und    In  hibitor kann man durch Dünnschichtchromatographie  in der in     Beispiel    1     beschriebenen        Weise    die Anwe  senheit von 3,17-Dioxo-1,4-androstadien und     3,

  17-          Dioxo-4-androsten        feststellen.       <I>Beispiel 6</I>  Man arbeitet wie in Beispiel 4 mit dem     Unter-          schiede    doch, dass man einen Mikroorganismus der Art  Arthrobacter, Stamm CBS Nr. 221.67, der Art     Arthro-          bacter,    Stamm CBS Nr. 223.67, und der Art Nocardia,  Stamm CBS Nr. 225.67, verwendet.

   Unter Verwendung  von NiSO4.7H2O als Inhibitor erhält man, in je  dem Kolben 24 bis 38 mg von     3,17-Dioxo-1,4-andro-          stadien,    so dass die Ausbeute, bezogen auf das zuge  setzte Cholesterin, zwischen 8,2     bis        13,0%        schwankt.     <I>Beispiel 7</I>  Eine Impfkultur der Art Nocardia, Stamm CBS  Nr. 224.67, wird     in    der in     Beispiel    1     beschriebenen     Weise hergestellt. Das Hauptfermentationsmedium be  steht aus einer Lösung von 5 g Maisquellflüssigkeit  (berechnet als Trockensubstanz) pro Liter Wasser, wel  cher 1 g Hefeextrakt ( DIFCO ) zugesetzt worden ist.

    Das Medium wird mittels einer wässrigen Natriumhy  droxydlösung auf ein pH-Wert von 7,0 eingestellt und  während 30 Minuten     bei    110 C     sterilisiert.    Jeder     der     500-cm3-Kolben enthält 100 cm3 dieses Mediums. Der  Prozentsatz des Animpfens beträgt 5 %.  



  Nach 24stündigem     Schütteln        versetzt    .man jeden  Kolben mit 200 mg Cholesterin in Formeiner wässrigen  Suspension und mit     einer        Lösung    von 50 mg  CoCl2.6H2O. Nach 3tätigem Schütteln isoliert ,man  aus jedem Kolben nach :der in     Beispiel    1     beschriebenen     Methode 32 mg 3,17-Dioxo-1,4-androstadien. Die Aus  beute beträgt 22 %, bezogen auf das zugesetzte Chol  esterin.    <I>Beispiel 8</I>  Eine Kultur von der Art Nocardia, Stamm CBS  Nr. 224.67, wird nach den Angaben von Beispiel 7  hergestellt. Einem jedem Kolben werden 200 mg Chol  esterin und SO mg CdSO4 zugesetzt.

   Nach     24stündi-          gem    Schütteln lässt sich die Anwesenheit von     3,17-          Dioxo-1,4-andmostadien    nach der in Beispiel 1 be  schriebenen Methode durch Dünnschichtchromatogra  phie nachweisen.  



  <I>Beispiel 9</I>  Eine Kultur von der Art Nocardia, Stamm CBS  Nr. 224.67, oder von Nocardia, Stamm CBS Num  mer 225.67, wird in der in Beispiel 7 beschriebenen  Weise hergestellt. Einem     jedem        Kolben    gibt     man     200 mg Cholesterin und Natriumselenit in Mengen  zwischen 3 und 10 :mg pro Kolben (30 bis 100 mg/  Liter) hinzu. Nach 24stündigem Schütteln lässt sich die  Anwesenheit einer Mischung von     3,17-Dioxo-1,4-an-          drostadien    und 3,17-Dioxo-4-androsten in jedem der  Kolben nach der gemäss     Beispiel    1 durchgeführten  Dünnschichtchromatographie nachweisen.

      <I>Beispiel 10</I>  Ähnlich wie beim     Beispiel    2 stellt man eine Kul  tur der Art Arthrobacter, Stamm CBS Nr. 221.67,  her. Anstelle von Cholesterin gibt man 200<I>mg</I>     l3-          Sitosterin    hinzu. Der Inhibitor besteht aus NiSO4 . 7H.-0.

    Nach 3 Tagen enthalten die Kolben     3,17-Dioxo-1,4-          androstadien    in einer Menge, welche zwischen 19 und  24 mg mit jedem Kolben     schwankt.    Die Ausbeute be  trägt ungefähr 15%, bezogen auf das zugesetzte     3-          Sitosterin.    (Das handelsübliche zugängliche 3-Sitosterin  enthält     eine        Anzahl    von     Steroiden    von praktisch glei  cher Struktur, so dass eine genaue Bestimmung der  Ausbeute unmöglich ist).  



  <I>Beispiel 11</I>       Dass    Beispiel 10 wird wiederholt mit dem Unter  schied, dass eine der folgenden Kulturen verwendet  wird: Art Arthrobacter, Stamm CBS Nr. 22.67, und  Nocardia, Stamm CBS Nr. 226.67. In beiden Fällen  lässt sich nach 3 Tagen die Gegenwart von     3,17-Dioxo-          1,4-androstadien    nachweisen, und zwar nach der in  Beispiel 1 beschriebenen     Dünnschichtchromatographie-          methode.     



  <I>Beispiel 12</I>  Ähnlich wie     in    Beispiel 2 wird     eine        Kultur    aus  ,der Art Nocardia, Stamm CBS Nr. 225.67, in 4 Fla  schen hergestellt, welche jeweils 100 cm3 des Mediums  enthalten.     Einem    jedem Kolben gibt man 500 mg  CoCl2³6H2O hinzu. Jedem der 4 Kolben wird eine  wässrige Suspension zugegeben, welche aus  a) 3-Oxo-4-cholesten  b) Stigmasterol  c) 5&alpha;-Chlorcholestanol und  d) einer Lösung von Cholesterylbetainat-chlorid       -besteht.     



  In sämtlichen     Fällen    beträgt die     jedem    Kolben     zu-          gesetzte        Steroidmenge    100 mg.    Nach 2 Tagen lässt sich durch     Dünnschichtchro-          matographie    -die     Anwesenheit    von     3,17-Dioxo-1,4        -an-          @drostadien        nachweisen.  

Claims (1)

1. PATENTANSPRUCH Verfahren zur Herstellung von Steroiden mit dem Grundskelett des 10,13-Dimethyl-cyclopentanoperhydrophen- anthrens, welche in der 3-Stellung eine Oxo-, Hydroxy-, Alk- oxy- oder Acyloxygruppe und in der 17-Stellung eine Oxogruppe aufweisen, durch :

   mikrobiologische Um- wandlung entsprechender Steroide, welche in der 3- Stellung eine Oxo-, Hydroxy-, Alkoxy- oder Acyloxy- gruppe und in der 17-Stellung eine ss-orientierte ali phatische Kohlenwasserstoffgruppe mit mindestens 8 Kohlenstoffatomen aufweisen, in Gegenwart eines an organischen Ions als Inhibitor, dadurch gekennzeich net, dass man die Umwandlung mit 'Hilfe von Enzymren von Mikroorganismen durchführt,

   welche das oben er wähnte Grundskelett in Abwesenheit eines Inhibitors angreifen würden, mit der Ausnahme von Enzymen von Mikroorganismen der Gattung Mycobacterium. UNTERANSPRÜCHE 1. Verfahren nach Patentanspruch, dadurch gekenn zeichnet, dass die Umwandlung mit Hilfe von Enzymen aus der Art Arthrobacter erfolgt. 2.

   Verfahren nach Patentanspruch, .dadurch gekenn zeichnet, @dass die Umwandlung mit Hilfe von Enzymen aus der Art Nocardia erfolgt.