CH507913A - Verfahren zur Herstellung eines bisher unbekannten Polypeptides - Google Patents

Verfahren zur Herstellung eines bisher unbekannten Polypeptides

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CH507913A
CH507913A CH1079768A CH1079768A CH507913A CH 507913 A CH507913 A CH 507913A CH 1079768 A CH1079768 A CH 1079768A CH 1079768 A CH1079768 A CH 1079768A CH 507913 A CH507913 A CH 507913A
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Bossert Heinz
Janos Dr Pless
Sandrin Edmond
Stephan Dr Guttmann
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Sandoz Ag
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Description


  
 



  Verfahren zur Herstellung eines bisher unbekannten Polypeptides
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines bisher unbekannten Polypeptides der Formel
EMI1.1     


<tb>  <SEP>    1# <SEP> 2 <SEP>     <SEP> 3 <SEP> 4 <SEP> 5 <SEP> 6 <SEP>    7# <SEP>     <SEP> 8 <SEP> 9 <SEP> 10
<tb> H-Cys-Ser-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys-Val-Leu-Ser 
11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 Ala-Tyr-Trp-Arg-Asn-Leu-Asn-Asn-Phe-His-Lys
22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 Phe-Ser-Gly-Nle-Gly-Phe-Gly-Pro-Glu-Thr-Pro NH2, seiner therapeutisch wirksamen Säureadditionssalze und Schwermetallkomplexe.



   Das bisher unbekannte Polypeptid kann nach für die Synthese von Verbindungen dieser Art allgemein bekannten Methoden hergestellt werden, wobei die Aminosäuren in der, in der obigen Formel festgelegten Reihenfolge einzeln oder nach vorheriger Bildung kleinerer Peptideinheiten miteinander   vcrknüpft    werden.



  indem man entsprechende zu seinem Aufbau nötige Aminosäuren unter Bildung von CONH-Bindungen in beliebiger zeitlicher Reihenfolge miteinander kondensiert, wobei nicht an der Reaktion teilnehmende freie funktionelle Gruppen intermediär durch geeignete Schutzgruppen geschützt werden, zu einem beliebigen Zeitpunkt der Synthese die Mercaptogruppen nach Bildung der Sequenz 1 bis 7 zum Disulfid oxydiert und die Carboxylgruppe des terminalen Prolylrestes in die Amidgruppe überführt.



   Beim Aufbau des neuen Polypeptids haben sich für die Blockierung der -Carboxylgruppe beispielsweise in der nachstehend beschriebenen Teilsequenz A. die tert. Butyloxygruppc bewährt.   ctoch    können auch andere Schutzgruppen. wie die Methoxy-, die   Äthoxy-.    die   tert.-Amyloxy-,    die Amid- oder die Benzyloxygruppe verwendet werden.



   Für die Blockierung der Imidazolgruppe des Histidinrestes in der nachstehend beschriebenen Teilsequenz C hat sich die Triphcnylmethylgruppe bewährt, doch können auch andere geeignete Schutzgruppen, wie die   Carbo-tert.-butoxy-,    die   Carbo-tert.-amyloxy-,    die   Carbobenzoxy-    oder die Benzylgruppe verwendet werden.



   Für die Blockierung der (1)-Aminogruppe des Lysinrestes in der nachstehend beschriebenen Teilsequenz C kann eine tert.-Alkoxy-carbonylgruppe, vorzugsweise die tert.-Butoxy-carbonylgruppe, verwendet werden.



   Für die Blockierung der Guanidogruppe des Argininrestes in der nachstehend beschriebenen Teilsequenz E wurde die Nitrogruppe verwendet, doch können auch andere geeignete Schutzgruppen, wie die Tosylgruppe, die p-Nitrocarbobenzoxygruppe oder die    2-(lsopropyloxycarbonyl)-3,4,5,6-tetrachloro- benzoylgruppe    verwendet werden. Man kann auch den Schutzeffekt der Protonisierung der Guanidogruppe bei der Synthese verwenden.



   Zum Schutz der Sulfhydrylgruppe in der nach   stchend    beschriebenen Teilsequenz   F1    und F2 kann z. B. die Benzyl-, die   p-Brombenzyl-    oder die p-Methylbenzylgruppe verwendet werden.



   Das neue Polypeptid lässt sich auch in Form seiner Salze gewinnen bzw. verwenden. Als Salze kommen   solche    mit organischen Säuren, wie Essigsäure, Propionsäure, Glykolsäure, Milchsäure, Brenztraubensäure,   Malonsäure,    Bernsteinsäure, Maleinsäure, Fumarsäure, Weinsäure, Zitronensäure, Benzoesäure, Zimtsäure,   Salicylsäure,      o-Phcnoxy-    oder 2-Acetoxy-benzoesäure, Mandelsäure, Methansulfonsäure, Äthansulfonsäure, Hydroxyäthansulfonsäure, Bcnzol- oder Toluolsulfonsäure,   Naphthalinsulfonsäure,    Sulfanilsäure sowie polymere Säuren   wic      Gerbsäure,    Alginsäure, Polygalacturonsäure, Polyphloretinphosphat oder Carboxymethylcellulose und Salze   nlit    anorganischen Säuren, wie Halogenwasserstoffsäure,

   z. B. Salzsäure oder   Bromwasserstoff-    säure, Salpetersäure, Thiocyansäure, Schwefelsäure und   Phosphorsäure    in Frage. Als   Schwermetallkomplex    kommt z. B. derjenige   vom      Zink##    in   Frage.   



     Die      Ausgangsprodukte    zur Herstellung des neuen Polypeptids können,   sofern    sie nicht bekannt waren, nach für die Peptidchemie bekannten   Niethoden    erhal  ten werden. wobei die Aminosäuren einzeln oder nach vorheriger Bildung kleinerer Peptideinheiten miteinander verknüpft werden.



   Die neue Verbindung stellt ein wichtiges therapeutisches Prinzip dar, das den Calciumplasmaspiegel, insbesondere den erhöhten Calciumplasmaspiegel senkt und als Antagonist des Parathormons eine positive Calciumbilanz im Knochen bewirkt.



   Es ist   somit      induziert    bei allen Zuständen, bei welchen eine Senkung des   Plasmacalciumspiegels    erwünscht ist, z. B. Hypercalcämien verschiedener Genese, Mangel des   cndogenen    Thyreocalcitonins infolge Ausfall von Schilddrüsengewebe,   Hyperfunktion    der Nebenschilddrüsen.



     Dic    neue Verbindung ist indiziert bei allen Knochenaffektionen, die auf einem vermehrten Abbau beruhen oder bei welchen eine vermehrte Calciumfixation im Knochen erwünscht ist, z. B. Osteoporose verschiedener Genese (z. B. postklimakterisch, posttraumatisch, bedingt durch Corticosteroidtherapie oder   Inaktivität    usw.), Frakturen, Osteomalacie, Rachitis sowie insbesondere zur Kombinationstherapie mit Calcium bzw.



  Phosphat. Die biologische Prüfung der neuen Verbindung crgab eine Wirksamkeit von etwa 100 bis 450   MRC-Einheiten!mg    Peptid. Die crforderliche Tagesdosis   (i. nl.    verabreicht) in MRC-Einheiten beträgt 20   mE    bis 10 E, vorzugsweise 100 mE/kg Tiergewicht.



   Beim Menschen beträgt die tägliche Dosis (i. m.



  verabreicht) in MRC-Einheiten 1 bis 500 E. Vorzugsweise wird eine tägliche Dosis von 5 E i. m. verabreicht.



   Die neue Verbindung kann als Heilmittel, z.B. in Form pharmazeutischer Präparate, Verwendung finden.



  Diese enthalten die genannte Verbindung in Mischung mit einem für die parenterale Applikation geeigneten organischen oder anorganischen Trägermaterial. Für dasselbe kommen solche Stoffe in Frage, die mit der neuen Verbindung nicht reagieren, wie z. B. Gelatine, Milchzucker, Stärke.   IxvIagnesiumstearat,    Talk, pflanzliche Öle, Benzylalkohole, Gummi arabicum, Polyalkylenglykole, Vaseline, Cholesterin oder andere bekannte Arzneimittelträger. Die pharmazeutischen Präparate können z. B. in flüssiger Form als Lösungen, Suspensionen oder Emulsionen vorliegen.

  Gcgebenenfalls sind sie sterilisiert und bzw. oder enthalten Hilfsstoffe, wie   Konservicrungs-.      Stabilisierungs-,    Netzmittel   ruder      EmuiiYiermittel.      Sic      können    auch noch andere, therapeutisch wertvolle Stoffe enthalten. Die neue Verbindung kann auch in Form eines   Depotpräparates    verabreicht werden.



   Die neue Verbindung und ihre Salze kann auch als   Zwischen produkt    zur Herstellung von   pharmazeutischen    Präparaten Verwendung finden.



   Es werden folgende Abkürzungen verwendet:
Z = Carbobenzoxy
Bzl   - Benzyl   
BOC = tert.-Butyloxycarbonyl
Trt = Trityl = Triphenylmethyl
OTB = tert.-Butyloxy
ONP = p-Nitrophenylester
OCP = 2,4,5-Trichlorphenoxy
OMe Methoxy
OEt   Äthoxy   
NO.2 = Nitro
Ser = L-Seryl
Asn L-Asparaginyl
Leu = L-Leucyl
Thr = L-Threonyl
Val = L-Valyl
Ala   ¯.    L-Alanyl
Tyr L-Tyrosyl
Trp = L-Tryptophenyl
Arg = L-Arginyl
Lys = L-Lysyl
Phe = L-Phenylalanyl
Glu   =      L-Glutamyl   
His = L-Histidyl
Pro = L-Prolyl
Gly   -    Glycyl
Nle   ---.    L-Norleucvl
Cys L-Cysteinyl    Tn    den folgenden Beispielen, die die Ausführung des Verfahrens erläutern, den Umfang der Erfindung aber in keiner Weise einschränken sollen, 

   erfolgen alle Temperaturangaben in Celsiusgraden.  



   Teilsequenz A    L-Phenylalanyl-glycyl-L-prolyl-&gamma;-tert.-butyloxy   
L-glutamyl-L-threonyl-L-prolinamid    (H-Phe-Gly-Pro-Glu(OTB)-Thr-Pro-NHJ)   
Man löst bei -5  134 g   Z-Thr-NH-NH.    in 2 Liter
In Salzsäure und versetzt mit 0,55 Liter In Natriumnitrit. Nach 5 Minuten wird Kaliumcarbonat bis pH 9 zugegeben, das entstandene Azid mit Äthylacetat extrahiert und eine Lösung von 80 g   H-Pro-NH2 # hydro-    chlorid in 100 ml Wasser, 500 ml Dimethylformamid und 77 ml Triäthylamin hinzugefügt. Man verdampft das Athylacetat bei 200 im Vakuum und lässt über Nacht bei 250 stehen. Die restliche Lösung wird im Vakuum verdampft, der Rückstand in   Athylacetat    gelöst, mit Wasser, verdünnter Salzsäure und einer wässrigen Kaliumcarbonatlösung gewaschen und über Natriumsulfat getrocknet.

  Man verdampft im Vakuum, löst in warmem   Äthylacetat    und kühlt ab. Man erhält Z-THr-Pro-NH2; Smp. 148 ,   [&alpha;]D30    = -72  in 95% Essigsäure. Man löst hierauf 90   ,      Z-Thr-Pro-NH2    in 2 Liter Dioxan und 260   nil    In Salzsäure und hydriert bei 20 ' und   Nortnaldruck    in Gegenwart eines Palladiumkatalysators Man filtriert, verdampft die Lösung   im      Vakuum,    wäscht den Rückstand mit Äthylacetat und erhält   H-Thr-Pro-NH2 #    HCl, Smp. 216 ,   [&alpha;]D20 = -64     in 95% Essigsäure. Dieses wird in 500 ml Dimethylformamid, 50 ml   Wasser    und 32 ml Triäthylamin gelöst und 118 g Z-Glu(OTB)-OCP und 800 ml Tetrahydroluran zugegeben.

  Man lässt über Nacht bei 200 stehen,   verdampft    im   Vakuum    und kristallisiert den Rückstand mit Äthyläther.   Man    erhält Z-Glu(OTB)-Thr-Pro-NH2, Smp. 650 (Zers.),   [&alpha;]D20      180    in Dimethylformamid.



   Man löst 80 g Z-Glu(OTB)-Thr-Pro-NH2 in 1,5 Liter Dioxan und 200 ml Wasser und hydriert bei 200 und Normaldruck in Gegenwart eines Palladiumkatalysators. Die Lösung wird filtriert und im   Vakuum    ver   dampft    und der Rückstand mit Diäthyläther versetzt, wobei H-Glu(OTB)-Thr-Pro-NH2 erhalten wird, Smp.



  65  (Zers.)   [&alpha;]D20    = -28  in Dimethylformamid. Dieses wird in 700   ml      Dimethyfformamid    bei OJ gelöst, 200 ml Acetonitril, 68 g Z-Phe-Gly-Pro-OH und 32 g Dicyclo   hexylcarbodiimid    hinzugefügt, über Nacht bei   200    stehengelassen, filtriert, im Vakuum eingedampft und mit Athylacetat versetzt. Danach wäscht man die Lö   sung    mit Wasser. verdünnter Salzsäure und wässriger Kaliumcarbonatlösung, trocknet über Natriumsulfat.



  Verdampft im Vakuum und kristallisiert den Rückstand aus Äthylacetat/Äthyläther. Man erhält Z-Phe-Gly-Pro Glu(OTB)-Thr-Pro-NH2 vom Smp. 120  (Zers.), [2]D20 =   --66-    in Dimethylformamid, das man in 1500 m! Dioxan und 300 ml Wasser löst. Man gibt 30 g Palladiumkohle (10%) zu   uild    hydriert bis zum   Fnde    der   Wasserstoff-    aufnahme. Man filtriert, dampft das Filtrat ein und kristallisiert den   Rückstand      aus    Dioxan. Man erhält das H-Phe-Gly-Pro-Glu(OTB)-Thr-Pro-NH2, Smp.



     153  [&alpha;]D20    = -79  in Dimethylformamid.



   Teilsequenz B
Benzyloxycarbonyl-L-seryl-glycyl-L-norleucyl glycin  (Z-Ser-Gly-Nle-Gly-OH) a) Benzyloxycarbonyl-L-norleucyl-glycin  (Z-Nle-Gly-OH)
Man löst   31,6    g H-Giy-OH in   420    ml In Natron   laute,    gibt   84()    ml   Tetrahydrofuran      zu.    versetzt anschliessend Illit   130    g Z-Nle-ONP, schüttelt, bis die Lösung klar wird, lässt eine Nacht bei 250 stehen. Dann wird im Vakuum auf 500 ml konzentriert und die erhaltene wässrige Lösung   mit    In NaOH auf pH 9 gestellt, zweimal mit Äther extrahiert, dann mit 4n Salzsäure angesäuert und mit Essigester extrahiert. Die Essigesterlösung wäscht man mit Wasser und mit NaCl 30%, trocknet über Natriumsulfat, dampft im Vakuum ein.



  Den Rückstand verreibt man mit Äther, lässt zwei Stunden bei -20  kristallisieren und erhält so Z-Nle Gly-OH, Smp. 138 ,   [&alpha;]D30    = -4  in Dimethylformamid.



  b) Benzyloxycarbonyl-glycyl-L-norleucyl-glycin  (Z-Gly-Nle-Gly-OH)
Man löst 100 g Z-Nle-Gly-OH in 1000 ml 4n   HBríEisessig,    lässt 50 Minuten bei 250, verreibt mit   Äther,    filtriert die Kristalle ab und wäscht gut mit Äther.



  Man erhält   HBr H-Nle-Gly-OH,      [&alpha;]D26    = +   24,70    in Essigsäure, 95 %.



   Man löst   84    g   HBr#   H-Nle-Gly-OH in 240 ml H20, versetzt mit 152 ml 4n NaOH, 800 ml Tetrahydrofuran und 91 g   Z-Gly-ONP.    Man schüttelt 1 Stunde bei 250, lässt dann 2 Tage bei 250 stehen. Man konzentriert im   Vakuum    auf S00 ml ein, stellt mit in Natronlauge auf pH 9 ein und extrahiert mit Äther. Die H2O-Phase wird mit In Salzsäure   angesäuere,    dann zweimal mit Essigester extrahiert. Man wäscht mit   HaO,    NaCl   30 %,    trocknet über Natriumsulfat, dampft im Vakuum ein,   vcrreibt    den Rückstand mit Äther. Man erhält Z-Gly Nle-Gly-OH, Smp. i550,   [&alpha;]      D    = -5,6  in Dimethylformamid.



  c) Benzyloxycarbonyl-L-seryl-glycyl-L-norleucyi glycin  (Z-Ser-Gly-Nle-Gly-OH)
Man löst 89,5 g Z-Gly-Nle-Gly-OH in 900 ml 4n HBr/Eisessig, lässt   50    Minuten bei 250 stehen. dampft im   Vakuum    ein, verreibt mit   Ather,    filtriert, wäscht gut   nli.    Äther trocknet im Vakuum, löst in 280 ml Wasser   etwa    650 ml Dimethylformamid, gibt 66,5 ml Triäthyl   amill    zu und versetzt mit dem Azid, das wie folgt erhalten wird:

  :    Man    kühlt 940 ml In Salzsäure auf -5 , gibt 96 g   Z-Ser-NH-NH.    zu und tropft dann bei -5  360 ml 1n Natriumnitrit ein, rührt noch 6 Minuten bei -5 , überschichtet mit etwa 600 ml Essigester von 0 , stellt unter Zugabe   voil    festem Na2CO3 auf pH 8,5, trennt die Essigesterphase ab, extrahiert nochmals, trocknet die Lösung über Natriumsulfat und filtriert. Die Reak   tionsiösung    dampft   man    im Vakuum ein, versetzt den   Rückstand    mit 600 ml Wasser, säuert an, extrahiert   nit    Äthylacetat,   wäscht      mit    Wasser. mit NaCl 30% kühlt auf   ü'      und    filtriert die Kristalle ab. 

  Man erhält Z-Ser-Gly-Nel-Gly-OH vom Smp.   210    mit Zers.,   [&alpha;]D20    = -8  in Dimethylformamid.



   Teilsequenz C    N69N@@-Ditrityl-L-histidyl-tert.-butyloxy-    carbonyl-L-lysyl-L-phenylalaninhydrazid  (Trt)-His(Trt)-Lys(BOC)-Phe-NH-NH2 a) Z-Lys(BOC)-Phe-OMe    94,8    g   H-Phe-OMe # HCl    werden in 1 Liter Äther und etwa 50 ml Eiswasser gelöst und unter Rühren und Kühlen genügend Natriumcarbonat zugegeben, bis alles Wasser ab abgebunden ist. Man filtriert und dampft das Filtrat bis zur Gewichtskonstanz ein, wobei ein farbloses   Öl    erhalten wird.  



   144 g Z-Lys(BOC)-OH werden in 300 ml Acetonitril und 150 ml Dimethylformamid gelöst und mit dem oben erhaltenen H-Phe-OMe versetzt. Danach wird auf   -200    abgekühlt und eine Lösung von 90,8 g Dicyclohexylcarbodiimid in 100 ml Acetonitril zugegeben. Das Ganze lässt man unter zeitweiligem Umschütteln während 4 Stunden im Eiskasten stehen. Der entstandene Niederschlag wird abfiltriert und das Filtrat eingedampft. Der Eindampfrückstand wird in 1 Liter Essigester gelöst und hierauf in der Kälte mit in Sodalösung, Wasser, in Schwefelsäure, Wasser und gesättigter Kochsalzlösung gewaschen. Die über Natriumsulfat getrocknete Essigsäureäthylester-Phase wird vollständig eingedampft. Nach Umkristallisieren aus Essigester/Petroläther erhält man Z-Lys(BOC)-Phe-OMe; Smp. 102 bis 105 ,   [&alpha;]D20    = -7 , -12  in Dimethylformamid.



  b)   H-Lys(BOC)-Phe-OMe #    HCl
29 g Z-Lys(BOC)-Phe-OMe werden in 500 ml Methanol gelöst und nach Zugabe von 53 ml in HCl/ Methanol in Anwesenheit von Palladiumkohle hydriert.



  Nach Filtrieren und Eindampfen wird der Rückstand im Hochvakuum getrocknet.



  c) Z-His-Lys(BOC)-Phe-OMe
45 g H-Lys(BOC)-Phe-OMe   # HCl    werden in einem Gemisch von 300 ml Acetonitril und 50 ml Dimethylformamid gelöst, danach eine Lösung von 40 g   Z-His-N3    in 150 ml Essigester und 20 ml Triäthylamin zugegeben und das Ganze 4 Stunden bei   0     stehengelassen. Nach Abfiltrieren wird das Filtrat eingedampft. Der Rückstand wird in Essigsäureäthylester aufgenommen und anschliessend mit gesättigter Kochsalzlösung gewaschen.



  Die über Natriumsulfat getrocknete Essigsäureäthylester Phase wird vollständig eingedampft, wobei Z-His Lys(BOC)-Phe-OMe (hellbeiger, amorpher Schaum) erhalten wird.   [&alpha;]D20    =   - 110    in Dimethylformamid.



  d) H-His-Lys(BOC)-Phe-OMe    HC1   
96 g Z-His-Lys(BOC)-Phe-OMe werden in 2000 ml Methanol gelöst. Danach werden 10 g   10SS    Palladium auf Aktivkohle in 120 ml In Salzsäure angerührt und in die Lösung gegeben. Das Ganze wird einer 2stündigen Hydrierung unterworfen und anschliessend der Katalysator abfiltriert. Das Filtrat wird erneut mit 5 g 10% Palladium auf Aktivkohle in Wasser versetzt und der Hydrierung unterworfen, die nach   51/2    Stunden beendet ist. Hierbei werden etwa 80 % der theoretischen Menge Wasserstoff verbraucht. Der Katalysator wird   abfiltriert    und das Filtrat vollständig eingedampft, wobei   H-ll.-Lys(BOC)-Phe-OMe    HCl in Form eines amorphen Schaumes erhalten wird.



  e)   Trt-His(Trt)-Lys(B OC)-Phe-OMe   
144 g   H-His-Lys(BOC)-Phe-OMe      # HCl    werden in 3000 ml Pyridin gelöst. Eei etwa + 5  werden 122 ml Triäthylamin zugegeben und anschliessend eine Lösung von 207 g Tritylchlorid in 100 ml Pyridin während 5 Minuten zugetropft. Nach Beendigung der Zugabe wird von Zeit zu Zeit das pH geprüft und nötigenfalls mit Triäthylamin auf etwa pH 9 gestellt. Das Ganze wird nach ungefähr 4 Stunden eingedampft, der Rückstand in Chloroform und Wasser aufgenommen und unter Zugabe von wenig in Salzsäure auf pH 4 gestellt.



  Man trennt die Chloroformphase ab, wäscht sie zweimal mit Wasser, trocknet über Natriumsulfat und dampft vollständig ein. Der Rückstand wird mit Äther gelöst, mit Petroläther gefällt und anschliessend abfiltriert, wobei Trt-His(Trt)-Lys(BOC)-Phe-OMe erhalten wird.



     [&alpha;]D20      = -26     in Dimethylformamid.



  f) Trt-His(Trt)-Lys(BOC)-Phe-NH-NH2
134 g Trt-His(Trt)-Lys(BOC)-Phe-OMe werden in 1000 ml Methanol gelöst und mit 60 ml Hydrazinhydrat versetzt. Danach wird 2 Tage bei Zimmertemperatur stehengelassen. Man dampft ein, löst den Rückstand in einem Gemisch von Essigester/n-Butanol   (9:1)    und wäscht zweimal mit Wasser. Die organische Phase wird über Natriumsulfat getrocknet und eingedampft.



  Hierauf wird der Rückstand mit Äther gewaschen und abfiltriert. Er besteht aus Trt-His(Trt)-Lys(BOC)-Phe NH-NH2 vom Smp. 125  mit Zers.,   [&alpha;]D20    = +10  in Dimethylformamid.



     Teilseqllenz    D    1 -(L-Asparaginyl-L-leucyl-L-asparaginyl-   
L-asparaginyl-L-phenylalanin)-2-benzyloxy carbonyl-hydrazid   Trifluoracetat     (H-Asn-Leu-Asn-Asn-Phe-NH-N H-Z    Trifluor-    acetat) a) 1-(N-tert.-Butyloxycarbonyl-L-phenylalanin)
2-benzyloxycarbonyl-hydrazid  (BOC-Phe-NH-NH-Z)
Man löst 72 g BOC-Phe-OH und 28 g N-Methylmorpholin in 500 ml Methylenchlorid auf und tropft bei   -5     26 ml Chlorameisensäuremethylester zu. Nach 10 Minuten gibt man noch 44 g Z-NHNH2 in 100 ml Methylenchlorid zu und rührt 4 Stunden bei Zimmertemperatur weiter. Nach Auswaschen mit verdünnter phosphoriger Säure wird getrocknet und eingedampft.



  Nach Kristallisieren aus Petroläther erhält man BOC Phe-NH-NH-Z vom Smp.   117',      [&alpha;]      =      = -5     in Dimethylformamid.



  b) 1-(N-tert.-Butyloxycarbonyl-L-asparaginyl
L-phenylalanin)-2-benzyloxycarbonyl-hydrazid  (BOC-Asn-Phe-NH-NH-Z)
Man löst 41 g BOC-Phe-NHNH-Z in 400 ml Trifluoressigsäure und lässt eine Stunde bei 200 stehen.



  Beim Verdampfen der Trifluoressigsäure erhält man das H-Phe-NHNH-Z als kristallines Trifluoracetat vom Smp.   1910,      [1 S =    +   26,4    in Dimethylformamid.



  Diese Substanz wird zusammen mit 35 g BOC-Asn ONP und 30 g N-Methylmorpholin in 200 ml Dimethylformamid gelöst. Nach 16 Stunden Stehen bei   20a    wird das Lösungsmittel verdampft und der Rückstand nacheinander mit Essigester und verdünnter phosphoriger Säure gewaschen. Man erhält BOC-Asn-Phe NH-NH-Z von Smp. 210 ,   [&alpha;]D20    = -18  in Dimethylformamid.



  c) l-(N-tert.-Butyloxycarbonyl-L-asparaginyl    L-asparaginyl-L-phenylalanin)-2-benzyloxy-    carbonyl-hydrazid    (BOC-Asn-Asn-Phe-NH-NH-Z)       Man    löst 26 g   BOC-Asn-Phe-NH-NH-Z    in   200    ml Trifluoressigsäure auf und lässt 1 Stunde bei 20  stehen.

 

  Nach Verdampfen des Lösungsmittels versetzt man in
100 ml   Dimethylformamid      mit    17 g BOC-Asn-ONP und 15 g N-Methylmorpholin. Nach 16 Stunden bei 20  wird das Lösungsmittel   verdampft    und der   Rücii    stand nacheinander mit Essigester und verdünnter   phc    phoriger Säure gewaschen.   Nian    erhält BOC-Asn-As Phe-NH-NH-Z. Smp.   240±,      [J    20   28C    in Dimeth formamid.  



  d) 1-(N-tert.-Butyloxycarbonyl-L-leucyl
L-asparaginyl-L-asparaginyl-L-phenylalanin)
2-benzyloxycarbonyl-hydrazid  (BOC-Leu-Asn-Asn-Phe-NH-NH-Z)
Man löst 22 g BOC-Asn-Asn-Phe-NH-NH-Z in 150 ml Trifluoressigsäure und lässt 1 Stunde bei   20     stehen. Nach Verdampfen des Lösungsmittels wird der Rückstand mit 12   g BOC-Leu-ONP    und 10 g N-Methylmorpholin in 100 ml Dimethylformamid versetzt. Nach 16 Stunden Stehenlassen bei   20     wird das Dimethylformamid verdampft und der Rückstand nacheinander mit Essigester und verdünnter phosphoriger Säure gewaschen. Man erhält BOC-Leu-Asn-Asn-Phe-NH-NH-Z vom Smp.   210 ,      [&alpha;]D20    =   -34     in Dimethylformamid.



  c) 1-(N-tert.-Butyloxycarbonyl-L-asparaginyl
L-leucyl-L-asparaginyl-L-asparaginyl-L-pheny alanin)-2-benzyloxycarbonyl-hydrazid  (BOC-Asn-Leu-Asn-Asn-Phe-NH-NH-Z)
Man löst 57 g BOC-Leu-Asn-Asn-Phe-NH-NH-Z in 300 ml Trifluoressigsäure und lässt eine Stunde bei   20     stehen. Nach Verdampfen des Lösungsmittels wird der Rückstand in äther kristallisiert. Man löst das Tetrapeptid-trifluoracetat in 400 ml Dimethylformamid und   versetz,    die Lösung mit 27 g BOC-Asn-ONP und   15    g   N-Methylmerpholin.    Nach 16 Stunden Stehenlassen bei   20     wird das   Lösuntrsmittel    verdampft und der Rückstand nacheinander mit Essigester und verdünnter phosphoriger Säure gewaschen.

  Man erhält BOC-Asn Leu-Asn-Asn-Phe-NH-NH-Z vom Smp.   250     (Zers.),   [&alpha;]D20    =   -    -34  in Dimethylformamid.



  f) 1-(L-Asparaginyl-L-leucyl-L-asparaginyl
L-asparaginyl-L-phenylalanin)-2-benzylox    carhonyl-hydrazid    zu trifluoracetat    (H-Asn-Leu-Asn-Asn-Phe-NH-NH-Z # Trifluor-    acetat)
Man löst 43,5 g BOC-Asn-Leu-Asn-Asn-Phe-NH-   SH-Z    in 200 ml Trifluoressigsäurc und lässt eine Stunde bei   '0-      stehen.    Nach Eindampfen wird der Rückstand mit Hilfe von Ather kristallisiert. Man erhält H-Asn    Leu-Asn-Asn-Phe-NH-NH-Z # Trifluoracetat, Smp.   



     142O,      [&alpha;]D20      v      2     in   DimethylEormamid.   



   Teilsequenz E
Trityl-L-seryl-L-alanyl-L-tyrosyl-L-try    L-arginin-hydrazid     (Trt-Ser-Ala-Tyr-Trp-Arg-NHNH2) a) N-tert.-Butyloxycarbonyl-L-tryptophenyl.



   (guanido)N-nitro-L-argininmethylester  (BOC-Trp-Arg(NO2)-OMe)
Man ist   35    g H-Arg(NO3)-OMe   HCI.    63   g    BOC   1rp-UCP    und 14 g N-Methylmorpholin in 300 ml Dimethylformamid auf und lässt 16 Stunden bei 20  stehen. Nach Verdampfen des Lösungsmittels wird der Rückstand in Essigester aufgenommen und mit verdünnter   Schwefcìsäure    gewaschen. Man   cngt    etwas cin und   Fällt    mit Äther   aus.    Dabei   kristallisicrt    BOC-Trp   Arg(NO2)-OMe vom Smp. 130 , [&alpha;]D20 = - 22  in Dimctllylformamid.   



  b) N-tert.-Butyloxycarbonyl-L-tyrosyl-L-trypto phenyl-(guanido)N-nitro-argininmethylester  (BOC-Tyr-Trp-Arg(NO2)-OMe)    A,lan    löst 15 g   BOC-Trp-Arg(NO,)-OMe    in   .80    ml 5n   mL thanoliscller    Salzsäurelösung auf und   lässt      I    Stunde   lrei      Zimmertcmperatur    stchen. Nach   'Xcrdampfcn    des   L ösunçTsmittcls    und Bchandeln mit Ather verbleiben 13 g H-Trp-Arg(NO2)-OMe als Hydrochlorid zurück; Smp.   120 ,    [a]D =   -9     in Dimethylformamid.

  Dieses Dipeptid wird zusammen   nait    14 g BOC-Tyr-OCP und   8      r,r      N-Methylmorpholin    in 200 ml Dimethylformamid gelöst. Nach   16    Stunden Stehen bei   20     wird das Lösungsmittel verdampft und der Rückstand in Essigester aufgenommen. Nach Waschen mit verdünnnter phosphoriger Säure und Einengen des Lösungsmittels kann man mit Hilfe von äther BOC-Tyr-Trp-Arg(NO2)-OMe   isolieren;    Smp.   130 ,      [&alpha;]D20      =      -11     in Dimethylformamid.



  c) tert.-Butyloxycarbonyl-L-alanyl-L-tyrosyl
L-tryptophenyl-(guanido)N-nitro-L-arginin methylester  (BOC-Ala-Tyr-Trp-Arg(NOi)-OMe)
Man löst 13,5 g BOC-Tyr-Trp-Arg(NO2)-OMe in 130 ml 5n methanolischer Salzsäurelösung auf, lässt 1 Stunde bei 25  stehen, dampft zur Trockne ein, wäscht den   Rückstand      Init    Dimethyläther, filtriert ab, löst in   100    ml Dimethylformamid auf und versetzt mit 8,0 g   BOC-Ala-OCP    und 3,0 ml Triäthylamin. Nach 16 Stunden bei   25       eibt    man 500 ml Essigester hinzu,   wcischt    mit verdünnter Schwefelsäure und Kaliumbicarbonatlösung und dampft zur Trockne ein.

  Nach Waschen des Rückstandes mit Chloroform erhält man BOC-Ala-Tyr-Trp-Arg(NO2)-OMe vom Smp. 120  (Zers.),   [&alpha;]D20    = -12  in Dimethylformamid.



  d) tert.-Butyloxycarbonyl-L-seryl-L-alanyl-L-tyrosyl
L-tryptophanyl-(guanido)N-nitro-L-arginin    methylester     (BOC-Ser-Ala-Tyr-Trp-Arg(NO2)-OMe)
Man löst   12,3      g,    BOC-Ala-Tyr-Trp-Arg(NO2)-OMe in 100 ml 5n methanolischer Salzsäure, lässt   I    Stunde bei   25     stehen, dampft zur Trockne ein, wäscht den   ,Rückstand    mit Diäthyläther, löst ihn in 100 ml Dimethylformamid, versetzt mit 14 ml Triäthylamin und   8.5      °    BOC-Ser-N7, lässt 16 Stunden bei   0     stehen, gibt   500    ml Essigester zu, wäscht nacheinander mit verdünnter Schwefelsäure und Ammoniumhydroxid, trocknet über Natriumsulfat und dampft das Lösungsmittel ab.

  Nach Waschen des Rückstandes mit Chloroform löst man ihn in Essigester und fällt durch Zugabe von Di äthyläther. Man erhält 13,5 g   BOC-Ser-Ala-Tyr-Trp-      Arg(NO2)-OMe; Smp. 135  (Zers.). [&alpha;]D20 = -15  in    Dimethylformamid.



  e) Trityl-L-seryl-L-alanyl-L-tyrosyl-L-triptophanyl    L-arginin # hydrazid     (Trt-Ser-Ala-Tyr-Trp-Arg-NHNH2)
Man löst 13.2 g von dem obigen Pentapeptidester in 300 ml Essigsäure, gibt 60 ml Wasser und 13,2 g Palladium-Kohle (10 %ig) zu und hydriert bis zum Endc   d7r      7'asserstoffaufnahme.    Man filtriert, dampft ab. löst den Rückstand in Dimethylformamid auf,   dampft    wiederum ab. u dic Spurcn von Essigsäure zu beseitigen.

  Anschliessend löst man den Rückstand in 250 ml 5a methanolischer Salzsäure, lässt 1 Stunde bei 20 stehen, dampft ab, löst in Methanol, dampft   alb      Ulld      iost    in   25()    ml   Pyridin    auf.   Danacll    gibt man 10 ml Triäthylamin zu, kühlt auf 0 , gibt 9,5 g Triphenylchlormethan zu und lässt   16    Stunden bei   0 '    stehen. 

  Man dampft zur Trockne ein, löst in Essigester und wäscht mit cincr 5%igen   NaCI-Lösung    Man trocknet,   dampft      ab,      wäscht    den Rückstand mit   cinem    Gemisch von Diäthyläther-Petroläther (2:1) und löst in 260 ml Methanol, versetzt mit 26 ml Hydrazinhydrat und lässt 16 Stunden bei 40  stehen. Man dampft ab,  wäscht den Rückstand bis zur Neutralität mit Wasser und trocknet im Hochvakuum über Schwefelsäure. Man erhält Trt-Ser-Ala-Tyr-Trp-Arg-NHNH2, Smp. 153 ,   [aj      !E)    = -6  in Dimethylformamid.



   Teilsequenz F1
L-Threonyl-S-benzyl-L-cysteinyl-L-valyl-L-leucin methylester hydrobromid  (H-Thr-Cys(Bzl)-Val-Leu-OMe   HBr)    a)   H-Cys(Bzl)-Val-Leu-OMe      HBr   
Man löst 21,0   g Z-Cys(Bzl)-OCP    und 12,3 g H-Val   Leu-OMe # HCl    in 120 ml Dimethylformamid. Danach gibt man 5,9 ml Triäthylamin hinzu, lässt 16 Stunden bei 250 stehen, fügt Essigester hinzu, wäscht mit verdünnter Salzsäure, trocknet über Natriumsulfat, dampft zur Trockne ab und   kristallisiert    den Rückstand aus Essigsäureäthylester/Diäthyläther. Man erhält Z-Cys (Bzl)-Val-Leu-OMe, Smp. 160 ,   [&alpha;]D20 =    -28  in Dimethylformamid, das man in 210 ml einer 40 %igen Lösung von Bromwasserstoff in Eisessig löst.

  Man lässt
1 Stunde bei   25     stehen, dampft zur Trockne ein und kristallisiert den Rückstand aus Isopropanol/Diäthyl äther um. Man erhält   H-Cys(Bzl)-Val-Leu-OMe #    HBr,   Smp. 168 , [&alpha;] = +14  in Dimethylformamid.   



  b)   H-Thr-Cys(Bzl)-Val-Leu-OMe #    HBr
Man löst 20 g Z-Thr-NHNH2 in 350 ml Dimethyl   formamid.    kühlt auf   -200,    gibt 100 ml einer Lösung von 2n Salzsäure in Dioxan und anschliessend noch 10 ml tert.-Butylnitrit zu. Nach 10 Minuten   bei 200    werden 45 ml Triäthylamin und 25,5 g H-Cys(Bzl)-Val   Leu-OMe #    HBr hinzugefüht und das erhaltene Gemisch während 16 Stunden bei 0  geschüttelt. Man dampft zur Trockne ein, löst den Rückstand in einem Gemisch von EssigsäureäthylesteriWasser, wäscht die organische Phase mit verdünnter Salzsäure, trocknet über Natriumsulfat. dampft ein und kristallisiert den Rückstand aus Essigester um. Man erhält Z-Thr-Cys(Bzl)-Val-Leu OMe, Smp. 208 ,   [&alpha;]D20    = -27  in Dimethylformamid.



   Man löst   20      g    von dem oben erhaltenen Tetrapeptid in 200 ml eines Gemisches von Trifluoressigsäure/Essigester   (1: 1)    auf, leitet während 1 Stunde bei 0  einen Strom   gasförmigen    Bromwasserstoffs ein. dampft anschliessend ein und kristallisicrt den Rückstand aus   Methanol    - Diäthyläther um. Man erhält H-Tyr-Cys(Bzl)   Val-Leu-OMe #    1,3 HBr, Smp. 202 ,   [&alpha;]D20 =    -10  in Dimethylformamid.



   Teilsequenz F2 tert.-Butyloxycarbonyl-S-benzyl-L-cysteinyl
L-seryl-L-asparaginyl-L-leucyl-L-serin-hydrazid  (BOC-Cys(Bzl)-Ser-Asn-Leu-Ser-NH-NH2) a)   H-Asn-Leu-Ser-OMe #    HCl
Man löst   43    g   H-Leu-Ser-OMe # HCl    und 53   tt      i3OC-Asn-ONP    in 400 ml Dimethylformamid auf, gibt 22 ml Triäthylamin zu, lässt 16 Stunden bei 25  stehen, dampft zur Trockne ein und kristallisicrt den Rückstand aus Methanol   Um.      Man    erhält 51,6 g BOC-Asn-Lcu Ser-OMe, Smp. 190 ,   [&alpha;]D20 =    -24  in Dimethylformamid. das man in   500    ml einer   4n-Lösung    von Salzsäurc in Methanol löst.

  Man lässt 1 Stunde bei   75      stehen,    dampft zur Trockne ein, löst den Rückstand in   Methanol    und fällt mit Diäthyläther. Man erhält H-Asn   Leu-Ser-OMe # HCl. Smp. 180 , [&alpha;]D20 = -23  in Di-    methylformamid.



  b) H-Ser-Asn-Leu-Ser-OMe   # HCl       Man    löst 39,5 g   BOC-Scr-NHNH.    in 500 ml Di   methylforma;nid,    kühlt auf   -20 ,    gibt 200 ml einer 2n-Lösung von Salzsäure in Dioxan und anschliessend 20 ml tert.-Butylnitrit zu. Nach 10 Minuten bei -20  werden 40 ml Triäthylamin und   3S,0      g    H-Asn-Leu   Ser-OMe # HCl    hinzugefugt, danach 16 Stunden bei 0    gcrührt,    zur Trockne eingedampft und der Rückstand aus   Chloroform/Diäthyläther    umkristallisiert. Man erhält BOC-Ser-Asn-Leu-Ser-OMe, Smp. 135 ,   [&alpha;]D20    = -22  in Dimethylformamid, das man in 420 ml einer 4n-Salzsäurelösung in   Methanol    löst.

  Man lässt 1 Stunde bei 250 stehen, dampft zur Trockne ein und kristallisiert aus Methanol/Essigsäureäthylester um. Man erhält   H-Ser-Asn-Leu-Ser-OMe    HCl, Smp. 1550 (Zers.),   [&alpha;]D20    = -15  in Dimethylformamid.



  c) BOC-Cys(Bzl)-Ser-Asn-Leu-Ser-NHNH2
Man löst 18,5 g H-Ser-Asn-Leu-Ser-OMe   # HCl    und 18,0 g BOC-Cys(Bzl)-ONP in 100 mi Dimethylformamid auf. gibt   10    ml Wasser, 3,5 ml Essigsäure und 5,6 ml Triäthylamin   zu,    lässt 16 Stunden bei 250 stehen, dampft zur Trockne ein und kristallisiert aus Methanol um. Man erhält 25.1 g BOC-Cys(Bzl)-Ser-Asn-Leu-Ser- OMe, Smp.   1820,      [&alpha;]      n"    -17  in Dimethylformamid, das man unter leichtem Erwärmen in 200   ml    Dimethylformamid löst.

  Man gibt 200 ml Methanol und 20 ml Hydrazinhydrat zu. lässt 16 Stunden bei 300 stehen, fällt mit Diäthyläther wäscht den Niederschlag mit Diäthyläther/Methanol (1:1) und trocknet das so erhaltene BOC - Cys(Bzl) -   Sor - Asn -    Leu-Ser-NHNH2, Smp.



     2240,      [&alpha;]D20 =    -13 in   Dimethylformamid.   



   Teilsequenz F tert.-Butyloxycarbonyl-L-hemicistinyl-L-seryl
L-asparaginyl-L-leucyl-L-seryl-L-threonyl
L-hemicistinyl-L-valyl-L-leucin-hydrazid  (BOC-Cys-Ser-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys-Val
Leu-NHNH2)
Man löst 18,4   g    BOC-Cys(Bzl)-Ser-Asn-Leu-Ser- NHNH2 (Teilsequenz F2) in 150 ml Dimethylformamid.



  kühlt auf   -20 ,    gibt 40 ml einer 2n-Lösung von Salzsäure in Dioxan und 15 ml   tert.-Butylnitrit    zu. Nach 10 Minuten bei -20  gibt man noch 28 ml Triäthylamin und 24.8 g   H-Thr-Cys(Bzl4-Val-Leu-OMe-    1,3 HBr (Tcilsequenz Fl) zu und rührt 16 Stunden bei 25 , Danach wird filtriert, die Lösung eingedampft und der Rückstand mit heissem   Methanol    durchgewaschen. Man erhält man BOC-Cys(Bzl)-Ser-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys(Bzi) Val-Leu-OMe, Smp. 242-244 ,   [&alpha;]D20    = -25  in Dimethylformamid das man bei   60    in 100 ml Dimethylformamid löst. Man gibt 10 ml Hydrazinhydrat zu und lässt 2 Stunden bei 60 stehen.

  Das entstandene Nonapeptidhydrazid kristallisiert aus.   Man    wäscht mit Di   äthyläther.    Wasser und Methanol und trocknet im Hochvakuum über Phosphorpentoxid. Man erhält Nonapeptidhydrazid vom Smp. 260  (Zers.),   [&alpha;]D20 =    -33 in Dimethylformamid Wasser   (3 1).    Man   suspcndicrt    das   erhaltende    Produkt in 5000 ml   getrocknetem    Ammo- niak, gibt unter   Rühren    und Sieden des Ammoniaks Natriummetall bis zur tiefblauen Färbung zu. 

  Zwecks   Entfärbung    wird   Ammoniumchlorid      hinzugefügt    und danach ein Luftstrom bis zur negativen Nitroprussiat   rcaktion    durch die   Lösung    geleitet. Man dampft zur Trockne ein und wäscht den Rückstand mit Wasser und Aceton durch. Nach Trocknen erhält man BOC  
EMI7.1     


<tb> Cys-Ser-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys-Val-Leu-NHNH3, <SEP> Smp.
<tb>   2980    <SEP> (Zcrs.), <SEP>    [&alpha;]D20 <SEP> = <SEP>     <SEP>    -20ç    <SEP> in <SEP>    Dimethylformamid/'vas-    <SEP> 
<tb> ser <SEP>    (3:1).    <SEP> 
<tb> 



   Teilsequenz ABC
L-Histidyl-a-tert-butyloxycarbonyl-L-lysyl
L-phenylalanyl-L-seryl-glycyl-L-norleucyl glycyl-L-phenylalanyl-glycyl-L-prolyl-tert.-butoxy    L-glutamyl-L-threonyl-L-prolinamid #    Triacetat  (H-His-Lys(BOC)-Phe-Ser-Gly-Lie-Gly-Phe
Gly-Pro-Glu(OTB)-Thr-Pro-NH2   # 3    CH3COOH) a) L-Seryl-glycyl-L-norleucyl-glycyl-L-phenylalanyl glycyl-L-prolyl-tert.-butyloxy-L-glutamyl
L-threonyl-L-prolinamid  (H-Ser-Gly-Nlc-Gly-Phe-Gly-Pro-Glu(OTB)    Thr-pro-NH2)   
Man löst 12 g   H-Phe-Gly-Pro-Glu(OTB)-Thr-Pro-      NHe    in 100 ml Dimethylformamid und   20    ml Acetonitril bei 0  und gibt   S.0    g   Z-Ser-G1y-Nle-Gly-OH,    4,0 g Dicyclohexylcarbodiimid zu, lässt über Nacht bei 0  stehen, filtriert,

   verdampft im Vakuum und kristallisiert aus Chloroform. Man erhält   Z-Ser-Gly-Nie-Gly-    Phe-Gly-Pro-Glu(OTB)-Thr-Pro-NH3, Smp. 125-138    [&alpha;]D20    = -44  in Dimethylformamid.



   Man löst in 400 ml Dioxan und 400 ml   HsO    und hydriert bei Normaldruck in Gegenwart von Palladiumkatalysator bis zum Ende der Wasserstoffaufnahme.



  Man filtriert, dampft im Vakuum ein, löst in   Methanol.   



  versetzt mit Äther und erhält H-Ser-Gly-Nle-Gly-Phe Gly-Pro-Glu(OTB)-Thr-Pro-NH3, Smp. 130  (Zers.),   [&alpha;]D20 =    -52  in Dimethylformamid.



  b)   L-Histidyl-#-tert.-butyloxycarbonyl-L-lysyl-   
L-phenylalanyl-L-seryl-glycyl-L-norleucyl    glyCyl-L-phenylalanyl-,glycyi-L-prolyl-tert.-butoxy-   
L-glutamyl-L-threonyl-l-prolinamid   # Triacetat     (H-His-Lys(BOC)-Phe-Ser-Gly-Nle-Gly-Phe    Gly-Pro-Glu(OTB)-Thr-Pro-NH2 #    3 CH2CO2H)    Man    löst 9.9 g Trt-His(Trt)-Lys(BOC)-Phe-NHNH2 in 100 ml Dimethylformamid, I;ühlt auf -20 , gibt 30   ml    Dioxan/HCl 2n und anschliessend 1,16 ml tert. Butylnitrit zu, rührt 10 Minuten bei -20 , gibt   28    ml Triäthylamin und    .7    g H-Ser-Gly-Nle-Gly-Phe-Gly-Pro- Glu(OTB)-Thr-Pro-NH2 zu. rührt 4 Stunden bei   0 ,      filtriert    und dampft zur Trockne ein.



   Man löst den Rückstand in einem Gemisch von Essigester/Methanol (8:2) auf, wäscht mit verdünntem Ammoniak und anschliessend mit Wasser bis zur Ncutralität. rocknet über Natriumsulfat. konzentriert auf 100   ml      ist und    fällt durch Zugabe von Diäthyläther.   Yvian    löst den niederschlag wiederum in Dimethylformamid auf   und    fällt durch Zugabe von Diäthyläther.

  Man erhält
Trt-His(Trt)-Lys(BOC)-Phe-Ser-Gly-Nle-Gly   
Phe-Gly-Pro-C;lu(OTB)-Thr-Pro-NH- (Smp. 135 Zers.). [&alpha;]D20 -3 1 in Dimethylformamid,    das   man    in 500 ml Essigsäure/Wasser   (8 : 2)    löst.   Man    lässt   3    Stunden bei 40    stchen.      dampft    ein. wäscht den   Rückstand    in Diäthyläther und trocknet im Hochvakuum   über    KOH-Späne, Man erhält
H-His-Lys(BOC)-Phe-Ser-Gly-Nle-Gly
Pro-Glu-(TOB)-Thr-Pro-NH2 3   CH    .COOH (Smp. 142 Zers.).   [&alpha;]D20 =    -45  in Dimethylformamid.



   Teilsequenz DE
Trityl-L-seryl-L-alanyl-L-tyrosyl-L-tryptophanyl
L-arginyl-L-asparaginyl-L-leucyl-L-asparaginyl    L-asparaginyl-L-phenylalanin-hydrazid #    Diacetat  (Trt-Ser-Ala-Tyr-Trp-Arg-Asn-Leu-Asn-Asn    Phe-NHNH--      2    CH.:COOH) a) 1-(N-Trityl-L-seryl-L-alanyl-L-tyrosyl    L-tryptophanyl-L-arginyl-L-asparaginyl-   
L-leucyl-L-asparaginyl-L-asparaginyl-L-phenyl alanin   )-2-benzyloxycarbonyl-hydrazid      . diacetat     (Trt-Ser-Ala-Tyr-Trp-Arg-Asn-Leu-Asn-Asn    Phe-NHNH-Z #    2 CH3COOH)
Man kühlt 320 ml Dimethylformamid auf -20 C, gibt 100 ml   2n    Chlorwasserstoff in Dioxan zu und löst darin 72 g   Trt-Ser-Ala-Tyr-Trp-Arg-NHNHn    (Teilsequenz E).

  Anschliessend versetzt man mit 12 ml tert. Butylnitrit. lässt   10    Minuten bei -20  rühren und tropft 35 ml Triäthylamin zu. Das so erhaltene Gemisch wird mit einer Lösung, entstanden aus 8,8 g H-Asn-Leu-Asn Asn-Phe-NHNH-Z Trifluoracetat (Teilsequenz D) und 17 ml Triäthylamin in 150 ml Dimethylformamid vereinigt. Nach 16 Stunden bei 0  wird eingedampft. Man löst den Rückstand in Essigester und wäscht mit verdünnter Essigsäure und Sodalösung. Nach Eindampfen des   Lösungsmittels    verbleibt das
Trt-Ser-Ala-Tyr-Trp-Arg-Asn-Leu-Asn-Asn    Phe-NHNH-Z #   2 CH3COOH vom Smp. 168 .   [&alpha;]D20 =    -19  in Dimethylformamid.



  b) Trityl-L-seryl-L-alanyl-L-tyrosyl-L-tryptophanyl
L-arginyl-L-asparaginyl-L-leucyl-L-asparaginyl    L-asparaginyl-L-phenylalanin-hydrazid #    Diacetat  (Trt-Ser-Ala-Tyr-Trp-Arg-Asn-Leu-Asn-Asn
Phe-NHNH2   #    2CH3COOH)    Man    löst 90 g   Trt-Srr-Ala-Tyr-TTrp-Ag-Asn-Leu-      Asn-Asn-Phe-WHNH-Z- 2 CHXCOOH    in 500 ml   Di-      methylformamid    und hydriert mit 10 g   Pd!C    (10 %ig) bis zum Ende der Wasserstoffaufnahme Nach Abfiltrieren des Katalysators wird das Lösungsmittel verdampft   und    der Rückstand aus einem Gemisch von Äther und Äthanol, enthaltend 1 %, Essigsäure, kristallisiert.

  Man erhält Trt-Ser-Ala-Tyr-Trp-Arg-Asn-Leu Asn-Asn-Phe-NHNH2.   2      CHCOOH    vom Smp.   2150,      [&alpha;]D20    = -53  in Dimethylformamid.



   Teilsequenz ABCDE
L-Scryl-L-aianyl-L-tyrosyl-L-tryptophanyl
L-arginyl-L-asparaginyl-L-leucyl-L-asparaginyl
L-asparaginyl-L-phenylalanyl-L-histidyl    #-tert.-butyloxycarbonyl-L-lysyl-L-phenyl-    alanyl-L-seryl-glycyl-L-norleucyl-glycyl
L-phenylalanyl-glycyl-L-prolyl-tert.-butyloxy    L-glutamyl-L-threonyl-L-prolinamid #    Hexaacetat  (H-Ser-Ala-Tyr-Trp-Arg-Asn-Leu-Asn-Asn
Phe-His-Lys(BOC)-Phe-Ser-Gly-Nle-Gly-Phe    Gly-Pro-Glu(OTB)-Thr-Pro-NH2 #    6 CH3CO2H)
Man löst 15.8 g Trt-Ser-Ala-Tyr-Trp-Arg-Asn-Leu    Asn-Asn-Phe-NHNH2 # Diacetat (Teilsequenz DE) in    260 ml Dimethylformamid, kühlt auf -20 , gibt 15 ml Dioxan   ilCi    2n und anschliessend 1,16 ml tert.-Butyl-   nie@@    zu und rührt 10 Minuten bei -20. 

  Man gibt
14 ml Triäthylamin und eine Lösung von 18.6 g des in Teilsequenz ABC erhaltenen Tridecapeptidacetats in Dimethylformamid zu,   rührt    das   erhaltene    Gemisch    1 6      Stunden    bei 0 , filtriert   und    dampft zur   Trockne    cin. Man wäscht den Rückstand mit   Dijithyläther    und Chloroform, löst in Dioxan/Wasser (8:2), behandelt die erhaltene Lösung mit 100 ml Amberlit-IRA-410 (Acetat-Form), dampft ein und kristallisiert den Rück  stand aus   IsopropanolíWasser    um. Man erhält das
Trt-Ser-Als-Tyr-Trp-Arg-Asn-Leu-Asn-Asn
Phe-His-Lys(BOC)-Phe-Ser-Gly-Nle-Gly
Phe-Gly-Pro-Glu(OTB)-Thr-Pro-NH2 # Acetat, Smp. 135  (Zers.),   [&alpha;]D20    = -45  in Dimethylformamid.



  das man unter Stickstoffatmosphäre in 500 ml 80    Óiger    Essigsäure löst. Man   lässt    1 Stunde bei   45     stehen, konzentriert auf 100 ml und fällt durch Zugabe von   10û0    ml   Diäthyläher.    Man filtriert, iöst den Rückstand in   Dimexhylformamid    und fällt mit   Diäthyläther.    Nach Trocknen über KOH-Späne erhält man das
H-Ser-Als-Tyr-Trp-Arg-Asn-Leu-Asn-Asn-P
His-Lys(BOC)-Phe-Ser-Gly-Nle-Gly-Phe.



      Gly-Pro-Glu(OTB)-Thr-Pro-NH2 # zu 6 CH:CO-H,    Smp.   130     (Zers.),   [&alpha;]D20    =   -43     in   Essigsäure.   



   Beispiel I tert.-Butyloxycarbonyl-L-hemicystinyl-L-seryl
L-asparaginyl-L-leucyl-L-seryl-L-threonyl
L-hemicistinyl-L-valyl-L-leucyl-L-seryl
L-alanyl-L-tyrosyl-L-tryptophanyl-L-arginyl
L-asparaginyl-L-leucyl-L-asparaginyl
L-asparaginyl-L-phenylalanyl-L-histidyl e-tert.-butoxycarbonyl-L-lysyl-L-phenylalanyl
L-seryl-glycyl-L-norleucyl-glycyl-L-phenyl alanyl-glycyl-L-prolyl-tert.-butoxy-L-glutamyl    L-threonyl-L-prolinamid #      Hexaacetat #    Dekahydrat
EMI8.1     


<tb>   #   
<tb> BOC-Cys-Ser-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys-Val-Leu 
Ser-Ala-Tyr-Trp-Arg-Asn-Leu-Asn-Asn-Phe
His-Lys(BOC)-Phe-Ser-Gly-Nle-Gly-Phe-Gly    Pro-Glu(OTB)-Thr-Pro-NH2 # Hexaacetat # Deka-    hydrat)
Man löst 1.05 g   Nonapeptid-Hvdrazid      (T;

  ;ilsequenz    F) in   einem      Gemisch    von 50 ml Dimethylformamid und 1,2 ml Dioxan HCl 2n bei -20 . Man gibt 0,116 ml   tert.-Butylni,rit      zu.    rührt 10 Minuten bei   -20 ,    gibt 1,4 ml Triäthylamin und 3,1 g Tricosapeptid-Hexaacetat (Tcilsequenz ABCDE) und 5 ml Wasser zu und rührt 16 Stunden bei 0  Man dampft zur   Trockene      cin.   



  wäscht den Rückstand mit Diäthyläther, Chloroform und Aceton. So   erhält    man das rohe geschützte Dotria   contapescid,    das man in 100 ml 0.3n   Essigsäure      löst!    mit 20 ml Amberlit-IRA-410 (Acetat) behandelt und 50 ml 0.6n Ammoniumhydroxyd hinzugibt. Man stellt das pH auf 6,5 ein und schichtet die erhaltene Lösung auf eine Carboxymethylcellulosesäule (10 / 100 cm).



  din mit cincr   0.15n    Ammoniumacetatpuffer-Lösung   equilibricrr    wird Die Elution wird mit ,   einem      steigenden    Konzentrations und pH-Gradient (0.15 n auf 0,4 n; pH 6.5 auf pH 7.0) eines Ammoniumacetatpuffers durchgeführt. Die vereinigten Fraktionen, die das reine Peptid   enthalten.    werden   dreimal    gefriertrocknet.   d r    Riickstand mit   .Athanoi    und   anschliessend    mit Diäthvl äther   gewaschen    und iiber   Kaliumhvdroxid    im Hochvakuum getrocknet.

  Man erhält
EMI8.2     


<tb>  <SEP>     <SEP> #   
<tb> BOC-Cys-Ser-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys-Val-Leu 
Ser-Ala-Tyr-Trp-Arg-Asn-Leu-Asn-Asn
Phe-His-Lys(BOC)-Phe-Ser-Gly-Nle-Gly
Phe-Gly-Pro-Glu(OTB)-Thr-Pro
NH2   #    6 CH2CO2H   #   10 H2O.



  Smp. 220  (Zers.).   [&alpha;]D20    = -19  in Essigsäure 1n.



     Aminosaurozusam      mcnsct%ung    n ach Säurehydrolyse   (6n.    16   S*d.):      A!a"      Arl..,    Asn   Cxs      '";,      Glul I,    Gly2,n Phe1,1, Leu29, Lys1.1,   Nle1.8, Phe2.8, @@@ @@    THr15, Tyr1,9 (Trp 1,0 durchh Spektrophotometrie).



   Beispiel 2 tert.-Butyloxycarbonyl-L-hemicistinyl-L-seryl L-asparaginyl-L-leucyl-L-seryl-L-threonyl L-hemicistinyl-L-valyl-L-leucyl-L-seryl-L-alanyl L-tyrosyl-L-tryptophanyl-L-arginyl-L-asparaginyl L-leucyl-L-asparaginyl-L-asparaginyl-L-phenyl   alanyl-L-histidyl-#-tert.-butoxycarbonyl-L-lysyl-    L-phenylalanyl-L-seryl-glycyl-L-norleucylglycyl-L-phenylalanyl-glycyl-L-prolyl-tert.-butoxy   L-glutamyl-L-threonyl-L-prolinamid # Hexaacetat # Decahydrat   
EMI8.3     


<tb>  <SEP> #
<tb> (BOC-Cys-Ser-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys-Val-Leu  Ser-Ala-Tyr-Trp-Arg-Asn-Leu-Asn-Asn-Phe His-Lys(BOC)-Phe-Ser-Gly-Nle-Gly-Phe-Gly   Pro-Glu(OTB)-Thr-Pro-NH2 # Hexaacetat # Decahydrat)   
EMI8.4     

  <SEP> I
<tb> Man <SEP> löst <SEP> 1.0 <SEP> g <SEP> BOC-Cys-Ser-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys    Val-Leu-OH      in     

     1 O    ml Dimethylformamid, gibt 1.5 g N-Hydroxysuccinimid und   U.59    g Dicyclohexylcarbodiimid hinzu rührt 6 Stunden bci   25-,      filtriert    und   dampft    das Filtrat zur   Trockne    ein.   N-'an    wäscht den   Rückstand    mit Essigester und   Dsäthyläther    und trocknet.
EMI8.5     





   <SEP> -I- <SEP> I
<tb> Man <SEP> erhält <SEP> 1.2 <SEP> g <SEP> BOC-Cys-Ser-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys    Val-Lcu-OSu,    Smp. 242 , das man in 10 ml Dimethyl   fonnamid      löst,      gibt      3.1    g   Tricosapeptid-Hexaacetat    (Teilsequenz   A9:CDE),      0,4    ml Triäthylamin und   1,9      g      N-Hydroxysuccinimid    zu und rührt 16 Stunden bei 25 .



     Man      dampf    zur   Troclelle    cin, wäscht den   Rückstand    mit Diäthyläther, Chloroform und Aceton. So erhält man das rohe geschützte Detriacontapeptid, das man in 100 ml 0.3n Essigsäure   löst    mit   0    ml Amberlit IRA 410   (Accta)      behandelt    und gibt 50 nil 0.6 n Ammoniumhydroxid hinzu. Man stellt das pH auf 6.5 ein und   schichte.    die   erhaltene    Lösung auf eine Carboxymethylcellulosesäule (10 x 100 cm), die mit einer 0.15n Ammoniumacetatpufferlösung äquilibriert wurde.



  Die Elution wird mit einem steigenden Konzentrationsund pH-Gradient (0,15n auf 0,4n; pH 6.5 auf pH 7,0) eines Ammoniumacetatpuffers durchgeführt. Die vereinigten   Fraliticnen.    die das reine Peptid enthalten. wer   den    dreimal gefriertrocknet, der   Pvüclistand    mit Äthanol und   anscl1liessend    mit Diäthyläther gewaschen und über Kaliumhydroxid im Hochvakuum getrocknet.



     fan    erhält
EMI8.6     

  <SEP> ! <SEP> ------- <SEP> i
<tb> BOC-Cys-Ser-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys-Val-Leu
<tb> 
Ser-Ala-Tyr-Trp-Arg-Asn-Leu-Asn-Asn
Phe-His-Lys(BOC)-Phe-Ser-Gly-Nle-Gly
Phe-Gly-Pro-Glu-(OTB)-Thr-Pro
NH2   #    6 CH3CO2   #   10 H2O.



  Smp. 220  (Zers.),   [&alpha;]D20    = -19  in in Essigsäure
Aminosäurezusammensetzung nach Säurehydrolyse (6n, 16 Std.):   Ala@@,      Arg@,      Asn@,    Cys21,5, Glu1,2, Gly3,n, His1,1. Leu2,9, Lys2,1, Nle1n, Phe2,n Pro21,   Ser@    Thr19, Tyr13, Val89, (Trp 1, 0 durch Spektrophotometrie).

 

   Das als Ausgangsmaterial verwendete BOC-Cys-Ser Asn-Leu-Ser-Thr-Cys-Val-Leu-OH wird wie folgt her   gestellt:    a) L-Threonyl-S-benzyl-L-cysteinyl-L-valyl-L-leucin  (H-Thr-Cys(Bzl)-Val-Leu-OH)    Man löst 372 g H-Thr-Cys(Bzl)-Val-Leu-OMe # HBr    (Teilsequenz F1) in 1800 ml Methanol, fügt 900 m.



     nn    Natronlauge hinzu. lässt   I      Stunde    bei   '53    stehen.  



  gibt 240 ml Eisessig hinzu und lässt 2 Stunden bei 0  stehen. Danach filtriert man die ausgeschiedene kristalline Masse   ab.    wäscht diese zuerst mit In Essigsäure, anschliessend mit Wasser und trocknet bei 500 im Hochvakuum. Man erhält das H-Thr-Cys(Bzl)-Val-Leu OH, Smp.   2190,      [ < ii    D20= -53  in In Ammoniak.



  b) tert-Butylloxycarbonyl-hemicystinyl-L-seryl
L-asparaginyl-L-leucyl-L-seryl-L-thereonyl    L-hemicystinyl-L-valyl-L-leucin   
EMI9.1     


<tb> (B <SEP> OC-Cys-Ser-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys-Val-Leu-OH)
<tb> 
Man löst 18,4 g BOC-Cys(Bzl)-Ser-Asn-Leu-Ser NHNH2 (Teilsequenz F2) in 150   ml    Dimethylformamid, kühlt auf   -200,    gibt 40 ml einer 2n-Lösung von Salzsäure in Dioxan und 15 ml tert.-Butylnitrit zu.



  Nach 10 Minuten bei -20  gibt man noch 28 ml Tri äthylamin und 16,2 g H-Thr-Cys(Bzl)-Val-Leu-OH zu und rührt 16 Stunden bei   250.    Danach wird filtriert, die Lösung eingedampft und der Rückstand mit In Essigsäure durchgewaschen. Man erhält BOC-Cys(Bzl) Ser-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys(Bzl)-Val-Leu-OH, Snlp.   217,      [&alpha;]D20 =    -27  in Dimethylformamid.



   Man löst das erhaltene Produkt in 5000 ml ge- trocknetem Ammoniak, gibt unter Rühren und Siedcn des Ammoniaks Natriummetall bis zur tiefblauen Färbung zu. Zwecks Entfärbung wird Ammoniumchlorid hinzugefügt. Man dampft zur Trockne ein und wäscht den Rückstand mit In Essigsäure und Aceton durch.



  Nach Trocknen erhält man   BOC-Cys-Ser-Asn-Leu-Ser-    Thr-Cys-Val-Leu-OH, Smp. 248  (Zers.),   [&alpha;]D20    = in Dimethylformamid/Wasser (7:3).



   Man löst das erhaltene Nonapeptid in 5000 ml   0.01n    Ammoniak auf, gibt unter Rühren In Wasserstoffperoxid bis zur negativen Nitroprussiatreaktion hinzu, dann noch 200 ml Eisessig, filtriert und Iyophi
EMI9.2     


<tb> lisiert. <SEP> Man <SEP> erhält <SEP> BOC-Cvs-Ser-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys  Val-Leu-OH, Smp. 238  (Zers.),   [&alpha;]D20 (      -18    in Dimethylformamid/Wasser (7:3).



   Beispiel 3
L-Hemicsytinyl-L-seryl-L-asparanginyl-L-leucyl    L-seryl-L-threonyl-L-hemicystinyl-L-valyl-
L-leucyl-L-seryl-L-alanyl-L-tyrosyl-L-trypto-    phanyl-L-arginyl-L-asparaginyl-L-leucyl
L-asparaginyl-L-asparaginyl-L-phenylalanyl
L-histidyl-L-lyayl-L-phenylalanyl-L-seryl glycyl-L-norleucy l-glycyl-L-phenylalanyl glycyl-L-prolyl-L-glutamyl-L-threonyl l-prolinamid-octaacetat-Hydrat
EMI9.3     


<tb> (H-Cys-Ser-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys-Val-Leu  Ser-Aln-Tyr-Trp-Arg-Asn-Leu-Asn-Asn-Phe His-Lys-Phe-Ser-Gly-Nle-Phe-Gyl-Pro   Glu-Thr-Pro-NH-      Octaacetat    Hydrat) Man löst 3.3 g
EMI9.4     


<tb> BOC-Cys-Ser-Asn-Lcu-Ser-Th <SEP> r-Cys-Val-Lcu 
Ser-Ala-Tyr-Trp-Arg-Asn-Leu-Asn-Asn
Phe-His-Lys(BOC)-Phe-Ser-Gly-Nle-Gly
Phe-Gly-Pro-Glut(OTB)-Thr-Pro    NH2#Hexaacetat#Hydrat    unter Stickstoffatomphäre in 100  

   ml Teifluoressigsäure.



  lässt 15 Minuten bei 200 stehen und dampft zur Trockne ein. Man löst in 300 ml 0.2n Essigsäure, behandelt mit 20 ml Amberlit-IRA-410 (Acetat), lyophilisiert, wäscht mit Diäthyläther und trocknet über   Kaliumhydroxid    im Hochvakuum. Man erhält
EMI9.5     


<tb> H-Cys-SerAsn-Leu-Ser-Thr-Cys-Val-Leu     Ser-Ala-Tyr-Trp-Arg-Asn-Leu-Asn-Asn   
Phe-His-Lys-Phe-Ser-Gly-Nle-Gly-Phe    Gly-Pro-Glu-Thr-Pro-NH2#8    CH3CO2H
10 H20, Smp. 220  (Zers),   [&alpha;]D20    = -54  in Essigsäure ln.



   Aminosäurezusammensetzung nach Säurehydrolyse (6n, 16 Std.): Ala1.1, Arg1.0, Asn3.9, Cys/21.0, Glu1.2, Gly3.0, His1.1, Leu2,9,Lys1.1, Nle 1.0, Phe8.0, Pro2.1m De3.8m Thr1.9, Tzr1.0, Val1.0 UTrp 1,0 durch Spektrophotometrie).

Claims (1)

  1. PATENTANSPRÜCHE
    T. Verfahren zur Herstellung eines bisher unbekannten Polypeptides der Formel EMI9.6 <tb> <SEP> 1 <SEP> 2 <SEP> 3 <SEP> 4 <SEP> 5 <SEP> 6 <SEP> 7 <SEP> 8 <SEP> 9 <SEP> 10 <tb> H-Cys-Ser-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys-Val-Leu-Ser 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 Ala-Tyr-Trp-Arg-Asn-Leu-Asn-Asn-Phe-His-Lys 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 Phe-Ser-Gly-Nle-Gly-Phe-Gly-Pro-Glu-Thr-Pro NH., und seiner therapeutisch wirksamen Säureadditionssalze, dadurch gekennzeichnet, dass man entsprechende zu seinem Aufbau nötige Aminosäuren unter Bildung von CONH-Bindungen in beliebiger zeitlicher Reihenfolge miteinander kondensiert, wobei nicht an der Reaktion teilnehmende freie funktionelle Gruppen intermediär durch geeignete Schutzgruppen geschützt werden,
    zu einem beliebigen Zeitpunkt der Synthese die Mercaptogruppen nach Bildung der Sequenz 1 bis 7 zum Disulfid oxydiert, die Carboxylgruppe des terminalen Prolylrestes in die Amidgruppe überführt und gegebenenfalls anschliessend die Säureadditionssalze herstellt, indem man das Polypeptid der obigen Formel durch Umsetzung nlit organischen oder anorganischen Säuren in die cntsprechenden Salze überführt.
    II. Verwendung des nach Patentanspruch I hergestellten Polypeptides der Formel EMI9.7 <tb> <SEP> 1 <SEP> 2 <SEP> 3 <SEP> 4 <SEP> 5 <SEP> 6 <SEP> 7 <SEP> 8 <SEP> 9 <SEP> 10 <tb> H-Cys-Ser-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys-Val-Leu-Ser II 12 13 14 13 16 17 18 19 20 21 Ala-Tyr-Trp-Arg-Asn-Leu-Asn-Asn-Phe-His-Lys 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 Phe-Ser-G ly-N le- G ly-Phe-Gly-Pro-Glu-Thr-Pro- NH.2 zur Herstellung von Schwermetallkomplexen, dadurch gekennzeichnet dass man das Polypeptid der obigen Formel durch Umsetzung mit Schwennetallsalzcn in die entsprechenden Schwermetallkomplexe iiberführt.
    UNTERANSPRUCH Verfahren zur Herstellung des neuen Polypeptids nach Patentanspruche 1 dadurch gekennzeichnet, dass inan aus EMI10.1 <tb> <SEP> 1 <SEP> 2 <SEP> 3 <SEP> 4 <SEP> 5 <SEP> 6 <SEP> 7 <SEP> 8 <SEP> 9 <SEP> 10 <tb> BOC-Cys-Ser-Asn-Leu-Ser-Thr-Cys-Val-Leu-Ser <tb> <SEP> BOC <tb> <SEP> 11 <SEP> 12 <SEP> 13 <SEP> 14 <SEP> 15 <SEP> 16 <SEP> 17 <SEP> 18 <SEP> 19 <SEP> 20 <SEP> 21 <tb> Als-Tyr-Trp-Arg-Asn-Leu-Asn-Asn-Phe-His-Lys 22 23 24 25 26 27 28 29 20 31 32 Phe-Ser-Gly-Nle-Gly-Phe-Gly-Pro-Glu-Thr-Pro NH3 die Schutzgruppen abspaltet.
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